CN102336817B - 棘球白素b母核的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种棘球白素B母核的分离方法，该方法包括如下步骤：1)含棘球白素B母核的转化液抽滤后，将滤液pH调整到5-8，上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，用水甲醇溶液洗脱，再用甲醇水溶液将棘球白素B母核集中洗下；2)将步骤1)收集液上大孔丙烯酸树脂，再用酸水溶液将棘球白素B母核集中洗下；3)将步骤2)收集液的pH调整到4-5，然后浓缩冻干制得棘球白素B母核。该方法不仅能够很好的去除色素，且适合大规模的工业生产，具有很好的商业价值。本发明方法能将棘球白素B母核的最终纯度提高到92％以上。
Description
技术领域
本发明涉及光谱抗真菌药物的研发，具体地，本发明涉及阿尼芬净的前体棘球白素B母核的分离方法。
背景技术
上世纪以来，由于大量使用广谱抗真菌药物和免疫抑制剂，真菌感染性疾病造成的死亡率逐渐提高，因此，研究安全新型的抗真菌药物显得非常重要。棘球白素类(echinocandins)即是以真菌细胞壁为作用靶点的新型抗真菌药物，它可以非竞争性地抑制细胞壁上β-1，3葡聚糖合成酶的活性，造成真菌细胞的死亡。棘球白素类主要有三种类型：B、C以及D，其中棘球白素B是最主要的类型，但由于它的水溶性较差，毒性较高，因此使用受阻。然而，将棘球自素B的侧链断开后生成棘球白素B母核(EchinocandinBNucleus，简称ECBNucleus)，再接上修饰基团构成阿尼芬净，此药目前已经上市，市场潜力巨大。
棘球白素B母核是通过游动放线菌对棘球白素B进行转化得到的，文献DEACYLATIONOFECHNOCANDINBBYACTINOPLANESUTAHENSIS(MAR1989THEJOURNALOFANTIBIOTICS)介绍了其分离提取工艺：转化液用HP-20大孔吸附树脂进行初分，然后用反向HPLC精制得到纯品，此法虽然步骤简单，得到的棘球白素B母核纯度较高，但该工艺的设备要求高，因此难以实现规模化生产。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种简单的制备棘球白素B母核的方法，其不仅能够很好的去除色素，且适合大规模的工业生产，具有很好的商业价值。本发明方法能将棘球白素B母核的最终纯度提高到92％以上。
本发明的技术方案如下：提供一种棘球白素B母核的分离方法，该方法包括如下步骤：
1)含棘球白素B母核的转化液抽滤后，将滤液pH调整到5-8，上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，用水甲醇溶液洗脱，再用甲醇水溶液将棘球白素B母核集中洗下；
2)将步骤1)收集液上大孔丙烯酸树脂，再用酸水溶液将棘球白素B母核集中洗下；
3)将步骤2)收集液的pH调整到4-5，然后浓缩冻干制得棘球白素B母核。
所述含棘球白素B母核的转化液按照下列步骤得到：将培养好的转化用菌体放入pH为6.0-7.0的磷酸缓冲液悬浮，加入棘球白素B母核精制品混匀，25-30℃下进行转化反应3-5小时，得到含棘球白素B母核的转化液。
上述步骤1)结束后，棘球白素B母核的收率为75-80％，纯度为65-70％；上述步骤2)结束后，棘球白素B母核的收率为90％以上，纯度为95-96％；上述方法的总收率在60％以上，最终棘球白素B母核纯度为95％左右。
优选地，步骤1)中使用的水甲醇溶液和甲醇水溶液的体积可以为2-4CV；步骤2)中使用的酸水溶液的体积可以为2-4CV。
上述步骤1)中含棘球白素B母核的转化液抽滤后的滤液pH对上柱影响较大，在pH为6-8时吸附效果较好，在pH＞8时破坏严重，在pH＜5时则吸附效果很差。
根据本发明，步骤1)中所述水甲醇溶液的浓度可以为5％-15％，优选9％。该步骤中用水甲醇洗脱是除杂的关键，甲醇含量可以在5％-15％之间，但随着甲醇含量的增加，棘球白素B母核的损失也逐渐加大，因此优选9％的甲醇洗脱。
根据本发明，步骤1)中所述甲醇水溶液的浓度可以为33％-100％，优选50％。该步骤中用甲醇水将棘球白素B母核集中洗脱下来，其中甲醇与水的比例在1∶2到100％甲醇都可以，但1∶1时洗脱色素含量较少，目的产物纯度相对高。
根据本发明的一个优选的实施方式，步骤2)中的大孔丙烯酸树脂可以用乙醇或甲醇预洗除杂。其中乙醇除杂更为集中。
根据本发明，步骤2)中的酸水溶液可以选自盐酸水溶液、硝酸水溶液或磷酸水溶液，优选盐酸水溶液。所述酸水溶液的浓度可以为0.005-0.5N，优选0.01N。该步骤的目的是用酸水溶液将棘球白素B母核集中洗下，酸的浓度在0.005-0.5N都可以，但0.01N洗脱时色素下来少，纯度较高。
根据本发明一个优选的实施方式，步骤1)和2)中的上柱流速均可为1％CV/min，洗脱流速均可为2％CV/min。
本发明含棘球白素B母核的转化液具体通过以下方法得到：
菌种：游动放线菌(Actinoplanesutahensis)保藏号为NRRL12052。菌体培养条件：
将保存在冷冻管中的游动放线菌NRRL12052在28℃条件下接入斜面培养基中培养7天，斜面培养基的组成为(％)：酵母提取物0.3、麦芽浸出物0.3、蛋白胨0.5、葡萄糖1.0、琼脂2.7、pH7.0；
培养7天后将斜面上长出的菌体按10％接种量接种到转化培养基中培养4天，培养温度为30℃，转化培养基的组成为(％)：蔗糖2.0、燕麦片2.0、麦芽浸出物0.5、酵母0.25、K2HPO40.1、KCl0.05、MgSO4.7H2O0.05、FeSO4.7H2O0.0002、pH7.0；培养4天后，将转化菌体用3倍体积的去离子水洗涤次后离心，倒去上清液，留作转化用。
菌体转化条件：
转化底物：纯度为95％的棘球白素B精制品，此精制品的制备工艺详见中国专利“一种制备高纯度阿尼芬净前体EchinocandinB的方法”，申请号：200810042128.9，用含10％DMSO的水溶解。
转化条件：将培养好的转化用菌体放入新鲜的pH为6.8、浓度0.1M磷酸缓冲液悬浮，加入底物混匀，30℃250r/min进行转化反应3小时得到最终含棘球白素B母核的转化液。
具体实施方式
ECBNucleusHPLC检测条件
色谱柱：ODS-C18(5μ)；
检测波长：222nm；
流动相：乙酸铵缓冲液∶乙腈＝94∶6
流速：0.8ml/min
柱温：40℃
实施例1-3考察转化液pH对大孔吸附树脂的影响：
实施例1
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2.5L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10∶1的水甲醇溶液3CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus集中洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为68％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为96.6％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为96.4％，总收率为64％。
实施例2
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2.7L过滤液，pH调整为6后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，上柱后HPLC检测有10％左右漏液，上柱吸附后用10∶1的水甲醇溶液3CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液4CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为69％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用3CV乙醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为97.1％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为97.1％，总收率为52％。
实施例3
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2.42L过滤液，pH调整为8后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10∶1的水甲醇溶液2CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为63％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为93.9％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为94.0％，总收率为71％。
实施例4-6考察大孔吸附树脂吸附后不同比例的甲醇水预洗效果
实施例4
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1.8L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含9％甲醇的水溶液4CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为62.3％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV甲醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为95.4％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为95.2％，总收率为66％。
实施例5
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1.73L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含5％甲醇的水溶液4CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为58.4％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV甲醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为92.6％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为92.5％，总收率为74％。
实施例6
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1.9L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含15％甲醇的水溶液4CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为71.3％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV甲醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为97.1％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为97.1％，总收率为58％。
实施例7-8考察大孔吸附树脂洗脱时的甲醇水比例
实施例7
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2.3L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含10％甲醇的水溶液2CV脱盐除DMSO，再用100％甲醇4CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为58.6％，洗脱液颜色较深。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用4CV乙醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液4CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为94.7％，其中含有少量色素，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，冻干粉末呈淡黄色，纯度为94.6％，总收率为69％。
实施例8
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2.1L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含10％甲醇的水溶液2CV脱盐除DMSO，再用含75％甲醇的水溶液4CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为61.2％，洗脱液颜色较深。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用4CV乙醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液4CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为95.1％，其中含有少量色素，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，冻干粉末呈浅黄色，纯度为95.1％，总收率为70％。
实施例9-10考察大孔弱酸树脂洗脱时盐酸浓度
实施例9
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1.5L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含10％甲醇的水溶液2CV脱盐除DMSO，再用含50％甲醇的水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为65.8％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0.005N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为97.3％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为97.2％，总收率为55％。
实施例10
菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1.37L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含10％甲醇的水溶液2CV脱盐除DMSO，再用含50％甲醇的水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为64.9％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0.5N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为92.7％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为92.6％，总收率为72％。
实施例11-14考察不同来源的发酵液对转化的影响：
对转化菌体游动放线菌NRRL12052进行自然分离得到三株生长状态良好的菌株S1、S2、S3，并按照相同的培养方法进行菌体培养，将培养好的菌体进行转化工艺研究。
实施例11
将转化菌体S1培养好后进行转化，转化后将转化液抽滤，得到1.8L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10∶1的水甲醇溶液3CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液3CV将ECBNucleus集中洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为64％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为94.5％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为94.4％，总收率为61％。
实施例12
将转化菌体S2培养好后进行转化，转化后将转化液抽滤，得到1.62L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10∶1的水甲醇溶液3CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液3CV将ECBNucleus集中洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为69％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用3CV乙醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为95.9％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为96％，总收率为58％
实施例13
将转化菌体S3培养好后进行转化，转化后将转化液抽滤，得到1.73L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10∶1的水甲醇溶液3CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus集中洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为59％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用3CV乙醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为93.8％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为93.7％，总收率为65％
对转化菌体游动放线菌NRRL12052进行基因改造，先构建一个含有酰基转移酶的质粒pSET152，再将其导入转化态的大肠杆菌中复制，最后通过结合转移导入到野生菌NRRL12052中，挑选阳性克隆子，得到基因工程菌G1，并按照相同的培养方法进行菌体培养，将培养好的菌体进行转化工艺研究。
实施例14
将转化菌体G1培养好后进行转化，将转化液抽滤，得到2.46L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10∶1的水甲醇溶液2CV脱盐除DMSO，再用1∶1甲醇水溶液3CV将ECBNucleus集中洗下，得到ECBNucleus初制品，纯度为71％。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0.01N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECBNucleus精制品，其纯度为96.8％，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为96.6％，总收率为66％。
Claims (6)
1.棘球白素B母核的分离方法，该方法包括如下步骤：
1)含棘球白素B母核的转化液抽滤后，将滤液pH调整到6-8，上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，用5％-15％的甲醇水溶液洗脱，再用50％-100％的甲醇水溶液将棘球白素B母核集中洗下；
2)将步骤1)收集液上大孔丙烯酸树脂，再用0.005-0.5N盐酸水溶液将棘球白素B母核集中洗下；
3)将步骤2)收集液的pH调整到4-5，然后浓缩冻干制得棘球白素B母核。
2.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，所述含棘球白素B母核的转化液按照下列步骤得到：将培养好的转化用菌体放入pH为6.0-7.0的磷酸缓冲液悬浮，加入棘球白素B母核精制品混匀，25-30℃下进行转化反应3-5小时，得到含棘球白素B母核的转化液。
3.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤1)中使用甲醇水溶液的体积为2-4CV；步骤2)中使用的酸水溶液的体积为2-4CV。
4.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤2)中的大孔丙烯酸树脂用乙醇或甲醇预洗除杂。
5.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤2)中的盐酸水溶液的浓度为0.01N。
6.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤1)和2)中的上柱流速为1％CV/min，洗脱流速为2％CV/min。
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