CN106544382A - 一种环己肽类化合物fr179642的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种环己肽类化合物FR179642的制备方法，更具体的，本发明提供了一种将FR901379通过脱酰酶催化脱去酰基反应，并通过控制反应起始物料和反应过程中反应液pH及反应温度等工艺条件，达到高效制备FR179642的方法。本发明提供的方法，操作简单，转化效率高，生产成本低。

Description

一种环己肽类化合物FR179642的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种环己肽类化合物FR179642的制备方法，更具体的涉及将FR901379通过脱酰酶转化成FR179642的方法。

背景技术

真菌对于健康人体而言通常是条件致病菌，当肌体免疫力下降，外部因素不良时，就可能造成局部或全身真菌感染。近年来，随着广谱抗生素免疫抑制剂和糖皮质激素的不当应用以及器官移植、放疗化疗、外科介入等的广泛应用，导致深部真菌感染发病率日益增高。真菌感染会侵犯内脏器官和深部组织，因此，有效控制深部真菌病具有十分重要的临床意义。

棘白菌素类是近年来新上市的一种抗真菌药物，能抑制真菌细胞壁的β-1,3-D-葡萄糖合成酶，由于哺乳动物细胞缺乏β-1,3-D-葡萄糖合成酶，故该类化合物对真菌细胞具有高度的特异性，能迅速杀灭真菌而对人体正常细胞影响较小，因而疗效好，安全性高。目前已上市的此类药物有：卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。

FK463，又名米卡芬净钠，（Micafungin，其结构式如式1 所示，）由日本藤泽公司(Japan Fujisawa Toyama Co.，Ltd，Takaoka Plant)开发，于2002 年12月在日本上市，商品名为Fungusrd，2005 年3 月通过美国FDA 认证，目前被批准用于治疗食道念珠菌感染、骨髓移植及ADS 患者中性粒细胞减少症的预防治疗。它是以FR901379，如式3所示化合物为前体通过酶解除掉侧链后得到FR179642，如式2 所示化合物（具体方法参见美国专利US5376634，EP0431350 及中国专利CN1161462C）然后经过化学修饰得到的，具体制备及纯化方法参见专利公开WO9611210，WO9857923，WO2004014879。环己肽类化合物FR179642 是鞘茎点霉Coleophoma empetri 发酵代谢产物。因此，要得到高纯度的米卡芬净，纯度高的式2 即环己肽类化合物FR179642是关键。

ZL91104847.2中公开将FR901379物质通过菌丝体游动放线菌属utahensis I FO-13244在37℃脱酰基反应得到FR179642的钠盐。

式1：米卡芬净钠

中国专利CN102443050A披露了以一种环脂肽化合物为前体通过酶解掉侧链得到FR179642，并报道了该种前体环脂肽化合物的分离提纯方法。此外还有文献中报道由FR179642 制备米卡芬净的合成方法（Ueda, S.; Ezaki, M.; Tanaka, M.; et al.Studies on a novellipopeptide acylase from Streptomyces spp. for productionof FR179642, a key intermediate of antifungal lipopeptide drug FK463. 38thIntersci Conf Antimicrob Agents Chemother (Sept 24 1998, San Diego) 1998,Abst F-145）。

中国专利CN201110244301.5 公开了一种纯化环己肽类化合物FR179642 的方法：将发酵液过滤后进行树脂吸附、解吸、浓缩、结晶后得到环己肽类化合物FR179642 粗品，然后再借助反向填料C18 对粗提物进行层析分离，最后得到较高纯度（98.1%~98.6%）的环己肽类化合物FR179642。

但长期以来FR179642的发酵一直停留在一个很低的水平，尽管人们都在为寻找一个廉价，高产的酶脱酰基条件，但收效甚微。这就使得FR179642化合物的制备难度加大，成本提高，从而间接使FK463 长期处于一个较高的价位。因此人们迫切需要一种高效低成本的FR179642制备方法。

已经报道的FR901379转化成FR179642的酰基侧链脱酰的酶有链霉菌属的细菌有环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)4811 号菌株，环圈链霉菌8703 号菌株、链霉菌(Streptomyces sp.)6907 号菌株，以及IFO13244，IFO6798，IFO31963，IFO9951，NRRL12052等。

本发明的作者通过创造性的思考和大量的试验，逐渐探索出了一种可以使FR901379脱酰酶高效脱酰基转化成FR179642的反应条件。

发明内容

本发明提供了一种将FR901379转化成FR179642的方法，包括以下步骤：

1）发酵Actinoplanes utahensis菌，获得FR901379脱酰酶；

2）发酵结束后，向发酵罐中加入2~3%（W/V）的硅藻土，通过板框压滤，然后用去离子水顶洗，吹干，收集菌体，即为FR901379脱酰酶；

3）将FR901379用5%反应体积的甲醇溶解，其起始浓度控制在2.0~4.0g/L，与步骤1）中的脱酰酶混合并搅拌使其转化为FR179642，转化12~48小时，分离提取得到FR179642；

其中，步骤3）转化过程中，控制反应液pH为5.0~7.0，反应温度为28℃~32℃。

上述方法中，优选，步骤3）控制反应液的pH缓冲盐体系为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠。

进一步的优选，所述磷酸二氢钾的浓度为2.0~2.5 g/L，磷酸二氢钠的浓度为1.0~1.5 g/L。

本发明人通过大量实验研究和创造性的思考， 发现FR901379在脱酰基转化过程中，通过控制转化液中FR901379的起始浓度以及转化过程中的pH控制，可显著的提高酶的转化效率。发明人通过大量的试验研究发现，转化过程中，反应温度控制在28℃~32℃，并且底物起始浓度控制在2.0~4.0g/L，同时控制反应液pH为5.0~7.0时，转化效率最佳，其中任何一个条件改变均会导致转化酶效率以及转化产率降低。

具体实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

其中FR901379可参考现有文献如CN102533551B、ZL91104847.2等公开的方法制备获得，公开了3-1的制备方法。

本发明所用的菌种为链霉菌属的细菌有环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)4811 号菌株，环圈链霉菌8703 号菌株、链霉菌(Streptomyces sp.)6907 号菌株，以及IFO13244，IFO6798，IFO31963，IFO9951，NRRL12052等，以及通过诱变选育的菌株。

实施例1 产FR901379脱酰酶菌株的发酵及粗酶制备

菌种：Actinoplanes utahensis Couch (ATCC® 14539™)；

种子培养基：蔗糖20 g/L，棉籽蛋白粉10 g/L，酵母粉10 g/L，玉米淀粉20 g/L，轻质碳酸钙2 g/L，消泡剂1 g/L，pH值5.50～6.50，于28.0～32.0℃培养24～72小时。

发酵培养基：蔗糖30 g/L，棉籽蛋白粉20 g/L，酵母粉20 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，氯化钾1 g/L，硫酸镁1 g/L，轻质碳酸钙2 g/L，消泡剂1 g/L，pH值约6.5，培养2~3天；

将菌种Actinoplanes utahensis Couch (ATCC® 14539™)接种到培养基中，于28.0～32.0℃培养4~5天。

发酵结束后，放罐，加入6%（W/V）的硅藻土，通过板框压滤，并用去离子水顶洗，吹干，收集滤饼，得到FR901379脱酰酶，用于下一步转化反应。

实施例2 FR901379转化成FR179642

根据反应体积，将FR901379起始浓度控制在4.0~5.0g/L，用5%~6%（W/V）反应体积的甲醇溶解，加入300kg去离子水搅拌均匀，投入反应釜中，加去离子水定容到总体积，开始转化反应，转化过程中以磷酸二氢钾和磷酸氢二钠为缓冲盐体系，并控制反应液pH为6.0~7.0，反应温度为28℃~32℃；反应结束后取样检测底物FR901379和产物FR179642浓度，其中生物转化率≥81%。

实施例3 FR901379转化成FR179642

根据反应体积，将FR901379起始浓度控制在3.0~4.0g/L，用5%~6%（W/V）反应体积的甲醇溶解，加入300kg去离子水搅拌均匀，投入反应釜中，加去离子水定容到总体积，开始转化反应，转化过程中以磷酸二氢钾和磷酸氢二钠为缓冲盐体系，并控制反应液pH为5.0~5.5，反应温度为28℃~32℃；反应结束后取样检测底物FR901379和产物FR179642浓度，其中生物转化率≥83%。

实施例4 FR901379转化成FR179642

根据反应体积，将FR901379起始浓度控制在3.5~4.0g/L，用5.5%（W/V）反应体积的甲醇溶解，加入280kg去离子水搅拌均匀，投入反应釜中，加去离子水定容到总体积，开始转化反应，转化过程中以磷酸二氢钾和磷酸氢二钠为缓冲盐体系，并控制反应液pH为5.0~5.5，反应温度为30℃~32℃；反应结束后取样检测底物FR901379和产物FR179642浓度，其中生物转化率≥80%。

对比实施例1 FR901379转化成FR179642

根据反应体积，将FR901379起始浓度控制在2.0g/L，用5%~6%（W/V）反应体积的甲醇溶解，加入300kg去离子水搅拌均匀，投入反应釜中，加去离子水定容到总体积，开始转化反应，转化过程中以磷酸二氢钾和磷酸氢二钠为缓冲盐体系，并控制反应液pH为5.0~5.5，反应温度为30℃~32℃；反应结束后取样检测底物FR901379和产物FR179642浓度，其中生物转化率约53%。

对比实施例2 FR901379转化成FR179642

根据反应体积，将FR901379起始浓度控制在2.0g/L，用5%~6%（W/V）反应体积的甲醇溶解，加入300kg去离子水搅拌均匀，投入反应釜中，加去离子水定容到总体积，开始转化反应，转化过程中以磷酸二氢钾和磷酸氢二钠为缓冲盐体系，并控制反应液pH为5.0~5.5，反应温度为35℃~40℃；反应结束后取样检测底物FR901379和产物FR179642浓度，其中生物转化率约48%。

对比实施例3 FR901379转化成FR179642

根据反应体积，将FR901379起始浓度控制在2.0g/L，用5%~6%（W/V）反应体积的甲醇溶解，加入300kg去离子水搅拌均匀，投入反应釜中，加去离子水定容到总体积，开始转化反应，转化过程中以磷酸二氢钾和磷酸氢二钠为缓冲盐体系，并控制反应液pH为7.5~8.5，反应温度为28℃~32℃；反应结束后取样检测底物FR901379和产物FR179642浓度，其中生物转化率约41%。

对比实施例4 FR901379转化成FR179642

根据反应体积，将FR901379起始浓度控制在2.0g/L，用1%（W/V）反应体积的甲醇溶解，加入300kg去离子水搅拌均匀，投入反应釜中，加去离子水定容到总体积，开始转化反应，转化过程中以磷酸二氢钾和磷酸氢二钠为缓冲盐体系，并控制反应液pH为2.5~3.5，反应温度为28℃~32℃；反应结束后取样检测底物FR901379和产物FR179642浓度，其中生物转化率约42%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (2)

1.一种将FR901379转化成FR179642的方法，包括以下步骤：

1）发酵Actinoplanes utahensis菌，获得FR901379脱酰酶；

2）发酵结束后，向发酵罐中加入硅藻土，通过板框压滤，然后用去离子水顶洗，吹干，收集菌体，即为FR901379脱酰酶；

3）将FR901379用甲醇溶解，其起始浓度控制在3.0~5.0g/L，与步骤1）中的脱酰酶混合，并搅拌使其转化为FR179642，转化12~48小时，分离提取得到FR179642；

其中，步骤3）转化过程中，控制反应液pH为5.0~7.0，反应温度为28℃~32℃。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3）控制反应液的pH缓冲盐体系为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠。