CN103060405B - 一种a40926的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种A40926的发酵工艺。该发酵工艺包括如下步骤：将产A40926的菌种接种到发酵培养基中进行发酵培养，其中，所述的发酵培养在培养至72h～112h，流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液控制葡萄糖0.5％～1.2％，蛋白胨0.3％～0.8％，L-缬氨酸0.05％～0.12％，百分比为各成分占发酵培养基总量的质量百分比。该工艺操作简单、成本低、能够大规模生产，最高可生产720mg/L达巴万星中间体A40926。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种A40926的发酵工艺。
背景技术
达巴万星(Dalbavancin)中间体A40926是1984年科学家在培养分离来自土壤的马杜拉放线菌属菌种(Actinomadura)时发现的一种糖肽类物质。2003年将A40926的产生菌归类于野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.sp ATCC 39727)。A40926包括5个主要组份：PA，PB，A，B0和B1，其中B0和B1统称为B组份。A40926B组份经过化学结构修饰后可得到一种新型糖肽类抗细菌药物达巴万星。
达巴万星是由Vicuron公司开发研究，目前正处于III期临床试验。研究发现达巴万星作用机制与万古霉素和替考拉宁相同，抑制G+菌细胞壁的生物合成，被广泛用作治疗皮肤和软组织感染的药物。并且，体内、外试验表明，达巴万星对于G+菌包括耐甲氧西林金葡球菌(MRSA)、甲氧西林敏感金葡球菌(MSSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、链球菌等具有抗菌活性；对耐G+病原菌包括耐青霉素和头孢曲松肺炎链球菌、替考拉宁不敏感CoNS、非vanA型肠球菌具有活性；对G+厌氧菌也具有活性。目前，达巴万星在治疗导管相关的血源性感染以及皮肤和软组织感染已取得了良好的效果，其优良的体内抗菌活性和安全性，具有更诱人的开发前景。
目前，对于A40926生产发酵工艺研究均较少。Technikova-Dobrova等人研究了不同培养基成分对野野村氏菌属放线菌ATCC39727生长以及生产A40926的影响时发现含为L-谷氨酰胺的NM-103培养基A40926产量较高，达到了122.6ug/ml，但若要生产应用，现有A40926产量很低显然不能够满足要求(Appl Microbiol Biotechnol，2004，65：671-677)。Beltrametti等人研究发现L-缬氨酸是A40926 B0组份的分支酰基链的潜在前体，在T/2培养基中添加0.3％L-缬氨酸，A40926总产量达到最高220u/ml(The Journal OfAntibiotics，2004，57(1)：33-44)；但是，此方法仅限于摇瓶试验，在工业生产规模的发酵罐上进行大规模生产工艺情况就不得而知了。鉴于现有的A40926发酵方法只是简单的摇瓶实验，且发酵单位低，达不到生产化的要求，该现状亟待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术中A40926的发酵工艺的发酵产率低，仅限于简单摇瓶实验，无法达到生产化要求的缺陷，提供了一种操作简单、成本低、能够大规模生产，最高可生产720mg/L达巴万星关键中间体A40926的发酵工艺。
本发明的A40926的发酵工艺包括如下步骤：将产A40926的菌种接种到发酵培养基中进行发酵培养，其中，所述的发酵培养在培养至72h～112h，流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液控制葡萄糖0.5％～1.2％，蛋白胨0.3％～0.8％，L-缬氨酸0.05％～0.12％，百分比为各成分占发酵培养基总量的质量百分比。
本发明中，所述的产A40926的菌种为本领域常规所说的能够发酵生产A40926的菌种，较佳的为野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.spATCC 39727)。
本发明中，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液步骤中，发酵培养较佳的培养至88h～104h，更佳的为96h。
本发明中，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液步骤中，较佳的控制葡萄糖0.8％～1.0％，蛋白胨0.4％～0.6％，L-缬氨酸0.08％～0.12％。
本发明中，所述的蛋白胨为本领域常规使用的蛋白胨，较佳的为鱼粉蛋白胨。
本发明中，所述的发酵培养的发酵工艺在本领域常规使用的培养容器中进行，较佳的为发酵罐，更佳的为50L不锈钢罐。所述的葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的用量较佳的分别为发酵罐实际装液质量的1％，0.5％和0.1％，所述的葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液总体积较佳的为发酵罐实际装液质量12％，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液的流加速率较佳的为0.8g/L.h～1.3g/L.h。
本发明中，所述的发酵培养基为本领域常规所说的产A40926的菌种使用的发酵培养基，可为每升中包含葡萄糖4.5％，硫酸铵0.83％，磷酸二氢钾0.15％，七水硫酸镁0.1％，酵母提取物0.1％，碳酸钙0.5％，3ml TMS-1(1LTMS-1包括5g七水硫酸亚铁，390mg五水硫酸铜，440mg七水硫酸锌，150mg一水硫酸锰，11mg一水钼酸钠，20mg二水氯化铜，50ml 37％盐酸)pH7.5(Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)；较佳的为按一升计含有以下配比的发酵培养基：玉米淀粉3％～5％，葡萄糖0.5％～1％，蔗糖1％～2％，黄豆饼粉3％～4％，鱼粉蛋白胨1％～1.5％，干酪素0.4％～0.5％，L-缬氨酸0.1％～0.12％，碳酸钙0.4％～0.6％，pH7.0，百分比为各成分占发酵培养基总量的质量百分比。发酵培养基配置好后，采用本领域常规使用的方法高温灭菌，较佳的方式为121℃，30min。
本发明中，所述的发酵培养的接种量为本领域常规使用，较佳的为5％～10％。所述的发酵培养中的培养条件为本领域常规所用，一般发酵至菌丝开始自溶时停止，较佳的为26℃～28℃下培养192h～240h。在所述的发酵培养的培养过程中，较佳的，搅拌转速为200rpm～300rpm，罐压0.02MPa～0.05MPa，通气比1∶1～1∶1.2V/V·min，V/V·min是指每分钟通过单位体积培养液的空气体积比。
本发明中，所述的A40926的发酵工艺较佳的还包括种子培养的步骤，将产A40926的菌种种子接种到种子培养基中，进行种子培养。所述的产A40926的菌种种子可以使用本领域常规方法保藏的种子，较佳的是2个月平板保存的种子或者长期保存的低温冷冻甘油管种子(-20℃～-80℃)。
其中，所述的种子培养基可以使本领域常规使用的液体培养基，可为每升中包含葡萄糖4.5％，硫酸铵0.83％，磷酸二氢钾0.15％，七水硫酸镁0.1％，酵母提取物0.1％，碳酸钙0.5％，3ml TMS-1(1L TMS-1包括5g七水硫酸亚铁，390mg五水硫酸铜，440mg七水硫酸锌，150mg一水硫酸锰，11mg一水钼酸钠，20mg二水氯化铜，50ml 37％盐酸)pH7.5(Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)，较佳的为一升计含有以下配比的种子培养基：牛肉膏0.3％～0.5％，干酪素0.2％～0.6％，燕麦粉2％～4％，碳酸钙0.2％～0.5％，pH7.0。
其中，所述的种子培养较佳的为二级种子培养。所述的种子培养的接种量为本领域常规用量，较佳的为5％～10％，更佳的为5％。所述的种子培养的培养条件较佳的为：一级种子培养，在30℃培养72h～80h，摇床转速240rpm；二级种子培养，在28℃培养72h，转速240rpm。
本发明所用试剂和原料除特殊说明外均市售可得。
在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征的优选条件可以任意组合得到本发明较佳实例。
本发明的积极进步效果在于：本发明的A40926的发酵工艺发酵水平高、操作简单、成本低、能够大规模生产，最高A40926可生产720mg/L比文献报道的最高产量220u/ml(即220mg/L)提高了227％。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
将斜面平板保存的种子野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.sp ATCC 39727)接种入摇瓶一级种子培养基：牛肉膏0.3％，干酪素0.5％，燕麦粉3％，碳酸钙0.4％，pH7.0，在30℃培养72h，摇床转速240rpm；按5％接种量接入摇瓶二级种子培养基(同一级种子培养基)，在28℃下，旋转摇床培养72h，摇床转速240rpm。
之后，按照8％接种量接种于50L发酵罐中进行发酵，实际装液量28L，以26℃培养226h。其中，搅拌转速为200rpm，罐压0.02MPa，通气比1∶1V/V·min。
发酵培养基按照常规方法配制，每升中包含葡萄糖4.5％，硫酸铵0.83％，磷酸二氢钾0.15％，七水硫酸镁0.1％，酵母提取物0.1％，碳酸钙0.5％，3mlTMS-1(1L TMS-1包括5g七水硫酸亚铁，390mg五水硫酸铜，440mg七水硫酸锌，150mg一水硫酸锰，11mg一水钼酸钠，20mg二水氯化铜，50ml 37％盐酸)pH7.5(Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)。
当发酵进行到72h时开始流加含有葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料控制葡萄糖0.8％，鱼粉蛋白胨0.5％，L-缬氨酸0.08％，混合料体积为发酵罐实际装液质量12％，流加速率0.8g/L.h，发酵226h。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度(该检测方法记载于，Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)，其中，A40926发酵单位为110mg/L。
与本实施例同时准备一对比实验，其余条件同上述进行二级种类培养以及发酵罐的发酵培养，区别仅在于发酵过程不流加葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度，A40926发酵单位为25mg/L。
实施例2
将斜面平板保存的种子野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.sp ATCC 39727)接种入摇瓶一级种子培养基：牛肉膏0.4％，干酪素0.2％，燕麦粉2％，碳酸钙0.2％，pH7.0，在30℃培养75h，摇床转速240rpm；按5％接种量接入摇瓶二级种子培养基(同一级种子培养基)，在28℃下，旋转摇床培养72h，摇床转速240rpm。
之后，按照6％接种量接种于50L发酵罐中进行发酵，实际装液量28L，以28℃培养215h。其中，搅拌转速为240rpm，罐压0.03MPa，通气比1∶1.2V/V·min。
发酵培养基按照常规方法配制，每升中包含玉米淀粉3％，葡萄糖0.5％，蔗糖1％，黄豆饼粉3％，鱼粉蛋白胨1.5％，干酪素0.4％，L-缬氨酸0.1％，碳酸钙0.4％，pH7.0。当发酵进行到80h时开始流加含有葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料控制葡萄糖0.9％，鱼粉蛋白胨0.4％，L-缬氨酸0.1％，混合料体积为发酵罐实际装液质量12％，流加速率0.9g/L.h。发酵215h通过HPLC监测发酵液中A40926浓度(该检测方法记载于，Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)，其中，A40926发酵单位为380mg/L。
与本实施例同时准备一对比实验，其余条件同上述进行二级种类培养以及发酵罐的发酵培养，区别仅在于发酵过程不流加葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度，A40926发酵单位为320mg/L。
实施例3
将斜面平板保存的种子野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.sp ATCC 39727)接种入摇瓶一级种子培养基：牛肉膏0.5％，干酪素0.5％，燕麦粉4％，碳酸钙0.5％，pH7.0，在30℃培养75h，摇床转速240rpm；按5％接种量接入摇瓶二级种子培养基(同一级种子培养基)，在28℃下，旋转摇床培养72h，摇床转速240rpm。
按照8％接种量接种于50L发酵罐中进行发酵，实际装液量28L。27℃培养218h。搅拌转速为250rpm，罐压0.05MPaMPa，通气比1∶1V/V·min
发酵培养基按照常规方法配制，每升中包含玉米淀粉5％，葡萄糖0.75％，蔗糖1.5％，黄豆饼粉3.5％，鱼粉蛋白胨1.25％，干酪素0.45％，L-缬氨酸0.11％，碳酸钙0.5％，pH7.0。当发酵进行到82h时开始流加含有葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料控制葡萄糖1.0％，鱼粉蛋白胨0.5％，L-缬氨酸0.12％，混合料体积为发酵罐实际装液质量12％，流加速率1.0g/L.h。发酵218h通过HPLC监测发酵液中A40926浓度。A40926发酵单位为461mg/L。
与本实施例同时准备一对比实验，其余条件同上述进行二级种类培养以及发酵罐的发酵培养，区别仅在于发酵过程不流加葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度，A40926发酵单位为332mg/L。
实施例4
将斜面平板保存的种子野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.sp ATCC 39727)接种入摇瓶一级种子培养基：牛肉膏0.3％，干酪素0.2％，燕麦粉2％，碳酸钙0.2％，pH7.0，在30℃培养75h，摇床转速240rpm；按5％接种量接入摇瓶二级种子培养基(同一级种子培养基)，在28℃下，旋转摇床培养72h，摇床转速240rpm。
之后，按照6％接种量接种于50L发酵罐中进行发酵，实际装液量28L，以26℃培养215h。其中，搅拌转速为300rpm，罐压0.02MPa，通气比1∶1V/V·min。
发酵培养基按照常规方法配制，每升中包含玉米淀粉3％，葡萄糖0.5％，蔗糖1％，黄豆饼粉4％，鱼粉蛋白胨1.5％，干酪素0.5％，L-缬氨酸0.1％，碳酸钙0.4％，pH7.0。当发酵进行到88h时开始流加含有葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料控制葡萄糖0.8％，鱼粉蛋白胨0.6％，L-缬氨酸0.10％，混合料体积为发酵罐实际装液质量12％，流加速率1.1g/L.h。发酵215h通过HPLC监测发酵液中A40926浓度(该检测方法记载于，Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)，其中，A40926发酵单位为610mg/L。
与本实施例同时准备一对比实验，其余条件同上述进行二级种类培养以及发酵罐的发酵培养，区别仅在于发酵过程不流加葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度，A40926发酵单位为345mg/L。
实施例5
将斜面平板保存的种子野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.sp ATCC 39727)接种入摇瓶一级种子培养基：牛肉膏0.5％，干酪素0.3％，燕麦粉3％，碳酸钙0.4％，pH7.0，在30℃培养75h，摇床转速240rpm；按5％接种量接入摇瓶二级种子培养基(同一级种子培养基)，在28℃下，旋转摇床培养72h，摇床转速240rpm。
之后，按照5％接种量接种于50L发酵罐中进行发酵，实际装液量28L，以26℃培养240h。其中，搅拌转速为240rpm，罐压0.05MPa，通气比1∶1V/V·min。
发酵培养基按照常规方法配制，每升中包含玉米淀粉4％，葡萄糖1％，蔗糖2％，黄豆饼粉3％，鱼粉蛋白胨1％，干酪素0.4％，L-缬氨酸0.12％，碳酸钙0.6％，pH7.0。当发酵进行到96h时开始流加含有葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料控制葡萄糖1.0％，鱼粉蛋白胨0.5％，L-缬氨酸0.12％，混合料体积为发酵罐实际装液质量12％，流加速率1.1g/L.h。发酵240h，通过HPLC监测发酵液中A40926浓度(该检测方法记载于，MicrobiolBiotechnol，2003，30：150-156)，其中，A40926发酵单位为720mg/L。
与本实施例同时准备一对比实验，其余条件同上述进行二级种类培养以及发酵罐的发酵培养，区别仅在于发酵过程不流加葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度，A40926发酵单位为366mg/L。
实施例6
将斜面平板保存的种子野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.sp ATCC 39727)接种入摇瓶一级种子培养基：牛肉膏0.4％，干酪素0.6％，燕麦粉4％，碳酸钙0.5％，pH7.0，在30℃培养75h，摇床转速240rpm；按5％接种量接入摇瓶二级种子培养基(同一级种子培养基)，在28℃下，旋转摇床培养72h，摇床转速240rpm。
之后，按照10％接种量接种于50L发酵罐中进行发酵，实际装液量28L，以26℃培养220h。其中，搅拌转速为220rpm，罐压0.05MPa，通气比1∶1.2V/V·min。
发酵培养基按照常规方法配制：玉米淀粉4％，葡萄糖0.5％，蔗糖1.5％，黄豆饼粉4％，鱼粉蛋白胨1％，干酪素0.5％，L-缬氨酸0.12％，碳酸钙0.5％，pH7.0。当发酵进行到104h时开始流加含有葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料控制葡萄糖1.0％，鱼粉蛋白胨0.5％，L-缬氨酸0.1％，混合料体积为发酵罐实际装液质量12％，流加速率1.2g/L.h。发酵220h。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度(该检测方法记载于，Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)，其中，A40926发酵单位为650mg/L。
与本实施例同时准备一对比实验，其余条件同上述进行二级种类培养以及发酵罐的发酵培养，区别仅在于发酵过程不流加葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度，A40926发酵单位为350mg/L。
实施例7
将斜面平板保存的种子野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.sp ATCC 39727)接种入摇瓶一级种子培养基：牛肉膏0.4％，干酪素0.2％，燕麦粉3％，碳酸钙0.3％，pH7.0，在30℃培养75h，摇床转速240rpm；按5％接种量接入摇瓶二级种子培养基(同一级种子培养基)，在28℃下，旋转摇床培养72h，摇床转速240rpm。
之后，按照8％接种量接种于50L发酵罐中进行发酵，实际装液量28L，以26℃培养210h。其中，搅拌转速为240rpm，罐压0.03MPa，通气比1∶1V/V·min。
发酵培养基按照常规方法配制，玉米淀粉4％，葡萄糖0.6％，蔗糖1.0％，黄豆饼粉3.0％，鱼粉蛋白胨1.5％，干酪素0.5％，L-缬氨酸0.11％，碳酸钙0.6％，pH7.0。当发酵进行到112h时开始流加含有葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料控制葡萄糖0.5％，鱼粉蛋白胨0.3％，L-缬氨酸0.1％，混合料体积为发酵罐实际装液质量12％，流加速率1.3g/L.h。发酵210h。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度(该检测方法记载于，Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)，其中，A40926发酵单位为550mg/L。
与本实施例同时准备一对比实验，其余条件同上述进行二级种类培养以及发酵罐的发酵培养，区别仅在于发酵过程不流加葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料。通过HPLC监测发酵液中A40926浓度，A40926发酵单位为355mg/L。
实施例8
同实施例5各条件，本实施例区别仅在于当发酵进行到96h时开始流加含有葡萄糖，鱼粉蛋白胨，L-缬氨酸的混合料控制葡萄糖1.2％，鱼粉蛋白胨0.8％，L-缬氨酸0.02％，发酵240h，通过HPLC监测发酵液中A40926浓度(该检测方法记载于，Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)，其中，A40926发酵单位为500mg/L。
将上述各实施例1-7和相应对比例的实验数据统计至下表1中，进-步进行对比，结果如下所示。
表1本发明实施例及对比例在50L发酵罐上的试验结果
从上表可以看出，在50L发酵罐上实验，发酵中期(96h)左右流加含有葡萄糖1.0％，鱼粉蛋白胨0.5％，L-缬氨酸0.12％的混合料，混合料体积为发酵罐实际装液质量12％，流加速率1.1g/L.h，发酵单位与不补加混合溶液相比提高了96.7％(该检测方法记载于，Microbiol Biotechnol，2003，30：150-156)。
Claims (11)
1.一种A40926的发酵工艺，所述的发酵工艺在发酵罐中进行，其特征在于：其包括如下步骤：将产A40926的菌种接种到发酵培养基中进行发酵培养，其中，所述的发酵培养在培养至72h～112h，流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液控制葡萄糖0.5％～1.2％，蛋白胨0.3％～0.8％，L-缬氨酸0.05％～0.12％，百分比为各成分占发酵培养基总量的质量百分比。
2.如权利要求1所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的产A40926的菌种为野野村氏菌属放线菌(Nonomuraea.sp)ATCC 39727；所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液步骤中，发酵培养至88h～104h。
3.如权利要求1所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液步骤中，发酵培养至96h。
4.如权利要求1所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液步骤中，控制葡萄糖0.8％～1.0％，蛋白胨0.4％～0.6％，L-缬氨酸0.08％～0.12％；所述的蛋白胨为鱼粉蛋白胨。
5.如权利要求1所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的发酵罐为50L不锈钢罐；所述的葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的用量分别为发酵罐实际装液质量的1％，0.5％和0.1％，发酵罐中溶液总体积为发酵罐实际装液质量12％，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液的流加速率为0.8g/L.h～1.3g/L.h。
6.如权利要求1所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的发酵培养基为按一升计含有以下配比的发酵培养基：玉米淀粉3％～5％，葡萄糖0.5％～1％，蔗糖1％～2％，黄豆饼粉3％～4％，鱼粉蛋白胨1％～1.5％，干酪素0.4％～0.5％，L-缬氨酸0.1％～0.12％，碳酸钙0.4％～0.6％，pH 7.0，百分比为各成分占发酵培养基总量的质量百分比。
7.如权利要求1所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的发酵培养的接种量为5％～10％；所述的发酵培养中的培养条件为26℃～28℃下培养192h～240h；在所述的发酵培养的培养过程中，搅拌转速为200rpm～300rpm，罐压0.02MPa～0.05MPa，通气比1:1～1:1.2V/V·min。
8.如权利要求1所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的A40926的发酵工艺还包括种子培养的步骤，将产A40926的菌种种子接种到种子培养基中，进行种子培养。
9.如权利要求8所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的发酵培养基为按一升计含有以下配比的种子培养基：牛肉膏0.3％～0.5％，干酪素0.2％～0.6％，燕麦粉2％～4％，碳酸钙0.2％～0.5％，pH 7.0。
10.如权利要求8所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的种子培养为二级种子培养；所述的种子培养的接种量为5％～10％。
11.如权利要求10所述的A40926的发酵工艺，其特征在于：所述的二级种种子培养的培养条件为：一级种子培养，在30℃培养72h～80h，摇床转速240rpm；二级种子培养，在28℃培养72h，转速240rpm。
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