CN85107903A - 生产抗生素a40926复合物及其纯因子pa.pb.a.b.及b0的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类新抗生素，称作抗生素A40926复合物和其因子A，B，B₀，PA及PB。用培养新的Actinomadura sp ATCC39727菌或其生产A40926的变种或突变体从而生产它们的方法，用这些新抗生素治疗传染病及致病微生物。本发明的抗生素属于能够结合酰基-D-丙氨酰-D-丙氨酸的万谷霉素抗生素类的糖肽类物质。

Description

本发明是有关一类新的抗生素物质，即被定名为抗生素A40926的复合物及其因子，即抗生素A40926因子A，抗生素A40926因子B，抗生素A40926因子B₀，抗生素A40926因子PA和抗生素A40926因子PB，本发明还涉及培养新的菌，即Actinomadura sp ATCC39727或其所产生的能产生A40926的变种或突变体从而产生上述物质的方法，还涉及使用这些新的抗生素物质治疗传染病及处理病菌。

本发明的抗生素物质属于万谷霉素（vanconycin）类抗生素，其具有结合酰基-D-丙氨酰基-D-丙氨酸的能力。

抗生素A40926复合物和其因子，如抗生素A40926因子A，因子B，因子B₀，因子PA和因子PB，均可用已知的技术形成相应的盐。

在本说明书和权利要求书中，“抗生素A40926”这一术语代表了选自抗生素A40926复合物，抗生素A40926因子A，抗生素A40926因子B，抗生素A40926因子B₀，抗生素A40926因子PA和抗生素A40926因子PB及它们的盐或任选的混合物中的一种化合物。术语“抗生素A40926复合物”，“抗生素A40926因子PA”，“抗生素A40926因子PB”，“抗生素A40926因子A”，抗生素A40926因子B”，抗生素A40926因子B₀，在涉及生物学性质时，包括相应的药理上可接受的盐。

抗生素A40926是由培养分离自土壤的Actinomadura 品系菌而产生的，该菌种已在1984年6月8日按布达佩斯条约储存于美国样板培养物收集中心〔American    Type    Culture    Collection（ATCC）-12301    Parklann    Drive，Rookville，Maryland    20852，U、S、A〕。该品系的储存号为ATCC39727。

该品系最初被认为属于链霉菌属并被定名为Slreptomyces    nov    sp    A40926，其在ATCC的储存号为39727。后经进一步研究，特别是对细胞壁组合的研究，使我们得出它是属于Actinomy属的结论。因此，最初储存的品系Streptomyces    sp，ATCC就被重新命名为Actinomadura    sp，ATCC    39727。

抗生素A40926复合物，抗生素A40926因子A，因子B，因子B₀，因子PA，因子PB，是由培养能生产它们的Actinomadura sp菌，即Actinomadura sp ATCC 39727品系或其能产生抗生素A40926的变种或突变体而生产的，即在含有可同化的碳源，氮源，无机盐的液体营养基中于厌氧条件下进行培养，发酵工业中许多常用的营养培养基均可应用，但有些是优选的，优选的碳源是葡萄糖，甘露糖，羊乳糖，淀粉，玉米粉等等。优选的氮源是氨，硝酸盐，大豆油，胨肉膏，酵母膏，胰胨，氨基酸等等。优选的能配入培养基的无机盐是那些能够产生钠、钾、铁、锌、钴、镁、钙、铵、氯、碳酸根，硫酸根，磷酸根，硝酸根等离子的常规的可溶性盐。

开始，将抗生素生产菌在瓶中预培养，然后用该培养基接种发酵罐以生产大量的抗生素物质，预培养的培养基可与大罐中的培养基 相同，但也可使用其它的培养基。抗生素A40926生产菌可以在20-40℃生长，在以24-35℃为好。在发酵期间，抗生素的生产可用诸如生物检测或TLC或HPLC方法对培养液或菌丝体提取物样品的抗生素活性试验来监测。

对抗生素A40926敏感的有机体，诸如抗草杆菌（Bacillus    sabtilis）和金黄色链霉菌（S.aureus）等可用作试验生物。生物检测可用在琼脂板上的琼脂扩散法来完成。抗生素活性的最大生产量一般在发酵的第二天至第十五天之间。

抗生素A40926是用培养Actinomadura    sp    ATCC    39727菌，或其生产抗生素A40926的变种或突变体而生产的，且它要存在于培养液中。

以下描述的是Actinomadura    sp，A40926    ATCC    39727的特征。

宏观和微观的检验

无性菌丝体包括曲折的和分技的菌丝（直径大约为0.8微米），其在某些培养基中（在表1中用星号标出）经几天生长后有形成棒状体的倾向，而在葡萄糖一天冬酰胺培养基中则变成球状体。

本品系的特征是在某些培养基中其营养为深酒红色（Burgundy    eolor）。

只在少数培养基中有气生菌丝存在，特别是在表1中所列的培养基中，只在燕麦粉琼脂和土壤琼脂（soil    agar）中存在。在这些培养基中，气生菌丝为灰色，形成排列为钓状的球形托（sphorophore）并形成10-20个孢子的小螺旋。

孢子为圆柱形，平均大小为0.8×1.2微米。

生长特征的鉴定

为了检查生长特征，将Actinomadura    sp    ATCC    39727菌在Shirling和Gottlieb所推荐的各种培养基（shirling    BB    and    Gottlieb    D，1966-Method    for    characterization    of    Streptomyces    species-Inf，J.Syst.Bacteriol，16    313-340）和另外一些由Waksman所推荐的培养基上（Waksman，S.A    1961-The    Actinomycetes-The    Williams    and    Wilkins    Co，Baltimore，Vol.2，328-334）进行培养

当需要时，可用Maerz和Paul的方法（Maerz    A    and    M.Rea    Paul，1950-A    Dictionary    of    Color-2nd    Edition    Mcavaw-Hill    Book    Company    Inc.New    ork）进行颜色检定。

有机体利用不同碳源的能力是由Shirling和Gottlieb所描述的方法进行测定的。

培养特性和生理学特性以及对碳源的利用列于表Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ。

表Ⅰ中的结果取自在28℃培养2周后。

表Ⅰ

Actinomadua    sp，ATCC    39727品系的培养特征

培养基    特征

2号培养基    生长丰富，表面粗糙8/L/8，

（酵母膏-麦芽琼脂）    微量琥珀-粉红可溶性色素

3号培养基    生长丰富，表面平滑，紫色55/E/4，

燕麦粉琼脂    气生菌丝近灰色，紫色可溶性色素55/H/4，

4号培养基    生长良好，表面平滑而薄，奶油色

（无机盐-淀粉琼脂）    10/D/2

5号培养基    生长良好，表面平滑而薄，杏色

（甘油-天冬酰

琼脂） 10/B/2

6号培养基^＊生长良好，表面稍微粗糙

（胨-酵母膏铁琼脂）    琥珀色    12/D/9

7号培养基    生长丰富，表面光滑且薄，

（酪氨酸琼脂）    琥珀-棕色    13/K/12

燕麦粉琼脂^＊生长丰富，表面光滑，深酒红色8/L/7

有气生菌丝，中度亮黄-灰色44/B/2

Hickey和Tresner的    生长丰富，表面皱，

琼脂    琥珀-棕色    13/K/12

Czapeck葡萄糖琼脂    生长良好，表面平滑，亮黄色9/I/3

葡萄糖天冬酰胺琼脂^＊生长差，乳色表面，稻草黄 9/E/I

营养琼脂    生长丰富，表面皱，亮桔黄色11/C/7

马玲薯琼脂^＊生长丰富，表面皱，深酒红色8/L/9

Bennetts琼脂^＊生长丰富，表面粗糙，深酒红色8/L/8

深琥珀玫瑰可溶性色素5/J/10

苹果酸钙琼脂    生长良好，表面平滑，杏色10/B/3

去奶油的牛奶琼脂    生长丰富，表面微皱，橙色9/B/9

Capeck蔗糖琼脂    生长丰富，表面光滑，杏色10/B/6

蛋清琼脂    生长丰富，表面平滑，玫瑰色52/B/3

微量可溶性性色素，玫瑰色52/B/3

Sabouraud琼脂    不生长

土壤琼脂    生长差，无色，气生菌丝灰白色

右旋糖胰胨琼脂^＊生长良好，表面平滑且薄，亮黄色10/G/2

马玲薯块    生长良好，橙棕色，灰白色气生菌丝少量。

生理学特征

表Ⅱ

生理学特征

试验

淀粉水解    阴性

H₂S的形成 在6号培养基上的为阴性

用醋酸铅试纸阳性

酪氨酸反应    阳性

酪蛋白水解    阳性

苹果酸钙水解    阴性

明胶液化    阳性

石蕊牛乳凝固    阴性

石蕊牛乳胨化    阳性

纤维素分解    阴性

硝酸盐降解    阳性

碳源的利用

表Ⅲ

碳的利用

碳源    生长

阿拉伯糖    +

木糖    +

甘露糖    +

果糖    +

棉子糖    +

鼠李糖    +

乳糖    +

牛乳糖    +

环己六醇    -

蔗糖    +

纤维素    -

水杨    +

甘露醇    +

核糖    -

+＝生长

-＝不长

化学分析特征

细胞壁分析：

对细胞壁中存在着的氨基酸的分析，采用Becker等人的著作中所描述的方法，见“Rapid    differentation    between    Nocardia    and    Streptomyces    by    paper    chromatography    of    whole    cell    hydrolysis”，APPL    Microbiol，12，421-423（1964）。全部细胞壁的水解分析揭示了内消旋-二氨基庚二酸的存在。对用Kawamoto等人（I，Kawamoto，T    oka，and    T.Nara，”Cellwall    composition    of    Micromonospora    olivoasterospora    Micromonospora    sagamiensis，and    related    organism”，J，of    Bacteriologg    146，527-534，1981）的方法所获得的纯细胞壁的分析表明不存在甘氨酸。

糖类分析：

对糖成分的分析，系用M.P.Lechevalier的方法，见“Identification    of    aerobic    actinomycetes    of    clinical    importance”，J，Lab.Clin.Med.71，934-944（1968），使用J.L.Staneck和G.DRoberts所描述的纤维素片薄层层析，见“Simplified    approach    to    identification    of    aerobic    actinomicetes    by    thinlayer    chromatography”，28，226-231（1974），溶剂系统如下：乙酸乙脂-吡啶-水（体积比为100∶35∶25）。所得结果表明主要存在着葡萄糖和核糖，同时也检测到有少量的半乳糖 甘露糖和madurose（3-O-甲基-D-半乳糖）。

分支枝菌酸：

分枝菌酸的存在是按Minnikin等人的方法（D，E，Minnikin    L，Alshamaony    and    M，Goodfellow，“Differentation    of    Mycobacterium，Nocardia    and    related    taxa    by    thin    layer，Chromatography    analysis    of    Goneral    Microbiology    88，200-204，1975）进行测定。

分析测定的结果是阴性的，没有发现分枝菌酸。

菌种的鉴定：

该品系被认为是属于Actinomycedes属Actinomadura，因为存在有内消旋-二氨基庚二酸和3-O-甲基-D-半乳糖，在粘肽中没有甘氨酸，没有分枝菌酸，以中等长度的孢子链形成气生菌丝。

与别的微生物相比，A40926生产的特征是易于产生变种的。例如，可用已知的突变剂，诸如紫外线，X-射线，高频波，放射性射线，化学试剂如亚硝酸，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍以及其他突变剂等进行处理而获得人工变种和突变体。所有属于Actinomadura属并生产A40926抗生素的天然及人工变种或突变体，均被认为是Actinomadura    sp，ATCC    39727品系的等同物，并被认为是属于本发明的范畴。从生产性微生物的发酵液中回收本发明中的抗生素物质，用的是已知的方法，包括用溶剂提取，加入非溶剂进行沉淀，改变溶液的PH值，分配层析等等。

优选的过程包括在固定化D-丙氨酰-D-丙氨酸上进行亲和层 析，接着进行反相柱层析。

适于本回收过程的固定化D-丙氨酰-D丙氨酸基质已于欧洲专利申请第83112555号中揭示了。在此过程中优选的基质是可控孔径交联聚葡聚糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸。

发酵液可在过滤后直接进行亲和层析，也可在初步提纯后进行。后一过程包括将全部发酵物质变为碱性，优选的PH为8.5～10.5，以溶解吸咐在菌丝上的抗生素物质，然后过滤，清亮的过滤液调PH至2.5-4.5，再用助滤剂过滤。弃去滤液，将滤饼浮悬于水中，调至碱性，优选PH值8～9，过滤。将滤饼再重复一次该过程，将含有抗生素A40926的滤液收集起来。

然后将这些滤液或已过滤的发酵液在固定化D-丙氨酰-丙氨酸上进行亲和层析，整体或分批进行。

抗生素物质与亲和基质的结合优选在PH值约为7.0～8.0进行，用碱液于PH值更偏碱性（优选PH9.0～10.5）时进行洗脱。碱液可以是氨，挥发性胺，碱或碱金属氢氧化物，碱性缓冲液，其中可选择性的存在着有机溶剂，如以下所定义的可与水混溶的极性溶剂。

当用PH4-8的缓冲液（其中可选择性地含有盐和（或）可与水溶混的溶剂）洗柱去除杂质后，用上述混合洗脱液洗脱抗生素A40926。然后回收粗抗生物物质，优选的方法是将所收集的含有抗生素的部分与能够同水形成最小共沸混合物的有机溶剂共沸蒸溜除去水相，然后再加入非溶剂性物质沉淀出所需产物。

与水可形成最小共沸混合物的有机溶剂举例有正丁醇，苯，甲苯，丁醚，四氯化碳，氯仿，环己烷，2.5-二甲基呋喃，己烷和m- xilene;优选的溶剂为正丁醇。

非溶剂性物质举例有：石油醚，低级烷基醚，如乙醚，丙醚和丁醚，低级酮，如丙酮。另外所收集的含抗生素的部分浓缩至较小的体积，优选的方法是与上述的有机溶剂共沸蒸馏，再将所获得的液体冷冻干燥。

如果在洗脱时所用的碱液不是挥发性的，则有必要在沉淀或冻干前，先将浓缩物调中性或脱盐。

一种方便的脱盐方法是将含抗生素物质的水溶液过硅烷化的硅胶柱，用蒸馏水洗，用可与水溶混的极性溶剂同水的混合物洗脱。

极性的可与水溶混的溶剂举例有：可溶于水醇（如甲醇，乙醇，异丙醇，正丁醇），丙酮，乙腈，低级烷基链烷酸脂（如乙酸乙脂），四氢呋喃，二噁烷和二甲基甲酰胺以及其混合物;

优选的可与水溶混的极性溶剂是乙腈。

此外，也可使含抗生素的溶液在上述的亲和柱上脱盐，用蒸馏水洗，用上述亲和层析的挥发性碱液进行洗脱。这样获得的产品是抗生素A40926复合物。当需要时，还可进一步纯化或分成其因子A，B，B₀，PA和PB各部分。

获取纯抗生素A40926复合物的便易方法是将如上所获的复合物在亲和层析柱上进一步纯化。通常使用上述的固气相（D-丙氨酰-D-丙氨酸），用上述在固定化D-丙氨酰-D-丙氨酸上进行亲和层析的各步骤洗脱所需的抗生素物质。优选的固定化D-丙氨酰-D-丙氨酸是琼脂糖-ε-氨基己酰基-D-丙氨酰-D-丙氨酸，优选的平衡混合物是含有2MNaCl的0.16%（W/V）的氨且调至PH为7-8，优选的洗液是含2MNaCl的0.16% （W/V）的氨且调PH至8-9.5，优选的洗脱混合物是含2MNaCl的0.16%（W/V）的氨且调PH至10.5-12最为优选的洗脱混合物是被调PH至11.5的上述洗脱混合物。

抗生素A40926各因子，即抗生素A40926因子A，抗生素A40926因子B，抗生素A40926因子B₀，抗生素A40926因子PA和抗生素A40926因子PB，是由抗生素A40926复合物水溶液用柱层析分离出来的，优选的是反相柱层析。在反相柱层析中优选的稳定相是硅烷化硅股。然而，在非功能化的聚苯乙烯和丙烯酸脂类树脂，如其商品名为Amberlite XAD-2，XAD-4 XAD-7和XAD-8（Rohm and Haas）或Daion PH20（Mitsubishi）的树脂上进行柱层析也能获得很好的结果。当反相提纯这一步是用硅烷化硅胶作为稳定相而完成时，则该柱应使用PH为4-9的缓冲水溶液预平衡为好，而以PH为5.5～6.5为更好，然后用线性梯度含有可与水溶混的极性溶剂的同样缓冲溶液洗脱。可与水溶混的极性溶混的极性溶剂举例有：可溶于水的醇类（如甲醇，乙醇，异丙醇，正丁醇），丙酮，乙腈，四氢呋喃，二噁烷和二甲基甲酰胺及其混合物，优选的可与水溶混的极性溶剂是乙。

由常规的生物检测法在可用的微生物上对洗脱的各部分测定其抗生素含量，如纸盘法（paper-disc）或琼脂扩散法（agar-diffusien）。这类有机体举例如Bacills    snbtilis，S.aureus。

一般还可用TLC或HPLC技术监测层析。

优选的高频液相层析（HPLC）技术可举例的有，反相HPLC， 使用直径最好为5微米的多孔或环状的并以C-18烷基功能化的硅烷化硅胶柱（如5微米ultrasphere（R）ODS    Altexi    Becmancc），一个用C-18烷基功能化的硅胶预备性柱（如RP18    Brownlee    Labs），洗脱液是可与水溶混的极性溶剂的线性梯度混合物，如上述中的一种，并存在于缓冲水液中。

优选的是将此溶液调至PH5～7。最为优选的洗脱液是洗脱液B在洗脱液A中的由5-6%所代表的线性梯度，其中洗脱液A是PH5-7，乙腈/缓冲液为10∶90的混合物。正如已知的那样，许多物质均可作为内部标准。在此，很便利的一种是Teicoplanin A₂组分工（GTVUPPO Lepetit S.P.A），其滞留时间与本发明化合物在此HPLC系统中的滞留时间接近。这种标准物质是已知的，并已在英国专利申请2121401号（GB-A-2121401）中揭示了。收集具有类似抗生素含量的各部分并按上述脱盐，得到基本纯净的抗生素A40926因子A，因子B，因子Bo，因子PA和因子PB。

基本纯净的抗生素A40926因子A，抗生素A40926因子B，抗生素A40926因子B₀，抗生素A40926因子PA，和抗生素A40926因子PB均可由含有它们的各组分中用各种已知技术获取，如冷冻干燥，加入非溶剂物进行沉淀，或改变溶液的PH值进行沉淀。

一种便易的方法是加入能与水形成共沸混合物的溶剂，用共沸蒸馏除去水，在加入类似上述的非溶剂性物质后所获的沉淀用过滤收集。

抗生素A40926因子PA和PB，至少在某些发酵条件下是抗生素A40926生产性微生物主要抗生素产物。抗生素A40926 因子A和B分别是抗生素40926因子PA和PB的主要转化产物，并且经常是已存在于发酵液中。

事实上已经发现的是在碱性条件下抗生素A40926因子PA可以转化为抗生素A40926因子A，而抗生素A40926因子PB可以转化为抗生素A40926因子B。例如，用0.5-10%氨溶液或其他亲核性碱，诸如有机胺，在室温下处理8-24小时，抗生素A40926因子PA和抗生素40926因子PB就可以分别转化为抗生素A40926因子A和因子B。

结果，当发酵液或含有抗生素40926的浸出物或其浓缩物在碱性条件下放置一般时间后（即亲核性碱水溶液，PH＞9过夜），所获的抗生素A40926复合物就主要含有抗生素A40926因子A和因子B。如果发酵液或其浸出物或浓缩物暴露于碱性条件下很短，则所获得的抗生素A40926复合物就富含抗生素40926因子PA和因子PB。

一种优选的获取富含抗生素A40926因子A和因子B的抗生素40926复合物的方法，包括将抗生素复合物的溶液（其中主要含有抗生素A40926因子PA和PB）在亲核性碱水液中，如氨水中于室温下放置8-12小时，然后按以上所述分离抗生素复合物。

含抗生素A40926的溶液举例有发酵液，浸出物及亲和层析的洗脱部分。

纯抗生素A40926可按上述用亲和层析对粗复合物进一步提纯而获取。

如此获取的具有可由其纯因子衍生来的生物学及物理化学性质的 产物，在实施例中将被作为抗生素A40926复合物AB。

优选的使抗生素A40926复合物制剂中富含因子PA和PB的过程，包括用酸快速地使亲和层析的洗脱部分中性化，优先选用无机酸，如硫酸或盐酸。

从这种复合物中分离纯抗生素A40926因子PA和PB，可按上述之一的过程完成。

优选的过程包括反相液层析，优选的是在不锈钢柱中，选用中压（5-50）或高压（100-200）。固相可以是硅烷化硅胶并伴有2-18个碳原子（优选C18）的烃或苯基，洗脱液为上述的可与水溶混的极性溶剂与缓冲液的混合物，其PH值与树脂的相一致（优选PH4-8）。

按常规监测洗脱剂，收集具有同质抗生素成分的各部分，并按上述处理，分离出具有如下所述特征的纯化合物。

高级的HPLC分析表明，抗生素A40926因子B实际上是叫作因子B₀与因子B₁的混合物。

抗生素A40926因子B₀，其在抗生素A40926因子B中约占90%，是这样的因子，在其以下所述的系统中相对于Teicoplanin A₂组合2的R+为1.22，见因子B的理化特征D项，因子B₁占抗生素A40926因子B的大约10%，在其同样的系统中的相对R+为1.27。

对抗生素A40926因子B进一步提纯可获取抗生素A40926因子B₀纯品，例如重复进行分离所用的反相层析过程。

抗生素A40926因子B₀的理化及生物学性质基本上与抗生素A40926因子B的相同，只是在如上所述的系统中的HPLC 分析时，仅有一个峰（在所述的HPLC系统中相对于Teicoplanin A₂组分2的R+为1.22）。

由于以上所指出的抗生素A40926因子B和抗生素A40926因子B₀的相似之处，则在本说明书和权利要求书中，抗生素A40926因子B的生物学性质也就被理解为抗生素A40926因子B₀的生物学性质，因子B₀是抗生素A40926因子B的主要成分（约占90%），并主要决定其生物学性质。

此外，本发明的抗生素物质可以从发酵液中分离，或用强的或弱的阴离子树脂进一步提纯，树脂包括功能化的聚苯乙烯，丙烯酸脂基质或聚葡聚糖基质。弱阴离子交换树脂举例有按以下商品名出售的树脂：Dowex    MWA-1或WGR（Dow    Chenical），Amberlite    IRA-73（Rohm    and    Haas），DEAE-Sephadex（Pharmacia）。根据本发明可用的强阴离子交换树脂举例有按以下商品名出售的树脂：Dowex    MSA-1，SBR，SBR-P（Dow    Chemical），Amberlite    IR-904（Rohm    and    Haas），QAE-Sephadex（Pharmacia）。

从这些树脂上洗脱本发明的抗生素，系采用电解质水溶液，如氢氯化钠或钾的混合物线性梯度，在水中，或在水与低级醇（例如C₁-C₄烷醇）或低级烷基酮（例如丙酮）等可与水溶混的有机溶剂中完成。

正如已经叙述的那样，本发明的抗生素物质具有酸和碱的功能，并能根据常规过程形成盐类。本发明的化合物的适宜且有代表性的酸加成盐，是用标准反应与有机或无机酸形成的盐，例如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，乙酸三氟乙酸，三氯乙酸，瑰珀酸，柠檬酸，抗坏血酸，乳酸，苹果酸，延胡索酸，棕榈酸，胆酸，pamoic    acid，粘酸，谷氨酸，樟脑酸，戊二酸，羟基乙酸，酞酸，酒石酸，月桂酸，硬脂酸，水杨酸，甲烷磺酸，苯磺酸，山梨酸，苦味酸，苯甲酸，肉桂酸等等。

可以举例的碱有：碱金属或碱土金属氢氧化物，如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钙;氨和有机胺，脂族胺，环脂族胺或芳族胺，如甲胺，二甲胺，三乙胺和甲基吡啶。

将本发明的游离氨基形式或非盐形式的化合物转化成相应的加成盐，或相反，将本发明化合物的加成盐转化成非盐或游离氨基形式，均属普通的技术并属本发明的范畴。

例如：将本发明化合物的非盐形式溶于水溶剂中，加入稍过量的所选择的酸或碱，使本发明的化合物转化成相应的酸或碱加成盐。能获得溶液或悬浮液再经冷冻干燥回收所需的盐。

当在一种溶剂中非盐形式可溶而最后的盐为不溶时，则回收是在加入等摩尔或稍过量的所选择的酸或碱之后，从非盐形式的有机溶液中将其过滤出的。在水溶剂中溶解相应的酸或碱盐，再调中性以放出非盐形式，就可制备非盐形式的化合物。当在调中性后需要脱盐，可使用常规的脱盐过程。例如可使用在硅烷化硅胶，非功能化聚苯乙烯，丙烯酸树脂和可控孔经聚葡聚糖树脂（例如Sephadex    LH20），或活性碳上进行柱层析。当用溶液洗脱了不需要的盐之后，对所需产物的洗脱可用水与极性或非极性有机溶剂的混合物的线性梯度或梯次梯度来完成，如乙腈/水从50∶50至乙腈称为100%。

正如本技术领域所知，与药理上可接受的酸（碱）或非药理上可 接受的酸（碱）形成盐的技术均可用作提纯技术。在其形成和分离之后，抗生素A40926的盐可转化成相应的非盐形式或药理上可接受的盐。

在某些情况下，本发明化合物的碱加盐在水和亲水性溶剂中更易溶解。

抗生素A40926因子A的理化特性

A）紫外吸收光谱，见附图1，表现出下述的最大吸收：

λ    max（nm）

a）0.1N    HCl    281

b）磷酸盐缓冲液PH7.38    281

300（肩峰）

c）0.1N氢氧化钠或氢氧化钾    300

d）甲醇    282

e）磷酸盐缓冲液    282

300（肩峰）

B）附图2中所示的红外吸收光谱表现出以下的最大吸收（cm^-1）

3700-3100，3100-2800（医药用润滑油），1655，1620-1560，1510，1480-1410（医药用润滑油），1375（医药用润滑油），1320-1250，1250-1190，1100-950，845，810，720（医药用润滑油）。

C）¹H-NMR波谱，见附图3，在DMSO d6，于270MHz处表现出以下各组信号（以ppm表示），

使用TMS作为内标准（0.00ppm），（δ＝ppm）：

δ0.86（+′S，6H）;1.21（～11H）;1.43（2H）：2.01（2H）;2.31-2.34（3H）;4-6.2（～16H）;6.2-8（～23H）;8.4;9.22，9.66（宽峰;动态质子）。

2.5-4：从H₂O峰来的干涉。

D）滞留时间（R+）相对于Teicoplanin A₂组分2（R+＝20.3分）为1.22，这是用反相HPLC在下述条件下测定的：

柱：Ultrasphere    ODS（5微米）Altek（Beackman）4.6毫米（i、d、）×250毫米。

预备柱：Brownlee    Labs    RP18（5微米）

洗脱：洗脱液B在洗脱液A中所占比率从5%～60%的线性梯度，40分钟。

流速：1.8毫升/分

紫外检测：254纳米

内标准：Teicoplanin A₂组分2（Grupo Lepetit S.p，A）

在相同的条件下，相对于睾酮（Roussel    Uclaf）的留时间为0.60。

E）元素分析，样品在140℃隋性气体（ΔW4.6%）先行条件下先行干燥，其各组分的百分比（平均）大约如下：

碳55.82%，氢5.17%，氮6.3%，氯（全部）4.24%，

氯（离子）0.37%，在空气中900℃的无机残留为1.2%。

F）酸碱滴定，2-甲氧基乙醇（MCS）：水为4∶1溶液中，在加入稍过量的HCl之后，用KOH滴定，表明4个可离子化的功能区具有的PK    MCS如下：

4.6，5.6，7.2，9.2。

G）Rf值为0.24，并且相对于Teicoplanin A₂组分2的Rf值为0.7，层析系统：

5%（W/V）Na₂SO₄液 70

乙腈    30

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck板（层厚0.25毫米）。

显色：

-紫外：光亮

-用Pauly试剂，即重氮化对氨基苯磺酸〔T，Chromatoy，20，171（1965），Z，Physiol，Chem.292，99，（1953）〕为黄色。

-在最小量Davis培养基上，用B，Subtilis    ATCC    6630生物自显影。

H）分子量（MW）为1716，从FAB-MS光谱推出，其在M+H 的峰为1717。

抗生素A40926因子B的理化特性

A）紫外吸收光谱见附图4，表现出以下的最大吸收：

λ    max    C

a）0.1NHCl    282

b）磷酸盐缓冲液PH7.38    281

300（肩峰）

c）0.1N氢氧化钾或氢氧化钠    300

d）磷酸盐缓冲液PH9.0    283

300（肩峰）

e）甲醇    282

B）红外吸收光谱见附图5，表现出下列最大吸收（cm^-1）：

3700-3080，3080-2700（医药用润滑油）;1375（医药用润滑油）;1295;1230;1210;1150;1100-1040;1030;1015;970;890;840;810;720（医药用润滑油）。

C）¹H-NMR见附图6，在270MH₂处表现出下列几组数据（以ppm表示），在DMSO d6中记录H-NMR。

使用TMS作为内标准（0.00ppm），（＝ppm）：

85（d，异丙基CH₃′S）;1.15（-13H），1.44（～2H）;2.02（2H）;2.32-2.35（3H）;4-6.1（～16）H）;6.1-8（～23H）;8.52，9.30，9.69（宽带，动态质子）。

2.5-4：从H₂O峰来的干涉。

D）滞留时间（R+）为1.22，相对于TeicoplaninA₂组分2的R+为1.27，用反相HPCC在下述条件下测定：

柱：Ultrasphere    ODS（5微米）Altex（Beckman）

4.6毫米（    ）×250毫米

预备柱：Brownlee    Labs    RP18（5微米）

洗脱：以洗脱液B在洗脱液A中占5%～60%的线性梯度，40分钟。

流速：1.8毫升/分

紫外检测：254纳米

内标准：Teicoplanin A₂组分2（Gruppo Lepetit S.P.A.）

E）元素分析，将样品在隋性气体（ΔW9.6%）

以140℃先行干燥，各组分的（平均）百分比大致如下：

碳54.09%，氢5.13%，氮6.34%;氯（全部）4.12%;氯（离子）0.39%;900  中无机残留为5%。

F）酸碱滴定，2-甲氧基乙醇（MCS）∶水为4∶1。

先加入稍过量的HCl（PH2.7）后，用KOH滴定，表明4个离子化功能区具有下述的pkmcs：4.5，5.6，7.2，9.2

G）Rf值为0.21，相对于Teicoplanin A₂组分2的Rf值为0.53，其色谱系统如下：

5%（W/V）NaSO₄液 70

乙腈    30

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck板（层厚0.25毫米）

显色：

-紫外，光亮

-Pauly试剂，黄色，即重氮化对氨基苯磺酸〔J.Chromotoy    20，171（1965），Z.Physiol    Chem.292，99，（1953）〕

-使用B，Subtilis    ATCC6633在最小Davis培养基上生物自显影。

H）分子量约为1730，自FAB-MS光谱推出，其在M+H

峰为1731。

抗生素A40926因子B₀的理化特征

A）紫外吸收光谱见附图4，表现出以下的最大吸收：

max（nm）

a）0.1N    HCl    282

b）磷酸盐缓冲液PH7.38    281

300（肩峰）

c）0.1N氢氧化钠或氢氧化钾    300

d）磷酸盐缓冲液PH9.0    283

300（肩峰）

e）甲醇    282

B）红外吸收光谱见附图5，表现出以下最大吸收（cm^-1）;3700-3080，3080-2700（医用润滑油）;1720-1625;1625-1560;1505;1460（医用润滑油）;1375（医药用润滑油），1295;1230;1210;1150;1100-1040;1030;1015;970;890;840;810;720（医药用润滑油）。

C）¹H-NMR波谱见附图6，在270MH处记录在DMSO d6中的几组H-NMR信号（以ppm表示），

使用TMS作为内标准（0.00ppm），（δ＝ppm）：

δ0.85（d，异丙基CH₃′S）;1.15（～13H）;1.44（～23H）;2.02（2H）;2.32-2.35（3H）;4-6.1（-16H）;6.1-8（～23H）;8.52，9.30，9.68（宽带，动态质子）

2.5-4：来自H₂O峰的干涉。

D）相对Teicoplanin A₂组分2（Rt＝20.3分）的滞留时间（R+）为1.22，反相HPLC分析的条件如下：

柱：Ultrasphere    ODS（5微米）Altex（Beckman）4.6毫米（i·d）×250毫米

预备柱：Brownlee    Labs    RP1815微米

洗脱：以洗脱液B在洗脱液A中占5%-60的线性梯度，40分钟。

流速：1.8毫升/分

紫外检测：254纳米

内标准：Teicoplanin A₂组分2（Gruppo Lepetit S.P.A）

E）元素分析：样品先在惰性气体（ΔW9.6%）中以140℃干燥后，表明各组分的（平均）百分数约为：

碳54.09%;氢5.13%;氮6.34%，氯（全部）4.12%;氯（离子）0.39%。

在900℃空气中无机残留为5%。

F）酸碱滴定，2-甲氧基乙醇（MCS）∶水为4∶1，先加入稍过量的HCL，用KOH滴定，表明4个离子化功能区具有下述PKmcs：

4.5，5.6，7.2，9.2。

G）Rf值为0.21，相对于Teicoplanin A₂组分2的Rf值为0.53，层析系统：

5%（W/V）Na₂SO₄液

乙腈

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck板（层厚0.25毫米）

显色：

-紫外光亮

-Pauly试剂，黄色，即重氮化对氨基苯磺酸〔J.Chromatog.20.171（1965）.2.Physiol    Chen    292.99，（1953）〕

-使用B.Subtilis在最小Davis培养基上生物自显影。

H）分子量约为1730，自FAB-ms波谱推出，其M+H

峰处为1730。

抗生素A40926因子PA的理化特性

A）紫外吸收光谱见附图7，表现出下列最大吸收。

max（nm）

a）0.1N    HCl    282

b）0.1氢氧化钾    300

c）磷酸盐缓冲液pH7.38    282

d）磷酸盐缓冲    283

300（肩峰）

B）红外吸收光谱见附图8，表现出下列最大吸收（cm^-1）

3700-3100，3000-2800（医药用润滑油）;1760-1710;1655;1620-1550;1505;1460（医药用润滑油）;1375（医药用润滑油）;1260，1250-950;845;805;720（医药用润滑油）

C）¹H-1 mR波谱见附图9，在270MHz处记录在LMSO d6中¹H-NmR的几组信号（以ppm表示）

使用TMS作为内标准（0.00ppm）（δ＝ppm）：0.86，d′S（CH₃）;1.15-1.22m（CH₂）n;1.41，m（CH₂）;2.01，S（CH₃）;2.01m（CH₂）;2.28，S（N-CH₃）;4.26-5.96，br（缩肽的或芳族的CH′S）;6.33-7.73br（芳族的CH′s和缩肽的NH′s）。

br＝宽

d＝双峰

dd＝双倍双峰

m＝多峰

s＝单峰

+＝三峰

D）相对于Teicoplanin A₂组分2（R+＝20.3分）的滞留时间（R+）为1.15，反相HPL分析在下述条件下进行：

柱：Ultrasphere    ODS（5微米）Altex（Beckman）4.6毫米（i.d.）×250毫米

预备柱：Brownlee    Labs    RP18（5微米）

洗脱：以洗脱液B在洗脱液A中占5%-60%的线性梯度，

40分钟。

流速：1.8毫升/分

紫外检测：254纳米

内标准：Teicoplanin A₂组分2（Gruppo Lepetit S.p.A.）

E）相对Teicoplanin A₂组分2的Rf值为0.62，色

谱系统如下：

5%（W/V）Na₂SO₄液

乙腈

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck板（层厚0.25毫米）

显色

-紫外光亮

-Pauly试剂，黄色，即重氮化对氨基苯石酸〔J.Chroma    tog    20，171（1965），Z.Physiol    Chem.292.99（1953）〕

-使用B.Sutilis    ATCC    6633在最小Davis培养基上生物自显影。

F）分子量约为1758，自FAB-MS波谱推出，其一群峰中最强峰为1761。FAB-MS分析的条件如下：

仪器：装备FAB枪Ion    Tech的VG    ModZAB

条件：阳性FAB，Xe

加速电压，8KV

基质：硫代甘油-甘油1/1（V/V）。

抗生素A40926因子PB的理化特性

A）紫外吸收光谱，见附图10，表现出下列最大吸收：

max（nm）

a）0.1NHCl    282

b）0.1N氢氧化钾    300

c）磷酸盐缓冲液pH7.38    282

300（肩峰）

d    磷酸缓冲液pH9.0    282

300（肩峰）

B）红外吸收光谱见附图11，表现下列最大吸收（cm^-1）：3700-3100，3000-2800（医药用润滑油）;1760-1710;1655;1620-1560;1605;1480-1420（医药用润滑油）;1375（医药用润滑油）;1320-1270;1230-1190;1150;1120-920;845;810;720（医药用润滑油）

C.1）¹H-NmR波谱见附图12，表明了下列几组信号（以ppm表示），270MHz，DMSOd₆，用TMS作内标准（0.00ppm），（δ＝ppm）多重性;（属性）：0.84，d（异丙基CH₃′S）;1.17m（CH₂）n;1.43，m（CH₂），1.99，S（CH₃）;2.01，m（CH₂）;2.31，S（N-CH₃）;2.79，dd（C-H）;3.70，m（C-H）;4.06-6.02，br（缩肽的或芳族的CH′S）;6.45-7.74、br（芳族的CH′S和缩肽的NH′S）;8.19-9.99，br（缩肽的NH′S和酚的OH′S）

2）¹H-NMR波谱见附图13，表明了

几组信号（以ppm表示），270MHz，DMSO+CF₃COOD，用TMS作为内标准（0.00ppm），（δ＝ppm多重性;（属性）：

0.84，d（异丙基CH₃S）;1.13，m（CH₂）n;1.40，m（CH₂）;1.98，s（CH₃）;2.00;m（CH₂）2.92，dd（C-H）;3.29-3.71，m（糖C-Hs）;4.07-6.09，s和m（缩肽的和芳族的CHs）;6.45-7.83，s和m（芳族的CHs和缩肽的NHs）;8.17-10.38（缩肽的NHs，酚的OHs）

D）滞留时间（R+）为1.27相对于Teicoplanin A₂组分2（R+＝20.3分）的滞留时间为1.32，进行反相HPLC分析的条件如下：

柱：Ultrasphere    ODS（5微米）Altex（Beckman）

4.6毫米（i.d.）×250毫米

预备主：Brownlee    Labs    RP18（5微米）

洗脱：以洗脱液B在洗脱液A中占5%-60%的线性梯度，40分钟

流速：1.8毫升/分

紫外检测：254纳米

内标准：Teicoplanin A₂性分2（Gruppo Lepetis S.p.A.）

E）相对Teicoplanin A₂组分2的R+值为0.53，色谱系统如下：

5%（W/V）Na₂SO₄液 70

乙腈    30

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck板（层厚0.25毫米）

显色：

-紫外光亮

-Pauly试剂，黄色，即重氮化对氨基苯磺酸〔J.Chromatog    20，171（1965），Z    Physiol    Chem.292，（1953）〕

-使用B.Subtilis    ATCC    6633在最小Davis培养基上生物自显影。

F）分子量大约1772，自FAB-MS波谱推出，其一群峰中最强峰为1776。FAB-MS分析的条件如下：

仪器：配备FAB    Ion    Tech的VG    Mod    ZABSE

条件：阳性FAB.Xe

加速电压，8KV

基质：硫代甘油-甘油1/1（V/V）。

本发明化合物的抗菌活性，可在体外用不同的微生物培养的标准稀释法来测定。

最小抑制浓度（MIC）测定的培养基和生长条件如下：对葡萄球菌（Strep.faecalis）和革兰氏阴性菊（Escherichia coli，Pseudomonas，Proteus）用等敏感性液体培养基（Isosensitest broth）（Oxoid），24小时;对其他种葡萄球菌用Todd-Hewitt液体培养基（Difco），24小时，对Neisseria gonorrhoeae用GC碱性液体培养基（Difco）+1% Isovitalex（BBl），富含CO₂的气体。48小时;对Haemophilus influenzae用GB碱性琼脂（Difco）+1% Isovitalek+0.001%高铁血红素，24小时，对Clostrdium perfringens用AC液体培养基（Difco），24小时，厌氧气体;对其他厌氧菌（C.difficile，Prop-ionibaeterium acnes，Bacternide fragilis），用Wilkins-Chalgren琼脂（参见T.D.Wilkins & S.Chalgren，1976，Antimicrob.Ag.Chemother，10，926），厌氧气体，48小时;对Mycoplasma gallisepticum用PPLO液体培养基（Difco）+10%马血清+1%葡萄糖，48小时;对Candida albicans用酵母碱性液体培养基（Difco）;24小时，除了C.albicans的培养温度为30℃之外，其余均为37℃。接种物如下：1%（V/V）M.gallisepticum 48小时液体培养基;对其他液体培养基稀释MIC为10⁴-10

个菌落形成单位/毫升;而琼脂稀释MIC （H.influenzae，C.difficile，P.acnes，B.fragilis）为10⁴-10

个细菌/点（用多点接种器接种）。

本发明化合物的抗菌活性，还可以按基本上如R.Pallanza等在J.Antimicrob.Chemother.11，419（1983）所述的方法用活性实验证明。实验性感染是给小鼠腹内注射接种S.pyogenes    C203的悬浮液。将接种物调至使未处理动物在48小时内因败血病而死亡。感染后约30分钟，用试验化合物给动物皮下处理。

ED₅₀值（半数有效量），是在第10天用Spearman和Karber的方法（D.J.Finney“Statistical Method in Biolgical Assay”，Griffin，524页1952），在各剂量存活百分数的基础上算出的。在上述条件下，ED50对抗生素A40926因子A为0.47毫克/公斤，对抗生素A 40926因子B为0.33毫克/公斤，对抗生素A40926因子PA为0.54毫克/公斤，对抗生素A40926因子PB为0.31毫克/公斤。

小鼠的大约急性中毒是用已知方法译定的抗生素A40926的大约的半数致死量（LD50），当对小鼠腹朠内注射时，其LD50高于100毫克/公斤。抗生素A40926复合物及其因子A，B，B₀，PA和PB，对许多导致广泛扩散感染的革兰氏阳性菌均有抗菌活性。由于这些病原体对常法医药的处理的抗性不断提高，所以仍急需新的抗生素物质。

正如前边所述，本发明的抗生素物质具有对Neissria菌类，如Neissria    gonorrhoeae的良好抗生性，而对其他革兰氏阴性菌实际上是非活性的。

已知，在最近15-20年中，淋病的发生率正在稳步地上升。

目前，对于控制感染仍有困难，因为患者在整个感染期间并不采取必要的措施以防止疾病的传播，从而造成大量的再次感染。另一方面，致病生物对常用抗生素产生的抗性正在增强，因此需要各种抗生素新的结合以及更长的治疗期。然而，更需要这样的新抗生素物质，即在治疗淋病，特别是对Neisseria    gonorhoeae的感染时非常有效，并只经有次施用，甚至只施用一次就有效的抗生素物质。

在一般的抗菌治疗中，抗生素A40926复合物，其因子A，B，B₀，PA和PB中的一种以及其无毒药理可接受的盐或其混合物，可经各种作途径施用，例如局部的或肠胃外服用。一般而言，优选的服药途径是肠胃外给药。

注射用组合物可以是悬浮液，溶液，在油性或水性赋形剂中的乳液这些形式，并且可合有辅助剂，例如悬浮剂，稳定剂和（或）分散剂。

当在使用时，有适宜的赋形剂，如无水菌等加入而再次配制时，活性成份可以呈粉状。

在某些情况下，可用本技术领域内已知方法（参见“Reming-Pharmaceutical    Scinces”，第15版Mack    Publishing    Company.Easton    Pennsylvanin.USA第1614页）将本发明的化合物制成包有肠溶衣的剂型用于口服。

特别是当需要抗菌物质在肠道被吸收而在其经过胃时又被改变的情况下更是如此。

同性物质的量原则上根据各种因素而不用，例如，处理对象的大 小和条件，给药途径和频率，以及所涉及的病原体等等。

本发明的抗生素物质，即抗生素A40926复合物，其因子A，B，B₀PA和PB，它们的生理上可接受的盐类，一般而言的每日有效剂量为每公斤患有体重约0.5～50毫克活性组分，每天可以分成1-4次给药

特别适宜的组合物是制备成每单位含100-5000毫克的剂量单位。

然而当作为淋病的一剂处理药物时，对抗生素A40926复合物，其因子A，B，B₀，PA和PB应使用高于其小有效剂量的剂量，一般为0.5～50毫克/公斤，以便在更长的时期内，保证药物在血液的有效水平。

进而言之，在治疗淋病时，优选使用长效肠胃外剂型。长效剂型可用本技术领域已知的各种机器和方法制备。

优选的制备含有抗生素A40926复合物，其因子A，B，B₀，PA和PB的长效剂型的方法，包括使用这种抗生素的非水溶性形式，将其悬浮在水液或油类介质中。

这些形式，例如不溶性盐或游离酸，事实上经肌肉注射仍释放的很慢，这是因为它们的水溶性很低，因而能维持该抗生素物质的血液水平。

药用组合物的制备

用5毫升无菌USP悬浮液，其中含有8%丙二醇，和1000毫克抗生素A40926因子A制备一剂肌肉注射用针剂。

用5毫升含有8%丙二醇的无菌USP悬浮液和500毫克抗生 素A40926因子B制备成一剂肌肉注射用针剂。

用2000毫克抗生素A40926因子B的钠盐悬浮于5毫升无菌水中制备成一剂肌肉注射用针剂。

此外，本发明的抗生素对于造成肠伪膜结肠炎的Clostrdium    difficile的生长有抑制作用。这些抗生素可以用于治疗伪膜结肠炎，即口服制成药理可接受剂型的有效剂量的这些抗生素或其药理上可接受的盐。使用时，抗生素可制成胶囊或悬浮液。

本发明的化合物，除了作为药物以外，还可作为动物生长促进物。

为此目的，本发明化合物的一种或一种以上，掺入适宜的饲料中口服。其具体的数量是在吃掉正常数量的饲料时，要能够保证摄入有效生长促进剂量的活性成份。

将本发明的活性化合物添加到动物饲料中，优选的是制备适当数量的含有效剂量活性化合的预混合饲料，然后将该混合物饲料放入全部饲料中。

此外，中间浓缩物或含活性成分的饲料添加剂也可掺入饲料中。

这样的饲料预混合物和完全饲料的制备及使用方法均在参考书中有描述（见Applied，Animal    Nutrition，W.H.Freed    man    and    CO.S.Francisco，USA，1969或“Livestock    Feeds    and    Feeding”O    and    B    books    Corvallis    Oregon，USA    1977）并在此相互参照结合。

以下的实施例进一步解释本发明，但不是对本发明范围的限制。

实施例1：Aofinomadura    sp    ATCC    39727的培养

将抗生素A40926生产菌（Actinomadwra    sp    AICC 39729在燕麦粉琼脂斜面培养基上培养2-3周，温度为28℃，然后用其接种500毫升的Erlenmeyer烧瓶，瓶中含100毫升培养基，其组成为0.5%肉膏，0.5%自溶的酵母，0.5%，0.3%水介酪蛋白，2%葡萄糖，0.15%NaCl（消毒前的PH为7.5）。

该烧瓶在旋转摇床上以28℃每分钟200转培养72小时，然后转入到含有4升上述培养基的发酵器中。这些培养物以28℃培养生长72小时，通气率大约为每分钟2升，搅拌速率为每分钟90转。然后用其接种含同样培养基200毫升的发酵器。向该发酵器中按每分钟100升通入无菌空气，以每分钟250转的速度率搅拌，温度为28℃抗生素的生产用纸盘（paper-disc）琼脂扩散法监测，用B.Subtilis在最小培养基上作为试验生物。在72-96小时后获得最大活性。

实施例2：抗生素A40926的回收

A）将发酵液冷却至4℃，调至PH9.5并搅拌。大约1小时后过滤，然后用无机酸将滤调至大约PH3.5。将该混合物在4℃搅拌30分钟，然后用助滤器（Hyflo-Floms）过滤。弃去上清滤液，将滤饼悬浮于去离子水中，调至大约PH8.5，搅拌过滤。滤饼再经一次同样的程序。收集的滤液中含抗生素A40926

B）将膨胀D-丙氯酰-D-丙氨酰-ε-氨基己酰基-琼脂糖改进基质（2升），加入到实施例1所获的发酵液（即在过滤之后，并将上清滤液调至大约PH8.5）或上述实施例2A的所收集的滤液中。在室温下搅拌过夜，然后滤出树脂，用含有5%（W/V）NaCl的HCl-TRIS缓冲液，PH7.5，浓度0.45mM，2× 10升洗（TRIS＝2-氨基-2-羟甲基-1·3-丙＝醇），然后用蒸馏水（4×20升）洗。

该树脂用1%（W/V）氨水合物（2×20升）洗脱下来抗生素A40926，洗脱液在室温下放置过夜，然后浓缩至较小的体积（大约2.5升）。水用与正丁醇共沸蒸馏法除去。然后加入石油醚，沉淀出出3.5克粗抗生素A40926复合物。

实施例3：抗生素A40926复合物AB的提纯

将基本上按照上述实施例2的程序所获的粗抗生素A40926复合物（750毫克;HPLC效价70%），溶于400毫升水中，调至PH7.5并过滤。滤液在D-丙氨酰-D-丙氨酰-ε-氨基己酰基-琼脂糖柱50毫升膨胀树脂;床高5米）上进行亲和层析。该柱用0.1%（W/V）的氨（其中含2MNaCl，并已被HCl调至PH7.5）平衡，然后用下列三种缓冲液按顺序展层：

缓冲液A：含2M    NaCl并被HCl调至PH7.5的0.16%（W/V）氨，（2.6床体积;

缓冲液B：含2M    NaCl并用HCl调至PH9.5的0.16%（W/V）氨，（16床体积）;

缓冲液C将抗生素A40926复合物AB洗脱在单一部分中，该洗脱部分被调至PH7.0，并在10mM    TRIS-HCl    PH7.0的缓冲液缓冲下，在同样的亲和柱上再次过柱。该柱用蒸馏水洗至完全脱盐时为止，然后用2柱床体积的0.39%（W/V）PH11.0氨水洗脱抗生素。

将洗脱部分浓缩为少量液体混合物，然后冻干。即获得纯抗生素A40926复合物AB（374毫克）。

实施例4：抗生素A40926因子A和B的分离

A）将按实施例2所获得抗生素A40926复合物（3.3克）或按实施例3所获的抗生素A40926复合AB（2.3克）悬浮于0.5升水中，搅拌并过滤。滤出的清液过硅烷化硅胶柱（200克，床高18厘米，硅烷化硅胶60，70-230目MerckIne），该柱用溶液A预平衡（溶液A的组成为0.001M NaEDTA，其中含有0.25%（W/V）NaHzPO₄·H₂O和2.5%（W/V）NaCl，并被NaOH调至PH6.0）。该柱用乙在溶液A中占0%～40%的线性梯度，总体积约7升，洗脱大约48小时，以15.5毫升为一份收集各部份，并在Bacillus Swbtilis上用生物检测法检测，并用HPLC分析。收集含相同抗生素成份的各部分。第310-3号和第348-365号各部分，分别含有抗生素A40926因子A和抗生素A40926因子B。

B）收集到的只含有A40926因子A及只含有A40926因子B的组分，经减压浓缩除去乙，用水稀释（至大约开始溶液的2倍体积），过上述类型的硅烷化硅胶柱（膨胀基质的体积：50毫升，床高15厘米）。该柱用去离子水洗至脱盐完全时为止，最后，用乙/水60∶40（V/V）展层。

洗脱的各部分用减压浓缩，残留物经冻干，从第一组洗脱部分第310-330部分）中获取134毫克抗生素A40926因子A，从第二组洗脱部分（第348-365部分获取206毫克A40926因子B。

实施例5：抗生素A40926因子PA和PB的分离

基本上按照实施例2A的程序及实施例2B的第一步，用1% （W/V）氨水合物（2×20升）洗脱连接在树脂上的抗生素。用硫酸将洗脱液调至PH7.8，并在真空条件下与正丁醇共沸蒸馏浓缩至较小的体积，得到浓缩液并在滤纸上过滤。所收获的滤液含有抗生素A40926因子PA，A40926因子PB和少量的A40926因子A和因子B（HPLC）。将含有大约50毫克/毫升纯抗生素A40926复合物（HPLC分析）的这种浓缩液的样品（10毫升），在孔径为5微米的滤纸（Acrodisc（R），Grlman    Science    Inc）上过滤，然后在含有20克十八烷基甲硅烷基反相硅胶（Lichrisorb    RP    18，Merck    Inc;颗粒径度10微米）的不锈钢柱（直径2厘米）上过柱。然后在冲压（一般为14巴）条件下将该硅胶装入一台Chromatospac    Modulplprep仪器的不锈钢柱（Yoben    Yvon    France），用乙和18mM磷酸钠缓冲液PH6.0，25∶75）V/V）组成的混合物进行平衡。洗脱时，使用于平微时所用相同的溶剂混合物，流速为大约10.5毫升/分。用HPLC和Bacillus    subtilis生物检测法监测洗脱。

收集含有相同抗生素成份的各部分，将5轮层析的均质的各部分浓缩，蒸发除去有机溶剂。

所获溶液用1M氯化钠水液稀释至原体积的两倍，并过硅烷化硅胶柱（50克，床高5厘米，硅烷化硅胶60，Merck    Ine），并用水平衡。

该柱用去离子水洗至完全脱盐时为止（当加入AgNO₃沉淀），然后用乙腈/水为1∶1的液体洗脱。收集含有相似抗生素成（HPLC分析）的洗脱液，与正丁醇共沸蒸馏浓缩至较小的体积，得到水相， 再冻干。产率：

抗生素A40926因子PA：55毫克

抗生素A40926因子PB：51毫克

抗生素A40926因子A：38毫克

抗生素A40926因子B₀：33毫克

实施例6：分离抗生素A40926因子B的选择方法

按实施例2（最后两步）所做的两种制剂，经收集并过滤，然后过硅烷化硅胶柱层析（400g，床高30厘米，Silicagel    60，70-230目，Merck    Ine），用水预平衡。

用水（6升）洗该柱，吸附的抗生素用乙/水按下述顺序洗脱：

2.7升    5%（V/V）    乙腈在水中

1.6升    10%（V/V）    乙腈在水中

2.97升    15%（V/V）    乙腈在水中

3.15升    20%（V/V）    乙腈在水中

以18毫升为1份收集各部分。

洗脱部分的活性，用在可接受的微生物如B.Subtilis）上的纸盘生物检测法检定，以及用HPLC分析。收集含相似抗生素成份的各部分（第472-526部分），并减压浓缩，在该浓缩物中加入正丁醇，共沸除去水。剩下的丁醇溶液再经浓缩，减少体积以沉淀抗生素A40926因子B（1.4克）。在搅拌条件下用石油醚洗该产物，并过滤收集（三次）。在真空条件下干燥后，得到760毫克A40926因子B。

将抗生素A40926因子B再经上述柱层析，就可获得（540毫克）抗生素A40926因子B₀，其具有与上述抗生素A40926因子B相同的理化性质，只是它在HPLC分析中仅表现出一个峰，即相对Teicoplanin A₂组分2的滞留时间为1.22。

实施例7：抗生素A40926因子PA和抗生素A40926因子PB各自向抗生素A40926因子A和因子B的转化。

将抗生素A40926因子PA和抗生素A40926因子PB（50毫克）分别溶于2.5毫升1%（W/V）的NH₄OH溶液中，所获溶液在室温下搅拌24小时。用与正丁醇共沸除去水，用乙醚沉淀，收集沉淀并过滤的方法，可从原来含有抗生素A40926因子PA的溶液中获得抗生素A40926因子，从原来含有抗生素A40926因子PB的溶液中获取抗生素A40926因子B（产率为75%）。

D-丙氨酰-D-丙氨酰-琼脂糖的制备

活化的1克CH-Sepharose    4B（PHarmacia    Fine    Chemicals）在1mM冰冷盐酸中膨胀15分钟，并用同样的溶液洗，所获的明胶（约3毫升）与D-丙氨酰-D-氨酸（30毫克）的溶液在0.5M氯化钠和0.1M碳酸氢钠缓冲液（PH8.0）中相混合。

该混合物在室温下颠倒摇动1小时。

当偶联反应完成后，用缓冲液洗去多余的配位体。用1M乙醇胺盐酸在PH9处理1小时封闭葡聚糖支持物上的未被联接的活化基因。然后，用过滤，并用0.5M氯化钠，0.1M醋酸钠PH4， 0.5M氯化钠和0.1M三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液PH8彻底洗（4次）的方法，回收到Sephadex-ε-氨基丙＝醇-D-丙氨酰-D-丙氨酸改进基质。

Claims (10)

1、一种制备抗生素物质的方法，抗生素物质选自抗生素A40926复合物，抗生素A 40926因子A，抗生素A  40926因子B，抗生素A  40926因子Bo，抗生素A 40926因子A，抗生素A 40926因子PB，其混合物和其加成盐，其特征在于：

非盐形式的抗生素A 40926因子A：

A)紫外吸收光谱表现出下列最大吸收：

                      λ  max(nm)

a)0.1NHCl                 281

b)磷酸盐缓冲液PH7.38      281

                          300(肩峰)

c)0.1N氢氧化钠或氢氧化钾  300

d)甲醇                    282

e)磷酸盐缓冲液pH9.0       282

                          300(肩峰)

B)红外吸收光谱表现出下列最大吸收(Cm^-1)：3700-3100，3100-2800(医药用润滑油)；1655；

1620-1560；1510；1480-1410(医药用润滑油)；

1375(医药用润滑油)；1320-1250；1250-1190；1100-950；845；810；720(医药用润滑油)

C)

H-NMR波谱表现出下列几组信号(以ppm表示)，在DMSOd₆中记录，270MHz，使用TMS作为内标准(0.00ppm)，(α=ppm)：

α0.86(t′s，6H)；1.21(～11H)；1.43(2H)；

2.01(2H)；2.31-2.34(3H)；4-6.2(～16H)；

6.2-8(～23H)；8.44，9.22，9.66(宽带；动态质子)

2.5-4：来自H₂O峰的干涉

D)相对于TeicoplaninA₂组分2(Rt=20.3分)的滞留时间(Rt)为1.22，反相HPLC的分析条件如下：

柱：Ultrasphere ODS(5毫米)Altex(Beckman)

4.6毫米(i.d)×250毫米

预备柱：Brownlee Labs RP18(5微米)

洗脱液A：

洗脱液B：

洗脱：以洗脱液B在洗脱A中占5%-60%的线性梯度，洗脱40分钟

流速：1.8毫升/分

紫外检测：254nm

内标准：Teicoplanin A₂组分2(GruppoLepetit S.P.A)

在相同的条件下，相对于睾酮(Roussel Uclaf)的滞留时间为0.60。

E)元素分析，样品在惰性气体(△W4.6%)中以140℃先干燥之后进行，指出了各组分(平均)百分数的大约值：

碳55.82%，氢5.17%，氮6.31%，氯(全部)4.24%，氯(离子)0.37%，

900℃空气中无机残留为1.2%

F)酸碱滴定，2-甲氧基乙醇(MCS)：水，4∶1，在加入稍过量的HCl之后，用KOH滴定，指出4个可离子化功能区具有以下的pKMCS：4.6，5.6，7。2，9.2，

G)Rf值为0.24，相对于Teicoplanin A₂组分2的Rf为0.70，层析系统如下：

5%(W/V)Na₂SO₄溶液 70

乙腈              30

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck板(层厚0.25毫米)显色：

--紫外明亮

--Pauly试剂，黄色，即重氮化对氨基苯磺酸[J.Chrom-atog。20，171(1965)，Z.Physiol.Chem.292，99(1953)]

--在最小Davis培养基上使用B.subtilis ATCC 6633生物自显影，

H)分子量为1716，由FAB-MS波谱推出，其表现M+H

的峰为1717

非盐形式的抗生素A  40926  因子B：

A)紫外吸收光谱表现出下列最大吸收：

                        λmax(nm)

a)0.1NHCl                 282

b)磷酸盐缓冲液pH7.38      281

                          300(肩峰)

c)0.1N氢氧化钠或氢氧化钾  300

d)磷酸盐缓冲液PH9.0       283

                          300(肩峰)

e)甲醇                    282

B)红外吸收光谱表现出下列最大吸收(cm^-1)：

3700-3080，3080-2700(医药用润滑油)；1720-1625；1625-1560；1505；1460(医药用润滑油)；1375(医药用润滑油)；1295；1230；1210；1150；1100-1040；1030；1015；970；890；840；810；720(医药用润滑油)

C)¹H-NMR波谱表现出下列各组信号(以ppm表示)，在DMSOd₆中记录的¹H-NMR 270MHz，使用TMS作为内标准(0.00ppm)，(α=ppm)：α0.85(d，异丙基CH₃′S)；1.15(～13H)；1.44(～2H)；2.02(2H)；2.32-2.35(3H)；4-6.1(～6H)；6.1-8(～23H)；8.52，9.30，9.68(宽带，动态质子)

2.5-4：来自H₂O峰的干涉

D)滞留时间(Rt)为1.22，相对于Teicoplanin A₂组分2(Rt=20.3分)的滞留时间为1.27，反相HPLC分析的条件如下：

柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beckman)4.6毫米(i.d.)×250毫米

预备柱：Brownlee Labs RP18(5微米)

洗脱液A：

洗脱液B：

洗脱：以洗脱液B在洗脱液A中占5%～60%的线性梯度，洗脱40分钟

流速：1.8毫升/分

紫外探测：254纳米

内标准：Teicoplanin A₂组分2(GruppolepetisS.P.A)

E)元素分析，样品先在约140℃惰性气体中(Δw9.6%)干燥，指出各组分(平均)百分数大约为：碳54.09%；氢 5.13%；氮 6.34%；氯(全部)4.12%；氯(离子)0.39%；

900℃空气中无机灰份为5%；

F)酸碱滴定，2-甲氧基乙醇(MCS)：水，4∶1，当加入稍过量的HCl(pH2.7)后用KoH滴定，其表明4个可离子化功能区具有如下所示的pKmcs：

4.5，5.6，7.2，9.2，

G)Rf值为0.21，相对于Teicoplanin A₂组分2的Rf值为0.53，层析系统如下：

5%(w/v)Na₂SO₄溶液 70

乙腈              30

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck板(层厚0.25毫米)显色：

--紫外明亮

--Pauly试剂，黄色，即重氮化对氨基苯磺酸[J.chromatog20，171(1965)，Z.Physiol.Chem.292，99，(1953)]

--在最小Davis 培养基上用B.subilis ATCC 6633生物自显影

H)分子量为1730，由FAB-MS波谱推出，其表示M+H

峰在1731

非盐形式的抗生素A 40926因子B

A)紫外吸收光谱表明以下最大吸收：

                       λ max(nm)

a)0.1N HCl                282

b)磷酸盐缓冲液PH7.38      281

                          300(肩峰)

c)0.1N氢氧化钠或氢氧化钾  300

d)磷酸盐缓冲液pH9.0       283

e)甲醇                    300(肩峰)

                          282

B)红外吸收光谱表现出下列最大吸收(cm^-1)：3700-3080，3080-2700(医药用润滑油)；1720-1625；1625-1560；1505；1460(医药用润滑油)；1375(医药用润滑油)；1295；1230；1210；1150；1100-1040；1030；1015；970；890；840；810；720(医药用润滑油)

C)¹H-NMR波谱表现出下列几组信号(以ppm表示)，在DMSOd₆中记录¹H-NMR，270MHz，使用TMS作为内标准(0.00ppm)，(α=ppm)：

α0.85(d，异丙基CH₃′S)；1.15(～13H)；1.44(～2H)；2.02(2H)；2.32-2.35(3H)；4-6.1(～16H)；6.1-8(～23H)；8.52，9.30，9.68(宽带，动态质子)2.5-4：来自H₂O峰的干涉

D)相对于Teicoplanin A₂组分2(Rt=20.3分)的滞留时间(Rt)为1.22，反相HPLC分析的条件如下：

柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beck-man)4.6毫米(i.d)×250毫米

预备柱：Brownlee Labs RP18(5微米)

洗脱液A：

洗脱液B：

洗脱：以洗脱液B在洗脱液A中占5%～60%的线性梯度洗脱40分钟

流速：1.8毫升/分

紫外检测：254nm

内标准：Teicoplanin A₂组分2(Gruppo LepetitS.P.A)

E)元素分析，样品先在140℃惰性气体(Δw9.6%)中干燥，指出各组分(平均)百分数大约为：

碳54.09%，氢5.13%，氮6.34%，氯(全部)4.12%，氯(离子)0.39%，

在900℃空气中无机灰分为5%

F)酸碱滴定，2-甲氧基乙醇(MCS)：水，4∶1，加入稍过量HCl之后用KOH滴定，表明有4个可离子化的功能区具有下述pKmcs；4.5，5.6，7.2，9.2

G)Rf值为0.21，相对于Teicplanin A₂组分2的Rf值为0.53，层析系统如下：

5%(w/v)Na₂SO₄溶液 70

乙腈              30

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck 板(层厚0.25毫米)

显色：

--紫外明亮

--Pauly 试剂，黄色，即重氮化对氨基苯磺酸[J.Chrom-atog 20，171(1965)，Z.Physiol.Chem.292，99，(1953)]

--在最小Davis培养基上用B.subtilis ATCC 6633生物自显影

H)分子量为1730，由FAB-MS波谱推出，其表现为M+H 峰在1731

非盐形式的抗生素A 40926 因子PA

A)紫外吸收光谱表现出下列最大吸收：

                    λmax(nm)

a)0.1N HCl            282

b)0.1N氢氧化钾        300

c)磷酸盐缓冲液pH7.38  282

                      300(肩峰)

d)磷酸盐缓冲液pH9.0   283

                      300(肩峰)

B)红外吸收光谱表明下列最大吸收(cm^-1)：

3700-3100，3000-2800(医药用润滑油)；1760-1710；1655；1620-1550；1505；1460(医药用润滑油)；1375(医药用润滑油)；1260，1250-950；845；805；720(医药用润滑油)

C)¹H-NMR波谱表明下列各组信号(以ppm计)，在DMSOd₆中记录¹H-NMR，270MHz，用TMS为内标准(0.00ppm)，(α=ppm)：

0.86，d′s(CH₃)；1.15-1.22，m(CH₂)n；1.41，m(CH₂)；2.01，s(CH₃)；2.01，m(CH₂)；2.28，s(N-CH₃)；4.26-5.96，br(缩肽的和芳族的CH′s)；6.33-7.73br(芳族的CH′s和缩肽的NH′s)

br=宽峰

d=双峰

dd=双倍双峰

m=多峰

s=单峰

t=三峰

D)相对于Teicoplanin A₂组分2(Rt=20.3分)的滞留时间(Rt)为1.15，反相HPLC分析的条件如下：

柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beckman)4.06毫米(i.d)×250毫米

预备柱：Brownlee Labs RP18(5微米)

洗脱液A：

洗脱液B：

洗脱：以洗脱液B在洗脱液A中占5%-60%的线性梯度洗脱40分钟

流速：1.8毫升/分

紫外检测：254nm

内标准：Teicoplanin A₂组分2(Gruppo Lepetit S.P.A)

E)相对于Teicoplanin A₂组分2的Rf值为0.62，层析系统如下：

5%(w/v)Na₂SO₄溶液 70

乙腈              30

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck板(层厚0.25毫米)

显色：

--紫外明亮

--Pauly试剂，黄色，即重氮化对氨基苯磺酸[J.Chromatog.20，171，(1965)，Z.Physiol.Chem.292，99，(1953)]

--在最小Davis培养基上用B.subtils ATCC 6633生物自显影

F)分子量约1758，由FAB-MS波谱推出，其一群峰中最大峰为1761，FAB-MS分析的工作条件如下：

仪器：装有FAB枪Ion Tech 的 VGMod ZAB SE

条件：阳性FAB，Xe

加速电压为8Kv

基质：硫代甘油-甘油1/l(v/v)

非盐形式的抗生素A 40926因子 PB

A)紫外吸收光谱表现出下列最大吸收：

                    λmax(nm)

a)0.1N HCl            282

b)0.1N氢氧化钾        300

c)磷酸盐缓冲液pH7.38  282

                      300(肩峰)

d)磷酸盐缓冲液pH9.0   282

                      300(肩峰)

B)红外吸收光谱表现出下列最大吸收(cm^-1)：

3700-3100，3000-2800(医药用润滑油)；1761-1710；1655；1620-1560；1605；1480-1420(医药用润滑油)；1375(医药用润滑油)；1320-1270；1230-1190；1150，1120-920；845；810；720(医药用润滑油)

C.1)¹H-NMR波谱表现出下列各组信号(以ppm表示)，在DMSOd₆中，270MHz用TMS作为内标准(0.00ppm)，(α=ppm)多重性(属性)：

0.84，d(异丙基CH₃′s)；1.17，m(CH₂)n；1.43m(CH₂)，1.99，s(CH₃)；2.01，m(CH₂)；2.31，s(N-CH₃)；2.79，dd(C-H)；3.70，m(C-H)；4.06-6.02，br(缩肽的或芳族的CH′s)；6.45-7.74，br(芳族的CH′S和缩肽的NH′s)；8.19-9.99，br(缩肽的NH′s和酚的OH′s)

C.2)¹H-NMR波谱表现出下列几组信号(以ppm计)，在DMSOd₆+CF₃COOD中，270MHz，以TMS为内标准(0.00ppm)，(α=ppm)多重性；(属性)：

0.84，d(异丙基CH₃′s)；1.13，m(CH₂)n；1.40，m(CH₂)；1.98，s(CH₃)；2.00，m(CH₂)；2.92，dd(C-H)；3.29-3.71，m(糖c-H′s)；4.07-6.09，s和m(缩肽的和芳族的CH′s)；6.45-7.83，s和m(芳族的CH′s和缩肽的NH′s)；8.17-10.38(缩肽的NH′s，酚的OH′s)

D)滞留时间(Rt)为1.27，相对于Teicoplanin A₂组分2(Rt=20.3分)的滞留时间为1.32，反相HPLC分析层析的条件如下：

柱：Ultrasphere ODS (5微米) Altex(Beckman) 4.6毫米(i。d)×250毫米

预备柱：Brownlee Labs RP18(5微米)

洗脱液A：

洗脱液B：

洗脱：以洗脱液B在洗脱液A中占5%-60%的线性梯度洗脱40分钟

流速：1.8毫升/分

紫外检测：254nm

内标准：Teicoplanin A₂组分2(Gruppo Lepetit S.P.A)

E)相对于Teicoplanin A₂组分2的Rf值为0.53，层析系统为：

5%(w/v)Na₂SO₄溶液 70

乙腈              30

使用硅烷化硅胶60F₂₅₄Merck板(层厚0.25毫米)

显色：

--紫外明亮

--Pauly试剂，黄色，即重氮化对氨基苯磺酸[J.Chrom-atog.20，171(1965)，Z.Physiol.Chem.292，99，(1953)]

--在最小Davis培养基上用B.subtilis ATCC 6633

生物自显影

F)分子量为1772，自FAB-MS波谱推出，其一群峰中的最大峰为1776，FAB-MS分析的工作条件如下：

仪器：装备有FAB枪Ion Tech 的VG Mod ZAB SE

条件：阳性FAB，Xe

加速电压为8KV

基质：硫代甘油-甘油1/l(V/V)；

该方法包括，在有碳原，氮源和无机盐存在的浸没厌氧条件下，培养Actinomadura sp。ATCC39727菌，或抗生素A 40926生产菌的突变体或其变种，从发酵液中分离并回收所述的抗生素，如果需要，将其转变为所需要的盐。

2、根据权利要求1所述的方法，其中所述的菌是在20-40℃的温度下培养的。

3、根据权项1所述的方法，其中所述的温度为24-35℃。

4、根据权项1所述的方法，其中所述的分离和回收抗菌素，是将经过滤的发酵液在固定化D-丙氨酰-丙氨酸上进行亲和层析，接着进行分配，反相或离子交换层析。

5、根据权利要求1所述的方法，其中所述的回收抗生素包括：

a）将发酵液在固定化D-丙氨酰-丙氨酸上进行亲和层析，

b）将所收集的含抗生素的洗脱部分迅速调至中性，

c）在硅烷化硅胶上用反相液层析的方法任选地分离抗生素A 40926因子PA，PB，A，B和B₀。

6、根据权利要求1的制备选自抗生素A 40926复合物，抗生素A 40926因子A，因子B和因子B₀的化合物的方法，其特征在于：

a）将发酵物调至碱性pH8.5-10.5

b）过滤

c）将滤出的清液酸化pH2.5-4.5

d）过滤并弃去滤液

e）将滤饼悬浮于水中并调至碱性pH8-9

f）在用过滤获取到粗抗生素A  40926复合物后，将其在固定化D-丙氨酰-丙氨酸上进行亲和层析

g）用分配，反相或离子交换层析的方法任选地分离抗生素A  40926因子A和因子B

h）当需要抗生素A 40926因子B₀时，将抗生素A 40926因子B再次进行素和层析。

7、根据权项6所述的方法，其中的层析技术是反相层析并且稳定相选自硅烷化硅胶和非功能化的聚苯乙烯树脂。

8、根据权项6所述的方法，其中所述的稳定相是用pH4-9的缓冲液预平衡过的硅烷化硅胶而且洗脱液是可与水溶混的极性溶剂在同样缓冲液中的线性梯度混合物。

9、细菌Actinomadura  sp.ATCC39727。

10、Actinomadura  sp.ATCC39727或抗生素A  40926生产菌的突变体或其变种的生物学纯净培养基，当有碳源，氮源，无机盐存在时，可在浸没厌氧条件下培养并生产如权项1所述的化合物。

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