CN1033043C

CN1033043C - 糖苷配基抗菌素a40926的制备方法

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Publication number: CN1033043C
Application number: CN86108977A
Authority: CN
Inventors: 恩里科·塞尔瓦; 厄尼斯托·里瓦; 吉奥瓦尼·卡萨尼; 弗朗希斯科·帕伦蒂
Original assignee: Gruppo Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1986-12-30
Publication date: 1996-10-16
Anticipated expiration: 2001-12-30
Also published as: IE863382L; JPS62242699A; NO172121B; DE3682767D1; FI86307C; ZA869713B; IL81106A; NZ218789A; KR950010461B1; NO172121C; AU6688386A; EP0240609A3; GB8608809D0; IE59523B1; NO865323L; ES2040207T3; FI865320A0; KR890002231A; MY101178A; FI865320A

Abstract

本发明涉及新的抗菌素物质，这些物质命名为N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子A、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₀、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₁、糖苷配基抗菌素A40926以及它们的加成盐类，涉及从抗菌素A40926复合物或其一个因子开始其制备的方法。

Description

糖苷配基抗菌素A40926的制备方法

本发明涉及名为N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子A，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₀，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A4096因子B₁，糖苷配基抗菌素A40926的新型抗菌物质和它们的加成盐，以及以抗菌素A40926复合物或它的一个因子作为起始物制备它们的方法，及其在治疗包括对它敏感的微生物的传染病方面的用途。

抗菌素A40926复合物及其因子是对革兰氏阳性细菌和奈瑟氏菌株有活性的抗菌物质，该抗菌素A40926复合物及其因子是由足肿放线菌(Actinomadura)的菌株产生的。

足肿放线菌属的A40926产生菌株已于1984年6月8日按照布达佩斯条约寄存在美国典型培养物收集中心(ATCC)-，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland20852，U.S.A.

抗菌A40926及其因子，及产生的微生物和它们的制备方法已在欧洲专利申请公井177882号中公开。基于理化数据并参考已知抗菌物质的结构，下面的结构式可属于A40926因子(编号类似于J.Williams在J.A.C.S.，106，4895-4902(1984)所建议的)。

式中A代表一个N-(C₁₁-C₁₂)酰氨基葡糖苷酸基团B代表一个甘露糖基或乙酰基甘露糖基团。

更具体地，抗菌素A40926因子A是上面的化学式中A代表十一酰氨基葡糖苷酸基和B代表甘露糖基的化合物；抗菌素A40926因子B₀是上面化学式中A代表异十二酰氨基葡糖苷酸基和B代表甘露糖基的化合物；以及A40926因子B₁是上面化学式中A代表十二酰氨基葡糖苷酸基和B代表甘露糖基的化合物。

抗菌素A40926因子PA和因子PB与相应的因子A和B不同之处在于前者的甘露糖单元被乙酰基-甘露糖单元取代。

抗菌素A40926是一种抗菌物质的复合物，已分离了它的五种组份并且鉴定为因子PA.PB、A、B和B₀。

至少在某些发酵条件下，抗菌素A40926因子PA和PB是A40926产生微生物的主要抗菌素产物。

抗菌素A40926因子A和B分别是抗菌素A40926因子PA和因子PB的主要转化产物，并且它们通常已经存在发酵液中。

已发现，在碱性条件下，抗菌素A40926因子PA能转化成抗菌素A40926因子A，而抗菌素A40926因子PB能转化成抗菌素A40926因子B。

因此，当使发酵液或者含有它的提取物或浓缩物的抗菌素A40926，在碱性条件下保持一定的时间(例如，亲核碱的水溶液，在pH＞9保持过夜)，就可以得到以抗菌素A40926因子A和因子B富集的抗菌素A40926复合物。

本发明说明书及权利要求中的“N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926族”是指N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB和/或它们的单个因子，也就是，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子A、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₀和N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₁。

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素

A40926复合物AB(非加成盐

形式)具有下列特性：A)紫外线吸收光谱，示于附图1，显示下列吸收峰：

波长(入)(毫微米)

a)0.1N HCl 282

b)pH7.4磷酸盐绂冲剂 282

310(肩峰)

c)0.1N KOH 302B)红外吸收光谱，示于附图2，显示下列吸收峰(厘米^-1)：

3700-3100，3000-2800(液状石蜡)，

1650，1620-1550，1500，1460(液状石

蜡)，1375(液状石蜡)，1.300，1250-1180，

1150，1060，1010，970，930，840，

820。C)¹H-核磁共振谱，见附图3，在270兆赫兹下，使用四甲基硅烷作为内标准(0.00ppm)，(δ＝ppm)，在六氘二甲基亚砜(DMSOd₆)加CH₃COOH中记录。显示下列信号(以ppm表示)群：

0.84，d和t〔由异丙基的CH₃和末端CH₃引起〕，

1.14，m〔(CH₂)_n〕；1.44，m〔-CH₂-C-CO

和异丙基的CH〕，2.00，t〔-CH₂-(CO)〕，

2.5s(DMSOd₆)，2.5s(N-CH₃)，2.93，

m〔CH，(Z2)〕，3.33，m〔CH，(Z′2)〕，

3.20-3.80，m〔糖CH〕，5.34，d〔酰氨基葡糖醛

酸的异头质子〕4.10m(X6)，4.33d，(X5)，

4.43d(X7)，4.9m(X2)，5.1(4F和Z6)，

5.4s(X1)，5.58d(X4)，5.7s(4B)，

6.06d(X3)，7.73s(6B)，6.26-8.42

s和m(芳族的CH和肽的NH〕，8.70-10.5，br

s〔酚的OH和NH₂+〕br＝宽频，d＝双谱线m＝多谱线

s＝单谱线，t＝三谱线D)当用逆相高压液相色谱分析时，在下列条件下，相对于Teicop-lanin A₂组分2(R_t＝20.3分钟)的保留时间(R_t)为1.20和1.30：

柱：Oltrasphere ODS(5μm)

Altex(Beckman)

4.6毫米(内径)×250毫米

前置柱：Brownlee Labs RP15(5微米)

洗脱剂A：CH₃CN 10％

}调至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％

洗脱剂B：CH₃CN

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 70％

}调整至pH6.0

30％

洗脱：在40分钟内，洗脱剂B在洗脱剂A中的线性梯度从5％到

60％。

流动速率：1.8毫升/分钟

紫外检测器：254毫微米

内标准：Teicoplanin A₂(Gruppo Lepetit S.P.A)(E)能形成盐的酸官能团(F)能形成盐的氨基官能团(G)没有甘露糖单元结合到核部

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子A

(非加成盐形式)具有下列特性：(A)紫外吸收光谱，显示下列吸收峰：

波长(入)(毫微米)

a)0.1N HCl 282

b)磷酸盐缓冲剂pH7.4 282

310(肩峰)

c)0.1N KOH 302(B)红外吸收光谱，见附图4，它显示下列吸收峰(厘米^-1)

3700-3000，3000-2800，1650，1585，

1505，1460(液状石蜡)，1370(液状石蜡)，

1295，1230，1210，1150，1070，1060，

1010，845，820，720(液状石蜡)(C)¹H-核磁共振谱，见附图5，在270兆赫兹下在DMSO d_e

中，用四甲基硅烷作内标准(0.00ppm)，(δ＝ppm)

记录，显示下列信号群(以ppm表示)：0.85t(末端CH₃)，

1.0÷1.3(脂族的CH₂)，1.42m((OC-C)CH₂)，

2.00t((CO)CH₂)，2.35s(NCH₃)，2.49s

(DMSOd₅)，2.82m(Z2)，2.8÷3.6(糖

质子和Z′2)，4.12m(X6)，4.56s(X1)，

4.34d(X5)，4.41d(X7)，4.96m(X2)，

5.08-5.12(4F和Z6)，5.40d(酰氨基葡糖

醛酸的异头质子)，5.58d(X4)，5.74s(4B)，

6.05d(X3)，7.75s(6B)，6.25-8.40s，

d和m(芳族的CH和肽的NH)(D)当用逆相高压液相色谱分析时，在下列条件下，相对于Teicop-

lanin A₂组份2(R_t＝20.3分钟)的保留时间(R_t)

为1.20：

柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beckman)

4.6毫米(内径)×250毫米

前置柱：Brownlee Labs RP18(5微米)

洗脱剂A：CH₃CN 10％

}调节PH至6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％

洗脱剂B：CH₃CN 10％

}调节pH至6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％

洗脱：在40分钟内洗脱剂B在洗脱剂A中的线性梯度从5％到

60％

流速：1.8毫升/分钟

紫外检测器：254毫微米

内标准：Teicoplanin A₂组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A)(E)用FAB-MS(快原子轰击质谱)法确定的分子量为1554(F)所形成盐的酸官能团(G)能形成盐的氨官能团(H)没有甘露糖结合到核部N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₀(非加成盐形式)具有下列特征：(A)紫外线吸收光谱，显示下列吸收峰：

吸收峰波长(入)(毫微米)

a)0.1N HCl 282

b)磷酸盐缓冲剂pH7.4 282

310(肩峰)

c)0.1N KOH 302(B)红外吸收光谱，见附图6，显示下列吸收峰(厘米^-1)：

3700-3100，3000-2800(液状石蜡)，1650，

1585，1505，1460(液状石蜡)，1375(液状

石蜡)，1295，1230，1210，1150，1060，

1010，980，840，820，720(液状石蜡)(C)¹H-核磁共振谱，见附图7，在270兆赫兹下，使用四甲基

硅烷作为内标准(0.00ppm)，(δ＝ppm)，显示下列信

号群(以ppm表示)：

0.84，d(异丙基的CH₃)，1.0÷1.3(脂族的

CH₂)，1.3÷1.6((OC-C)-CH₂和异丙基的

-CH)，2.00t((OC)CH₂)，2.32s(NCH₃)，

2.49s(五氘二甲基亚砜)，2.82m(Z2)，2.9÷

3.8(糖质子)，4.12m(X6)，4.44s(X1)，

4.33d(X5)，4.37d(X7)，4.95m(X2)，

5.06÷5.10(4F和Z6)，5.38d(酰氨基葡糖

醛酸的异头质子)，5.59d(X4)，5.72s(4B)，

6.05d(X3)，7.74s(6B)，6.27÷8.5

(芳族的和肽的NH)(D)在下列条件下，当用反相高压液相色谱分析时，相对于Tei-

coplanin A₂组份2(R_t＝20.3分钟)的保留时间

(R_t)是1：30：

柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beckman)

4.6毫米(内径)×250毫米

前置柱：Brownless Labs RP18(5微米)

洗脱剂A：CH₃CN 10％

}调节至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％

洗脱剂B：CH₂CN 70％

}调节至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％

洗脱：在40分钟内，洗脱剂B在洗脱剂A内的线性梯度从5％

到60％

流速：1.8毫升/分钟

紫外检测器：254毫微米

内标准：Teicophanin A₂组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A)(E)用FAB-MS测定的分子量约为1568(F)所形成盐的酸官能团(G)所形成盐的氨官能团(H)没有甘露糖单元结合到核部

当用FAB-M S测定时，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基因子B₁抗菌素A40926的分子量约为1568，基本上与上述N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₀的物理化学特性相同，只是它在0.84δppm处有一个三重峰，该三重峰是由于在核磁共振系统中的一个正丙基所引起的，相对于上述系统中Tei-coplanin A₂组分2的保留时间为1.32。

糖苷配基抗菌素A40926具有下列特征：(A)紫外吸收光谱，见附图8，显示下列吸收峰：

吸收峰波长(入)(毫微米)

a)0.1N HCl 280

b)磷酸盐缓冲剂pH7.4 280

310(肩峰)

c)0.1N KOH 299(B)红外吸收光谱，见附图9，显示下列吸收峰(厘米^-1)：

3700-3100，3000-2800(石蜡)，1655，

1620-1550，1500，1460(石蜡)，1375

(石蜡)，1300，1205，1145，1010，970，

930，840(C)¹H-核磁共振谱，见附图10，在270兆赫兹下，用四甲基

硅烷作为内标准(0.00ppm)，(δ＝ppm)，在六氘二

甲基亚砜加CF₃COOH中记录，具有下列信号群(以ppm表示)：

2.5.1s(五氘二甲基亚砜)，250s(NCH₃)，2.88

m(Z2)，2.33m(Z′2)，4.10m(X6)，

4.34d(X5)，4.43d(X7)，4.93m(X2)，

5.04s(4F)，5.09s(Z6)，5.54d(X4)，

5.75s(4B)，6.05d(X3)，7.76s(6B)，

6.3-8.4(芳族的和肽的NH)(D)在下列条件下，当用反相高压液相色谱分析时，相当于Tei-

coplanin A₂组分2(R_t＝20.3分钟)的保留时间

(R_t)为0.59。

柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Becknan)

4.6毫米(内径)×250毫米

前置柱：Brownlee Labs RP18(5微米)

洗脱剂 A：CH₃CN 10％

}调节至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％

洗脱剂B：CH₃CN 70％

}调节至pH60

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％

洗脱：在40分钟内，洗脱剂B在洗脱剂A中的线性梯度从5％

到60％

液速：1.8毫升/分钟

紫外检测器：254毫微米

内标准：Teicoplanin A₂组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A)在相同条件下，相对于抗菌素L17054

(Gruppo Lepetit，EP-A-119575)

的保留时间为1.42。(E)用FAB-MS确定分子量为1211(F)能形成盐的酸官能团(G)能形成盐的氨官能团(H)没有甘露糖单元结合到核部

根据物理—化学特征和参照同类已知抗菌物质的结构，以A代表N-(C₁₁-C₁₂)酰氨基葡糖苷酸基和以B代表氢的上式I可归属于N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926

更具体地，以A代表正十一酰氨基葡糖苷酸基和以B代表氢的上式I可归属于N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子A，以A代表异十二酰氨基葡糖苷酸基和以B代表氢的上式I可归属于N-酰氨基糖苷配基抗菌素A40926因子B₀，以A代表正十二酰氨基葡糖苷酸糖苷配基和以B代表氢的上式I可归属于N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₁。后者可按照本发明方法从抗菌素A40926因子B₁制得，在欧洲专利公开说明书177882中所描述的逆相系统中，该抗菌素A40926因子B₁是抗菌素A40926因子B的组分，而相对于Teicoplanin A₂组分2，该A40926因子B具有的R_t值等于1.27。并扳导于下。它是从抗菌素A40926因子B中分离了因子B₀(主要因子)后获得的。

以A和B代表氢的上式I可归属于糖苷配基A40926。

在本发明说明书和权利要求书中，当讨论N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物或它们的因子或糖苷配基抗菌素A40926时，打算包括“内盐”形式以及可能的酸和碱的加成盐，

本发明化合物的抗菌活性可以在体外于不同的微生物培养物上通过标准稀释试验加以证实。

供确定MIC(最低抑制浓度)的培养基和培养条件如下：对于葡萄球菌、粪链球菌和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)用等敏试验培养液(Isosensitest broth)(O Xoid)培养24小时，对其他链球菌类用Todd-Rewitt培养液(Difco)培养24小时，对淋病奈瑟氏菌在富二氧化碳气氛下，用淋球菌培养液(Difco)＋1％Isovitalex(BBL)培养48小时，对流感嗜血杆菌用脑心培养液(Difco)＋1％Supplement C(Difco)，生长48小时，对于产气荚膜杆菌用AC培养基(Difco)在厌氧气氛下培养24小时，对于其他厌氧微生物(difficile杆菌，痤疮丙酸菌属、脆弱拟杆菌)用Wilkins-Chalgrem琼脂(参考T.D.Wilkins和S.Chalgren，1976，Antimicrob，Ag.Chemother，10.926页)，在厌氧气氛下培养48小时，对鸡败血支原体属用类胸膜肺类微生物(PPLO)培养液(Difco)+10％马血清+1％葡萄糖培养48小时，对于(U.urealyti-cum)用带有如在R.T.Evans和D.Taylor-Robinson(J.Antimicrob.Chemother.4，57)中的添加物的PPLO培养液培养24小时，在37℃接种。接种物如下：1％(容积/容积)的鸡败血支原体属48小时培养液的培养物，约10⁴变色单位/毫升的U.urealyticum，约10⁴-10⁵变色单位/毫升的最低抑制浓度的其他培养汤稀释物，约10⁴-10⁵个细菌/点(用多点接种器接种)的最低抑制浓度的琼脂稀释物(C.diffi-cile杆菌、痤疮丙酸菌属)脆弱拟杆菌。

对于一些微生物的最低抑制浓度(MlC，微克/毫升)例如表I：

表I

最低抑制浓度(微克/毫升)

N-酰氨基萄糖苷酸糖苷配基

糖苷配基抗菌素 A- 抗菌素A-菌株

40926复合物AB 40926金黄色葡萄球菌L165 0.13 0.13金黄色葡萄球菌L165(10°菌落形成单位/毫升) 0.13 0.25表皮葡萄球菌L147 ATCC12228(凝固酶阴性) 0.13 0.13酿脓链球菌L49C203 0.06 0.5肺炎链球菌L44UC41 0.13 1粪链球菌L149ATCC7080 0.13 0.5轻型链球菌L796(临床分离) 0.06 0.5产气荚膜杆菌L290ISS30543 0.25difficile杆菌L1363ATCC9689 0.25 1痤疮丙酸菌属L1014ATCC6919 0.06 1脆弱拟杆菌L1010ATCC23745 16 32

接上表

最低抑制浓度(微克/毫升)

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基菌株糖苷配基抗菌素A- 抗菌素A-

40926复合物AB 40926淋病奈瑟氏菌L997 ISM8/126 4 16流感嗜血杆菌L970 b型ATCC19418 32大肠埃希氏杆菌L47SKF 12140 ＞128 128鸡败血支原体属L431 S6 Weybridge 64 ＞128

接上页

最低抑制浓度(微克/毫升)

N-酰氨基葡糖苷酸 N-酰氨基葡糖苷酸菌株糖苷配基抗菌素A 糖苷配基抗菌素A

.40926因子A 40926因子B，B₀和B₁金黄色葡萄球菌L165 0.06 0.06金黄色葡萄球菌L165(10°菌落形成单位/毫升) 0.13 0.13出血性葡萄球菌L602(凝固酶阴性) 0.25 0.25表皮葡萄球菌L147ATCC12228(凝固酶阴性) 0.06 0.06酿脓链球菌L49C203 0.06 0.06肺炎链球菌L44UC41 0.06 0.06粪链球菌L149ATCC7080 0.13 0.13轻型链球菌L796临床分离 0.06 0.06产气荚膜杆菌L290 ISS30543 0.03 0.03淋病奈瑟氏菌L997ISM68/126 8 8流感嗜血杆菌L970b型ATCC19418 32 32大肠埃希氏杆菌L47SKF12140 ＞128 ＞128Oreaplasma urealyticum L1479临床分离＞128 ＞128

曾发现N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB及其因子对于凝固酶阴性葡萄球菌具有特殊活性。关于临床分离的的一系列表皮葡萄球菌和出血性葡萄球菌的最低抑制浓度(微克/毫升)报导如下：

表II

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌株菌素A40926复合物AB最

低抑制浓度(微克/毫升)表皮葡萄球菌L393 0.16表皮葡萄球菌L408 0.13表皮葡萄球菌L410 0.06出血性葡萄球菌L381 0.25出血性葡萄球菌L382 0.13出血性葡萄球菌L383 0.5出血性葡萄球菌L403 0.25

此外，已发现N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB的M.I.C₉₀(微克/毫升)也就是36个治疗过的临床分离的凝固酶阴性葡萄球菌至少抑制90％的浓度为0.5微米/毫升。

本发明化合物的抗菌活力在小鼠实验性败血症中也得到证实。

对照组和治疗组包括重量为18-22克的CD-1小鼠(Char-less River)。用0.5毫升细菌混悬液作小鼠腹膜内感染，该混悬液是由金黄色葡萄球菌C203(L49)的过夜培养液经用灭菌胨化盐水稀释而制得的，调整接种物，以便未处理过的动物于48小时内死于败血病。此用作试验的化合物是在小鼠感染后立即皮下给药的。到第7天，用Sperman和Karber的方法(D.J.Fin-ney“生物检疫的统计方法”Griffin，524页，1952)从每一利剂量下的存活动物百分比计算出单位为毫克/公斤的半数有效剂量值(ED₆₀)。

在这些条件下，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB和抗菌素A40926糖苷配基的ED₅₀分别为0.54和6.2毫克/公斤。

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB及其因子以及糖苷配基抗菌素A40926具有酸和碱的官能团，并且能按照常规操作同有机和无机的对应的离子形成盐。

本发明化合物有代表性的和适当的加成盐包括通过标准反应同例如下列的有机酸和无机酸形成的盐类：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、琥珀酸、柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、马来酸、富马酸、棕榈酸、胆酸、双羟萘酸、粘酸、谷氨酸、樟脑酸、戊二酸、乙醇酸、苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸等酸。

这些碱的代表例有：碱金属或碱土金属的氢氧化物如钠、钾、钙、镁、钡的氢氧化物，氨和脂族的、脂环的或芳族的有机胺如甲胺、二甲胺、三甲胺和甲基吡啶。

本发明的“非盐”化合物向相应的加成盐的转化以及与此相反，即本发明化合物的加成盐向“非盐”形式的转化属于普通技术并且包括在本发明之内。

例如通过把非盐形式的N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB和/或它的因子以及糖苷配基抗菌素A40926溶解在水溶液中并加少许过量摩尔的所选用的酸或碱，就能转化成相应的酸或碱的加成盐。然后将所得的溶液或悬浮液冷冻干燥来回收所需的盐。

当最后所得的盐不溶解在一种溶剂中而非盐形式在其中是可溶解时，则通过加入化学计算量的或少许过量摩尔的所选用的酸和碱，经过过滤从有机溶剂中回收该最后所得的盐。

这些非溶解性盐的例子是钙、镁和钡盐。

非盐形式可通过把相应的酸或碱的盐溶解于一种水溶液中然后将其中和，以便游离该非盐形式来制备。

中和作用后需要除去过量的酸或碱时，可以使用普通的脱盐方法。

例如在硅烷化的硅胶上作柱层析提纯时，通常使用非官能化的聚苯乙烯，丙烯酸和可控孔度多葡聚糖树脂(如Sephadex LH20)或活性炭。用水溶液洗脱除去不需要的盐后，用线性梯度或阶梯性梯度的水与极性的或非极性有机溶剂的混合物洗脱所需的产物，例如用从50∶50到约1000％乙腈的乙腈/水混合物。

如本专业技术人员所知，用药用的酸(或碱)或者非药用酸(或碱)来形成盐的技术可作为方便的提纯技术。在形成盐和分离后，抗菌素A40926盐的形式可以转化成相应的非盐形式或转变为药用盐的形式。

在某些情况下，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB、及因子以及糖苷配基抗菌素A40926的碱加成盐更易溶解于水和亲水溶剂中。

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926和糖苷配基抗菌素A40926的制备法：

从抗菌素A40926复合物或一个单一因子或所说因子任意比例的混合物，即A40926因子A，A40926因子B、A40926因子PA、A40926因子PB、A40926因子B₀和A40926因子B₁，通过控制水解来制备N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基因子A，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基因子B、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A4.0926因子B₀、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₁和糖苷配基抗菌素A40926。

一般来说，这种水解在有强酸存在下，于一适当的有机溶剂中完成。反应温度可有相当大的范围，可取的温度是在4℃到100℃之间，而最好在25℃到80℃之间。

反应时间依具体反应条件而变化。一般来说，反应时间在30分钟和120分钟之间。

由于可用薄层色谱法或高压液相色谱法监控反应过程，技术人员能够决定何时起始物质的水解被认为是完成了并且开始回收步骤。

强酸的代表例有无机酸或有机酸如卤化氢、氯化氢、溴化氢和碘化氢、磷酸类、硫酸、卤代乙酸如三氯乙酸、三氟乙酸、氯二氟乙酸等。

合适的有机溶剂是这样的：

a)它们至少能部份地溶解起始物质，

b)产物一旦获得后就析出或者可按常规技术从该有机溶剂中分离出来，和

c)在任何情况下，它们不干扰反应过程。

上述有机溶剂的例子是质子传递溶剂或非质子传递溶剂如(C₁-C₄)烷基亚砜类、如二甲基亚砜和二乙基亚砜，(C₁-C₄)烷甲酰胺如二甲基甲酰胺、二乙基甲酰胺、二噁烷、四氢呋喃和类似溶剂，这些溶剂当然与选用的酸互相配伍的。

一般来说，水解是在有限水量存在下完成的，例如是反应混合物的0.1到10％(重量/重量)。明显地，此水量可含于起始物、溶剂和/或反应物中，或者如果需要可以有目的地加入。

本发明的一个较好的实施例是以二甲基亚砜/浓盐酸的混合物在温度为40℃到80℃之间来描述的。二甲基亚砜/浓盐酸的典型比例是从8∶2到9.5∶0。5。浓盐酸最好是37％(重量/重量)的盐酸。

一般，反应产物是N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基类和糖苷配基的混合物。通过控制温度，并在某些情况下，控制酸的浓度和强度，从而可能至少在一定程度上把过程引导到产生二个主要产品之一即N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926族或糖苷配基抗菌素A40926。更具体的是，保持较低的温度，合理地降低酸混合物的强度并适当地控制反应时间，可提高N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基族的产量。而在较高温度下和较长时间时，仅得到糖苷配基。

在这种情况下，反应过程也得用薄层色谱或最好是高压液相色谱监控，并且当获得了所需物质的最佳产品时，可使反应中止，以便提高随后回收所得的产量。

当所得产品是N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926族和糖苷配基抗菌素A40926的混合物时，可通过色谱法例如液/液色谱、闪烁色谱、高压液相色谱和亲和色谱加以分离。

当使用亲和层析时，较好的吸附剂是如在欧洲专利EP-A-122969中所描述的固定化D-丙氨酰-D-丙氨酸。最好是琼脂糖-ε-氨基乙酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸。洗脱混合物是水性缓冲液和盐水溶液的混合物。通过训整p H和盐的浓度，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926族可与糖苷配基抗菌素A40926分离开来。

本发明进一步的目的和较好实施例是有效地制备N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB或其因子的方法，该方法包括用极性的非质子传递溶剂和强无机酸或强有机酸在有限(0.1-10％，重量/重量)水量的存在下，在室温到100℃之间最好在40℃到65℃之间，使抗菌素A40926复合物或其单一因子，抗菌素A40926复合物AB，抗菌素A40926因子A，抗菌素A40926因子B₁，抗菌素A40926因子PA和抗菌素A40926因子PB进行可控酸水解3小时到120小时。

最好的水解混合物是二甲基亚砜和37％盐酸比为9∶1到9.5∶0.5的混合物。温度最好在65℃而反应时间最好为5小时。

当制备N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基的起始物质是抗菌素A40926复合物时，所得最终产物实际上仍是一种相应于原来那些复合物的各因子的混合物，而当用单一因子作起始物时，如抗菌素A40926因子A或因子B，就可得到单一的N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基因子，它们分别是N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子A和N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B、B₀或B₁。

当得到N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基复合物A B时，可用已知现有技术如液/液色谱，最好是制备高压液相色谱使其分离为它们的单个因子。

较好的方法包括逆相液体色谱法，最好在不锈钢柱中，在中等压力(5-50巴下，或高压(100-200巴)下进行。固相可以是带有2-18碳原子(最好是18个碳)的烃相或苯基的一种硅烷化硅胶。洗脱液是由如上所述的一种极性与水可混溶的溶剂和pH值与树脂匹配的缓冲水溶液(最好是pH为4-8)组成的混合物。

最好是一种由选自于乙腈的极性水溶性非质子传递溶剂和一种pH值为4到8之间最好是6左右的缓冲溶液组成的线性梯度洗脱混合物。例如线性梯度从5％到45％的混合物乙腈/磷酸盐缓冲剂，pH6，70∶30、混合物乙腈/磷酸盐缓冲剂pH6，10∶90。

本发明的另一发明目的和较佳实施例是关于选择制备糖苷配基抗菌素A40926的方法。该方法包括将抗菌素A40926复合物或它的一种单个因子、抗菌素A40926复合物AB、抗菌素A40926因子A、抗菌素A40926因子B、抗菌素A40926因子PA、抗菌素A40926因子PB、抗菌素A40926因子B₀、抗菌素A40926因子B₁、甘露糖基糖苷配基抗菌素A40926和N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926(复合物AB/或其单因子)进行有控制的酸水解。水解时要存在：(a)一种有机亲质子溶剂，它选自于在反应温度下呈液态的脂肪酸和α-卤代脂肪酸、在反应温度下呈液态并可少量混溶于水的脂肪烷链醇和环脂肪的烷链醇、在反应温度下呈液态的并可少量混溶于水的芳基取代的低级链烷醇，其芳基部分可选择地带有C₁-C₄的烷基、C₁-C₄的烷氧基或卤素残基、在反应温度下呈液态的β-多卤代低级链烷醇。(b)与所选的强无机酸、强有机酸混溶的强酸以及氢型强酸阳离子交换树脂。(c)大约20℃到大约100℃之间的反应温度。

当亲质子溶剂选自于脂肪酸和α-卤代脂肪酸时，尽管在反应温度下，任何能够溶解足够量起始原料的脂肪酸和α-卤代脂肪酸都能使用，但具有1-5个碳原子的脂肪酸和具有2-5个碳原子的α-卤代脂肪酸能有较好的效果。

上述酸的例子是：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、三甲基乙酸、氟乙酸、氯乙酸、二氟乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、五氟丙酸、2，2，3，4，4，4-六氟丁酸、七氟丁酸等。

根据本发明的一个实例，低级脂肪酸如乙酸和丙酸，或低级α-卤代脂肪酸如氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、二氟乙酸、氯二氟乙酸、三氟乙酸和五氟丙酸是较好的反应溶剂。在这些酸性溶剂中，那些具有高的酸强度的酸可同时作为溶剂和作为强酸来促进水解反应的进行。这样就没必要再另加入强酸来促进水解反应。当三氟乙酸浓度为75％到95％，温度在60℃到90℃反应时间为0.5小时到8小时时，对于这个目的显得特别有用。

根据最佳实施例，伯链烷醇、仲链烷醇和5到10个碳原子的仲环链烷醇作为这种控制酸水解的反应溶剂是有用的。所说的链烷醇的例子有：1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、3，3-二甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、2，2-二甲基-3-戊醇、2，4-二甲基-3-戊醇、4，4-二甲基-2-戊醇、5-甲基-2-己醇、1-庚醇、2-庚醇、5-甲基-1-己醇、2-乙基-1-己醇、2-甲基-3-己醇、1-辛醇、2-辛醇、环戊醇、2-环戊乙醇、3-环戊基-1-丙醇、环己醇、环庚醇、环辛醇、2，3-二甲基环己醇、4-乙基环己醇、环辛甲醇、6-甲基-5-庚基-2-醇、1-壬醇、2-壬醇、1-癸醇、2-癸醇和3-癸醇。

芳基取代的低级链烷醇的例子如下：苄醇、间-氯苯甲基醇、邻-氟苯甲基醇、间-氟苯甲基醇、对-氟苯甲基醇、间-甲基苯基醇、间-甲氧苯甲基醇、邻-乙氧苯甲基醇、间-丁氧苯甲基醇、对-叔丁氧苯甲基醇、对-叔丁基苯甲基醇、苯乙基醇、邻-氯苯乙基醇、间-氯苯乙基醇、邻-甲氧苯甲基醇、间-甲氧苯乙基醇、邻-丙苯乙基醇、邻-乙氧苯乙基醇、对-氟苯乙基醇、对-溴苯乙基醇、邻-丙氧苯乙基醇、邻-丁氧苯乙基醇、1-(对-异丙苯基)乙醇、3--苯-1-丙醇、2-苯-1-丙醇、4-苯-1-丁醇和3-苯-1-丁醇。

当有机亲质子溶剂是选自于在反应温度下呈液态的β-多卤代低级链烷醇时，β-氯代-和/或氟代链烷醇最好是1到4个碳原子。所述的β-多卤代低级链烷醇的例子是：二氯乙醇、三氯乙醇、二氯氟乙醇、二氟氯乙醇、二氟乙醇、三氟乙醇、1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇、2，2，3，4，4，4-六氟丁醇、2，2，3，3，4，4，4-七氟丁醇。

用以制备糖苷配基抗菌素A40926较好的水解条件是在40℃到100℃，最好在65℃到70℃温度下，用一种极性非质子传递溶剂和一种有限量的水(0.1-10％W/W)存在的强无机酸或有机酸的混合物控制水解1-4小时。

水解混合物最好是由8∶2到9.5∶0.5的二甲基亚砜和37％盐酸组成的混合物，温度大约80℃，反应时间大约3小时。

在此说明，在上述条件下，作为抗菌素A40926复合体(或其单个因子或所述因子的混合物)糖部份的部份水解的产物，甘露糖糖苷配基抗菌素A40926和N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926(复合物AB或其单个因子)在这些条件下也转变成糖苷配基抗菌素A40926。

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物和单因子A、B、B₀、B₁和糖苷配基抗菌素A40926对于很多由于广泛传播感染的革兰氏阳性菌的作用是可靠的。由于这些病原体提高了对惯常治疗方法的抵抗力，非常需要有新的抗菌素药物。

一般来说，为抗菌治疗，N-酰氨基糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB，它的因子和/或糖苷配基抗菌素A40926以及它的无毒的药用盐或它们的混合物可以不同的途径给药，如局部给药或肠胃外给药。肠胃外给药方法一般来说是较好的给药途径。

针剂组合物可采用混悬液、溶液或在油或水赋形剂中的乳液。还可以含有如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂这样的辅助剂。

有效成份也可制成粉剂形式，当一种适当的赋形剂如灭菌水加入时再成为液体。

根据给药途径，这些化合物可配制成不同的形式。

在一些例子中，本发明的化合物可通过已知的工艺(参见“Remingtono药物科学”第十五版，Mack出版公司，Easton宾西法尼亚，美国，1614页)制成适于口服的包有肠溶衣的药剂。

当特别希望该抗菌物质在肠道被吸收时，不改变地通过胃道时，这样做是很重要的。

所施用的有效成份的量取决于各种因素，如治疗对象的大小和条件，给药的途径和频率以及所含的引发剂。

本发明的命名为N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926和糖苷配基抗生素A40926及它们的药用盐的这些抗菌物质，当每日剂量在每千克体重大约0.5到50毫克有效成份时一般是有效的，最好每天服用1-4次。

最好是将其配成单位剂量为约100至5000毫克的药剂。

延缓作用的配方，可按已知技术用各种机械方法制备。

制备含N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926、糖苷配基抗菌素A40926的延缓作用成份的理想方法包括使用不溶于水形式的该抗菌素悬浮在水或油介质中。

药物组合物的制备：

用于肌肉注射的一个单位剂型是用5毫升灭菌悬浮液(USP)制成，该悬浮液中含8％丙二醇和500毫克N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB的药学上允许的碱加成盐。

用于肌肉注射的一个单位剂型是用5毫升灭菌悬浮液(美国药典)制成，该悬浮液中含8％丙二醇和500毫克N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子A的药学上可允许的碱加成盐。

用于肌肉注射的一个单位剂型是用5毫升灭菌悬浮液(美国药典)制成，悬浮液中含8％丙二醇和500毫克N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B的药学上可允许的碱加成盐。

用于肌肉注射的一个单位剂型是用1000毫克N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926以不溶于水的酸形式悬浮在5毫升注射水中制备的。

本发明的抗菌素对于抑制可在肠中引起假膜结肠炎的顽固的梭状芽胞杆菌的生长是有用的。这些抗菌素可通过口服有效剂量的该抗菌素或其药学上可允许的盐来用于治疗假膜结肠炎，为此目的，该抗菌素可以明胶胶囊形式或悬浮液形式服用。

除了它们的医用活性外，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926、糖苷配基抗菌素A40926和它们的药用盐可用作动物生长促进剂。

为此目的，本发明的化合物可加到适当的饲料中口服。使用的正确浓度是当消耗正常量饲料时能供给生长促进受体有效量的活性剂。

将本发明的活性化合物加入到动物饲料中去时，最好是先调制含有活性化合物有效量的预混合物，再将预混合物掺合到全部食物中。

也可将含活性成份的中等浓缩物或食物添加剂掺入饲料。

这种饲料预混合物和全饲料的制备和服用的方法在一些参考书中已作了描述，(如“实用动物营养”W.F.Feedman和CO，洛杉矶，美国，1969或“家畜饲料和饲养”D和B册，Corvallis俄勒冈，美国1977)，并通过引用结合到本发明中。

A401926起始物质的描述和制备

抗菌素A40926复合物、抗菌素A40926因子A、因子B、因子B₀、因子PA或因子PB的生产可在有氧条件下，在含有可同化的碳源、氮源和无机盐的中性水介质中培养一个能产生它的足肿放线菌(Actinomadura sp.)，即足肿放线菌ATCC39727或者产生它的抗菌素A40926的一个变种或突变株达到。很多通常用于发酵工业中的中性介质都可使用。但某些介质更好些。较好的碳源是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、淀粉、谷物粗粉等。较好的氮源是氨、硝酸盐、大豆粗粉、胨、内提取物、酵母提取物、胰化胨、氨基酸等。可加入培养基介质的无机盐是可产生钠、钾、铁、锌、钴、镁、钙、氨、氯化物、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐等离子的可溶性盐。

通常生产抗菌素的菌株在一个震荡烧瓶中预培养，再将培养物接种到发酵罐中以生产相当量的抗菌素物质。用作预培养的介质可以与用于大量发酵的相同，也可用另一些介质。生产抗菌素A40926的菌株可在20℃到40℃温度之间生长，最好是24℃到35℃之间。

在发酵过程中，可以通过生物测定或薄层色谱法或高压液相色谱法检测发酵液或菌丝提取物样品的抗菌活性以监控抗菌素的生产。

对抗菌素A40926敏感的有机体如枯草杆菌(Bacillussubtilis)和金黄色链霉菌(S.aureus)可被用来作为试验有机体。在琼脂板上通过琼脂糖扩散法进行生物测定是很方便的。最大抗菌活性一般出现在发酵的第二到第五天之间。

抗菌素A40926是通过培养足肿放线菌Actinomadurasp.ATCC39727，或它的产生抗菌素A40926的突变体或它的变种来生产的，并主要在培养液中找到。

足肿放线菌Actinomadura Sp.ATCC39727已于1985年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其编号为CGMCC No.0060。

下面描述了足肿放线菌(Actinomadura sp.)A40926ATCC39727的特征：

肉眼和显微镜检查

营养菌丝体由弯曲而分支的菌丝(直径大约0.8微米)组成。这些菌丝体在某些介质中，在表III中用星号标明的介质中，生长几天后稍有分裂成为棒杆状单元的倾向，而在葡糖-氨羰丙氨酸介质中，它分裂成为球状单元。

这种菌株的特征是该营养菌丝体在某些介质中的Burgundy色。

气生菌丝体只在不多的介质中出现，特别是在表III所列的介质中，它只在燕麦琼脂和土壤琼脂上出现。在这些介质中，气生菌丝体是灰-白色的，并形成排列成钩状的胞子柄，并具有大约10到20个孢子。

孢子是园柱形的且平均尺寸为0.8×1.2微米

生长特性的测定：

为检验生长特性，在Shirling和Gottlieb提出的各种标准介质中培养足肿放线菌ATCC39727(SHirling E.B.和Gottlieb D.，1966-Method for Characterizationof Streptomyces species-Int.J.Syst，Bacteriol，16，313-340)。培养介质中加入有Waksman建议的几种介质(Waksman，S.A.1961-The Actinomycetes-The Wil-liams和Wilkins Co.Baltimore；Vol.2，328-334)。

只要需要，可用Maerz和Paul的方法(Maerz A.和M.Red Paul.1950-A Dictionary of Color-第二版。McGraw-Hill Book Company Inc.纽约)进行颜色测定。

用Shirling和Gottlieb所描述的方法来调查有机体利用不同碳源的能力。

表III、IV、V报导了培养特征、生理特征和碳源的利用。

表III的读数是在28℃温度下培养二星期后取得的。

表III

足肿放线菌菌株ATCC39727

的培养特征培养介质特性2号介质(酵母大量生长，有坚硬表面，8/L/8提取物—麦芽琼微量琥珀—粉红色的可溶色素脂)3号介质(燕麦大量生长，有光滑表面，紫色，琼脂) 55/E/4，气生菌丝体呈非

常淡的灰色，可溶的紫罗兰色素

55/H/4。4号介质(无机中等生长，有光滑且薄的表面，盐—淀粉琼脂) 米色10/D/2。5号介质(甘油中等生长，有光滑且薄的表面，—天冬酰胺琼脂) 杏黄色10/B/2。6号介质(胨— 中等生长，有稍硬表面，琥珀色酵母提取物铁琼脂) 12/D/97号介质(酪氨酸大量生长，有光滑且薄的琼脂) 表面，琥珀色-褐色13/K/12燕麦粉琼脂^* 大量生长，有光滑的表面，

Burgundy色8/L/7，

气生菌丝体，中等淡黄色—

灰色44/B/2Hickey和Tresner 大量生长，表面皱褶，琥珀的琼脂^* —褐色13/K/12Czapeck葡糖琼脂中等生长，具有光滑的表面，

淡黄色9/I/3葡糖天冬酰胺^* 很少生长，有奶油状表面稻草琼脂黄9/E/1营养琼脂大量生长，表面皱褶，淡枯黄

色11/C/7土豆琼脂^* 大量生长，表面皱褶，Bur-

gundy色，8/L/9Bennett铁琼脂大量生长，表面坚硬，Bur-

gundy色8/L/8，可溶深

色琥珀玫瑰色色素5/J/10苹果酸钙琼脂中等生长，具有光滑表面，杏

黄色10/B/3脱脂奶琼脂大量生长，表面略有皱褶

桔黄9/B/9Czapeck蔗糖琼大量生长，表面光滑，杏黄脂色10/B/6卵清蛋白琼脂大量生长，表面光滑，玫瑰色

52/B/3，微量可溶性色

素，玫瑰色52/B/3Sabouraud琼脂不生长土壤琼脂生长稀少，无色，气生菌丝体

白—灰色葡糖胰化胨琼脂中等生长，具有光滑且薄的表面，

淡黄10/G/2土豆塞大量生长，桔黄—褐色，

微量白—灰色气生菌丝体。

生理特性

表VI 生理特性试验结果淀粉水解阴性生成H₂S 在6号介质上为阴性

用醋酸铅条为阳性酪氨酸反应阳性酪蛋白水解阳性苹果酸钙水解阴性明胶液化阳性纤维素分解阴性硝酸盐还原阳性

碳源的利用表V 碳的利用

碳源生长阿拉伯糖 +木糖 +甘露糖 +果糖 +棉子糖 +鼠李糖 +葡萄糖 +乳糖 +半乳糖 +肌醇 -蔗糖 +纤维素 -水杨苷 +甘露糖醇 +核糖 -

+＝生长

-＝不生长

化学分类学特征细胞壁分析：

用Beker等人“通过全细胞水解产物时的纸层析快速鉴定土壤丝菌与链霉菌”Appl.Microbiol12，421-423(1964)中表述的方法分析细胞壁中的氨基酸。

全细胞水解产物的分析表明存在内消旋二胺基庚二酸。

用Kawamoto等人的方法(I.Kawamoto，T.O_Aa ，和Nara，“Micromospora，Olivoasterospora，Micromo-nospora sagamiensis和有关有机物的细胞壁组成”J.ofBacteriology 146 527-534，1981)分析纯细胞壁发现没有甘氨酸。

糖分析：

用M.p.Lechevalier的方法(“临床重要的需氧放线菌的鉴定”J.Lab.Clin.Med.71，934-944，1968)，用下列溶剂系统：乙酸乙酯-吡啶-水(100∶35:25体积比)，按J.L.Staneck和G.D.Roberts描述的方法(用薄层色谱鉴定需氧放线菌的简单方法)28，226-231(1974)用薄层色谱纤维片分析糖的含量。

结果表明主要存在的是葡萄糖和核糖，只检测到少量半乳糖，甘露糖和足肿菌糖(3-O-甲基-D-半乳糖)。

霉菌酸：

用Minnikin等人的测试鉴定法来检测霉菌酸的存在。(D.E.Minnikin，L.Alshamaony 和M.Goodfellow，“用整的有机体甲酸分解的薄层色谱分析来区分Mycobacterium，Nocardia及有关生物类别”Journal of General Mic-robiology88，200-204，1975)。

测定结果为阴性：没发现霉菌酸。

菌株的鉴定：

由于存在内消旋二氨基庚二酸和足肿菌糖，在肽聚糖中没有甘氨酸，没有霉菌酸以及形成具有中长孢子链的气生菌丝体，所以该菌株被称为放线菌类足肿放线菌。

与其它微生物一样，生产A40926的菌株特征会发生变异。例如用各种已知的诱变因素如紫外线、X射线、高频放射性射线及化学剂如亚硝酸、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍和很多其它药剂处理可以得到该菌株的人工变异体和突变体。所有属于足肿放线菌类并生产A40926抗菌素的天然和人工变异株以及突变体都看作与足肿放线菌ATCC39727菌株是等同的并被认为都在本发明的范围之内。

从该生产微生物的发酵液中回收A40926抗菌素是按照本身已是公知的技术来进行的。这些技术包括用溶剂提取，通过加入非溶剂或改变溶液pH值的方法来沉淀、分割色层法、逆相分割色层法、离子交换色谱法、亲和色层法及诸如此类的技术。

较好的步骤包括先在固相的D-丙氨酰-D-丙氨酸上进行亲和色层分离再作逆相柱色层分离。

适用于本回收方法的固相D-丙氨酰-D-丙氨酸的基体在欧洲专利申请83112555中已被公开。本方法用的基体最好是与一种受控的微孔交链葡聚糖偶连的D-丙氨酰-D-丙氨酸。

发酵液在过滤或经初步提纯后可直接进行亲和色谱；这后一工艺包括为了溶解被吸附在菌丝体上的抗菌素物质，先使整个发酵物呈碱性，最好pH值在8.5到10.5之间，然后再进行过滤。调整澄清滤液的pH值到2.5-4.5，借助滤剂再次过滤，并弃去滤液，回收到的滤饼悬浮在水中，使其成碱性，pH值最好8-9，再进行过滤。对滤饼重复相同过程而将这些滤液，它们含有抗菌素A40926收集起来。

把这些滤液或过滤过的发酵液再在固定的D-丙氨酰-D-丙氨酸上进行柱式或分段式亲和色层分离。

最好是在pH值大约7.0-8.0时进行A40296抗菌素物质与亲和基体的结合，而它们的洗脱剂则要使用碱的水溶液，在更为碱性的pH值下进行(最好在9.0到10.5之间)。碱的水溶液可以是氨、挥发性胺、碱或碱金属的氢氧化物或最好在极性有机溶剂如以下定义的可混溶于水的溶剂的存在下的碱性缓冲溶液。

必要时，也可用含盐、尿素和/或可混溶于水的溶剂的pH4-9的缓冲溶液冲洗柱以去除杂质后，用上述洗脱混合物洗脱抗菌素A40296，这种抗菌素物质粗品然后最好用从收集到的含抗菌素的组份中通过用能与水生成最低共沸混合物的有机溶剂进行共沸蒸馏除水回收，再加入一种非溶剂将所需的产品沉淀。

能与水形成最低共沸混合物的代表例是：正丁醇、苯、甲苯、丁醚、四氯化碳、氯仿、环己烷、2，5-二甲基呋喃、己烷和间二甲苯，最好的溶剂是正丁醇。

非溶剂的例子是：石油醚、诸如乙醚、丙醚和丁醚这样的低级烷基醚、如丙酮这样的低级烷基酮。

可选用的另一方法是，将汇集起来的含抗菌素的组份首先用上述规定的有机溶剂进行共沸蒸馏的方法，浓缩到很小的一个体积，再将得到的这种水溶液冷冻干燥。

如果用于洗脱的碱液是不挥发的，则在沉淀或冷冻干燥之前必须对该浓缩物先进行中和和脱盐。

简便的脱盐步骤包括将该含抗菌素的水溶液加到一个硅烷化的硅胶柱上，用蒸馏水洗涤并用可与水混溶的极性溶剂与水的混合物洗脱。

可与水混溶的极性溶剂有代表性的例子是：水溶性醇类(如甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇)、丙酮、乙腈、低级烷基链烷酸酯(如乙酸乙酯)、四氢呋喃、二噁烷和二甲基甲酰胺以及它们的混合物，最好的可与水混容的极性溶剂是乙腈。

可选择使用的另一种脱盐方法是将含抗菌素的溶液加到上述亲和柱上，用蒸馏水洗涤并用上面提到过的用于亲和色谱洗脱的挥发性碱水溶液洗脱。

这样得到的产品是抗菌素A40926的复合物，必要时它可以进一步纯化或进行诸如它的因子A、B、B₀、PA和PB的分离。

一个取得纯净的抗菌素A40926复合物的简易步骤可在一个亲和色谱柱上，进一步纯化如上所获得的复合物。作为代表，一般使用与上述相同的固定相(固定化的D-丙氨酰-D-丙氨酸)，并在如上所述的固定化D-丙氨酰-D-丙氨酸上通过以下的亲和色谱步骤洗脱所希望的抗菌素物质。

固定化的D-丙氨酰-D-丙氨酸最好是琼脂糖-ε-氨己基-D-丙氨酰-D-丙氨酸，平衡混合物最好是含2M NaCl pH调至7-8的0.16％(重量/体积)的氨。冲洗液最好是含2MNaCl的pH调至8-9.5的0.16％(重量/体积)氨，洗脱混合液最好是含2M NaCl的pH值调至0.5-12的0.16％(重量/体积)的氨，特别是上述混合液的pH调至11.5更好。

抗菌素A40926的因子，也就是抗菌素A40926因子A、抗菌素A40926因子B、抗菌素A40926因子B₀、抗菌素A40926因子pA和抗菌素A40926因子PB，可通过色谱法，最好是用逆相柱色谱法从抗菌素A40926复合物的水溶液中被分离出来。用于逆相柱色谱法中的固定相最好是硅烷化硅胶，如那些商品名为大网状树脂(Ambcrlitc XAD)-2，大网状树脂-4，大网状树脂-7和大网状树脂-8(Rohm和Haas)或Diaion HP20(Mitsubishi)这样的，在未官能化的苯乙烯和丙烯酸树脂上进行柱色谱分离也会得到较好的结果。

当用硅烷化硅胶作为固定相进行逆相纯化步骤时，柱最好用缓冲水溶液预平衡，绂冲液的pH是4-9，最好是5.5-6.5。然后用在同一绂冲溶液中的线性梯度的可与水混溶的极性溶剂进行洗脱。有代表性的可与水混溶的极性溶剂是：水溶性醇(如甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇)、丙酮、乙腈、四氢呋喃、二噁烷和二甲基甲酰胺以及它们的混合物，最好的可与水混溶的极性溶剂是乙腈。

用诸如纸盘测试法或琼脂扩散法这样的在敏感微生物上的普通生物鉴定法来测定洗脱组份中抗生素的含量。敏感微生物可以是枯草杆菌和金色链霉菌(S.aureus)。

色谱法也可方便地用薄层色谱或高压液相色谱技术监控。

高压液相色谱技术可用按照上面在涉及用高压液相色谱步骤分析抗菌素A40926时描述过的方法，利用多孔和球形颗粒的硅烷化硅胶的逆向高压液相色谱作为代表。

将具有类似抗菌素成份的组份汇集起来，并如前所述对它脱盐，以得到基本上纯的抗菌素A40926因子A、因子B、因子B₀、因子PA和因子PB。

从含有各种因子的这些组份中用各种各样已知技术如冷冻干燥、用非溶剂沉淀或改变该水溶液pH值沉淀来得到基本纯的抗菌素A40926因子A、抗菌素A40926因子B、抗菌素A40926因子B₀、抗菌素A40926因子PA和抗菌素A40926因子PB。

一个简易的方法包括加入一种可以与水形成共沸混合物的溶剂，用共沸蒸馏除去水，然后再加入一个前面提到过的那些非溶剂、过滤收集得到的沉淀。

抗菌素A40926因子PA和PB，至少在一些特定的发酵条件下，是产生A40926微生物的主要抗菌产物。

抗菌素A40926因子A和B分别是抗菌素A40926因子PA和因子PB的主要转化产品，而且经常已存在在发酵液中。

已发现，在碱性条件下，抗菌素A40926因子PA可以转化成抗菌素A40926因子A，抗菌素A40926的因子PB可转化为抗菌素A40926因子B。例如，用0.5-10％的氨水或如有机胺这样的其它亲核碱，在室温下处理8-24小时，抗菌素A40926因子PA和抗菌素A40926因子PB就分别转化成抗菌素A40926因子A和因子B。

因此当发酵液或含抗菌素A40926的提取物或浓缩物，在碱性条件下维持一定的时间(例如亲核碱的水溶液，在pH＞9下过夜)，总是得到富集抗菌素A40926因子A和因子B的抗菌素40926复合物，如果发酵液、它的提取物或浓缩物处在碱性环境中的时间短，得到的抗菌素A40926复合物富含抗菌素A40926因子PA和PB。

一个得到富含因子A和因子B的抗菌素A40926复合物的最好步骤包括将抗菌素A40926复合物(主要含抗菌素A40926因子PA和PB)的溶液在室温下，在如氨水这样的亲核碱溶液中放置8-12小时，然后按前面所述那样分离该所需的抗菌素复合物。

含A40926溶液的例子是发酵液、它的提取物和用亲和色谱的洗脱组份。

可以用如前所述的亲和色谱法进一步纯化这种复合物粗品，得到纯的抗菌素A40926。

这样得到的具有可以从其纯因子得到的生物和生理化学性质的产品，在实例中将被称为抗菌素A40926复合物AB。

一个使抗菌素A40926复合物富集因子PA和PB的最好步骤包括用一个酸、最好是象硫酸或盐酸这样的无机酸迅速中和用亲和色谱法洗脱的组份。

根据上述的方法之一可从这种复合物中分离出纯的抗菌素A40926的PA因子和PB因子。一个较好的方法为反向液相色谱法，最好是用中等压力(5-50巴)或高压(100-200巴)下的不锈钢色谱柱。固相可以是一种硅烷化的硅胶，它具有一个2-18(最好是18)碳原子的烃相或具有苯基基团，洗脱液是一种混合物，由一种上面所规定的与水可混溶的极性溶剂和一种具有与树脂匹配pH值(最好pH为4-8)的缓冲剂水溶液组成。

用通常的方法来监测洗脱液，把具有相同抗菌素内容物的组分汇集在一起，并按前面提到过的方法进行处理，以分离出具有下面报导特性的纯化合物。

先进的高压液相色谱分析表明，抗菌素A40926的B因子实际上是被称做B₀因子和B₁因子的混合物。

抗菌素A40926的B₀因子在抗菌素A40926的B因子中占90％左右。在后面叙述到的关于B因子的物理—化学特性的D点所述的体系中，这种B₀因子是相对于Teicoplanin A₂的组分2具有R_t为1.22的因子，而在抗菌素A40926的B因子中占10％左右的B₁因子是在同样的体系中具有相对R_t值为1.27的因子。

通过例如采用反复进行反相色谱分离程序来进一步纯化抗菌素A40926的因子，就可获得纯净的抗菌素A40926的B₀因子。

抗菌素A40926的B₀因子在物理—化学及生物性质上基本上与抗菌素A40926的B因子相同，只是在用象上面引述的一种体系来进行高压液相色谱分析时，B₀因子只显示一个峰(在所述的高压液相色谱体系中，相对于Teicoplanin的组分2的R_t值为1.22)。

在本发明所公开的内容中，由于抗菌素A40926的B因子和B₀因子之间存在着上面指出的相似性，因此可以这样理解，在提到抗菌素A40926B因子的生物性质时要理解为同时也是指作为抗菌素A40926B因子的主要成分并对其生物性质作出主要贡献的B₀因子。

作为选择，本发明的抗菌素物质也可从发酵液中分离出来，或者利用强的或弱的阴离子交换树脂来进一步纯化，这些树脂包括官能团化的聚乙烯、聚丙烯的基质或聚葡聚糖的基质。作为弱阴离子交换树脂的例子可以是：Dowex MWA-1或WGR(Dow化学公司)，Amberlite IHA-73(Rohm及Haas公司)，及DEAE-琼脂糖凝胶(Sepha-rose)(Pharmacia公司)等商业名出售的树脂，可以用于本发明的强阴离子交换树脂的例子有以：Dowex MSA-1、SQR、SBR-P(Dow公学公司)、Amberlite IR-904(Rohm及Haas公司)以及QAE-琼脂糖树脂(Sepharose)(Pharmacia公司)等商品名出售的树脂。

从这些树脂上洗脱抗菌素A40926，是用在水中或水和可与水混溶的有机溶剂混合物中的像NaOH或KOH这样的电解质水溶液的线性梯度混合物进行的，所说可与水混溶的有机溶剂有低级醇(如C₁-C₄的链烷醇)或低级酮(如丙酮)等。

甘露糖糖苷配基抗菌素A40926是把富含A因子和B因子的抗菌素A40926复合物、抗菌素A40926的A因子、B因子、B₀因子或其混合物在受控的酸性条件下进行水解而制得的。

这些受控的酸性条件是以一种无机或有机强酸浓的水溶液(按需要可以有质子惰性的有机溶剂存在)来实现的。硫酸和磷酸是强无机酸较好的例子。

强有机酸最好是三氟乙酸。

质子惰性有机溶剂最好是脂环烃或环烷醚(如二噁烷和四氢呋喃)、低级烷基亚砜(如二甲基亚砜)和低级烷基酰胺(如二甲基甲酰胺)。

反应温度通常保持在0℃到该反应混合物的回流温度之间。在很多场合下，反应温度为15℃至75℃，较合适的温度为20℃至55℃，而最好是室温。

反应时间随具体的反应参数而变化，并由于该反应过程可以用薄层色谱或高压液相色谱技术来跟踪，所以专业技术人员可以监测该反应的过程并决定什么时候可以认为反应已经完全。

本发明方法的一个较好实施方案是用在室温下及在存在80-95％的三氟乙酸水溶液的条件下对抗菌素A40926复合物或它的一个纯因子进行受控水解处理以得出甘露糖糖苷配基抗菌素A40926来说明。

本发明方法的另一个较佳实施方案是用在有2:1至1:2的1-2N硫酸水溶液与二噁烷混合物存在的条件下对甘露糖糖苷配基抗菌素A40926进行受控水解来说明。

在水解步骤结束时所回收的甘露糖糖苷配基A40926粗品可用一些本身是公知的技术来纯化，这些技术有：如加入非溶剂使其沉淀、用溶剂萃取及色谱分离等。

较好的色谱分离方法包括柱色谱法，而最好的色谱分离技术是反相柱色谱法。

一种合适的反相液相色谱法最好是采用中压(5-50巴)或高压下(100-200巴)的不锈钢色谱柱。固相可以是一种硅烷化的硅胶，要具有一种2-18(最好18)碳原子的烃相或苯基基团。而洗脱液是由一种与水可混溶的极性溶剂和一种具有与树脂匹配pH值(最好pH为3-8)的缓冲剂水溶液组成的混合物。

具有代表性的与水可混溶的极性溶剂有：与水可混溶的醇类(如甲醇、乙醇、异丙醇、亚丁醇等)、丙酮、乙腈、低级链烷酸烷基酯(如乙酸乙酯)、四氢呋喃、二噁烷和二甲基甲酰胺以及它们的混合物；而其中最适合的与水可混溶的极性溶剂是乙腈。

用常用的对敏感微生物的生物测试方法，例如纸盘分析法或琼脂扩散分析法来分析洗脱组分中的抗菌素含量，这些敏感微生物有芽孢杆菌属、枯草杆菌及S.aureus。

纯化的反应过程皆可方便地应用薄层色谱或高压液相色谱技术来加以监测。

一种较合适的高压液相色谱技术是用18烷基基团官能化的多孔球颗粒的硅烷化硅胶作色谱柱的反相高压液相色谱，这种硅胶颗粒的直径最好是5微米(例如Beckman公司5微米的Ultrasphere^(注册商标)ODS Altex)，还采用一个预置柱，其内装有用C-18烷基进行官能化处理过的硅胶(如Brownlee实验室的RP18)，另外，所用的洗脱液是一种在一缓冲水溶液中与水可混溶的极性溶剂(上面描述的任一种)的线性梯度混合物。

最好把该溶液调到pH5-7。而最合适的洗脱液是一种在洗脱液A中的线性梯度从5-60％的洗脱液B，其中的洗脱液A是一种乙腈/缓冲剂水溶液混合物，其pH为5-7，混合比例为10∶90，而洗脱液B也是一种乙腈/缓冲剂水溶液的混合物，其pH为5-7，混合比例为70∶30。正如专业技术人员都知道的那样，很多种物质都可用作内标。在此情况下，其中很方便的一种内标是抗菌素L17054，它在这种高压液相色谱体系中的保留时间与本发明化合物的相接近。这种内标物质属于现有技术，并在欧洲专利申请公开No.0119575中已有描述。

本发明化合物的抗菌素活性可借助于在试管中对不同的微生物培养物进行标准稀释试验来演示。

抗菌素A40926的A因子的物理—化学特性：A)附图11中表示了紫外吸收光谱，显示出以下的吸收峰峰位

入峰位(毫微米)a)0.1N HCl 281b)磷酸盐缓冲液pH7.83 281

300(肩峰)c)0.1N NaOH或KOH 300d)甲醇 282e)磷酸盐缓冲液pH9.0 282

300(肩峰)B)附图12中表示了红外吸收光谱，显示出以下的最大吸收峰(厘米^-1)：3700-3100，3100-2800(液体石蜡)；1655；1620-1560；1510；1480-1410(液体石蜡)；1375(液体石蜡)；1320-1250；1250-1190；1100-950；845；810；720(液体石蜡)。C)附图13表示了¹H-核磁共振谱，显示出在270兆赫处记录到的各种基因的信号(以ppm表示)，所用介质为六氘二甲基亚砜(DMSOd₆)，用四甲基硅烷(TMS)作内标(0.00ppm)，(δ＝ppm)：δ0.86(t ′s，6H)；1.21(～11H)；1.43(2H)；2.01(2H)；2.31-2.34(3H)；

4-6.2(～16H)6.2-8(～23H)8.44，

9.22，9.66(宽频带；游离质子)

2.5-4：受H₂O峰的干扰。D)用反相高压液相色谱在以下条件下进行分析时，相对于Teicop-lanin A₂组分2(R_t＝20.3分)的保留时间(R_t)为1.12，这些条件是：色谱柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beckman

公司)4.6毫米(内径)×250毫米预置柱：Brownlee实验室生产的BP18(5微米)洗脱液A：CH₃CN 10％

}调至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄.H₂O 90％洗脱液B：CH₃CN 70％

}调至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄.H₂O 30％洗脱：洗脱液B在洗脱液A中的线性梯度是从5％，至60％，洗脱

时间40分钟。流速：1.8毫升/分紫外检测器：254毫微米内标：Teicoplanin A₂的组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A.)在相同条件下，相对于Testosterone(Roussel Uolaf公司)的保留时间为0.60。E)把样品置于惰性气氛中、在140℃下进行干燥(失重4.6％)，然后进行元素分析，分析得出如下的近似百分比组份：碳55.82％；氢5.17％；氮6.31％；总氯4.24％；离子氯0.37％；在空气中于900℃下灼烧所得的无机物残渣为1.2％。F)酸碱滴定，在2-甲氧基乙醇(MCS)∶水为4∶1的溶液中先加入过量的HCl，再以KOH回滴，分析结果表明，存在四个可离解的官能团，它们分别具有下列的pK_Mcs：4.6，5.6，7.2，9.2 。G)在如下的色谱体系中，获得的R_f值为0.24，相对于Tei-coplanin A₂的组分2的R_f为0.70，所说的色谱体系为：5％(重量/体积)的Na₂SO₄水溶液 70乙腈 30使用硅烷化的硅胶60F₂₅₄ Merck板(层厚0.25毫米)

目测：——在紫外线照射下——FPanly试剂(即重氮化的对氨基苯磺酸)作用时出现黄色

(J.Chromatog.20，171(1965)；Z.Physiol.Chem.

292，99，(1953))——利用芽孢杆菌属枯草杆菌ATCC6633在最低Davis培养

基上进行生物自显影法H)由FAB-质谱图上所显示的M＋H^峰为1717来减算，其分

子量应为1716。

抗菌素A40926的B因子的物理—化学特性：A)附图14表示了紫外吸收光谱，并显示下列最大吸收峰峰位：

入峰位(毫微米)

(a)0.1N HCl 282 (b)磷酸盐缓冲液pH7.38 281

300(肩峰)(C)0.1N NaOH或KOH 300(d)磷酸盐缓冲液pH9.0 283

300(肩峰)(e)甲醇 282B)附图15中表示了红外吸收光谱，并显示出下列最大吸收峰峰位(厘米^-1)：3700-3080，3080-2700(液体石蜡)；1720-1625；1625-1560；1505；1460(液体石蜡)；1375(液体石蜡)1295；1230；1210；1150；1100-1040；1030；1015；970；890；840；810；720(液体石蜡)。C)附图16中的¹H-核磁共振谱显示了在270兆赫频率处所记录到的基团信号(以ppm表示)，它是以六氘二甲基亚砜为介质，以四甲基硅烷为内标(0.00ppm)，(δ＝ppm)；δ0.85(d，异丙基上的CH₃)；1.15(～13H)；1.44(～2H)； 2.02(2)；2.32-2.35(3H)；4-6.1(～16H)6.1～8(～23H)；8.52，9.30，6.68(宽频带；游离质子)。2.5～4受到H₂O峰的干扰。D)当用反相高压液相色谱在下列条件下进行分析时，所获的相对于Teicoplanin A₂的组分2(R_t＝20.3分)的保留时间(R_t)为1.12和1.27。

色谱柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beck-

man公司)柱子尺寸为

4.6毫米(内径)×250毫米长。

预置柱：Brownlee实验室生产的RP18(5微米)

洗脱液A：CH₃CN 10％

}调至pH＝6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄.H₂O 90％

洗脱液B：CH₃CN 70％

}调至pH＝6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％

洗脱：洗脱液B在洗脱液A中的线性梯度是从5％至60％，洗

脱时间为40分钟。

流速：1.8毫升/分

紫外检测器：254毫微米

内标：Teicoplanin A₂的组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A)E)元素分析，先把样品置于惰性气氛中，在140℃下进行干燥(失重为9.6％)，然后进行分析，分析结果表明，样品具有如下的近似百分组份(平均值)：碳54.09％；氢5.13％；氮6.34％；总氯4.12％；离子态氯0.39％，于空气中在900℃下灼烧所剩无机残渣：5％。F)酸碱滴定，在2-甲氧基乙醇(MCS)∶ H₂O为4∶1的混合物中，先加入过量的HCl(pH2.7)，然后用KOH进行回滴，其结果表明有四个可离解的官能团，其pK_MCS为：4.5，5.6，7.2，9.2 。G)在下列色谱体系中，获得的R_f值为0.21，相对于Teicop-lanin A₂的组分2的R_f为0.53，所说的色谱体系为：5％(重量/体积)的Na₂SO₄水溶液 70乙腈 30使用硅烷化的硅胶60F₂₅₄ Merck板(层厚0.25毫米)

目测：——在紫外光下——以Pauly试剂(即重氮化的对氨苯磺酸)作用时出现黄色

(J.Chromatog.20，171，(1965)；

Z.Physiol.Chem.292，99，(1953))——利用芽孢杆菌属枯草杆菌ATCC6633于最低Davis培养

基中进行生物自显影。H)由FAB-质谱图上显示的M＋H^峰为1731来减算，其分子量应约为1730。

抗菌素A40926的B₀因子的物理—化学特性：A)附图14中表示了紫外吸收光谱，并显示出如下最大吸收峰峰位：

入峰位(毫微米)

(a)0.1N HCl 282

(b)磷酸盐缓冲液pH7.38 281

300(肩峰)

(c)0.1N NaOH或KOH 300

(d)磷酸盐缓冲液pH9.0 283

300(肩峰)

(e)甲醇 282B)附图15中表示了红外吸收光谱，并显示出下列最大吸收峰峰位(厘米^-1)：3700-3080，3080-2700(液体石蜡)；1720-1625；1625-1560；1505；1460(液体石蜡)1375(液体石蜡)；1295；1230；1210；1150；1100-1040；1030；1015；970；890；840；810；720(液体石蜡)。C)附图16中的¹H-核磁共振谱显示了在270兆赫频率处所记录到的基团信号(以ppm表示)，它是以六氘二甲基亚砜(DMSOd₆)为介质，以四甲基硅烷(TMS)为内标(0.00ppm)，(δ＝ppm)：δ0.85(d，异丙基上的CH₃)；1.15(～13H)；1.44(～2)；2.02(2H)；2.32-2.35(3H)；4-6.1(～16H)；6.1-8(～23H)；8.52，9.30，9.68(宽频带；游离质子)2.5-4受到H₂O峰的干扰。D)当用反相高压液相色谱在下列条件下进行分析时，所获的相对于Teicoplanin A₂组分2(R_t＝20.3分)的保留时间(R_t)为1.22，这些条件是：色谱柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beck-

man公司)柱子尺寸为4.6毫米(内径)×250毫

米长预置柱：Brownlee实验室生产的RP18(5微米)洗脱液A：CH₃CN 10％

}调至pH＝6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％洗脱液B：CH₃CN 70％

}调至pH＝6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％洗脱：洗脱液B在洗脱液A中的线性梯度为5％至60％，洗脱时间

为40分钟。流速：1.8毫升/分紫外检测器：254毫微米内标：Teicoplanin A₂的组分2(GruppoLepetit

S.P.A)E)元素分析，先把样品置惰性气氛中，在140℃下进行干燥(失重9.6％)，然后进行分析，分析结果表明，样品具有如下的近似百分组份(平均值)：碳54.09％；氢5.13％；氮6.34％；总氯4.12％；离子氯0.39％。于空气中在900℃下灼烧所剩无机残渣：5％F)酸碱滴定，在2-甲氧基乙醇(MCS)∶H₂O为4∶1的混合物中，先加入过量的HCl，然后用KOH进行回滴，其结果表明，有四个可解离的官能团，其pK_MCS为：4.5，5.6，7.2，9.2。G)在下列色谱体系中，获得的R_f值为0.21，相对于Tei-coplanin A₂的组分2的R_f为0.53，所说的色谱体系为：5％(重量/体积)的Na₂SO₄水溶液 70乙腈 30 使用硅烷化硅胶60F₂₅₄ Merck板(层厚0.25毫米)目测——在紫外光下——以Pauly试剂(即重氮化的对氨基苯磺酸)作用时出现黄

色〔J.Chromatog.20，171，(1965)；

Z.Physiol.chem.292，99，(1953)〕——利用芽孢杆菌属枯草杆菌ATCC6633在最低Davis

培养基上进行生物自显影。H)由FAB-质谱图上所显示的M＋H^峰为1731来减算，其分子量应约为1730。.抗菌素A40926的PA因子的物理—化学特性：A)附图17中所示的紫外吸收光谱显示出下列最大吸收峰峰位：

入峰位(毫微米)(a)0.1N HCl 282(b)0.1N KOH 300(c)磷酸盐缓冲液pH7.38 282

300(肩峰)(d)磷酸盐缓冲液pH9.0 283

300(肩峰)B)附图18中所示的红外吸收光谱显示出下列最大吸收峰峰位(厘米^-1)：3700-3100，3000-2800(液体石蜡)；1760-1710；1655；1620-1550； 1505；1460(液体石蜡)1375(液体石蜡)；1260；1250-950；845；805；720(液体石蜡)C)附图19中的¹H-核磁共振谱显示出在270兆赫处所记录到的基团信号(以ppm表示)，它是以六氘二甲基亚砜(DMSOd₆)为介质，以四甲基硅烷为内标(0.00ppm)，(δ＝ppm)：0.86，d′s(CH₃)；1.15-1.22，m(CH₂)_n ；1.41，m(CH₂)；2.01，s(CH₃)；2.01，m(CH₂)；2.28，s(N-CH₃)；4.26-5.96，br(肽的和芳香族的CH-′S)； 6.33-7.73br(芳香族的CH′S及肽的NH′S)。br＝宽频d＝双谱线dd＝双谱线组的双谱线m＝多谱线s＝单谱线t＝三谱线D)当用反相高压液相色谱在下列条件下进行分析时，所获的相对于Teicoplanin A₂的组分2(R_t＝20.3分)的保留时间(R_t)为1.15，这些条件是：色谱柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beck-man公司)，柱子尺寸为

4.6毫米(内径)×250毫米长预置柱：Brownlee实验室生产的RP18(5微米)洗脱液A：CH₃CN 10％

}调至pH＝6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％洗脱液B：CH₃CN 70％

}调至pH＝6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％洗脱：洗脱液B在洗脱液A中的线性梯度是从5％至60％，洗脱时间40分钟。流速：1.8毫升/小时。紫外检测器：254毫微米内标：Teicoplanin A₂的组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A.)E)在如下色谱体系中，相对于Teicoplanin A₂的组分2的R_f为0.62，所说的色谱体系为：5％(重量/体积)Na₂SO₄水溶液 70乙腈 30使用硅烷化的硅胶60F₂₅₄ Merck板(层厚0.25毫米)目测：——在紫外光下——以Pauly试剂(即重氮化的对氨基苯磺酸)作用时出现

黄色〔J.Chromatog.20，171，(1965)；

培养基中进行生物自显影。F)由FAB—质谱图上显示的表示基团的峰在1761处具有最强峰这一数值来减算，其分子量应约为1758。FAB-质谱分析的操作条件如下：

仪器：配备有FAB枪离子技术(FAB gun Ion Tech)

的VG Mod ZAB SE装置

条件：正电性的FAB，Xe

加速电压，8千伏

基质：硫甘油-甘油1/1(体积/体积)

抗菌素A40926的PB因子的物理—化学特性：A)附图20中所示的紫外吸收光谱显示出下列最大吸收峰峰位：

入峰位(毫微米)

(a)0.1N HCl 282

(b)0.1N KOH 300

(c)磷酸盐缓冲液pH7.39 282

300(肩峰)

(d)磷酸盐缓冲液pH9.0 282

300(肩峰)B)附图21中所示的红外吸收光谱显示出如下的最大吸收峰峰位

(厘米^-1)：

3700-3100，3000-2800(液体石蜡)；

1760-1710；1655；1620-1560；1605，

1480-1420(液体石蜡)；1375(液体石蜡)；

1320-1270；1230-1190；1150；

1120-920；845；810；720(液体石蜡)C.1)附图22中的¹H-核磁共振谱显示出在270兆赫处所记录

到的基团信号(以ppm表示)，它是以六氘二甲基亚砜(DMSO

d₆)为介质，以四甲基硅烷(TMS)为内标(0.00ppm)，

(δ＝ppm)多重性(属性)0.84，d(异丙基的

CH₃′S)；1.17，m(CH₂)_n；1.43，m(CH₂)，

1.99，s(CH₃)；2.01，m(CH₂)；2.31，

s(N-CH)32.79，dd(C-H)；3.70，

m(C-H)；4.06-6.02宽频(肽的及芳香基的

CH′S)；6.45-7.74，宽频(芳香基的CH′S及肽

的NH′S)；8.19-9.99，宽频(肽的NH′S及酚的

OH′S)C.2)附图23中的¹H-核磁共振谱显示出在270兆赫处所记

录到的基团信号(以ppm表示)，它是以六氘二甲基亚砜

(DMSOd₆)加上CF₃COOD为介质，以四甲基硅烷

(TMS)为内标(0.00ppm)(δ＝ppm)多重性；

(属性)：

0.84，d(异丙基的CH₃′S)；

1.13，m(CH₂)_n；1.40，m(CH₂)；

1.98，S(CH₃)；2.00，m(CH₂)；

2.92，dd(C-H)；3.29-3.71，m(蔗糖的

C-H′S)；4.07-6.09，S及m(肽及芳香基的

CH′S)；6.45-7.83，s及m(芳香基的CH′S及

肽的NH′S)； 8.17-10.38(肽的NH′S，酚的OH′S)。D)当用反相高压液相色谱在下列条件下进行分析时，所获的相对于Teicoplanin A₂的组分2(R_t＝20.3分)的保留时间(R_t)为1.27和1.32，这些条件是：色谱柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beckman公司)，柱子尺寸为4.6毫米(内径)×250毫米长预置柱：Brownlee实验室生产的BP18(5微米)洗脱液A：CH₃CN 10％}调至pH＝6.0(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％洗脱液B：CH₃CN 70％

}调至pH＝6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％洗脱：洗脱液B在洗脱液A中的线性梯度是从5％至60％，洗

脱时间为40分钟。流速：1.8毫升/分。紫外检测器：254微米内标：Teicoplanin A₂的组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A.)E)在如下色谱体系中，相对于Teicoplanin A₂组分2的B_f为0.53，所说的色谱体系为：5％(重量/体积)Na₂SO₄水溶液 70乙腈 30使用硅烷化的硅胶60F₂₅₄ Merck板(层厚0.52毫米)——在紫外线下 ——以Pauly试剂(即重氮化的对氨基苯磺酸)作用时出现的

黄色〔J.Chromatog.20，171，(1965)；

培养基上进行生物自显影。F)由FAB-质谱图上显示的表示基团的峰在1776处具有最强峰这一数值来减算，其分子量应约为1772。FAB-质谱分析的操作条件如下：仪器：配备有FAB枪离子技术的VG Mod ZAB SE装置条件：正电性的FAB，Xe

加速电压，8千伏

基质：硫甘油-甘油1/1(体积/体积)甘露糖苷配基抗菌素A40926具有下列的特性：A)附图24中表示了紫外吸收光谱，它显示下列最大吸收峰峰位

入峰位(毫微米)(a)0.1N HCl 280(b)磷酸盐绂冲液pH7.38 280

300(肩峰)(c)0.1N KOH 298(d)磷酸盐绂冲液pH9.0 282

300(肩峰)B)附图25中表示了红外吸收光谱，它显示下列最大吸收峰峰位(厘米^-1)：3700-3100；3000-2800(液体石蜡)； 1655；1620-1540；1505；1460(液体石蜡)1375(液体石蜡)；1350-1250；1210；1150；1020；970；850，810C)附图26中表示了¹H-核磁共振谱，它显示了在270兆赫处所记录到的基团信号(以ppm表示)，它是以六氘二甲基亚砜加CF₃COOH为介质，以四甲基硅烷为内标(0.00ppm)，(δ＝ppm)：2.51，s(DMSOd₅)；2.50，s(NCH₃)；2.88，m(Z2)；3.30，m(Z′2)；4.08，m(X6)；4.44，d(X5)；4.49，d(X7)；4.83m(X2)；5.02，s(4F)；5.08，s(Z6)；5.31，s(甘露糖的芳香基质子)5.53d(X4)5.78，s(4B)；6.08，d(X3)；7.07，s(6B)；6.44-8.52(芳香基和肽的NH′S)其中d＝双重谱线； m＝多重谱线； s＝单谱线。D)当用反相高压液相色谱在下列条件下进行分析时，所获得的相对于L17054(TA3-1)(R_t＝8.78分)的保留时间为1.18，这些条件是：色谱柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beck-

man公司)，柱子尺寸为4.6毫米(内径)×250

毫米长预置柱：Brownlee实验室生产的RP18(5微米) 洗脱液A：CH₃CN 10％

}调至pH＝6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％洗脱液B：CH₃CN 70％

}调至PH＝6.0

脱时间40分钟。流速：1.6毫升/分紫外检测器：254毫微米内标：抗菌素L17054(TA3-1)(Gruppo Lepetit

S.P.A.)E)在如下的色谱体系中的R_f值为0.39，该体系是：1M NaCl(内含5克/升的NaH₂PO₄·H₂O) 70乙腈 30调至pH＝6.0，使用硅烷化的硅胶60F₂₅₄ Merck板(层厚0.25毫米)目测试验：——在紫外线下——以Pauly试剂(即重氮化的对氨基苯磺酸)作用时出现黄

色〔J.Chromatog.20，171，(1965)；

Z.Physiol.Chem.292.99(1953)〕——利用芽孢杆菌属枯草杆菌ATCC6633在最低Davis

培养基中进行生物自显影。F)快原子轰击(FAB)质谱的M＋H^约在1374处。

下列的实施例将进一步说明本发明，但是这不能看成是对本发明范围的限制

实施例1：

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB及糖苷配基抗菌素A40926的制备

(a)把抗菌素A40926复合物AB(其制备方法基本上是按制备法3中的程序)(750毫克)溶于150毫升的二甲基亚砜(DMSO)/37％(重量/重量)HCl的混合物中，混合比为9∶1(体积/体积)，把该反应混合物加热至约65℃。

反应过程用高压液相色谱监测，当起始物料完全反应以后(约需5小时)，将反应物用冷水(600毫米)急冷，并把所获的混合物的pH调至7.5左右。

该混合物含有本标题的化合物之混合物，

根据下述方法，通过亲合色谱法把上述混合物分离成两个主要部

分。

(b)把上面所获的含水混合物加到一种琼脂糖凝胶-D-丙氨

酰-D-丙氨酸色谱柱上，该色谱柱按制备方法8所述的

方法制备)(在10mM的TRIS·HCl(pH＝7.5)

的绂冲液中浸胀过的树脂1000毫升；床高10厘米)。

使含有2M NaCl的0.05M浓度的NH₄OH·HCl

(pH＝7.5)(缓冲液B)2000毫升通过该色谱柱；然

后用含有2MNaCl的0.05M浓度的NH₄OH·HCl

(pH＝9.5)(缓冲液C)1500毫升通过柱子，

把糖苷配基抗菌素A40926选择性地洗脱下来。接着用0.1M NH₄OH(缓冲液D)通过柱子，把N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基复合物A B洗脱下来。把分级收集的洗脱液组分按其抗菌素内容物进行汇集，并将pH值调至pH＝7.5，然后把每一种含抗菌素的溶液在一个琼脂糖凝胶-D-丙氨酰-D-丙氨酸色谱柱上(在0.01M浓度的TRIS·HCl(pH＝7.5)的缓冲液中浸胀过的树脂100毫升；床高10厘米)进行色谱分离，再用蒸馏水通过柱子直至无机盐完全洗去为止，然后用0.1N NH₄OH溶液洗脱抗菌素。按其抗菌素内容物将这些洗脱组分汇集起来，并在减压下与正丁醇一起进行共沸蒸馏以将其浓缩到很小的体积并将其冻干，分别得到201毫克的N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基复合物A B及236毫克的糖苷配基A40926。

用DMSO/37％HCl 95∶5的混合液在约40℃下重复同样的实验，历时5天，结果是N-酰氨基。葡糖苷酸糖苷配基复合物A B的产率提高15％，而糖苷配基A40926的产率相应地降低。

用抗菌素A40926复合物、抗菌素A40926的A因子、抗菌素A40926的B因子，抗菌素A40926的B₀因子、抗菌素A40926的PA因子及抗菌素A40926的PB因子分别地作为起始原料来重复这些实验，获得了基本上相同的结果(即产率的变化在±5％的范围内)。

特别是，当用抗菌素A40926的A因子或PA因

子作为起始原料时，所获的产品是N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配

基抗菌素A40926的A因子，而用抗菌素A40926的

PB因子或B₀因子作为起始原料时，则所获的产品为N-酰

氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的B₀因子。如果

用抗菌素A40926的B因子作为起始原料时，则所获的产

品为N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的B₀因

子和B₁因子的混合物，该混合物可用高压液相色谱来进行分

离。

实施例2：

N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的A、B₀及

B₁因子的分离

把20毫克的N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素40926的

AB复合物溶于1毫升含10％乙腈的0.18m浓度的

Na₃PO₄缓冲液中(pH＝6.0)，将该溶液注入到粒度

为7微米的高压液相色谱预置柱(7毫米内径×250毫米)

Lichrosorb RP18硅烷化硅胶(Merck公司)上。

在55分钟内以5毫升/分钟的A相和B相的流率洗脱柱

子，A相的线性梯度从10％到55％。

A相：用NaOH使18mM磷酸钠/CH₃CN(30/70)

达到pH6.0

B相：用NaOH使18mM磷酸钠/CH₃CN(90/10)

达到pH6.0。

记录柱洗脱液于254毫微米处的紫外吸收，并收集具有同类内容物的洗脱组分，分别分离三组含有N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的A因子、B₀因子和B₁因子的洗脱液。

汇集11次连续色谱过程的含有纯化的N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子的洗脱液，并象通常一样通过将其装载到5毫升浸胀过的琼脂糖-D-丙氨酰-D-丙氨酸的柱上(参见制备法8)脱盐。在用10毫升1mM HCl并随之用5×10毫升蒸馏水去除盐类后，用5×10毫升1％(重量/体积)氨水洗脱抗菌素。然后单独收集这些氨水洗脱液并冷冻干燥，得出15毫克的N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的因子A、51毫克的N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的因子B₀和3毫克N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的因子B₁，它们的物理—化学数据和化学式在前面的描述中已被阐明。

实施例3：

由抗菌素A40926复合物AB选择制备糖苷配基抗菌素A40926：

将抗菌素A40926复合物AB750毫克(基本上按照制备法3方法制得)溶于150毫升以9∶1(体积/体积)混合的二甲基亚砜/37％盐酸的混合液中并将该混合物加热至约80℃。用高压液相色谱监控反应进程，当起始原料完全作用时(约3小时后)，用冷水(600毫升)使反应急停，并调节生成混合物的pH到约7.5。

这一混合物(750毫升)含有糖苷配基抗菌素A40926，它在如制备法8所述的琼脂糖-D-丙氨酰-D-丙氨酸色谱柱上(100毫升在10mM，TRIS·HCl.pH7.5中浸胀过的树脂；床高10厘米)通过亲合色谱被分离。

使含有2摩尔NaCl、pH为7.5的0.05 M的NH₄OH·HCl(200毫升)(缓冲液B)通过该柱子；然后用含有2M NaClpH9.5的0.05M NH₄OH·HCl(1500毫升)(缓冲液C)洗脱，从柱上有选择性地分离糖苷酸基A40926。而后根据其所含的抗菌素汇集洗脱组分，训至约pH7.5，并在琼脂糖-D-丙氨酰-D-丙氨酸柱上(100毫升在pH7.5 10mMTRIS·HCl浸胀过的树脂；床高10厘米)进行色谱分离。将蒸馏水通过柱子直至洗去无机盐类。用0.1当量氨水洗脱糖苷配基A40926在减压下通过与正丁醇共沸蒸馏将这些洗脱液浓缩至小体积，并冷冻干燥产得530毫克糖苷配基A40926。

原始材料的制备：

制备法1：

足肿放线菌(Actinomadura)菌种ATCC39727的发酵。

将产生抗菌素A40926的菌株(足肿放线菌菌种ATCC39727)于28℃在燕麦粉琼脂斜面上生长2-3周并用来给内含100毫升培养基的一个500毫升锥形烧瓶接种，其中的培养基由00.5％内汁、0.5％自溶酵母、0.5％蛋白胨、0.3％水解干酪素、2％葡萄糖、0.15％NaCl(灭菌前pH为7.5)组成。

将该烧瓶于28℃在回转摇动器上以200转/分培养约72小时，然后将培养物转移到含有4升上述培养基的发酵罐中。在约2升/分钟的空气流率及约900转/分的搅动下使这种培养物在28℃下生长72小时。然后用它来给200升含相同培养基的发酵罐接种。以100升/分钟无菌空气给这一发酵罐通气并在约28℃下以250转/分搅动。使用在最低培养基上的芽孢杆菌属枯草杆菌作为试验微生物、通过纸盘琼脂扩散法监控抗菌素的制备。在72-96小时后得到最大活性。

制备法2：

回收抗菌素A40926A)将上述发酵汤冷却至4℃，使达到pH9.5并搅动。在约1小时后将其过滤，将滤液用无机酸水溶液调至pH约3.5。将该混合物在4℃下搅拌30分钟，然后用(Hyflo-FloMa^(注册商标))助滤剂过滤。排出透明的滤液，将滤饼悬浮在去离子水中，调至pH约8.5，搅拌，然后过滤。将回收的滤饼进行相同的操作。汇集的滤液含有抗菌素A40926。

将浸胀过的D-丙氨酰-D-丙氨酸-ε-氨基己酰-琼脂糖改性质体(2升)加入按制备法1得到的发酵汤(在将其过滤并使透明滤液pH至约8.5以后)中或加入按上述制备法2A)得到的集中后的滤液中。在室温搅拌过夜后，通过过滤回收树脂并随后用约2×10升含5％(重量/体积)NaCl的0.45mM pH为7.5的HCl-TRIS(TRIS是2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)绂冲液洗涤，再用蒸馏水(4×20升)洗涤。用1％(重量/体积)氨水(2×20升)从树脂上洗脱A40926抗菌素。将洗脱液在室温下放置过夜，然后浓缩至小体积(约2.5升)。通过与正丁醇共沸蒸馏除去水。然后加入石油醚，析出3.4克抗菌素A40926复合物粗品。

制备法3：

抗菌素A40926复合物A B的提纯

把基本上按上述制备法2得到的抗菌素A40926复合物粗品(750毫克；高压液相色谱滴定浓度70％)溶解于400毫升水中，训至pH7.5并过滤。然后将滤液在D-丙氨酰-D丙氨酸-ε-氨基乙酰-琼脂糖柱上(500毫升浸胀过的树脂；床高为5厘米)进行亲合色谱分离，该柱先用含有用HCl调至pH7.5的2摩尔NaCl的0.16％(重量/体积)氨平衡过的。随后用以下三种缓冲溶液展开：

缓冲液A：含有用HCl调至pH7.5的2M NaCl的0.16％

(重量/体积)氨(2.6倍柱床体积)

缓冲液B：含有用HCl调至pH9.5的2M NaCl的0.16％

(重量/体积)氨(16倍柱床体积)

缓冲液C：1％(重量/体积)pH11.4的氨水(2.6倍柱

床体积)

缓冲液C将抗菌素A49026复合物AB洗脱在单独一个组分中。将这一洗脱组分调至pH7.0并再加到用10mM pH7.0的TRIS-HCl缓冲的相同亲合柱上。用蒸馏水洗涤该柱直至完全脱盐。

然后用2倍柱床体积的pH为11.0的0.39％(重量/体积)氨水洗涤抗菌素。

将洗脱的组份浓缩至小体积的含水混合物，然后冷冻干燥。得到纯的抗菌素A40926复合物AB(374毫克)

制备法4：

抗菌素A40926的A因子和B因子的分离A)将按制备法2得到的抗菌素A40926复合物(3.3克)或按制备法3得到的抗菌素A40926复合物AB(2.3克)悬浮在0.5升水中，搅拌，然后过滤。将透明的滤液加到硅烷化的硅胶柱(200克；床高18厘米；硅烷化Silicagel 60；70-230目；Merck公司)上，该硅胶柱用溶液A(0.001M含有用NaOH调节到pH6.0的0.25％(重量/体积)的NaH₂PO₄·H₂O和2.5％(重量/体积)NaCl的EDTA钠溶液)预先平衡。在约48小时内以总体积约7升的在溶液A中线性梯度从0％至40％(体积/体积)的乙腈洗脱该柱子。收集约15.5毫升的组分并通过在枯草杆菌上的生物试验检定并通过高压液相色谱进行分析。汇集含类似抗菌素的组分。含有抗菌素物质的组分No.310-330和No.348-365分别命名为A40926的A因子和A40926的B因子。B)将含有单独一种A40926A因子和B因子的汇集组分在减压下浓缩以去除乙腈，用水(约两倍于起始溶液的体积)稀释并加到如上所述类型的硅烷化的硅胶柱(浸胀过基质的体积：50毫升；柱床高15厘米)上。用去离子水洗涤该柱子直至完全脱盐，最后用60∶40(体积/体积)的乙腈/水展开。

在减压下浓缩洗脱组分，将残渣冷冻干燥以从第一组洗脱组分(上述的310-330组份)得到134毫克抗菌素A40926的A因子和从第二组洗脱组分(上述的348-365组份)得到206毫克A40926的B因子。

制备法5：

抗菌素A40926的PA因子和PB因子的分离

用1％(重量/体积)氨水(2×20升)将基本上按制备法2A的操作和制备法2B操作的第一步而结合到树脂上的抗菌素洗脱。将洗脱液用硫酸训至pH7.8并在真空下通过与正丁醇共沸蒸馏浓缩至小体积以得到含水浓缩物，然后在纸上过滤该浓缩物。回收的过滤液含有抗菌素A40926的PA因子、A40926的PB因子和少量 A40926的A因子和B因子(高压液相色谱)。

在5微米孔隙尺寸的过滤器上(Acrodisc^注册商标)；Gelman Science公司)过滤含有约50毫克/毫升纯抗菌素A40926复合物的这种含水浓缩物的样品(高压液相色谱分析)，然后加到含有20克十八烷基甲硅烷基的反相硅胶(LichrisorbRP18，Merck公司；粒度10微米)的不锈钢柱(直径为2厘米)上。然后在适当压力下(标称压力约14巴)将硅胶装在Chro-matospac Modulprep装置的不锈钢柱中(Jobenyron公司，法国)并用由pH6.0、25∶75(体积/体积)的乙腈和18毫摩尔磷酸钠缓冲液组成的混合物平衡。使用在平衡时用的相同溶剂混合物以约10.5毫升/分钟的流速进行洗脱。通过在枯草杆菌上的生物试验和通过高压液相色谱监控洗脱。

汇集含有类似抗菌素内容物的组分并浓缩5次色谱过程的同类组分以蒸发有机溶剂。

用1M氯化钠溶液稀释得到的溶液，直至两倍于原始的体积，并加到用水平衡过的硅烷化硅胶柱(50克；床高5厘米；硅烷化硅胶60；Merck公司)。

用去高子水洗涤柱子直至完全脱盐(在加入AgNO₃水溶液后，洗脱液中无AgCl沉淀)，然后用1∶1(体积/体积)的乙腈∶水洗脱。集中含有类似抗菌素内容物的洗脱液(高压液相色谱)，通过与与正丁醇共沸蒸馏浓缩至小体积以得到一个含水物相，然后将它冷冻干燥，产出；

抗菌素A40926的PA因子 55毫克

抗菌素A40926的PB因子 51毫克

抗菌素A40926的A因子 38毫克

抗菌素A40926的B₀因子 33毫克

制备法6：

分离抗菌素A40926的B因子的另一种方法

将按制备法2制得的两种制品的集中浓缩物(最后步骤)过滤，将过滤加到用水预先平衡过的硅烷化硅胶色谱柱上(400克；床高30厘水，Silicagel 60，70-230目，Merck公司)。

用水(6升)冲洗柱子，并按如下次序用乙腈/水洗脱吸附的抗菌素：

2.7升5％(体积/体积) 乙腈/水

1.6升10％(体积/体积) 乙腈/水

2.97升15％(体积/体积) 乙腈/水

3.15升20％(体积/体积) 乙腈/水

收集约18毫升的组分。

在敏感微生物如枯草杆菌上通过低盘生物试验测试洗脱组分的活性并高压液相色谱分析。将含类似抗菌素内容物的组分集中(组分472-526)并在减压下浓缩，向这一浓缩物加入正丁醇以使共沸除水。保留下来的正丁醇溶液本身再浓缩到小体积用来析出抗菌素A40926的B因子(1.4克)。用石油醚在搅拌下洗涤这一产物并通过过滤(三次)收集产品。真空干燥后，得到760毫克A40926的B因子。

将抗菌素A40926的B因子再次进行上述的柱色谱分离，得到一种抗菌素A40926的B₀因子产品(540毫克)，该产品具有与上述抗菌素A40926的B因子所报导过的相同的物理—化学特性，所不同的是它在高压液相色谱分析时仅显示出一个峰，即相对于Teicoplanin A₂组分2保留时间为1.22的峰。随后洗脱的在上述高压液相色谱体系中保留时间为1.27的另一个化合物，并命名为抗菌素A40926的B₁因子。通过上述操作将其分离(产量15毫克)。

制备法7：

抗菌素A40926的PA因子和抗菌素A40926的PB因子分别转化成抗菌素A40926的A因子和B因子

分别将抗菌素A40926的PA因子和抗菌素A40296的PB因子(50毫克)溶解在2.5毫升的1％(重量/体积)NH₄OH水溶液中并将得到的溶液在搅拌下于室温下保持约24小时。

通过与正丁醇的共沸蒸馏除去水，用乙醚沉淀并通过过滤收集沉淀，从原来含抗菌素A40926的PA因子的溶液中得到抗菌素A40926的A因子，而从原来含抗菌素A40926的PB因子的溶液中得到抗菌素40926的B因子(产率约75％)。

制备法8：

D-丙氨酰-D-丙氨酸-琼脂糖的制备

a)：用表氯醇(3-氯-1，2-环氧丙烷)活化琼脂糖

将在多孔玻璃滤器上过滤并用软化水洗涤的1升琼脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals公司)在轻微搅拌下于室温加入1.2升NaOH(当量/升)中。在加入100毫升表氯醇(3-氯-1，2-环氧丙烷)后，将该物料用冷水外部冷却在约20℃下搅拌保持24小时。过滤悬浮液并用软化水(约5升)洗涤固体至pH中性。

b)：琼脂糖ε-醋酸-D-丙氨酰-D-丙氨酸的制备

在机械搅拌下将约500毫升由去氯醇(3-氯-1，2-环氧丙烷)衍生的琼脂糖4B(环氧化合物总含量约15.5毫克当量)加入用20％NaOH调至PH11的17g(62.2毫摩尔)ε-醋酸-D-丙氨酰-D-丙氨酸的200毫升水溶液中。

在pH11和室温下搅拌该悬浮液约2天(直至用于测量环氧化合物含量的试验为阴性时止)，过滤并用300毫升水洗涤。再次用水(约3升)洗涤过滤后的树脂直至pH中性，得到460毫升琼脂糖ε-醋酸-D-丙氨酰-D-丙氨酸。

Claims

1.一种制备N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子A、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₀、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₁、糖苷配基抗菌素A40926及它们的加成盐类的抗菌素物质或其混合物的方法，所述物质具有如下结构式

其中，A代表氢或十一酰氨基葡糖苷酸基、十二酰氨基葡糖苷酸基和异十二酰氨基葡糖苷酸基及B代表氢；以A代表正十一酰氨基葡糖苷酸基和以B代表氢的上式I可归属于N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子A，以A代表异十二酰氨基葡糖苷酸基和以B代表氢的上式I可归属于N-酰氨基糖苷配基抗菌素A40926因子B₀，以A代表正十二酰氨基葡糖苷酸糖苷配基和以B代表氢的上式I可归属于N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926因子B₁，以A和B代表氢的上式I可归属于糖苷配基抗菌素A40926，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗素A40926因子B是上述因子B₀和B₁的混合物，N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB可由A40926复合物AB获得，由理化性质数据定义；及如下理化性质：

N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素复合物AB(非加成盐形式)：

A)显示以下最大吸收峰峰位的紫外吸收光谱：

入峰位(nm)

a)0.1N HCl 282

b)pH7.4的磷酸盐缓冲液 282

310(肩峰)

c)0.1N KOH 302

B)显示以下最大吸收峰峰位的红外吸收光谱(cm′)：

3700-3100；3000-2800(液体石蜡)；1650；1620-1550；1500；1460 (液体石蜡)；1375(液体石蜡)；1300；1250-1180；1150；1060；1010；970；930；840，820；

C)显示在270兆赫处记录到以下基团信号(以ppm表示)的¹H-核磁共振谱，所用介质为DMSOd₆(六氘二甲基亚砜)加CF₃COOH，利用四甲基硅烷作为内标(0.00ppm)，(δ＝ppm)：

0.84，d和t〔异丙基的CH₃和末端CH₃〕；1.14，m〔(CH₂)_n〕；1.44，m〔-CH₂-C-CO和异丙基的CH〕；2.00，t〔-CH₂-(CO)〕；2.5，s(五二甲基亚砜)；2.5，s〔N-CH₃〕；2.93，m〔CH，(Z2)〕；3.33，m〔CH，(Z′2)〕；3.20-3.80，m〔糖的CH〕；5.34，d〔酰氨葡糖苷酸的异头质子〕；4.10，m(X6)；4.33，d(X5)；4.43，d(X7)；4.9，m(X2)；5.1(4F和Z6)；5.4，s(X1)；5.58，(X4)；5.7，s(4B)；6.06d(X3)；7.73，s(6B)；6.26-8.42，s和m〔芳香基的CH和肽的NH〕；8.70-10.5，brs〔酚的OH和NH₂+〕

br＝宽频

d＝双重谱线

m＝多重谱线

s＝单谱线

t＝三重谱线

D)当在以下条件下通过反相高压液相色谱分析时，相对于Teicoplanin A₂的组分2(保留时间为20.3分钟)的保留时间(R_t)是1.20和1.30：

色谱柱：Ultraphere ODS(5微米)Altex(Beckmnan

公司)4.6毫米(内径)×250毫米

预置柱：Brownlee实验室生产的RP18(5微米)

洗脱液A：CH₃CN 10％

}调到pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％

洗脱液B：CH₃CN 70％

}调到pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％

流进：1.8毫升/分钟

紫外检测器：254nm

内标：Teicoplanin A₂的组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A.)

E)有能生成盐类的酸官能团

F)有能生成盐类氨基

G)没有与核部结合的甘露糖单元

N-酰氨葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的因子A(非加成盐形式)：

A)显示以下最大吸收峰峰位的紫外吸收光谱：

入峰位(nm)

a)0.1N HCl 282

b)pH7.4磷酸盐缓冲液 282

310(肩峰)

c)0.1N KOH 302

B)显示以下最大吸收峰峰位的红外吸收光谱(cm^-1)：

3700-3000；3000-2800；1650；1585；1505；1460(液体石蜡)；1375(液体石蜡)；1295；1230；1210；1150；1070；1060；1010；845；820；720(液体石蜡)；

c )显示在270兆赫处记录到如下基团信号(以ppm表示)的¹H-核磁共振谱，所用介质为DMSOd₆，利用四甲基硅烷作为内标(0.00ppm)，(δ＝ppm)：

0.85，t(末端CH₃)；1.0-1.3(脂族的CH₂)；1.42，m((OC-C)CH₂)；2.00，t((CO)CH₂)；2.35，s(NCH₃)；2.49，s(五二甲基亚砜)；2.82m(Z2)； 2.8-3.8(糖质子和Z′2)；4.12，m(X6)；4.56s(X1)；4.34，d(X5)；4.41，d(X7)；4.96，m(X2)；5.08-5.12(4F和Z6)，5.40，d(酰氨葡糖苷酸的异头质子)；5.58，d(X4)； 5.74；s(4B)；6.05，d(X3) ；7.75，s(6B)；6.25-8.40，s，d和m(芳香基的CH和肽的NH)；

D)在以下条件下通过反相高压液相色谱分析时，相对于Tei-coplani A₂的组分2(R_t＝20.0分钟)的保留时间(R_t)是1.2；

色谱柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beckman

公司)4.6毫米(内径)×250毫米

预置柱：Brownlee实验室生产的RP18(5微米)

洗脱液A：

CH₂CN 10％

}调至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％

洗脱液B：

CH₃CN 70％

}调至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％

洗脱：在40分钟内洗脱液B在洗脱液A中的线性梯度从5％到

60％；

流速：1.8毫升/分钟

紫外检测器：254nm

内标：Tetcoplanin A₂的组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A.)

E)用快原子轰击质谱(FAB-MS)测定的分子量为1554。

F)有能生成盐类的酸功能团

G)有能生成盐类的氨基

H)没有与核部结合的甘露糖单元

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的B₀因子(非加成盐形式)：

A)显示以下最大吸收峰峰位的紫外吸收光谱：

入峰位(nm)

a)0.1N HCl 282

b)PH7.4磷酸盐缓冲液 282

310(肩峰)

c)0.1N KOH 302

B)显示以下最大吸收峰峰位的红外吸收光谱(cm^-1)：

3700-3100；3000-2800(液体石蜡)；1650；1585；1505；1460(液体石蜡)；1375(液体石蜡)；1295；1230；1210；1150；1060；1010；980；840；820；720(液体石蜡)；

C)显示在270兆赫处记录到如下基团信号(以ppm表示)的¹H-核磁共振谱，共用介质为DMSOd₆，利用四甲基硅烷作为内标(0.00ppm)，(δ＝ppm)：

0.84，d(异丙基的CH₃)；1.0-1.3(脂族的CH₂)；1.3-1.6((OC-C)-CH₂和异丙基的-CH)；2.00，t((CC)CH₂)；2.32，S(NCH₂)；2.49，s(五氘二甲基亚砜)；2.82，m(Z2)；2.9-3.8(糖的质子)；4.12，m(X6；4.44，s(X1)；4.33，d(X5)；4.37，d(X7)；4.95，m(X2)；5.06-5.10(4F和Z6)；5.38，d(酰氨基葡糖苷酸的异头质子)；5.59，d(X4)；5.72，s(4B)；6.05，d(X3)；7.74，s(6B)；6.27-8.5(芳香基和肽的NH)。

D)在以下条件下用反相高压液相色谱分桥时，相对于Teicop-lanin A₂的组分2(R_t＝20.3分钟)的保留时间(R_t)为1.30：

色谱柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beckman

公司)4.6毫米(内径)×250毫米

预置柱：Brownlee实验室生产的RP18(5微米)

洗脱液A：

CH₃CN 10％

}调至PH 6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％

洗脱液B：

CH₃CN 70％

}调至PH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％

洗脱：在40分钟内洗脱液B在洗脱液A中的线性梯度从5％至

60％。

流速：1.8毫升/分钟

紫外检测器：254nm

内标：Teicoplanin A₂的组分2(Gruppo Lepetit

S.P.A。)

E)当用快原子轰击质谱测定时分子量为1568

F)有能生成盐类的酸功能团

G)有能生成盐类的氨基

H)没有与核部结合的甘露糖单元

N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的B₁因子(非加成盐形式)：

当用快原子轰击质谱测定时，分子量为1568，并且有基本上与上述N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的B₀因子相同的物理-化学特征，所不同的是在上述核磁共振体系中，由于正丙基功能团的甲基基团所以在δ0.84ppm处它具有三重谱线，并在上述体系中相对于Teicoplanin A₂的组分2的保留时间为1.32，

糖苷配基抗菌素A40926(非加成盐形式)：

A)显示以下最大吸收峰峰位的紫外吸收光谱：

入峰位(nm)

a)0.1N HCl 280

b)pH7.4磷酸盐缓冲液 280

310(肩峰)

c)0.1N NaOH 299

B)显示以下吸收峰峰位的红外吸收光谱(cm^-1)：

3700-3100；3000-2800(液体石蜡)；1655；1620-1550；1500；1460(液体石蜡)；1375(液体石蜡)；1300；1205；1145；1010；970；930；840 ；

C)显示在270兆赫处记录到如下基团信号(以ppm表示)的¹H-核磁共振谱，所用介质为DMSOd₆＋CF₃COOH，利用四甲基硅烷作为内标(0.00ppm)，(δ＝ppm)：

2.51，s(五二甲基亚砜)；2.50，s(NCH₃)；2.88，m(Z2)；3.33，m(Z′2)；4.10，m(X6)；4.34，d(X5)；4.43，d(X7)；4.93，m(X2)；5.04，s(4F)；5.09，s(Z6)；5.54，d(X4)；5.75，s(4B)；6.05，d(X3)；7.76，s(6B)；6.3-8.4(芳香基和肽的NH)；

D)在以下条件下用反相高压液相色谱分析时，相对于Teieop-lanin A₂的组分2(R_t＝20.3分钟)的保留时间(R_t)为0.59：

色谱柱：Ultrasphere ODS(5微米)Altex(Beck-

man公司)4.6毫米(内径)×250毫米

预置柱：Brownlee实验室生产的RP18(5微米)

洗脱液A：

CH₃CN 10％

}调至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 90％

洗脱液B：

CH₃CN 70％

}调至pH6.0

(2.5克/升)NaH₂PO₄·H₂O 30％

洗脱：在40分钟内洗脱液B在洗脱液A中的线性梯度从5％至60％

流速：1.8毫升/分钟

紫外检测器：254nm

内标：Teicoplanin A₂的组分2(Gruppo Lepetit S.P.A)

在相同条件下相对于抗菌素L17054(Gruppo Lepetit，EP-A-11975)的保留时间为1.42

E)用快原子轰击质谱测定的分子量为1211

F)有能生成盐类的酸功能团

G)有能生成盐类的氨基

H)没有与核部结合的甘露糖单元；该方法包括：

a)使下式所示的抗菌素A40926复合物、抗菌素A40926复合物AB、抗菌素A40926的A因子、抗菌素A40926的B因子、抗菌素A40926的B₀因子、抗菌素A40926的B₁因子、抗菌素A40926的PA因子、抗菌素A40926的PB因子：其中

A代表十一酰氨基葡糖苷酸基、十二酰氨基葡糖苷酸基或异十二酰氨基葡糖苷酸基；

B代表甘露糖基或乙酰甘露糖基；

其中，抗菌素A40926因子A是上面的化学式中A代表十一酰氨基葡糖苷酸基和B代表甘露糖基的化合物；抗菌素A40926因子B₀是上面化学式中A代表异十二酰氨基葡糖苷酸基和B代表甘露糖基的化合物；以及A40926因子B₁是上面化学式中A代表十二酰氨基葡糖苷酸基和B代表甘露糖基的化合物；抗菌素A40926因子B是抗菌素A40926因子B₀和B₁的混合物；抗菌素A40926因子PA和因子PB与相应的因子A和B，不同之处在于前者的甘露糖单元被乙酰基-甘露糖单元取代；抗菌素A40926复合物AB是抗菌素A40926的因子A和B的混合物；在限定量水(0.1-10％重量/重量)存在下于4℃-80℃于选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二乙基乙酰胺、二噁烷和四氢呋喃的合适有机溶剂中用选自盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、三氯乙酸、三氟乙酸和氯代二氟乙酸的强酸进行有控制的酸水解；

b)从水解液中分离所需产物；

c)当所需产物是加成盐时，将步骤b)的非盐产物溶解在水溶液中并加稍摩尔过量的所选用的酸或碱，使其转化成相应的酸的或碱的加成盐。

2.一种如权利要求1所述的方法，其中强酸为浓盐酸。

3.一种如权利要求1所述的方法，其中水解是在40℃-80℃之间的一个温度下用8∶2至9.5∶0.5的二甲基亚砜/浓盐酸的混合物进行的。

4.一种如权利要求1，2或3所述的方法，该方法包括：

a)在约65℃的温度下将抗菌素A40926复合物、抗菌素A40926的因子A、抗菌素A40926的因子B、抗菌素A40926的因子B₀、抗菌素A40926的因子B₁、抗菌素A40926的因子PA、抗菌素A40926的因子PB用9∶1-9.5∶0.5的二甲基亚砜/37％(重量/重量)盐酸混合物进行有控制的酸水解约5小时；

b)从水解液中分离所需产物。

5.一种如权利要求4所述的方法，该方法进一步包括将含N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926的因子A，抗菌素A40926的因子B，和抗菌素A40926糖苷配基的所需产物的混合物分离成其单一组分。

6.一种制备糖苷配基抗菌素A40926的方法，其中糖苷配基抗菌素A40926如权利要求1所定义，该方法包括将如权利要求1所定义的抗菌素A40926复合物或其一种因子、抗菌素A40926复合物AB、抗菌素A40926的因子A、抗菌素A40926因子B、抗菌素A40926因子PA、抗菌素A40926因子PB、抗菌素A40926因子B₀、甘露糖基糖苷配基抗菌素A40926和N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926(复合物AB/或其单个因子)在有以下化合物存在时在20-100℃之间的反应温度上进行有控制的酸水解：

a)一种亲质子的有机溶剂，该溶剂选自在反应温度时为液体的脂肪酸和a-卤代脂肪酸、在反应温度时为与水略微混溶液体的脂族和环脂族链烷醇、苯基取代的低级链烷醇(其中苯基部分为未取代苯基或被(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基或卤素取代的苯基)以及在反应温度时为液体的β-多卤代低级链烷醇，

b)一种与该溶剂相容的强酸，该酸选自强无机酸、强有机酸和以氢形式的强酸型阳离子交换树脂。

7.一种如权利要求6所述的方法，该方法包括将抗菌素A40926复合物、抗菌素A40926复合物AB、抗菌素A40926因子A、抗菌素A40926因子B、抗菌素A40926因子B₀、抗菌素A40926因子PA、抗菌素A40926因子PB、N-酰氨基葡糖苷酸糖苷配基抗菌素A40926复合物AB或其一个因子以及甘露糖基糖苷配基抗菌素A40926在温度约80℃下用8∶2-9.5∶0.5的二甲基亚砜/37％(重量/重量)盐酸混合物进行有控制的酸水解。