FI86307B - Foerfarande foer framstaellning av antibiotiska a 40926 n-acylaminoglukuronyl -aglykoner och antibiotisk a 40926 aglykon. - Google Patents

Description

86307

Menetelmä antibioottisten A 40926 N-asyyliaminoglukuronyy- li-aglykonien ja antibioottisen A 40926 aglykonin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uusia antibiootteja, joita nimitetään antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB, antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuro-nyyli-aglykoni tekijä A, antibioottinen A 40926 N-asyyli-ammoglukuronyyli-aglykoni tekijä B, antibioottinen A 40926 N-asyy1iaminoglukuronyy1i-aglykoni tekijä BQ, antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä Blf antibioottinen A 40926 aglykoni tai näiden additiosuoloja, menetelmää näiden valmistamiseksi lähtemällä antibioottisesta A 40926 kompleksista tai sen tekijästä. Niitä voidaan käyttää hoidettaessa infektiosairauksia, jotka ovat näille antibiooteille herkkien mikro-organismien aiheuttamia .

Antibioottinen A 40926 kompleksi ja sen tekijät ovat antibiootteja, jotka ovat aktiivisia gram-positiivisia bakteereita ja Neisseriae-kantoja vastaan ja jotka tuotetaan Actinomadura-kannoilla.

Antibioottia A 40926 tuottava kanta Actinomadura-suvusta on tallennettu kesäkuun 8. päivänä 1984 kokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC) - 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.

Antibioottinen A 40926 ja sen tekijät, sekä sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä niiden valmistamiseksi on esitetty eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa No 177882. Fysikaalis-kemiallisten arvojen perusteella ja vertaamalla tunnettujen antibioottien rakenteeseen, seu-raava kaava voidaan esittää A 40926 tekijälle (numerointi vastaa J. Williams'in julkaisussa J.AiC.S., 106, 4895-4908 (1984) esittämää): 2 86307 f ΐ Z6 [I feY ° ΥΓΤ ° Y^mI H Z2 z HO f00b H Z2 H Ob^H J Q H31J if * 0 < H ^1^,(10¾ H >y ο. Ιηχ70 4Cr01 JO) 'l >70όίί i"''"' f - o ' / on on no jossa A tarkoittaa N-(C11-C12)asyyliaminoglukuronyyliryhmaa ja B tarkoittaa mannosyyli- tai asetyylimannosyyliryhmää.

Erityisesti antibioottinen A 40926 tekijä A on edellä esitetyn kaavan mukainen yhdiste, jossa A tarkoittaa undekano-yyliaminoglukuronyyliä ja B tarkoittaa mannosyylia, antibioottinen A 40926 tekijä Bq on edellä esitetyn kaavan mukainen yhdiste, jossa A tarkoittaa isododekanoyyliaminoglu-kuronyy1iä ja B tarkoittaa mannosyyliä ja antibioottinen A 40926 tekijä on edellä esitetyn kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa A tarkoittaa dodekanoyyliaminoglukuronyyliä ja B tarkoittaa mannosyyliä.

Antibiottinen A 40926 tekijä PA ja tekijä PB eroavat vastaavista tekijöistä A ja B siinä, että mannoosi-yksikkö on korvattu asetyyli-mannoosi-yksiköllä.

li 3 86307

Antibioottinen A 40926 on kompleksinen antimikrobinen aine; viisi sen komponenteista on eristetty ja identifioitu tekijänä PA, PB, A, B ja BQ.

Antibioottiset A 40926 tekijät PA ja PB, ainakin tietyissä 5 käymisolosuhteissa, ovat A 40926:ta tuottavan mikro-organismin pääantibioottituotteet.

Antibioottiset A 40926 tekijät A ja B ovat etupäässä antibioottisten A 40926 tekijän PA ja tekijän PB transformaatio-tuotteita ja ne esiintyvät usein jo käymisliemessä.

10 On havaittu, että antibioottinen A 40926 tekijä PA voidaan muuttaa antibioottiseksi A 40926 tekijä A:k s i ja antibioottinen A 40926 tekijä PB voidaan muuttaa antibioottiseksi A 40926 tekijä B:ksi emäksisissä olosuhteissa.

Näin ollen, kun käymisliemen tai antitioottista A 40926 si-15 säitävän uutteen tai sen konsentraatin annetaan seistä tie-·" tyn ajan emäksisissä olosuhteissa (esim. nukleofiilisen emäk sen vesipitoinen liuos, pH >9, yön yli), seurauksena on, et-;· · T ä saadaan antibioottinen A 40926 kompleksi, joka on rikas tunut antibioottisten A 40926 tekijän A ja tekijän B suh-20 teen.

Tässä selityksessä ja vaatimuksissa "antibioottiset A 40926 N-a syy1iaminoglukuronyyli-aglykonit" tarkoittaa antibioottista A 40926 N-asyy1iami nog 1ukuronyy1i-ag1ykoni-komp1 e k sia AB ja/tai sen yksittäistä tekijää, t.s. antibioottista 25 A 40926 N-asyy1iaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä A:ta, antibioottista A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni Tekijä B: tä, antibioottista A 40926 N-asyyliaminoglukuro-nyyli-aglykoni tekijä BQ:aa ja antibioottista A 40926 N--asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä B :tä.

4 86 307

ANTIBIOOTTISELLA A 40926 N-ASYYLIAMINOGLUKURONYYLI-AGLYKONI -KOMPLEKSI AB: LLA (ei additiosuolamuodoss a) ON SEURAAVAT TUNNUSMERKIT

A) uitraviolettiabsorptiospektri , joka on esitetty liit- 5 teenä olevien piirustusten kuviossa 1 ja jossa esiintyy s eu -raavat absorptiomaksimit.

A, maks. (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri, pH 7,4 282 310 (olka) c) 0,1 N Κ0Η 302 B) infrapuna-absorptiospektri , joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 2 ja jossa on seuraavat absorptiomaksimit (cm ^): 15 3700-3100; 3000-2800 (nujoli); 1650; 1620-1550; 1500; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1300; 1250-1180; 1150; 1060; 1010; 970; 930; 840; 820 C) 1H-NMR-spektri , joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 3 ja jossa on seuraavat signaali- 20 ryhmät (ppm:ssä) 2 70 MHz : 11ä , rekisteröity DMSO dgissa (heksadeuterodimetyylisulfoksidi) plus CF^COOHissa, käyttäen sisäisenä standardina TMS:ää (0,00 ppm), (δ= ppm): 0,84, d ja t sopropyyl iset CH3:t ja terminaalinen CHj] ; 1,14, m [(CH2)n] ; 1,44, m \_-CH2-C-C0 ja i sopropyyl i nen Ch] ; 25 2 ,00 , t X-CH2-(CO)3 ; 2,5 s (_DMS0dg); 2,5 s (N - C H 3) ; 2,93, m |CH, (Z2)] ; 3,33, m ^CH, (Z‘2)] ; 3 ,20-3 ,80 , m ^sokeri CH:tj; 5,34, d \a syy 1 i ami nogl u kuron i ha pon anomee-r i nen protoni^; 4,10 m ( X 6); 4,33 d, (X 5) ; 4,43 d (X 7) ; 4,9 m (X 2) ; 5,1 (4F ja Z6); 5,4 s (X1) ; 5,58 d (X4); 5,7 s 30 (4 B); 6,06 d (X3); 7,73 s (6B); 6 , 26 -8,42 s ja m ^aromaatti set CH:t ja peptidiset NH:tj ; 8,70-10,5, br s ^fenoli set OH : t ja NH?+j I; 5 86307 br = leveä d = dubletti m = multipi etti s = singletti 5 t =tri pietti D) retentioajat (R^.) 1,20 ja 1,30 suhteessa telkoplanii-ni A 2 ϊ n komponenttiin 2 (R^ = 20,3 min), analysoitaessa käänteisf aas i-HPLC:Π ä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 jjm) Altex (Beckman) 10 4,6 mm (sisähalkaisija ) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 jjm) eluentti A: CH3CN 10¾] pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P0^.H20 90arvoon 6,0 eluentti B: CH3CN 70¾) pH säädetty ^ (2,5 g/1) NaH2P0^.H20 30¾^ arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 ^sta 60 ¾:iin eluent-•. : tia B eluentissa A, 40 minuutissa : virtausnopeus: 1,8 ml/min : UV-detektori : 254 nm 20 sisäinen standardi: teikoplaniini A2:n komponetti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) happamet funktiot pystyvät muodostamaan suoloja F) aminofunktiot pystyvät muodostamaan suoloja :·*: G) e1 mannoosiyksikköä liittyneenä runko-osaan.

6 86307 ANTIBIOOTTISELLA A 40926 N-ASYYLIAMINOGLUKURONYYLI-AGLYKONI TEKIJÄ A:LLA (ei additi oiuolamuodossa) ON SEURAAVAT TUNNUSMERKIT: A) uitravioletti-absorptiospektri, jossa seuraavat ab-5 sorptiomaksimit: X maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri, pH 7,4 282 310 (olka) 10 c) 0,1 N Κ0Η 302 B) infrapuna-absorptiospektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 4 ja jossa esiintyy seuraa-vat absorptiomaksimit (cm ): 3700-3000; 3000-2800; 1650; 1585; 1505; 1460 (nujoli); 15 1375 (nujoli); 1295; 1230; 1210; 1150; 1070; 1060; 1010; 845; 820; 710 (nujoli) C) 1H-NMR-spektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 5 ja jossa esiintyy seuraavat sig-naali ryhmät (ppm:ssä) 270 MHz:llä, rekisteröity DMSO^ssa 20 (heksaseuterodimetyylisulfoksidi), käyttäen sisäisenä stan dardina TMS:ää (0,00 ppm) , ( b= ppm): 0,85 t (terminaalinen CH3); 1,0 - 1,3 (ai ifaattiset C H 2:t); 1,42 m ((0C-C)CH2); 2,00 t ((C0)CH2); 2,35 s(NCH3); 2,49 s (DMSOdJ; 2,82 m (Z2); 2,8 - 3,8 (sokeri protoni t ja Z'2); 25 4,1 2 m (X6); 4,56 s (XI); 4,34 d (X5); 4,41 d (X7); 4,96 ;* m (x 2) ; 5,08 - 5,12 (4F ja Z6); 5,40 d (asyyl iaminogl ukuro- nihapon anomeerinen protoni); 5,58 d (X4); 5,74 s (4B), :! 6,05 d (X 3) ; 7,75 s (6B); 6,25-8,40 s, d ja m (aromaatti- set CH:t ja peptidiset NH:t) 30 D) retentioaika (Rt) 1,20 suhteessa teikoplaniIni A2:n ·: komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min), analysoitaessa käänteis- li 7 86307 faas i-HPLC:11ä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 .um) Altex (Beckman) 4,6 (s i s ä h a 1 k a i s i j a) x 250 mm e s i k o 1 o n n i : Brownlee Labs RP 18 (5 p) 5 eluentti A: CH3CN 105Tl pH säädetty (<:,5 g/1 ) NaH^PO^.H^O 90arvoon 6,0 eluentti B: CH3CN 70%] pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P0^.H20 30% arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 % : s ta 60 %:i i n eluent-10 tia B eluentissa A; 40 minuutissa virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniini A2:n komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) ^ ^ m°lekyylipaino noin 1554 määritettynä FAB-MS:11ä happamet funktiot pystyvät muodostamaan suoloja I .·. aminofunktio pystyy muodostamaan suoloja ^ roannoosiosaa liittyneenä runko-osaan.

ANTIBIOOTTISELLA A 40926 N-ASYYLIAMINOGLUKURONYYLI-AGLYKONI 20 TEKIJÄ Bg:LLA (ei additiosuolamuodossa) ON SEURAAVAT TUNNUSMERKIT: j\. A) ultraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seu- raavat absorptiomaksimit: λ maks (nm) 25 a) 0,1 N HC1 28(? ·;·' b) fosfaattipuskuri, pH 7,4 282 :7: 310 (olka) C) 0,1 N Κ0Η 302 8 86307 B) infrapuna-absorptiospektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 6 ja jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksirtiit (cm ): 3700-3100; 3000-2800 (nujoli); 1650; 1585; 1505; 1460 5 (nujoli); 1375 (nujoli); 1295; 1230; 1210; 1150; 1060; 1010; 980; 840; 820; 720 (nujoli) C) 1H-NMR-spektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 7 ja jossa esiintyy seuraavat sig-naaliryhmät (ppmrssä) 270 MHz:llä, rekisteröity DMSO d6:ssa 10 (heksadeute rodimetyy1isu 1 fok sidi) , käyttäen sisäisenä stan dardina TMS:ää (0,00 ppm), (^= ppm): 0,84, d (i sopropyyl i set CH^it); 1,0 - 1,3 (ai if aatti set C H 2:t) ; 1,3 - 1,6 ((OC-C)-CH2 ja isopropyylinen -CH); 2,00 t ((0C)CH2); 2,32 s (NCH3); 2,49 s (DMSOdg); 2,82 m • 15 (Z2) ; 2,9 - 3,8 ( sokeriprotonit); 4,12 m (X6); 4,44 s (XI); 4,33 d (X5) ; 4,37 d (X7); 4,95 m (X2); 5,06 - 5,10 (4F ja Z6); 5,38 d (asyyllaminoglukuronihapon anomeerinen protoni); 5,59 d (X 4) ; 5,72 s (4B); 6,05 d (X 3) ; 7,74 s (6B); 6,27 - 8,5 (aromaattiset ja peptidiset NH: t) 20 D) retentioaika (R^) 1,30 suhteessa teikoplaniini A2:n komponenttiin 2 (R^. = 20,3 min), analysoitaessa käänteis-faasi-HPLC:1lä käyttäen seuraavia olosuhteita; kolonni: Ultrasphere ODS (5/jm) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisi ja) x 250 mm 25 esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 ^jm) eluentti A: CH^CN 10%| pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J arvoon 6,0 eluentti B: CH3CN 70%\ pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%] arvoon 6,0 ti 9 86307 eluoint1: lineaarinen gradients 5 *:sta 60 «Min eluent-tia B eluentlssa A, 40 minuutissa virtausnopeus : 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm 5 sisäinen standardi: teikoplaniini A£: n komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) molekyylipaino noin 1568 määritettynä FAB-MS:llä F) happamet funktiot pystyvät muodostamaan suoloja G) aminofunktio pystyy muodostamaan suoloja ^ ^ ei* mannoosiyksikköä liittyneenä runko-osaan.

ANTIBIOOTTISELLA A 40926 N-ASYYLIAMIN0GLUKUR0NYYLI-AGLYKONI TEKIJÄ Bt:LLÄ on molekyylipaino noin 1 568 määritettynä FAB-MS:llä ja pääasiallisesti samat fysikokemial1iset tunnusmerkit kuin edellä on esitetty antibioottiselle A 40926 15 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä BQ: 11 e paitsi, että sillä on edellä esitetyssä NMR-systeemissä tripletti 0,84 8 ppm vastaten N-propyyli-funktion metyyliryhmää, ja retentioaika suhteessa teikoplani ini A2:n komponentti 2 | I on 1*32 edellä esitetyssä systeemissä.

20 ANTIBIOOTTISELLA A 40926 AGLYKONILLA ON SEURAAVAT TUNNUS-:V; MERKIT: A) uitraviolettiabsorptiospektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 8 ja jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: 25 λ maks (nm) a) 0,1 N HC1 280 :··; b) fosfaattipuskuri, pH 7 ,4 280 310 (olka) c) 0,1 N Κ0Η 299 10 86307 B) 1nfrapuna-absorptiospektrl, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 9 ja jossa esiintyy seu-raavat absorptiomaksimit (cm ): 3700-3100; 3000-2800 (nujoli); 1655; 1620-1550; 1500; 5 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1300; 1205; 1145; 1010; 970; 930; 840 C) 1H-NMR-spektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 10 ja jossa on seuraavat signaali-ryhmät (ppmrssä) 270 MHz:11ä rekisteröity DMSO d6:ssa 10 (heksadeute rodimetyy1isu1 foksidi) plus CF^COOHissa, käyt täen sisäisenä standardina TMS:ää (0,00 ppm) , ( £> = ppm): 2,51 s (DMS0d5): 2,50 s (NCH3) ; 2,88 m (12), 3,33 m (Z * 2) ; 4,10 m (X6); 4,34 d (X5); 4,43 d (X7); 4,93 m (X 2); 5,04 s (4F); 5,09 s (Z6); 5,54 d (X4); 5,75 15 s (4 B) ; 6,05 d (X3); 7,76 s (6B); 6,3 - 8,4 (aromaattiset ja peptidiset NH:t) D) retentioaika ( R ^.) 0,59 suhteessa teikoplaniini A 2: n komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min), analysoitaessa seuraavis-sa oiosuhtei ssa : 20 kolonni: Ultrasphere ODS (5 |jm) Altex (Beckman) ·; 4,6 mm ( sisähal kaisi ja) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 ^im) eluenttiAiCH^CN 10^1 pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J arvoon 6,0 25 eluentti B: CH^CN 70%1 pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 %:sta 60 %:iin eluent-tia B eluentissa A, 40 minuutissa : virtausnopeus: 1,8 ml/min

II

11 86307 UV-detektor1: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniini A2:n komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.)

Samoissa olosuhteissa retentioaika suhteessa antibioot-5 tiseen L 1 7054 :ään (Gruppo Lepetit EP-A- 119575) on 1,42 E) mol ekyyl i pa i no on noin 1211 määritettynä FAB - MS: 1 la* F) happamet funktiot pystyvät muodostamaan suoloja G) aminofunktio pystyy muodostamaan suoloja H) ei mannoosiyksikköä liittyneenä runko-osaan.

12 86307

Fysikaalis-kemiai 1isten tunnusmerkkien perusteella ja vertaamalla saman luokan tunnettujen antibioottien rakenteeseen, edellä esitetyn kaavan (I), jossa A tarkoittaa N-(C11-C12)-asyyliaminoglukuronyyliä ja B tarkoittaa vetyä, voidaan sanoa 5 kuuluvan antibioottisille A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoneilie.

Erityisesti edellä esitetyn kaavan (I), jossa A tarkoittaa n-undekanoyy1iaminoglukuronyylia ja B tarkoittaa vetyä, voidaan sanoa esittävän antibioottista A 40926 N-asyyli-10 aminoglukuronyyli-aglykoni tekijä A:ta, edellä esitetyn kaavan (I) , jossa A tarkoittaa 1sododekanoyyliaminogluku-ronyyliä ja B tarkoittaa vetyä, voidaan sanoa kuvaavan antibioottista A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä Bgiaa, edellä esitetyn kaavan (I), jossa A tarkoit-15 taa n-dodekanoyyliaminoglukuronyyliä ja B tarkoittaa vetyä, voidaan sanoa kuvaavan antibioottista A 40926 N-asyy 1iaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä B^rtä. Tämä viimeksi mainittu saadaan keksinnön mukaisella menetelmällä antibioottisesta A 40926 tekijä B^:stä, joka on antibioottisen A 40926 te-20 kijä B:n, jonka Rt on yhtä kuin 1,27, suhteessa teikopla-niini Ä2^n komponenttiin 2 käänteisfaasi-systeemissä, joka on kuvattu julkaisussa EP-A 177882 ja selitetään jäljempänä, komponentti. Se saadaan antibioottisesta A 40926 tekijä B:stä tekijän BQ:n (päätekijä) erottamisen jälkeen.

25 Edellä esitetyn kaavan (I), jossa A ja B tarkoittavat vetyä, voidaan sanoa kuvaavan antibioottista A 40926 agly-konia.

Tässä selityksessä ja vaatimuksissa, käsiteltäessä antibioottista A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni-komp-30 leksia tai sen tekijöitä tai antibioottista A 40926 agly-konia, tarkoitetaan sen käsittävän myös "sisäisen suolan" sekä mahdolliset happo- tai emäsadditiosuolat.

li i3 86 307 EP-A 117882 kuvaa »lähtöaineita», joita käytetään tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä. Koska mainittu EP-hakemus ei ollut julkinen vielä tämän hakemuksen etuoikeuspäivänä, olemme toistaneet sen sisällön tässä hakemuksessa.

EP, A-132116:ssa kuvataan ns. AAD 216-antibioottien aglykoneja ja pseudoaglykoneja. Kun verrataan näiden antibioottien rakennetta keksintömme mukaisten yhdisteiden rakenteeseen, voidaan nähdä, että niissä on ainakin yksi ilmeinen ero, nimittäin peptidiytimeen sitoutuneiden klooriatomien määrä.

EP-A-90578:ssa on kyse mikrobiologisesta menetelmästä tiettyjen antibioottisten aineiden, jotka on nimetty A 41030, valmistamiseksi. Nämä aineet ovat kaikki rakenteellisesti erilaisia kuin meidän hakemuksemme vaatimuksissa esitetyt.

williams J., Am. Chem. Soc., 106, 4895-4902. Tässä viitteessä käsitellään teikoplaniini-nimisen antibiootin rakenneselvityk-siä.

Seuraavassa taulukossa on kuvattu rakenteelliset erot teikopla-nunin ja sekä antibiootti A 40926 N-asyyliaminoglukopyrano-syyli-aglykonin ja antibiootti A 40926-aglykonin välillä.

Taulukko

Fenyy1irengas asema teikoplaniini antibiootti A 40926 . : 1 1 -chnh2- -chnhch3- V 2 5 Cl h 3 e h ci

:.V 4 4 0R± OA

R1 = H tai N-asyyli-B-D-glukosamiini . ]. A — H tai N-asyyliaminoglukuronyyli ^84 496:1 myös teikoplaniinin johdannaiseen, joka valmistetaan hydrolysoimalla teikoplaniini. Tämän keksinnön . . mukaiset yhdisteet voidaan erottaa siitä samalla tavalla kuin em. Williamsin artikkelin mukaiset yhdisteet.

14 863C7

Keksinnön mukaisten yhdisteiden antibakteerinen aktiivisuus voidaan todeta in vitro standardi1 aimennostestei11 a erilaisilla mikro-organismivi1jel mi 1lä.

Vi1jelyalustat ja kasvatusolosuhteet MlC-maarityksiä 5 (minimal inhibitory concentration, pienin estävä konsen- traatio) varten ovat seuraavat: Isosensitest-1iemi (Oxoid) , 24 tuntia stafylokokille, kannalle Strep . faecalis ja gram-negati ivisille bakteereille (Escherichia coli ) ; Todd-Hewitt-1iemi (Difco), 24 tuntia muille streptokokki 1 ajei 11 e; GC-10 emäsiiemi (Difco) + 1 % Isovitalex (BBL), 48 tuntia, C02-rikastettu ilma kannalle Neisseria gonorrhoaea; Brain--Heart-1iemi (Difco) + 1 % Supplement C (Difco), 48 tuntia kannalle Haemophilus influenzae; AC-1iemi (Difco), 24 tuntia, anaerobiset olosuhteet kannalle Clostridium perfringes; 15 Wilkins-Chalgren-agar (ref: T.D. Wilkins & S. Chalgren, 1976, Antimicrob. Ag. Chemother. 10, 926), 48 tuntia, anaerobiset olosuhteet muille anaerobeille (C.difficile,

Propionibacterium acnes, Bacteroides fragilis), PPLO liemi (Difco) + 10 % hevosen seerumia + 1 % glukoosia, 48 tuntia 20 kannalle Mycoplasma gal 1isepticum ; PPLO-liemi lisäaineiden kera, kuten R.T. Evans ja D. Taylor-Robinson esittävät (J. Antimicrob. Chemother. 4, 57), 24 tuntia kannalle U urealyticum. Inkubointi suoritettiin 37°C:ssa. Ympit olivat seuraavat: 1% (til./til.) 48 tontista liemiviljel-25 mää kannalle M. galliseptiticum; noin 10 väriä^vaihtavaa yks i kköä/ml kannalle U.urealyticum; noin 10 -10 koloniaa muodostavaa yksikköä/ml muille 1iemi 1aimennoksi11 e MIC-määrityksiä varten; noin 104-105 bakteeria/täplä (ymppays "multi point"-ymppääjäll8) agar-1aimennus-MIC-määrityksia 30 varten (C. difficile, P. acnes, B. fragilis)

Pienimmät estävät konsentraati ot (MIC, jig/ml) eräille mikro-organismeille on esitetty seuraavassa taulukossa 11.

li , ( is 86307 • !

I I

' I

I I

' I

' c I

I a) ,

1 c I

' -r- I

• -*-> ·Γ- I

1 4-> VO C I

I o c\j o I co tn m tn

I ! >- cnj — m inmcM

I ί ^ n I OOOO'-oOO<r-.-CVIV£>C\j00C0

1 +-> <C Π3 I ΓΟ ID N W

'Cl *~ I -—· ra I /\

I r— I

' E I

1 I OQ I

I CT) >, c I

1 a. ΙΟ >> I

I --- OJ c ·<- I

1 CT> Ο ΙΛ I

' · O S- I

1 t_> *3- 3 OJ I

1 I— I

1 ·—' <C Z3 Ql I

1 <— E I

i X S o ^ ! ^oorowDoocovo IDVO

• c c f ~ ~ ~Z ° ~ ~ ° ~ ° ! £ g c ! ° ° ° ° ° ° o ° ο Ό ^ oo «

1 +-> rtJ O I *" CM VO

1 O *t— ^ I

1 O r— >} I -p ^ ' ·-—>»— I m I JD >, cn I c 1 ·γ- </i no I *r- 1 +-> Π3 I I >

t-H ! C I (— I

' « z r- I £ ° 1 I t: r; ' 05 v: I , a; ra I , c —I I ! 00 —^ * I 4_j * 2 ' 1C ^ I— I I -r- CTl I I O '— d) ' I rz cn

• I E> <-> -O

. « ® <-> I I o cn T- I— s- I , «ί- σ» cn m et xj I I ' ' N 0T> 00 VO VO >, I , „ <υ cd r- cj xi <u I °P -t->cocr.oco«- s I 1 o (NJ \ a> I I _ 7 W U h 00 CL U3

I , p C3QJt—1|— O S -t-> CD

I I , , 00 <C «3- I— m τι I ^ PP CDCCD *- <C I—I CD f— CO

I ! ,? Γ^ωσιοοο n n ^ I . 7: 7Γ ccMtnf-or^cnr— _j I . *— 0 cn 1 II c 1 . f^-0ZDI— ·- (Λ _| in ,— _I D<03

• Γί .* ** "" c * -< ω 00 S

, , C^ 2^r7aja,c 0J re

I , —, *a‘CI'-*Oi— OcntONr^+J

I I . —I ^ " C *r- rO *r- QJ C 0 SSJJ.i.ii,:··:· I . 10 chvt-s-ucns-r-T.r- I —1—1·-- (Λ -r- oor^ i- l*_ t- S-4-r-^- I 1 E <D C *r— Q) «r— t t λ — Λ ; · inoos-EOr- ο,-αω^Ε-ίο^ I 1 ^ ^ QJ <D E rtJ ι/l 4_j O rn ^ w ^ «ω u u ^ 2φ ™ : ^ —’ —' t-*- >> C Π3 *r— «1— .f— ro -T-J — _ , ; OO<UQ.Q.U-ETDXJ.r-.r-.^.r--5^ 1 I .... T T c 0 *- *= --- « * ra , r- r- ^ ~ * · S-^Oi-OJO.^r- ’ I 4~> , ^ 00 ο φ d.

, ie 86307

I I >i O I

I Z >) CO I

I C I

I O * I

I CM 1. CO I

I (T\ 3 I

I O :rO I

I *3- :3 *r-> I COfOUilOlOlO^lOn

I I— *r- IO««— CSJOOO*— OO

I < O) ^ I ««ΛΛΛΛΛΛΛ I o CD I OOOOOOOOOC0CMC0C0 I c c -M I Γ0 cvj cvj

I Oi ·Γ- I

I C £ »r- I /\ /\

I t; ^ c I

I Xj ·Γ- o ·

I ««-—N Q I” ^ I

I fmm O >» >» *"** ·

I E *jr >> I— OQ I

I ^ CT> I

I ro ro <tj I

I 2k C ‘ I *r"> I

I --- fO I

I I

I · KO I >

I O C\J 2 I

I · O'* I

I HH O 3 ·»- I

I · ^- I— C I

»s: en o I

I co-2*: I comLOcoiocorocon I C>> l0*—C\J000*—00

I C -r- i— I

I O) E CD I OOOOOOOOOOOCVJOOCO

*·—* I ^ <0 Π3 I CO CVJ CNJ

. I £ ·>- 1 <C I

I +J r— -I- I ^ /\ A

4-> I o >» I— :<o I c

(TJ I o >, >, -ι-j I CU

•I-J I 'I to >, ·Γ- I C

—' ' « «= -* I ·-

I +j I ο οι I

i—I I c rr s- +-> I

I rO I +d O I · <o ^ I I cn ^ I . _ £ ZD I I "c1 CO 0) —I I I Q) ·ι- r- 4-> rD I I c +-> *3- in <r ( I ·>- c: σι ·γ- t- I I > ·£ - s- ' ' - ° CD ω I I 4-> 3 <->

I I Π3 CD CD C

I I en (O m I— αι

I I di O cC C

, I C ^ Id U)

I I >r_ QJ CD CVJ _Q C

I I +-> CO -P CO <— ·>“ I I c cvj to <d τι I ‘JZ cvj ·ι- CO 00 Ο- i—

I I /v ° CVJ S- (/) CO >1 JC

I I r- Z) *- O CU I—. s: +J O

I I ε CD 00 CO Vi- CTi I I Π3 CD CD c CD >—I CD ·<—

I I 30c_) is (U O ts CJ <J

I I «— C CVJ fs CD -— -

I I CD <C «3- CD ·*— —I CD

I I CVJ CO O CD C OV —I U- —I

I itoorsoni— t-io_id<c

I I O ID vi CVJ <C'|-C QJCOE

I I *— I *— CD r— <D 0) fO 3

I I --- _l >JCIlJCO)lONrsU

1 I to σν —I V3- CO)C^J-*r- I I LD LT) 3 to *3- »— to ·γ- O CL) —I 4-> I I to to O <— I dJ .—1 CD L- -ΣΖ 3 >1 I ( -— *— -1— “O »0 rs. 4- i- I— ·!- I—

I I _I _14-)-1- to·!— to — (O

I I >,Εωε·ι-_ιθ)θΕοω I I to tO t~~ C C O r- CL C ·Γ- CD C- I l33OQ)QJE<at0O 3 I I <ua)ET5cn30'i-Ecr)tO(0 I is_s_ai-i-oa>a>4->3 3 ·γ- <0

I ΐ3 3<οο.>,ε:(θ·ι-·Γ-π3Γ— x: E

I I rOfO-CCD 0-0-4- ΕΌ·ι-·γ-Οι/> I I M— S- _£Z ‘ < 03 I .........

inj I ^cxrxrjz a a 0. a -p to o O) 0.

14-) ICLQ-CLCXQJQJClJttJlOtOE-CClO

1C lrtJ(^i^r0S-i-S-i-O*i“CL)Od) ΙΠ3 l4D4_>4_>4->4->4->4->4->r— OJfatOS-

1 I cotooocococococoozcacLurD

I! 17 86307

Antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB ja sen tekijät on havaittu erityisen aktiivisiksi koagulaasi-negatiivisia stafylokokkeja vastaan. MIC-arvot (pg/ml) joukolle kliinisesti eristettyjä S. epi-5 dermidis ja S.haemolyticus kantoja on esitetty seuraavas-sa taulukossa:

TAULUKKO II

Kanta antibioottinen A 40926

N-asyyliaminoglukuronyyli-agly-^ koni-kömpieksi AB

M.I.C. (/jg/ml ) S. epidermidis L 393 0,06 S. epidermidis L 408 0,13 S. epidermidis L 410 0,06 15 S. haemolyticus L 381 0,25 S. haemolyticus L 382 0,13 ';·[ S. haemolyticus L 383 0,5 '· S. haemolyticus L 403 0,25 ; ; Lisäksi antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli- V.: 20 aglykonl kompleksi AB:n MIC90-arvO (jig/ml), t. s. konsentraa- tio, joka inhiboi koagulaasi negatiivisten stafylokokkien 36 käsitellystä, kliinisestä eristeestä, ainakin 90 %, on havaittu olevan 0,5 jjg/ml .

18 86307

Keksinnön mukaisten yhdisteiden antimikrobinen aktiivisuus on varmennettu myös kokeellisilla verenmyrkytyksillä (septicemia) hi irellä .

Kontrolli- ja kasittelyryhmät sisälsivät 10 CD-I hiirtä 5 (Charles River), joiden paino 18-22 g. Ne infektoitiin intraperitoneaalisesti 0,5 ml :11a bakteeri suspensiota , joka valmistettiin laimentamalla S. pyogenes C 203 (L 49)-kannan yön yli kasvatettua viljelmää steriilillä pepto-noidulla suolaliuoksella. Ympit säädettiin siten, että 10 käsittelemättömät eläimet kuolivat verenmyrkytykseen 48 tunnin sisällä. Testattavat yhdisteet annostettiin subku-taanisesti välittömästi infektion jälkeen. Seitsemäntenä päivänä ED5Q laskettiin mg/kg:ssa menetelmällä, jonka ovat esittäneet Spearman ja Kärber (D.J. Finney "Statistical 15 Methods in Biological Assay", Griffin, sivu 524, 1952), elossa olevien eläimien prosentuaalisesta määrästä jokaiselle annoksel1 e.

Näissä olosuhteissa antibioottisen A 40926 N-asyyliamino-g1ukuronyy1i-ag1ykoni kompleksi AB:n ja antibioottisen 20 A 40926 aglykonin vastaavat ED5Q-arvot olivat 0,54 ja 6,2 mg/kg.

Antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyl1-aglykoni kompleksi AB, sen tekijät ja antibioottinen A 40926 agly-koni sisältävät happamia ja emäksisiä funktioita ja voivat 25 muodostaa suoloja orgaanisten ja epäorgaanisten vastakkais merkkisten ionien kanssa tavanomaisten menetelmien mukaisesti.

Tyypillisiä ja sopivia, keksinnön mukaisten yhdisteiden happoadditiosuoloja ovat sellaiset suolat, jotka muodoste-30 taan standardireaktiolla sekä orgaanisten että epäorgaanis ten happojen, kuten esimerkiksi kloorivety-, bromivety-, rikki-, fosfori-, etikka-, trif1uorietikka-, trikloori-etikka-, meripihka-, sitruuna-, askorbiini-, maito-, li i9 86307 ma lei inifumaari-, palmitiini-, kooli-, pamoe-, lima-, glutamiini-, kamferi-, glutaari-, glykoli-,ftaa!i-, viini-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bent-seenisulfoni-, sorbiini-, pikriini-, bentsoe-, kaneliha-5 pon ja vastaavien happojen kanssa.

Tyypillisiä esimerkkejä näistä emäksistä ovat: aikaiimetal-li tai maa-alkaiimetal1ihydroksidi, kuten natrium-, kalium-, kalsium-, magnesium-, bariumhydroksidi; ammoniakki ja a 1i-faattiset, alisykliset tai aromaattiset, orgaaniset amii-nit, kuten metyyliamiini, dimetyyliamiini , trimetyyliamiτη i ja pikoliini.

Keksinnön mukaisten "ei-suola" muodossa olevien yhdisteiden muuttaminen vastaaviksi additiosuoloiksi ja päinvastoin, t.s. keksinnön mukaisen yhdisteen additiosuolan muut-15 taminen ei-suolamuotoon on alan ammattimiehelle tavanomaista tekniikkaa ja kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

Esimerkiksi antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyy-li-aglykoni kompleksi AB ja/tai sen tekijät ja antibioottinen A 40926 aglykoni voidaan muuttaa vastaavaksi happo- tai ' 20 emä s additiosuo1 a k si liuottamalla ei-suolamuoto vesipitoi- ; seen liuottimeen ja lisäämällä pieni ylimäärä valittua hap poa tai emästä. Sen jälkeen muodostunut liuos tai suspensio lyofilisoidaan halutun suolan talteenottamiseksi.

Siinä tapauksessa, että lopullinen suola on liukenematon 25 liuottimeen, johon ei-suolamuoto liukenee, se saadaan talteen suodattamalla ei-suolamuodon orgaanisesta liuoksesta sen jälkeen, kun on lisätty stökiömetrinen määrä tai vähäinen ylimäärä valittua happoa tai emästä.

Esimerkkejä tällaisista liukenemattomista suoloista ovat 30 kalsium-, magnesium- ja bariumsuolat.

Ei-suol amuoto voidaan valmistaa vastaavasta happo- tai emässuolasta liuottamalla vesipitoiseen liuottimeen, joka ; sen jälkeen neutraloidaan vapaaksi e i-suol amuodoks i .

20 86307

Kun hapon tai emäksen ylimäärän eliminointia tulee seurata neutralointi, voidaan käyttää tavanomaista suolan poistomenetelmää .

Esimerkiksi voidaan edullisesti käyttää pyiväskromatogra-5 fiaa silanoidulla piihappogeelil 1ä , ei-funktiona1isoidul- la polystyreeni-, akryyli- ja tasahuokoisei 1 a polydekstraa-ni hartsei11 a (kuten Sephadex LH 20) tai voidaan käyttää . aktiivihiiltä. Sen jälkeen kun ei-toivotut suolat on eluoi-tu vesipitoisella liuoksella, toivottu tuote eluoidaan ve-10 den ja polaarisen tai apolaarisen, orgaanisen liuottimen, kuten asetonitrii1in ja veden seoksen lineaarisella gra-dientil1 a tai vaihe-gradienti11 a , alkaen suhteesta 50:50 aina noin 100 %: i in asetonitriiliä.

Kuten on alalla tunnettua, suolan muodostamista sekä far-15 maseuttisesti hyväksyttävien happojen (tai emästen) kans sa tai farmaseuttisesti hyväksyttämättömien happojen (tai emästen) kanssa voidaan käyttää sopivana puhdistusmenetelmänä. Muodostamisen ja eristämisen jälkeen A 40926 antibiootin suolamuoto voidaan muuttaa vastaavaksi ei-suola-20 muodoksi tai farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Eräissä tapauksissa antibioottisen A 40926 N-asyyliamino-glukuronyylΐ-aglykoni kompleksi AB:n, sen tekijän ja antibioottisen A 40926 aglykonin emäsadditiosuola liukenee enemmän veteen kuin hydrofii1isiin liuottimiin.

I: 2i 86307

ANTIBIOOTTISEN A 40926 N-ASYYLIAMINOGLUKURONYYLI-AGLY-KONIEN JA ANTIBIOOTTISEN A 40926 AGLYKONIN VALMISTUS

Antibioottinen A 40926 N-asyyliami nog 1ukuronyyli-ag1 ykoni kompleksi AB, N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä A, 5 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä B, antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä Bq, antibioottinen A 40926 N-asyyliami nog 1ukuronyyli-aglykoni tekijä B ^ ja antibioottinen A 40926 aglykoni valmistetaan antibioottisesta A 40926 kompleksista tai yksittäi-10 sestä tekijästä tai mainittujen tekijöiden missä tahansa suhteessa muodostamasta seoksesta, t.s. A 40926 tekijä A:n, A 40926 tekijä B:n, A 40926 tekijä PA: n, A 40926 tekijä PB: n, A 40926 tekijä BQ:n ja A 40926 tekijä B^n seoksesta kontrolloidulla happohydrolyysi11ä.

15 Tavallisesti tämä hydrolyysi suoritetaan vahvan hapon läsnäollessa sopivassa, orgaanisessa 1iuottimessa. Reak-tiolämpötila voi vaihdella huomattavasti, mieluimmin se on välillä 4 C - 100°C ja kaikkein mieluimmin välillä 25°C - 80°C.

20 Reaktioaika vaihtelee riippuen spesifisistä reaktio-olosuhteista.

Tavallisesti reaktioaika on 30 minuuttia - 120 tuntia.

Kuitenkin, koska reaktion etenemistä voidaan seurata TLC: 11ä tai HPLC:llä, alan ammattimies kykenee päättele-25 mään,milloin lähtöaineiden hydrolyysi on tapahtunut kokonaan ja tuotteen talteenottovaihe voidaan aloittaa.

Tyypillisiä esimerkkejä vahvoista hapoista ovat mi ne raa -T i h a p o t tai orgaaniset, vahvat hapot, kuten halogeenive-dyt, esim. kloori-, bromi- ja jodivety, fosforihapot, rik-30 kihappo, ha 1ogeenietikkahapot, esim. trikloorietikkahappo , tri fluori etikkahappo, kloori di fluori etikkahappo ja v a s -taavat.

22 86307

Sopivia, orgaanisia liuottimia ovat seuraavanlaiset: a) niiden täytyy ainakin osittain liuottaa lähtöaineita; b) tuotteet, niiden muodostuessa, voivat joko erottua tai ne voidaan erottaa niistä tavanomaisilla menetel- 5 m i 11 ä , j a c) missään tapauksessa ne eivät epäsuotuisasti häiritse reaktion kulkua.

Esimerkkejä mainituista, orgaanisista liuottimista ovat proottiset tai aproottiset liuottimet, kuten (C^-C^)al-10 kyy!isulfoksidit, esim. dimetyylisulfoksidi ja dietyyli- sulfoksidi, (Cj-C^Jalkyyliformamidit, esim. dimetyyliform-amidi, dietyyliformamidi , dioksaani, tetrahydrofuraani ja samanlaiset liuottimet, jotka tietysti sopivat yhteen valitun hapon kanssa.

15 Yleensä hydrolyysi suoritetaan rajoitetun vesimäärän läsnä ollessa, esim. 0,1 %:sta - 10 % : i i n (paino/paino) reaktio-seoksesta. Tämä vesimäärä voi aivan ilmeisesti olla jo joko lähtöaineissa, liuottimissa ja/tai reagensseissa tai se voidaan lisätä tätä varten tarvittaessa.

20 Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritus muodossa käytetään dimetyylisulfoksidin ja konsentroidun kloorivetyhapon seosta lämpötilassa, joka on 40 C - 80 C. Tyypillistä on, että dimetyylisulfoksidin ja konsentroidun kloorivetyhapon seoksen suhde on alkaen 8:2 aina 25 9,5 : 0 ,5 : teen . Edullinen konsentroitu kloorivetyhappo on 37-prosenttinen (paino/paino) kloorivetyhappo.

Tavallisesti reaktiotuote on N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykonien ja aglykonin seos. Kontrolloimalla lämpötilaa ja eräissä tapauksissa myös hapon konsentraatiota ja voi-30 makkuutta, on mahdollista ohjata menetelmää ainakin tietyssä määrin, yhden päätuotteen, joita on kaksi, tuotta- li 23 86307 miseen, t.s. antibioottisten A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyl i-aglykonien tai antibioottisen A 40926 aglykonin tuottamiseen. Erityisesti pitämällä suhteellisen alhainen lämpötila, mahdollisesti alentamalla happoseoksen vahvuut-5 ta ja sopivasti kontrolloimalla reaktioaikaa, N-asyyliami-noglukuronyyli-aglykonien saannot lisääntyvät, kun taas vastaavasti korkeammat lämpötilat ja pidemmät ajat johtavat siihen, että saadaan ainoastaan aglykonia.

Myös tässä tapauksessa reaktion etenemistä seurataan ^ TLCrllä tai mieluimmin H P L C : 11ä ja reaktio voidaan pysäyttää, kun saavutetaan toivotun aineen optimaalinen tuotto, jolloin myöhemmin tapahtuvan taiteenottomenetelmän saannot voidaan maksimoida.

Kun saadaan tuote, joka on antibioottisten A 40926 N-asyy-15 1iaminoglukuronyylΐ-aglykonien ja antibioottisen A 40926 aglykonin seos, se voidaan erottaa kromatografisesti , kuten neste/neste-kromatografisesti, pikakromatografisesti, korkea paine-nestekromatografisesti ja affiniteettikromatograf isesti.

20 Käytettäessä affiniteettikromatografiaa, edullinen adsor-bentti on immobi1isoitu D-alanyyli-D-alaniini, kuten kuva-taan julkaisussa EP-A-122969. Erityisesti edullinen on ; ; agaroosi- £-aminokaproyyli-D-alanyyli-D-alaniini. Eluointi- ·· seos on vesipitoisen puskurin ja suolaliuoksen seos. Sää- ;; 25 tämällä pH ja suo!akonsentraatio, antibioottiset A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykonit erotetaan antibioottisesta A 40926 aglykonista.

Edelleen tämän keksinnön kohteena on sen menetelmän edul-linen suoritusmuoto, jolla ylivoimaisesti valmistetaan anti-.· 30 bioottista A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni komp- ^e^si AB:tä tai sen tekijää, jossa menetelmässä antibioot-tinen A 40926 kompleksi tai sen yksittäinen tekijä, anti- 24 86307 bioottinen A 40926 kompleksi AB, antibioottinen A 40926 tekijä A, antibioottinen A 40926 tekijä B, antibioottinen A 40926 tekijä Bq, antibioottinen A 40926 tekijä B^ , antibioottinen A 40926 tekijä PA ja antibioottinen A 40926 te-5 kijä ΡΒ saatetaan alttiiksi kontrolloidulle happohydrolyy- sille, käyttäen polaarisen aproottisen liuottimen ja vahvan mineraalihapon tai orgaanisen hapon seosta rajoitetun (0,1 - 10 %, paino/paino) määrän vettä läsnäollessa lämpötilassa, joka on huoneen lämpötilan ja 100 C:n välillä ja 10 mieluimmin 40°C - 65°C, reaktioajan ollessa 3 tunnista 120 tuntiin.

Kaikkein mieluimmin hydro!ysoimisseos on dimetyylisulfoksidin ja 37-prosenttisen kloorivetyhapon seos, suhteessa 9:1 - 9,5:0,5, lämpötila on 65°C ja reaktioaika 5 tuntia.

15 Kun lähtöaine N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni n valmis tuksessa on antibioottinen A 40926 kompleksi, saadaan lopullinen tuote, joka yhä on tekijöiden seos vastaten olennaisesti alkuperäisen kompleksin tekijöitä, kun taas käytettäessä yksittäistä tekijää, kuten antibioottista A 40926 20 tekijä A:ta tai tekijä B:tä, saadaan yksittäinen N-asyyli- aminoglukuronyyli-aglykoni tekijä, joka on vastaavasti antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä A ja antibioottinen A 40926 N-asyy 1iaminoglukuronyy-li-aglykoni tekijä B, Bq tai B ^ .

25 Kun saadaan antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuro nyyl i -agl ykoni kompleksi AB, se voidaan erottaa sen yksittäisiksi tekijöiksi sinänsä tunnetuilla menetelmillä, kuten neste/neste-kromatografisesti ja mieluimmin prepara-ti ivisella HPLC:llä.

30 Edullisessa menetelmässä käytetään käänteisfaasi-neste- kromatografiaa , mieluimmin ruostumattomissa teräskolonneis-sa kohtuullisessa paineessa (5-50 baaria) tai korkeapaineessa (100-200 baaria). Kiinteä faasi voi olla silanoitu li 25 86 307 piihappogeeli yhdessä hiilivetyfaasin kanssa, jossa (2-18) hiiliatomia (kaikkein mieluimmin C 18), tai fenyyliryhmän kanssa ja eluentti on polaarisen, veteen sekoittuvan liuottimen, kuten edellä määritellyn, ja vesipitoisen puskurin 5 seos pH:n ollessa yhteensopiva hartsin kanssa (mieluimmin pH 4-8).

Kaikkein edullisin on polaarisen vesiliukoisen, aprootti-sen liuottimen lineaarinen gradienttieluointiseos asetonit-rillistä ja vesipitoisesta puskuriliuoksesta, pH:n ollessa 10 4-8 ja mieluimmin noin 6, kuten asetonitriili/fosfaattipus- kuri-seoksen lineaarinen gradientti alkaen 5 %:sta aina 45 %:iin, pH 6, 70:30 ja asetonitrii1i/fosfaattipuskuri-seoksen, pH 6, 10:90, lineaarinen gradientti alkaen 5 %:sta aina 45 %: iin.

15 Tämän keksinnön eräs toinen kohde ja edullinen suoritusmuoto on menetelmä selektiivisesti valmistaa antibioottista A 40926 aglykonia, jossa menetelmässä antibioottinen A 40926 kompleksi tai sen yksittäinen tekijä, antibioottinen A 40926 kompleksi AB, antibioottinen A 40926 tekijä A, 20 antibioottinen A 40926 tekijä B, antibioottinen A 40926 ...· tekijä PA, antibioottinen A 40926 tekijä PB, antibiootti nen A 40926 tekijä BQ, antibioottinen A 40926 tekijä B1 , antibioottinen A 40926 mannosyyli-aglykoni ja antibiootti-nen A 40926 N-asyy1iami nog 1ukuronyy1i-ag1ykoni (kompleksi 25 AB / tai sen yksittäinen tekijä) saatetaan kontrolloidun happohydrolyysin alaiseksi: (a) orgaanisen, proottisen liuottimen läsnäollessa, joka liuotin on alifaattinen happo tai aifa-halogenoitu, alifaattinen happo, joka reaktio-lämpötilassa on neste, alifaattinen tai sykioalifaattinen 30 alkanoli, joka reaktiolämpötilassa on neste ja hiukan ve-^en kanssa sekoittuva, fenyyli-substituoitu aiempialkano-jossa fenyyliosa voi mahdollisesti sisältää (C^-C^)-a1kyyli~, (C^-C^)alkoksi- tai halogeenitähteitä ja joka : ; reaktiolämpötilassa on neste ja hiukan veden kanssa seko it- 26 86307 tuve tai beta-polyhalogenoitu alempialkanoli, joka reaktio-lämpötilassa on neste, (b) liuottimen kanssa sopivan vahvan hapon läsnäollessa, joka happo on vahva mineraalihappo, vahva, orgaaninen happo tai vahva, haponkationin vaih-5 tohartsi vetymuodossa, ja (c) reaktiolämpötila on noin 20°C - noin 100°C.

Kun proottinen liuotin on alifaattinen happo tai alfa-halogenoitu, alifaattinen happo, edullisia ovat 1-5 hiili-atomia sisältävät alifaattiset hapot ja vastaavasti 2-5 10 hiiliatomia sisältävät aifa-halogenoidut, alifaattiset ha pot, vaikkakin mitä tahansa alifaattista happoa tai mitä tahansa alfa-halogenoitua alifaattista happoa, joka reaktiol ämpöti 1 assa pystyy liuottamaan lähtöainetta riittävässä määrin, voidaan edullisesti käyttää.

15 Esimerkkejä edellä mainituista hapoista ovat: muurahais happo, etikkahappo, propionihappo, voihappo, isovoihappo, vaieri aanahappo , isovaleriaanahappo , trimetyylietikkahappo, fluorietikkahappo, kloorietikkahappo , difluorietikkahappo, dikloorietikkahappo, trifluorietikkahappo , trikloorietikka-20 happo, pentafluoripropionihappo , 2,2,3,4 ,4,4-heksf1uorivoi - happo, heptafluorivoihappo ja vastaavat.

: Alemmat, alifaattiset hapot, kuten etikkahappo ja propioni- happo tai alempi-alfa-halogenoitu alifaattinen happo, kuten kloorieti kkahappo, dikloorietikkahappo, trikloorietikkahap-25 po, dif 1 uorietikkahappo, klooridif 1uorietikkahappo, trifluo- rietikkahappo ja pentafluoripropionihappo ovat edullisia reaktioliuottimia tämän keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti. Näistä happoliuottimista sellaiset, joilla on korkea happovahvuus, voivat samanaikaisesti toimia sekä liuot-30 timina että vahvana happopromoottorina hydrolyysireaktios- sa ja siten ei ole tarpeen lisätä muuta vahvaa happoa edistämään hydro 1yysireaktio ta . Tätä tarkoitusta varten trifluo rietikkahappo osoittautui erityisen käyttökelpoiseksi, käytettäessä sitä konsentraatiossa 75 % - 95 %, lämpötilan li 27 86307 ollessa 60°C - 90°C ja reaktioajan vaihdellessa 0,5 tunnista 8 tuntiin.

Kaikkein edullisimman suoritusmuodon mukaan 5-10 hiiliatomia sisältävät primääriset ja sekundääriset alkanolit ja 5 5-10 hiiliatomia sisältävät sekundääriset sykioalkanolit ovat käyttökelpoisia käytettäväksi tämän kontrolloidun happohydrolyysin reaktioliuottimena. Esimerkkejä mainituista alkanoleista ovat: 1-pentanoli, 2-pentanoli, 3-pen-tanoli, 1-heksanoli, 2-heksanoli, 3-heksanoli, 3,3-dimetyy-10 1i-1-butanoli , 4-metyyli-1-pentanoli, 3-metyyli-1-pentano- li, 2,2-dimetyyli-3-pentanoli, 2,4-dimetyyli-3-pentanoli , 4,4-dimetyyli-2-pentanoli, 5-metyyli-2-heksanoli, 1-hepta-noli, 2-heptanoli, 5-metyyli-1-heksanoli, 2-etyyli-1-hek-sanoli, 2-metyyli-3-heksanoli, 1-oktanoli, 2-oktanoli, 15 sykiopentanoli , 2-syklopentyylietanoli , 3-syklopentyyli-1 --propanoli, sykioheksanoli, sykioheptanoli , sykio-oktanoli , 2,3-dimetyylisykioheksanoli, 4-etyylisykioheksanoli , syklo-oktyylimetanoli, 6-metyyli-5-hepten-2-oli, 1-nonanoli, 2-no-nanoli, 1-dekanoli, 2-dekanoli ja 3-dekanoli.

20 Esimerkkejä fenyyli-substituoiduista ai empi aikanoleista ovat seuraavat: bentsyylia 1koholi , m-klooribentsyylialkoho! i , o-f1uoribentsyyliaikoholi , m-f1uoribentsyylia 1koholi , p-fluoribentsyyliaikoholi, m-metyylibentsyylia 1koholi , m-metoksibentsyylialkoholi , o-etoksibentsyyliai koho 1i , m-25 butoksibentsyylialkoholi, p-tert.-butoksibentsyylialkoho-li, p-tert.-butyylibentsyylialkoholi , fenetyylialkoholi, o-kloorifenetyyli alkoholi, m-kloorifenetyylialkoholi, o-metoksifenetyylialkoholi , m-metoksifenetyyliaikoholi , o-propyylifenetyylialkoholi, o-etoksifenetyylialkoholi, p-30 f1uorifenetyylialkoholi , p-bromifenetyylia 1koholi , o-pro- poksifenetyylialkoholi, o-butoksifenetyylialkoholi , 1-(p-isopropyylifenyyli)etanoli , 3-fenyyli-1-propanoli, 2-fenyyli- 1-propanoli, 4-fenyyli-1-butanoli ja 3-fenyyli-1-:"r -butanoli.

28 86307

Kun orgaaninen, proottinen liuotin on beta-polyhalogenoi-tu a!empi aikanoli, joka reaktiolämpötilassa on neste, beta-kloori- ja/tai -fluori-substituoidut, 1-4 hiiliatomia sisältävät alkanolit ovat edullisia. Esimerkkejä ma i -5 nituista beta-polyhalogenoiduista alempialkanoleista ovat: dikloorietanoli , trikloorietanoli , dikloorifluorietanoli , dif 1uorik 1oorietanoli, dif1uorietanoli, tri f 1uorietanoli, 1,1,1,3,3,3-heksafluori-2-propanoli, 2,2,3,4,4,4-heksa-fluoributanoli ja 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoributanoli.

10 Edulliset hydro!yysi-oiosuhteet antibioottisen A 40926 aglykonin valmistamiseksi on kontrolloitu hydrolyysi, jossa käytetään polaarisen, aproottisen liuottimen ja vahvan mineraalihapon tai orgaanisen hapon seosta rajoitetun (0,1-10%, paino/paino) määrän vettä läsnäollessa, lämpö-15 tilan ollessa 40°C-100°C ja mieluimmin 65°C-90°C, reaktioaika on 1 tunnista 4 tuntiin.

Kaikkein mieluimmin hydrolysoimis seos on dimetyylisulf oksidin ja 37-prosenttisen kloorivetyhapon seos, suhteessa alkaen 8:2 - 9,5:0,5, lämpötilan ollessa noin 80°C, reak-20 tioaika noin 3 tuntia.

Kuten edellä huomautettiin, näissä olosuhteissa myös antibioottinen A 40926 mannosyyli-aglykoni ja antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni (kompleksi AB tai sen yksittäinen tekijä), jotka ovat antibioottisen 25 A 40926 kompleksin (tai sen yksittäisen tekijän tai mainittujen tekijöiden seoksen) sokeriosien osittaisen hydrolyysin tuotteita, muuttuvat antibioottiseksi A 40926 a g 1 y k o n i k s i .

Antibioottinen A 40926 N-asyyliami nog 1ukuronyyli-ag1 ykoni 30 kompleksi AB ja sen yksittäiset tekijät A, B, Bq ja B^ ja antibioottinen A 40926 aglykoni ovat aktiivisia gram-positiivisia bakteereita vastaan, jotka aiheuttavat monia, laajalti levinneitä infektioita. Koska näiden patogeenien 29 86307 resistanssi tavanomaisia terapeuttisia hoitomuotoja vastaan on kasvanut, uusien antibioottien tarve on yhä suuri.

Yleensä antibakteerista hoitoa varten antibioottinen 5 A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB, sen tekijä ja/tai antibioottinen A 40926 aglykoni sekä näiden myrkyttömät, farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat tai niiden seokset voidaan annostaa eri tavoilla kuten topikaa1is e sti tai parenteraalisesti. Parenteraa1i-10 nen annostus on, yleensä, edullinen annostamistapa.

Injektoivat koostumukset voivat olla suspensioina, liuoksina tai emulsioina öljymäisissä tai vesipitoisissa kantoa i ne issa ja ne voivat sisältää apuaineita, kuten sus-pendoivia, stabiloivia ja/tai dispergoivia aineita.

Vaihtoehtoisesti aktiiviaine voi olla jauhemuodossa, josta se muodostetaan uudestaan annostettaessa, lisäämällä siihen sopiva kantoaine, kuten steriili vesi.

Riippuen annostamistavasta, nämä yhdisteet voidaan val-mistaa erilaisissa annosmuodoissa.

20 Eräissä tapauksissa voi olla mahdollista valmistaa keksinnön mukaiset yhdisteet enteropäällysteisinä annosmuo-töinä oraaliseen annostukseen, jotka annosmuodot valmistetaan alalla tunnetulla tavalla (kts. esimerkiksi "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. painos, Mack Publishing 25 Company, Easton, Pennsylvania, USA, sivu 1614).

Tämä voisi tulla kysymykseen erityisesti silloin, kun anti-;·. mikrobisen aineen absorption toivotaan tapahtuvan suolis tossa, samalla kun sen toivotaan kulkeutuvan muuttumattomana ma hän 1 ä p i .

30 Annostettavan aktiiviaineen määrä riippuu erilaisista te- kijöistä, kuten hoidettavan koosta ja olotilasta, annostus-tavasta ja annostustiheydestä sekä taudin aiheuttajasta.

30 86307 Tämän keksinnön mukaiset antibiootit, nimittäin antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-a g 1 ykoni ja antibioottinen A 40926 aglykoni ja niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat, ovat yleensä tehokkaita päivittäisen 5 annostuksen ollessa noin 0,5 - 50 mg aktiiviainetta poti laan kehon painokiloa kohti, mahdollisesti jaettuna 1-4 annokseen per päivä.

Erityisen toivottavia koostumuksia ovat sellaiset, jotka on valmistettu yksikköannoksiin sisältäen noin 100 - noin 10 5 000 mg per yksikkö.

Jatkuvavaikutteiset koostumukset voidaan valmistaa alalla tunnettujen erilaisten mekanismien ja menetelmien mukaan.

Edullisessa menetelmässä jatkuvavaikutteisen koostumuksen 15 valmistamiseksi, joka sisältää antibioottisen A 40926 N- asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni n tai antibioottisen A 40926 aglykoni n, käytetään tämän antibiootin veteen liukenematonta muotoa suspendoituna vesipitoiseen tai öljy-mäiseen väliaineeseen.

20 FARMASEUTTISEN KOOSTUMUKSEN VALMISTAMINEN

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmistetaan siten, että 5 ml steriiliä suspensiota USP sisältää 8 % propy1eenig 1ykoiia ja 500 mg antibioottisen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB:n fysio-25 logisesti hyväksyttävävää emäsadditiosuolaa.

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmistetaan siten, että 5 ml steriiliä suspensiota USP sisältää 8 % propyleenig 1ykolia ja 500 mg antibioottisen A 40926 N-asyyliami nog 1ukuronyyli-aglykoni tekijä A:n fysiologi-30 sesti hyväksyttävää emäsadditiosuolaa .

Il 31 86307

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmistetaan siten, että 5 ml steriiliä suspensiota USP sisältää 8 % propyleeniglykolia ja 500 mg antibioottisen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä B:n fysiolo- 5 gisesti hyväksyttävää emäsadditiosuolaa.

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmistetaan siten, että 1000 mg antibioottista A 40926 N-asyyli-aminoglukuronyyli-aglykoneja veteen 1iukenemattomassa hap-pomuodossa suspendoidaan 5 ml:aan steriiliä vettä injek-10 tiota varten.

Lisäksi keksinnön mukaiset antibiootit ovat käyttökelpoisia ehkäisten Clostridium diffici1e-kannan kasvun, joka aiheuttaa kalvoi sen paksunsuolentulehduksen suolistossa. Näitä antibiootteja voitaisiin käyttää kalvoista paksun-15 suolentulehdusta hoidettaessa annostamalla oraalisesti tehokas määrä antibiootteja tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa valmistettuna farmaseuttisesti hyväksyttävään annosmuotoon. Tällaisessa käytössä antibiootit voidaan annostaa gelatiinikapse!eissa tai nestemäi-.··. 20 sessä suspensiossa.

*· Paitsi, että yhdisteet ovat aktiivisia lääkkeinä, anti- : ·· bioottisia A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoneja

Ja antibioottista A 40926 aglykonia ja niiden farmaseut-tisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan käyttää eläinten : : : 2 5 kasvua edistävinä aineina.

Tätä tarkoitusta varten keksinnön mukainen yhdiste annostetaan oraalisesti sopivassa ravintoaineessa. Tarkka käyt-tökonsentraatio on sellainen, joka on tarpeen kasvun edistämiseksi tehokkaasti aktiiviaineella käytettäessä nor-30 maaleja määriä ravintoa.

keksinnön mukaisen aktiivi aineen lisääminen eläinten ra-·;* vintoon suoritetaan mieluimmin valmistamalla sopiva ennalta 32 86307 sekoitettu ravintoseos, joka sisältää aktiiviaineen tehokkaassa määrässä ja ennalta sekoitettu seos yhdistetään valmiiseen päivän ravintoannokseen.

Vaihtoehtoisesti välituotekonsentraatti tai ravintolisä-5 aine, jotka sisältävät aktiiviaineen , voidaan sekoittaa ravintoon.

Tapa, jolla tällaiset ravintoseokset ja valmiit päivän ravintoannokset voidaan valmistaa ja annostaa, on kuvattu viitekinjoissa (kuten "Applied Animal Nutrition1 , W.H.

10 Freedman and Co., S.Francisco, USA, 1969 tai "Livestock

Feeds and Feeding" 0 and B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) ja liitetään tähän selitykseen viitteinä.

A 40926 LÄHTÖAINEIDEN KUVAUS JA VALMISTUS

Antibiootin A 40926 kompleksin, antibioottien A 40926 teki-15 jän A, tekijän B, tekijän BQ, tekijän PA tai tekijän PB

tuottaminen tapahtuu viljelemällä kantaa Actinomadura sp., joka kykenee tuottamaan kyseistä antibioottia, t.s. viljelemällä kantaa Actinomadura sp. ATCC 39727 tai sen antibioottia A 40926 tuottavaa muunnosta tai mutanttia, aero-20 bisissa oloissa vesipitoisessa ravintoalustassa, joka si sältää assimiloituvat hiili- ja typpilähteet sekä epäorgaanisia suoloja. Voidaan käyttää monia niistä ravinto-alustoista, joita tavallisesti käytetään käymisessä, kuitenkin tietyt alustat ovat edullisia. Edullisia hiililäh-25 teitä ovat glukoosi, mannoosi, galaktoosi, tärkkelys, maissijauho ja vastaavat. Edullisia typpi 1ähteitä ovat ammoniakki, nitraatit, soijapapujauho , peptoni , lihauute, hiiva u u t e , tryptoni, aminohapot ja vastaavat. Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan lisätä vi1jelyalustoihin , ovat ta-30 valli sesti liukenevat suolat, jotka kykenevät tuottamaan natrium-, kalium-, rauta-, sinkki-, koboltti-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti-, fosfaatti-, nitraatti-ioneja ja vastaavia.

l! 33 86307

Tavallisesti antibioottia tuottavaa kantaa eslvlljellään ravistelupul1ossa, sen jälkeen viljelmää käytetään käy-misastiolden ymppäämiseen huomattavien määrien antibioottia tuottamiseksi. Es 1v11jelmään käytetty kasvualusta voi 5 olla sama kuin mitä käytetään suuremmissa käym1sast1o1ssa, mutta myös muita alustoja voidaan käyttää, Antibioottia A 40926 tuottava kanta voi kasvaa lämpötiloissa, jotka ovat 20 - 40°C, mieluimmin 24 - 35°C.

Käymisen aikana antlbioottltuotantoa voidaan seurata tes-10 taamalla kasvullemestä tai myseellstä otettujen uuttonäyt-telden antibioottinen aktiivisuus esimerkiksi kasvukokell-la ta 1 ohutkerroskromatograf1sestl (TLC) ta 1 korkeapaine-nestekromatograf1ses 11 (HPLC).

Testiorgan1sme1na voidaan käyttää antibiooteille A 40926 15 herkkiä organismeja, kuten Bacillus subtllls'ta ja S. au-reus'ta. Kasvukoe suoritetaan mieluimmin agardlffuuslome-ne tel mä 11ä agarlevylllä. Antibioottisen anti 1v1suuden mak-simituotanto tapahtuu tavallisesti käymisen toisen ja viidennen päivän välisenä aikana.

20 Antibioottia A 40926 tuotetaan viljelmällä kantaa Actl-nomadura sp, ATCC 39727 ta 1 sen antibiootti A 40926 tuottavaa mutanttla tai muunnosta, ja antibiootti löytyy pääasiassa viljelyn emistä,

Seuraavissa kappaleissa on esitetty kannan Actlnomadura 25 sp, A 40926 ATCC 39727 tunnusmerkit:

MAKROSKOOPPINEN JA MIKROSKOOPPINEN TUTKIMUS

Kasvumyseel1 muodostuu taipuisasta ja haarautuneesta hyyf 1 stä (halkaisija noin 0,8 jum), jolla eräillä kasvualustoilla, merkitty tähdellä taulukossa III, jossain mää-30 rin on taipumusta pilkkoutua sauvamalslksi kappaleiksi j usean päivän kasvun jälkeen, kun taas glukoos1-asparag11-m-kasvualustalla se pilkkoutuu kokk1ma1s1ks1 kappaleiksi, 34 86 307

Tyypillistä tälle kannalle on kasvumyseelln Burgundy-vär1 eräillä kasvualustoilla,

Ilmamyseel1ä esiintyy ainoastaan muutamilla kasvualustoilla; erity1 sestl taulukoissa III esitetyissä alustoissa, sitä 5 esiintyy ainoastaan kaurajauhoagarilla ja maa-agarilla.

Näillä kasvualustoilla Hmamyseell on vai koi sen-harmaata ja muodostaa it1öalustoja , jotka ovat järjestäytyneet koukuiksi ja lyhyiksi, noin 10-20 1t1bn spiraaleiksi.

Itiöt ovat syl1nterlmälsiä ja niiden keskimääräinen koko 10 on 0,8 x 1 ,2 |jm. i

VIIJELYTUNNUSMERKKIEN MÄÄRITTÄMINEN

Viljelytunnusmerkkien määrittämiseksi viljeltiin kantaa Actinomadura sp. ATCC 39727 erilaisilla standardi-kasvualustoilla, joita ovat Sh i rli ng ja Gottlieb esittäneet 15 (Sh i rli ng E.B. and Gottlieb D,, 1966 - Method for characterization of Streptomyces species - Int, J. Syst,

Bacter i oi ., J_6, 31 3-340), lisäksi käytettiin useita Waksman'1n suosittelemia kasvualustoja (Waksman, S.A, 1961 - The Actlnomycetes - The Williams and Wilkins Co, 20 Baltimore; Voi, 2, 328-334), , Värin määrittäminen suoritettiin tarvittaessa MaerzMn ja Paul'in menetelmällä (Maerz A, and M. Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2nd Edition McGraw-ΗΠΙ Book Company Inc, New York), 25 Organismin kykyä käyttää hyväkseen erilaisia hl 11118hte1-tä tutkittiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet Shirling ja Gottlieb,

Viljely- ja fysiologiset tunnusmerkit Ja h1111lähte1den hyväksikäyttö on esitetty taulukoissa III. IV Ja v* 30 Taulukossa III esitetyt tulokset on saatu aikaan kahden v11- j kon inkubolnnln jälkeen 28°C;ssa, t li 35 86307

TAULUKKO III

KANNAN ACTINOMAÖURA sp, ATCC 39727 VILJELYTUNNUSMERKIT

Kasvualusta Tunnusmerkit N?i2 \ runsasta kasvua, kovakuorl- ( 11vauute-mallasagar) nen pinta, 8/L/8, jälkiä kul- lanruskeasta-vaaleanpuna 1ses-ta, liukenevasta pigmentistä (kauraiauhonna**? runsasta kasvua, pehmeä pinta, (kaurajauhoagar) violetti, 55/E/4, llmamysee- 1iä hyvin niukasti, harmaa, liukeneva pigmentti violetti 55/H/4 Ϊ0 4 , . kohtuullista kasvua, pehmeä tärkkelysagar) SU° °J*' ’ io/g/j4 p1nta> kermanvär1nen ('glyseroll-asparaqllnl kohtuullista kasvua, pehmeä , agar) sparagiipi- ^n°f^B^nt* · aprikoosinvärl- , (pjpt;i“hM!.0uSt.:r..t.. koS^ a9ar' ruskea 12/D/9

Uyiosiinlao!!?)7 runsasta kasvua, pehmeä ja ' yrosimiagar) ohut pinta, kullanruskea- ruskea 13/K/12 !

Kaurajauhoagar * runsasta kasvua, pehmeä pinta,

Burgundy'n-värinen 8/L/7, 11-: mamyseel1ä kohtuullisesti, . vaa1eankeltainen-harmaa 44/B/2

Hlckney'n ja TresnerMn runsasta kasvua, rypistynyt y pinta, kullanruskea-ruskea 13/K/12

Czapeck-glukooslagar kohtuullista kasvua, pehmeä pinta, vaaleankeltainen 9/1/3

Glukoos1-asparag11n1«g.r * niukkaa kasvua, kermamalnen pinta, oijenvärinen-kelta 1-nen 9/E/1

Ravlntoagar runsasta kasvua, rypistynyt pinta, vaalean oranssi.

; 11/C/7 .36 86307 TAULUKKO III (jatk.)

Kasvualusta Tunnusmerkit

Peruna-agar * runsasta kasvua, rypistynyt pinta, Burgundy'n värinen 8/L/9

Bennett'in agar * runsasta kasvua, kovakuori nen pinta, Burgundy'n värinen 8/L/8, liukeneva pigmentti syvän kullanruskea-roosa 5/J/10

Kai s 1um-malaattiagar kohtuullista kasvua, pehmeä pinta, aprikoosin värinen 10/B/3

Kuorittumaitoagar runsasta kasvua, hiukan ry pistynyt pinta, oranssi 9/B/9

Czapeck-sakkarooslagar runsasta kasvua, pehmeä pin ta, aprikoosin värinen 10/B/6

Munanvalkuaisagar runsasta kasvua, pehmeä pin ta, roosa 52/B/3, jälkiä liukenevasta pigmentistä, roosa 52/B/3

Sabouraud-agar ei kasvua

Maa-agar niukkaa kasvua, väritön, vai koisenharmaa ilmamyseell

Oekstroosi-triptonlagar * kohtuullista kasvua, pehmeä ja ohut pinta, vaaleankeltainen 10/G/2

Peruna runsasta kasvua, oranssin- ruskea, merkkejä valkoisen-harmaästa ilmamyseelistä I! 37 86307

TAULUKKO IV

FYSIOLOGISET TUNNUSMERKIT

Kokeet Tulokset Tärkkelyshydrolyysi negatiivinen R1kkihi1len (S) muodostus negatiivinen kasvualustalla 6 positiivinen 1 y 1 jyasetaatti-, liuskoilla

Tyro s 11 nirea kt i o positiivinen

Kasei i nihydrolyysi positiivinen

Kalsiummalaattihydrolyysi negatiivinen

Gelatiinin nesteytys positiivinen koagulointi negatiivinen

Lakmusma i to^ ^peptonisaatio positiivinen

Selluloosan hajottaminen negatiivinen

Nitraattlpelklstys positiivinen f .

l 38 86307 TAULUKKO V HIILEN HYVÄKSIKÄYTTÖ v

Hiili!ähde Kasvu ____- ____- -____- ------------------ _ . ------------ --------------------

I

arablnoosi + ksyloosi + mannoosi ' + fruktoosi + raffinoosi + ramnoosi + glukoosi + laktoosi + galaktoosi + inositoll sakkaroosi + selluloosa s a 1 i s i i n 1 + mannitoli + riboosi + kasvua - » e1 kasvua li 39 86307 - KEM0TAKS0N0MISET TUNNUSMERKIT SOLUSEINÄANALYYSIj

Soluseinässä esiintyvien aminohappojen analyysi suoritettiin menetelmillä1, joita kuvataan teoksessa Becker et ai.

5 "Rapid differentation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates", Appi, Microbiol. J_2, 421 -423 (1964). Koko solun hydrolyys 1 ana-lyysi osoitti meso-diaminopimeliinihapon läsnäolon.

Pelkän soluseinän analyysillä, joka suoritettiin menetel-10 maila, jonka ovat esittäneet Kawamoto et ai. (I. Kawamoto, T. Oka and T. Nara, "Cell-wall composition of Micromono-spora oiivoasterospora, Micromonospora sagamiensis and related organism", J. of Bacteriology 146, 527-534, 1981), voitiin osoittaa glysiinin puuttuminen.

15 SOKERI ANALYYSI:

Sokeripitoisuuden analyysi suoritettiin menetelmällä, jonka on esittänyt M.P. Lechevalier, "Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance", J. Lab. Clin. Med. 7^, 934-944 (1968), käyttäen ohutkerroskromatografias-20 sa sei 1 uioosakalvoja kuten ovat esittäneet J.L. Staneck ja G.0. Roberts, "Simplified approach to identification of aerobic actinomicetes by thin-layer chromatography", 28, 226-231 (1974), yhdessä seuraavan liuotin systeemin kanssa: etyyliasetaatti-pyridiini-vesi (100:35:25 tilavuuksia).

25 Saadut tulokset osoittivat, että pääasiassa esiintyi glukoosia ja riboosia, kun taas pienempiä määriä glaktoosia, mannoosia ja maduroosia (3-0-metyyl1-D-galaktoos1a) myös havaittiin.

MYK0LI INI HAPOT: 30 Koe esiintyvien mykol1inihappojen havaitsemiseksi suoritettiin käyttäen menetelmää, jonka ovat esittäneet Minnikin et ai. (D.E. Minnikin, L. Alshamaony and M, Good- ' 40 86307 fellow, "Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin layer chromatography analysis of whole organism methanolysates", Journal of General Microbiology 88, 200-204, 1975).

5 Kokeen tulokset olivat negatiiviset; mykol1inihappoja ei löydetty.

KANNAN IDENTIFIOINTI:

Kanta merkitään kuuluvaksi Actinomycetes sukuun Actino-madura, koska läsnä on meso-diaminopimeliinihappo ja 10 maduroosi, glysiini puuttuu peptodoglykaanissa, mykolli-nihapot puuttuvat ja ilmamyseeliä muodostuu suhteellisen pitkin itiöketjuin.

i • Kuten muillakin mikro-organismeilla, antibioottia A 40926 tuottavan kannan tunnusmerkit ovat aittiit-muutoksi 11 e.

15 Esimerkiksi kannan keinotekoiset muunnokset tai mutantit voidaan saada käsittelemällä erilaisilla tunnetuilla muta- 1 geeneillä, kuten UV-säteil la', röntgensäteillä, suurtaajuisilla aalloilla, radioaktiivisella säteilyllä ja kemikaaleilla, kuten typpihapolla, N-metyyli-N 1-nitro-nitrosogua-20 nidlinilla ja monilla muilla. Kaikki luonnolliset ja keinotekoiset muunnokset ja mutantit, jotka kuuluvat Actmo-madura-suvun lajeihin ja tuottavat antibiootteja A 40926, pidetään ekvivalentteina kannan Actinomadura sp. ATCC 39727 suhteen ja katsotaan kuuluvaksi tämän keksinnön pii- 25 riin.

i A 40926 antibioottien ,taiteenottaminen tuottavien mikro-organismien käymisliemestä tapahtuu sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti, jolloin suoritetaan uutto liuottimilla, seostaminen lisäämällä ei-1iuottimia tai 30 liuoksen pH-arvon muuttaminen, jakaantumiskromatografia, käänteis-faasinen jakaantumiskromatografia, ionmvaihto-kromatografia, affiniteettikromatografia ja vastaavat toimenpiteet.

li 4i 86307

Edullisessa menetelmässä käytetään aff 1niteettikromato-grafiaa liikkumattomalla D-alanyyli-D-alani1ni11 a , jonka jälkeen seuraa käänteisfaasinen pyiväskromatografia.

Liikkumattomat D-a1anyyli-D-a1 aniini-matriisit, jotka 5 ovat sopivia tähän taiteenottomenetelmään, on kuvattu EPO-patenttihakemuksessa No 83112555. Edullinen matriisi tässä menetelmässä on D-alanyyli-D-alaniini kytkettynä tasahuokoiseen ristiinkytkettyyn polydekstraaniin.

Käymisliemelle voidaan suorittaa affiniteettikromatogra-1° fia suoraan suodatuksen jälkeen tai alustavan puhdistus-menetelmän jälkeen. Tässä viimeksi mainitussa menetelmässä koko käymistilassa tehdään emäksiseksi, mieluimmin säädetään pH-arvo välille 8,5 - 10,5 myseeliin adsorboituneen antibiootin liuottamiseksi, jonka jälkeen suodatetaan.

15 Kirkkaan suodoksen pH säädetään arvoon 2,5 - 4,5 ja suodatetaan uudestaan suodatusapuaineen läsnäollessa. Tämä suodos hylätään kun taas suodatuskakku otetaan talteen ja suspendoidaan veteen, tehdään emäksiseksi, mieluimmin säädetään pH-arvo välille 8 - 9 ja suodatetaan. Suodatus-20 kakulle suoritetaan uudestaan tämä menetelmä, kun taas suodokset, jotka sisältävät antibiootin A 40926, yhdistetään.

Näille suodoksille tai suodatetuille käymisliemi11 e suoritetaan sen jälkeen affiniteettikromatografia liikkumat-25 tomalla D-alanyyl1-D-alaniinilla, joko pylväässä tai annoksittain.

Antibiootin A 40926 sitoutuminen affiniteettimatriisiin tapahtuu mieluimmin pH-arvossa noin 7,0 - 8,0 ja sen eluointi suoritetaan emäksisemmi11ä pH-arvoilla (mieluimmin 9,0 - 10,5) 30 käyttäen vesipitoista emästä. Tämä vesipitoinen emäs voi olla ammoniakki, haihtuva amiini, alkali- tai aikaiimetalli-hydroksidi tai emäksisesti puskuroitu liuos mahdollisesti polaarisen, orgaanisen liuottimen, kuten polaarisen veteen sekoittuvan 1iuottimen, joita jäljempänä määritellään, 42 86307 1äsnäollessa.

Sen jälkeen kun epäpuhtaudet on poistettu huuhtomalla pylväs vesipitoisella puskurilla, jonka pH-arvo on 4 - 9 ja joka mahdollisesti sisältää suoloja, kuten karbodiamidia 5 ja/tai veteen sekoittuvia liuottimia, antibiootti A 40926 eluoidaan edellä esitetyllä eluointiseoksella. Sen jälkeen raaka antibiootti otetaan talteen mieluimmin poistamalla vettä yhdistetyistä antibioottia sisältävistä fraktioista atseo-trooppisesti tislaamalla yhdessä orgaanisen liuottimen 10 kanssa, joka kykenee muodostamaan atseotrooppisia minimi-seoksia veden kanssa, jonka jälkeen lisäämällä ei-liuo-tinta seostetaan toivottu tuote.

Tyypillisiä esimerkkejä orgaanisista liuottimista, jotka pystyvät muodostamaan atseotrooppisia minimi seoksia veden 15 kanssa, ovat n-butanoli, bentseeni, tolueeni, butyylieet-teri, hiilitetrakloridi, kloroformi, sykioheksaani, 2,5--dimetyylifuraani, heksaani ja m-ksyleeni; edullinen liuotin on n-butanoli.

Esimerkkejä ei-1iuottimista ovat petrolieetteri, alempi-20 alkyylieetterit, kuten etyylieetteri, propyylieetteri ja butyylieetteri ja ai empi ai kyy!iketonit, kuten asetoni.

Vaihtoehtoisesti yhdistetyt antibioottia sisältävät fraktiot konsentroidaan pieneen tilavuuteen, mieluimmin tislaamalla atseotrooppisesti edellä määritellyn orgaanisen 25 liuottimen kanssa ja muodostunut vesipitoinen liuos lyo- fi1i soidaan.

Jos eluointiin käytetty vesipitoinen emäs on haihtumaton, voi olla tarpeen suorittaa neutralointi ja suolan poistaminen konsentraatista ennen seostamista tai pakastus-30 kuivausta.

Sopiva suolanpoistomenetelmä käsittää antibioottia sisältävän vesipitoisen liuoksen valuttamisen läpi silanoidusta piihappogeelipyiväästä, joka pestään tislatulla Vedellä ja 43 86307

eluoidaan polaarisen veteen sekoittuvan liuottimen Ja veden seoksella. J

Tyypillisiä esimerkkejä polaarisista, veteen sekoittuvis- 5 n!l 0fUl?ta °Vat Vesi,1llk»ise‘ a 1 kohol i t (kuten meta-no etanol,. isopropanol1, n-butanoli), asetoni, aseto- "itrnl,, ai empi aikyylialkanoaatlt (kuten etyyliasetaatti), tetrahydrofuraani, dioksaani Ja dimetyyliformamidi ja näiden seokset; edullinen polaarinen, veteen sekoittuva liuo-tin on asetoni tri il 1, 10 Vaihtoehtoisesti suolan poistaminen voidaan suorittaa käyttäen antibioottia sisältävälle liuokselle edellä kuvattua a miteettipylvästä, joka pestään tislatul la vedellä ja eluoidaan haihtuvalla, vesipitoisella emäksellä, kuten edellä esitettiin affiniteettikromatografian eluoinnin yb-ey essä. Nain saatu tuote on antibiootti A 40926 kompleksi. Tarvittaessa se voidaan edelleen puhdistaa tai sille voidaan suorittaa sellainen erottaminen, että saadaan sen tekijät A, B, Bq, PA ja PB.

Sopiva menetelmä puhtaan antibiootin A 40926 kompleksin saamiseksi on sellainen, jossa edellä saatu kompleksi puhdistetaan edel 1 een affini teettikromatograf iapyl väässä, Ta- va lisesti käytetään samaa statlonäärlfaasia (liikkumaton 0-a anyyli-D.,1,mini) ja toivottu antibiootti eluoidaan ede la kuvatun affiniteettikromatografia-menetelmän mukaisesti liikkumattomalla 0-alanyyli-0-alaniinilla.

Edullinen liikkumaton D-alanyyl1-D-alaniini on Sepharose--c-aminokaproyyl1-D-alanyyli-D-alaniini, edullinen tasapai-noitusseos on 0,16-prosenttinen (paino/til.) ammoniakki, , ° * s1sä'te'ä 2 M NaCliää, pH säädettynä arvoon 7 - Θ, edul linen huuhdelko. on 0,16-prosenttinen (paino/til.) ammoniakki, joka sisältää 2 M natriumkloridia, pH-säädettynä arvoon 8 - 9,5, edullinen eluointiliuos on 0,16-prosentti- nen (paino/til.) ammoniakki, joka sisältää 2 H natriumklo- r'd1a, pH säädettynä arvoon 10,5 - 12 ja kaikkein edullisin 44 86307 eluointlseos on edellä esitetty seos, jonka pH on sää-detty afVoon 11,5.

Antibioottiset A 40926 tekijät, eli antibiootti A 40926 tekijä A, antibiootti A 40926 tekijä B, antibiootti A 40926 teki-6 ja B0, antibiootti A 40926 tekijä PA ja antibiootti A

40926 tekijä PB, eristetään antibiootti A 40926 kompleksin vesipitoisesta liuoksesta pyiväskromatografisesti ja mieluimmin käyttäen käänteisfaasipyiväskromatografiaa . Edullinen stationäärifaasi , käänteisfaasipylvaskromatogra-10 fian ollessa kyseessä, on silanoitu piihappogeel i. Hyviä tuloksia voidaan saada pyiväskromatografisesti kuitenkin myös funktionali soimattomal1 a polystyreeni- ja akryyli-hartseilla, kuten sellaisilla, joita myydään rekisteröidyillä nimillä Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7 ja XAD-8 15 (Rohm and Haas) tai Diaion HP 20 (Mitsubishi).

Kun käänteisfaasi-puhdistusvaihe suoritetaan käyttäen silanoitua piihappogeeliä stationäärifaasina , pylväs mieluimmin tasapainoitetaan etukäteen puskuroidulla, vesipitoisella liuoksella pH-arvossa 4-9 ja mieluimmin 5,5-20 -6,5, ja sen jälkeen eluoidaan polaarisen, veteen sekoit tuvan liuottimen lineaarisella gradient!11 a samassa puskuroidussa liuoksessa. Tyypillisiä esimerkkejä polaarisista, veteen sekoittuvista liuottimista ovat vesiliukoiset alk°“ holit (kuten metanoli, etanoli, isopropanoli , n butanoli , 25 asetoni, asetoni trii1i, tetrahydrofuraani, dioksaani ja dimetyyliformamiöi ja näiden seokset; edullinen polaarinen, veteen sekoittuva liuotin on asetonitriili.

Eluoiduista fraktioista tutkitaan niiden antibioottipitoi-suus käyttäen tavallisia kasvukokeita, kuten paperi-kiekko- 30 tai agar-diffuusiokokeita, herkillä mikro-organismeilla.

Esimerkkejä herkistä organismeista ovat Bacillus subtilis , ja S.aureus.

Kromatografointia seurataan myös sopivasti käyttäen tLC-tai HPLC-menetelmiä,

II

45 86307

Edullinen HPLC-menetelmä on käänteisfaasi-HPLC , jossa käytetään silanoidun piihappogeelin huokoisten ja pallomaisten hiukkasten muodostamaa kolonnia edellä esitetyn menetelmän mukaisesti, jossa HPLC-menetelmää 5 käsiteltiin antibioottisten A 40926 antibioottien analyysien yhteydessä.

Fraktiot, joilla on samanlainen antibiootti pitoisuus, yhdistetään ja suola poistetaan edellä esitetyllä tavalla, jolloin saadaan olennaisesti puhtaat antibioo-10 tit A 40926 tekijä A, tekijä B, tekijä BQ, tekijä PA

ja tekijä PB. Olennaisesti puhtaat antibiootit A 40926 tekijä A ja antibiootti A 40926 tekijä B, antibiootti A 40926 tekijä BQ, antibiootti A 40926 tekijä PA ja antibiootti A 40926 tekijä PB saadaan näistä fraktiois-^ ta» joihin ne sisältyvät, erilaisilla tunnetuilla menetelmillä, kuten 1yofΐ1isoima 11 a, seostamalla ei-liuottimilla tai seostamalla siten, että vesipitoisen liuoksen pH:ta muutetaan.

46 86307

Sopivassa menetelmässä lisätään liuotinta, joka kykenee muodostamaan atseotroopjii s1a seoksia veden kanssa, vesi poistetaan atseotroopplsestl tislaamalla, jonka jälkeen sakka, joka saadaan e 1-1luottimien , kuten edellä kuvattu-5 jen lisäyksen jälkeen, kerätään suodattamalla.

Antibiootit A 40926 tekijät PA ja PB, ainakin tietyissä käymlsoi oissa , ovat antibioottia A 40926 tuottavan mikro-organismin pääantibioottituotteet.

Antibiootit A 40926 tekijät A ja B ovat pääasiassa ant1-10 bloottien A 40926 tekijän PA ja vastaavasti tekijän PB transformaatlotuotteita ja ne esiintyvät usein jo käy- m1sl i eme s sä .

On havaittu, että antibiootti A 40926 tekijä PA voidaan muuttaa antibiootiksi A 40926 tekijä A ja antibiootti A 15 40926 tekijä PB voidaan muuttaa antibiootiksi A 40926 te kijä B emäksisissä oloissa. Esimerkiksi antibiootti A 40926 tekijä PA ja antibiootti A 40926 tekijä PB muutetaan antibiooteiksi A 40926 tekijä A ja vastaavasti tekijä B käsittelemällä 0,5 - 10-prosenttisella vesipitoisella ammoniakilla tai 20 muulla nukleof1111 sell a emäksellä, kuten orgaanisella amiinilla huoneen lämpötilassa 8-24 tunnin ajan,

Näin ollen kUn käym1sl1emen ta 1 antibioottia A 40926 sisältävän uutteen tai sen konsentraatin annetaan seistä tietyn ajan emäksisissä oloissa (esim, nukleoflilisen 25 emäksen vesipitoisessa liuoksessa pH >9 yön yl1) saadaan antibiootti A 40926 kompleksi, joka on rikastunut antibioottien A 40926 tekijä A ja tekijä B suhteen. Jos käy-misliemen, sen uutteen ta 1 konsentraatin altistusaika emäksiselle ympäristölle on lyhyt, saadaan antibiootin 30 A 40926 kompleksi, joka on rikastunut antibioottien A

40926 tekijä PA ja tekijä PB suhteen. i

Edullinen menetelmä antibiootin A 40926 kompleksin saamiseksi, joka on rikastunut tekijän A ja tekijän B suhteen, l! 47 86307 on sellainen, jossa antibiootin A 40926 kompleksin Huos ( joka sisai UK pääasial)isestl antibioottia A 40926 teki-jä PA ja tekijä PB) jätetään huoneen lämpötilassa 8-12 tunnin ajaksi seisomaan vesipitoiseen, nukleof11Hseen emäkseen, kuten vesipitoiseen ammoniakkiin, jonka jälkeen haluttu antibioottikompleksi eristetään edellä kuva-tulla tavalla.

Esimerkkejä antibiootin A 40926 sisältävistä liuoksista ovat käymisliemet, uutteet ja affiniteetttkromatografias-10 sa eluoidut fraktiot,

Puhdas antibiootti A 40926 voidaan saada puhdistamalla edelleen raakakompleksi affiniteettikromatografisesti edellä kuvatulla tavalla.

Nain saatu tuote, joka omaa biologiset ja fys i kokemian i -set ominaisuudet, jotka ovat johdettavissa sen puhtaista tekijöistä, käsitellään esimerkeissä antibioottina A 40926 kompleksina AB.

Edullinen menetelmä, jossa antibiootti A 40926 kompleksi-valmiste rikastetaan tekijöiden PA ja PB suhteen, on affiniteettikromatografisesti eluoitujen fraktioiden nopea neutralointi hapolla, mieluimmin mineraalihapolla , kuten rikkihapolla tai kloorivetyhapolla.

Puhtaiden antibioottien A 40926 tekijöiden PA ja PB eris-täminen tästä kompleksista voidaan tehdä jollain edellä 25 mainituista menetelmistä.

Edullisessa menetelmässä käytetään kääntelsfaasi-neste-kromatograflaa, mieluimmin ruostumattomissa teräskolon-neissa kohtalaisessa paineessa (5-50 bar) tai suurpai-neessa (100-200 bar). Kiinteä faasi voi olla silanoitu 30 pnhappogeeli, yhdessä hi il i vetyfaas i n kanssa, joka muo- dostuu (2-18) hiiliatomeista (mieluimmin C-18) tai fenyy- ' 1iryhmästä, ja eluenttina on polaarisen, veteen sekoittu- • 1 . '1 ! 48 86307 van liuottimen, kuten edellä esitetyrt, ja vesipitoisen puskurin seos pH-arvossä, joka sopii käytetylle hartsil-le (mieluimmin pH 4 - 8).

Eluointia seurataan kuten tavallista, homogeenisen anti-5 bioottip i toi suuden sisältävät fraktiot yhdistetään ja kä-sitel 1 ään edellä esitetyllä tavalla puhtaiden komponent-' tien, joilla on jäljempänä esitetyt tunnusmerkit, eristämiseksi.

Monimutkainen HPLC-analyysi on osoittanut, että antibioot-10 ti A 40926 tekijä B itse asiassa on kahden tekijän, joita merkitään tekijä Bq ja tekijä B^, seos.

Antibiootti A 40926 tekijä BQ, jota on kaikkiaan noin 90¾ antibiootista A 40926 tekijä B, on tekijä, jonka Rt on 1,22 verrattuna teikoplaniinin A2 komponentin 2 jäljem-15 pänä, tekijän B fysikokemiai 1isten tunnusmerkkien kohdassa D esitetyssä systeemissä, kun taas tekijä B1 , jota on noin 10¾ antibiootista A 40926 tekijä B, on yhdiste, jonka suhteellinen Rt on 1,27 samassa systeemissä.

Puhdas antibiootti A 40926 tekijä BQ saadaan puhdistamal-20 la edelleen antibiootti A 40926 tekijä B esimerkiksi toistamalla sen eristämiseen käytetty käänteisfaasi-kromato-grafi amenetelmä.

Antibiootin A 40926 tekijän BQ fysikokemialliset ja biologist ominaisuudet ovat käytännöllisesti katsoen ident-25 ti set antibiootin A 40926 tekijän B arvojen kanssa paitsi, että HPLC-analyysi ssä systeemissä, kuten edellä mainitussa, sillä on ainoastaan yksi piikki (Rt 1,22 suhteessa teikoplaniinin A2 komponenttiin 2 kuvatussa HPLC- sys teemi ssä).

30 Johtuen esitetyistä samankaltaisuuksista antibiootin A

40926 tekijän B ja antibiootin A 40926 tekijän BQ välillä, tässä selityksessä ja vaatimuksissa viitattaessa antibiootin A 40926 tekijän B biologisiin ominaisuuksiin on ym- l! 49 86 307 märrettävä tarkoitettavan myös antibioottia A 40926 tekijää B0, joka on antibiootin A 40926 tekijän B pää-komponentti (noin 90 %) ja etupäässä vaikuttaa sen biologisiin ominaisuuksiin.

5 Vaihtoehtoisesti keksinnön mukaiset antibiootit voidaan eristää käymi s 1iemestä tai edelleen puhdistaa vahvojen tai heikkojen anionihartsien avulla, mukaanluettuna funk-tionalisoidut polystyreeni-, akryyli- tai polydekstraani-matriisit. Esimerkkejä heikoista anioninvaihtohartseis ta 10 ovat sellaiset, joita myydään seuraavilla kauppanimillä: Dowex MWA-1 tai WGR (Dow Chemical), Amberlite IRA-73 (Rohm and Haas), DEAE-Sephadex (Pharmacia). Esimerkkejä vahvoista anioninvaihtohartseis ta , joita voidaan käyttää keksinnön mukaisesti, ovat sellaiset, joita myydään seu-15 r a a v i11 a kauppanimillä: Dowex MSA-1, SB R, SBR-P (Dow Che mical), Amberlite IR-904 (Rohm and Haas) ja QAE-Sephadex (Pharmacia ) .

A 40926 antibioottien eluointi näistä hartseista suoritetaan elektrolyyttien , kuten natrium- tai kaiiumhydroklo-20 ridien vesipitoisen liuoksen lineaarisilla gradientti-·...’ seoksilla vedessä tai veden ja orgaanisen, veteen sekoit- V : tuvan liuottimen, kuten alempialkanolin (esim. (C1-C4)- alkanolin) tai a 1 empi a 1 kyy 1iketonien (esim. asetonin) seoksissa.

25 Antibiootti A 40926 mannosyyli-aglykoni valmistetaan hydrolysoimalla antibiootti A 40926 kompleksi, joka on rikastettu tekijän A ja tekijän B suhteen hydrolysoimalla antibiootti A 40926 tekijä A, tekijä B, tekijä BQ tai näiden seokset kontrolloiduissa, happamissa olosuh-30 teissä.

Tällaisia kontrolloituja happamia olosuhteita edustavat mineraalihapon tai orgaanisen, vahvan hapon konsentroitu ...· vesipitoinen liuos mahdollisesti aproottisen, orgaanisen 50 86 307 liuottimen läsnäollessa. Edullisia esimerkkejä vahvoista mineraalihapoista ovat rikki- ja fosfori happo.

Edullinen, vahva, orgaaninen happo on trif1uorietikka-happo.

5 Edullisia, aproottisia, orgaanisia liuottimia ovat ali- sykliset tai sykliset ai kyy1ieetterit, kuten dioksaani ja tetrahydrofura a ni , a 1 empi a 1 kyy1isu 1 foksidit, kuten di-metyylisulfoksidi ja ai empi ai kyy!iamidit, kuten di metyy-1i formami di.

10 Rea ktio 1ämpöti1 a pidetään tavallisesti 0 C:n ja reaktio-seoksen palautuslämpöti1 an välillä. Monissa tapauksissa se on välillä 15°C - 75°C, edullisen lämpötilan ollessa 20°C - 55°C ja kaikkein mieluimmin se on huoneen lämpötila.

15 Reaktioaika vaihtelee riippuen spesifisistä reaktiopara- metreistä ja koska reaktion etenemistä voidaan seurata TLC- tai HPLC-tekniikalla, alan ammattimies pystyy seuraamaan reaktion kulkua ja pystyy päättämään milloin reaktion voidaan katsoa tapahtuneen kokonaan.

.· 20 Tämän menetelmän edullisessa suoritusmuodossa antibiootin A 40926 kompleksin tai sen puhtaan tekijän kontrolloidulla hydrolyysi1lä saadaan antibiootti A 40926 mannosyyli-ag1 ykoni vesipitoisen 80-95-prosenttisen trifluorietikka-hapon läsnäollessa huoneen lämpötilassa.

25 Tämän menetelmän eräässä toisessa suoritusmuodossa anti biootti A 40926 mannosyyli-aglykonin kontrolloitu hydrolyysi suoritetaan vesipitoisen 1-2 N rikkihapon ja diok-saanin seoksen 2:1 - 1:2 läsnäollessa.

Raa1 an antibiootti A 40926 mannosyyli-aglykonin, joka ote- 30 taan talteen hydrolyysivaiheen lopussa, puhdistaminen voi daan suorittaa sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti,

II

51 86307 kuten seostamalla siten, että lisätään ei-1iuottimia, uuttamalla liuottimilla ja kromatografisesti

Edullisissa kromatografiamenetelmissä käytetään pylväs-kromatogra fiaa ja kaikkein edullisin kromatografiamene-5 tel mä on k äänteisfaasi-kolonni kromatograf ia.

Sopivassa käänteisfaasi-nestekromatografiässä käytetään ruostumattomia teräskolonneja kohtuullisessa paineessa (5-50 baaria) tai korkeapaineessa (100-200 baaria). Kiinteä faasi voi olla silanoitu piihappogeeli yhdessä hiili— 10 vetyfaas i n kanssa, joka muodostuu (2-18) hiiliatomeista (kaikkein mieluimmin C 18), tai yhdessä fenyyliryhmän kanssa, ja eluentti on polaarisen, veteen sekoittuvan liuottimen ja vesipitoisen puskurin seos, jonka pH on yhteensopiva hartsin kanssa (mieluimmin pH 3-8).

15 Tyypillisiä esimerkkejä polaarisista, veteen sekoittuvista liuottimista ovat vesiliukoiset alkoholit (kuten me-tanoli, etanoli, iso-propanol i, n-butanoli), asetoni, asetonitrii1i , alempia!kyyliai kanoaa tit (kuten etyyliasetaatti), tetrahydrofuraani, dioksaani ja dimetyyli-20 formamidi ja näiden seokset; edullinen polaarinen, ve-

Teen sekoittuva liuotin on aseton i tr i i 1 i .

Eluo i du i s ta fraktioista testataan niiden antibiootti pitoisuus käyttäen tavanomaisia kasvukokeita , kuten paperi-kiekko- tai agardiffuusiokokeita, herkillä mikro-orga-^ nismeilla. Esimerkkejä herkistä mikro-organismeista ovat kannat Bacillus subtil is ja S.aureus.

Puhdistamista kuten myös reaktiota seurataan tavallisesti TLC- tai HPLC-menetelmi 11ä.

Edullisessa HPLC-menetelmässä käytetään käänteisfaasi-^ HPLCrtä ja siinä silanoidun piihappogeelin, joka on funktionaliso itu C-18-alkyyliryhmillä, huokoisten ja pallomaisten hiukkasten, joiden halkaisija on mieluimmin 52 86307 5 mikrometriä, muodostamaa kolonnia (kuten 5 pm Ultra-sphere ® ODS Altex; Beckman & Co.), esikolonnia, joka on piihappogeeli funktiona!isoituna C-18-alkyyliryhmil-lä (kuten RP 18, Brownlee Labs.), ja eluenttia, joka on 5 polaarisen, veteen sekoittuvan liuottimen, kuten jonkin jäljempänä mainitun liuottimen, lineaarinen gradientti vesipitoisessa, puskuroidussa liuottimessa.

Mieluimmin tämän liuoksen pH säädetään arvoon 5 - 7. Kaikkein edullisin eluentti on eluentin B lineaarinen 10 gradientti 5 %:sta 60 %:i i n eluentissa A, jolloin eluentti A on aseton i tri i1i n ja vesipitoisen puskurin, pH 5-7, 10:90-seos, ja eluentti B on asetoni trii1in ja vesipitoisen puskurin, pH 5-7, 70:30-seos. Kuten on alalla tunnettua, sisäisenä standardina voidaan käyttää monia aineita. 15 Erityisen edullinen tässä tapauksessa on antibiootti L 17054, jonka retentioaika on lähellä keksinnön mukaisten yhdisteiden retentioaikoja tässä HPLC-systeemissä . Tämä standardiyhdiste on tunnettu ja se on kuvattu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa, jonka julkaisunu-20 mero on 0 1 1 9575 .

Keksinnön mukaisten yhdisteiden anti bakteerinen aktiivisuus voidaan todeta in vitro käyttäen standardilaimen-nostestejä eri mikro-organismiviljelmillä.

li 53 86307 miBimiN A 40926 TEKIJÄN A FVSIKOKEHIAUISET TUNNUS- ul*rav1o1et^äbsorptiospektr1ssä. Joka on esitetty 5 raavaTnK Pl1rUStUSten kuviossa 11, esiintyy seu- » raavat absorptiomaksimit; λ maks (nm) a) 0,1 N HC1 28j b) fosfaattipuskuri pH 7,38 281 300 (olka) 10 c) °»1 N natrium- ta1 kallum- hydroks id i 300 d) metanol1 2Q2 e) fosfaattipuskuri pH 9,0 282 300 (olka) '5 tin* '"f7U"I;al>50,,'’t1°sP‘il‘tr1ssS, joka,on esitetty I11t-teenk o evien perustusten kuviossa 12, on seuraavat absorp- tiomaks1mit (cm '): μ 3700-3100, 3100-2000 (nujoll); 1655 5 1620-1560; 1510· 20 nn°',4'° (nUj°,1)i 1375 ("PJP’Dl 1320-12501 1260-1 190 ; 20 1100-9501 845; 810; 720 (nujolt).

c) 'H-NMR-spektnssä. joka on kuviossa 13,esiintyy seu-™**St slgnaallryhmät (ppmissS) rekisteröitynä 270 MHz OMSO d6;ssa (heksadeuterodimetyylisulfoksldi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm)(&- ppm): 1 25 ίίΓ!,Ρ,?*η· 6Hh 1>21 (2HJ, 2,01 (2H); , 2.31- .34 (3H)t 4-6,2 C~,6H) ; 6,2-8 (~23H); 8,44, 9,22, 9.66 (leveät juovat; liikkuvat protonit) 2,5-4; häiriö H p 0-p i i k e 1 s t ä.

54 86307 D) retentloalka (Rt) 1,12 verrattuna telkoplani 1n1n A2 komponenttiin 2 (Rt - 20,3 min), analysoitaessa kääntels-faasi-HPLC;118 seuraavlssa oloissa: l kolonnl: Ultrasphere ODS (5 ^m) Altex (Beckman) 5 4,6 mm (s1sähalkais 1ja) x 250 mm eslkolonnl: Brownlee Labs RP 18 (5 /jm) eluenttl A: CH3CN 10%Ί säädetty pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J -arvoon 6,0 eluenttl B; CH3CN 70%j säädetty pH- 10 (2,5 g/1) NäH2P04,H20 30%) -arvoon 6,0 eluolntl: lineaarinen gradlenttl, jossa 5 prosentista 60 prosenttiin eluenttl B eluentissa A, 40 minuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/m1n 15 UV-detektor1: 254 nm sisäinen standardi; telkoplan 11 n 1 n A2 komponentti 2 (Gruppo Lepetlt S.p.A.) ,

Samoissa oloissa retentloalka verrattuna testosteroniin (Roussel Uclaf) on 0,60, 20 E) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on ensin kuivattu noin 140°C; s sa 1nertt1 atmosfääri ssä (Aw 4,6%), antaa tulokseksi seuraavan likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 55,82 %\ vetyä 5,17 %i typpeä 6,31 %; klooria (ko-25 konais) 4,24 %; klooria (Ioneja) 0,37 %. Epäorgaaninen jäännös 900°C:ssa 11 massa: 1,2 %, I: 55 86307 F) happo-emäs-t1trausprof1111 2-metoksietanol 1 (MCS): vesiseoksessa, 4:1, K0H:lla titraamlsen jälkeen, kun on lisätty-ylimäärin HCliää, osoittaa neljä ionisoituvaa 5 ίΤΓ?2 J°n,a °n seuraam PhMCS-arvot: 4,6; 5.6; G) Rf-arvo on 0,24 Ja R^-arvo suhteessa teikoplaniinin A2 komponenttiin 2 on 0,70 seuraavassa kromatografiasys- teemissä: 5 % (paino/til.) vesipitoista Na?S0. 70 i0 asetonltrin 1ä 4 30 käytetään silanoituja pllhappogeel1-60 F25. Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo 15 - keltainen väri Pauly-reagenssilla, t.s. diatsotoldulla sul fanll i inihapolla (J. Chromatog. 2J), 171 ( 1 965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) - blöautograf1assa käytetään B.subtllis 'ATCC 6633 Davisin mlnlmlalustal1 a.

20 H) molekyyli paino noin 1716 arvioitu FAB-MS-spektristä, jossa M+H & -piikki 1717.

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN B FYSIKOKEMIALLISET TUNNUSMERKIT

A) ultraviolettiabsorptlospektrissä, joka on esitetty 25 liitteenä olevien piirustusten kuviossa 14, esiintyy seu-raavat absorptiomaksimlt: 56 86307 s X maks (nm) ___ - - - - -- ----- ------ - - * ..... · - 11 11,1 a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri pH 7,38 281 300 (olka) . 5 c) 0,1 N natrium- tai kalium- hydroksidi 300 d) fosfaattipuskuri pH 9*0 283 300 (olka) e) metanoli 282 10 B) infrapuna-absorptiospektrissä, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 15, on seuraavat absorp-tiomaksimit (cm ^): 3700-3080, 3080-2700 (nujoli); 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1295; 1230; 1210; 1150; 15 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujoli).

C) 1H-NMR-spektrissä, joka on esitetty kuviossa 16, esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) rekisteröitäessä, ^ H-NMR-spektri 270 MHz DMS0 dg;ssa (heksadeuterodimetyyl1-sulfoksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm), 20 (S “ ppm): S 0,8 5 (d, isopropyylln CH g : t) ; 1,15 (/v13H); 1,44 (rv2H); 2,02 (2H) ; 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 (rj16H); 6,1-8 (<\;23H); 8,52, 9,30, 9,68 (leveät juovat; liikkuvat protonit) 2,5-4 häiriö HgO-piikeistä .

25 D) retentloajat (R^.) 1 #22 ja 1,27 verrattuna teikopla-n i i n 1 n A2 komponenttiin 2 (R^. » 20,3 min), analysoitaessa käänteisfaasi-HPLCsllä seuraavissa oloissa; li » 57 86307 i kolooni: Ultrasphere ODS (5 /jm) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisä hai kaisi ja) x 250 mm e s i k o 1 o n n i: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluentti A: CH3CN 10%Ί säädetty pH- ^ (2,5 g/1) NaHgPO^.HgO 90%J -arvoon 6,0 eluentti Bj CH3CN 70¾] säädetty pH- (2|5 g/1) NaH^PO^.H^O 30%J -arvoon 6,0 eluolntii lineaarinen gradienttl eluenttia B 5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 mi-nuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniinin A,, komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A,) 15 . aikuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on ensin kuivattu noin 14 0 °C:s s a inerttiatmosfäärissä (Λ w 9,6%), antaa seuraavan likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 54,09 %; vetyä 5,13 %; typpeä 6,34 %, klooria (ko-20 konais) 4,12 %; klooria (ioneja) 0,39 %. Epäorgaaninen jäännös 900°C:s-sa ilmassa: 5 %, F) happo-emäs-titrausprofi i 1 i 2-metoksietanoli (MCS): vesi-seoksessa,4:1, ΚΌΗ s 1 la titraamisen jälkeen, kun on lisätty ylimäärin HCl:ää (pH 2,7), osoittaa neljää ionisoituvaa 25 funktiota, joilla on seuraavat pkMr<.-arvot: 4,5; 5,6; 7,2 ja 9,2, 1 58 86307 G) R^.-arvo 0,21 ja R^.-arvo suhteessa teikoplani in 1 n A2 komponenttiin 2 on 0*53, seuraavassa kromatografiasys-teemi ssä: 5 % (paino/til.) vesipitoista Na2S0^ 70 5,asetonitriiliä 30 käytetään silanoituja piihappogeeli-60 Ρ2^ Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo 10 - keltainen väri Pauly-reagenssi11 a , t.s, diatsotoidul1 a sulfani! i inihapolla (J, Chromatog. 2_0 , 1 71 ( 1965), Z. Physiol. Chem. 292., 99 ( 1 953)) - bioautografiässä käytetään B.subtilis ATCC 6633 Davisin mlnimialustalla.

15 H) molekyylipaino noin 1730 pääteltynä FAB-MS-spektris-tä, jossa M+H®-piikki 1731.

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN BQ FYSIKOKEMIALL IS ET TUNNUSMERKIT

A) ·uitravlolettiabsorptlospektrissä, joka on esitetty 20 liitteenä olevien piirustusten kuviossa 14, esiintyy seu-raavat absorptiomaksimit: X maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri pH 7,38 281 25 300 (olka) c) 0,1 N natrium- tai kalium- hydroksidi 300 l! 59 86307 d) fosfaattipuskuri pH 9,0 283 300 (olka) e) metanol1 282 B) 1nfrapuna-absorpt1ospekirissä, joka on esitetty Uit- 5 teenä olevien piirustusten kuviossa 15,on seuraavat absorp-tlomaksimit (cm" ): 3700-3080, 3080-2700 (nujoll); 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujoll); 1375 (nujoll); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujoll), 10. C) 1H-NMR-spektr1ssä, joka on esitetty kuviossa 16, esiintyy seuraavat slgnaalIryhmät (ppm:ssä) rekisteröitäessä H-NMR-spektr1 270 MHz, DMSO dgjssa (heksadeuterodImetyyl1 -sulfoksldl), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm), • ( β a ppm): 15 So,85 (d, 1 sopropyyl 1 n CH3:t); 1,15 (<%>13H); 1,44 (rxJ 2H) * 2*02 (2H); 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 (*\>16H); 6,1-8 (ru 23H) ; 8,52, 9,30, 9,68 (leveät juovat; liikkuvat protonit) 2,5-4 häiriö Hg0-p11ke1stif.

^ ^ retentloalka (R^.) 1,22 verrattuna telkoplanl 1n1n A~ komponettUn 2 (R^ * 20,3 min), analysoitaessa käänteis-faas1-HPLC:llä seuraavlssa oloissa: koi onni: Ultrasphere ODS (5 μη) Altex (Beckman) 4,6 mm (slsähalkaisi ja) x 250 mm 25 eslkolonnl: Brownlee Labs RP 18 (5 /jm) eluenttl A: CH3CN ' ! 10 «Vsäädetty pH-’ (2,5 g/1) NaH2P04.H2Ö 90 *J, -arvoon 6,0 ·”: , . eluenttl B: ·CHgCN 70 *V säädetty pH- M (2,5 g/1) N«H2P04.H20 30 *J -arvoon 6,0 60 86307 eluointii lineaarinen gradientti, jossa eluenttia B 5 • prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, ' 40 minuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/rnin 5 UV-detektori s 254 nm sisäinen standardi: telkoplaniinin A,, komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on ensin kuivattu noin 140°C: s sa i nertti kaasuatmosfääri ssä (Aw 9,6¾). 10 antaa tulokseksi seuraavan, likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 54,09 %; vetyä 5,13 %; typpeä 6,34 klooria (kokonais) 4,12 %\ klooria (ioneja) 0,39 %. Epäorgaaninen jäännös 900°C:ssa ilmassa: 5 %.

15 F) happo-emäs-titrausprofii1i 2 metoksietanoli (MCS): vesi-seoksessa, 4:1, KOH:11 a titrauksen jälkeen, kun on lisätty ylimäärin H C1:ä ä , osoittaa neljä ionisoituvaa funktiota, joilla on seuraavat pkMCS*arvot 4,5; 5,6; 7,2 ja 9,2.

G) R^-arvo 0,21 ja R^-arvo suhteessa teikoplaniinin Ag 20 komponenttiin 2 on 0,53 seuraavassa kromatografiasystee-missä: 5 ¾ (paino/til.) vesipitoista NagSO^ 70 asetoni trii1iä 3° käytetään silanoituja piihappogeel1-60 F254Merdk-levyjä 25 (kerroksen paksuus 0,25 ηιιη) näkyväksi tekeminen: l· (,ι 86 307 : - UV-valo - keltainen väri Pauly-reagenssi11 a , t.s. diatsotoidul1 a sulfaniliinihapolla (J, Chromatog. £0, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 2^2, 99 (1953))

5 - bioautografiässä käytetään kantaa B.subtil is ATCC

6633 Davisin minimialustalla.

H) molekyylipaino noin 1730 arvioituna FAB-MS-spekt-ristä, jossa M+H ® -piikki 1731.

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PA FYSIKOKEMIALLISET TUNNUS-10 MERKIT

A) ultraviolettlabsorptlospektrissä, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 17, esiintyy seu-raavat absorptiomaksimitj maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) 0,1 N kaiiumhydroksldi 300 c) fosfaattipuskuri pH 7,38 ' 282 300 (oi ka) d) fosfaattipuskuri pH 9,0 283 20 300 (olka) B) infrapuna-absorptiospektrissä, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 18, esiintyy seuraavat absorptiomaksimit (cm”^): 3700-31 00 ; 3000-2800 (nujol1); 1760-1710; ,1655; 1620-1 550 ; 25 1 505 ; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1260 , 1250-950 ; 845 ; 805 ; 720 (nujoli).

. v . · ' ' . i · 62 86307 C) 1H-NMR-spektrissä, joka on esitetty kuviossa 19, esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) rekisteröitäessä 1H - NM R spektri 270 MHz DMSO dgissa (heksadeutero-dimetyyli sulfoksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm), 5 ( b » ppm): 0,86, d s t (CH3); 1,15-1,22, m (C H 2)n i 1,41, m (CHg); 2,01, s (C H 3) ; 2,01, m (CH2); 2,28, s'(N-CHg) ; 4,26-5,96 , br (peptidiset ja aromaattiset C H: t); 6,33-7,73 br (aromaattiset CH:t ja peptidiset NHst).

10 br “1eveä d a dubletti dd a doubletin dubletti m = multi pletti s esingletti 15 t = tri pietti D) retentioaika (R't) 1,15 verrattuna te i kopl an i i ni n A£ komponenttiin 2 (R^. ** 20,3 min) analysoitaessa käänteis-faas1-HPLC:llä seuraavissa oloissa: kolonni! Ultrasphere ODS (5 ^m) Altex (Beckman) ,20 4,6 mm (s 1 sähal kais 1 ja) x 250 mm esikolonni! Brownlee Labs RP 18 (5 ym) eluenttl A! , CH3CN 10jO säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J -arvoon 6,0 eluentti B: CH3CN 70% ^ säädettynä pH- 25 (2,5 g/1) NaH2P04<H20 30%] -arvoon 6,0

eluointi: lineaarinen gradientti, jossa eluenttla B

5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 minuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm I: 63 86307 sisäinen standardi! teikoplaniinin Ag komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) Rf-arvo verrattuna' teikoplani1n1n A? komponenttiin 2 on 0,62 seuraavassa kromatografiasysteemissä: 5 5 % (pa 1 no/tiΊ.) vesipitoista Na2S04 70 asetoni trii1iä 30 käytetään silanoltuja piihappogeeli-60 F254Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi te kerni nen ί 10 - U V - v a 1 o keltainen väri Pauly-reagenssi11 a, t.s4 diatsotoidulla sulfanili1nihapol1 a (J. Chromatog. ^0 , 1 71 ( 1 965), Z. Physiol. Chem. £92, 99 (1953)) - bioautografiässä käytetään kantaa B.subtil is ATCC 6633 15 Davisin mi nimialusta 11 a , F) molekyylipaino 1 758 arvioituna FAB-MS-spektristä, jossa esiintyy piik k 1ryhmlttymä, jonka intensiivisin piik-ki ,pn 1761, FAB-MS-analyysin operatiiviset olosuhteet oi Ivat seuraavat: laite! VG Mod ZAB SE varustettuna FAB ruiskutus- ioni tekni i kali a olosuhteet! positiivinen FAB, Xe kiihdytysjännite 8 kV , ma triisiί11og1yse ro 1i-g 1yse ro 1i 1/1 (til,/til,) ‘ 64 86 307

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PB FYSIKOKEMIALLISET TUNNUSMERKIT

A) uitraviolettiabsorptiospektrissä, joka on.esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 20, esiintyy seu- 5 raavat absorptiomaksimit: X maks (nm) a) 0,1 N HC1 ' 282 b) 0,1 N kaiiumhydroksldi 300 c) fosfaattipuskuri pH 7,38 282 10 300 (olka) d) fosfaattipuskuri pH 9,0 282 300 (olka) B) infrapuna-absorptiospektrissä , joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa -21, esiintyy seuraa- 15 vat absorptiomaksimit (cm ^): 3700-3100, 3000-2800 (nujoli); 1760-1710; 1655; 1620-1560; 1605; 1480-1420 (nujoli); 1375 (nujoli); 1320- -1270; 1230-1190; 1150,1120-920; 845; 810; 720 (nujoli) C.1) 1H-NMR-spektrissä, joka on esitetty kuviossa 22, 20 esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) 270 MHz DMSO dgissa (heksadeuterodimetyylisu 1 foksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm), (S» ppm) multipl isiteetti ; (ominaisuus): 0,84, d (isopropyyli C H ^: t); 1,17, m (^ H g)n i 1.43, m (CHg), 25 1,99, s (CH3); 2,01, m (CH2); 2,31, s (N-CH3); 2,79, dd (C-H); 3,70, m (C-H); 4,06-6,02 , br (pepti di set ja aromaattiset CH : t) ; 6,45-7,74 , br (aromaattiset CH:t ja peptidi -set NH:t); 8,19-9,99, br (peptidiset NH: t ja fenoliset OH:t) li f 65 8 6 3 O 7 , C.2) H-NMR-spektri ssä, joka on esitetty kuviossa 23, esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) 270 MHz, spektri rekisteröity seoksessa DMSO dg + CFgCOOD, sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm)(&. ppm) multiplisi-5 teetti; (ominaisuus)» 0,84, d (isopropyylin CH3»t); 1,13, m (CH ) ; 1,40, m (CHj; 1.98, s (CH3)j 2,00, m (CH2); 2,92, dd (C-H); 3,29-3,71, m (sokerin C-H:t); 4,07-6,09, s ja m (peptidiset ja aromaattiset CH;t)s 6,45-7,83, s ja m (aromaattiset CH:t ja 10 peptidiset NHtt)j 8,17-10,38 (peptidiset N H:t, fenoliset OH: t) 0) retentloajat (Rt)-1.27 ja 1.32 verrattuna telko-planiinin A2 komponenttiin 2 (Rt « 20,3 min), analysoitaessa käänteisfaasi-HPLC:llä seuraavissa oloissa» 15 koi onni: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkai sija) x 250 mm esikolonrH» Brownlee Labs RP 18 (5 jjm) eluentti A» CH3CN . 10%Ί säädettynä pH- (2»5 g/1) NaHgPO^.HgO 90S!j -arvoon 6,0 20 eluentti B: CH3CN 70*'Ί säädettynä pH- (2,5 g/1) NaHgPO^.HgO 30%J -arvoon 6,0

eluolnti: lineaarinen gfadientti, jossa eluenttia B

5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 minuuttia 25 virtausnopeus» 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi» teikoplaniinin A2 komponentti 2 ·' (Gruppo Lepetit* S*p.A.) 66 86 307 I ί E) R^-arvo verrattuna teikoplani 1 nin A2 komponenttiin 2 on 0,53 seuraavassa kromatograf1asysteem1ssä: 4 5 % (pa1no/t11 .) vesipitoista Na2S04 70 asetoni trii1iä ^0 5 käytetään sllanoituja pUhappogeel1-60 F254 Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo - keltainen väri Pauly-reagenss1l1ä, t,s, diatsotoldulla 10 sulfani!11n1hapolla (J, Chromatog, 2£» 171, (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) - bioautografiässä käytetään kantaa B,subtills ATCC 6633

Davisin mi nimi aiustal1 a F) molekyyl1pai no noin 1 772 arvioituna FAB-MS-spektr1s-15 tä, jossa piikkiryhmä, jonka Intensiivisin pilkki 1776.

FAB-MS-analyysin operatiiviset olosuhteet olivat seuraavat: laite: VG Mod ZAB SE varustettuna FAB ruiskutus- ioni tekni ikal la olosuhteet: positiivinen FAB, Xe k1ihdytysjännlte 8 kV matriisi: tioglyserol1-glyserol1 1/1 (tn ,/tn.) 1 · c l · ' * ‘ ;. .

. . _ . 1 » \ li 67 86307 ANTIBIOOTTISELLA A 40926 MANNOSYYLI-AGLYKONILLA ON SEU-RAAVAT TUNNUSMERKIT: A) ultraviolettiabsorptiospektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 24, jossa on 5 seuraavat absorptiomaksimit: A maks (nm) a) 0,1 N HC1 280 b) fosfaattipuskuri, pH 7,38 280 300 (olka) 10 c) 0,1 N natriumhydroksidi 298 d) fosfaattipuskuri, pH 9,0 282 300 (olka) B) infrapuna-absorptiospektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 25, jossa on seuraa- 15 vat absorptiospektri: 3700-3100; 3000-2800 (nujoli); 1655; 1620-1540; 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1350-1250; 1210; 1150; 1020; 970; 850; 810 C) H-NMR-spektri, joka on esitetty kuviossa 26, jossa : 2^ on seuraavat signaa 1 iryhmät (ppm:ssä), spektri rekiste-

röity 270 MHzrllä DMSO dg:ssa (heksadeuterodimetyylisu 1 -| · foksidi) plus CFgCOOHrssa, sisäisenä standardina TMS

" (0,00 ppm) ( S = ppm) : :Y: 2,51, s(DMSOdg); 2,50, s (NCH3); 2,88, m (Z2); 3,30, m 25 (z *2)ϊ 4»°8. m (X6); 4,44, d (X5); 4,49, d (X7); 4,83, m (X 2) ; 5»02, s (4F); 5,08, s (Z6); 5,31, s (mannoosin ano-meerinen protoni); 5,53, d (X4); 5,78, s (4B); 6,08, d :·. (X3); 7,70, s (6B); 6 ,44-8,52 (aromaattiset ja peptidi- !* set NH: t) 30 d = dubletti; m = multipletti; s = singletti 68 8 6 3 0 7 D) retentioaika (R^) 1,18 verrattuna antibioottiin L 17054 (TA3-1) (R^ = 8*78 min), analysoitaessa käänteistä asi-HPLC:llä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 jjm) Altex (Beckman) 5 4,6 mm (sisahalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluentti A: CH3CN 10¾) säädettynä (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J pH-arvoon 6,0 eluentti B: CH^CN 70%^ säädettynä 10 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%j pH-arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 ^sta 60 %: i i n eluent-tia B eluentissa A, 40 minuutissa virtausnopeus: 1,6 ml/min UV-detektori: 254 nm 20 sisäinen standardi: antibiootti L 17054 (TA3-1) (Gruppo Lepetlt S.p.A.) E) Rf-arvo 0,39 seuraavassa kromatografisessa systeemissä: 1 M NaCl , joka sisältää 5 g/1

NaH2P04.H20:ta 70 25 asetonitriiliä 30 pH säädetty arvoon 6, käytetään silanoituja piihappogeeli 60 F254 Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo 30 - keltainen väri Pauly-reagenssilla, t. s, diatsotoi- dulla sul fani 1 i inihapoll a (J. Chromatog. 2J3, 171 (1965), Z. Physiol.Chem. 292, 99, (1953)) - bioautografiässä, käyttäen kantaa B.subtilis ATCC 6633 Davisin min imi kasvualustalla 35 F) nopealla atomipommitus (FAB) massaspektrillä M+H®on noin 1374.

li 69 86307

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä.

ESIMERKKI 1

5 ANTIBIOOTTISEN A 40926 N-ASYYLIAMINOGLUKURONYYLI-AGLYKONI KOMPLEKSI AB:n JA ANTIBIOOTTISEN A 40926 AGLYKONIN VALMISTUS

a) Antibioottinen A 40926 kompleksi AB (joka valmistetaan pääasiallisesti valmistusesimerkin 3 mukaisesti) 10 ^750 m9) liuotetaan 150 ml:aan dimetyylisulfoksidin (DMSO) ja 37-prosenttisen (paino/paino) kloorivetyhapon (HC1) seosta, 9:1 (til./til.), ja reaktioseos kuumennettan noin 65°C:seen.

Reaktion etenemistä seurataan HPLCrllä ja kun lähtöaineet 15 ovat täydellisesti reagoinneet (noin 5 tunnin kuluttua), reaktio sammutetaan kylmällä vedellä (600 ml) ja muodostuneen seoksen pH säädetään arvoon noin 7,5.

Tämä seos sisältää otsikossa mainittuje n yhdisteiden seok-sen* J°ka erotetaan sen kahdeksi pääkomponentiksi affini-2^ teettikromatografisesti seuraavan menetelmän mukaisesti:

b) Edellä saatu, vesipitoinen seos (750 ml) laitetaan Sepha rose-D-ala nyyli-D-alaniini-kromatografia pylvääseen, joka valmistetaan kuten valmistusesimerkissä 8 esitetään (100 ml turvotettua hartsia 10 mM:ssa tris.HC1-puskurissa, 25 pH 7’5* täytteen korkeus 10 cm). 0,05 M NH40H.HCl:a, pH

7,5, joka sisältää 2 M NaCl:a, (200 ml)(puskuri B) valu-:·. tetaan läpi pylväästä; sen jälkeen A 40926 aglykoni pois tetaan selektiivisesti pylväästä eluoimalla 0,05 M NH^OH.HClrllä, pH 9,5, joka sisältää 2 M NaCl:a, (1500 ml) (puskuri C). N-asyyl iaminoglukuronyyl i-aglykoni kompleksi AB eluoidaan sen jälkeen 0,1 M vesipitoisella ammoniakil-la (puskuri D).

70 86307

Sen jälkeen eluoidut fraktiot yhdistetään niiden antibioottisen sisällön mukaan, pH säädetään arvoon noin 7,5 ja jokainen, antibiootin sisältävä liuos kromatografoi-daan Sepharose-D-alanyyli-D-alaniini-pylväässä (100 ml 5 turvotettua hartsia 10 mM:ssa tris.HC1-puskurissa, pH

7,5; täytteen korkeus 10 cm). Tislattua vettä valutetaan pylvään läpi, kunnes epäorgaaniset suolat ovat huuhtoutuneet pois. Sen jälkeen antibiootit eluoidaan 0,1 N vesipitoisella ammoniakilla. Nämä eluoidut fraktiot, jotka 10 yhdistetään niiden antibioottisen sisällön mukaan, kon sentroidaan pieneen tilavuuteen alennetussa paineessa, tislaamalla atseotrooppisesti n-butanolin kanssa ja lyo-filisoidaan, jolloin saadaan vastaavasti 201 mg N-asyyli-aminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB:tä ja 236 mg 15 A 40926 aglykonia.

Toistamalla sama menetelmä kuin edellä on esitetty, mutta käyttämällä DMS0/37-prosenttista HCL-seosta 95:5, noin 40°C:ssa, noin 5 päivän ajan, saadaan N-asyyliaminogluku-ronyy1i-aglykoni kompleksi AB:n saanto nousemaan noin 15 % 20 samalla kun A 40926 aglykonin saanto pienenee.

Toistamalla nämä menetelmät ja lähtemällä antibioottisesta A 40926 kompleksista, antibioottisesta A 40926 tekijä A:sta, antibioottisesta A 40926 tekijä B:stä, antibiootti-: sesta A 40926 tekijä BQ:sta, antibioottisesta A 40926 te- 25 kijä PArsta ja antibioottisesta A 40926 tekijä PB:stä saa daan pääasiallisesti samat tulokset (t.s. saannot vaihte-1 evät rajan ollessa +_ 5 %).

Erityisesti lähdettäessä antibioottisesta A 40926 tekijä A: sta tai tekijä PArsta tuote, joka saadaan on antibioot-30 tinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä A, kun taas lähdettäessä antibioottisesta A 40926 tekijä PBrstä tai tekijä BQ:sta, saatu tuote on antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä Bq. Antibioottisesta A 40926 tekijä B:stä saadaan antibioottisten l! 71 86307 A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyl1-aglykon1 tekijöiden B. ja seos, joka voidaan erottaa HPLC:11S.

ESIMERKKI 2

ANTIBIOOTTISTEN A 40926 N-ASYYLIAMINOGLUKURONYYLI-AGLYKONI 5 TEKIJÖIDEN A, BQ ja B1 EROTTAMINEN

20 mg antibioottista A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB:tä liuotetaan 1 ml:aan 18 mM natrium-fosfaattipuskuria, pH 6, joka sisältää 10 % asetonitrii1iä. Liuos injektoitiin preparatiiviseen HPLC-kolonniin (7 mm 10 sisähalkaisi ja x 250 mm) Lichrosorb RP18 si1 a noitu pii- happogeeli (Merck Co.), jonka hiukkaskoko oli 7 mikromet-r i ä.

Koi°nni eluoitiin virtausnopeuden ollessa 5 ml/min faasilla A ja B, käyttäen faasin A lineaarista gradienttia 15 10 %:s ta 55 %: i i n .

Faasi A: 18 mM natriumfosfaatti/CH3CN 30/70 pH säädetty NaOH:lla arvoon 6,0

Faasi B: 18 mM natriumfosfaatti/CH3CN 90/10 / pH säädetty N a 0 H : 11 a arvoon 6,0 20 Koi onniel uaatti en UV-adsorptio 254 n m: 11 ä mitataan ja . eluointifraktiot, joilla on samanlaiset sisällöt, yhdis- tetään, erotetaan kolme el uaatti ryhmää, jotka sisältävät vastaavasti antibiootiset A 40926 N-asyyliaminoglukuronyy-1i-aglykoni tekijät A, BQ ja B^ .

25 Eluaatit, jotka sisältävät 11 peräkkäisellä kromatogra-: fia-ajolla saadut, puhdistetut, antibioottiset A 40926 :Y: N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijät, yhdistetään

Ja n1istä poistetaan suola tavanomaiseen tapaan, siirtämäl-... lä ne pylvääseen, jossa on 5 ml turvotettua Sepharose-D-

30 Ala-D-Ala-hartsia (katso valmistusesimerkki 8). Sen jäl-v : keen kun suolat on poistettu eluoimalla 10 ml :11a 1 mM

HCl.ää ja 5 x 10 ml : 1 1 ' · s 1 a T t u a vettä, eluoidaan anti- 72 86307 biootti 5 x 10 ml:lla t-prosenttista paino/til. vesipitoista ammoniakkia. Sen jälkeen ammoniakkieluaatit kerätään erikseen ja jäädytyskuivataan, jolloin saadaan 15 mg antibioottista A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-5 aglykoni tekijä A:ta, 51 mg antibioottista A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä B q : t a ja 3 mg antibioottista A 40926 N-asyyliaminoglukuronyy1i-aglykoni tekijä B^:tä, joiden fysiko-kemial1iset arvot ja kemialliset kaavat on esitetty selityksessä edellä.

10 ESIMERKKI 3

ANTIBIOOTTISEN A 40926 AGLYK0NIN SELEKTIIVINEN VALMISTUS

a) Antibioottisesta A 40926 kompleksi AB:stä

Antibioottinen A 40926 kompleksi (valmistetaan olennaisesti kuten vai mitusesimerkissä 3 on esitetty) ( 750 mg) 15 liuotetaan 150 ml:aan dimetyy1isu 1 fok sidin ja 37-prosent- tisen kloorivetyhapon seosta, 9:1 (til./til.) ja reaktio-seos kuumennetaan noin 80°C:seen. Reaktion kulkua seurataan HPLC:llä ja kun lähtöaineet ovat reagoineet koko-: naan (noin 3 tunnin kuluttua), reaktio sammutetaan kyl- 20 maila* vedellä (600 ml) ja muodostuneen seoksen pH säädetään arvoon noin 7,5.

Tämä seos (750 ml) sisältää antibioottisen A 40926 agly-konin, joka erotetaan affiniteettikromatografisesti Sepha-rose-D-alanyyli-D-alaniini-kromatografiapylväässä , joka 25 valmistetaan kuten valmistusesimerkissä 8 on kuvattu (100 ml turvotettua hartsia 10 mM:ssa tris.HCl:ssa, pH 7,5; täytteen korkeus 10 cm).

0,05 M NH40H.HC1:a . pH 7,5, joka sisältää 2 M NaCl:a.

( 200 mlMpuskuri B) valutetaan pylvään läpi; sen jälkeen ·: 30 A 40926 aglykoni poistetaan pylväästä selektiivisesti eluoi- malla 0,05 M NH40H. HC1 :11 a, pH 9,5, joka sisältää 2 M NaCl : a, ( 1 500 mlMpuskuri C). Sitten eluoidut fraktiot li 73 86307 yhdistetään niiden antibioottisen sisällön mukaan, pH säädetään arvoon noin 7,5 ja ne kromatografoiddan

Sepharose-D-alanyyli-D-alaniini-pylväässä (100 ml turvotettua hartsia 10 mMrssa tris.HC1:ssä, pH 7,5; täytteen 5 korkeus 10 cm). Tislattua vettä valutetaan pylvään läpi, kunnes epäorgaaniset suolat ovat huuhtoutuneet pois.

A 40926 aglykoni eluoidaan 0,1 N vesipitoisella ammoniakilla. Nämä eluaatit konsentroidaan pieneen tilavuuteen alennetussa paineessa tislaamalla atseotrooppisesti n-bu-10 tanolin kanssa ja 1yofi1isoidaan , jolloin saadaan 530 mg A 40926 aglykonia.

74 86307 . LÄHTÖAINEIDEN VALMISTUSESIMERKIT:

VALMISTUSESIMERKKI 1: KANNAN ACTINOMADURA sp. ATCC 39727 KÄYMINEN

Antibioottia A 40926 tuottavan kannan (Act1nomadura sp. ATCC 39727) viljelmää kasvatetaan kaurajauhoagarvlnopln-nalla 2-3 viikkoa 28°C:ssa ja käytetään ympättäessä 500 5 ml: n eri enmeyer-pulloa, joka sisältää 100 ml viljelyalus-taa, jonka koostumus on 0,5 % llhauutetta, 0,5 % autoly-so1tua hiivaa, 0,5 % peptonla, 0,3 % hydrolysoitua kaseiinia, 2 % glukoosia, 0,15 % NaCl (pH 7.5 ennen sterilointia).

10 · Pulloa 1nkuboldaan 28°C:ssa pyöröravlstelljassa 200 klerr.

/min noin 72 tuntia, jonka jälkeen viljelmä siirretään käymlsastlaan, joka sisältää 4 litraa edellä mainittua viljelyalustaa. Tätä viljelmää kasvatetaan 28°C:ssa noin 72 tuntia, ilmastuksen ollessa noin kaksi litraa per mi-15 nuutti, ja hämmentäen noin 900 kierr./min, Sen jälkeen sitä käytetään ympättäessä 200 litran käymlsastia, joka sisältää samaa vil jelyalustaa. Tätä käymlsastiaa ilmastetaan 100 litraa per minuutti, käytetään ster1111S.il-maa, ja hämmennetään 250 klerr./min noin 28°C:ssa. Anti-20 bloottltuotantoa tarkkaillaan paperi-kiekko-agardiffuu-slomenetelmällä , käyttäen testiorganlsm1na B f subtil 1 s'ta mi nimi ai us tall a. Maksimaalinen aktiivisuus saavutetaan 72-96 tunnin kuluttua.

VALMISTUSESIMERKKI 2: ANTIBIOOTIN A 40926 TALTEENOTTAMINEN

25 A) Käymlsl1 emi jäähdytetään 4°C:seen, pH säädetään .arvoon 9,5 ja hämmennetään, Noin 1 tunnin kuluttua suodatetaan ja suodoksen pH säädetään arvoon noin 3,5 käyttäen vesipitoista mineraal1 happoa. Seosta hämmennetään 30 minuuttia 4°C: ssa, jonka jälkeen se suodatetaan käyttäen 30 mukana suodatusapuainetta (Hyflo-FloMa ® ). Kirkas suodos hylätään ja suodatuskakku suspendoldaan delon1soituun veteen, pH säädetään arvoon noin 8,5, hämmennetään, jonka jälkeen suodatetaan. Saadulle suodatuskaan e suoritetaan sama menetelmä toistamiseen. Yhdistetyt suodokset slsäl- \ i 75 86307 tavat antibiootin A 40926, B) Turvotettu D-Ala-D-AI a-£ -amlnokaproyyl1-Sepharose modifioitu matriisi (2 l) lisätään käymlsllemeen, joka saadaan valmistusesimerkin 1 mukaisesti (sen jälkeen kun on suoda-5 tettu ja kirkkaan suodoksen pH on säädettu arvoon noin 8,5), ta 1 yhdistettyyn suodokseen, joka saadaan edellä esitetyn valmistusesimerkin 2A) mukaisesti. Hämmennetään yön y 11 huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen hartsi otetaan talteen suodattamalla ja pestään peräkkäin noin 2 x 10 litralla 10 0,45 mM HC1-tris-puskur1a , jonka pH on 7,5 (t r1 s = 2- -amino-2-hydroksImetyyl1-1,3-propaan1d1ol1) ja joka sisältää 5 % (paino/til.) natr1umklor1dia, Jonka jälkeen pestään tislatulla vedellä (4 x 20 1).

Antibiootti A 40926 eluoldaan hartsista 1-prosenttisellä 15 (paino/til.) ammoniumhydraatUla (2 x 20 1). Eluaatlt jä-jätetään huoneen lämpötilaan yön yl1, jonka jälkeen konsentroidaan pieneen tilavuuteen (noin 2,5 litraa). Vesi poistetaan tislaamalla atseotrooppisesti n-butanolin kanssa. Sen jälkeen lisätään petrolieetteriä, jolloin saostuu 20 3,4 g raakaa antibioottia A 40926 kompleksia.

VALMISTUSESIMERKKI 3: ANTIBIOOTIN A 40926 KOMPLEKSIN AB PUHDISTUS

Raaka antibiootti A 40926 kompleksi, joka saadaan pääasiassa edellä esitetyn valmistusesimerkin 2 menetelmän mukaisesti, ( 750 mg; HPLC-11itterl 70 %), liuotetaan 400 ml:aan vettä, 25 pH säädetään arvoon 7,5, Ja liuos suodatetaan. Sen jälkeen suodokselle suoritetaan affiniteetti kroma togra f 1 a D-Ala-D- 1 -AIa-&-amlnokaproyyl1-Sepharose-pylväässä (50 ml turvonnutta hartsia; täytteen karkeus » 5 cm). Pylväs, joka on tasapal :· o 1 tettu 0,16-prosentt1 sei 1 a (paino/t1l.) ammonia-30 kiila, joka sisältää 2 M NaCl:ää ja jonka pH on säädetty arvoon 7,5 HCl:llä, kehitetään käyttäen peräkkäin seuraa-via, kolmea puskuriliuosta: 76 86307 puskuri At 0,16-prosentt1nen (pa1no/t11·) ammoniakki, joka sIsäUKS 2 M NaClta, pH säädetty arvoon 7,5 HCltlla (2,6 pyivästäytteen tilavuutta ) ; 5 puskuri Bt 0 ,16-prosentt1nen (pa1no/t11 .) ammoniakki, joka sisältää 2 M NaClta, pH säädetty arvoon 9,5 HCltlla (16 pyivästäytteen tilavuutta ) ; puskuri Ct 1-prosenttinen (paino/til.) vesipitoinen ammoniakki, )0 pH 11,4 (2,6 pyivästäytteen tilavuutta).

Puskuri C eluoi antibiootin A 40926 kompleksin AB yhtenä ainoana fraktiona. Tämän eluoldun fraktion pH säädetään arvoon 7,0 ja toistetaan sama affiniteetti pyiväs , puskuroituna 10 mM:11a tris-HCl :llä, pH 7,0. Pylväs pestään tis-•15 letulla vedellä, kunnes suolan poistuminen on täysin tapahtunut. Sen jälkeen eluoidaan kahdella pyivästäytteen tilavuudella 0,39-prosenttista (paino/til.) vesipitoista ammoniakkia, pH 11,0.

El uoIdut fraktiot konsentroidaan pieneen vesipitoiseen 20 seokseen, jonka jälkeen ne pakasteku1vataan, Saadaan puh· das antibiootti A 40926 kompleksi AB (374 mg).

VALMITUSESIMERKKI 4: ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÖIDEN A JA B ERISTÄMINEN

A) Antibiootti A 40926 kompleksi, joka saadaan valmistusesimer-25 k 1 n 2 mukaisesti (3,3 g), tai antibiootin A 40926 kompleksi AB, joka saadaan valmistusesimerkin 3 mukaisesti (2,3 g) suspendoidaan 0,5 litraan vettä, hämmennetään, jonka jälkeen suodatetaan. Kirkas suodos laitetaan sHanoituun pi1-happogeel1 pyivääseen ( 200 g; täytteen korkeus 18 cm; si-30 lanoitua p1ihappogeel 1ä 60 ; 70-230 mesh, Merck Inc.), joka on etukäteen tasapainoltettu liuoksella A (0,001 M vesipitoinen natr1um-EDTA, joka sisältää 0,25 % (paino/ til.) NaH2P04.H20:ta ja 2,5 % (paino/til .) NaClsa, li 77 , 86307 i pH säädetty arvoon 6,0 NaOHjlla). Pylväs eluoldaan lineaarisella gradlentHla, jossa on asetoni tri 111H 0 prosentista 40 prosenttiin (tH./til.) liuoksessa A, kokonaistilavuus on noin 7 litraa, eluolntlalka noin 48 tuntia, Noin 15,5 5 ml:n fraktiot kerätään ja testataan ka svukokeel 1 a käyttäen Bacillus subtilIsta Ja analysoidaan HPLC:llä, Fraktiot, joilla on samanlainen antibloottlkoostumus, yhdistetään, Fraktiot numerot 310-330 ja numerot 348-365 sisältävät antibiootit, joita vastaavasti merkitään A 40926 te-10 kijä A ja A 40926 tekijä B.

B) Yhdistetyt fraktiot, jotka sisältävät yksittäiset A 40926 tekijät A ja B, konsentroidaan alennetussa paineessa asetoni tri 111n poistamiseksi, laimennetaan vedellä (alkuperäiset liuokset noin kaksinkertaisiksi) ja laitetaan 15 silanoituun piihappogeel1 pyivääseen, joka on edellä kuvatun tyyppinen (turvonneen matriisin tilavuus 50 ml; täytteen korkeus 15 cm). Pylväs pestään deionlsoldulla vedellä, kunnes suolan poistuminen on täysin tapahtunut Ja lopuksi pylväs kehitetään aseton1 tri111/vedel1ä 60:40 (til ./ 20 tn.).

Eluoldut fraktiot konsentroidaan alennetussa paineessa Ja jäännökset pakastuskulvataan, saadaan 134 mg antibioottia A 40926 tekijää A eluoltujen fraktioiden ensimmäisestä ryhmästä (edellä esitetyt fraktiot 310-330) ja 206 mg antibioottia 25 A 40926 tekijää B eluoltujen fraktioiden toisesta ryhmäs tä (edellä mainitut fraktiot 348-365), ; 4 ; f ' · · - 78 86307

VALMISTUSESIMERKKI 5: ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PA JA TEKIJÄN PB

ERISTÄMINEN

Pääasiallisesti valmistusesimerkin 2A) menetelmän ja valmistusesimer-kin 2B) menetelmän ensimmäisten vaiheiden mukaisesti, hartsiin 5 liittynyt antibiootti eluoidaan 1-prosentti sei 1 a (paino/ til.) ammoniumhydraatl11 a (2 x 20 1), Eluaattien pH säädetään arvoon 7,8 rikkihapolla ja ne konsentroidaan pieneen tilavuuteen tyhjössä tislaamalla atseotrooppisestl n-buta-,nol1n kanssa, jolloin saadaan vesipitoinen konsentraatti, 10 joka sen jälkeen suodatetaan paperilla. Saatu suodos sisältää antibiootin A 40926 tekijän PA, antibiootin A 40926 .tekijän PB ja pienempiä määriä antibiootteja A 40926 tekijää A Ja tekijää B (HPLC). Erä (10 ml) tätä vesipitoista konsentranttia, joka sisältää noin 50 mg/ml puhdasta anti-15 bioottia A 40926 kompleksia (HPLC-analyysin mukaan) suodatetaan suodattimel1 a, jonka huokoskoko on 5 mikrometriä (Acrodlsc® ; Gelman Science Inc.), jonka jälkeen se siirretään kolonniin, joka on ruostumatonta terästä (halkaisija = 2 cm) ja joka sisältää 20 g oktadekyyl isi1yyl1 -20 -käänteisfaa si-p11happogeeliä (Llchrisorb RP 18 Merck

Inc.; hlukkaskoko 10 μη\). Pi i happogeel i pakataan sen jälkeen kohtuullisessa paineessa (nimel11spalne noin 14 bar) Chromatospac Modulprep-1a 1tteen ruostumattomaan teräsko-Tonni 1 n (joben Yvon, Ranska) ja tasapa1no1tetaan seoksel-25 la, joka muodostuu asetoni trii11stä ja 18 mM natriumfos-faattipuskurista, pH 6,0, 25:75 (til,/til,), Eluointi suoritetaan käyttäen samaa 1luotin-seosta, jota käytettiin tasapalnoitukseen, virtausnopeus on noin 10,5 ml/m1n, Elulontia seurataan kasvukokei11 a , käyttäen niissä 30 Bacillus subtllls'ta ja HPLCillä.

Ne fraktiot, joilla on samanlainen ant1b1oott1koostumus, yhdistetään ja viiden kromatograf1a-ajon homogeeniset fraktiot konsentroidaan haihduttamalla orgaaninen liuotin.

i i 79 86307

Muodostunut liuos laimennetaan vesipitoisella 1 M natrium-kloridilla kaksinkertaiseksi alkuperäiseen tilavuuteen verrattuna ja laitetaan sllanoltuun p11happogeel1 pyivääseen (50 g; täytteen korkeus 5 cm; s1lano1tua p1Ihappogeeliä 60; 5 Merck Inc.), pylväs tasapalnoltetaan vedellä.

Pylvästä pestään delonlsoidulla vedellä, kunnes suolan poistuminen on täysin tapahtunut (eluaatelssa e1 tapahdu AgCl-saostumista vesipitoisen AgN03:n lisäyksen jälkeen), • jonka jälkeen eluoidaan asetoni tri 111/vedellä 1:1 (t1l./ 10 til.). Eluaatit, joilla on samanlainen antibioottlkoostu-mus (HPLC-analyys1n mukaan) yhdistetään, konsentroidaan pieneen tilavuuteen tislaamalla atseotrooppisestl n-buta-nolin kanssa, jolloin saadaan vesipitoinen faasi, joka sen jälkeen pakastekuivataan. Saannot: 15 antibioottia A 40926 tekijää PA 55 mg antibioottia A 40926 tekijää PB 51 mg antibioottia A 40926 tekijää A 38 mg antibioottia A 40926 tekijää Bq 33 mg, 20 VALMISTUSESIMERKKI 6: VAIHTOEHTOINEN MENETELMÄ ANTIBIOOTIN A 40926

TEKIJÄN B ERISTÄMISEKSI

j. . Valmitusesimerkin 2 (viimeinen vaihe) mukaisesti valmistettujen kahden valmisteen yhdistetty konsentraattl suodatetaan ja suodos laitetaan sllanoltuun p11happogeel1kromatografia-25 pylvääseen (400 g; täytteen korkeus 30 cm; pi 1happogeel1 60, 70-230 mesh, Merck Inc.), Joka on etukäteen tasapai-noltettu vedellä.

Pylväs huuhdotaan vedellä (6 1) ja adsorboitunut antibiootti eluoidaan asetoni tri 111/vedellä seuraavan kaavion 30 mukaisesti: 2,7 litraa 5 % (t1l./t1l.) aseton1tr11l1ä vedessä 1,6 litraa 10% (111 ./til.) asetonltrl11iä vedessä 2,97 litraa 15% (til./ti 1.)"asetonitri 111ä vedessä 3,15. litraa 20% (til./til.) asetoni tri i 1 iä vedessä 80 86307

Noin 18 ml:n fraktiot kerätään. Eluoitujen fraktioiden aktiivisuus testataan paperikiekko-kasvukokeella herkillä mikro-organismeilla kuten B.subtilis ja analysoidaan HPLC:11ä. Fraktiot, joilla on samanlainen antibiootti-5 koostumus yhdistetään (fraktiot 472-526) ja konsentroidaan alennetussa paineessa. Tähän konsentraattiin lisätään n-butanolia veden poistamiseksi atseotrooppisesti. Jäljelle jäävä butanolipitoinen liuos puolestaan konsentroidaan pieneen tilavuuteen antibiootin A 40926 tekijän 10 B saostamiseksi (1,4 g). Tämä tuote pestään petrolieetterillä, samalla hämmentäen, ja kerätään suodattamalla (kolme kertaa). Tyhjössä kuivaamisen jälkeen saadaan 760 mg antibioottia A 40926 tekijää B.

Suorittamalla antibiootille A 40926 tekijälle B vielä uu-15 destaan edellä mainittu pyiväskromatografia saadaan (540 mg) antibioottia A 40926 tekijää Bq, jolla on samat fysiko-kemialliset tunnusmerkit, jotka on edellä esitetty antibiootille A 40926 tekijälle Β paitsi, että nyt saadaan ainoastaan yksi piikki HPLC-analyysissä, nimittäin piikki, 20 jonka retentioaika on 1,22 suhteessa teikoplaniinin A^ komponenttiin 2. Toinen yhdiste, joka eluoituu myöhemmin, saa edellä esitetyssä HPLC-systeemissä retentioajan 1,22 ja se on nimetty antibiootti A 40926 tekijä B1. Se eristetään työskentelemällä edellä kuvatulla tavalla (saanto 25 = 15 mg).

VALMISTUSESIMERKKI 7: ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PA JA

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PB MUUTTAMINEN ANTIBIOOTIKSI A 40926 TEKIJÄKSI A JA VASTAAVASTI TEKIJÄKSI B

30 Antibiootti A 40926 tekijä PA ja antibiootti A 40926 tekijä PB (50 mg) liuotetaan erikseen 2,5 ml:aan vesipitoista 1-prosenttista (paino/til.) NH^0H:ta ja muodostuneita liuoksia pidetään noin 24 tuntia huoneen lämpötilassa, samalla niitä hämmentäen. Antibiootti A 40926 tekijä A saadaan 81 86307 liuoksesta, joka alunperin sisältää antibiootin A 40926 tekijän PA ja antibiootti A 40926 tekijä B saadaan liuoksesta, joka alunperin sisältää antibiootin A 40926 tekijän PB poistamalla vettä atseotrooppisesti tislaa-5 maila n-butanolin kanssa, saostaminen tapahtuu etyyli-eetterillä ja sakka kerätään suodattamalla (saanto noin 75 %) .

VALMISTUSESIMERKKI 8: D-ALA-D-ALA-SEPHAROSEN VALMISTUS

a) Sepharosen aktivointi epik 1oorihydriin 111ä 10 Yksi litra Sepharose 4B:tä (Pharmacia Fine Chemicals), joka on suodatettu huokoisella 1 asisuodattimel1 a ja pesty demi nerali soidul1 a vedellä, lisätään 1,2 litraan NaOH N/1 hämmentämällä varovasti huoneen lämpötilassa. Lisätään 100 ml epikloorihydriiniä, jonka jälkeen massaa 15 sekoitetaan noin 20°C:ssa jäähdyttäen sitä ulkoisesti kyl mällä vedellä, 24 tuntia. Suspensio suodatetaan ja kiinteä aine pestään demineralisoidul1 a vedellä (noin 5 litraa), kunnes pH on neutraali.

h) Sepharose <i-ACA-D-Ala-D-Ala-hartsin valmistaminen 20 Liuokseen, jossa on 17 g (62,2 mmoolia) -ACA-D-A1 a-D- -Alaraa 200 ml:ssa vettä, pH säädettynä 20-prosenttisei 1 a NaOH:lla arvoon 11, lisätään noin 500 ml Sepharose 4B:tä, joka derivoituu epikloorihydriinillä (kokonaisepoksidipi-toisuus noin 15,5 mi 11iekvivaienttia) , samalla seosta häm-25 mennetään mekaanisesti.

Suspensiota hämmennetään pH:n ollessa 11 ja huoneen lämpö-tilassa noin 2 päivää (kunnes testi, jota käytetään mittaamaan epoksidipitoisuutta, on negatiivinen), suodatetaan ja pestään 300 ml :11a vettä. Suodatettu hartsi pestään taas 30 vedellä (noin 3 litraa), kunnes pH on neutraali, saadaan 460 ml Sepharose- c-ACA-D-A1a-D-Ala-hartsia.

Claims (10)

82 86307

1. Menetelmä antibiootin valmistamiseksi, joka on antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB, antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-agly-koni tekijä A, antibioottinen A 40926 N-asyyliaminogluku-ronyyli-aglykoni tekijä BQ, antibioottinen A 40926 N-asyy-liaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä B^, antibioottinen A 40926 aglykoni tai näiden additiosuolan tai seoksen valmistamiseksi, jolla antibiootilla on seuraavat tunnusmerkit: antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB (ei additiosuolamuodossa): A) ultraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit λ maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri, pH 7,4 282 310 (olka) c) 0,1 N KOH 302 B) infrapuna-absorptiospektri, jossa on seuraavat absorptiomaksimit (cm-1): 3700-3100; 3000-2800 (nujoli); 1650; 1620-1550; 1500; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1300; 1250-1180; 1150; 1060; 1010; 970; 930; 840; 820 C) 1H-NMR-spektri, jossa on seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) 270 MHz:llä, rekisteröity DMSO d6:ssa (heksa-deuterodimetyylisulfoksidi) plus CF3COOH:ssa, käyttäen sisäisenä standardina TMS:ää (0,00 ppm), (δ = ppm): 0,84, d ja t [isopropyy1 isot CH2:t ja terminaalinen CH2]; 1,14, m [(CH2)n]; 1,44, m [-CH2-C-CO ja isopropyylinen CH]; 2,00, t [-CH2-(CO)]; 2,5, s (DMSOd5); 2,5, s (N-CH3); 2,93, m 83 86307 [CH, (Z2)]; 3,33, m [CH, (Z'2)]; 3,20-3,80, m [sokeri CH:t]; 5,34, d [asyyliaminoglukuronihapon anomeerinen protoni]; 4,10, m (X6); 4,33, d (X5); 4,43, d (X7); 4,9, m (X2); 5,1 (4F ja Z6); 5,4, s (XI); 5,58, d (X4); 5,7, s (4B) , 6,06, d (X3) ; 7,73, s (6B); 6,26-8,42, s ja in [aromaattiset CH:t ja peptidiset NH:t]; 8,70-10,5, br, s [fe-noliset OH:t ja NH2+] br = leveä d = dupletti m = multipletti s = singletti t = tripletti D) retentioajat (R^) 1,20 ja 1,30 suhteessa teikoplaniini A2. n komponenttiin 2 (R^. = 20,3 min), analysoitaessa kään-teisfaasi-HPLC:llä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 /un) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 μτα) oluentti A: CHjCN 10% p„ säädetty (2,5 g/1) NaH2P04*H20 90% arvoon 6,0 eluentti B: CH3CN 70% pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04’H20 30% arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 %:sta 60 %:iin eluent-tia B eluentissa A, 40 minuutissa virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniini A2:n komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) happamet funktiot pystyvät muodostamaan suoloja aminofunktio pystyy muodostamaan suoloja G) ei mannoosiyksikköä liittyneenä runko-osaan; 84 86307 antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä A (ei additiosuolamuodossa): A) ultraviolettiabsorptiospektri, jossa seuraavat absorp-tiomaksimit X maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri, pH 7,4 282 310 (olka) c) 0,1 N KOH 302 B) infrapuna-absorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit (cm-1): 3700-3000; 3000-2800; 1650; 1585; 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1295; 1230; 1210; 1150; 1070; 1060; 1010; 845; 820; 720 (nujoli) C) 1H-NMR-spektri, jossa esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) 270 MHzrllä, rekisteröity DMSO d6:ssa (heksa-deuterodimetyylisulfoksidi), käyttäen sisäisenä standardina TMS:ää (0,00 ppm), (δ = ppm): 0,85, t (terminaalinen CH3); 1,0-1,3 (alifaattiset CH2:t); 1,42 m ((OC-C)CH2); 2,00 t ((CO)CH2); 2,35 s (NCH3); 2,49 s (DMSOd5); 2,82 m (Z2); 2,8-3,8 (sokeriprotonit ja Z'2); 4,12 m (X6); 4,56 s (Xl); 4,34 d (X5); 4,41 d (X7); 4,96 m (X2); 5,08-5,12 (4F ja Z6); 5,40 d (asyyliaminoglukuronihapon anomeerinen protoni); 5,58 d (X4); 5,74 s (4B); 6,05 d (X3); 7,75 s (6B); 6,25-8,40 s, d ja m (aromaattiset CH:t ja peptidiset NH:t) D) retentioaika (R^) 1,20 suhteessa teikoplaniini A2:n komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min), analysoitaessa käänteis-faasi-HPLC:llä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 μπι) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 μπι) eluentti A: CH3CN 10% pH säädetty II 85 86307 (2,5 g/1) Na^PO^'^O 90% arvoon 6,0 eluentti B: CHqCN 70% pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04'H20 30% arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 %:sta 60 %:iin eluent-tia B eluentissa A, 40 minuutissa virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniini A2in komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) molekyy1ipaino noin 1554 määritettynä FAB-MS:llä F) happamet funktiot pystyvät muodostamaan suoloja G) aminofunktio pystyy muodostamaan suoloja H) ei mannoosiyksikköä liittyneenä runko-osaan; antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä Bq (ei additiosuolamuodossa): ultraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: λ maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri, pH 7,4 282 310 (olka) c) 0,1 N KOH 302 B) infrapuna—absorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit (cm-1): 3700-3100; 3000-2800 (nujoli); 1650; 1585; 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1295; 1230; 1210; 1150; 1060; 1010; 980; 840; 820; 720 (nujoli) C) 1H-NMR-spektri, jossa esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) 270 MHz:llä, rekisteröity DMSO d6:ssa (heksa- 86 86307 deuterodixnetyylisulfoksidi) , käyttäen sisäisenä standardina TMS:ää (0,00 ppm), (δ = ppm): 0,84, d (isopropyyliset CH3:t); 1,0-1,3 (alifaattiset CH2:t); 1,3-1,6 ((OC-C)CH2 ja isopropyylinen -CH); 2,00 t ((C0)CH2); 2,32 s (NCH3); 2,49 s (DMSOd5); 2,82 m (Z2); 2,9-3,8 (sokeriprotonit) 4,12 m (X6); 4,44 s (Xl); 4,33 d (X5); 4,37 d (X7); 4,95 m (X2); 5,06-5,10 (4F ja Z6); 5,38 d (asyyliaminoglukuroni-hapon anomeerinen protoni); 6,27-8,5 (aromaattiset ja pep-tidiset NH:t) D) retentioaika (R^.) 1,30 suhteessa teikoplaniini A2: n komponenttiin 2 (R^ = 20,3 min), analysoitaessa käänteis-faasi-HPLC:llä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 μΐη) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 μΐη) eluentti A: CH3CN 10% pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04*H20 90% arvoon 6,0 eluentti B: CH3CN 70% pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04-H20 30% arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 %:sta 60 %:iin eluent-tia B eluentissa A, 40 minuutissa virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniini A2:n komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) molekyylipaino noin 1568 määritettynä FAB-MS:llä F) happamet funktiot pystyvät muodostamaan suoloja G) aminofunktio pystyy muodostamaan suoloja H) ei mannoosiyksikköä liittyneenä runko-osaan; antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni tekijä B^:llä (ei additiosuolamuodossa): 87 86307 iuolekyylipaino on noin 1568 määritettynä FAB-MS:llä ja pääasiallisesti samat fysikokemialliset tunnusmerkit kuin edellä on esitetty antibioottiselle A 40926 N-asyyliamino-glukuronyyli-aglykoni tekijä B0:lle paitsi, että sillä on edellä esitetyssä NMR-systeemissä tripletti 0,84 δ ppm vastaten N-propyyli-funktion metyyliryhmää, ja retentioaika suhteessa teikoplaniinin A2:n komponenttiin 2 on 1,32 edellä esitetyssä systeemissä; antibioottinen A 40926 aglykoni (ei additiosuolamuodossa) A) ultraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit X maks (nm) a) 0,1 N HC1 280 b) fosfaattipuskuri, pH 7,4 280 310 (olka) c) 0,1 N KOH 299 B) infrapuna-absorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit (cm-1): 3700-3100; 3000-2800 (nujoli); 1655; 1620-1550; 1500; 1460 (nujoli); 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1300; 1205; 1145; 1010; 970; 930; 840 C) 1H-NMR-spektri, jossa on seuraavat signaaliryhmät (ppmrssä) 270 MHzrllä, rekisteröity DMSO d6:ssa (heksa-deuterodimetyylisulfoksidi) plus CF3COOH:ssa, käyttäen sisäisenä standardina TMS:ää (0,00 ppm), (δ = ppm): 2,51 s (DMSOd5) ; 2,50 s (NCH3); 2,88 m (Z2) ; 3,33, m (Z'2); 4,10 m (X6); 4,34, d (X5); 4,43, d (X7); 4,93, m (X2); 5,04 s (4F); 5,09 s (Z6); 5,54 d (X4); 5,75 s (4B); 6,05 d (X3); 7,76 s (6B); 6,3-8,4 (aromaattiset ja peptidiset NH:t) D) retentioaika (Rt) 0,59 suhteessa teikoplaniini A2:n komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min), analysoitaessa käänteis- 88 86 307 faasi-HPLC:llä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 μχα) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 μτα) eluentti A: CH3CN 10% pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04*H20 90% arvoon 6,0 eluentti B: CH3CN 70% pH säädetty (2,5 g/1) NaH2P04‘H20 30% arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 %:sta 60 %:iin eluent-tia B eluentissa A, 40 minuutissa virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniini A2:n komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) samoissa olosuhteissa retentioaika suhteessa antibioottiseen L 17054:ään (Gruppo Lepetit EP-A-119575) on 1,42; E) molekyylipaino on noin 1211 määritettynä FAB-MS:llä F) happamet funktiot pystyvät muodostamaan suoloja G) aminofunktio pystyy muodostamaan suoloja H) ei mannoosiyksikköä liittyneenä runko-osaan; ja joilla on seuraava kaava (I) f H h irirri h v2 z HO C1 H 22 v«bS51.* J I » - o - VVX' TN yl 'l1s'TT '„Y“^h3 Vh X2 vS / /1 <5i> 110 ^oV i - o / \Jv 0B oh HO 89 86307 jossa A tarkoittaa vetyä tai N-(C11-C12)asyyliaminoglukuronyyliä, ja B tarkoittaa vetyä, tunnettu siitä, että a) antibioottiselle A 40926 kompleksille, antibioottiselle A 40926 kompleksi AB:lie, antibioottiselle A 40926 tekijä A:lie, antibioottiselle A 40926 tekijä B:lle, antibioottiselle A 40926 tekijä B0:lle, antibioottiselle A 40926 tekijä PA:lie, antibioottiselle A 40926 tekijä PB:lle suoritetaan kontrolloitu happohydrolyysi käyttäen vahvaa happoa sopivassa, orgaanisessa liuottimessa rajoitetun (0,1-10% paino/paino) määrän vettä läsnäollessa; b) kun saadaan lopullisten tuotteiden seos, ne, mahdollisesti, erotetaan kromatografisella menetelmällä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kaavassa I A on undekanoyyliaminoglukuro-nyyli tai isododekanoyyliaminoglukuronyyli.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa reaktiolämpötila on välillä 4°C - 80°C.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa vahva happo on vetyhalogenidi, fosforihappo, rikkihappo tai halogeenietikkahappo.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa vahva happo on konsentroitu kloorivetyhappo.

6· Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa orgaaninen liuotin on (C1-C4)alkyylisulfoksidi, (Cj-C^)- 90 86 307 alkyyliformamidi, dioksaani, tetrahydrofuraani tai vastaava .

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa hydrolyysi suoritetaan käyttäen dimetyylisulfoksidin ja konsentroidun kloorivetyhapon seosta, suhteessa 8:2 -9,5:0,5, lämpötilan ollessa välillä 40°C - 80°C.

8. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä antibioottisen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB:n tai sen tekijän valmistamiseksi, tunnettu siitä, että antibioottinen A 40926 kompleksi, antibioottinen A 40926 kompleksi AB, antibioottinen A 40926 tekijä A, antibioottinen A 40926 tekijä B, antibioottinen A 40926 tekijä Bq, antibioottinen A 40926 tekijä PA, antibioottinen A 40926 tekijä PB saatetaan kontrolloidun happohydro-lyysin alaiseksi, käyttäen dimetyylisulfoksidin ja 37-pro— senttisen (paino/paino) kloorivetyhapon seosta, suhteessa 9:1 - 9,5:0,5, lämpötilassa noin 65°C, noin 5 tuntia, mahdollisesti antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyy-li-aglykoni tekijä A ja antibioottinen A 40926 N-asyyli-aminoglukuronyyli—aglykoni tekijä B erotetaan kromatografisella menetelmällä.

9. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä antibioottisen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykonin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että antibioottinen A 40926 kompleksi tai sen yksittäinen tekijä, antibioottinen A 40926 kompleksi AB, antibioottinen A 40926 tekijä A, antibioottinen A 40926 tekijä B, antibioottinen A 40926 tekijä PA, antibioottinen A 40926 tekijä PB, antibioottinen A 40926 tekijä BQ, antibioottinen A 40926 mannosyyli-aglykoni tai antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuro-nyyli-aglykoni (kompleksi AB/tai sen yksittäinen tekijä) saatetaan kontrolloidun happohydrolyysin alaiseksi l! 91 86307 (a) orgaanisen proottisen liuottimen, joka on alifaattinen happo tai alfa-halogenoitu, alifaattinen happo, joka reak-tiolämpotilassa on neste, alifaattisen tai sykloalifaatti-sen alkanolin, joka reaktiolämpötilassa on neste ja hiukan veteen sekoittuva, fenyyli-substituoidun alempialkanolin, jossa fenyyliosa voi mahdollisesti sisältää (C-^-C^) -alkyy-ii-» (^i”C4)-alkoksi- tai halogeenitähteitä ja joka reak-tiolämpotilassa on neste ja hiukan veteen sekoittuva, tai beta-polyhalogenoidun alempialkanolin, joka reaktiolämpötilassa on neste, (b) valitun, liuottimen kanssa yhteen sopivan, vahvan hapon, joka on mineraalihappo, vahva, orgaaninen happo tai vahva, hapan, vetymuodossa oleva kationinvaihtohartsi, läsnäollessa, ja (c) reaktiolämpötilassa, joka on noin 20°C - noin 100°C.

10. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä antibioottisen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykonin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että antibioottinen A 40926 kompleksi, antibioottinen A 40926 kompleksi AB, antibioottinen A 40926 tekijä A, antibioottinen A 40926 tekijä B, antibioottinen A 40926 tekijä Bq, antibioottinen A 40926 tekijä PA, antibioottinen A 40926 tekijä PB, antibioottinen A 40926 N-asyyliaminoglukuronyyli-aglykoni kompleksi AB tai sen tekijä tai antibioottinen A 40926 manno-a<?lykoni saatetaan kontrolloidun happohydrolyysin alaiseksi, käyttäen dimetyylisulfoksidin ja 37-prosentti-sen (paino/paino) kloorivetyhapon seosta, suhteessa 8:2 -. 9,5:0,5, lämpötilassa joka on noin 80°C. 92 86307