JP4191238B2 - 抗生物質107891、そのa1及びa2因子、薬学的に許容されるその塩及び組成物、並びにその使用 - Google Patents
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Description
Microbispora sp.107891は、環境中で単離されて、2003年2月27日にブダペスト条約の規定の下で米国20110−2209、バージニア州、Manassas市、University Blvd、10801、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)に寄託された。該菌株は寄託番号PTA−5024が与えられた。
Microbispora sp.ATCC PTA−5024は、種々の標準の固体培地でよく増殖する。微細な寸法は、1ml/lのビタミン溶液(チアミン塩酸塩25mg/l、パントテン酸カルシウム250mg/l、ニコチン酸250mg/l、ビオチン0.5mg/l、リボフラビン1.25g/l、シアノコバラミン6.25mg/l、パラアミノ安息香酸25mg/l、葉酸500mg/l、塩酸ピリドキサール500mg/l)が添加されたフミン酸−Trace Salts Agar(g/lでの組成:フミン酸0.5、FeSO4・7H2O 0.001、MnCl2・4H2O 0.001、ZnSO4・7H2O 0.001、NiSO4・6H2O 0.001、MOPS 2、寒天20)上で増殖された培養物を用いて測定された。
Microbispora sp.ATCC PTA−5024を、AF/MS液体培地(実施例1を参照されたい)で28℃及び200rpmにおいて6日間増殖し、次いで新しいAF/MS液体培地に移し(5%接種材料)、更に6日間培養して、最終的に100mlのV6液体培地(実施例1を参照されたい)中に接種した(7%接種材料)。28℃及び200rpmでの培養の6日後に、菌糸体を遠心分離で回収し、無菌食塩水で3度洗浄し、次いで希釈して適切な接種材料を得た。懸濁液のアリコットを、Shirling及びGottlieb(E.B.Shirling and D.Gottlieb,(1966):“Method for Characterization of Streptomyces species”,Int.J.Syst.Bacteriol.16:313−340)によって推奨された種々の培地、及びS.A.Waksman(1961):“The Actinomycetes”,The Williams and Wilkins Co.,Baltimore.Vol.2:328−334によって推奨された培地にクロスハッチング式に(cross−hatched manner)すじをつけて(streak)接種した。
Microbispora sp.ATCC PTA−5024を、GYM培地(グルコース4g/l、酵母エキス4g/l、麦芽エキス10g/l)中28℃において回転式振盪機で増殖し、菌糸体を回収し、無菌蒸留水で2度洗浄し次いで凍結乾燥した。アミノ酸の分析が、Staneck及びRoberts(J.L.Staneck and G.D.Roberts,(1974):“Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin−layer chromatography”,Appl.Microbiol.28:226−231)の方法に従って実施された。メナキノン及び極性脂質が、Minnikin他(D.E.Minnikin,A.G.O’Donnell,M.Goodfellow.,G.Alderson,M.Athalye,A.Schaal and J.H.Parlett,(1984):“An integrated procedure of isoprenoid quinones and polar lipids”,J.Microbiol.Meth.2:233−241)の手順に従って抽出された。極性脂質が、薄層クロマトグラフィーによって分析され(D.E.Minnikin,V.Patel,L.Alshamaony,and M.Goodfellow,(1977):“Polar lipid composition in the classification of Nocardia and related bacteria”,Int.J.Syst.Bacteriol.27:104−117)、メナキノンが、HPLCによって分析され(R.M.Kroppenstedt,(1982):“Separation of bacterial menaquinones by HPLC using reverse phase RP18 and a silver loaded ion exchanger as stationary phase”,J.Liquid.Chromat.5:2359−2367;R.M.Kroppenstedt,(1985):“Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related organisms”,in:Chemical Methods in Bacterial Systematics.No20 SAB Technical Series pp.173−199,M.Goodfellow and D.E.Minnikin eds,Academic Press,London)、脂肪酸メチルエステルが、ガス液体クロマトグラフィーによってそれぞれ分析された(L.T.Miller,(1982):“A single derivatization method for bacterial fatty acid methyl esters including hydroxy acids”,J.Clin.Microbiol.16:584−586;M.Sasser,(1990):“Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids”,USFCC News Letters 20:1−6)。ミコール酸の存在は、Minnikin他(D.E.Minnikin,L.Alshamaony,and M.Goodfellow,(1975):“Differentiation of Mycobacterium,Nocardia and related taxa by thin layer chromatographic analysis of whole organism methanolyzates”,.J.Gen.Microbiol.88:200−204)の方法によって確かめられた。
Microbispora sp.ATCC PTA−5024株の全rRNAの95%に相当する、16 rRNA遺伝子(16S rDNA)の部分配列、即ち1443ヌクレオチドは、公開された手順に従って達成された(P.Mazza,P.Monciardini,L.Cavaletti,M.Sosio and S.Donadio,(2003):“Diversity of Actinoplanes and related genera isolated from an Italian soil”,Microbial Ecol.5:362−372)。それは配列番号1に報告された。この配列は、米国特許第6551591B1号に報告されたように菌株Microbispora corallina NRRL 30420(MF−BA−1768)の配列と比較された。これら2つの配列は整列され、差異は1456整列位置のうちの31で見出され、全体で2.13%の配列相違があった。97.5%未満の配列同一性を共有する任意の2つの菌株は、一般的に異なる種に属する(Stackebrandt,E.and Embley,M.T.(2000)“Diversity of Uncultered Microorganisms in the Environment”.In:Nonculturable Microorganisms in the Environment,R.R.Colwell and D.J.Grimes(eds).ASM,Press,Washington DC,pp.57−75)。従って、配列相違の2%レベルは、極めて高く(Rossello−Mora,R.,and Amann,R.(2001).“The Species Concept for Prokaryotes”.FEMS Microbiol.Rev.25:39−67)、Microbispora sp.ATCC PTA−5024とMicrobispora corallina NRRL 30420(MF−BA−1768)は異なる菌株であることを示している。
抗生物質107891を産生する菌株は、次の化学分類学的及び形態学的特徴によりストレプトスポランギアセアエ(Streptosporangiaceae)科、ミクロビスポラ(Microbispora)属に割り当てられる。
・細胞壁中のメソ−ジアミノピメリン酸の存在、
・多量のMK−9(III、VIII−H4)、及びLechevalier他(H.A.Lechevalier,C.De Brieve and M.P.Lechevalier,(1977):“Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes:phospholipid composition”,Biochem.Syst.Ecol.5:246−260)によるリン脂質IV型、
・3cセンスクロッペンシュテッド(R.M.Kroppenstedt,(1992):“The genus Nocardiopsis”,in:The Prokariotes,Vol II,,pp.1139−1156,A.Balows,H.Truper,M.Dworkin,W.Harder and K.H.Schleifer eds;New York,Springer−Verlag)の脂肪酸プロフィール、
・ミコール酸の欠如、
・気中菌糸から側面に分岐する短い担胞子体の先端の特徴的な縦の胞子の組の形成。非運動性胞子、
・記載されたMicrobispora sp.からの16S rDNA配列に対して>97%の同一性を示す、配列番号1に報告された、全rRNAの95%に相当する、16 rRNA遺伝子(16S rDNA)の部分配列、即ち1443ヌクレオチド。
上記の通り、抗生物質107891は、菌糸体中と発酵ブロスのろ過画分中の両方に殆ど等しく配分されていることが見出される。
回収されたブロスは、発酵ブロスの上澄みから菌糸体を分離するよう処理することができ、菌糸体は、水混和性溶媒で抽出して、使用済み菌糸体の除去後に107891抗生物質を含む溶液を得ることができる。この菌糸体エキスは、次いで、上澄み画分についてこれから先に報告される手順に従って上澄みと別に、又は一緒に処理することができる。水混和性溶媒が菌糸体エキスから抗生物質を回収する操作に支障をもたらしうる場合、水混和性溶媒は蒸留によって除去することができ、又は支障のない濃度に水で希釈することができる。
n−ブタノール、1−ペンタノール、2−ペンタノール、3−ペンタノール、1−ヘキサノール、2−ヘキサノール、3−ヘキサノール、3,3−ジメチル−1−ブタノール、4−メチル−1−ペンタノール、3−メチル−1−ペンタノール、2,2−ジメチル−3−ペンタノール、2,4−ジメチル−3−ペンタノール、4,4−ジメチル−2−ペンタノール、5−メチル−2−ヘキサノール、1−ヘプタノール、2−ヘプタノール、5−メチル−1−ヘキサノール、2−エチル−1−ヘキサノール、2−メチル−3−ヘキサノール、1−オクタノール、2−オクタノール、シクロペンタノール、2−シクロペンチルエタノール、3−シクロペンチル−1−プロパノール、シクロヘキサノール、シクロヘプタノール、シクロオクタノール、2,3−ジメチル−シクロヘキサノール、4−エチルシクロヘキサノール、シクロオクチルメタノール、6−メチル−5−ヘプテン−2−オル、1−ノナノール、2−ノナノール、1−デカノール、2−デカノール、及び3−デカノールなどの直鎖、分枝又は環状であってよい少なくとも4個の炭素原子のアルカノール;メチルイソプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチル−n−アミルケトン、メチルイソアミルケトンなどの少なくとも5個の炭素原子のケトン、並びにそれらの混合物である。
抽出に続いて、相当量の水を含む有機相が回収される場合、それより水を共沸的に蒸発することが便利であるかもしれない。一般的に、このことは、最小の水との共沸混合物を形成することが可能な溶媒の添加、及びそれに続く必要ならば所望の産成物を析出させるための析出剤の添加を必要とする。最小の水との共沸混合物を形成することが可能な有機溶媒の代表例は、n−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ブチルエーテル、四塩化炭素、クロロホルム、シクロヘキサン、2,5−ジメチルフラン、ヘキサン、及びm−キシレンであり、好ましい溶媒はn−ブタノールである。
抗生物質107891を回収するための好ましい一手順によれば、ろ過された発酵ブロスは、吸着マトリックスと接触させ、次いで極性の水混和性溶媒又はその混合物で溶離し、減圧下で油状の残渣に濃縮し、前述のタイプの析出剤で析出させることができる。
試料注入口条件:
シートガス(N2) 60psi(約413685Pa)、
補助ガス(N2) 5psi(約34474Pa)、
キャピラリー加熱器 250℃
試料注入口電圧設定:
陽極性及び陰極性の両方、
イオンスプレイ電圧 +/−5kV、
キャピラリー電圧 +/−19V
走査条件:最大イオン時間 200ms、
イオン時間 5ms、
フルミクロスキャン 3、
セグメント:持続時間 30min、スキャンイベントポジティブ(150〜2000m/z)及びネガティブ(150〜2000m/z)
A1因子は、DMSO:ギ酸 95:5(v/v)中に溶解された精製された抗生物質107891複合体から、流速3.5mlにおける30%から45%のB相の25分線形勾配溶離を用いて、Symmetry Prep.C18カラム上で分離され精製された。
抗生物質107891複合体、そのA1及びA2因子、並びに前記因子の任意の比率の混合物は、そのまま又は薬学的に許容される担体と混合して投与することができ、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド及びグリコペプチドなどの他の抗菌剤と併せて投与することもできる。
A)質量分析:
Thermofinnigan較正ミックス(calibration mix)を用いた、エレクトロスプレイ源を備えたThermofinnigan LCQ deca装置上のMS実験においては、抗生物質107891は、2つの二重にプロトン化されたイオンを、複合体A1因子とA2因子の最も低い同位体組成にそれぞれ対応するm/z=1124とm/z=1116において示す。エレクトロスプレイ条件は、スプレイ電圧4.7kV、キャピラリー温度220℃、キャピラリー電圧3V、注入モード 10μl/分であった。スペクトルは、トリフルオロ酢酸0.1%を含むメタノール/水80/20(v/v)中の0.2mg/ml溶液から記録され、図1A(完全走査低解像度スペクトル)及び1B(拡大高解像度スペクトル)に示される。
C)Perkin−Elmer分光光度計λ16を用いてメタノール/H2O(80:20の比率)中で実施された抗生物質107891の紫外スペクトルは、226と267nmにおいて2つの肩を示す。紫外スペクトルは図3に示されている。
D)1H−NMRスペクトルが、水抑制シーケンス(water suppression seqience)を適用するBruker AMX 600分光計でメタノール−d4:H2O(pH4.3 HCl)40:10(v/v)の混合物中40℃において記録された。内部標準として、3.31ppmにおけるメタノール−d4の残留シグナルが考慮された。
メタノール−d4:H2O(0.01N HCl)40:10(v/v)中に溶解された抗生物質107891の1H−NMRスペクトルは、600MHzにおいてMeOH−d4を内部標準(3.31ppm)として用いて次のシグナルのグループ(ppmで)を示す[δ=ppm、多重度(帰属)]:0.93d(CH3)、0.98d(CH3)、1.07t(重複CH3)、1.18t(重複CH3)、1.26s(CH3)、1.30t(重複CH3)、1.62〜1.74m(CH2)、1.78d(CH3)、1.80d(CH3)、2.03m(CH2)、2.24m(CH)、2.36m(CH2)、2.72〜3.8m(ペプチド性アルファCH)、3.8〜5.2m(ペプチド性アルファCH)、5.53〜6.08s(CH2)、5.62d(CH二重結合)、6.42m(CH)、6.92d(CH二重結合)、7.0〜7.55m(芳香族CH)、7.62〜10.4d及びm(芳香族及びペプチド性NH)。
E)13C−NMRスペクトルが、内部標準として49.15ppmにおけるメタノール−d4の残留シグナルを用いるBruker AMX 600分光計上でメタノール−d4:H2O(pH4.3 HCl)40:10(v/v)の混合物中40℃において記録された。抗生物質107891のbbデッカプル(bb decoupled)13C−NMRスペクトルが図5に示されている。
メタノール−d4:H2O(0.01N HCl)40:10(v/v)中に溶解された抗生物質107891の13C−NMRスペクトルは、MeOH−d4を内部標準(49.15ppm)として用いて600MHzにおいて次のシグナルのグループ(ppmで)を示す[δ=ppm、(帰属)]:13.6〜23.2(脂肪族CH3)、26.16〜73(脂肪族CH2及びペプチド性アルファCH)、105〜136(芳香族及び二重結合CH及び四級炭素)、164.3〜176.3(ペプチド性カルボニル)。
F)抗生物質107891複合体が、過剰モルの0.01M塩酸を含む2−メトキシエタノール(MCS):H2O 12:3(v/v)に溶解された。この溶液は、次いで、0.01N水酸化カリウムの溶液で逆滴定された。得られた滴定曲線は、1つの塩基性イオン性官能基を示した。
A)抗生物質107891複合体中の「耐酸性」アミノ酸の決定
抗生物質107891が完全な酸加水分解(HCl 6N、105℃、24時間)にかけられ、酸処理に耐性がある抗生物質のアミノ酸成分が同定された。酸に不安定なアミノ酸はこの手法で検知できない。加水分解物は、適切な誘電体化の後に、同様に誘電体化された標準のアミノ酸の混合物と比較して、HPLC−MS及びGC−MS分析によって研究された。HPLC分析については、加水分解された試料は、6−アミノキノリル−N−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート(AccQ−Tag(商標)Fluor試薬キット)で処理され、GC分析については、無水メタノール及びトリフルオロ酢酸無水物中の3N HClの混合物で処理された。
カラム:AccQ−Tag(商標)(Waters C18 NovoPak 4μm 3.9×150mm)
カラム温度:37℃
流速:1mL/分
A相:酢酸アンモニウム140mM pH5(酢酸)
B相:水:アセトニトリル60:40(v/v)
MS条件は次の通りである。
分光計:標準エレクトロスプレイ源を備えたFinnigan LCQ Deca
キャピラリー温度:250℃
供給源電圧:4.70KV
供給源電流:80μA
キャピラリー電圧:−15V
定性的GC分析は、MS−EI検知が取り付けられたガスクロマトグラフ上で実施された。
カラム:J & W Scientific DB−5、30m×0.254mm ID×0.25μm FT
キャリヤーガス:ヘリウム
注入モード:スプリットレス
注入温度:200℃
トランスファーライン温度:300℃
温度プログラム:2.5℃/分で50℃から100℃まで(10分)、10℃/分で100℃から250℃まで(15分)、250℃で15分
注入量:1μl
分光計:Finnigan TSQ700
イオン化モード:電子衝撃
電圧設定:
フィラメント電流:400mA
電子マルチプライヤ:1400V
電子エネルギー:70eV
陽イオンモード
走査条件:
走査範囲:40〜650amu
走査時間:1秒
カラム:Restek RTX−5MS、15m×0.25mm ID×0.25μm FT
キャリヤーガス:ヘリウム
インターフェース温度:250℃
温度プログラム:50℃で1.5分、20℃/分で50℃から100℃まで、100℃で1分、20℃/分で100℃から135℃まで、135℃で1分、20℃/分で135℃から250℃まで、250℃で1分
注入量:1μl
注射器:スプリットレスモード、基本温度50°C、トランスファー(transfer)温度 280°C、トランスファーレート 14.5°C/min
イオン化モード:電子衝撃
電圧設定:
フィラメント電流:149μA
電子マルチプライヤ:200V
電子エネルギー:70eV
陽イオンモード:
走査条件:
走査範囲:33〜500amu
走査時間:0.6秒
精製された107891複合体並びにその単一のA1及びA2因子の完全な加水分解が、Simpson RJ,Neuberger MR,Liu TY,“Complete Aminoacid Analysis of Proteins from a Single Hydrolysate”.Journal Biol.Chem(United States),April 10,1976,251(7),1936−40によって記載された方法に従って実施された。
Thermofinnigan較正ミックスを用いる、エレクトロスプレイ源を取り付けたThermofinnigan LCQ deca装置上のMS実験で、最低の同位体組成に対応して、抗生物質107891A1因子はm/z=1124において、A2因子はm/z1116において二重にプロトン化されたイオンを示す。エレクトロスプレイ条件は、スプレイ電圧:4.7kV、キャピラリー温度:250℃、キャピラリー電圧:8V、注入モード 10μl/分であった。スペクトルは、酢酸0.5%を含むアセトニトリル:水 50:50(v/v)中の0.1mg/ml溶液から記録され、図6A(完全走査低解像度スペクトル)及び6B(拡大走査高解像度スペクトル)及び図7A(完全走査低解像度スペクトル)及びB(拡大走査高解像度スペクトル)に報告されている。
A)米国特許第6551591B1号に記載されたMicrobispora corallina NNRL 30420(MF−BA−1768)は、NNRLコレクションから得られた。予備的な実験においては、M.corallina NNRL 30420(MF−BA−1768)株を米国特許第6551591B1号に記載された条件で三角フラスコ中で発酵した。回収されたブロスは、メタノールでの希釈によって抽出された。菌糸体の遠心分離後、上澄みをHP20ポリスチレン吸収樹脂に載せ、メタノール:水 70:30の混合物で溶離し、その溶離液を小容量にし、次いで凍結乾燥した。
B)更なる一実験においては、Microbispora sp.株NRRL 30420 (MF−BA−1768)の30l槽発酵が実施され、回収されたブロスが米国特許第6551591B1号の記載に従って処理された。HP20ポリスチレン樹脂及びポリアミドCC 6 0.1〜0.3mm(Macherey−Nagel)樹脂上で逐次行われた精製ステップの後、27ml/分の流速で溶離された、次の多段階プログラム、即ち時間=0分(B相の32%)、時間=8分(B相の32%)、時間=20分(B相の36%)、時間=32分(B相の90%)を用いた、μ10粒子サイズC18 Phenomenex(Torrance CA、USA)Luna(250×12.2mm)カラム上の分取HPLCによって2つの個別の物質が純粋な形態で得られた。A相は水中の0.05%(v/v)ギ酸であり、B相はCH3CNであった。
単離された抗生物質MF−BA−1768α1及びMF−BA−1768β1のLC−MS分析が、Symmetry C18(5:m)3.9×20mm前置カラムを備えたSymmetry C18(5:m)4.6×250mm.カラム(Waters;Milford MA、USA)上(両方とも温度50℃でオーブン中に保たれた)で実施された。溶離は、次の多段階溶離プログラム、即ち時間=0分(B相30%)、時間=8分(B相30%)、時間=20分(B相45%)、時間=24分(B相90%)、及び時間=28分(B相90%)を用いて流速1ml/分で実施された。A相は、25mM HCOONH4緩衝液pH4.5:CH3CN 95:5(v/v)であり、B相はCH3CNであった。HPLC装置は、Finnigan LCQイオントラップ質量分析計(Thermoquest、Finnigan MAT、San Jose CA、USA)と連結された。カラムからの100μl/分の溶離液は、LCQ質量分析計のESIインターフェースに回された。MS分析が次の条件、即ち、試料注入口:シートガスフロー(N2)25psi(約172369Pa)、補助ガスフロー5psi(約34474Pa)、キャピラリー加熱器:210°C、試料注入口電圧極性 陽極及び陰極の両方、イオンスプレイ電圧:+/−4.75KV、キャピラリー電圧:+/−12V、走査条件:最大イオン時間50ms、フルミクロ:スキャン3で実施された。
抗生物質107891A1因子及びA2因子の1H−NMRスペクトルが、水抑制シーケンスを適用するBruker AMX 600分光計上でCD3CN:D2O(1:1)の混合物中298Kにおいて記録された。内部標準として1.94ppmにおけるアセトニトリル−d3の残留シグナルが考えられた。
A)抗生物質107891A1因子の1H−NMRスペクトルが図8に報告されている。
B)抗生物質107891A2因子のbbデカップル1H NMRスペクトルが図9に報告されている。
C)抗生物質107891A1因子の13C−NMRスペクトルが図10に示されている。CD3CN:D2O(1:1)に溶解された抗生物質107891A1因子の13C−NMRスペクトルは、CD3CNを内部標準(1.39ppm)として使用して600MHzにおいて次のシグナル群(ppmで)を示す[δ=ppm;(帰属)]:13.6〜23.03(脂肪族CH3)、25.69〜77.9(脂肪族CH2及びペプチド性CHα)、105〜137.3(芳香族及び二重結合CH及び四級炭素)、165.6〜176.6(ペプチド性カルボニル)。
D)抗生物質107891A2因子のbbデカップル13C−NMRスペクトルが図11に示されている。
A)Brukerフーリエ変換赤外分光光度計IFS 48型でKBr中で記録された抗生物質107891A1因子の赤外スペクトルは、3294;3059;2926;1661;1529;1433;1407;1287;1114;1021に(cm−1)において吸収極大を示した。赤外スペクトルは図12に報告されている。
B)Perkin−Elmer分光光度計λ16を用いてメタノール:H2O 80:20(v/v)中で記録された抗生物質107891A1因子の紫外スペクトルは、226と267nmに2つの肩を示す。紫外スペクトルは図13に報告されている。
C)Brukerフーリエ変換赤外分光光度計IFS 48型を用いてKBr中で記録された抗生物質107891A2因子の赤外スペクトルは、3296;3060;2928;1661;1529;1433;1407;1288;1116に(cm−1)において吸収極大を示す。赤外スペクトルは図14に報告されている。
D)Perkin−Elmer分光光度計λ16を用いてメタノール:H2O 80:20(v/v)中で記録された抗生物質107891A2因子の紫外スペクトルは、226と267nmに2つの肩を示す。紫外スペクトルは図15に報告されている。
抗生物質107891の抗菌活性が、米国臨床研究所規格委員会の提案(NCCLS、文書M7−A5)によるブロス微量希釈法によって測定された。
抗生物質107891をDMSO中に溶解して、1000μg/mlの原液を得、次いで水に希釈して使用液を得た。使用された培地は、Staphylococci、モラキサラカタラーリス(M.catarrhalis)、Enterococci及びリステリア菌(L.monocytogenes)用の陽イオン調整したMueller Hintonブロス(CAMHB);連鎖球菌(Streptococci)用のTodd Hewittブロス(THB);ナイセリア spp.(Neisseria spp.)用のGC培地+1% Isovitalex+1% ヘミン(haemine);インフルエンザ菌(H.influenzae)用のBrain Hearth Infusion+1% Cサプリメント(C supplement);乳酸菌(Lactobacilli)用の乳酸菌ブロス;スメグマ菌(M.smegmatis)用のMiddlebrook OADC濃縮を含むMiddlebrook 7H9;カンジダアルビカンス(C.albicans)用のRPMI 1640培地;クロストリジウム(Clostridia)用のWilkins Chalgrenブロス+オキシラーゼ(oxyrase)(1:25v/v);プロピオン酸菌属(Propionibacteria)用のシステイン(cisteine)(0.5g/L)を含むBrucellaブロスであった。バクテリアの接種原は105CFU/mlであった。C.albicansの接種原は1X104CFU/mlであった。全ての試験は、0.02%のウシ血清アルブミン(BSA)の存在下で実施された。培養物は、嫌気性雰囲気を必要とするClostridia及びPropioniobacteria菌株以外は空気中35℃でインキュベートされた。18〜24時間後、視覚による記録が行われ、MICが測定された。MICは目に見える増殖がない抗生物質のより低い濃度として定義された。
メチシリン耐性(MRSA)及びグリコペプチド中間体(GISA)耐性株を含めたStaphylococcus spp.に対するMIC範囲は、=0.13〜4μg/mlであり、最近の臨床分離株である、バンコマイシン耐性菌(VRE)を含めたEnterococcus spp.に対するMIC範囲は、0.5〜4μg/mlである。Streptococcus spp.に対しては、MICは≦0.13μg/mlである。
タイムキル(time−kill)実験においては、抗生物質107891は、S.aureus GISA及びE.faecalis VanA株に対して殺菌活性を示し、24時において殺菌濃度はMueller Hintonブロス中でMIC値である。
表VIIIは、抗生物質107891のA1及びA2因子の個々の抗菌活性を報告している。MICは、上記に記載された微量ブロス希釈法によって測定された。
23〜25gの体重の雌性ICRマウス(Harlan Italia SpA−S.Pietro al Natisone、イタリア)が、免疫応答性又は好中球減少性マウスの急性致死性感染症の実験に使用された。好中球減少症が、4日及び1日でそれぞれ200及び100mg/kgのシクロホスファミドの2種の腹腔内投与によって誘発された後、マウスが感染された。
Microbispora sp.ATCC PTA−5024株が、オートミール寒天斜面上に2〜3週間28℃で維持された。一斜面の微生物含有量が、5ml滅菌水でかき取られ、デキストロース20、酵母エキス2、大豆かす8、NaCl1、及び炭酸カルシウム4(g/l)から構成される100mlの種培地(AF/MS)を収容する500ml三角フラスコ中に接種された。培地は、蒸留水中で調製され、121℃での20分間の殺菌の前に、pHが7.3に調節された。接種されたフラスコは、28℃において200rpmで作動する回転式振とう機上で培養された。4〜6日後、この培養物の5%が、同じ発酵培地を収容する第二シリーズのフラスコ中に接種された。72時間のインキュベーションの後、200mlが3Lの同じ栄養培地を収容する4Lバイオリアクター中に移された。
Microbispora sp.ATCC PTA−5024が、グルコース10、マルトース10、ダイズ油10、ダイズ粉8、酵母エキス2及び炭酸カルシウム4g/lから構成される100mlの培養培地(G1)を収容する500ml三角フラスコ中に接種された。培地は脱イオン水中で調製され、pH調節することなく120℃×20分殺菌された。接種されたフラスコは、120〜168時間28℃において200rpmで撹拌しながら良好な増殖が観察されるまでインキュベートされた。このフラスコは次いで、実施例1に記載の通り構成された3Lの種培地AF/MSを収容する4Lバイオリアクターを接種(3%)するのに使用された。700rpmでの撹拌及び0.5vvmエアレーションを行いながらの30℃における120時間の発酵の後、1.5Lの培養物が、15Lの同じ栄養培地を収容する20Lバイオリアクターに移された。発酵は30℃において600rpmでの撹拌及び0.5vvmエアレーションを行いながら96時間実施され、次いで産生槽に移された。
実施例1に記載された発酵ブロスを、接線ろ過システム(tangential filtration system)(0.1μm細孔サイズ膜、Koch Carbo−Cor、Koch Wilmington、米国)によってろ過して170Lの上澄み及び30Lの濃縮された菌糸体を得た。抗生物質107891複合体が、ろ液(A)中及び菌糸体(B)中の両方で見出された。
(A)ろ過されたブロスは、Diaion HP−20ポリスチレン樹脂(4L)の存在下で室温において終夜撹拌された。樹脂は次いで回収され、10Lのメタノール:水 4:6(v/v)で洗浄され、バッチ式に最初に10Lのメタノール:水 9:1(v/v)で、次いで10Lのメタノール:ブタノール:水 9:1:1(v/v)で溶離された。合わされた抗生物質107891を含む溶離された画分は、回転式蒸発器で小容量に濃縮され、次いで凍結乾燥され、32gの粗材料が得られた。この粗材料がn−ブタノール(1L)中に溶解され、次いで800mlの水で逐次的に3回抽出された。有機相が減圧下で濃縮されて油状残留物になり、その油状残留物がメタノール中に溶解された。石油エーテルが添加されると、5gの粗抗生物質製剤が析出によって得られた。
(B)25Lのメタノールの添加後、菌糸体を含む残存部分が1時間撹拌され、ろ過されて45Lの菌糸体エキスが得られた。この溶液が次いで水(20L)で希釈され室温でDiaion HP−20ポリスチレン樹脂(1L)と共に室温で終夜撹拌された。樹脂が次いで回収され、2Lのメタノール:水 40:60(v/v)で洗浄されてバッチ式に逐次的に3Lのメタノール:水 85:15(v/v)で、及び次いで2Lのメタノール:水 90:10(v/v)で溶離された。溶離された画分は、抗生物質107891の存在が、Staphylococcus aureusについての寒天拡散アッセイによって、また先に報告された分析的HPLC法によって監視された。
実施例2に記載された200L槽発酵から回収されたブロスがpH6.8にされ、このブロスが接線ろ過(0.1μm細孔サイズ膜、Koch Carbo−Cor)によってろ過された。透過水(180L)がバッチ式に終夜室温で2LのDiaion HP20樹脂(三菱化学)と一緒に撹拌され、樹脂が次いで回収された。
実施例3に記載の通りに調製された粗抗生物質107891(3.6g)は、B−687グラジェントフォーマー(gradient former)、B−684フラクションコレクター(fraction collector)、B−685ガラスカラム70×460mmを備えたBuchi B−680中圧クロマトグラフィーシステム(Buchi laboratoriums−technik AG、Flawil、スイス)を使用することによって、100gの逆相C8(EC)40〜70μm粒子サイズ、60A細孔サイズ、IST(International Sorbent Technology、Mid−Glamorgan、英国)上の中圧クロマトグラフィーによって精製された。樹脂は、A相:B相 8:2(v/v)で先に調整され、次いで、60分でB相の20%から60%の60分線形勾配で25ml/分で溶離された。
抗生物質107891が、更に、B相の30%から45%の25分線形勾配溶離を用いて流速30ml/分でHibar prepacked lichrosorb RP8(7:m 粒子サイズ)カラムRT250〜25mm、Merck上の分取HPLCによって精製された。A相は、25mMギ酸アンモニウム緩衝液pH4.5:アセトニトリル 95:5(v/v)であり、B相は、アセトニトリルであった。
A1及びA2因子が、2つの異なる溶離プログラムを使用して、Symmetry Prep C18(7μm粒子サイズ)カラム7.8×300mm Waters(Mildfold、米国)上の分取HPLCによって実施例5の抗生物質107891複合体から分離され精製された。
A)A1因子は、流速3.5mlでB相の30%から45%の25分線形勾配溶離によって精製された。A相は、25mMギ酸アンモニウム緩衝液pH4.5:アセトニトリル 95:5(v/v)であり、B相は、アセトニトリルであった。精製された抗生物質107891複合体(15mg)が、350μlのDMSO:ギ酸 95:5(v/v)に溶解され、クロマトグラフ処理された。A1及びA2因子は、典型的には11〜13分の時間枠中に溶離された。溶離された画分が、次いで、上記に記載された分析的条件下でHPLCによって分析された。純粋な抗生物質107891A1因子を含む14のクロマトグラフ処理の画分が合わされ、真空下で濃縮された。残った溶液が、逐次的に3回水から凍結乾燥されて、15mgの純粋なA1因子が白色粉末として得られた。
B)A2因子が、流速7mlで100mMのギ酸アンモニウム緩衝液pH4:アセトニトリル 82.5:17.5(v/v)で定組成溶離によって精製された。精製された抗生物質107891複合体(5mg)が、250μlの酢酸:アセトニトリル:100mMギ酸アンモニウム緩衝液pH4 50:120:80(v/v)混合物中に溶解され、クロマトグラフ処理された。A1及びA2因子は、典型的には9〜10分時間枠中に溶離された。溶離された画分が、次いで、上記に記載された分析的条件下でHPLCによって分析された。純粋な抗生物質107891A2因子を含む20のクロマトグラフ処理の画分が合わされ、真空下で濃縮された。残った溶液が、水から2回凍結乾燥され、8mgの純粋なA2因子が白色粉末として得られた。
Claims (17)
- R4、R5、R6、R7、及びR8がHである、請求項1に記載の化合物又は塩。
- R1がHであり、R2がHであり、R3がHである、請求項2に記載の化合物又は塩。
- R1がHであり、R2がHであり、R3がOHである、請求項2に記載の化合物又は塩。
- R1がHであり、R2がOHであり、R3がOHである、請求項2に記載の化合物又は塩。
- R1がOHであり、R2がOHであり、R3がOHである、請求項2に記載の化合物又は塩。
- R1がOHであり、R2がHであり、R3がHである、請求項2に記載の化合物又は塩。
- R1がOHであり、R2がHであり、R3がOHである、請求項2に記載の化合物又は塩。
- Y1がS−O−、S=O、O−−S=O、及びO=S=Oからなる群から選択され、Y2、Y3、Y4、及びY5がSである、請求項1に記載の化合物又は塩。
- Y2がS−O−、S=O、O−−S=O、及びO=S=Oからなる群から選択され、Y1、Y3、Y4、及びY5がSである、請求項1に記載の化合物又は塩。
- Y3がS−O−、S=O、O−−S=O、及びO=S=Oからなる群から選択され、Y1、Y2、Y4、及びY5がSである、請求項1に記載の化合物又は塩。
- Y4がS−O−、S=O、O−−S=O、及びO=S=Oからなる群から選択され、Y1、Y2、Y3、及びY5がSである、請求項1に記載の化合物又は塩。
- Y5がS−O−、S=O、O−−S=O、及びO=S=Oからなる群から選択され、Y1、Y2、Y3、及びY4がSである、請求項1に記載の化合物又は塩。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の化合物又は塩、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 薬剤としての使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の化合物又は塩。
- 細菌性感染症の治療又は予防のための、請求項14に記載の医薬組成物。
- 動物成長促進剤として使用するための、請求項14に記載の医薬組成物。
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