HU196229B

HU196229B - Process for producing n-acylamino-glukuronyl aglykones of antibiotikum a 40926, aglycone of antibiotikum a 40926 and pharmaceutical compositions containing them as active components

Info

Publication number: HU196229B
Application number: HU865504A
Authority: HU
Inventors: Enrico Selva; Ernesto Riva; Giovanni Cassani; Francesco Parenti
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1986-12-29
Publication date: 1988-10-28
Also published as: HUT43869A; FI86307C; EP0240609B1; NZ218789A; IL81106A; MY101178A; US4868171A; IE863382L; IE59523B1; DK617286A; KR870010194A; GR3003443T3; KR960010557B1; DK617286D0; FI865320A0; KR950010461B1; PH23620A; EP0240609A3; DE3682767D1; CN86108977A

Description

A találmány tárgya: eljárás új antibiotikumok — nevezetesen az A 40926 antibiotikum AB komplex N-acilaminoglukuronil-aglikonja, az A 40926 antibiotikum A faktor N-acilaminoglukuronil-aglikonja, az A 40926 antibiotikum Bo faktor N-acilaminoglukuronil-aglikonja, az A 40926 antibiotikum Bi faktor N-acilaminoglukuronil-aglikonja, az A 40926 antibiotikum aglikonja — és ezek addiciós sói előállítására, az A 40926 antibiotikum komplexből vagy ennek valamelyik faktorából kiindulva. Az új antibiotikumok alkalmasak fertőző betegségek kezelésére, amelyek a rájuk érzékeny mikroorganizmusokkal kapcsolatosak.

Az A 40926 antibiotikum komplex és ennek faktorai Gram-pozitiv baktériumok és Neisseria törzsek ellen aktív antibiotikumok, amelyeket Actinomadura törzsek termelnek.

Az Actinomadura genushoz tartozó egyik, A 40926 antibiotikum komplexet termelő törzset 1984. június 8-án helyeztük letétbe az American Type Culture Collection-nél (ATCC, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok), a Budapesti Szerződés előírásai szerint.

Az A 40926 antibiotikumot és faktorait, az ezeket termelő mikroorganizmusokat és az előállításukra irányuló eljárást a 177882 számú, 1986. április 16-án közzétett európai szabadalmi bejelentés ismerteti. A fizikokémiat adatok alapján és ismert antibiotikumok szerkezetére való hivatkozással az A 40926 faktoroknak az (I) általános képlet tulajdonítható (a számozás analóg azzal, amelyet J. Williams a J. A. C. S. 106, 4895-4908, 1984 helyen javasol); e képletben

A jelentése N-(ll—12 szénatomos)-aci]aminoglukuronil-csoport és

B jelentése mannozil- vagy acetil-mannozil-csoport.

Közelebbről:

— az A 40926 antibiotikum A faktor olyan előbbi képletű vegyület, amelyben A jelentése undekanoilaminoglukuronil-csoport és B jelentése mannozil-csoport;

— az A 40926 antibiotikum B_o faktor olyan előbbi képletű vegyület, amelyben A jelentése izododekanoilaminoglukuronÍl-csoport és B jelentése mannözil-csoport és — az A 40926 antibiotikum Bi faktor olyan előbbi (I) általános képletű vegyület, amelyben A jelentése dodekanoilaminoglukuronil-csoport és B jelentése mannozil-csoport.

Az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor abban különbözik a megfelelő A és B faktortól, hogy bennük a mannóz-egység helyett acetil-mannóz egység van jelen.

Az A 40926 antibiotikum a komplex antibiotikumok közé tartozik; 5 komponensét különítették el, amelyeket PA, PB, A, B, és Bo faktorként azonosítottak.

Legalábbis bizonyos fermentációs körülmények között az A 40926 antibiotikumot termelő törzsek fő terméke az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor.

Az A 40926 antibiotikum A és B faktor elsősorban az A 40926 antibiotikum PA ill. PB faktor átalakulási terméke és gyakran már a fermentlében jelen van.

Azt találták, hogy az A 40926 antibiotikum PA faktor bázisos körülmények között átalakítható A 40926 antibiotikum A faktorrá, az A 40926 antibiotikum PB faktor pedig A 40926 antibiotikum B faktorrá.

Következésképp: ha egy fermentlevet vagy egy ebből előállított, A 40926 antibiotikumot tartalmazó kivonatot vagy koncentrátumot bizonyos ideig bázisos körülmények között állni hagyunk (pl. pH 9 felett, egy nukleofil bázis vizes oldatában egy éjjelen át), olyan A 40926 antibiotikum komplexet kapunk, amely A 40926 antibiotikum A és B faktorban feldúsult.

A leírásban és az igénypontokban az „A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronilaglikonjai” kifejezés az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexre és/vagy ennek egy faktorára utal, amilyen az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktor, A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon B faktor, A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon Bo faktor és az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon Bi faktor.

Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-agtikon AB komplex (nem-addíciós só alakban) a következő jellemzőket mutatja:

A) az 1. ábra szerinti UV abszorpciós spektrum, a következő abszorpciós maximumokkal:

lambda,nax (nm)

a) 0, IN HCl 282

b) pH 7,4 foszfát puffer 282, 310 (váll)

c) 0,lNKOH 302

B) a 2. ábra szerinti IR spektrum, a következő abszorpciós maximumokkal (cm^-’)·'

3700—3100; 3000—2800 (nujol); 1650; 1620— 1550; 1500; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1300; 1250—1180; 1150; 1060; 1010; 970; 930; 840; 820

C) a 3. ábra szerinti ’H—NMR spektrum, amely a következő jelcsoportokat (ppm-ben) mutatja 270 MHz-en, DMSO—d₆ (hexadeutero-dimetiíszulfoxid) és CF3COOH elegyében felvéve, belső standardként TMS-t (0,00 ppm) alkalmazva (delta, ppm):

0,84, d és t (izopropil-CH3-ek és terminális CH3);

1,14, m [(CH₂)„J; 1,44, m (—CH₂—C-CO és izopropil—CH); 2,00, t (—CH₂—CO); 2,5, s (DMSOd₅); 2,5, s (N—CH,); 2,93, m (CH, (Z2)];

3.33, m [CH, (Z’2)]; 3,20—3,80, m (cukor CH-k);

5.34, d (az acilaminogíukuronsav anomer protonja); 4,10, m (X6); 4,33, d (X5); 4,43, d (X7); 4,9, m (X2); 5,1 (4F és 26); 5,4, s (XI); 5,58, d (X4); 5,7, s (4B); 6,06, d (X3); 7,73, s (6B); 6,26—8,42, s és m (aromás CH-k és peptid NH-k); 8,70—10,5, széles s (fenolos OH-k és NH₂) d = duplett m = multiplett s = szingulett t = triplett

D) retenciós idő (R_t) 1,20 és 1,30 a teikoplanin A2 komponenshez (R, = 20,3 perc) viszonyítva, fordított fázisú HPLC-vel meghatározva, a kővetkező körülmények között:

oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer: CH₃CN 10%

NaH₂PO₄H₂O (2,5 g/1) 90% pH 6,0-ra beállítva

B eluálószer: CH₃CN 70%

NaH₂PO₄H₂O (2,5 g/1) 30% pH 6,0-ra beállítva eluálás: lineáris grádiens (5%—60% B eluálószer az A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc

UV detektor: 254 nm belső standard: teikoplanin A₂ 2 komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.)

E) sóképzésre képes savas csoportok

F) sóképzésre képes amino-csoportok

G) a maghoz nem kapcsolódik mannóz-egység.

Az A 40926 antibiotikum N-acilatninoglukuronil-aglikon A faktor (nem-só alakban) a következő jellemzőket mutatja:

A) a következő abszorpciós maximumokat tartalmazó UV abszorpciós spektrum:

lambdamax (nm)

a) O,1N HC1 282

b) pH 7,4 foszfát puffer 282; 310 (váll)

c) 0,lNKOH 302

B) a 4. ábra szerinti IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm^-1):

3700—3000; 3000—2800; 1650; 1585; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1070; 1060; 1010; 845; 820; 720 (nujol)

C) az 5. ábra szerinti *H—NMR spektrum, amely a következő jelcsoportokat mutatja (ppmben) 270 MHz-en DMSO—dé-ban (hexadeutero-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta, ppm):

0,85, t (terminális CH₃); 1,0-1,3 (alifás CH₂-ek);

1,42, m (OC—C—CH₂); 2,00, t (CO—CH₂); 2,35, s (NCH₃); 2,49, s (DMSOdj); 2,82, m (Z2);

2,8—3,8 (cukor-protonok és Z’2); 4,12, m (X6); 4,56, s (XI); 4,34, d (X5); 4,41, d (X7); 4,96, m (X2); 5,08—5,12 (4F és Z6); 5,40 (az acilaminoglukuronilsav anomer protonja); 5,58, d (X4); 5,74, s (4B); 6,05, d (X3); 7,75, s (6B); 6,25—8,40, s, d és m (aromás CH-k és peptid—NH-k).

D) retenciós idő (RJ 1,20 a teikoplanin A₂ 2 komponenshez viszonyítva, amelynek R, értéke

20,3 perc, az elemzést fordított fázisú HPLC technikával végezve a következő körülmények között: oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm előoszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer: CH₃CN 10%

NaH₂PO₄-H₂O (2,5 g/1) 90% pH 6,0-ra beállítva

B eluálószer: CH₃CN 70%

NaH₂PO4-H₂O(2,5g/l) 30% pH 6,0-ra beállítva eluálás: lineáris grádiens (5%—60% B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc

E) molekulatömeg kb. 1554, FAB—MS-sel meghatározva

F) sóképzésre képes savas funkciók

G) sóképzésre képes amino-funkció

H) a maghoz nem kapcsolódik mannóz-egység.

Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon Bo faktor (a nem-addíciós só alakban) a következő tulajdonságokkal rendelkezik:

A) UV abszorpciós spektruma a következő abszorpciós maximumokat mutatja:

lambdamw (nm)

a) 0,lNHCl 282

b) pH 7,4 foszfát puffer 282; 310 (váll)

c) 0.1NKOH 302

B) a 6. ábrán bemutatott IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm^-1);

3700—3100; 3000—2800 (nujol); 1650; 1585; 1505; 1460(nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1060; 1010; 980; 840; 820; 720 (nujol);

C) a 7. ábrán bemutatott ’H—- NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokftt (ppm-ben) mutatja 270 MHz-en, DMSO—d«-han (hexadeuterodimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta, ppm);

0,84, d (izopropil—CH₃-ek); 1,0-1,3 (alifás CH₂ek); 1,3-1,6 (OC-C—CH₂ és izopropil—CH); 2,00, t (OC-CH-); 2,32, s (NCH₃); 2,49, s (DMSOdj); 2,82, m (Z2); 2,9—3,8 (cukor protonok); 4,12, m (X6); 4,44, s (XI); 4,33, d (X5);

4.37, d (X7); 4,95, m (X2); 5,06-5.10 (4F és Z6);

5.38, d (az acilaminoglukuronilsgv anomer protonja); 5,59, d (X4); 5,72, s (4B); 6,05, d (X3); 7,74, s (6B); 6,27—8,5 (aromás és peptid NH-k)

D) retenciós idő (R<) 1,30 a teikoplanin Ας 2 komponenshez (R, = 2O,3 perc) viszonyítva, az elemzést fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve):

oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer: CH₃CN 10%

NaH₂PO₄H₂O (2,5 g/1) 90% pH 6,0-ra beállítva

B eluálószer :CH₃CN 70%

NaH₂PO₄-H₂O (2,5 g/1) 30% pH 6,0-ra beállítva eluálás: lineáris grádiens (5%—60% B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc

UV detektor: 254 nm belső standard: teikoplanin Á₂ 2 komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.)

E) molekulatömeg kb. 1568, FAB—MS-sel meghatározva

F) sóképzésre képes savas csoportok

G) sóképzésre képes amino-csoport

H) a maghoz nem kapcsolódik mannóz-egység

Az A 40926 antibiotikum bl-acilaminoglukuronil-aglikon B_t faktor molekulatömege kb. 1569, FAB—MS-sel meghatározva, és fizikokémiai tulajdonságai lényegében megegyeznek az A 40926 antibiotikum N-acilaminogiukuronil-aglikon Bo faktor előbbiekben ismertetett jellemzőivel, a következő eltérésekkel: 0,84-nél (delta, ppm) triplettel rendelkezik (amely egy n-propil-csoport metilcsoportjának tulajdonítható) az előbbiekben leírt NMR rendszerben, és retenciós ideje a teikoplanin

-31 196229 2

Αι 2 komponenséhez viszonyítva 1,32 az előbbiekben ismertetett rendszerben.

Az A 40926 antibiotikum aglikonja a következő tulajdonságokat mutatja:

A) a 8. ábra szerinti UV abszorpciós spektruma a következő Abszorpciós maximumokat mutatja:

lambdanm (nm)

a) 0,lNHCI 280

b) pH 7,4 foszfát puffer 280; 310 (váll)

c) 0,lNKOH 299

B) a 9. ábra szerinti IR abszorpciós spektruma a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm^-1):

3700—3100; 3000-2800 (nujol); 1655; 1620— 1550; 1500; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1300; 1205; 1145; 1010; 970; 930; 840

C) a 10. ábra szerinti Ή—NMR spektruma a következő jel-csoportokat (ppm-ben) mutatja 270 MHz-en DMSO—de (hexametildeutero-dímetilszulfoxid) és CFjCOOH elegyében felvéve, belső standardként (0,00 ppm) ZTMS-t alkalmazva (delta, ppm):

2,51, s (DMSO—d₅); 2,50, s (NCH₃); 2,88, m (Z2);

3,33, m (Z’2); 4,10, m (X6); 4,34, d (X5); 4,43, d (X7); 4,93, m (X2); 5,04, s (4F); 5,09, s (Z6); 5,54, d (X4); 5,75, s (4B); 6,05, d (X3); 7,76, s (6B);

6,3-8,4 (aromás és peptid NH-k)

D) retenciós idő (R₍) 0,59 a teikoplanin A₂ 2 komponenséhez (R_t = 20,3 perc) viszonyítva, fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve a meghatározást:

oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 gm) Aeluálószer: CH3CN 10%

NaH₂PO4-HíO(2,5g/l) 90% pH 6,0-ra beállítva

B eluálószer: CH3CN 70%

NaH₂PO₄· H₂O (2,5 g/1) 30% pH 6,0-ra beállítva eluálás: lineáris grádiens (5%—60% B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc

Ugyanilyen körülmények között az L 17054 antibiotikumhoz (Gruppo Lepetit S. p. A., 119575 sz. európai szabadalmi bejelentés, közzétéve 1984. szeptember 2,6-án) viszonyított retenciós idő 1,42.

E) molekulatömege kb. 1211 FAB—MS-sel meghatározva

F) sóképzésre képes savas csoportok

G) sóképzésre képes amino-csoport

H) a maghoz nem kapcsolódik mannóz-egység.

A fizikokémiai adatok alapján és az ugyanezen osztályba tartozó ismert antibiotikumok szerkezetének ismeretében az A 40926 antibiotikumnak N-acilaminoglukuronil-aglikonnak az olyan előbbi (I) általános képlet tulajdonítható, amelyben A jelentése N-(l 1—12: szénatomos)~acrlaminoglukuronil-csoport és B jelentése hidrogénatom,

Közelebbről:

— az olyan előbbi (I) általános képlet, amelyben A jelentése n-undekanoilaminoglukuronil-csoport és B jelentése hidrogénatom, az A 40926 antibioti4

IC kum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktornak tulajdonítható;

— az olyan előbbi (I) általános képlet, amelyben A jelentése izododekanoilaminoglukuronil-csoport és B jelentése hirdogénatom, az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon Bo faktornak tulajdonítható;

— az olyan előbbi (I) általános képlet, amelyben A jelentése n-dodekanoilaminoglukuronil-csoport és B jelentése hidrogénatom, az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon Bi faktornak tulajdonítható.

Ez utóbbi a találmány szerinti eljárással az A 40926 antibiotikum Bi faktorból állítható elő, amely faktor az A 40926 antibiotikum B faktor komponense; R_t értéke a teikoplanin A₂ 2 komponenshez viszonyítva 1,27 a 177882 sz. európai szabadalmi bejelentésben leírt és az alábbiakban ismertetett fordított fázisú rendszerben. Az A 4Ö926 antibiotikum B faktorból a Bo faktor (a nagyobb mennyiségben jelenlevő faktor) elkülönítése után állítható elő.

Az olyan előbbi (1) általános képlet, amelyben A és B jelentése hidrogénatom, az A 40926 antibiotikum aglikonnak tulajdonítható,

A leírásban és az igénypontokban A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon komplexről vagy ennek faktorairól vagy az A 40926 antibiotikum aglikonról mondottak magukban foglalják a „belső só” alakot, valamint az esetleges savas és bázisos addíciós sókat is.

A találmány szerinti vegyületek antibakteriális aktivitása in vitro a standard higitási próba segítségével mutatható ki, különböző mikroorganizmusok alkalmazásával.

Az MIC érték (minimális gátló koncentráció) meghatározásához alkalmazott táptalajok és tenyésztési körülmények a következők:

— ísosensitest húsleves (Oxoid) — 24 óra a Staphylococcus törzsek, a Streptococcus faecalis és a Gram-negativ baktériumok (E. coli) esetében;

— Todd—Hewitt húsleves (Difco) — 24 óra más Streptococcus törzsek esetében;

— GC alap-húsleves (Difco) + 1% Isovitalex (BBL), 48 óra, CC>2-ban dúsított atmoszféra a Neisseria gonorrhoeae esetében;

— Brain Heart húsleves (Difco) + 1% C adalék (Difco) — 48 óra a Haemophilus influenzáé esetében;

— AC leves (Difco), 24 óra, anaerob atmoszféra a Clostridium perfringens esetében;

— Wilkins-Chalgren agar (T. D. Wilkins és S, Chalgren, Antimicrob. Ag. Chemother. 10, 926, 1976), 48 óra, anaerob atmoszféra a többi anaerob (C. difficile, Propionibacterium acnes, Bacteroides fragilis) esetében;

— PPLO leves (Difco) + 10% lószérum -í- 1% glükóz, 48 óra a Myeoplasma gallisepticum esetében;

— PPLO leves adalékokkal (R. T. Evans, D. Taylor-Robinson, ,1. Antimicrob. Chemother. 4, 57), 24 óra az U. urealyticum esetében.

Az inkubálást 37 °C-on végezzük.

Az inokulumok a kővetkezők:

— 1% (térf./térf.) 48 órás leves tenyészetből a M. gallisepticum esetében;

— kb. 10⁴ szín változtató egység/ml az U. urealyticum esetében;

— kb. 10⁴—10⁵ telepképző egység/ml más leveshígításos MIC értékek esetében;

— kb. 10⁴—10’ baktérium (folt) a beoltást többpontos inokulátorral végezve (az agar-hígításos MIC értékek esetében) C. difficile, P. acnes, B. fragilis).

Az egyes mikroorganizmusokra vonatkozó néhány MIC értéket a következő I. Táblázatban tüntetünk fel.

I. Táblázat

Törzs	MIC (Ug/ml) A 40926 antibiotikum
N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex	ágiikon
1	0,13	0,13
2	0,13	0,25
3	0,13	0,13
4	0,06	0,5
5	0,13	1
6	0,13	0,5
7	0,06	0,5
8		0,25
9	0,25	1
10	0,06	l
11	16	32
12	4	16
13		32
14	128 felett	128
15	64	128 felett

A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon

	A faktor	B, Bo és B] faktor
1	0,06	0,06
2	0,13	0,13
16	0,25	0,25
3	0,06	0,06
4	0,06	0,06
5	0,06	0,06
6	0,13	0,13
7	0,06	0,06
8	0,03	0,03
12	8	8
13	32	32
14	128 felett	128 felett
17	128 felett	128 felett

1. Staph. aureus L165

2. Staph. aureus L165 (IQ⁶ telepképző egység/ml)

3. Staph. epidermidis L147 ATCC 12228 (koaguláz negatív)

4. Strep. pyogenes L49 C2O3

5. Strep. pneumoniae L44 UC41

6. Strep. faecalis L149 ATCC 7080

7. Strep. mitis L796 (klinikai izolátum)

8. Clostridium perfringens L290ISS 30543

9. Clostridium difficile L1363 ATCC 9689

10. Propionibacterium acnes L1014 ATCC 6919

11. Bacteroides fragilis L1010 ATCC 23745

12. Neisseria gonorrhoeae L997 ISM68/126

13. Haemophilus influenzáé L 970 b típus ATCC 19418

14. Escherichia coli L47 SKF 12140

15. Mycoplasma gallisepticum L431 S6 Weybridge

16. Staph. haemolyticus L602 (koaguláz negatív)

17. Ureaplasma urealyticum L 1479 (klinikai izolátum)

Azt találtuk, hogy az A 40926 antibiotikum N-acilamínoglukuronil-aglikon AB komplex és faktorai különösen aktívak koaguláz negatív Staphylococcusokkai szemben. A különböző klinikai izolátumokból származó S. epidermidis és S. haemolyticus törzsekre vonatkozó MIC értékeket (Ug/ml) a következőkben mutatjuk be:

II. Táblázat

Törzs A 40926 antibiotikum

N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex

MIC (ug/ml)

S. epidermidis L 393	0,06
S. epidermidis L 408	0,13
S. epidermidis L 410	0,06
S. haemolyticus L 381	0,25
S. haemolyticus L 382	0,13
S. haemolyticus L 383	0,5
S. haemolyticus L 403	0,25

Ezenkívül azt találtuk, hogy az A 40926 antibiotikum N-acilaminogiukuronil-aglikon AB komplex MIC*» (ug/ml) értéke — azaz az a koncentráció, amely 36 koaguláz negatív Staphylococcus klinikai izolátum közül legalább 90% növekedését gátolja — 0,5 ug/ml.

A találmány szerinti vegyületek antimikrobiális aktivitását egérben, kísérleti vérmérgezés esetében is megerősítettük.

A kontroll és a kezelt csoportok 10—10 db, 18—22 g tömegű CD—1 egeret (Charles River) tartalmaztak. Ezeket intraperitoneálisan fertőztük 0,5-0,5 ml baktérium-szuszpenzióval, amelyet úgy állítottunk elő, hogy S. pyogenes C 203 (L49) egy éjszakán át növesztett tenyészetét steril peptonizált sóoldattal hígítottuk. Az inokulumokat úgy állítottuk be, hogy a nem-kezeit állatok 48 órán be1 il elpusztuljanak a vérmérgezésben. A megvizsgálandó vegyületeket közvetlenül a fertőzés után szubkután adagoltuk be. A hetedik napon, Spearman és Kárber módszerével (D. J. Finney: Statistical Methods in Biologícal Assay, Griffin, p. 524, 1952) az egyes dózisokhoz tartozó túlélő állatok százalékos mennyisége alapján kiszámítottuk az EDjo értékeket (mg/kg-ban).

Ilyen körülmények között az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex, ill. az A 40926 antibiotikum ágiikon ED50 értéke 0,54 ill. 6,2 mg/kg.

Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronií-ágiikon AB komplex, ennek faktorai és az A 40926 antibiotikum ágiikon savas és bázisos csoportokat tartalmaz és szerves, ill. szervetlen ellenionokkal a szokásos eljárások keretében sókat képez.

Λ találmány szerinti vegyületek jellegzetes és megfelelő savaddíciós sói a szokásos reakciókkal állíthatók eíő, szerves, ill. szervetlen savakkal, amilyenek pl. a következők: sósav, hídrogénbro5 mid, kénsav, foszforsav, ecetsav, trifluorecetsav, triklórecetsav, borostyánkősav, citromsav, aszkorbinsav, tejsav, maleinsav, fumársav, palmitinsav, kólsav, pamoinsav, nyálkasav, glutaminsav, kámforsav, glutársav, glikolsav, ftálsav, borkősav, laurinsav, sztearinsav, szalicilsav, metánszulfonsav, benzolszulfonsav, szorbinsav, pikrinsav, benzoesav, fahéjsav stb.

A bázisok jellegzetes példái: alkálifém- vagy alkáliföldfém-hidroxidok (pE nátrium-, kálium-, kalcium-, magnézium-, bárjumhidroxid), ammónia és az alifás, aliciklusos vagy aromás szerves aminok (pl. metilamin, dimetilamin, trimetilamin és a pikolin).

A találmány szerinti „nem-só” vegyületek átalakítása a megfelelő addíciós sókká és viszont (azaz egy találmány szerinti vegyület addíciós sójának átalakítása a nem-só alakká) a szakember tudásához tartozik és a találmány kiterjed ezekre a műveletekre.

Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglíkon AB komplex és/vagy ennek faktorai és az A 4Ö926 antibiotikum ágiikon pl. úgy alakítható át a megfelelő sav- vagy bázis-addíciós sóvá, hogy a nem-só alakot vizes oldószerben oldjuk és kis moláris feleslegben az oldathoz adjuk a kiválasztott savat vagy bázist. A keresett só kinyerésére ezután a kapott oldatot vagy szuszpenziót liofilizáljuk.

Abban az esetben, ha a végeredményként kapott só oldhatatlan abban az oldószerben, amelyben a nem-só alak oldható, a sót szűréssel nyerjük ki a nem-só alak szerves oldószeres oldatából, a kiválasztott sav vagy bázis sztöchiometrikus mennyiségben vagy kis moláris feleslegben való hozzáadása után.

Ezekre az oldhatatlan sókra példák a kalcium-, magnézium- és a bárium-sók.

A nem-só alak úgy állítható elő, hogy á megfelelő savval vagy bázissal képezett sót vizes oldószerben oldjuk, majd az oldatot a nem-só alak felszabadítására semlegesítjük.

Ha a semlegesítést követően a sav vagy a bázis feleslegének eltávolítására van szükség, a szokásos sómentesítési eljárást alkalmazhatjuk.

Előnyösen alkalmazható pl. a szilanizált szilikagélen végzett oszlopkromatográfia; erre a célra használhatunk funkcionálisan át nem alakított polisztirolt, akril- és ellenőrzött pórusnagyságú polidextrán-gyantákat (amilyen pl. a Sephadex LH 20) is, valamint aktív szenet. Miután a nem-keresett sókat vizes oldattal eluáltuk, a keresett terméket víz és egy poláris vagy apoláris szerves oldószer elegyével (pl. 50:50 acetonitril:víz elegy — kb. 100% acetonitril) eluáljuk, lineáris grádiens vagy lépcsős grádiens alkalmazása mellett.

Mint ez a szakember számára ismert, a gyógyászati szempontból elfogadható savakkal (vagy bázisokkal) vagy a gyógyászati szempontból nem elfogadható savakkal (vagy bázisokkal) végzett sóképzés célszerű tisztítási technikaként alkalmazható. Kialakulása és elkülönítése után egy A 40926 antibiotikum só-alakja átalakítható a megfelelő nem-só alakká vagy egy gyógyászati szempontból elfogadható só-alakká.

Egyes esetekben az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex, vagy egy faktora, illetőleg az A 40926 antibiotikum ágiikon bázis-addíciós sója oldhatóbb vízben és hidrofil oldószerekben.

Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikonok és az A 40926 antibiotikum ágiikon előállítása:

Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet, az A 40926.antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktort, az A 40926 antibiotikum N-ácilaminoglukuronil-aglikon B faktort, az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon B_o faktort, az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon Bi faktort és az A 40926 antibiotikum aglikont ellenőrzött savas hidrolízissel állítjuk elő az A 40926 antibiotikum komplexből, ennek valamelyik faktorából (ezek: az A 40926 A faktor, A 40926 B faktor, A 40926 PA faktor, A 40926 PB faktor, A 40926 Bo faktor és A 40926 B, faktor) vagy eze^{1 f} ktorok tetszőleges arányú keverékéből.

Ezt a hidrolízist általában egy erős sav jelenlétében végezzük, megfelelő szerves oldószerben. A reakció hőmérséklete tág határok között változtatható: előnyösen 4 °C és 100 °C között, legelőnyösebben pedig 25 °C és 80 °C között helyezkedik el.

A reakció időtartama a konkrét reakció-körülmények függvényében változik.

A reakcióidő általában 30 perc és 120 óra közötti időtartam.

Mivel azonban a reakció lefolyása TLC-vel vagy HPLC-vel követhető, a szakember képes annak eldöntésére, hogy a kiindulási anyagok hidrolízisét mikor kell teljesnek tekinteni és mikor indítható meg a kinyerési eljárás.

Az erős savakra jellegzetes példák az ásványi és az erős szerves savak, amilyenek a hidrogénhalogenidek (pl. a hidrogénklorid, hidrogénbromid és hidrogénjodid), a foszforsavak, kénsav, halogénecetsavak (pl. a triklórecetsav, trifluorecetsav, klór-difluorecetsav) stb.

Megfelelőnek tekintjük azt a szerves oldószert, amely a következő tulajdonságokkal rendelkezik:

a) legalább részben képes oldatba vinni a kiindulási anyagokat;

b) az előállított termékek vagy kiválnak az oldószerből vagy a szokásos eljárásokkal elkülöníthetők;

c) semmiképpen sem befolyásolja kedvezőtlenül a reakció lefolyását.

Az ilyen szerves oldószerekre példák a protikus vagy aprotikus oldószerek, pl. az 1—4 szénatomos alkil-szulfoxidok (pl. a dimetil-szulfoxid és a dictilszulfoxid), az I—4 szénatomos alkil-formamidok (pl. a dimetil-formamid és a dietil-formamid), a dioxán, tetrahidrofurán és hasonló oldószerek, amelyek a kiválasztott savval kompatíbilisek.

A hidrolízist általában korlátozott mennyiségű víz (pl. a reakcióelegy 0,1—10%-ának (tömeg/tömeg/megfelHő mennyiségű víz) jelenlétében hajtjuk végre. Lz a vízmennyiség nyilvánvalóan már jelen lehet vagy a kiindulási anyagokban, az oldószerekben vagy a reagensekben, vagy szükség esetén ad hoc hozzáadható.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös változata szerint dimetil-szulfoxid/cc. sósav elegyet használunk, 40 °C és 80 °C közötti hőmérsékleten.

A dimetil-szulfoxid/cc. sósav aránya általában 8:2—9,5:0,5. Tömény sósavként kitüntetetten a 37%-os (tömeg/tömeg) sósavat alkalmazzuk.

A reakció terméke általában az N-acilaminoglukuronil-aglikon és az ágiikon elegye. A hőmérséklet ellenőrzésével és egyes esetekben a sav koncentrációja és erőssége beállításával az eljárást — legalábbis bizonyos mértékben — úgy irányíthatjuk, hogy a két főtermék — azaz az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikonok és az A 40926 antibiotikum ágiikon — közül valamelyikhez jussunk. Közelebbről: viszonylag alacsony hőmérséklet fenntartásával, a sav-keverék töménységének lehetséges csökkentésével és a reakcióidő megfelelő ellenőrzésével az N-acilaminoglukuronil-aglikonok kitermelése növelhető, míg aránylag magasabb hőmérsékleteken és hosszabb idők alatt egyedül az aglikont kapjuk.

A reakció lefolyását ebben az esetben is TLC-vel vagy előnyösen HPLC-vel követjük és a reakciót leállíthatjuk, amint a keresett anyag optimális termelését elértük, annak érdekében, hogy a további kinyerési eljárás kitermelését a maximálisra növeljük.

Ha olyan terméket kapunk, amely az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikonok és az A 40926 antibiotikum ágiikon keveréke, ez kromatográftával (így folyadék-folyadék kromatográfiával, gyorskromatográfíával, HPLC-vel = nagynyomású folyadékkromatográfiával és affinitáskróm atográfiával) választható szét.

Ha affinitáskromatográfiát alkalmazunk, egy kitüntetett adszorbens az immobilizált D-alanil-D-alanin, amelyet a 122969 sz, európai szabadalmi leírás (közzétéve 1984. október 31-én) ismertet. Különösen kitüntetett az agaróz-epszilon-aminokaproil-D-alanil-D-alanin. Az eluáló elegy vizes pufferből és egy sóoldatból áll. A pH és a só koncentráció beállítása hatására az A 4Q926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikoriJái elkülönülnek az A 40926 antibiotikum aglikontól.

A találmány további tárgya és előnyös kiviteli módja eljárás az A 40926 antibiotikum N-acilami-* noglukuronil-aglikon AB komplex vagy ennek egyik faktora túlnyomó mennyiségben való előállítására, amely abból áll, jíogy az A 40926 antibiotikum komplexet vagy ennek egyik faktorát (azaz az A 40926 antibiotikum AB komplexet, az A 40926 antibiotikum A faktort, az A 40926 antibiotikum B-faktort, az A 40926 antibiotikum B_o faktort, az A 40926 antibiotikum Bi faktort, az A 40926 antibiotikum PA faktort vagy az A 40926 antibiotikum PB faktort) ellenőrzött savas hidrolízisnek vetjük alá egy poláris aprotikus oldószer és egy erős ásványi vagy szerves sav keverékével, korlátozott (0,1—10 tömeg/tömeg%) mennyiségű víz jelenlétében, a szobahőmérséklet és 100 °C (előnyösen 40 °C és 65 °C) közötti hőmérsékleten, 3—120 órán át.

Legelőnyösebben a hidrolizáló elegy dimetilszulfoxid és 37%-os sósav 9:1—9,5:0,5 arányú elegye, a hőmérséklet 65 °C és a reakcióidő 5 óra.

Ha az N-acilaminoglukuronil-aglikonok előállításához kiindulási anyagként az A 40926 antibiotikum komplexet alkalmazzuk, olyan végterméket kapunk, amely lényegében az eredeti komplex faktorainak megfelelő keverék, míg ha egyetlen faktort — pl. az A 40926 antibiotikum A faktort vagy B faktort — alkalmazunk, egyetlen N-acilaminoglukuronil-aglikon faktort kapunk, amely az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktorral, illetőleg az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon B, Bo vagy Bi faktorral azonos.

Ha az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet kapjuk, ez ismert módon — pl. folyadék-folyadék kromatográfiával vagy előnyösen preparatív HPLC-vel — választható szét az egyes faktorokra.

Egy kitüntetett eljárás szerint fordított fázisú folyadék-kromatográfiát végzünk, előnyösen saválló acél oszlopokon, mérsékelt nyomáson (5—50 bar), vagy nagy nyomáson (100—200 bar). A szilárd fázis lehet egy szilanizált szilikagél, 2—18 (legelőnyösebben 18) szénatommal vagy fenilcsoporttal a szénhidrogén fázist «η; az eluálószer egy poláris, vízzel elegyedő (az előzőkben meghatározott) oldó- ·’ szer és egy, a gyantával kompatíbilis pH-jú (előnyösen pH 4—8) vizes puffer elegye.

Legelőnyösebben lineáris grádiens elúciót végzünk egy poláris vizoldható aprotikus oldószer — pl. acetonitril — és egy pH 4—8, előnyösen pH kb.

vizes puffer oldat elegyével. így 5%—45% közötti lineáris grádienst képezhetünk acetonitril: pH 6 foszfát puffer 70:30 arányú elegyével és acetonitril: pH 6 foszfát puffer 10:90 arányú elegyével.

A találmány egy további tárgya és kitüntetett foganatosítási módja eljárás az A 40926 antibiotikum ágiikon szelektív előállítására, amely abból áll, hogy az A 40926 antibiotikum komplexet vagy ennek egyik faktorát — azaz az A 40926 antibiotikum AB komplexet, az A 40926 antibiotikum A faktort, az A 40926 antibiotikum B faktort, az A 40926 antibiotikum PA faktort, az A 40926 antibiotikum PB faktort, az A 40926 antibiotikum Bo faktort vagy az A 40926 antibiotikum Bi faktort —, az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont vagy az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikont (az AB komplexet vagy ennek valamelyik faktorát) ellenőrzött savas hidrolízisnek vetjük alá (a) egy szerves protikus oldószer jelenlétében, amelyet a következők közül választunk ki: a reakció hőinérsékletén cseppfolyós alifás savak és alfahalogénezett alifás savak; a reakció hőmérsékletén vízzel enyhén elegyedő folyékony alifás és cikloalifás alkanolok; a reakció hőmérsékletén vízzel enyhén elegyedő folyékony fenil-helyettesített rövidszénláncú alkanolok, ahol a fenil-csoport adott esetben 1—4 szénatomos alkil-, 1—4 szénatomos alkoxi-csoportokat vagy halogénatomokat tartalmazhat helyettesítőkként; és a reakció hőmérsékletén folyékony beta-polihalogénezett rövidszénláncú alkanolok; vagy (b) egy erős sav jelenlétében, amely kompatíbilis az oldószerrel (ez lehet egy erős ásványi sav, erős szerves sav vagy hidrogén alakban egy erős savas kationcserélő gyanta) és (c) kb. 20 °C és kb. 100 °C közötti reakció-hőmérsékleten.

Ha protikus oldószerként alifás savat vagy alfahalogénezett alifás savat alkalmazunk, előnyben részesítjük az 1—5 szénatomos alifás savakat és a 2—5 szénatomos alfa-halogénezett alifás savakat,

-71 .

bár eredményesen használható bármelyik alifás sav vagy alfa-halogénezett alifás sav, amely a reakció hőmérsékletén képes a kiindulási anyagok kellő mennyiségben való feloldására.

Példák az előbbi savakra: a hangyasav, ecetsav, propionsav, vajsav, izovajsav, valeriánsav, izovaleriánsav, trimetil-ecetsav, fluor-ecetsav, klór-ecet sav, difluor-ecetsav, diklór-ecetsav, trifluor-ecetsav, triklór-ecetsav, pentafluor-propionsav, 2,2,3,

4,4,4-hexafluor-vajsav, heptafluor-vajsav stb.

A találmány egyik foganatosítási módja szerint előnyben részesített oldószerek a rövidszénláncú alifás savak — pl. az ecetsav és a propionsav —, vagy a rövidszénláncú alfa-halogénezett alifás savak — pl. a klór-ecetsav, diklór-ecetsav, triklór-ecetsav, difluor-ecetsav, klór-difluor-ecetsav, trifluor-ecetsav és pentafluor-propionsav. Ezen savas oldószerek közül azok, amelyek nagy sav-erősségűek, egyidejűleg képesek hatni oldószerként és erős savként, amely a hidrolitíkus reakciót elősegíti, igy nincs szükség egy erős sav további hozzáadására a hidrolízis-reakció elősegítésére. Erre a célra különösen hasznosnak bizonyul a trifluor-ecetsav, 75—95% közötti koncentrációban és 60 °C—90 °C közötti hőmérsékleten alkalmazva, mi mellett a reakció időtartama 0,5—8 óra között változik.

A leginkább kitüntetett foganatosítási mód szerint 5—10 szénatomos primer és szekunder alkanolokat és szekunder cikloalkanolokat alkalmazunk célszerűen a reakcióelegy oldószeréiként ennek az ellenőrzött savas hidrolízisnek a lefolytatására. Példák az ilyen alkanolokra: 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol,

3,3-dimetil-l-butanol, 4-metil-l-pentanol, 3-metil-1-pentanol, 2,2-dimetil-3-pentanol, 2,4-dimetil-3-pentanol, 4,4-dimetil-2-pentanol, 5-metil-2-hexanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 5-metil-l-hexanol, 2-etil-l-hexanol, 2-metil-3-hexanol, 1-oktanol, 2-oktanol, ciklopentanol, 2-ciklopentiI-etanol, 3-ciklopentil-l-propanol, ciklohexanol, cikloheptanol, ciklooktanol, 2,3-dimetil-ciklohexanol, 4-etil-ciklohexanol, ciklooktil-metanol, 6-metil-5-hepten-2-ol, 1-nonanol, 2-nonanol, 1-dekanol, 2-dekanol és 3-dekanol.

A fenilcsoporttal helyettesített rövidszénláncú alkanolokra példák a következők: benzilalkohol, m-klór-benzilalkohol, o-fluor-benzilalkohol, m-fluor-benzilalkohol, p-fluor-benzilalkohol, m-metil-benzilalkohol, m-metoxi-benzilalkohol, o-etoxi-benzilalkohol, m-butoxi-benzilalkohol, p-terc. butoxi-benzilalkohol, p-terc.-butil-benzilalkohol, fenetilalkohol, e-klór-fenetilalkohol, m-klór-fenetilalkohol, o-metoxi-fenetilalkohol, m-metoxi-fenetilalkoliol, o-propil-fenetilalkohol, e-etoxi-fenetilalkohol, p-fluor-fenetilalkohol, p-bróm-fenetilalkohol, o-propoxi-fenetilalkohol, o-butoxi-fenetilalkohol, l-(p-izopropil-fenil)-etanol, 3-fenil-l-propanol, 2-fenil-l-propanol, 4-fenil-l-butanol és

3-fenil-l-butanol.

Ha a szerves protikus oldószert a beta-polihalogénezett rövidszénláncú alkanolok közül választjuk ki, amelyek a reakció hőmérsékletén folyékonyak, előnyben részesítjük az 1—4 szénatomos beta-klór- és/vagy -fluor-alkanolokat. Példák az ilyen beta-polihalogénezett rövidszénláncú alkanolokra: a diklór-etanol, triklór-etanol, diklór-fluoretanol, difluor-klór-etanol, difluor-etanol, tritlu8 or-étanol, l,I,l,3,3,3-hexafluor-2-propanöl, 2,2,

3,4,4,4-hexafluor-butanol és a 2,2,3,3,4,4,4-heptafluor-butanoí.

Az A 40926 antibiotikum ágiikon előállítására előnyben részesített hidrolízis-körülmények a következők: az ellenőrzött hidrolízist egy poláris aprotikus oldószer és egy erős ásványi vagy szerves sav keverékével végezzük, korlátozott mennyiségű (0,1—10 tömeg/tömeg%) víz jelenlétében, 40 °C és 100 °C — előnyösen 65 °C és 90 °C — közötti hőmérsékleten, 1—4 óra időtartamon át.

Legelőnyösebben a következő körülményeket alkalmazhatjuk: a hidrolizáló elegy dimetil-szulfoxid és 37%-os sósav 8:2—9,5:0,5 arányú elegye; a hőmérséklet kb. 80 °C; a reakcióidő kb. 3 óra.

Mint az előbbiekben erre utaltunk, ilyen körülmények között az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikonja és az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon (az AB komplex vagy ennek valamelyik faktora) — amelyek az A 40926 antibiotikum komplex (vagy ennek egyik faktora vagy az ilyen faktorok keveréke) cukor-maradékai részleges hidrolízisének termékei — ugyancsak átalakulnak A 40926 antibiotikum aglikonná.

Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex, ennek egyes faktorai (A, B, Bo és Bj) és az A 40926 antibiotikum ágiikon aktív Gram-pozitív baktériumokkal szemben, amelyek számos, széles körben elterjedt fertőző betegségért felelősek. Mivel ezekre a patogénekre fokozódó rezisztencia jellemző a szokásos gyógyászati kezelésekkel szemben, még mindig nagy szükség van arra, hogy új antibiotikumokat állítsunk elő.

Az antibakteriális kezeléshez az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex, ennek valamelyik faktora és/vagy az A 40926 antibiotikum ágiikon, valamint ezeknek vagy keverékeiknek nem-toxikus, gyógyászati szempontból elfogadható sói különböző módokon — pl. helyileg vagy parenterálisan — adagolhatók be. Általában 'előnyben részesítjük a parenterális beviteli módot.

Az injekciós készítmények olajos vagy vizes hordozókkal elkészített szuszpenziók, oldatok vagy emulziók, és hatásfokozókat tartalmazhatnak, amilyenek a szuszpendáló, stabilizáló és/vagy diszpergáló szerek. ¹

Egy másik megoldás szerint az aktív komponens poralakú lehet, amely az adagolás időpontjában szolgáltatja a kívánt oldatot egy megfelelő vivőanyag, pl. steril víz hozzáadásakor.

A beviteli módtól függően ezek a vegyületek különböző adagolási formákban készíthetők ki.

Egyes esetekben a találmány szerinti vegyületek enterális bevonattal rendelkező adagolási alakban készíthetők ki, Orális bevitel céljából, amint ez a szakember számára ismeretes (1. pl.: Remington’s Pharmaceulieal Sciences, 15. kiadás, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok, p. 1614).

Erre kük nősen abban az esetben lehet szükség, ha főként az enterális szakaszban kívánatos az antimikrobiális anyag abszorpciója, tehát annak elváltozás nélkül kell áthaladnia a gyomor-szakaszon.

A beviendő aktív komponens mennyisége különböző tényezőktől függ, amilyen a kezelésre szoruló

196 229 beteg tömege és állapota, a bevitel módja és gyakorisága és a szóbanforgó betegségkiváltó ok.

A találmány szerinti antibiotikumok, nevezetesen az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon és az A 40926 antibiotikum ágiikon, valamint ezek fiziológiailag elfogadható sói általában hatékonyak kb. 0,5—50 mg aktív komponens/testtömeg-kg napi bevitele mellett; ezt a mennyiséget tetszőlegesen osztjuk szét, napi 1—4 adagra.

Különösen előnyösen olyan adagolási egységalakban készíthetjük ki a készítményeket, amelyek kb. 100—kb. 5000 mg/egység hatóanyagot tartalmaznak.

Különböző mechanizmusok és módszerek alapulvételével késleltetett hatású készítmények állíthatók elő, amint ez a szakember számára ismert.

Egy kitüntetett eljárás olyan késleltetett hatású készítmény előállítására, amely A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikont vagy A 40926 antibiotikum aglikont tartalmaz, abból áll, hogy ennek az antibiotikumnak egy vízoldhatatlan alakját alkalmazzuk, vizes vagy olajos közegben szuszpendálva.

Gyógyszerkészítmények előállítása

Intramuszkuláris injekció céljára szolgáló egységadagolási alakot állítunk elő 5 ml steril szuszpenzióval (USP) — ez 8% propilénglikolt tartalmaz — és 500 mg fiziológiailag elfogadható bázis-addíciós sóval, amelyet az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexből állítottunk elő.

Intramuszkuláris injekció céljára szolgáló egységadagolási alakot állítunk elő 5 ml steril szuszpenzióval (USP) — ez 8% propilénglikolt tartalmaz — és 500 mg fiziológiailag elfogadható bázis-addíciós sóval, amelyet az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktorból állítottunk elő.

Intramuszkuláris injekció céljára szolgáló egységadagolási alakot állítunk elő 5 ml steril szuszpenzióval (USP) — ez 8% propilénglikolt tartalmaz — és 500 mg bázis-addíciós, fiziológiailag elfogadható sóval, amelyet az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon B faktorból állítottunk elő.

Intramuszkuláris injekció céljára szolgáló egységadagolási alakot állítunk elő 1,000 mg A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon keverékkel, amelyet vízben nem oldható alakban 5 ml steril vízben (pro inj.) szuszpendáltunk.

Továbbá: a találmány szerinti antibiotikumok felhasználhatók a Clostridium difficile növekedésének elnyomására, amely a bélrendszerben pszeudomembrán-kolitiszt okoz. Ezek az antibiotikumok alkalmazhatók voltak a pszeudomembrán-kolitisz kezelésében az antibiotikumok vagy ezek gyógyászati szempontból elfogadható sói hatékony adagjának orális bevitele segítségével, miután a hatóanyagot gyógyászati szempontból elfogadható adagolási alakban kikészítettük. Ilyen alkalmazás esetén az antibiotikumok zselatin kapszulában vagy folyékony szuszpenzió alakjában vihetők be.

Gyógyszerként való aktivitásuk mellett az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikonjai és az A 40926 antibiotikum ágiikon, valamint ezek gyógyászati szempontból elfogadható sói felhasználhatók az állati növekedés elősegítésére.

Erre a célra a találmány szerinti vegyületeket orálisan, megfelelő takarmányban adagoljuk be. Az alkalmazott pontos koncentráció azonos azzal, amely ahhoz szükséges, hogy az aktív komponenst a növekedést elősegítő hatásos mennyiségben biztosítsa normál mennyiségű takarmány elfogyasztása mellett.

A találmány szerinti aktív vegyületnek az állattakarmányhoz való hozzáadását előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy megfelelő takarmány-premixet készítünk elő, amely az aktív vegyületet hatásos mennyiségben tartalmazza, és a premixet belekeverjük a teljes takarmányadagba.

Égy másik megoldás szerint egy közti koncentrátum vagy takarmányadalék — amely az aktív komponenst tartalmazza — keverhető össze a takarmánnyal.

A takarmány-premixek és a teljes takarmányok előállítási és beviteli módja kézikönyvekben található leírva, amilyenek pl. a következők: W. H. Freedman & Co., Applied Animál Nutrition, San Francisco, Amerikai Egyesült Államok, 1969, vagy Livestock Fecds and Feeding, O & B books, Corvallis, Oregon, Amerikai Egyesült Államok, 1977. Ezeket, a hivatkozás révén, a leírás részeivé tesszük.

Az A 40926 kiindulási anyagok leírása és előállítása

Az A 40926 antibiotikum komplex, az A 40926 antibiotikum A faktor, B faktor, Bo faktor, PA faktor vagy PB faktor előállítása úgy történik, hogy egy annak termelésére képes Actinomadura sp. törzset — azaz az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzset vagy ennek egy A 40926 antibiotiku- . mot termelő variánsát vagy mutánsát — aerob körülmények között vizes táptalajban (amely asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat és szervetlen sókat tartalmaz) tenyésztjük. A fermentációs iparban rendszerint alkalmazott táptalajok közül sok felhasználható, egyes táptalajokat azonban előnyben részesítünk. Kitüntetett szénforrás a glükóz, mannóz, galaktóz, keményítő, kukoricaliszt stb. Kitüntetett nitrogénforrás az ammónia, a nitrátok, szójaliszt, pepton, húskivonat, élesztőkivonat, inpton, aminosavak stb. A táptalajban alkalmazható szervetlen sók azonosak azokkal a szokásosan alkalmazott oldható sókkal, amelyek képesek nátrium, kálium, vas, cink, kobalt, magnézium, kalcium, ammónium, klorid, karbonát, szulfát, foszfát, nitrát stb. ionok biztosítására.

Áz antibiotikum-termelő törzset rendszerint rátólombikban előtenyésztjük, majd a tenyészetet üvegfermentorok beoltására használjuk fel, jelenősebb mennyiségű antibiotikum előállítására. Az elő-tenyésztéshez alkalmazott táptalaj azonos lehet azzal, amelyet a nagyobb méretű fermentációkhoz használunk, de más táptalajok szintén felhasználhatók. Az A 40926 antibiotikumot termelő törzs 20 ’C és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 24 C és 35 °C között tenyészthető. Á fermentáció alatt az antibiotikum termelést oly módon követhetjük, hogy pl. biológiai vizsgálatokkal vagy vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) vagy nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) rnegha9

-91 196229 tározzuk a fermentlé-minták vagy a micélium kivonat minták antibiotikus aktivitását.

Vizsgálati organizmusként az A 40926 antibiotikumokra érzékeny organizmusokat használhatunk fel, amilyen a Bacillus subtilis és a Streptococcus aureus. A biológiai meghatározást előnyösen agardiffúziós módszerrel végezzük, agar lemezeken. A maximális antibiotikum termelés általában a fermentáció 2. és 5. napja között következik be.

Az A 40926 antibiotikumot az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzs — vagy ennek egy A 40926 antibiotikumot termelő mutánsa vagy variánsa — tenyésztésével állítjuk elő. Az antibiotikum főtömegében a fermentlében van jelen.

Az A 40926 antibiotikumot termelő Actinomadura sp. ATCC 39727 törzs jellemzését a következőkben adjuk meg:

Makroszkópos és mikroszkópos vizsgálat

A vegetatív micélium hajlékony, elágazó hifákból áll (átmérő kb. 0,8 pm), amely egyes táptalajokon — ezeket a III. Táblázatban csillaggal jelöljük — többnapi növekedés után enyhe tendenciát mutat a pálcaalakú elemekké való fragmentálásra, míg glükóz-aszparagin táptalajon kokkoid elemekké fragmentál.

Erre a törzsre egyes táptalajokon a vegetatív micélium borvörös színe jellemző.

Légmicélium csak néhány táptalajon van jelen. Közelebbről: a III. Táblázatban feltüntetettek közül csak zabliszt agaron és talaj agaron képződik. Ezeken a táptalajokon a légmicélium fehéres-szürke és spórahordozókat képez — amelyek sarló alakban rendeződnek el —, valamint rövid, kb. 10—20 spórából álló spirálokat.

A spórák hengeresek és átlagos méretük 0,8 x 1,2 pm.

A növekedési jellemzők meghatározása

A tenyésztési jellemzők meghatározásához az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzset különböző, Shirling és Gottlieb által javasolt standard táptalajokon tenyésztjük (Ε. B. Shirling, D. Gottlieb, Method fór characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313—340, 1966), és ezek mellett néhány, Waksman által ajánlott táptalajt is felhasználunk (S. A. Waksman, The Actonomycetes. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Vol. 2, 328—334.).

A színmeghatározást, ha ez szükségesnek bizonyult, Maerz és Paul módszerének alkalmazásával végeztük (A. Maerz, M. Reá Paul, A Dictionary of Color, 2^nd ed., McGraw-Hill Book Company Inc., New York, 1950).

Az organizmus különböző szénforrások hasznosítására irányuló képességét a Shirling és Gottlieb által leírt módszerrel határoztuk még.

A tenyésztési és fiziológiai jellemzőket, valamint a szénforrás hasznosítást a III., IV. és V. Táblázatban mutatjuk be.

A III. Táblázat elkészítéséhez a leolvasásokat 2 hetes, 28 °C-on végzett tenyésztés után hajtottuk végre.

III. Táblázat

Az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzs tenyésztési jellemzői

Táptalaj

2. sz. táptalaj (élesztőkivonat-maláta agar)

3. sz. táptalaj ¹⁰ (zabliszt agar)

4. sz. táptalaj (szervetlen só-keményítő agar)

5. sz. táptalaj (glicerin-aszparagin agar)

6. sz. táptalaj* (pepton-élesztőkivonat vas agar)

7. sz. táptalaj* (tirozin agar)

Zabliszt agar*

Hickey—Tresner agar*

Czapek-f. glükóz 35 agar

Glükóz-aszparagin agar*

Tápagar

Burgonyás agar* Bennet-f. agar*

Kalcium-malát agar

Lefölözött tej-agar

Czapek-f. szacharóz agar

Tojásalbumin agar*

Sabouraud-f agar 60 Talaj agar

Dextróz-tripton agar*

Burgonyaszelet

Jellemzők bőséges növekedés, kérges felülettel, nyomokban borostyánszínű-rózsaszínű oldható pigment (8/L/8) bőséges növekedés, sima felület, ibolyaszínű (55/ E/4), nagyon gyér szürke légmicélium, lila oldható pigment (55/H/4) mérsékelt növekedés, nagyon sima és vékony felszín, krémszínű (10/D/2) mérsékelt növekedés, sima és vékony felszín (10/B/2), sárgabarack mérsékelt növekedés, enyhén kérges felület, borostyánszínű (12/D/9) bőséges növekedés, sima és vékony felszín, borostyánszínű-barna (13/K/12) intenzív növekedés, sima felszín, borvőrös (8/L/7); légmicélium mérsékelten világos-sárgásszürke (44/ B/2) intenzív növekedés, ráncos felület, borostyánszínűbarna (13/K/12) mérsékelt növekedés, sima felület, világossárga (9/1/3) gyér növekedés, krémszínű felszín, szalmasárga (9/E/l) intenzív növekedés, ráncos felület, világossárga (11/ C/7) intenzív növekedés, ráncos felület, borvörös (8/L/9) intenzív növekedés, kérges felület, borvörös (8/L/9); mély borostyán-rózsaszínű oldható pigment (5/J/10) mérsékelt növekedés, sima felszín, sárgabarack (10/ E/3) intenzív növekedés, enyhén ráncos felület, narancs (9/B/9) intenzív növekedés, sima felület, sárgabarack (10/ B/6) intenzív növekedés, sima felület, rózsaszínű oldható pigment nyomok (52/B/3) nincs növekedés gyér növekedés, színtelen; fehéres-sárga légmicélium mérsékelt növekedés, sima és vékony felület, világossárga (10/C/2) intenzív növekedés, narancs-barna ; nyom okban fehéres-szürke légmicélium

-101

Az Actinomadura törzs sp. ATCC 39727 törzs tenyésztési jellemzői (folytatás)

IV. Táblázat Fiziológiai jellemzők

Vizsgálat keményítő-hidrolízis H2S képződés tirozin-reakció kazein-hidrolízis kalcium-malát hidrolízis zselatin-folyósítás lakmusz-tej koagulálás peptonizálás cellulóz-bontás nitrát-redukció

Eredmények negatív a 6, sz. táptalajon negatív, ólomacetátos szalagokon pozitív pozitív pozitív negatív pozitív negatív pozitív negatív pozitív

V. Táblázat Szén forrás-hasznosítás

Szénforrás arabinóz xilóz mannóz fruktóz raf finóz ramnóz glukóz laktóz galaktóz inozit szacharóz cellulóz szalicin mannit ribóz ⁺ = növekedés észlelhető ~ = nincs növekedés

Növekedés +

+ +

+

Kemotaxonómiai jellemzés

Sejtfal elemzés

A sejtfalban jelenlevő aminosavak elemzését Becker és munkatársai módszereivel végeztük (Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates. Appl. Microbiol. 12, 421—423, 1964).

A teljes sejt-hidrolizátum elemzése mezo-diaminopimelinsav jelenlétére mutat.

A Kawamoto és munkatársai módszereivel (I. Kawamoto, T. Oka, T. Mara: Cell-wall composition of Micromonospora olivoasterospora, Micromonospora sagamiensis and related organisms, J. Bact. 146, 527—534, 1981) előállított tiszta sejtfal elemzése glicin távollétére mutat.

Cukorelemzés

A cukortartalom meghatározását Μ. P. Lechevalier módszere szerint végeztük (Identification of aerobic Actinomycetes of clinical importance, J. Láb. Clin. Med. 71, 934—944, 1968), vékonyrétegkromatográfiás lemezek alkalmazásával, a J. L.

Staneck és G. D. Roberts által leírt módon (Simplified approach to identification of aerobic Actinomycetes by thin-layer chromatography, 28, 226— 231, 1974), a következő oldószer-rendszer al₅ kalmazásával (térf./tcrf.): etilacetát:piridin:víz 100:35:25.

A kapott eredmények arra mutatnak, hogy főleg glükóz és ribóz van jelen, és kisebb mennyiségben ugyancsak kimutatható a galaktóz, mannóz és a maduróz.

Mikolsavak

A mikolsavak jelenlétének kimutatására irányuló vizsgálatokat Minnikin és munkatársai (D. E. Minnikin, L. Alshamaony, M. Goodfellow: Diffe¹⁵ rentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin layer chromatography analysis of whole organism methanolysates, J. Gén. Microbiol. 88, 200—204, 1975) módszere szerint hajtottuk végre.

A vizsgálat eredménye negatív: mikolsavak nem találhatók.

A törzs azonosítása

A törzset az „Actinomycetes, Actinomadura ge25 nus” rendszertani helyre soroljuk be a következő ismérvek alapján: jelen van a mezo-diaminopimelinsav és a maduróz, nincs jelen a peptidoglikánban a glicin, hiányzik a mikolsav és mérsékelten hosszú spóraláncokat hordozó légmicélium képző30 ^dikMás mikroorganizmusokhoz hasonlóan az A 40926 antibiotikumot termelő törzs jellemzői is változásoknak vannak kitéve. Például előállíthatjuk a törzs mesterséges variánsait és mutánsait, kü35 lönböző ismert mutagénekkel (pl. UV-besugárzással, röntgensugárzással, nagyfrekvenciájú hullámokkal, radioaktív sugárzással), vegyi anyagokkal (pl. salétromsavval, N-metil-N' -nitro-N-nitrozo-guanidinnel) és más módon való kezeléssel. Vala₄θ mennyi természetes és mesterséges variánst és mutánst, amely az Actinomadura genus speciesei közé tartozik és A 40926 antibiotikumot termel, az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzzsel egyenértékűnek tekintünk, ₄₅ A találmány szerinti antibiotikumoknak a termelő mikroorganizmus fermentlevéből való kinyerését ismert módon végezzük. Ezek a módszerek a következőket foglalják magukban: oldószeres extrakció, kicsapás nem-oldószerek hozzáadásával vagy az oldat pH-jának változtatásával, megosztá^bU sós kromatográfia, fordított fázisú megosztásos kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, affinitáskromatográfia stb.

Kitüntetett eljárás a rögzített D-alanil-D-alaninon végzett affinitáskromatográfia, amelyet fordí⁵⁵ tott fázisú oszlopkromatográfia követ.

A találmány szerinti kinyerési eljárás szempontjából megfelelő rögzített D-alanil-D-alanin mátrixokat ismertet a 112555 sz. európai szabadalmi bejelentés. A találmány szerinti eljárás vonatkozásá⁶⁰ bán a kitüntetett mátrix a meghatározott pórusméretű keresztkötéses polidextránnal összekapcsolt D-alanil-D-alanin.

A fermentlé közvetlenül szűrés után vagy előzetes tisztítási eljárás után vethető alá affinitáskro^fab matográfiának. Az utóbbi esetben a teljes fermentlevet meglúgosítjuk — a pH-t előnyösen 8,5 és 10,5

Π

-111 közé állítjuk be — a micéliumon adszorbeálódott antibiotikum oldatba vitelére, majd a fermentlevet szűrjük. A tiszta szűrlet pH-ját 2,5—4,5-re állítjuk be és ismét szűrjük, szűrést elősegítő anyag jelenlétében. A szűrletet elvetjük, a kinyert szűrőlepényt pedig vízben szuszpendáljuk, a pH-t lúgosra — előnyösen 8 és 9 közé — állítjuk be, majd a szuszpenziót szűrjük. A szűrőlepényt ugyanilyen módon kezeljük, az A 40926 antibiotikumot tartalmazó szűrleteket pedig összegyűjtjük.

Ezeket a szűrleteket vagy a szűrt fermentleveket ezután rögzített D-alanil-D-alaninon — oszlopban vagy szakaszosan — affinitáskromatográfiának vetjük alá.

Az A 40926 antibiotikumnak az affinitást mutató mátrixhoz való kötését előnyösen kb. 7,0—8,0 pH-η végezzük és az eluálást magasabb pH értékeken (előnyösen 9,0 és 10,5 között) hajtjuk végre, vizes bázis segítségével. Ez a vizes bázis lehet ammónia, egy illékony amin, egy alkáli-fém- vagy alkáliföldfém-hidroxid vagy lúgos pufferoldat, adott esetben egy poláris szerves oldószer — pl. a következőkben meghatározott poláris, vízzel elegyedő oldószer — jelenlétében.

A szennyezéseket úgy távolítjuk el, hogy az oszlopot pH 4—8 vizes pufferrel öblítjük át, amely adott esetben sókat, karbamidot és/vagy vízzel elegyedő oldószereket tartalmaz. Ezután az A 40926 antibiotikumot az előbbi eluáló szerekkel eluáljuk. A nyers antibiotikumot előnyösen úgy nyerjük ki, hogy az egyesített, antibiotikumot tartalmazó frakciókból a vizet egy szerves oldószerrel — amely vízzel minimális azeotróp keverékek képzésére képes — végzett azeotróp desztillációval eltávolítjuk, majd a keresett termék kicsapására egy nem-oldószert adagolunk.

A következőket jelöljük meg olyan oldószerek jellegzetes példáiként, amelyek vízzel minimális azeotróp elegyeket képesek alkotni: n-butanol, benzol, toluol, butiléter, széntetraklorid, kloroform, cikloh^án, 2,5-dimetil-furán, hexán és xiIol. Az előnyben részesített oldószer az n-butanol.

Példák a nem-oldószerekre: petroléter, rövidszénláncú alkil-éterek (pl. etiléter, propiléter és butiléter) és rővidszénláncú alkil-ketonok, pl. aceton.

Egy másik megoldás szerint az egyesített, antibiotikumot tartalmazó frakciókat kis térfogatra töményítjűk be — előnyösen egy, az előbbiekben meghatározott szerves oldószerrel végzett azeotróp desztiííáció segítségével — és á kapott vizes oldatot liofilizáljuk.

Ha az eluáláshoz alkalmazott vizes bázis nem illékony, kicsapás vagy fagyasztva-szárítás előtt szükségessé válhat a semlegesítés és a koncentrátum sómentesítése.

Egy egyszerű sómentesítési eljárás szerint az antibiotikumot tartalmazó vizes oldatot szilanizált szilikagél oszlopra visszük fel, az oszlopot desztillált vízzel mossuk és poláris, vízzel elegyedő oldószer és víz elegyével eluáljuk.

A poláris, vízzel elegyedő oldószerek jellegzetes példái: vízben oldódó alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, rővidszénláncú alkánkarbonsavak rővidszénláncú alkilészterei (pl. etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán, dimetil-formamid és ezek elegyei. A kitüntetett poláris, vízzel elegyedő oldószer az acetonitril.

Egy másik megoldás szerint a sómentesítést úgy hajthatjuk végre, hogy az antibiotikumot tartalmazó oldatot felvisszük az előbbiekben ismertetett affinitás-oszlopra, ezt desztillált vízzel mossuk és egy illékony vizes bázissal eluálunk, amint ezt az affinitáskromatográfiával kapcsolatos eluáció esetére az előbbiekben leírtuk.

Az így kapott termék az A 40926 antibiotikum komplex. Ezt szükség esetén tovább tisztíthatjuk vagy megosztásnak vethetjük alá az A, B, B_o, PA és PB faktor előállítására.

Célszerű eljárást jelent a tiszta A 40926 antibiotikum komplex előállítására az előbbi módon kapott komplex további tisztítása affinitáskromatográfiás oszlopon. Általában az előbb említett stacionárius fázist (D-alanil-D-alanin) alkalmazzuk és a keresett antibiotikumot úgy eluáljuk, hogy az előbbiekben ismertetett, a rögzített D-alanil-D-alanin felhasználásán alapuló affinitáskromatográfiás eljárást követjük. *

Kitüntetett rögzített D-alanil-D-alanin a Sepharose-epszilon-aminokaproil-D-aíanil-D-alanin; puffer-elegyként előnyben részesítjük a pH 7—8-ra beállított, NaCl-ra nézve 2M 0,16%-os (tömeg/ térf.) ammóniát. Előnyben részesítjük, továbbá a következő oldatok alkalmazását: átöblítő oldatként pH 8—9,5-re beállított, Na—Cl-ra nézve 2M 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia-oldat; eluáló elegyként pH 10,5—12-re beállított, NaCl-ra nézve 2M 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia, mimellett a leginkább kitüntetett eluáló-elegy az előbbi Összetételű oldat, pH 11,5-re beállítva.

Az A 40926 antibiotikum faktorokat — nevezetesen az A 40926 antibiotikum A faktort, az A 40926 antibiotikum B faktort, az A 40926 antibiotikum Bo faktort, az A 40926 antibiotikum PA faktort és az A 40926 antibiotikum PB faktort — az A 40926 antibiotikum komplex vizes oldatából oszlopkromatográfiával, előnyösen fordított fázisú oszlopkromatográfiával különítjük el. A fordított fázisú oszlopkromatográfia esetében a kitüntetett stacionárius fázis a szilanizált szilikagél. Jó eredményeket kapunk abban az esetben is, ha az oszlopkromatográfiát eredeti (funkcionálisan nem átalakított) polisztirol és akrilsav gyantákon hajtjuk, végre. A kereskedelemben ezek a következő neveken szerezhetők be: Amberlite XAD—2, XAD—4, XAD—7 és XAD—8 (Rohm és Haas), vagy Diaion HP 20 (Mitsubishi).

Abban az esetben, ha a fordított fázisú tisztítási lépést stacionárius fázisként szilanizált szilikagélen hajtjuk végre, az oszlopot — egy előnyös megoldás szerint — előzetesen egy pH 4—9 vizes púfferoldattal, előnyösen pH 5,5—6,5 puffer-oldattal hozzuk egyensúlyba, majd egy poláris, vízzel elegyedő oldószerrel (lineáris grádiens képzésével ugyanebben a pufferoldatban) eluáljuk. Jellemző példák a poláris, vizzel elegyedő oldószerekre: vizoldható alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, tetrahidrofurán, dioxán és dimetil-f frmamid, illetőleg ezek elegyei. A kitüntetett poláris, vízzel elegyedő oldószer azeacetonitril.

Az eluált frakciók antibiotikum-tartalmát a szokásos biológiai vizsgálatok segítségével — amilyen a papírkorongos vagy az agardiffúziós elemzés — határozzuk meg, valamely érzékeny mikroorganiz-121 mussal. Az érzékeny mikroorganizmusok közétartozik a Bacillus subtilis és a Streptococcus aureus.

A kromatográfiás eljárás lefolyása előnyösen követhető TLC vagy HPLC technikákkal is.

Kitüntetett HPLC technikát képvisel az olyan fordított fázisú HPLC, amelynek során porózus, gömbalakú szílanizált szilikagél részecskéket használunk fel az oszlop megtöltésére. Ezt ez eljárást az előbbiekben ismertettük, a HPLC eljárásnak az A 40926 antibiotikumok elemzésére való felhasználása tárgyalásakor.

A hasonló antibiotikus aktivitást mutató frakciókat összeöntiük és az előbbiekben leírt módon sómentesítjük. így lényegében tiszta A 40926 antibiotikum A, B, Bo, PA és PB faktorhoz jutunk.

A lényegében tiszta A 40926 antibiotikum A faktort, A 40926 antibiotikum B faktort, A 40926 antibiotikum tio faktort, A 40926 antibiotikum PA faktort és A 40926 antibiotikum PB faktort az ezeket tartalmazó frakciókból számos ismert eljárással nyerhetjük ki, amilyen pl. a liofilizálás, kicsapás nem-oldószerekkel vagy kicsapás a vizes oldat pH-jának megváltoztatásával.

Egy kitüntetett eljárás abból áll, hogy olyan oldószert adagolunk, amely képes vízzel azeotróp elegyeket képezni, azeotróp desztillációval eltávolítjuk a vizet, majd egy —· pl. az előbbiekben ismertetett — nem-oldószert adunk a maradékhoz és a képződött csapadékot szűréssel összegyűjtjük.

Legalábbis bizonyos fermentációs körülmények között az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor az A 40926-ot termelő mikroorganizmus fő antibiotikum terméke.

Az A 40926 antibiotikum A és B faktor főként az A 40926 antibiotikum PA, illetőleg PB faktor átalakulási terméke és gyakran már a fermentlében jelen van.

Azt találtuk, hogy az A 40926 antibiotikum PA faktor átalakítható az A 40926 antibiotikum A faktorrá, az A 40926 antibiotikum PB faktor pedig A 40926 antibiotikum B faktorrá, bázisos körülmények alkalmazásával. Az A 40926 antibiotikum PA faktor és az A 40926 antibiotikum PB faktor A 40926 antibiotikum A faktorrá, illetőleg B faktorrá alakítható át pl. 0,5—10%-os vizes ammóniával vagy más nukleofil bázissal — pl. egy szerves aminnal — szobahőmérsékleten, 8—24 órán át végzett kezeléssel.

Következésképp: ha egy A 40926 antibiotikumot tartalmazó fermentlevet, koncentrátumát vagy kivonatát bizonyos körülmények között állni hagyjuk (pl. egy nukleofil bázis vizes oldata hozzáadása után, pH 9 fölött, egy éjszakán át), olyan A 40926 antibiotikum komplexet kapunk, amely az A 40926 antibiotikum A és B faktorban feldúsult. Ha rövid az az idő, amelyen át a fermentlevet, ennek kivonatát vagy koncentrátumát a bázisos körülményeknek kitesszük, olyan A 40926 antibiotikum komplexet kapunk, amely az A 40926 antibiotikum PA és PB faktorban dúsult fel.

Ezért egy kitüntetett eljárás az olyan A 40926 antibiotikum komplex előállítására, amely A és B faktorban feldúsult, abból áll, hogy az A 40926 antibiotikum komplex oldatát (amely főként A 40926 antibiotikum PA és PB Faktort tartalmaz) szobahőmérsékleten 8—12 órán át állni hagyjuk egy vizes nukleofil bázis oldatban — pl. vizes ammónia oldatban —, majd az előbbiekben leírt módon elkülönítjük a keresett antibiotikum komplexet.

Az A 40926 antibiotikumot tartalmazó oldatokra példák a fermentlevek, kivonatok és az affinitáskromatográfia során eluált frakciók.

Ha a nyers komplexet az előbbiekben leírt módon, affinitáskromatográfiával tovább tisztítjuk, tiszta A 40926 antibiotikumot kaphatunk.

Az így kapott termékre, amely a tiszta faktorokból leszármaztatható biológiai és fizikokémiai tulajdonságokkal rendelkezik, a példákban mint A 40926 antibiotikum AB komplexre fogunk hivatkozni.

Egy-kitüntetett eljárás egy A 40926 antibiotikum komplex készítmény PA és PB faktorban való dúsítására abból áll, hogy az affinitáskromatográfia során eluált frakciókat gyorsan semlegesítjük egy savval, előnyösen egy ásványi savval, pl. kénsavval vagy sósavval.

A tiszta A 40926 antibiotikum PA és PB faktor ebből a komplexből való elkülönítését valamelyik, az előbbiekben ismertetett eljárás szerint végezhetjük.

Egy kitüntetett eljárást képvisel a fordított fázisú folyadékkromatográfia, előnyösen saválló acél oszlopban mérsékelt nyomáson (5—50 bar), vagy nagy nyomáson (100—200 bar). A szilárd fázis lehet egy szílanizált szilikagél, amely a szénhidrogén fázisban 2—18 (legelőnyösebben 18) szénatomos csoportokat vagy fenil-csoportot tartalmaz, az eluálószer pedig egy, az előbbiekben meghatározott poláris, vízzel elegyedő oldószer és a gyantával kompatíbilis ρΗ-jú (előnyösen pH 4—8) vizes oldat — puffer — elegye.

Az eluációt a szokásos módon követjük, a homogén antibiotikumot tartalmazó frakciókat összeöntjük és a tiszta vegyületek elkülönítésére, amelyek az alábbi jellemzőkkel rendelkeznek, az előbbiekben leírt módon kezeljük.

Bonyolult HPLC elemzéssel kimutatható, hogy az A 40926 antibiotikum B faktor ténylegesen két, Bo és Bi faktornak nevezett komponens keveréke.

Az A 40926 antibiotikum Bo faktor — amely az A 40926 antibiotikumnak kb. 90%-át teszi ki — azzal jellemezhető, hogy R_t értéke a teikoplanin A₂2 komponenséhez viszonyítva 1,22 a B faktor fizikokémiai jellemzőivel kapcsolatban a következő

D) pontban leírt rendszerben; a Bi faktor megfelelő Rt értéke pedig — ez az A 40926 antibiotikum B faktor kb. 1,0%-át képviseli — ugyanebben a rendszerben 1,27.

A tiszta A 40926 antibiotikum Bo faktort az A 40926 antibiotikum B faktor tovább-tisztításával állítjuk elő, pl. oly módon, hogy megismételjük az elkülönítéshez alkalmazott fordított fázisú kromatográfiás eljárást.

Az A 40926 antibiotikum Bo faktor fizikokémiai és biológiai'jellemzői lényegében azonosak az A 40926 antibiotikum B faktoréival, azzal a különbséggel, hogy az előbbiekben említett rendszerekben végzett HPLC elemzés során csak egy csúcsot mutat (a teikoplanin A₂ 2 komponenséhez viszonyított Ri érték a leírt HPLC rendszerben 1,22).

Az A 40926 antibiotikum B faktor és az A 40926 antibiotikum Bo faktor között fennálló, az előbbiekben részletezett hasonlóságok miatt a leírásban az A 40926 antibiotikum B faktor biológiai tulaj 13

-131 ¹ donságaival kapcsolatban szereplő utalásokat úgy kell érteni, hogy azok egyben az A 40926 antibiotikum Bo faktorra is vonatkoznak, amely az A 40926 antibiotikum B faktor fő komponense (annak kb. 90%-át teszi ki) és nagy mértékben hozzájárul annak biológiai tulajdonságaihoz.

Egy másik megoldás szerint a találmány szerinti antibiotikumok erős vagy gyenge anioncserélő gyanták — ideértve a funkcionálisan átalakított polisztirolt, akril- vagy polidextrán mátrixokat — alkalmazásával különíthetők el a fermentléből vagy tisztíthatók tovább. Á gyenge anioncserélők pl. a következő kereskedelmi neveken forgalomba hozott gyanták közül kerülnek ki: Dowex MWA—1 vagy WGR (Dow Chemical), Amberlite IRA—73 (Rohm & Haas), DEAE—Sephadex (Pharmacia). A találmány szerinti eljárásban használható erős anioncserélő gyanták pl. a következő kereskedelmi néven forgalomba hozott termékeket foglalják magukban: Dowex MSA—1, SBR, SBR—P (Dow Chemical), Amberlite ÍR—904 (Rohm & Haas) és QAF—Sephadex (Pharmacia).

A találmány szerinti antibiotikumoknak az ilyen gyantákról való eluálását elektrolitok — pl. nátrium- vagy káliumklorid — vizes oldatainak lineáris grádiens elegyeivel végezzük, amelyeket vízzel vagy víz és egy szerves, vízzel elegyedő oldószer — pl. rövidszénláncú alkohol (pl. 1—4 szénatomos alkohol) vagy egy rövidszénláncú alkil-keton (pl. aceton) — elegyeivel állítunk elő.

Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont úgy állítjuk elő, hogy az A és B faktorban feldúsított A 40926 antibiotikum komplexet, az A 40926 antibiotikum A faktort, B faktort, B_o faktort vagy ezek elegyeit ellenőrzött savas körülmények között hidrolizáljuk.

Ezeket az ellenőrzött savas körülményeket úgy biztosítjuk, hogy egy ásványi vagy egy erős szerves sav tömény vizes oldatát alkalmazzuk, kívánt esetben egy aprotikus szerves oldószer jelenlétében. Kitüntetett példák az erős ásványi savakra a kénsav és a foszforsav.

Kitüntetett erős szerves sav a trifluorecetsav.

Kitüntetett aprotikus szerves oldószerek az aliciklusos vagy ciklikus alkil-éterek, amilyen pl. a dioxán és a tetrahidrofurán; a rövidszénláncú alkilszulfoxidok — pl. a dimetil-szulfoxid — és a rövidszénláncú alkil-amidok, pl. a dimetil-formamid.

A reakció hőmérsékletét általában 0 C° és a reakcióelegy visszafolyatási hőmérséklete között tartjuk. Sok esetben ez 15 °C és 75 °C között helyezkedik el, míg kitüntetettek a 20 °C és 55 °C közötti hőmérsékletek, és leginkább kitüntetett a szobahőmérséklet.

A reakcióidő a reakció konkrét paraméterei függvényében változik és mivel a reakció lefolyása TLC vagy HPLC technikával követhető, a szakember képes a reakció előrehaladásának figyelésére és annak meghatározására, hogy a reakció mikor tekinthető teljesnek.

Ennek az eljárásnak egy kitüntetett foganatosítási módját képviseli az A 40926 antibiotikum komplexnek vagy egy tiszta komponensének 80— 95%-os vizes trifluorecetsav jelenlétében szobahőmérsékleten végzett ellenőrzött hidrolízise, az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon előállítására.

Ennek az eljárásnak egy másik előnyös módját képviseli az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikonjának 2:1—1:2 vizes 1—2N kénsav és dioxán elegye jelenlétében végzett ellenőrzött hidrolízise.

A hidrolízis-lépés végén kinyert nyers A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon tisztítása önmagukban ismert eljárások szerint történhet, amilyen a nem-oldószerek hozzáadásával végzett kicsapás, az oldószerekkel végzett extrakció és a kromatográfiai

A kitüntetett kromatográfiás eljárások közé tartozik az oszlopkromatográfia, és a leginkább kitüntetett kromatográfiás eljárás a fordított fázisú oszlop-kromatográfia.

Egy alkalmas fordított fázisú folyadék-kromatográfiás eljárás során előnyösen saválló acél oszlopot alkalmazunk mérsékelt (5—50 bar) vagy nagy nyomáson (100—200 bar). A szilárd fázis lehet egy szilanizált szilikagél, 2—18 (előnyösen 18) szénatomos szénhidrogén fázissal, vagy fenil-csoporttal. Az eluálószer egy poláris, vízzel elegyedő oldószer és a gyantával kompatíbilis pH-jú (előnyösen pH 3—8) vizes puffer elegye.

Jellemző példák a poláris, vízzel elegyedő oldószerekre: vízoldható alkoholok (pl. a metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, alkánkarbonsavak rövidszénláncú alkilészterei (pl. az etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán, dimetil-formamid és ezek elegyei. A kitüntetett poláris, vízzel elegyedő oldószer az acetonitril.

Az eluált frakciók antibiotikum tartalmát a szokásos biológiai vizsgálatok valamelyikével — amilyen a papírkorongos vagy az agardiffúziós meghatározás —, érzékeny mikroorganizmusok alkalmazásával állapítjuk meg. Az érzékeny organizmusokra példa a Bacillus subtilis és a S. aureus.

A tisztítás, akárcsak a reakció, ugyancsak előnyösen TLC vagy HPLC technikákkal követhető.

Egy kitüntetett HPLC technikát képvisel az olyan fordított fázisú HPLC, amelynek során 18 szénatomos alkil-csoportokkal funkcionalizált, porózus, gömbalakú szilanizált szilikagélt használunk fel ; a gömbalakú részecskék átmérője előnyösen 5 μ (ilyen pl. az 5 gm Ultrasphere^R ODS Altex, Beckman Co.). Elő-oszlopként 18 szénatomos alkil-csoportokkal funkcionalizált szilikagéllel töltött oszlopot használunk (ilyen pl. az RP 18 Brownlee Labs), eluálószerként pedig egy — pl. az előbbiekben leírt — poláris, vízzel elegyedő oldószer és egy vizes puffer-oldat lineáris grádiens elegyét.

Ezt az oldatot előnyösen pH 5—7-re állítjuk be. Egy kitüntetett eluálószer 5—60% B eluenst tártálmáz — lineáris grádiens. szerinti eloszlásban — A eluensben, ahol az A eluens acetonitril: pH 5—7 vizes puffer 10:90 elegye és a B eluens acetonitril: pH 5—7 vizes puffer 10:90 elegye.

Mint ez a ¹ zakember számára ismert, belső standardként számos anyag alkalmazható. Ebben az esetben nagyon célszerű belső standard az L 17054 antibiotikum, amelynek retenciós ideje ebben a HPLC rendszerben közel áll a találmány szerinti vegyületekéihez. Ez a standard anyag ismert: a 0119575 sz. európai szabadalmi bejelentésben írják le.

-141

A találmány szerinti vegyületek antibakteriális aktivitását in vitro standard hígitásos vizsgálatokkal határozhatjuk meg, különböző mikroorganizmus tenyészetek alkalmazásával.

Az A 40926 antibiotikum A faktor fizikokémiai jellemzői

A) a 11. ábra szerinti UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:

a) 0,IN HCI

b) pH 7,38 foszfát puffer

c) 0,lN nátrium- vagy káliumhidroxid

d) metanol

e) pH 9,0 foszfát puffer 0 lambdamax (nm) 281

281; 300 (váll)

300

282

-)0)

300 (váll)

B) a 12. ábrán bemutatott IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm^-1):

3700—3100; 3100—2800; (nujol); 1635; 1620— 1560; 1510; 1480—1410 (nujol); 1375 (nujol); 1320—1250; 1250—1190; 1100—950 ; 845; 810; 720 (nujol)

C) a 15. ábrán bemutatott ’H—NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppmben) 270 MHz-en, DMSO—de-ban (hexadeutero-dimetil szulfoxid) felvéve, belső standardként TMS-t (0,00 ppm) alkalmazva (delta, ppm):

0,86 (t-k, 6H); 1,21 (kb. UH); 1,43 (2H); 2,01 (2H); 2,31—2,34 (3H); 4—6,2 (kb. 16H); 6,2—8 (kb. 23H); 8,44; 9,22; 9,66 (széles sávok, mozgékony protonok) 2,5—4: interferencia a H₂O csúcsok hatására

D) retenciós idő (R,) 1,22 a teikoplanin A₂ 2 komponenséhez viszonyítva (R_t = 20,3 perc) az elemzést fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve:

oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer:

CH₃CN	10%
NaH₂PO₄H₂O (2,5 g/1) pH 6,0-ra beállítva eluálószer:	90%
CHjCN	' 70%
NaH₂PO₄-H₂O (2,5 g/1) pH 6,0-ra beállítva	30%

eluálás: lineáris grádiens 5%—60% B eluálószer az A eluálószerben, 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc UV detektor: 256 nm belső standard: teikoplanin A₂ 2 komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.)

Ugyanilyen körülmények között a tesztoszteronhoz (Roussel Uclaf) viszonyított retenciós idő 0,60.

E) Az elem-analízis — miután a mintát előzetesen kb. 140 °C-on közömbös atmoszférában megszárítottuk (súlyveszteség 4,6%) — a következő közelítő (átlagos) százalékos összetételt mutatja: szén 55,82%; hidrogén 5,17%; nitrogén 6,31%; klór (összes) 4,24%; klór (ionos) 0,37%. Szervetlen maradék 900 °C-on, levegőn: 1,2%.

F) Sav-bázis titrálási görbe 2-metoxi-etanol (MCS): víz 4:1 elegyben. A HCl-felesleg hozzáadása KOH-dal végzett titrálás 4 ionizálható funkció jelenlétére utal, amelyek pk_MCS értékei a követke₆ zők: 4,6; 5,6; 7,2; 9,2.

G) Rf érték 0,24 és a teikoplanin A₂ 2 komponenséhez viszonyított R_f érték 0,70 a következő kromatográfiás rendszerben:

5%-os (súly/térf.) vizes Na₂SO₄ 70 acetonitril 30 szilanizált szilikagél (60 F₂₅₄, Merck) lemezeket alkalmazva (rétegvastagság 0,25 mm)

Előhívás:

— UV fény — Pauly-reagenssei — azaz diazotáit szulfanilsavval (J. Chromatogr. 20, 171, 1965; Z. Physiol. Chem. 292, 99, 1953) sárga szín — bioautográfia Bac. subtilis ATCC 6633 felhasználásával, minimális Davis táptalajon

2f H) molekulatömeg kb. 1716 a FAB—MS spektrumból levezetve, amely 1717-nél mutatja az M + H⁺ csúcsot.

3C

Az A 40926 antibiotikum B faktor fizikokémiai jellemzői

A) a 14. ábrán bemutatott UV abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja:

a) 0,IN HCI

b) pH 7,38 foszfát puffer

c) Ó,1N nátrium- vagy káliumhidroxid

d) pH 9,0 foszfát-puffer

e) metanol lambdamax (nm) 282

281, 300 (váll) 300

283; 300 (váll) 282

B) a 15. ábrán bemutatott IR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm^-1):

3700-3080 ; 3080—2700 (nujol); 1720—1625; 1625—1560; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujol)

C) a 16. ábrán bemutatott ’H—NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm) 270 MHz-nél; a spektrumot DMSO—cL-ban (hexadeutero-dimetilszulfoxid) vettük fel, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva; delta (ppm): 0,85 (d, izopropil-metilek); 1,15 (kb. 13H); 1,44 (kb. 2H); 2,02 (2H); 2,32—2,35 (3H); 4-6,1 (kb, 16H); 6,1—8 (kb. 23H); 8,52; 9,30; 9,68 (széles sávok, mozgékony protonok); 2,5—4: interferencia a H₂O csúcsok miatt

D) retenciós idő (R,) a teikoplanin A₂ 2 komponenséhez viszonyítva (R_t = 20,3 perc) 1,22 és 1,27 a következő körülmények között fordított fázisú HPLC módszerrel végzett elemzés során: oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer:

CHjCN	10%
NaH₂PO₄H₂O(2,5g/l)	90%
pH 6,0-ra beállítva eluálószer: CHaCN	70%
NaH₂PO₄-H₂O (2,5 g/1)	30%
pH 6,0-ra beállítva	15

-151 196229 eluálás: lineáris grádiens 5%—60% között (B eluálószer az A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc

E) az elem-analízis — a minta előzetes, kb. 140 °C-on közömbös atmoszférában való szárítása után (súlyveszteség 9,6%) — a következő közelítő (átlagos) százalékos összetételt mutatja: szén 54,09; hidrogén 5,13; nitrogén 6,34; klór (összes) 4,12; klór (ionos) 0,39%.

Szervetlen maradék 900 °C-on levegőn végzett szárítás után: 5%.

F) Sav-bázis titrálási görbe 2-metoxi-etanol (MCS): víz 4:1 elegyben; a HO-felesleg hozzáadása után (pH 2,7) KOH-dal végzett titrálás 4 ionizálható funkció jelenlétére mutat, amelyek pkstcs értékei a következők: 4,5; 5,6; 7,2; 9,2.

G) Rf érték 0,21 és a teikoplanin A₂ 2 komponenséhez viszonyított Rf érték 0,53 a következő kromatográfiás rendszerben:

5%-os (tömeg/térf.) vizes Na₂SO4 70 acetonitril 30 szilanizált szilikagél lemezek (60 F₂₅₄ Merck, rétegvastagság 0,25 mm)

Kimutatás:

— UV fény — Pauly-reagenssel — azaz diazotált szulfanilsavval (J. Chromatogr. 20, 171, 1965; és Z. Physiol. Chem. 292, 99, 1953) sárga szín — bioautográfia Bac. subtilis ATCC 6633 felhasználásával, Davis-f. táptalajon

H) Molekulatömeg kb. 1730 a FAB—MS spektrum alapján, amely az M + H⁺ csúcsot 1731-nél mutatja.

Az A 40926 antibiotikum B_o faktor fizikokémiai jellemzői

lambda_max (nm)

a) 0,IN HCI 282

b) pH 7,38 foszfát puffer 281, 300 (váll)

c) 0,lN nátrium- vagy káliumhidroxid 300

d) pH 0,9 foszfát puffer 283; 300 (váll)

e) metanol 282

3700—3080; 3080—2700 (nujol); 1720—1625; 1625—1560; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100—1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujol)

C) a 16. ábra szerinti ’H—NMR spektrum a következő jel-csoportokat (ppm) mutatja 270 MHzen, DMSO—dó-ban (hexadeutero-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként TMS-t (0,00 ppm) alkalmazva; delta, ppm:

0,85 (d, izopropil-metilek); 1,15 (kb. 13H); 1,44 (kb. 2H); 2,02 (2H); 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 (kb. 16H); 6,1—8 (kb. 23H); 8,52; 9,50; 9,68 (széles sávok, mozgékony protonok);

2,5—4: interferencia a H₂O csúcsok miatt

D) retenciós idő (Rt) 1,22 a teikoplanin A₂ 2 komponenséhez viszonyítva (R_t = 20,3 perc) fordított fázisú HPLC technikával a következő körülmények között végzett elemzés során: oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer:

CHjCN	10%
NaH₂PO4-H₂O (2,5 g/1) pH 6,0-ra beállítva eluálószer:	90%
CHjCN	70%
NaH₂PÓ4-H₂O (2,5 g/I)	30%
pH 6,0-ra beállítva

eluálás: lineáris grádiens 5%—60% között (B eluálószer az A oldószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc

E) az elem-analízis — miután a mintát előzetesen kb. 140 °C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (tömegveszteség 9,6%) — a következő közelítő (átlagos) százalékos összetételt mutatja: szén 54,09%; hidrogén 5,13%; nitrogén 6,34%; klór (összes) 4,12%; klór (ionos) 0,39%.

Szervetlen maradék 900 °C-on levegőn végzett izzítás után: 5%.

F) A sav-bázis titrálási görbe 4:1 2-metoxi-etanol (MCS): víz elegyben — HCl-felesleg hozzáadása után KOH-dal végzett titrálással — 4 ionizálható funkció jelenlétére mutat, amelyek pkMcs értékei a következők: 4,5; 5,6; 7,2; 9,2.

G) Az Rf érték 0,21 és a teikoplanin A₂ 2 komponenséhez viszonyított Rf érték 0,53 a következő kromatográfiás rendszerben:

5%-os (tömeg/térf.) Na₂SO4 70% acetonitril 30% szilanizált szilikagél lemezeket (60 F₂₃4 Merck, rétegvastagság 0,25 mm) alkalmazva

Kimutatás:

— UV fény — Pauly-reagenssel — azaz diazotált szulfanilsavval (J. Chromatogr. 20, 171, 1965 és Z. Physiol. Chem. 292, 99, 1953) sárga szín — bioautográfia Bac. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis-f. minimális táptalajon.

H) A molekulatömeg kb. 1730 az FAB—MS spektrum alapján, amely szerint az M + H⁺ csúcs 1731-nél helyezkedik el.

Az A 40926 antibiotikum PA faktor fizikokémiai jellemzői:

A) a 17. ábra szerinti UV abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja:

lambdam ax (nm)

a) 0,IN HCI 282

b) 0,lNKOH 300 ;

c) pH 7,38 foszfát puffer 282; 300 (váll)

d) pH 9,0 foszfát puffer 283; 300 (váll)

B) a 18. ábra szerinti IR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm^-1):

3700—3100 ; 3000—2800 (nujol); 1760—1710; 1655; 1620-1550; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); Í26Ö; 1250—950 ; 845; 805; 720 (nujol)

-161

C) a 19. ábra szerinti Ή—NMR spektrum a következő jel-csoportokat (ppm-ben) mutatja 270 MHz-nél DMSC—d«-ben (hexadeutero-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként TMS-t (0,00 ppm) alkalmazva (delta, ppm):

0,86 (CHa-dublettek); 1,15—1,22 [m, (CH₂)„j; 1,41 (m, CH₂); 2,01 (s, CH₃); 2,01 (m, CH₂); 2,28 (s, N—CH₃); 4,26—5,96 (széles, peptid- és aromás metilek); 6,33—7,73 (széles, aromás CH-csoportok és peptid-NH-csoportok)

D) retenciós idő (R_t) 1,15 a teikoplanin A₂2 komponenshez (R_t = 20,3 perc) viszonyítva fordított fázisú HPLC módszerrel a következő körülmények között végzett elemzés során:

oszlop: Ultrasphere ODS (5 gm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer:

CH₃CN	10%
NaH₂PO4-H₂O (2,5 g/I) pH 6,0-ra beállítva eluálószer:	90%
ch₃cn	70%
NaH₂PO₄H₂O (2,5 g/1) pH 6,0-ra beállítva	30%

eluálás: lineáris grádiens 5%—60% között (B eluálószer az A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc U V detektor: 254 nm belső standard: teikoplanin A₂ 2 komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.)

E) az Rf érték 0,62 a teikoplanin A₂ 2 komponenshez viszonyítva a következő kromatográfiás rendszerben:

5%-os (tömeg/térf.) vizes Na₂SO₄ 70 acetonitril 30 szilanizált szilikagél lemezek (60 F₂54 Merck, rétegvastagság 0,25 mm)

Kimutatás:

— UV fény — Pauly reagenssel-diazotált szulfanilsav (J. Chromatogr. 20, 171, 1965 és Z. Physiol. Chem. 292, 99, 1953) — sárga szín — bioautográfia Bac. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis-f. minimális táptalajon.

F) Molekulatömeg kb. 1758 az FAB—MS spektrum alapján, amelyen számos csúcs látható, a legintenzívebb 1761-nél. Az FAB—MS elemzés műveleti körülményei a következők:

berendezés: VG Mód ZAB SE, FAB ágyúval (Ion Tech) ellátva körülmények: pozitív FAB, Xe gyorsítófeszültség 8 kV mátrix: tioglicerin.-glicerin 1:1 (térf./ térf.)

Az A 40926 antibiotikum PB faktor fizikokémiai jellemzői

A) a 20. ábra szerinti UV abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja:

lambdamax (nm)

a) 0,lN HCl 282

b) 0,INKOH 300.

c) pH 7,38 foszfát puffer 282; 300 (váll)

d) pH 9,0 foszfát puffer 282; 300 (váll)

B) a 21. ábra szerinti IR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm^-1):

3700—3100; 3000—2800 (nujol); 1760—1710; 1655; 1620—1560; 1605; 1480—1420 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1270; 1230—1190; 1150; 1120— 920; 845; 810; 720 (nujol)

C.l. a 12. ábra szerinti Ή—NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-nél DMSO—d₆-ban (hexadeutero-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t használva (delta, ppm):

0,84 (d, izopropil-metilek); 1,17 [m, (CH₂)„j; 1,43 (m, CH₂); 1,99 (s, CH,); 2,01 (m, CH₂); 2,31 (s, N—CHj); 2,79 (dd, CH); 3,70 (m, CH); 4,Οδό,02 (széles, peptid és aromás CH-csoportok); 6,45—7,74 (széles, aromás CH-csoportok és peptid NH-csoportok); 8,19—9,99 (széles, peptid NHcsoportok és fenolos OH-csoportok)

C.2. a 23. ábra szerinti ’H—NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-nél, DMSO—d₆ + CF)COOD közegben felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta, ppm):

0,84 (d, izopropíl-mctilek); 1,13 [m, (CH₂)„j; 1,40 (m, CH₂); 1,98 (s, CH,); 2,00 (m, CH₂); 2,92 (dd, CH); 3,29—3,71 (m, cukor-CH-csoportok);

4,07—6,09 (s és m, peptid és aromás CH-csoportok); 6,45—7,83 (s és m, aromás CH-csoportok és peptid NH-csoportok); 8,17—10,38 (peptid NH-csoporlok, fenolos OH-csoportok)

D) retenciós idő (R,) 1,27 és 1,32 a teikoplanin Aa 2 komponenshez viszonyítva (R, = 20,3 perc) a fordított fázisú HPLC technikával a következő körülmények között végzett elemzés során : oszlop: Ultrasphere ODS (5 gm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 gm)

A eluálószer: CH₃CN 10%

NaH₂PO₄-H₂O (2,5 g/1) 90% pH 6,0-ra beállítva

B eluálószer: CHjCN 70%

NaH₂PO₄H₂O (2,5 g/1) 30% pH 6,0-ra beállítva eluálás: lineáris grádiens 5%—60% között (B eluálószer az A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc UV detektor: 254 nm belső standard: teikoplanin A₂ 2 komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.)

E) Rr érték a teikoplanin A₂ 2 komponenséhez viszonyítva 0,53 a következő kromatográfiás rendszerben:

5%-os (tömeg/térf.) vizes Na₂SO₄ 70 acetonitril 30 szilanizált szilikagél lemezek (60 F₂54 Merck) alkalmazásával (rétegvastagság 0,25 mm)

Kimutatás:

— UV fény — Pauly reagenssel — díazotált szulfanilsav (J. Chromatogr. 20, 171, 1965 és Z. Physiol. Chem. 292, 99, 1953) sárga szín — bioautográfia Bac. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, minimális Davis-f. táptalajon.

F) Molekulatömeg kb. 1772 az FAB—MS spektrum alapján, amelyen számos csúcs látható, a

-171 .

legintenzívebb csúcs 1776-nál. Az FAB—MS elemzés műveleti körülményei a következők: berendezés: VG Mód ZAB, FAB ágyúval (Ion

Tech) ellátva körülmények: pozitív FAB, Xe gyorsító feszültség 8 kV mátrix: tioglicerin:glicerin 1:1 (térf./ térf.).

Az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon a következő tulajdonságokkal rendelkezik:

A) a 24. ábra szerinti UV abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja:

a) 0,IN HCI

b) pH 7,38 foszfát puffer

c) 0, IN káliumhidroxid

d) pH 9,0 foszfát puffer lambdamas (nm) 280

280; 300 (váll) 298

282; 300 (váll)

B) a 25. ábra szerinti IR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm-¹):

3700—3100: 3000—2800 (nujol); 1655; 1620— 1540; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1350— 1250; 1210; 1150; 1020; 970; 850; 810

C) a 26. ábra szerinti ’H—NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat (ppm-ben) mutatja 270 MHz-en, DMSO-de (hexadeutero-dimetilszulfoxid) és CF3COOH elegyében felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta, ppm):

2,51 (s, DMSOdj); 2,50 (s, NCH₃); 2,88 (m, Z2);

3,30 (m, Z’2); 4,08 (m, X6); 4,44 (d, X5); 4,49 (d, X7); 4,83 (m, X2); 5,02 (s, 4F); 5,08 (s, Z6); 5,31 (s, a mannóz anomer protonja); 5,53 (d, X4); 5,78 (s, 4B); 6,08 (d, X3); 7,70 (s, 6B); 6,44—8,52 (aromás és peptid NH-k)

D) retenciós idő (R_t) 1,18 az L 17054 (TA3—1) antibiotikumhoz (R_t = 8,78 perc) viszonyítva, az elemzést fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve:

oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer :CH₃CN 10%

ΝαΗ₂ΡΟ₄·Η₂Ο (2,5 g/1) 90% pH 6,0-ra beállítva

B eluálószer :CH₃CN 70%

NaH₂PO₄ · H₂O (2,5 g/1) 30% pH 6,0-ra beállítva eluálás: lineáris grádiens (5%—60% B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,6 ml/perc UV detektor: 254 nm belső standard: L 17054 (TA3—1) antibiotikum (Gruppo Lepetit S. p. A.)

E) R_f érték 0,39 a kővetkező kromatográfiás rendszerben:

g/1 NaH₂PO₄-H₂O-t tartalmazó 1M NaCl 70 acetonitril 30 pH 6 ,0-ra beállítva, 60 F₂m Merck lemezeket (szilanizált szilikagél, rétegvastagság 0,25 mm) használva

Kimutatás:

— UV fény — sárga szín Pauly reagenssel — azaz diazotált szulfanilsawai (J. Chromatogr. 20, 171, 1965; Z. Physiói. Chem. 292, 99, 1953) — bioautográfia B. subtilis ATCC 6633-mal minimális Davis-f. táptalajon

F) a gyors atom bombázásos (FAB) tömegspektrumban M + H^F kb. 1374-nél található.

Az A 40926 antibiotikum B faktor N-acilaminoglukuronil-aglikon fizikokémiai jellemzői

A) Dinátrium-só ₁₀ C 52,11 %; H 5,33%; N 6,31 %; Cl (összes) 4,0%; Na₂SO₄ hamu 8%; tömegveszteség 140 °C-on: 9%

B) Nátrium-só

C 52,90%; H 5,44%; N 6,41%; Cl (összes) 4,05%; Na₂SO₄ hamu 4,06%; tömegveszteség 140 °C-on:

8,9%

C) Hidroklorid

C 52,63%; H 5,44%; N 6,37%; Cl (összes) 6,05%; tömegveszteség 140 °C-on: 8,5%

Az A 40926 antibiotikum A faktor N-acilamino20 glukuronil-aglikon fizikokémiai jellemzői

A) Dinátrium-só

C 51,74%; H 5,27%; N 6,35%; Cl (összes) 4,02%; Na₂SO₄ hamu 8,08%; tömegveszteség 140 °C-on: 9,3% ε B) Nátrium-só

C 52,77%; H 5,34%; N 6,48%; Cl (összes) 4,01%; Na₂SO₄ hamu 4,09%; tömegveszteség 140 °C-on: 8,7%

C) Hidroklorid c 52,47%; H 5,41 %; N 6,44%; CJ (összes) 6,11%; tömegveszteség 140 °C-on: 8,5%

Az A 40926 antibiotikum ágiikon fizikokémiai jellemzői

3b A) Nátrium-só

C 53,19%; H 4,30%; N 7,36%; Cl (összes) 5,32%; Na₂SO₄ hamu 5,35%; tömegveszteség 140 °C-on: 7,3%

B) Hidroklorid

C 51,86%; H 4,50%; N 7,17%; Cl (összes) 7,78%; tömegveszteség 140 °C-on: 8,8%

Az addiciós sóknál a tömegveszteséget nitrogén atmoszférában 140 °C-on való szárítás után, míg a hamutartalmat az USP XXII módszer szerint mér45 tűk.

A találmány további szemléltetésére a következő példákat mutatjuk be, amelyek önmagukban nem tekinthetők korlátozó jellegűnek a találmány oltalmi köre vonatkozásában.

l. példa

Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex és az A 40926 antibiotikum ágiikon előállítása

a) 750 mg A 40926 antibiotikum AB komplexet (amelyet lényegében a 3. eljárás szerint állítottunk elő) feloldunk 150 ml 9:1 (térf./térf,) dirnetil-szulfoxid:37 (tömeg/tömeg)%-os sósav (DMSO: HCI) elegyben és a reakcióelegyet kb. 65 °C-ra me60 legítjük fel.

A reakció lefolyását HPLC-vel követjük, és miután a kiindulási anyagok teljes mértékben reagáltak egymással (kb. 5 óra elteltével), a reakciót hideg víz (600 ml) hozzáadásával leállítjuk és a ka65 pott elegy pH-ját kb. 7,5-re állítjuk be.

Ez az anyag a cím szerinti vegyületek keverékét tartalmazza, amelyet affinitáskromatográfiával, a

-181 196229 2 következő eljárás szerint választunk szét két fő összetevőjére.

b) Az előbbiek szerint kapott vizes elegyet (750 ml) felvisszük egy Sepharose-D-alanil-D-alanin kromatográfiás oszlopra, amelyet a 8. eljárással kapcsolatban leírt módon állítottunk elő (100 ml duzzasztott gyanta lOmM trisz-HCl pufferben, pH 7,5; az ágy magassága 10 cm). 200 ml, NaCl-ra 2M pH 7,5 0,05M NHiOH-HCl puffért (B puffer) vezetünk át az oszlopon, majd az A 40926 antibiotikum aglikont szelektíve eltávolítjuk az oszlopról, 1500 ml, NaCl-ra 2M pH 9,5 0,05M NH4OHHCIlel (C puffer) végezve az eluálást.

Ezután az N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet 0,lM vizes ammóniával (D puffer) eluáljuk.

Az eluált frakciókat kb. pH 7,5-re állítjuk be és antibiotikum tartalmuknak megfelelően ősszeöntjük, majd a különböző antibiotikum-tartalmú oldatokat Sepharose-D-alanil-D-alanin oszlopon kromatografáljuk (100 ml duzzasztott gyanta lOmM trisz-HCl pufferben, pH 7,5; az ágy magassága 10 cm). Desztillált vizet vezetünk át az oszlopon, a szervetlen sók kimosásáig. Ezt követően az antibiotikumokat 0,lN vizes ammóniával eluáljuk. Ezeket az eluált frakciókat antibiotikum tartalmuknak megfelelően összeöntjük, csökkentett nyomáson, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be és liofilizáljuk. így 201 mg N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet ill. 236 mg A 40926 antibiotikum aglikont kapunk.

Az előbbiekben leírt kísérletet megismételve, de 95:5 DMSO:37%-os HCI elegyet alkalmazva, kb. 40 °C-on kb. 5 napon át, az N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex kitermelése kb. 15%-kal nő, míg az A 40926 antibiotikum ágiikon kitermelése megfelelően csökken.

Ezeket a kísérleteket A 40926 antibiotikum komplexből, A 40926 antibiotikum A faktorból, A 40926 antibiotikum B faktorból, A 40926 antibiotikum Bo faktorból, A 40926 antibiotikum PA faktorból és A 40926 antibiotikum PB faktorból kiindulva megismételve lényegében ugyanezeket az eredményeket kapjuk (azaz á kitermelések a ± 5% tartományban váltakoznak).

Közelebbről: A 40926 antibiotikum A faktorból vagy PA faktorból kiindulva a kapott termék az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktor, míg az A 40926 antibiotikum PB faktorból vagy Bo faktorból kiindulva a kapott termék az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon Bo faktor.

Az A 40926 antibiotikum B faktorból kiindulva az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon Bo és B₁ faktor keverékét kapjuk, amelyet HPLC-vei választhatunk szét.

2. példa

Az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A, Bo és Bi faktor szétválasztása.

mg A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet 1 ml pH 6,0 18mM nátriumfoszfát pufferben oldunk, amely 10% acetonitrilt tartalmaz. Az oldatot egy preparatív HPLC oszlopba injektáljuk (7 mm belső átmé10 rő x250 mm; 7 pm részecskenagyságú Lichrosorb RP 18 — Merck Co. — szilanizált szilikagél).

Az oszlopot 5 ml/perc sebességgel A és B fázissal eluáljuk (lineáris gradiens 10%—55% A fázissal, 55 perc alatt).

A fázis: 30/70 18mM nátriumfoszfát/CHjCN, NaOH-dal pH 6,0-ra beállítva

B fázis: 90:10 18mM nátriumfoszfát/CHjCN, NaOH-dal pH 6,0-ra beállítva.

Meghatározzuk az oszlopról eluált frakciók UV abszorpcióját 254 nm-en és az azonos koncentrációjú eluált frakciókat összeöntjük. Három eluátum-csoportot különítünk el; ezek az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A, Bo, illetőleg Bi frakciót tartalmazzák.

A tisztított A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon faktorokat tartalmazó eluátumokat, amelyeket 11 egymásutáni kromatográfiás Nemzés során kapunk, összeöntjük és a szokásos módon sómentesítjük: felvisszük egy oszlopra, amely 5 ml duzzasztott Sepharose-D-alanil-D-alaaint (1. a 8. eljárást) tartalmaz. A sókat 10 ml ImM HCl-lel, majd 5x10 ml desztillált vízzel eltávolítjuk, majd az antibiotikumot 5x10 ml 1 tömeg/ ’crf.%-os vizes ammóniával eluáljuk. Azammónias eluátumokai ezután külön-külön összegyűjtjük ás fagyasztva szárítjuk. 15 mg A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-agiikon A faktort, 51 ng A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronilaglikon Β» faktort és 3 mg A 4Ö926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon Bi faktort kapunk, amelyek fizikokémiai adatait és kémiai képletét a /eírásban az előbbiekben közöltük.

3. példa

Az A 40926 antibiotikum ágiikon szelektív előállítása

a) az A 40926 antibiotikum AB komplexből

750 mg A 40926 antibiotikum AB komplexet — amelyet lényegében a 3. eljárás szerint állítottunk elő — feloldunk 150 ml 9:1 (térf./térf.) dimetilszulfoxid 37%-os sósav elegyben és a reakcióelegyet kb. 80 °C-ra melegítjük fel, A reakció előrehaladását HPLC-vei követjük és miután a kiindulási anyagok teljes mértékben reagáltak egymással (kb. 3 óra után), a reakciót (600 ml) hideg vízzel leállítjuk és a kapott keverék pH-ját kb. 7,5-re állítjuk be.

Ez az elegy (750 ml) tartalmazza az A 40926 antibiotikum aglikont, amelyet affinitáskromatográfiával különítünk el, Sepharose-D-alanil-D-alanin kromatográfiás oszlopon, amelyet a 8. eljárással kapcsolatban írunk le (100 ml duzzasztott gyanta lOmM pH 7,5 trisz-HCl pufferben; az ágy magassága 10 cm).

200 ml 0,05M NH₄OH-HCl-t — amely NaCI-re 2M töménységű — (B puffer) vezetünk át az oszlopon, majd az A 40926 antibiotikum aglikont szelektíve eltávolítjuk az oszlopról oly módon, hogy azt 1500 ml, NaCl-re 2M pH 9,5 0,05M NRtOH-HCl-lel (C puffer) eluáljuk. Az eluált frakciókat ezután antibiotikum tartalmuknak megfelelően összeöntjük, kb. pH 7,5-re állítjuk be és Sepharose-D-alanil-D-alanin oszlopon kromatografáljuk (100 ml duzzasztott gyanta lOmM pH 7,5 trisz-HCl pufferben; az oszlopban az ágy magassága 10 cm). A szervetlen sók kimosásáig desz19

-19196229 2 tillált vizet vezetünk át az oszlopon. Az A 40926 antibiotikum aglikont O,1N vizes ammóniával eluáljuk. Ezeket az eluátuinokat csökkentett nyomáson, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be, majd liofilizáljuk. 530 mg A 40926 antibiotikum aglikont kapunk.

4. példa

Az 1. példa szerinti eljárással, azonban kiindulási anyagként az AB komplex helyett 750 mg A 40926 antibiotikum PA és PB faktor elegyét alkalmazva, 195 mg N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplexet és 230 mg A 40926 antibiotikum aglikont állítunk elő.

A kiindulási anyagok előállítása

1. eljárás:

Fermentáció az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzzsel

Az A 40926 antibiotikumot termelő Actinomadura sp. ATCC 39727 törzs ferde zabliszt agar tenyészetét — amelyet 2—3 héten át 28 °C-on növesztettünk — használjuk fel egy 500 ml-es Erlenmeyer lombik beoltására, amely 100 ml következő összetételű táptalajt tartalmaz:

0,5% húskivonat

0,5% autolizált élesztő

0,5% pepton

0,3% hidrolizált kazein

2% glükóz

0,15% NaCl pH 7,5 sterilizálás előtt.

A lombikot 28 °C-on forgó rázógépen inkubálják, 200 ford./perc sebességgel, kb. 72 órán át, majd a tenyészetet átvisszük egy fermentorba, amely 4 liter előbbi összetételű táptalajt tartalmaz. Ezt a tenyészetet kb. 72 órán át 28 °C-on tartjuk, miközben kb. 2 liter/perc sebességgel levegőt áramoltatunk be és kb. 900 ford./perc sebességgel kevertetjük a rendszert. Ezt a tenyészetet használjuk fel egy 200 literes fermentor beoltására, amely ugyanezt a táptalajt tartalmazza. Ezt a fermentort 100 liter/perc sebességgel steril levegővel levegőztetjük és kb. 28 °C-on 250 ford./perc sebességgel kevertetjük. Az antibiotikum-termelést papírkorongos agardiffúziós módszerrel követjük, minimális táptalajon B. subtilis t alkalmazva kísérleti organizmusként. A maximális aktivitást 72—96 óra után érjük el.

2. eljárás

Az A 40926 antibiotikum kinyerése

A) Az előbbiek szerint előállított fermentlevet 4 °C-ra hűtjük, pH-ját 9,5-re állítjuk be és kevertetjük. Kb. 1 óra elteltével szűrjük és a szűrlet pH-ját vizes ásványi savval kb. 3,5-re állítjuk be. A keveréket 30 percen át 4 °C-on kevertetjük, majd segédanyaggal (Hyflo—FloMa^R) szűrjük. A tiszta szűrletet elvetjük és a szűrőlepényt ionmentesített vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzió pH-ját kb.

8,5-re állítjuk be, kevertetjük, majd szűrjük. A kinyert szűrőlepényt ugyanennek az eljárásnak vetjük alá. Az összeöntött szűrletek tartalmazzák az A 40926 antibiotikumot.

B) Az 1. eljárás szerint előállított fermentléhez (miután szűrtük és a tiszta szűrlet pH-ját kb. 8,5-re állítottuk be), vagy a 2. A) eljárás szerint kapott összeöntött szűrlethez 2 liter módosított duzzasztott D-ala-D-ala-cpszilon-aminokaproil-Sepharose mátrixot adunk, A szuszpenziót egy éjjelen át szobahőmérsékleten kevertetjük, a gyantát szűréssel kinyerjük és egymás után a következőkkel mossuk: kb. 2x10 liter 0,45mM pH 7,5 trisz—HCI puffer (trisz = 2-amino-2-hidroxi-metÍl-l ,3-propándiol), amely 5 tömeg/térf.% NaCl-t tartalmaz, majd 4 x 20 liter desztillált víz. A gyantáról az antibiotikumot 2x20 liter 1 tömeg/térf.%-os ammóniumhidroxiddal eluáijuk. Az eluátumokat egy éjjelen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd kis térfogatra (kb. 2,5 liter) töményítjük be. A vizet n-butanollal végzett azeotróp desztillációval távolítjuk el. Ezután petrolétert adagolunk; ennek hatására 3,4 g nyers A 40926 antibiotikum komplex csapódik ki.

3. eljárás

Az A 40926 antibiotikum AB komplex tisztítása

A lényegében a 2. eljárás szerint előállított nyers A 40926 antibiotikum komplexet (750 mg; HPLC titer 70%) 400 ml vízben oldjuk, az oldat pH-ját

7,5-re állítjuk be és szűrjük. A szűrletet affinitáskromatográfiának vetjük alá D-ala-D-ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose oszlopon (50 ml duzzasztott gyanta; az ágy magassága 5 cm). Áz oszlopot NaCl-ra 2M töménységű 0,16 tömeg/térf.%os, pH 7,5-re sósavval beállított ammóniával hozzuk egyensúlyba és egymás után a következő három puffer oldattal fejlesztjük ki:

A puffer: NaCl-ra 2M, sósavval pH 7,5-re beállított 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia (2,6 agytérfogat);

B puffer: NaCl-ra 2M, sósavval pH 9,5-re beállított 0,16 súly/térf.%-os ammónia (16 ágy-térfogat);

C puffer: pH 11,4 1 tömeg/térf.%-os vizes ammónia (2,6 ágy-térfogat). ___

A C pufferrel az A 40926 antibiotikum komplexet egyetlen frakcióban eluáijuk. Ezt az eluált frakciót pH 7,0-re állítjuk be és újra felvisszük ugyanerre az affinitás-oszloprá, amelyet lOmM pH 7,0 trisz—HCI pulferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot a sómentesítés befejeződéséig desztillált vízzel mossuk.

Ezután 2 ágy-térfogatnyi pH 11,0 0,39 tömeg/ térf.%-os vizes ammóniával eluáijuk az antibiotikumot.

Az eluált frakciókat kis térfogatú vizes eleggyé töményítjük be, majd fagyasztva szárítjuk. 374 mg tiszta A 40926 antibiotikum AB komplexet kapunk.

4. eljárás

Az A 40926 antibiotikum A és B faktor szétválasztása

A) 3,3 g, a 2. eljárás szerint előállított A 40926 antibiotikum komplexet vagy 2,3 g, a 3, eljárás szerint előállított A 40926 antibiotikum AB komplexet 0,5 liter vízben szuszpendálunk, kevertetünk, majd szűrjük a szuszpenziót. A tiszta szűrletet felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (200 g; ágy-magasság 18 cm; szilanizált szilikagél 60; 70—

-201

230 mesh, Merck Inc.), amelyet A oldattal előzetesen egyensúlyba hoztunk (0,25 súly/térf. % NaH₂PO4-H₂O-t és 2,5 tőmeg/térf.% NaCl-t tartalmazó, NaOH-dal pH 6,0-ra beállított Ο,ΟΟΙΜ vizes Na—EDTA oldat). Az oszlopot lineáris grádiens alkalmazásával eluáljuk (0%— 40% — térf./ térf.-acetonitril az A oldatban); össztérfogat kb. 7 liter, kb. 48 óra alatt. Kb. 15,5 ml-es frakciókat szedünk; ezeket Bac. subtilis alkalmazásával biológiai vizsgálatnak vetjük alá és HPLC-vel elemezzük. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat összeöntjük. A 310—330 frakció tartalmazza az említett antibiotikumok közül az A 40926 antibiotikum A faktort, a 348—365 frakció pedig az A 40926 antibiotikum B frakciót.

B) az A 40926 antibiotikum A faktort, illetőleg az A 40926 antibiotikum B faktort tartalmazó egyesített frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük az acetonitril eltávolítására, vízzel hígítjuk (a kiindulási oldatok térfogatának kb. kétszeresére) és felvisszük az előbbiekben leírt típusú szilanizált szilikagél oszlopra (a duzzasztott mátrix térfogata: 50 ml; az ágy magassága 15 cm). Az oszlopot a sók teljes eltávolításáig ionmentesitett vízzel mossuk, majd 60:40 (térf./térf.) acetonitril:víz eleggyel fejlesztjük ki.

Az eluált frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük és a maradékot fagyasztva szárítjuk. Az eluált frakciók első csoportjából (az előbbi 310—330 frakció) 134 mg A 40926 antibiotikum A faktort, az eluált frakciók második csoportjából (az előbbi 348—365 frakció) pedig 206 mg A 40926 antibiotikum B faktort kapunk.

5. eljárás

Az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor elkülönítése

Lényegében a 2. A) eljárást és a 2. B) eljárás első lépései szerinti műveleteket követve a gyantához kötött antibiotikumot 2x20 liter 1 tömeg/térf.%os ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumok pH-ját kénsawal 7,8-re állítjuk be és az oldatokat vákuumban, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be; így vizes tömény oldatot kapunk, amelyet papíron szűrünk. A kapott szűrlet az A 40926 antibiotikum PA faktort, az A 40926 antibiotikum PB faktort, valamint kisebb mennyiségű A 40926 antibiotikum A faktort és B faktort tartalmaz (HPLC).

Ebből a vizes koncentrátumból egy mintát (10 ml), amely kb. 50 mg/ml tiszta A 40926 antibiotikum komplexet (HPLC elemzés) tartalmaz, 5 pm pórusméretű szűrőn (Acrodisc^R, Gelman Science Inc.) szűrünk, majd a szűrletet felvisszük egy 2 cm átmérőjű saválló acél oszlopba töltött 20 g oktadecíl-szilíl fordított fázisú szilikagélre (Lichrosorb RP 18, Merck Inc.; részecskenagyság 10 pm). A szilikagélt ezután mérsékelt nyomáson (névleges nyomás kb. 14 bar) betöitjük egy Chromatospac Modulprep berendezés saválló acél oszlopába (Joben Yvon, Franciaország) és kiegyensúlyozzuk egy olyan eleggyel, amely 25:75 (térf./térf.) arányban acetonitrilt és 18mM pH 6,0 nátriumfoszfát puffért tartalmaz. Az eluálást ugyanannak az oldószerelegynek az alkalmazásával hajtjuk végre, amelyet a kiegyensúlyozáshoz használtunk fel;

áramlási sebesség kb. 10,5 ml/perc. Az elúciót Bac. subtilis-szel végzett biológiai vizsgálattal és HPLC-vel követjük.

A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat összeöntjük és 5 kromatográfiás futtatás homogén frakcióit betöményítjük, a szerves oldószer eltávolítására.

A kapott oldatot 1M nátriumkloriddal az eredeti térfogat kétszeresére hígítjuk és ezt az oldatot felvisszük egy szílanizált szilikagél oszlopra (50 g; ágymagasság 5 cm; szílanizált szilikagél 60, Merck Inc.), amelyet vizzel hoztunk egyensúlyba.

Az oszlopot a sók teljes eltávolításáig (vizes AgNO₃ hozzáadása után az eluátumokban nem jelenik meg AgCl csapadék) ionmentesített vízzel mossuk, majd 1:1 térf./térf. acetonitril: víz eleggyel eluáljuk. A hasonló antibiotikum-tartalmú eluátumokat (HPLC elemzés) ezután összeöntjük, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be és így egy vizes fázist kapunk, amelyet fagyasztva szárítunk. Kitermelések:

— A 40926 antibiotikum PA faktor: 55 mg — A 40926 antibiotikum PB faktor: 51 ml — A 40926 antibiotikum A faktor: 38 mg — A 40926 antibiotikum B_o faktor: 33 mg.

6. eljárás

Alternatív eljárás az A 40926 antibiotikum B faktor elkülönítésére

A 2. eljárás szerint két kísérletet végzünk és az utolsó lépésből származó összeöntött koncentrátumot szűrjük, majd a szűrletet felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (400 g; az ágy magassága 30 cm; szilikagél 60, 70—230 mesh, Merck Inc.), amelyet előzetesen vízzel hoztunk egyensúlyba.

Az oszlopot 6 liter vízzel öblítjük át és az adszorbeált antibiotikumot acetonitril :víz eleggyel eluáljuk, a következő sorrend szerint :

— 2,7 liter 5 térf./térf.% acetonitril vízben — 1,6 liter 10 térf./térf.% acetonitril vízben — 2,97 liter 15 térf./térf.% acetonitril vízben — 3,15 liter 20 térf ./térf.% acetonitril vízben

Kb. 18 ml-es frakciókat szedünk.

Az eluált frakciók aktivitását papírkorongos biológiai elemzéssel, érzékeny mikroorganizmusok (pl. Bac. subtilis) alkalmazásával határozzuk meg, illetőleg HPLC-vel vizsgáljuk. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat (472—526) összeöntjük és az oldatot csökkentett nyomáson betöményítjük. Ehhez a koncentrátumhoz n-butanolt adagolunk a víz azeotrópos eltávolítására. A visszamaradó butanolos oldatot kis térfogatra töményítjük be az A 40926 antibiotikum B faktor (1,4 g) kicsapására. Ezt a terméket petroléterrel mossuk, kevertetés mellett, és szűréssel gyűjtjük össze (háromszor). Vákuumban való szárítás után 760 mg A 40926 antibiotikum B faktort kapunk.

Ha az A 40926 antibiotikum B faktort az előbbi oszlopkromatográfiás eljárásnak vetjük alá, 540 mg A 40926 antibiotikum B ₀ faktort kapunk végtermékként, amely az előbbiekben az A 40926 antibiotikum B faktorra vonatkozóan közölt fizikokémiai tulajdonságokkal rendelkezik, azzal az eltéréssel, hogy HPLC elemzés során csak egy csúcsot mutat, nevezetesen azt a csúcsot, amelynek retenciós ideje a teikoplanin Á₂ 2 komponenshez viszo21

-21196 220 nyitva 1,22. A továbbiakban eluált másik vegyület retenciós ideje ebben a HPLC rendszerben 1,27; ezt A 40926 antibiotikum Bi faktornak nevezzük. Ez a vegyület az előbbi módszerrel különíthető el (kitermelés 15 mg).

7. eljárás

Az A 40926 antibiotikum PA faktor, illetőleg az A 40926 antibiotikum PB faktor átalakítása A 40926 antibiotikum A faktorrá, illetőleg B faktorrá

50—50 mg A 40926 antibiotikum PA faktort, illetőleg A 40926 antibiotikum PB faktort külön-külön feloldunk 2,5 ml vizes 1 tömeg/térf.%-os ammóniumhidroxidban és a kapott oldatokat kevertetés közben kb. 24 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk.

A vizet n-butanollal végzett azeotróp desztillációval eltávolítva, etiléteres kicsapást végezve és a csapadékot szűréssel összegyűjtve az eredetileg A 40926 antibiotikum PA faktort tartalmazó oldatból A 40926 antibiotikum A faktort, az eredetileg A 40926 antibiotikum PB faktort tartalmazó oldatból pedig A 40926 antibiotikum B faktort kapunk (kitermelés kb. 75%).

8. eljárás

A D-ala-D-ala-Sepharose előállítása

a) A Sepharose aktiválása epiklórhidrinnel.

liter Sepharose 4B-t (Pharmacia Fine Chemicals) porózus üvegszűrőn szűrünk, ionmentesített vízzel mosunk, majd enyhe kevertetés közben szobahőmérsékleten hozzáadjuk 1,2 liter IN NaOH oldathoz. 100 ml epiklórhidrin hozzáadása után az anyagot kb. 20 °C-on hideg vízzel végzett külső hűtés mellett 24 órán át folyamatosan kevertetjük. A szuszpenziót szűrjük és a szilárd anyagot kb. 5 liter ionmentesített vízzel, semleges pH eléréséig, mossuk.

b) A Sepharose-epszilon-ACA-D-Ala-D-Ala előállítása.

g (62,2 mmól) epszilon-ACA-D-Ala-D-Ala-t 200 ml vízben oldunk, az oldat pH-ját 20%-os NaOH-dal 11-re állítjuk be és hozzáadunk kb. 500 ml epiklórhidronnel kezelt Sepharose 4B oldatot (összes epoxid-tartalom kb. 15,5 m-egyenérték), mechanikai kevertetés mellett.

A szuszpenziót pH 11-en és szobahőmérsékleten kb. 2 napon át kevertetjük (amíg az epoxid-tartalom mérésére szolgáló próba negatív eredményt nem ad), szűrjük és a gyantát 300 ml vízzel mossuk. A szűrt gyantát ismét vizzel mossuk (kb. 3 liter), semleges pH eléréséig. 460 ml Sepharose-epszilon-ACA-D-Ala-D-Ala-t kapunk.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás (I) általános képletű antibiotikum, a képletben

A jelentése hidrogénatom vagy —N-(ll—12 szénatomos)-acilaminoglukuronil-csoport és

B jelentése hidrogénatom, nevezetesen az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon AB komplex, az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktor, az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon B_o faktor, az A 40926 antibiotikum N22' acilaminoglukuronil-aglikon Bi faktor, az A 40926 antíbiotikum-aglikon, amely a következő tulajdonságokkal jellemezhető:

A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronilaglikon AB komplex (& nem-addíciós só alakban):

A) UV abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokkal:

lambdamax (nm)

a) 0,IN HCl 282

b) pH 7,4 foszfát puffer 282; 310 (váll)

c) 0,lNKOH 302

B) IR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokkal (cm^-1);

3700—3100; 3000—2800 (nujol); 1650; 1620— 1550; 1500; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1300; 1250—1180; 1150; 1060; 1010; 970; 930; 840; 820

C) az Ή—NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-en, DMSO—dft-ban (hexadeutero-dimctilszulfoxid) felvéve, CF.iCOOH hozzáadása mellett, belső standardként (0,00 ppm) TMS-l alkalmazva (delta, Ppm):

0,84, d és t (izopropil-CHí-ek és terminális CHi);

1,14, m [(CH₂),,]; 1,44, m (—CH₂—C—CO és izopropil—CH); 2,00, t (—CH₂—CO); 2,5, s (DMSOdj); 2,5, s (N—CH₃); 2,93, m [CH, (Z2)j;

3.33, m [CH, (Z’2)j; 3,20—3,80, m (cukor CH-k);

5.34, d (az acilaminoglukuronsav anomer protonja); 4,10, m (X6); 4,33, d (X5); 4,43, d (X7); 4,9, m (X2); 5,1 (4F és Z6); 5,4, s (XI); 5,58, d (X4); 5,7, s (4B); 6,06,d (X3); 7,73, s (6B); 6,26—8,42, s és m (aromás CH-k és peptid—NH-k); 8,70—10,5, széles váll (fenolos OH-k és ΝΗ₂/ d = duplett m = multiplett s - szingulett t = triplett

D) retenciós idő (R,) 1,20 és 1,30 a teikoplanin A₂ 2 komponenshez viszonyítva (R_t = 20,3 perc) az elemzést fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve:

oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluálószerek:

A eluálószer:

CH₃CN 10%

NaH₂POrH₂O (2,5 g/l) 90% pH 6,0-ra beállítva

B eluálószer;

CH₃CN 70%

NaH₂PO₄H₂Ó(2,5g/l) 30% pH 6,0 -ra beállítva eluálás: lineáris grádiens (5%—60% B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc UV detektor: 254 nm belső standard: teikoplanin A₂ 2 komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.)

E) sóképzésre kénes sav-csoportok

F) sóképzésre képes amino-csoportok

G) a maghoz nem kapcsolódik mannóz-egység.

A 40926 antibiotikum N-acilamittoglukuronil-cglikon A faktor (a nem-addíciós só alakban):

A) UV abszorpciós spektrum a következő ab-221 szorpciós maximumokkal:

lambda,,, ax (nm)

a) 0,IN HCl 282

b) pH 7,4 foszfát puffer 282, 310 (váll)

c) 0.1NKOH 302

B) IR abszorpciós spektrum a kővetkező abszorpciós maximumokkal (cm^-1):

3700-3000; 3000-2800; 1650; 1585; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1070; 1060; 1010; 845; 820; 720 (nujol)

C) az ’H—NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-en DMSO— dé-ban (hexadeutero-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta, ppm):

0,85, t (terminális CH3); 1,0—1,3 (alifás CH₂-k);

1,42, m (OC—C—CH,); 2,00, t (CO~CH₂); 2,35, s (n—CH₃); 2,49, s (DMSOds); 2,82, m (Z2);
2,8—3,8 (cukor protonok és Z'21); 4,12, m (X6); 4,56, s (XI); 4,34, d (X5); 4,41, d (X7); 4,96, m (X2); 5,08—5,12 (4F és Z6); 5,40, d (az acilaminoglukuronsav anomer protonja); 5,58, d (X4); 5,74, s (4B); 6,05, d (X3); 7,75, s (6B); 6,25—8,40, s, d és m (aromás CH-k és pepiid—NH-k).

D) a retenciós idő (R_t) 1,20 a teikoplanin A₂ 2 komponenshez viszonyítva (Rt = 20,3 perc), az elemzést fordított fázisú HPLC-vel a kővetkező körülmények között végezve:

oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer:

CH₃CN 10% NaH₂PO₄H₂O (2,5 g/1) pH 6,0-ra beállítva eluálószer: 90% CHjCN 70% NaH₂PO₄«H₂O (2,5 g/1) pH 6,0-ra beállítva 30%

eluálás: lineáris grádiens (5%—60% B eluálószer A eiuálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc UV detektor: 254 nm belső standard: teikoplanin Aj 2 komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.)

E) molekulatömeg kb. 1554, FAB—MS-sel meghatározva

F) sóképzésre képes savas-csoportok

G) sóképzésre képes amino-csoport

H) a maghoz nem kapcsolódik mannóz-egység.

A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-ágiikon Bu faktor (a nem-addfciós só alakban):

A) UV abszorpciós spektrum a kővetkező abszorpciós maximumokkal:

lambdamax (nm)

a) 0, IN HCl 282

b) pH 7,4 foszfát puffer 282; 310 (váll)

c) 0,lNKOH 302

B) ÍR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokkal (cm^-1);

3700—3100; 3000—2800 (nujol); 1650; 1585; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1060; 1010; 980; 840; 820; 720 (nujol);

C) az ’H—NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben), 270 MHz-en, DMSO— d₆-ban (hexadeutero-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta, ppm);

0,84, d (izopropil—CH,-ek); 1,10—1,3 (alifás CHí-ek); 1,3—1,6 (OC—CH₂ és izopropil—CH); 2,00, f (OC—CHi); 2,32, s (NCHj); 2,49, s (DMSOdj); 2,82, m (Z2); 2,9—3,8 (cukor protonok); 4,12, m (X6); 4,44, s (XI); 4,33, d (X5);

4.37, d (X7); 4,95, m (X2); 5,06—5,10 (4F és Z6);

5.38, d (azacilaminoglukuronilsav anomer protonja); 5,59, d (X4); 5,72, s (4B); 6,05, d (X3); 7,74, s (6B); 6,27—8,5 (aromás és peptid —NH-k)

D) a retenciós idő (RJ 1,30 a teikoplanin A₂ 2 komponenshez viszonyítva (R, = 2O,3 perc) az elemzést fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve:

oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)

4,6 mm (belső átmérő) X 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 μιη)

A eluálószer:

CHaCN 10% NaH₂PO₄-H₂O (2,5 g/1) pH 6,0-ra beállítva eluálószer: 90% CHjCN 70% NaH₂PO₄H₂O (2,5 g/1) pH 6,0-ra beállítva 30%

eluálás: lineáris grádiens (5%—60% B eluálószer A eiuálószerben), 40 perc alatt áramlást sebesség: 1,8 ml/perc UV detektor: 254 nm belső standard: teikoplanin A₂ 2 komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.)

E) molekulatömeg kb. 1568 FAB—MS-sel meghatározva

F) lóképzésre képes savas-funkciók

G) sóképzésre képes amino-funkció

H) a maghoz nem kapcsolódik mannóz-egység.

A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukttronil-aglikon Bi faktor (a nem-addíeíós só alakban): molekulatömege kb. 1568 FAB—MS-sel meghatározva és lényegében azokkal a fizikokémiai tulajdonságokkal rendelkezik, amelyeket az előbbiekben az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronll-aglikon B_o faktorra vonatkozóan ismertettünk, a következő eltérésekkel:

0,84 ppm-nél az előbbiekben leirt NMR-rendszerben triplettet mutat, amely egy n-propil-csoport metilcsoportjának tulajdonítható;

retenciós ideje az előbbiekben leírt rendszerben a teikoplanin N 2 komponenshez viszonyítva 1,32.

A 40926 antibiotikum ágiikon (a nem-addíciós só alakban):

A) UV abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokkal:

lambdamax (nm)

a) 0,lN HCl 280

b) pH 7,4 foszfát puffer 280; 310 (váll)

c) 0,lNKOH 299

B) IR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokkal (cm^-1):

3700—3100; 3000—2800 (nujol); 1655; 1620— 1550; 1500; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1300; 1205; 1145; 1010; 970; 930; 840

C) az Ή—NMR spektrum a kővetkező jel-cso23

-231 portokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-en, DMSO— de (hexadeutero-dimetilszulfoxid) és CF3COOH elegyében felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta, ppm):

2,51, s (DMSO—d₃); 2,50, s (NCH₃); 2,88, m (Z2);
3,33, m (Z’2); 4,10, m (X6); 4,34, d (X5); 4,43, d (X7); 4,93, m (X2); 5,04, s (4F); 5,09, s (Z6); 5,54, d (X4); 5,75, s (4B); 6,05, d (X3); 7,76, s (6B);

6,3-8,4 (aromás és peptid-NH-k)

D) retenciós idő (R_t) 0,59 a teikoplanin A₂ 2 komponenshez viszonyítva (R, = 20,3 perc) az elemzést fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve:

oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm/Altex/Beckman)
4,6 mm (belső átmérő) x 250 ram elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)

A eluálószer:

CH3CN 10% NaH₂PO₄-H₂O(2,5g/l) 90% pH 6,0-ra beállítva eluálószer: CH₃CN 70% NaH₂PO₄H₂O (2,5 g/1) 30%

pH 6,0-ra beállítva eluálás: lineáris grádiens (5%—60% B eluálószer

A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc UV detektor: 254 nm belső standard: teikoplanin A₂ 2 komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.)

Ugyanilyen körülmények között az L 17054 antibiotikumhoz (Gruppo Lepetit, 119575 sz. európai szabadalmi bejelentés) viszonyított retenciós idő

1,42.

E) molekulatömeg FAB—MS-sel meghatározva kb. 1211

F) sóképzésre képes sav-csoportok

G) sóképzésre képes amino-funkció

H) a maghoz nem kapcsolódik mannóz-egység, valamint addíciós sói előállítására, azzal jellemezve, hogy — az A 40926 antibiotikum komplexet, A 40926 antibiotikum AB komplexet, A 40926 antibiotikum A faktort, A 40926 antibiotikum B faktort, A 40926 antibiotikum Bo faktort, A 40926 antibiotikum PA faktort, A 40926 antibiotikum PB faktort ellenőrzött savas hidrolízisnek vetjük alá egy erős savval, megfelelő szerves oldószerben, korlátozott mennyiségű (0,1—10 tömeg/tömeg%) víz jelenlétében;

— ha a végtermékek keverékéhez jutunk, kívánt esetben ezeket kromatográfiás eljárással választjuk szét.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakció hőmérsékletét 4 °C és 80 °C között tartjuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy erős savként hidrogénhalogenideket, foszforsavakat, kénsavat vagy halogén-ecetsavakat alkalmazunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy erős savként sósavat alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szerves oldószerként 1—4 szénatomos alkil-szulfoxidot, 1—4 szénatomos alkil-formamidot, dioxánt, tetrahidrofuránt vagy hasonló oldószereket alkalmazunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrolízist dimetil-szulfoxid és tömény sósav 8:2—9,5:0,5 arányú keverékével, 40 °C—80 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre.

5
7. Az I. igénypont szerinti eljárás az, A 40926 antibiotikum N-acilamínoglukuronii-ágiikon komplex vagy egy faktora előállítására, azzal jellemezve, hogy az A 40926 antibiotikum komplexet, A 40926 antibiotikum AB komplexet, A 40926 antibioti10 kum A faktort, A 4Ö926 antibiotikum B faktort, A 40926 antibiotikum Bo faktort, A 40926 antibiotikum PA faktort, A 40926 antibiotikum PB faktort ellenőrzött savas hidrolízisnek vetjük alá 9:1— 9,5:0,5 arányú dimetil-szulfoxid — 37 tömeg%-os

15 sósav eleggyel, kb. 65 °C hőmérsékleten, kb. 5 órán át, és kívánt esetben kromatográfiás eljárással szétválasztjuk az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon A faktort és az A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikon B

20 faktort.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A 40926 antibiotikum ágiikon előállítására, azzal jellemezve, hogy az A 40926 antibiotikum komplexet vagy valamely faktorát, az A 40926 antibiotikum AB

25 komplexet, az A 40926 antibiotikum A faktort, A 40926 antibiotikum B faktort, A 40926 antibiotikum PA faktort, A 40926 antibiotikum PB faktort, A 40926 antibiotikum B_o faktort, A 40926 anibiotikum mannozil-aglikont vagy az A 40926 an30 ibiotikum N-acilaminoglukuronil-aglikont — az AB komplexet vagy valamelyik faktorát — ellenőrzött savas hidrolízisnek vetjük alá (a) egy szerves protikus oldószer jelenlétében, amilyenek a reakció hőmérsékletén folyékony ali35 fás és alfa-halogénezett alifás savak, a reakció hőmérsékletén folyékony, vizzel kissé elegyedő alifás és cikloalifás alkanolok, a reakció hőmérsékletén folyékony, vízzel kissé elegyedő fenil-helyettesített rövidszénláncú alkanolok — ahol a fenilcsoport

40 kívánt esetben 1—4 szénatomos alkil-, 1—4 széna omos alkoxi- vagy halogén-helyettesítőt tartalir azhat —, és a reakció hőmérsékletén folyékony b'ta-poiihalogénezett rövidszénláncú alkanolok, (b) egy, az oldószerrel kompatíbilis oldószerrel,

45 amilyenek az erős ásványi savak, erős szerves savak, és az. erős savas kationcserélő gyanták, hidrogén alakban, (c) kb. 20 °C és kb. 100 °C közötti reakció-hőmérsékleten.

50
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A 40926 antibiotikum ágiikon előállítására azzal jellemezve, hogy az A 40926 antibiotikum komplexet, A 40926 antibiotikum AB komplexet, A 40926 antibiotikum A faktort, A 40926 antibiotikum B faktort, A

55 40926 antibiotikum B_o faktort, A 40926 antibiotikun PA faktort, A 40926 antibiotikum PB faktort, A 40926 antibiotikum N-acilaminoglukuronil ágiikon ABkomplexet vagy valamely faktorát, vagy az A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont gQ ellenőrzött savas hidrolízisnek vetjük alá 8:2— 9,5:0,5 dii ,etil-szF.lfoxid:37 tömeg%-os sósav eleggyel, kb. 80 °C hőmérsékleten.
10. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellen[ezve, hogy egy 1. igénypont szerinti eljárással előállított vegyületet egy gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal és adott esetben adalékanyagokkal gyógyszerkészítménnyé feldolgoz. uk.