JPH0771479B2 - 抗生物質ａ５１５６８因子ａおよびｂを産生する微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、これまで記載されたことのない
微生物、ノカルジア・オリエンタリス(Ｎocardia orie
ntalis)ＮＲＲＬ１５２３２に関する。ノカルジア・オ
リエンタリスＮＲＲＬ１５２３２またはＡ５１５６８を
産生するその変異株(mutantまたはvariant)を深部通気
発酵の条件下で培養すると、本明細書中でＡ５１５６８
因子ＡおよびＢと称する抗生物質が生産できる。ノカル
ジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１５２３２は通常Ａ５１
５６８因子ＡおよびＢのおよそ９５:５混合物を生成す
る。上記抗生物質は病原性微生物、特に、ペニシリン耐
性のグラム陽性菌であるスタフィロコッカス属およびス
トレプトコッカス属の菌の増殖を抑制する。

【０００２】非常に多くの微生物が病原性を有し、ヒト
および動物の疾病誘因物質である。多年に亘り、病原性
微生物に対して有効な非常に多数の抗生物質が開発され
てきた。しかし、これらの病原微生物により引き起こさ
れるヒトまたは動物の疾病をより良く治療するために前
記微生物に対して更に有効な薬剤の開発が今なお望まれ
ている。

【０００３】抗生物質Ａ５１５６８因子ＡおよびＢはグ
リコペプタイド系抗生物質に属する抗グラム陽性菌抗生
物質である。

【０００４】当該分野で既に知られているグリコペプタ
イド系抗生物質としては、特に、バンコマイシン[ＭcＣ
ormick et al．,アメリカ合衆国特許ＮＯ．３,０６
７,０９９(１９６２年１２月４日)。Ｗilliamson et
al．,Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc．１０３,６５８０−６５８
５(１９８１)に構造記載。],アクタプラニン(抗生物質
Ａ−４６９６)[Ｈamill et al．,アメリカ合衆国特許
ＮＯ．３,９５２,０９５(１９７６年４月２０日)。Ｄeb
ono,アメリカ合衆国特許ＮＯ．４,３２２,３４３(１９
８２年３月３０日)に部分構造記載。],リストセチン[イ
ギリス特許ＮＯ．７６５,８８６(１９５７年)。Ｋalman
et al．,Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc．１０２,８９７−９
０５(１９８０)にリストセチン複合体の中の１因子、リ
ストセチンＡの構造記載。]、アボパルシン[Ｋunstmann
et al．,アメリカ合衆国特許ＮＯ．３,３３８,７８
６(１９６７年８月２９日)。Ｅllestad et al．,Ｊ．
Ａm．Ｃhem．Ｓoc．１０３,６５２２−６５２４(１９８
１)に構造記載。]が例示される。

【０００５】本発明は、特に、構造式(Ｉ)で表わされる
単離抗生物質もしくはその製薬上許容される塩またはこ
れらのいづれかを主成分として含有する抗生物質混合物
を提供する。ここで、nが１の場合の式(Ｉ)の抗生物質
をＡ−５１５６８因子Ａと表わし、nが２の場合をＡ−
５１５６８因子Ｂと表わす。

【化１】 [式中、nは１または２を表わす。]

【０００６】抗生物質Ａ５１５６８因子Ａは白色無定形
固体である。抗生物質Ａ５１５６８因子Ａの元素分析は
以下のおおよそのパーセント組成を示す。 Ｃ,５０．６３％;Ｈ,５．０７％;Ｎ,８．３６％; Ｃl,８．１９％;Ｏ,２５．１６％ 当該抗生物質の分子量は、ファスト・アトム・ボンバー
ドメント・マス・スペクトル(fast−atom−bombardment
mass spectrometry)によれば約１４３５である。

【０００７】抗生物質Ａ５１５６８因子Ａのプロトン核
磁気共鳴スペクトルは、ジメチルスルホキシド中６０
℃,３６０ＭＨzで測定した。構造式中の幾つかある６員
環を次式に示すようにアルファベットを付して識別す
る。

【化２】

【０００８】化学シフト(ppm)の一覧は次の表１に示す
とおりである。

【０００９】

【表１】

【００１０】抗生物質Ａ５１５６８因子Ａのプロトン核
磁気共鳴スペクトルは、バンコマイシンのものと非常に
類似している。測定によりみられる主たる顕著な相異点
は、Ａ５１５６８のスペクトルにはＮ−(メチル)ロイシ
ンに関連したＮ−ＣＨ₃共鳴が存在しないことである。
従って、バンコマイシンのプロトンＮＭＲスペクトル
は、Ａ５１５６８因子ＡのプロトンＮＭＲスペクトルに
はみられない、２３９ppmにおけるメチルの一重線を有
する。

【００１１】分子量、プロトン核磁気共鳴スペクトル・
データーおよび元素分析に基づけば、Ａ５１５６８因子
Ａの実験式はＣ₆₅Ｈ₇₃Ｃl₂Ｎ₉Ｏ₂₄である。

【００１２】抗生物質Ａ５１５６８因子Ａの６６％ジメ
チルホルムアミド水溶液中での電位差滴定によれば、p
Ｋa値としてＮ６．２、８．８、１０．３および１２．
８５(開始pＨ＝６．１２)を示した。

【００１３】抗生物質Ａ５１５６８因子Ａは次のような
特異的旋光を示す。[α]Ｄ²⁵℃＝−２０．４°(c＝１０
mg／ml、水)、[α]₃₆₅ ²⁵℃＝−３３．６°(c＝１０mg／
ml、水)。抗生物質Ａ５１５６８因子ＡのＫＢrペレット
における赤外線吸収スペクトルは添付の図１に示すとお
りである。その認識し得る吸収極値としては次の値が観
察される。３４００(巾広、強)、３３８０(巾広、強)、
１６５７(巾広、強)、１５８７(やや強)、１５０５(や
や強)、１４２４(中程度)、１３９６(中程度)、１３２
８(巾広、弱)、１３１０(巾広、弱)、１２３１(やや
強)、１１７４(弱)、１１５６(弱)、１１２８(中程
度)、１０６２(やや強)、１０２８(弱)、１０１５
(弱)、９９０(弱)、８８２(弱)、８８１(弱)cm^-1。

【００１４】抗生物質Ａ５１５６８因子Ａの水中におけ
る、酸性、中性および塩基性条件下での紫外線吸収極値
を、次の表２に記載する。

【表２】 抗生物質Ａ５１５６８因子ＡのＵＶスペクトル 酸性または中性極値 mm(ε) 塩基性極値 nm(ε) ２７８(５,５００) ３０２(６,０００) ２３４(肩)(２５,０００) ２６４(肩)(１０,０００) 抗生物質Ａ５１５６８因子Ｂ(式Ｉにおいてn＝２)は白
色無定形固体である。Ａ５１５６８因子Ｂの分子量はフ
ァスト・アトム・ボンバードメント・マス・スペクトル
によれば約１４３７である。

【００１５】抗生物質Ａ５１５６８因子Ｂのプロトン核
磁気共鳴スペクトルは、ジメチルスルホキシド中６０
℃,３６０ＭＨzで測定した。構造式中の幾つかある６員
環を次式に示すようにアルファベットを付して識別す
る。

【化３】

【００１６】化学シフト(ppm)の一覧は、次の表３に示
すとおりである。

【表３】

【００１７】抗生物質Ａ５１５６８因子Ｂのプロトン核
磁気共鳴スペクトルは、バンコマイシンおよびＡ５１５
６８因子Ａのものと非常に類似している。測定によりみ
られる主たる顕著な相異点は、バンコマイシンのスペク
トルにみられるＮ−(メチル)ロイシンに関連したＮ−Ｃ
Ｈ₃共鳴ならびにバンコマイシンおよびＡ５１５６８因
子Ａのスペクトルにみられるアスパラギン共鳴が存在し
ないことである。バンコマイシンおよびＡ５１５６８因
子Ａにみられるアスパラギン共鳴がＡ５１５６８因子Ｂ
ではグルタミン共鳴に置き換わっている。

【００１８】マス・スペクトル・データー，プロトン核
磁気共鳴スペクトル・データーおよび対応するＡ５１５
６８因子Ａのデーターとの比較に基づけば、抗生物質Ａ
５１５６８因子Ｂの実験式はＣ₆₅Ｈ₇₃Ｃl₂Ｎ₉Ｏ₂₄であ
る。

【００１９】因子ＡおよびＢを含有する抗生物質Ａ５１
５６８混合物はこれまで未記載の株、ノカルジア・オリ
エンタリスＮＲＲＬ１５２３２を培養することにより製
造する。

【００２０】本発明は、更に、これまで未記載の株、ノ
カルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１５２３２およびそ
の生物学的に純粋な菌株に関する。簡便にするために、
ノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１５２３２の生物
学的に純粋な培養菌をＡ５１５６８．１菌株と称する。

【００２１】Ａ５１５６８．１菌株は、Ａ５１５６８菌
から自然選択により誘導される変異株である。このＡ５
１５６８菌は、最初はメキシコのユカタンで採取した土
壌試料から単離した。

【００２２】Ａ５１５６８．１菌株は、刊行物中のノカ
ルジア属に関する記載との比較と同時に実験的な比較か
らノカルジア・オリエンタリスの菌株として分類され
る。上記刊行物とは、Ｄ．Ｂerd,“Ｌaboratory Ident
ification of ＣlinicallyImportant Ａerobic Ａc
tinomycetes",Ａppl．Ｍicrobirol．２５(４),６６５−
６８１(１９７３);Ｂergey's Ｍanual of Ｄetermin
ative Ｂacteriology,８th Ｅdition,Ｒ．Ｅ．Ｂucha
nan and Ｎ．Ｅ．Ｇibbons編集(Ｔhe Ｗilliams an
d Ｗilkins Ｃo．,Ｂaltimore);Ｒ．Ｅ．Ｇordon et
al．,“Ｎocardia coeliaca,Ｎocardia autotrophi
a,and the Ｎocardin Ｓtrain",Int．Ｊ．Ｓyst．Ｂ
acteriol．２４(１),５４−６３(１９７４);Ｒ．Ｅ．Ｇ
ordonet al．,“Ｒesistance to Ｒifampin and
Ｌysozyme of Ｓtrains ofＳome Ｓpecies of Ｍ
ycobacterium and Ｎocardia as a ＴaxonomicＴo
ol",Int．Ｊ．Ｓyst．Ｂacteriol．２７(３),１７６−
１７８(１９７７);Ｓ．Ａ．Ｗaksman,Ｔhe Ａctinomyc
etes Ｖol．ＩＩ,[Ｔhe Ｗilliams andＷilkins Ｃ
o．,Ｂaltimore(１９６１)];Ｒ．Ｅ．Ｇordon et a
l．,“Ｓome Ｂits and Ｐieces of the Ｇenus
Ｎocardia:Ｎ,carnea,Ｎ．vacinii,Ｎ,transvalensi s,
Ｎ,orientalis,and Ｎ．aerocolonigenes",Ｊ．Ｇen．
Ｍicrobiol．１０９,６９−７８(１９７８);Ｓ．Ｊ．Ｍ
ishra et al．,“Identification of Ｎocardiae
and Ｓtreptomycetes of Ｍedical Importance",
Ｊ．Ｃlin．Ｍicrobiol．１１(６),７２８−７３６(１
９８０);Ｐittenger etal．,“Ｓtreptomyces ori ent
alis,n．sp．,the Ｓource of Ｖancomycin",Ａntib
iot．and Ｃhemoth．ＶＩ(ＩＩ),６４２−６４７(１９
５６)である。

【００２３】Ｇordon et al．,“Ｎocardia coeliac
a,Ｎocardia autotrophia,and the Ｎocardin Ｓtr
ain",Ｉnt．Ｊ．Ｓyst．Ｂacteriol．２４(１),５４−
６３(１９７４)に記載されているようなノカルジア種の
特徴付けに適した方法であると同時に、Ｓhirling and
Ｇottlieb,“Ｍethods of Ｃharacterization of
Ｓtreptomyces Ｓpecies",Int．Ｊ．Ｓyst．Ｂacteri
ol．１６(３),３１３−３４０(１９６６)に記載されて
いるようなストレプトマイセス種の特徴付けにインター
ナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト(ＩＳ
Ｐ)が適しているとする方法または手段は次のとおりで
あった。

【００２４】Ａ５１５６８．１菌株の特徴 形態 Ａ５１５６８．１菌株は広範囲に基底および気中菌糸体
を生産する。光学顕微鏡下で観察すると、気中菌糸はク
モの巣様である。深部振盪条件下で増殖させると、菌糸
は短い菌糸体フラグメントに分壊する。

【００２５】気中菌糸を光学顕微鏡下で観察すると分生
胞子は観察されなかったが、走査電子顕微鏡下では観察
される。この特徴は、Ａ５１５６８．１菌株をＩＳＰ培
地Ｎo．５および水道水寒天培地で増殖させると観察さ
れる。胞子表面の状態は滑らか(Ｓm)である。胞子の形
状は球形〜円筒状であり、胞子は少量、不規則に生成す
る。この形態は、バージーズ・マニュアル(同上)の記載
に従えば、非ストレプトマイセス属に分類される。

【００２６】培養上の特徴 Ａ５１５６８．１菌株は、酵母−デキストローズ寒天培
地および他の多くの寒天培地上でよく増殖し、その増殖
は、しわ状あるいは薄片状になることもあった。全体色
が灰色系(ＧＹ)あるいは時々は白色系(Ｗ)である胞子を
有する気中菌糸体を豊富に産生した。ＴresnerとＢacku
s系[Ｔresner and Ｂackus,“Ｓystemof Ｃolor Ｗ
heels for Ｓtreptomycete Ｔaxonomy",Ａppl．Ｍic
robiol．１１,３３５−３３８(１９５６)参照]における
灰色系で最も類似した色タブ(tab)はd明灰色〜２dc黄灰
色である。

【００２７】気中での増殖は、典型的なストレプトマイ
セス属ほど密でも長くもない。この気中での増殖は、無
機塩−デンプン寒天培地(ＩＳＰＮＯ．４)、グリセリン
−アスパラギン寒天培地(ＩＳＰＮＯ．５)およびグリセ
リン−グリシン寒天培地上でみられるが、酵母−麦芽エ
キス寒天培地(ＩＳＰＮＯ．２)上で最もよく観察され
る。

【００２８】次の寒天培地上では、裏面に独特の暗褐色
が観察される。ＩＳＰＮo．２、ＩＳＰＮＯ．５、チロ
シン寒天培地(ＩＳＰＮＯ．７)およびグリセリン−グリ
シン寒天培地。この色はpＨにより影響されない。上記
の培地中ならびにツアペックの溶液寒天培地中およびグ
ルコース−アスパラギン寒天培地中では、明〜赤褐色の
可溶性色素も産生される。他の培地中でのＡ５１５６
８．１菌株の裏面色は黄褐色である。

【００２９】変化性をプレートで調べると、Ａ５１５６
８．１菌株はコロニーの混在型を示さなかったので、安
定した単離株である。種々の培地上でノカルジア・オリ
エンタリスＡＴＣＣ１９７９５と比較したＡ５１５６
８．１の培養上の特徴を次の表４および表５に示す。

【００３０】色名は、ＩＳＣＣ−ＮＢＳ Ｃentroid
Ｃolor Ｃharts Ｓample Ｎo．２１０６(Ｎational
Ｂureau of Ｓtandards,Ｕ．Ｓ．Ｄepartment of
Ｃommerce,１９５８)およびthe Ｃolor Ｈarmony Ｍ
anual,４th Ｅdition(ＣolorＳtandards Ｄepartmen
t,Ｃontainer Ｃorporation of Ａmerica,Ｃhicago,
Ｉllinois,１９５８)に従って表わした。

【表４】

【表５】

【００３１】細胞壁に関する知見 加水分解したＡ５１５６８．１菌株の全体細胞を用い
て、Ｍ．Ｐ．Ｌechevalier,“Ｉdentification of Ａ
erobic Ａctinomycetes of Ｃlinical Importanc
e",Ｊ．Ｌab．Ｃlin．Ｍed．７１,９３１−９４４(１９
６８)のクロマトグラフィー法により、特性表示となる
糖類としてどのような糖類が存在するかを調べた。

【００３２】加水分解した全体細胞を用いて、Ｂecker
et al．,Ａppl．Ｍicrobiol．１１,４２１−４３３
(１９６４)の方法に従って、ジアミノピメリン酸の異性
体を測定した。上記に関する試験結果を以下に示す。

【表６】 試 験 観 察 結 果 特性表示的糖類 ガラクトース,アラビノース ２,６−ジアミノピメリン酸の異性体 リボース・メソ異性体 上記の結果はＡ型の全体細胞糖パターンおよびＩＶ型の
細胞壁を示し、主細胞壁成分のこの組合せはノカルジア
属であることを示す。Ｍ．Ｐ．Ｌechevalier(同上)参
照。

【００３３】全体細胞のメタノリシス物の薄層クロマト
グラフィーを用いて、Ｄ．Ｅ．Ｍinnikin et al．,
“Ｄifferentiation of Ｍycobacterium,Ｎocardia,a
nd Ｒelated Ｔaxa by Ｔhin−layer Ｃheromatog
raphic analysis of Ｗhole−organism Ｍethanoly
sates",Ｊ．Ｇen．Ｍicrobiol．８８,２００−２０４
(１９７５)に記載の方法に従えば、ミコリン酸のメチル
エステルは観察されなかった。

【００３４】上記の測定に加えて、Ａ５１５６８．１菌
株をＮ．オリエンタリス関連の２１株に関する刊行物中
のデーターならびにＮＲＲＬ２４５１,ＮＲＲＬ２４５
２およびＡＴＣＣ１９７９５と比較して調べた。培養
上、形態上および生理学上の特徴の比較を次の表７、
８、および９に記載する。

【表７】

【表８】

【表９】

【００３５】更に、Ａ５１５８６．１,ＮＲＲＬ２４５
１,ＮＲＲＬ２４５２およびＡＴＣＣ１９７９５菌株に
よる炭水化物からの酸産生をＮ．オリエンタリス関連の
２１株に関する刊行物中の結果と比較した。これを次の
表１０および表１１に記載する。

【００３６】

【表１０】

【表１１】

【００３７】Ａ５１５６８．１について観察した培養
上、形態上および生理学上の特徴により、Ｒ．Ｅ．Ｇor
don et．al．,“Ｓome Ｂits and Ｐieces of th
e Ｇenus Ｎocardia:Ｎ．carnea,Ｎ．vaccinii,Ｎ．t
ransvalensis,Ｎ．orientalis,and Ｎ．aerocolonigen
es",Ｊ．Ｇen．Ｍicrobiol．１０９,６９−７８(１９７
８)およびＳ．Ｊ．Ｍishra et al．,“Ｉdentificati
on of Ｎocardia andＳtreptomycetes of Ｍedica
l Ｉmportance",Ｊ．Ｃlin,Ｍicrobiol．１１(６),７
２８−７３６(１９８０)に記載されているようなノカル
ジア属の１４種に関する記載と比較した。また、これと
同時に、Ａ５１５６８．１菌株とＮＲＲＬ２４５１,Ｎ
ＲＲＬ２４５２およびＡＴＣＣ１９７９５菌株とを実験
的に比較した。

【００３８】ここで、類似度係数を次式から計算した。 Ｓ＝[Ｎs⁺＋Ｎs^-]／[Ｎs⁺＋Ｎs^-＋Ｎd]×１００ [式中、Ｎs⁺＝陽性類似点の数 Ｎs^-＝陰性類似点の数 Ｎd＝非類似点(相異点)の数] Ｗ．Ａ．Ｋurylowicz et al．,“Ｎumerical Ｔaxon
omy of Ｓtreptomycetes",Ｐolish Ｍedical Ｐubl
ishers,Ｗarsaw(１９７５)参照。

【００３９】類似度係数を計算するには、主に生理学上
の特徴を用いた。比較は、Ａ５１５６８．１菌株に対し
て他の全ての株を観察することにより行った。従って、
Ａ５１５６８．１自体の係数は１００となった。この比
較を次の表１２に記載する。

【００４０】

【表１２】 Ａ５１５６８．１菌株と数種のノカルジア属関連株との類似度係数 菌 株 係 数 Ａ５１５６８．１ １００ ＮＲＲＬ２４５１ ９５ ＮＲＲＬ２４５２ ９５ ＡＴＣＣ１９７９５ ８６ Ｎ．オリエンタリス(２１株を合せて) ８９ Ｎ．エアロコロニゲネス ７６ (Ｎ．aerocolonigenes) Ｎ．ヒルスタ ６８ (Ｎ．hirsuta) Ｎ．オートトロフィア ６５ (autotrophia) Ｎ．ダッソンヴィレイ ６３ (Ｎ．dassonvillei) Ｎ．マドレア ６３ (Ｎ．madurea) Ｎ．ブラジリエンシス ６１ (Ｎ．brasiliensis) Ｎ．カヴィアエ ６１ (Ｎ．caviae) Ｎ．トランスヴァレンシス ５７ (Ｎ．transvalensis) Ｎ．アマラエ ５３ (Ｎ．amarae) Ｎ．ヴァクシニイ ５０ (Ｎ．vaccinii) Ｎ．アステロイデス ４７ (Ｎ．asteroides) Ｎ．カルネア ４７ (Ｎ．carnea) Ｎ．ペレテイエリ ３９ (Ｎ．pelletieri)

【００４１】Ａ５１５６８．１株菌とＮ．オリタンエリ
スＡＴＣＣ１９７９５との類似点および相異点を次の表
１３に示す。

【００４２】

【表１３】 Ａ５１５６８．１菌株とＡＴＣＣ１９７９５菌株との類似点および相異点 類 似 点 相 異 点 炭水化物から酸生成気中菌糸 数種の培地での培養上の特徴 カタラーゼ産成 気中菌糸体色 細胞壁−ＩＶ型 裏面色 分生胞子存在 可溶性色素産生 培養上の特徴 キサンチンの分解 分解 Ｎacl耐性 カゼイン 硝酸還元 ＤＮＡ ノボビオシンへの耐性 ヒポキサンチン チロシン 菌糸体の分裂 ゼラチン液化 加水分解 エスキュリン 馬尿酸塩 脱脂乳 デンプン アデニンの分解不能 メラノイド色素産生無 形態 フォスファターゼ産生 耐性 リゾチーム ペニシリン リファンピン バシトラシン感受性 胞子の形状 胞子の表面状態 染色反応 全体細胞の加水分解物の 糖パターンＡ型 ５０℃,８時間後に生存 温度範囲(１０−４０℃) ウレアーゼ産生 有機化合物の利用 ＣＳＭ培地での生育増殖

【００４３】Ａ５１５６８．１菌株は、the Ｎorthern
Ｒegional Ｒesearch Ｃenter,Ｕ．Ｓ．Ｄepartmen
t of Ａgriculture,Ａgricultural Ｒesearch Ｓer
vice,Ｐeoria,Ｉllinois ６１６０４に寄託され、保存
菌株の一部となっており、ＮＲＲＬ１５２３２の番号の
下に誰でもそこから入手できる。この寄託はブダペスト
条約に基づく国際寄託である（受託日１９８２年１１月
２９日）。

【００４４】抗生物質Ａ５１５６８因子ＡおよびＢの製
薬上許容される非毒性塩も本発明の一部である。“製薬
上許容される"塩とは、温血動物に対する全体としての
化合物の毒性が非塩型と比較して増加しない塩である。
抗生物質Ａ５１５６８因子ＡおよびＢの代表的で適当な
塩としては、有機および無機酸(例えば、硫酸、リン
酸、塩酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、マレイン
酸、フマル酸など)と常法で反応させて製造する酸付加
塩ならびにカルボキシル基から強塩基(例えば、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、水酸化アンモニウム、ジエタノールアミンな
ど)により製造する塩が包含される。

【００４５】種々の細菌に対する抗生物質Ａ５１５６８
因子Ａの活性を寒天希釈法で測定して、最少阻害濃度
(ＭＩＣ)値を記載した次の表１４に示す。

【００４６】

【表１４】 種々の細菌に対するＡ５１５６８因子Ａの活性 細 菌 ＭＩＣ(μg／ml) スタフィロコッカス・アウレウス (Ｓtaphylococus aureus) ３０５５ ０．５ Ｘ４００ １ Ｖ１３８ １ Ｖ１４０ １ Ｖ１０２ １ スタフィロコッカス・エピデルミディス (Ｓtaphylococcus epidermidis) ２２２ １ ２７０ ２ ２８５ ２ ２１９ １ ２６９ ２ ストレプトコッカス・ピオゲネス (Ｓtreptcoccus pyogenes) Ｃ２０３ ０．５ ＡＴＣＣ１０３８９ ０．５ ストレプトコッカス・エスピー・グループＢ (Ｓtreptococcus sp．Ｇroup Ｂ) ５ ４ １４ ０．５ ストレプトコッカス・エスピー・グループＤ Ｘ６６ １ ９９６０ ４ ２０４１ ２ ８０４３ １ ９９０１ ２ １２２５３Ｆ １ Ｍx１６１ １ ２０５８ ４ ストレプトコッカス・ニューモニアエ (Ｓtreptococcus pneumoniae) パークＩ(Ｐark Ｉ) ０．１２５ Ｂl−４３８ ０．５ ヘモフィルス・パラインフルエンザエ (Ｈaemophilus parainfluenzae) ７９０１ ６４ ９７９６ ６４ ヘモフィルス・インフルエンザエ (Ｈaemophilus influenzae) Ｃ．Ｌ． ３２ Ｍx３６６ ３２ Ｍx３７１ ６４ ７６ ６４ ボンド(Ｂond) ６４ １６８３６ １２８ ４８４２ ３２ ３１２ １２８ ＊各々の菌に付した名前または番号により本試験に用いた微生物の株を識別する 。

【００４７】多数の好気性菌に対する抗生物質Ａ５１５
６８因子ＡおよびＢの生体外系での活性を標準的寒天希
釈測定法を用いて測定した。２４時間後を終了点として
読み取ることにより測定した結果を次の表１５に記載す
る。

【００４８】

【表１５】 Ａ５１５６８因子ＡおよびＢの好気性菌に対する活性 被 験 菌 ＭＩＣ(μg／ml) Ａ Ｂ スタフィロコッカス・アウレウス３０５５(Ｘ１．１) １ ２ スタフィロコッカス・アウレウスＶ４１ １ ２ スタフィロコッカス・アウレウスＶ４００ ２ ２ スタフィロコッカス・アウレウスＳ１３Ｅ １ ２ スタフィロコッカス・エピデルミディスＥＰＩ１ ２ ２ スタフィロコッカス・エピデルミディスＥＰＩ２ １ − スタフィロコッカス・エピデルミディス２２２ − ２ ストレプトコッカス・ピオゲネスＣ２０３ １ ０．５ス トレプトコッカス・ニューモニアエ・パークＩ ０．５ ０．６スト レプトコッカス・エスピー・グループＤ Ｘ６６ １ １ ストレプトコッカス・エスピー・グループＤ９９６０ ４ − ストレプトコッカス・エスピー・グループＤ２０４１ − ２ ヘモフィルス・インフルエンザエ (感受性)ホウルト(Ｈolt) ６４ − (耐性)Ｒ２５２ １２８ − (感受性)Ｃ．Ｌ． − １２８ (耐性)７６ − ６４ エシエリキア・コリＮ１０ ＞１２８ ＞１２８ (Ｅscherichia coli Ｎ１０) エシエリキア・コリＥＣ１４ ＞１２８ ＞１２８ エシエリキア・コリＴＥＭ １２８ ＞１２８ クレブシェラ・ニューモニアエ Ｘ２６ ＞１２８ ＞１２８ (Ｋlebsiella pneumoniae Ｘ２６） クレブシェラ・ニューモニアエＫＡＥ ＞１２８ ＞１２８ クレブシェラ・ニューモニアエＸ６Ｂ − ＞１２８

【００４９】抗生物質Ａ５１５６８因子ＡおよびＢを試
験して、次の表１６に示すように、多数の嫌気性菌に対
して活性であることが分かった。ここでＭＩＣ値は、寒
天希釈法により測定した。

【００５０】

【表１６】 Ａ５１５６８因子ＡおよびＢの嫌気性菌に対する活性 被 験 菌 ＭＩＣ（μg／ml) Ａ Ｂ クロストリジウム・ジフィシレ２９９４ ２ １ (Ｃlostridium difficile ２９９４) クロストリジウム・ペルフリンゲンス８１ １ １ (Ｃlostridium perfringens８１) クロストリジウム・セプチカム１１２８ １ １ (Ｃlostridium septicum１１２８) ユーバクテリウム・エアロファシエンス１２３５ ２ １ (Ｅubacterium aerofaciens １２３５) ペプトコッカス・アサッカロリチカス １３０２ １６ １ (Ｐeptococcus asaccharolyticus１３０２) ペプトコッカス・プレボチ １２８１ ３２ ４ (Ｐeptococcus prevoti１２８１) ペプトストレプトコッカス・アネロビウス１４２８ １ ２ (Ｐeptostreptococcus anaerobius１４２８) ペプトストレプトコッカス・インテルメディウス１２６４ １ １ (Ｐeptostreptococcus intermedius１２６４) プロピオニバクテリウム・アクネス ７９ １ ２ (Ｐropionibacterium acnes７９)ハ゛クテロイテ゛ス・フラシ゛リス 111 32 32 (Ｂacteroides fragilis１１１) バクテロイデス・フラジリス １８７７ ３２ １６ バクテロイデス・フラジリス １９３６Ｂ ３２ ３２ バクテロイデス・シータイオタオミクロン １４３８ ３２ ３２ (Ｂacteroides thetaiotaomicron１４３８) バクテロイデス・メラニノゲニカス１８５６／２８ ＞１２８ ＞１２８ (Ｂacteroides malaninogenicus１８５６／２８) バクテロイデス・メラニノゲニカス ２７３６ １６ ＞１２８ バクテロイデス・ブルガチス １２１１ ３２ ４ (Ｂacteroides vulgatis１２１１) バクテロイデス・コローデンス １８７４ ３２ ３２ (Ｂacteroides corrodens１８７４) フソバクテリウム・シンビオサム １４７０ ２ ３２ (Ｆusobacterium symbiosum１４７０) フソバクテリウム・ネクロフォラム ６０５４Ａ ２ １２８ (Ｆusobacterium necrophorum６０５４Ａ)

【００５１】抗生物質Ａ５１５６８因子Ａは、寒天希釈
法での測定によれば、クロストリジウム・ジフィシレの
多数の株に対しても活性である。本試験の結果を次の表
１７に記載する。

【００５２】

【表１７】抗生物質Ａ５１５６８因子Ａのクロストリジウム・ジフィシレ種株に対する活性 クロストリジウム・ジフィシレ ＭＩＣ(μg／ml) ８４８４ ２ ６８９０ ２ ２６３４ ２ ７８ ２ Ａ−１９４ ２ Ａ−１９５ ２ Ａ−１９６ ２ Ａ−２７９ ２ Ａ−２８０ ２ Ａ−２８１ ２ ＷＡＬ−２１１２ ２ ＷＡＬ−３６５７ ２ ＷＡＬ−４２６８ ２ １０７Ｂ ２ １１１Ｆ ２ １１５３ ２ ３４２４−５Ｂ ２ ３８１６ ２ ３９５０Ｄ ２

【００５３】抗生物質Ａ５１５６８ＡおよびＢは、生体
内系において実験的細菌感染症に対する抗微生物活性を
示した。被験化合物の二種の用量を例となる感染症に罹
ったマウスに皮下投与した場合に得られる活性をＥＤ₅₀
[被験動物の５０％を保護するのに有効な投与量(mg／k
g)、Ｗarren Ｗick et al．,Ｊ．Ｂacteriol．８１,
２３３−２３５(１９６１)参照]で測定した。抗生物質
Ａ５１５６８因子ＡおよびＢのＥＤ₅₀値は以下の如くで
ある(単位はmg／kg×２)。

【表１８】 Ａ Ｂ スタフィロコッカス・アウレウス ３０５５ １．７９ ２．５ ストレプトコッカス・ビオゲネス Ｃ２０３ ３．０３ ７．９４ ストレプトコッカス・ニューモニアエ・パークＩ ２．７１ ２．５

【００５４】また、抗生物質Ａ５１５６８因子Ｂはマウ
スに関して、＞３００ｍｇ／ｋｇ（腹腔内投与）の５０
％致死量（ＬＤ₅₀）を示した。Ａ５１５６８因子Ａおよ
びＢは類似の構造を有するので、Ａ５１５６８因子Ａも
同様に比較的非毒性であると考えられる。さらに本発明
の抗生物質は市販の抗生物質バンコマイシンと緊密な構
造上の関連性を有するので、本発明の抗生物質は、医薬
用途に適さない程の毒性を有しないと考えられる。

【００５５】本発明は、その一側面として、ヒトまたは
動物に抗生物質Ａ５１５６８因子ＡもしくはＡ５１５６
８因子Ｂまたはその製薬上許容される塩を抗生物質とし
て有効な非毒性量、約２５mg〜約２,０００mg投与する
ことを特徴とするヒトまたは動物における感染症を治療
する方法を提供する。

【００５６】ヒトにおける感染症を治療する際には、本
抗生物質を非経口投与する(例えば、筋肉注射、静脈内
注入など)。注射の場合には、本抗生物質またはその製
薬上許容される賦形剤を加えて所望の濃度にしたものを
投与する。適当な賦形剤としては、例えば、注射用水、
０．９％食塩水、５％デキストローズ、リンガー溶液ま
たは他の汎用される賦形剤が例示される。静脈内注入で
投与する場合は、本抗生物質またはその塩を適当な濃度
(例えば、約５％〜約１０％)の生理液または希栄養液と
し、それをゆっくり注入すればよい。または、本抗生物
質を“ピギー・バック(piggy−back)"法で投与してもよ
い。

【００５７】本抗生物質またはその製薬上許容される塩
は、密封バイアル、滅菌したゴム栓付きバイアルまたは
プラスチックの袋中で単位投与剤型とし得る。この単位
投与剤型は、抗酸化剤、溶解剤、拡散剤、緩衝剤などの
添加剤を含有してもよい。ある上記単位投与剤型は、ゴ
ム(ブチルゴム)栓付きバイアル中にＡ５１５６８因子Ａ
もしくはＢまたはその製薬上許容される非毒性塩１００
mgを含有する。また別の単位投与剤型は、滅菌密封バイ
アル中に抗生物質Ａ５１５６８因子ＡもしくはＢまたは
その塩２５０mgを含有する。静脈内注入の場合は、本発
明の単位投与剤型はプラスチックの袋中に抗生物質Ａ５
１５６８因子ＡもしくはＢまたはその製薬上許容される
塩５gを含有する。

【００５８】抗生物質Ａ５１５６８因子ＡまたはＢを抗
微生物剤として用いる場合、経口的にも非経口的にも投
与できる。当業者には明らかなように、抗生物質Ａ５１
５６８因子ＡまたはＢは通常製薬上許容される担体また
は賦形剤と共に投与する。抗生物質Ａ５１５６８因子Ａ
またはＢの投与量は、例えば、治療すべきある特定の感
染症の性状および重症度などの種々の考慮すべき事項に
依存する。当業者には公知なように、投与に適した投与
量範囲および／または単位投与量は、患者または宿主お
よび感染菌などの要因と共に、本明細書で提示したＭＩ
Ｃ値およびＥＤ₅₀値を考慮して決定すればよい。

【００５９】抗生物質Ａ５１５６８因子ＡおよびＢは、
特に、スタフィロコッカス・ストレプトコッカスおよび
プロピオニバクテリウム・アクネス菌の増殖を抑制する
のに有効であるので、例えば、にきびの治療に用い得
る。Ａ５１５６８因子ＡおよびＢの精製物は、皮膚に適
用する場合は、イソプロピルアルコールなどの製薬上許
容される賦形剤中に製剤化することができる。この溶液
中の抗生物質濃度は、約１〜約１５重量／容量％をとり
得る。または、皮膚に適用するに際して、クリームまた
はローションに仕上げることもできる。

【００６０】Ａ５１５６８因子ＡおよびＢは、腸管にお
いて偽膜大腸炎を誘発するクロストリジウム・ジフィシ
レ菌の増殖を抑制するのにも有用である。従って、Ａ５
１５６８因子ＡおよびＢは、製薬上許容される投与剤型
に調製した当該抗生物質またはその製薬上許容される非
毒性塩の有効量を経口投与することにより、偽膜大腸炎
の治療に用いることができる。このような用途には、Ａ
５１５６８因子ＡまたはＢをゼラチンカプセルまたは液
体懸濁液にして投与することもできる。

【００６１】Ａ５１５６８因子ＡおよびＢは、これまで
未記載のノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１５２３
２またはＡ５１５６８を生産するその変異株を、同化し
得る炭素源、窒素源および無機塩を含有する培養培地中
で深部通気発酵の条件下にて実質量の抗生物質活性が得
られるまで培養することにより製造する。大部分の抗生
物質活性はブロスに存在するが、菌糸体にも若干関係し
ているようである。本抗生物質は、菌糸体、即ち、生体
の固まりを濾去することにより発酵液から非常に容易に
分離したのち、濾液から、好ましくは適当な溶離剤を用
いた適当な吸着剤によるカラムクロマトグラフィーによ
り単離する。

【００６２】適当な吸着剤としては、炭素、陰イオンお
よび陽イオン交換樹脂、ポリアミド、カルボキシメチル
セルロース、スチレンおよびジビニルベンゼンの多孔質
共重合体(Ｄaiaion ＨＰ−２０、Ａmberlite ＸＡＤ
樹脂、デキストランを重度に連結させてできる親水性
不溶性分子ふるいクロマトグラフィー培体のようなＤuo
lite 樹脂など)ならびにＴＳＫゲル類などが例示され
る。Ｄaiaion 樹脂は三菱化成工業株式会社(東京、日
本)の製品である。Ａmberlite ＸＡＤ樹脂はＲohm an
d Ｈass(Ｐhiladelphia,Ｐennsylvania)が製造してい
る。Ｄuolite 樹脂はＤaiamond Ｓhamrock(Ｒedwood
Ｃity,Ｃalifornia)の製品である。Ｓephadex樹脂はＰ
harmacia Ｆine Ｃhemicals ＡＢ(Ｕppsala,Ｓwede
n)が製造している。ＴＳＫゲル類は、Ｅ．Ｍerck(Ｄarm
stadt,Ｇermany)およびＢio−Ｒad、(２２００ Ｗrigh
e Ａve．,Ｒichmond,Ｃalifornia,９４８０４)から入
手できる。

【００６３】ノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１５
２３２でＡ５１５６８因子ＡおよびＢを製造するのに用
い得る培地は多種類ある。しかし、生産の経済性、至適
収率および生産物の単離し易さの点から、ある特定の培
地が好ましいものとなる。この培地は同化し得る炭素
源、窒素源および無機塩を含有しなければならない。好
ましい炭素源としては、ポテト・デキストリン、ブラッ
クストラップ糖蜜、グルコース、スクロース、ラクトー
ス、マルトースおよびデンプンなどが例示される。炭素
源の至適濃度は約２〜約５重量％である。

【００６４】好ましい窒素源としては、グルタミン酸ナ
トリウム、肉ペプトン、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、大豆粗粒粉および酵母などが
例示される。

【００６５】微生物を増殖生育させるのに必要な微量必
須元素は、微生物の増殖および生合成の要求に見合うだ
けの量は培地の他の成分中に不純物として存在する。し
かし、培養培地中に、ナトリウム、カリウム、マグネシ
ウム、カルシウム、アンモニウム、塩素、炭素、リン
酸、硫酸、硝酸などのイオンを生じ得る可溶性栄養素無
機塩を更に添加するのは有益である。

【００６６】発泡が問題となる場合は、大量発酵培地に
プロピレングリールなどの消泡剤を少量(即ち、０．２m
l／l)加える必要がある。

【００６７】少量のＡ５１５６８因子ＡおよびＢはフラ
スコ振盪培養で得ることができるが、実質量の本抗生物
質混合物を製造するにはタンク内での深部通気発酵が好
ましい。タンク発酵の場合は、増殖期の接種物を用いる
のが好ましい。この増殖期の接種物は少量の培養培地に
胞子型または菌糸体フラグメントを接種して新しい活発
に増殖する菌株を得ることにより製造される。この増殖
期にある接種物を、次いで大型タンクに移して適当な時
間培養すると、抗生物質Ａ５１５６８混合物が最大収率
で製造される。

【００６８】増殖培地への接種物を得る別法は、胞子の
水性懸濁液の代わりに凍結乾燥ペレットを用いる方法で
ある。凍結乾燥ペレットは当該分野で知られた方法で製
造する。凍結乾燥に供する胞子懸濁液の製造は、滅菌蒸
留水の代わりに滅菌牛血清を用いる事以外は、胞子の水
性懸濁液の製造と同様である。

【００６９】ＮＲＲＬ１５２３２は約２５〜約３７℃の
広い温度範囲で増殖し得る。抗生物質Ａ５１５６８混合
物を最も良く生産するのは約３２〜３４℃である。

【００７０】深部通気培養工程で通常そうであるよう
に、培養培地の隅々まで滅菌空気を拡散させる。当該菌
を効率良く増殖させるために、約１００〜約３００rpm
の撹拌下でのタンク生産に用いる空気量は、１分間当り
培養培地容量に対して約０．１〜約０．２５容量(v／v
／分)の範囲内である。１００lの発酵培地を入れた１６
５l容の容器における至適量は、約２００rpmで回転する
インペラー(impeller)で撹拌した場合、約０．１５(v／
v／分)である。

【００７１】抗生物質活性は、発酵期間のうち、通常は
約２４時間後に存在し、少なくとも約１６８時間は残存
している。抗生物質の生産は、約９０時間〜約１１４時
間の発酵時間に最大となる。

【００７２】本抗生物質混合物の生産を増加させるため
に、p−ヒドロキシフェニルグリシンを５×１０^-3Ｍの
濃度で培地に加えてもよい。この添加によりある実験で
は生産性が６４％増加した。

【００７３】生産性はリン酸塩の濃度にも影響される。
リン酸塩を極少量３×１０^-4Ｍ(０．０５mg／ml)だけ濃
くすると、ある実験では収率が２０％低下した。

【００７４】本抗生物質活性は上清に存在する。試料と
してブロスの試料全部を１０００gで約１５分間遠心分
離し、沈渣を測定用に取出す。測定はマイクロコッカス
・ルテウス(Ｍicrococcus luteus)ＡＴＣＣ９３４１を
用いた寒天ウェル・プレート(well plate)・テストに
より微生物学的に行う。

【００７５】抗生物質Ａ５１５６８混合物の生産は、発
酵の間、バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)
ＡＴＣＣ６６３３を用いた寒天拡散法またはスタフィロ
コッカス・アウレウスＡＴＣＣ９１１４を用いた濁り測
定法で追跡できる。

【００７６】従って、本発明の別の側面は、ノカルジア
・オリエンタリスＮＲＲＬ１５２３２またはＡ５１５６
８を生産するその変異株を、同化し得る炭素源、窒素源
および無機塩を含有する培養培地中で深部通気発酵の条
件下にて実質量の抗生物質活性が得られるまで培養する
ことを特徴とする前記式(Ｉ)の抗生物質の製造法を提供
することである。

【００７７】本発明の実施方法をより充分に例示するた
めに、以下に実施例を提示する。実施例１ 第１段階の接種物の製造 ノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１５２３２の寒天
スラント培地用に次の培地を製造した。

【表１９】 成 分 量(g／l) 前煮沸オートミール ６０．０ 酵母 ２．５ Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．０ ツアペックのミネラル・ストック ５．０(ml／l) 寒天 ２５．０ 脱イオン水 全量を１lとする量

【００７８】ツアペックのミネラル・ストックは以下の
成分で製造する。

【表２０】 成 分 量(g／１００ml) ＫＣl １０．０ ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １０．０ ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．２ 脱イオン水 全量を１００mlとする量 殺菌前のpＨは６．２。水酸化ナトリウム水溶液でpＨ
７．３に調整。殺菌後のpＨは６．７。

【００７９】ノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１５
２３２の胞子は、上述の成分で製造した寒天スラントに
接種し、７日間、約３０℃で培養した。成熟スラント培
地を滅菌蒸留水で包い、滅菌用具で掻き取って胞子また
は菌糸体を緩めた。得られた胞子懸濁液１mlを以下の組
成を有する増殖培地５０mlに接種するのに用いた。

【００８０】

【表２１】 成 分 量(g／l) ポテト・デキストリン ３０．０ 糖蜜・ブラックストラップ ２０．０ バクト−ペプトン(Ｄifco Ｌaboratories) ７．０ Ｌ−チロシン １．０ 脱イオン水 全量を１．０lとする量 混合物のpＨは５．５。これを殺菌前に水酸化ナトリウ
ム水溶液でpＨ７．０に調整した。殺菌後のpＨは６．
１。

【００８１】この増殖期にある接種物を、直径２インチ
のアーク(arc)により２５０rpmで回転する振盪器上で約
３０℃、約４８時間、２５０ml容の広口エーレンマイヤ
ー・フラスコ中で培養した。この培養した培地を小さな
発酵槽に接種する(接種物は培地の０．８容量％にする)
か、または大量の菌糸体を生産するための第２段階のフ
ラスコに接種するのに用いる。

【００８２】Ａ５１５６８．１の発酵 生産培地１００lに上記で得た培養済みの増殖培地０．
８％(８００ml)を接種した。生産培地の組成は次のとお
りであった。

【００８３】

【表２２】 成 分 量(g／l) ポリプロピレングリコール(２０００) ０．２ ポテト・デキストリン ３０．０ ブラックストラップ糖蜜 ２０．０ バクト−ペプトン(Ｄifco Ｌabofatories) ７．０ Ｌ−チロシン １．０ 脱イオン水 全量を１００lとする量 培地のpＨは５．２。これを５Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液で７．１に調整し、１２１℃、１７〜１９psiで４５
分間滅菌した。滅菌後の培地のpＨは６．２。

【００８４】接種した生産培地を１６５l容の発酵タン
ク中で、３０℃にて約１１４時間発酵させた。この発酵
培地に０．１５(v／v／分)の速度にて滅菌空気を通気し
て、汎用される撹拌器により約２００rpmで撹拌した。

【００８５】本抗生物質活性は発酵液の上清に存在す
る。全ブロス試料を１０００gで遠心分離し、デカント
して残った沈渣を測定に供して抗生物質活性を調べた。
これをpＨ６．０のリン酸緩衝液で希釈して、マイクロ
コッカス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１菌株測定法で用い
た寒天ウェル・プレート・テストで微生物学的に測定す
る。

【００８６】実施例２ 抗生物質Ａ５１５６８混合物の単離 因子ＡおよびＢをおよそ９５:５の比率で含有する抗生
物質Ａ５１５６８全発酵ブロス３lに濾過助剤(Ｈyflo
Ｓupercel、ケイソウ土、Ｊohns−Ｍanville,Ｃorp．)
を加えて濾過した。濾液は、２７lあり、pＨは７．８で
あった。この濾液を、３×２５cmのクロマトグラフィー
・カラムに詰めたＤaeaionＨＰ−２０樹脂(多孔質、ベ
ッド型のスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、三菱化
成工業株式会社、東京、日本)に通じた。流出液を廃棄
しカラムを水１lおよび２５％メタノール水溶液５００m
lで洗浄した。抗生物質Ａ５１５６８混合物は、５０％
メタノール水溶液５００mlづつでカラムを２回洗浄して
流出させた。因子ＡおよびＢは同様にＨＰ−２０に吸着
し、同一条件で溶出する。従って、本工程では因子は分
離できなかった。流出した分画の抗生物質活性をＢ．ズ
ブチリスを用いて測定した。より活性な分画を少量まで
濃縮し、凍結乾燥して、因子ＡおよびＢをおよそ９５:
５の比率で含有する粗製の抗生物質Ａ５１５６８混合物
９０５mgを得た。

【００８７】実施例３ 抗生物質Ａ５１５６８混合物の精製 上記実施例２で得た粗製の抗生物質Ａ５１５６８混合物
(９０５mg)を水５０mlに溶解し、１．７×４４cmのクロ
マトグラフィー・カラムに詰めたＳephadexＣＭ−２５
(ＮＨ₄ ⁺サイクル)(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals Ａ
Ｂ,Ｕppsala,Ｓweden)に通じた。流出液を廃棄し、カラ
ムを水２５０mlで洗浄したのち炭酸水素アンモニウムの
中高のグラディエント(Ｈ₂Ｏ→１Ｍ ＮＨ₄ＨＣＯ₃,１
００ml混合チェンバー)で溶出した。２５mlづつ５０分
画採取し、Ｂ．ズブチリス測定法を用いて抗生物質活性
を調べた。

【００８８】活性分画、即ち、抗生物質活性を有する分
画を合した。ＳephadexＣＭ−２５を用いた場合、因子
Ａおよび因子Ｂは別々に吸着され溶出するので、因子Ａ
に富む分画は因子Ｂに富む分画と一致しなかった。混合
物中に存在する因子Ｂの量は因子Ａの量より少なかった
ので、因子Ｂに富む分画は因子Ａに富む分画より比較的
低い抗生物質活性を示した。合した分画は因子Ｂを殆ど
含んでいなかった。生成物を脱塩するために、予め水中
で平衡化したＤaiaion ＨＰ−２０樹脂を詰めた１．７
×１０cmクロマトグラフィー・カラムに上記の合した分
画を通じ、カラムを水２００mlで洗浄して５０％メタノ
ール水溶液１００mlで溶出した。メタノール溶出液を蒸
発乾固し、残渣を少量の水に溶解して０．１Ｎ塩酸で酸
性化した。これを凍結乾燥して精製された抗生物質Ａ５
１５６８因子Ａ２５mgを得た。

【００８９】因子Ｂを単離するために、Ｂ．ズブチリス
を用いた測定法の代わりにＨＰＬＣ測定法を用いて実施
例３の方法を行った。これは、Ｂ．ズブチリスを用いた
測定法では因子ＡおよびＢを分別できないので必要な行
程である。ＨＰＬＣ測定法を用いれば、因子Ａに富む分
画と因子Ｂに富む分画を各々同定して別々に採取でき
る。この別々に採取された物を実施例３の最終工程のよ
うにして脱塩して因子Ａに富む生産物と因子Ｂに富む生
産物を得る。

【００９０】実施例４ Ａ５１５６８因子ＡおよびＢの単離精製と分離 Ａ５１５６８の全ブロスから因子ＡおよびＢのＡ５１５
６８混合物を分離するために、全ブロスをＨyflo Ｓup
ercelで濾過した。濾液を５ＮＨＣlでpＨ６．０〜６．
５に調整したのち、Ｉonac Ｘ−２３６樹脂(Ｈ⁺)を加
えて(濾液１００l当り樹脂４l)、活性物を吸着させるた
めに撹拌した。上清を廃棄し、樹脂を水(樹脂の１０倍
容)で洗浄した。洗液を廃棄したのち、このＸ−２３６
樹脂をカラムに充填して０．１Ｎ塩化アンモニウム(カ
ラムの５倍容)で溶出し、４l分の分画を直ちに５ＮＨＣ
lで中和した。抗生物質活性は、Ｓ．アウレウスおよび
ＨＰＬＣで追跡した。Ａ５１５６８因子ＡおよびＢを含
有する分画を合して、脱塩するために Ｄaiaion ＨＰ
−２０樹脂を詰めたカラムに通じた。流出液を廃棄し、
樹脂を０．１％Ｈ₃ＰＯ₄を含有する５％イソプロピルア
ルコールで溶出した。５００ml分の分画を採取し、抗生
物質活性を調べた。活性分画を合し、濃縮して凍結乾燥
した。得られた不純な物質は、Ａ５１５６８因子Ａを９
５％およびＡ５１５６８因子Ｂを５％含有していた。

【００９１】生成物を更に精製し同時に因子ＡおよびＢ
に分離するために、上記の因子ＡおよびＢの不純な混合
物を水に溶解し、ＣＭ−Ｓephadex Ｃ−２５を詰めた
カラムに通じて水と０．２５ＮＮＨ₄ＨＣＯ₃の線型グラ
ジエントで溶出した。分画をＨＰＬＣで調べて因子Ａを
含有する分画を因子Ｂを含有する分画と別々に採取し
た。

【００９２】前工程で付加した塩を除去する為に、各々
の採取物をＤaiaion ＨＰ−２０樹脂を詰めたカラムに
通じて、０．１％Ｈ₃ＰＯ₄を含有する５％イソプロピル
アルコールで溶出した。各々のカラムについてＨＰＬＣ
測定法に基づいて適当な分画を採取した。２つの採取物
を濃縮し凍結乾燥して実質的に純粋なＡ５１５６８因子
Ａおよび実質的に純粋なＡ５１５６８因子Ｂを各々得
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はＡ５１５６８因子ＡのＫＢrペレット
における赤外線吸収スペクトルを表わす。図中、横軸は
波数を縦軸は透過率を表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:365）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の式（Ｉ）で表される少なくとも１
   つの抗生物質を産生するノカルジア・オリエンタリス： 【化１】 ［式中、ｎは１または２を表す。］
2. 【請求項２】 ノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１
   ５２３２である請求項１のノカルジア・オリエンタリ
   ス。