JP2554350B2

JP2554350B2 - グリコペプチド抗生物質

Info

Publication number: JP2554350B2
Application number: JP62506057A
Authority: JP
Inventors: セルバ，エンリコ; ベレツタ，グラツイア; ボルギ，アンジエロ; デナロ，マウリツイオ
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1986-10-10
Filing date: 1987-10-08
Publication date: 1996-11-13
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: WO1988002755A1; KR880701734A; ATE78490T1; DK312688D0; IL84092A0; AU8078187A; JPH02500742A; CN87106876A; IE872709L; KR960013074B1; DK312688A; CA1337861C; IE60281B1; US5567676A; EP0327548A1; DK172934B1; EP0327548B1; DE3780644D1; ES2010729A6; PT85885A

Description

【発明の詳細な説明】抗生物質A40926は、アクチノマズラ（Actonomadura）
の培養物、アクチノマズラ（Actonomadura）sp.ATCC 3
9727と呼ばれる、から分離されたグルコペプチド抗生物
質である。それは、その因子が因子Ａ、因子Ｂ、因子
B₀、因子PAおよび因子PBと呼ばれる複合体である。それ
は欧州特許出願（EP−Ａ）177882号に記載された。

抗生物質A40926は、欧州特許（EP）86117452号に記載
されているような制御された条件下の酸加水分解によっ
て、対応するＮ−アシルグルクロニルアグリコン誘導体
に形質転換される。

抗生物質A40926複合体、それらの因子、対応するＮ−
アシルアミノグルクロニルアグリコン複合体およびそれ
らの因子は、主にグラム陽性バクテリアおよびネイセリ
アエ（Neisseriae）に対して活性である。

本発明は、Ｏ−グリコシド結合を通してペプチド部分
に連結するＮ−アシルアミノグルクロニル基を有すると
いう共通の特徴を共用する、上に命名した化合物の新規
なデアシル（de−acyl）アミノ誘導体である。それら
は、デアシル抗生物質A40926、デアシルA40926抗生物質
Ｐおよび抗生物質A40926アミノグルクロニルアグリコン
と命名され、そして次の式Ｉによって表すことができる
［番号付けは、他のグリコペプチド抗生物質についての
ウィリアムス（Williams）、J.ら、ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサイアティ−（J.Am.Chem.So
c.）、106、4895−4908（1984）に示唆されているもの
に類似する］：式中、Ａは２−アミノ−２−デオキシ−ベータ−Ｄ−グルコ
ピラノシズロン酸基を表し、そしてＢは水素、アルファ−Ｄ−マンノピラノシルまたは６
−アセチル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシルを表す、およびそれらの付加塩類。

これらの脱アシル（de−acylated）誘導体は、集合的
に「デアシルA40926抗生物質」と呼び、そして一般にそ
れらの各々は「デアシルA40926抗生物質」と呼ぶ。

上に命名した出発物質、すなわち、A40926複合体およ
びそれらの因子、対応するＮ−アシルアミノグルクロニ
ルアグリコン複合体およびそれらの因子は、式中、Ａは
２−デオキシ−２−（C₁₁−C₁₂）アシルアミノ−ベータ
−Ｄ−グルクロニル基を表し、そしてＢは水素、アルフ
ァ−Ｄ−マンノシルまたは６−アセチル−アルファ−Ｄ
−マンノシル基を表す、上の式Ｉによって表すことがで
きるか、あるいはそれらの付加塩類である。

さらに詳しくは、抗生物質A40926因子Ａは、式中Ａが
２−デオキシ−２−ウンデカノイルアミノ−ベータ−Ｄ
−グルコピラノシズロニル基を表し、そしてＢがマンノ
シルを表す上の式の化合物であり、抗生物質A40926因子
B₀は、式中Ａが２−デオキシ−２−イソデカノイルアミ
ノ−ベータ−Ｄ−グルクロニルを表し、そしてＢがアル
ファ−Ｄ−マンノシルを表す上の式の化合物であり、抗
生物質A40926因子B₁は、式中Ａが２−デオキシ−２−ド
デカノイルアミノ−ベータ−Ｄ−グルクロニルを表し、
そしてＢがアルファ−Ｄ−マンノシルを表す上の式の化
合物である。

「Ｐ」系列の抗生物質A40926因子、例えば、因子PAお
よび因子PB₀は、マンノース単位が６−アセチル−マン
ノース単位で置換されている点で、対応する因子（それ
ぞれ、因子ＡおよびB₀）と異なる。

抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コンは、Ｂが上に定義しとおりである。そしてＡが水素
を表す、上の式によって表される。アミノグルクロニル
基上のそれらのアシル鎖は、抗生物質A40926の単一の因
子のそれらに相当する。

入手可能なデータを基準にしかつ既知の物質を参照す
ることにより、式中Ａが２−アミノ−２−デオキシ−ベ
ータ−Ｄ−グルクロニルを表し、そしてＢがアルファ−
Ｄ−マンノシルを表す、上の式を、デアシル抗生物質A4
0926に帰属させることができ、式中Ａが２−アミノ−２
−デオキシ−ベータ−Ｄ−グルクロニルを表し、そして
Ｂが６−アセチル−アルファ−Ｄ−マンノシルを表す、
上の式を、デアシル抗生物質A40926 Ｐに帰属させるこ
とができ、そして式中Ａが２−アミノ−２−デオキシ−
ベータ−Ｄ−グルクロニルを表し、そしてＢが水素を表
す、上の式を、抗生物質A40926アミノグルクロニルアグ
リコンに帰属させることができる。

抗生物質A40926因子PAおよびPBは、少なくともある発
酵条件下に、A40926産生微生物の主な抗生物質生成物で
ある。

抗生物質A40926因子ＡおよびＢは、おもに、それぞ
れ、抗生物質A40926因子PAおよびPBの変換生成物であ
り、そして、しばしば発酵ブロス中に既に存在する。

抗生物質A40926因子PAは抗生物質A40926因子Ａに、お
よび抗生物質A40926因子PBは抗生物質A40926因子Ｂに、
アミノグルクロニル単位上のアシル基を置換させない
で、マンノース単位のアセチル基の除去に導く塩基性条
件下に、変換することができることが見出された。

結局、発酵ブロス、あるいは抗生物A40926含有抽出液
またはそれらの濃縮物を、塩基性条件下にある時間（例
えば、親核塩基の水溶液、pH＞９、一夜）放置すると
き、抗生物質A40926因子Ａおよび因子Ｂに富んだ抗生物
質A40926複合体が得られる［参照、欧州特許出願公開
（EP−Ａ）第177882号］。

同一タイプの塩基性変換は、デアシル抗生物質A40926
Pのデアシル抗生物質A40926への転化に適用することが
できる。

デアシル抗生物質A40926は、次の物理化学的特性を有
する：Ａ）次の吸収極大： λmax（nm）ａ）0.1M HCl 282 ｂ）リン酸塩緩衝液 pH6.0 281 ｃ）リン酸塩緩衝液 pH7.4 282、300（肩）ｄ）0.1M KOH 300 を示す紫外線吸収スペクトル、Ｂ）次の吸収極大（nujol mull）（ν、cm^-1）： 3700−3100;3000−2800（nujol）;1650;1590;1505;1460
（nujol）;1375（nujol）;1300、1230、1210、1150、10
60、1030、970、810、720（nujol）を示す赤外吸収スペクトル、Ｃ） DMSO d₆（ヘキサジュウトロジメチルスルホキシ
ド）中で記録した270MHzにおける次の信号群（ppm）
［（δ、ppm;m;（帰属）］： 2.30、ｓ（Ｎ−CH₃）;2.49、ｓ（DMSOd₅）;2.7−3.8、
ｍ（糖のCH）;2.79m（Z2）;4.08m（X6）;4.33s（X1）;
4.37d（X5）;4.37d（X7）;4.86m（X2）;5.08s（4f）;5.
08s（Z6）;5.27s（マンノースのアノマープロトン）;5.
35d（アミノグルクロン酸のアノマー部分）;5.61d（X
4）;5.86s（4b）;6.05、ｄ（X3）;7.73s（6b）;6.45−
8.49（芳香族プロトンおよびペプチドのNH）ｓ＝一重線;d＝二重線;m＝多重線を示す¹H−NMRスペクトル、Ｄ）バンコマイシン（Vancomycin）（Eli Lilly）に
関して0.34の保持時間（Rt）カラム：シラン化シリカゲルウルトラスフェアー（Ul
trasphare）ODS（５μｍ）4.6mm×25cmアルテックス（A
ltex）［ベックマン（Beckman）］ 18mMのリン酸ナトリウム緩衝液/CH₃CN 92/8（v/v）に
よるアイソクラティック（isocratic）溶離流速:1.8ml/分検出：紫外線 254nm 内部標準：バンコマイシン（Eli Lilly）Rt8.4分Ｅ） FAB−MS分光分析によって決定して1548の分子
量。

とくにNMRスペクトルを参照して、出発物質の物理化
学的データを比較することによって、範囲0.8〜2.0ppm
における脂肪族プロトンに相当するピークが新規な分子
中にもはや存在しないことを認めることができる。

また、抗生物質A40926 Ｐおよび抗生物質A40926アミ
ノグルクロニルアグリコンの各場合において、これらの
化合物および対応する「アシル化」されたものの間の主
な差は、範囲0.8〜2.0ppmにおける脂肪族プロトンの信
号が存在しないことである。

さらに詳しくは、デアシル抗生物質A40926の¹H−NMR
スペクトルは、DMSO d₆中で記録した270MHzにおける次
の信号の群（ppm）［δ、ppm;m;（帰属）］を有する： 2.0s（CH₃CO）;2.3、ｓ（NCH₃）;2.5、ｓ（DMSO
d₅）;2.7−3.8、ｍ（糖のCH）;2.8m（Z2）;4.1m（X6）;
4.1m（CH₂O、糖）;4.4s（X1）;4.4d（X5）;4.4d（X7）;
4.9m（X2）;5.1s（4f）;5.3s（Z6）;5.3s（マンノース
のアノマープロトン）;5.4d（アミノグルクロン酸のア
ノマープロトン）;5.6d（X4）;5.8s（4b）;6.1、ｄ（X
3）;7.7s（6b）;6.5−8.6（芳香族プロトンおよびペプ
チドのNH）。

抗生物質A40926アミノグルクロニルアグリコンの¹H−
NMRスペクトルはDMSO d₆中で記録した270MHzにおける
次の信号の群（ppm）［（δ、ppm;m;（帰属）］を有す
る： 2.3、ｓ（NCH₃）;2.5、ｓ（DMSO d₆）;2.7−3.8、ｍ
（糖のCH）;2.8m（Z2）;4.1m（X6）;4.4s（X1）;4.4d
（X5）;4.4d（X7）;4.9m（X2）;5.1s（4f）;5.1s（Z
6）;5.4d（アミノグルクロン酸のアノマープロトン）;
5.5d（X4）;5.7s（4b）;6.1、ｄ（X3）;7.7s（6b）;6.2
−8.5（芳香族プロトンおよびペプチドのNH）。

本発明の化合物の抗菌活性は、異なる微生物培養物に
ついての標準の希釈試験によって生体外で立証すること
ができる： MIC（最小阻止濃度）の決定のための培地および増殖
条件は、次の通りである：ブドウ球菌（staphylococc
i）、Strep.faecalisおよびグラム陰性バクテリア［大
腸菌（Escherichia coli）、肺炎扞菌（Klebisella p
neumoniae）についてアイソセンシテスト（Isosensites
t）ブロス（Oxoid）、24時間；ぶどう状球菌の種につい
てトッド−ヘウィット（Todd−Hewitt）ブロス（Difc
o）、24時間；淋菌（Neiseria gonorrhoeae）につい
て、GC基本ブロス（Difco）＋１％のイソビタレックス
（Isovitalex）（BBL）、48時間、CO₂に富んだ雰囲気；
インフルエンザ菌（Hasemophilus influenzae）につい
て脳心臓ブロス（Difco）＋補充Ｃ（Difco）、48時間；
ウルチ菌（Clostridium perfringens）についてACブロ
ス（Difco）、24時間、嫌気性雰囲気；ウレアプラズマ
・ウレアリチクム（U.urealyticum）についてR.T.エバ
ンス（Evans）およびD.タイラー−ロビンソン（Taylor
−Robinson）［ジャーナル・オブ・アンチミクロンバイ
アル・ケモセラピー（J.Antimicrob.Chemother.）、4,5
7］におけるような補充物質を含むPPLOブロス、24時
間。インキュベーションは37℃において実施した。接種
物は次のとおりであった：ウレアプラズマ・ウレアリチ
クム（U.urealyticum）について、約10⁴色変化単位/ml;
他のブロス希釈MICについて約10⁴〜10⁵コロニー形成単
位/ml。

いくつかの微生物についての最小阻止濃度（MIC）を
下表Ｉに報告する。

抗生物質A40926アミノグルクロニルアグリコンおよび
デ−アシル抗生物質A40926Pは、デーアシル抗生物質A40
926について前述したレベルと同一の抗微生物活性を示
す。

本発明の化合物の抗微生物活性は、また、マウスにお
ける実験的敗血症において立証される。

対照群および処置群は、10匹のCD−１マウス［チャー
レス・リバー（Charles River）］体重18−22gを包含
することができる。それらを0.5mlのバクテリアの懸濁
液で腹腔内に感染する。この懸濁液はS.pyogenes Ｃ
203（L49）一夜の培養物を、無菌のペプトン添加生理的
食塩水で希釈することによって調製した。接種物は敗血
症の未処置の動物が48時間以内に死亡するように調節す
る。試験すべき化合物を感染直後皮下的に投与する。第
７日に、ED₅₀（mg/kg）スペアルマン（Spearman）およ
びケルベル（Ｋrber）の方法［D.J.フィンネイ（Finn
ey）、「生物学的アッセイにおける統計学的方法（Stas
tical Methods in Biolgical Assay）」、グリッフ
ィン（Griffin）、524ページ、1952］により、各投与量
において生存する動物の百分率から計算する。

例えば、これらの条件下に、デ−アシル抗生物質A409
26のED₅₀は2.33mg/kg、皮下、である。

デ−アシルA40926抗生物質は、酸および塩基の官能性
を有し、そして有機および無機の反対イオンと、普通の
方法に従って塩を形成する。本発明の化合物の代表的な
かつ適当な酸付加塩は、次の有機および無機の両者の酸
との標準の反応によって形成されるものを包含する：例
えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフ
ルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、コハク酸、クエン酸、ア
スコルビン酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、パルミチ
ン酸、コール酸、パモン酸、ムチン酸、ショウオウ酸、
グルタル酸、グリコール酸、フタル酸、酒石酸、ラウリ
ン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、
ベンゼンスルホン酸、ソルビン酸、桂皮酸などの酸類。

これらの塩基の代表例は、次の通りである：アルカリ
金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、例えば、ナト
リウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、バリウ
ムの水酸化物；アンモニアおよび脂肪族、脂環族または
芳香族の有機アミン、例えば、メチルアミン、ジメチル
アミン、トリメチルアミンおよびピコリンである。

本発明の「非塩」化合物の対応する酸付加塩への転化
およびその逆、すなわち、本発明の化合物の酸付加塩の
非塩の形態への転化は、当業者の技量の範囲内であり、
そして本発明に包含される。例えば、デ−アシル抗生物
質A40926、抗生物質A40926アミノグルクロニルアグリコ
ンまたはデ−アシル抗生物質A40926Pは、非塩の形態を
水性溶媒中に溶解し、そしてわずかにモル過剰量の選択
した酸または塩基を添加することによって、対応する酸
または塩基の付加塩に転化することができる。次いで、
得られる溶液または懸濁液を凍結乾燥して所望の塩を回
収する。最終の塩が非塩の蹴板が可溶性である溶媒中に
不溶性である場合、それは、理論量またはわずかにモル
過剰量の選択した酸または塩基の転化後、非塩の形態の
有機溶液からろ過によって回収される。

非塩の形態は、水性溶媒中に溶解した対応する酸また
は塩基の塩から調製することができ、次いでこれを中和
して遊離の非塩の形態にする。

この工程を実施した後、過剰の酸または塩基の排除は
必要であり、普通の脱塩の手順を用いることができる。

例えば、シラン化シリカゲル、非官能化ポリスチレ
ン、アクリル酸および調節した孔サイズのポリデキスト
ラン樹脂［例えば、セファデックス（Sephadex）LH20］
または活性炭のカラムクロマトグラフィーを便利に使用
できる。不必要な塩を水溶液で溶離した後、所望の生成
物を、水および極性または非極性の有機溶媒の混合物、
例えば、アセトニトリル／水の直線の勾配または段階多
岐勾配、50:50〜100％のアセトニトリルで溶離する。

この分野において知られているように、製薬学的に許
容されうる酸（または塩基）または製薬学的に許容され
えない酸（または塩基）との塩の形成を便利な精製技術
として使用できる。形成および単離後、A40926抗生物質
を、対応する非塩の形態に、あるいは製薬学的に許容さ
れうる塩の形態に転化することができる。

ある場合において、デ−アシルA40926抗生物質の塩基
の付加塩は水および親水性溶媒中でいっそう可溶性であ
る。

デ−アシル抗生物質A40926、デ−アシル抗生物質A409
26Pおよび抗生物質A40926アミノグルクロニルアグリコ
ンは、それぞれ、抗生物質A40926の複合体またはその因
子、抗生物質A40926の因子PAまたは因子PBまたはそれら
の混合物、および抗生物質A40926N−アクリルアミノグ
ルクロニルアグリコン複合体またはその因子から、適当
なアクチノプラネス（Actinoplanes）菌株、例えば、ア
クチノプラネス・テイコミセチクス（Actinoplanes te
ichomyceticus）ATCC 31121、アクチノプラネス・ミゾ
リウリエンシス（Actinoplanes missouriensis）ATCC
23342、アクチノプラネス・ミゾリウリエンシス（Act
inoplanes missouriensis）NRRL 15647またはNRRL 1
5646およびアクチノプラネス（Actinoplanes）NRRL 38
84で微生物学的に形質転換することによって調製され
る。アクチノプラネス・テイコミセチクス（Actinoplan
es teichomyceticus）ATCC 31121は米国特許第4,239,
751号に記載され、アクチノプラネス・ミゾリウリエン
シス（Actinoplanes missouriensis）ATC 23342は米
国特許第3,952,095号に記載され、アクチノプラネス・
ミゾリウリエンシス（Actinoplanes missouriensis）N
RRL 15647およびNRRL 15646は米国特許第4,587,218号
に記載されているが、アクチノプラネス（Actinoplane
s）NRRL 3884は米国特許第3,780,174号に記載されてい
る。すべてのこれらの菌株は、それぞれの培養物収集所
から入手可能である。

さらに詳しくは、アクチノマズラ（Actinomadura）s
p.ATCC 39727または産生性突然変異体またはその変異
型の発酵ブロスの収穫物を包含する、純粋な形態または
粗製の調製物の形態の、選択した出発物質を、アクチノ
プラネス（Actinoplanes）菌株、例えば、アクチノプラ
ネス・テイコミセチクス（Actinoplanes teichomyceti
cus）ATCC 31121、アクチノプラネス・ミゾリウリエン
シス（Actinoplanes missouriensis）ATCC 23342、ア
クチノプラネス・ミゾリウリエンシス（Actinoplanes
missouriensis）NRRL 15646、アクチノプラネス・ミゾ
リウリエンシス（Actinoplanes missouriensis）NRRL
15647またはアクチノプラネス（Actinoplanes）NRRL
3884の培養物と、好ましくは発酵の間に、接触させ
る。アクチノプラネス（Actinoplanes）菌株、例えば、
好ましくは、アクチノプラネス・テイコミセチクス（Ac
tinoplanes teichomyceticus）ATCC 31121、アクチノ
プラネス・ミゾリウリエンシス（Actinoplanes missou
riensis）ATCC 23342、アクチノプラネス・ミゾリウリ
エンシス（Actinoplanes missouriensis）NRRL 1564
6、アクチノプラネス・ミゾリウリエンシス（Actinopla
nes missouriensis）NRRL 15647またはアクチノプラ
ネス（Actinoplanes）NRRL 3884を、通常の浸漬好気的
条件下に、炭素、窒素およびIg塩類の同化可能な源を含
有する培地中で培養する。このような培地の例は、上に
引用した米国特許に報告されているものおよびこの分野
において一般に知られているものである。

一般に、前述の出発物質はアクチノプラネス（Actino
planes）菌株、例えば、好ましくは、アクチノプラネス
・テイコミセチクス（Actinoplans teichomyceticus）
ATCC 31121、アクチノプラネス・ミゾリウリエンシス
（Actinoplanes missouriensis）ATCC 23342、アクチ
ノプラネス・ミゾリウリエンシス（Actinoplanes miss
ouriensis）NRRL 15646、アクチノプラネス・ミゾリウ
リエンシス（Actinoplanes missouriensis）NRRL 156
47またはアクチノプラネス（Actinoplanes）NRRL 3884
の培養物に、時間ゼロから培養がその最大の増殖に到達
した時間までの変化する時間において添加することがで
きる。増殖の36〜72時間後の添加は、少なくともある場
合において、好ましい。

反応温度は、一般に20℃〜40℃、好ましくは24℃〜35
℃、最も好ましくは25℃〜32℃である。

反応時間、すなわち、最終生成物を回収する前の微生
物培養環境に出発物質を暴露する時間は、使用する特定
の条件に依存して、100〜300時間で変化しうる。いずれ
にしても、反応はこの分野において知られているよう
に、例えば、HPLCにより出発物質の減少および／または
最終生成物の増加を追跡することによって、監視するこ
とができるので、当業者は反応が完結したと考えるべき
時および回収手順を開始することができる時を容易に決
定することができる。

アクチノプラネス（Actinoplanes）菌株、例えば、好
ましくは、アクチノプラネス・テイコミセチクス（Acti
noplanes teichomycticus）ATCC 31121、アクチノプ
ラネス・ミゾリウリエンシス（Actinoplanes missouri
ensis）ATCC 23342、アクチノプラネス・ミゾリウリエ
ンシス（Actinoplanes missouriensis）NRRL 15646、
アクチノプラネス・ミゾリウリエンシス（Actinoplanes
missouriensis）NRRL 15647またはアクチノプラネス
（Actinoplanes）NRRL 3884の増殖する培養物を使用す
る代わりに、前述の出発物質を脱アシルして本発明の脱
アシル化合物を産生することがなおできる、任意の突然
変異体またはその変異型の培養物を使用できる。このよ
うな突然変異体またはその変異型を使用する本発明によ
る方法は、本発明の領域内に包含されると考えられる。
実際に、アクチノプラネス・ミゾリウリエンシス（Acti
noplanes missouriensis）NRRL 15646およびNRRL 15
647は、アクチノプラネス・ミゾリウリエンシス（Actin
oplanes missouriensis）ATCC 23342の突然変異生成
物である、アクチノプラネス・ミゾリウリエンシス（Ac
tinoplanes missouriensis）ATCC 31683を化学的突然
変異誘発することによって得られる。アクチノプラネス
・ミゾリウリエンシス（Actinoplanes missouriensi
s）ATCC 31683は、米国特許第4,322,406号および米国
特許第4,375,513号に、アクチノプラネス・ミゾウリエ
ンシス（Actinoplanes missouriensis）ATCC 31682お
よびATCC 31680とともに記載されており、そして他の
述べられているアクチノプラネス（Actinoplanes）菌株
として培養物収集所か入手可能である。

アクチノプラネス・テイコミセチクス（Actinoplanes
teichomyceticus）ATCC 31121の突然変異体アクチノプラネス・テイコミセチクス（Actinoplanes
teichomyceticus）ATCC 31121の突然変異体菌株は、
ATCCに1987年７月21日に受託され、そして受託番号5364
9を受けた。この菌株は、ブタペスト条約の規定に従っ
て受託された。

上の脱アシル化微生物の単一の純粋な培養物を使用す
る代わりに、任意の比率のそれらの混合物を使用でき
る。

本発明の化合物は、また、本発明の方法に従って、上
に同定した脱アシル化微生物培養物の１つの洗浄した菌
糸体、細胞を崩壊することによって、例えば、超音波処
理および破片の遠心による収集によって得られる細胞不
含調製物、あるいは破壊した細胞調製物から得られる細
胞不含水溶性抽出物または濃縮物を使用することによっ
て、調製できる。反応の時間および温度はこの場合にお
いてある種の適合を必要とすることがあるが、温度を増
大することができる、少なくともある場合において、50
〜60℃、好ましくは25〜50℃まで増大することができる
場合においてさえ、全体の微生物について上に示したも
の実質的に反映する。

次いで、反応の媒質からの抗生物質の回収は、それ自
体既知の技術に従って実施し、この技術は、溶媒を使用
する抽出、非溶媒の添加または溶液の交換による沈澱、
分配クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラ
フィーなどを包含する。

好ましい手順は、固定化されたＤ−アラニル−Ｄ−ア
ラニンの親和クロマトグラフィーおよび引き続く異なる
pHにおける分離を包含する。

本発明の回収法のために適当な固定化されたＤ−アラ
ニル−Ｄ−アラニンのマトリックスは、欧州特許出願公
開第122969号に開示されている。この回収法において好
ましいマトリックスは、また、その中に記載されてい
る、調節された孔の架橋したポリデキストランに結合し
たＤ−アラニル−Ｄ−アラニンである。

反応の媒質は、濾過または予備的精製手順の直後に、
親和クロマトグラフィーにけることができる。後者の手
順は、媒質全体を塩基性、好ましくはpH8.5〜10.5に
し、次いで、必要に応じて、濾過助剤の存在下に濾過す
ることを包含する。反応の媒質をある時間塩基性のpHに
保持する場合、デアシル抗生物質A40926Pを、それぞれ
の出発物質の、同一条件下の、転化と同様に、デアシル
抗生物質A40926に転化する。（この転化は、通常のよう
に、HPLCによって監視することができる）。

次いで、透明の濾過を７〜８のpH値に調節し、次い
で、カラムまたはバッチ式に、固定化されたＤ−アラニ
ル−Ｄ−アラニンの親和クロマトグラフィーにかける。

親和性マトリックスへの物質の結合は、好ましくは、
約7.0〜8.0のpHにおいて実施するが、その溶離は水性塩
基によってより塩基性のpH値（好ましくは9.0〜10.5）
において実施する。この水性塩基はアンモニア、揮発性
アミン、アルカリまたはアルカリ金属の水酸化物または
塩基性緩衝化溶液であることができ、必要に応じて極性
有機溶媒、例えば極性水混和性溶媒を存在させる。

極性水混和性溶媒の代表的な例は、次の通りである：
水溶性アルコール（例えば、メタノール、エタノール、
イソプロパノール、ｎ−ブタノール）、アセトン、アセ
トニトリル、低級アルキルアルカノエート（例えば、酢
酸エチル）、テトラヒドロフラン、ジオキサンおよびジ
メチルホルムアミドおよびそれらの混合物；好ましい極
性水混和性溶媒はアセトニトリルである。

必要に応じて塩類、尿素および／または水混和性溶媒
を含有する、水性緩衝液pH4〜９でカラムを洗浄するこ
とによって、不純物を除去した後、デアシルA40926抗生
物質を上の溶離混合物で溶離する。

この溶離液を有機または無機の酸でpH2.5〜4.0に調節
して、このpHにおい不溶性の物質を除去する。

沈澱を濾過または遠心により除去し、次いでデアシル
A40926抗生物質を含有す上澄み液を便利には脱塩する。

便利な脱塩手順は、シラン化シリカゲルのカラムに抗
生物質含有水溶液を適用し、蒸留水で洗浄し、そして上
に定義した極性水混和性溶媒および水の混合物で溶離す
ることを包含する。

あるいは、脱塩は、抗生物質含有溶液を上に記載する
親和性カラムに適用し、蒸留水で洗浄し、そして、親和
クロマトグラフィーの溶離について上に記載したよう
に、揮発性水性塩基で溶離することによって実施するこ
とができる。

得られる生成物、すなわち、デアシルA40926抗生物
質、抗生物質A40926アミノグルクロニルアグリコンまた
はデアシル抗生物質A40926Pは、それを含有する溶離し
た分画（HPLC分析）を濃縮し、次いで非溶媒の添加また
は凍結乾燥による沈澱によって実質的に純粋に得られ
る。

非溶媒の例は、次の通りである：水混和性ケトン、例
えば、アセトンまたはメチルエチルケトン、または水混
和性アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プ
ロパノールなど、ならびにそれらと水混和性有機溶媒、
例えば、石油エーテル、低級アルキルエーテル、例え
ば、エチルエーテル、プロピルエーテルおよびブチルエ
ーテル。

デアシルA40926抗生物質、デアシル抗生物質A40926P
および抗生物質A40926アミノグルクロニルアグリコン
は、多くの広く拡散する感染の原因となる、グラム陽性
バクテリアに対して活性である。通常の治療学的処置に
対するこれらの病原体の抵抗は増大しつつあるので、新
しい抗生物質に対する要求はなお大きい。

一般に、抗バクテリア処置のために、デアシルA40926
抗生物質、デアシル抗生物質A40926Pおよび抗生物質A40
926アミノグルクロニルアグリコンならびに無毒の製薬
学的に許容されうる塩類またはそれらの混合物は、異な
る道筋で、例えば、局所的または非経口的に投与するこ
とができる。非経口的投与は、一般に、投与の好ましい
道筋である。

注射のための組成物は、例えば、油性または水性の賦
形剤中の懸濁液、溶液または乳濁液の形態をとることが
でき、そしてアジュバント、例えば、懸濁剤、安定剤お
よび／または分散剤を含有することができる。

あるいは、活性成分は、適用のとき適当な賦形剤、例
えば、無菌の水をそれに添加するとき、再構成するため
粉末の形態であることができる。

投与の道筋に依存して、これらの化合物は種々の投与
形態に配合することができる。

ある場合において、本発明の化合物は経口的投与のた
めの腸溶被覆投与形態に配合することができ、この形態
は、この分野において既知あるようにして調製できる
［参照、例えば、「レミントンの製薬科学（Remingto
n′ Pharmceutical Science）」、マック・パブリシ
ング・カンパニー（Mack Publishng Company）、米国
ペンシルベニア州イーストン、第1614ページ］。

これは、胃を無変化で通過するが、腸管内における抗
微生物物質の吸収がとくに望ましいときの特定の場合で
ある。

活性生物の投与量は、種々の因子、例えば、処置すべ
き患者の大きさおよび状態、投与の道筋および頻度、お
よび含まれる病原性因子に依存する。

本発明の構成物質、すなわち、デアシルA40926抗生物
質、デアシル抗生物質A40926Pおよび抗生物質A40926ア
ミノグルクロニルアグリコンおよびそれらの生理学的に
許容されうる塩類は、一般に、約0.5〜50mgの活性成分/
kg患者体重の一日量で有効であり、必要に応じて１〜４
回／日に分割される。

とくに望ましい組成物は、約100〜約5,000mg/単位を
含有する投与単位で調製された組成物である。

持続作用の配合物は、この分野において知られている
ように、異なる機構および方法に基づいて調製できる。

デアシルA40926抗生物質、デアシル抗生物質A40926P
または抗生物質A40926アミノグルクロニルアグリコンを
含有する持続作用の配合物を調製する好ましい方法は、
水性または油性の媒質中に懸濁した、水不溶性の形態の
抗生物質の使用を包含する。

好ましくは、本発明の製薬学的調製物は、一般に霊長
目および哺乳動物ならびにペットの動物を、また、本発
明の組成物および調製物で処置することができる場合で
さえ、ヒトにおける治療（予防、処置、治癒などを包含
する）のために意図される。

製薬学的組成物の調製筋肉内注射のための単位投与形態は、８％のプロピレ
ングリコールを含有する無菌の懸濁液USPの5mlおよびデ
アシルA40926抗生物質の生理学的に許容されうる塩基付
加塩の500mgを使用して調製される。

筋肉内注射のための単位投与形態は、８％のプロピレ
ングリコールを含有する無菌の懸濁液USPの5mlおよびデ
アシル抗生物質A40926Pの生理学的に許容されうる塩基
付加塩の500mgを使用して調製される。

筋肉内注射のための単位投与形態は、８％のプロピレ
ングリコールを含有する無菌の懸濁液USPの5mlおよび抗
生物質A40926アミノグルクロニルアグリコンの生理学的
に許容されうる塩基付加塩の500mgを使用して調製され
る。

筋肉内注射のための単位投与形態は、注射のための無
菌の水の5ml中の水不溶性の形態の抗生物質A40926アミ
ノグルクロニルアグリコンの1,000mgを使用して調製さ
れる。

さらに、本発明の抗生物質は、偽膜性大腸炎（pseudo
membranous colitis）を引き起こすクロストリジウム
・ディフィシル（Clostridium difficile）の増殖を抑
制するために有用であることができる。これらの抗生物
質は、偽膜性大腸炎（pseudomembranous colitis）の
処置において、有効投与量の、製薬学的に許容されうる
投与形態で調製された、抗生物質まは製薬学的に許容さ
れうる塩を経口的に投与することによって使用すること
ができる。このような使用のために、抗生物質は、ゼラ
チンカプセルまたは液体の懸濁液で投与することができ
る。

薬物としてのそれらの活性のほかに、デアシルA40926
抗生物質、デアシル抗生物質A40926Pおよび抗生物質A40
926アミノグルクロニルアグリコンは、動物の成長促進
剤として使用することができる。

この目的に対して、本発明の化合物は適当な飼料の形
態で経口的に投与される。使用する正確な濃度は、正常
の量の飼料が消費されるとき、成長促進有効量で活性成
分を提供するために要求される濃度である。

動物飼料への本発明の活性化合物の添加は、好ましく
は、活性化合物を有効量で含有する適当な飼料予備混合
物を調製し、そしてこの予備混合物を完全食糧中に混入
することによって達成される。

このような予備混合物を調製しかつ投与する方法は、
参考書に記載されている［例えば、「アプライド・アニ
マル・ニュートリション（Applied Animal Nutrtio
n）」、W.H.フリードマン・アンド・カンパニー（W.F.F
reedman and Co.）、米国サンフランシスコ、1969ま
たは「家畜の飼料および飼料供給（Livestock Feeds
and Feeding）」、オー・アンド・ビー・ブックス（Ｏ
and Ｂ books）、米国オレゴン州コルバリス、197
7、そしてそれらの開示をここに引用によって加える。

アクチノマズラ（Actonomadura）種ATCC39727からの
抗生物質A40926複合体およびそれらの単一の因子または
それらの産生性突然変異体もしくは変異型の調製は、欧
州特許出願（EP−Ａ）177882号に記載されている。

抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリコ
ンの調製抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コン複合体AB、Ｎ−アシルアミノグルクロニルアグリコ
ン因子Ａ、Ｎ−アシルアミノグルクロニルアグリコン因
子Ｂ、抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルア
グリコン因子B₀、抗生物質A40926N−アシルアミノグル
クロニルアグリコン因子B₁および抗生物質A40926アグリ
コンは、抗生物質A40926複合体またはその単一の因子ま
たは任意の卑劣の前記因子の混合物、すなわち、A40926
因子Ａ、A40926因子Ｂ、A40926因子AB、A40926因子PA、
A40926因子PB、A40926因子B₀およびA40926因子B₁から、
制御した酸加水分解によって調製される。

一般に、この加水分解は適当な有機溶媒中で強酸の存
在下に実施する。反応温度は、かなり広く変化すること
ができ、好ましくは４〜100℃、最も好ましくは25〜80
℃の間である。

反応時間は、特定の反応条件に依存して変化する。

一般に、反応時間は30分〜120時間である。

しかしながら、反応の過程は薄層クロマトグラフィー
またはPHLCによって監視することができるので、当業者
は出発物質の加水分解が完結したと考えるべきとき、お
よび回収手順を開始であることができるときを、決定す
ることができる。

強酸の代表例は、鉱酸または有機酸、例えば、ハロゲ
ン化水素、例えば、塩酸、臭化水素酸およびヨウ化水素
酸、リン酸、硫酸、ハロ酢酸など、トリフルオロ酢酸、
クロロジフルオロ酢酸などである。

適当な有機酸は、次の通りである：ａ）それらは出発物質を少なくとも部分的に可溶化す
る；ｂ）生成物は、別々に得られるか、あるいは、いったん
得られると、通常の技術に従って分離であることができ
る；ｃ）いずれの場合においても、それらは反応の過程を不
都合に妨害しない。

前記有機酸の例は、次の通りである：プロトン性また
は非プロトン性の溶媒、例えば、C₁−C₄アルキルスルホ
キシド、例えば、ジメチルスルホキシドおよびジエチル
スルホキシド、C₁−C₄アルキルホルムアミド、例えば、
ジメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、ジオキ
サン、テトラヒドロフランおよび同様な溶媒、これらは
もちろん選択した酸と相溶性である。

一般に、加水分解は、制限された量、例えば、反応混
合物の0.1〜10％（w/w）の水の存在下に実施する。この
水の量は、明らかなように、出発物質、溶媒および／ま
たは試薬中に既に存在することができるか、あるいは、
必要に応じて、任意に添加することができる。

この方法の好ましい実施態様は、40〜80℃の温度にお
いて、混合物のジメチルスルホキシド／濃塩酸を使用す
ることによって代表される。典型的には、混合物のジメ
チルスルホキシド／濃塩酸の比は、8:2〜9.5:0.5の間で
変化する。好ましい濃塩酸は37％（w/w）の塩酸であ
る。

一般に、反応生成物はＮ−アシルアミノグルクロニル
アグリコンおよびアグリコンの混合物である。温度、お
よびある場合において、酸の濃度および強度、を制御す
ることによって、この方法を、少なくともある程度、２
つの主要生成物の１つ、すなわち、抗生物質A40926N−
アシルアミノグルクロニルアグリコンまたは抗生物質A4
0926アグリコンの生成に向けることが可能である。より
詳しくは、比較的低い温度を保持し、可能ならば酸混合
物の強度を低下させ、かつ反応時間を適切に制御するこ
とによって、Ｎ−アシルアミノグルクロニルアグリコン
の収率は増加するが、比較的高い温度におおいて、アグ
リコン単独が得られる。

また、この場合において、反応の過程は薄層クロマト
グラフィーまたはHPLCによって監視し、そして反応は、
所望の物質の最適な生成が得られるとき、停止して、引
き続く回収の収量を最大にすることができる。

抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コンおよび抗生物質A40926アグリコンの混合物である生
成物が得られるとき、それはクロマトグラフィー、例え
ば、液体／液体クロマトグラフィー、フラッシュクロマ
トグラフィーおよび親和クロマトグラフィーによって分
離することができる。

親和クロマトグラフィーを使用するとき、好ましい吸
着剤は欧州特許出願（EP−Ａ）122969号に記載されてい
るような固定化されたＤ−アラニル−Ｄ−アラニンであ
る。アガロース−エプシロン−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラ
ニンはとくに好ましい。pHおよび塩濃度を調節すること
によって、抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニ
ルアグリコンを抗生物質A40926アグリコンから分離す
る。

抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コン複合体ABまたはその因子を主として調製するために
好ましい手順は、抗生物質A40926複合体またはその単一
の因子、抗生物質A40926複合体AB、抗生物質A40926因子
Ａ、抗生物質A40926因子Ｂ、抗生物質A40926因子B₀、抗
生物質A40926因子B₁、抗生物質A40926因子ABおよび抗生
物質A40926因子PBを、極性非プロトン性溶媒および強い
無機酸または有機酸の混合物を使用して、制限された
（0.1〜10％（w/w））量の水の存在下に室温〜100℃、
好ましくは40〜65℃の温度において、３〜120時間時
間、制限された加水分解に付すことからなる方法であ
る。

最も好ましくは、加水分解の混合物は9:1〜9.5:0.5の
比におけるジメチルスルホキシドおよび37％の塩酸の混
合物であり、温度は65℃であり、そして反応時間は５時
間である。

Ｎ−アシルアミノグルクロニルアグリコンの調製のた
めの出発物質が抗生物質A40926複合体であるとき、まだ
もとの複合体に実質的に相当する因子の混合物である、
最終生成物が得られるが、単一の因子、例えば、抗生物
質A40926因子Ａまたは因子Ｂを使用するとき、単一のＮ
−アシルアミノグルクロニルアグリコンが得られ、これ
は、それぞれ、抗生物質A40926N−アシルアミノグルク
ロニルアグリコン因子Ａおよび抗生物質A40926N−アシ
ルアミノグルクロニルアグリコン因子Ｂである（これら
は順次に因子B₀および因子B₁に分離することができ
る）。

抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コン複合体ABが得られるとき、それはそれ自体既知の技
術によって、例えば、液体／液体クロマトグラフィー、
好ましくは調製用HPLCによって、その単一の因子に分離
することができる。

好ましい手順は、好ましくはステンレスのカラム中
の、中圧（５〜50バール）または高圧（100〜200バー
ル）における、逆相液体クロマトグラフィーを包含す
る。固相は（２〜18）の炭素原子（最も好ましくはC1
8）の炭化水素相またはフェニル基でシラン化されたシ
リカゲルであることができ、そして溶離剤は上に定義し
たような極性の水混和性溶媒および水性緩衝液の混合
物、樹脂と適合性のpH（好ましくはpH4〜８）、であ
る。

アセトニトリルから選択される極性の水溶性非プロト
ン性溶媒および水性緩衝液、pH4〜８、好ましくは約
６、の直線の勾配の溶離混合物、例えば、アセトニトリ
ル／リン酸塩緩衝液、pH6、70:30、の混合物、およびア
セトニトリル／リン酸塩緩衝液、pH6、10:90、の混合物
の５％〜45％の直線の勾配は最も好ましい。

抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コン複合体AB（付加塩以外の形態）は、次の特性をも
つ：Ａ）次の吸収極大： λmax（nm）ａ）0.1NのHCl 282 ｂ）リン酸塩緩衝液 pH7.4 282、310（肩）ｃ）0.1NのKOH 302 を示す紫外線吸収スペクトル、Ｂ）次の吸収極大（cm^-1）： 3700−3100;3000−2800（nujol）;1650;1620−1550;150
0;1460（nujol）;1375（nujol）;1300;1250−1180;115
0;1060;1010;970;930;840;820 を示す赤外吸収スペクトル、Ｃ） DMSO d₆（ヘキサジュウトロジメチルスルホキシ
ド）＋CH₃COOH中で記録した270MHzにおける次の信号の
群（ppm）内部標準（0.00ppm）としてTMSを使用する
（δ＝ppm）： 0.84、ｄおよびｔ［イソプロピルのCH₃および末端のC
H₃］;1.41m［（CH₂）_ｎ］;1.44m［−CH₂−Ｃ−CO及びイ
ソプロピルのCH］;2.00t［−CH₂−（CO）］;2.5s（DMSO
d₅）;2.5s（Ｎ−CH₃）;2.93、ｍ［CH、（Z2）］;3.33、
ｍ［CH、（Ｚ′２）］;3.20−3.80、ｍ［糖のCH］;5.3
4、ｄ［アシルアミノグルクロン酸のアノマープロト
ン］;4.10m（X6）;4.33d、（X5）;4.43d（X7）;4.9m（X
2）;5.1（4fおよびZ6）;5.4s（X1）;5.58d（X4）;5.7s
（4b）;6.06d（X3）;7.73s（6b）;6.26−8.42sおよびｍ
［芳香族のCHおよびペプチドのNH］;8.70−10.5、br
ｓ［フェノールのOHおよびNH₂ ⁺］ bd ＝広いｄ＝二重線ｍ＝多重線ｓ＝一重線ｔ＝三重線を示す¹H−NMRスペクトル、Ｄ）逆相HPLCによって次の条件下に分析したとき、テ
イコプラニンA₂成分２（Rt＝20.3分）に関して1.20およ
び1.30の保持時間（Rt）：カラム：ウルトラスフェアー（Ultrasphere）ODS（５
μｍ）アルテックス（Altex）［ベックマン（Beckma
n）］4.6mm（内径）×250mm 予備カラム：ブラウンリー・ラブス（Brownlee Lab
s）RP18（５μｍ）溶離剤A: CH₃CN 10％（2.5g/）NaH₂PO₄・H₂O pH6.0に調節した 90％溶離剤B: CH₃CN 70％（2.5g/）NaH₂PO₄・H₂O pH6.0に調節した 30％溶離：溶離剤Ａ中の溶離剤Ｂの５％〜60％の勾配、40分流速:1.8ml/分検出：紫外線 254nm 内部標準：テイコプラニンA₂成分２［グルポ・レペチ
ット（Gruppo Lepetot）S.p.A.］Ｅ）塩類を形成できる酸官能性Ｆ）塩類を形成できるアミノ官能性Ｇ）中心部分に結合したマンノース単位なし。

抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コン因子Ａ（付加塩以外の形態）は、次の特性をもつ：Ａ）次の吸収極大： λmax（nm）ａ）0.1NのHCl 282 ｂ）リン酸塩緩衝液 pH7.4 282、310（肩）ｃ）0.1NのKOH 302 を示す紫外線吸収スペクトル、Ｂ）次の吸収極大（cm^-1）： 3700−3100;3000−2800;1650;1585;1505;1460（nujo
l）;1375（nujol）;1295;1230;1210;1150;1070;1010;84
5;820;720（nujol）を示す赤外吸収スペクトル、Ｃ） DMSO d₆（ヘキサジュウトロジメチルスルホキシ
ド）で記録した270MHzにおける次の信号の群（ppm）、
内部標準（0.00ppm）としてTMSを使用する（δ＝pp
m）： 0.85t（末端のCH₃）;1.0−1.3（脂肪族のCH₂）;1.42
（（OC−Ｃ）CH₂）;2.00t（（CO）CH₂）;2.35s（NC
H₃）;2.49s（DMSOd₅）;2.82m（Z2）;2.8−3.8（糖のプ
ロトンおよびＺ′２）;4.12m（X6）;4.56s（X1）;4.34
d、（X5）;4.41d（X7）;4.96m（X2）;5.08−5.12（4fお
よびZ6）;5.40d（アシルアミノグルクロン酸のアノマー
プロトン）;5.58d（X4）;5.74s（4b）;6.05d（X3）;7.7
5s（6b）;6.25−8.40s、ｄおよびｍ（芳香族のCHおよび
ペプチドのNH）を示す¹H−NMRスペクトル、Ｄ）逆相HPLCによって次の条件下に分析したとき、テ
イコプラニンA₂成分２（Rt＝20.3分）に関して1.20の保
持時間（Rt）：カラム：ウルトラスフェアー（Ultrasphere）ODS（５
μｍ）アルテックス（Altex）［ベックマン（Beckma
n）］4.6mm（内径）×250mm 予備カラム：ブラウンリー・ラブス（Brownlee Lab
s）RP18（５μｍ）溶離剤A: CH₃CN 10％（2.5g/）NaH₂PO₄・H₂O pH6.0に調節した 90％溶離剤B: CH₃CN 70％（2.5g/）NaH₂PO₄・H₂O pH6.0に調節した 30％溶離：溶離剤Ａ中の溶離剤Ｂの５％〜60％の勾配、40分流速:1.8ml/分検出：紫外線 254nm 内部標準：テイコプラニンA₂成分２［グルポ・レペチ
ット（Gruppo Lepetot）S.p.A.］Ｅ） FAB−MSにより決定した約1554の分子量Ｆ）塩類を形成できる酸官能性Ｇ）塩類を形成できるアミノ官能性Ｈ）中心部分に結合したマンノース単位なし。

抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コン因子B₀（付加塩以外の形態）は、次の特性をもつ：Ａ）次の吸収極大： λmax（nm）ａ）0.1NのHCl 282 ｂ）リン酸塩緩衝液 pH7.4 282、310（肩）ｃ）0.1NのKOH 302 を示す紫外線吸収スペクトル、Ｂ）次の吸収極大（cm^-1）： 3700−3100;3000−2800（nujol）;1650;1585;1505;1460
（nujol）;1375（nujol）;1295;1230;1210;1150;1060;1
010;980;840;820;720（nujol）を示す赤外吸収スペクトル、Ｃ） DMSO d₆（ヘキサジュウトロジメチルスルホキシ
ド）で記録した270MHzにおける次の信号の群（ppm）、
内部標準（0.00ppm）としてTMSを使用する（δ＝pp
m）： 0.84、ｄ（イソプロピルのCH₃）;1.0−1.3（脂肪族のCH
₂）;1.3−1.6（（OC−Ｃ）−CH₂およびイソプロピルの
−CH）;2.00t（（CO）CH₂）;2.32s（NCH₃）;2.49s（TMS
Od₅）;2.82m（Z2）;2.8−3.8（糖のプロトン）;4.12m
（X6）;4.44（X1）;4.33d（X5）;4.37d（X7）;4.95m（X
2）;5.06−5.10（4fおよびZ6）;5.38d（アシルアミノグ
ルクロン酸のアノマープロトン）;5.59d（X4）;5.72s
（4b）;6.05d（X3）;7.74s（6b）;6.27−8.5（芳香族の
CHおよびペプチドのNH）を示す¹H−NMRスペクトル、Ｄ）逆相HPLCによって次の条件下に分析したとき、テ
イコプラニンA₂成分２（Rt＝20.3分）に関して1.30の保
持時間（Rt）：カラム：ウルトラフェアー（Ultrasphere）ODS（５μ
ｍ）アルテックス（Altex）［ベックマン（Beckman）］
4.6mm（内径）×250mm 予備カラム：ブラウンリー・ラブス（Brownlee Lab
s）RP18（５μｍ）溶離剤A: CH₃CN 10％（2.5g/）NaH₂PO₄・H₂O pH6.0に調節した 90％溶離剤B: CH₃CN 70％（2.5g/）NaH₂PO₄・H₂O pH6.0に調節した 30％溶離：溶離剤Ａ中の溶離剤Ｂの５％〜60％の勾配、40分流速:1.8ml/分検出：紫外線 254nm 内部標準：テイコプラニンA₂成分２［グルポ・レペチ
ット（Gruppo Lepetot）S.p.A.］Ｅ） FAB−MSにより決定した約1568の分子量Ｆ）塩類を形成できる酸官能性Ｇ）塩類を形成できるアミノ官能性Ｈ）中心部分に結合したマンノース単位なし。

抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コン因子B₁（付加塩以外の形態）は、次の特性をもつ： FAB−MSにより決定して約1568の分子量および抗生物
質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリコン因子B
₀について上に報告したのと実質的に同一の物理化学的
特性を有するが、ただしそれは上に報告したNMR系にお
いてｎ−プロピル官能のメチル基に起因する0.84δにお
ける三重線および上に報告した系においてテイコプラニ
ンA₂成分２に関して1.32の保持時間を有する。

次の「調製」は、抗生物質A40926N−アシルアミノグ
ルクロニルアグリコン複合体およびその因子を調製する
ことができる方法の例である。

調製1: 抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリコ
ン複合体ABの調製ａ）抗生物質A40926複合体AB（欧州特許出願（EP−Ａ）
177882号の実施例３の手順に従うことによって実質的に
調製される）（750mg）を、150mlの混合物ジメチルスル
ホキシド（DMSO）/37％（w/w）塩酸（HCl）、9:1（v/
v）中に溶解し、そして反応混合物を約65℃に加熱す
る。反応の過程をHPLCによって監視し、そして出発物質
が完全に反応したとき（約５時間後）、反応混合物を冷
水（600ml）で急冷し、そして得られる混合物のpHを約
7.5に調節する。この混合物は標題の化合物の混合物を
含有し、これらは次の手順に従い親和クロマトグラフィ
ーによってその２つの主要な成分に分割される。

ｂ）上で得られた水性混合物（750ml）を欧州特許出願
（EP−Ａ）177882号および欧州特許出願（EP−Ａ）1229
69号、実施例１、Ａ）に記載されているようにセファロ
ース−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンのクロマトグラフィ
ーのカラムに適用する（10ミリモルのトリス・HCl pH
7.5緩衝液中の100mlの膨潤した樹脂；床の高さ10cm）。
２モルのNaClを含有する0.05モルのNH₄OH・HCl pH7.5
（200ml）（緩衝液Ｂ）をカラムに通過させ；次いでA40
926アグリコンをカラムから２モルのNaClを含有する0.0
5モルのNH₄OH・HCl pH9.5（1500ml）（緩衝液Ｃ）で溶
離することによってカラムから除去する。次いで、Ｎ−
アシルアミノグルクロニルアグリコン複合体ABを、0.1
モルの水性アンモニア（緩衝液Ｄ）で溶離する。次い
で、溶離した分画をそれらの抗生物質の含量に従ってプ
ールし、pH約7.5に調節し、そしてセファロース−Ｄ−
アラニル−Ｄ−アラニンのカラム（10ミリモルのトリス
・HCl pH7.5緩衝液中の100mlの膨潤した樹脂；床の高
さ10cm）のクロマトグラフィーにかける。無機塩類が洗
浄除去されるまで、蒸留水をカラムに通過させる。次い
で、抗生物質を0.1Nのアンモニアで溶離する。これらの
溶離した分画をそれらの抗生物質の含量に従ってプール
し、減圧下にｎ−ブタノールとともに共沸蒸留すること
によって小さい体積濃縮し、そして凍結乾燥して、それ
ぞれ、201mgのＮ−アシルアミノグルクロニルアグリコ
ン複合体ABおよび236mgのA40926アグリコンを得る。

上に記載した同一の実験を反復するが、混合物DMSO/3
7％HCl95:5を約40℃において約５日間使用することによ
って、Ｎ−アシルアミノグルクロニルアグリコン複合体
ABの収率は約15％増加するが、A40926アグリコンの収率
はそれに応じて減少する。

抗生物質A40926複合体、抗生物質A40926因子Ａ、抗生
物質A40926因子Ｂ、抗生物質A40926因子B₀、抗生物質A4
0926因子B₁、抗生物質A40926因子PAおよび抗生物質A409
26因子PBから出発して、これらの実験を反復することに
よって、実質的に同一の結果が得られる（すなわち、収
率は±５％の範囲で変化する）。とくに、抗生物質A409
26因子Ａまたは因子PAから出発して、得られる生成物は
抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリコ
ン因子Ａであり、抗生物質A40926因子PB₀または因子B₀
から出発して、得られる生成物は抗生物質A40926N−ア
シルアミノグルクロニルアグリコン因子B₀であり、抗生
物質A40926因子Ｂまたは因子PBから出発して、得られる
生成物は抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニル
アグリコン因子Ｂであり、これは順次に因子B₀および因
子B₁に分割することができ、そして抗生物質A40926因子
B₁から出発して、抗生物質A40926N−アシルアミノグル
クロニルアグリコン因子B₁が得られる。

調製2: 抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリコ
ン因子Ａ、因子B₀および因子B₁の分割 20mgの抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニル
アグリコン複合体ABを10％のアセトニトリルを含有する
1mlの18ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0中に溶
解する。この溶液を７μｍの粒子サイズを有するHPLC調
製用カラム（7mmの直径×250mm）リクロソルブ（Lichro
sorb）RP18シラン化シリカゲル［メルク・カンパニー
（Merck Co.）］中に注入した。

このカラムを5ml/分の相ＡおよびＢの流速において55
分で10％〜55％の相Ａの直線の勾配で溶離する。

相A: 18ミリモルのリン酸ナトリウム/CH₃CN 30/70、N
aOHでpH6.0に調製した。

相B: 18ミリモルのリン酸ナトリウム/CH₃CN 90/10、N
aOHでpH6.0に調製した。

カラムの溶離物の254nmにおける紫外線吸収を記録
し、そして均質の含量を有する溶離分画を集め、それぞ
れ、抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグ
リコン因子Ａ、因子B₀および因子B₁を含有する溶離物の
３つの群を分割する。

11の引き続くクロマトグラフィーの実験の精製した抗
生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリコン
因子を含有する実験物をプールし、そして通常のように
それらを5mlのセファロース−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラ
ニン（上を参照）のカラムに適用することによって脱塩
する。10mlの１ミリモルのHClで、次いで５×10mlの蒸
留水で塩類を除去した後、抗生物質を５×10mlの１％w/
vの水性アンモニアで溶離する。次いで、アンモニアの
溶離液を別々に集め、そして凍結乾燥して、15mgの抗生
物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリコン因
子Ａ、51mgの抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロ
ニルアグリコン因子B₀および3mgの抗生物質A40926N−ア
シルアミノグルクロニルアグリコン因子B₁が得られ、そ
れらの物理化学的データおよび化学式はこの明細書中に
上に報告した。

次の実施例は、本発明をさらに例示し、そして、それ
ら自体、その範囲を限定するものと解釈すべきでない。

実施例1: アクチノプラネス・テイコミセチクス（Actinoplanes
teichomyceticus）の発酵アクチノプラネス・テイコミセチクス（Actinoplanes
teichomyceticus）ATCC 31121の凍結した原培養物の
試料を、次の組成を有する100mlの栄養培地に接種す
る：グルコース 10 g ペプトン４ g 酵母エキス４ g MgSO₄ 0.5g KH₂PO₄ ２ g K₂HPO₄ ４ g 蒸留水 1000 ml 100mlの接種した培地を、ロータリー震盪器上で28℃
において500mlのエルレンマイヤーフラスコ内で48時間
インキュベーションする。200mlのこの培養物を使用し
て、次の組成を有する４の発酵培地を接種する：ペプトン４ g 酵母エキス１ g 大豆粉末 10 g グルコース４ g NaCl 2.5g CaCO₃ ５ g 蒸留水 1000 ml この接種した培地を約20℃において0.5v/v/分の無菌
の空気流下に約900rpmで約48時間発酵する。

アクチノプラネス・テイコミセチクス（Actinoplanes
teichomyceticus）ATCC 53649を、アクチノプラネス
・テイコミセチクス（Actinoplanes teichomyceticu
s）ATCC 31121の代わりに使用することができる。

実施例2: アクチノプラネス・ミゾウリエンシス（Actinoplanes
missouriensis）ATCC 23342の発酵アクチノプラネス・ミゾウリエンシス（Actinoplanes
missouriensis）ATCC 23342を含有する凍結乾燥した
管を開き、そしてオートミール寒天傾斜培地中に無菌的
に移す。28℃において12日間インキュベーションした
後、培養物を蒸留水中に懸濁し、そして各々が次の組成
を有する100mlの培地を含有する10のエルレンマイヤー
フラスコ中に接種する：酵母エキス２ g 大豆粉末８ g デキストロース 20 g NaCl １ g CaCO₃ ４ g H₂O 1000 ml 接種した培地をロータリー震盪器上で200rpmにおいて
48時間インキュベーションする。

アクチノプラネス・ミゾウリエンシス（Actinoplanes
missouriensis）NRRL 15646、NRRL 15647、ATCC 3
1683、ATCC 31682、ATCC 31680または任意の比率のそ
れらの混合物を、アクチノプラネス・ミゾウリエンシス
（Actinoplanes missouriensis）ATCC 23342の代わり
に使用することができ。

実施例3: アクチノプラネス（Actinoplanes）NRRL 3884の発酵アクチノプラネス（Actinoplanes）菌株NRRL 3884を
含有する凍結乾燥した管を開き、そしてオートミール寒
天傾斜培地中に無菌的に移す。28℃において12日間イン
キュベーションした後、培養物を蒸留水中に懸濁し、そ
して各々が次の組成を有する100mlの培地を含有する10
のエルレンマイヤーフラスコ中に接種する：酵母エキス２ g 大豆粉末８ g デキストロース 20 g NaCl １ g CaCO₃ ４ g H₂O 1000 ml 接種した培地をロータリー震盪器上で200rpmにおいて
48時間インキュベーションする。

実施例4: デアシル抗生物質A40926の調製ａ）抗生物質A40926複合体ABの生物変換抗生物質A40926複合体AB［実質的に欧州特許出願（EP
−Ａ）177882号に記載されているように調製した］は、
接種後48時間に、実施例１、２または３に実質的に記載
されているように調製した発酵培地に無菌的に添加し
た。生物変換法はブロスのHPLC分析によって監視する。
糖ペプチド抗生物質をセファロース−Ｄ−アラニル−Ｄ
−アラニンで精製し［参照、欧州特許出願（EP−Ａ）12
2969号］、そして次のHPLC法に従い分析する：カラム：ウルトラスフェアー（Ultrasphere）ODS（５
μｍ）アルテックス（Altex）［ベックマン（Beckma
n）］4.6mm（内径）×250mm 予備カラム：ブラウンリー・ラブス（Brownlee Lab
s）RP18（５μｍ）溶離剤A: 18ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液/CH₃CN
98/2（v/v） NaOHでpH6.0に調節した溶離剤B: 18ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液/CH₃CN
30/30（v/v） NaOHでpH6.0に調節した溶離：溶離剤Ｂの５％〜65％の勾配、43分流速： 1.8ml/分検出：紫外線254nm 収穫時間は、抗生物質A40926複合体ABを培地に添加
後、アクチノプラネス（Actinoplanes）NRRL 3884につ
いて約196時間に、アクチノプラネス・ミゾウリエンシ
ス（Actinoplanes missouriensis）ATCC 23342 ATCC
31683、ATCC 31682、ATCC 31680、NRRL 15646およ
びNRRL 15647について約168時間に、そしてアクチノプ
ラネス・テイコミセチクス（Actinoplanes teichomyce
ticus）ATCC 31121について約192時間に設定する。デ
アシル化効率は、上の培養物のいずれを用いても実質的
に同様である。

ｂ）回収および精製プールしたエルレンマイヤーフラスコから得られる収
穫したブロスを、NaOHでpH9.5にし、そしてHyflo−FloM
a濾過助剤で濾過する。フィルターケークを排出する
が、透明濾液をHClでpH7.5に調節する。10mlの膨潤した
セファロース−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン（上を参
照）を添加し、そしてこの混合物を一夜室温において攪
拌する。次いで、樹脂を濾過により回収し、引き続いて
フィルター上で４−40mlの40ミリモルのトリス・HCl緩
衝剤（pH6.5）［２−アミノ−２−ヒドロキシ−メチル
−1.3−プロパンジオール］および６×40mlの蒸留水で
洗浄する。次いで、混合物を樹脂から３×40mlの１％
（w/v）の水性NH₄OHで溶離する。この溶液を約４℃に冷
却し、そしてH₂SO₄でpH3.5にする。沈澱を遠心により除
去し、一方生物変換した抗生物質A40926を溶液中にを含
有する上澄み液をNaOHで約pH7.0にし、そして蒸留水中
で膨潤した25mlをセファロース−Ｄ−アラニル−Ｄ−ア
ラニンを含有するカラム（直径）に適用する。このカラ
ムを引き続いて50mlの蒸留水および200mlのエタノール
／水1/9（v/v）で溶離する。次いで、標題の抗生物質を
35mの１％（w/vの水性NH₄OHで溶離する。この溶液を真
空下に濃縮し、次いで凍結乾燥して41〜45mgのデアシル
抗生物質A40926が得られる。

抗生物質A40926因子Ａまたは抗生物質A40926因子Ｂま
たは因子B₀から出発して同一手順は反復することによっ
て、同一の化合物が同一の収率で得られる。

実施例5: 抗生物質A40926アミノグルクロニルアグリコンの調製抗生物質A40926N−アシルアミノグルクロニルアグリ
コン複合体AB、抗生物質A40926N−アシルアミノグルク
ロニルアグリコン因子Ａ、因子Ｂ、因子B₀または因子B₁
（上に記載するようにして調製した）から出発して実施
例４の手順を反復すると、この説明において上に報告し
た特性を有する抗生物質A40926N−アシルアミノグルク
ロニルアグリコンが得られる。

実施例6: デアシル抗生物質A40926Pの調製実施例４の手順を反復するが、抗生物質A40926因子PA
または因子PBまたは任意の比率のそれらの混合物から出
発し、そして塩基性のpHにおける反応物の永続性を最小
に減少することによって、デアシル抗生物質A40926Pが
得られ、その特性は上に報告したとおりである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:045） (72)発明者デナロ，マウリツイオイタリー国20136ミラノ・ビアレブリニ 41

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式式中、Ａは２−アミノ−２−デオキシ−ベータ−Ｄ−グルコピ
ラノシズロン酸基を表し、そしてＢは水素、アルファ−Ｄ−マンノピラノシルまたは６−
アセチル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシルを表す、のデアシルA40926抗生物質およびその付加塩類。
【請求項２】付加塩でない形態で、次の特性：Ａ）次の吸収極大： λmax（nm）ａ）0.1M HCl 282 ｂ）リン酸塩緩衝液 pH6.0 281 ｃ）リン酸塩緩衝液 pH7.4 282、300（肩）ｄ）0.1M KOH 300 を示す紫外線吸収スペクトル、Ｂ）次の吸収極大（nujol mull）（ν、cm^-1）： 3700−3100;3000−2800（nujol）;1650;1590;1505;1460
（nujol）;1375（nujol）;1300、1230、1210、1150、10
60、1030、970、810、720（nujol）示す赤外吸収スペクトル、Ｃ） DMSO d₆（ヘキサジュウトロジメチルスルホキシ
ド）中で記録した270MHzにおける次の信号群（ppm）
［（δ、ppm;m;（帰属）］： 2.30、ｓ（Ｎ−CH₃）;2.49、ｓ（DMSOd₅）;2.7−3.8、
ｍ（糖のCH）;2.79m（Z2）;4.08m（X6）;4.33s（X1）;
4.37d（X5）;4.37d（X7）;4.86m（X2）;5.08s（4f）;5.
08s（Z6）;5.27s（マンノースのアノマープロトン）;5.
35d（アミノグルクロン酸のアノマープロトン）;5.61d
（X4）;5.86s（4b）;6.05、ｄ（X3）;7.73s（6b）;6.45
−8.49（芳香族プロトンおよびペプチドのNH）を示す¹H−NMRスペクトル、Ｄ）バンコマイシン（Vancomycin）（Eli Lilly）に
関して0.34の保持時間（Rt）カラム：シラン化シリカゲルウルトラスフェアー
（Ultrasphare）ODS（５μｍ）4.6mm×25cmアルテック
ス（Altex）［ベックマン（Beckman）］ 18mMのリン酸ナトリウム緩衝液/CH₃CN 92/8（v/v）に
よるアイソクラティック（isocratic）溶離流速:1.8ml/分検出：紫外線 254nm 内部標準：バンコマイシン（Eli Lilly）Rt8.4分Ｅ） FAB−MS分光分析によって決定して1548の分子
量、を有する請求の範囲第１項記載のデアシルA40926抗生物
質またはその付加塩類。
【請求項３】式Ｉにおいて、Ａが定義したとおりであ
り、そしてＢが水素を表す抗生物質A40926アミノグルク
ロニルアグリコンまたはその付加塩である請求の範囲第
１項記載の化合物。
【請求項４】式Ｉにおいて、Ａが定義したとおりであ
り、そしてＢが６−アセチル−アルファ−Ｄ−マンノシ
ルを表すデアシル抗生物質A40926Pまたは付加塩である
請求の範囲第１項記載の化合物。
【請求項５】Ａが定義したとおりであり、そしてＢがア
ルファ−Ｄ−マンノシルを表す請求の範囲第１項記載の
デアシル抗生物質A40926またはその付加塩類である請求
の範囲第１項記載の化合物。
【請求項６】式式中、Ａは２−デオキシ−２−（C₁₁−C₁₂）アシルアミノ−ベ
ータ−Ｄ−グルコピラノシズロン酸基を表し、そしてＢは水素、アルファ−Ｄ−マンノシルまたは６−アセチ
ル−アルファ−Ｄ−マンノシルを表す、の化合物、その付加塩および／または任意の比率のそれ
らの混合物を、アクチノプラネス・テイコミセチクス
（Actinoplanes teichomyceticus）ATCC 31121、アク
チノプラネス・テイコミセチクス（Actinplanes teich
omyceticus）ATCC 53649、アクチノプラネス（Actinop
lanes）NPPL 3884、アクチノプラネス・ミゾウリエン
シス（Actinoplanes missouriensis）ATCC 23342、ア
クチノプラネス・ミゾウリエンシス（Actinoplanes mi
ssouriensis）NRRL 15646、アクチノプラネス・ミゾウ
リエンシス（Actinoplanes missouriensis）NRRL 156
47、アクチノプラネス・ミゾウリエンシス（Actinoplan
es missouriensis）ATCC 31683、アクチノプラネス・
ミゾウリエンシス（Actinoplanes missouriensis）ATC
C 31682、アクチノプラネス・ミゾウリエンシス（Acti
noplanes missouriensis）ATCC 31680、および親株の
脱アシル能力を保持するそれらの突然変異体または変異
型から成る群より選択されるアクチノプラネス（Actino
planes）属の菌株の成長培養物で処理することを特徴と
する式式中、Ａは２−アミノ−２−デオキシ−ベータ−Ｄ−グルコピ
ラノシズロン酸基を表し、そしてＢは水素、アルファ−Ｄ−マンノピラノシルまたは６−
アセチル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシルを表す、のデアシルA40926抗生物質およびその付加塩類の製造方
法。
【請求項７】脱アシル微生物の成長培養物の代わりに、
洗浄した菌糸体、細胞不含抽出液または濃縮物を使用す
る請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】反応温度が20℃〜40℃である請求の範囲第
６または７項記載の方法。
【請求項９】反応温度が25℃〜50℃である請求の範囲第
７項記載の方法。
【請求項１０】抗生物質A40926複合体、因子Ａ、Ｂまた
はB₀からデアシル抗生物質A40926を製造する請求の範囲
第６項記載の方法。
【請求項１１】抗生物質A40926N−アシルアミノグルク
ロニルアグリコン複合体、因子Ａ、ＢまたはB₀から抗生
物質A40926アミノグルクロニルアグリコンを製造する請
求の範囲第６項記載の方法。