SU1194285A3 - Способ получени антибиотиков А51568-фактора А и А51568-фактора В - Google Patents

Abstract

Способ получени  антибиотиков формулы .

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промьшшенности, в частности к производству антибиотиков.

Целью изобретени   вл етс  создание спосо.ба получени  новых антибиотиков , активными против грамположительных микроорганизмов.

Дл  осуществлени  способа используют штамм Nocardia orientalis NRFL 15232, который характеризуетс  следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Имеет субстрактньй и воздушньй мицелий. Воздушные гифы похожи на паутину, при глубинном культивироваии в услови х встр хивани  разрьгоатс  на короткие фрагменты.

Рельеф споровой поверхности гладий . Форма споры мен етс  от сферической до цилиндрической. Образует споры в незначительном количестве и нерегул рное

Солодовый агар с дрожжевым экстрактом (МСП 2), Рост обильный, складчата  поверхность. Воздушный мицелий обильный, серый. Раствориый пигмент красновато-коричневый.

Крахмальный агар с неорганическими сол ми (МСП № 4. Рост обильный, воздушный мицелий обильный, перламутровый белый. Растворимый пигмент отсутствует.

Глицерин - -аспарагиновый агар (МСП № 5). Рост обильный. Воздушный мицелий обильный, перламутровый белый. Растворимый пигмент свето-коричневьй .

Тирозиновый агар (МСП № 7). Рост обильный. Обратйа  сторона колонии черного цвета. Воздушный мицед1ий обильньй, желтый. Растворимый пигмент темный, красновато-коричневый.

Агар Чапека. Рост хороший. Воздушньй мицелий хороший, перламутровый белый. Растворимый пигмент светло-коичневый .

Агар Эмерсона. Рост обильный, орщинистьй, слоистый. Воздушньй миелий хорошо развит, бледно-желтьй.

Глицерин - глицин . Рост обильньй . Воздушный мицелий обильный, перамутровый серый. Растворимьй пигмент оливково-коричневьй.

Цельные клетки по сахарному состау относ тс  к типу А, а клеточна  оболочка - к типу ТУ;

Физиолого-биохимические признаки.

Каталаза положительна .

Разлагает козеин, ДНК, гипоксантин тирозин, мочевину, ксантин, не разлагает аденин.

Желатину разжижает.

Гидролизует зскулин, сн тое молоко крахмал.

МеЛаноидна  пигментаци  отрицательна . Нитрит из нитрата не образует.

Фосфатаза положительна .

Совместимость с NaCl 8%.

Устойчив к лизоциму, пенициллину, рифампицину; чувствителен к бацитрацину , новобмоцину.

Вырабатывает уреазу. Усваивает углеродсодержащие соединени  и органические кислоты.

I

Грамположительный. ВьЕкивает при. 8ч. Температурньй интервал 10-40 С. Сбраживает углеводы до кислоты: L (+)арабинозу, целлобиозу, i-эритрит фруктозу, д(+)галактозу, глюкозу, глицерин, i-инозитол, инулин, d(+)лактозу , d(+)мaльтoзy, й(-)маннкт, d(+)MaHH03y, 4(+)мелезитозу, cs -метилD-глюкозид , салицин, сахарозу, d(+) трефалрзу, d(+)ксилозу; не сбраживает адонитол, целлюлозу, дульцитол, d(+.)мeлибиoзy, .d(+)paфинoзy, Ь(+)рамнозу d()copбит.

Пример 1. Получение посевной культуры первой стадии.

Дл  вьфащивани  Nocardia orientalis NRRL 15232 на скошенном агаре готов т следующую среду, г/л: термически обработанна  овс на  мука 60,0: дрожжи 2,5; Kj,HPO 1,0; исходный минеральный раствор Чапека 5,0 мл/л; агар 25,0; дистилл.ированна  вода до 1,0.л.

Исходньй минеральньй раствор Чапека -5сод%ржит, г/100 МЛ5 КС1 10,0; 10,0; ,0 0,2; дистиллированна  вода до 100 мл.

Перед стерилизацией раствор с рН 6,2 довод т до рН 7,3 водным раствором гидроокиси натри . После стерилизации рН среды 6,7.

Споры штамма высевают на скошенный агар вьш1еуказанного состава и инкубируют в течение 7 дней при . Затем культуру заливают стерильной дистиллированной водой и снимают культуру стерильным инструментом дл  диспергировани  спор и мицели . 1 мл споровой суспензии используют дл  засева 50 мл вегетативной среды, имеющей следуюпщй состав , г/л: картофельньй декстрин

3

30,0; патока 20,0; бактепентон 7,0;, с -тирозин 1,0; дистиллированна  вода до 1,0 л; рН 5,5. Довод т рН до 7,0, водным раствором гидроокиси натри  перед стерилизацией, после стерилизации рН 6,1.

.Вегетативный посевной материал инкубируют в 250 мл широкогорлой колбы Эрленмейера при 30 в течение 48 ч на аппарате дл  встр хивани , вращающемс  по Дуге диаметром 5,08 см со скоростью 250 об/мин. Эту инкубационную среду используют либо дл  засева небольших ферментаторов (концентраци  засева 0|8 об.% в об.среды),.либо дл  засева сосудов второй стадии, предназначенных дл  получени  большего объема мицели .

Ферментаци  А 51568,1.

100 л ферментационной среды засевают 0,8% (800 мл) вышеописанной культуральной жидкостью.

Ферментационна  среда имеет, следующий состав, .г/л: полипропиленгликоль (2000) 0,2; картофельный декстрин Difco 30,0; патока 20,0; бактопептон Difco 7,0; oi-тирозин 1,0; дистиллированна  вода до 100 л; рН.5,2. Водным 5N раствором гидроокиси натри  довод т рН среды до 7,1, стерилизуют при 121°С и давлении 1,19 - 1,33 кг/см в течение 45 мин. После стерилизации рН среды 6,2.

Ферментацию ведут в 165-литровом ферментационном танке в течение приблизительно 114 ч при 30.С. Аэрацию ведут со скоростью 0 15V/V/ /мин и перемешивают обычной мешалкой со скоростью около 200 об/мин. Накопление антибиотика в культуральной среде контролируют центрифугированием образца культуральной. жидкости при 1000 g и декантируют супернатант дл  анализа. Образец разбавл ют фосфатным буфером с рН 6,0 и подвергают микробиологическому анализу испытанием на чашке с агаром с использованием Micrococcus luteits АТСС 8341 в качестве теста-микроба.

П р и м е р 2. Вьщеление антибиотической А51568-смеси.

К 3 л культуральнай жидкости, содержащей факторы А и В в соотношении приблизительно 95:5, добавл ют фильтровальный брикет (кизельгур) и смесь отфильтровывают. 2,7 л фильтрата с рН 7,8 нанос т на смолу

942Й5Л

Diaion НР-20 (высокопористый стиролдивинилбензольный сополимер в форме шариков), помещенную в колонку размером 3x25 см. Элюент отбрасьша5 ют и колонку промывают 1 л воды и 500 мл 25%-ного раствора метанола в воде. Смесь антибиотиков элюируют из колонки дважды по 500 мл 50%-го водного раствора метанола. ФактоtO РЫ А и В одинаково, адсорбируютс  на НР-20 и элюируют с этой смолы в одинаковых услови х.

Фракции элюата оценивают на антибиотическую активность с использованием В. suhtilis. Более активные фракции концентрируют до небольшого объема и лиофилизуют. Получают сырую антибиотическую А 51568-смесь весом 905 мг. .

20 П р и м е р 3. Очистка антибиотической А51568-смеси.

Сырую антибиотическую смесь раствор ют в 50 мл воды и нанос т на колонку размером 1,7x44 см, заполненную

25 Сефадексом СМ-25 в .е. Элюент отбрасьшают, колонку промывают 250 мл воды. Затем колонку элюируют злюентом , в котором концентраци  бикарбоната аммони  нарастает по вогнутой

2JJ кривой ( 1 йчейка смешени  100 мл). Собирают 50 фракций

. по 25 мл и провер ют их на антибиотическую активность с использованием В,subtilis..

Факторы А и В элюируютс  в различ35 ных фракци х. Дл  обессоливани  продукта отобранные фракции с фактором А нанос т на хроматографическую колонку размером 1,7x10 см, запаенную смолой Diaicn НР-20, которую предва40 рительно вьщерживают в воде до равновесного набухани , и колонку промывают водой, после чего элюируют 100 мл 50%-го водного раствора метанола. Метанольный элюат вьшаривают до сухо45 го остатка. Остаток раствор ют в небольшом количестве воды и подкисл ют О, IN водным раствором хло ристоводородной кислоты. Затем подкисленную смесь лиофилизируют. Получают 25 мг

очищенного антибиотического А51568фактора А.

Дл  выделени  фактора В используют методику по примеру 3 с использованием анализа с помощью жидкостной хроматографии высокого давлени  вместо анализа с помощью В.subtilis.

Отдельно отобранные фракции обессоливают аналогично фракции А 5 и получают один продукт, обоггиценНЫЙ фактором А, и второй продукт, обогащенный фактором В. П р и м е р 4. Выделение, очистка и разделевие А51568-фактороЕ А и В. Дл  отделени  А51568-смеси фактороз А и В от культуральной жидкос ти последнюю фильтруют через фильтр Hyflo supercel. После доведени  фильтрата до рН 6,0-6,5 с помощь.ю 5NHC1 прибавл ют смолу Jonac Х-236(Н) и смесь перемешивают дл  адсорбции антибиотиков. Супернатант отбрасывают и смолу промывают водой (10 V смолы). После отбрасывани  промьюных вод смолу Х-236 помещают в колонку, которую элюируют О,IN раствором хлорида аммони  (5 V колонки), фракции объемом -4 л сразу нейтрализуют 5N НС1. Сонтролируют антибиотическую активность с помощью S.aureus и жидкостной хроматографии высокого давлени  Фракции, содержащие А 51568-факторы А и В, отбирают и дл  обессолива ни .смеси пропускают через колонку со смолой Diaion НР-20. Элюент отбрасывают . Затем смолу элюируют 5%-ным раствором изопропилового спи та, содержащим 0,1% HjPOj. Фракции по 500 мл собирают и определ ют в них антибиотическую активность. Активные фракции соедин ют, концент рируют и лиофилизируют. Дл  дальнейшей очистки продукта и одновременного разделени  факторов А и В загр зненную смесь факторов А и В раствор ют в воде и нанос т на колонку с СМ-сефадексом с-25 Колонку элюируют, линейным градиентом от воды до 0525N . Фракции анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давлени  и фракции, содержащие фактор А, собирают отдельно от фракций, содер жащих фактор В. Дл  удалени  соли, добавленной на предьвдущей стадии, каждый набор фракций нанос т на колонку со смоло Diaion НР-20, которую элюируют 5%-ным раствором изопропилового спирта, содержащего 0,1% HjPO. Соответствующий набор фракций на каждой колонке отбирают на основании анализа с помощью жидкостной хроматографии высокого давлени . Дл  набора фракций концентрируют. 856 лиофилизируют и получают соответственно практически чистый А51568фактор А и практически чистьй А51568-фактор В. Антибиотик А51568-фактор А представл ет собой белое, аморфное твердое соединение. Элементный состав, %: углерода 50,635 водорода 5,07; азота 8,36; хлора 8,19; кислорода 25,16. Молекул рный вес около 1435. Эмпирическа  формула C yH-jjCljNgO . Потенциометрическим титрованием фактора А в 66%-ном водном растворе диметилформамида получают значени  рКа, равные 6,2; .8,8; 10,3 и 12,85 (первоначальный. ,12) . , „j. Удельное, вращение: 20,4 (С-10 мг/мл, вода), Г.,6 ( МГ/1УШ, вода). Спектр инфракрасного поглощени  в таблетке из КВг, максимум поглоще ни : 3400 (широкий, сильный), 3380 (пюрокий, сильный), 1657 (широкий, сильный), 1387 (средней интенсивности ), 1505 (средней интенсивности), 1424 (средний), 1396 (средний), 1328 (широкий, слабый), 1310 (широкий ,; слабьй), 1231 .(средней интенсивно .сти) ,1174 (слабьй) , 1156 (слабьй) , 11/8 (средний), 1062 (средней интенсивности ), 1028 (слабый), 1015 (слабый ) , 990 (слабый), 882 (слабьш), 88t (слабый) см УФ - спектрофотометри : кислотные или нейтральные услови , макс., нм (t):278 (5500), 234 (плечо) (25000). Щелочные услови , макс. нм ():302 (6000), 264 (плечо) (10000). Антибиотический А51568-фактор В белое , аморфное твердое соединение.. Молекул рна  масса около 1437. Эмпирическа  формула С 45 К тгСХ .. Протонный ЯМР - спектр фактора В схож со спектром ванкомицина и фактора А, но отличаетс  отсутствием резонанса N-CH,N - ристил/лейцина, имеющего место в спектре ванкомицина и. аспарогиновых резонансов, найденных в спектрах ванкомицина и фактора А, в спектре фактора В имеютс  оезонансы глутамина. Про вл ет активность по отношению к аэробным и анаэробным бактери м, таким как Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes. Streptococcus pneumonial . Streptococcus species,

7 11942858

Haemophilfis influenzae, Escherichiafragilis, Bacteroides fchetaiotaoraiccoli , Klebsiella pneumoniae,ron, Bacteroides melaninogenicus,

Clostridium difficile, ClostridiumBacteroidS vulgatis, Bacteroides

perfrlngens, Clostridium septicum,corrodens, Fusobacterium sumbiosum,

Eubacterium aerofaciens, Peptococcus5 Fusobacterium necrophorum.

asaccharolyticus, Peptococcus prevo-Антибиотики или их фармацевтичесti , Peptostreptococcus anaerobius,ки приемлемые соли примен ют дл  леPeptostreptococcus intermedius, .чени  инфекций у людейи животных, при

Propionifacterium acnes,Bacteroidesэтом .эффективна доза равна25-2000 мг.

Claims (1)

1. Способ получения антибиотиков формулы

   Глюкоз&анкозамин где n=1 (А51568-фактор А); n=2 (А51568-фактор В), заключающийся в том, что штамм Nocardia oriental is NRRL 15232 культивируют в питательной,среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим выделением из культуральной жидкости целевых продуктов.