DK167688B1

DK167688B1 - Antibiotika benaevnt a51568 faktor a og b, en fremgangsmaade til fremstilling heraf, mikroorganismen nocardia orientalis nrrl 15232 til brug ved fremgangsmaaden, farmaceutiske praeparater indeholdende saadanne antibiotika samt anvendelse af disse antibiotika som antibiotiske midler

Info

Publication number: DK167688B1
Application number: DK578083A
Authority: DK
Inventors: Marvin Martin Hoehn; Gary G Marconi
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1982-12-20
Filing date: 1983-12-15
Publication date: 1993-12-06
Also published as: GB2132207B; ATE42571T1; HK72088A; JPH05168466A; IE832990L; GR78784B; EP0112184B1; IL70441A0; NZ206592A; EP0112184A3; GB8333668D0; PT77810A; ES528197A0; RO87735B1; ZA839269B; JPS59118798A; JPH0430400B2; GB2132207A; EG16163A; AU2242683A

Description

i DK 167688 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte antibiotika benævnt A51568 faktor A og B, der fremstilles ved at dyrke den hidtil ubeskrevne mikroorganisme Nocardia orientalis NRRL 15232, eller en A51568 producerende mutant heraf under 5 neddykkede aerobe fermenteringsbetingelser. Opfindelsen angår endvidere mikroorganismen Nocardia orientalis NRRL 15232 til brug ved fremgangsmåden, farmaceutiske præparater indeholdende de omhandlede antibiotika samt disse antibiotika til brug som antibiotiske midler. Nocardia 10 orientalis NRRL 15232 frembringer normalt en blanding af A51568 faktor A og B i et forhold på ca. 95 til 5. Disse antibiotika hæmmer væksten af patogene mikroorganismer, specielt de gram-positive arter stapholococcus og streptococcus, der er resistente overfor penicillin.

15

En stor mængde mikroorganismer er patogene og forårsager sygdomme hos både mennesker og dyr. I de senere år er der blevet udviklet en stor mængde antibiotika, der er aktive overfor patogene organismer. Der er imidlertid stadig et 20 behov for at finde midler, der er mere effektive overfor disse patogene mikroorganismer, for med større held at kunne behandle de sygdomme, der er forårsaget af mikroorganismer i mennesker eller dyr.

25 De omhandlede antibiotika A51568 faktor A og B hører til glycopeptid-familien af antibiotika og er gram-positive antimikrobielle midler.

Glycopeptid-antibiotika kendes allerede inden for bl.a.

30 områderne vancomycin, McCormick et al., US patentskrift nr. 3 067 099 (4. december 1962), idet opbygningen af vancomycin er omtalt af Williamson et al., J. Am. Chem.

Soc. 103, 6580-6585 (1981); actaplanin (antibiotium A- 4694), Hamill et al., US patentskrift nr. 3 952 095 (20.

35 april 1976), idet en del af opbygningen af actaplanin er omtalt af Debono i US patentskrift nr. 4 322 343 (30. marts 1982); ristocetin, GB patentskrift nr. 765 886

UK I O/OSS b I

2 (1957), idet opbygningen af ristocetin A, en faktor i ristocetin-komplekset, er behandlet af Kalman et al., J.

Am. Chera. Soc. 102, 897-905 (1980); og avoparcin, Kunst-mann et al., US patentskrift 3 338 786 (29. august 1967), 5 idet opbygningen af avoparcin er beskrevet af Ellestad et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 6522-6524 (1981).

Opfindelsen tilvejebringer nærmere bestemt et isoleret antibiotikum, som er ejendommeligt ved at have formlen I

10 g Iucose-va ncosam i n • /\ ^ Λ ?' 15 /\/ γ \/\/\ i il t« Y jt „o/VY V \/γ 1 o I *o r 20 /\ o y \ o y\

o< \" H/ \« H/ Y

> Y Y Y

™“\ Λ Y- \ 25 /\ Γ I! cifø^Hs i rv HOT \y X0H OH 30 hvori n er 1 eller 2, eller farmaceutisk acceptable salte heraf. Antibiotikummet med formlen I, hvori n er 1, er 35 blevet betegnet A51568 faktor A. Antibiotikummet med formlen I, hvori n er 2, er blevet betegnet A51568 faktor B.

3 DK 167688 B1

Antibiotikum A51568 faktor A er et hvidt amorft fast materiale. En elementaranalyse af antibiotikum A51568 faktor A angiver følgende procentvise sammensætning: 50,63% carbon, 5,07% hydrogen, 8,36% nitrogen, 8,19% chlor og 5 25,16% oxygen. Den antibiotiske forbindelse har en mole kylvægt på ca. 1435 bestemt ved massespektrometri under bombardement med hurtige atomer.

Det protonkernemagnetiske resonansspektrum af antibioti-10 kum A51558 faktor A bestemtes i dimethylsulfoxid ved 60 °C og 360 MHz. De mange seksleddede ringe i formlen er identificeret ved bogstaver som angivet i følgende formel: , . glucose-vancosamin : a i A ,, Ί^ί ,n HC-/VXcl V \ / V' 20 2 I V Voh /•S' o L' 2 o I , / \H 11 / \H 11 / \ o c \ o c cxr \" H/ : V H/ \ \h J-nh 25 Γ \

H00C-e,i' i \Y

/\ Ah, /\ Ί DI V*5

H0/ V/ \)H OH

30 %

En oversigt over de kemiske forskydninger (chemical shift) i ppm er anført i den nedenstående tabel 1.

35

UK 10/000 o I

Kemiske forskydninger for A51568 faktor A (60 °C)

Betegnelse Betegnelse 5 Ring A Kemisk forskydning Asparagin Kemisk forskydning

Tabel I

4 -NH 6,54 -NH 6,61 -2' 4,19 -a 4,32 -1' 5,14 -Ø'er 2,56 & 10 -OH 5,86 2,14 -2 7,86 -NH2 7,29 & -5 7,30 6,83 -6 7,47 15 Leucin

Ring B -NH2 * -NH 8,24 -a 3,70 -1' 5,72 -0'er 1,65 & -2 5,63 1,49 20 -6 5,22 -r 1,76 -a'er 0,93 & 0,90

Ring C Glucose 25 -NH ----* -1 5,33 -2' 4,78 -2 3,58 -1’ 5,18 -3 3,49 -OH 5,74 -4 3,29 -2 7,66 -5 _* 30 -3 7,18 -6 3,70 & -6 7,42 3,54

Ring D Vancosamin -NH 8,45 -1 5,30 35 -1' 4,47 -2 1,93 & -2 6,26 1,77 -4 6,42 (3-CH3) 1,37 5 DK 167688 B1

Tabel 1 fortsat

Kemiske forskydninger for A51568 faktor A Betegnelse Betegnelse 5 Ring A Kemisk forskydning Vancosamin Kemisk forskydning -NH 8,54 4 ----* -1' 4,47 5 4,67 -2 7,17 (5-CH3) 1,09 10 -5 6,72 -6 6,79 * ikke bestemt 15 Det protonkernemagnetiske resonansspektrum af antibiotikum A51568 faktor A er meget lig med spektret af vancomycin. Hovedforskellen ses i fraværet af N-CH0 resonans for N-(methyl)leucin i spektret for A51568. Proton NMR spektret af vancomycin indeholder således en methyl-singlet 20 ved 2,39 ppm, der ikke findes i proton NMR spektret af A51568 faktor A.

Baseret på molekylvægten, det protonkernemagnetiske resonans-spektrum og elementaranalysen har antibiotikum 25 A51568 faktor A den empiriske formel Cg3H^gCl2Ng02^.

Potentiometrisk titrering af antibiotikum A51568 faktor A i 66% vandig dimethyl formamid giver pKa værdier på 6,2, 8,8, 10,3 og 12,85 (begyndelses-pH 6,12).

30

Antibiotikum A51568 faktor A har følgende specifikke rotation : 25 °r [o] n = 20,4° (C=10 mg/ml, vand), 2 5 0 cu [a] = -33,6° (C=10 mg/ml, vand).

Det infrarøde absorptionsspektrum af antibiotikum A51568 faktor A optaget i en KBr-pellet er vist på tegningen.

35

Ulv Ib/bbb b l 6 Følgende skelnelige absorptionsmaksima ses: 3400 (bred, stærk), 3380 (bred, stærk), 1657 (bred, stærk), 1587 (middelstærk), 1505 (middelstærk), 1424 (middel), 1396 (middel), 1328 (bred, svag), 1310 (bred 5 svag), 1231 (middelstærk), 1174 (svag), 1156 (svag), 1128 (middel), 1062 (middelstærk), 1028 (svag), 1015 (svag), 990 (svag), 882 (svag), 881 (svag) cm-'*'.

De ultraviolette absorptionsmaksima af antibiotikum 10 A51568 faktor A i vand under sure, neutrale og basiske betingelser er angivet i tabel 2 nedenfor: TABEL 2 15 UV spektrofotometri af

antibiotikum A51568 faktor A

Sur eller neutral Basisk max nm (s)_ max nm (e) 20 278 (5,500) 302 (6,000) 234 (skulder) 264 (skulder) (25,000) (10,000)

Antibiotikum A51568 faktor B (formel I, hvori n er 2) er 25 et hvidt amorft fast stof. A51568 faktor B har en molekylvægt på ca. 1437 bestemt ved massespektrometri under bombardement med hurtige atomer.

Det protonkernemagnetiske resonansspektrum af antibioti-30 kum A51568 faktor B bestemtes i dimethylsulfoxid ved 60 °C og 360 MHz. De mange seksleddede ringe i formlen er identificeret ved bogstaver som angivet i følgende formel: 35 7 DK 167688 B1 g Iucose—vancosam i π

5 “ A I A P

,/V\.A/\ J\ J\ A *\A lcr

HO-/V ^ V \/V

I 2 j V y-OH

ίο /% 0 Å' 2 o i , ° / V "/ \H " /\ / X 0 / \ O X \h \ y \ y , v

\H V7 \a/ Leu I

v \y α»—nh I ’ Glu y / 2 HOQC—-»i' l 3 P 3» \ */ \~ γ L· /\ /\ e r 1 /\ 1» —\/·5 Λ«.- hX \/ X0H Jh 4 20 25 En oversigt over de kemiske forskydninger (chemical shift) i ppm er anført i den nedenstående tabel 3.

30 35

Tabel 3

Kemiske forskydninger for A51568 faktor A (60 °C)

Betegnelse Betegnelse 5 Ring A Kemisk forskydning Glutamin Kemisk forskydning uiv ιο/bbb b i δ -NH 6,54 -NH 6,83 -2' 4,19 -a 4,06 -1' 5,13 -0 1,67 & 10 -OH 5,85 r 1,87 -2 7,84 -NH2 6,83 & -5 7,29 6,41 -6 7,47 15 Leucin

Ring B -NH2 _* -NH 7,63 -a 4,05 -1' 5,67 -0'er 1,63 -2 5,60 1,68 20 -6 5,23 -r 1,67 -6'er 0,92 0,91

Ring C Glucose 25 -NH ----* -1 5,33 -2' 4,81 -2 5,52 -1' 5,13 -3 3,48 -OH 5,83 -4 3,29 -2 7,84 -5 3,16 30 -3 7,16 -6 3,70 & -6 7,13 3,52

Ring D Vancosamin -NH 8,42 -1 5,30 35 -1' 4,48 -2 1,92 & -2 6,29 1,76 -4 6,42 (3-CH3) 1,37

Kemiske forskydninger for A51568 faktor A

Betegnelse Betegnelse 5 Ring E Kemisk forskydning Vancosamin Kemisk forskydning

Tabel 3 fortsat 9 DK 167688 B1 -NH 8,48 4 3,16 -1’ 4,48 5 4,67 -2 7,18 (5-CHg) 1,09 10 -5 6,72 -6 6,79 * ikke bestemt 15 Det protonkernemagnetiske resonansspektrum af antibiotikum A51568 faktor B er meget lig med spektret af vancomycin og af A51568 faktor A. Hovedforskellene, der findes ved studium af spektrene, er at der ikke findes den N-CHg resonans for N-(methyl)leucin, der findes i vancomycin-20 spektret, og at der ikke findes de asparagin-resonanser, der findes i spektrene for vancomycin og A51568 faktor A. Asparagin-resonanserne, der ses i vancomycin og i A51568 faktor A, er erstattet med glutamin-resonanser i A51568 faktor B.

25

Baseret på massespektral-data, det protonkernemagnetiske resonansspektrum og sammenligning af disse resultater med de tilsvarende resultater for A51568 faktor A fås en empirisk formel cg5H73d2N9®24 ^or antibi°tikum A51568 fak-30 tor B.

Den antibiotiske blanding A51568 indeholdende faktorerne A og B frembringes ved at dyrke den ikke tidligere beskrevne stamme Nocardia orientalis NRRL 15232. Fremgangs-35 måden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man dyrker Nocardia orientalis NRRL 15232 eller en A 51568-pro-ducerende mutant heraf i et dyrkningssubstrat indeholden-

Ulv 10/033 B l 10 de assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte under neddykkede aerobe fermenteringsbetingelser, indtil der er produceret en væsentlig mængde antibiotisk aktivitet, og at man herefter isolerer den dan-5 nede forbindelse med formlen I.

Opfindelsen angår yderligere den omhandlede stamme Nocar-dia orientalis NRRL 15232. Den biologisk rene kultur af Nocardia orientalis NRRL 15232 betegnes som kulturen 10 A51568.1.

Kulturen A51568.1. er en variantstamme, der gennem naturlig selektion er afledt af kulturen A51568, idet sidstnævnte kultur oprindelig isoleredes fra en jordprøve op-15 samlet i Yucatan, Mexico.

Kulturen A51568.1 er klassificeret som en stamme af Nocardia orientalis baseret på samtidige laboratoriesammen-ligninger såvel som sammenligninger med publicerede be-20 skrivelser af Nocardia af D. Berd, "Laboratory Identifi cation of Clinically Important Aerobic Actinomycetes",

Appl. Microbiol. 25(4), 665-681 (1973); ud fra Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave redigeret af R.E. Buchanan og N.E. Gibbons (The Williams and Wil-25 kins Co., Baltimore); af R.E. Gordon et al., "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophia and the Nocardin Strain",

Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54-63 (1974); af R.E.

Gordon et al., "Resistance to Rifampin and Lysozyme of Strains of Some Species of Mycobacterium and Nocardia as 30 a Taxonomic Tool", Int. J. Syst. Bacteriol. 27(3), 176-178 (1977); af S.A. Waksman, The Actinomycetes Vol. II, [The Williams and Wilkins Co., Baltimore (1961)]; og med publicerede beskrivelser af disse arter af R.E. Gordon et al., "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. car-35 nea, N. vacinii, N. transvalensis, N. orientalis, and N. aerocolonigenes", J. Gen. Microbiol. 109, 69-78 (1978); af S.J. Mishra et al., "Identification of Nocardiae and DK 167688 B1 11

Streptomycetes of Medical Importance", J. Clin. Microbiol. 11(6), 728-736 (1980) og af Pittenger et al., "Streptomyces orientalis, n. sp., the Source of Vancomycin", Antibiot. and Chemoth. VI(ll), 642-647 5 (1956).

Man fulgte metoderne og substraterne anbefalet for "the International Streptomyces Project" (ISP) til karakterisering af Streptomyces-arter, som er publiceret af 10 Shirling og Gottlieb [Methods of Characterization of Streptomyces Species", Ing. J. Syst. Bacteriol. 16(3), 313-340 (1966)], såvel som metoder anbefalet til karakterisering af Nocardia arter publiceret af Gordon et al., "Nocardia coeliaca, Nocardia autrophis, and the Nocardin 15 Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. (24(1), 54-63 (1974).

Karakterisering af A51568.1 kulturen

Morfologi 20

Kulturen A51568.1 frembringer et extensivt substrat og luftmycelium. Når kulturen ses under mikroskop, har lufthyferne et spindelvævsagtigt udseende. Når kulturen dyrkes neddykket under rystning, brydes hyferne ned til kor-25 te mycelie-fragmenter.

Der kunne ikke observeres conidia, når lufthyferne undersøgtes ved lysmikroskopi. Imidlertid ses conidierne, når kulturen undersøges ved skanderende elektronmikroskopi.

30 Disse træk observeres, dersom kultur A51568.1 dyrkes på ISP substrat nr. 5 og postevandsagar. Sporeoverfladeudseendet er glat (Sm). Sporeformen er sfærisk til cylindrisk, og sporerne er dårligt og uregelmæssigt udformet.

Denne morfologi klassificeres i ikke-streptomycetes-sek-35 tionen således som beskrevet i Bergey's Manual nævnt ovenfor.

12

Dyrkningskarakteristika

Kulturen A51568.1 vokser godt på gærdextroseagar såvel som på mange andre agarsubstrater, idet væksten ofte er 5 krøllet og flageagtig. Der produceres rigelige luftmycelier, der har en sporemas sefarve i de grå (GY) og somme tider hvide (W) farverækker. Den nærmeste matchende farveangivelse for de grå farverækker i Tresner og Backus systemet (se Tresner og Backus, "System of Color Wheels 10 for Streptomycete Taxonomy", Appl. Microbiol. 11, 335-338 (1956) er d lysegrå til 2 dc gulliggrå.

Væksten ovenover er hverken så tæt eller så lang, som det er typisk for streptomyces. Luftvækst fås på en agar af 15 uorganiske salte og stivelse (ISP nr. 4), på glycerol-asparagin-agar (ISP nr. 5) og på glycerol-glycin-agar, og den ses bedst, dersom der dyrkes på gær-maltekstrakt-agar (ISP nr. 2).

20 En mørkebrun distinkt farve ses på bagsiden i følgende agarsubstrater: ISP nr. 2, ISP nr. 5, tyrosin-agar (ISP nr. 7) og glycerol-glycin-agar. Denne farve er upåvirkelig af pH. Et lyst til rødligt brunt opløseligt pigment fremkommer også i ovennævnte substrater såvel som i 25 Czapek's opløsningsagar og i glucose-asparagin-agar. Den modsatte farve af kultur A51568.1 i andre substrater er gulbrun.

Dersom der foretages dyrkning på plader for variabilitet, 30 viser kultur A51568.1 ingen blanding af kolonityper, og kulturen A.51568.1 betragtes derfor som et stabilt iso-lat.

Dyrkningsegenskaberne af kultur A51568.1 på forskellige 35 substrater i sammenligning med dyrkningsegenskaberne for Nocardia orientalis ATCC 19795 er angivet i tabel 4 nedenfor .

DK 167688 B1 13

Farvebetegnelserne er taget fra ISCC-NBS "Centroid Color Charts" Sample No. 2106 (national Bureau of Standards, U.S. Department of Commerce, 1958) og Color Harmony-Manual, 4. udgave (Color Standards Department, Container 5 Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958).

Tabel 4 Vækstegenskaber af A51568.1 og ATCC 19795 på forskellige substrater

Substrat A51568.1 ATCC 19795 G. Rigeligt-rynket rigeligt-rynket overflade overflade

ISP R. 59.1.Br (ingen 72-d.OY

pH forandring) 15 2 Am. Rigeligt: d 1. Rigeligt: 2ba lyse grå (GY) gul (Y)

Sp: rødbrunt intet G: rigeligt rigeligt

20 ISP R: 89-p.Y 89.p.Y

3 Am: god:d 1. grå (GY) god: d 1. grå (GY)

Sp: intet intet G: rigelig rigelig 25

ISP R: 72.d.0Y 70.1.0Y

4 Am: rigeligt:b rigeligt:b østershvidt (W) østershvidt (W)

Sp: intet intet 30 G: rigelig rigelig

ISP R: 59.d.Br (ingen 70.1.0Y

forandring) 5 Am: rigeligt:b rigeligt:b østershvidt (W) østershvidt (W) 35

Sp: lysebrunt intet G: rigelig rigelig

ISP R: 65.br. sort 71.m.0Y

(ingen pH forandring) 14

UIV 10/000 o I

G: god god

Czapeks R: 74.2.yBR 70.1.0Y

5

Tabel 4 fortsat Vækstegenskaber af A51568.1 og ATCC 19795 på forskellige substrater 10 Substrat A51568.1 ATCC 19795 opløsning Am: god:b østershvidt (W) god:b østershvidt (W)

Sp: lysebrunt intet G: rigelig-rynket-flaget rigeligt-rynket-flaget 15

Emerson's R: 74.s.yBr 74.s.yBr

Agar Am: God:d.1.GYT God:2ba p.

2ba p.Y (GY) gul (Y)

Sp: intet intet 7Ω G: rigelig rigelig

Glucose R: 75 dyb Br 67. strålende OY

Asparagin

Am: rigeligt: 2dc y rigeligt:2ba p.

grå (GY) gul (Y) 25 Sp: olivenbrunt intet G: rigelig rigelig

Glycerol- R: 78.d.yB (ingen 71.m.0Y

glycin pH forandring)

Am: rigeligt: 2dc Y rigeligt:2ba p.

30 grå (GY) gul (Y)

Sp: olivenbrun intet G: god god

Nærings- R: 70.1.0Y 70.1.0Y

35 agar Am: god:b østershvidt (W) god: b østershvidt (W)

Sp: intet intet G: moderat moderat

Postevand R: 83. grå 93. grå DK 167688 B1 15

gær- R: 68.S.OY 68.S.OY

dextrose Am: rigeligt:d rigeligt:b 5 lysegråt (GY) østershvidt (W)

Sp: intet intet 10 G vækst; R = bagside; AM = luftmycelium; Sp = opløseligt pigment.

Undersøgelser af cellevægge 15 Under anvendelse af hydrolyserede hele celler af A51568.1 kulturer bestemtes tilstedeværelsen af visse diagnostiske sukkerarter ved den kromatografiske metode beskrevet af M.P. Lechevalier, "Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance”, J. Lab. Clin. Med.

20 71, 931-944 (1968).

Hydrolyserede hele celler anvendtes til at bestemme iso-mererne af deaminopimelinsyre således som beskrevet af Becker et al., Appl. Microbiol. 11, 421-423 (1964).

25

Disse resultater er angivet nedenfor:

Forsøg Resultater 30 Diagnostiske sukkerarter Calactose, Arabinose,

Isomere af 2,6- Ribose Meso-isomer diaminopimelinsyre

Disse resultater viser et type A hel-cellet sukkermønster 35 og en type IV-cellevæg, hvilken kombination af hovedcellens vægbestanddele tyder på slægten Nocardia. Se M.P. Lechevalier, supra.

16 uiv ιο/bbs b i

Under anvendelse af tyndtlagskromatografi af hel-cellede methanolysater som beskrevet af D. E. Minnikin et al., "Differentiation of Mycobacterium, Nocardia, and Related Taxa by Thin-layer Chromatographic analysis of Whole-5 organism Methanolysates", J. Gen. Microbiol. 88. 200-204 (1975), kunne der ikke observeres nogen mycolsyrernethyl-estere.

Udover de ovennævnte bestemmelser undersøgtes og sammen-10 lignedes kulturen A51568.1 med publicerede resultater vedrørende 21 N. oriental!s referencestammer, og der blev foretaget samtidige sammenligninger med NRRL 2451, NRRL 2452 og ATCC 19795.

15 Sammenligningen af dyrkningsegenskaberne, de morfologiske egenskaber og de fysiologiske egenskaber er angivet i tabel 5 nedenfor.

20 25 30 35 DK 167688 B1

CO

•H

H

(0

P

φ > Q O O

-Η I++H+ I+2 + + +I+22 ++ + p P (D O g

g J

(0 2 •p

CO

d) o c Q) p m O) σι m cs d) cn ^ H |++H+ I+ + + + +I+ + + + + + + CO U •H O Η E*< co <

•P

c 0) ri p o

<N

• m 2 ^ tø ^ I++H+ I+ + + + + + + + + + + + +

O J

K

r-l Oh • 2

CO

lO

in in h in

iJ <C

IS W H

h ffl m in < (0 ''tf ^ μ ^ i++h+ I+++++++++ ++++

0) PI X! K (0 K A! 2 CO

c 0)

D

(1)

CD

X H

CO

ri CO

O in i++h+ I+ + + + + + + + + + + + +

H rH

o m •H < to >1 m m cd

Di 5 3 c *h d a Λ » c +3 ip -p g a> tø ip ccodD c ro -p co •H (d β c (0 -η -μ -H q r—j φ -P ·Ρ K CO CO ,d -H H 3 E c) c X 0) C C 0) O O C -P D C 3ftg>

§ 5 a OfflOI<D.H-WdCdD)<HOa3-H

S -P T3 >1 ·ΗΌ(02>(>ιΡΐ0·Η>ιΰΐ0Μ·ΓΗ^·Ρ g rø Q) 4J +Jt0OQ£-P3XhH-W 0)x:t0C0 ® Ή xl il CO -ri ® ^ ®

U) p -P Cl) 0) D P CO +} g > W

Φ comcoffitDO C C p >< •P (0 >1 <0 > Ή O. S Ti .2 n

X ipXJr-HCDOg ε ti β P

CO 0) -P CO Η -H O 0> g P

μ μΐΗ4ΐΓ(Οϋ JO H |0 -d

CO >i D (0 0) O CD

tf CO J«UOP føOOK

Ulv Ib/obo B l

CO

H

(0

+J

C !* O

<D QQQQQDQQ 1 ^ •Η 2+22Z ZZZZ + S + + + I + + + +

μ O

O i—i • z w σι ts σι o ι-H ·ς}ΐ 1+0 + + I+ + + +I + + +I++ + +

UH SO

U H

E-i <

CS

in o CS >* r)i 1 + CO 1 + 1 + 1 + + I + + + I + + + + J S m

Οί H

K

μ z (d co μ 5-1 o μ

oo H

h in in o

iJ CS |X

Cd I+C0I+ I + I + + I + + + I + + + + CQ J S in C Οί h

Eh Di

Z

rH

• CO o ID s ^ in 1+001+ 1 + 1+ +1 + + +I++ + +

H !x O

in O }-i h < 0) ε

-H

μ Ό 00

C O

D)-H H O

β α acc η μ= μ •H CO Η -Η -Η μ (d O 0) μ & o ohc ΗΟομμμ 0)0 μ μ ιο ε o η ·η χ οηη co β id ø <ο μ j* <#> ιο ο μ >ι -η ·η α co οι c o to β μ μ μμκίΛοε -η 'ΌΌ^-η μπ μ ^ <0 α) α) α) μ μ ·η ο ο ·η n μ φφιοε^οιιχιιφ χ ε ό ο ·η α) ο co > c μ æ i3 > μ μ ϋμΰμ μ η οΐΌ ββ > id ex ο ø η μ <0 ε ø σ co β co :χ μ τΐ φ in ΐ) ολη β & μ co Ηΐυο^Όβ-Ηβΐιι co Οιΐ 5η)(ο α) ,Μμωμ.Μο·Θ·.Ω·θ· •η ·η α) μ id co >ΕΐομΗ33μεμε® μ ό oh μμβ μμ·Ηΐΐ)ύ)μ(οθιΐοο(θΛΐ α) ή ο ο (do) co ο μ > > <ο 6μ οκο μ οπμμΛμ μμτ3οα)μ<0ββ3Η α: β ο ι η ara o m ο φη φ ιο μ ο μ c id ιΰμπ ti ιο-Η μμ-πμμοιωιΟΛΛΛιΰ μ η μυμ ο ίο οοποΦεαομμμο <5 0) Ο Λ ·ΗΛ Φ ΟιΟι>ιΟ.> Φ ο Id ο k

Μ SSZZfco; COMOCOOE^E-iDI+OPhO

DK 167688 B1 03

•ri i—I

(O

P

c

0) Q

•rl Z

P

o tf

LO

σ'

CN

cn

rH

+

O

u

&H

< 03 in 03 +

tJ

g tf P z

(0 03 P P O

O' rp h in in PJ 03 ω + n d < tf B tf 2 t—l «

CO

lO

in + i-i in < Ή

S

3

E

•r| -P

•P -P 03 Q, 10 &

OP 03 •P -P P

(0 CO 03 0) X X Λ Ό

P ft! 3 G

•P > 03 3 03 •rl > Q) 0) P -H g *

<V P E X

p 03 (0 -H

.* -p CO

(0 0) Il

P 0)P

(0 0) 0) P

tf > Ό 2

LJIV I U / UOO D I

20

Yderligere sammenlignes syreproduktionen fra kulhydrater for kulturer med A.51568.1, NRRL 2451, NRRL 2452 og ATCC 19795 med publicerede resultater for 21 N. orientalis referencestammer. Resultaterne er angivet i tabel 6 neden-5 for.

10 15 20 25 30 35 TABEL 6 21 DK 167688 B1

Syreproduktion fra kulhydrater med kulturer af A51568, 5 NRRL 2451, NRRL 2452, ATCC 19795 og N. orientalis referencestamme NRRL NRRL ATCC N.orien-

Egenskaber_A51568.1 2451 2452 19795 talis

Adonitol - + + + + 10 1 (+) Arabinose + + + + +

Cellobiose + + + + +

Cellulose - ND

Dulcitol - ND

i-Erythritol + + + + +

15 Fructose + + + + ND

d(+) Galactose + + + + ND

Glucose + + + + +

Glycerol + + + + + i-Inositol + + + + +

20 Inulin + + + + ND

d(+) Lactose + + + + + d(+) Maltose + + + + + d(-) Mannitol + + + + + d(+) Mannose + + + + + 25 d( + ) Melezitose + + + d(+) Melibiose - - α-Me-D-Glucosid + + + + + d(+) Raffinosel - - 1(+) Rhamnose - +

30 Salicin + + + + ND

d(-) Sorbitol - -

Saccharose + + + + ND

d(+) Trehalose + + + + + d(+) Xylose + + + + + 35 Kontrol - - ND = ikke undersøgt 22

UIV I O / OOo D I

Under anvendelse af dyrkningsmæssige, morfologiske og fysiologiske egenskaber foretoges sammenligninger af egenskaber for A51568.1 med publicerede beskrivelser af 14 egenskaber af nocardia som angivet af R.E. Gordon et al., 5 "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia:N. carnea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis, and N. aeroco-lonigenes", J. Gen. Microbiol. 109, 69-78 (1978); og af S. J. Mishra et al., "Identification of Nocardia and Streptomycetes of Medical Importance", J. Clin. Microbi-10 ol. 11(6), 728-736 (1980). Herudover foretoges samtidig laboratoriesammenligninger mellem kulturen A51568.1 og kulturerne NRRL 2451, NRRL 2452 og ATCC 19795.

Lighedskoefficienter beregnet ud fra ligningen 15 S = [Ns+ 0 Ns"]/[Ns+ + Ns" + Nd] x 100 hvor

Ns+ = antal positive ligheder Ns = antal negative ligheder 20 Nd = antal forskelle se: W.A. Kurylowicz et al., "Numerical Taxonomy of Streptomycetes", Polish Medical Publishers, Warsaw 81975).

De anvendte egenskaber til at beregne lighedskoefficien-25 ter var hovedsageligt fysiologiske egenskaber. Sammenligninger foretoges ved at måle alle de andre stammer i forhold til kulturen A51568.1. Således bedømtes A51568.1 sammenlignet med sig selv som 100. De opnåede sammenligninger angivet i tabel 7 nedenfor.

30 35 23 TABEL 7 DK 167688 B1

Lighedskoefficienter mellem kulturen A51568.1 og forskellige Nocardia referencestammer 5

Kultur Koefficient A51568.1 100 NRRL 2451 95 10 NRRL 2452 95 ATCC 19795 86 N. orientalis (blanding af 21 stammer) 89 N. aerocolonigenes 76 15 N. hirsuta 68 N. autotrophia 65 N. dassonvillei 63 N. madurea 63 N. brasiliensis 61 20 N. caviae 61 N. transvalensis 57 N. amarae 53 N. vaccinii 50 N. asteroides 47 25 N. carnea 47 N. pelletieri 39

En sammenligning af ligheder og forskelle mellem kulturen A51568.1 og N. orientalis ATCC 19795 er angivet i tabel 8 30 nedenfor.

35 TABEL 8 24

LiIV ΙΟ/Οΰΰ bl

Ligheder og forskelle imellem kultur A51568♦1 og kultur ATCC 19795 5

Ligheder_Forskelle_

Syrer fra kulhydrater Dyrkningsmæssige egen skaber på visse substrater: 10 Lufthyfer luftmyceliefarve

Katalaseproduktion farve på bagsiden

Cellevægstype IV opløseligt pigmentering

Tilstedeværende conidier Dekomponering af xanthin

Dyrkningsmæssige 15 egenskaber NaCl tolerance

Dekomponering af: Nitrat reduktion casein Resistens overfor nove- DNA biocin hypoxanthin 20 tyrosin

Fragmentering af mycelium Flydning af gelatine Hydrolyse af: esculin 25 hippurat skummetmælk stivelse

Ikke evne til dekomponering af adenin Melanoide pigmenter findes ikke 30 Morfologi

Phosphataseproduktion Resistens overfor: lysozym penicillin 35 rifampin Følsomhed overfor bacitracin Sporform TABEL 8 DK 167688 B1 25

Ligheder og forskelle imellem kultur A51568.1 og kultur ATCC 19795 5

Ligheder______Forskelle_

Sporeoverflade ornamentering Farvningsreaktion Sukkermønster af hydrolysat af 10 hele celler af type A

Overlevelse ved 50 "C i 8 timer Temperaturområde (10-40 °C)

Ureaseproduktion

Anvendelse af organiske forbindelser 15 Vegetabilsk vækst i CSM substrat.

Kulturen A51568.1 er deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten og udgør en del af kultursamlingen i Northern Regional Research Center, U.S. Department of 20 Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, hvorfra kulturen er tilgængelig for offentligheden under nummeret NRRL 15232.

Omfattet af den foreliggende opfindelse er også de farma-25 ceutisk acceptable, ikke-toxiske salte af antibiotika A51568 faktor A og B. "Farmaceutisk acceptable" salte er salt, i hvilke forbindelsens toxiditet i al almindelighed overfor varmblodede dyr ikke forøges i forhold til ikke-saltformen. Eksempler på passende salte af antibiotika 30 A51568 faktor A og B omfatter syreadditionssaltene dannet ved standardomsætning med både organiske og uorganiske syrer som f.eks. svovlsyre, phosphorsyre, saltsyre, eddikesyre, ravsyre, citronsyre, mælkesyre, maleinsyre og fu-marsyre samt de salte, der dannes af carboxylgruppen med 35 stærke baser som f.eks. natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriumcarbonat, kaliumcarbonat, ammoniumhydroxid, di-ethanolamin og lignende baser.

DK 167688 B1 26

Endvidere angår opfindelsen farmaceutiske præparater indeholdende de omhandlede antibiotika samt disse antibiotika til brug som antibiotiske midler.

5 Virkningen af antibiotikum A51568 faktor A overfor en række bakterier bestemt ved agarfortyndingsmetoden er angivet i tabel 9, hvori den minimale hæmmende koncentration (MIC) er angivet.

10 TABEL 9

Virkning af A51568 faktor A overfor forskellige bakterier

Bakterier 15

Staphylococcus aureus MIC (tig/ml) 3055* 0,5 X400 1 20 V138 1 V140 1 V102 1

Staphylococcus epidermidis MIC (ug/ml) 25 222 1 270 2 285 2 219 1 30 269 2

Streptococcus pyogenes MIC (ug/ml) C203 0,5 35 ATCC 10389 0,5 DK 167688 B1 27

Streptococcus sp. gruppe B MIC (ug/ml) 5 4 14 0,5 5

Streptococcus sp. gruppe D MIC (ag/ml) X56 1 9960 4 10 2041 2 8043 1 9901 2

Streptococcus sp. gruppe D MIC (ug/ml) 15 12253F 1

Mxl61 1 2058 4 20 Streptococcus pneumoniae MIC ( μρ/πιΐ)

Park I 0,125

Bl-438 0,5 25 Haemophilus parainfluenzae MIC (ug/ml) 7901 64 9796 64 30 35 DK 167688 B1 28

Haemophilus influenzae MIC (ug/ml) C.L. 32

Mx366 32 5 Mx371 64 76 64

Bond 64 16836 128 4842 32 10 312 128 * Navnet eller nummeret under hver organisme identificerer stammen af den ved forsøget anvendte organisme.

15 In vitro virkningerne af antibiotika A51568 faktor A og B over for en række aerobe bakterier bestemtes under anvendelse af standard agarfortyndingsmetoden. Resultaterne, der bestemtes ved aflæsning af slutpunktet efter 24 timer, er angivet i tabel 10.

20 25 30 35 DK 167688 Bl 29 TABEL 10

Virkning af A51568 faktor A og B overfor aerobe bakterier 5 Forsøgsorganisme MIC (ug/ml)

A B

Staphylococcus aureus 3055 (Xl.l) 1 2

Staphylococcus aureus V41 12 10 Staphylococcus aureus X400 2 2

Staphylococcus aureus S13E 1 2

Staphylococcus epidermidis EPI1 2 2

Staphylococcus epidermidis EPI2 1

Staphylococcus epidermidis 222 - 2 15 Streptococcus pyogenes C203 1 0,5

Streptococcus pneumoniae Park I 0,5 0,6

Streptococcus sp. Gruppe D X66 1 1

Streptococcus sp. Gruppe D 9960 4

Streptococcus sp. Gruppe D 2041 - 2 20 Haemophilus influenzae (følsom) Holt 64

Haemophilus influenzae (resistent) R 252 128

Haemophilus influenzae 25 (følsom) C.L. - 128

Haemophilus influenzae (resistent) 76 - 64

Escherichia coli N10 >128 >128

Escherichia coli EC14 >128 >128 30 Escherichia coli TEM 128 >128

Klebsiella pneumoniae X26 >128 >128

Klebsiella pneumoniae KAE >128 >128

Klebsiella pneumoniae X6B - >128 35 Antibiotika A51568 faktor A og B er undersøgt og har vist sig aktive over en række anaerobe bakterier, som er angivet i tabel 11, hvori MIC værdierne er bestemt ved agar- TABEL 10 DK 167688 B1 30 fortyndingsmetoden.

5 Virkning af A51568 faktor A og B overfor anaerobe bakterier

Forsøgsorganisme MIC (μg/ml)

A B

10

Clostridium difficile 2994 2 1

Clostridium perfringens 81 11

Clostridium septicum 1128 1 1

Eubacterium aerofaciens 1235 2 1 15 Peptococcus asaccharolyticus 1302 16 1

Peptococcus prevoti 1281 32 4

Peptostreptococcus anaerobius 1428 1 2

Peptostreptococcus intermedius 1264 1 1

Propionibacterium acnes 79 12 20 Bacteroides fragilis 111 32 32

Bacteroides fragilis 1877 32 16

Bacteroides fragilis 1936B 32 32

Bacteroides thetaiotaomicron 1438 32 32

Bacteroides melaninogenicus 1856/28 >128 >128 25 Bacteroides melaninogenicus 2736 15 >128

Bacteroides vulgatis 1211 32 4

Bacteroides corrodens 1874 32 32

Fusobacterium symbiosum 1470 2 32

Fusobacterium necrophorum 6054A 2 128 30

Antibiotikum A51568 faktor A er også virksomt overfor en række stammer af Clostridium difficile bestemt ved agarfortyndingsmetoden. Resultaterne af forsøget er angivet i tabel 12.

35 TABEL 12 DK 167688 B1 31

Virkning af antibiotikum A51568 faktor A overfor Clostridium difficile stammer 5

Clostridium difficile MIC (uq/ml) 8484 2 6890 2 10 2634 2 78 2 A-194 2 A-195 2 A-196 2 15 A-279 2 A-280 2 A-281 2 WAL-2112 2 WAL-3657 2 20 WAL-4268 2 107B 2 111F 2 1153 2 3424-5B 2 25 3816 2 3950D 2

De omhandlede A51568 faktor A og B har udvist in vivo an-timikrobiel virkning overfor eksperimentelle bakteriein-30 fektioner. Dersom to doser af forsøgsforbindelsen administreres subcutant til mus i forsøgsinfektioner, måles virkningen som en ED^-q (effektiv dosis i mg/kg til 50% beskyttelse af forsøgsdyrene: se Warren Wick et al., J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961)). ED^Q-værdierne for anti-35 biotika A51568 faktor A og B er følgende (i enheder på mg/kg x 2): DK 167688 Bl 32

A_B

Staph, aureus 3055 1,79 2,5

Strep, pyogenes C203 3,03 7,94 5 Strep, pneumoniae Park I 2,71 2,5

Ved behandlingen af infektioner hos mennesker administreres antibiotikummet parenteralt, f.eks. ved intramuskulær injektion eller intravenøs infusion. Til injektionsformål 10 fortyndes antibiotikummet eller et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel til den ønskede koncentration og administreres. Velegnede fortyndingsmidler omfatter f.eks. vand til injektions formål, 0,9% saltvand, 5% dextrose, Ringers opløsning eller andre almindeligvis an-15 vendte fortyndingsmidler. Til administrering ved intravenøs infusion kan antibiotikummet eller saltet heraf fremstilles i en fysiologisk acceptabelt væske eller et fortyndet næringsmiddel til en passende koncentration, f.eks. til en koncentration mellem ca. 5% og ca. 10%, og 20 langsomt tilføres med væsken. Alternativt kan administreringen foregå ved hjælp af den såkaldte "piggy-back" metode.

Den antibiotiske forbindelse eller salte heraf kan udfor-25 mes i dosisenheder i hermetisk forseglede prøveglas, sterile, gummitilproppede prøveglas eller i plastposer. Sådanne enheder kan indeholde hjælpestoffer som f.eks. an-tioxidanter, solubiliseringsmidler, dispergeringsmidler, buffere og lignende. Et enhedsdosispræparat omfatter 100 30 mg A51568 faktor A eller B eller et farmaceutisk acceptabelt ikke-toxisk salt heraf i et gummitilproppet (butyl-gummi) prøveglas. Andre enhedsdosispræparater omfatter 250 mg antibiotikum A51568 faktor A eller B eller et salt heraf i sterile forseglede prøveglas. Til intravenøs in-35 fusion omfatter et omhandlet enhedsdosispræparat 5 g antibiotika A51568 faktor A eller B eller et farmaceutisk salt heraf i en plastpose.

DK 167688 Bl 33

Dersom antibiotikum A51568 faktor A eller B anvendes som et antibakterielt middel, kan dette administreres enten peroralt eller parenteralt. For fagmanden vil det være klart, at A51568 faktor A eller B sædvanligvis admini-5 streres sammen med et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel. Doseringen af A51568 faktor A eller B afhænger af en hel række hensyn, f.eks. af arten af infektionen og hvor kraftig den pågældende infektion, der skal behandles, er. For fagmanden vil det være klart, 10 at passende dosisområder og/eller dosisenheder til administreringen skal bestemmes under hensyn til MIC og ED,_q værdierne angivet ovenfor sammen med faktorer som f.eks. hensyn til patienten eller værtsorganismen og de inficerende organismer.

15 A51568 faktor A og B antibiotika kan blandt anvendes til at undertrykke væksten af Staphylococcus, Streptococcus og Propionibacterium aenes organismer, og de antibiotiske forbindelser kan derfor f.eks. anvendes ved behandlingen 20 af aene. A51568 faktor A og B kan i ren tilstand formuleres i farmaceutisk acceptable fortyndingsmidler som f.eks. isopropanol til påførsel på huden. Sådanne opløsninger kan fremstilles med koncentrationer af det anvendte antibiotikum på 1-15% (w/v). Som et alternativ kan de 25 antibiotiske forbindelser indarbejdes i cremer eller lotioner til påførsel på huden.

A51568 faktor A og B kan også anvendes til at undertrykke væksten af Clostridium difficile organismer, der for-30 årsager pseudomembran-colitis i tarmen. A51568 faktor A og B kan derfor anvendes ved behandlingen af pseudomembran-colitis ved peroral administrering af en effektiv dosis af antibiotikummet eller et farmaceutisk acceptabelt, ikke-toxisk salt heraf indarbejdet til en farmaceu-35 tisk acceptabel dosis. Til dette formål kan A51568 faktor A og B administreres i gelatinekapsler eller i væskesuspension.

DK 167688 B1 34

Det meste af den antibiotiske virkning af A51568 faktor A og B findes i dyrkningsvæsken, medens mindre mængder antibiotisk virkning kan findes i forbindelse med myceliet. Den antibiotiske forbindelse skilles lettest fra 5 fermenteringsvæsken ved at fjerne myceliet, dvs. biomassen, ved filtrering. Herefter isoleres den antibiotiske forbindelse fra den filtrerede fermenteringsvæske, fortrinsvis ved søjlekromatografi over et passende adsorbe-ringsmiddel, idet der anvendes et passende elueringsmid-10 del.

Velegnede adsorberingsmidler omfatter carbon, anion- og kationbytterharpikser, polyamid, carboxymethylcellulose, højporøse copolymerer af styren og divinylbenzen som 15 f.eks. "Diaion®" HP-20 "Amberlit®" XAD harpikser og "Duolit®" harpikser som f.eks. hydrophile, uopløselige kromatografiske medier og molekylsier fremstillet ved tværbinding af dextran og også TSK geler. "Diaion®" harpikserne er fremstillet af Mitsubishi Chemical Industri-20 es, A/S, Tokyo, Japan. "Amberlit®" XAD harpikser er fremstillet af Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania. "Duolit®" harpikser er produkter fra Diamond Shamrock, Redwood City, California. "Sephadex®" harpikser er fremstillet af Pharmacia Fine Chemicals A/S, Uppsala, 25 Sverige. "TSK"geler fås fra E. Merck, Darmstadt, Tyskland og fra Bio-Rad, 2200 Wright Ave., Richmond, Californien 94804.

Et antal forskellige substrater kan anvendes med nocardia 30 orientalis NRRL 15232 til fremstilling af A51568 faktor A og B. For at opnå god økonomi ved produktionen, optimale udbytter og simpel isolering af produktet foretrækkes imidlertid visse bestemte dyrkningssubstrater. Disse substrater bør indeholde assimilerbare kilder for carbon, 35 nitrogen og uorganiske salte. Velegnede carbonkilder omfatter kartoffelstivelse, melasse, glucose, saccharose, lactose, maltose og stivelse. Optimale mængder af carbon- DK 167688 B1 35 kilderne er fra ca. 2 til ca. 5 vægt-%.

Foretrukne nitrogenkilder omfatter natriumglutamat, kød-pepton, natriumnitrat, ammoniumnitrat, ammoniumsulfat, 5 sojaskrå og gær.

Livsvigtige sporstoffer for væksten og udviklingen af organismen kan forekomme som urenheder i andre bestanddele i substratet i mængder, der er tilstrækkelige til at til-10 fredsstille organismens vækstkrav og biosyntese. Imidler tid kan det være en fordel i dyrkningssubstratet at indarbejde yderligere opløselige uorganiske næringssalte, der er i stand til at afgive natrium-, kalium-, magnesium-, calcium-, ammonium-, chlorid-, carbonat-, phosphat-, 15 sulfat-, nitrat- og lignende ioner.

Det kan være nødvendigt at tilsætte små mængder (dvs. 0,2 ml/liter) af et antiskumningsmiddel som f.eks. propylen-glycol ved fermentering i industriel målestok, dersom op- 20 skumning bliver et problem.

Skønt små mængder A51568 faktor A og B kan opnås ved dyrkning i rystekolbekulturer, foretrækkes neddykkede aerobe fermenteringsbetingelser i beholdere til fremstil-25 ling af væsentlige mængder af den antibiotiske blanding.

Til tankfermentering foretrækkes det at anvende et vegetativt inoculum. Det vegetative inoculum fremstilles ved at pode en lille mængde dyrkningssubstrat med sporeformen eller myceliedele til opnåelse af en frisk, aktivt vok-30 sende kulturorganisme. Herefter overføres det vegetative inoculum til en større beholder, der efter en passende inkubationstid frembringer den antibiotiske A51568 blanding i optimalt udbytte. En alternativ metode til at tilvejebringe et inoculum for det vegetative substrat består 35 i at anvende en lyophiliseret pellet i stedet for den vandige sporesuspension. Lyophiliserede pellets fremstilles på kendt måde. Fremstillingen af sporesuspensionen 36 DK 167688 B1 ved lyophilisering foregår på samme måde som fremstillingen af en vandig sporesuspension, bortset fra, at sterilt kalvefosterserum anvendes i stedet for sterilt destilleret vand.

5 NRRL 15232 kan dyrkes indenfor et bredt temperaturområde mellem ca. 25 og ca. 37 °C. Optimal produktion af A51568 antibiotika-blandingen forekommer ved en temperatur på ca. 32 til ca. 34 °C.

10

Som det er sædvanligt ved dyrkning af aerobe neddykkede kulturer, dispergeres steril luft gennem dyrkningssubstratet. For at opnå effektiv vækst af organismen er den anvendte mængde luft ved tankproduktion på mellem ca. 0,1 15 og ca. 0,25 rumfang luft pr. rumfang dyrkningssubstrat pr. minut (v/v/m) ved omrøring med mellem ca. 100 og ca.

300 omdrejninger pr. minut. En optimal hastighed i en 165 liter beholder indeholdende 100 liter forgæringssubstrat er ca. 0,15 v/v/m under omrøring med et blad, der roterer 20 med ca. 200 omdrejninger pr. minut.

Den antibiotiske virkning findes sædvanligvis efter ca.

24 timer og forbliver i mindst 168 timer under forgæringen. Den maksimale antibiotiske produktion forekommer ef-25 ter ca. 90-114 timers forgæringstid.

For at forøge produktionen af den antibiotiske blanding kan p-hydroxyphenylglycin sættes til substratet i en -3 mængde på 5 x 10 M. En sådan tilsætning fandtes i et 30 forsøg at forøge produktiviteten med 64%.

Produktiviteten er også påvirket af phosphatmængder. Til- -4 sætning af phosphat i så små mængder som 3 x 10 M (0,05 mg/ml) viste sig i et forsøg at sænke udbyttet med 20%.

Den antibiotiske virkning findes i den supernatante del.

For at udtage en prøve centrifugeredes en prøve af hele 35 DK 167688 Bl 37 væsken i ca. 15 minutter ved 1000 x g, og den centrifugerede del fjernedes for at blive undersøgt. Undersøgelsen blev foretaget mikrobiologisk ved hjælp af et agarhulpla-deforsøg, der anvender Micrococcus luteus ATCC 9341.

5

Produktionen af den antibiotiske A51568 blanding kan kontrolleres under forgæringen, enten ved agardiffusion under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 eller ved en tubidimetrisk metode under anvendelse af Staphylococ-10 cus aureus ATCC 9114.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

15 EKSEMPEL 1

Fremstilling af et førstetrins inoculum Følgende substrat fremstilledes til anvendelse som agar-20 skråkultur af Nocardia orientalis NRRL 15232: 25 30 35 38 DK 167688 B1

Bestanddele Mængde (g/1)

For-kogt havremel 60,0 Gær 2,5 5 K2HP04 1,0

Czapek's mineral bouillon 5,0 ml/1

Agar 25,0

Demineraliseret vand q.s til 1,0 liter 10 Czapek's mineralblanding fremstilledes ud fra følgende bestanddele:

Bestanddele Mængde (g/100 ml) 15 KC1 10,0

MgS04.7H20 10,0

FeS04.7H20 0,2

Afioniseret vand q.s til 100 ml 20 For-sterilisering pH = 6,2. pH indstilles til 7,3 med en vandig natriumhydroxidopløsning. Efter-sterilisering pH = 6,7.

Sporer af Nocardia orientalis NRRL 15232 udsåedes på en 25 agarskråkultur fremstillet af ovennævnte bestanddele, og den således tilsåede skråagar inkuberedes 7 dage ved ca.

30 °C. Den modne agarskråkultur dækkedes herefter med sterilt destilleret vand og blev skrabet med et sterilt værktøj for at løsne sporerne og myceliet. En milliliter 30 af den fremkomne sporesuspension anvendtes til at tilså 50 ml vegetativt substrat med følgende sammensætning: 35 DK 167688 B1 39

Bestanddele Mængde (q/ΐϊ

Kartoffelstivelse 30,0

Melasse 20,0 5 Bacto-pepton (Difco Laboratories) 7,0 L-Tyrosin 1,0

Afioniseret vand q.s til 1,0 liter 10 Blandingen havde pH 5,5, der indstilledes til pH 7,0 med vandig natriumhydroxidopløsning inden steriliseringen. Eftersterilisering pH = 6,1.

Det vegetative inoculum inkuberedes i en 250 ml bredhal-15 set Erlenmeyerkolbe ved ca. 30 °C i ca. 48 timer på et rystebord, der roterede med et udsving på ca. 5 cm i diameter ved 250 omdrejninger pr. minut. Det inkuberede substrat anvendes enten til at tilså små forgæringsbeholdere (idet podestoffet udgør 0,8% af substratrumfanget) eller 20 til at tilså andet trins kolber til fremstilling af en større mængde mycelium.

Fermentering af A51568.1 25 100 liter produktionssubstrat tilsåedes med 0,8% (800 ml) af det ovennævnte inkuberede vegetative substrat. Produktionssubstratet havde følgende sammensætning:

Bestanddele Mængde (g/1) 30

Polypropylenglycol (2000) 0,2

Kartoffelstivelse 30,0

Melasse 20,0

Bacto-pepton 35 (Difco Laboratories) 7,0 L-Tyrosin 1,0

Demineraliseret vand g.s til 100 liter DK 167688 B1 40

Substratet havde en pH-værdi på 5,2, der indstilledes til 7,1 med vandig 5N natriumhydroxid. Substratet sterilise- o redes ved 121 °C ved 1,2-1,3 kg/cm i 45 minutter. Efter sterilisering havde substratet en pH-værdi på 6,2.

5

Det podede produktionssubstrat forgærede i en 165 liter forgæringsbeholder i ca. 114 timer ved en temperatur på 30 °C. Forgæringssubstratet gennemluftedes med steril luft i en hastighed på 0,15 v/v/m og omrørtes med almin-10 delig omrøring med ca. 200 omdrejninger pr. minut.

Den antibiotiske virkning forefindes i den supernatante del af forgæringsblandingen. Tilstedeværelse af antibiotisk aktivitet undersøgtes ved at centrifugere en prøve 15 af hele væskemængden ved 1000 x g og derefter afdekantere for at undersøge. Prøven fortyndes med pH 6,0 phosphat-puffer og undersøges mikrobiologisk i et agarhulpladefor-søg under anvendelse af forsøgsorganismen Micrococcus lu-teus ATCC 9341.

20 EKSEMPEL 2

Isolering af den antibiotiske A51568 blanding 25 Til tre liter antibiotisk A51568 hel fermenteringsvæske indeholdende faktor A og B i et forhold på ca. 95 til 5 sattes en filterhjælp ("Hyflo Supercel®"; en diatoméjord,

Johns-ManviIle Corporation), og blandingen filtreredes. Filtratet, der udgjorde 2,7 liter, og som havde en pH-30 værdi på 7,8, hældtes på "Diaion®" HP-20 harpiks (en høj-porøs, styrendivinylbenzencopolymer i perleform, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd. Tokyo, Japan) anbragt i en 3 x 25 cm kromatografisk søjle. Gennemstrømningsvæsken blev borthældt, og kolonnen vaskedes med 1 liter vand og 35 500 ml 25% methanol i vand. Den antibiotiske A51568 blan ding elueredes fra søjlen med to 500 ml portioner 50% methanol i vand. Faktor A og B absorberes på HP-20 på samme DK 167688 B1 41 måde og elueres derfra under samme betingelser. Derfor opnås ingen adskillelse af de to faktorer. De eluerede fraktioner undersøgtes for antibiotisk virkning under anvendelse af B. subtilis. De mere aktive fraktioner kon-5 centreredes til et ringe rumfang og lyophiliseredes. Den rå antibiotiske A51568 blanding vejede 895 mg og indeholdt faktor A og B i et forhold på ca. 95 til 5.

EKSEMPEL 3 10

Rensning af den antibiotiske A51568 blanding

Den rå antibiotiske A51568 blanding fra eksempel 2 ovenfor (905 mg) opløstes i 50 ml vand og påførtes "Sepha-15 dex®" (NH^+ cyclus) (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) anbragt i en 1,7 x 44 cm kromatografisk søjle. Den gennemstrømmende væske blev borthældt, og søjlen vaskedes med 250 ml vand. Herefter elueredes søjlen med en konveks gradient af ammoniumbicarbonat 20 NH^HCOg; 100 ml blandekammer). Halvtreds 25 ml fraktioner opsamledes og undersøgtes for antibiotisk virkning, idet der anvendtes en B. subtilis prøve.

De aktive fraktioner, dvs. de, der havde antibiotisk 25 virkning, blev slået sammen. Fordi faktor A og B adsor-beres og elueres forskelligt fra hinanden, dersom "Sepha-dex®" CM-25 anvendes, var de fraktioner, der var rige på faktor A, ikke de samme som de, der var rige på faktor B.

Fordi mængden af tilstedeværende faktor B i blandingen 30 var ringe i forhold til mængden af faktor A, udviste fraktionerne rige på faktor B en forholdsvis lav antibiotisk virkning i forhold til de, der var rige på faktor A.

De sammenslåede fraktioner indeholdt forholdsvis ringe mængde faktor B. For at afsalte produktet påhældtes de 35 sammenslåede fraktioner en 1,7 x 10 cm kromatografisk søjle af "Diaion®" HP-20 harpiks forud ekvilibreret i vand, og søjlen vaskedes med 200 ml vand og elueredes med DK 167688 Bl 42 100 ml 50% methanol i vand. Methanoleluatet inddampedes til tørhed. Remanensen opløstes i en ringe mængde vand og syrnedes med 0,1N vandig saltsyre. Herefter lyophilisere-des den syrnede blanding. Der opnåedes 25 mg renset anti-5 biotisk A51568 faktor A.

For at isolere faktor B anvendtes fremgangsmåden fra eksempel 3, idet der anvendtes et HPLC forsøg i stedet for forsøget, der anvendte B. subtilis. Dette er nødven-10 digt, fordi sidstnævnte forsøg ikke skelner mellem faktor A og B. Under anvendelse af HPLC metoden kan fraktioner rige på faktor A og B adskilles, identificeres og slås sammen hver for sig. De adskilte samlede mængder afsaltes som i det sidste trin fra eksempel 3 for at give et pro-15 dukt, der er rigt på faktor A, og et andet produkt, der er rigt på faktor B.

EKSEMPEL 4

20 Isolering, rensning og adskillelse af A51568 faktor A og B

For at skille A51568 blandingen af faktor A og B fra den hele A51568 væske, filtreredes hele væsken gennem "Hyflo 25 Supercel®". Efter indstilling af filtratet til pH 6,0-6,5 med 5N HC1, tilsattes "Ionac®" X-236 harpiks (H+) (4 liter harpiks pr. 100 liter filtrat), og blandingen omrør-tes for at muliggøre adsorption af den antibiotiske aktivitet. Den supernatante del bortkastedes, og harpiksen 30 vaskedes med vand (10 harpiksvolumener). Efter bortkastning af vaskeopløsningen anbragtes X-236 harpiksen i en søjle, der elueredes med 0,1N ammoniumchlorid (5 søjlerumfang ). 4 liter fraktioner neutraliseredes umiddelbart herefter med 5N HC1. Den antibiotiske aktivitet kontrol-35 leredes ved hjælp af S. aureus og med HPLC. De fraktioner, der indeholdt A51568 faktor A og B blev slået sammen og påhældt en søjle af "Diaion®" HP-20 harpiks for at af- 43 DK 167688 B1 salte blandingen.

Det gennemløbende materialet borthældtes. Herefter elue-redes harpiksen med 5% 2-propanol indeholdende 0,1% 5 H^PO^. Fraktioner på 500 ml opsamledes og kontrolleredes for antibiotisk virkning. De aktive fraktioner blev slået sammen, koncentreret og lyophiliseret. Det fremkomne urene materiale indeholdt ca. 95% A51568 faktor A 5% A51568 faktor B.

10

For yderligere at rense produktet og samtidig adskille faktor A og B opløstes den urene blanding af faktor A og B i vand og påførtes en søjle af CM-"Sephadex®" C-25. Søjlen elueredes med en lineær gradient fra vand til 15 0,25N NH^HCOg. Fraktionerne kontrolleredes ved hjælp af HPLC og de, der indeholdt faktor A, blev slået sammen for sig adskilt fra de, der indeholdt faktor B.

For at fjerne saltet tilsat i det foregående trin påfør-20 tes hver samlet mængde en søjle af "Diaion®" HP-20 harpiks, der elueredes med 5% 2-propanol indeholdende 0,1% HgPO^. Passende fraktioner for hver søjle bedømt på basis af HPLC forsøg blev slået sammen. De to sammenslåede mængder koncentreredes og lyophiliseredes, hvorved der 25 opnåedes henholdsvis i det væsentlige ren A51568 faktor A og i det væsentlige ren A51568 faktor B.

30 35

Claims

1. Antibiotisk forbindelse med formlen: 5 g Iucose-va ncosam i n /a1.a Λ ho/\A. \/S \A i „ f · V* </®\ ° i ol / \H 11 / \ H 11 /\ A o C TI 0 C TIP \ X \y V H \y i—MHa HOOC-o i \ \ / \ X /\ /\ f I CTTJHs CHs XCH3 20. i—\/* 9 § 'i H(/\/X0H OH (I) hvori n er 1 eller 2, benævnt henholdsvis A51568 faktor A 25 og A51568 faktor B, eller et farmaceutisk acceptabelt salt heraf. 1 Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotikum eller et antibiotisk blanding som defineret i krav 1, 30 kendetegnet ved, at man dyrker Nocardia orien-talis NRRL 15232 eller en A51568-producerende mutant heraf i et dyrkningssubstrat indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte under neddykkede aerobe fermenteringsbetingelser, indtil der er 35 produceret en væsentlig mængde antibiotisk aktivitet, og at man herefter om ønsket isolerer den dannede forbindelse I. 45 DK 167688 B1

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den omfatter et trin til isolering af A51568 faktor A antibiotikum fra dyrkningssubstratet.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den omfatter et trin til isolering af A51568 faktor B antibiotikum fra dyrkningssubstratet.

5. Nocardia orientalis NRRL 15232. 10

6. Farmaceutisk præparat til brug ved behandling af bakterieinfektioner hos pattedyr, kendetegnet ved, at det som hovedaktiv bestanddel omfatter en antibiotisk forbindelse med formlen I ifølge krav 1 eller et 15 farmaceutisk acceptabelt salt heraf sammen med én eller flere farmaceutisk acceptable hjælpestoffer eller bærestoffer herfor.

7. Antibiotikum med formlen I ifølge krav 1 til anvendel-20 se som et antibiotisk middel. 25 30 35