JP2634174B2

JP2634174B2 - グリコペプチド抗生物質

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Publication number: JP2634174B2
Application number: JP62236048A
Authority: JP
Inventors: ロバート．エル．ハミル; ジェイムス．アルバート．マベ; デビッド．フランシス．マホニー; ウォルター．ミツオ．ナカツカサ; レイモンド・チー―フォン・ヤオ
Original assignee: IIRAI RIRII ANDO CO
Current assignee: IIRAI RIRII ANDO CO
Priority date: 1986-09-19
Filing date: 1987-09-18
Publication date: 1997-07-23
Anticipated expiration: 2012-07-23
Also published as: DE3782720D1; AU608534B2; JPH09182581A; HK44393A; GR3006311T3; EP0265071A1; FI90993B; KR960013093B1; FI874082A; IE872529L; PT85742A; DK489787A; NZ221856A; CN87106483A; ZA877003B; IE60132B1; DK489787D0; JP2806912B2; HUT46365A; MX168708B

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はバンコマイシン群の新規グリコペプチド抗生
物質に関する。特に本発明は抗生物質A82846、その各個
の成分A82846A、A82846BおよびA82846C、並びに新規微
生物菌株の培養による上記抗生物質の製造に関する。

従来技術現在多くの有益な抗生物質を入手することができる
が、人間の医薬用の改良された抗生物質を見いだすこと
の必要性はなお続いている。たとえばバンコマイシンは
商業的に成功した抗生物質であつて多くの生命を救つ
た。しかしバンコマイシンは、たとえば聴覚毒性および
腎毒性のような問題の原因となることもある。従つて、
バンコマイシンと同様の活性を有し、改善された薬物動
態学的性質、またはより副作用が少ない抗生物質が要請
されている。

発明の構成と効果本発明によれば、同化しうる炭素源、窒素源および無
機塩源を含む培地中、ノカルジア・オリエンタリス（No
cardia orientalis）NRRL18098、NRRL18099またはNRRL1
8100を液中好気的に発酵させることにより、大なる価値
を有するグリコペプチド抗生物質を製造することができ
ることが見いだされた。本発明者らはこれらのグリコペ
プチド抗生物質を任意にA82846およびその各成分として
命名した。

抗生物質A82846は構造的にバンコマイシンに類似する
が、グラム陽性菌に対する試験管内および生体内活性、
並びにバンコマイシンの半減期より非常に長い半減期に
起因する薬物動態学的性質が改良されたものである。

A82846成分は本質的に次の物理的および分光学的性質
を有する。

A82846Aの特性：− 分子量:1556 実験式：C₇₃H₈₉N₁₀O₂₆Cl FAB−MS（チオグリセロール）：（Ｍ＋１）測定値1557.
5803、計算値C₇₃H₉₀N₁₀O₂₆Cl＝1557.5716（図４参照） UV（水）λ_max:281nm（ε5,052）、基線から300nmシフ
ト IR（KBr）:1716、1655、1611、1586、1552、1504、141
0、1340、1310、1230、1212、1132、1066、1028、1015c
m^-1（図１参照） NMR〔（CD₃)₂SO〕：図７参照 pKa（水）:4.7、9.5、および（66％DMF）5.5、6.8、7.
9、9.4、12.3 （見掛けの分子量1542） A82846Bの特性：− 分子量:1590 実験式：C₇₃H₈₈N₁₀O₂₆Cl₂ FAB−MS（チオグリセロール）：（Ｍ＋１）測定値1591.
5315、計算値C₇₃H₈₉N₁₀O₂₆Cl₂＝1591.5327（図５参照） UV（水）λ_max:280nm（ε5,192）、基線から300nmシフ
ト IR（KBr）:1656、1586、1562、1504、1403、1264、123
0、1135、1105、1065、1023、1018cm^-1（図２参照） NMR〔（CD₃)₂SO〕：図８参照 pKa（水）:4.65、9.5 A82846Cの特性：− 分子量:1522 実験式：C₇₃H₉₀N₁₀O₂₆ FAB−MS（チオグリセロール）：（M⁺Na）測定値1545.59
98 計算値C₇₃H₉₀N₁₀O₂₆Na＝1545.5925（図６参照） UV（水）λ_max:280nm（ε5,198）、基線から300nmシフ
ト IR（KBr）:3600→3004（広い）、2999、2991、2950、16
87→1650（広い）、1585、1570、1509、1503、1453、14
49、1402、1212、1130、1102、1060、1032、1014cm
^-1（図３参照） NMR〔（CD₃)₂SO〕：図９参照 pKa（水）:4.6、9.4 6N塩酸による加水分解後のA82846A、A82846BおよびA8
2846Cのアミノ酸分析の結果は、アスパラギン酸ならび
に微量のグリシンに符号する２個の広いピークの存在を
示した。この２個のピークはアクチノイジン性（actino
idinic）およびバンコマイシン性（vancomycinic）アミ
ノ酸（この２個は、バンコマイシン類のグリコペプチド
類中に存在する）に対応するものと考えられる。

相対NMR研究により、A82846A、A82846BおよびA82846C
がそれぞれ次の新規アミノ糖４−epi−バンコサミン
（３−メチル−アコサミン）を含むことが見いだされ
た： A82846Aの分子式はバンコマイシンの分子式（C₆₆H₇₅N
₉O₂₄Cl₂）の塩素原子が１個少なく、追加的にバンコサ
ミン型アミノ糖（C₇H₁₄NO₂）要素が多い分子式に対応す
る。

A82846Bの分子式は、水素原子１個が塩素原子１個で
置換されたA82846Aの分子式に対応する。

A82846Cの分子式は、塩素原子が水素で置換されたA82
846Aの分子式に対応する。

A82846成分は、一般的組成のバンコマイシン分子に似
ているが、主として塩素含量が異なり、追加的にバンコ
サミン組成を有する部分単位１個が存在することで異な
る新規グリコペプチド類の構造を有するものと考えられ
る。

A82846成分は次の構造式を有すると考えられる： A82846化合物の糖成分の完全配置はまだ決定されてい
ない。

A82846およびその各個の成分A82846A、A82846Bおよび
A82846Cは、これを反応させて種々の塩を形成させるこ
とができる。これらの塩型抗生物質はすべて本発明の一
部である。これらのA82846塩は、たとえばA82846を分離
および精製するのに有用である。加うるに塩類は水に対
して改良された溶解性を有する。

A82846塩は標準的塩製造法により製せられる。たとえ
ばA82846を適当な酸で中和して酸付加塩を形成させるこ
とができる。

酸付加塩は特に有用である。代表的に適当な塩は、有
機酸または無機酸の双方たとえば硫酸、塩酸、リン酸、
酢酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、フマル
酸、コール酸、パモン酸、粘液酸、Ｄ−グルタミン酸、
ｄ−シヨウノウ酸、グルタール酸、グリコール酸、フタ
ル酸、酒石酸、ギ酸、ラウリン酸、ステアリン酸、サリ
チル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ソル
ビン酸、ピクリン酸、安息香酸、桂皮酸および同様の酸
などのような酸との標準的反応により形成される塩を包
含する。

薬理的に許容される酸付加塩は、本発明の特に好まし
い塩類である。

抗生物質A82846は、適当な培地中、液中好気的条件下
にノカルジア・オリエンタリスのA82846産生菌株を、実
質的抗生物質活性が生成するまで培養することにより製
造することができる。この抗生物質を、この技術分野で
理解される種々の分離および精製方法で回収することが
できる。

また本発明はノカルジア・オリエンタリスNRRL1809
8、ノカルジア・オリエンタリスNRRL18099、ノカルジア
・オリエンタリスNRRL18100またはこれらの菌株のA8284
6産生突然変異菌株、変異菌株もしくは遺伝子組換え菌
株（recombinant）から選ばれた生物学的に純粋な培養
菌株に関する。これらの微生物は、抗生物質A82846を産
生するので有用である。以下便宜上、NRRL18098菌株を
培養菌株A82846、NRRL18099菌株を培養菌株A82846.1お
よびNRRL18100菌株を培養菌株A82846.2と呼称する。培
養菌株A82846はハイチ（Haiti）の土壌試料から単離さ
れた。培養菌株A82846.1は化学的突然変異誘導（chemic
al mutagenesis）により得られた菌株、培養菌株A8284
6.2は培養菌株A82846から単離された自然的変異菌株で
ある。

培養菌株A82846、A82846.1およびA82846.2は、米国イ
リノイ州61604ペオリア、ノース・ユニバーシテイ・ス
トリート1815在米国農務省農業研究部ミドウエスト・エ
アリア・ノーザン・リージヨナル・リサーチ・センター
（Midwest Area Northern Regional Research Center）
に、1986年８月８日寄託し、そのストツク・カルチユア
・コレクシヨンの一部を構成する。これらの培養菌株
は、受理番号NRRL18098（A82846、親菌株）、NRRL18099
（A82846.1、突然変異菌株）およびNRRL18100（A82846.
2、変異種菌株）として公的に入手することができる。

培養菌株A82846、A82846.1およびA82846.2の分類学上
の（taxonomic）研究はリリー研究所（Lilly Research
Laboratories）のフレデリツク・ピー・メルツ（Freder
ick P.Mertz）が行なつた。この研究に基づき、新規微
生物を、ノカルジア・オリエンタリス（Pittenger and
Brigham 1956）プリダム・アンド・ライオンズ（Pridha
m and Lyons）1969年タイプ・ストレイン:ATCC19795菌
株として分類された〔ピツテンガー（R.C.Pittenger）
およびブリガム（R.B.Brigham）“ストレプトミセス・
オリエンタリスn.sp.,ザ・ソース・オブ・バンコマイシ
ン（Streptomyces orientalis n.sp.,the Source of Va
ncomycin）”アンチバイオテツクス・アンド・ケモセラ
ピイ（Antibiotics and Chemotherapy）第６巻642〜647
頁（1956年）〕。この分類は、下記文献に記載の研究所
の直接的比較と実験に基づくものである。

〔バーギーズ・マニユアル・オブ・デターミネイテブ
・バクテリオロジイ（Bergey′s Manual of Determinat
ive Bacteriology）第８版、ブチヤナン（R.E.Buchana
n）およびギボンズ（N.E.Gibbons）編、ザ・ウイリアム
ズ・アンドウイルキンズ・カンパニー（The Williams a
nd Wilkins Co.（バルチモア,1974年）刊；グツドフエロウ（M.Goodfellow）およびシヤール（K.
P.Schaal）著“アイデンテフイケイシヨン・メゾズ・フ
オア・ノカルジア・アクチノマデユラ・アンド・ロドコ
ツクス（Identification Methods for Nocardia,Actino
madura and Rhodococcus）”（アイデンテフイケイシヨ
ン・メゾズ・フオア・ミクロバイオロジスツ（Identifi
cation Methods for Microbiologists）第２版、スキナ
ー（F.A.Skinner）およびラブロツク（D.W.Lovelock）
編、ソサエテイ・フオア・アプライド・バクテリオロジ
イ・テクニカル・シリーズ（Society for Applied Bact
eriology Technical Series）No.14、アカデミツク・プ
レス社Academic Press,Inc.）、ニユーヨーク1979年
刊、261頁））；ゴルドン（R.E.Gordon）、バーネツト（D.A.Barnet
t）、ハンダーハン（J.E.Handerhan）およびパング（C.
H.Png）著“ノカルジア・コエリアカ、ノカルジア・ア
ウトトロピカ・アンド・ザ・ノカルジン・ストレイン
（Nocardia coeliaca,Nocardia autotrsphica,and the
Nocardin Strain）”インターナシヨナル・ジヤーナル
・オブ・システマテカル・バクテリオロジイ（Int.J.Sy
st.Bact.eriol.）第24（１）巻54〜63頁（1974年）；ゴルドン（R.E.Gordon）、ミシラ（S.K.Mishra）およ
びバーネツト（D.A.Barnett）著“サム・ビツツ・アン
ド・ピーセス・オブ・ザ・ジーナス・ノカルジア：ノカ
ルジア・カルネア、ノカルジア・ワクシニイ、ノカルジ
ア・トランスバレンシス、ノカルジア・オリエンタリス
およびノカルジア・アエロコロニゲネス（Some Bits an
d Pieces of the Genus Nocardia:N.carnea,N.vaccini
i,N.transvalensis,N.orientalis,and N.aerocolonigen
es）”ジヤーナル・オブ・ゼネラル・ミクロバイオロジ
イ（J.Gen.Microbiol.）第109巻69〜78頁（1978年）；ミシラ（S.J.Mishra）、ゴルドン（R.E.Gordon）およ
びバーネツト（D.A.Barnett）著“アイデンテフイケイ
シヨン・オブ・ノカルジアエ・アンド・ストレプトミセ
ス・オブ・メデカル・インポータンス（Identification
of Nocardiae and Streptomyces of Medical Importan
ce）”ジヤーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロ
ジイ（J.Clin.Microbiol.）第11（６）巻728〜736頁（1
980年）；モルダルスカ（H.Mordarska）およびモルダルスキ
（M.Mordarski）著“ケモタキソノミク・キヤラクター
ズ・アンド・クラシフイケイシヨン・オブ・サム・ノカ
ルジオホルム・バクテリア（Chemotaxonomic Character
s and Classification of Some Nocardioform Bacteri
a）”ジヤーナル・オブ・ゼネラル・ミクロバイオロジ
イ（J.Gen.Microbiology）第71巻77〜86頁（1972年）；
およびシノブ（R.Shinobu）およびカワト（M.Kawato）“オ
ン・ストレプトミセス・アエロコロニゲネスnov.sp.ホ
ーミング・ザ・セカンダリイ・コロニーズ・オン・ザ・
エアリアル・マイセリア（On Streptomyces aerocoloni
genes nov.sp.,Forming the Secondary Colonies on th
e Aerial Mycelia）”ボタニカル・マガジン・トウキヨ
ウ（Bot.Mag.Tokyo）第73巻213〜216頁（1960年）〕分類方法ストレプトミセス属に属する種の特性検定のため、以
下に述べる方法は、ザ・インターナシヨナル・ストレプ
トミセス・プロジエクト（the International Streptom
yces Project（ISP））により推奨される方法〔シヤー
リング（E.B.Shirling）およびゴツトリーブ（D.Gottli
eb）著“メソズ・フオア・キヤラクタリゼイシヨン・オ
ブ・ストレプトミセス・スピーシス（Methods for Char
acterization of Streptomyces Species）”インターナ
シヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテカル・バクテ
リオロジイ（Int.J.Syst.Bacteriol.）第16巻313〜340
頁（1966年）〕、ノカルジア属の種の分類特性は、ゴル
ドン、バーネツト、ハンダーハンおよびパング（Gordo
n,Barnett,Handerhan and Pang）〔上記文献〕により推
奨される方法である。

形態学的特性は、光学顕微鏡を用いて研究を行なつ
た。胞子表面外観を研究するため走査電子顕微鏡（SE
M）を用いた。

リフアムピンおよびリゾチームに対する抵抗性は、ゴ
ルドンにより推奨される方法により測定した〔ゴルドン
（R.E.Gordon）およびバーネツト（D.A.Barnett）著
“リジスタンス・ツー・リフアムピン・アンド・リゾチ
ーム・オブ・ストレインズ・オブ・サム・スピーシズ・
オブ・ミクロバクテリウム・アンド・ノカルジア・アズ
・ア・タキソノミツク・ツール（Resistance to Rifamp
in and Lysozyme of Strains of Some Species of Myco
bacterium and Nocardia as a Taxonomic Tool）”イン
ターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテツク・
バクテリオロジイ（Int.J.Syst.Bacteriol.）第27
（３）巻176〜178頁（1977年）〕。

色名を指定するため、ISCC−NBSセントロイド・カラ
ー・チヤート（Centroid Color Charts）・標準試料No.
2106（ワシントンD.C.米国商務省標準局（National Bur
eau of Standards）（1958年））、およびカラー・ハー
モニイ・マニユアル（Color Harmony Manual）第４版
（イリノイ州シカゴ在コンテナー・コーポレイシヨン・
オブ・アメリカ（Container Corporation of America）
（1958年）を用いた。

メラノイド色素産生（chromogenicity）は、ISP No.1
（トリプトン−酵母エキス液）、ISP No.6（ペプトン−
酵母エキス鉄寒天）およびISP No.7（チロシン寒天）培
地を用いて決定した。

細胞全体の加水分解物中のジアミノピメリン酸（DA
P）の異性体および炭水化物は、ベツカーら〔ベツカー
（B.Becker）、レチエバリアー（M.P.Lechevalier）、
ゴルドン（R.E.Gordon）およびレチエバリアー（H.A.Le
chevalier）著“ラピツド・デフアレンシエイシヨン・
ビトウイン・ノカルジア・アンド・ストレプトミセス・
バイ・ペーパー・クロマトグラフイー・オブ・ホール−
セル・ハイドロリセーツ（Rapid Differentiation betw
een Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatogra
phy of Whole−cell Hydrolysates）”アプライド・ミ
クロバイオロジー（Appl.Microbiol）第12巻421〜423頁
（1964年）〕およびレチエバリアー〔レチエバリアー
（M.P.Lechevalier）“アイデンテフイケイシヨン・オ
ブ・エアロビツク・アクチノミセテス・オブ・クリニカ
ル・インポータンス（Identification of Aerobic Acti
nomycetes of Clinical Importance）”ジヤーナル・オ
ブ・ラボラトリイ・アンド・クリニカル・メデシン（J.
Lab.Clin.Med.）第71巻934〜944頁（1968年）〕のクロ
マトグラフイにより確定した。

ミコール酸は、マンニキン記載の技術に基づく方法に
より試験した〔マンニキン（D.E.Minnikin）、ハツチン
ソン（I.G.Hutchinson）およびカルジコツト（A.B.Cald
icott）著“シンレイヤー・クロマトグラフイ・オブ・
メタノリセーツ・オブ・ミコリク・アシド−コンテイニ
ング・バクテリア（Thin−Layer Chromatography of Me
thanolysates of Mycolic Acid−Containing Bacteri
a）”ジヤーナル・オブ・クロマトグラフイ（J.Chromat
ography）第188巻221〜233頁（1980年）〕。

ホスフアターゼおよびウレイアーゼはブラゼビク記載
の方法により試験した〔ブラゼビク（D.J.Blazevic）お
よびエデラー（G.M.Ederer）著“プリンシプルス・オブ
・バイオケミカル・テスツ・イン・ダイアグノスチク・
ミクロバイオロジイ（Principles of Biochemical Test
s in Diagnostic Microbiology）”ジヨン・ウイリイ・
アンド・サンズ社（John Wiley and Sons,Inc.）ニユー
ヨーク1975年刊、136頁〕。プロテイナーゼ活性を測定
するため、ゼラチン液化法を用いた。

抗生物質に対する抵抗性は、ISP No.2寒天プレートに
接種し、そのプレート上、抗生物質感受性デイスクのパ
ツド法により測定した。

殿粉加水分解は、ISP No.4（無機塩−殿粉）寒天プレ
ート上、殿粉の存在をヨウ素で試験することにより測定
した（ブラゼビクおよびエデラー上掲参照）。

ヒツプレート加水分解は、ヒツプレートの加水分解を
すみやかに検出するバクト分別デイスク（Bacto Differ
entiation Disks）を使用することにより測定した。

培養特性培養菌株A82846およびA82846.2は、使用するすべての
複合および限定培地によく発育する。これらの培養菌株
はほとんどの培地上で気生菌糸体を産生する。気生胞子
塊の色は培地により白色または灰色である。多くの培地
上で特有の可溶性褐色色素を産生し、裏面は褐色ないし
黄色味を帯びた白色である。

また培養菌株A82846.1はすべての培地上で発育する
が、その発育は親菌株に比してそれ程豊富ではない。A8
2846.1はまれに気生菌糸体を産生する。産生したその菌
糸体の色は白色である。数種の培地に時折、目立たない
淡褐色の可溶性色素を産生し、裏面は褐色ないし黄色味
を帯びた白色である。

培養菌株A82846、A82846.1およびA82846.2の培養特性
を表１に要約する。培養菌株A82846とA82846.2は、数種
の培養特性だけが異なるが、非常に類似している。この
類似性の故に、またA82846.2はA82846の自然変異種であ
るから、更に比較は行なわなかつた。

形態学的特性培養菌株A82846、A82846.1およびA82846.2は、広範な
基底菌糸体（substrate mycelium）を産生する。個別の
菌糸は長鎖状の分生子を形成してくもの巣状の外観を有
し、バーギイス・マニユアル・オブ・デタミネイテブ・
バクテリオロジイ（Bergey′s Manual of Determinativ
e Bacteriology、前掲）における非ストレプトミセテス
の特性として分類される。

すべての培養菌株において、胞子表面外観は平滑で円
筒状である。胞子の大きさはA82846が1.2〜1.3×0.4〜
0.5μＭ、A82846.1が1.4〜2.2×0.3〜0.4μＭである。

液中振盪条件下に発育させたとき、A82846は最少の断
片を現わし、A82846.1は広範に断片を現わし、A82846.2
は中程度の断片を現わす。

生理学的特性培養菌株A82846およびA82846.1は、アラビノース、セ
ロビオース、デキストラン、フルクトース、ガラクトー
ス、グルコース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、グリセ
ロール、イノシトール、ラクトース、マルトース、マン
ニトール、マンノース、メリビオース、ラムノース、リ
ボース、シユクロース、トレハロースおよびキシロース
から酸を生成するが、アドニトール、セルロース、ズル
シトール、エリストール、イヌリン、ソルビトールおよ
びキシリトールから酸を生成しない。またA82846はエタ
ノール、グリコーゲン、メレチトース、ラフイノースお
よびサリシンから酸を生成するが、A82846.1は生成しな
い。双方の培養菌株はアセテート、シトレート、ラクテ
ート、マレート、オキサレート、プロピオネート、ピル
ベートおよびスクシネートを利用するが、ベンゾエー
ト、ムケートおよびタートレートを利用しない。培養菌
株A82846.1はブチレートを利用するがA82846は利用しな
い。

A82846およびA82846.1はカゼイン、ヒポキサンチン、
チロシン、尿素およびDNAを分解するがアデニン、リン
ゴ酸カルシウムまたはキサンチンを分解しない。双方の
培養菌株は殿粉を加水分解するが、エスクリンまたはヒ
ツプレート、還元ナイトレート、液化ゼラチンを加水分
解しない。50℃で８時間生き残り、カタラーゼ、硫化水
素およびホスフアターゼを産生する。

培養菌株A82846およびA82846.1は、同一の抗生物質抵
抗パターンを有する。これらは、バシトラシン（10単
位）、セフアロチン（30μｇ）、ゼンタマイシン（10μ
ｇ）、リンコマイシン（２μｇ）、オレアンドマイシン
（15μｇ）ペニシリンＧ（10単位）、ストレプトマイシ
ン（10μｇ）、バンコマイシン（30μｇ）、トブラマイ
シン（10μｇ）、エリスロマイシン（15μｇ）、ナリジ
キシン酸（30μｇ）、ポリミキシンＢ（300単位）、ト
リメトプリム（５μｇ）およびスルフアジアジン（300
μｇ）に対して抵抗性を有し、ネオマイシン（30μ
ｇ）、リフアムピン（５μｇ）、テトラサイクリン（30
μｇ）、クロラムフエコール（30μｇ）、ノボビオシン
（30μｇ）およびマンデルアミン（３μｇ）に対して感
受性を有する。

A82846およびA82846.1はそれぞれグラム染色される
（＋）が、抗酸性染色されない。A82846はメラノイド色
素を産生するが、A82846.1は産生しない。

細胞壁の分析 A82846の加水分解した全細胞は、ジアミノピメリン酸
のメソ異性体およびその糖類、アラビノースおよびガラ
クトースを含む。この培養菌株は、ベツカー（Becker）
ら（前掲）によるタイプIV細胞壁を有する。糖パターン
はタイプＡである（レツチヤバリヤー（Lechavalier）
前掲）。この培養菌株はミコール酸（LCN−Ａ）を産生
しない。

菌株A82846の同定菌株A82846の化学分類学的特性および一般的培養特性
は、そのノカルジア（Nocardia）属トレビサン（Trevis
an）1889への帰属に矛盾しない〔スカーマン（V.B.D Sk
erman）、マクガバン（V.McGowan）およびスニース（P.
H.A.Sneath）編“アプリーブド・リスツ・オブ・バクテ
リアル・ネームス（Approved Lists of Bacterial Name
s）”インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・システ
マテカル・バクテリオロジイ（Int.J.Syst.Bacterio
l.）第30巻225〜420頁（1980年）〕。

ノカルジアに属する14種〔ゴルドン（Gordon）、ミシ
ユラ（Mishra）およびバーネツト（Barnett）により公
表（前掲）されている〕およびリリー・カルチユア・コ
レクシヨン（Lilly culture collection）から得られた
５種の菌株の特性から、類似性係数（similarity coeff
icients）を計算した。ジヤカード係数（coegfficient
of Jaccard〔スニース（P.H.A.Sneath）著“ジ・アプリ
ケイシヨン・オブ・コンピユーターズ・ツウ・タキソノ
ミイ（The Application of Computers to Taxonomy）”
ジヤーナル・オブ・ゼネラル・ミクロバイオロジイ（J.
Gen.Microbiol.）第17巻201頁（1957年）参照〕、およ
び単純符合係数（simple matching coefficient）〔ソ
カル（R.R.Sokal）およびミチナー（C.D.Michener）著
“ア・スタテステカル・メソド・フオア・エバリユエー
テング・システマテク・リレーシヨンシツプス（A Stat
istical Method for Evaluating Systematic Relations
hips）”キヤンザス・ユニバーシテイ・サイエンス・ブ
リテン（Kan.Univ.Sci.Bull.）第38巻1409頁（1958年）
参照〕を用いた。これらの比較結果を表IIに示す。

注）N.アエロコロニゲネス（N.aerocolonigenes）、
N.オリエンタリス（N.orientalis）、N.マジユラエ（N.
madurae）、N.ヒルスタ（N.hirsuta）、N.アウトトロピ
カ（N.autotrophica）、N.ダツソンビレイ（N.dassonvi
llei）、N.アマラエ（N.amarae）、N.ブラシリエンシス
（N.brasiliensis）、N.バクシンシ（N.vaccinci）、N.
トランスバレンシス（N.transvalensis）、N.カビアエ
（N.caviae）、N.ペレテイエリ（）N.pelletieri）、N.
アステロイデス（N.asteroides）、N.カルネア（N.carn
ea）。

N.マジユラエはアクチノマジユラ（Actinomadura）属
に移されたので、これは考察から除外した。N.アエロコ
ロニゲネスおよびN.オリエンタリスの２種は、良好な類
似性係数を有する。A82846とこれら２種の実験室的比較
を行なつた。比較結果を表IIIに示す。

ａ）＋＝菌株がその特性を有する；−＝菌株がその特
性を有しない。

多数の単位特性を用いて再度、類似性係数を計算し
た。その結果を表IVに要約する。

N.オリエンタリスもN.アエロコロニゲネスもその細胞
壁中にミコール酸が存在しない。ゴルドン（前掲）は、
N.オリエンタリスとN.アエロコロニゲネスの区別を助け
るための鍵となる要点として３つの特性を述べている。
ゴルドンの要点特性を用いたA82846とノカルジア属の２
種の比較結果を表Ｖに示す。

A82846は、他のいずれのノカルジア菌株の要点特性と
も完全に一致しないが、A82846は、培養特性およびN.オ
リエンタリスとの高い類似性係数の点で、N.オリエンタ
リスへの近似性がより大である。またA82846は、これが
グリコペプチド抗生物質を産生するという点でN.オリエ
ンタリスに似ている。それ故A82846は、ノカルジア・オ
リエンタリス（ピツテンガー・アンド・ブリガム（Pitt
enger and Brigham）1956）プリダム・アンド・リオン
ズ（Pridham and Lyons）1969の菌株として分類され
る。N.オリエンタリスは、アプルーブド・リスツ・オブ
・バクテリアル・ネームス（前掲）中に認知されている
ので、確実な根拠で公表された種である。

培養菌株A82846.1は、菌株A82846の化学的に誘導され
た突然変異菌株である。A82846.1がA82846と異なる特性
を表VIに示す。

またA82846.1は、その産生する抗生物質活性の量にお
いて、A82846と異なる。これらの菌株の間の他の最も明
らかな差異は、A82846と異なりA82846.1が気生菌糸体と
明確な可溶性色素を産生しないことである。

培養菌株A82846.2は培養菌株A82846の自然変異種であ
る。それ故A82846.2の同定された特性は、A82846のそれ
と本質的に同様である。A82846とA82846.2の間の主要な
差異は、振盪フラスコ中で発育させたとき、A82846.2培
養菌株はA82846培養菌株より有意に多量の抗生物質A828
46を生産することである。

他の微生物の場合と同様に、本発明のA82846生産菌
株、ノカルジア・オリエンタリス（Nocardia orientali
s）菌株NRRL18098、NRRL18099およびNRRL18100の特性
は、変異種に従属する。それ故これらの菌株の後代（子
孫）たとえば遺伝子組換え変異種、突然変異種および変
異種は、この技術分野における公知方法により得ること
ができる。たとえば変異種は自然的選択により得ること
ができ、突然変異種は、種々の公知の物理的および化学
的突然変異誘導物（mutagen）、たとえば紫外線、Ｘ
線、ガンマ線およびＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンのような化学的突然変異誘導物で処理
することにより得ることができる。

遺伝子組換え変異菌株は、この技術分野でよく知られ
た方法を用いノカルジア・オリエンタリス菌株を形質転
換することにより開発することができる。ノカルジア属
とストレプトミセス属は類似しているので、ストレプト
ミセス用に開発された形質転換法および組換えベクター
を、ノカルジア属菌株の形質転換にも使用することがで
きる。遺伝子組換え技術を用いることにより、ノカルジ
ア・オリエンタリスが生産する抗生物質に加え、これら
の菌株を形質転換して多くの遺伝子産物を発現させるこ
とができる。たとえばノカルジア・オリエンタリス菌株
が通常、感受性を有する抗生物質に対する抵抗性を付与
する組換えベクターを用いて該菌株を形質転換すること
ができる。かくて得られた形質転換体は、A82846抗生物
質自体ばかりでなく、形質転換された細胞野生型からの
選択を可能にする抵抗性付与酵素をも生産する。更に同
様の技術を用い、この菌株を処理して内生的抗生物質生
合成遺伝子の多くのコピーを導入し、より多くの抗生物
質収量を得るように改良することができる。A82846生産
特性を保持するノカルジア・オリエンタリス菌株NRRL18
098、NRRL18099およびNRRL18100の後代（子孫）菌すな
わちその自然のまたは誘導された変異種、突然変異種な
らびに遺伝子組換え種は、本発明の一部を構成する。

ノカルジア・オリエンタリス培養菌株を発育に使用す
る培地は、多くの培地のいずれかであることができる。
しかし生産上の経済性、最適収量および生産、単離の容
易さのため、ある種の培地が好ましい。このようにたと
えば大規模発酵における好ましい炭水化物源は、グルコ
ースおよびポテトデキストリンであるが、リボース、キ
シロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、
マンニトール、可溶性殿粉なども使用することができ
る。

好ましい窒素源は、酵素加水分解カゼインおよびミー
トペプトン類であるが、酵母エキス、酸加水分解カゼイ
ン、牛肉エキス、魚粉、肝臓粉その他も使用することが
できる。

培地中に配合することができる栄養無機塩類中、亜
鉛、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニ
ウム、クロリド、カーボネート、サルフエート、ニトレ
ートなどのイオンを供与することができる通常の可溶性
塩を包含する。

また微生物の生長および発育のために必要な必須微量
元素を培地中に含有させるべきである。かかる微量元素
は、微生物の生長需要に適合するのに充分量で培地の他
の成分中に不純物として通常存在する。もし発泡が問題
であるならば、ポリプロピレングリコールのような消泡
剤少量（すなわち0.2ml/L）を、大規模発酵培地中に加
えてもよい。

A82846抗生物質の実質的量の生産のため、タンクの液
中好気的発酵が好ましい。少量の抗生物質は振盪フラス
コ培養により得ることができる。大型タンクに胞子型の
微生物を接種することに通常付随する抗生物質生産にお
ける時間の遅れ（タイムラグ）の故に、栄養接種物を用
いるのが好ましい。栄養接種物は、少容量の培地に胞子
形微生物または菌糸体断片を接種し、微生物の新鮮で活
性を有する生長培養物を得ることにより製造することが
できる。次いでこの栄養接種物を大型タンクに移す。栄
養接種物培地は、より大型の発酵のために使用する培地
と同様であつてよいが、他の培地も適当である。

A82846抗生物質は、A82846産生菌を約23〜37℃で生長
させるとき生産される。A82846生産のための最適温度は
約30〜31℃であると考えられる。

液中好気的培養工程で通常行なわれているように、培
地を常套のタービン羽根車で攪拌する間、底部から容器
内に滅菌空気を吹込む。従来採用されていた条件下の発
酵における最大酸素吸収量は約0.2mM/L/分を越えていな
かつた。一般的には通気速度および攪拌速度は、溶解し
た酸素濃度を、飽和の50％またはそれ以上に保持するの
に充分にするべきである。

A82846抗生物質の製造は、抗生物質に感受性を有する
ことで知られた微生物に対する抗生物質活性を監視する
ため、発酵の間、発酵液試料を試験することにより製造
を継続する。有用な供試微生物はバチルス・スブテイリ
ス（Bacillus subtilis）ATCC6633である。生物試験法
は寒天−くぼみ板（agar−well plate）試験により行な
うのが好都合である。

液中好気的発酵条件下に製造を行ない、この技術分野
において用いる方法により発酵培地からA82846抗生物質
を回収することができる。A82846産生微生物の発酵の
間、生成した抗生物質活性は、菌糸体および発酵液の双
方中に存在する。それ故、初めにpH10.5に調節して菌糸
体からA82846を分離し、培地を過して菌糸体塊から発
酵液を分離することにより、A82846の最大量の回収を達
成することができる。

過した発酵液から、種々の方法によりA82846を回収
することができる。好ましい方法は、過した発酵液を
pH約７に調節し、これを陽イオン交換樹脂、たとえばダ
ウエツクス（Dowax）XF5−43278、ダウエツクス−50ま
たはアンバーライト（Amberlite）IR−120に吸収させる
方法を包含する。たとえば希水酸化アンモニウム溶液の
ような適当な溶媒を用い、上記樹脂から活性物質を溶離
する。この活性分画を減圧下に濃縮し、マクロレテイキ
ユラー樹脂たとえばダイアイオン（Diaion）HP−20およ
びアンバーライトXAD−４に吸着させ、水：イソプロパ
ノール（95:5）（１％酢酸含有）のような適当な溶媒で
溶離してA82846を得る。また活性物質を、水：アセトニ
トリルまたは水：メタノール混合物（少量の酸含有）で
溶離することもできる。

A82846を同様の方法により、その各個の成分A82846
A、A82846BおよびA82846Cに分離することができる。好
ましい分離方法は、逆相シリカゲル（C₁₈またはC₈）ク
ロマトグラフイを包含する。

またA82846源としての培地成分および菌糸体を含む培
地固体を、抽出または分離することなく好ましくは水を
除いた後、使用することができる。たとえばA82846を製
造後、全発酵液を凍結乾燥、ドラム乾燥または共沸蒸留
して乾燥することができる。次いで乾燥発酵液はこれを
たとえば直接飼料プレミツクス中に混合する。

A82846抗生物質は、グラム陽性病原菌に対して試験管
内または生体内的にすぐれた活性を有する。これらの抗
生物質の特に予想外の特質は、長い血清半減期である。
たとえばラツトに静脈内投与したとき、バンコマイシン
は45分の血清半減期を有するが、A82846AおよびA82846B
はそれぞれ2.2時間の半減期を有する。

A82846抗生物質がある種の細菌を抑制する最小抑制濃
度（MIC′ｓ）を表VIIおよびVIIIに示す。表VIIおよびV
III中のMIC′ｓは標準寒天希釈試験法で試験した。

表VII・注）スタフイロコツクス・アウレウス（Staph
ylococcus aureus）、スタフイロコツクス・エピデルミ
デス（Staphylococcus epidermidis）、ストレプトコツ
クス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレ
プトコツクス・プノイモニアエ（Streptococcus pneumo
niae）、ヘモフイルス・インフルエンザエ（Haemophilu
s influenzae）、エシエリヒア・コリー（Escherichia
coli）、クレブシエラ・プノイモニアエ（Klebsiella p
neumoniae）、プソイドモナス・アエルギノサ（Pseudom
onas aeruginosa）。

表VIII・注）ストレプトコツクス・サリバリス（Stre
pto coccus salivaris）、ストレプトコツクス・サング
イス（S.sanguis）、ストレプトコツクス・ムタンス
（S.mutans）。

A82846化合物の抗菌活性の重要な側面は、その嫌気性
菌に対する活性である。この活性を表IXに示す。表IXは
標準寒天−希釈試験法で試験した種々の嫌気性菌に対す
るA82846AおよびA82846Bの活性を要約したものである。
24時間熟成後、終末点と解釈した。

表IX注）C.デイフイシン（Clostridium difficil
e）、C.ペルフリンゲンス（Clostridium perfringen
s）、C.セプチクム（Clostridium septicum）、E.アエ
ロフアシエンス（Eubacterium aerofaciens）、P.アサ
ツカロリテイクス（Peptococcus asaccharolyticus）、
P.プレイボテイ（ Peptococcus prevoti）、P.バリア
ビリス（Peptococcus variabilis）、P.コンステラツス
（Peptococcus constellatus）、P.マグヌス（Peptococ
cus magnus）、P.アナエロビウス（Peptostreptococcus
anaerobius）、P.インテルメデイウス（Peptosteptoco
ccus intermedius）、P.アクネス（Propionibacterium
acnes）。

表IX（つづき）注） B.フラギリス（Bacteroides fragilis）、B.テタイオタ
オミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、B.メラ
ニノゲニクス（Bacteroides melaninogenicus）、B.ブ
ルガテイス（Bacteroides vulgatis）、B.コロデンス
（Bacteroides corrodens）、F.シムビオスム（Fusobac
terium symbiosum）、F.ネクロフオルム（Fusobacteriu
m necrophorum）。

またA82846抗生物質は、実験動物に実験的に誘導した
感染に対する生体内抗菌活性を示す。実験的に供試微生
物に感染させたマウスに試験化合物を２回投与したと
き、観察された活性をED₅₀値として測定した〔供試動物
50％を保護する有効投与量（mg/kg）：ウオレン・ウイ
ツク（Warren Wick）ら著ジヤーナル・オブ・バクテリ
オロジイ（J.Bacteriol.）第81巻233〜235頁（1961
年）〕。例示する化合物について観察されたED₅₀値を表
Ｘに示す。

抗菌活性の重要な一側面において、A82846抗生物質は
腎盂腎炎の処置のために有用である。たとえばA82846A
およびA82846Bは、ラツトの腎盂腎炎の罹患を実験的に
減少させて保護することにおいてバンコマイシンより有
効である。この試験は、米国特許第4,208,403号に開示
されたような方法を用いて行なわれる。観察結果を表XI
に要約する。

またA82846抗生物質は心内膜炎に有用である。たとえ
ばA82846AおよびＢは、実験的にカテーテルを挿入して
心内膜炎に罹患させたラツトを処置することにおいてバ
ンコマイシンと同様な効果を有する。この試験におい
て、ラツトの右頸動脈にプラスチツクカテーテルを挿入
し、これを右心室中に到達させて確実に固定することに
よりラツトの実験準備をする。動物を２日間安静に保つ
た後、供試微生物：ストレプトコツクス・フエカリス
（Streptococcus faecalis）Ｘ−66を静脈注射する。微
生物力価は約５×10⁸/mL、注射量は0.5mLである。

活性化合物を、感染15分前および12時間間隔で14日
間、全28回皮下投与する。治療後、動物を２日間保持し
た後、心臓を切除して均質にし、希釈し、トリプチカー
ゼ大豆寒天上に板状に延ばす。計数前、板状物を48時間
熟成する。

実験結果を表XIIに示す。

A82846抗生物質の薬物製剤もまた本発明の一部であ
る。それ故この抗生物質好ましくはその薬理学的に許容
される塩類型を、菌類感染症の治療的または予防的処置
のため、経口的もしくは非経口的投与剤形に製剤するこ
とができる。たとえば活性化合物を、通常の薬学的担体
または賦形剤と混合し、錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、懸濁液、シロツプ剤、ウエーフアスなどの剤形で使
用することができる。

A82824抗生物質を含有する薬剤組成物は、これに活性
化合物約0.1〜90重量％、より一般的には約10〜30重量
％を含有せしめる。かかる組成物は、これに通常の担体
および賦形剤たとえばコーンスターチまたはゼラチン、
ラクトース、シユクロース、微結晶セルロース、カオリ
ン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウ
ムおよびアルギン酸を含有せしめることができる。本発
明組成物に通常使用する崩壊剤は、クロスカルメロース
（croscarmellose）ナトリウム、微結晶セルロース、コ
ーンスターチ、グリコール酸ナトリウム殿粉およびアル
ギン酸を包含する。

包含することができる錠剤混合組成物は、アラビアゴ
ム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナ
トリウム、ポリビニルピロリドン（Povidone）、ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、シユクロース、殿粉お
よびエチルセルロースを包含する。

使用することができる滑沢剤は、ステアリン酸マグネ
シウムまたは他のステアリン酸金属塩、ステアリン酸、
液状シリコーン、タルク、ワツクス、油脂類およびコロ
イド状シリカを包含する。

ペパーミント、冬緑油、チエリー香料その他のような
香料を使用することができる。

投与剤型を外観上より美的にし、薬物の識別を助ける
ため、着色剤を加えるのが好ましいこともある。

静脈内（IV）使用のため、水溶性型抗生物質を、通常
用いる静脈注射内液体に溶解し、注射により投与するこ
とができる。たとえば生理的食塩水、リンゲル液または
５％デキストロース溶液のような液体を使用することが
できる。

筋肉内投与用製剤として、化合物の適当な可溶性塩た
とえば塩酸塩の滅菌調製物を、注射用水、生理的食塩水
または５％グルコース溶液のような薬学的希釈剤に溶解
して投与することができる。水性基質または薬学的に許
容される油性基質たとえばオレイン酸エチルのような長
鎖脂肪酸エステル中の懸濁液として、活性化合物の適当
な不溶性剤型を製剤し、投与することができる。

経口的用途のため、抗生物質の適当な塩型たとえば塩
酸塩を、蒸留水または脱イオン水中に調製した滅菌製剤
は特に有用である。

また、本発明の抗生物質の単位投与剤型は、適当な滅
菌希釈剤中、抗生物質好ましくはその塩の溶液を密閉し
て封入したアンプルであることができる。単位投与剤中
の抗生物質の濃度は、抗生物質の特定の剤形、その溶解
性および医師の所望する投与剤形に依存してたとえば約
１〜50％の範囲で変えることができる。

更に上記以外の観点から、本発明は動物の感染症、特
にグラム陽性菌に起因する感染症を処置する方法を提供
する。動物は微生物に感受性を有するか、または感染す
るかいずれかであることができる。処置方法は当該目的
のために有効なA82846抗生物質の量を動物に投与するこ
とから成る。一般にA82846抗生物質の有効量は、約0.5
〜100mg/kgの投与量である。好ましい投与量は活性化合
物約１〜60mg/kgである。成人１人１日当り典型的投与
量は約50mg〜約1.0gである。

この方法の実施において、抗生物質を１日当り１個ま
たは１日当り複数個の剤形で投与することができる。養
生処置は長期間、たとえば数日間または１〜６週間に渡
る投与が必要なこともある。単位投与量または投与総量
は、感染の症状および重篤度、患者の年令および一般的
健康度、患者の抗生物質に対する耐性、ならびに感染症
に含まれる１種ないし複数種の微生物のような因子に依
存する。

処置方法を実施するのに好都合な方法は抗生物質を静
脈注射（IV infusion）により投与することである。こ
の方法において、抗生物質の適当な可溶性塩の滅菌組成
物を、５％デキストロース溶液のような生理的液体中に
配合し、得られた溶液をゆつくり静脈（IV）注射する。
また静脈注射のピギ−バツク法（piggy−back method）
を採用してもよい。

他の実施態様において、本発明は（１）家禽、豚、羊
および牛のような動物の飼料利用効率を高める方法、
（２）家禽、豚、羊および牛のような動物の肉生産を上
げるための生長促進法および（３）反芻動物の乳汁分泌
における乳生産増強方法に関する。飼料利用効率を高
め、生長を促進するため、A82846抗生物質を、全飼料ト
ン当り約２〜200gの量で適当な飼料に配合して経口的に
投与する。肉牛のために、たとえば約12〜3000mg/頭／
日の割合が適当である。反芻動物の乳汁分泌における乳
生産増強のための経口投与量を示せば、１日当り約0.04
〜16mg/kg（体重）（または約25〜5000mg/動物／日）で
ある。

かかる観点において本発明化合物を、生理学上許容さ
れる担体を含む動物飼料プレミツクス型として正規に販
売することができる。

本発明の実施をより完全に説明するため、以下実施例
を列挙する。

実施例１ A82846HPLC試験法：− A82846成分のため次の分析的HPLC系は有用である。

1.陽イオン交換樹脂カラムカラム支持：ゾルバツクス^＊SCX（4.6×150mm）、系：
傾斜溶離、A:B（4:1）→A:B（1:9）、５分中、15分間保
つ。

Ａ＝MeOH:0.1M・NaH₂PO₄（1:9）Ｂ＝MeOH:0.9M・NaH₂PO₄（1:9）流速:1.0mL/分、検出:225nm UV 保持時間：濃度に依存するが、概略、A82846C＝6.6分、
A82846B＝8.9分、A82846A＝9.5分。

2.逆相カラムカラム支持：ゾルバツクス^＊ODS（4.6×150mm）、系：
傾斜溶離、１％(NH₄)H₂PO₄：CH₃CN、（95:5）→（1:
1）、20分中。

流速:1.0mL/分、検出:225nm UV 保持時間:A82846A＝7.3分、A82846C＝7.6分、A82846A＝
8.0分。

注）＊ゾルバツクス（Zorbax）はE.I.デユポン・ド・ナ
ムール社（duPont de Nemours Co.,Inc.）デラウエア州
19898ウイルミントン）の製品。

実施例２培養菌株A82846を用いる抗生物質A82846の製造：− A.培養菌株A82846の振盪フラスコ発酵：− 培養菌株ノカルジア・オリエンタリスNRRL18098（凍
結乾燥したペレツトまたは液体窒素に保持した懸濁液の
いずれかとして）を使用し、次の組成を有する種菌培地
に接種する。

種菌培地の組成：グルコース1.0％；可溶性殿粉2.0％；酵母エキス0.5
％；カゼイン^＊の酵素加水分解物0.5％；炭酸カルシウ
ム0.1％；脱イオン水全量１になる量。

滅菌前、培地を水酸化ナトリウムでpH7.5に調節。

注）＊NZアミンＡ（シエフイールド・ケミカル・カンパ
ニー（Sheffield Chemical Co.（NY,ノーウイツ
チ））。

種菌培地に2.5％寒天を加えて斜面培地および平板培
地を調製する。接種した斜面培地を30℃で約10〜14日間
インキユベートする。熟成した斜面培養物を滅菌器具で
かき削つて胞子を解き離し、菌子体マツトを覗き浸漬す
る。解き離して得られた胞子と生長培養物の約1/4量を
使用して第１段階の種菌培地50mLに接種する。

接種し第１段階の培地を、250mL エルレンマイヤーフ
ラスコ中、２インチ（5.08cm）旋回、回転数250rpmのシ
エーカー上、30℃で約24〜48時間熟成する。

上記熟成した第１段階の培地（0.5mL）を用い、次の
組成を有する生産培地50mLに接種する。

生産培地の組成：グルコース2.5％；大豆粉1.5％；ポテトデキストリン
3.0％；炭酸カルシウム0.25％；廃糖蜜0.3％；酸加水分
解カゼイン^＊0.5％；脱イオン水、全量１となる量。

（滅菌前、水酸化ナトリウムでpH7.5に調節）注）＊ハイ−ケース（Hy−Case）（シエフイールド・ケ
ミカル・カンパニー）接種した生産培地を、250mL広口エルレンマイヤーフ
ラスコ中、２インチ、250rpmの回転シエーカー上、30℃
で４〜５日間熟成する。

B.培養菌株のタンク発酵：− 大容量の接種材料を製造するため、前記Ａ項に記載の
ように製造した第１段階の熟成培地10mLを用い、第１段
階の培地の組成と同一の組成を有する第２段階の生長培
地400mLに接種する。この第２段階の栄養培地を、２−
Ｌ広口エルレンマイヤーフラスコ中、２インチ旋回、回
転数250rpmのシエーカー上、30℃で約48時間熟成する。

熟成して得られた第２段階の栄養培地1000mLを用い、
前記Ａ項に記載のように製造した滅菌生産培地（ただし
Ｐ−2000消泡剤0.3g/Lを加える）100lに接種する。接種
した生産培地を、攪拌中の165L発酵タンク中、30℃で90
〜100時間発酵させる。攪拌（80rpm）している容器中の
空気流を、溶解酸素濃度（空気の飽和の50％以上）に保
持するよう調節する。

C.培養菌株A82846の別のタンク発酵：− 栄養培地の適当量を用い、1600ガロン（4536−Ｌ）発
酵タンク中、生産培地約1200ガロンに接種する。

実施例３培養菌株A82846.1を用いる抗生物質A82846の製造：ノカルジア・オリエンタリスNRRL18099（凍結乾燥し
たペレツトまたは液体窒素中に保持した懸濁液のいずれ
かとして）を、実施例２に記載の方法（但し生産培地は
次の組成を有する）により培養する。

成分：グルコース1.0％；ポテトデキストリン2.0％；ペプト
ン^＊1.0％；炭酸カルシウム0.2％；廃糖蜜2.0％；脱イ
オン水を加えて全量１。

pHを調節しない。注）^＊バクト−ペプトン（Bacto
−peptone（デイフコ・ラボラトリーズ（Difco Laborat
ories））。

実施例４培養菌株A82846.2を用いる抗生物質A82846の製造：− 培養菌株ノカルジア・オリエンタリスNRRL18100（凍
結乾燥ペレツトまたは液体窒素中に保持した懸濁液のい
ずれかとして）を、実施例２に記載の方法（ただし用い
た酸加水分解カゼインはアミカーゼ（Amicase,シエフイ
ールド・ケミカル・カンパニー）である）により、培養
する。

実施例５粗A82846の製造：− 実施例２のＣ項記載のように製造された1600ガロン発
酵容器から得られた発酵液4200Lを、5N水酸化ナトリウ
ムでpH10.5に調節し、３％セライト545（過助剤）を
加える。混合物をフイルタープレスに通して過し、プ
レスを水洗する。液と洗液（4200L）を合して5N塩酸
（または硫酸）でpH7に調節し、ダウエツクス−XFS−43
278（NH₄ ⁺）樹脂カラム（液200L/樹脂10L）に適用す
る。このカラムを流速750mL/分で溶離する。各分画をバ
チルス・スブチリス（Bacillus substilis）による生物
試験法またはHPLCのいずれかで試験する。

カラムを５カラム容量の水で洗い、残部100L分画を集
める。

５カラム容量の0.05N水酸化アンモニウムで樹脂から
活性物質を溶離し、25L分画を集める。A82846を含む分
画を合して減圧下、約30L容に濃縮する。この溶液を、
水中ダイアイオン（Diaion）HP−20樹脂の10Lカラムに
適用する。このカラムを、流速300mL/分の下に３カラム
容量の水で洗う。洗水を捨てる。1.0％酢酸を含有する
水：イソプロパノール（95:5）溶液を用い、流速100mL/
分でカラムから活性物質を溶離し、4L分画を集め、生物
試験法およびHPLCで試験する。A82846（＃６−14）含有
分画を合して減圧下に濃縮し、凍結乾燥して356gの粗A8
2846を得る。

実施例６ A82846AおよびA82846Bの単離：− A.濃厚なA82846AおよびA82846Bの分離：− 実施例５で製せられたA82846（30g）を水500mLに溶解
し、１％リン酸二水素アンモニウム中加圧して平衡にし
たシリカゲルLP−1/C₁₈の30Lステンレススチールカラム
に適用する。１％リン酸二水素アンモニウム60Lから１
％リン酸二水素アンモニウム含有の水：アセトニトリル
（88:12）60Lの傾斜溶離剤を用い、流速250〜300mL/分
（最大圧力600psi）で、カラムを展開し、4L分画を集
め、254nmのUV検出器を用いて溶出液を監視する。各分
画を分析的HPLCで試験する。A82846Aに富む分画（＃６
〜９）とA82846Bに富む分画（＃10〜17）それぞれを合
し、減圧下に濃縮する。

B.A82846Aの精製：− 前記Ａ項記載のように処理した１回の操作30gの２回
分から得られたA82846Aに富む濃厚物を、ダイアイオンH
P−20SSの1750mLカラム上で脱塩、水洗し、0.5％酢酸含
有の水：イソプロパノール（95:5）で溶離し、分析的HP
LCにより試験する。A82846Aを含む分画を合して濃縮
し、凍結乾燥してA82846Aに富む生成物7.4gを得る。

A82846Aに富む生成物7.2gを水に溶解し、１％リン酸
二水素アンモニウム中シリカゲルLP−1/C₁₈のプレパラ
テブHPLCカラムに適用する。１％リン酸二水素アンモニ
ウムから１％リン酸二水素アンモニウム：アセトニトリ
ル（9:1）の傾斜溶離剤を用いてカラムを展開し、分析
的HPLCによる溶出液を254nmで監視しながら流速48mL/分
で溶離する。最初の10Lを溶離した後、500mL分画を集め
る。

A82846Aを含む分画（＃４〜10）およびA82846Bを含む
分画（＃12〜20）それぞれを合し、減圧下に濃縮する。
３回の操作で得られたA82846Aの濃厚物を合し、ダイア
イオンHP−20SSの1750mLカラムに適用して溶液を脱塩す
る。カラムを水洗し、0.5％酢酸含有の水：イソプロパ
ノール（95:5）で溶離する。HPLCで溶出液を監視する。
A82846Aを含む分画を合して濃縮し、凍結乾燥して純品A
82846A7.9gを得る。

KBrデイスク中A82846AのIRスペクトルを図1;チオグリ
セロール中A82846AのFAB−MSを図4;ブラツカー（Bruke
r）AM500分光計（HDO抑制）を用いて（メチルスルホキ
シド）−d₆中（60℃）、A82846A塩酸塩のNMRスペクトル
を図７に示す。

C.A82846Bの精製：− 前記Ｂ項記載のようにプレパラテイブHPLCの操作３回
でA82846AとA82846Bを分離して得られたA82846Bに富ん
だ分画を合し、ダイアイオンHP−20SSの1750mLカラム上
で脱塩し、水洗して0.5％酢酸含有の水：イソプロパノ
ール（95:5）で溶離する。溶出液をHPLCで監視し、この
A82846B分画を合して減圧下に濃縮し、凍結乾燥してA82
846B純品8.8gを得る。

KBrデイスク中A82846BのIRスペクトルを図2;チオグリ
セロール中A82846BのFAB−MSを図5;ブラツカー（Bruke
r）AM500分光計を用いて（メチルスルホキシド）−d₆中
（60℃）、A82846B酢酸塩のNMRスペクトルを図８に示
す。

D.脱塩：− ダイアイオンHP−20樹脂を用い、0.1％酢酸含有のメ
タノール：水（4:1）で溶離し、脱塩することもでき
る。

実施例７ A82846Cの単離：− A.A82846の分離：− 実施例２・Ｂ項のように処理した165L発酵４回から得
られた発酵液461Lを、5N水酸化ナトリウムでpH10.5に調
節し、３％ハイフロ・スーパーセル（Hyflo Supercel）
過助剤で過する。液430Lを5N塩酸でpH7に調節
し、ダウエツクス（Dowex）−XFS−43278（NH₄ ⁺）樹脂
を含むカラムに適用する。カラムを水50Lで洗い、0.05N
水酸化アンモニウム50Lで活性物質を溶離し、4L分画を
集める。溶出液を生物試験法で監視する。活性分画（＃
１〜７）を合して減圧下、約1700mL容に濃縮し、凍結乾
燥して粗A82846（283.9g）を得る。

B.A82846A、ＢおよびＣの分離：− 前記Ａ項で得られた粗A82846（2g）を水に溶解し、１
％リン酸二水素アンモニウム中、シリカゲルLP−1/C₁₈
樹脂2110mL含有の２″×45″ステンレススチール製プレ
パラテブHPLCカラムに適用する。１％リン酸二水素アン
モニウムから１％リン酸アンモニウム：アセトニトリル
（92:8）の傾斜溶離剤を用い、流速70mL/分でカラムを
展開し、400mL分画を集め、254nmのUVで監視する。

A82846Aを含む分画（＃11〜14）を合してプール１と
し;A82846Cを含む分画（＃16〜20）を合してプール２と
し、A82846Bを含む分画（＃21〜25）を合してプール３
とする。

C.A82846Cの精製：− プール２と約200mL容に濃縮し、脱塩するため、ダイ
アイオンHP−20樹脂1800mL含有の７×45cmグラスカラム
に適用する。0.1％酢酸含有のメタノール：水（4:1）を
用い、流速25mL/分で活性物質を溶離し、1L分画を集め
る。Ｃ含有分画（＃９〜12）を合して減圧下に濃縮し、
凍結乾燥して半精製A82846C（662.2mg）を得る。

シリカゲルLP−1/C₁₈（450mL）含有の１″×48″スチ
ールカラム上、１％リン酸二水素アンモニウムから１％
リン酸二水素アンモニウム：アセトニトリル（92:8）の
傾斜溶離剤を用い、流速11mL/分で逆相HPLC操作を反復
し、25mL分画を集め、254nmで監視することにより、上
記半精製A82846C（500mg）を更に精製する。A82846C含
有分画（＃169〜210）を合し、HP−20樹脂を含む５×45
cmのグラスカラム上で脱塩する。このカラムを0.1％酢
酸含有メタノール／水（4:1）で溶離し、100mL分画を集
め、分析的HPLC上、225nmのUVを用いて溶離を続ける。A
82846Cを含む分画（＃５〜11）を合して減圧下に濃縮
し、凍結乾燥してA82846C（127.3g）を得る。

A82846Aを含むプール１およびA82846Bを含むプール３
を上記A82846Cの精製と同様の方法で精製し、更にA8284
6AおよびA82846B純品を得る。

D.更にA82846Cの精製：− 下記プレパラテブクロマトグラフイ操作によりA82846
C（70mg）を更に精製する。

カラム：ゾルバツクスSCX（9.2×250mm）陽イオン交換移動相:10％メタノール含有の0.15Mリン酸二水素ナトリ
ウム緩衝液から出発して10％メタノール含有の0.9Mリン
酸二水素ナトリウム緩衝液に到る線型傾斜溶離剤（６分
間移動、５分間保持、緩衝液に対して無調節）流速:6.0mL/分検出:280nmのUV 負荷:6.0mg/水中注入ピーク検出機構を備えた自動フラクシヨンコレクター
（Gilson 201C）を用いてA82846Cを集める。移動相をミ
リポア・ウオーターズ（Millipore Waters）M600傾斜溶
離HPLC系で供給し、試料溶液を日立（Hitach）オートサ
ンプラーにより注入する。

A82846Cを含む分画を合して30mL容に濃縮し、HP−20
カラム（50mL）に適用する。カラムを水洗し、0.5％酢
酸含有の水：イソプロパノール（95:5）で溶離し、25mL
分画を集める。A82846C含有分画（＃９〜14）を合して
濃縮し、凍結乾燥してA82846C純品37mgを得る。

KBrデイスク中A82846CのIRスペクトルを図3;チオグリ
セロール中A82846CのFAB−MSを図6;およびブラツカーAM
500分光計（HPO抑制）上、（メチルスルホキド）−d₆中
（60℃）、A82846C酢酸塩のNMRスペクトルを図９に示
す。

実施例８ A82846塩の製造：− 操作：それぞれの場合において、A82846成分（100mg）
を脱イオン水（10mL）に溶解する。この溶液を0.5N酸
（塩酸、硫酸およびリン酸）でpH約３に調節する。溶液
を凍結乾燥して相当の塩型化合物を得る。もしpH3より
非常に低く（すなわちpH2）なれば成分の品質が低下す
ることに注意することが重要である。

収量(mg) 塩 A82846A A82846B 塩酸塩 93.8 88.1 硫酸塩 92.5 75.4 リン酸塩 110.8 105.7 実施例９ A82846A錠剤の製造：− 下記成分と量によりA82846A含有錠剤を製造する。

成分： A82846Aリン酸塩282.9mg;微結晶セルロース101.1mg;
クロスカルメロース・ナトリウム12.0mg;プロビドン12.
0mg;ステアリン酸マグネシウム3.0mg;ステアリン酸4.0m
g;純水0.16mL。

注）クロスカルメロース（croscarmellose）；プロビド
ン（providone）。

A82846Aリン酸塩、微結晶セルロースの一部およびク
ロスカルメロース・ナトリウムの一部を適当な容器に入
れ、均質になるまで混和する。プロピドンの水溶液を製
し、このプロピドン溶液を上記粉末混合物に加える。得
られた混合物を顆粒化し、必要に応じて計測し、乾燥す
る。この乾燥混合物に微結晶セルロース残部とクロスカ
ルメロース・ナトリウム残部を加え、混和する。ステア
リン酸マグネシウムとステアリン酸を加え、この混合物
を混和し、得られた粉末を圧縮して錠剤を製造する。

実施例10 A82846Bカプセル剤の製造：− 下記成分と量によりA82846B含有カプセル剤を製造す
る。

成分： A82846B塩酸塩262.2mg;流動性コーンスターチ粉末13
7.7mg;シリコーン液体350センチストロークス2.7mg;コ
ーンスターチ147.1mg。

A82846B塩酸塩、流動性コーンスターチ粉末、シリコ
ーン液体350センチストロークスおよびスターチ粉末を
適当なミキサー中、均質になるまで混和する。適当なサ
イズの硬質ゼラチンカプセルに充填する。

実施例11 A82846A懸濁薬の製造：− 結晶化または沈殿により、A82846Aの滅菌不溶性型薬
剤を製造する。粉砕または篩別けして懸濁薬に適する粒
形の大きさにする。下記賦形剤中にA82846Aを懸濁す
る。

成分：レシチン１％；クエン酸ナトリウム２％；プロピルパ
ラベン0.015％；注射用水、所望の容量になる量。

懸濁液をばらで、またはバイアルに充填するか、もし
くはバイアル中のA82846Aに上記賦形剤を即席的に加え
ることにより懸濁薬を製造する。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第３図は各々A82846A、A82846Bお
よびA82846CのKBr法によるIRスペクトルを、第４図、第
５図および第６図は各々A82846A、A82846BおよびA82846
CのFAB−質量スペクトルを、並びに第７図、第８図およ
び第９図は各々A82846A、A82846BおよびA82846CのNMRス
ペクトルを示している。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:365） (72)発明者デビッド．フランシス．マホニーアメリカ合衆国インディアナ46260、インディアナポリス、ベクテル．ロード 1927番 (72)発明者ウォルター．ミツオ．ナカツカサアメリカ合衆国インディアナ46217、インディアナポリス、アイアン．リージ. ロード1517番 (72)発明者レイモンド・チー―フォン・ヤオアメリカ合衆国インディアナ46032、カーメル、ホーソーン・ドライブ987番

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の構造式：［式中、ＸがＨであるとき、ＹはClであり（A82846A）;
XがClであるとき、ＹはClであり（A82846B）；およびＸ
がＨであるとき、ＹはＨである（A82846C）］を有する、抗生物質A82846A、A82846BおよびA82846Cか
らなる群から選択されるグリコペプチド抗生物質または
その薬理学的に許容される塩類。
【請求項２】抗生物質A82846Aまたはその薬理学的に許
容される塩類である特許請求の範囲第１項記載の抗生物
質。
【請求項３】抗生物質A82846Bまたはその薬理学的に許
容される塩類である特許請求の範囲第１項記載の抗生物
質。
【請求項４】抗生物質A82846Cまたはその薬理学的に許
容される塩類である特許請求の範囲第１項記載の抗生物
質。
【請求項５】適当な培地中、液中好気的条件下に実質的
量の抗生物質活性が生産されるまでノカルジア・オリエ
ンタリスNRRL18098、18099または18100またはそのA8284
6A産生後代菌を培養することにより製造される特許請求
の範囲第１項記載の抗生物質A82846A。
【請求項６】適当な培地中、液中好気的条件下に実質的
量の抗生物質活性が生産されるまでノカルジア・オリエ
ンタリスNRRL18098、18099または18100またはそのA8284
6B産生後代菌を培養することにより製造される特許請求
の範囲第１項記載の抗生物質A82846B。
【請求項７】適当な培地中、液中好気的条件下に実質的
量の抗生物質活性が生産されるまでノカルジア・オリエ
ンタリスNRRL18098、18099または18100またはそのA8284
6C産生後代菌を培養することにより製造される特許請求
の範囲第１項記載の抗生物質A82846C。
【請求項８】同化しうる炭素源、窒素源および無機塩源
を含む培地中、液中好気的発酵条件下にノカルジア・オ
リエンタリスNRRL18098、NRRL18099またはNRRL18100ま
たはそのA82846産生後代菌を培養し、必要に応じて発酵
培地から抗生物質を分離し、および／または該抗生物質
が塩型でないならばこの抗生物質を塩にすることを特徴
とする、以下の構造式：［式中、ＸがＨであるとき、ＹはClであり（A82846A）;
XがClであるとき、ＹはClであり（A82846B）；およびＸ
がＨであるとき、ＹはＨである（A82846C）］を有する、抗生物質A82846A、A82846BおよびA82846Cか
らなる群から選択されるグリコペプチド抗生物質または
その薬理学的に許容される塩類の製造法。
【請求項９】以下の構造式：［式中、ＸがＨであるとき、ＹはClであり（A82846A）;
XがClであるとき、ＹはClであり（A82846B）；およびＸ
がＨであるとき、ＹはＨである（A82846C）］を有する、抗生物質A82846A、A82846BおよびA82846Cか
らなる群から選択されるグリコペプチド抗生物質または
その薬理学的に許容される塩類を、薬理学的に許容され
る１またはそれ以上の担体と組み合わせて含有せしめ
た、菌類感染症治療用医薬組成物。
【請求項１０】以下の構造式：［式中、ＸがＨであるとき、ＹはClであり（A82846A）;
XがClであるとき、ＹはClであり（A82846B）；およびＸ
がＨであるとき、ＹはＨである（A82846C）］を有する、抗生物質A82846A、A82846BおよびA82846Cか
らなる群から選択されるグリコペプチド抗生物質または
その薬理学的に許容される塩類を、生理学上許容される
１またはそれ以上の担体と組み合わせて含有せしめた動
物用飼料プレミックス。