JPH09182581A - グリコペプチド抗生物質を産生する微生物 - Google Patents
グリコペプチド抗生物質を産生する微生物Info
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- JPH09182581A JPH09182581A JP8301665A JP30166596A JPH09182581A JP H09182581 A JPH09182581 A JP H09182581A JP 8301665 A JP8301665 A JP 8301665A JP 30166596 A JP30166596 A JP 30166596A JP H09182581 A JPH09182581 A JP H09182581A
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Abstract
物質A82846、その各個の成分A82846A、A
82846BおよびA82846Cを産生する新規微生
物の提供。 【解決手段】 同化しうる炭素源、窒素源および無機塩
源を含む培地中、液中好気的に発酵させることにより、
該新規グリコペプチド抗生物質を製造することができる
ノカルジア・オリエンタリス(Nocardia orientalis)N
RRL18098、NRRL18099およびNRRL
18100を提供する。
Description
新規グリコペプチド抗生物質を産生する微生物に関す
る。特に本発明は抗生物質A82846、その各個の成
分A82846A、A82846BおよびA82846
Cを産生する新規微生物に関する。
くの有益な抗生物質を入手することができるが、人間の
医薬用の改良された抗生物質を見いだすことの必要性は
なお続いている。たとえばバンコマイシンは商業的に成
功した抗生物質であって多くの生命を救った。しかしバ
ンコマイシンは、たとえば聴覚毒性および腎毒性のよう
な問題の原因となることもある。従って、バンコマイシ
ンと同様の活性を有し、改善された薬物動態学的性質、
またはより副作用が少ない抗生物質が要請されている。
うる炭素源、窒素源および無機塩源を含む培地中、ノカ
ルジア・オリエンタリス(Nocardia orientalis)NRR
L18098、NRRL18099またはNRRL18
100を液中好気的に発酵させることにより、大なる価
値を有するグリコペプチド抗生物質を製造することがで
きることが見いだされた。本発明者らはこれらのグリコ
ペプチド抗生物質を任意にA82846およびその各成
分として命名した。
イシンに類似するが、グラム陽性菌に対する試験管内お
よび生体内活性、並びにバンコマイシンの半減期より非
常に長い半減期に起因する薬物動態学的性質が改良され
たものである。
よび分光学的性質を有する。 A82846Aの特性:− 分子量:1556 実験式:C73H89N10O26Cl FAB−MS(チオグリセロール):(M+1)測定値15
57.5803、計算値C73H90N10O26Cl=155
7.5716(図4参照) UV(水)λmax:281nm(ε5,052)、基線から30
0nmシフト
1、1586、1552、1504、1410、134
0、1310、1230、1212、1132、106
6、1028、1015cm-1(図1参照) NMR[(CD3)2SO]:図7参照 pKa(水):4.7、9.5、および(66%DMF)5.5、
6.8、7.9、9.4、12.3 (見掛けの分子量1542)
1.5315、計算値C73H89N10O26Cl2=1591.
5327(図5参照) UV(水)λmax:280nm(ε5,192)、基線から30
0nmシフト
2、1504、1403、1264、1230、113
5、1105、1065、1023、1018cm-1(図
2参照) NMR[(CD3)2SO]:図8参照 pKa(水):4.65、9.5
45.5998計算値C73H90N10O26Na=1545.
5925(図6参照) UV(水)λmax:280nm(ε5,198)、基線から30
0nmシフト
2999、2991、2950、1687→1650
(広い)、1585、1570、1509、1503、1
453、1449、1402、1212、1130、1
102、1060、1032、1014cm-1(図3参照) NMR[(CD3)2SO]:図9参照 pKa(水):4.6、9.4
A、A82846BおよびA82846Cのアミノ酸分
析の結果は、アスパラギン酸ならびに微量のグリシンに
符号する2個の広いピークの存在を示した。この2個の
ピークはアクチノイジン性(actinoidinic)およびバンコ
マイシン性(vancomycinic)アミノ酸(この2個は、バン
コマイシン類のグリコペプチド類中に存在する)に対応
するものと考えられる。
A82846BおよびA82846Cがそれぞれ次の新
規アミノ糖4−epi−バンコサミン(3−メチル−アコサ
ミン)を含むことが見いだされた:
の分子式(C66H75N9O24Cl2)の塩素原子が1個少な
く、追加的にバンコサミン型アミノ糖(C7H14NO2)要
素が多い分子式に対応する。A82846Bの分子式
は、水素原子1個が塩素原子1個で置換されたA828
46Aの分子式に対応する。A82846Cの分子式
は、塩素原子が水素で置換されたA82846Aの分子
式に対応する。
マイシン分子に似ているが、主として塩素含量が異な
り、追加的にバンコサミン組成を有する部分単位1個が
存在することで異なる新規グリコペプチド類の構造を有
するものと考えられる。
考えられる:
まだ決定されていない。A82846およびその各個の
成分A82846A、A82846BおよびA8284
6Cは、これを反応させて種々の塩を形成させることが
できる。これらの塩型抗生物質はすべて本発明の一部で
ある。これらのA82846塩は、たとえばA8284
6を分離および精製するのに有用である。加うるに塩類
は水に対して改良された溶解性を有する。
られる。たとえばA82846を適当な酸で中和して酸
付加塩を形成させることができる。
な塩は、有機酸または無機酸の双方たとえば硫酸、塩
酸、リン酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、マレイ
ン酸、フマル酸、コール酸、パモン酸、粘液酸、D−グ
ルタミン酸、d−ショウノウ酸、グルタール酸、グリコ
ール酸、フタル酸、酒石酸、ギ酸、ラウリン酸、ステア
リン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、安息香酸、桂皮酸お
よび同様の酸などのような酸との標準的反応により形成
される塩を包含する。薬理的に許容される酸付加塩は、
本発明の特に好ましい塩類である。
液中好気的条件下にノカルジア・オリエンタリスのA8
2846産生菌株を、実質的抗生物質活性が生成するま
で培養することにより製造することができる。この抗生
物質を、この技術分野で理解される種々の分離および精
製方法で回収することができる。
NRRL18098、ノカルジア・オリエンタリスNR
RL18099、ノカルジア・オリエンタリスNRRL
18100またはこれらの菌株のA82846産生突然
変異菌株、変異菌株もしくは遺伝子組換え菌株(recombi
nant)から選ばれた生物学的に純粋な培養菌株に関す
る。これらの微生物は、抗生物質A82846を産生す
るので有用である。以下便宜上、NRRL18098菌
株を培養菌株A82846、NRRL18099菌株を
培養菌株A82846.1およびNRRL18100菌
株を培養菌株A82846.2と呼称する。培養菌株A
82846はハイチ(Haiti)の土壌試料から単離され
た。培養菌株A82846.1は化学的突然変異誘導(ch
emical mutagenesis)により得られた菌株、培養菌株A
82846.2は培養菌株A82846から単離された
自然的変異菌株である。
およびA82846.2は、米国イリノイ州61604
ペオリア、ノース・ユニバーシティ・ストリート181
5在米国農務省農業研究部ミドウエスト・エアリア・ノ
ーザン・リージョナル・リサーチ・センター(Midwest
Area Northern Regional Research Center)に、1
986年8月8日寄託し、そのストック・カルチュア・
コレクションの一部を構成する。これらの培養菌株は、
受理番号NRRL18098(A82846、親菌株)、
NRRL18099(A82846.1、突然変異菌株)
およびNRRL18100(A82846.2、変異種菌
株)として公的に入手することができる。
およびA82846.2の分類学上の(taxonomic)研究は
リリー研究所(Lilly Research Laboratories)のフレ
デリック・ピー・メルツ(Frederick P.Mertz)が行
なった。この研究に基づき、新規微生物を、ノカルジア
・オリエンタリス(Pittenger and Brigham 1956)
プリダム・アンド・ライオンズ(Pridham and Lyons)
1969年タイプ・ストレイン:ATCC19795菌
株として分類された[ピッテンガー(R.C.Pittenge
r)およびブリガム(R.B.Brigham)“ストレプトミセ
ス・オリエンタリスn.sp.,ザ・ソース・オブ・バンコ
マイシン(Streptomyces orientalis n.sp.,the Sou
rce of Vancomycin)"アンチバイオテックス・アンド・
ケモセラピイ(Antibiotics and Chemotherapy)第6巻
642〜647頁(1956年)]。この分類は、下記文
献に記載の研究所の直接的比較と実験に基づくものであ
る。
ミネイテブ・バクテリオロジィ(Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology)第8版、ブチャナン
(R.E.Buchanan)およびギボンズ(N.E.Gibbon
s)編、ザ・ウイリアムズ・アンド・ウイルキンズ・カン
パニー(The Williams and Wilkins Co.(バルチモ
ア,1974年)刊;
シャール(K.P.Schaal)著“アイデンテフィケイシ
ョン・メソッズ・フォー・ノカルジア・アクチノマデュ
ラ・アンド・ロドコックス(Identification Methods
for Nocardia,Actinomaduraand Rhodococcus)"(ア
イデンテフィケイション・メソッズ・フォー・ミクロバ
イオロジスツ(Identification Methods for Microbi
ologists)第2版、スキナー(F.A.Skinner)および
ラブロック(D.W.Lovelock)編、ソサエティ・フォ
ー・アプライド・バクテリオロジィ・テクニカル・シリ
ーズ(Society for Applied Bacteriology Technica
l Series)No.14、アカデミック・プレス社(Academ
ic Press,Inc.)、ニューヨーク1979年刊、26
1頁));
(D.A.Barnett)、ハンダーハン(J.E.Handerha
n)およびパング(C.H.Pang)著“ノカルジア・コエ
リアカ、ノカルジア・アウトトロピカ・アンド・ザ・ノ
カルジン・ストレイン(Nocardia coeliaca,Nocardia
autotrsphica,and the Nocardin Strain)"インター
ナショナル・ジャーナル・オブ・システマテカル・バク
テリオロジィ(Int.J.Syst.Bacteriol.)第24
(1)巻54〜63頁(1974年);
K.Mishra)およびバーネット(D.A.Barnett)著
“サム・ビッツ・アンド・ピーセス・オブ・ザ・ジーナ
ス・ノカルジア:ノカルジア・カルネア、ノカルジア・
ワクシニイ、ノカルジア・トランスバレンシス、ノカル
ジア・オリエンタリスおよびノカルジア・アエロコロニ
ゲネス(Some Bits and Pieces of the Genus Noca
rdia:N.carnea,N.Vaccinii,N.transvalensi
s,N.orientalis,and N.aerocolonigenes)"ジャー
ナル・オブ・ゼネラル・ミクロバイオロジィ(J.Ge
n.Microbiol.)第109巻69〜78頁(1978
年);
E.Gordon)およびバーネット(D.A.Barnett)著"
アイデンテフィケイション・オブ・ノカルジアエ・アン
ド・ストレプトミセス・オブ・メディカル・インポータ
ンス(Identification of Nocardiae and Streptomyc
es of Medical Importance)"ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・ミクロバイオロジィ(J.Clin.Microbio
l.)第11(6)巻728〜736頁(1980年);
ルダルスキ(M.Mordarski)著“ケモタキソノミク・キ
ャラクターズ・アンド・クラシフィケイション・オブ・
サム・ノカルジオホルム・バクテリア(Chemotaxonomic
Characters and Classification of Some Nocardi
oform Bacteria)"ジャーナル・オブ・ゼネラル・ミク
ロバイオロジィ(J.Gen.Microbiology)第71巻7
7〜86頁(1972年);および
Kawato)“オン・ストレプトミセス・アエロコロニゲネ
スnov.sp.ホーミング・ザ・セカンダリィ・コロニー
ズ・オン・ザ・エアリアル・マイセリア(On Streptom
yces aerocolonigenes nov.sp.,Forming the Secon
dary Colonies on the Aerial Mycelia)"ボタニカル
・マガジン・トウキョウ(Bot.Mag.Tokyo)第73巻
213〜216頁(1960年)]
の述べる方法は、ザ・インターナショナル・ストレプト
ミセス・プロジェクト(the International Streptomy
ces Project(ISP))により推奨される方法[シャーリ
ング(E.B.Shirling)およびゴットリーブ(D.Got
tlieb)著“メソッズ・フォー・キャラクタリゼイション
・オブ・ストレプトミセス・スピーシーズ(Methods fo
r Characterization of Streptomyces Species)"イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマテカル
・バクテリオロジィ(Int.J.Syst.Bacteriol.)
第16巻313〜340頁(1966年)]、ノカルジア
属の種の分類特性は、ゴルドン、バーネット、ハンダー
ハンおよびパング(Gordon, Barnett, Handerhan and
Pang)[上記文献]により推奨される方法である。
を行なった。胞子表面外観を研究するため走査電子顕微
鏡(SEM)を用いた。
抗性は、ゴルドンにより推奨される方法により測定した
[ゴルドン(R.E.Gordon)およびバーネット(D.
A.Barnett, )著“レジスタンス・ツー・リファムピ
ン・アンド・リゾチーム・オブ・ストレインズ・オブ・
サム・スピーシーズ・オブ・ミクロバクテリウム・アン
ド・ノカルジア・アズ・ア・タキソノミック・ツール
(Resistance to Rifampinand Lysozyme of Strains
of Some Species of Mycobacterium and Nocardia
as a Taxonomic Tool)"インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・システマテック・バクテリオロジィ(In
t.J.Syst.Bacteriol.)第27(3)第176〜1
78頁(1977年)]。
ントロイド・カラー・チャート(Centroid Color Cha
rts)・標準試料No.2106(ワシントンD.C.米国
商務省標準局(National Bureau of Standards)(19
58年))、およびカラー・ハーモニイ・マニュアル(Co
lor Harmony Manual)第4版(イリノイ州シカゴ在コン
テナ−・コーポレイション・オブ・アメリカ(Containe
r Corporation of America)(1958年)を用いた。
ISP No.1(トリプトン−酵母エキス液)、ISP
No.6(ペプトン−酵母エキス鉄寒天)およびISP N
o.7(チロシン寒天)培地を用いて決定した。
ン酸(DAP)の異性体および炭水化物は、ベッカーら
[ベッカー(B.Becker)、レチエバリアー(M.P.Le
chevalier)、ゴルドン(R.E.Gordon)およびレチエ
バリアー(H.A.Lechevalier)著“ラピッド・デファ
レンシエイション・ビトウイン・ノカルジア・アンド・
ストレプトミセス・バイ・ペーパー・クロマトグラフィ
ー・オブ・ホール−セル・ハイドロリセーツ(Rapid D
ifferentiation between Nocardia and Streptomyces
by Paper Chromatography of Whole−cell Hydrol
ysates)"アプライド・ミクロバイオロジー(Appl.Mic
robiol)第12巻421〜423頁(1964年)]および
レチエバリアー[レチエバリアー(M.P.Lechevalie
r)“アイデンテフィケイション・オブ・エアロビック・
アクチノミセテス・オブ・クリニカル・インポータンス
(Identification of Aerobic Actinomycetes of Cl
inical Importance)"ジャーナル・オブ・ラボラトリィ
・アンド・クリニカル・メディシン(J.Lab.Clin.
Med.)第71巻934〜944頁(1968年)]のクロ
マトグラフィーにより確定した。
づく方法により試験した[マンニキン(D.E.Minniki
n)、ハッチンソン(I.G.Hutchinson)およびカルジ
コット(A.B.Caldicott)著“シン−レイヤー・クロ
マトグラフィ・オブ・メタノリセーツ・オブ・ミコリク
・アシッド−コンテイニング・バクテリア(Thin−Lay
er Chromatography of Methanolysates of Mycolic
Acid−ContainingBacteria)"ジャーナル・オブ・ク
ロマトグラフィ(J.Chromatography)第188巻22
1〜233頁(1980年)]。
ビク記載の方法により試験した[ブラゼビク(D.J.B
lazevic)およびエデラー(G.M.Ederer)著“プリン
シプルス・オブ・バイオケミカル・テスツ・イン・ダイ
アグノスチク・ミクロバイオロジィ(Principles of B
iochemical Tests in Diagnostic Microbiology)"ジ
ョン・ウイリイ・アンド・サンズ社(Jhon Wiley and
Sons,Inc.)ニューヨーク1975年刊、136頁]。
プロテイナーゼ活性を測定するため、ゼラチン液化法を
用いた。
2寒天プレートに接種し、そのプレート上、抗生物質感
受性ディスクのパッド法により測定した。
殿粉)寒天プレート上、殿粉の存在をヨウ素で試験する
ことにより測定した(ブラゼビクおよびエデラー上掲参
照)。
加水分解をすみやかに検出するバクト分別ディスク(Ba
cto Differentiation Disks)を使用することにより測
定した。
するすべての複合および限定培地によく発育する。これ
らの培養菌株はほとんどの培地上で気生菌糸体を産生す
る。気生胞子塊の色は培地により白色または灰色であ
る。多くの培地上で特有の可溶性褐色色素を産生し、裏
面は褐色ないし黄色味を帯びた白色である。
培地上で発育するが、その発育は親菌株に比してそれ程
豊富ではない。A82846.1はまれに気生菌糸体を
産生する。産生したその菌糸体の色は白色である。数種
の培地に時折、目立たない淡褐色の可溶性色素を産生
し、裏面は褐色ないし黄色味を帯びた白色である。
およびA82846.2の培養特性を表1に要約する。
培養菌株A82846とA82846.2は、数種の培
養特性だけが異なるが、非常に類似している。この類似
性の故に、またA82846.2はA82846の自然
変異種であるから、更に比較は行なわなかった。
846.2は、広範な基底菌糸体(substratemycelium)を
産生する。個別の菌糸は長鎖状の分生子を形成して蜘蛛
の巣状の外観を有し、バーギイス・マニュアル・オブ・
デタミネイテブ・バクテリオロジィ(Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology、前掲)における非
ストレプトミセテスの特性として分類される。
は平滑で円筒状である。胞子の大きさはA82846が
1.2〜1.3×0.4〜0.5μM、A82846.1が
1.4〜2.2×0.3〜0.4μMである。
846は最少の断片を現わし、A82846.1は広範
に断片を現わし、A82846.2は中程度の断片を現
わす。
ビノース、セロビオース、デキストラン、フルクトー
ス、ガラクトース、グルコース、α−メチル−D−グル
コシド、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マ
ルトース、マンニトール、マンノース、メリビオース、
ラムノース、リボース、シュクロース、トレハロースお
よびキシロースから酸を生成するか、アドニトール、セ
ルロース、ズルシトール、エリスリトール、イヌリン、
ソルビトールおよびキシリトールから酸を生成しない。
またA82846はエタノール、グリコーゲン、メレチ
トース、ラフィノースおよびサリシンから酸を生成する
が、A82846.1は生成しない。双方の培養菌株は
アセテート、シトレート、ラクテート、マレート、オキ
サレート、プロピオネート、ピルベートおよびスクシネ
ートを利用するが、ベンゾエート、ムケートおよびター
トレートを利用しない。培養菌株A82846.1はブ
チレートを利用するがA82846は利用しない。
ゼイン、ヒポキサンチン、チロシン、尿素およびDNA
を分解するがアデニン、リンゴ酸カルシウムまたはキサ
ンチンを分解しない。双方の培養菌株は殿粉を加水分解
するが、エスクリンまたはヒップレート、還元ナイトレ
ート、液化ゼラチンを加水分解しない。50℃で8時間
生き残り、カタラーゼ、硫化水素およびホスファターゼ
を産生する。
6.1は、同一の抗生物質抵抗パターンを有する。これ
らは、バシトラシン(10単位)、セファロチン(30μ
g)、ゼンタマイシン(10μg)、リンコマイシン(2μ
g)、オレアンドマイシン(15μg)、ペニシリンG(10
単位)、ストレプトマイシン(10μg)、バンコマイシン
(30μg)、トブラマイシン(10μg)、エリスロマ
イシン(15μg)、ナリジキシン酸(30μg)、ポリミキ
シンB(300単位)、トリメトプリム(5μg)およびス
ルファジアジン(300μg)に対して抵抗性を有し、ネ
オマイシン(30μg)、リファムピン(5μg)、テトラサ
イクリン(30μg)、クロラムフェコール(30μg)、ノ
ボビオシン(30μg)およびマンデルアミン(3μg)に対
して感受性を有する。
れぞれグラム染色される(+)が、抗酸性染色されない。
A82846はメラノイド色素を産生するが、A828
46.1は産生しない。
ン酸のメソ異性体およびその糖類、アラビノースおよび
ガラクトースを含む。この培養菌株は、ベッカー(Beck
er)ら(前掲)によるタイプIV細胞壁を有する。糖パター
ンはタイプAである(レッチャバリヤー(Lechavalier)
前掲)。この培養菌株はミコール酸(LCN−A)を産生
しない。
特性は、そのノカルジア(Nocardia)属トレビサン(Tre
visan)1889への帰属に矛盾しない[スカーマン(V.
B.D Skerman)、マクガバン(V.McGowan)および
スニース(P.H.A.Sneath)編“アプルーブド・リ
スツ・オブ・バクテリアル・ネームス(Approved List
s of Bacterial Names)"インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・システマテカル・バクテリオロジィ(In
t.J.Syst.Bacteriol.)第30巻225〜420
頁(1980年)]。
don)、ミシュラ(Mishra)およびバーネット(Barnett)
により公表(前掲)されている]およびリリー・カルチュ
ア・コレクション(Lilly culture collection)から得
られた5種の菌株の特性から、類似性係数(similarity
coefficients)を計算した。ジャガード係数(coefficien
t of Jaccard[スニース(P.H.A.Sneath)著“ジ
・アプリケイション・オブ・コンピューターズ・ツウ・
タキソノミイ(The Application of Computers to T
axonomy)"ジャーナル・オブ・ゼネラル・ミクロバイオ
ロジィ(J.Gen.Microbiol.)第17巻201頁(1
957年)参照]、および単純符号係数(simple matching
coefficient)[ソカル(R.R.Sokal)およびミチナー
(C.D.Michener)著“ア・スタテステカル・メソッ
ド・フォー・エバリュエーテング・システマテク・リレ
ーションシップス(A Statistical Method for Eval
uating Systematic Relationships)"キャンザス・ユ
ニバーシティ・サイエンス・ブリテン(Kan.Univ.S
ci.Bull.)第38巻1409頁(1958年)参照]を
用いた。これらの比較結果を表2に示す。
nomadura)属に移されたので、これは考察から除外し
た。N.アエロコロニゲネスおよびN.オリエンタリス
の2種は、良好な類似性係数を有する。A82846と
これら2種の実験室的比較を行なった。比較結果を表3
に示す。
を計算した。その結果を表4に要約する。
ネスもその細胞壁中にミコール酸が存在しない。ゴルド
ン(前掲)は、N.オリエンタリスとN.アエロコロニゲ
ネスの区別を助けるための鍵となる要点として3つの特
性を述べている。ゴルドンの要点特性を用いたA828
46とノカルジア属の2種の比較結果を表5に示す。
ロ コロニゲネスの要点特性の比較 エリスリ Me−α− リゾチーム 菌 株 名 トール グリコシド に対する から酸の生成 抵抗性 A82846 − + + N.オリエンタリス + + − N.アエロコロニゲネス − − +
菌株の要点特性とも完全に一致しないが、A82846
は、培養特性およびN.オリエンタリスとの高い類似性
係数の点で、N.オリエンタリスへの近似性がより大で
ある。またA82846は、これがグリコペプチド抗生
物質を産生するという点でN.オリエンタリスに似てい
る。それ故、A82846は、ノカルジア・オリエンタ
リス(ピッテンガー・アンド・ブリガム(Pittenger and
Brigham)1956)プリダム・アンド・リオンズ(Pri
dham and Lyons)1969の菌株として分類される。
N.オリエンタリスは、アプルーブド・リスツ・オブ・
バクテリアル・ネームス(前掲)中に認知されているの
で、確実な根拠で公表された種である。
846の化学的に誘導された突然変異菌株である。A8
2846.1がA82846と異なる特性を表6に示
す。
生物質活性の量において、A82846と異なる。これ
らの菌株の間の他の最も明らかな差異は、A82846
と異なりA82846.1が気生菌糸体と明確な可溶性
色素を産生しないことである。
2846の自然変異種である。それ故、A82846.
2の同定された特性は、A82846のそれと本質的に
同様である。A82846とA82846.2の間の主
要な差異は、振盪フラスコ中で発育させたとき、A82
846.2培養菌株はA82846培養菌株より有意に
多量の抗生物質A82846を生産することである。
2846生産菌株、ノカルジア・オリエンタリス(Noca
rdia orientalis)菌株NRRL18098、NRRL1
8099およびNRRL18100の特性は、変異種に
従属する。それ故、これらの菌株の後代(子孫)たとえば
遺伝子組換え変異種、突然変異種および変異種は、この
技術分野における公知方法により得ることができる。た
とえば変異種は自然的選択により得ることができ、突然
変異種は、種々の公知の物理的および化学的突然変異誘
導物(mutagen)、たとえば紫外線、X線、ガンマ線およ
びN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン
のような化学的突然変異誘導物で処理することにより得
ることができる。
よく知られた方法を用いノカルジア・オリエンタリス菌
株を形質転換することにより開発することができる。ノ
カルジア属とストレプトミセス属は類似しているので、
ストレプトミセス用に開発された形質転換法および組換
えベクターを、ノカルジア属菌株の形質転換にも使用す
ることができる。遺伝子組換え技術を用いることによ
り、ノカルジア・オリエンタリスが生産する抗生物質に
加え、これらの菌株を形質転換して多くの遺伝子産物を
発現させることができる。たとえばノカルジア・オリエ
ンタリス菌株が通常、感受性を有する抗生物質に対する
抵抗性を付与する組換えベクターを用いて該菌株を形質
転換することができる。かくて得られた形質転換体は、
A82846抗生物質自体ばかりでなく、形質転換され
た細胞野性型からの選択を可能にする抵抗性付与酵素を
も生産する。更に同様に技術を用い、この菌株を処理し
て内生的抗生物質生合成遺伝子の多くのコピーを導入
し、より多くの抗生物質収量を得るように改良すること
ができる。A82846生産特性を保持するノカルジア
・オリエンタリス菌株NRRL18098、NRRL1
8099およびNRRL18100の後代(子孫)菌、す
なわちその自然のまたは誘導された変異種、突然変異種
ならびに遺伝子組換え種は、本発明の一部を構成する。
育に使用する培地は、多くの培地のいずれかであること
ができる。しかし、生産上の経済性、最適収量および生
産、単離の容易さのため、ある種の培地が好ましい。こ
のように、たとえば大規模発酵における好ましい炭水化
物源は、グルコースおよびポテトデキストリンである
が、リボース、キシロース、フルクトース、ガラクトー
ス、マンノース、マンニトール、可溶性澱粉なども使用
することができる。
およびミートペプトン類であるが、酵母エキス、酸加水
分解カゼイン、牛肉エキス、魚粉、肝臓粉、その他も使
用することができる。
類中、亜鉛、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、
アンモニウム、クロリド、カーボネート、サルフエー
ト、ニトレートなどのイオンを供与することができる通
常の可溶性塩を包含する。
な必須微量元素を培地中に含有させるべきである。かか
る微量元素は、微生物の生長需要に適合するのに充分量
で培地の他の成分中に不純物として通常存在する。もし
発泡が問題であるならば、ポリプロピレングリコールの
ような消泡剤少量(すなわち0.2ml/L)を、大規模発
酵培地中に加えてもよい。
ため、タンクの液中好気的発酵が好ましい。少量の抗生
物質は振盪フラスコ培養により得ることができる。大型
タンクに胞子型の微生物を接種することに通常付随する
抗生物質生産における時間の遅れ(タイムラグ)の故に、
栄養接種物を用いるのが好ましい。栄養接種物は、少容
量の培地に胞子形微生物または菌糸体断片を接種し、微
生物の新鮮で活性を有する生長培養物を得ることにより
製造することができる。次いで、この栄養接種物を大型
タンクに移す。栄養接種物培地は、より大型の発酵のた
めに使用する培地と同様であってよいが、他の培地も適
当である。
生菌を約23〜37℃で生長させるとき生産される。A
82846生産のための最適温度は約30〜31℃であ
ると考えられる。
ように、培地を常套のタービン羽根車で撹拌する間、底
部から容器内に滅菌空気を吹込む。従来採用されていた
条件下の発酵における最大酸素吸収量は約0.2mM/L
/分を越えていなかった。一般的には通気速度および撹
拌速度は、溶解した酸素濃度を、飽和の50%またはそ
れ以上に保持するのに充分にするべきである。
に感受性を有することで知られた微生物に対する抗生物
質活性を監視するため、発酵の間、発酵液試料を試験す
ることにより製造を継続する。有用な供試微生物はバチ
ルス・スブテイリス(Bacillus subtilis)ATCC66
33である。生物試験法は寒天−くぼみ板(agar−well
plate)試験により行うのが好都合である。
技術分野において用いる方法により発酵培地からA82
846抗生物質を回収することができる。A82846
産生微生物の発酵の間、生成した抗生物質活性は、菌糸
体および発酵液の双方中に存在する。それ故、初めにp
H10.5に調節して菌糸体からA82846を分離
し、培地を濾過して菌糸体塊から発酵液を分離すること
により、A82846の最大量の回収を達成することが
できる。
82846を回収することができる。好ましい方法は、
濾過した発酵液をpH約7に調節し、これを陽イオン交
換樹脂、たとえばダウエックス(Dowax)XF5−432
78、ダウエックス−50またはアンバーライト(Ambe
rlite)IR−120に吸収させる方法を包含する。たと
えば希水酸化アンモニウム溶液のような適当な溶媒を用
い、上記樹脂から活性物質を溶離する。この活性分画を
減圧下に濃縮し、マクロレテイキュラー樹脂、たとえば
ダイアイオン(Diaion)HP−20およびアンバーライ
トXAD−4に吸着させ、水:イソプロパノール(95:
5)(1%酢酸含有)のような適当な溶媒で溶離してA8
2846を得る。また活性物質を、水:アセトニトリル
または水:メタノール混合物(少量の酸含有)で溶離する
こともできる。
個の成分A82846A、A82846BおよびA82
846Cに分離することができる。好ましい分離方法
は、逆相シリカゲル(C18またはC8)クロマトグラフィ
を包含する。
び菌糸体を含む培地固体を、抽出または分離することな
く好ましくは水を除いた後、使用することができる、た
とえばA82846を製造後、全発酵液を凍結乾燥、ド
ラム乾燥または共沸蒸留して乾燥することができる。次
いで、乾燥発酵液はこれをたとえば直接飼料プレミック
ス中に混合する。
菌に対して試験管内または生体内的にすぐれた活性を有
する。これらの抗生物質の特に予想外の特質は、長い血
清半減期である。たとえばラットに静脈内投与したと
き、バンコマイシンは45分の血清半減期を有するが、
A82846AおよびA82846Bはそれぞれ2.2
時間の半減期を有する。
制する最小抑制濃度(MIC's)を表7および表8に示
す。表7および表8中のMIC'sは標準寒天希釈試験法
で試験した。
ス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコックス・エ
ピデルミデス(Staphylococcus epidermidis)、ストレ
プトコックス・ピオゲネス(Streptococcus pyogene
s)、ストレプトコックス・プノイモニアエ(Streptococ
cus pneumoniae)、ヘモフイルス・インフルエンザエ(H
aemophilus influenzae)、エシエリヒア・コリー(Esch
erichia coli)、クレブシエラ・プノイモニアエ(Klebs
iella pneumoniae)、プソイドモナス・アエルギノサ(P
seudomonas aeruginosa)。
ス(Streptococcus salivaris)、ストレプトコックス・
サングイス(S.sanguis)、ストレプトコックス・ムタ
ンス(S.mutans)。
面は、その嫌気性菌に対する活性である。この活性を表
9に示す。表9は標準寒天−希釈試験法で試験した種々
の嫌気性菌に対するA82846AおよびA82846
Bの活性を要約したものである。24時間熟成後、終末
点と解釈した。
difficile)、C.ペルフリンゲンス(Clostridium per
fringens)、C.セプチクム(Clostridium septicum)、
E.アエロファシエンス(Eubacterium aerofaciens)、
P.アサッカロリテイクス(Peptococcus asaccharolyt
icus)、P.プレボテイ(Peptococcus prevoti)、P.
バリアビリス(Peptococcus variabilis)、P.コンス
テラツス(Peptococcus constellatus)、P.マグヌス
(Peptococcus magnus)、P.アナエロビウス(Peptost
reptococcus anaerobius)、P.インテルメデイウス(P
eptostreptococcus intermedius)、P.アクネス(Prop
ionibacterium acnes)。B.フラギリス(Bacteroides
fragilis)、B.テタイオタオミクロン(Bacteroides t
hetaiotaomicron)、B.メラニノゲニクス(Bacteroide
s melanilogenicus)、B.ブルガテイス(Bacteroides
vulgatis)、B.コロデンス(Bacteroides corroden
s)、F.シムビオスム(Fusobacterium symbiosum)、
F.ネクロフオルム(Fusobacterium necrophorum)。
実験的に誘導した感染に対する生体内抗菌活性を示す。
実験的に供試微生物に感染させたマウスに試験化合物を
2回投与したとき、観察された活性をED50値として測
定した[供試動物50%を保護する有効投与量(mg/kg):
ウオレン・ウイック(Warren Wick)ら著、ジヤーナル
・オブ・バクテリオロジィ(J.Bacteriol.)、第81
巻、233〜235頁(1961年)]。例示する化合物
について観察されたED50値を表10に示す。
846抗生物質は腎盂腎炎の処置のために有用である。
たとえばA82846AおよびA82846Bは、ラッ
トの腎孟腎炎の罹患を実験的に減少させて保護すること
においてバンコマイシンより有効である。この試験は、
米国特許第4,208,403号に開示されたような方法
を用いて行われる。観察結果を表11に要約する。
有用である。たとえばA82846AおよびBは、実験
的にカテーテルを挿入して心内膜炎に罹患させたラット
を処置することにおいてバンコマイシンと同様な効果を
有する。この試験において、ラットの右頸動脈にプラス
チックカテーテルを挿入し、これを右心室中に到達させ
て確実に固定することによりラットの実験準備をする。
動物を2日間安静に保った後、供試微生物: ストレプト
コックス・フエカリス(Streptococcus faecalis)X−
66を静脈注射する。微生物力価は約5×108/mL、
注射量は0.5mLである。
間間隔で14日間、全28回皮下投与する。治療後、動
物を2日間保持した後、心臓を切除して均質にし、希釈
し、トリプチカーゼ大豆寒天上に板状に延ばす。計数
前、板状物を48時間熟成する。実験結果を表12に示
す。
発明の一部である。それ故、この抗生物質、好ましくは
その薬理学的に許容される塩類型を、菌類感染症の治療
的または予防的処置のため、経口的もしくは非経口的投
与剤形に製剤することができる。たとえば活性化合物
を、通常の薬学的担体または賦形剤と混合し、錠剤、カ
プセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエー
ファスなどの剤形で使用することができる。
物は、これに活性化合物約0.1〜90重量%、より一
般的には約10〜30重量%を含有せしめる。かかる組
成物は、これに通常の担体および賦形剤、たとえばコー
ンスターチまたはゼラチン、ラクトース、シュクロー
ス、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン
酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸を含
有せしめることができる。本発明組成物に通常使用する
崩壊剤は、クロスカルメロース(croscarmellose)ナトリ
ウム、微結晶セルロース、コーンスターチ、グリコール
酸ナトリウム澱粉およびアルギン酸を包含する。
アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン(Povidon
e)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、シュクロー
ス、澱粉およびエチルセルロースを包含する。
ン酸マグネシウムまたは他のステアリン酸金属塩、ステ
アリン酸、液状シリコーン、タルク、ワックス、油脂類
およびコロイド状シリカを包含する。
の他のような香料を使用することができる。投与剤型を
外観上より美的にし、薬物の識別を助けるため、着色剤
を加えるのが好ましいこともある。
質を、通常用いる静脈注射用液体に溶解し、注射により
投与することができる。たとえば生理的食塩水、リンゲ
ル液または5%デキストロース溶液のような液体を使用
することができる。
可溶性塩、たとえば塩酸塩の滅菌調製物を、注射用水、
生理的食塩水または5%グルコース溶液のような薬学的
希釈剤に溶解して投与することができる。水性基質また
は薬学的に許容される油性基質、たとえばオレイン酸エ
チルのような長鎖脂肪酸エステル中の懸濁液として、活
性化合物の適当な不溶性剤型を製剤し、投与することが
できる。
たとえば塩酸塩を、蒸留水または脱イオン水中に調製し
た滅菌製剤は特に有用である。
は、適当な滅菌希釈剤中、抗生物質好ましくはその塩の
溶液を密閉して封入したアンプルであることができる。
単位投与剤中の抗生物質の濃度は、抗生物質の特定の剤
形、その溶解性および医師の所望する投与剤形に依存し
てたとえば約1〜50%の範囲で変えることができる。
感染症、特にグラム陽性菌に起因する感染症を処置する
方法を提供する。動物は微生物に感受性を有するか、ま
たは感染するかいずれかであることができる。処置方法
は当該目的のために有効なA82846抗生物質の量を
動物に投与することから成る。一般にA82846抗生
物質の有効量は、約0.5〜100mg/kgの投与量であ
る。好ましい投与量は活性化合物約1〜60mg/kgであ
る。成人1人1日当り典型的投与量は約50mg〜約1.
0gである。
当り1個または1日当り複数個の剤形で投与することが
できる。養生処置は長期間、たとえば数日間または1〜
6週間に渡る投与が必要なこともある。単位投与量また
は投与総量は、感染の症状および重篤度、患者の年令お
よび一般的健康度、患者の抗生物質に対する耐性、なら
びに感染症に含まれる1種ないし複数種の微生物のよう
な因子に依存する。
生物質を静脈注射(IV infusion)により投与することで
ある。この方法において、抗生物質の適当な可溶性塩の
滅菌組成物を、5%デキストロース溶液のような生理的
液体中に配合し、得られた溶液をゆっくり静脈(IV)注射
する。また静脈注射のピギーバック法(piggy−backmeth
od)を採用してもよい。
禽、豚、羊および牛のような動物の飼料利用効率を高め
る方法、(2)家禽、豚、羊および牛のような動物の肉生
産を上げるための生長促進法および(3)反芻動物の乳汁
分泌における乳生産増強方法に関する。飼料利用効率を
高め、生長を促進するため、A82846抗生物質を、
全飼料トン当り約2〜200gの量で適当な飼料に配合
して経口的に投与する。肉牛のために、たとえば約12
〜3000mg/頭/日の割合が適当である。反芻動物の
乳汁分泌における乳生産増強のための経口投与量を示せ
ば、1日当り約0.04〜16mg/kg(体重)(または約2
5〜5000mg/動物/日)である。
学上許容される担体を含む動物飼料プレミックス型とし
て正規に販売することができる。本発明の実施をより完
全に説明するため、以下実施例を列挙する。
ある。 1.陽イオン交換樹脂カラム カラム支持:ゾルバックス*SCX(4.6×150mm)、
系:傾斜溶離、A:B(4:1)→A:B(1:9)、5分中、
15分間保つ。 A=MeOH:0.1M・NaH2PO4(1:9) B=MeOH:0.9M・NaH2PO4(1:9) 流速:1.0mL/分、検出:225nmUV 保持時間:濃度に依存するが、概略、A82846C=
6.6分、A82846B=8.9分、A82846A=
9.5分。
系:傾斜溶離、1%(NH4)H2PO4:CH3CN、(95:
5)→(1:1)、20分中。 流速:1.0mL/分、検出:225nmUV 保持時間:A82846A=7.3分、A82846C=
7.6分、A82846B=8.0分。 注)*ゾルバックス(Zorbax)はE.I.デュポン・ド・
ナムール社(du Pontde Nemours Co.,Inc.)(デラ
ウェア州19898ウイルミントン)の製品。
製造:− A.培養菌株A82846の振盪フラスコ発酵:− 培養菌株ノカルジア・オリエンタリスNRRL1809
8(凍結乾燥したペレットまたは液体窒素に保持した懸
濁液のいずれかとして)を使用し、次の組成を有する種
菌培地に接種する。
性澱粉2.0%;酵母エキス0.5%;カゼイン*の酵素加
水分解物0.5%;炭酸カルシウム0.1%;脱イオン水全
量1Lになる量。滅菌前、培地を水酸化ナトリウムでp
H7.5に調節。 注)*NZアミンA(シェフィールド・ケミカル・カンパ
ニー(Sheffield Chemical Co.(NY,ノーウィッ
チ))。
および平板培地を調製する。接種した斜面培地を30℃
で約10〜14日間インキュベートする。熟成した斜面
培養物を滅菌器具でかき削って胞子を解き離し、菌糸体
マットを除き浸漬する。解き離して得られた胞子と生長
培養物の約1/4量を使用して第1段階の種菌培地50
mLに接種する。
ルレンマイヤーフラスコ中、2インチ(5.08cm)旋
回、回転数250rpmのシェーカー上、30℃で約24
〜48時間熟成する。上記熟成した第1段階の培地(0.
5mL)を用い、次の組成を有する生産培地50mLに接
種する。
粉1.5%;ポテトデキストリン3.0%;炭酸カルシウム
0.25%;廃糖蜜0.3%;酸加水分解カゼイン*0.5
%;脱イオン水、全量1Lとなる量。(滅菌前、水酸化ナ
トリウムでpH7.5に調節) 注)*ハイ−ケース(Hy−Case)(シェフィールド・ケミ
カル・カンパニー) 接種した生産培地を、250mL広口エルレンマイヤー
フラスコ中、2インチ、250rpmの回転シェーカー
上、30℃で4〜5日間熟成する。
うに製造した第1段階の熟成培地10mLを用い、第1
段階の培地の組成と同一の組成を有する第2段階の生長
培地400mLに接種する。この第2段階の栄養培地
を、2−L広口エルレンマイヤーフラスコ中、2インチ
旋回、回転数250rpmのシェーカー上、30℃で約4
8時間熟成する。
00mLを用い、前記A項に記載のように製造した滅菌
生産培地(ただしP−2000消泡剤0.3g/Lを加え
る)100lに接種する。接種した生産培地を、撹拌中の
165L発酵タンク中、30℃で90〜100時間発酵
させる。撹拌(80rpm)している容器中の空気流を、溶
解酸素濃度(空気の飽和の50%以上)に保持するよう調
節する。
酵:− 栄養培地の適当量を用い、1600ガロン(4536−
L)発酵タンク中、生産培地約1200ガロンに接種す
る。
6の製造:ノカルジア・オリエンタリスNRRL180
99(凍結乾燥したペレットまたは液体窒素中に保持し
た懸濁液のいずれかとして)を、実施例2に記載の方法
(但し生産培地は次の組成を有する)により培養する。
リン2.0%;ペプトン*1.0%;炭酸カルシウム0.2
%;廃糖蜜2.0%;脱イオン水を加えて全量1L。pHを
調節しない。注)*バクト−ペプトン(Bacto−peptone
(ディフコ・ラボラトリーズ(Difco Laboratories))。
6の製造:− 培養菌株ノカルジア・オリエンタリスNRRL1810
0(凍結乾燥ペレットまたは液体窒素中に保持した懸濁
液のいずれかとして)を、実施例2に記載の方法(ただし
用いた酸加水分解カゼインはアミカーゼ(Amicase、シ
ェフィールド・ケミカル・カンパニー)である)により、
培養する。
発酵容器から得られた発酵液4200Lを、5N水酸化
ナトリウムでpH10.5に調節し、3%セライト545
(濾過助剤)を加える。混合物をフィルタープレスに通し
て濾過し、プレスを水洗する。濾液と洗液(4200L)
を合して5N塩酸(または硫酸)でpH7に調節し、ダウ
エックス−XFS−43278(NH4 +)樹脂カラム(濾
液200L/樹脂10L)に適用する。このカラムを流
速750mL/分で溶離する。各分画をバチルス・スブ
チリス(Bacillus substilis)による生物試験法または
HPLCのいずれかで試験する。
00L分画を集める。5カラム容量の0.05N水酸化
アンモニウムで樹脂から活性物質を溶離し、25L分画
を集める。A82846を含む分画を合して減圧下、約
30L容に濃縮する。この溶液を、水中ダイアイオン
(Diaion)HP−20樹脂の10Lカラムに適用する。
このカラムを、流速300mL/分の下に3カラム容量
の水で洗う。洗水を捨てる。1.0%酢酸を含有する水:
イソプロパノール(95:5)溶液を用い、流速100mL
/分でカラムから活性物質を溶離し、4L分画を集め、
生物試験法およびHPLCで試験する。A82846
(#6−14)含有分画を合して減圧下に濃縮し、凍結乾
燥して356gの粗A82846を得る。
離:− 実施例5で製せられたA82846(30g)を水500m
Lに溶解し、1%リン酸二水素アンモニウム中加圧して
平衡にしたシリカゲルLP−1/C18の30Lステンレ
ススチールカラムに適用する。1%リン酸二水素アンモ
ニウム60Lから1%リン酸二水素アンモニウム含有の
水:アセトニトリル(88:12)60Lの傾斜溶離剤を用
い、流速250〜300mL/分(最大圧力600psi)
で、カラムを展開し、4L分画を集め、254nmのUV
検出器を用いて溶出液を監視する。各分画を分析的HP
LCで試験する。A82846Aに富む分画(#6〜9)
とA82846Bに富む分画(#10〜17)それぞれを
合し、減圧下に濃縮する。
分から得られたA82846Aに富む濃厚物を、ダイア
イオンHP−20SSの1750mLカラム上で脱塩、
水洗し、0.5%酢酸含有の水:イソプロパノール(95:
5)で溶離し、分析的HPLCにより試験する。A82
846Aを含む分画を合して濃縮し、凍結乾燥してA8
2846Aに富む生成物7.4gを得る。
溶解し、1%リン酸二水素アンモニウム中シリカゲルL
P−1/C18のプレパラテブHPLCカラムに適用す
る。1%リン酸二水素アンモニウムから1%リン酸二水
素アンモニウム:アセトニトリル(9:1)の傾斜溶離剤を
用いてカラムを展開し、分析的HPLCによる溶出液を
254nmで監視しながら流速48mL/分で溶離する。
最初の10Lを溶離した後、500mL分画を集める。
よびA82846Bを含む分画(#12〜20)それぞれ
を合し、減圧下に濃縮する。3回の操作で得られたA8
2846Aの濃厚物を合し、ダイアイオンHP−20S
Sの1750mLカラムに適用して溶液を脱塩する。カ
ラムを水洗し、0.5%酢酸含有の水:イソプロパノール
(95:5)で溶離する。HPLCで溶出液を監視する。
A82846Aを含む分画を合して濃縮し、凍結乾燥し
て純品A82846A7.9gを得る。
ペクトルを図1;チオグリセロール中A82846Aの
FAB−MSを図4;ブラッカー(Bruker)AM500分
光計(HDO抑制)を用いて(メチルスルホキシド)−d6中
(60℃)、A82846A塩酸塩のNMRスペクトルを
図7に示す。
回でA82846AとA82846Bを分離して得られ
たA82846Bに富んだ分画を合し、ダイアイオンH
P−20SSの1750mLカラム上で脱塩し、水洗し
て0.5%酢酸含有の水:イソプロパノール(95:5)で
溶離する。溶出液をHPLCで監視し、このA8284
6B分画を合して減圧下に濃縮し、凍結乾燥してA82
846B純品8.8gを得る。
ペクトルを図2;チオグリセロール中A82846Bの
FAB−MSを図5;ブラッカー(Bruker)AM500分
光計を用いて(メチルスルホキシド)−d6中(60℃)、A
82846B酢酸塩のNMRスペクトルを図8に示す。
のメタノール:水(4:1)で溶離し、脱塩することもでき
る。
得られた発酵液461Lを、5N水酸化ナトリウムでp
H10.5に調節し、3%ハイフロ・スーパーセル(Hyf
lo Supercel)濾過助剤で濾過する。濾液430Lを5
N塩酸でpH7に調節し、ダウエックス(Dowex)−XF
S−43278(NH4 +)樹脂を含むカラムに適用する。
カラムを水50Lで洗い、0.05N水酸化アンモニウ
ム50Lで活性物質を溶離し、4L分画を集める。溶出
液を生物試験法で監視する。活性分画(#1〜7)を合し
て減圧下、約1700mL容に濃縮し、凍結乾燥して粗
A82846(283.9g)を得る。
− 前記A項で得られた粗A82846(2g)を水に溶解
し、1%リン酸二水素アンモニウム中、シリカゲルLP
−1/C18樹脂2110mL含有の2"×45"ステンレ
ススチール製プレパラテブHPLCカラムに適用する。
1%リン酸二水素アンモニウムから1%リン酸アンモニ
ウム:アセトニトリル(92:8)の傾斜溶離剤を用い、流
速70mL/分でカラムを展開し、400mL分画を集
め、254nmのUVで監視する。
を合してプール1とし;A82846Cを含む分画(#1
6〜20)を合してプール2とし、A82846Bを含
む分画(#21〜25)を合してプール3とする。
イアイオンHP−20樹脂1800mL含有の7×45c
mグラスカラムに適用する。0.1%酢酸含有のメタノー
ル:水(4:1)を用い、流速25mL/分で活性物質を溶
離し、1L分画を集める。C含有分画(#9〜12)を合
して減圧下に濃縮し、凍結乾燥して半精製A82846
C(662.2mg)を得る。
有の1"×48"スチールカラム上、1%リン酸二水素ア
ンモニウムから1%リン酸二水素アンモニウム:アセト
ニトリル(92:8)の傾斜溶離剤を用い、流速11mL/
分で逆相HPLC操作を反復し、25mL分画を集め、
254nmで監視することにより、上記半精製A8284
6C(500mg)を更に精製する。A82846C含有分
画(#169〜210)を合し、HP−20樹脂を含む5
×45cmグラスカラム上で脱塩する。このカラムを0.
1%酢酸含有メタノール/水(4:1)で溶離し、100m
L分画を集め、分析的HPLC上、225nmのUVを用
いて溶離を続ける。A82846Cを含む分画(#5〜
11)を合して減圧下に濃縮し、凍結乾燥してA828
46C(127.3g)を得る。
2846Bを含むプール3を上記A82846Cの精製
と同様の方法で精製し、更にA82846AおよびA8
2846B純品を得る。
46C(70mg)を更に精製する。 カラム:ゾルバックスSCX(9.2×250mm)陽イオン
交換 移動相:10%メタノール含有の0.15Mリン酸二水素
ナトリウム緩衝液から出発して10%メタノール含有の
0.9Mリン酸二水素ナトリウム緩衝液に到る線型傾斜
溶離剤(6分間移動、5分間保持、緩衝液に対して無調
節) 流速:6.0mL/分 検出:280nmのUV 負荷:6.0mg/水中注入
コレクター(Gilson 201C)を用いてA82846
Cを集める。移動相をミリポア・ウォーターズ(Millip
oreWaters)M600傾斜溶離HPLC系で供給し、試
料溶液を日立(Hitachi)オートサンプラーにより注入す
る。
L容に濃縮し、HP−20カラム(50mL)に適用す
る。カラムを水洗し、0.5%酢酸含有の水:イソプロパ
ノール(95:5)で溶離し、25mL分画を集める。A8
2846C含有分画(#9〜14)を合して濃縮し、凍結
乾燥してA82846C純品37mgを得る。
ペクトルを図3;チオグリセロール中A82846Cの
FAB−MSを図6;およびブラッカーAM500分光
計(HPO抑制)上、(メチルスルホキシド)−d6中(60
℃)、A82846C酢酸塩のNMRスペクトルを図9
に示す。
0mg)を脱イオン水(10mL)に溶解する。この溶液を
0.5N酸(塩酸、硫酸およびリン酸)でpH約3に調節す
る。溶液を凍結乾燥して相当の塩型化合物を得る。もし
pH3より非常に低く(すなわちpH2)なれば成分の品質
が低下することに注意することが重要である。
る。 成分:A82846Aリン酸塩282.9mg;微結晶セル
ロース101.1mg;クロスカルメロース・ナトリウム1
2.0mg;プロビドン12.0mg;ステアリン酸マグネシウ
ム3.0mg;ステアリン酸4.0mg;純水0.16mL。 注)クロスカルメロース(croscarmellose);プロビドン(p
rovidone)。
スの一部およびクロスカルメロース・ナトリウムの一部
を適当な容器に入れ、均質になるまで混和する。プロビ
ドンの水溶液を製し、このプロビドン溶液を上記粉末混
合物に加える。得られた混合物を顆粒化し、必要に応じ
て計測し、乾燥する。この乾燥混合物に微結晶セルロー
ス残部とクロスカルメロース・ナトリウム残部を加え、
混和する。ステアリン酸マグネシウムとステアリン酸を
加え、この混合物を混和し、得られた粉末を圧縮して錠
剤を製造する。
造する。 成分:A82846B塩酸塩262.2mg;流動性コーン
スターチ粉末137.7mg;シリコーン液体350センチ
ストロークス2.7mg;コーンスターチ147.1mg。
ーチ粉末、シリコーン液体350センチストロークスお
よびスターチ粉末を適当なミキサー中、均質になるまで
混和する。適当なサイズの硬質ゼラチンカプセルに充填
する。
型薬剤を製造する。粉砕または篩別けして懸濁薬に適す
る粒形の大きさにする。下記賦形剤中にA82846A
を懸濁する。 成分:レシチン1%;クエン酸ナトリウム2%;プロピル
パラベン0.015%;注射用水、所望の容量になる量。
るか、もしくはバイアル中のA82846Aに上記賦形
剤を即席的に加えることにより懸濁液を製造する。
トルを示す図である。
トルを示す図である。
トルを示す図である。
示す図である。
示す図である。
示す図である。
である。
である。
である。
Claims (1)
- 【請求項1】 ノカルジア・オリエンタリス菌株NRR
L18098、NRRL18099およびNRRL18
100またはそのA82846産生後代菌から選択され
た生物学的に純粋な培養物。
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