DK167689B1 - Hidtil ukendte glycopeptid-antibiotika hoerende til vancomycingruppen, farmaceutisk acceptable salte deraf, en fremgangsmaade til fremstilling af saadanne antibiotika, biologisk oprenset kultur til brug ved fremstillingen samt farmaceutisk praeparat og tilskudsmiddel til dyrefoder indeholdende saadanne antibiotika - Google Patents

Description

i DK 167689 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte glyco-peptid-antibiotika hørende til vancomycin-gruppen. Nærmere bestemt angår opfindelsen et antibiotikum benævnt A82846, dets individuelle komponenter A82846A, A82846B og 5 A82846C og farmaceutisk acceptable salte._deraf samt en fremgangsmåde til dets fremstilling ved dyrkning af hidtil ukendte mikroorganismestammer. Opfindelsen angår også en biologisk oprenset kultur til brug ved fremstillingen af de omhandlede antibiotika samt et farmaceutisk præpa-10 rat og et tilskudsmiddel til dyrefoder indeholdende sådanne antibiotika.

Selv om man i dag råder over mange nyttige antibiotika, er der fortsat et behov for at finde frem til forbedrede 15 antibiotika til anvendelse indenfor den humane medicin.

For eksempel er vancomycin et kommercielt succesfuldt antibiotikum, som har reddet mange menneskeliv. Imidlertid kan vancomycin også bevirke problemer, eftersom stoffet eksempelvis kan fremkalde ototoxicitet og nephrotoxici-20 tet. Der eksisterer derfor et behov for antibiotika, som har en virkning, der ligner virkningen af vancomycin, men som har en forbedret farmakokinetik eller færre bivirkninger .

25 Det har nu overraskende vist sig, at det er muligt at fremstille glycopeptid-antibiotika af høj-- værdi ved sub- 4 mers aerob fermentering af Nocardia orientalis NRRL 18098, NRRL 18099 eller NRRL 18100 i et dyrkningsmedium, der indeholder assimilerbare kilder for carbon, nitrogen 30 og uorganiske salte. Disse glycopeptid-antibiotika har fået den arbitrære betegnelse A82846 og komponenter deraf, og de er kendetegnet ved den nedenfor viste strukturformel, i hvilken X og Y hver for sig er H eller Cl.

35 Antibiotikummet A82846 har en strukturel lighed med vancomycin, men har en forbedret in vitro og in vivo virkning overfor gram-positive bakterier, ligesom stoffet 2

LUV 10/009 D I

udviser en forbedret farmakokinetik, hvilket resulterer i en væsentligt længere halvtid end den, der kendetegner vancomycin.

5 A82846-komponenterne har først og fremmest de følgende fysiske og spektrale egenskaber:

Karakteristika af A82846A

10 Molekylvægt: 1556

Empirisk formel:C^2HggN2o°26C1 FAB-MS (thioglycerol): (M+l) Fundet: 1557,5803;

Beregnet: C73HgoNio°26C1 = 1557,5716 (se fig. 4) UV (H2O) \max: 281 nm (e 5052), forskydes til 300 nm med 15 base IR (KBr): 1716, 1655, 1611, 1586, 1552, 1504, 1410, 1340, 1310, 1230, 1212, 1132, 1066, 1028 og 1015 cm-1 (se fig.

1)”' 20 NMR [(CD3)2S0]: se fig. 7 pKa (H20): 4,7; 9,5 (66 % DMF): 5,5; 6,8; 7,9; 9,4; 12,3 (tilsyneladende molekylvægt 1542) 25

Karakteristika af A82846B

Molekylvægt: 1590 Empirisk formel: ^73^8^0^26^2 30 FAB-MS (thioglycerol): (M+l) Fundet 1591,5315;

Beregnet: ^73^39^10^26^^2 = 1591,5327 (se fig. 5) UV (H20) Amax: 280 nm (e 5192), forskydes til 300 nm med base 35 IR (KBr): 1656, 1586, 1562, 1504, 1403, 1264, 1230, 1135, 1105, 1065, 1023 og 1018 cm-1 (se fig. 2) 3 DK 167689 B1 NMR [(CD3)2SO]: se fig. 8 pKa (H20): 4,62; 9,5.

Karakteristika af A82846C 5

Molekylvægt: 1522

Empirisk formel: C73HgoNio026 FAB-MS (thioglycerol): (M+Na) Fundet 1545,5998;

Beregnet: C^HgQN^QO^Na = 1545,5925 (se fig. 6) 10 UV (H20) Kmax: 280 nm (e 5198), forskydes til 300 nm med base IR (KBr): 3600-*3004 (bred), 2999, 2991, 2950, 1687^1650 (bred), 1585, 1570, 1509, 1503, 1453, 1449, 1402, 1212, 15 1130, 1102, 1060, 1032 og 1014 cm-1 (se fig. 3) NMR C(CD3)2S0]: se fig. 9 pKa (H20): 4,6; 9,4.

20 Aminosyreanalyser af A82846A, A82846B og A82846C efter hydrolyse med 6N HC1 indikerede tilstedeværelse af aspa-raginsyre og to brede toppe med et spor af glycin. De to toppe synes at svare til actinoidiniske og vancomyciniske aminosyrer, som begge er til stede i glycopeptider høren-25 de til vancomycin-klassen.

i

Sammenlignende NMR-undersøgelser indikerer, at A82846A, A82846B og A82846C hver især indeholder den hidtil ukendte amino-sukkerart 4-epi-vancosamin (3-methyl-acosamin) 30 med formlen:

j'vvOR

CHs—-cr <j>fe 35 «O-/** DK 167689 Bl 4

Molekylformlen af A82846A svarer til formlen for vancomycin (^66^75N9°24^2^ m:i-nus et chloratom plus grundstofferne i en yderligere aminosukkerart af vancomysamin-typen (c7 h14no2).

5

Molekylformlen for A82846B svarer til formlen for A82846A, hvori et hydrogenatom er udskiftet med et chloratom.

10 Molekylformlen for A82846C svarer til formlen for A82846A, hvori et chloratom er udskiftet med et hydrogenatom.

A82846-komponenterne udgør en hidtil ukendt familie af 15 glycopeptider, som minder om vancomycin-molekylet i den generelle sammensætning, og som først og fremmest afviger herfra med hensyn til indholdet af chlor og med hensyn til tilstedeværelsen af en yderligere underenhed, som har vancosamin-sammensætning.

20 Nærmere bestemt har A82846-komponenterne den følgende strukturformel:

VHl H0 nu I--O-'W-CHjOH

25 cHj Vio

HO—«Η* I

CH’ ° Ij i II l JL

' * lu YoH

O u_JL c«’

X Yr Nu A / H i'·*» I

_ /V r i V NH

°=/ π t N \ NH—--^ \ - 30 a h<^i o >r 0 hn 1 / H ° \ HO- JA I / V I il /'-HH, [TY ° CH5

0H A82846A: X = H Y = CI

H0

A82846B : X = Cl Y = CI

A82846C: X = H Y = H

‘35 5 DK 167689 B1

Den absolutte konfiguration af sukkergrupperne i A82846-forbindelserne er endnu ikke blevet bestemt.

A82846 og dettes individuelle komponenter A82846A, 5 A82846B og A82846C kan reagere under dannelse af forskel lige salte. Alle sådanne former af de omhandlede antibiotika, som er farmaceutisk acceptable, er omfattet af den foreliggende opfindelse. A82846-salte er eksempelvis nyttige til at separere og oprense A82846. Desuden har sal-10 tene en forøget opløselighed i vand.

A82846-saltene fremstilles ved anvendelse af standardprocedurer til saltfremstilling. For eksempel kan A82846 neutraliseres med en passende syre til dannelse af et sy-15 readditionssalt.

Syreadditionssaltene er særligt nyttige. Som repræsenta tive eksempler på egnede salte kan anføres de salte, der dannes ved standardreaktioner med såvel organiske som 20 uorganiske syrer, herunder svovlsyre, saltsyre, phosphor-syre, eddikesyre, ravsyre, citronsyre, mælkesyre, malein-syre, fumarsyre, cholsyre, pamoinsyre, slimsyre, D-glut-aminsyre, d-kamfersyre, glutarsyre, glycolsyre, phthalsy-re,' vinsyre, myresyre, laurinsyre, stearinsyre, salicyl-25 syre, methansulfonsyre, benzensulfonsyre, soirbinsyre, pi- crinsyre, benzoesyre, kanelsyre og lignende syrer.

<

Antibiotikummet A82846 fremstilles ifølge opfindelsen ved at dyrke en A82846-producerende stamme af Nocardia orien-30 talis under submerse aerobe betingelser i et egnet dyrkningsmedium, der indeholder assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte, indtil der er produceret en betydelig antibiotisk aktivitet. Antibiotikummet kan herefter udvindes under anvendelse af forskellige 35 isolations- og oprensningsprocedurer, som er velkendte indenfor fagområdet.

DK 167689 Bl 6

Den foreliggende opfindelse angår også en biologisk oprenset kultur af en mikroorganisme, som er kendetegnet ved at være valgt blandt Nocardia orientalis NRRL 18098, Nocardia orientalis NRRL 18099, Nocardia orientalis NRRL 5 18100 og A82846-producerende mutanter af _disse stammer.

Disse mikroorganismer er nyttige, fordi de producerer antibiotikummet A82846. Af bekvemmelighedsgrunde har man i det følgende betegnet NRRL 18098-stammen som kultur A82846, NRRL 18099-stammen er blevet betegnet kultur 10 A82846.1 og NRRL 18100-stammen er blevet betegnet kultur A82846.2. Kulturen A82846 er blevet isoleret fra en jordprøve fra Haiti. Kulturen A82846.1 blev opnået fra kulturen A82846 ved kemisk mutagenese, og kulturen A82846.2 er en naturlig variant isoleret fra kulturen A82846.

15

Kulturerne A82846, A82846.1 og A82846.2 er deponeret i henhold til Budapest-traktaten som dele af samlingen af stamkulturer hos the Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United Sta-20 tes Department og Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, den 8. august 1986. Kulturerne er tilgængelige for offentligheden under deponeringsnumrene NRRL 18098 (A82846, forældrestammen), NRRL 18099 (A82846.1, mutantstammen) og NRRL 18100 (A82846.2, 25 variantstammen).

Taxonomiske undersøgelser af kulturerne A82846, A82846.1 og A82846.2 er blevet gennemført af Frederick P. Mertz hos the Lilly Research Laboratories. Baseret på disse un-30 dersøgelser har man klassificeret de hidtil-ukendte organismer som stammer af Nocardia orientalis (Pittenger og Brigham, 1956) Pridham og Lyons 1969, typestammen: ATCC 19795 [R. C. Pittenger og R. B. Brigham, "Streptomyces orientalis n. sp., the Source of Vancomycin", Antibiotics 35 and Chemotherapy 6, 642-647 (1956)]. Denne klassifikation er baseret på direkte sammenligninger i laboratoriet og på en gennemgang af publicerede beskrivelser [Bergey's 7 DK 167689 B1

Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, redigeret af R. E. Buchanan og N. E. Gibbons, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974; M. Goodfellow og K. P. Schaal, "Identification Methods for Nocardia, Actinomadu-5 ra og Rhodococcus", i Identification Methods for Microbiologists, 2. udgave, redigeret af F.A. Skinner og D. W. Lovélock, Society for Applied Bacteriology Technical Series No. 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, p.

261; R. E. Gordon, D. A. Barnett, J. E. Handerhan og C.

10 H. Pang, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the Nocardin Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54-63 (1974); R. E. Gordon, S. K. Mishra og D. A. Barnett, "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. carnea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis and N. aero-15 colonigenes", J. Gen. Microbiol. 109, 69-78 (1978); S. J. Mishra, R. E. Gordon og D. A. Barnett, "Identification of Nocardiae and Streptomyces of Medical Importance", J.

Clin. Microbiol. 11(6), 728-736 (1980); H. Mordarska og M. Mordarski, "Chemotaxonomic Characters and Classifica-20 tioni of Some Nocardioform Bacteria", J. Gen. Microbiology· 71, 77-86 (1972); og R. Shinobu og M Kawato, "On

Streptomyces aerocolonigenes nov. sp., Forming the Secondary Colonies on the Aerial Mycelia", Bot. Mag. Tokyo 73, 213-216 (I960)].

25

Anvendte metoder

Man fulgte de metoder, der er anbefalet af the Intenatio-nal Streptomyces Project (ISP) til karakterisering af 30 Streptomyces-arter [E. B. Shirling og D. Gottlieb, "Me thods for Characterization of Streptomyces Species", Int.

J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966)], og de metoder der er anbefalet til karakterisering af Nocardia-arter af Gordon, Barnett, Handerhan og Pang, supra.

Morfologien blev undersøgt ved anvendelse af et optisk lysmikroskop. Man benyttede et skanderende elektronmikro- 35 8 skop (SEM) til at undersøge sporeoverfladens ornamentik.

Resistensen over for rifampin og lysozym blev målt ved metoder anbefalet af Gordon et al. [R. E. Gordon og D. A. 5 Barnett, "Resistance to Rifampin and Lysozyme of Strains of Some Species of Mycobacterium and Nocardia as a Taxonomic Tool", Int. J. Syst. Bacteriol. 27(3), 176-178 (1977)].

10 Til angivelse af farvenavne benyttede man ISCC-NBS

Centroid color Charts, standardprøve No.2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) og the Color Harmony Manual (4. udgave. Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 15 1958).

Produktionen af melanoid-pigment (chromogenicitet) blev bestemt ved hjælp af ISP No. 1 (trypton-gærekstraktvæs-ke), ISP No. 6 (pepton-gærekstrakt-jernagar) og ISP No. 7 20 (tyrosin-agar) medier.

Man frembragte isomere af diaminopimelinsyre (DAP) og carbonhydraterne i hydrolysater af hele celler ved hjælp af de chromatografiske metoder beskrevet af Becker et al.

25 [B. Becker, Μ. P. Lechevalier, R. E. Gordon og Η. A.

Lechevalier, "Rapid Differentiation between Nocardia and <

Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)] og af

Lechevalier [Μ. P. Lechevalier, "Identification of Aero- 30 bie Actinomycetes of Clinical Importance", -J. Lab. Clin.

Med. 71, 934-944 (1968)].

Mycoliske syrer (svampesyrer) blev bestemt ved en metode baseret på teknikker beskrevet af Minnikin [D. E. Minni-35 kin, I. G. Hutchinson og A. B. Caldicott, "Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bacteria", J. Chromatography 188, 221-233 (1980)].

DK 167689 B1 9

Phosphatase og urease blev bestemt ved metoder beskrevet af Blazevic (D. J. Blazevic og G. M. Ederer, Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology, John 5 Wiley and Sons, Inc., New York, 1975, p. 136). Omdannelsen af gelatine til væske blev benyttet til bestemmelse af proteinase-aktiviteten.

Resistensen over for antibiotika blev målt ved anbrin-10 gelse af skiver til bestemmelse af antibiotikum-sensitivitet på overfladen af plader podet med ISP nr. 2 agar.

Hydrolysen af stivelse blev bestemt ved at teste for tilstedeværelse af stivelse med iod på ISP nr. 4 (uorganiske 15 salte og stivelse) agarplader (se Blazevic og Ederer, supra).

Hippurat-hydrolysen blev målt ved anvendelse af såkaldte "Bacto Differentiation Disks", som hurtigt kan påvise hy-20 drolysen af hippurat.

Kulturkarakteristika

Kulturerne A82846 og A82846.2 udviste en udmærket vækst 25 på alle de komplicerede og veldefinerede medier, som blev anvendt. Disse kulturer frembragte luftmycelier på de < fleste medier. Farven af den luftige sporemasse var hvid eller grå i afhængighed af mediet. På mange medier produceredes et brunt opløseligt pigment, som tydeligt kunne 30 skelnes. Bagsidens farve var fra brun til hvidgul.

Kulturen A82846.1 voksede også godt på alle de anvendte medier, men der var tale om en mindre rigelig vækst end i tilfældet med forældrekulturen. A82846.1 producerede kun 35 sjældent luftmycelier. Når sådanne var til stede, havde myceliet en hvid farve. På nogle få medier produceredes lejlighedsvis et lysebrunt opløseligt pigment, som var 10

UH 10/083 b I

vanskeligt at skelne fra de øvrige pigmenter. Bagsidens farve var fra brun til hvidgul.

De..fundne karakteristika for kulturerne A82846, A82846.1 5 og A82846.2 er opsummeret i den efterfølgende tabel I. Kulturerne A82846 og A82846.2 mindede meget om hinanden, idet de kun udviste forskelle med hensyn til nogle få egenskaber. På grund af deres indbyrdes lighed, og eftersom A82846.2 er en naturlig variant af A82846, blev der 10 ikke foretaget yderligere sammenligninger.

15 20 25 30 35 ! ] DK 167689 B1 o(0 p TO Dl

Η TJ P (D

> -η cq co

p Ό X P > P ><P

(S G ·Η CQ ffi · j fi

• D)P 3 > (01 . rtl ?b^,S

vO -H CQ Μ X >h (01 -H DVdlP

<HI r-| i ·· P · P H · JQ

CO (D E P <D >i C <D E · · (D (DO ·· CD

<N dl * O CO T> · > P TI · T> P Dl · 'O CO

oo t| co ft >1 OcsffiB O > O fi ·Η IS O !P

< Di LO CO S ØffihH o is O w Di 'tf O ij ja --

K

(d λ - . m p (0 0) ri p Ό 0)

0) H

s d P (0

(0 X

to co (0

CD

0) Ti O) (0

•ri H

H P 'O "3 0) 0) -H d c,

vi s ϊ> ϊ> P

co o s * « „

c, w Ό Ό μ P

O Η -H Cd! T* ^ S

p · o p > j> S’^S

vo -ri CQ X ·· £G ·· Ή V) P

o{fj (D (D P (D Q) P Η · P ja a oo o)ri οι οι to >1 di cd di :s di <d cd t) cd cd

O! dl · P P C · C P β · β P Dl* P CO

(VJ CO ·Η IS β β -ri (S Ή C ·ι-| ΟΊ Η β -rj C^· C >) . .< Ci 1Γ) Η H Di C* Di H Di CT> Di H Oi^Hj co 'tf 00 s -

CO ·- C

< CD dl

di C

0 -H

«(0 r-1' Pi . o

VO P

S. 11 s

æ ·ο ή x ’S

< - cd di kp 2 Qi Dl , ^ T) (01 p_<d vo dl P H CQ co ^ C Ό > P ·· P !^p

oo · · d -Hffi CQ P w.k’^S

/\j Οί Lj Γ7) Li ^ O) d) O) , r*

CO vD -H CQ -H JQ x (01 -H -Q "P ·* D1T5IP

<* »rfi o . ,—I CD PH >iH P Η · P

00 (D ·ΰ <ϋ Λ i* ·· CD CD Ό CD CD (DO »CD

iu OJ di*dip Ό · Ό P D> DIP di · Ό w (d CO Η σι H & O CM O C -H VD ·Η β ·Η £· 0 >1

< Di in X 2 Ο σι CD h Di in X h Di "tf O P

Cd •rl ~

P

CD

•rl

P

CD ........ ........................

X ODiEDj β CDOi£Q)CDOiEO<CDOijsQi

(0 g < 0) -rl < (/) <CO < CO

p 3 ,¾ (OH T) Η Λ -D £ Η β g CN I co ^ ^ A h Id a · a p* · a* · g g S SS s2° S2° B§

]2 L/lv ΙΟ/ΟΟΰ D I

μ «(0 01 μ -μ -η tn c -μ Φ Φ cn we ό 3 >ι on ή n) ‘μ J ·μ > tn α a ο » όι to μ μ μ μ toi μ ο) — m ••ο m ο * φ μ >ι μ μ 3 ·· ι ο ό μ 3 • tn μ G) μ ΟιΛ ΟΐΌ >i Λ CQ 3 >ι Ό Ή tP Ή ΰ ·μ >ι·μ ©· μ <—I £>ι μ θ' μ» η · η ο) ηόη μ win . μ λ ·μμ οο φ ό φ λ ο) wo) μ ε φ φ ch c id - ν οι · a μ 3)·οιω,αΦ·μω>·>μ 00 ·Η σ> ·Η & -Ηώ·Η>ι Ο > Ο 3 ϊμ tø σ> ffi 3 < a in a 2 a in a 31 Ο Ο Ν Η J 3> IN ti Η__ tn •Η μ μ C tn Φ 3 ε μ tn •μ *· a μ μ (Q Q) ^ μ μ α) χ φ η μ 3 · & co μ μ • CQ 3 (* 3 >ι <0 CQ m νο μ οι <α μ η μ · λ · c μ —μ ·μμ ·μμ οο ό μ φ ό φ ο μεΦΦ ηφφ οι ό - ora ό · tn ό ό φ · μ μ ό · μ μ

οο Ο οο a >ι Ο IN 3 © Ο > in 3 3 OOCC

< Ο IN CO 31 Ο ^ Η CK Ο Ο IN Η Η Ο Γ' Η Η μ co

C

φ μ . tn Φ C Η μ γΗ KO (0 μ ι χ tn ω ε μ 3 C Φ •μ Φ Ό Ό ε Ό C0 φ οι ·μ η 2 -μ > μ μ a κ μ c ΦΙ φ 3 μ μ a <οΐ > μ · μ m ••33 μ - μ λ μμ μ 3 ·μ ω ·· ο ό · _3 σιμοιμμοιοι οι ω © >ι 3 VO ·μ 0Q ·μ Χ3 Ό ΉΧΝ ·μ Ό μ Οι μ η · η φ 3 η >ιΗ μ η -©-μ ·μχι οο ΦΌΦΛίΚ φ ό φ φ φ μ φμ ηφφ οι οι · οι μ ι ο>·ο>μ a · μ λ ό · μ w οο ·μ σι ·μ © a ·μ «η ·μ 3 ·μ η 3 >ι Ο ιη 3 >ι < a m a 2 a κ κι κ η a νηρ o^hj μ <ο w μ μ ·· ·· ·· ·· .............. ·· ........

ο ο a ε a ο a ε a ο a ε a ο a ε a μ ε < ω < co < ω < co ^ 3 μ w ι ι η ό - φ ω Φ χ ω ι μ a η ε ο» φ ο^ί^3 φ μ a ϋΦ<ο·μμ λ (0(¾. <ο 3μμ μ<ο <ο t n co ο ν η (¾ μ «a ε* < hz υ ο οι ω a <ο π DK 167689 B1 /***%

CD

Cfl >ι

rH

o ρ °0 >i Ρ Λ

Di PØ Od CQ CG HØ

P >i Ό > Dl -P

<n . j -μ -η ffi c d 1 O ^ C > . ^ p

vd ·Η σ> ΌΙ d æ (Ο I CQ P

"ψ Η · P ·Ρ * »Q

CO 0 Ό ·· ,Q ί>π · · d) d H p 0 ~ο3ϋι·,θ,θ'θ·,ο·μ>·οω CO -H IS O © ON O C !B IN a Is

<C £ -tf O od ocnøH D> in co J

Ό

•Η -P

> d Λ ^ 0 co fl) e p CO Dl Ό 0 >1 Ή π -P i-t a > co o

DG Ό ® P -P -P

Η Η Ό d D)

• Dl P øl > £)l Is P d H

VD H CQ æ dffl h H

•^Jl H · ·· -P ·· -Ρ >—·+ΐΧ3 0 00 0 Η P 0 disdø 600 0 CN Οι · O-P > · > -Ρ Ό · -P co & co h ts a d fficNfBd ooo d >1 h < dinØH l-DCTilDH OIQH J &

II

a co • s 6 ø d

CO H

|S H

o(|i a ø

P O O

Dl P >i 0 Ό 6

CO -P Is -P

IS d XI ^ dl d Ό 3 P P ·Η d HØ CQ Τ3|Λ >0 Di p ό ok a -p ii cd • ·· *Θ* *H d d *0 D> >c Dl P >øl HP d 6 co h Di h K —'KP ch H · i—Ι·Ρ ·· P · *Q 03 co øTJøM dNdø d η ρ ø ·'

03 Dl · Dl Ρ >·>Ρ > · O CO ØH

co -hs-h-θ- fB o3 s d æ is a is ό „

<C Od 'tf Od S D D D H DllDCOdl -HU

Cfl o a 0 o

^ Λ CO

0 " *

co P

.p Od > o oaeaooieaoKea ~ -p m-4 g < co < co < co -PØ ""•Η Η I *10 Η Ό 0 § §j -¾ ø i g d > d

H g+JØØ H -P X

ø p 0>0Ρ -POP oø II d

X) 0 S p > CO d 0 HH _ H

co a odø o ø di øø _p eh < aæ a > ø o ε ® λ DK 167689 Bl 14

Morfologiske karakteristika

Kulturerne A82846, A82846.1 og A82846.2 producerede et ekstensivt substrat-mycelium. Lufthyferne dannede lange 5 kæder af conidia med et spindelvæv-lignende udseende, som klassificeres som karakteristisk for ikke-streptomyceter i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, supra.

I alle kulturerne var sporeoverflade-ornamentikken glat, 10 og sporeformen var cylindrisk. Sporestørrelsen var 1,2- 1,3 x 0,4-0,5 tun for A82846 og 1,4-2,2 x 0,3-0,4 um for A82846.1.

Ved dyrkning under submerse rysteflaske-betingelser ud-15 viste A82846 en minimal fragmentation, A82846.1 udviste en udstrakt fragmentation, mens A82846.2 udviste en moderat fragmentation.

Fysiologiske karakteristika 20

Kulturerne A82846 og A82846.1 producerede begge syrer ud fra: arabinose, cellobiose, dextran, fructose, galactose, glucose, α-methyl-D-glycosid, glycerol, inositol, lactose,’ maltose, mannitol, mannose, melibiose, rhamnose, ri-25 bose, saccharose, trehalose og xylose, men producerede ikke syre ud fra adonitol, cellulose, dulcitol, erythri-tol, inulin, sorbitol og xylitol. A82846 producerede også syre ud fra: ethanol, glycogen, melezitose, raffinose og salicin, men A82846.1 gjorde ikke. Begge kulturer udnyt-30 tede acetat, citrat, lactat, malat, oxalat, propionat, pyruvat og succinat, men udnyttede ikke benzoat, mucat og tartrat. Kulturen A82846.1 udnyttede butyrat, men A82846 gjorde ikke.

35 A82846 og A82846.1 virkede nedbrydende på casein, hypo- xanthin, tyrosin, urinstof og DNA, men virkede ikke nedbrydende på adenin, calciummalat eller xanthin. Begge DK 167689 B1 15 kulturer hydrolyserede stivelse, men hydrolyserede ikke esculin eller hippurat. De virkede reducerende på nitrat, gjorde gelatine flydende, overlevede en temperatur på 50 °C„i 8 timer og producerede catalase, I^S og phosphatase.

5

Kulturerne A82846 og A82846.1 havde identiske mønstre mht. antibiotikum-resistens. De var resistente overfor bacitracin (10 enheder), cephalothin (30 ug), gentamicin (10 ug), lincomycin (2 ug), oleandomycin (15 ug), peni-10 cillin G (10 enheder), streptomycin (10 ug), vancomycin (30 ug), tobramycin (10 ug), erythromycin (15 ug), nali-dixinsyre (30 ug), polymixin B (300 enheder), trimethoprim (5 ug) og sulfadiazin (300 ug), og de var sensitive overfor neomycin (30 ug), rifampin (5 ug), tetracyclin 15 (30 ug), chloramphenicol (30 ug), novobiocin (30 ug) og mandelamin (3 ug).

A82845 og A82846.1 bevirkede hver især farvning af Gram +, men bevirkede ikke nogen hurtig farvning af syre.

20 A82846 producerede melanoid-pigmenter, hvilket A82846.1 ikke gjorde.

Cellevæg-analyse 25 Hydrolyserede hele celler af A82846 indeholdt meso-iso-meren af diaminopemelinsyre og sukkerarterne arabinose og galactose. Kulturerne havde en cellevæg af Type IV ifølge Becker et al., supra. Sukkermønsteret er af Type A (Lechavalier, supra). Kulturerne producerede ikke myco-30 liske syrer (LCN-A).

Identitet af stammen A82846

De chemotaxonomiske og generelle kulturkarakteristika af 35 stammen A82846 er i overensstemmelse med stammens til-skrivelse til slægten Nocardia Trevisan 1889 [V. B. D. Skerman, V. McGowan og P. H. A. Sneath, (red.) "Approved 16 DK 167689 B1

Lists of Bacterial Names", Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 225-420 (1980)].

Lighedskoefficienter blev beregnet ud fra de egenskaber 5 af fjorten Nocardia-arter, som er publiceret af Gordon, Mishra og Barnett, supra, og fem stammer fra Lilly's kultursamling. Man benyttede koefficienten benævnt Jaccard [se P. Η. A. Sneath, "The Application of Computers to Taxonomy", J. Gen. Microbiol. 17, 201 (1957)] og den 10 simple matching-koefficient [se R. R. Sokal og C. D.

Michener, "A Statistical Method for Evaluating Systematic Relationships", Kan. Univ. Sci. Bull. :38, 1409 (1958)]. Resultaterne af disse sammenligninger er opsummeret i tabel II.

15 20 25 t 30 35

Tabel II

17 DK 167689 B1

Lighedskoefficienter for A82846 og 19 andre Nocardia-art.er 5 ---

Kultur Lighedskoefficient

Ssm Sj A82846 100 100 10 N. aerocolonigenes 84 76 N. aerocolonigenes (A42125)* 83 78 N. orientalis (M43-05865) 78 72 N. orientalis (A51568.1) 78 72 N. orientalis 75 68 15 N. orientalis (M5-18215) 73 66 N. orientalis (M5-18260) 73 66 N. madurae 73 63 N. hirsuta 62 60 N. autotrophica 62 53 20 N. dassonvillei 62 50 N. ·amarae 62 46 N. brasiliensis 56 43 N. vaccinci 56 43 N. transvalensis 48 38 25 N. caviae 48 - 32 N. pelletieri 48 24 N. asteroides 46 23 N. carnea 43 25 30 * Tallene i parantes angiver, at der er-tale om stam mer fra Lillys kultursamling.

35 18

Ulv ΙΟ/Οΰΰ D I

Eftersom N. madurae er blevet overført til slægten Acti-nomadura, blev denne kultur unddraget bedømmelse. To arter, N. aerocolonigenes og N. orientalis, havde gode lig-hed.skoefficienter. Der blev foretaget laboratoriesammen-5 ligninger imellem A82846 og disse to arter. I den efterfølgende tabel III er anført resultaterne af disse sammenligninger .

10 15 20 25 30 35

Tabel III

19 DK 167689 B1

Sammenligning af egenskaber hos A82846, N. orientalis og N..aerocolonigenes 5 -:----

Kultur _a N. ori- N. aeroco-

Egenskab 82846 entalis lonigenes 10

Producerer lufthyfer + + +

Hvidt luftmycelium + + +

Producerer conidia + + +

Sporeoverflade glat + + +

Sporeform cylindrisk + + - 15

Producerer opløseligt pigment + -

Gram + + + +

Syre hurtig -

Udviser fragmentation + + +

Producerer catalase + + +

Hydrolyserer: esculin + + hippurat - stivelse + + _ + 25

Camalat - + +

Reducerer nitrat + + ‘

Nedbryder: adenin - casein + + + 30 hypoxanthin + + + tyrosin + + + urinstof + + + xanthin - 35

Tabel III (fortsat) DK 167689 Bl 20

Kultur _a_ 5 _ - N. ori- N. aeroco-

Egenskab 82846 entalis lonigenes Gør gelatine flydende + + ^ Producerer phosphatase + + +

Overlever ved 50 ‘C i 8 t. + +

Producerer syre ud fra: adonitol + arabinose + + + cellobiose + + + 15 erythritol + glucose + + + α-Me-glucosid + + glycerol + + + inositol ++ + 20 -lactose + + + maltose + + + mannitol + + + mannose ++ + melezitose + -.- 25 melibiose +- + raffinose + - rhamnose ++ + sorbitol -- trehalose ++ + 30 xylose ++ + kontrol --

Udnytter: benzoat -- Λ citrat ++ + 35 mucat --

Tabel III (fortsat) 21 DK 167689 B1

Kultur a · 5 N. ori- N. aeroco-

Egenskab 82846 entalis lonigenes succinat + + + tartrat - - kontrol -

Resistens overfor: bacitracin (10 enheder) + cephalothin (30 ag) + + + .gentamicin (10 ug) +

_L O

lincomycin (2 ag) + + + neomycin (30 ug) oleandomycin (15 ag) + + + penicillin G (10 enh.) + + + 20 rifampin (5 ug) streptomycin (10 ag) + + tetracyclin (30 ag) tobramycin (10 ag) + + vancomycin (30 ag) + + „ chloramphenicol (30 ag) 25 erythromycin (15 ag) + nalidixinsyre (30 ag) + + ' novobiocin (30 ag) - + polymixin B (300 enh.) + + + trimethoprim (5 ag) + + + g + = stammen har den angivne egenskab. - = stammen har ikke den angivne egenskab.

35 Lighedskoefficienterne blev atter beregnet under anvendelse af et stort antal enhedskarakterer. Resultaterne er opsummeret i tabel IV.

22 DK 167689 B1

TABEL IV

Lighedskoefficient for A82846, Nocardia orientalis og Nogardia aerocolonigenes 5

Kultur Lighedskoefficient

Ssm Sj A82846 100 100 10 N. orientalis 81 76 N. aerocolonigenes 73 65

Hverken N. orientalis eller N. aerocolinigenes har myco-15 liske syrer i cellevæggene. Gordon, supra, beskriver tre nøgleegenskaber, som kan hjælpe med til at skelne N. orientalis fra N. aerocolonigenes. En sammenligning af A82846 med Nocardia-arterne under anvendelse af Gordon's nøgleegenskaber er vist i den efterfølgende tabel V.

20

TABEL V

Sammenligning af nøgleegenskaber af A82846, Nocardia orientalis og Nocardia aerocolonigenes 25 EGENSKAB- 4

Producerer syre fra Resistens over for 30 Me-a- -

Kultur Erythritol glucosid Lysosym A82846 - + + N. orientalis + + - N. aerocolonigenes - +

O D

23 DK 167689 B1

Selv om A82846 ikke på identisk måde passer med nøgleegenskaberne af nogen af Nocardia-stammerne, har den en større affinitet til N. orientalis med hensyn til kulturkarakteristika, og den har en høj lighedskoefficient med 5 N. orientalis. A82846 minder også om N. orientalis derved, at den producerer et glycopeptid-antibiotikum. A82846 klassificeres derfor som en stamme af Nocardia orientalis (Pittenger og Brigham, 1956) Pridham and Lyons 1969. Eftersom N. orientalis er anført i the Approved 10 Lists of Bacterial Names, supra, er der tale om en godkendt publiceret art.

Kulturen A82846.1 er en kemisk induceret mutant af A82846-kulturen. De karakteristiske træk, hvorved 15 A82846.1 afviger fra A82846, er angivet i den efterføl gende tabel VI.

20 25 30 35 24 υι\ ισ/σοΰ d i

TABEL VI

Sammenligning af forskelle imellem A82846 og-A82846.1 5 Egenskab A82846 A8J2846.1

Fragmentation minimal rigelig

Kolonistørrelse 7 mm 5 mm

Kolonioverflade hård blød

Lufthyfer rigelige spor

Bagsidefarve mørkebrun lysebrun

Opløseligt pigment +

Producerer syre fra: ethanol + ig glycogen + melezitose + raffinose + salicin +

Udnytter: 20 α-Me-glucosid + glycogen + melezitose + sorbose + butyrat - +

Melanoidpigmenter + . +

ZD

A82846.1 afviger ligeledes fra A82846 mht.‘ den producerede mængde af antibiotisk aktivitet. De mest iøjnefaldende af de øvrige forskelle imellem stammerne er, at A82846.1 ^ i modsætning til A82846 ikke producerer luftmycelier og et skelneligt opløseligt pigment.

Kulturen A82846.2 er en naturlig variant af kulturen A82846. Det betyder, at de identificerende egenskaber af A82846.2 i det væsentlige er de samme som de egenskaber,

O O

der kendetegner A82846. Den væsentligste forskel imellem A82846 og A82846.2 er, at den sidstnævnte kultur produce- DK 167689 B1 25 rer signifikant større mængder af antibiotikummet A82846, når den dyrkes i rystekolber, end A82846-kulturen selv gør.

5 Ligesom det er tilfældet med andre organismer, kan egenskaberne af de A82846-producerende kulturer ifølge opfindelsen, dvs. Nocardia orientalis stammerne NRRL 18098, NRRL 18099 og NRRL 18100, undergå variationer. Det betyder, at man kan opnå afkom af disse stammer ved i sig 10 selv kendte metoder. For eksempel kan man opnå varianter ved naturlig udvælgelse, og mutanterne kan opnås ved behandling med forskellige kendte fysiske og kemiske mutagener, såsom ultraviolet lys, røntgenstråler, r-stråler og kemikalier, eksempelvis N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-15 guanidin.

Man kan udvikle rekombinante stammer ved at transformere Nocardia orientalis stammerne under anvendelse af velkendte procedurer. På grund af lighederne imellem Nocar-20 dia og Streptomyces kan de transformationsteknikker og rekombinante vektorer, som er blevet udviklet til anvendelse i forbindelse med Streptomyces, også anvendes til transformation af Nocardia-stammer. Gennem anvendelse af rekømbinant teknologi kan Nocardia orientalis stammerne 25 transformeres til udtrykkelse af en række gen-produkter udover de antibiotika, som disse stammer-producerer. For .1 eksempel kan man transformere stammerne med en rekombi-nant vektor, som fremkalder resistens over for et antibiotikum, over for hvilket stammen normalt er sensitiv.

30 De således opnåede transformanter vil ikke -kun producere A82846-antibiotika, men også det resistens-fremkaldende enzym, som tillader en udvælgelse af de transformerede celler fra vildtype-cellerne. Ved at anvende lignende teknikker kan man endvidere modificere de omhandlede 35 stammer til at introducere flere kopier af de endogene antibiotikum-biosyntese-gener med henblik på opnåelse af et større antibiotisk udbytte. Mutanter af Nocardia 26

Ulv lb/b«y b I

orientalis stammerne NRRL 18098, NRRL 18099 og NRRL 18100, som opretholder de karakteristika, der kendetegner A82846-produktionen, omfattes af den foreliggende opfindelse .

5

Dyrkningsmediet, som benyttes til dyrkning af Nocardia oriéntalis-kulturer, kan være valgt blandt et antal forskellige medier. Af hensyn til økonomisk produktion, optimalt udbytte og en tilstrækkelig let isolation af pro-10 duktet foretrækker man imidlertid bestemte dyrkningsmedier. Foretrukne carbonhydrat-kilder til fermentering i stor målestok kan således være glucose og kartoffeldex-trin, selv om man også kan anvende ribose, xylose, fructose, galactose, mannose, mannitol, opløselig stivelse og 15 lignende.

Foretrukne nitrogenkilder er enzym-hydrolyseret casein og kødpeptoner, selv om man også kan anvende gærekstrakt, syrehydrolyseret casein, kødekstrakt, fiskemel, levermel 20 og lignende.

Blandt de nærende uorganiske salte, som kan inkorporeres i dyrkningsmediet, kan nævnes de sædvanlige opløselige salte, som kan tilvejebringe ioner af zink, natrium, mag-25 nesium, kalcium og ammonium samt chlorid-', carbonat-, sulfat- og nitrationer samt andre ioner. - Væsentlige sporelementer, som er nødvendige for organismens vækst og udvikling, bør også inkluderes i dyrknings-30 mediet. Sådanne sporelementer optræder hyppigt som uren heder i andre af de bestanddele, der indgår i mediet, i mængder, som er tilstrækkelige til at imødekomme organismens vækstkrav. Hvis skumning er et problem ved fermentering i stor målestok, kan man sætte små mængder (nærmere 35 bestemt 0,2 mm/liter) af et antiskummiddel, såsom poly-propylenglycol, til fermenteringsmediet.

27 DK 167689 B1

Til produktion af passende store mængder A82846-antibio-tika foretrækker man submers aerob fermentering i fermenteringstanke. Små mængder af antibiotikummet kan opnås ved dyrkning i rysteflasker. På grund af den tidsforskyd-5 ning i den antibiotiske produktion, som sædvanligvis er forbundet med en podning af store tanke med organismens sporeform, foretrækkes det at anvende et vegetativt podestof. Dette vegetative podestof fremstilles ved at pode en lille mængde af dyrkningsmediet med organismens spore-10 form eller myceliefragmenter, hvorved man opnår en frisk, aktivt voksende kultur af organismen. Det vegetative podestof overføres derefter til en større tank. Mediet, der anvendes i forbindelse med det vegetative podestof, kan være det samme som det medium, der anvendes ved større 15 fermenteringer, men andre medier vil også kunne anvendes.

De omhandlede A82846-antibiotika produceres af de A82846-producerende organismer, når disse dyrkes ved temperaturer på mellem ca. 23 og ca. 37 “C. De optimale temperatu-20 rer for A82846-produktionen synes at være omkring 30-31 eC'.:

Som" det er sædvanligt med dyrkningsprocesser under submerse aerobe betingelser, blæses der steril luft ind i 25 beholderen igennem bunden, mens mediet omrøres med sædvanlige turbinepropeller. Fermenteringens- maksimale op- tagelse af oxygen under de betingelser, der hidtil har været anvendt, har ikke oversteget omkring 0,2 mM/li-ter/minut. Generelt bør beluftningshastigheden og omrø-30 ringshastigheden holdes på et tilstrækkligt niveau til, at niveauet af opløst oxygen kan opretholdes på 50 % mætning eller derover.

Produktionen af A82846-antibiotika kan følges under fer-35 menteringen ved at teste prøver af fermenteringsvæsken for antibiotisk aktivitet over for organismer, som vides at være følsomme for antibiotikummet. En nyttig testorga- i

Ulv 10/009 D I

28 nisme er Bacillus subtilis ATCC 6633. Bioanalysen foretages bekvemt ved den velkendte pladetest med agar-brønde.

Eft_er produktionen af A82846-antibiotika under submerse 5 aerobe fermenteringsbetingelser kan de dannede antibiotika udvindes fra fermenteringsmediet ved i sig selv kendte metoder. Den antibiotiske aktivitet, som er produceret under fermenteringen af A82846-producerende organismer, optræder såvel i myceliet som i fermenteringsvæs-10 ken. Den maksimale udvinding af A82846 . foregår derfor ved, at man først indstiller pH til 10,5 for at frigøre A82846 fra myceliet, hvorefter man filtrerer mediet for at separere væsken fra myceliemassen.

15 A82846 kan udvindes fra den filtrerede væske ved en række forskellige teknikker. En foretrukken teknik består i, at man justerer den filtrerede væske til en pH-værdi på omkring 7 og adsorberer væsken på en kationbytterkolonne, eksempelvis Dowex XF5-43278, Dowex-50 eller Amberlite IR-20 120. Det aktive materiale elueres fra harpiksen ved hjælp af'· et egnet opløsningsmiddel, eksempelvis en fortyndet NH^OH-opløsning. De aktive fraktioner koncentreres derefter under vakuum, adsorberes på en makroretikulær harpiks, eksempelvis Diaion HP-20 eller Amberlite XAD-4, og 25 elueres med et egnet opløsningsmiddel, såsom en blanding af vand og isopropanol (95:5), der indeholder 1 % eddike-syre, til opnåelse af A82846. Det aktive materiale kan også elueres med blandinger af vand og acetonitril eller blandinger af vand og methanol, der indeholder små mæng-30 der syre.

A82846 kan separeres i de individuelle komponenter A82846A, A82846B og A82846C ved tilsvarende procedurer.

En foretrukken separationsprocedure involverer silicagel-35 chromatografi (C^g eller Cg) i omvendt fase.

Alternativt kan de faste bestanddele fra dyrkningen, 29 DK 167689 B1 herunder mediets bestanddele og myceliet, anvendes uden ekstraktion eller separation, men fortrinsvis efter fjernelse af vand, som en kilde for A82846. Efter produktionen af A82846 kan man således tørre hele fermenterings-5 væsken ved lyof ilisering, ved troml et ørr_ing eller ved azeotropisk destillation efterfulgt af en tørring. Den tørrede væske kan derefter blandes direkte i en foderblanding.

10 De omhandlede A82846-antibiotika har fremragende virkning in vitro og in vivo over for Gram-positive patogene bakterier. En særligt uventet egenskab ved disse antibiotika er deres lange halvtid i serum. Ved intravenøs indgivelse til rotter har vancomycin således en halvtid i serum på 15 45' minutter, hvorimod A82846A og A82846B hver har en halvtid på 2,2 timer.

De minimale inhiberingskoncentrationer (MIC'er), ved hvilke de omhandlede A82846-antibiotika inhiberer bestem-20 te bakterier, er angivet i de efterfølgende tabeller VII og VIII. MIC-værdierne i tabellerne VII og VIII blev bestemt ved standard-agarfortyndingsforsøg.

25 30 35 30

UK IO/OQy b I

• s.

3 · ε 3

ϋ E IS

VD H i—1 i—1 i—1 i—! i—I (N 03 M1 I 3 3 'Φ P >

- CO CG H

N D

CO > < -H Q) P Ό •H 3

CO P

C co

3 (D

co p

^ I

H CO)

S -HP

\ ω H CO

ø vo in in in in m HQ) a-^csicMCMOJininnjin h -n —'CO HHHHMCMHCMin O'©

(N Ή .C

u co oooooooooii ii a

H < £ P

2 < Q) ϋ Ό • \ *s

Q) H

p ε ε ο) ε ^ ε (åen ε pa 3 < (li X UD 00

H ^ in in in in in P(N

P co NNNNinmNin C h Ο N HHHrlNNrlNlT) till 0) rl CO --------Ό P Ό Λ < OOOOOOOOOI I I I I COQ) " Ή H !>

p CO

-C Ο >

(0 S-l H

I I P

-VO D Λ Η (0 CO Η (S Ο <Ν HQ)

CO IS Μ ϋ -ri X

< CM <Ν CO Η · O X

X) O Ό Μ* XJO σ> Η Η

Η H3OWC0C0CMvOO.cO 00 X

3 ·ΗΟ(·ΟΗΗ0Χ(ΜΟΟ VO (Μ 0)11

ΗΊ'ψΗΌΌ (MX S

D) X>XCOHHCOQQQ)Q)IX X) I

C Ε Ε II IS (0(0 0)'

H CQCOCOCODDC33NNM<3CO

C 33 33a)(P(l)ftftQl5H(ilO .0)0) x Q)a)Q)Q)O,dO)aaa)Q)UHC εε u DDDDHH 03333WCH εε Η 3333aai*^DHH OD) 3 (0

> 333333a0) D)H Ή Η ε 3 P P

C D H 3 Sh CO CO

H COCOCOCOCGCOCOCQCOHH033

Q) 0) 333333333 ϋ C (d PP

η ε ooooooooococo a c c k CO 000000000333 CO Q) 0)

0) Η OOOOOOOOOHHH33 P_P

P C OOOOOOOOO Η Η X! H C COCO

X 3 OOOOOOOOOXXOHO HH

3 D) HHHHHHHHH a DjH 3 £ (li CO

X) U 3 3 η o χ:χ:χ:χ:χ:χ:χ;χ:χ:οο3ωΌ d d p p a a a a a a a a a ε ε x: x 3 i i

C CO 33333333333033 CC

(0 3 PPPPPPPPP33C0HC0 HH

H COCOWCOCOWWWCOKKWXPj HH

H O HH

> D HH

P 0 O

J Η Η H

ω > c a CQ 3 ε < C Oj < Ε-· H 3 Ό 3] DK 167689 B1

C

•H O

0 B i 0 in

O H

c o (0 > o

VI

in (NO H *"

g P OO OO OCN

\ N< s s I s "I

O) m cn cn in cn Hin

=i CO II CN I I CN •^cNinomHOinLnH

CO ««ssssss O < ohoohooo

H

2 N< in in

vO (N CN O

CO O s vO

CN *-0 O O *· H

C CO Η » I I Η I

•ri < i h in in i in

O inicNHintnincN

>, CNIOHOCNCNCNH

C WKVVSkwSV

o oooooooo ϋ ·' vi C in (0- o CN in > « o «o in *

H « O « « O

C5) I CN I Η O I

O μ μ m i in i i in d)(D4-> cn in cn in incN

P H i CD H CN H CNOCNH

Ν' Id E -P SV«. SSSS

vo 4-)(dW o O O O H o o

CO C +J CD

cn < co -μ

CO

< O O CN O O CNCNH(NCNHN<CN

V

<

Ni

vO

CO W P

CN H

CO V 0) d)

rt* -H (0 D< CD

g CD H Di Ή

m CO μ CD C 3 D CD

(0 DCUCODiOHCD

0Ό Hl E tJi> 3 C p P-rlD)3 POHi

O) 3 Di O CD · H C -P

+J (0(D>iCDi(0(0D

H D. Di CD CD CD g

> 01 CD

•H 0) ddcococdcocdcd 4J £ 00333333

CD OOOOOOOO

Η (0 H OOOOOOOO

H C OOOOOOOO

H O (0 OOOOOOOO

> μ OlHHOOOOOO

J H O DDiDiDiDiDi

m > DiDCDCDCDCDCDCD

p («(βμμμμμ^ < C pipppppipp E-ι η ρρρρρωωω 32 UIV 10/083 B l

Et vigtigt aspekt ved den antimikrobielle aktivitet af A82846-forbindelserne er disses aktivitet over for anaerobe bakterier. Denne aktivitet er illustreret i tabel IXV som opsummerer aktiviteten af A82846A og A82846B over 5 for forskellige anaerobe bakterier som bestemt ved standard- agar fortyndings for søg. Endepunkterne blev aflæst efter 24 timers inkubation.

10 15 20 25 30 35 DK 167689 Bl 33

C

•ri o <m o 1 ^ O in i co

rj CM in CM

-S . . rH

> h O O a in in CQ -

O ri CO O

VO M* I III M* oo i vo in m in m vo oo csi in o o) O (S η · cm m v v - - - 1 CM M< Η ·<ί M<

<ζ o O HOOON ΠνΟ AVOID

H

E

O)

Λ CM

w *·

eC in O

O M< cm I

H CD H in

g oo - CM

^ CM O Ml Η ω

ij CO I 1 -CM CM

O) (£ lOCMCMCMLnHrHOlinin H M< h , q (nj invncMcM oo co co co U -in min -M< cm o - - cm co cm cm cm co co

(I) o *·*· O I - -O O H CM H ri H CM CM

4J VlOOOVlrlriO O VI VI A r-i A A A ι-i r-i r -

h CM

H

(D H '

r> I O

o f-ι in I

i-ι 0)4-> cMinin inuo m

Q) Η ε CD rH cm in cm in cm o CM

c .2 § to oooococmooocoooo co r-ι cm co co co co

co β P CD VI VI I VI CM <N CM CM

< CO P H r-H r-l r-i Η H

i, · CD Λ A

O σ> co d cn

U_1 HHHHtd^HHCOd-Hrl 00. C r-i r-l r-l H

u P ΉΌ O CO

S o Λ CD b 3

> -π o ε ... o o E

O P CO H 3-1 -Η -H 3 CO CO >i 3 <D 0) CD EC Ek m CCHCOPtCPCD OCD 30 W J)S ¢0 ·Η(ί fififi ® S1 m 2 2 £ Οι H Dl ε Ή li HH li-rl ϋ 2^229954 o *· -ri c P 0 (0 -ri -Η H (ti ·· -H 0 C -H OD -H 0 M O-rlOcti^+JXICDCOCOCO c H -d ‘d ^ ·9 h c CD -HC-rimuOiti-PCCCE o Ί 2 S £L P £ 2

2 g i4-iiH-POO>‘HC0dOOC E CD +J (0 cn i-H >1 OJ

M< P E <H3-iOi3H(0<DlHGCnOO-i-l E -(OOlHrH^jCOC

00 CD co -riCDCDCDCOi-iitiOcOOOk (0 MxiojdO

(Μ -Η -μ ΌΟι(0(0(ΰΟι!>ΟΕυϋ(1) P P P Ε > O E E

oo IhCO OOP CO P P

c CD aEEECOCOCOCOCOPPO COCOCOWCO-H-H

+J 0) PpppppPPPPtQtfl (D d)(D(D<DCDi-il-j ih x > -Η·Η·^·Ηθϋϋϋϋο)θΡ > ¢¢001300

(O (ti -Η ΌΌΌΜΟϋΟΟΟί-ΐ^-Η -H "ri "ri Λ n "ri Μ M

O -P ΉΉΉΟΟΟΟΟΟΡΡί P O O O O O O O

jj -H MPkPOOOOOCOCQO (O In 3-1 3-1 i-ι f-l <0 <0 tc m 0) CD PPPOOOOOOOO-H 01 (D (D CD (D CD Λ Λ

H P Λ O COCDCDiflPPPPPPPQ Q) ^ » t! n ti S S

-π o Ot o o oo aaaaaaftp c 9999222 J > u I rlHHtiOOOOOOOH I £ $ ® $ P ? ω -H CD g OOUWfcCUCUOjtiU&iCUOi E DQCDCQCQOQtufc OQ P (0 (O fø <31 3¾ ,¾ E-ι < < 0 DK 167689 B1 34

De omhandlede A82846-antibiotika har også udvist antimi-krobiel aktivitet in vivo overfor eksperimentelt inducerede infektioner i laboratoriedyr. Når to doser af testforbindelsen blev indgivet til mus, som var blevet infi-5 ceret eksperimentelt med testorganismen, blev den observerede aktivitet målt som en ED^q-værdi [den effektive dosis i mg/kg til beskyttelse af 50 % af forsøgsdyrene; se Warren Wick et al., J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961)].

De observerede ED._„-værdier for illustrative forbindelser

oU

10 er angivet i den efterfølgende tabel X.

Tabel X

In vivo aktivitet af A82846 antibiotika 15 - EDj-g-værdia

Staphylococcus Streptococcus Streptococcus Forbindelse aureus pyogenes pneumoniae 20 A82846A 0,19 0,19 0,17 A82846B 0,19 0,20 0,18 A82846C 2,18 2,71 5,87

Vancomycin 1,3 0,72 1,52 a mg/kg x 2; doser indgivet subcutant til mus 1 og 4 timer 25 efter infektionen. 1 et væsentligt aspekt af deres antibakterielle aktivitet er de omhandlede A82846-antibiotika nyttige til behandling af pyelonephritis. For eksempel viste A82846A og

OU

A82846B sig at være mere effektive end vancomycin med hensyn til at give beskyttelse i forbindelse med en eksperimentel nedarvet pyelonephritis-infektion i rotter. Denne test blev gennemført ved anvendelse af en procedure i lighed med den i US patentskrift nr. 4 208 403 beskrev-35 ne. De opnåede resultater er anført i tabel XI.

DK 167689 B1 35

Tabel XI

Aktivitet af A82846A og B i test med nedarvet pyelone-5 phritis hos rotter % rotter med en Dosering % rotter 4-log-reduktion

Forbindelse (mg/kg x 12) helbredt i indhold 10 - A82846A 10 88 100 5 75 88 2 63 100 15 A82846B 10 100 100 5 100 100 2 50 88

Vancomycin 10 63 100 20 5 38 88 2 38 75 ct

Doseres 2 gange pr. dag subkutant i 6 dage.

25 De omhandlede A82846-antibiotika er også nyttige ved behandling af endocarditis. For eksempel viste A82846A og * A82846B sig begge at være lige så effektive som vancomycin til behandling af en eksperimentel kateder-induceret endocarditis-infektion hos rotter. I denne test blev rot-30 terne klargjort ved, at man indførte et p-lastkateder i den højere halspulsåre, førte den ned i hjertets højre ventrikel og fastgjorde den sikkert. Dyrene fik lov at hvile i to dage, hvorefter testorganismen, Streptococcus faecalis X-66, blev indgivet intravenøst. Indholdet i or- g 35 ganismen var i forvejen 5 x 10 /ml. Der blev indgivet 0,5 ml.

DK 167689 B1 36

Forbindelserne blev indgivet subkutant 15 minutter forud for infektionen og derefter med intervaller på 12 timer i 14 dage, hvilket gav ialt 28 behandlinger. Dyrene blev holdt i 2 dage efter terapien. Derefter blev deres hjer-5 ter udtaget og homogeniseret, og efter fortynding blev de udsået på trypticase-sojaagar. Pladerne blev inkuberet 48 timer før tællingen.

Resultaterne af disse undersøgelser er anført i tabel 10 XII.

Tabel XII

g

Aktivitet af A82846A og B ved rotte-endocarditis-testen 15 ——------- 16 dage

Dosering % % med

Forbindelse (mg/kg x 28) helbredte 4-log-faldC

A82846A 20 100 100 20 A82846B 20 100 100

Vancomycin 20 100 100 g

Kateter-induceret endocarditis ved anvendelse af

Streptococcus faecalis X-66 z o ^Subcutane doser med 12-timers intervaller· i 14 dage

Q

% af de aflivede dyr med 4-log-fald.

Farmaceutiske formuleringer af de omhandlede A82846-an-tibiotika omfattes også af opfindelsen. Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen er kendetegnet ved, at det som aktiv bestanddel indeholder en antibiotisk forbindelse valgt blandt A82846, A82846A, A82846B og A82846C i kombination med et eller flere farmaceutisk acceptable

v O

bærestoffer. Således kan antibiotikummet, der fortrinsvis DK 167689 B1 37 foreligger i form af et farmaceutisk acceptabelt salt, formuleres til oral eller parenteral indgivelse med henblik på terapeutisk eller profylaktisk behandling af bakterieinfektioner. For eksempel kan forbindelsen blandes 5 med konventionelle farmaceutiske bærere og _excipienser og anvendes i form af tabletter, kapsler, eliksirer, suspensioner, sirupper, oblatkapsler og lignende.

De farmaceutiske midler, som indeholder et A82846-anti-10 biotikum, vil indeholde fra omkring 0,1 til omkring 90 vægt-% af den aktive forbindelse, almindeligvis fra omkring 10 til omkring 30 vægt-%. Midlerne kan indeholde sædvanlige bærere og excipienser, såsom majsstivelse eller gelatine, lactose, saccharose, mikrokrystallinsk cel-15 luose, kaolin, mannitol, dicalciumphosphat, natriumchlo-rid og algininsyre. Disintegratorer, der almindeligvis anvendes i de omhandlede formuleringer, omfatter croscar-mellosenatrium, mikrokrystallinsk cellulose, majsstivelse, 'natrium-stivelsesglycolat og algininsyre.

20

Midlerne kan indeholde tabletbindemidler, som kan være valgt blandt acaciegummi, methylcellulose, natriumcar-boxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidon, hydroxypropyl-methylcellulose, saccharose, stivelse og ethylcellulose.

25

Smørende midler, som kan anvendes i de omhandlede farma- « ceutiske midler, omfatter magnesiumstearat eller andre metalstearater,. stearinsyre, flydende silicone, talkum, voksarter, olier og kolloidt siliciumoxid.

30

Der kan også anvendes aromastoffer, såsom pebermynte, vintergrøntolie, kirsebæraroma eller· lignende.

Det kan være ønskeligt at sætte et farvestof til midlet 35 for at gøre dosisformen mere æstetisk af udseende eller for at gøre det lettere at identificere produktet.

DK 167689 B1 38

Til intravenøs (IV) anvendelse kan man opløse en vand-opløselig form af antibiotikummet i en af de sædvanligvis anvendte intravenøse væsker og indgive opløsningen ved infusion. Til dette formål kan man anvende sådanne væsker 5 som fysiologisk saltvand, Ringer's opløsning eller en 5 % dextroseopløsning.

Til fremstilling af intramuskulære præparater kan man opløse en steril formulering af en egnet opløselig saltform 10 af den pågældende forbindelse, eksempelvis hydrochlorid-saltet, og indgive opløsningen i et farmaceutisk fortyndingsmiddel, såsom vand til injektionsbrug, fysiologisk saltvand eller en 5 % glucoseopløsning. Man kan fremstille en passende uopløselig form af forbindelsen og indgive 15 denne i form af en suspension i en vandig base eller en farmaceutisk acceptabel oliebasis, eksempelvis en ester af en langkædet fedtsyre, såsom ethyloleat.

Til oral anvendelse er en steril formulering af en egnet 20 saltform af antibiotikummet, f.eks. hydrochloridsaltet, som er formuleret i et fortyndingsmiddel såsom destilleret eller demineraliseret vand, særligt anvendelig.

Alternativt kan enhedsdosisformen af antibiotikummet være 25 en opløsning af antibiotikummet, fortrinsvis i dettes saltform, i et passende fortyndingsmiddel -i sterile, her- t metisk tillukkede ampuller. Koncentrationen af antibiotikummet i dosisenheden kan variere, eksempelvis fra omkring 1 til omkring 50 vægt-%, i afhængighed af den be-30 stemte form af antibiotikummet, dettes opiøselighed og den dosis, som lægen ønsker at indgive.

Det omhandlede antibiotikum kan anvendes til fremstilling af et lægemiddel til terapeutisk behandling af bakterie-35 infektioner, især sygdomme fremkaldt af Gram-positive mikroorganismer, hos dyr. Et sådant lægemiddel indeholder en effektiv mængde af en antibiotisk forbindelse valgt DK 167689 B1 39 blandt A82846, A82846A, A82846B, A82846C og farmaceutisk accpetable salte deraf. En effektiv mængde af et A82846-antibiotikum er generelt en dosis på mellem ca. 0,5 og ca... 100 mg/kg legemsvægt. En foretrukken dosering er fra 5 omkring 1 til omkring 60 mg/kg af den aktive forbindelse.

En typisk daglig dosis til et voksent menneske er mellem ca. 50 mg og ca. 1,0 g.

Man kan indgive antibiotikummet i en enkelt daglig dosis 10 eller i flere daglige doser. Behandlingsprogrammet kan kræve, at indgivelsen sker over lange tidsperioder, eksempelvis over flere dage eller over 1 til 6 uger. Den mængde af den aktive forbindelse, som indgives for hver dosis, eller den totale indgivne mængde vil variere i af-15 hængighed af sådanne faktorer som arten og sværhedsgraden af infektionen, patientens alder og generelle helbredstilstand, patientens tolerance over for antibiotikummet samt den eller de mikroorganismer, som er involveret i infektionen.

20

En bekvem metode til behandling af infektioner består i at indgive antibiotikummet ved intravenøs infusion. Til dette formål inkorporerer man en steril formulering af et egnet opløseligt salt af antibiotikummet i en fysiologisk 25 væske, såsom en 5 % dextroseopløsning, hvorefter man langsomt indsprøjter den resulterende opløsning intrave- < nøst. Alternativt kan man anvende den såkaldte "piggyback metode" til intravenøs infusion.

30 I andre udførelsesformer har opfindelsen relation til (1) metoder til forøgelse af foderudnyttelseseffektiviteten hos husdyr, såsom fjerkræ, svin, får og kvæg, (2) metoder til at forøge væksten hos husdyr, såsom fjerkræ, svin, får og kvæg opdrættet med henblik på kødproduktion og (3) 35 metoder til forøgelse af mælkeproduktion hos mælkegivende drøvtyggere. Med henblik på at forøge foderudnyttelseseffektiviteten og fremme væksten indgiver man et A82846- DK 167689 B1 40 antibiotikum oralt i et passende foderstof i en mængde på mellem ca. 2 og ca. 200 g pr. ton af foderstoffet. Til kødkvæg er en mængde på mellem ca. 12 og ca. 3000 mg pr. dyr pr. dag velegnet. Til forøgelse af mælkeproduktionen 5 hos mælkegivende drøvtyggere foreslås en oral indgivelse af en daglig mængde på mellem ca. 0,04 og ca. 16 mg/kg legemsvægt (eller omkring 25-5000 mg/dyr/dag).

Det omhandlede antibiotikum kan således også anvendes som 10 aktiv bestanddel i et tilskudsmiddel til. dyrefoder. Opfindelsen angår derfor tillige et tilskudsmiddel til dyrefoder, som er kendetegnet ved, at det som aktiv bestanddel indeholder en antibiotisk forbindelse valgt blandt A82846, A82846A, A82846B og A82846C i kombination 15 med et eller flere agronomisk acceptable bærestoffer.

De omhandlede forbindelser vil normalt blive forhandlet i form af dyrefoder-forblandinger, som indeholder et eller flere agronimisk acceptable bærestoffer.

20

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 25 A82846 HPLC analysemetode

De følgende analytiske systemer til højtryksvæskechroma-tografi (HPLC) er anvendelige i forbindelse med A82846-30 komponenterne: 1. Kationbytterharpiks-kolonne

Kolonnebærer: Zorbax* SCX(4,6 x 150 mm)

35 System: Gradienteluering A:B (4:1) til A:B

(1:9) på 5 min., ophold i 15 min.

A = MeOH:0,1 M NaH2P04 (1:9) 41 DK 167689 B1 B = MeOH:O,9 M NaH2P04 (1:9)

Flowhastighed: 1,0 ml/min.

Detektering: UV ved 225 nm

Retentionstider: Er koncentrationsafhængige, 5 men er tilnærmelsesvis: A82846C = 6,6 min.

A82846B =8,9 min.

A82846A = 9,5 min.

2. Kolonne i omvendt fase 10

Kolonnebærer: Zorbax* ODS (4,6 x 150 mm)

System: Gradienteluering 1 % (NH^i^PO^CH^CN (95:5) til (1:1) på 20 min.

Flowhastighed: 1,0 ml/min.

15 Detektering: UV ved 225 nm

Retentionstider: A82846A = 7,3 min.

A82846C =7,6 min.

A82846B =8,0 min. 1 35 *Zorbax-kolonnerne er produkter fra E. I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, Delaware 19898, USA.

EKSEMPEL 2 25 Fremstilling af antibiotiket A82846 ved hjælp af kulturen A82846 A. Rysteflaskefermentering af kulturen A82846 30 Kulturen Nocardia orientalis NRRL 18098, enten i form af en lyophiliseret tablet eller i form af en suspension opretholdt i flydende nitrogen, benyttes til at pode et udsåningsmedium med følgende sammensætning: 42 DK 167689 B1

Udsåningsmedium

Ingrediens Mængde (%)

Glucose 1,0 5 Opløselig stivelse 2,0.

Gærekstrakt 0,5

Enzymatisk hydrolysat af casein* 0,5

CaCOg 0,1 10 Deioniseret vand op til 1 liter

Mediets pH indstilles til omkring 7,5 med NaOH før sterilisation.

15 *NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich,

NY

Skråkulturer eller plader fremstilles ved tilsætning af 2,5 % agar til udsåningsmediet. Den podede skråkultur in-20 kuberes ved 30 “C i et tidsrum på mellem ca. 10 og ca. 14 dage. Den modne skråkultur skrabes med et sterilt redskab med henblik på at løsne sporerne og fjerne og opbløde my-celiematerialet. Omkring en fjerdedel af de løsnede sporer’ og den således opnåede kulturvækst benyttes til at 25 pode 50 ml af et første trins udsåningsmedium.

<

Det podede første trins medium inkuberes i en 250 ml Er-lenmeyer-kolbe ved 30 "C i omkring 24-48 timer på et rysteapparat, der roterer i en cirkelbevægelse (5,08 cm) med 30 250 omdr/min.

Dette inkuberede første trins medium (0,5 ml) benyttes til at pode 50 ml af et produktionsmedium, der har den følgende sammensætning: 35 DK 167689 B1 43

Ingrediens Mængde (%)

Glucose 2,5

Soyabønnemel 1,5

Kartoffeldextrin 3,0 5 CaCOg 0,25 Mørk melasse 0,3

Syre-hydrolyseret casein* 0,5 Deioniseret vand op til 1 liter 10 (Inden sterilisationen justeres pH til 7,5 med

NaOH) *Hy-case, Sheffield Chemical Co.

Det podede produktionsmedium inkuberes i en 250 ml Erlen-15 meyer-kolbe med stor munding ved 30 °C i 4-5 dage på et rysteapparat, der roterer i en cirkelbevægelse (5,08 cm) med 250 omdr/min.

B. Tankfermentering af kulturen Λ82846 20

Med henblik på at tilvejebringe et større volumen podestof benytter man 10 ml inkuberet første trins medium, fremstillet som beskrevet i afsnit A, til at pode 400 ml af et andet trins vækstmedium med samme sammensætning som 25 første trins mediet. Dette andet trins vegetative medium inkuberes i en to liter Erlenmeyer-kolbe med stor munding t i omkring 48 timer ved 30 'C på et rysteapparat, der roterer i en cirkelbevægelse (5,08 cm) med 250 omdr/min.

30 Det således fremstillede inkuberede andet -trins vegetative medium (1000 ml) benyttes til at pode 100 liter af et sterilt produktionsmedium, fremstillet som beskrevet i afsnit A med den undtagelse, at det endvidere indeholder P-2000 antiskummiddel (0,3 g/liter). Det podede pro-35 duktionsmedium for lov at fermentere i en fermenteringstank (165 liter) med omrøring i 90-100 timer ved en temperatur på 30 °C. Luftgennemstrømningen i den omrørte be- DK 167689 Bl 44 holder (80 omdr/min.) benyttes til at opretholde et niveau af opløst oxygen på over 50 % luftmætning.

C.„ Alternativ tankfermentering af kulturen A82846 5

Man følger den i afsnit B beskrevne procedure med den undtagelse, at man anvender en passende mængde vegetativt medium til at pode omkring 3402 liter produktionsmedium i en fermenteringstank med volumen 4536 liter.

10 EKSEMPEL 3

Fremstilling af antibiotiket A82846 ved anvendelse af kulturen A82846.1 15

Kulturen Nocardia orientalis NRRL 18099, enten i form af en lyophiliseret tablet eller i form af en suspension opretholdt i flydende nitrogen, dyrkes under anvendelse af den i eksempel 2 beskrevne procedure med den undtagelse, 20 at produktionsmediet har den følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde (%)

Glucose 1,0

Kartoffeldextrin 2,0 25 Pepton* 1,0 -

CaC03 0;-2 Mørk melasse 2,0

Deioniseret vand op til 1 liter

Ingen pH-justering 30 *Bacto-pepton (Difco Laboratories) 35 DK 167689 B1 45 EKSEMPEL 4

Fremstilling af antibiotiket A82846 ved anvendelse af kulturen A82846.2 5

Kulturen Nocardia orientalis NRRL 18100, enten i form af en lyophiliseret tablet eller i form af en suspension opretholdt i flydende nitrogen, dyrkes under anvendelse af den i eksempel 2 beskrevne procudure med den undtagelse, 10 at det anvendte syrehydrolyserede casein er Amicase (Sheffield Chemical Co.).

EKSEMPEL 5 15 Fremstilling af rå A82846

Fermenteringsvæske (4200 liter) fra en fermenteringstank med volumen 4536 liter, hvilken væske var fremstillet som beskrevet i eksempel 2 afsnit C, blev indstillet til pH 20 10,5 med 5 N NaOH, og der tilsattes 3 % Celite 545 (fil terhjælp). Blandingen blev filtreret igennem en filterpresse, hvorefter pressen blev vasket med vand. Det kombinerede filtrat og vaskevand (4200 liter) blev indstillet’ til pH 7 ved hjælp af 5 N HCl (eller ^SO^) og over-25 ført til en kolonne bestående af Dowex-XFS-43278 (NH^+) harpiks (200 1 filtrat/10 1 harpiks). Kolonnen blev elu-eret med en strømningshastighed på 750 ml/min. De udtagne fraktioner blev analyseret, enten ved bioanalyse ved anvendelse af Bacillus subtilis eller ved højtryksvæske-30 chromatografi.

Kolonnen blev vasket med 5 kolonnevolumener vand, og der opsamledes prøver på 100 liter.

35 Det aktive materiale blev elueret fra kolonnen med 5 kolonnevolumener 0,05N NH^OH, idet der opsamledes fraktioner på 25 liter. De fraktioner, der indeholdt A82846, DK 167689 B1 46 blev kombineret og koncentreret i vakuum til et volumen på omkring 30 liter. Denne opløsning blev overført til en 10 liter kolonne indeholdende Diaion HP-20 harpiks i vand. Kolonnen blev vasket med tre kolonnevolumener vand 5 med en strømningshastighed på 300 ml/min._ Derefter blev vaskevandet borthældt. Det aktive materiale blev elueret fra kolonnen ved hjælp af en opløsning af vand og isopro-panol (95:5), der indeholdt 1,0 % eddikesyre, i en mængde på 100 ml/min. Der opsamledes fraktioner på 4 liter, som 10 blev analyseret ved bioanalyse og højtryksvæskechromato- grafi. De fraktioner, der indeholdt A82846 (#6-14), blev kombineret, koncentreret i vakuum og frysetørret til opnåelse af 356 g rå A82846.

15 EKSEMPEL 6

Isolation af A82846A og A82846B

A. Separation af beriget A82846A og A82846B

20 A82846 (30 g), fremstillet som beskrevet i eksempel 5, blev opløst i 500 ml vand og overført til en 30 liter rustfri stålkolonne under tryk og indeholdende silicagel LP-l/C^g ækvilibreret i 1 % NH^I^PO^. Kolonnen blev ud- 25 viklet ved anvendelse af en gradient fra 1 %'NH^I^PO^ (60 liter) til vand/acetonitril (88:12) indeholdende 1 % < NH^I^PO^ (60 liter) med en strømningshastighed på 250-300 ml/min. (maksimalt tryk 600 psi svarende til ca. 42,2 2 kg/cm ). Der opsamledes fraktioner pa 4 liter, og elue-30 ringen blev overvåget ved anvendelse af en UV-detektor ved 254 nm. De individuelle fraktioner blev analyseret ved højtryksvæskechromatografi. De fraktioner, som var rige på A82846A (#6-9), og de fraktioner, som var rige på A82846B (#10-17), blev hver især kombineret og koncentre-35 ret i vakuum.

DK 167689 B1 47

B. Oprensning af A82846A

A82846A-rige koncentrater fra to gennemløb på hver 30 g (gennemført som beskrevet i afsnit A, blev afsaltet på en 5 1750 ml kolonne indeholdende Diaion HP-20__SS. Efter ud vaskning med vand blev der elueret med vand/isopropanol (95:5), der indeholdt 0,5 % eddikesyre, hvorefter der blev foretaget analytisk højtryksvæskechromatografi. De fraktioner, der indeholdt A82846A, blev kombineret, kon-10 centreret og frysetørret til opnåelse af 7,4 g af et A82846A-beriget præparat.

Det A82846A-berigede præparat (7,2 g) blev opløst i vand og overført til en præparativ kolonne til højtryksvæske-15 chromatografi. Kolonnen indeholdt silicagel LP-l/C^g i 1 % (NH4)H2PC>4, og den blev udviklet med en gradient fra 1 % (NH4)H2P04 til 1 % (NH4)H2P04/acetonitril (9:1). Elue-ringen blev fulgt ved analytisk højtryksvæskechromatogra-fi ved 254 nm, og der elueredes med en strømningshastig-20 hed på 48 ml/min. Efter eluering af de første 10 liter opsamledes fraktioner på 500 ml.

De fraktioner, der indeholdt A82846A (#4-10), og de fraktioner, der indeholdt A82846B (#12-20), blev hver især 25 kombineret og koncentreret i vakuum. Koncentraterne af A82846A fra 3 gennemløb blev kombineret og overført til en 1750 ml kolonne indeholdende Diaion HP-20 SS til afsaltning af opløsningen. Kolonnen blev vasket med vand, og A82846A blev elueret med vand/isopropanol (95:5) inde-30 holdende 0,5 % eddikesyre. Elueringen blev fulgt ved høj -tryksvæskechromatografi. De fraktioner, der indeholdt A82846A, blev kombineret, koncentreret og frysetørret til opnåelse af 7,9 g oprenset A82846A.

35 IR-spektret af A82846A i en KBr-skive er vist på figur 1; FAB-MS af A82846A i thioglycerol er vist på figur 4 og NMR-spektret af A82846A-hydrochlorid i (methylsulfoxid)- DK 167689 B1 48 dg på et Bruker AM500 spektrometer (HDO udeladt) ved 60 °C er vist på figur 7.

C. „ Oprensning af A82846B 5 A82846B-berigede fraktioner fra 3 præparative højtryks-væskechromatografiske behandlinger til separation af A82846A og A82846B, gennemført som beskrevet i ansnit B, blev kombineret og afsaltet på en 1750 ml kolonne inde-10 holdende Diaion HP-20 SS. Efter udvaskning med vand elu-erede man med vand/isopropanol (95:5), der indeholdt 0,5 % eddikesyre. Elueringen blev overvåget ved højtryksvæs-kechromatografi, og A82846B-fraktionerne blev kombineret, koncentreret i vakuum og frysetørret til opnåelse af 8,8 15 g oprenset A82846B.

IR-spektret af A82846B i en KBr-skive er vist på figur 2; FAB-MS af A82846B i thioglycerol er vist på figur 5 og NMR-spektret af A82846B-acetat i (methylsulfoxid)-dg på 20 et Bruker AM500 spektrometer ved 60 °C er vist på figur 8.

D. Afsaltning 25 Afsaltningen kan også foretages ved at anvende Diaion HP-20 harpiks og eluere med MeOHr^O (4:1) indeholdende 0,1 % eddikesyre.

EKSEMPEL 7 30

Isolation af A82846C A. Separation af A82846 35 461 liter fermenteringsvæske, opnået fra fire fermente

ringer på hver 165 liter gennemført som beskrevet i eksempel 2 afsnit B, blev indstillet til pH 10,5 med 5N

DK 167689 B1 49

NaOH og filtreret med 3 % Hyflo Supercel filterhjælp. Filtratet (430 liter) blev indstillet til pH 7 med 5N HC1 og overført til en kolonne indeholdende 10 liter Dowex-XFS-43278 (NH^+) harpiks. Kolonnen blev vasket med 50 5 liter vand, og det aktive materiale bley elueret med 0,05N NH^OH (50 liter), idet der opsamledes fraktioner på 4 liter. Elueringen blev fulgt ved bioanalyse. De aktive fraktioner (#1-7) blev kombineret, koncentreret i vakuum til et volumen på omkring 1700 ml og frysetørret til op-10 nåelse af 283,9 rå A82846.

B. Separation af A82846A, B og C

Rå A82846 (2 g), opnået som beskrevet i afsnit A, blev 15 opløst i vand og overført til en rustfri stålkolonne til præparativ højtryksvæskechromatografi (5 x 115 cm) indeholdende 2110 ml silicagel LP-l/C^g harpiks i 1 % (NH^)H2P0^. Kolonnen blev udviklet ved anvendelse af en gradient fra 1 % (NH^)H2P0^/acetonitril (92:8) ved en 20 strømningshastighed på 70 ml/min. Der opsamledes fraktioner på 400 ml, som blev analyseret ved UV ved 254 nm.

De fraktioner, der indeholdt A82846A (#11-14), blev kombineret som portion 1, og de fraktioner, der indeholdt 25 A82846C (#16-20), blev kombineret som portion 2. Endelig blev de fraktioner, der indeholdt A82846B-(#21-25), kombineret som portion 3.

C. Oprensning af A82846C 30

Portion 2 blev koncentreret til et volumen på omkring 200 ml og overført til en 7 x 45 cm glaskolonne indeholdende 1800 ml Diaion HP-20 til afsaltning. Det aktive materiale blev elueret med Me0H/H20 (4:1) indeholdende 0,1 % eddi-35 kesyre, og der opsamledes fraktioner på 1 liter ved en strømningshastighed på 25 ml/min. De fraktioner, der indeholdt A82846C (#9-12), blev sammenlagt, koncentreret DK 167689 B1 50 i vakuum og frysetørret til opnåelse af 662,2 mg semi-oprenset A82846C.

Det. semi-oprensede A82846C (500 mg) blev yderligere op-5 renset ved gentagelse af højtryksvæskechromatografi-be-handlingen i omvendt fase, idet man anvendte en 2,5 x 120 cm stålkolonne, der indeholdt 450 ml silicagel LP-l/C^g, og en gradient fra 1 % (NH^J^PO^ til 1 % (NH^)^PO^/ace-tonitril (92:8). Strømningshastigheden var 11 ml/min., og 10 der opsamledes fraktioner på 25 ml, som blev analyseret ved 254 nm. De fraktioner, der indeholdt A82846C (#169-210), blev samlet og afsaltet på en 5 x 45 cm glaskolonne indeholdende HP-20 harpiks. Kolonnen blev elueret med Me0H/H20 (4:1), der indeholdt 0,1 % eddikesyre, idet man 15 opsamlede fraktioner på 100 ml og fulgte elueringen ved analytisk højtryksvæskechromatografi med UV ved 225 nm.

De fraktioner, der indeholdt A82846C (#5-11), blev kombineret, koncentreret i vakuum og frysetørret til opnåelse af 127,3 mg A82846C.

20

Portion 1, som indeholdt A82846A, og portion 3, som indeholdt A82846B, blev oprenset på samme måde som beskrevet for A82846C, hvorved der opnåedes en yderligere mængde oprenset A82846A og A82846B.

25

D. Yderligere oprensning af A82846C

A82846C (70 mg) blev oprenset yderligere under anvendelse af den følgende præparative chromatografiske procedure: 30

Kolonne: Zorbax SCX (9,2 x 250 mm) kationbytter Mobil fase: En lineær gradient, der går fra 0,15M NaH^PO^-puffer indeholdende 10 % MeOH til 0,9 M NaH^PO^-puffer indeholdende 10 % MeOH, 35 i 6 min. og ophold i 5 min. (ingen justering af pufferen).

Flowhastighed: 6,0 ml/min.

DK 167689 B1 51

Detektering: UV ved 280 nm Belastning: 6,0 mg/injektion i H20.

A82846C blev opsamlet ved hjælp af en automatiseret frak-5 tionsopsamler (Gilson 201C) forsynet med en mekanisme til påvisning af toppe. Den mobile fase blev afgivet af et Millipore Waters M600 gradient-HPLC-systera, og prøveopløsningen blev injiceret via en Hitachi autosampler.

10 De fraktioner, der indeholdt A82846C, blev kombineret, koncentreret til et volumen på 30 ml og overført til en HP-20 kolonne (50 ml). Kolonnen blev vasket med vand og elueret med vand/isopropanol (95:5) indeholdende 0,5 % eddikesyre, idet der opsamledes fraktioner på 25 ml. De 15 fraktioner, der indeholdt A82846C (#9-14), blev kombine ret, koncentreret og lyophiliseret til opnåelse af 37 mg oprenset A82846C.

IR-spektret af A82846C i en KBr-skive er vist på figur 3; 20 FAB-MS af A82846C i thioglycerol er vist på figur 6 og NMR-spektret af A82846C-acetat i (methylsulfoxid)-dg på et Bruker AM500 spektrometer (HDO udeladt) ved 60 °C er vist på figur 9.

25 EKSEMPEL 8

Fremstilling af A82846-salte I hvert enkelt tilfælde blev A82846-komponenten (100 mg) 30 opløst i deioniseret vand (10 ml). I den fremkomne opløsning blev pH indstillet til omkring 3 ved anvendelse af 0,5 N syre (HC1, H2S04 og H^PO^. Opløsningen blev lyophiliseret til opnåelse af den pågældende saltform. Det er vigtigt at bemærke, at hvis pH-værdien sænkes ret me-35 get under pH 3 (eksempelvis til pH 2), nedbrydes komponenten. Man opnåede de følgende udbytter: DK 167689 Bl 52 _Udbytte (mg)_

Salt A82846A A82846B

HC1 93,8 88,1 H2S04 92,5 75,4 5 H3P04 H0,8 105,7 EKSEMPEL 9 A82846A-tabletformulering 10

Tabletter, der indeholder A82846A, kan fremstilles ved anvendelse af de følgende ingredienser i de angivne mængder: 15 Ingrediens Vægt A82846A phosphat 282,9 mg

Mikrokrystallinsk cellulose 101,1 mg croscarmellosenatrium 12,0 mg 20 Polyvinylpyrrolidon 12,0 mg

Magnesiumstearat 3,0 mg

Stearinsyre 4,0 mg

Renset vand 0,16 ml 25 A82846A-phoshat overføres sammen med en del af den mikro-krystallinske cellulose og en del af mængden af cros-carmellose-natrium til en egnet beholder, og der blandes indtil homogenitet. Derefter fremstilles en opløsning af 30 polyvinylpyrrolidon i vand, og denne opløsning sættes til de blandede pulvere. Den resulterende blanding granuleres og sigtes, såfremt dette er nødvendigt, hvorefter den tørres. Den resterende mængde mikrokrystallinsk cellulose og croscarmellose-natrium sættes til den tørrede blan-35 ding, og der blandes omhyggeligt. Efter tilsætning af magnesiumstearat og stearinsyre blandes påny. Endelig presses den resulterende pulverblanding til tabletter.

53 DK 167689 B1 EKSEMPEL 10 A82846B-kapselformulering 5

Kapsler, der indeholder A82846B, kan fremstilles ved hjælp af de følgende ingredienser i de angivne mængder:

Ingrediens Vægt 3.0 -!- A82846B-hydrochlorid 262,2 mg

Majsstivelse, fritstrømmende pulver 137,7 mg

Flydende silicone, 350 centistoke 2,7 mg

Majsstivelse 147,1 mg 15 - A82846B-hydrochlorid, fritstrømmende stivelsespulver, flydende silicone og majsstivelse blandes i en egnet mikser, indtil der er opnået en homogen blanding. Denne 20 blanding fyldes derefter på hårde gelatinekapsler med passende størrelse.

EKSEMPEL 11 25 A82846A-suspensionsformulering <

Man fremstiller en steril uopløselig form af A82846A ved krystallisation eller udfældning. Præparatet formales eller sigtes til en partikelstørrelse, som egner sig til 30 fremstilling af en suspension. Derefter suspenderes A82846A i det følgende bæremedium: 35 54 DK 167689 B1

Ingrediens Mængde

Lecithin 1 %

Natriumcitrat 2 % 5 Propyl-p-hydroxybenzoesyre _ 0,015 %

Vand til injektionsbrug op til det ønskede volumen 10 Suspensionen kan fremstilles i stor mængde og fyldes på hætteflasker, eller den kan fremstilles improviseret ved tilsætning af bæremediet til A82846A i hætteflasken.

15 20 25 < 30 35

Claims (7)

1. Hidtil ukendte glycopeptid-antibiotika hørende til 5 vancomycin-gruppen og benævnt A82846, A82846A, A82846B og A82846C eller farmaceutisk acceptable salte deraf, kendetegnet ved, at de har formlen 10 „o I ^o-^V-ch2oh HO NH2 * V-° . I o I

15 CH3 ° f 1 [ i jj Ί Η^Ϊ-ΝΗ\^.° [X O H--tOH O^A /v / I ri =/H NH—X \ HN Hpø\ O /X ° H,„. / 1 / Ή ° \ 20 \^\ \ / II J /X"NH2 >^ch3 0. ifr^ ° «ίΤ I 11 I h ho/^X^oh oh 25 hvori X og Y hver for sig er hydrogen eller chlor.

2. Antibiotikum A82846A ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har den i krav 1 angivne formel, hvori 30. er hydrogen og Y er chlor. 1 2 Antibiotikum A82846B ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har den i krav 1 angivne formel, hvori X og Y begge er chlor. 35 2 Antibiotikum A82846C ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har den i krav 1 angivne formel, hvori DK 167689 B1 X og Y begge er hydrogen.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af glycopeptid-antibio-tika benævnt A82846, A82846A, A82846B eller A82846C iføl-5 ge krav 1, kendetegnet ved, "at man dyrker Nocardia orientalis NRRL 18098, NRRL 18099 eller NRRL 18100, eller en A82846-producerende mutant deraf, i et dyrkningsmedium, der indeholder assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte, under submerse 10 aerobe fermenteringsbetingelser, hvorefter man om ønsket separerer det dannede antibiotikum fra fermenteringsmediet og/eller omdanner det til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

6. Biologisk oprenset kultur, kendetegnet ved, at den er valgt blandt Nocardia orientalis stammerne NRRL 18098, NRRL 18099 og NRRL 18100 samt A82846-producerende mutanter deraf.

7. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det som aktiv bestanddel indeholder en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1-4 i kombination med et eller flere farmaceutisk acceptable bærestoffer.

8. Anvendelse af en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1-4 til fremstilling af et lægemiddel til terapeutisk behandling af bakterieinfektioner. 1 35 Tilskudsmiddel til dyrefoder, kendetegnet 30 ved, at det som aktiv bestanddel indeholder en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1-4 i kombination med et eller flere agronomisk acceptable bærestoffer.