HU198964B - Process for producing glycopeptide antibiotics and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents
Process for producing glycopeptide antibiotics and pharmaceutical compositions comprising same Download PDFInfo
- Publication number
- HU198964B HU198964B HU874180A HU418087A HU198964B HU 198964 B HU198964 B HU 198964B HU 874180 A HU874180 A HU 874180A HU 418087 A HU418087 A HU 418087A HU 198964 B HU198964 B HU 198964B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibiotic
- preparation
- antibiotics
- nrrl
- acid
- Prior art date
Links
- 0 CCCNC*C(**)N=O Chemical compound CCCNC*C(**)N=O 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
- C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/365—Nocardia
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/872—Nocardia
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás új, a vankomicin-csoportba tartozó, glikopeptid antibiotikumok előállítására, közelebbről eljárás az A82 846 antibiotikum, illetve ennek az A82 846A, A82 846B A82 846C jelű alkotórészeinek előállítására új mikroorganizmustörzsek segítségével.
Noha napjainkban már számos antibiotikum áll rendelkezésünkre, új antibiotikumok feltalálása a. humán gyógyászat fontos igénye. A vankomicin például kereskedelmi forgalomból beszerezhető, eddig is sok ember életét megmentő, sikeres antibiotikum, ennek ellenére alkalmazása nem kívánt következményekkel, például hallószervi- és vesekárosodással járhat. Ezért kívánatosak az olyan antibiotikumok, melyek a vankomicinhez hasonló aktivitásúak, de jobb farmakokinetikai tulajdonságokkal vagy gyengébb mellékhatással rendelkeznek.
Feltaláltuk, hogy a Nocardia oreintalis NRRL 18 098, NRRL 18 099 vagy az NRRL 18 100 törzs süllyesztett, aerob tenyészete asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon értékes glikopeptid antibiotikumokat termelhet. Ezeket a glikopeptid antibiotikumokat önkényesen A82 846 jelöléssel láttuk el.
Az A82 846 antibiotikumok szerkezetét tekintve hasonló a vankomicinhez, de fokozottabb aktivitást mutat in vivő és in vitro a Gram-pozitiv baktériumokkal szemben, ezen kívül a farmakokinetikai vizsgálatok szerint félélettartalma hosszabb a vankomicinénél.
Az A82 846 alkotórészek az alábbi fizikai és fizikai-kémiai tulajdonságokkal jellemezhetők:
A82 846A
Molekulatömeg: 1556.
Tapasztalati képlet: C73Hs9NioOz6C1
FAB-MS (tioglicerin): M+l; mért: 1557, 5803; a C73H90N10O26CI képlet alapján számolt:
1557,5716 (4. ábra).
UV (víz), λ·»: 281 nm (£=5052), lúgosítással
300 nm-re tolódik.
IR(KBr): 1716, 1655, 1611, 1586, 1552, 1504, 1410, 1340, 1310, 1230, 1212, 1132, 1066, 1028 és 1015 cm-1 (1. ábra).
NMR (dimetil-szulfoxid): 7. ábra.
pKa (víz): 4,7; 9,5;
(66%, dimetil-formamid): 5,5, 6,8, 7,9, 9,4,
12,3.
(Látszólatos móltömeg: 1542).
A82 846B
Molekulatömeg: 1590.
Tapasztalati képlet: C73H8SN10O26CI2
FAB-MS (tioglicerin): M+l, mért: 1591, 5315; a C73H89N10O2ÍCI2 képlet alapján számolt:
1591,5327 (5. ábra).
UV (víz) λ·»: 280 nm (£=5192), lúgositva eltolódik 300 nm-re.
IR(KBr): 1656, 1586, 1562, 1504, 1403, 1264, 1230, 1135, 1105, 1065, 1023 és 1018 cm'1 (2. ábra).
NMR (dimetil-szulfoxid): 8. ábra.
pKa (víz): 4,65 és 9,5.
A82 846C
Molekulatömeg: 1552.
Tapasztalati képlet: C73H90N10O26
FAB-MS (tioglicerin): M+Na, mért: 1545,5998; a C73ll9tNio026Na képlet alapján számolt:
1545,5925 (6. ábra).
UV tvlz), A«a.\·. 280 nm (£=5198), lúgosítással
300 nm-re tolódik.
IR(KBr): 3600 —>3004 (széles), 2999, 2991,
2950, 1687->1650 (széles), 1585, 1570, 1509,
1503, 1453, 1449, 1402, 1212, 1130, 1102, 1060, 1032 és 1014 cm*1 (3. ábra).
NMR .(dimetil-szulfoxid): 9. ábra.
pKa (víz): 4,6 és 9,4.
\z A82 846A, A82 846B és az A82 846C komponensek 6 n sósavval végzett hidrolízise után az aminosavanalízis aszparaginsav jelenlétére utal, emellett két széles csúcs je20 lenik meg glicin nyommal. A két csúcs aktinoidin- és vankomicin - aminosavaknak látszanak megfelelni, mindkettő jelen van a vankomicin típusú glikopeptidekben.
Az összehasonlító NMR vizsgálatok azt mutatják, hogy az A82 846A, A82 846B és az A82 846C mindegyike tartalmazza az (1) képletű új amino-cukrot, a 4-epi-vankózamint (3-met.il-akózamint).
Az A82 846A szerkezeti képlete megfelel a vankomicinénak (C6SH75N9O24CI2), de egy klóratommal kevesebbet tartalmaz és egy vankczamin (C7H14NO3) típusú további aminocukor elemeit tartalmazza.
Az A82 846B szerkezeti képlete megfelel az A82 846A szerkezeti képletének, de az utóbbi egy hidrogénatomját klóratom helyettesíti.
Az A82 846C szerkezeti képlete megfelel az A82 846A szerkezeti képletének, de az utóbbi klóratomját egy hidrogénatom helyettesíti.
Az A82 846 komponensek a glikopeptidek új csoportját képezik, melyre a vankomicin molekula általánosan jellemző, de attól a klórtartalomban és egy további vankózamin alegységben különböznek.
íz A 82 846 komponensek a (2) általános képlettel jellemezhetők.
Az A82 846 komponensek cukorcsoport50 jainak abszolút konfigurációi még nincsenek meghatározva.
Az A82 846 és az egyes kompoenesei, az A82 846A, A82 846B és az A82 846C savaddiciós sókat képezhetnek. Az antibiotikumok mindezen származékai részét képezik a találmánynak. Az A82 846 sókat például felhasználhatjuk az antibiotikum elválasztásánál és tisztításánál. Ezenkívül sóképzéssel megnövelhető a vízben való oldhatóság.
Az A82 846 és az egyes komponensei, az járásokkal állíthatjuk elő.
Példaként említhetjük azokat a sókat, amelyeket a szokásos sóképzö eljárások segítségével szerves vagy szervetlen savakkal állítunk elő; ilyen savak például a kén-, só-,
HU 198964 Γ· foszfor-, ecet-, borostyánkő-, citrom-, tej-, malein-, furnér-, kol-, panioe-, mucin-, D-glutamin-, d-kámfor-, glutár-, glikol-, ftál-, borkő-, hangya-, laurin-, sztearin-, szalicil-, benzoe-, fenil-akril-sav, stb. 6
Különösen előnyösek a gyógyászati szempontból alkalmazható savaddíciós sók.
Az A82 846 antibiotikumot az A82 846-ot termelő Nocardia orientalis törzsekkel termelhetjük süllyesztett, aerob tenyészetben, al- 10 kalmas táptalajon. Az antibiotikumot ismert izolálási és tisztítási eljárásokkal nyerhetjük ki.
A találmány foglalkozik azokkal a biológiailag tisztított mikroorganizmus tenyészetekkel, melyeket Nocardia orienlelis NRRL 18 098, Nocardia orientalis NRRL 19 099, Nocardia orientalis NRRL 18 100 törzsekből vagy e törzsek A82 846 antibiotikumot termelő mutánsaiból vagy változataiból szelektál- 20 tünk. Ezek a mikroorganizmusok felhasználhatók, mert A82 846 antibiotikumot termelnek. Kényelmi szempontból a továbbiakban az NRRL 18 098 törzset A82 846 tenyészetnek, az NRRL 18099 törzset A82 846.1 tenyészet- 25 nek és az NRRL 18 100 törzset A82 846.2 tenyészetnek nevezzük. Az A82 846 tenyészetet Haitiben gyűjtött talajmintából izoláltuk. Az A82 846.1 tenyészetet az A82 846 tenyészetből nyertük kémiai mutagenezissel, az 20 A82 846.2 tenyészetet az A82 846 tenyészetből izoláltuk, mint egyik természetes variánsát.
Az A82 846, A82 846.1 és az A82 846.2 tenyészeteket 1986. augusztus 8-án letétbe 25 helyeztük és most a Midwest Area Northern Régiónál Resarch Center (Agricultural Research Service, United States Department, of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, USA) törzsgyűjteményének 40 része. A tenyészetek az alábbi nyilvántartási számokon hozzáférhetők: NRRL 18 098 (A82 846 szülő törzs), NRRL 18 099 (A82 846.1 mutáns törzs) és NRRL 18 100 (A82 846.2 szülő törzs változata). 46
Az A82 846, A82 846.1 és az A82 846.2 törzsek rendszertani vizsgálatát Frederick P. Mertz (Lilly Research Laboratories) végezte.
E vizsgálatok alapján az új mikroorganizmusokat Nocardia orientalis-nak (Pittenger és 50 Brigham, 1956) határozták meg, tipustörzs: ATCC 19 795 [R. C. Pittenger és R. B. Brigham, .Streptomyces orientalis n. sp., the source of vancomycin, Antibiotics and Chemotherapy 6: 642-247 (1956)]. A meghatározás 55 közvetlen laboratóriumi ossz hasonlításon és a közölt leírások alapján történt. iBergey’s manual of determinative bacteriology, 8. kiadás, szerk.: R. E. Buchanem és N. E. Gibbons, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 60 1974; M. Goodfellow és K. P. Schaal, .Identification methods fór Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus in Identification methods fór microbiologists, 2. kiadás, szer.: F. A. Skinner és D. W. Lovelock, Society fór Appli- 65 4 ed Bacteriology Technical Series No. 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, 261. old.;
R. E. Gordon, D. A. Barnett. J. E. Handerhan és C. H. Púiig, .Nocardia coeliaca, Nocardia Nocardia autotrophica, and the Nocardin st.-ain, Int. J. Syst. Bacteriology 24, (1): 54-63 (1974); R. E. Gordin, S. K. Mishra és D. A. Barnett, .Somé bits and pieces of the genus Nocardia: N. carnea, N. vaccinii, N. Lransvalensis, N. orientalis, N. aerocolinigenes', J. Gén. Microbiol., 109: 69-78 (1978); S. J. Mishra. R. E. Gordon és D. A. Barnett, .Identification of Nocardiae and Streptomyces of medical im por táncé, J. Clin. Microbiol., 11 (6i: 728-736 (1980); H. Mordarska és M. Mordarski .Chemolaxonomic characters and classiíicatiori of somé nocardioform bacteria, J. Gén. Microbiol., 71: 77-86 (1972); R. Shinobu és M. Kawato .On Streptomyces aerocolonigenes riov. sp., Forining the secondary colonies on the aerial ínycelia, Bor. Mag. Tokió 73, 213-216 (1960)1.
A meghatározásokhoz az International Streptomyces project. (ISP) Streptomyces fajok meghatározására szolgáló [E. B. Shirling és D. Got.tlieb, .Methods fór characterization of Streptomyces species, Int. J. Syst. Bacteriol., 16: 313-340 (1966)] és Gordon, Barnett, Handerham és Pang (1. fentebb) Nocardia fajok meghatározására vonatkozó módszered használtuk.
A morfológiai vizsgálatokhoz fénymikroszkópot használtunk. A spórafelszín rajzolatának meghatározása pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) történt.
A rifampin és lizozim rezisztenciát Gordon módszerével mértük [R. E. Gordon és D. A. Barnett, .Resistance to rifampin and lysosine of strains of somé species of Mycobacterium and Nocardia as a taxonomic tool', Int, J. Syst. Bacteriol, 27 (3): 176-178 (1977)].
A színek megnevezésénél az ISCC-NBS Centroid Color Charts, standard sample No. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.
S. Department of Commerce, Washington, D. C.) és a Color Harmony Manuel (4. kiadás, Contanier Corporation of America, Chicago, Illinoise, (1958) szabványokat használtuk.
A malenoid-pigment termelését (kromogenitás) ISP 161 (tripton/élesztőkivonatos táptalaj), ISP No.6 (pepton/élesztőkivonat/vasas agar) és ISP No.7 (tirozinos agar) táptalajon vizsgáltuk.
A teljes sejt hidrolizátumának diamino-pimelinsav (DAP) izomerjeit és szénhidrátjait Becker és munkatársainak [B. Becker, Μ. P. Lechevalier, R. E. Gondon és H. A. Lechevalier, .Rapid differentiation between Nocardia and Straptomyc.es by paper chromatography of whole-cell hydrolysates, Appl. Microbiol., 12: 421-423 (1946)] és Lechevalier [Μ. P. Lechevalier, .Identification of aerobic Actinoínycetes of clinical importance, J. Clin. Med.,
-3HU 198964 B
71: 934-944 (1968)1 kromatográfiás módszerével határoztuk meg.
A mikrolinsavak meghatározásához Minnikin által leirt eljáráson alapuló módszert alkalmaztuk [D. E. Minnikin, I. G. Hutchinson és A. B. Caldlcott, Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing haeteria, J. Citrom., 188: 221-233 (1980)1.
A foszfatázt és az ureázt Blazevic mód- 10 szerével (D. J. Blazevic és G. M. Ederer, .Principles of biochemical test in diagnostic microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975, 136. old.) határoztuk meg. A zselatin elfolyósítást használtuk a proteináz aktivitás meghatározásához.
Az antibiotikumrezisztencia megállapításához az antibiotikus korongmódszert használtuk, a korongokat beoltott ISP No.2 agarlemezek felszínére helyezve.
A keményitőhidrolizis keményítős ISP No.4 táptalajon (szervetlen sók - keményítő) határoztuk meg jódos festéssel (Blazevic és Ederer, 1. fentebb).
A hippuráthidrolízis meghatározásához 25 Bac.to Differentiation Disks-et használtunk, amivel gyorsan kimutatható a hippur&t hidrolízise.
Az A82 846 és az A82 846.2 törzsek egyaránt jól nőttek valamennyi megvizsgált komplex és szintetikus táptalajon. Ezek a tenyészetek a legtöbb táptalajon légmicéliu5 mókái fejlesztenek. A spóratömeg színe a táptalajtól függően fehér vagy szürke. Sok táptalajon jellemző barna oldható festékanyag termelődik, a fonák oldal barnától sárgásfehérig változik.
A A82 846.1 törzs ugyancsak kinőtt valamennyi megvizsgált táptalajon, de növekedése kevésbé erőteljes, mint a szülő törzsé. Λζ A82 846.1 csak ritkán fejleszt légmicéliumot, ha igen, a micélium színe fehér. Eseten15 ként néhány táptalajon nem jellemző halványítania oldható pigment termelődik, a fonákoldal barnától sárgás fehérig változik.
A A82 846, A82 846.1 és az A82 846,2 tenyészetek jellemzését az I. táblázatban fog20 lalt.uk össze. Az A82 846 és az A82 846.2 nagyon hasonlóak és csak néhány tulajdonságban különböznek. A hasonlóságuk miatt, és mert az A82 846.2 az A82 846 törzs természetes változata további összehasonlítást köztük nem tettünk.
I. táblázat.
Az A82 846, A82 846.1 és az A82 846.2 tenyészetek összehasonlítása különféle agaros táptalajokon
táptalaj | A82 846 | A82 846.1 | A82 846.2 | |
N | erőteljes | erőteljes (felületről leváló) | erőteljes | |
ISP 2 | F | 59.d.Br | 57.1.Br. | 58.m.Br. |
Lm | erőteljes: g Médium Cray | nincs | nyomokban | |
θΡ | sötétbarna pigment; nem pH-függő | nincs | halványbarna | |
N | jól fejlődő | jól fejlődő | jól fejlődő | |
ISP 3 | F | 92.y.White | 92. y. White | 92.y.white |
Lm | jól fejlett: | gyenge: a White | elég jól fejlett: | |
a White | a White | |||
Op | nincs | nincs | nincs | |
N | erőteljes | gyenge | jól fejlődő | |
ISP 4 | F | 56.deep.Br | 92.y White | 77.m.y Br |
bm | erőteljes: a White | gyenge: a White | jól fejlődő: a White | |
Op | nincs | nincs | nincs | |
N | erőteljes | erőteljes | erőteljes | |
ISP 5 | F | 47.d.gy.rBr | 47.d.gy.rBr | 47.d.gy.rBr |
Lm | jól fejlődő: d Light | nincs | jól fejlődő: d Light | |
gray | gray | |||
Op | halványbarna | halványbarna | halványbarna |
IIU 198964 E
Az A82 84β, A82 846.1 és az A82 846.2 tenyészetek összehasonlítása különféle agaros táptalajokon
táptalaj | A82 846 | A82 846.1 | A82 846.2 | |
N | erőteljes | jól fejlődő | erőteljes | |
ISP 7 | F | 59.d. Br | 78.il. yBr | 59.d.Br |
Lm | erőteljes; e Médium gray | nyomokban | erőteljes: d Lighty gray | |
Op | sötétbarna pigment - nem pH függő | hab’ánybarna | sötétbarna pigment | |
N | erőteljes | jól fejlődő | erőteljes | |
Czapek | F | 56.deep Br | 47.d.gy. rBr | 5b deep Br |
tm | erőteljes: a White | nincs | erőteljes: a White | |
Op | nincs | vöröses narancssárga | halvány vöröses narancssárga | |
N | jól fejlődő | jól fejlődő | jól fejlődő | |
glükóz/ /aszparagin | F | 58. m. Br (csak foltokban | 77, m, yBr | 58,m.Br |
Lm | elég jól fejlett: a White | nincs | nincs | |
Op | nincs | nincs | nics | |
glükóz/élesz- | N | erőteljes (felületről leváló) | jól fejlődő (ráncos, nedves felület) | jól fejlődő (ráncos, nedves felület) |
tőkivonat | F | 21.blackish red | 77. m. yBr | 77.m. yBr |
Lm | nincs | nincs | nincs | |
Op | sötét vörösesbarna | nincs | halványbarna | |
N | jól fejlődő | jól fejlődő | elég jól fejlődő | |
F | 45.1.gy. rBr | 76.1. yBr | 79.1.9y. yBr | |
tápagar | Lm | nincs | nincs | gyenge |
Op | halványbarna | nincs | nincs | |
N | erőteljes | erőteljes | ei'ő teljes | |
paradicsom- | F | 47.d.gy. rBr | 57.1. Br | 47.d.9y. rBr |
paszta/ /zabliszt | Lm | erőteljes: d Light gray | nyomokban: a White | jól fejlett: d Light gray |
Op | sötét vörösesbarna | nincs | vörösesbarna | |
N | elég jól fejlődő | elég jól fejlődő | jól fejlődő | |
csapvizes | F | 92.y White | 92.y White | 92.y White |
agar | Lm | elég jól fejlett: a White | elég jól fejlett: b Oyster White | jól fejlett: a White |
Op | nincs | nincs | nincs | |
N | elég jól fejlődő (nincs hidrolízis) | jól fejlődő (hidrolízis) | elég jól fejlődő (nincs hidrolízis) | |
kalcium- | F | 57.1.ΒΓ | 58.m.Br | 57.1.Br |
malát | Lm | nyomokban | nincs | nyomokban |
Op | halványbarna | ha! ványbarna | halványbarna |
HU 198964 Β
N: növekedés, F: fonák oldal, Lm: légmicélium, Op: oldható pigment.
A tenyészeteket 30 °C hőmérsékleten inkubáltuk 21 napon át.
(A színek megjelölésénél a megnevezett színtáblázatokban szereplő eredeti elnevezéseket és rövidítéseket használtuk. Ezek jelentése - feltehetően - a következő: d - sötét, 1 - halvány, m - közepes, Br - barna, White - fehér, Oyster White - kagylófehér, Gray - szürke, y - sárgás, gy - szürkés, blackish red - feketésvörös, Light - halvány, Médium - közepes).
Morfológiai jellemzők: az A82 846,
A82 846.1 és az A82 846.2 erőteljes szubsztrátmicéliumot fejleszt. A lcghifák konidiumok hosszú láncát alakítják ki, pók hálószerű megjelenéssel, melyet a .Bergey’s manuál of determinative bacteriology' a nein-sztreptomicétesz típusba sorol.
Valamennyi törzsnél a spórafelszín sima, a spórák alakja hengeres. A spórák mérete az A82 846 törzsnél 1,2-1,3x0,4-0,5 Mm, Az A82 846.1-nél 1,4-2,2x0,3-0,4 um.
Rázott süllyesztett tenyészetben az A82 846 minimális fragmentáltságot mutat., az A82 846.1 erőteljesen, az A82 846 közepesen fragmentált.
Fiziológiai jellemzők: az Λ82 846 és az A82 846.1 törzsek egyaránt savat képeznek az arabinózból, ' cellobiózból, dextránból, fruktózból, galaktózból, glükózból, cC-metil-D-glükozidból, glicerinből, inozitolból, laktózból, szacharózból, trehalózból és xilózból; viszont nem termelnek savat az adonitból, cellulózból, dulcitból, eritritből, inulinből, szorbitból és xilitböl. Az A82 846 törzs ezen túlmenően savat képez még az etanolból, glikogénből, melezitózból, raffinózból és szalicinböl; az A82 846.1 törzs ezt utóbbiakból nem termel savat. Mindkét tenyészet felhasználja az acetátot, laktatót, malátot, oxalátot, propionátot, piruvátot és a szukcinátot, nem hasznosítja viszont a benzoátot, mukátot és tartarátot. Ellentétben az A82 846 törzzsel az A82 846.1 tenyészet a butirátot felhasználja, butira tót felhasználja.
Az A82 846 és az A82 846.4 törzsek lebontják a kazeint, hipoxantint, tirozint, karbamidot és a DNS-t, de nem bontják az adenint, kalcium-malátot vagy xantint. Mindként törzs hidrolizálja a keményítőt, de egyik sem hidrolizálja az eszkulint vagy ' a hippurátot, redukálják a nitrátot, elfolyósitják a zselatint, túlélik a 8 órás 50 °C hőmérsékletű kezelést; katalázt, kénhidrogént és foszfatázt termelnek.
Az A82 846 és az A82 846.1 törzsek antibiotikumokkal szembeni rezisztenciája azonos. Rezisztensnek az alábbi antibiotikumokkal szemben: bacitracin (10 egység), cefalotin (30 Mg), gentamicin (10 Mg). linkomicin (2 Mg), oleandomicin (15 Mg), penicillin G (10 egység), sztreptomicin (10 Mg), vankomicin (30 Mg), tobramicin (10 Mg) ertitromicin (15 Mg), nalidixsav (30 Mg), polimixin B (300 egység), trimetoprim (5 Mg), szulfadiazin (300 Mg); szenzit.ivek a neomicinnel (30 Mg. rifanipinnal (5 Mg), tetraciklinnel (30 Mg), kloranifenikollal (30 Mg). novobiocinnal (30 Mg) és a mandelaminnal (3 Mg) szemben.
Az A82 846 és az A82 846.1 törzsek Gram-pozitív festődésűek, de nem festődnek savállóan. Az A82 846 törzs termel melanoid pigmenteket, az A82, 846.1 törzs nem.
Sejtfal analízis: az A82 846 teljes sejt hidrolizáluina a diamino-pimerlinsav mezo-izonierjet tartalmazza, a hidrolizátumban levő cukrok arabinóz és gálák tóz. A törzsek sejtfala a Becker és munkatársai (1. fentebb) szerinti IV. típusba tartoznak. Cukor-típus szerint A-tipusúak (Lechavalier, 1. fentebb). A törzsek nem termelnek mikolinsavakat (LCN-A).
A kemotaxonomiaí és a tenyészetek általános jellemzői szerint az A82 846 törzs a Nocardia Trevisan 1889 nemzetségbe tartozik fV. B. D. Skerman, V. McGovan és P. H. A. Sneat.h, .Approved lists of bacterial naines, Int. J. Syst. Bacteriol., 30: 225-420 (1980)].
A hasonlósági mutatót tizennégy Gordon, Mish-a és Barnett (1. fentebb) által közölt Nocardia faj és öt, Lilly törzsgyüjteményéból származó törzs segítségével számoltuk ki. A Jaccard-féle [lásd: P. H. A. Sneath, .The applicatiori of computers to taxonomy', J. Fen. Microbiol., 17: 201 (1957)] és az egyszerű összehasonlító hasonlósági mutatókat [lásd: R. R. Sokai és C. D, Michener, .A statistical method fór evaluating systematio relationships, Kan. Univ. Sci. Bull., 38: 1409 (1956)] használtuk. Az összehasonlítások eredményeit a II. táblázatban foglaljuk össze. JM - Jaccard-féle mutató; eöm = egyszerű össze hason li tási ni 11 tató 1.
fi. táblázat
mikroorganizmus | hasonlósági mutatók | |
eöm | jm | |
A82 846 | 100 | 100 |
N. aerocolonigenes | 84 | 76 |
N. aerocolonigenes (A42 125)* | 83 | 78 |
N. orientalis (M43-05865) | 78 | 72 |
N. orientalis (A51 568.1) | 78 | 72 |
N. orientalis | 75 | 68 |
N. orientalis (M5-18 215) | 73 | 66 |
N. orientalis (M5-18 260) | 73 | 66 |
N. madurae | 73 | 63 |
N. hirsuta | 62 | 60 |
N. autotrophica | 62 | 53 |
N. dassonvillei | 62 | 50 |
N. amarae | 62 | 46 |
N. brasiliensis | 56 | 43 |
N. vaccinci | 56 | 43 |
N. transvalensis | 48 | 38 |
-6HÍJ 1989C4 Β
π.
mikroorganizmus | hasonlósági mutatók | |
eöm | jm | |
N. caviae | 48 | 32 |
N. pelletieri | 48 | 24 |
N. asteroides | 46 | 23 |
N. carnea | 43 | 25 |
*A zárójelben lévő | számok a Lilly törzste- | |
nyészetböl származó | mikroorganizmusokat | je- |
lölik.
Minthogy a N. madurae az Actinomadura nemzetségbe került át, az összehasonlításból kivettük. Két fajnak, a N. aerocolonigenesnek és a N. orientalis-nak magas értékű hasonlósági koefficiensei vannak. Elvégeztük az A82 846 törzs és az említett két faj laboratóriumi összehasonlítását, melynek eredményeit a III. táblázatban adjuk meg.
III. táblázat
Az A82 846 törzs, a N. orientalis és a
N. aerocolonigenes tulajdonságainak összehason li tása
tulajdonság A82 846 N. őri- | N. aero- coloni- genes | |
en telis | ||
léghifa képzés | + + | + |
léghifa fehér | + + | + |
konidiumképzés | + + | + |
sima spórafelszin | + + | + |
hengeres spóraalak | + + | - |
oldható pigment | + | - |
Gram-pozitív | + + | + |
saválló festődés | - | - |
fragmentáció | + + | + |
katalázképzés | + + | + |
hidrolízis: | ||
eszkulin | + | + |
hippurát | - | - |
keményítő | + + | + |
kalcium-maiét | + | + |
nitrát redukció | + + | - |
lebontás: | ||
adenin | - | - |
kazein | + + | + |
hipoxantin . | + + | + |
tirozin | + + | + |
karbamid | + + | + |
xantin | - | - |
zselatin elfő- | ||
lyósités | + + | - |
foszfatáz termelés | + + | + |
túlélés 50 °C, | ||
8 óra | + + | - |
tulajdonság A82 846 | N. őri- | N. | |
enta- | aero- | ||
lis | coloni- | ||
genes | |||
savtermelés: | |||
adonitból | - | + | — |
arabinózból | + | + | + |
cellobiózból | + | + | + |
eritritolból | - | ||
glükózból | + | + | + |
c<-metil-glü- | t | ||
kozidból | + | + | - |
glicerinből | + | + | + |
inozitból | + | + | + |
laktózból | + | + | + |
maltózból | + | + | + |
mannítból | + | + | + |
mánnózból | + | + | + |
melezitózból | + | - | - |
melibiózból | + | - | + |
raffiriózból | + | - | - |
ranmózból | + | + | + |
szorbilból | - | - | - |
Lrehalózból | + | + | + |
xilózból | + | + | + |
kontroll | - | - | - |
hasznosítás: | |||
berizoát | - | - | - |
citrát | + | + | + |
mukát | - | - | - |
szukcinát | + | + | + |
tartarát | - | - | - |
kontroll | - | - | - |
rezisztencia: | |||
bacitracin | |||
(10 egység! | + | - | - |
cefalotiri (30 Mg) | + | + | + |
gentamicin (10 Mg) | + | - | - |
linkomicin (2 Mg) | + | + | + |
neomicin (30 Mg) | - | - | - |
oleandomicin (15 ug) | + | - | - |
penicillin G | |||
(10 egység) | + | + | + |
rifampin | - | - | - |
sztreptomicin | |||
(10 Mg) | + | + | - |
tetraciklin (30 Mg) | - | - | - |
tobramicin 110 Mg) | + | + | - |
vankomicin (30 Mg) | + | + | - |
kloramfenikol | |||
(30 Mg) | - | - | - |
eritromicin (15 Mg) | + | - | - |
nalidixinsav (30 Mg) | + | + | - |
novobiocin (30 ug) | - | + | - |
polimixin B | |||
(300 egység) | + | + | + |
trimetoprin (5 Mg) | + | + |
+ a tulajdonság megvan
- n tulajdonság hiányzik
Ismételten kiszámoltuk a hasonlósági mutatókat nagy számú tulajdonság figyelembevételével. Az eredményeket a IV. táblázatban foglaltuk össze.
-713
HU 198964 D
IV. táblázat
Az A82 846 törzs, a Nocardia orientalis ás ’a
Nocardia aerocolonigenes hasonlósági mutatói
mikroorganizmus | hasonlósági mutatók | |
eöm | jm | |
A82 846 | 100 | 100 |
N. orientalis | 81 | 76 |
N. aerocolonigenes | 73 | 65 |
Sem a N. orientalis, sem a N. aerocoloni- | ||
genes nem tartalmaz | mikolinsavat a sejtfalé- | |
bán. Gordon (lásd | fentebb) | három olyan |
kulcstulajdonságot ir | le, melyek | alapján a N. |
orientalist megkülönböztethetjük a N. aerocolonigenes-től. A Gordon-féle kulcstulajdonságok figyelembevételével összehasonlítottuk az A82 846 törzset a Nocardia fajokkal. A vizsgálatok eredményeit az V.. táblázatban mutatjuk be.
V. táblázat
Az A82 846 törzs, a Nocardia orientalis és a Nocardia aerocolonigenes kulcstulajdonságainak összehasonlítása
mikroorganizmus | tulajdonság | |
savat képez: erit- ritböl | lizo- zimmel c<-nietil- szeinbe-glüko- ni rezidból ziszlencia | |
A82 846 | - | + + |
N. orientalis | + | + |
N. aerocolonigenes | - ' + |
Noha a kulcstulajdonságokat illetően az A82 846 törzs nem hozható tökéletes fedésbe egyik Nocardia fajjal sem, a tenyészetek jellemző tulajdonságai nagyobb rokonságot mutatnak a N. orientalis-szal és a hasonlósági mutató is a N. orientalis esetében a legmagasabb. Ugyancsak a N. orientalis-ra hasonlít olyan tekintetben is, hogy mindketten glikopeptid antibiotikumot termelnek. Az A82 846 törzset ezért a Nocardia orientalis IPittenger és Birgham, 1956), egyik törzsének határoztuk meg. Minthogy N. orientalis szerepel az .Approved lists of bacterial names’ jegyzékben (Baktériumnevek elfogadott névjegyzéke), ezért érvényesen elfogadott fajnak tekinthető.
Az A82 846.1 törzs az A82 846-nak kémiai indukcióval előállított mutánsa. A VI. táblázatban összefoglaljuk azokat a tulajdonságokat, melyben az A82 846.1 különbözik az. A82 846 törzstől.
V'í. táblázat
Az A82 846 és az A82 846.1 törzsek eltérő tulajdonságai
tulajdonság | A82 846 | A82 846.1 |
fragmentáltság | minimális | erőteljes |
telepméret | 7 mm | 5 mm |
telep felszíne | kemény | lágy |
léghifa | erőteljes | nyomokban |
fonák oldal színe | sötét- | halvány- |
oldható pigment | barna + | barna |
savat képez: etanolból | + | |
glikogénből | + | - |
melezitózból | + | - |
raffinózból | + | - |
szaliciriből | + | - |
hasznosítás: cé-metil-glü- kozid | + | |
glikogén | + | - |
inelezítóz | + | |
szőrhöz | + | - |
buti rét | - | + |
melanoid pigmentek | + | - |
Az A82 846.1 kölönbözik az A82 846 törzstől az antibiotikum-termelést illetően is. A másik legszembetűnőbb különbség a két törzs között, hogy - ellentétben az A82 846 törzzsel - az A82 846.1 törzs nem hoz létre légmicéliumot és nem termel oldható pigmentet.
Az A82 846.2 törzs az A82 846 törzsnek természetes változata, ezért a meghatározó tulajdonságok tekintetében a két törzs lényegében megegyezik, A közöttük levő fő különbség, hogy rázott lombikos tenyészetben az A82 846.2 törzs lényegesen több A82 846 antibiotikumot termel, mint az A82 846 törzs.
Hasonlóan más mikroorganizmusokhoz, a találmány A82 846 antibiotikumot termelő törzsei, az NRRL 18 098, NRRL 18 099 és az NRRL 18 100 Nocardia orientalis törzsek változékonyak. E törzsek eltérő tulajdonságú leszarmazottait, például mutánsokat és változatokat az ismert módokon kaphatjuk meg. így például variánsokat kaphatunk természetes szelekcióval, vagy mutánsokhoz juthatui k fizikai és kémiai mutagén kezelésekkel, 9
-815 például ultraibolya, Röntgen gamma besugárzással vagy N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidines kémiai indukcióval.
A Nocardia orientalis tenyésztéséhez használt tápközeg a nagy számú táptalaj 5 bármelyike lehet. A termelés gazdaságossága, az optimális hozadék és a termék könnyű kinyerhetősége szempontjából bizonyos táptalajok előnyösebben használhatók, igy például nagyméretű fermentálásnál előnyös szénhid- 10 rátforrás a glükóz és a burgonya dextriu, noha a ribóz, xilóz, fruktóz, galaktóz, mannóz, mannit, oldható keményítő és hasonlóak szintén alkalmazhatók.
Előnyös nitrogénforrás az enzimmel hid- 15 rolizált kazein és hús-pepton, de ugyancsak használhatunk élesztőkivonalot, savval hidrolizált kazeint, marhahúskivonatot, hallisztet, májlisztet, stb. is.
A táptalaj alkotórészét képező szervet- 20 len sók a szokásos vizoldékony sók, melyek cink-, nátrium-, magnézium-, kalcium-, amniónium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrátés hasonló ionokat szolgáltatnak.
A táptalajnak tartalmaznia kell a mikro- 25 organizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges esszenciális nyomelemeket is. Ezek a nyomelemek szennyezésként általában olyan mennyiségben fordulnak elő a táptalaj többi alkotórészében, mely elegendő a mikroorga- 30 nizmus növekedéséhez. Ha habzás lépne fel, kis mennyiségű (például 0,2 ml/liter) habzasgátlót, például polipropilénglikolt adhatunk a nagyméretű fermentációs táptalajhoz.
Jelentősebb mennyiségű A82 846 antibio- 35 tikum-termeléséhez előnyös a süllyesztett aerob tenyésztést tankfermentorban végezni.
Kis mennyiségű antibiotikumhoz rázott lombikos tenyészettel is hozzájuthatunk. Minthogy a tankfermentálásnál az antibiotikum-termelés 40 csak általában egy lag fázis után indul meg, ha az oltáshoz spórákat használunk, előnyösebb vegetatív oldóanyagot használni. A vegetatív oltóanyag elkészítéséhez kis térfogatú táptalajt spórákkal vagy micélium-frag- 45 mensekkel oltunk be, hogy friss, aktivan növekvő tenyészethez jussunk. A vegetatív oltóanyagot ezután átvisszük a nagy fermentorba. A vegetatív oltóanyag táptalaja azonos vagy különböző lehet a nagy fermentor táp- 50 talajával.
Az A82 846 antibiotikumot a termelő mikroorganizmusok 23-37 °C hőmérsékleten növesztve termelik. Az A82 846 antibiotikum termeléséhez az optimális hőmérséklet 30- 55
-31 °C.
Amint az a süllyesztett, aerob tenyészeteknél szokásos, a fermentor aljából steril levegőt hajtunk át a táptalajon, miközben lapátos keveróvel kevertetjük. Az alkalmazott go körülmények között a maximális oxigénfelvétel nem lépi túl a 0,2 mM/liter/perc értéket. A levegőztetés mértékét és a kevertetést általában olyan szinten kell tartani, hogy az oldott oxigén a telítettségi érték 50%-ánál gr, vagy a felett legyen.
Az A82 846 antibiotikum termelését a fei mentáció folyamán időnként vett mintákkal határozzuk meg olyan mikroorganizmusok segítségével, melyek az antibiotikumra szenzitivek. Egyik alkalmas tesztorganizmus lehet a Bacillus subtilis ATCC 6633. A biológiai értékmérést előnyösen lyukasztott agarlemezen végezzük.
A süllyesztett., aerob fermentációs körülmények között végzett termelés után az A82 846 antibiotikumot a fermentléből a szokásos módon nyerhetjük ki. Az antibiotikus aktivitás a mic.éliumban és a ferinentlében egyaránt, megtalálható, ezért az A82 846 antibiitikum maximális kinyeréséhez először a kémhatást pH=10,5 értékre állítjuk be, hogy az antibiotikum kijusson a micéliumból, majd a fermentléből kiszűrjük a micéliumot.
A szűrletból az A82 846 antibiotikumot különféle eljárásokkal nyerhetjük ki. Előnyös módszer, ha a szűrt fermentlé kémhatását pH=7 körüli értékre állítjuk be, és az antibiotikumot kationcseréló gyantán, például Dow?x XF5-43 278, Dowex 50 vagy Amberlite 1R-j20 gyantán kötjük meg. Az aktív anyagot alkalmas oldószerrel, például híg ammómium-hidroxidos oldattal mossuk le a gyantáról. A', aktív frakciókat csökkentett nyomáson hipároljuk, makroretikuláris gyantán, például Diaion HF-20 és Amberlite XAD-4 gyantán ads'.orbeáljuk, majd alkalmas oldószerrel, például víz/izopropanol, 95:5 eleggyel, mely 1% ecetsavnt tartalmaz, eluálva, megkapjuk az A32 846 antibiotikumot. Az aktív anyagot kevés savat tartalmazó víz/acetonitril vagy viz/metariol eleggyel is eluálhatjuk.
Hasonló módszerrel választható szét az A82 846 antibiotikum az A82 846A, A82 846B és az A82 846C alkotórészeire. Előnyös elválasztási módszer erre a fordított fázisú (Cie vagy Cs) kromatográfia.
Más eljárás szerint a fermentlé szilárd komponenseit, mely a micéliumból és a táptalaj szilárd alkotórészeiből áll, extrahálás és elválasztás nélkül - előnyösen a víztartalom eltávolítása után - használjuk fel, mint A82 846 antibiotikum forrást, igy például a fermentáció befejeztével az egész fermentlevet beszoríthatjuk liofilizációval, dob-szárítással vagy azeotropos desztillációval és szá1 itassa). A beszárított fermentlevet közvetlenül belekeverjük a takarmánypremixbe.
Az A82 846 antibiotikumoknak kitűnő hatásuk van in vivő és in vitro a Gram-pozitív kórokozó baktériumokkal szemben. Különösen váratlan sajátossága ezeknek az antibiotikumoknak a hosszú felezési idejük a ' érben. így például, ha patkányoknak intravénásán viszünk be antibiotikumot, a vankomicinszérum felezési ideje 45 perc, míg az λ82 846A és az A82 846B mindegyikének a felezési ideje 2,2 óra.
-917
HU 198964 Β
Az A82 846 antibiotikumok minimális gállási koncentrációit (MTC érték), melyeknél az antibiotikumok bizonyos baktériumokat gátolnak, a VII. és VIII. táblázatban adjuk meg. A táblázatokban szereplő MIC értékeket á szabványos agar-bigitásos eljárással határoztuk meg.
VII. táblázat
Teszt organizmus | MIC (mcg/ml) | ||
Λ82 846A | A82 846B | A82 846C | |
Staphylococcus aureus XI. 1 | 0.125 | 0.125 | 1 |
Staphylococcus aureus V41“ | 0.125 | 0.125 | 1 |
Staphylococcus aureus X400b | 0.125 | 0.125 | 1 |
Staphylococcus aureus S13E | 0.125 | 0.125 | 1 |
Staphylococcus epidermidis 270 | 0.25 | 0.25 | 1 |
Staphylococcus epidermidis 222 | 0.25 | 0.25 | I |
Streptococcus pyogenes C203 | 0.125 | 0.125 | 1 |
Streptococcus pneumoniae Park 1 | 0.125 | 0.125 | 2 |
Streptococcus Group D X66 | 0.25 | 0.25 | 2 |
Streptococcus Group D 2041 | 0.5 | 0.5 | 4 |
Haemophilus influenzáé C. L.c | _ e | - | - |
a = penicillin rezisztens törzs, b = meticillin rezisztens törzs, c = ampicillin szenzitív törzs, e = nem aktív a legmagasabb, 128 mcg/ml vizsgált koncentrációnál.
VIII. táblázat
Az A82 846, A82 846B és a vankoiuicin in vitro aktivitása
tesztorganizmus | vizsgált törzsek száma | MIC (mcg/ml) | ||
A82 846A | A82 846B | vankomicin | ||
Staphylococcus aureus | 20 | 0.125-1.0 | 0.25-1.0 | 0.5-2.0 |
Staphylococcus epidermidis | 20 | 0.25-2.0 | 0.5-1.0 | 1.0-2.0 |
Streptococcus pyogenes | 12 | 0.125-0.25 | 0.125-0.25 | 0.5 |
Streptococcus pneumoniae | 20 | <0.015-0.25 | 0.125-0.25 | <0.015-4.0 |
Streptococcus sp. group. D | 20 | 0.25-1.0 | 0.25-1.0 | 1.0-2.0 |
Streptococcus salivaris | 1 | 1.0 | 0.25 | 0.5 |
Streptococcus sanguis | 4 | 0.25-0.5 | 0.25 | 0.5-1.0 |
Streptococcus mutáns | 2 | 0.125-0.5 | 0.125-1.0 | 0.125-2.0 |
Az A82 846 vegyületek antimikrobiális aktivitásainak egyik fontos jellemzője, hogy anaerob baktériumokkal szemben hatnak. Ezt az aktivitást mutatjuk be a IX. táblázatban, melyben összefoglaljuk az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok szabványos agai— higitásos módszerrel megállapított aktivitását különböző anaerob baktériumokkal szemben. Az értékeket 24 órás inkubáció elteltével állapítottuk meg.
-1019
HXJ 198964 B IX. táblázat.
Az A82 846A és az A82 8lfifl antibiotikumok aktivitása anaerob baktériumokkal szemben
anaerob baktériumok | vizsgált törzsek száma | MIC (uicg/ml) | ||
A82 846A | A82 846B | vankomicin | ||
Gram-pozitiv törzsek: | ||||
Clostridium difficile | 19 | 0.125-1 | 0.06-0.125 | 0.5-4 |
Clostridium perfringens | 1 | £0.25 | 0.5 | 2 |
Clostridium speticum | 1 | 0.5 | 0.5 | 2 |
Eubacterium aerofaciens | 1 | £0.25 | 0.5 | 2 |
Peptococcus asaccharolyticus | 3 | <,0.25 | 0.06-0.5 | 1 |
Peptococcus prevoti | 4 | 1-2 | 1-4 | 1-4 |
Peptococcus variábilis | 1 | 0.5 | 1 | 1 |
Peptococcus constellatus | 1 | 0.25 | 0.25 | 1 |
Peptococcus magnus | 3 | 0.06-0.125 | 0.125-0.25 | 0.25-1 |
Peptostreptococcus anaerobius | 3 | 0.06-2 | 0.06-7 | 0-25-2 |
Peptostreptococcus intermedius | 8 | £0.25 | 0.25-0.5 | 0.5-1 |
Propionibacterium acnes | 19 | £0.25 | £0.25 | 2-16 |
Gram-negativ törzsek: | ||||
Bacteroides fragilis | 3 | >128 | >128 | 32-64 |
Bacteroides thetaiotaomicron | 1 | 128 | 128 | 64 |
Bacteroides melaninogenicus | 2 | >128 | >128 | >128 |
Bacteroides vulgatis | 1 | 128 | >128 | 64 |
Bacteroides corrodens | 1 | >128 | >128 | 64 |
Fusobacterium syinbiosum | 1 | 128 | 128 | 4 |
Fusobacteri um necrop ború ni | 1 | 128 | 128 | 1 |
Az A82 846 antibiotikumok in vivő antimikrobiális aktivitást is mutatnak a mesterségesen megfertőzött kísérleti állatokban. A vizsgálandó vegyűletet két dózisban beadva a tesztmikroorganizmussal mesterségesen megfertőzött egerekbe, az aktivitást az EDso értékek mérésével jellemezhetjük. Az EDso érték az a mg/kg értékben kifejezett hatékony dózis, ami a vizsgálati állatok 50%-át megvédi [lásd: Warren Wick és munkatársai, J. Bacteriol., 81: 233-236 (1961)]. A vegyületek EDso értékeit a X. táblázatban foglaljuk össze.
X. táblázat *mg/kg x 2; a dózisokat a fertőzés utáni 1. és 4. órában szubkután adjuk be az egereknek.
Az A82 846 antibiotikumok antibakteriális hatásának fontos jellemzője, hogy alkalmasak pielonefritísz kezelésére. Az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok például hatásosabbak a vankomieinnél a patkányok mes40 terségesen kiváltott pielonefritiszének kezeléséhen, Ezt a vizsgálatot a 4 208 403 számú USA szabadalomban leírt eljáráshoz hasonlóan hajtottuk végre. Az eredményeket a XI. táblázatban foglaljuk össze.
XI. táblázat
Az A82 846 antibiotikumok in vivő aktivitása
vegyület | Staphy- | EDso érték* Strep- Strep- |
lococcus | tococcus Lococcus | |
aureus | pyogenes pneu- | |
• | moniae |
A82 846A | 0.19 | 0.19 | 0.17 |
A82 846B | 0.19 | 0.20 | 0.18 |
A82 846C | 2.18 | 2.71 | 5.87 |
vankomicin | 1.3 | 0.72 | 1.52 |
50 55 | Vegyület | dózis fmg/kgx x!2)a | meggyó- gyult pat- kányok száza- léka | patkányok %-a titer lO^sze- rés hígításánál |
A82 846A | 10 | 88 | 100 | |
5 | 75 | 88 | ||
2 | 63 | 100 | ||
60 | A82 846B | 10 | 100 | 100 |
5 | 100 | 100 | ||
2 | 50 | 88 | ||
vankomicin | 10 | 63 | 100 | |
5 | 38 | 88 | ||
65 | 2 | 38 | 75 |
-1121
HU 198964 Β a hat napon keresztül, naponként két dózis szubkután
Az A82 846 antibiotikumokat az szivbelhártya-gyulladás kezelésére is alkalmazhatjuk. Így például az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok olyan aktívak a patkányok katéterrel indukált szívbelhártya-gyulladásos fertőzéssel szemben, mint a vankomicin. A vizsgálatokban a patkányokat úgy készítjük elő, hogy műanyag katétert vezetünk a jobb szivartériába, levisszük a jobb szívkamrába és óvatosan rögzítjük. Az állatokat két napig pihentetjük, majd Streptoccus faecalis X-66 tesztorganizmust juttatunk be intravénásán. A mikroorganizmus litere körülbelül 5x10** volt milliliterenként; ebből 0,5 ml-t juttatunk be az állatokba.
A vegyületeket 15 perccel a fertőzés után adjuk be szubkután, majd 14 napon ét 12 óránként, vagyis összesen 28 alkalommal. A kezelés után még két napig hagyjuk élni az állatokat, majd a szivüket kivesszük, homogenizáljuk, a homogenizátumot hígítjuk és triptikáz szójas agarra kenjük. Kiértékelés előtt 48 óráig inkubáljuk a lemezeket.
Az így kapott eredményeket a XII. táblázatban foglaljuk össze.
XII. táblázat
Az A82 846A és B antibiotikumok aktivitása a patkány endokarditisz tesztbe/?
vegyület | dózis15 (mg/kgx x28) | 16. napon meggyógyult, % | meggyógyult % a ti tér 10'4- szeres csökkentésénél |
A82 846A | 20 | 100 | 100 |
A82 84 6B | 20 | 100 | 100 |
vankomicin | 20 | 100 | 100 |
a katéterrel indukált szívbelhártya-gyulladás, Streptococcus faecalis X-66 tesztorganiznius használva b 14 napon át 12 óránként szubkután bejuttatva.
Az A82 846 antibiotikum gyógyszerkiszerelési eljárása szintén részét képezi a találmánynak. A baktériumos fertőzés kezelésére vagy megelőzésére az antibiotikumot, előnyösen gyógyászati szempontból alkalmazható sója alakjában orális vagy parenterális adagolásnak megfelelően formáljuk meg. A hatóanyagot összekeverjük a szokásos, gyógyászatban alkalmazható hordozó- és adalékanyagokkal, tablettát, kapszulát, elixírt, szuszpenziót, sziripot, ostyát, stb. készítve.
Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó készítményekben a hatóanyagtartalom 0,1-90% (tömeg), általában 10-30% (tömeg). A készitiiények a szokásos hordozó- és adalékanyagokat tartalmazhatják, például kukoricakeményitól, zselatint, laktózt, szacharózt, mikroI ristályos cellulózt, kaolint, mannitot, dikalr ium-foszfátot, nátriuin-kloridot és alginsavat. A találmány megformált gyógyszereiben alkalmazott szétesést elősegítő anyagok például a kroszkarmellóz-nátrium, a mikrokristályos cellulóz, kukoricakeményító, nótriumkeményíló-glukolát és az alginsav.
A tablettákban alkalmazható kötőanyagok az arabmézga, metil-cellulóz, nátrium-karboxi-melil-ceHulóz, polivinil-pirrolidon (Povidone) hidroxi-propil-metil-cellulóz, szacharóz, keményítő vagy etil-cellulóz.
Alkalmazható sikositóanyag a magnézium-szlearát vagy más fém-sztearátok, szteaiinsav, szilikon folyadék, talkum, viaszok, olajok és a kollidális szilícium-dioxid, izesítóanyagok például a borsmenta, a lélizőldek olaja, cseresznye aroma, stb.
Kívánatos lehet, hogy a készítményt színezzük esztétikai okokból vagy, hogy a térnék azonosítását megkönnyítsük.
Intravénás alkalmazáshoz az antibiotilum vízoldékony formáját az intravénás készítmények elkészítéséhez általánosan használ! folyékony közegekben oldjuk és infúzióval visszük be a szervezetbe. Ilyen folyélony közeg lehet például a fizológiés sóoldat, e Ringer oldat vagy az 5%-os dextróz oldat.
Az inlramuszkuláris adagoláshoz használt készítményben az oldható állapotban levő vegyületet, például a hatóanyag hidrokloridsóját sterilen oldjuk valamilyen gyógyászati szempontból alkalmazható oldószerben, például injektálható vízben (Water-for-Injection), fiziológiás sóoldatban vagy 5%-os glükózoldatban. Az oldhatatlan állapotban lévő vegyületet szuszpenzió alakjában vihetjük be a szervezetbe. A szuszpenziót vizes közeglen vagy gyógyászati szempontból alkalmaz1 ató olajban, például hosszú szénláncú zsírsav észterében, - mint amilyen az etil-oleát készíthetjük el.
Orális alkalmazásnál az antibiotikum alkalmas sóját, például hidrokloridját desztillált. vagy ionmentes vízben oldva alkalmazzuk.
Az antibiotikum egységnyi dozirozásához az - előnyösen só alakjában lévő - antibiotikum megfelelő oldószerben levő steril oldatát ampullákban forrasztjuk le. Az egységnyi dózis antibiotikum-koncentrációja változhat, például 1%-tól 50%-ig, az antibiotikum alkalmazott állapotától, az oldékonyságától és az orvos által előírt adagtól függően.
A találmány szerint előállított vegyületókkel különösen Gram-pozitív mikroorganizmusokkal - fertőzött élőlényeket kezelhetünk. Az élőlények lehetnek a fertőzésre fogékonyak vagy már egy mikroorganizmussal meg13
-1223
HU 198964 Β fertőződtek. A kezelési eljárás abban áll, hogy az élőlénynek az A82 846 antibioLikum célnak megfelelő hatásos dózisát adjuk be.
Az A82 846 antibiotikum hatásos dózisa általában 0,5-100 mg között van testtömeg kilo- 5 grammonként. Az aktív vegyület előnyös dózisa 1-60 mg testtömeg kilogrammonként. Egy felnőtt ember napi dózisa általában 50 mg és 1 g között van.
Az antibiotikumot bejuttathatjuk a szel— 10 vezetbe napi egyszeri dózisban vagy egy nap többszöri dózisrészletbe elosztva. A kezelést általában hosszabb időtartam alatt alkalmazzuk, mely kiterjedhet például néhány naptól kezdve hat hétre is. A bevitt dózis 15 vagy a bevitt összmennyiség különböző tényezőktől függ, ilyenek: a fertőzés természete és súlyossága, a beteg életkora, általános egészségi állapota és az antibiotikummal szembeni érzékenysége, a fertőzést okozó 20 mikroorganizmus vagy mikroorganizmusok.
Az antibiotikumos kezelés alkalmas módja az intravénás infúzió. Az eljárásban az antibiotikum alkalmas, oldható sóját sterilen fiziológiás közegben, például 5%-os dextrózol- 25 dalban oldjuk, és a nyert oldatot lassan intravénásán infuzáljuk. Alternatív eljárásként az intravénás infúziónak .piggy-back' módszerét is alkalmazhatjuk.
A találmány szerinti eljárással előállított 30 vegyületek alkalmasak továbbá: 1) az állatok - például szárnyasok, sertés, juh vagy szarvasmarha - tápanyag-hasznosításának fokozására; 2) hústermelésre nevelt állatok - például szárnyasok, sertés, juh vagy szarvas-35 marha - növekedésének meggyorsítására; 3) tejelő állatok tejtermelésének fokozására. A tápanyag-hasznosítás fokozására és a növekedés meggyorsítására megfelelő mennyiségű A82 846 antibiotikumot juttatunk be megfelelő40 eleségbe elkeverve az állatba. Ez a mennyiség 2-200 g között változik 1000 kg takarmányra számítva. Szarvasmarháknak például 12-3000 mg-ot adunk be naponként. Tejelő kérődzők tejtermelésének fokozásához test-45 súlykilogrammonként 0,04-16 mg antibiotikumot adunk be naponként orális adagolás esetében (ez egy állatra számolva napi 25-5000 mg mennyiséget jelent).
A találmány antibiotikumjait célszerű50 premix formájában forgalmazni, amely premix a hatóanyag mellett egy vagy több, az állattenyésztésben alkalmazható hordozóanyagot is tartalmaz.
Az elmondottak szemléltetésére az aláb-55 biakban példákat adunk meg.
Az A82 846 komponensek HPLC analízisére az alábbi rendszereket alkalmazhatjuk:
a) kationcseréló gyantán:
oszloptöltet: Zorbax SCX(4,6x150 mm oszlop; a Zorbax oszlopok az É. J. du Pont de Nemours el. Co., Inc. termékei; Delaware 19 898 USA); eluens: gradiens elüció - A:B komponens arányt 5 perc alatt 4:1-röl l:9-re változtatjuk, majd ezen eluálunk 15 percen át;
A - melanol/Ο,ΙΜ nátrium-dihidrogén-foszfát, 1:9,
B = metanol/0,9M nátrium-dihidrogén-foszfát, 1:9, áramlási sebesség: 225 nm;
retenciós idők: A82 846 = 6,6 perc,
A82 846B = 8,9 perc,
A82 846C = 9,5 perc.
b) fordított fázisú oszlopon: oszloptöltet: Zorbax ODS 14,6x150 mm oszlop); eluens: gradiens elúció - 1% ammónium-dihidrogén-foszfát/acetonitril rendszerben az arány 20 perc alatt 95:5-röl 50:50-re változik;
áramlási sebesség: 1,0 ml/perc, detektálás: 225 mm,
retenciós idők: | A82 | 84 6A | = 7,3 | perc |
A82 | 846B | 2 7,6 | perc | |
A82 | 846C | = 8,0 | perc. |
1. példa
Az A82 846 antibiotikumot rázott lombikban vagy tankfermentorban termelhetjük az ΛΚ2 846 törzset tenyésztve.
a) Rázott lombikos termelés: liofilizált vagy folyékony nitrogén alatt tartott Noeardia orientalis NRRL 18 098 törzzsel oltjuk be a következő összetételű inokulum te p talajt;
glükóz oldható keményítő éiesztőkivonat enzimmel hidrolizált kazein* kalcium-karbonát ionmentes vízzel *NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norvich,
N. Y, USA.
1.0%
2.0%
0.5%
0.5%
0.1% literre feltöltve
Sterilizálás előtt a táptalaj kémhatását nátrium-hidroxid oldattal pH=7,5-re állítjuk be. 2,5% agart adva e táptalajhoz ferde agart vagy agarlemezeket öntünk és ezeket oltjuk be a megnevezett törzzsel. A beoltott táptalajt 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10-14 napig. A kinőtt tenyészetet steril eszközzel lekaparjuk, hogy kiszabaduljanak a spórák és széttöredezzen a micélium. A lekapart tenyészetnek kb. egynegyedével oltunk be 53 ml fenti összetételű folyékony inokulum táptalajt,
A beoltott táptalajt 250 ml-es Erlenneyer lombikban, 30 °C hőmérsékleten rázatj ik 24-48 órán át. Az 5,08 cm kitérésű rázógep forgási sebessége 250 fordulat percenteni.
0,5 ntl igy kapott oltóanyaggal oltunk be 50 ml, alábbi összetételű termelő táptalajt:
-1325
HU 198964 Β glükóz 2.5% szójaliszt 1.5% ' burgonya dextrin 3.0% kalcium-karbonát 0.25% melasz 0.3% savval hidrolizált kazein* ‘ 0.5% ionmentes vízzel 1 literre feltöltve *Hy-Case, Sheffield Chemical Co.
Sterilizálás előtt a táptalaj kémhatását pH=7,5 értékre állítjuk be nátrium-hidroxid oldattal.
A beoltott táptalajt 250 ml-es széles szájú Erlenmeyer lombikban rázatjuk 30 °C hőmérsékleten 4-5 napon keresztül. Az 5,08 cm kitérésű rázógép forgási sebessége 250 fordulat percenként.
b) Tankfermentorban történő termelés: hogy kellő mennyiségű oltóanyaghoz jussunk, 10 ml· az előző a) pontban leirt módon előállított inokuliim tenyészettel beoltunk 400 ntl újabb táptalajt, melynek összetétele megegyezik az első lépéses tenyészet táptalajának összetételével. Ezt a második lépéses vegetatív közeget 2 literes széles szájú Erlenineyer lombikban rázatjuk 30 °C hőmérsékleten 48 órán át. Az 5,08 cm kitérésű rázógép forgási sebessége 250 fordulat percenként.
1000 ml így kapott, második lépéses vegetatív tenyészettel oltunk be 100 liter steril termelő táptalajt, melyet az a) pontban leírtak szerint állítunk össze, azzal a különbséggel, hogy literenként 0,3 g P-2000 habzásgátlót is adunk hozzá. A beoltott táptalajt 165 literes kevert tankfermentorban fermentáljuk 30 °C hőmérsékleten 90-100 órán át. A percenként 80-as fordulatszámmal kevert tenyészet levegőztetését úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigénszint a levegőtelítettségi érték 50%-a felett legyen.
b) lépést elvégezhetjük úgy is, hogy 4536 literes tankfermentorban levő 3400 liter termelő táptalajt beoltunk megfelelő mennyiségű vegetatív oltóanyaggal.
2. példa
Az A82 846 antibiotikum termelését A82 846.1 törzzsel elvégezhetjük úgy, hogy liofilizált állapotban vagy folyékony nitrogén alatt tartott Nocardia orientalis NRRL 18 099 törzzsel az 1. példában leírtak szerint végzünk fermentációt, azzal a különbséggel, hogy a termelő táptalajt az alábbi összetételű:
glükóz burgonya dextrin pepton* kalcium-karbonát melasz ionmentes vízzel pH beállítás nincs. ’Bacto-pepton (Difco
1.0%
2.0%
1.0%
0.2%
2.0% literre feltöltve
Laboratories).
3. példa
Az A82 8-16 antibiotikum előállítása Λ82 816.2 törzzsel: a liofilizett állapotban vagy folyékony nitrogén alatt eltartott Nocirdia orientalis NRRL 18 100 törzzsel az 1. példában leírtak szerint végzünk fermentálást, azzal a különbséggel, hogy a savval hidrolizált kazein helyett Amicase-t (Sheffield
Chemical Co.) használunk.
4. példa
A nyers A82 8-16 antibiotikum előállitásóI oz 4200 liter, az A példa b) pontjában leírtak szerint előállított fermentlé kémhatását 4 n nátrium-hidroxiddal pH=10,5 értékre állítjuk he, és hozzáadunk 3% Celite 545-öt (szűrést elősegítő adalék). A keveréket présszűrőn szűrjük, a kiszűrt anyagot vizzel mossuk. A szűrletel és a mosóvizet egyesítjük (4200 liter), a kémhatását 5 n sósavval (vagy kénsavval) pll-7 értékre állítjuk be és
Powex-SFS-43 278 (NH*) gyantára visszük. 10 1 Ler gyantát számítunk 200 liter szűrletre. Az oszlopot 750 ml/perc sebességgel eluáljuk. A frakciókat biológiai értékméréssel - Bacil1 is subtilisl használva tesztorganizmusként 30 vagy HPLC-vel vizsgáljuk.
Az. oszlopot 5 oszlop-térfogatnyi vizzel mossuk, 100 literes frakciókat gyűjtve.
Az aktív anyagot 5 oszlop-térfogatnyi
C,05 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk a gyantáról, 25 literes frakciókat gyűjtve. Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson kb. 30 literrel töményítjük. Ezt az oldatot visszük rá 10 liter, vizes gyantaágyban levő Diaion ) P-20 oszlopra. Az oszlopot 3 oszlop-térfogatnyi vízzel mossuk 300 ml/perc átfolyási sebességnél. A vizes mosót eldobjuk. Az aktív anyagot víz/izopropanol, 95:5 eleggyel, mely ) ,0% eeetsavat tartalmaz eluáljuk per45 cenként. 100 ml-es átfolyási sebességnél. 4 literes frakciókai. gyűjtünk, melyeket biológiai értékméréssel vagy , HPLC-vel vizsgálunk. Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat (6—14.) egyesítjük, csökkentett nyomóson be50 pároljuk és fagyasztva szárítjuk, 356 g r yers A82 846 antibiotikumot nyerve.
5. példa
Az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok elválasztásához 30 g a 4. példában leírlak szerint nyert A82 846 antibiotikumot 500 ml vízben oldjuk és 30 literes, LP-l/Cie szilikagéllel töltött rozsdamentes acéloszlopra visszük, melyet 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfáttal ekvilibráltunk. Az elúciót 60 liter 1%-os ammóriiuiii-dihidi’ogén-foszfát oldattal kezdjük, majd a következő 60 literben 1%
-1427
IIU 198954 Β ammónium-dihidrogén-foszfát/acetonitril,
88:12 arányú elegyet használunk.
Az egyes frakciókat analitikai HPLC-vel elemezzük. Az A82 846A antibiotikumban és az A82 846B antibiotikumban feldúsult frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk (6-9., illetve 10-17. frakciókat).
Az előzőekben leírt elödúsitás szerint 2x30 g nyers A82 846 antibiotikumból nyert A82 846A antibiotikumban feldúsított terméket sótalanitás céljából 1750 ml Diaion HF-20 SS oszlopra visszük, amit vízzel mosunk, 0,5% ecetsavat tartalmazó, viz/izopropanol, 95:5 eleggyel eluálunk, és a frakciókat analitikai HPLC-vel elemezzük. Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, fagyasztva szárítjuk 7,4 g A82 846A antibiotikumban gazdag preparátumot nyerve.
7,2 g fenti preparátumot vízben oldunk és 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfátban levő LP-l/Cis szilikagél preparativ oszlopra visszük. Az oszlopot gradiens elúcióval kromatografáljuk, a kezdeti eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát a befejező eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát pufféi/ /acetonitril, 9:1 arányú elegye. Az elúciós sebesség percenként 48 ml. A frakciókat analitikai HPLC-vel vizsgáljuk, 254 nm-nél detektálva. Az első 10 liter eluens lejövetele után 500 ml-es frakciókat gyűjtünk.
Az A82 846A (4-10.) és az A82 846B (12-20.) antibiotikumokat tartalmazó frakciókat egyesítve, csökkentett nyomáson bepároljuk. Három sorozat A82 846A antibiotikumot tartalmazó preparátumát egyesítjük és 1750 ml Diaion HP-20 SS oszlopra visszük sótalanitás céljából. Az oszlopot vízzel mossuk, az A82 846A antibiotikumot 0,5% ecetsavat tartalmazó, viz/izopropanol, 95:5 eleggyel eluáljuk. Az elúciót analitikai HPLC-vel követjük nyomon. Az A82 846A antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 7,9 g tisztított A82 846A antibiotikumot nyerve.
Az A82 846A antibiotikum IR spektrumát (KBr) az 1. ábrán mutatjuk be; a tioglicerinben felvett FAB-tömegspektrumát a 4. ábrán láthatjuk; a 7. ábra az A82 846A-hidroklorid metil-szulfoxid-d6-ban 60 °C hőmérsékleten felvett NMR spektrumát mutatja (Bruker AM500 spektrométer, HDO szupresszált).
Az A82 846B tisztításához 3 preparativ HPLC kromatográfiát futtatunk le az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok szétválasztására. Az előzőekben leirt eljárás szerint kapott, A82 846B antibiotikumban feldúsított frakciókat egyesítjük és 1750 ml Diaion HP-20 SS oszlopon sótalanitjuk. Az oszlopot vízzel mossuk és 0,5% ecelsaval tartalmazó víz/izopropanol 95:5 eleggyel elítélünk. Az elúciót analitikai HPLC-vel követjük nyomon. Az A82 846B antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk,
8,8 g tisztított A82 846B antibiotikumot nyerve.
Az A82 846B antibiotikum IR spektrumát (KBr) a 2. ábrán, tioglicerinben felvett FAB-lömegspeklrumát az 5. ábrán, az acetátjának metil-szulfoxid-de-ban, 60 °C hőmérsékleten felvett NMR spektrumát (Bruker AM500 spektrométer, a 8. ábrán mutatjuk be,
A sótalanitási eljárásokat végezhetjük úgy is, hogy a Diaion HP-20 gyantára vitt anyagot 0,1% ecetsavat tartalmazó, metanol/víz, 4:1 eleggyel eluáljuk.
G. példa
Az A82 846C antibiotikum előállításához először A82 846 antibiotikumot termelünk, majd az A82 846A, B és C komponenseket elválasztjuk és az A82 846C komponenst tisztítjuk az alábbiak szerint:
Az 1. példában ismertetett tankfermentáció 461 liter fermentlevének kémhatá.- \t 5 n nátrium-hidroxiddal pH=10,5 értékre elitjük be, és 3% Hyflo Supercelt hozzáadva szűrjük. A 430 liter szűrlet kémhatását 5 n sósavval pH=7 értékre állítjuk be, és 10 liter Dowex-SFS-43 278 gyantára visszük. Az oszlopot 50 liter vízzel mossuk, az aktív anyagot 50 liter 0,05 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk, 4 literes frakciókat gyűjtve. Az elúciót biológiai érték méréssel analizáljuk. Az aktív frakciókat (1-7.) egyesítjük, csökkentett nyomáson kb. 1700 ml térfogatra tömény ít. jük, majd fagyasztva szárítva 283,9 g nyers A82 846 antibiotikum preparátumot nyerünk.
g nyers, A82 846 antibiotikum terméket vízben oldunk és 5,08x114,3 cm méretű rozsdamentes acél preparativ HPLC oszlopban 2110 ml LP-l/Cis szilikagél oszlopra viszünk, amit 1% ammónium-dihidrogén-foszfátban készítettünk előzőleg el. Az oszlopot gradiens elúciónak vetjük alá, a kezdeti eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldat, a végső 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát/ /acetonitril, 92:8 elegy. Átfolyási sebesség 70 ml/perc. 400 ml-es frakciókat gyűjtünk és 254 nm-nél detektálunk.
Különválasztjuk az A82 846A (11-14.) az A82 846C (16-20.) és az A82 846B antibiotikumot (21-25.) tartalmazó frakciókat, majd a megfelelőket egyesítjük.
Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó egyesített frakciókat 200 ml térfogatra tömé~ nyitjük és 7x45 cm-es üvegoszlopban 1800 ml Diaion HP-20 gyantán sótalanitjuk. Az aktív anyagot 0,1% ecetsavat tartalmazó, metanol/ /víz, 4:1 eleggyel eluáljuk. Átfolyási sebesség percenként 25 ml. 1 literes frakciókat gyűjtünk. Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat (9-12.) egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 662,2 mg félig tisztított A82 846C antibiotikum terméket nyerve.
-1529
HU 198964 Β
500 mg félig tisztítóit terméket tovább tisztítunk, megismételve a fordított fázisú kromatográfiai. Ehhez egy 1,5x121,92 cm méretű acéloszlopban készített 450 ml-es LP-l/Cie szilikagél oszlopot használunk. Gradiens elúció 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfáttal indulva, a végső eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldat/acetonitril, 92:8, áramlási sebesség 11 ml/perc. 25 ml-es frakciókat gyűjtünk, az elúciót 254 nm-en detektáljuk. Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat (169-210.) egyesítjük, HP-20 gyantát tartalmazó 5x45 cm méretű üvegoszlopon sótalanitjuk. Az oszlopot 0,1% ecetsavat tartalmazó, metanol/víz, 4:1 eleggyel eluáljuk, 100 ml-es frakciókat gyűjtünk, az elúciót analitikai HPLC-vel kisérjük nyomon, 225 nmen detektálva. Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat (5-11.1 egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, fagyasztva szárítjuk. 127,3 mg Λ82 8-16C antibiotikumot kapunk.
Az A82 846A és az A82 846B antibiotikumot tartalmazó egyesített frakciókat az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakció előzőekben ismertetett feldolgozása szerint tisztítjuk tovább, a megfelelő tisztított antibiotikumokhoz jutva.
Az A82 846C antibiotikum további tisztításához 70 mg fenti terméket az alábbi kromatográfiás rendszerben dolgozunk fel:
Oszlop: Zorbax SCX (9,2x250 nini) kationcserélö.
Mozgó fázis: lineáris gradiens; kezdő eluens: 10% metanolt tartalmazó 0,15 M nátrium-dihidrogén-foszfát pufféi·; végső eluens, 10% metanolt tartalmazó 0,9 M nátrium-dihídrogén-foszfát puffer, a gradiens kialakítás 6 perc időtartamú, majd 5 percen át a végső eluenssel eluálunk. A pufferek kémhatását nem állítjuk be adott értékre.
Áramlási sebesség: 6,0 ml/perc.
Detektálás: 280 nm-en.
Bevitt anyagmennyiség: 6,0 mg, vízben oldva.
Az A82 846C antibiotikum frakciókat automatikus frakciószedövel (Gilson 2010 gyűjtünk össze, csúcsdetektálási mechanizmus segítségével. A mozgó fázist Millipore Wpters M600 Gradient HPLC System készülékkel alakítjuk ki, az injektálást Hitachi automata frakciógyűjtövel végezzük.
Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, 30 ml térfogatra töményítjűk és 50 ml-es HP-20 oszlopra viszszúk. Az oszlopot vízzel mossuk, 0,5% ecetsavat tartalmazó viz/izopropanol, 95:5 eleggyel eluáljuk, 25 ml-es frakciókat gyűjtve. Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük (9-14.). bepároljuk, fagyasztva szárítjuk. 37 mg tisztított A82 846C antibiotikumot nyerünk.
Az A82 846C antibiotikum IR spektrumát (KBr) a 3. ábrán, tioglicerinben felvett FAB-tömegspektrumát a 6. ábrán, az acetátjának metil-szulfoxid-d6-ban 60 °C hőmérsékletén felvett NMR spektrumát (Bruker AM500 spektrométer, 1IDO szupresszált), a 9. ábrán mulatjuk be.
7. példa
Az Λ82 816 antibiotikum sóinak előállításához 100 mg antibiotikumot feloldunk 10 ml ionmentes vízben. Az oldat kémhatását 5 n savval - sósavval, kénsavval vagy foszforsavval - pll=3 értékre állítjuk be. Az oldatot fagyasztva beszárítva megkapjuk a megfelelő sót.. Ha az oldat kémhatása alacsonyabb pll=3 értéknél (például pH=2), a vegyület bomlik. Az i.lábbi kitermeléseket kaptunk:
só A82 846A (mg) A82 846B (mg)
I1C1 UzSOUIbPOí 93,8(92,5)110,8 88,1(75,41105,7
Az A82 846B UV-spektruma a következő:
körülmények hullámhossz (nm) abszorbancia | ||
semleges savas bázikus | 281 282 398/298 | 0.0587 0.0613 0.0023/ /0.0781 |
8. példa | ||
Az A82 | 846A antibiotikumot | tartalmazó |
tabletták előállitásíit az alábbi alkotórészekből készítjük:
A82 846-foszfát | 282.9 | mg |
mikrokristályos cellulóz | 101.1 | mg |
kraszkar mai lóz- nátrium | 12.0 | mg |
Providone | 12.0 | mg |
mag'nézium-sztearát | 3.0 | mg |
sztearinsav | 4.0 | mg |
tisztított víz | 0.1€ | i ml |
Megfelelő edénybe homogénné őröljük az A62 846A-foszfátot, a mikrokristályos cellulóz egy részét és a kroszkarmellóz-nátrium egy részét. Vizes Providone oldatot készítünk, és ezt hozzáadjuk a megőrölt porhoz. A keveréket megfelelő méretűre granuláljuk és megszárítjuk. A száraz szemcsés anyaghoz hozzáadjuk a mikrokristályos cellulóz és a kioí zkarmellóz fennmaradt részét és a keveréket összeóröljük. Magnézium-sztearátol és sztearinsavat adunk hozzá és megőróljük, majd a kapott port. tablettákká sajtoljuk. ,
Claims (4)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOKAz A82 846B antibiotikumot tartalmazó
kapszulák elkészítéséhez a kapszulákat. alábbi összetételű keverékkel töltjük meg: A82 846B-hidroklorid 262.2 kukoricakeményitő, folyékony por 137.7 szilikonfolyadék, 350 centistoke 2.7 kukoricakeményitő 147.1 Az alkotórészeket alkalmas malomban homogénné őröljük, és a megfelelő méretű ke- 15 mény zselatin kapszulákba töltjük.10. példaAz A82 84CA antibiotikumot tartalmazó szuszpenzió elkészítéséhez az A82 846A antibiotikumot átkristályositással vagy lecsapással steril, oldhatatlan állapotba hozzuk.Ezt olyan szemcseméretüre aprítjuk, ami al- 25 kalmas a szuszpenzió elkészítéséhez. Az A82 846A antibiotikumot az alábbi hordozóközegben szuszpendáljuk:lecitin 1% 30 nátrium-citrát. 2% propilparaben 0.015% injektálható víz kívánt térfogatban.A szuszpenziót elkészítjük gyárilag 35 nagy térfogatban és ezt fiolákba töltjük szét, vagy elkészítjük a szuszpenziót felhasználás előtt., a hordozóközeget hozzáadva az üvegcsékben lévő A82 846A antibiotikumhoz. 401. Eljárás az A82 846 antibiotikum-komplex, és az annak alkotórészeit képező (2) általános képletű A82 846A - aholX hidrogénatom ésY klóratom -,Λ82 846B - aholX és λ' klóratom -, és A82 846C - aholX és 1' hidrogénatom antibiotikumok és savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a Nocardia orientalis NRRL 18 098, NRRL 18 099 vagy NRRL 18 100 törzset vagy ezek valamelyikének A82 816 antibiotikumot termelő mutánsát vagy variánsát, asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon tenyésztjük süllyesztett, aerob r<:rmenl.ációs körülmények között, kívánt esetben az antibiotikumot elválasztjuk t ferniotiUéböl és/vagy savaddiciós sóvá alakítjuk, ha nincs sóforniában. - 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A82 846A antibiotikum és gyógyászati szempontból alkalmazható savaddíciós sói előállítására, azzal jellemezve, hogy az antibiotikumot a tenyészléból elválasztjuk, és kívánt esetben megfelelő sóvá alakítjuk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A82 84GB antibiotikum és gyógyászati szempontból alkalmazható savaddiciós sói előállítására, azzal jellemezve, hogy az antibiotikumot a tenyészléból elválasztjuk, és kívánt esetben megfelelő sóvá alakítjuk.
- 4. Eljárás aktív alkotórészként A82 846, A82 846A, A82 846B vagy A82 846C antibiotikumot vagy- gyógyászati szempontból alkalmazható sóját tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított hatóanyagot egy vagy több gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyaggal gyógy szerkészitménnyé feldolgozzuk.Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest - A kiadásért felel: Himer Zoltán osztályvezető R 4889 - KJK90.2639.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US90979186A | 1986-09-19 | 1986-09-19 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT46365A HUT46365A (en) | 1988-10-28 |
HU198964B true HU198964B (en) | 1989-12-28 |
Family
ID=25427837
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU874180A HU198964B (en) | 1986-09-19 | 1987-09-18 | Process for producing glycopeptide antibiotics and pharmaceutical compositions comprising same |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5312738A (hu) |
EP (1) | EP0265071B1 (hu) |
JP (2) | JP2634174B2 (hu) |
KR (1) | KR960013093B1 (hu) |
CN (1) | CN1061095C (hu) |
AU (1) | AU608534B2 (hu) |
CA (1) | CA1339033C (hu) |
CY (1) | CY1691A (hu) |
DE (1) | DE3782720T2 (hu) |
DK (1) | DK167689B1 (hu) |
EG (1) | EG18377A (hu) |
ES (1) | ES2052574T3 (hu) |
FI (1) | FI90993C (hu) |
GR (1) | GR3006311T3 (hu) |
HK (1) | HK44393A (hu) |
HU (1) | HU198964B (hu) |
IE (1) | IE60132B1 (hu) |
MX (1) | MX168708B (hu) |
NZ (1) | NZ221856A (hu) |
PH (1) | PH24288A (hu) |
PT (1) | PT85742B (hu) |
SU (1) | SU1724015A3 (hu) |
ZA (1) | ZA877003B (hu) |
Families Citing this family (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946941A (en) * | 1986-01-24 | 1990-08-07 | Shionogi & Co., Ltd. | Novel glycopeptide antibiotics |
EG18377A (en) * | 1986-09-19 | 1993-04-30 | Lilly Co Eli | Process for preparing glycopeptide antibiotics |
US5071749A (en) * | 1987-04-16 | 1991-12-10 | Shionogi & Co., Ltd. | Glycopetide antibiotic pa-45052-b |
WO1989002441A1 (en) * | 1987-09-19 | 1989-03-23 | Beecham Group Plc | Antibiotic compounds |
US5534420A (en) * | 1988-07-28 | 1996-07-09 | Eli Lilly And Company | Biotransformation of glycopeptide antibiotics |
CA1339808C (en) * | 1988-10-19 | 1998-04-07 | Manuel Debono | Glycopeptide antibiotics |
JP2577133B2 (ja) * | 1989-11-27 | 1997-01-29 | スティフティング フォール ド テフニスヘ ウェッテンスハッペン | 船舶のプロペラ |
NZ236393A (en) * | 1989-12-13 | 1992-05-26 | Lilly Co Eli | N-alkylated glycopeptide derivatives prepared from antibiotics a82846 series and pa-42867-a; pharmaceutical compositions |
US5187082A (en) * | 1990-08-16 | 1993-02-16 | Eli Lilly And Company | Process for producing A83850 antibiotics |
MY128335A (en) * | 1994-01-28 | 2007-01-31 | Lilly Co Eli | Glycopeptide antibiotic derivatives |
US5840684A (en) * | 1994-01-28 | 1998-11-24 | Eli Lilly And Company | Glycopeptide antibiotic derivatives |
US5919756A (en) * | 1996-06-28 | 1999-07-06 | Eli Lilly And Company | Amides |
US5952466A (en) * | 1997-11-12 | 1999-09-14 | Eli Lilly And Company | Reductive alkylation of glycopeptide antibiotics |
US5952310A (en) * | 1997-05-20 | 1999-09-14 | Eli Lilly And Company | Glycopeptide hexapeptides |
JP4307723B2 (ja) * | 1998-05-01 | 2009-08-05 | イーライ リリー アンド カンパニー | N1−修飾グリコペプチド |
WO2001036655A2 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Eli Lilly And Company | Method for optimization of a medium for glycopeptide fermentation |
US7019129B1 (en) | 2000-05-09 | 2006-03-28 | Biosearch Technologies, Inc. | Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer |
US6734165B2 (en) | 2001-08-23 | 2004-05-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for re-sensitizing vancomycin resistant bacteria which selectively cleave a cell wall depsipeptide |
US6551591B1 (en) | 2001-09-07 | 2003-04-22 | Essential Therapeutics, Inc. | Antibiotics from microbispora |
US20050289488A1 (en) * | 2004-06-29 | 2005-12-29 | I-Ju Chou | System and method for mask defect detection |
WO2006010038A2 (en) * | 2004-07-08 | 2006-01-26 | Biosearch Technologies, Inc. | Inducible fluorescence assay |
EP2096107A1 (en) | 2004-12-23 | 2009-09-02 | GPC Biotech AG | Derivatives of squaric acid with anti-proliferative activity |
CN101245068A (zh) | 2007-02-14 | 2008-08-20 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 结晶型态的恩替卡韦及其制备方法和其药物组合物及用途 |
US8450348B2 (en) * | 2007-02-21 | 2013-05-28 | Forma Tm, Llc | Derivatives of squaric acid with anti-proliferative activity |
CN101284799B (zh) | 2007-03-23 | 2013-04-03 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 咖啡酰奎宁酸含氮衍生物及其制备方法和其药物组合物及用途 |
EP2019101A1 (en) * | 2007-07-26 | 2009-01-28 | GPC Biotech AG | Pyrazol[3,4-d]pyrimidin-4-one useful as Kinase Inhibitor |
CN101397333A (zh) * | 2007-09-27 | 2009-04-01 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 去羟基万古霉素及其制备方法、和其药物组合物及其用途 |
CN101545000B8 (zh) * | 2008-03-28 | 2018-09-21 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种提高东方拟无枝酸菌发酵生产eco-0501的产量的方法 |
DK2757091T3 (en) | 2008-04-01 | 2017-08-14 | Biosearch Tech Inc | PROBLEMS FOR STABILIZED NUCLEIC ACID DARK-QUENCHER FLUOROPHOR |
EP2112152A1 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-28 | GPC Biotech AG | Dihydropteridinones as Plk Inhibitors |
EP2112150B1 (en) | 2008-04-22 | 2013-10-16 | Forma Therapeutics, Inc. | Improved raf inhibitors |
CN101828693B (zh) | 2009-03-09 | 2013-01-02 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 制备低粘度高流动性类胡萝卜素油悬浮液的方法及其应用 |
CN101928331B (zh) * | 2009-06-26 | 2014-05-28 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种化合物及其应用 |
EP2325185A1 (en) | 2009-10-28 | 2011-05-25 | GPC Biotech AG | Plk inhibitor |
CN102690332B (zh) * | 2011-03-23 | 2017-06-27 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 新型糖肽类抗生素衍生物及药物组合物、以及其制备方法和用途 |
CN102690330B (zh) * | 2011-03-23 | 2014-10-08 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 三取代糖肽类衍生物及药物组合物、以及其制备方法和用途 |
RU2011122942A (ru) | 2011-06-08 | 2012-12-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Асинэкс Медхим" | Новые ингибиторы киназ |
JP5996187B2 (ja) * | 2011-12-20 | 2016-09-21 | 株式会社ダイセル | エクオールの製造方法 |
WO2014160250A2 (en) * | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Yale University | Site-selective functionalization of glycopeptide antibiotics |
CN104805161A (zh) * | 2014-01-29 | 2015-07-29 | 上海医药工业研究院 | 生产奥利万星前体a82846b的方法及培养基 |
AU2015289602B2 (en) | 2014-07-17 | 2020-06-25 | Abbvie Inc. | High purity oritavancin and method of producing same |
CN106190854B (zh) * | 2015-04-29 | 2019-09-27 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法 |
CN106467570B (zh) * | 2015-08-14 | 2020-04-07 | 正大天晴药业集团股份有限公司 | 糖肽类抗生素的还原烷基化方法 |
WO2018010475A1 (zh) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 糖肽类衍生物及其药学可接受的盐、制备方法和应用 |
CN106928323B (zh) * | 2017-03-02 | 2021-08-20 | 重庆乾泰生物医药有限公司 | 一种高纯度奥利万星关键中间体a82846b的制备方法 |
CN108929860B (zh) * | 2017-05-23 | 2023-08-22 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种产chloroeremomycin的基因工程菌及其制备方法和应用 |
CN109971809B (zh) * | 2019-04-02 | 2023-04-28 | 博瑞生物医药(苏州)股份有限公司 | 一种糖肽类抗生素中间体的发酵制备方法 |
CN109929895B (zh) * | 2019-04-02 | 2021-05-18 | 博瑞生物医药泰兴市有限公司 | 一种酸降解液 |
CN113563426B (zh) * | 2021-08-05 | 2023-03-31 | 丽珠集团福州福兴医药有限公司 | 奥利万星母核a82846b的分离纯化方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3067099A (en) * | 1955-09-16 | 1962-12-04 | Lilly Co Eli | Vancomycin and method for its preparation |
US4558008A (en) * | 1983-12-13 | 1985-12-10 | Eli Lilly And Company | Process for production of A-51568B antibiotic |
US4548925A (en) * | 1984-04-16 | 1985-10-22 | Eli Lilly And Company | Antibiotic M43A, pharmaceutical composition and method of use |
US4547488A (en) * | 1984-04-16 | 1985-10-15 | Eli Lilly And Company | Antibiotic M43D, pharmaceutical compositions and method of use |
US4548924A (en) * | 1984-04-16 | 1985-10-22 | Eli Lilly And Company | Antibiotics M43B and M43C, pharmaceutical composition and method of use |
US4946941A (en) * | 1986-01-24 | 1990-08-07 | Shionogi & Co., Ltd. | Novel glycopeptide antibiotics |
GB8618445D0 (en) * | 1986-07-29 | 1986-09-03 | Lepetit Spa | Antibiotic a 42867 |
DK387287A (da) * | 1986-07-30 | 1988-01-31 | Smithkline Beckman Corp | Glycopeptidantibiotika |
EG18377A (en) * | 1986-09-19 | 1993-04-30 | Lilly Co Eli | Process for preparing glycopeptide antibiotics |
US5071749A (en) * | 1987-04-16 | 1991-12-10 | Shionogi & Co., Ltd. | Glycopetide antibiotic pa-45052-b |
-
1987
- 1987-07-17 EG EG532/87A patent/EG18377A/xx active
- 1987-09-17 EP EP87308219A patent/EP0265071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-17 ES ES87308219T patent/ES2052574T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-17 ZA ZA877003A patent/ZA877003B/xx unknown
- 1987-09-17 DK DK489787A patent/DK167689B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-09-17 PH PH35832A patent/PH24288A/en unknown
- 1987-09-17 CA CA000547163A patent/CA1339033C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-09-17 PT PT85742A patent/PT85742B/pt unknown
- 1987-09-17 DE DE8787308219T patent/DE3782720T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-18 MX MX008363A patent/MX168708B/es unknown
- 1987-09-18 AU AU78658/87A patent/AU608534B2/en not_active Expired
- 1987-09-18 JP JP62236048A patent/JP2634174B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-18 FI FI874082A patent/FI90993C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-09-18 SU SU874203370A patent/SU1724015A3/ru active
- 1987-09-18 NZ NZ221856A patent/NZ221856A/en unknown
- 1987-09-18 HU HU874180A patent/HU198964B/hu not_active IP Right Cessation
- 1987-09-18 IE IE252987A patent/IE60132B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-09-18 KR KR1019870010365A patent/KR960013093B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-09-19 CN CN87106483A patent/CN1061095C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-05-09 US US07/521,202 patent/US5312738A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-11-20 GR GR920402572T patent/GR3006311T3/el unknown
-
1993
- 1993-05-06 HK HK443/93A patent/HK44393A/xx not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-01-14 CY CY169194A patent/CY1691A/xx unknown
-
1995
- 1995-06-06 US US08/466,656 patent/US5843437A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-11-13 JP JP8301665A patent/JP2806912B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU198964B (en) | Process for producing glycopeptide antibiotics and pharmaceutical compositions comprising same | |
US4994270A (en) | A54145 antibiotics and process for their production | |
US5286631A (en) | Process for producing the A10255 complex and corresponding microorganism | |
US5187082A (en) | Process for producing A83850 antibiotics | |
CA1297825C (en) | Antibiotics called "chloropolysporins b and c" a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use | |
US4495179A (en) | A51568 Antibiotic and process for producing thereof | |
IE60394B1 (en) | Antibiotic A10255 complex and factors, process, microorganisms for its production | |
US4764510A (en) | Antibiotic A42125 and process for its production | |
DE68925540T2 (de) | Peptid-Antibiotika | |
US4558009A (en) | Process for producing antibiotic A-51568 by fermentation and microorganism | |
EP0112184B1 (en) | Antibiotic a51568 factors a and b | |
US5213797A (en) | A80407 antibiotics | |
US4996148A (en) | A80407 antibiotics | |
AT390802B (de) | Glykopeptidantibiotika |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HU90 | Patent valid on 900628 | ||
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |