HU198964B

HU198964B - Process for producing glycopeptide antibiotics and pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HU198964B
Application number: HU874180A
Authority: HU
Inventors: Robert L Hamill; James A Mabe; David F Mahoney; Walter M Nakatsukasa; Yao R Che-Fong
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1986-09-19
Filing date: 1987-09-18
Publication date: 1989-12-28
Also published as: JP2806912B2; PT85742B; JP2634174B2; ZA877003B; US5843437A; NZ221856A; IE872529L; CN1061095C; DK489787D0; FI874082A0; DE3782720D1; HUT46365A; DK489787A; KR880004097A; US5312738A; AU7865887A; EP0265071B1; CY1691A; DE3782720T2; HK44393A

Description

A találmány tárgya eljárás új, a vankomicin-csoportba tartozó, glikopeptid antibiotikumok előállítására, közelebbről eljárás az A82 846 antibiotikum, illetve ennek az A82 846A, A82 846B A82 846C jelű alkotórészeinek előállítására új mikroorganizmustörzsek segítségével.

Noha napjainkban már számos antibiotikum áll rendelkezésünkre, új antibiotikumok feltalálása a. humán gyógyászat fontos igénye. A vankomicin például kereskedelmi forgalomból beszerezhető, eddig is sok ember életét megmentő, sikeres antibiotikum, ennek ellenére alkalmazása nem kívánt következményekkel, például hallószervi- és vesekárosodással járhat. Ezért kívánatosak az olyan antibiotikumok, melyek a vankomicinhez hasonló aktivitásúak, de jobb farmakokinetikai tulajdonságokkal vagy gyengébb mellékhatással rendelkeznek.

Feltaláltuk, hogy a Nocardia oreintalis NRRL 18 098, NRRL 18 099 vagy az NRRL 18 100 törzs süllyesztett, aerob tenyészete asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon értékes glikopeptid antibiotikumokat termelhet. Ezeket a glikopeptid antibiotikumokat önkényesen A82 846 jelöléssel láttuk el.

Az A82 846 antibiotikumok szerkezetét tekintve hasonló a vankomicinhez, de fokozottabb aktivitást mutat in vivő és in vitro a Gram-pozitiv baktériumokkal szemben, ezen kívül a farmakokinetikai vizsgálatok szerint félélettartalma hosszabb a vankomicinénél.

Az A82 846 alkotórészek az alábbi fizikai és fizikai-kémiai tulajdonságokkal jellemezhetők:

A82 846A

Molekulatömeg: 1556.

Tapasztalati képlet: C73Hs9NioOz6C1

FAB-MS (tioglicerin): M+l; mért: 1557, 5803; a C73H90N10O26CI képlet alapján számolt:

1557,5716 (4. ábra).

UV (víz), λ·»: 281 nm (£=5052), lúgosítással

300 nm-re tolódik.

IR(KBr): 1716, 1655, 1611, 1586, 1552, 1504, 1410, 1340, 1310, 1230, 1212, 1132, 1066, 1028 és 1015 cm^-1 (1. ábra).

NMR (dimetil-szulfoxid): 7. ábra.

pKa (víz): 4,7; 9,5;

(66%, dimetil-formamid): 5,5, 6,8, 7,9, 9,4,

12,3.

(Látszólatos móltömeg: 1542).

A82 846B

Molekulatömeg: 1590.

Tapasztalati képlet: C73H8SN10O26CI2

FAB-MS (tioglicerin): M+l, mért: 1591, 5315; a C73H89N10O2ÍCI2 képlet alapján számolt:

1591,5327 (5. ábra).

UV (víz) λ·»: 280 nm (£=5192), lúgositva eltolódik 300 nm-re.

IR(KBr): 1656, 1586, 1562, 1504, 1403, 1264, 1230, 1135, 1105, 1065, 1023 és 1018 cm'¹ (2. ábra).

NMR (dimetil-szulfoxid): 8. ábra.

pKa (víz): 4,65 és 9,5.

A82 846C

Molekulatömeg: 1552.

Tapasztalati képlet: C73H90N10O26

FAB-MS (tioglicerin): M+Na, mért: 1545,5998; a C73ll9tNio026Na képlet alapján számolt:

1545,5925 (6. ábra).

UV tvlz), A«a.\·. 280 nm (£=5198), lúgosítással

300 nm-re tolódik.

IR(KBr): 3600 —>3004 (széles), 2999, 2991,

2950, 1687->1650 (széles), 1585, 1570, 1509,

1503, 1453, 1449, 1402, 1212, 1130, 1102, 1060, 1032 és 1014 cm*¹ (3. ábra).

NMR .(dimetil-szulfoxid): 9. ábra.

pKa (víz): 4,6 és 9,4.

\z A82 846A, A82 846B és az A82 846C komponensek 6 n sósavval végzett hidrolízise után az aminosavanalízis aszparaginsav jelenlétére utal, emellett két széles csúcs je20 lenik meg glicin nyommal. A két csúcs aktinoidin- és vankomicin - aminosavaknak látszanak megfelelni, mindkettő jelen van a vankomicin típusú glikopeptidekben.

Az összehasonlító NMR vizsgálatok azt mutatják, hogy az A82 846A, A82 846B és az A82 846C mindegyike tartalmazza az (1) képletű új amino-cukrot, a 4-epi-vankózamint (3-met.il-akózamint).

Az A82 846A szerkezeti képlete megfelel a vankomicinénak (C6SH75N9O24CI2), de egy klóratommal kevesebbet tartalmaz és egy vankczamin (C7H14NO3) típusú további aminocukor elemeit tartalmazza.

Az A82 846B szerkezeti képlete megfelel az A82 846A szerkezeti képletének, de az utóbbi egy hidrogénatomját klóratom helyettesíti.

Az A82 846C szerkezeti képlete megfelel az A82 846A szerkezeti képletének, de az utóbbi klóratomját egy hidrogénatom helyettesíti.

Az A82 846 komponensek a glikopeptidek új csoportját képezik, melyre a vankomicin molekula általánosan jellemző, de attól a klórtartalomban és egy további vankózamin alegységben különböznek.

íz A 82 846 komponensek a (2) általános képlettel jellemezhetők.

Az A82 846 komponensek cukorcsoport50 jainak abszolút konfigurációi még nincsenek meghatározva.

Az A82 846 és az egyes kompoenesei, az A82 846A, A82 846B és az A82 846C savaddiciós sókat képezhetnek. Az antibiotikumok mindezen származékai részét képezik a találmánynak. Az A82 846 sókat például felhasználhatjuk az antibiotikum elválasztásánál és tisztításánál. Ezenkívül sóképzéssel megnövelhető a vízben való oldhatóság.

Az A82 846 és az egyes komponensei, az járásokkal állíthatjuk elő.

Példaként említhetjük azokat a sókat, amelyeket a szokásos sóképzö eljárások segítségével szerves vagy szervetlen savakkal állítunk elő; ilyen savak például a kén-, só-,

HU 198964 Γ· foszfor-, ecet-, borostyánkő-, citrom-, tej-, malein-, furnér-, kol-, panioe-, mucin-, D-glutamin-, d-kámfor-, glutár-, glikol-, ftál-, borkő-, hangya-, laurin-, sztearin-, szalicil-, benzoe-, fenil-akril-sav, stb. 6

Különösen előnyösek a gyógyászati szempontból alkalmazható savaddíciós sók.

Az A82 846 antibiotikumot az A82 846-ot termelő Nocardia orientalis törzsekkel termelhetjük süllyesztett, aerob tenyészetben, al- ¹⁰kalmas táptalajon. Az antibiotikumot ismert izolálási és tisztítási eljárásokkal nyerhetjük ki.

A találmány foglalkozik azokkal a biológiailag tisztított mikroorganizmus tenyészetekkel, melyeket Nocardia orienlelis NRRL 18 098, Nocardia orientalis NRRL 19 099, Nocardia orientalis NRRL 18 100 törzsekből vagy e törzsek A82 846 antibiotikumot termelő mutánsaiból vagy változataiból szelektál- 20 tünk. Ezek a mikroorganizmusok felhasználhatók, mert A82 846 antibiotikumot termelnek. Kényelmi szempontból a továbbiakban az NRRL 18 098 törzset A82 846 tenyészetnek, az NRRL 18099 törzset A82 846.1 tenyészet- 25 nek és az NRRL 18 100 törzset A82 846.2 tenyészetnek nevezzük. Az A82 846 tenyészetet Haitiben gyűjtött talajmintából izoláltuk. Az A82 846.1 tenyészetet az A82 846 tenyészetből nyertük kémiai mutagenezissel, az 20 A82 846.2 tenyészetet az A82 846 tenyészetből izoláltuk, mint egyik természetes variánsát.

Az A82 846, A82 846.1 és az A82 846.2 tenyészeteket 1986. augusztus 8-án letétbe 25 helyeztük és most a Midwest Area Northern Régiónál Resarch Center (Agricultural Research Service, United States Department, of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, USA) törzsgyűjteményének 40 része. A tenyészetek az alábbi nyilvántartási számokon hozzáférhetők: NRRL 18 098 (A82 846 szülő törzs), NRRL 18 099 (A82 846.1 mutáns törzs) és NRRL 18 100 (A82 846.2 szülő törzs változata). 46

Az A82 846, A82 846.1 és az A82 846.2 törzsek rendszertani vizsgálatát Frederick P. Mertz (Lilly Research Laboratories) végezte.

E vizsgálatok alapján az új mikroorganizmusokat Nocardia orientalis-nak (Pittenger és 50 Brigham, 1956) határozták meg, tipustörzs: ATCC 19 795 [R. C. Pittenger és R. B. Brigham, .Streptomyces orientalis n. sp., the source of vancomycin, Antibiotics and Chemotherapy 6: 642-247 (1956)]. A meghatározás 55 közvetlen laboratóriumi ossz hasonlításon és a közölt leírások alapján történt. iBergey’s manual of determinative bacteriology, 8. kiadás, szerk.: R. E. Buchanem és N. E. Gibbons, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 60 1974; M. Goodfellow és K. P. Schaal, .Identification methods fór Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus in Identification methods fór microbiologists, 2. kiadás, szer.: F. A. Skinner és D. W. Lovelock, Society fór Appli- 65 4 ed Bacteriology Technical Series No. 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, 261. old.;

R. E. Gordon, D. A. Barnett. J. E. Handerhan és C. H. Púiig, .Nocardia coeliaca, Nocardia Nocardia autotrophica, and the Nocardin st.-ain, Int. J. Syst. Bacteriology 24, (1): 54-63 (1974); R. E. Gordin, S. K. Mishra és D. A. Barnett, .Somé bits and pieces of the genus Nocardia: N. carnea, N. vaccinii, N. Lransvalensis, N. orientalis, N. aerocolinigenes', J. Gén. Microbiol., 109: 69-78 (1978); S. J. Mishra. R. E. Gordon és D. A. Barnett, .Identification of Nocardiae and Streptomyces of medical im por táncé, J. Clin. Microbiol., 11 (6i: 728-736 (1980); H. Mordarska és M. Mordarski .Chemolaxonomic characters and classiíicatiori of somé nocardioform bacteria, J. Gén. Microbiol., 71: 77-86 (1972); R. Shinobu és M. Kawato .On Streptomyces aerocolonigenes riov. sp., Forining the secondary colonies on the aerial ínycelia, Bor. Mag. Tokió 73, 213-216 (1960)1.

A meghatározásokhoz az International Streptomyces project. (ISP) Streptomyces fajok meghatározására szolgáló [E. B. Shirling és D. Got.tlieb, .Methods fór characterization of Streptomyces species, Int. J. Syst. Bacteriol., 16: 313-340 (1966)] és Gordon, Barnett, Handerham és Pang (1. fentebb) Nocardia fajok meghatározására vonatkozó módszered használtuk.

A morfológiai vizsgálatokhoz fénymikroszkópot használtunk. A spórafelszín rajzolatának meghatározása pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) történt.

A rifampin és lizozim rezisztenciát Gordon módszerével mértük [R. E. Gordon és D. A. Barnett, .Resistance to rifampin and lysosine of strains of somé species of Mycobacterium and Nocardia as a taxonomic tool', Int, J. Syst. Bacteriol, 27 (3): 176-178 (1977)].

A színek megnevezésénél az ISCC-NBS Centroid Color Charts, standard sample No. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.

S. Department of Commerce, Washington, D. C.) és a Color Harmony Manuel (4. kiadás, Contanier Corporation of America, Chicago, Illinoise, (1958) szabványokat használtuk.

A malenoid-pigment termelését (kromogenitás) ISP 161 (tripton/élesztőkivonatos táptalaj), ISP No.6 (pepton/élesztőkivonat/vasas agar) és ISP No.7 (tirozinos agar) táptalajon vizsgáltuk.

A teljes sejt hidrolizátumának diamino-pimelinsav (DAP) izomerjeit és szénhidrátjait Becker és munkatársainak [B. Becker, Μ. P. Lechevalier, R. E. Gondon és H. A. Lechevalier, .Rapid differentiation between Nocardia and Straptomyc.es by paper chromatography of whole-cell hydrolysates, Appl. Microbiol., 12: 421-423 (1946)] és Lechevalier [Μ. P. Lechevalier, .Identification of aerobic Actinoínycetes of clinical importance, J. Clin. Med.,

-3HU 198964 B

71: 934-944 (1968)1 kromatográfiás módszerével határoztuk meg.

A mikrolinsavak meghatározásához Minnikin által leirt eljáráson alapuló módszert alkalmaztuk [D. E. Minnikin, I. G. Hutchinson és A. B. Caldlcott, Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing haeteria, J. Citrom., 188: 221-233 (1980)1.

A foszfatázt és az ureázt Blazevic mód- 10 szerével (D. J. Blazevic és G. M. Ederer, .Principles of biochemical test in diagnostic microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975, 136. old.) határoztuk meg. A zselatin elfolyósítást használtuk a proteináz aktivitás meghatározásához.

Az antibiotikumrezisztencia megállapításához az antibiotikus korongmódszert használtuk, a korongokat beoltott ISP No.2 agarlemezek felszínére helyezve.

A keményitőhidrolizis keményítős ISP No.4 táptalajon (szervetlen sók - keményítő) határoztuk meg jódos festéssel (Blazevic és Ederer, 1. fentebb).

A hippuráthidrolízis meghatározásához 25 Bac.to Differentiation Disks-et használtunk, amivel gyorsan kimutatható a hippur&t hidrolízise.

Az A82 846 és az A82 846.2 törzsek egyaránt jól nőttek valamennyi megvizsgált komplex és szintetikus táptalajon. Ezek a tenyészetek a legtöbb táptalajon légmicéliu5 mókái fejlesztenek. A spóratömeg színe a táptalajtól függően fehér vagy szürke. Sok táptalajon jellemző barna oldható festékanyag termelődik, a fonák oldal barnától sárgásfehérig változik.

A A82 846.1 törzs ugyancsak kinőtt valamennyi megvizsgált táptalajon, de növekedése kevésbé erőteljes, mint a szülő törzsé. Λζ A82 846.1 csak ritkán fejleszt légmicéliumot, ha igen, a micélium színe fehér. Eseten15 ként néhány táptalajon nem jellemző halványítania oldható pigment termelődik, a fonákoldal barnától sárgás fehérig változik.

A A82 846, A82 846.1 és az A82 846,2 tenyészetek jellemzését az I. táblázatban fog20 lalt.uk össze. Az A82 846 és az A82 846.2 nagyon hasonlóak és csak néhány tulajdonságban különböznek. A hasonlóságuk miatt, és mert az A82 846.2 az A82 846 törzs természetes változata további összehasonlítást köztük nem tettünk.

I. táblázat.

Az A82 846, A82 846.1 és az A82 846.2 tenyészetek összehasonlítása különféle agaros táptalajokon

táptalaj	A82 846	A82 846.1	A82 846.2
	N	erőteljes	erőteljes (felületről leváló)	erőteljes
ISP 2	F	59.d.Br	57.1.Br.	58.m.Br.
	Lm	erőteljes: g Médium Cray	nincs	nyomokban
	θΡ	sötétbarna pigment; nem pH-függő	nincs	halványbarna
	N	jól fejlődő	jól fejlődő	jól fejlődő
ISP 3	F	92.y.White	92. y. White	92.y.white
	Lm	jól fejlett:	gyenge: a White	elég jól fejlett:
		a White		a White
	Op	nincs	nincs	nincs
	N	erőteljes	gyenge	jól fejlődő
ISP 4	F	56.deep.Br	92.y White	77.m.y Br
	bm	erőteljes: a White	gyenge: a White	jól fejlődő: a White
	Op	nincs	nincs	nincs
	N	erőteljes	erőteljes	erőteljes
ISP 5	F	47.d.gy.rBr	47.d.gy.rBr	47.d.gy.rBr
	Lm	jól fejlődő: d Light	nincs	jól fejlődő: d Light
		gray		gray
	Op	halványbarna	halványbarna	halványbarna

IIU 198964 E

Az A82 84β, A82 846.1 és az A82 846.2 tenyészetek összehasonlítása különféle agaros táptalajokon

táptalaj	A82 846	A82 846.1	A82 846.2
	N	erőteljes	jól fejlődő	erőteljes
ISP 7	F	59.d. Br	78.il. yBr	59.d.Br
	Lm	erőteljes; e Médium gray	nyomokban	erőteljes: d Lighty gray
	Op	sötétbarna pigment - nem pH függő	hab’ánybarna	sötétbarna pigment
	N	erőteljes	jól fejlődő	erőteljes
Czapek	F	56.deep Br	47.d.gy. rBr	5b deep Br
	tm	erőteljes: a White	nincs	erőteljes: a White
	Op	nincs	vöröses narancssárga	halvány vöröses narancssárga
	N	jól fejlődő	jól fejlődő	jól fejlődő
glükóz/ /aszparagin	F	58. m. Br (csak foltokban	77, m, yBr	58,m.Br
	Lm	elég jól fejlett: a White	nincs	nincs
	Op	nincs	nincs	nics
glükóz/élesz-	N	erőteljes (felületről leváló)	jól fejlődő (ráncos, nedves felület)	jól fejlődő (ráncos, nedves felület)
tőkivonat	F	21.blackish red	77. m. yBr	77.m. yBr
	Lm	nincs	nincs	nincs
	Op	sötét vörösesbarna	nincs	halványbarna
	N	jól fejlődő	jól fejlődő	elég jól fejlődő
	F	45.1.gy. rBr	76.1. yBr	79.1.9y. yBr
tápagar	Lm	nincs	nincs	gyenge
	Op	halványbarna	nincs	nincs
	N	erőteljes	erőteljes	ei'ő teljes
paradicsom-	F	47.d.gy. rBr	57.1. Br	47.d.9y. rBr
paszta/ /zabliszt	Lm	erőteljes: d Light gray	nyomokban: a White	jól fejlett: d Light gray
	Op	sötét vörösesbarna	nincs	vörösesbarna
	N	elég jól fejlődő	elég jól fejlődő	jól fejlődő
csapvizes	F	92.y White	92.y White	92.y White
agar	Lm	elég jól fejlett: a White	elég jól fejlett: b Oyster White	jól fejlett: a White
	Op	nincs	nincs	nincs
	N	elég jól fejlődő (nincs hidrolízis)	jól fejlődő (hidrolízis)	elég jól fejlődő (nincs hidrolízis)
kalcium-	F	57.1.ΒΓ	58.m.Br	57.1.Br
malát	Lm	nyomokban	nincs	nyomokban
	Op	halványbarna	ha! ványbarna	halványbarna

HU 198964 Β

N: növekedés, F: fonák oldal, Lm: légmicélium, Op: oldható pigment.

A tenyészeteket 30 °C hőmérsékleten inkubáltuk 21 napon át.

(A színek megjelölésénél a megnevezett színtáblázatokban szereplő eredeti elnevezéseket és rövidítéseket használtuk. Ezek jelentése - feltehetően - a következő: d - sötét, 1 - halvány, m - közepes, Br - barna, White - fehér, Oyster White - kagylófehér, Gray - szürke, y - sárgás, gy - szürkés, blackish red - feketésvörös, Light - halvány, Médium - közepes).

Morfológiai jellemzők: az A82 846,

A82 846.1 és az A82 846.2 erőteljes szubsztrátmicéliumot fejleszt. A lcghifák konidiumok hosszú láncát alakítják ki, pók hálószerű megjelenéssel, melyet a .Bergey’s manuál of determinative bacteriology' a nein-sztreptomicétesz típusba sorol.

Valamennyi törzsnél a spórafelszín sima, a spórák alakja hengeres. A spórák mérete az A82 846 törzsnél 1,2-1,3x0,4-0,5 Mm, Az A82 846.1-nél 1,4-2,2x0,3-0,4 um.

Rázott süllyesztett tenyészetben az A82 846 minimális fragmentáltságot mutat., az A82 846.1 erőteljesen, az A82 846 közepesen fragmentált.

Fiziológiai jellemzők: az Λ82 846 és az A82 846.1 törzsek egyaránt savat képeznek az arabinózból, ' cellobiózból, dextránból, fruktózból, galaktózból, glükózból, cC-metil-D-glükozidból, glicerinből, inozitolból, laktózból, szacharózból, trehalózból és xilózból; viszont nem termelnek savat az adonitból, cellulózból, dulcitból, eritritből, inulinből, szorbitból és xilitböl. Az A82 846 törzs ezen túlmenően savat képez még az etanolból, glikogénből, melezitózból, raffinózból és szalicinböl; az A82 846.1 törzs ezt utóbbiakból nem termel savat. Mindkét tenyészet felhasználja az acetátot, laktatót, malátot, oxalátot, propionátot, piruvátot és a szukcinátot, nem hasznosítja viszont a benzoátot, mukátot és tartarátot. Ellentétben az A82 846 törzzsel az A82 846.1 tenyészet a butirátot felhasználja, butira tót felhasználja.

Az A82 846 és az A82 846.4 törzsek lebontják a kazeint, hipoxantint, tirozint, karbamidot és a DNS-t, de nem bontják az adenint, kalcium-malátot vagy xantint. Mindként törzs hidrolizálja a keményítőt, de egyik sem hidrolizálja az eszkulint vagy ' a hippurátot, redukálják a nitrátot, elfolyósitják a zselatint, túlélik a 8 órás 50 °C hőmérsékletű kezelést; katalázt, kénhidrogént és foszfatázt termelnek.

Az A82 846 és az A82 846.1 törzsek antibiotikumokkal szembeni rezisztenciája azonos. Rezisztensnek az alábbi antibiotikumokkal szemben: bacitracin (10 egység), cefalotin (30 Mg), gentamicin (10 Mg). linkomicin (2 Mg), oleandomicin (15 Mg), penicillin G (10 egység), sztreptomicin (10 Mg), vankomicin (30 Mg), tobramicin (10 Mg) ertitromicin (15 Mg), nalidixsav (30 Mg), polimixin B (300 egység), trimetoprim (5 Mg), szulfadiazin (300 Mg); szenzit.ivek a neomicinnel (30 Mg. rifanipinnal (5 Mg), tetraciklinnel (30 Mg), kloranifenikollal (30 Mg). novobiocinnal (30 Mg) és a mandelaminnal (3 Mg) szemben.

Az A82 846 és az A82 846.1 törzsek Gram-pozitív festődésűek, de nem festődnek savállóan. Az A82 846 törzs termel melanoid pigmenteket, az A82, 846.1 törzs nem.

Sejtfal analízis: az A82 846 teljes sejt hidrolizáluina a diamino-pimerlinsav mezo-izonierjet tartalmazza, a hidrolizátumban levő cukrok arabinóz és gálák tóz. A törzsek sejtfala a Becker és munkatársai (1. fentebb) szerinti IV. típusba tartoznak. Cukor-típus szerint A-tipusúak (Lechavalier, 1. fentebb). A törzsek nem termelnek mikolinsavakat (LCN-A).

A kemotaxonomiaí és a tenyészetek általános jellemzői szerint az A82 846 törzs a Nocardia Trevisan 1889 nemzetségbe tartozik fV. B. D. Skerman, V. McGovan és P. H. A. Sneat.h, .Approved lists of bacterial naines, Int. J. Syst. Bacteriol., 30: 225-420 (1980)].

A hasonlósági mutatót tizennégy Gordon, Mish-a és Barnett (1. fentebb) által közölt Nocardia faj és öt, Lilly törzsgyüjteményéból származó törzs segítségével számoltuk ki. A Jaccard-féle [lásd: P. H. A. Sneath, .The applicatiori of computers to taxonomy', J. Fen. Microbiol., 17: 201 (1957)] és az egyszerű összehasonlító hasonlósági mutatókat [lásd: R. R. Sokai és C. D, Michener, .A statistical method fór evaluating systematio relationships, Kan. Univ. Sci. Bull., 38: 1409 (1956)] használtuk. Az összehasonlítások eredményeit a II. táblázatban foglaljuk össze. JM - Jaccard-féle mutató; eöm = egyszerű össze hason li tási ni 11 tató 1.

fi. táblázat

mikroorganizmus	hasonlósági mutatók
eöm	jm
A82 846	100	100
N. aerocolonigenes	84	76
N. aerocolonigenes (A42 125)*	83	78
N. orientalis (M43-05865)	78	72
N. orientalis (A51 568.1)	78	72
N. orientalis	75	68
N. orientalis (M5-18 215)	73	66
N. orientalis (M5-18 260)	73	66
N. madurae	73	63
N. hirsuta	62	60
N. autotrophica	62	53
N. dassonvillei	62	50
N. amarae	62	46
N. brasiliensis	56	43
N. vaccinci	56	43
N. transvalensis	48	38

-6HÍJ 1989C4 Β

π.

mikroorganizmus	hasonlósági mutatók
eöm	jm
N. caviae	48	32
N. pelletieri	48	24
N. asteroides	46	23
N. carnea	43	25
*A zárójelben lévő	számok a Lilly törzste-
nyészetböl származó	mikroorganizmusokat	je-

lölik.

Minthogy a N. madurae az Actinomadura nemzetségbe került át, az összehasonlításból kivettük. Két fajnak, a N. aerocolonigenesnek és a N. orientalis-nak magas értékű hasonlósági koefficiensei vannak. Elvégeztük az A82 846 törzs és az említett két faj laboratóriumi összehasonlítását, melynek eredményeit a III. táblázatban adjuk meg.

III. táblázat

Az A82 846 törzs, a N. orientalis és a

N. aerocolonigenes tulajdonságainak összehason li tása

tulajdonság A82 846 N. őri-	N. aero- coloni- genes
	en telis
léghifa képzés	+ +	+
léghifa fehér	+ +	+
konidiumképzés	+ +	+
sima spórafelszin	+ +	+
hengeres spóraalak	+ +	-
oldható pigment	+	-
Gram-pozitív	+ +	+
saválló festődés	-	-
fragmentáció	+ +	+
katalázképzés	+ +	+
hidrolízis:
eszkulin	+	+
hippurát	-	-
keményítő	+ +	+
kalcium-maiét	+	+
nitrát redukció	+ +	-
lebontás:
adenin	-	-
kazein	+ +	+
hipoxantin .	+ +	+
tirozin	+ +	+
karbamid	+ +	+
xantin	-	-
zselatin elfő-
lyósités	+ +	-
foszfatáz termelés	+ +	+
túlélés 50 °C,
8 óra	+ +	-

tulajdonság A82 846	N. őri-	N.
		enta-	aero-
		lis	coloni-
			genes
savtermelés:
adonitból	-	+	—
arabinózból	+	+	+
cellobiózból	+	+	+
eritritolból	-
glükózból	+	+	+
c<-metil-glü-		t
kozidból	+	+	-
glicerinből	+	+	+
inozitból	+	+	+
laktózból	+	+	+
maltózból	+	+	+
mannítból	+	+	+
mánnózból	+	+	+
melezitózból	+	-	-
melibiózból	+	-	+
raffiriózból	+	-	-
ranmózból	+	+	+
szorbilból	-	-	-
Lrehalózból	+	+	+
xilózból	+	+	+
kontroll	-	-	-
hasznosítás:
berizoát	-	-	-
citrát	+	+	+
mukát	-	-	-
szukcinát	+	+	+
tartarát	-	-	-
kontroll	-	-	-
rezisztencia:
bacitracin
(10 egység!	+	-	-
cefalotiri (30 Mg)	+	+	+
gentamicin (10 Mg)	+	-	-
linkomicin (2 Mg)	+	+	+
neomicin (30 Mg)	-	-	-
oleandomicin (15 ug)	+	-	-
penicillin G
(10 egység)	+	+	+
rifampin	-	-	-
sztreptomicin
(10 Mg)	+	+	-
tetraciklin (30 Mg)	-	-	-
tobramicin 110 Mg)	+	+	-
vankomicin (30 Mg)	+	+	-
kloramfenikol
(30 Mg)	-	-	-
eritromicin (15 Mg)	+	-	-
nalidixinsav (30 Mg)	+	+	-
novobiocin (30 ug)	-	+	-
polimixin B
(300 egység)	+	+	+
trimetoprin (5 Mg)	+	+

+ a tulajdonság megvan

- n tulajdonság hiányzik

Ismételten kiszámoltuk a hasonlósági mutatókat nagy számú tulajdonság figyelembevételével. Az eredményeket a IV. táblázatban foglaltuk össze.

-713

HU 198964 D

IV. táblázat

Az A82 846 törzs, a Nocardia orientalis ás ’a

Nocardia aerocolonigenes hasonlósági mutatói

mikroorganizmus	hasonlósági mutatók
eöm	jm
A82 846	100	100
N. orientalis	81	76
N. aerocolonigenes	73	65
Sem a N. orientalis, sem a N. aerocoloni-
genes nem tartalmaz	mikolinsavat a sejtfalé-
bán. Gordon (lásd	fentebb)	három olyan
kulcstulajdonságot ir	le, melyek	alapján a N.

orientalist megkülönböztethetjük a N. aerocolonigenes-től. A Gordon-féle kulcstulajdonságok figyelembevételével összehasonlítottuk az A82 846 törzset a Nocardia fajokkal. A vizsgálatok eredményeit az V.. táblázatban mutatjuk be.

V. táblázat

Az A82 846 törzs, a Nocardia orientalis és a Nocardia aerocolonigenes kulcstulajdonságainak összehasonlítása

mikroorganizmus	tulajdonság
savat képez: erit- ritböl	lizo- zimmel c<-nietil- szeinbe-glüko- ni rezidból ziszlencia
A82 846	-	+ +
N. orientalis	+	+
N. aerocolonigenes		- ' +

Noha a kulcstulajdonságokat illetően az A82 846 törzs nem hozható tökéletes fedésbe egyik Nocardia fajjal sem, a tenyészetek jellemző tulajdonságai nagyobb rokonságot mutatnak a N. orientalis-szal és a hasonlósági mutató is a N. orientalis esetében a legmagasabb. Ugyancsak a N. orientalis-ra hasonlít olyan tekintetben is, hogy mindketten glikopeptid antibiotikumot termelnek. Az A82 846 törzset ezért a Nocardia orientalis IPittenger és Birgham, 1956), egyik törzsének határoztuk meg. Minthogy N. orientalis szerepel az .Approved lists of bacterial names’ jegyzékben (Baktériumnevek elfogadott névjegyzéke), ezért érvényesen elfogadott fajnak tekinthető.

Az A82 846.1 törzs az A82 846-nak kémiai indukcióval előállított mutánsa. A VI. táblázatban összefoglaljuk azokat a tulajdonságokat, melyben az A82 846.1 különbözik az. A82 846 törzstől.

V'í. táblázat

Az A82 846 és az A82 846.1 törzsek eltérő tulajdonságai

tulajdonság	A82 846	A82 846.1
fragmentáltság	minimális	erőteljes
telepméret	7 mm	5 mm
telep felszíne	kemény	lágy
léghifa	erőteljes	nyomokban
fonák oldal színe	sötét-	halvány-
oldható pigment	barna +	barna
savat képez: etanolból	+
glikogénből	+	-
melezitózból	+	-
raffinózból	+	-
szaliciriből	+	-
hasznosítás: cé-metil-glü- kozid	+
glikogén	+	-
inelezítóz	+
szőrhöz	+	-
buti rét	-	+
melanoid pigmentek	+	-

Az A82 846.1 kölönbözik az A82 846 törzstől az antibiotikum-termelést illetően is. A másik legszembetűnőbb különbség a két törzs között, hogy - ellentétben az A82 846 törzzsel - az A82 846.1 törzs nem hoz létre légmicéliumot és nem termel oldható pigmentet.

Az A82 846.2 törzs az A82 846 törzsnek természetes változata, ezért a meghatározó tulajdonságok tekintetében a két törzs lényegében megegyezik, A közöttük levő fő különbség, hogy rázott lombikos tenyészetben az A82 846.2 törzs lényegesen több A82 846 antibiotikumot termel, mint az A82 846 törzs.

Hasonlóan más mikroorganizmusokhoz, a találmány A82 846 antibiotikumot termelő törzsei, az NRRL 18 098, NRRL 18 099 és az NRRL 18 100 Nocardia orientalis törzsek változékonyak. E törzsek eltérő tulajdonságú leszarmazottait, például mutánsokat és változatokat az ismert módokon kaphatjuk meg. így például variánsokat kaphatunk természetes szelekcióval, vagy mutánsokhoz juthatui k fizikai és kémiai mutagén kezelésekkel, 9

-815 például ultraibolya, Röntgen gamma besugárzással vagy N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidines kémiai indukcióval.

A Nocardia orientalis tenyésztéséhez használt tápközeg a nagy számú táptalaj 5 bármelyike lehet. A termelés gazdaságossága, az optimális hozadék és a termék könnyű kinyerhetősége szempontjából bizonyos táptalajok előnyösebben használhatók, igy például nagyméretű fermentálásnál előnyös szénhid- 10 rátforrás a glükóz és a burgonya dextriu, noha a ribóz, xilóz, fruktóz, galaktóz, mannóz, mannit, oldható keményítő és hasonlóak szintén alkalmazhatók.

Előnyös nitrogénforrás az enzimmel hid- 15 rolizált kazein és hús-pepton, de ugyancsak használhatunk élesztőkivonalot, savval hidrolizált kazeint, marhahúskivonatot, hallisztet, májlisztet, stb. is.

A táptalaj alkotórészét képező szervet- 20 len sók a szokásos vizoldékony sók, melyek cink-, nátrium-, magnézium-, kalcium-, amniónium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrátés hasonló ionokat szolgáltatnak.

A táptalajnak tartalmaznia kell a mikro- 25 organizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges esszenciális nyomelemeket is. Ezek a nyomelemek szennyezésként általában olyan mennyiségben fordulnak elő a táptalaj többi alkotórészében, mely elegendő a mikroorga- 30 nizmus növekedéséhez. Ha habzás lépne fel, kis mennyiségű (például 0,2 ml/liter) habzasgátlót, például polipropilénglikolt adhatunk a nagyméretű fermentációs táptalajhoz.

Jelentősebb mennyiségű A82 846 antibio- 35 tikum-termeléséhez előnyös a süllyesztett aerob tenyésztést tankfermentorban végezni.

Kis mennyiségű antibiotikumhoz rázott lombikos tenyészettel is hozzájuthatunk. Minthogy a tankfermentálásnál az antibiotikum-termelés 40 csak általában egy lag fázis után indul meg, ha az oltáshoz spórákat használunk, előnyösebb vegetatív oldóanyagot használni. A vegetatív oltóanyag elkészítéséhez kis térfogatú táptalajt spórákkal vagy micélium-frag- 45 mensekkel oltunk be, hogy friss, aktivan növekvő tenyészethez jussunk. A vegetatív oltóanyagot ezután átvisszük a nagy fermentorba. A vegetatív oltóanyag táptalaja azonos vagy különböző lehet a nagy fermentor táp- 50 talajával.

Az A82 846 antibiotikumot a termelő mikroorganizmusok 23-37 °C hőmérsékleten növesztve termelik. Az A82 846 antibiotikum termeléséhez az optimális hőmérséklet 30- 55

-31 °C.

Amint az a süllyesztett, aerob tenyészeteknél szokásos, a fermentor aljából steril levegőt hajtunk át a táptalajon, miközben lapátos keveróvel kevertetjük. Az alkalmazott go körülmények között a maximális oxigénfelvétel nem lépi túl a 0,2 mM/liter/perc értéket. A levegőztetés mértékét és a kevertetést általában olyan szinten kell tartani, hogy az oldott oxigén a telítettségi érték 50%-ánál gr, vagy a felett legyen.

Az A82 846 antibiotikum termelését a fei mentáció folyamán időnként vett mintákkal határozzuk meg olyan mikroorganizmusok segítségével, melyek az antibiotikumra szenzitivek. Egyik alkalmas tesztorganizmus lehet a Bacillus subtilis ATCC 6633. A biológiai értékmérést előnyösen lyukasztott agarlemezen végezzük.

A süllyesztett., aerob fermentációs körülmények között végzett termelés után az A82 846 antibiotikumot a fermentléből a szokásos módon nyerhetjük ki. Az antibiotikus aktivitás a mic.éliumban és a ferinentlében egyaránt, megtalálható, ezért az A82 846 antibiitikum maximális kinyeréséhez először a kémhatást pH=10,5 értékre állítjuk be, hogy az antibiotikum kijusson a micéliumból, majd a fermentléből kiszűrjük a micéliumot.

A szűrletból az A82 846 antibiotikumot különféle eljárásokkal nyerhetjük ki. Előnyös módszer, ha a szűrt fermentlé kémhatását pH=7 körüli értékre állítjuk be, és az antibiotikumot kationcseréló gyantán, például Dow?x XF5-43 278, Dowex 50 vagy Amberlite 1R-j20 gyantán kötjük meg. Az aktív anyagot alkalmas oldószerrel, például híg ammómium-hidroxidos oldattal mossuk le a gyantáról. A', aktív frakciókat csökkentett nyomáson hipároljuk, makroretikuláris gyantán, például Diaion HF-20 és Amberlite XAD-4 gyantán ads'.orbeáljuk, majd alkalmas oldószerrel, például víz/izopropanol, 95:5 eleggyel, mely 1% ecetsavnt tartalmaz, eluálva, megkapjuk az A32 846 antibiotikumot. Az aktív anyagot kevés savat tartalmazó víz/acetonitril vagy viz/metariol eleggyel is eluálhatjuk.

Hasonló módszerrel választható szét az A82 846 antibiotikum az A82 846A, A82 846B és az A82 846C alkotórészeire. Előnyös elválasztási módszer erre a fordított fázisú (Cie vagy Cs) kromatográfia.

Más eljárás szerint a fermentlé szilárd komponenseit, mely a micéliumból és a táptalaj szilárd alkotórészeiből áll, extrahálás és elválasztás nélkül - előnyösen a víztartalom eltávolítása után - használjuk fel, mint A82 846 antibiotikum forrást, igy például a fermentáció befejeztével az egész fermentlevet beszoríthatjuk liofilizációval, dob-szárítással vagy azeotropos desztillációval és szá1 itassa). A beszárított fermentlevet közvetlenül belekeverjük a takarmánypremixbe.

Az A82 846 antibiotikumoknak kitűnő hatásuk van in vivő és in vitro a Gram-pozitív kórokozó baktériumokkal szemben. Különösen váratlan sajátossága ezeknek az antibiotikumoknak a hosszú felezési idejük a ' érben. így például, ha patkányoknak intravénásán viszünk be antibiotikumot, a vankomicinszérum felezési ideje 45 perc, míg az λ82 846A és az A82 846B mindegyikének a felezési ideje 2,2 óra.

-917

HU 198964 Β

Az A82 846 antibiotikumok minimális gállási koncentrációit (MTC érték), melyeknél az antibiotikumok bizonyos baktériumokat gátolnak, a VII. és VIII. táblázatban adjuk meg. A táblázatokban szereplő MIC értékeket á szabványos agar-bigitásos eljárással határoztuk meg.

VII. táblázat

Teszt organizmus	MIC (mcg/ml)
Λ82 846A	A82 846B	A82 846C
Staphylococcus aureus XI. 1	0.125	0.125	1
Staphylococcus aureus V41“	0.125	0.125	1
Staphylococcus aureus X400^b	0.125	0.125	1
Staphylococcus aureus S13E	0.125	0.125	1
Staphylococcus epidermidis 270	0.25	0.25	1
Staphylococcus epidermidis 222	0.25	0.25	I
Streptococcus pyogenes C203	0.125	0.125	1
Streptococcus pneumoniae Park 1	0.125	0.125	2
Streptococcus Group D X66	0.25	0.25	2
Streptococcus Group D 2041	0.5	0.5	4
Haemophilus influenzáé C. L.^c	_ e	-	-

a = penicillin rezisztens törzs, b = meticillin rezisztens törzs, c = ampicillin szenzitív törzs, e = nem aktív a legmagasabb, 128 mcg/ml vizsgált koncentrációnál.

VIII. táblázat

Az A82 846, A82 846B és a vankoiuicin in vitro aktivitása

tesztorganizmus	vizsgált törzsek száma	MIC (mcg/ml)
A82 846A	A82 846B	vankomicin
Staphylococcus aureus	20	0.125-1.0	0.25-1.0	0.5-2.0
Staphylococcus epidermidis	20	0.25-2.0	0.5-1.0	1.0-2.0
Streptococcus pyogenes	12	0.125-0.25	0.125-0.25	0.5
Streptococcus pneumoniae	20	<0.015-0.25	0.125-0.25	<0.015-4.0
Streptococcus sp. group. D	20	0.25-1.0	0.25-1.0	1.0-2.0
Streptococcus salivaris	1	1.0	0.25	0.5
Streptococcus sanguis	4	0.25-0.5	0.25	0.5-1.0
Streptococcus mutáns	2	0.125-0.5	0.125-1.0	0.125-2.0

Az A82 846 vegyületek antimikrobiális aktivitásainak egyik fontos jellemzője, hogy anaerob baktériumokkal szemben hatnak. Ezt az aktivitást mutatjuk be a IX. táblázatban, melyben összefoglaljuk az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok szabványos agai— higitásos módszerrel megállapított aktivitását különböző anaerob baktériumokkal szemben. Az értékeket 24 órás inkubáció elteltével állapítottuk meg.

-1019

HXJ 198964 B IX. táblázat.

Az A82 846A és az A82 8lfifl antibiotikumok aktivitása anaerob baktériumokkal szemben

anaerob baktériumok	vizsgált törzsek száma	MIC (uicg/ml)
A82 846A	A82 846B	vankomicin
Gram-pozitiv törzsek:
Clostridium difficile	19	0.125-1	0.06-0.125	0.5-4
Clostridium perfringens	1	£0.25	0.5	2
Clostridium speticum	1	0.5	0.5	2
Eubacterium aerofaciens	1	£0.25	0.5	2
Peptococcus asaccharolyticus	3	<,0.25	0.06-0.5	1
Peptococcus prevoti	4	1-2	1-4	1-4
Peptococcus variábilis	1	0.5	1	1
Peptococcus constellatus	1	0.25	0.25	1
Peptococcus magnus	3	0.06-0.125	0.125-0.25	0.25-1
Peptostreptococcus anaerobius	3	0.06-2	0.06-7	0-25-2
Peptostreptococcus intermedius	8	£0.25	0.25-0.5	0.5-1
Propionibacterium acnes	19	£0.25	£0.25	2-16
Gram-negativ törzsek:
Bacteroides fragilis	3	>128	>128	32-64
Bacteroides thetaiotaomicron	1	128	128	64
Bacteroides melaninogenicus	2	>128	>128	>128
Bacteroides vulgatis	1	128	>128	64
Bacteroides corrodens	1	>128	>128	64
Fusobacterium syinbiosum	1	128	128	4
Fusobacteri um necrop ború ni	1	128	128	1

Az A82 846 antibiotikumok in vivő antimikrobiális aktivitást is mutatnak a mesterségesen megfertőzött kísérleti állatokban. A vizsgálandó vegyűletet két dózisban beadva a tesztmikroorganizmussal mesterségesen megfertőzött egerekbe, az aktivitást az EDso értékek mérésével jellemezhetjük. Az EDso érték az a mg/kg értékben kifejezett hatékony dózis, ami a vizsgálati állatok 50%-át megvédi [lásd: Warren Wick és munkatársai, J. Bacteriol., 81: 233-236 (1961)]. A vegyületek EDso értékeit a X. táblázatban foglaljuk össze.

X. táblázat *mg/kg x 2; a dózisokat a fertőzés utáni 1. és 4. órában szubkután adjuk be az egereknek.

Az A82 846 antibiotikumok antibakteriális hatásának fontos jellemzője, hogy alkalmasak pielonefritísz kezelésére. Az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok például hatásosabbak a vankomieinnél a patkányok mes40 terségesen kiváltott pielonefritiszének kezeléséhen, Ezt a vizsgálatot a 4 208 403 számú USA szabadalomban leírt eljáráshoz hasonlóan hajtottuk végre. Az eredményeket a XI. táblázatban foglaljuk össze.

XI. táblázat

Az A82 846 antibiotikumok in vivő aktivitása

vegyület	Staphy-	EDso érték* Strep- Strep-
	lococcus	tococcus Lococcus
	aureus	pyogenes pneu-
•		moniae

A82 846A	0.19	0.19	0.17
A82 846B	0.19	0.20	0.18
A82 846C	2.18	2.71	5.87
vankomicin	1.3	0.72	1.52

50 55	Vegyület	dózis fmg/kgx x!2)^a	meggyó- gyult pat- kányok száza- léka	patkányok %-a titer lO^sze- rés hígításánál
	A82 846A	10	88	100
		5	75	88
		2	63	100
60	A82 846B	10	100	100
		5	100	100
		2	50	88
	vankomicin	10	63	100
		5	38	88
65		2	38	75

-1121

HU 198964 Β ^a hat napon keresztül, naponként két dózis szubkután

Az A82 846 antibiotikumokat az szivbelhártya-gyulladás kezelésére is alkalmazhatjuk. Így például az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok olyan aktívak a patkányok katéterrel indukált szívbelhártya-gyulladásos fertőzéssel szemben, mint a vankomicin. A vizsgálatokban a patkányokat úgy készítjük elő, hogy műanyag katétert vezetünk a jobb szivartériába, levisszük a jobb szívkamrába és óvatosan rögzítjük. Az állatokat két napig pihentetjük, majd Streptoccus faecalis X-66 tesztorganizmust juttatunk be intravénásán. A mikroorganizmus litere körülbelül 5x10** volt milliliterenként; ebből 0,5 ml-t juttatunk be az állatokba.

A vegyületeket 15 perccel a fertőzés után adjuk be szubkután, majd 14 napon ét 12 óránként, vagyis összesen 28 alkalommal. A kezelés után még két napig hagyjuk élni az állatokat, majd a szivüket kivesszük, homogenizáljuk, a homogenizátumot hígítjuk és triptikáz szójas agarra kenjük. Kiértékelés előtt 48 óráig inkubáljuk a lemezeket.

Az így kapott eredményeket a XII. táblázatban foglaljuk össze.

XII. táblázat

Az A82 846A és B antibiotikumok aktivitása a patkány endokarditisz tesztbe/?

vegyület	dózis¹⁵ (mg/kgx x28)	16. napon meggyógyult, %	meggyógyult % a ti tér 10'⁴- szeres csökkentésénél
A82 846A	20	100	100
A82 84 6B	20	100	100
vankomicin	20	100	100

^a katéterrel indukált szívbelhártya-gyulladás, Streptococcus faecalis X-66 tesztorganiznius használva ^b 14 napon át 12 óránként szubkután bejuttatva.

Az A82 846 antibiotikum gyógyszerkiszerelési eljárása szintén részét képezi a találmánynak. A baktériumos fertőzés kezelésére vagy megelőzésére az antibiotikumot, előnyösen gyógyászati szempontból alkalmazható sója alakjában orális vagy parenterális adagolásnak megfelelően formáljuk meg. A hatóanyagot összekeverjük a szokásos, gyógyászatban alkalmazható hordozó- és adalékanyagokkal, tablettát, kapszulát, elixírt, szuszpenziót, sziripot, ostyát, stb. készítve.

Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó készítményekben a hatóanyagtartalom 0,1-90% (tömeg), általában 10-30% (tömeg). A készitiiények a szokásos hordozó- és adalékanyagokat tartalmazhatják, például kukoricakeményitól, zselatint, laktózt, szacharózt, mikroI ristályos cellulózt, kaolint, mannitot, dikalr ium-foszfátot, nátriuin-kloridot és alginsavat. A találmány megformált gyógyszereiben alkalmazott szétesést elősegítő anyagok például a kroszkarmellóz-nátrium, a mikrokristályos cellulóz, kukoricakeményító, nótriumkeményíló-glukolát és az alginsav.

A tablettákban alkalmazható kötőanyagok az arabmézga, metil-cellulóz, nátrium-karboxi-melil-ceHulóz, polivinil-pirrolidon (Povidone) hidroxi-propil-metil-cellulóz, szacharóz, keményítő vagy etil-cellulóz.

Alkalmazható sikositóanyag a magnézium-szlearát vagy más fém-sztearátok, szteaiinsav, szilikon folyadék, talkum, viaszok, olajok és a kollidális szilícium-dioxid, izesítóanyagok például a borsmenta, a lélizőldek olaja, cseresznye aroma, stb.

Kívánatos lehet, hogy a készítményt színezzük esztétikai okokból vagy, hogy a térnék azonosítását megkönnyítsük.

Intravénás alkalmazáshoz az antibiotilum vízoldékony formáját az intravénás készítmények elkészítéséhez általánosan használ! folyékony közegekben oldjuk és infúzióval visszük be a szervezetbe. Ilyen folyélony közeg lehet például a fizológiés sóoldat, e Ringer oldat vagy az 5%-os dextróz oldat.

Az inlramuszkuláris adagoláshoz használt készítményben az oldható állapotban levő vegyületet, például a hatóanyag hidrokloridsóját sterilen oldjuk valamilyen gyógyászati szempontból alkalmazható oldószerben, például injektálható vízben (Water-for-Injection), fiziológiás sóoldatban vagy 5%-os glükózoldatban. Az oldhatatlan állapotban lévő vegyületet szuszpenzió alakjában vihetjük be a szervezetbe. A szuszpenziót vizes közeglen vagy gyógyászati szempontból alkalmaz1 ató olajban, például hosszú szénláncú zsírsav észterében, - mint amilyen az etil-oleát készíthetjük el.

Orális alkalmazásnál az antibiotikum alkalmas sóját, például hidrokloridját desztillált. vagy ionmentes vízben oldva alkalmazzuk.

Az antibiotikum egységnyi dozirozásához az - előnyösen só alakjában lévő - antibiotikum megfelelő oldószerben levő steril oldatát ampullákban forrasztjuk le. Az egységnyi dózis antibiotikum-koncentrációja változhat, például 1%-tól 50%-ig, az antibiotikum alkalmazott állapotától, az oldékonyságától és az orvos által előírt adagtól függően.

A találmány szerint előállított vegyületókkel különösen Gram-pozitív mikroorganizmusokkal - fertőzött élőlényeket kezelhetünk. Az élőlények lehetnek a fertőzésre fogékonyak vagy már egy mikroorganizmussal meg13

-1223

HU 198964 Β fertőződtek. A kezelési eljárás abban áll, hogy az élőlénynek az A82 846 antibioLikum célnak megfelelő hatásos dózisát adjuk be.

Az A82 846 antibiotikum hatásos dózisa általában 0,5-100 mg között van testtömeg kilo- 5 grammonként. Az aktív vegyület előnyös dózisa 1-60 mg testtömeg kilogrammonként. Egy felnőtt ember napi dózisa általában 50 mg és 1 g között van.

Az antibiotikumot bejuttathatjuk a szel— 10 vezetbe napi egyszeri dózisban vagy egy nap többszöri dózisrészletbe elosztva. A kezelést általában hosszabb időtartam alatt alkalmazzuk, mely kiterjedhet például néhány naptól kezdve hat hétre is. A bevitt dózis 15 vagy a bevitt összmennyiség különböző tényezőktől függ, ilyenek: a fertőzés természete és súlyossága, a beteg életkora, általános egészségi állapota és az antibiotikummal szembeni érzékenysége, a fertőzést okozó 20 mikroorganizmus vagy mikroorganizmusok.

Az antibiotikumos kezelés alkalmas módja az intravénás infúzió. Az eljárásban az antibiotikum alkalmas, oldható sóját sterilen fiziológiás közegben, például 5%-os dextrózol- 25 dalban oldjuk, és a nyert oldatot lassan intravénásán infuzáljuk. Alternatív eljárásként az intravénás infúziónak .piggy-back' módszerét is alkalmazhatjuk.

A találmány szerinti eljárással előállított 30 vegyületek alkalmasak továbbá: 1) az állatok - például szárnyasok, sertés, juh vagy szarvasmarha - tápanyag-hasznosításának fokozására; 2) hústermelésre nevelt állatok - például szárnyasok, sertés, juh vagy szarvas-35 marha - növekedésének meggyorsítására; 3) tejelő állatok tejtermelésének fokozására. A tápanyag-hasznosítás fokozására és a növekedés meggyorsítására megfelelő mennyiségű A82 846 antibiotikumot juttatunk be megfelelő40 eleségbe elkeverve az állatba. Ez a mennyiség 2-200 g között változik 1000 kg takarmányra számítva. Szarvasmarháknak például 12-3000 mg-ot adunk be naponként. Tejelő kérődzők tejtermelésének fokozásához test-45 súlykilogrammonként 0,04-16 mg antibiotikumot adunk be naponként orális adagolás esetében (ez egy állatra számolva napi 25-5000 mg mennyiséget jelent).

A találmány antibiotikumjait célszerű50 premix formájában forgalmazni, amely premix a hatóanyag mellett egy vagy több, az állattenyésztésben alkalmazható hordozóanyagot is tartalmaz.

Az elmondottak szemléltetésére az aláb-55 biakban példákat adunk meg.

Az A82 846 komponensek HPLC analízisére az alábbi rendszereket alkalmazhatjuk:

a) kationcseréló gyantán:

oszloptöltet: Zorbax SCX(4,6x150 mm oszlop; a Zorbax oszlopok az É. J. du Pont de Nemours el. Co., Inc. termékei; Delaware 19 898 USA); eluens: gradiens elüció - A:B komponens arányt 5 perc alatt 4:1-röl l:9-re változtatjuk, majd ezen eluálunk 15 percen át;

A - melanol/Ο,ΙΜ nátrium-dihidrogén-foszfát, 1:9,

B = metanol/0,9M nátrium-dihidrogén-foszfát, 1:9, áramlási sebesség: 225 nm;

retenciós idők: A82 846 = 6,6 perc,

A82 846B = 8,9 perc,

A82 846C = 9,5 perc.

b) fordított fázisú oszlopon: oszloptöltet: Zorbax ODS 14,6x150 mm oszlop); eluens: gradiens elúció - 1% ammónium-dihidrogén-foszfát/acetonitril rendszerben az arány 20 perc alatt 95:5-röl 50:50-re változik;

áramlási sebesség: 1,0 ml/perc, detektálás: 225 mm,

retenciós idők:	A82	84 6A	= 7,3	perc
	A82	846B	2 7,6	perc
	A82	846C	= 8,0	perc.

1. példa

Az A82 846 antibiotikumot rázott lombikban vagy tankfermentorban termelhetjük az ΛΚ2 846 törzset tenyésztve.

a) Rázott lombikos termelés: liofilizált vagy folyékony nitrogén alatt tartott Noeardia orientalis NRRL 18 098 törzzsel oltjuk be a következő összetételű inokulum te p talajt;

glükóz oldható keményítő éiesztőkivonat enzimmel hidrolizált kazein* kalcium-karbonát ionmentes vízzel *NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norvich,

N. Y, USA.

1.0%

2.0%

0.5%

0.1% literre feltöltve

Sterilizálás előtt a táptalaj kémhatását nátrium-hidroxid oldattal pH=7,5-re állítjuk be. 2,5% agart adva e táptalajhoz ferde agart vagy agarlemezeket öntünk és ezeket oltjuk be a megnevezett törzzsel. A beoltott táptalajt 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10-14 napig. A kinőtt tenyészetet steril eszközzel lekaparjuk, hogy kiszabaduljanak a spórák és széttöredezzen a micélium. A lekapart tenyészetnek kb. egynegyedével oltunk be 53 ml fenti összetételű folyékony inokulum táptalajt,

A beoltott táptalajt 250 ml-es Erlenneyer lombikban, 30 °C hőmérsékleten rázatj ik 24-48 órán át. Az 5,08 cm kitérésű rázógep forgási sebessége 250 fordulat percenteni.

0,5 ntl igy kapott oltóanyaggal oltunk be 50 ml, alábbi összetételű termelő táptalajt:

-1325

HU 198964 Β glükóz 2.5% szójaliszt 1.5% ' burgonya dextrin 3.0% kalcium-karbonát 0.25% melasz 0.3% savval hidrolizált kazein* ‘ 0.5% ionmentes vízzel 1 literre feltöltve *Hy-Case, Sheffield Chemical Co.

Sterilizálás előtt a táptalaj kémhatását pH=7,5 értékre állítjuk be nátrium-hidroxid oldattal.

A beoltott táptalajt 250 ml-es széles szájú Erlenmeyer lombikban rázatjuk 30 °C hőmérsékleten 4-5 napon keresztül. Az 5,08 cm kitérésű rázógép forgási sebessége 250 fordulat percenként.

b) Tankfermentorban történő termelés: hogy kellő mennyiségű oltóanyaghoz jussunk, 10 ml· az előző a) pontban leirt módon előállított inokuliim tenyészettel beoltunk 400 ntl újabb táptalajt, melynek összetétele megegyezik az első lépéses tenyészet táptalajának összetételével. Ezt a második lépéses vegetatív közeget 2 literes széles szájú Erlenineyer lombikban rázatjuk 30 °C hőmérsékleten 48 órán át. Az 5,08 cm kitérésű rázógép forgási sebessége 250 fordulat percenként.

1000 ml így kapott, második lépéses vegetatív tenyészettel oltunk be 100 liter steril termelő táptalajt, melyet az a) pontban leírtak szerint állítunk össze, azzal a különbséggel, hogy literenként 0,3 g P-2000 habzásgátlót is adunk hozzá. A beoltott táptalajt 165 literes kevert tankfermentorban fermentáljuk 30 °C hőmérsékleten 90-100 órán át. A percenként 80-as fordulatszámmal kevert tenyészet levegőztetését úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigénszint a levegőtelítettségi érték 50%-a felett legyen.

b) lépést elvégezhetjük úgy is, hogy 4536 literes tankfermentorban levő 3400 liter termelő táptalajt beoltunk megfelelő mennyiségű vegetatív oltóanyaggal.

2. példa

Az A82 846 antibiotikum termelését A82 846.1 törzzsel elvégezhetjük úgy, hogy liofilizált állapotban vagy folyékony nitrogén alatt tartott Nocardia orientalis NRRL 18 099 törzzsel az 1. példában leírtak szerint végzünk fermentációt, azzal a különbséggel, hogy a termelő táptalajt az alábbi összetételű:

glükóz burgonya dextrin pepton* kalcium-karbonát melasz ionmentes vízzel pH beállítás nincs. ’Bacto-pepton (Difco

1.0%

2.0%

1.0%

0.2%

2.0% literre feltöltve

Laboratories).

3. példa

Az A82 8-16 antibiotikum előállítása Λ82 816.2 törzzsel: a liofilizett állapotban vagy folyékony nitrogén alatt eltartott Nocirdia orientalis NRRL 18 100 törzzsel az 1. példában leírtak szerint végzünk fermentálást, azzal a különbséggel, hogy a savval hidrolizált kazein helyett Amicase-t (Sheffield

Chemical Co.) használunk.

4. példa

A nyers A82 8-16 antibiotikum előállitásóI oz 4200 liter, az A példa b) pontjában leírtak szerint előállított fermentlé kémhatását 4 n nátrium-hidroxiddal pH=10,5 értékre állítjuk he, és hozzáadunk 3% Celite 545-öt (szűrést elősegítő adalék). A keveréket présszűrőn szűrjük, a kiszűrt anyagot vizzel mossuk. A szűrletel és a mosóvizet egyesítjük (4200 liter), a kémhatását 5 n sósavval (vagy kénsavval) pll-7 értékre állítjuk be és

Powex-SFS-43 278 (NH*) gyantára visszük. 10 1 Ler gyantát számítunk 200 liter szűrletre. Az oszlopot 750 ml/perc sebességgel eluáljuk. A frakciókat biológiai értékméréssel - Bacil1 is subtilisl használva tesztorganizmusként 30 vagy HPLC-vel vizsgáljuk.

Az. oszlopot 5 oszlop-térfogatnyi vizzel mossuk, 100 literes frakciókat gyűjtve.

Az aktív anyagot 5 oszlop-térfogatnyi

C,05 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk a gyantáról, 25 literes frakciókat gyűjtve. Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson kb. 30 literrel töményítjük. Ezt az oldatot visszük rá 10 liter, vizes gyantaágyban levő Diaion ) P-20 oszlopra. Az oszlopot 3 oszlop-térfogatnyi vízzel mossuk 300 ml/perc átfolyási sebességnél. A vizes mosót eldobjuk. Az aktív anyagot víz/izopropanol, 95:5 eleggyel, mely ) ,0% eeetsavat tartalmaz eluáljuk per45 cenként. 100 ml-es átfolyási sebességnél. 4 literes frakciókai. gyűjtünk, melyeket biológiai értékméréssel vagy , HPLC-vel vizsgálunk. Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat (6—14.) egyesítjük, csökkentett nyomóson be50 pároljuk és fagyasztva szárítjuk, 356 g r yers A82 846 antibiotikumot nyerve.

5. példa

Az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok elválasztásához 30 g a 4. példában leírlak szerint nyert A82 846 antibiotikumot 500 ml vízben oldjuk és 30 literes, LP-l/Cie szilikagéllel töltött rozsdamentes acéloszlopra visszük, melyet 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfáttal ekvilibráltunk. Az elúciót 60 liter 1%-os ammóriiuiii-dihidi’ogén-foszfát oldattal kezdjük, majd a következő 60 literben 1%

-1427

IIU 198954 Β ammónium-dihidrogén-foszfát/acetonitril,

88:12 arányú elegyet használunk.

Az egyes frakciókat analitikai HPLC-vel elemezzük. Az A82 846A antibiotikumban és az A82 846B antibiotikumban feldúsult frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk (6-9., illetve 10-17. frakciókat).

Az előzőekben leírt elödúsitás szerint 2x30 g nyers A82 846 antibiotikumból nyert A82 846A antibiotikumban feldúsított terméket sótalanitás céljából 1750 ml Diaion HF-20 SS oszlopra visszük, amit vízzel mosunk, 0,5% ecetsavat tartalmazó, viz/izopropanol, 95:5 eleggyel eluálunk, és a frakciókat analitikai HPLC-vel elemezzük. Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, fagyasztva szárítjuk 7,4 g A82 846A antibiotikumban gazdag preparátumot nyerve.

7,2 g fenti preparátumot vízben oldunk és 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfátban levő LP-l/Cis szilikagél preparativ oszlopra visszük. Az oszlopot gradiens elúcióval kromatografáljuk, a kezdeti eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát a befejező eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát pufféi/ /acetonitril, 9:1 arányú elegye. Az elúciós sebesség percenként 48 ml. A frakciókat analitikai HPLC-vel vizsgáljuk, 254 nm-nél detektálva. Az első 10 liter eluens lejövetele után 500 ml-es frakciókat gyűjtünk.

Az A82 846A (4-10.) és az A82 846B (12-20.) antibiotikumokat tartalmazó frakciókat egyesítve, csökkentett nyomáson bepároljuk. Három sorozat A82 846A antibiotikumot tartalmazó preparátumát egyesítjük és 1750 ml Diaion HP-20 SS oszlopra visszük sótalanitás céljából. Az oszlopot vízzel mossuk, az A82 846A antibiotikumot 0,5% ecetsavat tartalmazó, viz/izopropanol, 95:5 eleggyel eluáljuk. Az elúciót analitikai HPLC-vel követjük nyomon. Az A82 846A antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 7,9 g tisztított A82 846A antibiotikumot nyerve.

Az A82 846A antibiotikum IR spektrumát (KBr) az 1. ábrán mutatjuk be; a tioglicerinben felvett FAB-tömegspektrumát a 4. ábrán láthatjuk; a 7. ábra az A82 846A-hidroklorid metil-szulfoxid-d6-ban 60 °C hőmérsékleten felvett NMR spektrumát mutatja (Bruker AM500 spektrométer, HDO szupresszált).

Az A82 846B tisztításához 3 preparativ HPLC kromatográfiát futtatunk le az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok szétválasztására. Az előzőekben leirt eljárás szerint kapott, A82 846B antibiotikumban feldúsított frakciókat egyesítjük és 1750 ml Diaion HP-20 SS oszlopon sótalanitjuk. Az oszlopot vízzel mossuk és 0,5% ecelsaval tartalmazó víz/izopropanol 95:5 eleggyel elítélünk. Az elúciót analitikai HPLC-vel követjük nyomon. Az A82 846B antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk,

8,8 g tisztított A82 846B antibiotikumot nyerve.

Az A82 846B antibiotikum IR spektrumát (KBr) a 2. ábrán, tioglicerinben felvett FAB-lömegspeklrumát az 5. ábrán, az acetátjának metil-szulfoxid-de-ban, 60 °C hőmérsékleten felvett NMR spektrumát (Bruker AM500 spektrométer, a 8. ábrán mutatjuk be,

A sótalanitási eljárásokat végezhetjük úgy is, hogy a Diaion HP-20 gyantára vitt anyagot 0,1% ecetsavat tartalmazó, metanol/víz, 4:1 eleggyel eluáljuk.

G. példa

Az A82 846C antibiotikum előállításához először A82 846 antibiotikumot termelünk, majd az A82 846A, B és C komponenseket elválasztjuk és az A82 846C komponenst tisztítjuk az alábbiak szerint:

Az 1. példában ismertetett tankfermentáció 461 liter fermentlevének kémhatá.- \t 5 n nátrium-hidroxiddal pH=10,5 értékre elitjük be, és 3% Hyflo Supercelt hozzáadva szűrjük. A 430 liter szűrlet kémhatását 5 n sósavval pH=7 értékre állítjuk be, és 10 liter Dowex-SFS-43 278 gyantára visszük. Az oszlopot 50 liter vízzel mossuk, az aktív anyagot 50 liter 0,05 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk, 4 literes frakciókat gyűjtve. Az elúciót biológiai érték méréssel analizáljuk. Az aktív frakciókat (1-7.) egyesítjük, csökkentett nyomáson kb. 1700 ml térfogatra tömény ít. jük, majd fagyasztva szárítva 283,9 g nyers A82 846 antibiotikum preparátumot nyerünk.

g nyers, A82 846 antibiotikum terméket vízben oldunk és 5,08x114,3 cm méretű rozsdamentes acél preparativ HPLC oszlopban 2110 ml LP-l/Cis szilikagél oszlopra viszünk, amit 1% ammónium-dihidrogén-foszfátban készítettünk előzőleg el. Az oszlopot gradiens elúciónak vetjük alá, a kezdeti eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldat, a végső 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát/ /acetonitril, 92:8 elegy. Átfolyási sebesség 70 ml/perc. 400 ml-es frakciókat gyűjtünk és 254 nm-nél detektálunk.

Különválasztjuk az A82 846A (11-14.) az A82 846C (16-20.) és az A82 846B antibiotikumot (21-25.) tartalmazó frakciókat, majd a megfelelőket egyesítjük.

Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó egyesített frakciókat 200 ml térfogatra tömé~ nyitjük és 7x45 cm-es üvegoszlopban 1800 ml Diaion HP-20 gyantán sótalanitjuk. Az aktív anyagot 0,1% ecetsavat tartalmazó, metanol/ /víz, 4:1 eleggyel eluáljuk. Átfolyási sebesség percenként 25 ml. 1 literes frakciókat gyűjtünk. Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat (9-12.) egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 662,2 mg félig tisztított A82 846C antibiotikum terméket nyerve.

-1529

HU 198964 Β

500 mg félig tisztítóit terméket tovább tisztítunk, megismételve a fordított fázisú kromatográfiai. Ehhez egy 1,5x121,92 cm méretű acéloszlopban készített 450 ml-es LP-l/Cie szilikagél oszlopot használunk. Gradiens elúció 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfáttal indulva, a végső eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldat/acetonitril, 92:8, áramlási sebesség 11 ml/perc. 25 ml-es frakciókat gyűjtünk, az elúciót 254 nm-en detektáljuk. Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat (169-210.) egyesítjük, HP-20 gyantát tartalmazó 5x45 cm méretű üvegoszlopon sótalanitjuk. Az oszlopot 0,1% ecetsavat tartalmazó, metanol/víz, 4:1 eleggyel eluáljuk, 100 ml-es frakciókat gyűjtünk, az elúciót analitikai HPLC-vel kisérjük nyomon, 225 nmen detektálva. Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat (5-11.1 egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, fagyasztva szárítjuk. 127,3 mg Λ82 8-16C antibiotikumot kapunk.

Az A82 846A és az A82 846B antibiotikumot tartalmazó egyesített frakciókat az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakció előzőekben ismertetett feldolgozása szerint tisztítjuk tovább, a megfelelő tisztított antibiotikumokhoz jutva.

Az A82 846C antibiotikum további tisztításához 70 mg fenti terméket az alábbi kromatográfiás rendszerben dolgozunk fel:

Oszlop: Zorbax SCX (9,2x250 nini) kationcserélö.

Mozgó fázis: lineáris gradiens; kezdő eluens: 10% metanolt tartalmazó 0,15 M nátrium-dihidrogén-foszfát pufféi·; végső eluens, 10% metanolt tartalmazó 0,9 M nátrium-dihídrogén-foszfát puffer, a gradiens kialakítás 6 perc időtartamú, majd 5 percen át a végső eluenssel eluálunk. A pufferek kémhatását nem állítjuk be adott értékre.

Áramlási sebesség: 6,0 ml/perc.

Detektálás: 280 nm-en.

Bevitt anyagmennyiség: 6,0 mg, vízben oldva.

Az A82 846C antibiotikum frakciókat automatikus frakciószedövel (Gilson 2010 gyűjtünk össze, csúcsdetektálási mechanizmus segítségével. A mozgó fázist Millipore Wpters M600 Gradient HPLC System készülékkel alakítjuk ki, az injektálást Hitachi automata frakciógyűjtövel végezzük.

Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, 30 ml térfogatra töményítjűk és 50 ml-es HP-20 oszlopra viszszúk. Az oszlopot vízzel mossuk, 0,5% ecetsavat tartalmazó viz/izopropanol, 95:5 eleggyel eluáljuk, 25 ml-es frakciókat gyűjtve. Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük (9-14.). bepároljuk, fagyasztva szárítjuk. 37 mg tisztított A82 846C antibiotikumot nyerünk.

Az A82 846C antibiotikum IR spektrumát (KBr) a 3. ábrán, tioglicerinben felvett FAB-tömegspektrumát a 6. ábrán, az acetátjának metil-szulfoxid-d6-ban 60 °C hőmérsékletén felvett NMR spektrumát (Bruker AM500 spektrométer, 1IDO szupresszált), a 9. ábrán mulatjuk be.

7. példa

Az Λ82 816 antibiotikum sóinak előállításához 100 mg antibiotikumot feloldunk 10 ml ionmentes vízben. Az oldat kémhatását 5 n savval - sósavval, kénsavval vagy foszforsavval - pll=3 értékre állítjuk be. Az oldatot fagyasztva beszárítva megkapjuk a megfelelő sót.. Ha az oldat kémhatása alacsonyabb pll=3 értéknél (például pH=2), a vegyület bomlik. Az i.lábbi kitermeléseket kaptunk:

só A82 846A (mg) A82 846B (mg)

I1C1 UzSOUIbPOí 93,8(92,5)110,8 88,1(75,41105,7

Az A82 846B UV-spektruma a következő:

körülmények hullámhossz (nm) abszorbancia
semleges savas bázikus	281 282 398/298	0.0587 0.0613 0.0023/ /0.0781
8. példa
Az A82	846A antibiotikumot	tartalmazó

tabletták előállitásíit az alábbi alkotórészekből készítjük:

A82 846-foszfát	282.9	mg
mikrokristályos cellulóz	101.1	mg
kraszkar mai lóz- nátrium	12.0	mg
Providone	12.0	mg
mag'nézium-sztearát	3.0	mg
sztearinsav	4.0	mg
tisztított víz	0.1€	i ml

Megfelelő edénybe homogénné őröljük az A62 846A-foszfátot, a mikrokristályos cellulóz egy részét és a kroszkarmellóz-nátrium egy részét. Vizes Providone oldatot készítünk, és ezt hozzáadjuk a megőrölt porhoz. A keveréket megfelelő méretűre granuláljuk és megszárítjuk. A száraz szemcsés anyaghoz hozzáadjuk a mikrokristályos cellulóz és a kioí zkarmellóz fennmaradt részét és a keveréket összeóröljük. Magnézium-sztearátol és sztearinsavat adunk hozzá és megőróljük, majd a kapott port. tablettákká sajtoljuk. ,

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Az A82 846B antibiotikumot tartalmazó

kapszulák elkészítéséhez a kapszulákat. alábbi összetételű keverékkel töltjük meg: A82 846B-hidroklorid 262.2 kukoricakeményitő, folyékony por 137.7 szilikonfolyadék, 350 centistoke 2.7 kukoricakeményitő 147.1

Az alkotórészeket alkalmas malomban homogénné őröljük, és a megfelelő méretű ke- 15 mény zselatin kapszulákba töltjük.

10. példa

Az A82 84CA antibiotikumot tartalmazó szuszpenzió elkészítéséhez az A82 846A antibiotikumot átkristályositással vagy lecsapással steril, oldhatatlan állapotba hozzuk.

Ezt olyan szemcseméretüre aprítjuk, ami al- 25 kalmas a szuszpenzió elkészítéséhez. Az A82 846A antibiotikumot az alábbi hordozóközegben szuszpendáljuk:

lecitin 1% 30 nátrium-citrát. 2% propilparaben 0.015% injektálható víz kívánt térfogatban.

A szuszpenziót elkészítjük gyárilag 35 nagy térfogatban és ezt fiolákba töltjük szét, vagy elkészítjük a szuszpenziót felhasználás előtt., a hordozóközeget hozzáadva az üvegcsékben lévő A82 846A antibiotikumhoz. 40

1. Eljárás az A82 846 antibiotikum-komplex, és az annak alkotórészeit képező (2) általános képletű A82 846A - ahol

X hidrogénatom és

Y klóratom -,

Λ82 846B - ahol

X és λ' klóratom -, és A82 846C - ahol

X és 1' hidrogénatom antibiotikumok és savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a Nocardia orientalis NRRL 18 098, NRRL 18 099 vagy NRRL 18 100 törzset vagy ezek valamelyikének A82 816 antibiotikumot termelő mutánsát vagy variánsát, asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon tenyésztjük süllyesztett, aerob r<:rmenl.ációs körülmények között, kívánt esetben az antibiotikumot elválasztjuk t ferniotiUéböl és/vagy savaddiciós sóvá alakítjuk, ha nincs sóforniában.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A82 846A antibiotikum és gyógyászati szempontból alkalmazható savaddíciós sói előállítására, azzal jellemezve, hogy az antibiotikumot a tenyészléból elválasztjuk, és kívánt esetben megfelelő sóvá alakítjuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A82 84GB antibiotikum és gyógyászati szempontból alkalmazható savaddiciós sói előállítására, azzal jellemezve, hogy az antibiotikumot a tenyészléból elválasztjuk, és kívánt esetben megfelelő sóvá alakítjuk.
4. Eljárás aktív alkotórészként A82 846, A82 846A, A82 846B vagy A82 846C antibiotikumot vagy- gyógyászati szempontból alkalmazható sóját tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított hatóanyagot egy vagy több gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyaggal gyógy szerkészitménnyé feldolgozzuk.

Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest - A kiadásért felel: Himer Zoltán osztályvezető R 4889 - KJK

90.2639.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató