DK167770B1

DK167770B1 - Antibiotikum a 40926 n-acylaminoglucuronyl-aglyconer og antibiotikum a 40926 aglycon og farmaceutisk acceptable additionssalte deraf, fremgangsmaade til fremstilling af saadanne forbindelser, farmaceutisk praeparat indeholdende forbindelserne samt anvendelse af saadanne forbindelser til fremstilling af et medikament

Info

Publication number: DK167770B1
Application number: DK617286A
Authority: DK
Inventors: Enrico Selva; Ernesto Riva; Giovanni Cassani; Francesco Parenti
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1986-12-19
Publication date: 1993-12-13
Also published as: IE863382L; JPS62242699A; NO172121B; DE3682767D1; FI86307C; ZA869713B; IL81106A; NZ218789A; KR950010461B1; NO172121C; AU6688386A; EP0240609A3; GB8608809D0; IE59523B1; NO865323L; ES2040207T3; FI865320A0; KR890002231A; MY101178A; FI865320A

Description

i DK 167770 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte antibiotiske stoffer benævnt antibiotikum A 40926 N-acylami-noglucuronylaglycon kompleks AB, antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor A, antibiotikum A 40926 5 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor B, antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor Bq ,antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor B1, antibiotikum A 40926 aglycon og farmaceutisk acceptable additionssalte deraf, en fremgangsmåde til fremstilling af disse stoffer 10 ud fra antibiotikum A 40926 kompleks eller en faktor deraf, anvendelse af disse forbindelser til fremstilling af lægemidler til behandling af infektionssygdomme som er fremkaldt af mikroorganismer der er følsomme for dem samt et sådant farmaceutisk præparat indeholdende forbindelserne.

15 Antibiotikum A 40926 kompleks og dets faktorer er antibiotiske stoffer som er virksomme mod grampositive bakterier og stammer af Neisseriae, og det fremstilles af stammer af slægten Actinomadura.

En A 40926-producerende stamme af slægten Actino-20 madura er deponeret den 8. juni 1984 hos American Type

Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockvill, Maryland 20852, USA under Budapest-traktatens regler.

Antibiotikum A 40926 og dets faktorer såvel som den producerende mikroorganisme og fremgangsmåden til 25 fremstilling deraf er beskrevet i US patentansøgningspublikation nr. 177882. På basis af de fysisk-kemiske data og under henvisning til strukturen af kendte antibiotiske stoffer kan følgende formel tilskrives faktorerne af A 40926 (nummereringen er analog med den der er foreslået 30 af J. Williams i J.A.C.S., 106, 4895-4908 (1984)): 35 2

Ulv TO///U Dl

0A H

0.^1 H°Z4tøciCi l3^HZ3 b

5 O X3„ O X3 O

^X^pvr^å'lr4i-VNH2'CH3

°=^ 6 <> X4 ° X2 X6 I

"n N"H C1n>^N

10 V _UHX7 5 I 3 |l 1 i 0 \ / iC H0 j

m-oB 0H

15 hvor A betegner en N-(C.j-j-C^Jacylaminoglucuronylgruppe og B betegner en mannosyl- eller acetylmannosylgruppe.

Nærmere betegnet er antibiotikum A 40926 faktor A den forbindelse med den ovennævnte formel, hvor A betegner 20 undecanoylaminoglucuronyl og B mannosyl; antibiotikum A 40926 faktor Bg er den forbindelse med den ovenfor viste formel hvor A betegner isododecanoylaminoglucuronyl og B mannosyl; og antibiotikum A 40926 faktor B^ er den forbindelse med den ovenfor viste formel I hvor A betegner dode-25 canoylaminoglucuronyl og B mannosyl.

Antibiotikum A 40926 faktor PA og faktor PB afviger fra de tilsvarende faktorer A og B ved at der i stedet for en mannoseenhed er en acetylmannoseenhed.

Antibiotikum A 40926 er et komplekst antimikrobielt 30 stof; fem af dets komponenter er blevet isoleret og identificeret som faktorerne PA, PB, A, B og Bg.

Antibiotikum A 40926 faktorerne PA og PB er, i det mindste under visse gæringsbetingelser, de dominerende antibiotiske produkter fra den A 40926-producerende mikro-35 organisme.

Antibiotikum A 40926 faktorer A og B er i hovedsagen omdannelsesprodukter af antibiotikum A 40926 henholds- 3 DK 167770 Bl vis faktor PA og faktor PB, og de er ofte til stede allerede i gæringssuppen.

Det har vist at antibiotikum A 40926 faktor PA kan omdannes til antibiotikum A 40926 faktor A og at antibio-5 tikum A 40926 faktor PB kan omdannes til antibiotikum A 40926 faktor B under basiske betingelser.

Som følge heraf vil der, når man lader gæringssuppen eller en ekstrakt eller et koncentrat deraf som indeholder antibiotikum A 40926 henstå i en vis tid under ba-10 siske betingelser (fx en vandig opløsning af en nukleofil base, ved en pH-værdi over 9 natten over), vindes et antibiotikum A 40926-kompleks som er beriget med hensyn til antibiotikum A 40926 faktor A og faktor B.

I nærværende beskrivelse med tilhørende krav sigtes 15 der med udtrykket "antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucu-ronylaglycon" til antibiotikum A 40926-N-acylaminoglucuro-nylaglycon kompleks AB og/eller en enkelt faktor deraf, dvs. antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor A, antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylagly-20 con faktor B, antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronyl aglycon faktor Bq og antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor B^.

Forbindelserne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de i ikke-additionssaltformen har følgende 25 egenskaber:

Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB_______________________________________________________ har i den form hvor det ikke er et additionssalt følgende 30 egenskaber: A) et ultraviolet absorptionsspektrum som er vist i tegningens fig. 1 og som udviser følgende absorptions-maxima: 22 λ max (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfatpuffer pH 7,4 282 310 (skulder) c) 0,1 N KOH 302 DK Ί 67770 ΒΊ 4 Β) et infra rødt absorptionsspetrum som er vist i tegningens fig. 2 og som viser følgende absorptionsmaxima: 3700-3100? 3000-2800 (nujol); 1650; 1620-1550; 1500? 1460 (nujol)? 1375 (nujol); 1300; 1250-1180; 1150; 1060; 5 1010; 970? 930? 840? 820 cm"1.

C) H-NMR-spektrum som er vist i tegningens fig. 3 og som udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz og optaget i DMSO d^ (hexadeuterodimetylsulfoxid) plus 10 CF^COOH under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppn), 6 = ppm: 0,84, d og t (isopropyliske CH^'er og terminal CH^); 1,14, m ((CH2)n); 1r44, m (-C^-C-CO og isopropylisk CH); 2,00, t (-CH2-(CO)); 2,5 s (DMS0d5); 2,5, s (N-CH3); 2,93, m (CCH, (Z2)); 3,33, m (CH, (Z'2)); 3,20-3,80, m 15 (sukker CH'er)); 5,34, d (anomerisk proton af acylamino-glu .uronsyre)? 4,10, m (X6); 4,33, d (X5); 4,43, d (X7); 4,9, m (X2); 5,1 (4F og Z6); 5,4, s (XI); 5,58, d (X4); 5,7, s (4B); 6,06, d (X3); 7,73, s (6B); 6,26-8,42, s og m (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); 8,70-10,5, br 20 s (fenoliske OH'er og NH2 ) hvor br står for bred, d for dublet, m for multiplet, s for singlet og t for triplet.

D) retentionstider (Rt) 1,20 og 1,30 i forhold til Teicoplanin A2 komponent 2 (Rt =20,3 min) ved analyse ved 25 reversfase HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex" ® (Beckman), 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH^CN 10%") reguleret 30 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6 elueringsmiddel B: CH^CN 70%7 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%j til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter 35 strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm DK 167770 B1 5 intern standard: Teicoplanin komponent 2 (Gruppo

Lepetit S.p.A.) E) syrefunktioner med evne til at danne salte 5 F) aminofunktion med evne til at danne salte G) ingen mannoseenhed bundet til kernedelen.

10 ^£tibiotikum_A_40926_N-acYlaminoglucuronYlaglYcon_faktor_A

har i form af ikke-additionssalt følgende egenskaber: A) ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima: λ max, nm 15 a) 0,1N HC1 282 b) fosfatpuffer pH 7,4 282 310 (skulder) c) Ο,ΙΝ KOH 302 20 B) et infrarødt spektrum som er vist i tegningens fig.

4 og som udviser følgende absorptionsmaxima: 3700-3300; 3000-2800; 1650; 1585; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1070; 1060; 1010; 845; 820; 720 _ i (nujol) cm 25 C) H-NMR spektrum som er vist i tegningens fig. 5 og udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz, optaget i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), δ = ppm: 30 0,85, t (terminal CH^); 1,0-1,3 (alifatiske CH^er); 1,42, m ((0C-C)CH2); 2,00, t ((C0)CH2); 2,35, s (NCH3); 2,49, s (DMSOdj.); 2,82, m (Z2); 2,8-3,8 (sukkerprotoner og Z'2); 4,12, m (X6); 4,56, s (XI); 4,34, d (X5); 4,41, d (X7); 4,96, m (X2); 5,08-5,12 (4F og Z6); 5,40, d (anomerisk pro-35 ton af acylaminoglucuronsyre); 5,58, d (X4); 5,74, s (4B); 6,05, d (X3); 7,75, s (6B); 6,25-8,40, s, d og m (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er).

DK Ί677/0 di 6 D) en retentionstid (Rt) på 1,20 i forhold til Teico-planin A2 komponent 2 (R^ = 20,3 min) ved analyse ved revers fase HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex"® (Beckman) 5 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH^CN 10%} reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH^CN 70%”) reguleret 10 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm 15 intern standard: Teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepe- tit S.p.A.) E) molekylvægt ca. 1554, bestemt ved FAB-MS 20 F) syrefunktioner med evne til at danne salte G) aminofunktion med evne til at danne salte H) ingen mannoseenhed bundet til kernedelen 25

Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor lo----------------------------------------------------- i ikke-additionssaltformen har følgende egenskaber: A) et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima: λ max, nm a) 0,1N HC1 282 b) fosfatpuffer pH 7,4 282 ^ 310 (skulder) c) 0,1N KOH 302 DK 167770 B1 7 B) et infrarødt absorptionsspektrum som er vist i tegningens fig. 6 og som udviser følgende absorptionsmaxima: 3700-3100; 3000-2800 (nujol); 1650; 1585; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1060; 1010; 5 980; 840; 820; 720 (nujol) cm"1 C) H-NMR-spektrum som er vist i tegningens fig. 7 og som udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz, optaget i DMSO dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anven- 10 delse af TMS som intern standard (0,00 ppm), δ = ppm: 0,84, d (isopropyliske CH^’er); 1,0-1,3 (alifatiske CH2'er); 1,3-1,6 ((OC-C)-CH2 og isopropylisk -CH); 2,00, t ((OC)CH2); 2,32, s (NCH3); 2,49, s (DMSOdg); 2,82, m (Z2); 2,9-3,8 (sukkerprotoner); 4,12, m (X6); 4,44, s (X1); 4,33, d (X5); 15 4,37, d (X7);, 4,95, m (X2);, 5,06-5,10 (4F og Z6); 5,38, d (anomerisk proton af acylaminoglucuronsyre); 5,59, d (X4); 5,72, s (4B); 6,05, d (X3); 7,74, s (6B);’6,27-8,5 (aromatiske og peptidiske NH'er) 20 D) en retentionstid (Rj.) på 1,30 i forhold til Teico-planin A2 komponent 2 (R^_ = 20,3 min) ved analyse ved reversfase HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 ym) "Altex" ® (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 25 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 ym) elueringsmiddel A: CH^CN 10%1 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH^CN 70%1 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 30 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm intern standard: Teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepe-35 tit S.p.A.) DK 167770 Bl 8

E) en molekylvægt på ca. 1568, bestemt ved FAB-MS

F) syrefunktioner med evne til at danne salte 5 G) en aminofunktion med evne til at danne salte H) ingen mannoseenhed bundet til kernedelen.

Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor 10 B1______________________________________________________ har en molekylvægt på ca. 1568, bestemt ved FAB-MS, og har i det væsentlige samme fysisk-kemiske egenskaber som er vist ovenfor for antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor Bn, blot med den forskel at det har 15 u en triplet ved 0,84 δ ppm som kan tilskrives metylgruppen 1 en n-propylfunktion i det ovenfor beskrevne NMR-system og en retentionstid i forhold til Teicoplanin komponent 2 på 1,32 i det ovenfor beskrevne system.

^2tibiotikum_A_40926_a9lycon har følgende egenskaber: A) et ultraviolet absorptionsspektrum som er vist i tegningens fig. 8 og som udviser følgende absorptionsmaxima: 2^ λ max, nm a) 0,1N HC1 280 b) fosfatpuffer pH 7,4 280 310 (skulder) c) 0,1N KOH 299 30 B) et infrarødt absorptionsspektrum som er vist i tegningens fig. 9 og som udviser absorptionsmaxima: 3700-3100; 3000-2800 (nujol); 1655;. 1620-1550; 1500; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1300; 1205; 1145; 1010; 970; 930; 840 cm-1 35 1 C) H-NMR-spektrum som er vist i tegningens fig. 10 og som har følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz, op- DK 167770 B1 9 taget i DMSO dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) plus CF^COOH under anvendelse af TMS som intern standard (0,00. ppm), δ = ppm: 2,51, s (DMSOdg); 2,50, s (NCH3); 2,88, m (Z2); 3,33, m (Z'2); 4,10, m (X6); 4,34, d (X5); 4,43, d (X7); 5 4,93, m (X2); 5,04, s (4F); 5,09, s (Z6); 5,54, d (X4); 5,75, s (4B); 6,05, d (X3); 7,76, s (6B); 6,3-8,4 (aromatiske og peptidiske NH'er) D) en retentionstid (Rfc) på 0,59 i forhold til Teico-10 planin A2 komponent 2 (R = 20,3 min) ved analyse ved reversfase HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 ym) ”Altex"® (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 ym) 15 elueringsmiddel A: CH^CN 10%| reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH^CN 70%1 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel 20 Bi elueringsmiddel A, i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm intern standard: Teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepe- tit S.p.A.) 25

Under de samme betingelser er retentionstiden i forhold til antibiotikum L 17054 (Gruppo Lepetit, europæisk patentansøgningspublikation nr. 119575) 1,42.

30 E) en molekylvægt på ca. 1211, bestemt ved FAB-MS

F) syrefunktioner med evne til at danne salte G) en aminofunktion med evne til at danne salte 35 H) ingen mannoseenhed bundet til kernedelen, . 10

Ulv lb///u b I

idet disse faktorer er tilskrevet formlen oA h X*XL--hz3 5 ° x3h o x3h o + Η I Η I S H ά . ^rJL /NH7-CH3 • Y^1v<

0=βζ^ 6 O X4 ° X2 Xg I

"°>_ν*7 i3 j3 10 ^v/D& B0'ί»

O-OH

hvor A betegner hydrogen eller N-fC^-C^)acylaminoglucuronyl. 15 På basis af de fysisk-kemiske egenskaber og under henvisning til strukturen af kendte antibiotiske stoffer hørende til samme stofgruppe kan man tilskrive ovennævnte formel I, hvor A er N-(C^-C^2)acylamin°9lucur0nyl og B betegner hydrogen, til antibiotikum A 40926 N-acylamino-20 glucuronylaglyconer.

Nærmere betegnet kan den foran viste formel I, hvor A betegner n-undecanoylaminoglucuronyl og B betegner hydrogen, tilskrives antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucu-ronylaglycon faktor A? formel I, hvor A betegner isodode-25 canoylaminoglucuronyl og B betegner hydrogen kan tilskrives antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor Bq; formel I, hvor A betegner n-dodecanoylaminoglucu-ronyl og B betegner hydrogen, kan tilskrives antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor B^. Sidst-30 nævnte vindes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ud fra antibiotikum A 40926 faktor B^, som er den komponent af antibiotikum A 40926 faktor B i hvilken er lig 1,27 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 i det reversfasesy-stem som er beskrevet i europæisk patentansøgningspublika-35 tion nr. 177882 og anført senere i nærværende beskrivelse. Det vindes ud fra antibiotikum A 40926 faktor B efter fra-skillelse af faktor Bq (hovedfaktoren).

11 DK 167770 Bl

Ovennævnte formel I, hvor A og B begge betegner hydrogen, kan tilskrives antibiotikum A 40926 aglycon.

I nærværende beskrivelse med tilhørende krav indbefatter antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon 5 kompleks eller faktorerne deraf og antibiotikum A 40926 aglycon den "indre saltform" såvel som mulige syre- og baseadditionssalte.

Den antibakterielle aktivitet af forbindelserne ifølge opfindelsen kan påvises in vitro ved standardfor-10 tyndingsprøver på forskellige mikroorganismekulturer.

Dyrknignsmedier og vækstbetingelser for bestemmelser af MIC (mindste inhiberende koncentration) var som (5) følger: Isosensitestsuppe ("Oxoid" ,24 timer, for stafylokokker, Streptococcus faecalis og gramnegative bakterier 15 (Escherichia coli); Todd-Hewitt suppe ("Difco" ®), 24 timer for andre arter af Streptococcus; GC basesuppe ("Difco"®) + 1% "Isovitalex" (BBL), 48 timer, CC^-beriget atmosfære for Neisseria gonorrhoeae; hjerne-hjertesuppe ("Difco" ®) + 1% supplement C ("Difco" ® ), 48 timer, for 20 Haemophilus influenzae; AC suppe ("Difco"®), 24 timer , anaerob atmosfære for Clostridium perfringens; Wilkins-Chalgren agar (se T.D. Wilkins og S. Chalgren, 1976, Anti-microb. Ag. Chemother. J_0, 926), 48 timer, anaerob atmosfære for de andre anaerobe bakterier (Clostridium diffici-25 le, Propionibacterium aenes, Bacteroides fragilis); PPLO suppe ("Difco" ® + 10% hesteserum + 1% glukose, 48 timer, for Mycoplasma galliseptieum; PPLO suppe med supplementer som angivet af R.T. Evans og D. Taylor-Robinson (J. Anti-microb. Chemother. 4_, 57), 24 timer, for Ureaplasma urealy-30 tieum; inkubering skete ved 37°C. Inocula var som følger: 1 rumfangs! af en 48 timers suppekultur for Mycoplasma 4 galliseptieum; ca. 10 farveændrende enheder/ml ·for Urea- 4 5 / plasma urealyticum; ca. 10 -10 kolonidannende enheder/ml 4 5 for andre suppefortyndingsværdier af MIC; ca. 10-10 bakte-35 rier/plet (podet med et mangepunkts poderedskab) for MIC-værdier ved agarfortynding (Clostridium difficile, Propionibacterium aenes, Bacteroides fragilis).

De mindste inhiberende koncentrationer (MIC, pg/ml) for nogle mikroorganismer er vist i nedenstående tabel I.

12 UK ΊΌ///ϋ bl i SMcazrondoocncncncfl'-'Cnaicn cn ! : ^wsuroiDi-ii-’Mrf'c+r+rtOrtr+rt rt

i OOfCH-OOOO^'it-ihOiDSUpj SU

i o^gmri-'rsmtnroajrocDCu'dO'd 3 i fOffiOCnffiH-rtrtOTJOO'QS'trtr 3 i H-'i-iOfD^Oi-it-ir+rt-f+r+C^^C^ Φ {υΗ-ίΤΜΟΰΗ-Η-ΟΟΟΟΗΗΗΗ £βΟι-·Η-Η·Η·&·α·ΟΟΩΩΦΟΟΟ 3σΜίΐ)ΩισΗ-Η·000003ΩΩΩ SU H- ¢3 Φίυ£53ΩΩΩΩΦΟΟΟ ίυωιΩωΩ330ΩΩΩ ΙΩΩΩ ιΩ ο ct ρρρρρωοο αΐΩΗ-ηΗιΩΩ,ΌΐηοικωΦααΩ HODOMMH-φ o cn cn ca

)— 1— ("ti i~t SU μ- Mi M 3 Μι Ό Ό SU

Η- Η- Η M lQ C Hi Hi l·· pi rt (P SU £fl

CD CtTH-gH-Hir+CDCDOH-^OfiC

(DtMfDOH Ω Η- Μ- Ω D iQ < Η- Μ M

»Ojs.siCH-suH-Dmsugro'— s^ffici) Γΐ--θΝΡυωΩΗΐΩ HOD (0 P p H- SU CD DOOfM-DCD M tn tn Ω UP Φ Φ D'JCDH-CD 3 P tr(-‘Cnt-,CDVD SU H· f* f gHrJtMVDO -» σ f* Φ t-1 Qi-»-* co -» f* u> t1 -» tt· η- o σ cnuiui it* CO -J O U> U) X CD it.

ω -» O H > -* OH tt» O Ir1'·' -» it» 03 1-3 it» > M-> CO —> -» o rt S O t-3 H D i-3 G o tt· o co h< ctnD>ocoM-onH ό o σι Ό oo h3 O cn tn o »t.

® \ w n x -» >ω

Si —· OJ Q CD UJ -J H3 Ml

Φ cr co -o o o h o OD

o it· o æ cn cn co o \ CT!><-7i<D<Dtt»o© 3 i-3

i-{ i-3 -» ω H —1 H SU

η- O vo SU to — C7 S^j O rt to φ uq co (—* Φ —» 03

O H

tt·

CO

D 2 >

0^< I D

v g h SU rt

-> Ό SU Ω H

σ> to -» HiQ h< CT

it co it» σ o o ooooo oo φηηη·

•x -χ ^ «* ·* ** «* «χ *% ^ ^ pj Q

o to o —1 —» o —» —» —» οι Ω 3 rt en w cn u> w σ u> ww ομ·μ· >33^

to O C s Ώ 3 H

H O

P > Ω C tt· -c

M O iQ

0 CD \ i co g I ο h S v i —» —» SU > >

CO CO OJ —» CO VQ D

aocotooro—»—»ooo—»oo oo H *· r+ «* *x *· *» > ^ O H· to cn σ cn -» co-» ω cd σ' cn to ui ω o to Μ η o o rt H· **

P

j 3 DK 167770 B1 13 GHæaocncocncn-^cncncnoi! ω ' tiiiiSi(lii-,(+ft(trtOrtt+(+rtj rt

(D0(Dh-0I33330SUSUSUSU

Su3'3cncncDCDCD(Dsu,0,0t0td 3 'OOOSirtOOOOlQiJ'fftfti' 3

H HitifllH rtrtrtrtCK^^1^ CD

PJ Η· ET Η Η·' O O O O Η Η Η Η H

[nOH-3-fLOOOOSUOOOO 3ETHSUH· OOOOcnOOOO (DH-P dOOOOCDOOOO SUtniQBOOOO I O O O O C O CCOCDOOOO

30t--3fdtncntncncDdddd CD O 3 o cd Gcnmcotn

SUi-‘3i3333iOtaSD t-* η- H 3 MiH-fu 3 35 rt CD ETPJ SU

r< d3'3rt(DCDOH-,ossudd

rttr,(DOH-3-od<-Q<:i-'-cD33 3-.fc>3CD3tnSD3CD'--Qj3CDCD O^JNDJtQ I—1 O E3 CD O C C

C su CD (D G 3· 3 CD 3 i-1 tn tn g ffl (D D ί in h· tu 3 ·< 5¾ Gcnvo fu H-rttr,trl σι f CD tr1 o, η- -» -» voG -» η- o σι cn —» —»vDvjfoj’r’iP'f'O tndmcn .fc. tO ~J CO M VO tn •~J~»OHOH· *e» O tr1 ^ W5 ιΡ» CO 3 ί> to ο<+2ηη- (-3CO fli o π << σι t n t n η o u> όο cn m tj ου k ?? n i- to H- CD \ -> > Ω 3 -> U> H- -J 1-3 — Hl η- o' to o tn o O O d *-3 tn oi ui O co Π O \ [u ^ i-1 o sug σ ι-g to su -» iQ Η Φ H- O ri- to C — I-1 tn O 10 tr1 · O to SU h 03 to ru co CD -

r+ it» I

—> 3 O

oo CD ^ uQ . rt- pu cn rt su H- rt < "" ι-h SU iQ 2 > > v V su ifl Η I S3 _» _* ^(--dSUiJirt rotooj n-^C o η o μ· oocotocooooooo o o o OOC^yocr , - hjO'-iHtOH- o o —i o o o to-»o 3 O su σι 0 u σι ω <31 <5\ !3\ U1 U <31 33 rt l-< Η· H-

H 3 ?T S

10 d H

i 3 o > Έ

ω 3 2 >iO

v v - K I 3 \ 11 H SU rt 3

to IO U> t3j SU O 3- M

ooootoæoooooo ooo o <0 k: tr > ·ν > ^ ^ " I—1 Η* W·

oo^ooo to—‘O O^SUO

to cn w σι σι σι υι ω cn ιΩ Ω 3 rt O H- 3- ¢)33^

Od ttllfl 3 SU H ** d > rt o odi> 3 3 0

0 O

1 to cn DK 167770 Bl 14

Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB og faktorerne deraf har vist sig særlig virksomme mod coagulasenegative stafylokokker. MIC (pg/ml) i forhold til en række kliniske isolater af Staphylococcus 5 epidermidis og Staphylococcus haemolyticus fremgår af nedenstående tabel II.

_Tabel II_

Stamme af Antibiotikum A 40926 10 StaDhvlococcus N-acylaminoglucuronyl- iu stapnyiococcus aglycon kompleks AB, MIC, ug/ml S. epidermidis L 393 0,06 S. epidermidis L 408 0,13 ^ S. epidermidis L 410 0,06 S. haemolyticus L 381 0,25 S. haemolyticus L 382 0,13 S. haemolyticus L 383 0,5 S. haemolyticus L403 0,25 20 _

Desuden har MIC^q (yg/ml) for antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB, dvs. den koncentration som inhiberer mindst 90% af 36 behandlede klini-25 ske isolater af coagulasenegative stafylokokker, vist sig at være 0,5 pg/ml.

Den antimikrobielle aktivitet af forbindelserne ifølge opfindelsen er også bekræftet ved forsøg med eksperimentelt fremkaldt septicæmi hos mus.

30 Kontrolgrupper og behandlingsgrupper indeholdt hver ti CD-1 mus (Charles River) med en vægt på 18-22 g. De blev inficeret intraperitonealt med 0,5 ml bakteriesuspension fremstillet ved fortynding af en en nat gammel kultur af Streptococcus pyogenes C 203 (L 49) med sterilt peptoni-35 seret saltopløsning. Podningerne blev reguleret på en sådan måde at ubehandlede dyr døde af septicæmi i løbet af 48 timer. De til afprøvning værende forbindelser blev indgi- DK 167770 Bl 15 vet subkutant straks efter infektionen. På den 7. dag blev ED^q, udtrykt i mg/kg, beregnet ved den af Spearman og Kårber angivne metode (se D.J. Finney, "Statistical Methods in Biological Assay", Griffin, side 524, 1952) ud 5 fra procentdelen af overlevende dyr efter hver dosis.

Under disse betingelser var EDj-g-værdierne for antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB og antiobiotikum A 40926 aglycon henholdsvis 0,54 og 6,2 mg/kg.

10 Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB, faktorerne deraf og antibiotikum A 40926 aglycon har sure og basiske funktioner og kan danne salte med organiske og uorganiske modioner ved konventionelle fremgangsmåder.

15 Repræsentative og egnede syreadditionssalte af for bindelserne ifølge opfindelsen er de salte der dannes ved standardreaktioner med både organiske og uorganiske syrer som fx saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre, fosforsyre, eddikesyre, trifluoreddikesyre, trikloreddikesyre, rav-20 syre, citronsyre, askorbinsyre, mælkesyre, maleinsyre, fu-marsyre, palmitinsyre, cholsyre, pamoesyre, mucinsyre, glu-taminsyre, kamfersyre, glutarsyre, glykolsyre, ftalsyre, vinsyre, laurinsyre, stearinsyre, salicylsyre, metansulfon-syre, benzensulfonsyre, sorbinsyre, picrinsyre, benzoesyre 25 og kanelsyre.

Repræsentative eksempler på baser med hvilke der kan dannes additionssalte er alkalimetal- og jordalkali-metalhydroxider såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid, kalciumhydroxid, magnesiumhydroxid og bariumhydroxid, ammoni-30 ak og alifatiske, alicykliske og aromatiske organiske aminer såsom metylamin, dimetylamin, trimetylamin og picolin.

Omdannelse af "ikke-salt" forbindelser ifølge opfindelsen til de tilsvarende additionssalte og omvendt, dvs. omdannelse af et additionssalt til en forbindelse ifølge 35 opfindelsen i ikke-saltform, ligger inden for normal teknisk viden og omfattes af opfindelsen.

DK 167770 Bl 16

Fx kan antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronyl-aglycon kompleks AB og/eller faktorer deraf og antibiotikum A 90926 aglycon omdannes til de tilsvarende syre- eller baseadditionssalte ved opløsning af ikke-saltformen 5 i et vandigt opløsningsmiddel og tilsætning af et lille molært overskud af den valgte syre eller base. Den resulterende opløsning eller suspension frysetørres derefter til udvinding af det ønskede salt.

I tilfælde af at det sluttelige salt er uopløseligt 10 i et opløsningsmiddel og ikke-saltformen er opløselig, udvindes det ved filtrering fra den organiske opløsning af ikke-saltformen efter tilsætning af en støkiometrisk mængde eller et svagt molært overskud af den valgte syre eller base.

15 Eksempler på sådanne uopløselige salte er kalcium-, magnesium- og bariumsalt.

Ikke-saltformen kan fremstilles ud fra et tilsvarende syre- eller basesalt opløst i en vandig opløsning, der derefter neutraliseres for at frigøre ikke-saltformen.

20 Når det efter neutralisationen er nødvendigt at eliminere overskud af syre eller base kan der bruges en sædvanlig udsaltningsproces.

Fx kan der hensigtsmæssigt bruges søjlekromatogra-fering på silaniseret silikagel, ikke-funktionaliseret 25 polystyren, akryliske og polydextranharpikser med kontrolleret porestørrelse (fx "Sephadex" ® LH20) eller aktiveret kul. Efter eluering af de uønskede salte med en vandig opløsning elueres det ønskede produkt ved hjælp af en lineær gradient eller en trinvis gradient af en blanding 30 af vand og et polært eller apolært organisk opløsningsmiddel såsom acetonitril/vand fra 50:60 til ca. 100% aceto-nitril.

Som det er kendt i teknikken kan saltdannelse enten med farmaceutisk acceptable syrer (eller baser) eller far-35 maceutisk uacceptable syrer (eller baser) bruges som en hensigtsmæssig rensningsteknik. Efter dannelse og isolering kan saltformen af et A 40926 antibiotikum omdannes DK 167770 B1 17 til den tilsvarende ikke-saltform eller til en farmaceutisk acceptabel saltform.

I nogle tilfælde er et baseadditionssalt af antibiotikum A40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB el-5 ler en faktor deraf og af antibiotikum A 40926 aglycon mere opløseligt i vand og hydrofile opløsningsmidler.

Fremstilling af antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronyl- aglycon og antibiotikum A 40926 aglycon_ 10 Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB, N-acylaminoglucuronylaglycon faktor A, N-acyl-aminoglucuronylaglycon faktor B, antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor BQ, antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor B^ og antibiotikum A 15 40926 aglycon eller et farmaceutisk acceptabelt additions salt deraf fremstilles ud fra antibiotikum A 40926 kompleks eller en enkelt faktor eller en blanding af disse faktorer i et hvilket som helst mængdeforhold, dvs. A 40926 faktor A, A 40926 faktor B, A 40926 faktor PA, A 40926 faktor PB, 20 A 40926 faktor Bq og A 40926 faktor B^, ved kontrolleret sur hydrolyse, idet fremgangsmåden er ejendommelig ved det i krav 3's kendetegnende del angivne.

Denne hydrolyse gennemføres som nævnt i nærværelse af en stærk syre i et passende organisk opløsnings-25 middel. Reaktionstemperaturen kan variere inden for vide grænser; fortrinsvis er den mellem 4°C og 100°C og navnlig mellem 25°C og 80°C.

Reaktionstiden varierer i afhængighed af de særlige reaktionsbetingelser.

30 I almindelighed er reaktionstiden mellem 30 minut ter og 120 timer.

Eftersom reaktionens forløb imidlertid kan overvåges ved TLC eller HPLC, vil den på dette tekniske område sagkyndige person være i stand til at fastslå når hydrolysen 35 af udgangsmaterialet kan anses for fuldført, hvorpå udvindingsprocessen kan sættes igang.

18

Ulv IO///U D I

Egnede organiske opløsninsmidler er således at a) de er i det mindste delvis i stand til at opløseliggøre udgangsmaterialerne; b) produkterne, når de er vundet, enten udskiller sig 5 fra eller kan skilles fra dem ved sædvanlige teknikker, og c) de må i intet tilfælde på ugunstig måde gribe ind i reaktionsforløbet.

Eksempler på sådanne organiske opløsningsmidler er 10 protiske og aprotiske opløsningsmidler såsom C^_4 alkylsulf-oxider, fx dimetylsulfoxid og diætylsulfoxid, alkyl- formamider som fx dimetylformamid og diætylformamid, dio-xan, tetrahydrofuran og lignende opløsningsmidler der naturligvis må være kompatible med den valgte syre.

15 I almindelighed gennemføres hydrolysen i nærværelse af en begrænset mængde vand, fx udgørende 0,1-10 vægt% af reaktionsblandingen. Denne mængde vand kan selvsagt være til stede allerede i udgangsmaterialerne, opløsningsmidlerne og/eller reagenserne, eller den kan om nødvendigt tilsættes 20 ad hoc.

En foretrukken udførelsesform af fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i anvendelse af en blanding af dimetylsulfoxid og koncentreret saltsyre ved en temperatur mellem 40°C og 80°C. Typisk.er mængdeforholdet i blan-25 dingen dimetylsulfoxid/koncentreret saltsyre fra 8:2 til 9,5:0,5. En foretrukken koncentreret saltsyre er 37 vægt% saltsyre.

I almindelighed er reaktionsproduktet en blanding af N-acylaminoglucuronylaglyconer og aglyconen. Ved kontrol 30 af temperaturen og i nogle tilfælde også koncentrationen og styrken af syren er det muligt at dirigere processen, i det mindste i et vist omfang, til dannelse af det ene af de to hovedprodukter, dvs. antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglyconer eller antibiotikum A 40926 aglycon.

35 DK 167770 B1 19 Nærmere betegnet forøges udbytterne af N-acylaminoglucuro-nylaglyconer ved at man holder en forholdsvis lav temperatur, eventuelt nedsætter styrken af syreblandingen og kontrollerer reaktionstiden omhyggeligt, mens der ved for-5 holdsvis højere temperaturer og længere reaktionstider vindes aglyconen alene.

Også i dette tilfælde overvåges reaktionens forløb ved TLC eller fortrinsvis HPLC, og reaktionen kan standses når der er opnået optimal produktion af det øn-10 skede stof for at maximere udbytterne ved den påføldende udvindingsproces.

Når der vindes et produkt som er en blanding af antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglyconer og antibiotikum A 40926 aglycon, kan den adskilles ved kroma-15 tografering såsom væske/væske-kromatografering, flash-kro-matografering, højtryksvæskekromatografering (HPLC) og af f initetskromatografering.

Når der bruges affinitetskromatografering er en fo-retrukken adsorbent et immobiliseret D-alanyl-D-alanin som 20 beskrevet i europæisk patentansøgningspublikation nr.

122969. Særlig foretrækkes agarose-s-aminokaproyl-D-alanyl-D-alanin. Elueringsblandingen er en blanding af en vandig puffer og en saltopløsning. Ved regulering af pH og saltkoncentrationen skiller man antibiotikum A 40926 N-acyl-25 aminoglucuronylaglyconer fra antibiotikum A 40926 aglycon.

En særlig og foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen 'er en fremgangsmåde til overvejende at fremstille antibiotikum A 40926 N-acylamino-glucuronylaglycon kompleks AB eller en faktor deraf, ved 30 hvilken udførelsesform man underkaster antibiotikum A 40926 kompleks eller en enkelt faktor deraf,antibiotikum A 40926 kompleks AB, antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor Bq, antibiotikum A 40926 faktor B^, antibiotikum A 40926 faktor PA el-35 ler antibiotikum A 40926 faktor PB kontrolleret sur hydrolyse med en blanding af et polært aprotisk opløsningsmiddel og en stærk mineralsk eller organisk syre i nærværel- DK 167770 Bl 20 se af en begrænset (0,1-10 vægt%) mængde vand ved en temperatur mellem stuetemperatur og 100°C, fortrinsvis mel lem 40 og 65°C, i en periode på 3-120 timer.

I særlig grad foretrækkes det at hydrolyseblandin-5 gen er en blanding af dimetylsulfoxid og 37%s saltsyre i forholdet fra 9:1 til 9,5:0,5, at temperaturen er 65°C og reaktionstiden 5 timer.

Når udgangsmaterialet til fremstilling af N-acyl-aminoglucuronylaglycon er antibiotikum A 40926 kompleks, 10 vindes der et slutprodukt som stadig er en blanding af faktorer som i det væsentlige svarer til dem i det oprindelige kompleks, mens der når der bruges en enkelt faktor såsom A 40926 faktor A eller faktor B, vindes en enkelt N-acylaminoglucuronylaglyconfaktor, nemlig henholdsvis 15 antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor A og antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor B, Bq eller B^.

Når der vindes et antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB, kan det adskilles i 20 sine enkelte faktorer ved i og for sig kendte teknikker såsom væske/væskekromatografering eller fortrinsvis præparativ HPLC.

En foretrukken fremgangsmåde indbefatter revers-fasevæskekromatografering, fortrinsvis i rustfaste stål-25 kolonner under moderat tryk (5-50 bar) eller ved højt tryk (100-200 bar). Den faste fase kan være en silaniseret silikagel med en kulbrintefase med 2-18 kulstofatomer (navnlig C 18) eller fenylgruppe, mens elueringsmidlet er en blanding af et polært vandblandbart opløsningsmiddel 30 som defineret ovenfor og en vandig puffer ved en pH-værdi som er kompatibel med harpiksen, fortrinsvis pH 4-8.

I særlig grad foretrækkes en lineær gradient-elueringsblanding af et polært vandopløseligt aprotisk opløsningsmiddel udvalgt blandt acetonitril og vandige puf-35 feropløsninger ved pH-værdier mellem 4 og 8, fortrinsvis på ca. 6, såsom en lineær gradient fra 5% til 45% af en blanding acetonitril/fosfatpuffer pH 6 70:30 og en blanding acetonitril/fosfatpuffer pH 6 10:90.

DK 167770 B1 21

En anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er en fremgangsmåde til selektivt at fremstille antibiotikum A 40926 aglycon, og den består i at man underkaster antibiotikum A 40926 kompleks 5 eller en enkelt faktor deraf, antibiotikum A 40926 kompleks AB, antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor PA, antibiotikum A 40926 faktor PB, antibiotikum A 40926 faktor Bq, antibiotikum A 40926 faktor B^, antibiotikum A 40926 man-10 nosyl-aglycon og antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuro-nylaglycon (kompleks AB/eller en enkelt faktor deraf) kontrolleret sur hydrolyse i nærværelse af: et organisk protisk opløsningsmiddel udvalgt blandt alifatiske syrer og α-halogenerede alifatiske syrer som er væsker ved reak-15 tionstemperaturen, alifatiske og cykloalifatiske alkanoler som ved reaktionstemperaturen er væsker som er svagt blandbare med vand, fenylsubstituerede lavere alkanoler hvor fenyldelen eventuelt kan indeholde alkyl-, alko- xy- eller halogenrester og som ved reaktionstemperaturen 20 er væsker der er svagt blandbare med vand, og Ø-polyhalo-generede lavere alkanoler som er væsker ved reaktionstemperaturen, (b) en stærk syre som er forenelig med opløsningsmidlet og udvalgt blandt stærke mineralske syrer, stærke organiske syrer og stærkt sure kationbytterharpik-25 ser i hydrogenformen, og (c) ved en reaktionstemperatur mellem ca. 20°C og ca. 100°C.

Når det protiske opløsningsmiddel er udvalgt blandt alifatiske syrer og α-halogenerede alifatiske syrer, foretrækkes alifatiske syrer med 1-5 kulstofatomer og a-halo-30 generede alifatiske syrer med 2-5 kulstofatomer, men der kan dog med fordel bruges en hvilken som helst alifatisk syre og en hvilken som helst α-halogeneret alifatisk syre som ved reaktionstemperaturen kan opløse udgangsmaterialet i tilstrækkelig grad.

35 Eksempler på syrer som nævnt ovenfor er myresyre, eddikesyre, propionsyre, smørsyre, isosmørsyre, valerianesyre, isovalerianesyre, trimetyleddikesyre, fluoreddike- DK 167770 Bl 22 syre, kloreddikesyre, difluoreddikesyre, dikloreddikesy-re, trifluoreddikesyre, trikloreddikesyre, pentafluorpro-pionsyre, 2,2,3,4,4,4-hexafluorsmørsyre og heptafluorsmøre-syre.

5 Lavtkogende alifatiske syrer såsom eddikesyre og propionsyre eller lavere cc-halogenerede alifatiske syrer såsom kloreddikesyre, dikloreddikesyre, trikloreddikesyre, difluoreddikesyre, klordifluoreddikesyre, trifluoreddikesyre og pentafluorpropionsyre er de foretrukne op-10 løsningsmidler ved en særlig udførelsesform af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Blandt disse opløsningsmidler kan de som har høj syrestyrke samtidig virke både som opløsningsmiddel og som stærk syre der fremmer hydrolysereaktionen, og der behøves derfor ikke nogen yderligere tilsæt-15 ning af en stærk syre for at fremme hydrolysereaktionen.

Til dette formål har trifluoreddikesyre vist sig at være særlig nyttig når den an-vendes i en koncentration mellem 75% og 95% ved en temperatur mellem 60°C og 90°C i en reaktionstid der varierer fra en halv time til 8 timer.

20 I henhold til en ganske særlig foretrukket udførel sesform kan der med fordel anvendes primære og sekundære alkanoler og sekundære cykloalkanoler med 5-10 kulstof atomer som reaktions-opløsningsmiddel ved denne kontrollerede syrehydrolyse. Eksempler på sådanne alkanoler er 1-penta-25 nol, 2-pentanol, 3-pentanol, 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexa-nol, 3,3-dimetyl-1-butanol, 4-metyl-1-pentanol; 3-metyl-1-pentanol, 2,2-dimetyl-3-pentanol, 2,4-dimetyl-3-penta-nol, 4,4-dimetyl-2-pentanol, 5-metyl-2-hexanol, 1-hepta-nol, 2-heptanol, 5-metyl-1-hexanol, 2-ætyl-1-hexanol, 2-30 metyl-3-hexanol, 1-oktanol, 2-oktanol, cyklopentanol, 2-cyklopentylætanol, 3-cyklopentyl-1-propanol, cyklohexanol, cykloheptanol, cyklooktanol, 2,3-dimetylcyklohexanol, 4-ætylcyklohexnaol, cyklooktylmetanol, 6-metyl-5-hepten-2-ol, 1-nonanol, 2-nonanol, 1-dekanol, 2-dekanol og 3-dekanol. 35 Eksempler på egnede fenylsubstituerede lavere alka noler er benzylalkohol, m-klorbenzylalkohol, o-fluorbenzyl-alkohol, m-fluorbenzylalkohol, p-fluorbenzylalkohol, m- DK 167770 B1 23 metylbenzylalkohol, m-metoxybenzylalkohol, o-ætoxybenzyl-alkohol, m-butoxybenzylalkohol, p-tert.butoxybenzylalko-hol, p-tert.butylbenzylalkohol, fenætylalkohol, o-klorfen-ætylalkohol, m-klorfenætylalkohol, o-metoxyfenætylalkohol, 5 m-metoxyfenætylalkohol, o-propylfenætylalkohol, o-ætoxyfen- ætylalkohol, p-fluorfenætylalkohol, p-bromfenætylalkohol, o-propoxyfenætylalkohol, o-butoxyfenætylalkohol, 1-(p-iso-propylfenyl)-ætanol, 3-fenyl-1-propanol, 2-fenyl-1-propanol, 4-fenyl-l-butanol og 3-fenyl-1-butanol.

10 Når det organiske protiske opløsningsmiddel er ud valgt blandt j3-polyhalogenerede lavere alkanoler som er væsker ved reaktionstemperaturen, foretrækkes /3-klor- og/ eller fluor-substituerede alkanoler med 1-4 kulstofatomer. Eksempler på disse β-polyhalogenerede lavere alkanoler er 15 diklorætanol, triklorætanol, diklorfluorætanol, difluor-klorætanol, difluorætanol, trifluorætanol, 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol, 2,2,3,4,4,4-hexafluorbutanol og 2,2,3,3,4,4,4-heptafluorbutanol.

Foretrukne hydrolysebetingelser til fremstilling 20 af antibiotikum A 40926 aglycon er en kontrolleret hydrolyse med en blanding af et polært aprotisk opløsningsmiddel og en stærk mineralsk eller organisk syre i nærværelse af en begrænset mængde (0,1-10 vægt%) vand ved en temperatur mellem 40°C og 100°C og fortrinsvis mellem 65°C og 90°C 25 i en periode på 1-4 timer.

I særlig grad foretrækkes det at hydrolyseblandingen er en blanding af dimetylsulfoxid og 37%s saltsyre i forholdet fra 8:2 til 9,5:0,5, at temperaturen er ca. 80°C og reaktionstiden ca. 3 timer.

30 Som nævnt foran omdannes under disse betingelser også antibiotikum A 40926 mannosylaglycon og antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon (kompleks AB eller en enkelt faktor deraf), der er produkterne af en partiel hydrolyse af sukkerdelene i antibiotikum A 40926 kompleks 35 (eller en enkelt faktor deraf eller en blanding af disse faktorer) til antibiotikum A 40926 aglycon.

DK 167770 B1 24

Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB og de enkelte faktorer A, B, Bq og B^ samt antibiotikum A 40926 aglycon er virksomme mod grampositive bakterier som er ansvarlige for mange vidt udbredte in-5 fektioner. På grund af den stigende resistens mod disse patogener over for de sædvanlige terapeutiske behandlinger er behovet for nye antibiotiske stoffer stadig stort.

I almindelighed kan, til den antibakterielle behandling, antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon 10 kompleks AB, en faktor deraf og/eller antibiotikum A 40926 aglycon såvel som de ugiftige, farmaceutisk acceptable salte deraf eller blandinger deraf indgives ad forskellige indgiftsveje og fx bruges topisk (lokalt) eller parente-ralt. Den parenterale indgift er i almindelighed den fore-15 trukne administrationsmåde.

Et farmaceutisk præparat ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder en forbindelse ifølge opfindelsen i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer. Endelig er anvendelsen ifølge opfindelsen af de omhandlede 20 forbindelser til fremstilling af et medikament til antibiotisk terapi.

Præparater til injektion kan have sådanne former som suspension, opløsninger eller emulsioner i olieagtige eller vandige bærevæsker og de kan indeholde adjuvanser 25 såsom suspenderingsmidler, stabiliseringsmidler og/eller dispergeringsmidler.

Den virksomme bestanddel kan også være i pulverform til rekonstitution på brugstidspunktet ved tilsætning af et passende bærestof såsom sterilt vand dertil.

30 I afhængighed af indgiftvejen kan disse forbindel ser oparbejdes i forskellige dosisformer.

I nogle tilfælde kan det være muligt at oparbejde forbindelserne ifølge opfindelsen i tarmovertrukne dosisformer til oral indgift, og de kan fremstilles på kendt 35 måde (se fx "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. udgave, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, side 1614).

DK 167770 B1 25

Dette kan navnlig være tilfældet når absorption af det antimikrobielle stof i tarmkanalen ønskes i særlig grad, mens stoffet passerer uændret gennem maven.

Den mængde virksomt stof der skal indgives afhænger 5 af forskellige faktorer såsom størrelsen og tilstanden af det individ der skal behandles, indgiftvejen og indgiftens hyppighed og sygdommens årsag.

De antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen, nemlig antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglyconer og 10 antibiotikum A 40926 aglycon og fysiologisk acceptable salte deraf, er i almindelighed effektive ved en dagsdosis på mellem 0,5 og 50 mg virksomt stof pr. kg af patientens legemsvægt, eventuelt opdelt i 1-4 deldoser om dagen.

15 Særlig hensigtsmæssigt præparater er sådanne der fremstilles i dosisenheder indeholdende fra ca. 100 til ca. 5000 mg pr. enhed.

Præparater med forlænget eller forsinket virkning kan fremstilles på basis af forskellige mekanismer og me-20 toder som kendt i farmacien.

En foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af et præparat med langvarig virkning og indeholdende antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon eller antibiotikum A 40926 aglycon indebærer anvendelse af en 25 vanduopløselig form for vedkommende antibiotikum, suspenderet i et vandigt eller olieagtigt medium.

Fremstilling af farmaceutiske præparater

En enhedsdosisform til intramuskulær injektion frem-30 stilles med 5 ml steril suspension USP indeholdende 8% pro-pylenglykol og 500 mg af et fysiologisk acceptabelt baseadditionssalt af antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB.

En enhedsdosisform til intramuskulær injektion 35 fremstilles med 5 ml steril suspension USP indeholdende 8% propylenglykol og 500 mg af et fysiologisk acceptabelt baseadditionssalt af antibiotikum A 40926 N-acylamino-glucuronylaglycon faktor A.

26

Ulv IO///U D I

En enhedsdosisform til intramuskulær injektion fremstilles med 5 ml steril suspension USP indeholdende 8% propylenglykol og 500 mg af et fysiologisk baseadditionssalt af antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylagly-5 con faktor B.

En enhedsdosisform til intramuskulær injektion fremstilles med 1000 mg antibiotikum A 40926 N-acylamino-glucuronylaglyconer i vanduopløselig syreform, suspenderet i 5 ml sterilt vand til injektion.

10

De antibiotiske stoffer ifølge den foreliggende opfindelse er desuden nyttige til at undertrykke væksten af Clostridium difficile, der bevirker pseudomembranes colitis i tarmen. Disse antibiotika kan således bruges til be-15 handling af pseudomembranes colitis ved oral indgift af en effektiv dosis af et af disse antibiotika eller farmaceutisk acceptable salte deraf, fremstillet i farmaceutisk acceptabel dosisform-. Til denne anvendelse kan disse antibiotika indgives i gelatinekapsler eller i en fly-20 dende suspension.

Foruden deres aktivitet som medikamenter kan antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglyconer og antibiotikum A 40926 aglycon og de farmaceutisk acceptable salte deraf bruges til fremme af dyrs vækst.

25 Til dette formål indgives en forbindelse ifølge op findelsen oralt i et passende foder. Den præcise koncentration der bruges er den som behøves til at sikre at det virksomme middel indtages i en til fremme af væksten effektiv mængde når der fortæres normale mængder foder.

30 Tilsætning af en virksom forbindelse ifølge opfin delsen til dyrefoder foretages fortrinsvis ved at man tilbereder en passende foder-forblanding indeholdende den virksomme forbindelse i en effektiv mængde og inkorporerer forblandingen i den fuldstændige foderration.

35 Man kan også blande et mellemprodukt i form af et koncentrat eller et fodersupplement indeholdende det virksomme stof i foderet.

DK 167770 B1 27

De måder på hvilke sådanne foder-forblandinger og fuldstændige rationer kan tilberedes og indgives er beskrevet i opslagsværker (fx "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and CO., San Fransicso, USA, 1969, eller "Live-5 stock Feeds and Feeding", 0 and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977), og der henvises til dem.

Beskrivelse og fremstilling af A 40926-udgangsmaterialerne Produktionen af antibiotikum A 40926 kompleks, 1 0 antibiotikum A 40926 faktor A, faktor B, faktor Bq, faktor PA eller faktor PB sker ved at man dyrker en art af Acti- nomadura med evne til at danne en sådan forbindelse, nemlig Actinomadura sp. ATCC 39727 eller en antibiotikum A 40926-producerende variant eller mutant deraf under 1 5 aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganiske salte. Mange af de næringsmedier der sædvanligt .anvendes i gæringsteknikken kan bruges, men visse medier foretrækkes. Foretrukne kulstofkilder er glukose, mannose, galaktose, 20 stivelse, majsmel og lignende stoffer. Foretrukne nitrogenkilder er ammoniak, nitrater, sojabønnemel, pepton, kødekstrakt, gærekstrakt, trypton, aminosyrer og lignende substanser. Blandt de uorganiske salte der kan inkorporeres i næringsmedierne er de sædvanlige opløselige salte 25 med evne til at udvikle natrium-, kalium-, jern-, zink-, kobolt-, magnesium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbonat-, sulfat-, fosfat-, nitrat- og lignende ioner.

I almindelighed for-dyrkes den antibiotikumproducerende stamme i en rystekolbe hvorpå kulturen bruges til podning af krukkefermentorer til produktion af væsentlige mængder af de antibiotiske stoffer. Det medium der bruges til forkulturen kan være det samme som bruges til gæringer 35 DK i67//U bl 28 i større målestok, men der kan også bruges andre medier.

Den antibiotikum A 40926-producerende stamme kan dyrkes ved temperaturer mellem 20 og 40°C, fortrinsvis mellem 24 og 35°C. Under gæringen kan antibiotikumproduktionen t- overvåges ved afprøvning af prøver af gæringssuppe eller mycelieekstrakt for antibiotisk aktivitet, fx ved biobe-stammelse eller TLC- eller HPLC-metoder.

Organismer der er følsomme for antibiotikum A 40926 såsom Bacillus subtilis og S. aureus kan bruges som test-organismer. Biobedømmelsen udføres hensigtsmæssigt ved agardiffusionsmetoden på agarplader. Den maksimale produktion af antibiotisk aktivitet indtræder i almindelighed mellem gæringens anden og femte dag.

Antibiotikum A 40926 produceres ved dyrkning af stammen Actinomadura sp. ATCC 39727 eller en antibiotikum A 40926-producerende mutant eller variant deraf og findes hovedsagelig i dyrkningsmediet.

Egenskaberne af Actinomadura sp. A 40926 ATCC 39727 beskrives nærmere i det følgende.

20

Makroskopisk og mikroskopisk undersøgelse

Det vegetative mycelium er sammensat af bølgede og grenede hyfer (diameter ca. 0,8 pm) der på nogle medier, identificeret ved en asterisk i tabel I, har en svag ten-^ dens til at blive fragmenteret til stavlignende elementer efter flere dages dyrkning, mens det på glukose-aspa-ragin-medium fragmenterer til coccoide elementer.

Karakteristisk for denne stamme er det vegetative myceliums bourgognefarve på nogle medier.

Luftmycelium forekommer kun i få medier; blandt 30 dem der er anført i tabel I forekommer det specielt kun på havremelsagar og jordbundsagar. På disse medier er luftmyceliet hvidgråt og danner sporoforer der er anbragt i hager og korte spiraler med omkring 10-20 sporer.

Sporerne er cylindriske og har en gennemsnitlig størrelse på 0,8 x 1,2 pm.

DK 167770 B1 29

Bestemmelse af vækstkarakterer

Til undersøgelse af kulturkaraktererne blev Actino-madura sp. ATCC 39727 dyrket på forskellige standardmedier som foreslået af Shirling og Gottlieb (E.B. Shirling 5 og D. Gottlieb, 1966 - Method for characterization of

Streptomyces species - Int. J. Syst. Bacteriol, JL6, 313-340) med tilføjelse af flere medier anbefalet af Waksman (S.A. Waksman, 1961, The Actinomycetes, The Williams and Wilkins Co., Baltimore; bind 2, 328-334).

1q Farvebestemmelse skete hvor nødvendigt ved den metode der er angivet af Maerz og Paul (A. Maerz og M.

Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2nd Edition McGraw-Hill Book Company Inc., New York).

Organismens evne til at udnytte forskellige kulstof-kilder undersøgtes ved den metode der er beskrevet af Shirling og Gottlieb.

Kulturkaraktererne og de fysiologiske karakterer samt udnyttelse af kulstofkilder er anført i tabellerne I, II og III.

2g Resultaterne i tabel I er opnoteret efter to ugers inkubering ved 28°C.

Tabel III

Kulturkarakterer hos stammen Actinomadura sp. ATCC 39727 25 -

Kulturmedium Karakterer

Medium nr. 2 (gæreks- Rigelig vækst med skorpet over- trakt-maltagar) flade, 8/L/8, spor af ravfarvet ^ til lyserødt opløseligt pigment

Medium nr. 3 (havre- Rigelig vækst med glat overflade, melsagar) violet, 55/E/4, luftmycelium me get sparsomt, gråt, opløseligt pigment violet 55/H/4 35 Medium nr. 4 (uorgani- Moderat vækst med glat og tynd ske salte-stivelses- overflade, flødefarvet 10/D/2 agar) DK 167770 ΒΊ 30

Tabel III (fortsat)

Kulturmedium Karakterer 5 Medium nr. 5 (glyce- Moderat vækst med glat og tynd rol-asparaginagar) overflade, abrikosfarvet 10/B/2

Medium nr. 6 (pepton- Moderat vækst med svagt skorpet gærekstrakt-jernagar) overflade, ravfarvet 12/D/9

Medium nr. 7 (tyrosin- Rigelig vækst med glat og tynd ^ agar) overflade, ravfarvet-brun 13/K/12

Havremelsagarx Rigelig vækst med glat overflade, bourgognefarvet 8/L/7, luftmycelium moderat lysegul-gråt 44/B/2 15 Hickey og Tresners Rigelig vækst med rynket overflaagar3* de, ravfarvet-brun 13/K/12

Czapecks glukoseagar Moderat vækst med glat overflade, lysegul 9/1/3 y

Glukose-asparagmagar Sparsom vækst med flødefarvet overflade, strågul 9/E/l Næringsagar Rigelig vækst med rynket overfla de , lysorange ll/C/7

Kartoffelagar Rigelig vækst med rynket overfla- 25 de, bourgognefarvet 8/L/9

Bennetts agarx Rigelig vækst med skorpet over flade, bourgognefarvet 8/L/8, opløseligt pigment dybt ravfarvet- rosa 5/J/10 30

Kalciummalatagar Moderat vækst med glat overflade, abrikosfarvet 10/B/3

Skummetmælksagar Rigelig vækst med svagt rynket overflade, orangefarvet 9/B/9 35

Czapecks sakkaroseagar Rigelig vækst med glat overflade, abrikosfarvet 10/B/6 DK 167770 B1 31

Tabel m (fortsat)

Kulturmedium Karakterer Ægalbuminagar Rigelig vækst med glat overflade, 5 rosa 52/B/3, spor af opløseligt pigment, rosa 52/B/3

Sabourauds agar Ingen vækst

Jordbundsagar' Sparsom vækst, farveløs, hvid- 10 gråt luftmycelium

Dextrosetryptonagarx Moderat vækst med glat og tynd overflade, lysegul 10/G/2

Kartoffelstykker Rigelig vækst, orange-brun, spor 15 af hvidgråt luftmycelium

Tabel IV

Fysiologiske karakterer 2 q Prøve Resultat

Stivelseshydrolyse negativ H2S-dannelse negativ på medium nr. 6 positiv med blyacetatstrimler 25 Tyrosinreaktion positiv

Caseinhydrolyse positiv

Kalciummalathydrolyse negativ

Gelatinesmeltning positiv

Lakmusmælk, koagulering negativ 2Q lakmusmælk, peptonise- ring positiv

Cellulosenedbrydning negativ

Nitratreduktion positiv 35 DK Ί67770 Bl 32

Tabel V

Udnyttelse af kulstofkilder

Kulstofkilde Vækst 5

Arabinose +

Xylose +

Mannose +

Fruktose + ^ q Raffinose +

Rhamnose +

Glukose +

Laktose +

Galaktose + „_ Inositol - 15

Sakkarose +

Cellulose -

Salicin +

Mannitol + 20 Rlb°Se_- + - vækst - - ingen vækst _ Kemotaxonomiske karakterer 25 -

Analyse af i cellevæggen tilstedeværende aminosyrer udførtes ved de metoder der er beskrevet i Becker et al: "Rapid differentation between Nocardia and Streptomyces 30 by paper chromatography of whole cell hydrolysates”, Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964). Analysen af hydrolyserede hele celler viste tilstedeværelse af meso-diaminopimelinsy-re.

Analysen af den rene cellevæg, der opnåedes ved 35 den metode der er angivet af Kawamoto et al. (I. Kawamoto, T. Oka og T. Nara, "Cell-wall composition of Micromono-spora olivoasterospora, Micromonospora sagamiensis, and DK 167770 Bl 33 related organism", J. of Bacteriology 146, 527-534, 1981) viste fravær af glycin.

Sukkeranalyse 5 Analysen af sukkerindholdet udførtes ved den metode der er angivet af M.P. Lechevalier, "Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance", J. Lab.

Clin. Med. 71, 934-944 (1968) under anvendelse af tynd-lagskromatograf iske celluloseark som beskrevet af J.L.

10 Staneck og G.D. Roberts, "Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography", 28, 226-231 (1974) med følgende opløsningsmiddelsystem: ætylacetat/pyridin/vand 100:35:25 (rumfang).

De opnåede resultater viste tilstedeværelse af i hoved-15 sagen glukose og ribose, mens der også konstateredes mindre mængder galaktose, mannose og madurose (3-0-metyl-D-galaktose).

Mycolinsyrer 0 Π

En prøve til opdagelse af tilstedeværelse af myco-linsyrerudførtes ved følgende metode ifølge Minnikin et al. (D.E. Minnikin, L. Alshamaony og M. Goodfellow, "Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin layer chromatography analysis of whole 25 organism methanolysates", Journal of General Microbiology 88, 200-204, 1975). Resultaterne af denne prøve var negative, der fandtes ikke mycolinsyrer.

Stammens identitet 50 Stammen henføres til actinomycetslægten Actinomadura på grund af tilstedeværelsen af mesodiaminopimelinsyre og madurose, manglen på glycin i peptodoglykan, manglen på mycolinsyrer og dannelse af luftmycelium med moderat lange sporekæder.

35 DK 16///U bl 34

Som med andre mikroorganismer undergår den A 40926-producerende stammes karakterer nogen variation.

Fx kan der vindes kunstige varieteter og mutanter af stammen ved behandling med forskellige kendte mutagener ^ såsom ultraviolette stråler, røntgenstråler, højfrekvente stråler, radioaktive stråler og kemkalier såsom salpetersyrling, N-metyl-Ν'-nitro-N-nitrosoguanidin og mange andre. Alle naturlige og kunstige varieteter og mutanter som hører til den foreliggende art af slægten Actinomadu-^q ra og danner A 40926-antibiotika anses for ækvivalente med stammen Actinomadura sp. ATCC 39727 og anses for at ligge inden for opfindelsens rammer.

Udvindingen af de antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen fra gæringssuppen med den producerende mikroor-ganisme udføres ved i og for sig kendte teknikker som indbefatter ekstraktion med opløsningsmidler, fældning ved tilsætning af ikke-opløsningsmidler eller ved ændring af opløsningens pH-værdi, fordelingskromatografering, reversfase-fordelingskromatografering, ionbytterkromato-grafering, affinitetskromatografering og lignende metoder.

& U

En foretrukken fremgangsmåde indbefatter en affini-nitetskromatografering på immobiliseret D-alanyl-D-alanin efterfulgt af reversfase-søjlekromatografering.

Immobiliserede D-alanyl-D-alanin-matrixer som egner sig til den foreliggende udvindingsproces er angivet 25 i europæisk patentansøgning nr. 83112555. Den foretrukne matrix ved den foreliggende fremgangsmåde er D-alanyl-D-alanin koblet med tværbundet polydextran med kontrolleret porestørrelse.

Gæringssuppen kan underkastes affinitetskromatogra-feringen direkte efter filtrering eller efter en indledende rensningsprocedure. Sidstnævnte procedure omfatter at man gør hele gæringsmassen basisk, fortrinsvis til mellem pH 8,5 og 10,5, for at opløseliggøre det antibiotiske stof som er adsorberet på myceliet, og derefter 35 filtrerer det. Det klare filtrat bringes til pH 2,5-4,5 og filtreres på ny i nærværelse af et filterhjælpemiddel.

DK 167770 B1 35

Dette filtrat kasseres mens den udvundne filterkage suspenderes i vand, gøres basisk fortrinsvis til en pH-værdi mellem 8 og 9 og filtreres. Filterkagen underkastes på ny samme procedure mens filtraterne, der indeholder anti-5 biotikum A 40926, forenes.

Disse filtrater eller de filtrerede gæringssupper underkastes derefter affinitetskromatografering på immo-biliseret D-alanyl-D-alanin, enten i kolonne eller portionsvis.

1Q Bindingen af det antibiotiske stof til affinitets matrixen udføres fortrinsvis ved en pH-værdi på omkring 7,0-8,0, og eluering udføres ved mere basiske pH-værdier (fortrinsvis mellem 9,0 og 10,5) ved hjælp af en vandig base. Denne vandige base kan være ammoniak, en flygtig .jt- amin, et alkali eller et alkalimetalhydroxyd eller en basisk pufret opløsning, eventuelt i nærværelse af et polært organisk opløsningsmiddel såsom et polært vandblandbart opløsningsmiddel som defineret nedenfor-

Efter fjernelse af urenheder ved skylriing af ko-2Q lonnen med en vandig puffer pH 4-8, eventuelt indeholdende salte, urinstof og/eller vandblandbare opløsningsmidler, elueres antibiotikum A 40926 med ovennævnte elueringsblan-ding. Det rå antibiotiske stof udvindes derefter fortrinsvis ved fjernelse af vand fra de forenede antibiotikumhol-22 dige fraktioner ved azeotrop destillation med et organisk opløsningsmiddel med evne til at danne minimumsazeotrope blandinger med vand, efterfulgt af tilsætning af ét ikke-opløsningsmiddel for at udfælde det ønskede produkt.

Repræsentative eksempler på organiske opløsnings-midler med evne til at danne minimumsazeotrope blandinger med vand er n-butanol, benzen, toluen, butylæter, kulstof tetraklorid, kloroform, cyklohexan, 2,5-dimetylfuran, hexan og m-xylen; det foretrukne opløsningsmiddel er n-butanol.

^ Eksempler på ikke-opløsningsmidler er petroleums æter, lavere alkylætere såsom ætylæter, propylæter og butylæter samt lavere alkylketoner såsom acetone. De for- DK 167770 Bl 36 enede antibiotikumholdige fraktioner kan også koncentreres til et lille rumfang, fortrinsvis ved azeotrop destillation med et organisk opløsningsmiddel som defineret ovenfor, hvorpå den resulterende vandige opløsning frysetørres . Hvis den vandige base scm anvendes ved elueringen ikke 5 er flygtig, kan det være nødvendigt at neutralisere og afsalte koncentratet før udfældning eller frysetørring.

En hensigtsmæssig afsaltningsprocedure indebærer at man overfører den antibiotikumholdige vandige opløs-ning til en silaniseret silikagelkolonne, vasker med destilleret vand og eluerer med en blanding af et polært vandblandbart opløsningsmiddel og vand.

Repræsentative eksempler på polære vandblandbare opløsningsmidler er vandopløselige alkoholer (fx metanol, ætanol, isopropanol og n-butanol), acetone, acetonitril, 15 lavere alkylalkanoater (fx ætylacetat), tetrahydrofuran, dioxan og dimetylformamid samt blandinger deraf; det foretrukne polære vandblandbare opløsningsmiddel er acetonitril.

Afsaltningen kan eventuelt også udføres ved at man overfører den antibiotikumholdige opløsning til den foran beskrevne affinitetskolonne, vasker med destilleret vand og eluerer med en flygtig vandig base som beskrevet ovenfor til eluering i affinitetskromatograferingen.

Det således vundne produkt er antibiotikum A

25 40926 kompleks. Om nødvendigt kan det renses yderligere elir som sådant underkastes adskillelse af dets faktorer A, B, Bg, PA og PB.

En hensigtsmæssig fremgangsmåde til udvinding af et rent antibiotikum A 40926 kompleks består i en yderlige-30 re rensning af komplekset, vundet som beskrevet ovenfor, på en affinitetskromatograferingskolonne. Der bruges i almindelighed samme stationære fase som ovenfor (immobi-liseret D-alanyl-D-alanin), og det ønskede antibiotiske stof elueres ved at man følger den affinitetskromatogra-^ feringsprocedure på immoboliseret D-alanyl-D-alanin, der er beskrevet foran. En foretrukket immobiliseret D-alanyl- DK 167770 B1 37 D-alanin er "Sepharose" ® -ε-aminokaproyl-D-alanyl-D-alanin og en foretrukken ækvilibreringsblanding er 0,161 v/r (vægt/rumfang, dvs. forholdet mellem faststof og væske som mellem g og ml) ammoniak indeholdende 2M NaCl regule-5 ret til pH 7-8 og en foretrukken skylleopløsning er 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 8-9,5 mens en foretrukken elueringsblanding er 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 10,5-12 idet en særlig foretrukken elueringsblanding er ovennævnte •jq blanding reguleret til pH 11,5.

Antibiotikum A 40926-faktorerne, nemlig antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor BQ, antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB isoleres fra en van-dig opløsning af antibiotikum A 40926 kompleks ved søjle-kromatografering og fortrinsvis ved reversfase-søjlekro-matografering. Den foretrukne stationære fase i-tilfælde af reversfase-søjlekromatografering er silaniseret silika-gel. Der kan imidlertid også opnås gode resultater ved 2q søjlekromatografering på ikke-funktionaliserede polystyrenharpikser og akryliske harpikser såsom dem der sælges under varemærkerne "Amberiite" ® XAD-2, XAD-4, XAD-7 og XAD-8 (fra Rohm og Haas) eller "Diaion" HP 20 (Mitsubishi). I tilfælde af at reversfase-rensningstrinnet ud-25 føres ved hjælp af en silaniseret silikagel som den stationære fase for-ækvilibreres kolonnen fortrinsvis med en pufret vandig opløsning ved pH mellem 4 og 9 og fortrinsvis mellem 5,5 og 6,5, og derefter elueres der med en lineær gradient af et polært vandblandbart opløsnings-2Q middel i samme pufrede opløsning. Repræsentative eksempler på polære vandblandbare opløsningsmidler er vandopløselige alkoholer (fx metanol, ætanol, isopropanol og n-butanol), acetone, acetonitril, tetrahydrofuran, dioxan, dimetyl-formamid og blandinger deraf; det foretrukne polære vand-^ blandbare opløsningsmiddel er acetonitril.

De eluerede fraktioner bestemmes med hensyn til antibiotikumindhold ved hjælp af de sædvanlige biobestem- DK 167770 Bl 38 melsesmetoder såsom papirskivebestemmelser eller agardif-fusionsbestemmelser på følsomme mikroorganismer. Eksempler på følsomme organismer er Bacillus subtilis og S. aureus.

Kromatograferingen kan også hensigtsmæssigt over-5 våges ved TLC- eller HPLC-teknikker.

En foretrukken HPLC-teknik repræsenteres af en reversfase-HPLC under anvendelse af en kolonne af porøse og kugleformede partikler af silaniseret silikagel i henhold til den fremgangsmåde der er beskrevet oven-10 for i forbindelser med HPLC-fremgangsmåder til analyse af antibiotika hørende til A 40926 gruppen.

Fraktioner med ensartet antibiotikumindhold forenes og afsaltes som beskrevet ovenfor til frembringelse af i det væsentlige rent antibiotikum A 40926 faktor Af fak-15 tor B, faktor Bq, faktor PA og faktor PB.

I det væsentlige rent antibiotikum A 40926 faktor A og antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor BQ, antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB vindes fra de fraktioner der indeholder 2q dem ved hjælp af forskellige kendte teknikker såsom frysetørring, udfældning ved hjælp af ikke-opløsningsmidler eller udfældning ved ændring af pH-værdien af den vandige opløsning.

En hensigtsmæssig fremgangsmåde indbefatter tilsæt-2^ ning af et opløsningsmiddel med evne til at danne azeotrope blandinger med vand, fjernelse af vandet ved azeotrop destillation og derefter ved filtrering opsamle det bundfald der vindes ved tilsætning af et ikke-opløsningsmid-del såsom de ovenfor beskrevne.

2Q Antibiotikum A 40926 faktorerne PA og PB er, i det mindste under visse gæringsbetingelser, de antibiotiske hovedprodukter af den A 40926-producerende mikroorganisme. Antibiotikum A 40926 faktorerne A og B er i hovedsagen omdannelsesprodukter af henholdsvis antibiotikum 25 A 40926 faktor PA og faktor PB og er ofte allerede til stede i gæringssuppen.

Det har faktisk vist sig at antibiotikum A 40926 faktor PA kan omdannes til antibiotikum A 40926 faktor DK 167770 Bl 39 A og antibiotikum A 40926 faktor PB og kan omdannes til antibiotikum A 40926 faktor B under basiske betingelser.

Fx omdannes antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB til antibiotikum A 40926 henholdsvis 5 faktor A og faktor B ved behandling med 0,5-10% ammoniakvand eller andre nukleofile baser som fx en organisk amin ved stuetemperatur i 8-24 timer.

Som følge heraf vil der, når gæringssuppen eller en antibiotikum A 40926-holdig ekstrakt eller et koncentrat 10 henstår en vis tid under basiske betingelser (fx en vandig opløsning af en nukleofil base ved en pH-værdi på over 9 natten over), vindes et antibiotikum A 40926-kompleks som er beriget med hensyn til antibiotikum A 40926 faktor A og faktor B. Hvis den periode under hvilken gæringssup-15 pen, ekstrakten eller koncentratet deraf er udsat for det basiske miljø er kort, vindes der et antibiotikum A 40926-kompleks som er beriget med hensyn til antibiotikum A 40926 faktor PA og faktor PB.

En foretrukken fremgangsmåde til opnåelse af et 20 antibiotikum A 40926-kompleks der er beriget med hensyn til faktor A og faktor B omfatter derfor den forholdsregel at man lader opløsningen af antibiotikum A 40926 kompleks (der hovedsagelig indeholder antibiotikum A 40926 faktorer PA og PB) ved stuetemperatur i 8-12 timer i en vandig nu-25 kleofil base såsom ammoniakvand, hvorpå man isolerer det ønskede antibiotikum-kompleks som beskrevet ovenfor.

Eksempler på A 40926-holdige opløsninger er gæringssupper, ekstrakter og fraktioner elueret ved affinitets-kromatografering.

3q Rent antibiotikum A 40926 kan vindes ved yderlige re rensning af det rå kompleks ved affinitetskromatogra-fering som beskrevet foran.

Det således vundne produkt, der har biologiske og fysisk-kemiske egenskaber som kan afledes af de rene 33 faktorer deraf, vil i eksemplerne blive benævnt antibiotikum A 40926 kompleks AB.

En foretrukken fremgangsmåde til berigelse af et antibiotikum A 40926-komplekspræparat med hensyn til fak- DK 167770 bl 40 torerne PA og PB indbefatter at man hurtigt neutraliserer de ved affinitetskromatografering eluerede fraktioner med en syre, fortrinsvis en mineralsk syre såsom svovlsyre eller saltsyre.

Isolering af rent antibiotikum A 40926 faktorer PA og PB fra dette kompleks kan opnås ved hjælp af en af de ovenfor beskrevne procedurer.

En foretrukken fremgangsmåde indbefatter revers-fase-væskekromatografering, fortrinsvis i kolonner af rustfrit stål under moderat tryk (5-50 bar) eller ved højere 10 tryk (100-200 bar). Den faste fase kan være en silanise-ret silikagel med en kulbrintefase med 2-18 kulstofatomer (især foretrukket C 18) eller en fenylgruppe, og elue-ringsmidlet er en blanding af et polært vandblandbart opløsningsmiddel som defineret foran og en vandig puffer 15 ved en pH-værdi som er forenelig med harpiksen (fortrinsvis pH 4-8).

Elueringen overvåges på sædvanlig måde og de fraktioner som har homogent antibiotikumindhold forenes og behandles som beskrevet ovenfor til isolering af de rene 20 forbindelser med de rene forbindelser med de nedenfor angivne karakteristika.

Sofistikeret HPLC-analyse har vist at antibiotikum A 40926 faktor B faktisk er en blanding af to faktorer der benævnes faktor Bn og faktor B..

25 U 1

Antibiotikum A 40926 faktor Bg, der tegner sig for ca. 90% af antibiotikum A 40926 faktor B, er den faktor som har R^ på 1,22 i forhold til teicoplanin A^ komponent 2 i det system der er beskrevet nedenfor under punkt D med hensyn til fysisk-kemiske karakterer for fak-^ tor B, mens faktor B^, der tegner sig for ca. 10% af antibiotikum A 40926 faktor B, er den faktor med den relative Rt~værdi på 1,27 i samme system.

Rent antibiotikum A 40926 faktor Bg vindes ved yderligere rensning af antibiotikum A 40926 faktor B fx

O C

ved gentagelse af den reversfase-kromatograferingsproce-dure der er anvendt til isolering deraf.

DK 167770 B1 41

De fysisk-kemiske og biologiske egenskaber af antibiotikum A 40926 faktor Bg er i det væsentlige identiske med dem for antibiotikum A 40926 faktor B, med den forskel at HPLC-analysen i et system som det ovenfor citerede 5 kun udviser én top (Rt = 1,22 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 i det beskrevne HPLC-system).

På grund af de ovenfor angivne ligheder mellem antibiotikum A 40926 faktor B og antibiotikum A 40926 faktor Bg gælder det i nærværende beskrivelse med tilhø-10 rende krav at henvisning til biologiske egenskaber af antibiotikum A 40926 faktor B skal forstås' som refererende også til antibiotikum A 40926 faktor Bg som er hovedkomponenten (ca. 90%) af antibiotikum A 40926 faktor B og i hovedsagen bidrager til dets biologiske egenskaber.

15 De antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen kan også isoleres fra gæringssuppen eller yderligere renses med stærke eller svage anionbytterharpikser, herunder funktionaliserede polystyren-, akryliske eller polydextran-matrixer. Eksempler på svage anionbytterharpikser er dem 20 der sælges under følgende varemærker: "Dowex" ® MWA-1 eller WGR (Dow Chemical), "Amberlite" ® IRA-73 (Rohm and (S)

Haas), DEAE-"Sephadex" w (Pharmacia). Eksempler på stærke anionbytterharpikser som kan bruges i henhold til opfindelsen indbefatter dem der sælges under følgende handels-25 navne: "Dowex” ® MSA-1, SBR, SBR-P (Dow Chemical), "Amberlite" ® IR-904 (Rohm and Haas) og QAE-"Sephadex" ® (Pharmacia).

Eluering af de antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen fra disse harpikser udføres ved hjælp af lineære gra-3Q dientblandinger af vandige opløsninger af elektrolytter såsom natrium- eller kaliumhydroklorider, i vand eller blandinger af vand og et vandblandbart opløsningsmiddel såsom en låvtkogende alkohol (fx en alkanol) eller en låvtkogende alkylketon, fx acetone.

35 DK 167770 Bl 42

Antibiotikum A 40926 mannosylaglycon fremstilles ved hydrolyse af antibiotikum A 40926 kompleks som er beriget med hensyn til faktor A og faktor B, antibiotikum A 40926 faktor A, faktor B, faktor Bg eller blandinger deraf 5 under kontrollerede sure betingelser.

Disse kontrollerede sure betingelser kan fx være en koncentreret vandig opløsning af en mineralsk eller organisk stærk syre, eventuelt i nærværelse af et aprotisk organisk opløsningsmiddel. Foretrukne eksempler på stærke 10 mineralske syrer er svovlsyre og fosforsyre.

En foretrukken stærk organisk syre er trifluroed-dikesyre.

Foretrukne aprotiske organiske opløsningsmidler er alicykliske eller cykliske alkylætere såsom dioxan og te-15 trahydrofuran, lavere alkylsulfoxider såsom dimetylsulf-oxid og lavere alkylamider som fx dimetylformamid.

Reaktionstemperaturen holdes i almindelighed mellem 0°C og reaktionsblandingens tilbagesvalingstemperatur. X mange tilfælde er den mellem 15 og 75°C, og et foretrukket 20 temperaturområde er mellem 20°C og 55°C, idet der i særlig grad foretrækkes at arbejde ved stuetemperatur.

Reaktionstiden varierer i afhængighed af de særlige reaktionsparametere, og eftersom reaktionens forløb kan følges ved TLC- eller HPLC-teknikker kan den sagkyndige 25 på området overvåge reaktionens forløb og konstatere når reaktionen kan anses for at være fuldført.

En foretrukken udførelsesform for denne fremgangsmåde er kontrolleret hydrolyse af antibiotikum A 40926 kompleks eller en ren faktor deraf til dannelse af 30 antibiotikum A 40926 mannosylaglycon i nærværelse af vandig 80-95%s trifluoreddikesyre ved stuetemperatur.

En anden foretrukken udførelsesform for denne fremgangsmåde er kontrolleret hydrolyse af antibiotikum A 40926 mannosylaglycon i nærværelse af en blanding 2:1 til 1:2 35 af vandig 1-2N svovlsyre og dioxan.

Rensning af råt antibiotikum A 40926 mannosylaglycon som udvundet ved slutningen af hydrolysetrinnet kan DK 167770 B1 43 udføres ved i og for sig kendte teknikker såsom udfældning ved tilsætning af ikke-opløsningsmidler, ekstraktion med opløsningsmidler og kromatografering. Foretrukne kromatografiske fremgangsmåder indbefatter søjlekromatografe-5 ring og den mest foretrukne kromatografiske fremgangsmåde er reversfasesøjlekromatografering.

En hensigtsmæssig reversfasevæskekromatografe-ringsfremgangsmåde udnytter fortrinsvis rustfaste stålkolonner under moderat tryk (5-50 bar) eller ved højt tryk 10 (100-200 bar). Den faste fase kan være en silaniseret sili- kagel med en kulbrintefase med 2-18 kulstofatomer (særlig foretrækkes C 18) eller en fenylgruppe, og elueringsmid-ler er en blanding af et polært vandblandbart opløsningsmiddel og en vandig puffer med en pH-værdi som er forene-15 lig med harpiksen, fortrinsvis pH 3-8.

Repræsentative eksempler på polære vandblandbare opløsningsmidler er vandopløselige alkoholer (fx metanol, ætanol, isopropanol eller n-butanol), acetone, acetonitril, lavere alkylalkanoater (fx ætylacetat), tetrahydrofuran, 20 dioxan, dimetylformamid og blandinger deraf; det foretrukne polære vandblandbare opløsningsmiddel er acetonitril.

De eluerede fraktioner bedømmes med hensyn til antibiotikumindhold ved hjælp af de sædvanlige biobestem-25 melsesmetoder såsom papirskive- eller agar-diffusionsbestemmelser på følsomme mikroorganismer. Eksempler på følsomme organismer er Bacillus subtilis og S. aureus.

Rensningen såvel som reaktionen overvåges også hensigtsmæssigt ved TLC- eller HPLC-teknikker.

30 En foretrukken HPLC-teknik er repræsenteret af en reversfase-HPLC under anvendelse af en kolonne af porøse og kugleformede partikler af silaniseret silikagel som er funktionaliseret med C-18 alkylgrupper med en diameter på fortrinsvis 5 mikrometer (såsom 5 μιη "Ultrasphere" ODS 35 "Altex" Beckman Co.), en for-kolonne som er en silikagel funktionaliseret med C-18 alkylgrupper (såsom RP1g fra Brownlee Labs) og et elueringsmiddel som er en lineær gra- DK T67//U B l 44 dientblanding af et polært vandblandbart opløsningsmiddel såsom et af de ovenfor beskrevne, i en vandig pufret opløsning.

Fortrinsvis reguleres denne opløsning til pH 5-7.

5 Et i særlig grad foretrukket elueringsmiddel er en lineær gradient fra 5-60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel Δ, hvor elueringsmidlet A er en blanding af acetonitril/van-dig puffer pH 5-7, 10:90, og elueringsmiddel B er en blanding af acetonitril/vandig puffer pH 5-7, 70:30. Som kendt 10 i teknikken kan mange stoffer bruges som interne standarder. En meget hensigtsmæssig standard er i dette tilfælde antibiotikum L 17054, der har en retentionstid nær ved forbindelserne ifølge opfindelsen i dette HPLC-system. Dette standardstof kendes og er beskrevet i europæisk pa-15 tentansøgningspublikation nr. 119575.

Den antibakterielle virkning af forbindelserne i-følge opfindelsen kan påvises in vitro ved standardfortyndingsprøver på mikroorganismekulturer.

20 25 1 35 DK 167770 B1 45

Fysisk-kemiske karakterer af antibiotikum A 40926 faktor A

A) Det ultraviolette absorptionspektrum, der er vist på tegningens fig. 11, udviser følgende absorptionsmaxima: λ max (nm) a) 0,1N HC1 281 b) fosfatpuffer pH 7,38 281 300 (skulder) c) 0,1N natrium- eller kaliumhydroxyd 300 d) metanol 282 10 e) fosfatpuffer pH 9,0 282 300 (skulder) B) Det infrarøde absorptionsspektrum, der er vist på tegningens fig. 12, udviser følgende absorptionsmaxima 15 (i cm-1): 3700*3100, 3100-2800 (nujol)? 1655; 1620-1560; 1510; 1480-1410 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1250; 1250-1190; 11-950; 845; 810; 720 (nujol).

C) 1H-NMR-spektret er vist på fig.13 og udviser føl-20 gende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz og opnoteret i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxi'd) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (5 = ppm): S 0,86 (fer, 6H); 1,21 (*vllH); 1,43 (2H); 2,01 (2H); 2,31-2,34 (3H); 4-6,2 U/L6H); 6,2-8 U23H); 8,44, 9,22, 9,66 (brede 25 bånd; mobile protoner); 2,5-4: interferens fra ^O-toppe.

D) Retentionstid (Rt) 1,22 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (R = 20,3 min) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: 30 kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 35

DK lb///u D I

46 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μπι) elueringsmiddel A: CH^CN 10% \ reguleret (2/5 g/1) NaH2P04.H20 90% J til pH 6,0 5 elueringsmiddel B: CH^CN 70%"' reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel 10 Bi elueringsmiddel A i 40 minutter.

strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm 15 intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo

Lepetit S.p.A.)

Under samme betingelser er retentionstiden i for-2q hold til testosteron (Roussel Uclaf) 0,60.

E) Elementæranalyse efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (4w 4,6%), viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gen-nemsnit): kulstof 55,82%, hydrogen 5,17%, nitrogen 6,31%, klor (ialt) 4,24%, klor (ionisk) 0,37%. Uorganisk rest ved 900°C i luft: 1,2%.

F) Syre-base titreringsprofil i 2-metoxyætanol (MCS)/ vand 4:1 efter titrering med KOH efter tilsætning af overskud af HC1, hvilket viser fire ioniserbare funktioner med følgende værdier for pkMCS: 4,6, 5,6, 7,2, 9,2.

G) En R^-værdi på 0,24 og en R^-værdi i forhold til teicoplanin A„ komponent 2 på 0,70 i følgende kromatogra-35 ^ fiske system: 5% v/r vandigt Na2S04 70 acetonitril 30 DK 167770 B1 47 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 F254 Merc^“ plader (lagtykkelse 0,25 mm)..

Synliggørelse:

Ultraviolet lys.

Gul farve med Pauly s reagens, dvs. diazoteret sulfanil-syre (J. Chromatog. 20_, 171 (1965), Z. Physiol. Chem.

292, 99 (1953)).

Bioautografi under anvendelse af B. subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium.

10 H) Molekylvægt på ca. 1716 anslået ud fra et FAB-MS spektrum som udviser en M+H+ top ved 1717.

Fysisk-kemiske karakterer af antibiotikum A 40926 faktor B

A) Det ultraviolette absorptionsspektrum er vist på 1 5 tegningens fig. 14 og udviser følgende absorptionsmaxima: λ max (nm) a) 0,IN HC1 282 b) fosfatpuffer pH 7,38 281 20 300 (skulder) c) 0,1N natrium- eller kaliumhydroxid 300 d) fosfatpuffer pH 9,0 283 300 (skulder) 25 e) metanol 282 B) Det infrarøde absorptionsspektrum er vist på tegningens fig.15 og udviser følgende absorptionsmaxima i cm-1: 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 1720-1625; 1625-1560; 30 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujol).

C) ^H-NMR spektret er vist i fig. 16 og udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz ^H-NMR opnoteret 35 i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (S = ppm): δ 0,85 (d, isopropyl CH^er); 1,15 (<vl3H); 1,44 Gv2H); 2,02 (2H); DK 167770 Bl 48 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 U16H); 6,1-8 (,>,23H); 8,52, 9,30, 9,68 (brede bånd; mobile protoner). 2,5-4 interferens fra H20-toppe.

5 D) Retentionstid (Rfc) 1,22 og 1,27 i forhold til tei-coplanin A2 komponent 2 (Rt = 20,3 min) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μια) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 10 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μια) elueringsmiddel A: CH^CN 10% *) reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 15 elueringsmiddel B: CH^CN 70% 1 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30% J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel Bi elueringsmiddel A i 40 minutter

ti* U

strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm 25 intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo

Lepetit S.p.A.) E) Elementæranalyse efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (&w 9,6%) viser 30 følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 54,09%, hydrogen 5,13%, nitrogen 6,34%, klor (ialt) 4,12%, klor (ionisk) 0,39%. Uorganisk rest ved 900°C i luft:'5%.

35 F) Syre-base titreringsprofil i 2-metoxyætanol (MCS)/ vand 4:1 efter tirering med KOH efter tilsætning af over- DK 167770 B1 49 skud af HC1 (pH 2,7), der viser fire ioniserbare funktioner med følgende værdier for pkMCg: 4,5, 5,6, 7,2, 9,2.

G) R^-værdi 0,21 og en R^-værdi i forhold til tercets planin A2 komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2S0^ 70 acetonitril 30 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 F254 Merck q plader (lagtykkelse 0,25 mm).

Synliggørelse:

Ultraviolet lys

Gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanil- syre (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem.

292, 99 (1953)).

15 -

Bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium.

H) Molekylvægt på ca. 1730, anslået ud fra et FAB-MS spektrum som udviser M+H+ toppen ved 1731.

Fysisk-kemiske karakterer af antibiotikum A 40926 faktor Bq_ A) Det ultraviolette absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 14 og udviser følgende absorptionsmaxima: 2 5 λ max (nm) a) 0,IN HCl 282 b) fosfatpuffer pH 7,38 281 300 (skulder) 30 c) 0,1N natrium- eller kaliumhydroxid 300 d) fosfatpuffer pH 9,0 283 300 (skulder) e) metanol 282 35 Β) Det infrarøde absorptionsspektrum er vist på tegningens fig.15 og udviser følgende absorptionsmaxima (cm_1): 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 1720-1625; 1625- DK 167770 Bl 50 1560; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujol).

5 C) ^H-NMR spektret, der er vist i fig. 16, udviser følgende grupper signaler (i ppm) i 270 MHz ^H-NMR opno-teret i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm) (δ - ppm): δ 0,85 (d, isopropyl CH-^'er); 1,15 (<vl3H); 1,44 (n->2H); 10 2,02 (2H); 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 U/16H); 6,1-8 U,23H); 8,52, 9,30, 9,68 (brede bånd; mobile protoner). 2,5-4 interferens fra H20-toppe.

D) Retentionstid (Rfc) 1,22 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (Rfc =20,3 min) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" O.DS (5 μιη) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 2q for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μια) elueringsmiddel A: CH^CN 10% ") reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%j til pH 6,0 25 elueringsmiddel B: CH3CN 70%1 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A i 40 minutter 30

Strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm intern standard: teicoplanin A„ komponent 2 (Gruppo j D mT_ 1-1 ' *

Lepetit S.p.A.) DK 167770 B1 51 E) Elementæranalysen viser, efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (Aw 9,6%), følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 54,09%, hydrogen 5,13%, nitrogen 6,34%, c- klor (ialt) 4,12%, klor (ionisk) 0,39%. Uorganisk rest ved 900°C i luft: 5%.

F) Syre-base titreringsprofil i 2-metoxyætanol (MCS)/ vand 4:1 efter titrering med KOH efter tilsætning af over-skud af HC1 viser fire ioniserbare funktioner med følgende værdier for PkMCS: 4 »5, 5,6, 7,2, 9,2.

G) R^-værdi 0,21 og en R^-værdi i forhold til teico- planin Aj komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: 15 5% v/r vandigt Na2SO^ 70 acetonitril 30 under anvendelse af silaniserede silikagel 60 Merck_ plader (lagtykkelse 0,25 mm).

2Q Synliggørelse:

Ultraviolet lys

Gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)).

H) Molekylvægt ca. 1730, anslået ud fra et FAB-MS spektrum der udviser M+H+ toppen ved 1731. 1 35

Fysisk-kemiske karakterer for antibiotikum A 40926 faktor PA_ A) Det ultraviolette absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 17 og udviser følgende absorptionsmaxima: 52

Ulv IO///U D I

_λ max (nm) a) O,IN HC1 282 b) O,IN kaliumhydroxid 300 c) fosfatpuffer pH 7,38 282 300 (skulder) d) fosfatpuffer pH 9,0 283 300 (skulder) B) Det infrarøde absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 18 og udviser følgende absorptionsmaxima 10 (cm-1): 3700-3100, 3000-2800 (nujol); 1760-1710; 1655; 1620-1550; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1260, 1250-950; 845; 805; 720 (nujol).

C) 1H-NMR spektret, der er vist på tegningens fig.

15 19udviser følgende grupper signaler (i ppm) i 270 MHz 1H-NMR opnåteret i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (δ = ppm): 0,86, d'er (CH3); 1,15-1,22, m (cH2)n; 1,41, m (CH2); 2,01, s (CH3); 2,01, m (CH2); 2,28, s (N-CH3); 20 4,26-5,96, br (peptidiske og aromatiske CH’er); 6,33-7,73 br (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er). Her står br for bred, d for dublet, dd for dublet af dubletter, m for multiplet, s for singlet og t for triplet.

25 D) Retentionstid (Rfc) 1,15 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (Rt = 20,3 min) ved analyse ved reversfa-se-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 30 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μιη) elueringsmiddel A: CH3CN 10%*) reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH3CN 70% 1 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 35 DK 167770 B1 53 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% af elueringsmid-del B i elueringsmiddel A i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min 5 UV-detektor: 254 nm intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo '

Lepetit S.p.A.) 10 E) -værdi i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 på 0,62 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2S04 70 acetonitril 30 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 ?254 Merck_ plader (lagtykkelse 0,25 mm).

Synliggørelse:

Ultraviolet lys

Gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre (J. Chromatog. 2£, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)).

F) Molekylvægt på ca. 1758 anslået ud fra et FAB-MS

25 spektrum som udviser en klynge toppe med den mest intense top ved 1761. Arbejdsbetingelserne ved FAB-MS analysen var som følger: ^ Instrument: VG Mod ZAB SE udstyret med FAB gun Ion Tech

Betingelser: Positiv FAB, Xe

Accelererende spænding, 8KV

Matrix: tioglycerol/glycerol 1:1 (rumfang).

35 54 DKTb///Ubl

Fysisk-kemiske karakterer for antibiotikum A 40926 faktor PB_ A) Det ultraviolette absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 20 og udviser følgende absorptionsmaxima: 5 _λ max (nm)_ a) 0,1N HC1 282 b) 0,1N kaliumhydroxid 300 c) fosfatpuffer pH 7,38 282 1q 300 (skulder) d) fosfatpuffer pH 9,0 .282 300 (skulder) B) Det infrarøde absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 21 og udviser følgende absorptionsmaxima 15 (cm**1): 3700-3100, 3000-2800 (nujol); 1760-1710; 1655; 1620-1560; 1605; 1480-1420 (nujol); 1375 {nujol); 1320-1270; 1230-1190; 1150, 1120-920; 845; 810; 720 (nujol).

C.l) 1H-NMR-spektret, der er vist på tegningens fig.

20 22 udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (δ = ppm) multi-plicitet; (tilskrivning): 0,84, d (isopropyl CH^'er); 1,17, m (CH2)n; 1,43, m (CH2), 1,99, s (CH3); 2,01, m 25 (CH2); 2,31, s (N-CH3); 2,79, dd (C-H); 3,70, m (C-H); 4,06-6,02, br (peptiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,74, br (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); 8,19-9,99, br (peptidiske NH'er og fenoliske OH'er).

30 1 o C.2) H-NMR-spektret, der er vist på tegningens fig.

23 udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz i DMSO-dg plus CF-jCOOD under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (5 = ppm) multiplicitet; (tilskrivning): 0,84, d (isopropyl CH3'er); 1,13, m (CH2)n; 35 1,40, m (CH2); 1,98, s (CH3); 2,00, m (CH2); 2,92, dd (C-H); 3,29-3,71, m (sukker C-H'er); 4,07-6,09, s og m DK 167770 Bl 55 (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,83, s og m (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); 8,17-10,38 (peptidiske NH'er, fenoliske OH'er).

5 D) Retentionstider (R ) på 1,27 og 1,32 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (Rt =20,3 min) ved analyse ved reversfase-PHLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μπι) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 10 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH3CN 10% *) reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%Jtil pH 6,0 15 elueringsmiddel B: CH^CN 70% | reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmid-2Q del B i elueringsmiddel A i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/rain UV-detektor: 254 nm 25 intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo

Lepetit S.p.A.) E) Rf-værdi i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2S04 70 acetonitril 30 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 F254 Merck_ plader (lagtykkelse 0,25 mm).

^ Synliggørelse:

Ultraviolet lys

Gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre 56 υκ Ίϋ///υ bi (J. Chromatog. 2£, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)).

5 F) Molekylvægt på ca. 1772 anslået ud fra et FAB-MS spektrum som udviser en klynge toppe med den mest intense top ved 1776. Arbejdsbetingelserne ved FAB-MS analysen var som følger: ^ Instrument: VG Mod ZAB SE udstyret med FAB gun Ion Tech

Betingelser: Positiv FAB, XE

Accelererende spænding, 8KV

Matrix: tioglycerol/glycerol 1:1 (rumfang) 15 har følgende egenskaber: A) et ultraviolet absorptionsspektrum, der er vist i 2q tegningens fig. 24 og udviser følgende absorptionsmaxima:

Xmax, nm a) 0,1N HCL 280 b) fosfatpuffer pH 7,38 280 300 (skulder) 25 c) 0,1N kaliumhydroxid 298 d) fosfatpuffer pH 9,0 282 300 (skulder) B) et infrarødt absorptionsspektrum som er vist i teg-2q ningens fig. 25 og som udviser følgende absorptionsmaxima: 3700-3100; 3000-2800 (nujol); 1655; 1620-1540; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1350-1250; 1210; 1150; 1020; 970; 850; 810 cm 25 C) ^H-NMR-spektrum som er vist i fig. 26 og som udvi ser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz optaget i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) plus CF^COOH under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), δ = ppm: DK 167770 B1 57 2,51, s (DMS0d5); 2,50, s (NCH3); 2,88, m (Z2); 3,30, m (Z*2); 4,08, m (X6); 4,44, d (X5); 4,49, d (X7); 4,83, m (X2); 5,02, s (4F); 5,08, s (Z6); 5,31, s (anomeriske proton af mannose); 5,53, d (X4); 5,78, s (4B); 6,08, d (X3); 7,70, s (6B); 6,44-8,52 (aromatiske og peptidiske NH'er), og d står for dublet, m for multiplet og S for singlet.

D) en retentionstid (R ) på 1,18 i forhold til antibiotikum L 17054 (TA3-1) (Rt = 8,78 min) ved analyse ved reversf ase-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultraspere" ODS (5 pm) " Alt ex" ® (Beckman), 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs. RP 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH^CN 10%") reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90% j til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH^CN 70%| reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter strømningshastighed: 1,6 ml/min UV-detektor: 254 nm intern standard: antibiotikum L 17054 (TA3-1) (Gruppo

Lepetit S.p.A.) E) en R^-værdi på 0,39 i følgende kromatografiske system: 1M NaCl indeholdende 5 g/1 NaH2P04.H20 70 acetonitril 30 reguleret til pH 6,0 og under anvendelse af silaniseret silikagel 60 ^54 Merck plader (lagtykkelse 0,25 mm) Synliggørelse: ultraviolet lys , gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, ( 1953) ) ,

UlV ΙΟ///U Dl 58 bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium F) et hurtigt atombombardement (FAB) massespektrum med 5 M + H+ på ca. 1374.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen uden at begrænse dens rækkevidde.

10

Eksempel 1

Fremstilling af antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronyl- aqlycon kompleks AB og antibiotikum A 40926 aglycon_ ^ a) 750 mg antibiotikum A 40926 kompleks AB (fremstillet i det væsentlige på den måde der er beskrevet i omstående mellemprodukt 3) opløses i 150 ml af en blanding af dimetylsulfoxid (DMSO) og 37 vægt%s saltsyre (HC1) 9:1 (rumfang)/ og reaktionsblandingen opvarmes til ca. 65°C.

2q Reaktionens forløb overvåges ved HPLC og når ud gangsmaterialerne er fuldstændig omsat (efter ca. 5 timer) standses reaktionen med 600 ml koldt vand og den resulterende blandings pH-værdi reguleres til ca. 7,5.

Denne blanding indeholder en blanding af de i over-2^ skriften angivne forbindelser, der adskilles i de to hovedkomponenter ved affinitetskromatografering på følgende måde: b) Den vandige blanding vundet på den ovenfor beskrev- (p\ 2Q ne måde (750 ml) overføres til en "Sepharose'-D-alanyl- D-alanin kromatograferingskolonne tilberedt som beskrevet i omstående mellemprodukt 8 (100 ml kvældet harpiks i 10 mmol tris.HCl pH 7,5 puffer; lejehøjde 10 cm). Der føres 0,05M NH40H.HC1 pH 7,5 indeholdende 2M NaCl (200 ml; puf-22 fet B) gennem kolonnen; derefter fjernes A 40926 aglycon selektivt fra kolonnen ved eluering med 0,05M NH^OH.HCl pH 9,5 indeholdende 2M NaCl (1500 ml; puffer C). Derefter DK 167770 B1 59 elueres N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB med 0,1M ammoniakvand (puffer D). De eluerede fraktioner forenedes derefter i overensstemmelse med deres antibiotikumindhold og reguleredes til pH ca. 7,5, hvorpå hver af de antibio-5 tikumholdige opløsninger kromatograferes på en "Sepharo-se" ® D-alanyl-D-alanin-kolonne (100 ml kvaeldet harpiks i 10 mmol tris-HCl pH 7,5 puffer; lejehøjde 10 cm). Der føres destilleret vand gennem kolonnen indtil de uorganiske salte er udvasket. De antibiotiske stoffer elueres der-10 efter med 0,1N ammoniakvand. Disse eluerede fraktioner, slået sammen efter deres antibiotikumindhold, koncentreres til et lille rumfang under nedsat tryk ved azeotrop destillation med n-butanol og frysetørres, hvorved der vandtes henholdsvis 201 mg N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks 15 AB og 236 mg A 40926 aglycon.

Ved gentagelse af det samme forsøg som beskrevet ovenfor, men under anvendelse af en blanding DMSO/37%s HC1 95:5 ved ca. 40°C i ca. 5 dage stiger udbyttet af N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB med ca. 15%, mens ud-20 byttet af A 40926 aglycon nedsættes tilsvarende.

Ved at gentage disse forsøg ud fra antibiotikum A 40926 kompleks, antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor BQ, antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 25 faktor PB opnås i det væsentlige samme resultater (dvs. at udbytterne varierer inden for området +5%).

Når man går ud fra antibiotikum A 40926 faktor A eller faktor PA, vinder man nærmere betegnet som reaktionsprodukt antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon 30 faktor A, mens man ved at gå ud fra antibiotikum A 40926 faktor PB eller faktor Bq som reaktionsprodukt vinder antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor Bg. Fra antibiotikum A 40926 faktor B vindes der en blanding af antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon 35 faktorerne Bq og B^, og de kan adskilles ved HPLC.

Ulv IO///U D I

60

Eksempel 2

Adskillelse af antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronyl-aglycon faktorerne A, Bg og _ 20 mg antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronyl-aglycon kompleks AB opløses i 1 ml 18 mmol natriumfosfat-puffer pH 6,0 indeholdende 10% acetonitril. Opløsningen indsprøjtes i en HPLC præparativ kolonne (7 mm indvendig diameter x 250 mm) med "Lichrosorb" ® RP18 silaniseret si-^ likagel (Merck Co.) med en partikelstørrelse på 7 mikrometer .

Kolonnen elueres ved en strømningshastighed på 5 ml/rain af fase A og B med en lineær gradient fra 10% til 55% af fase A i 55 minutter.

Fase A: 18 mmol natriumfosfat/CH^CN 30:70, bragt til pH 6,0 med NaOH.

Fase B: 18 mmol natriumfosfat/CH3CN 90:10 bragt til pH 6,0 med NaOH.

Den ultraviolette adsorption af eluaterne fra ko-2Q lonnen ved 254 nm opnoteres og de elueringsfraktioner som har homogent indhold opsamles og der adskilles tre grupper eluater indeholdende antibiotikum A 40926 N-acylamino-glucuronylaglycon faktorerne henholdsvis A, Bg og .

De eluater som indeholder de rensede antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-faktorer fra elleve på hinanden følgende kromatografi-gennemløb forenes og af-saltes på sædvanlig måde ved at de overføres til en kolonne af 5 ml kvældet "Sepharose" ® D-Ala-D-Ala (jvf. mellemprodukt 8). Efter fjernelse af saltene med 10 ml Immol 3g HC1 efterfulgt af 5 x 10 ml destilleret vand elueres det antibiotiske stof med 5 x 10 ml 1%s v/r ammoniakvand.

Ammoniakeluaterne opsamles derefter hver for sig og frysetørres, hvorved der vindes 15 mg antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor A, 51 mg antibiotikum A 32 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor Bg og 3 mg antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor B^, hvis fysisk-kemiske data og kemiske formler er angivet DK 167770 Bl 61 tidligere i nærværende beskrivelse.

Eksempel 3

2 Selektiv fremstilling af antibiotikum Å 40926 aglycon a) Ud_fra_antibiotikum_A_40926_komEleks_AB

750 mg antibiotikum A 40926 kompleks AB (fremstillet i det væsentlige ved den fremgangsmåde der er beskrevet i mellemprodukt 3) opløses i 150 ml af en blanding af 10 dimetylsulfoxid og 37%s saltsyre 9:1 (rumfang), og reaktionsblandingen opvarmes til ca. 80°C. Reaktionens forløb overvåges ved HPLC og når udgangsmaterialerne er fuldstændig omsat (efter ca. 3 timer) standses reaktionen med 600 ml koldt vand og den resulterende blandings pH-værdi regu-15 leres til ca. 7,5.

Denne blanding, 750 ml, indeholder antibiotikum A 40926 aglycon som fraskilles ved affinitetskromatografe-ring på en "Sepharose" ®-D-alanyl-D-alanin kromatografikolonne tilberedt som beskrevet i mellemprodukt 8 (100 ml 20 kvældet harpiks i 10 mmol tris.HCl pH 7,5; lejehøjde 10 cm).

0,05M NH40H.HC1 pH 7,5 indeholdende 2M NaCl (200 ml; puffer B) føres gennem kolonnen; herefter fjernes A 40926 aglycon selektivt fra kolonnen ved eluering med 25 0,05M NH40H.HC1 pH 9,5 indeholdende 2M NaCl (1500 ml; puf fer C). De eluerede fraktioner slås derefter sammen i overensstemmelse med deres antibiotikumindhold, og reguleres til pH ca. 7,5 og kromatograferes på en "Sepharose'® D-alanyl-D-alanin kolonne (100 ml kvældet harpiks i 10 mmol 30 tris-HCl pH 7,5; lejehøjde 10 cm). Der føres destilleret vand gennem kolonnen indtil de uorganiske salte er udvasket. A 40926 aglycon elueres med 0,1N ammoniakvand. Disse eluater koncentreres til et lille rumfang under nedsat tryk ved azeotrop destillation med n-butanol og frysetør-35 res, hvorved der vindes 530 mg A 40926 aglycon.

DK 1b///U Bl 62

Fremstilling af udgangsmaterialer Mellemprodukt 1 Gæring af Actinomadura sp. AJCC 39727 5 En kultur af en antibiotikum A 40926-producerende stamme (Actinomadura sp. ATCC 39727) dyrkes på en skråkultur af havremelsagar i 2-3 uger ved 28°C og bruges til podning af en 500 ml stor Erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml medium sammensat af 0,5% kødekstrakt, 0,5% autolyse-1Q ret gær, 0,5% pepton, 0,3% kaseinhydrolysat, 2% glukose, 0,15% NaCl (pH 7,5 før sterilisation).

Kolben inkuberes ved 28°C på en roterende ryster ved 200 opm i ca. 72 timer hvorpå kulturen overføres til en gæringsbeholder indeholdende 4 liter af ovennævnte ^ medium. Denne kultur dyrkes ved 28°C i ca. 72 timer med en luftning på ca. to liter pr. minut og omrøring ved ca. 900 opm. Derefter bruges denne kultur til at pode en 200 liter stor gæringsbeholder med samme medium. Denne gæringsbeholder luftes med 100 liter steril luft pr. minut 2q og omrøres ved 250 opm ved ca. 28°C. Antibiotikumproduktionen overvåges ved papirskive-agardiffusionsmetoden under anvendelse af Bacillus subtilis på et minimalt medium som testorganisme. Den maximale aktivitet opnås efter 72-96 timer.

25 30 35 DK 167770 B1 63

Mellemprodukt 2

Udvinding af antibiotikum A 40926 A) Gæringssuppen afkøles til 4°C, bringes til pH 9,5 og omrøres. Efter ca. 1 time filtreres den og filtratet ^ reguleres til pH ca. 3,5 med en vandig mineralsyre. Blandingen omrøres i 30 minutter ved 4°C og filtreres derefter med filterhjælp ("Hyflo-FloMa" ® ). Det klare filtrat kasseres og filterkagen suspenderes i deioniseret vand, reguleres til pH ca. 8,5, omrøres og filtreres derefter.

Den herved genvundne filterkage underkastes samme proces.

De forenede filtrater indeholder A 40926.

B) 2 liter opsvulmet D-Ala-D-Ala-e-aminokaproyl-"Se- pharose" ® -modificeret matrix sættes til den ifølge 15 mellemprodukt 1 vundne gasringssuppe (efter filtrering deraf og . efter at det klare filtrats pH-værdi er bragt til ca.

8,5) eller til de forenede filtrater vundet i henhold til foranstående eksempel 2 A. Efter omrøring natten over ved stuetemperatur fraskilles harpiksen ved filtrering 90 og vaskes i rækkefølge med ca. 2 x 10 liter 0,45 mM HC1-TRIS-puffer pH 7,5 (TRIS: 2-amino-2-hydroxymetyl-l,3-pro-pandiol) som indeholder 5% v/r NaCl, og derefter med 4 x 20 liter destilleret vand.

Antibiotikum A 40926 elueres fra harpiksen med 25 2 x 20 liter l%s v/r ammoniakvand. Eluaterne henstår nat ten over ved stuetmeperatur og koncentreres derefter til et ringe rumfang (ca. 2,5 liter). Vand fjernes ved azeo-trop destillation med n-butanol. Derefter tilsættes der petroleumsæter hvorved der udfældes 3,4 g råt antibioti-50 kum A 40926 kompleks.

Mellemprodukt 3

Rensning af antibiotikum Å 40926 kompleks AB 35 Råt antibiotikum A 40926 kompleks, opnået i det væsentli ge ved fremgangsmåden i foranstående mellemprodukt 2 (750 mg;

HPLC-titer 70%) opløses i 400 ml vand, reguleres til pH

64

Ulv ιο///u d i 7,5 og filtreres. Derefter underkastes filtratet affini-tetskromatografering på en D-Ala-D-Ala-c-aminokaproyl-"Sepharose" ® -kolonne (50 ml opsvulmet harpiks; lejehøjde 5 cm). Kolonnen, ækvilibreret med 0,16% v/r ammoniak t- indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 7,5 med HC1, fremkaldes med følgende tre pufferopløsninger i rækkefølge: puffer A: 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 7,5 med HC1 (2,6 kolonnelejerumfang); 10 puffer B: 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 9,5 med HC1 (16 kolonnelejerumfang); puffer C: 1% v/r ammoniakvand pH 11,4 (2,6 kolonneleje-15 rumfang) .

Puffer C eluerer antibiotikum A 40926 kompleks AB i en enkelt fraktion. Denne eluerede fraktion reguleres til pH 7,0 og overføres igen til sanme affinitetskolonne puf-2Q ret med 10 raM TRIS-HC1 pH 7,0. Kolonnen vaskes med destilleret indtil afsaltningen er fuldstændig. Antibioti-ket elueres derefter med 2 kolonnelejerumfang 0,39%s v/r ammoniakvand pH 11,0.

De eluerede fraktioner koncentreres til en lille 2^ vandig blanding og frysetørres derefter. Der vindes 374 mg rent antibiotikum A 40926 kompleks AB.

Mellemprodukt 4

Isolering af antibiotikum A 40926 faktor A og B 30 A) 3,3 g antibiotikum A 40926 kompleks vundet i henhold til mellemprodukt 2, eller 2,3 g antibiotikum A 40926 kompleks AB vundet i henhold til eksempel 3, suspenderes i 0,5 ml vand, omrøres og filtreres derefter. Det klare filtrat overføres til en silaniseret silikagelkolonne 35 (200 g; lejehøjde 18 cm; silaniseret silikagel 60; 70- 230 mesh, Merck Inc.), for-ækvilibreret med opløsning A (0,001M vandig natrium-EDTA indeholdende 0,25% v/r DK 167770 B1 65

NaH2P04.H20 og 2,5% v/r NaCl reguleret til pH 6,0 med NaOH). Kolonnen elueres med en lineær gradient fra 0% til 40% (rumfang) acetonitril i opløsning A med et samlet rumfang på ca. 7 liter i løbet af ca. 48 timer. Der 5 opsamles fraktioner på ca. 15,5 ml og de prøves ved biobestemmelse på Bacillus subtilis og analyseres ved HPLC. Fraktioner med ensartet antibiotikumindhold forenes. Fraktionerne nr. 310-330 og nr. 348-365 indeholdt de antibiotiske stoffer der er betegnet henholdsvis A 40926 1 g faktor A og A 40926 faktor B.

B) De forenede fraktioner indeholdende de enkelte fraktioner A 40926 faktor A og faktor B koncentreres under nedsat tryk for at fjerne acetonitril, fortyndes ^ med vand (ca. det dobbelte rumfang af de oprindelige opløsninger) og overføres til en silaniseret silikagelkolon-ne af den ovenfor beskrevne type (rumfang af den opsvulmede matrix: 50 ml; lejehøjde 15 cm). Kolonnen vaskes med deioniseret vand indtil afsaltningen er fuldstændig og 2Q fremkaldes til sidst med acetonitril/vand 60:40 (rumfang).

De eluerede fraktioner koncentreres under nedsat tryk og remanenserne frysetørres til udvinding af 134 mg antibiotikum A 40926 fra den første gruppe eluerede fraktioner (ovennævnte fraktioner 310-330) og 206 mg A 40926 faktor B fra den anden gruppe eluerede fraktioner (ovennævnte fraktioner 348-365).

Mellemprodukt 5

Isolering af antibiotikum A 40926 faktor PA 'og faktor PB Ved i det væsentlige at gå frem som beskrevet i mellemprodukt 2 A og det første trin i mellemprodukt 2 B elueres det til harpiksen koblede antibiotikum med 2 x 20 liter l%s v/r ammoniakvand. Eluaterne reguleres til pH 7,8 med svovlsyre og koncentreres til et lille rumfang under va-35 kuum ved azeotrop destillation med n-butanol for at vinde et vandigt koncentrat som derefter filtreres på papir.

UK IO///U D I

66

Det udvundne filtrat indeholder antibiotikum A 40926 faktor PA, A 40926 faktor PB og mindre mængder A 40926 faktor A og faktor B (HPLC). En prøve på 10 ml af dette vandige koncentrat indeholdende ca. 50 mg/ml rent antibioti-5 kum A 40926 kompleks (HPLC-analyse) filtreres på et filter med en porestørrelse på 5 μια ("Acrodisc"; Gelman Science Inc.) og overføres derefter til en kolonne af rustfrit stål (diameter 2 cm) indeholdende 20 g oktadecyl-silyl-reversfase-silikagel ("Lichrosorb"® RP 18, Merck ^ g Inc; partikelstørrelse 10 μιη). Silikagelen pakkes derefter under moderat tryk (et nominelt tryk på ca. 14 bar) i en kolonne af rustfrit stål hørende til et "Chromatospac Modulprep" apparat (Yoben Yvon, Frankrig) og ækvilibreres med en blanding bestående af acetonitril og 18 mM natrium-fosfatpuffer pH 6,0, 25:75 (rumfang). Elueringen udføres med samme opløsningsmiddelblanding som brugtes til ækvili-breringen og med en strømningshastighed på ca. 10,5 ml/min. Eluatet overvåges ved biobestmemelse på Bacillus subtilis og ved HPLC. De fraktioner som har ensartet antibiotikum-2g indhold forenes og de homogene fraktioner af 5 kromatogra fiske gennemløb koncentreres for at afdampe det organiske opløsningsmiddel.

Den resulterende opløsning fortyndes med vandigt 1M natriumklorid til det dobbelte af det oprindelige rum-fang og overføres til en silaniseret silikagelkolonne (50 g; lejehøjde 5 cm; silaniseret silikagel 60, Merck Inc.) ækvilibreret med vand.

Kolonnen vaskes med deioniseret vand indtil afsalt- ningen er fuldstændig (ingen udfældning af AgCl i eluater-

ne efter tilsætning af vandigt AgNO-,) og elueres derefter 30 J

med acetonitril/vand 1:1 (rumfang). De eluater som har ensartet antibiotikumindhold (HPLC-analyse) forenes, koncentreres til et lille rumfang ved azeotrop destillation med n-butanol til opnåelse af en vandig fase som derefter frysetørres. Udbytter: 35 antibiotikum A 40926 faktor PA: 55 mg antibiotikum A 40926 faktor PB: 51 mg DK 167770 Bl 67 antibiotikum A 40926 faktor A: 38 mg antibiotikum A 40926 faktor Bg: 33 mg

Mellemprodukt 6

Anden fremgangsmåde til isolation af antibiotikum A 40926 faktor B_

Det forenede koncentrat af to præparater fremstillet i henhold til mellenprodukt 2 (sidste trin) filtreres og filtratet overføres til en silaniseret silikagel-kroraato- 10 grafikolonne (400 g; lejehøjde 30 cm; silikagel 60, 70-230 mesh, Merck Inc.) for-ækvilibreret med vand.

Kolonnen skylles med 6 liter vand og det adsorbe-rede antibiotikum elueres med acetonitril/vand i henhold til følgende rækkefølge, hvor procenterne er rumfangspro-^ center: 2,7 liter 5% acetonitril i vand 1,6 liter 10% acetonitril i vand 2,97 liter 15% acetonitril i vand 3,15 liter 20% acetonitril i vand.

2^ Der opsamles fraktioner på ca. 18 ml. Aktiviteten af de eluerede fraktioner afprøves ved papirskive-biobestemmel-se på følsomme mikroorganismer såsom Bacillus subtilis og analyseres ved HPLC. Fraktioner med ensartet antibiotikumindhold forenes (fraktionerne nr. 472-526) og koncen-2^ treres under nedsat tryk. Der sættes n-butanol til dette koncentrat for azeotropt at fjerne vand. Den butanoliske opløsning som er tilbage koncentreres derefter til et lille rumfang for at udfælde A 40926 faktor B (1,4 g).

Dette produkt vaskes med petroleumsæter under omrøring og opsamles ved filtrering (3 gange). Efter tørring under vakuum vindes der 760 mg A 40926 faktor B.

Ved på ny at underkaste antibiotikum A 40926 faktor B den ovenfor beskrevne søjlekromatografering vindes der et produkt (540 mg) i form af antibiotikum A 40926 fak-35 tor Bq, der har samme fysisk-kemiske karakterer som er beskrevet foran for antibiotikum A 40926 faktor B, med den forskel at det kun udviser én top ved HPLC-analyse,

Ulv IO///UDI

68 nemlig toppen med retentionstid 1,22 i forhold til teico-planin A^ komponent 2.

Den anden komponent, der derefter elueres, har en retentionstid på 1,27 i ovennævnte HPLC-system og er ble-5 vet benævnt antibiotikum A 40926 faktor . Det isoleres ved oparbejdning som ovenfor, udbytte 15 mg.

Mellemprodukt 7 1q Omdannelse af antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum 40926 faktor PB til antibiotikum A 40926 henholds- vis faktor A og faktor B_

Antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB (50 mg) opløses hver for sig i 2,5 ml ^ vandigt l%s v/r NH^OH og de resulterende opløsninger opbevares i ca. 24 timer ved stuetemperatur under omrøring. Antibiotikum A 40926 faktor A vindes fra den opløsning der oprindelig indeholdt antibiotikum A 40926 faktor PA, og antibiotikum A 40926 faktor B vindes fra den opløsning 2Q der oprindelig indeholdt antibiotikum A 40926 faktor PB ved fjernelse af vand ved azeotrop destillation med n-butanol, udfældning med ætylæter og opsamling af bundfaldet ved filtrering (udbytte ca. 75%).

Mellemprodukt 8

Fremstilling af D-ala-D-ala-"Sepharose,, ® a) Stivering_af_ " Sepharose"_®_med_epiklorhydri5

En liter "Sepharose" ® 4B (Pharmacia Fine Chemi-^ cals), filtreret på et porøst glasfilter og vasket med demineraliseret vand, sættes til 1,2 liter NaOH N/1 under forsigtig omrøring ved stuetemperatur. Efter tilsætning af 100 ml epiklorhydrin holdes massen under omrøring ved 20°C ved ekstern afkøling med koldt vand i 24 timer. Sus-^ pensionen filtreres og det faste stof vaskes med demineraliseret vand (ca. 5 liter) til neutral pH-værdi.

DK 167770 B1 69 b) Fremstilling_af_"Segharose"_®_-s-ACA-D-ala-D-ala

Til en opløsning af 17 g (62,2 mmol) ε-ACA-D-ala-D-ala i 200 ml vand, bragt til pH 11 med 20%s NaOH, sættes der ca. 500 ml "Sepharose" ® 4B derivatiseret med epiklor- 5 hydrin (samlet epoxidindhold ca. 15,5meq) under mekanisk omrøring.

Suspensionen omrøres ved pH 11 og ved stuetemperatur i ca. 2 timer (indtil den prøve der bruges til måling er epoxidindholdet er negativ), filtreres og vaskes med 10 300 ml vand. Den filtrerede harpiks vaskes på ny med ca.

3 liter vand til neutral pH-værdi, og der vindes 460 ml "Sepharose" ®-ε-ACA-D-ala-D-ala.

15- 20 25 30 35

Claims

70 UK 1b///U bl

1. Antibiotisk stof udvalgt blandt antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB, antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor A, 5 antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor Bq, antibiotikum Ά 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor B1, antibiotikum A 40926 aglycon og farmaceutisk acceptable additionssalte deraf, kendetegnet ved at stofferne i ikke-additionssaltformen har følgende 10 egenskaber: Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB________________________________________________________ A) et ultraviolet absorptionsspektrum som er vist i 15 tegningens fig. 1 og som udviser følgende absorptions- maxima: λ max (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfatpuffer pH 7,4 282 20 310 (skulder) c) 0,1 N KOH 302 B) et infra rødt absorptionsspetrum som er vist i tegningens fig. 2 og som viser følgende absorptionsmaxima: 25 3700-3100; 3000-2800 (nujol)? 1650? 1620-1550? 1500? 1460 (nujol)? 1375 (nujol).? 1300? 1250-1 180; 1150; 1060? 1010? 970; 930? 840? 820 cm"1. C) 1H-NMR-spektrum som er vist i tegningens fig. 3 30 og som udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz og optaget i DMSO dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) plus CF^COOH under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), 5 = ppm: 0,84, d og t (isopropyliske CH3'er og terminal CH3); 1,14, m ((CH2) )? 1/44, m (-CH2-C-CO og isopropylisk 35 CH); 2,00, t (-CH2-(CO))? 2,5 s (DMSOdg); 2,5, s (N-C^)? 2,93, m (CCH, (Z2)); 3,33, m (CH, (Z'2)); 3,20-3,80, m (sukker CH'er)); 5,34, d (anomerisk proton af acylamino- DK 167770 B1 71 glukuronsyre); 4,10, m (X6); 4,33, d (X5); 4,43, d (X7); 4,9, m (X2); 5,1 (4F og Z6); 5,4, s (XI); 5,58, d (X4); 5,7, s (4B); 6,06, d (X3); 7,73, s (6B); 6,26-8,42, s og m (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); 8,70-10,5, br 5 s (fenoliske OH'er og NH2+) hvor br står for bred, d for dublet, m for multiplet, s for singlet og t for triplet. D) retentionstider (Rt) 1,20 og 1,30 i forhold til Teicoplanin A2 komponent 2 (R = 20,3 min) ved analyse ved 10 reversfase HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μπι) "Altex" ® (Beckman), 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μιη) elueringsmiddel A: CH^CN 10%| reguleret 15 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6 elueringsmiddel B: CH^CN 70%”] reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter 20 strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm intern standard: Teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.)

25 E) syrefunktioner med evne til at danne salte F) aminofunktion med evne til at danne salte G) ingen mannoseenhed bundet til kernedelen. 30 ^Dlribi2ti35H!]?_^_å0926_N-acYlaminoglucuronYla2lycon_faktor_A A) ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima: λ max, nm 35 a) 0,IN HCl 282 b) fosfatpuffer pH 7,4 282 310 (skulder) c) 0,1N KOH 302 DK 1677/U B l 72 B) et infrarødt spektrum som er vist i tegningens fig. 4 og som udviser følgende absorptionsmaxima: 3700-3300; 3000-2800; 1650; 1585; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1070; 1060; 1010; 845; 820; 720 ^ (nujol) cm-1. C) ^H-NMR spektrum som er vist i tegningens fig. 5 og udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz, optaget i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anven- •jq delse af TMS som intern standard (0,00 ppm), δ = ppm: 0,85, t (terminal CH^); 1,0-1,3 (alifatiske CH2'er); 1/42, m ((0C-C)CH2); 2,00, t ((CO)CH2); 2,35, s (NCH3>; 2,49, s (DMS0d5); 2,82, m (Z2); 2,8-3,8 (sukkerprotoner og Z'2); 4,12, m (X6); 4,56, s (X1); 4,34, d (X5); 4,41, d (X7); 15 4,96, m (X2); 5,08-5,12 (4F og Z6); 5,40, d (anomerisk proton af acylaminoglucuronsyre); 5,58, d (X4); 5,74, s (4B); 6,05, d (X3); 7,75, s (6B); 6,25-8,40, s, d og m (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er).

20 D) en retentionstid (Rt) på 1,20 i forhold til Teico- planin A2 komponent 2 (Rt = 20,3 min) ved analyse ved reversfase HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex"® (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 25 for-kolonne: Brownlee Labs RP- 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH^CN 10%| reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH^CN 70%| reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%) til pH 6,0 30 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm intern standard: Teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepe-35 tit S.p.A.) E) molekylvægt ca. 1554, bestemt ved FAB-MS DK 167770 B1 73 F) syrefunktioner med evne til at danne salte G) aminofunktion med evne til at danne salte 5 H) ingen mannoseenhed bundet til kernedelen Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor -o----------------------------------------------------- A) et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser føl- 10 gende absorptionsmaxima: λ max, nm a) 0,1N HC1 282 b) fosfatpuffer pH 7,4 282 310 (skulder) 15 c) 0,1N KOH 302 B) et infrarødt absorptionsspektrum som er vist i tegningens fig. 6 og som udviser følgende absorptionsmaxima: 2Q 3700-3100; 3000-2800 (nujol); 1650; 1585; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1060; 1010; 980; 840; 820; 720 (nujol) cm ^ C) ^H-NMR-spektrum som er vist i tegningens fig. 7 og som udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz, 25 optaget i DMSO d^ (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), δ = ppm: 0,84, d (isopropyliskeCH^'er); 1,0-1,3 (alifatiske C^'er); 1,3-1,6 ((OC-C)-CH2 og isopropylisk -CH); 2,00, t ((OOC^); 2,32, s (NCH-,); 2,49, s (DMSOd,-); 2,82, m (Z2); 2,9-3,8 30 J -3 , (sukkerprotoner); 4,12, m (X6); 4,44, s (X1); 4,33, d (X5); 4,37, d (X7);, 4,95, m (X2);, 5,06-5,10 (4F og Z6); 5,38, d (anomerisk proton af acylaminoglucuronsyre); 5,59, d (X4); 5,72, s (4B); 6,05, d (X3); 7,74, s (6B); 6,27-8,5 (aromatiske og peptidiske NH'er) 35 74 Ulv IO///U B 1 D) en retentionstid (R^.) på 1,30 i forhold til Teico-planin A2 komponent 2 (Rt = 20,3 min) ved analyse ved reversfase HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex” ® (Beckman) 5 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH^CN 10%"} reguleret (2,5 g/1) NaH2P04-H20 90%) til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH^CN 70%1 reguleret 10 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%) til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm 15 intern standard: Teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepe- tit S.p.A.) E) en molekylvægt på ca. 1568, bestemt ved FAB-MS 20 F) syrefunktioner med evne til at danne salte G) en aminofunktion med evne til at danne salte H) ingen mannoseenhed bundet til kernedelen. 25 Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor g,------------------------------------------------------ har en molekylvægt på ca. 1568, bestemt ved FAB-MS, og 3Q har i det væsentlige samme fysisk-kemiske egenskaber som er vist ovenfor for antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon faktor Bq, blot med den forskel at det har en triplet ved 0,84 6 ppm som kan tilskrives metylgruppen 1 en n-propylfunktion i det ovenfor beskrevne NMR-system 23 og en retentionstid i forhold til Teicoplanin A2 komponent 2 på 1,32 i det ovenfor beskrevne system. DK 167770 B1 75 ^ti^i2tikum_A_40926_aglYCon A) et ultraviolet absorptionsspektruxn som er vist i tegningens fig. 8 og som udviser følgende absorptionsmaxima: λ max, nm 5 a) 0,1N HC1 280 b) fosfatpuffer pH 7,4 280 310 (skulder) c) 0,1N KOH 299

10 B) et infrarødt absorptionsspektrum som er vist i teg ningens fig. 9 og som udviser absorptionsmaxima: 3700-3100; 3000-2800 (nujol); 1655; 1620-1550; 1500; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1300; 1205; 1145; 1010; 970; 930; 840 cm“1 15 c) 1H-NMR-spektrum som er vist i tegningens fig. 10 og som har følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz, optaget i DMSO dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) plus CF^COOH under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), δ = ppm.· 2,51, s (DMSOdg); 2,50, s (NCH3); 2,88, m (Z2); 20 3,33, m (Z'2); 4,10, m (X6); 4,34, d (X5); 4,43, d (X7); 4,93, m (X2); 5,04, s (4F); 5,09, s (Z6); 5,54, d (X4); 5,75, s (4B); 6,05, d (X3); 7,76, s (6B); 6,3-8,4 (aromatiske og peptidiske NH’er)

25 D) en retentionstid (Rt) på 0,59 i forhold til Teico-planin A2 komponent 2 (R^_ = 20,3 min) ved analyse ved reversfase HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex"® (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 30 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH^CN 10%") reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%j til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH3CN 70%^ reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 35 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min DK 167770 Bl 76 UV-detektor: 254 nm intern standard: Teicoplanin komponent 2 (Gruppo Lepe- tit S.p.A.)

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved at A betegner undecanoylaminoglucuronyl, dodecanoyl-aminoglucuronyl eller isododecanoylaminoglucuronyl.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse 5 som angivet i krav 1 eller 2 eller en blanding.deraf, kendetegnet ved at man a) underkaster antibiotikum A 40926 kompleks, antibiotikum A 40926 kompleks AB, antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 10 40926 faktor Bg, antibiotikum A 40926 faktor PA eller antibiotikum A 40926 faktor PB sur hydrolyse med en stærk syre udvalgt blandt hydrogenha-logenider, navnlig koncentreret saltsyre, fosforsyrer, svovlsyre og halogeneddikesyrer, i et passende organisk 15 opløsningsmiddel, fortrinsvis udvalgt blandt (C1~C4)alkyl-sulfoxider, (C^-C^)alkyl-formamider, dioxan, tetrahydro-furan og lignende forbindelser, i nærværelse af en begrænset (0,1-10 vægt%) mængde vand, b) såfremt der vindes en blanding af slutprodukter om 20 ønsket adskiller dem ved en kromatografisk fremgangsmåde, og c) og om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt additionssalt heraf.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved at reaktionstemperaturen er mellem 4°C og 80°C.

5. Fremgangsmåde ifølge krav i, kendetegnet ved at hydrolysen udføres med en blanding af dimetylsulfo-xid og koncentreret saltsyre fra 8:2 til 9,5:0,5 ved en temperatur mellem 40°C og 80°C.

5 Under de samme betingelser er retentionstiden i forhold til antibiotikum L 17054 (Gruppo Lepetit, europæisk patentansøgningspublikation nr. 119575) 1,42. E) en molekylvægt på ca. 1211, bestemt ved FAB-MS 10 F) syrefunktioner med evne til at danne salte G) en aminofunktion med evne til at danne salte

15 H) ingen mannoseenhed bundet til kernedelen, idet disse faktorer er tilskrevet formlen 0A H b 25 N-H Cl^l Jj. °^c_jLhx7 I 5 jJ TVjl fi j] /tC. oh 30 xZy^H hvor A betegner hydrogen eller N-(C1 -j-C^acylaminoglucu-35 ronyl. DK 167770 Bl 77

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3 til frenstilling af antibiotikum 30 A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB eller en faktor deraf, kendetegnet ved at man underkaster antibiotikum A 40926 kompleks, antibiotikum A 40926 kompleks AB, antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor Bg, antibioti-35 kum A 40926 faktor PA eller antibiotikum A 40926 faktor PB kontrolleret sur hydrolyse med en blanding af dimetyl-sulfoxid og 37 vægt%s saltsyre i forholdet 9:1 til 9,5:0,5, 78 Ulv IO///U D I ved en temperatur på ca. 65°C i ca. 5 timer, hvorefter man om ønsket fraskiller antibiotikum A 40926 N-acylamino-glucuronylaglycon faktor A og antibiotikum A 40926 N-acyl-aminoglucuronylaglycon faktor B ved en kromatografisk frem-5 gangsmåde.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 3 til fremstilling af antibiotikum A 40926 aglycon, kendetegnet ved at man underkaster antibiotikum A 40926 kompleks eller en enkelt faktor deraf, antibiotikum A 40926 kompleks AB, 10 antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor PA, antibiotikum A 40926 faktor PB, antibiotikum A 40926 faktor Bq, antibiotikum A 40926 mannosylaglycon og antibiotikum A 40926 N-acylamino-glucuronylaglycon (kompleks AB eller en enkelt faktor der-15 af) kontrolleret sur hydrolyse i nærværelse af: a) et organisk protisk opløsningsmiddel udvalgt blandt alifatiske syrer og α-ha-logenerede alifatiske syrer som er væsker ved reaktionstemperaturen, alifatiske og cyklo-alifatiske alkanoler som ved reaktionstemperaturen er væ-20 sker der er svagt blandbare med vand, fenylsubstituerede lavere alkanoler i hvilke fenyldelen eventuelt bærer alkyl-, alkoxy- eller halogenrester og som ved reak tionstemperaturen er væsker der er svagt blandbare med vand, og Ø-polyhalogenerede lavere alkanoler som ved reak-25 tionstemperaturen er væsker, b) en stærk syre som er forenelig med opløsningsmidler og udvalgt blandt stærke mineralske syrer, stærke organiske syrer og stærkt sure kationbytterharpikser i hydrogenformen, og 30 c) ved en reaktionstemperatur mellem ca.20°C og ca. 100°C.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 3 til fremstilling af antibiotikum A 40926 aglycon, kendetegnet ved at man underkaster antibiotikum A 40926 kompleks, 35 antibiotikum A 40926 kompleks AB, antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor Bq, antibiotikum A 40926 faktor PA, DK 167770 B1 79 antibiotikum A 40926 faktor PB, antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon kompleks AB eller en faktor deraf, eller antibiotikum A 40926 mannosylaglycon kontrolleret sur hydrolyse med en blanding af dimetylsulfoxid og 5 37 vægt%s saltsyre i mængdeforholdet 8:2 til 9,5:0,5 ved en temperatur på ca. 80°C.

9. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved at det indeholder en forbindelse som angivet i krav 1 eller 2 i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.

10. Anvendelse af forbindelse som angivet i krav 1 eller 2 til fremstilling af et medikament til antibiotisk terapi.