KR100430202B1 - 등전성 집속에 의한 달바 헵티드 항생제의 정제 - Google Patents

등전성 집속에 의한 달바 헵티드 항생제의 정제 Download PDF

Info

Publication number
KR100430202B1
KR100430202B1 KR10-1998-0700010A KR19980700010A KR100430202B1 KR 100430202 B1 KR100430202 B1 KR 100430202B1 KR 19980700010 A KR19980700010 A KR 19980700010A KR 100430202 B1 KR100430202 B1 KR 100430202B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibiotic
chamber
group
purified
concentration
Prior art date
Application number
KR10-1998-0700010A
Other languages
English (en)
Other versions
KR19990028712A (ko
Inventor
알레산드라 마리아 보씨
피에르 죠르지오 리게티
에르네스토 리바
루이지 프랑코 제릴리
Original Assignee
아벤티스 벌크 에스.피.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아벤티스 벌크 에스.피.에이. filed Critical 아벤티스 벌크 에스.피.에이.
Publication of KR19990028712A publication Critical patent/KR19990028712A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100430202B1 publication Critical patent/KR100430202B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
    • C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/14—Peptides containing saccharide radicals; Derivatives thereof, e.g. bleomycin, phleomycin, muramylpeptides or vancomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 고정 막, 구체적으로는 쯔비터이온 막을 갖는 다격실 전해조 중에서의 등전성 집속(IEF)을 사용하여 달바헵티드 계의 항생제 화합물을 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 순수한 항생제 화합물, 구체적으로는 항생제 A40926의 순수한 6B-데카르복시-6B-(히드록시메틸)-N63-3-(디메틸아미노)프로필 아미드 유도체에 관한 것이다.

Description

등전성 집속에 의한 달바헵티드 항생제의 정제{Purification of Dalbaheptide Antibiotics by Isoelectric Focusing}
본 발명은 등전성 집속으로 알려져 있는 전기영동 기술을 사용하여 달바헵티드 계의 항생제 화합물을 정제하는 방법에 관한 것이다.
보다 정확하게는, 본 발명의 정제 방법은 고정 막, 구체적으로는 쯔비터이온 막이 있는 다격실 전해조에서의 달바헵티드 항생제의 등전성 집속(IEF)에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 순수한 항생제 화합물, 구체적으로는 항생제 A40926의 순수한 6B-데카르복시-6B-(히드록시메틸)-N63-3-(디메틸아미노)프로필 아미드 유도체에 관한 것이다.
고정 막이 있는 다격실 전해조에서의 IEF의 원리 및 방법의 상세한 설명은 참고문헌 5에서 찾아볼 수 있다.
이 기술에 따르면, 정제하고자 하는 화합물은 소정의 등전점(pI), 및 pI 값에서 양호한 완충 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 양성(兩性) 물질이다(참고문헌 102). 정제하고자 하는 혼합물은 액체 베인(vein) 중에 함유되어 있고, 일련의 챔버들 중의 하나로 트랩핑되는데, 상기 챔버는 원하는 화합물의 pI를 포함하는 등전점을 갖는 2개의 고정 막에 의해 경계가 정해진다. 따라서, 계속되는 전기영동 적정 방법에 의해, 비등전성이거나 또는 상이한 pI 값을 갖는 모든 다른 불순물들은 강제로 챔버를 떠나 보다 음극 또는 양극인 챔버로 향하게 되는 반면, 정제된 화합물은 초기 챔버 내에 남겨진다.
이 정제 기술은 수많은 단백질, 예를 들면 에글린 C(참고문헌 5), AIDS 바이러스의 gp-41에 대한 모노클로날 항체(참고문헌 103), 재조합 사람 성장 호르몬(참고문헌 104), 표피 성장 인자 수용체(참고문헌 105 및 106), 재조합 과산화물 디스뮤타아제(참고문헌 107), 인터류킨(참고문헌 108) 및 글루코아밀라제(참고문헌 109)에 적용되어 왔다.
본 발명은 약 1800 달톤의 분자량을 갖는 다소 작은 분자에, 구체적으로는 달바헵티드 계의 항생제 화합물에 상기 IEF 정제 기술을 적용하는데 적합한 방법을 처음으로 개시한다.
용어 달바헵티드는 일반적으로 7개의 아미노산으로 구성된 고도로 개질된 선형 헵타펩티드를 공통적으로 갖고, 이들 7개 중 5개가 항상 아릴- 및 아릴메틸-아미노산이며, 상기 구조가 공통적인 작용 메카니즘, 즉 세포 파괴를 유도하는 세포벽 합성 중간체 중 1종 이상의 D-알라닐-D-알라닌 말단과의 특이적 결합을 결정하는 모든 항생제 물질로 정의된다. 따라서 용어 달바헵티드는 헵타펩티드 구조를 갖는 D-알라닐-D-알라닌 결합 항생제[D-al{anyl-D-alanine} b{inding} a{ntibiotics} {having} hept{apept}ide {structure}]라는 어구로부터 유래된 것이다.
달바헵티드 항생제는 종래적으로 하기 화학식 (I)로 나타낼 수 있다.
상기 식 중,
W, Z, X1, X2및 T는 달바헵티드 군의 항생제의 관련 부분을 나타내고,
Y는 카르복시산 기 또는 그의 관능성 유도체를 나타낸다.
화학식 (I)은 달바헵티드 항생제의 산 및 염기와의 염 뿐만 아니라 그들의 내부 염을 포함한다.
화학식 (I)로 나타내어진 일반적인 구조에서, 상기한 5개의 기본적 아릴- 및 아릴메틸아미노산은 잔기 Z 및 W와 연결된다. 각각의 아릴 부분 상에서의 치환에서의 약간의 차이와는 별도로, 5개의 아릴- 및 아릴메틸 아미노산은 실질적으로 달바헵티드 항생제 군의 모든 구성원들에게 공통적인 반면, 치환체 X1및 X2를 함유하는 2개의 나머지 아미노산 부분의 상이한 유형 및 구조가 지금까지 알려진 4개의 상이한 아(亞)군으로 추가로 분류할 수 있게 만들고, 이들 각각의 아군은 실용적인 이유로 이전의 과학 문헌에서 일반적으로 글리코펩티드 항생제로서 동정된 군의 공지된 항생제로 언급된다.
상기 4개의 아군은 각각 리스토세틴 타입, 반코마이신 타입, 아보파르신 타입 및 신모니신 타입 항생제로 정의된다.
달바헵티드 항생제의 상세한 분류에 대해서는 참고문헌 1 및 2를 참고할 수 있다.
본 명세서의 용어 및 정의에 따라, 달바헵티드 항생제 및 현재 이들이 분류되고 있는 4개의 아군은 미생물 균주의 대사산물로서 생성된 생성물 및 이들의 반합성 유도체를 모두 포함한다.
발효 생성물은 일반적으로 5개의 기본 아미노산의 아릴 또는 아릴메틸 부분 상에 또는 X1및(또는) X2잔기가 히드록실화 방향족 고리 성분을 함유할 때에는 그들 상에 위치하는 히드록시기와 결합된 당 성분을 함유한다. 소수의 경우, 1개의 페놀계 히드록시 관능기가 황산 성분과 함께 에스테르화될 수 있다. 발효 생성물의 경우, 기호 Y로 표시되는 관능기는 일반적으로 카르복시산 또는 저급 알킬 카르복시에스테르인 반면, 기호 T는 일반적으로 아미노 또는 저급 알킬 아미노(예를 들면, 메틸아미노) 성분을 나타낸다.
특허 및 과학 문헌에 설명되어 있는 반합성 유도체는 예를 들면, 당 부분의 완전 또는 부분 가수분해로부터 유도되어 아릴 또는 아릴메틸 부분 상에 유리 히드록시기를 갖는 생성물, 아릴메틸 부분 상의 벤질계 히드록시기의 제거로부터 유도되는 생성물, 페놀계 히드록시 관능기 상에 특정 당 성분 또는 지방족 또는 지환족 성분의 도입으로부터 유도되는 생성물, 카르복실기 Y의 변형으로부터 유도되어 이들의 관능성 유도체, 예를 들면 에스테르, 아미드 또는 히드라지드 유도체를 생성시키는 생성물, 다양하게 치환된 아미노기를 생성시키는(예를 들면, 알킬화 또는 아실화에 의해) T 부분의 변형으로부터 유도되거나 또는 상기 아민 관능기의 보호기의 도입으로부터 야기되는 생성물, 아미노 당 성분의 아민 성분의 아실화로부터 유도되는 생성물, 원래 할로 치환체를 함유하는 아릴 성분의 할로겐 제거반응으로부터 야기되는 생성물, 또는 아릴 성분 상에 할로(바람직하게는, 클로로, 브로모 및 요오도) 치환체의 도입으로부터 유도되는 생성물이다. 상기 반합성 유도체는 천연 생성물의 기본 구조의 상기한 변형체 중 1개 이상을 함유할 수 있다.
보다 구체적인 표현에 따르면, 지금까지 구조가 결정되어 있는 대부분의 달바헵티드 항생제는 기호 W가 하기하는 화학식의 부분 구조를 나타내는 화학식 (I)로 나타낼 수 있다:
상기 식 중, R1은 수소, 당 성분, 지방족 또는 지환족 탄화수소 성분이고, R2, R3및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐, 바람직하게는 클로로 또는 브로모이고, 가장 바람직하게는 에테르 결합에 대해 오르토 위치에 있고, R5및 R6은 각각 독립적으로 수소 또는 OR7기(여기서 R7은 수소 또는 당 성분임)이다. 상기 화학식 (I)에 나타낸 바와 같이, W기는 동시에 달바헵티드의 헵타펩티드 사슬의 제2,제4 및 제6 아미노산 성분(오른쪽으로부터 출발하였을 때)과 연결되고, 기호 Z는 하기하는 화학식의 부분 구조를 나타낸다.
상기 식 중, OR8및 OR9는 바람직하게는 2개의 페닐 고리를 연결시키는 결합에 대해 각각 파라 및 오르토 위치에 있고, R8및 R9라디칼은 각각 독립적으로 수소 또는 당 성분을 나타내고, 가장 바람직하게는 R8이 수소이다. OR10기는 바람직하게는 2개의 페닐 고리를 연결시키는 결합에 대해 오르토 위치에 있고, R10라디칼은 수소 또는 당 성분을 나타낸다. R11기는 바람직하게는 2개의 페닐 고리를 연결시키는 결합에 대해 메타 위치에 있고, 수소 또는 할로겐, 가장 바람직하게는 수소 또는 클로로이다. 화학식 (I)에 나타낸 바와 같이, Z기는 달바헵티드의 헵타펩티드 사슬의 제5 및 제7 아미노산 성분(오른쪽으로부터 출발하였을 때)과 연결된다.
지금까지 알려진 달바헵티드 항생제를 4개의 아군으로 구별 가능하게 하는 기호 X1및 X2의 의미는 각각 다음과 같다:
X1은 페닐 고리가 할로겐(바람직하게는 클로로), 저급 알킬(바람직하게는 메틸) 및 히드록시(이 때 히드록시기는 임의적으로 아세탈 결합을 통해 당 성분과 결합되거나 또는 황산 잔기로 에스테르화될 수 있음)로부터 선택된 1개 또는 2개의치환체를 임의로 함유할 수 있는 페닐 또는 벤질기를 나타내거나, 또는 카르복실 또는 카르복스아미드 관능기, 티오메틸 또는 메틸술피닐기로 치환된 (C1-C2) 지방족 성분을 나타낼 수도 있고;
X2는 할로겐(바람직하게는 클로로), 저급 알킬(바람직하게는 메틸) 및 히드록시(이 때 히드록시기는 임의적으로 아세탈 결합을 통해 당 성분과 결합될 수 있음)로부터 선택된 1개 또는 2개의 치환체를 임의로 함유할 수 있는 페닐기를 나타내거나, 또는 (C1-C4) 지방족 성분, 바람직하게는 메틸 또는 이소부틸을 나타낼 수 있고; 또는
X1및 X2가 함께 1개 또는 2개의 페닐 고리가 임의적으로는 상기한 바와 같이 치환될 수 있는 옥시비스(페닐렌) 성분을 나타낸다.
지금까지 알려진 화학식 (I)의 달바헵티드 항생제(이들의 반합성 유도체 포함) 대부분의 보다 구체적인 표현법에 따르면, 기호 T는 바람직하게는 1개 또는 2개의 수소 원자가 임의로 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알킬 라디칼에 의해 치환될 수 있고, 이는 다시 (C4-C7) 시클로알킬, 아실 라디칼 또는 아민 관능기의 적합한 보호기에 의한 1개 이상의 치환체를 함유할 수 있는 아민기를 말하거나, 또는 T는 또한 트리(저급 알킬)암모니오 라디칼을 나타낼 수 있고, 이 때 트리(저급 알킬)암모니오 라디칼의 양전하는 강산 또는 내부 산 관능기로부터 유도되는 음이온, 예를 들면 기호 Y로 나타내어지는 카르복시산 성분으로부터 유도되는 카르복실레이트 음이온에 의해 중화된다. 몇몇 경우, T는 또한 수소(예를 들면, 테이코플라닌 반합성 유도체) 또는 히드록시, 옥소 또는 옥시미노 성분(예를 들면, 리스토세틴 유도체)을 나타낼 수도 있다. 따라서, T가 2가 라디칼일 때 화학식 (I) 중의 점선은 추가의 결합을 나타낸다.
기호 Y는 카르복시기, 이들의 관능성 유도체, 예를 들면 카르복시에스테르, 카르복스아미드, 카르보히드라지드기, 또는 히드록시메틸 성분을 나타낸다. 이 정의는 천연 발생 저급 알킬 에스테르, 및 카르복실 관능기의 알콜(예를 들면 지방족 사슬 내에 치환체를 함유하는 지방족 알콜)과의 반응에 의해 형성되는 에스테르를 포함하고, 또한 카르복시기의 지방족, 지환족 및 헤테로시클릭 아민과의 반응에 의해 형성된 일련의 광범위한 치환 아미드류도 포함한다. 구체적으로는, 지방족 아민은 아미노, 저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복시, 카르바밀, 치환된 카르바밀 등과 같은 치환체를 지방족 사슬 상에 함유할 수 있다.
화학식 (I)의 최종 화합물의 염은 분자의 염기성 관능기(예를 들면 기호 T로 나타내어지는 아민 관능기, 또는 기호 Y로 나타내어지는 카르복시에스테르, 카르복스아미드 또는 카르보히드라지드 성분 또는 당 성분(예를 들면, 반코마이신, 아보파르신) 중의 치환체로서 함유되어 있는 아민 관능기)의 산과의 염화로부터 유도되는 것일 수 있다. 별법으로는, 염은 기호 Y로 나타내어지는 카르복실산 관능기, 또는 카르복시에스테르 또는 카르복스아미드 성분 중에 치환체로서 함유되어 있는 산성 관능기 또는 분자의 임의의 다른 부분에 존재할 수 있는 임의의 산성 관능기의 적절한 염기와의 염화를 통해 생성될 수 있다. 내부 염은 달바헵티드 전구체 및(또는) 펜타헵티드 최종 화합물 내에 충분한 강도의 염기성(예를 들면, 아민) 및 산성(예를 들면, 카르복실) 관능기가 동시에 존재하는 경우에 내부의 염화를 통해 생성된 것이다.
달바헵티드 항생제에서, 히드록시기에 연결될 수 있는 당 성분은 히드록실 기 중의 하나에서 아세틸화 또는 메틸화되거나, 또는 1개 또는 2개 위치에서 산소제거될 수 있는 단당류 또는 다당류이고, 예를 들면 지방족 산 라디칼에 의해 아실화될 수 있는 카르복실 또는 아민 치환체를 함유할 수 있다. 특정 당 성분은 방향족 고리 상에 유리 히드록시기를 갖는 달바헵티드 기질 상에서의 화학 또는 미생물 반응을 통해 도입될 수 있다.
염기성 달바헵티드 구조의 히드록시기에 연결된 비치환 단당류 성분의 대표적인 예로서는 육탄당 및 오탄당, 예를 들면 글루코스(예를 들면, 악타플라닌 B2), 갈락토스(예를 들면, 항생제 A 41030C), 만노스(예를 들면, 테이코플라닌 A2), 푸코스(예를 들면, 항생제 A 35512 B), 람노스(예를 들면, 아보파르신) 및 아세틸 만노스(예를 들면, 파르보디신 C3)를 모두 포함한다.
히드록시기에 연결된 카르복시 또는 아미노 치환된 단당류 성분의 대표적인 예로서는 N-아세틸 글루코사민(예를 들면, 테이코플라닌 A2복합체), N-(C9-C12) 지방족 아실 글루코사민(예를 들면, 테이코플라닌 A2복합체), 리스토사민(예를 들면,리스토세틴 A), 악티노사민(예를 들면, 악티노이딘 A), N-(C9-C12) 지방족 아실-2-아미노-2-데옥시-글루쿠론산(예를 들면, 아르다신)을 들 수 있다.
다당류 성분의 대표적인 예는 1개 이상의 다른 당 단위와 연결된, 비치환 및 카르복시 또는 아미노 치환된 당 단위, 예를 들면 글루코스(예를 들면, 악타플라닌 A), 만노스(예를 들면, 리스토세틴 A), 람노스(예를 들면 리스토세틴 B), 올리보스(예를 들면, 오리엔티신 B), 반코사민(예를 들면, 반코마이신) 에피반코사민(예를 들면, 오리엔티신 A, C 및 D), 아코사민(예를 들면, 악티노이딘) 및 리스토사민(예를 들면, 아보파르신)을 모두 함유할 수 있다. 지금까지 알려져 있고 그의 구조가 결정되어 있는 달바헵티드에서, 최대로 4개의 당 단위를 함유하는 다당류가 동정되어 있다.
지금까지 알려진 달바헵티드의 4개의 아군으로의 추가의 분류를 가능하게 하는 특징은 달바헵티드 항생제의 일반적인 분류에 속하는 신규의 천연 생성물 및 이들의 유도체가 얻어지고 동정되어 본 발명의 IEF 방법에 따라 정제될 수 있다는 점에서 결코 본 발명의 영역을 제한하지 않는다. 그러나, 본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 대표적인 화합물의 보다 정확한 동정을 위하여, 하기에서는 상기한 4개의 아군 및 대응하는 대표적인 화합물의 상세한 설명을 추가로 제공한다.
상기 화학식 (I)을 살펴보면, 리스토세틴 타입 달바헵티드로서 동정된 아군은 기호 X1및 X2가 함께 옥시비스(페닐렌) 성분을 나타내고, 이 때 1개 또는 2개의 페닐 고리가 임의로 할로겐(바람직하게는 클로로), 저급 알킬(바람직하게는 메틸)및 히드록시(이 때, 히드록시기는 임의로 아세탈 결합을 통해 당 성분과 결합되거나 또는 황산 잔기로 에스테르화될 수 있음)로부터 선택된 1개 또는 2개의 치환체를 함유할 수 있는 것을 특징으로 한다.
이 아군으로 분류될 수 있는 달바헵티드 항생제는 리스토세틴(참고문헌 6), 악타플라닌(참고문헌 7, 8), 테이코플라닌(참고문헌 9, 10, 11), 항생제 A35512(참고문헌 12, 13), 항생제 A41030(참고문헌 14, 15), 항생제 A47934(참고문헌 16, 17), 아르다신 A, B, C(참고문헌 18, 19, 20), 항생제 A40926(참고문헌 21, 22, 23), 키브델린(참고문헌 24), 파르보디신(참고문헌 25) 및 항생제 UK 68597(참고문헌 26)을 포함한다.
상기한 천연 생성물의 반합성 유도체도 또한 이 아군에 포함된다. 예를 들면, 아르다신의 아글리콘 및 슈도아글리콘(참고문헌 27) 및 Y가 카르복스아미드 또는 카르보히드라지드 성분인 이들의 유도체(참고문헌 28); 파르보디신의 아글리콘 및 슈도아글리콘(참고문헌 29); 악타플라닌의 가수분해 생성물(참고문헌 30); 리스토세틴 A, 항생제 A 35512, A 41030 및 A 47934의 제1 아미노산 성분의 대응하는 케토-유사체로의 전환 생성물(참고문헌 31 및 32); 리스토세틴, 악타플라닌 및 이들의 슈도아글리콘의 아실화 유도체(참고문헌 33); 악타플라닌의 브롬 유사체(참고문헌 34); 리스토세틴의 방향족 알데히드 유도체(참고문헌 35); 테이코플라닌 및 항생제 A40926의 유도체를 들 수 있고, 이들에 대해서는 아래에서 구체적으로 언급된다.
반코마이신 타입 달바헵티드로서 동정된 달바헵티드 항생제 아군은 화학식(I)에서 기호 X1이 카르복실 또는 카르복스아미드 관능기로 치환된 (C1-C2)지방족 잔기를 나타내고, 기호 X2가 (C1-C4)지방족 잔기를 나타낸다는 사실을 특징으로 한다. 구체적으로는, 이 아군 내에 속하는 항생 물질의 가장 흔한 예에서, X1은 아스파르트산, 아스파라긴 또는 글루타민으로부터 유도되는 잔기인 반면, X2는 알라닌 또는 류신으로부터 유도되는 잔기이다.
일부 반코마이신 타입 달바헵티드(예를 들면, M43A, B 및 C, 참고문헌 55)는 추가로 T가, 양전하가 기호 Y로 나타내어지는 카르복실기에 의해 형성된 카르복실레이트 음이온에 의해 중화된 트리메틸암모니오기를 나타내는 것을 특징으로 한다.
이 아군에 분류될 수 있는 다른 달바헵티드 항생제로는 하기하는 것을 들 수 있다: OA-7653(참고문헌 51, 52), A 51568 A 및 B(참고문헌 53, 54), 오리엔티신(참고문헌 56, 57), 에레모마이신(참고문헌 58, 59, 60, 61), A 42867(참고문헌 50, 62), A 82846(참고문헌 63, 64), 클로로오리엔티신(참고문헌 65), MM 47761 및 MM 49721(참고문헌 94), 데카플라닌(참고문헌 95), MM 45289 및 MM 47756(참고문헌 96).
상기한 천연 생성물의 반합성 유도체가 이 아군에 포함된다. 예를 들면, 반코마이신, A51568A 및 B 및 M43D의 가수분해 생성물의 다양하게 글리코실화된 유도체(참고문헌 66); 반코마이신, A 51568A, A 51568B, M 43A 및 M 43B의 데스반코사미닐 및 데스(반코사미닐-O-글루코실)-유도체(참고문헌 67); A 82846의 유도체(참고문헌 93); 일부 반코마이신 타입 달바헵티드의 아민 잔설과 알데히드 및 케톤의반응 생성물 및 대응하는 수소첨가 반응 생성물(참고문헌 68, 69); 반코마이신 타입 항생제의 N-아실 유도체(참고문헌 70, 71), 모노- 및 디데클로로반코마이신(참고문헌 72) 및 에레모마이신의 가수분해 생성물(참고문헌 60)을 들 수 있다.
아보파르신 타입 달바헵티드 아군은 화학식 (I)의 기호 X1이 페닐 또는 벤질기를 나타내고, 이 때 페닐 고리는 임의로 히드록시 및 할로겐(바람직하게는 클로로)으로부터 선택된 1개 또는 2개의 치환체를 함유할 수 있고, 기호 X2가 할로겐(바람직하게는 클로로) 및 임의로 당 성분(예를 들면 람노스)과 결합될 수 있는 히드록시로부터 선택된 1개 또는 2개의 치환체를 임의로 함유할 수 있는 페닐기를 나타내는 것을 특징으로 한다.
이 군에 분류될 수 있는 다른 달바헵티드 항생제로는 하기하는 것을 들 수 있다: 악티노이딘 A, B(참고문헌 3, 75, 76), 클로로폴리스포린 A, B, C(참고문헌 77, 78, 79), 악티노이딘 A2(참고문헌 80, 76) 및 헬베카르딘 A, B(참고문헌 26), MM 47767, MM 55256(참고문헌 92).
달바헵티드 항생제의 아보파르신 타입 아군의 반합성 유도체는 예를 들면 데만노실 클로로폴리스포린 B 유도체, 클로로폴리스포린 슈도아글리콘, 데르함노실 알파 및 베타 아보파르신(참고문헌 81), 아보파르신의 만노실 아글리콘(LL-AV290) 및 1개 이상의 당 성분이 가수분해된 다른 유도체(참고문헌 84)이다.
신모니신 타입 항생제로서 동정된 달바헵티드 항생제 아군은 화학식 (I)에서 기호 X1이 말단 탄소 상에서 티오메틸 또는 메틸술피닐기로 치환된 C2알킬 잔기를나타내고, 기호 X2가 당 성분과 결합될 수 있는 히드록시 치환체를 함유하는 페닐기를 나타내는 것을 특징으로 한다. 신모니신(CWI-785) 복합체, 그의 성분 및 그의 가수분해 생성물 중의 일부(참고문헌 86, 87, 88)가 이 아군의 유일한 구성원인 듯하다.
상기한 바와 같이, 리스토세틴 타입 달바헵티드로 분류될 수 있는 구체적인 화합물은 하기하는 화학식을 갖는 테이코플라닌 A2복합체이다.
상기 식 중, A, B 및 M은 천연 생성물에서 분자 코어에 연결된 당 성분을 나타낸다.
용어 "테이코플라닌" 내에는 발효 복합체의 단일 성분(참고문헌 9) 및 관련 물질(참고문헌 36, 37) 뿐만 아니라 아글리콘, 슈도아글리콘(참고문헌 4, 38, 39, 40) 및 이들의 반합성 유도체가 포함된다.
생물학적 활성에 대해 특히 주목을 받는 테이코플라닌의 반합성 유도체의 화학 구조는 C63카르복시기 및(또는) C15상의 아민 잔기가 변형된, 테이코플라닌 주요 성분, 관련 물질, 아글리콘 및 슈도아글리콘과 동일한 기본 구조를 갖는다. 구체적으로는, 상기 화학식 (I) 중의 기호 Y에 대응하는 C63카르복시기 잔기는 참고문헌 41에 따라 대응하는 에스테르 및 참고문헌 73, 74, 82 및 83에 각각 기재된 의미에 따라 카르복스아미드기 CONR14R15로 변형되었다.
반합성 유도체에서, C15상의 아민 잔기는 보호기와의 반응에 의해 또는 대응하는 알킬아미노 또는 디알킬아미노기(여기서, 알킬 부분은 참고문헌 85, 89, 90 및 91에 따른 치환체를 추가로 함유할 수 있음)로의 전환에 의해 변형된 아민 라디칼을 확인시킨다. C63카르복시기 및 C15상의 아민 잔기 모두에서 변형된 테이코플라닌 유도체 및 이들의 제조 방법은 참고문헌 83 및 98에 기재되어 있다.
선행 기술에 기재된 다른 반합성 테이코플라닌 유도체는 C63카르복시기의 에스테르 및 히드라지드(참고문헌 41 및 42), 데아세틸 글루코사미닐-데옥시 테이코플라닌(참고문헌 43) 및 대응하는 C63카르복시아미드(참고문헌 44), 테이코플라닌의 모노- 및 디-데클로로 유도체(참고문헌 45), 테이코플라닌 아글리콘 및 슈도아글리콘의 O56알킬 및 시클로알킬 유도체(참고문헌 46 및 97) 및 38-데옥시-38-히드록시메틸 유도체(참고문헌 99)를 포함한다.
리스토세틴 타입 달바헵티드 아군 내에 속하는 추가의 화합물은 하기하는 화학식에 의해 정의되는 항생제 A 40926 복합체 및 그의 주요 인자(참고문헌 21, 22,23)이다.
상기 식 중, A 및 M은 천연 생성물에서 분자 코어에 연결된 당 성분을 나타낸다.
테이코플라닌에 대해서 뿐만 아니라, 항생제 A 40926의 수많은 유도체들이 개시되어 있으며, 이들 중에는 이들의 아글리콘(참고문헌 48), 만노실 아글리콘(참고문헌 47), N-아실아미노-데옥시-글리쿠로닐 아글리콘(참고문헌 48), 데아실 유도체(참고문헌 49), C63에스테르 유도체(참고문헌 100) 및 C63-아미드 유도체(참고문헌 101)가 있다.
참고문헌 101은 무엇보다도, 항생제 A 40926의 6B-데카르복시-6B-(히드록시메틸)-N63-3-(디메틸-아미노)프로필 아미드 유도체의 제조 방법을 설명한다. 이 화합물은 6B-데카르복시-6B-(히드록시메틸) 항생제 A 40926과 디메틸프로필아민을 축합제 벤조트리아졸릴옥시-트리스-(피롤리디노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP) 존재하에 반응시켜 제조한다. 그러나 이렇게 얻어진 생성물은 종래의 크로마토그래피 방법 하에 제거될 수 없는 일부 바람직하지 못한 불순물을 함유한다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 한 목적은 바람직하지 못한 불순물로부터 상기 달바헵티드 항생제를 정제하기 위하여 등전성 집속에 기초한 정제 방법을 제공하는 것이다.
상기 분리되어야 하는 불순물은 발효 방법으로부터 얻은 항생제 복합체 혼합물의 부성분이거나 또는 이들의 반합성 유도체를 얻기 위하여 항생제 화합물로 행해야 하는 화학 반응의 부산물일 수 있다.
예를 들면, 달바헵티드 항생제 복합체(천연 또는 반합성)가 환자에 투여되었을 때 히스타민 방출을 이끌어내는 일부 불순물들을 함유할 수 있음은 알려져 있고, 특정 달바헵티드 항생제에 따라, 상기 히스타민 방출은 다소 두드러질 수 있다(참고문헌 114). 상기 히스타민 방출은 또한 예를 들면, 항생제 A40926 복합체의 6B-데카르복시-6B-(히드록시메틸)-N63-3-(디메틸아미노)프로필 아미드 유도체에서 관찰될 수 있다.
이들 불순물은 일반적으로 거의 검출할 수 없고 따라서 거의 개별적으로 제거할 수 없기 때문에, 활성 물질로부터 모든 불순물을 제거할 수 있는 방법이 매우 요망된다.
따라서 본 발명의 IEF 정제법은 종래의 RP-HPLC를 포함하는 크로마토그래피방법들의 배열에 의해서는 제거될 수 없었던 불순물을 제거하는데 강력한 도구이다. 또한 공업적 규모의 달바헵티드 항생제의 정제에 적용될 수 있는 방법이다.
달바헵티드 항생제의 정제를 위해 IEF 기술을 적용하는데 있어서 중요한 장애는, 모든 집속 방법의 경우 공통적으로 그의 pI값에서 정제하고자 하는 화합물이 매우 제한된 용해도를 나타낸다는 것이다. 그의 pI 값에서 분석물질의 적합한 지지 용액의 제법은 비교적 높은 농도에서도 정제하고자 하는 화합물의 용해도를 유지할 수 있게 하고, 따라서 해결하고자 하는 주요 문제점들 중의 하나이고, 사실상 침전시에 불순물은 주요 분획물과 함께 동시침전된다.
쯔비터이온 세제 및 우레아의 수용액이 달바헵티드 항생제 화합물을 용해시키는데 적합함이 이제 발견되었고, CHAPS계의 세제, 즉 콜산의 술포베타인 쯔비터이온 유도체, 예를 들면 {3-[3-(콜아미도프로필)-디메틸암모니오]}-1-프로판술포네이트 또는 {3-[3-(콜아미도프로필)-디메틸암모니오]}-2-히드록시-1-프로판술포네이트, 이들 중 바람직하게는 {3-[3-(콜아미도프로필)-디메틸암모니오]}-1-프로판술포네이트와 우레아의 혼합물이 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
혼합물 중에서 우레아/CHAPS 비 및 이들의 농도는 정제하고자 하는 특정 달바헵티드 화합물에 의존하게 된다. 일반적으로, 용액 중의 우레아 농도는 약 4M 내지 8M 범위에서 변할 수 있고, 예를 들면 항생제 A40926의 63-아미드 유도체를 함유하는 혼합물이 본 발명의 IEF 정제에 관계할 때 우레아의 바람직한 농도는 약 8M이다. IEF 지지 용액에서 CHAPS 세제의 적합한 농도는 약 1% 내지 5%(w/v)일 수 있고, 바람직하게는 농도는 약 2% 내지 4.5%이다. 항생제 A40926의 아미드화로부터 얻어진 혼합물을 정제하는데 특히 바람직한 것은 약 3.5%의 농도이다.
각 달바헵티드 항생제 물질의 pI 값은 통상적인 분석 방법에 따라, 예를 들면 분석 고정화 pH 구배 겔(IPG 겔) 상에서의 전기영동에 의해 용이하게 결정될 수 있다. IPG 겔을 사용하여 pI 값을 결정하는데 적합한 방법은 참고문헌 112에 기재되어 있다.
항생제 분자의 산 및(또는) 염기성 기의 pK 값에 기초한 pI 값의 이론적 계산은 단일 성분의 유효 pK 값을 변화시킬 수 있는 산 및 염기성 성분의 상호작용이 가능하기 때문에, 정확하지 못한 결과를 초래할 수 있다.
달바헵티드 항생제의 적합한 지지 용액이 일단 제조되면, IEF 정제는 당업계에 공지되어 있는 것들과 유사한 방법에 따라 수행될 수 있다.
따라서, 일련의 챔버가 제조되며, 이들 챔버는 증가하는 pI 값을 갖는 많은 등전 막에 의해 결정된다. 막의 pI 값의 범위는 분리하고자 하는 불순물의 pI 값 및 정제하고자 하는 화합물의 소정의 pI 값에 따라 정해지게 된다. 정제하고자 하는 구체적인 달바헵티드에 따라, 막의 pI 값은 약 3 내지 약 9로 변할 수 있다. 일반적으로, pI 값의 범위는 정제하고자 하는 화합물의 pI 값의 약 ±2이게 된다. 막을 제조하는 적합한 방법은 참고문헌 5 및 113에 기재되어 있다.
정제하고자 하는 혼합물의 성분은 따라서 그들의 특이적 pI 값에 따라 등전 구배를 지나 분리되게 되고, 이 방법의 종반에 각 챔버는 그 챔버의 경계를 정하고 있는 2개의 등전 막의 pI 값들 사이에 포함되는 pI 값을 갖는 물질(불순물 또는 주요 화합물)을 함유하게 된다. 양호한 정제 결과를 얻기 위하여, 정제하고자 하는화합물의 pI 값은 물론 불순물의 pI 값과 적어도 최소한의 정도로 상이해야 하지만, 단일 챔버를 한정하는 pI 값은 서로 매우 근접하여 매우 높은 수준의 정제가 가능할 수 있다.
복합체의 1개의 항생제 인자(또는 적어도 그의 주요 인자들)가 유사한 pI 값을 가질 때, 바람직하지 못한 불순물이 항생제 인자의 pI 범위 밖의 pI 값을 갖는 한, 이들 인자들을 모두 한 개의 챔버 내에 수집할 수 있음을 알아야 하며, 이러한 방식으로 활성 항생제 화합물은 각각의 단일 인자를 분리시킬 필요없이 바람직하지 못한 불순물들로부터 전체로 분리될 수 있다. 따라서, 하기하는 본 명세서에서, 표현 "주 성분"이란 항생제 복합체의 단일 인자 및 유사한 pI 값을 갖는 인자들의 혼합물을 말한다.
본 발명의 IEF 정제법을 수행하는데 적합한 장치는 참고문헌 113에 기재되어 있다.
본 발명에 따라, 정제시키고자 하는 화합물은 주 성분이 등전성이 챔버 내로 연속적으로 부하되며, 이러한 방식으로 전기영동 적정 방법 조건 하에서 원하는 화합물(들)은 그 챔버 내로 트랩핑된 채 남아있는 반면, 상이한 pI 값을 갖거나 비등전성인 불순물은 강제로 그 챔버를 떠나 보다 양극 또는 음극인 챔버로 향하게 된다. 필요할 경우, 각 챔버는 생성물의 바람직하지 못한 침전을 피할 수 있도록 적합한 챔버의 순환을 제공하기 위하여 액체 저장조와 연결될 수 있다. 이 선택사항은 주 성분의 챔버에 적용될 때 특히 적합하며, 사실상 IEF 방법이 수행됨에 따라 챔버(비교적 작은 부피를 갖는) 내로의 생성물의 집중은 침전 값으로까지 증가될수 있고, 상기한 바와 같이 이 사건은 주 성분과 함께 불순물도 또한 동시침전되기 때문에 엄격하게 피해야 한다. 한편, 다른 챔버 내로의 불순물의 집중은 바람직할 수 있으며, 따라서 상기한 순환이 필요하지 않다.
본 발명의 정제 방법의 별법의 실시태양에서는, 정제하고자 하는 화합물이 주 성분이 등전성이 아닌 챔버 내로 연속적으로 부하되어 강제로 등전성 챔버를 향해 이동하게 된다. 이 별법은 주요 성분의 하나에 매우 근접한 pI를 갖는 불순물을 분리하는데 특히 적합하다. 정제하고자 하는 혼합물이 그의 등전 챔버 내로 부하될 때, 주 성분의 하나에 매우 근접한 pI 값을 갖는 불순물은 불순물에 등전성인 각각의 이웃하는 음극 또는 양극 챔버를 향해 이동하지 않고 그 챔버 내에 남아 있게 된다. 따라서, 예를 들면 이웃하는 양극 챔버에서 주 성분에 등전성이 아닌 챔버내로 정제하고자 하는 화합물을 부하시킴으로써, 주 성분은 그의 등전 챔버를 향해 이동하는 반면, 보다 양극 pI 값을 갖는 불순물은 초기 챔버 내에 남겨진다.
상기한 바와 같이, 액체 저장조는 각각의 챔버와 연결될 수 있고, 물론 주 성분의 침전을 피하기 위하여 액체 저장조는 이 경우 주 성분에 등전성인 챔버 내로도 연결되어야 한다.
사용되는 전압은 많은 인자, 예를 들면 정제하고자 하는 물질의 타입, 존재하는 불순물의 양, 부하된 물질의 양, 지지 용액의 조성, 및 양극액 및 음극액의 조성, 및 IEF 장치의 기하형태(예를 들면, 치수, 등전 막의 수, 전극들의 거리 등)에 의존하게 되고, 예를 들면, 보다 높은 전압으로 정제 방법을 시작하기 전에 샘플 중의 과량의 염을 제거하기 위하여 낮은 전압이 일반적으로 사용되며, 예를 들면 전극의 거리가 12 cm인 경우 400V 내지 600V 범위의 초기 전압이 사용될 수 있고, 후에 상기 방법은 1000V 내지 5000V, 바람직하게는 약 1500V의 전압에서 수행된다.
전기영동 과정 동안에 형성된 열은 공지되어 있는 기술에 따라 산일(散逸)될 수 있으며, 감소된 가열의 경우, 실온에서 공기중에서의 산일이 충분한 반면, 보다 강한 가열의 경우, 물과 같은 냉각제의 순환이 바람직할 수 있다.
공정 시간은 부하된 물질의 양 및 사용된 전압의 양에 주로 의존하게 된다.
IEF 정제 방법이 수행된 후, 바람직한 화합물은 공지된 기술에 따라 지지 용액으로부터 회수된다. 예를 들면, 우레아/CHAPS 혼합물로부터 정제된 화합물의 분리는 실란화 실리카 겔 컬럼 상에서 수행될 수 있다.
하기하는 실시예는 본 발명의 보다 상세하게 예시한다.
본 특정 실시예는 6B-데카르복시-6B-(히드록시메틸) 항생제 A40926을 축합제 PyBOP 존재하에 디메틸프로필아민과 반응시켜 참고문헌 101에 기재된 아미드화 방법에 따라 얻은 항생제 A40926의 6B-데카르복시-6B-(히드록시메틸)-N63-3-(디메틸아미노)프로필 아미드 유도체(이하, "아미드 유도체")의 정제 방법에 관한 것이다. 약리학적 연구 동안에, 상기 아미드 유도체 복합체는 히스타민 방출 효과를 이끌어낼 수 있는 바람직하지 못한 불순물을 함유함이 발견되었다. 본 발명의 방법을 사용하여, 상기 바람직하지 못한 불순물을 제거하여, 히스타민 방출 효과를 나타내지 않는 정제된 생성물을 얻을 수 있다.
공지되어 있는 바와 같이, 발효 방법(참고문헌 21)으로부터 얻은 항생제 A40926은 1개의 관련 인자들의 혼합물이고, 이 때 주 인자는 인자 B0및 인자 B1이다. 단일 인자들의 비는 발효 조건을 변형시킴으로써 변화될 수 있다(참고문헌 115). 또한, 필요할 경우, A40926의 단일 인자를 먼저 분리시킨 다음 원하는 비율의 단일 인자들의 혼합물을 제조할 수 있다.
명백하게, A40926 복합체의 관련 아미드 유도체는 따라서 특정 항생제 A40926 출발 물질의 조성에 따라 단일 인자들의 아미드 유도체의 대응하는 혼합물일 수 있다.
하기하는 본 명세서에서, 인자 B0및 B1의 아미드 유도체들의 혼합물을 취급할 때, 임의의 비율로 혼합된 2개의 인자들의 혼합물을 말한다.
상기 A40926 인자 B0및 인자 B1의 아미드 유도체는 하기하는 화학식으로 나타낼 수 있다:
상기 식 중, M은 만노실 성분을 나타내고, R1은 인자 B0의 경우 -CH(CH3)2기 또는 인자 B1의 경우 -(CH2)2CH3기를 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따르면, 상기 A40926의 아미드 유도체는 인자 B0및 B1의 아미드의 혼합물로서 바람직하지 못한 불순물이 실질적으로 없이 얻어진다. 인자 B0및 B1의 아미드의 실질적으로 순수한 혼합물이 임의의 비율로 혼합된 2개의 화합물의 혼합물이고, 이 혼합물은 8M 우레아 및 3.5% (w/v) CHAPS의 용액 중에서 측정하였을 때 약 8.40 내지 약 8.65의 범위 내의 pI 값을 갖는 바람직하지 못한 불순물이 없다. 상기 정제된 혼합물을 얻기 위하여, 이 전해조 챔버 내에 정제하고자 하는 혼합물을 부하시키면서 수거 챔버의 2개의 한정 막을 각각 8.41 및 8.65의 pI 값으로 정할 수 있다.
필요할 경우, 부 인자 B1을 주 인자 B0로부터 분리할 수 있고, 따라서 인자 B0의 실질적으로 순수한 아미드 유도체를 얻을 수 있다. 인자 B0의 실질적으로 순수한 아미드 유도체는 8M 우레아 및 3.5% (w/v) CHAPS의 용액 중에서 측정하였을 때 약 8.45 내지 약 8.65의 범위 내의 pI 값을 갖는 바람직하지 못한 불순물이 없는 화합물이다. 상기한 순수한 화합물을 얻기 위하여, 수거 챔버의 2개의 한정 막을 각각 8.45 및 8.65의 pI 값으로 설정할 수 있으며, 이 경우, 정제하고자 하는 혼합물은 바람직하게는 가장 가까운 양극 챔버 중에 부하된다.
도면은 다음을 보여준다:
도 1: 분별되지 않은 샘플의 분석 RP-HPLC; 주 피크는 인자 B0및 B1의 아미드 유도체에 관한 것이다.
도 2: 실시예 1에 따른 분별되지 않은 샘플의 분석 IPG; 샘플 부하량은 트랙 당 80(오른쪽) 내지 600(왼쪽) μg 범위이다.
도 3: 실시예 2에 따른 IEF 정제 방법 후의 챔버 3(pI 8.41 내지 8.65, 정제된 주 분획물이 수거되는 챔버)의 내용물의 분석 RP-HPLC. 주 피크는 인자 B0의 아미드 유도체에 대응하고, 이 피크와 겹쳐지는 보다 작은 피크는 인자 B1의 아미드 유도체에 대응한다.
도 4-6: 실시예 2에 따른 IEF 정제 방법 후의 챔버 1, 2 및 4(불순물이 수거되는 챔버)의 내용물의 분석 RP-HPLC.
도 7: 실시예 3에 따른 IEF 정제 방법 후의 챔버 3(pI 8.46 내지 8.65, 정제된 인자 B0의 아미드 유도체가 수거되는 챔버)의 내용물의 분석 RP-HPLC. 주 피크는 인자 B0의 순수한 아미드 유도체에 대응한다.
분석 RP-HPLC 계
- 장치: 2개의 모델 305 펌프, 모델 232 자동샘플채취기, 모델 805 압력계, 모델 811B 동력학적 혼합기[모두 미합중국 위스콘신주 미들타운 소재 길슨 메디칼 일레트로닉(Gilson Medical Electronic) 제품];
- 컬럼: YMC-팩(Pack) C4-AMP 5 μm, 20 nm, 250 x 4.6 mm[일본국 교또 구세군 신아라미 다이 구미자마쪼 소재 와이엠씨 캄파니 리미티드(YMC Co. Ltd.) 제품];
- 용출:
상 A: 물/아세토니트릴/인산 (95/5/0.05),
상 B: 물/아세토니트릴/인산 (5/95/0.05),
구배 프로필: 시간(분): 2 25 35 55 60 64 65
%B: 5 20 20 40 95 95 5
투입 부피: 100 μl,
유속: 1.8 ml/분,
오븐 온도: 30 ℃;
- 검출: 모델 116 UV 검출기[미합중국 위스콘신주 미들타운 소재 길슨 메디칼 일레트로닉 제품] 상에서 254 nm에서 UV 흡광.
<실시예 1>
주 성분 및 불순물의 pI 값을 측정하기 위한 분석용 고정화 pH 구배(IPG) 겔의 제조
겔 치수: 25 x 10 cm, 0.5 mm 두께; pH 간격: 7.0 내지 10.0.
IPG 범위를 참고문헌 110에 기재되어 있는 제조 지침서에 따라 5% T, 4% C 폴리아크릴아미드 매트릭스 중에서 정한다. 2개의 한계 산성 및 염기성 혼합물을 제조한 후, 이들을 중성에 가까운 pH 값으로 (약산 및 약 염기를 사용하여) 적정한다. 이는 예비형성된 pH 구배를 통해 균일한 중합 및 효과적인 단량체 전환을 확실하게 하기 위해 중요하다. 증류수(3 x 30 분) 중에서 겔 세척시에, 모든 첨가된 적정물(뿐만 아니라 촉매 및 중합되지 않은 단량체)이 효과적으로 제거된다. 이어서 겔을 2% 글리세롤 용액 중에서 30분 동안 평형화시키고, 공기 중에서 건조시키고 8M 우레아 및 3.5% CHAPS의 혼합물 중에서 밤동안 재팽윤시켰다. 샘플을 80 내지 600 μg/트랙의 농도로 양극 겔 쪽에서 표면 웰 내에 가하였다. 500 V에서 처음의 1 시간 기간 후에, 20 ℃에서 6 시간 동안 2500 V에서 집속을 계속하였다.
겔 염색을 위하여, 류코 형태의 12.5% TCA 중의 쿠마씨 브릴리언트 블루 G. 250의 콜로이드성 분산액을 사용하였다(참고문헌 111 참조). 순수한 증류수 중에서 헹굼으로써 색 향상을 얻었다.
도 2는 분석 IPG의 결과를 나타낸다.
인자 B0및 B1의 아미드 유도체의 pI 값을 정확하게 측정하기 위하여, 8M 우레아 및 1% CHAPS의 혼합물을 사용하여 8.0 내지 9.0의 pH 간격에서 동일한 조건을 사용하여 상기 방법을 반복하였다. 이렇게 측정된 인자 B0의 아미드 유도체의 pI 값은 8.56인 반면, 인자 B1의 아미드 유도체의 pI 값은 8.40이었다.
<실시예 2>
샘플(항생제 A40926 인자 B 0 및 B 1 의 아미드)의 IEF 정제
등전성 완충 막과 함께 조립되어야 하는 다격실 전해조로 이루어진, Iso-PrIME 장치[미합중국 샌프란시스코 소재 훼퍼 사이.(Hoefer Sci.) 제품]을 사용하여 IEF 정제를 수행하였다.
A) 등전성 고정화 막의 제조
상기 분석 겔 중에서 주 분획물 및 불순물의 정확한 pI 값을 측정한 후, 하기하는 pI 값을 갖는 6개의 등전 막을 제조하였다: 7.00, 8.31, 8.41, 8.46, 8.65 및 9.50. 모든 막을 직경 4.7 cm 및 두께 약 1 mm의 디스크 형태의 10%T, 4%C 매트릭스로서 주조하였고, 막을 유리 섬유 필터로 지지하였다(이들의 특성 및 제법에 관한 상세한 설명은 참고문헌 5 및 113 참조).
B) 실험 조건
- 양극액: 8M 우레아 및 0.1% CHAPS 중에서의 5 mM 아세트산(pH 4.84, 전도도: 85.5 μmhos);
- 챔버 내의 지지 용액: 8M 우레아 및 3.5% CHAPS의 혼합물;
- 전극 전해조 내의 지지 용액: 8M 우레아 및 0.1% CHAPS.
샘플 중에서의 과량의 염을 제거하기 위한 초기 저전압 실행(500 V) 후, 30 시간 동안 500 V(12 cm 전극 거리에 걸쳐)에서 정제를 수행하였다. 순환하는 냉각제는 사용하지 않았고, 실온(22 ℃)에서 공기 중에 주울 열을 산일시켰다. 상기 조건 하에서, 정상 상태에서 전해조 중의 액체의 온도 상승은 단지 3 ℃이었다.
C) 정제 과정
다격실 전해조의 챔버 3(pI 8.41 및 pI 8.65 막 사이에 있고, 주 성분이 등전적으로 트랩핑됨)에서 (8M 우레아 및 3.5% CHAPS 100 ml 중에 용해된) 샘플 500 mg을 부하시켜 예비 실험을 행하였다. 이 챔버의 내용물을 저장조로부터 순환시키는 반면, 모든 이웃하는 챔버들은 어떠한 저장조에도 연결되지 않았다. 전해조의 각 챔버의 액체 내용물이 5 ml인 반면, 챔버 3(챔버 + 저장조)에서는 100 ml이었고, 이 결과는 이웃하는 챔버 내에서 20배 농축된 불순물의 수거를 야기시켰다.
예비 시험 결과를 도 3 내지 6에 요약하였는데, 여기서는 각 챔버의 RP-HPLC 분석을 나타낸다.
도 1은 주 성분의 과중한 과부하로 나타내어지는 바와 같이, 성분들의 전체 스펙트럼을 제공한다. pI 스펙트럼으로 RP-HPLC 중에서 용출 순서를 완전하게 비교할 수는 없지만, 성분 B1은 성분 B0에 대한 가장 가까운 양극 pI 값을 갖는 화합물과 명백하게 구별가능하다.
전해조의 챔버 1(pI 7.0 및 pI 8.31 막 사이에 있음)에서 수거되는 성분들의 스펙트럼은 도 4에 나타나 있고, 챔버 2(pI 8.31 및 pI 8.41 막 사이에 있음)에서 농축된 불순물은 도 5에 나타나 있고, 마지막 챔버(4번, pI 8.65 및 pI 9.5 막 사이에 있음)에서 농축된 불순물은 도 6에 나타나있다.
주 성분(챔버 3에서 수거됨, pI 8.41 및 pI 8.65 막 사이에 있음)는 도 3에 나타나 있고, 주 피크에 가까운 보다 작은 피크는 인자 B1의 아미드 유도체에 대응한다.
<실시예 3>
A40926 인자 B 0 의 순수한 아미드 유도체
실시예 2와 동일하지만, 챔버 3에서의 pI 범위가 이제 8.46 내지 8.65이고,샘플 500 mg을 챔버 3 대신에 가장 가까운 양극 챔버 내로 부하시키고, 챔버 3(주 성분이 강제로 이동하게 되고 등전적으로 트랩핑됨)의 내용물을 저장조로부터 순환시키는 것만이 다른 실험 조건 하에서 실시예 2를 반복하였다.
도 7은 이 정제의 결과를 나타내는데, A40926 인자 B0의 아미드 유도체의 주 피크에 가까운 보다 작은 피크가 없고, 따라서 A40926의 B1의 아미드 유도체의 부재를 나타낸다.
<실시예 4>
우레아/CHAPS 지지 혼합물로부터 A40926 인자 B 0 의 아미드 유도체의 분리
실시예 3에 따라 얻은 챔버 3(50 ml 중의 200 mg) 중에 함유되어 있는 최종 용액을 0.5M 트리스(450 ml, pH 9)로 희석시키고, 미니플러스(Miniplus) 3 연동 펌프(길슨 제품)를 사용하여 4 ml/분의 유속에서 실란화 실리카 겔 컬럼(16 x 250 mm)의 상부에 가하고, 메탄올을 용출제로서 사용하였다.
용액을 가하기 전에, 컬럼을 트리스 완충제(0.5M, pH 9)로 세척하였다.
용액을 가한 후, 컬럼을 먼저 트리스 완충제(0.5M, pH 9)로 0의 광학 밀도까지 세척시킨 다음 염을 제거하기 위하여 증류수로 세척하였다.
UV 검출기 모델 2138 유니코드[스웨덴 웁살사 소재 엘케이비(LKB) 제품]을 사용하여 280 nm에서 용출물 용액의 모니터링을 행하였다.
0과 다른 광학 밀도를 나타내는 분획물을 수거하여 RP-HPLC(상기 방법 참조) 및 실리카 겔 F254[독일 담스타트 소재 머크(Merck) 제품] 상의 TLC, 이동상CHCl3/CH3OH/NH4OH(50/47/3) 또는 CH3CN/H2O/CH3COOH/CH3OH(50/20/15/5)로 분석하고, UV 램프 또는 요오드 증기로 가시화시켰다.
A40926 인자 B0의 순수한 아미드 유도체를 함유하는 분획물들을 수거하여, 진공 하에 농축시키고, 동결건조시켰다.
참고문헌
번호

Claims (13)

  1. 지지 용액이 콜산의 술포베타인 쯔비터이온 유도체인 세제 및 우레아의 수성 혼합물임을 특징으로 하는, 고정 쯔비터이온 막을 갖는 다격실 전해조 중에서의 등전성 집속을 사용하는, 달바헵티드 계 항생제 화합물의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세제가 {3-[3-(콜아미도프로필)디메틸암모니오]}-1-프로판술포네이트인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 우레아의 농도가 4M 내지 8M인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 우레아의 농도가 8M인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세제의 농도가 1% 내지 5%(w/v)인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세제의 농도가 2% 내지 4.5%(w/v)인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세제의 농도가 3.5%(w/v)인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 달바헵티드 항생제가 리스토세틴 타입 아군에 속하는방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 정제하고자 하는 달바헵티드 항생제가 리스토세틴, 악타플라닌, 테이코플라닌, 항생제 A35512, 항생제 A41030, 항생제 A47934, 아르다신 A, B, C, 항생제 A40926, 키브델린, 파르보디신, 항생제 UK 68597, 또는 상기 항생제의 천연 또는 반합성 유도체인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 정제하고자 하는 달바헵티드 항생제가 항생제 A40926 복합체 또는 이들의 천연 또는 반합성 유도체인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 정제하고자 하는 달바헵티드 항생제가 항생제 A40926 복합체의 6B-데카르복시-6B-(히드록시메틸)-N63-3-(디메틸아미노)프로필 아미드 유도체인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 정제된 생성물이 수거되는 챔버의 2개의 경계 막이 각각 8.41 및 8.65의 pI 값으로 설정된 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 정제된 생성물이 수거되는 챔버의 2개의 경계 막이 각각 8.45 및 8.65의 pI 값으로 설정된 방법.
KR10-1998-0700010A 1995-07-05 1996-06-25 등전성 집속에 의한 달바 헵티드 항생제의 정제 KR100430202B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP95110467 1995-07-05
EP95110467.8 1995-07-05
EP95111583.1 1995-07-24
EP95111583 1995-07-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR19990028712A KR19990028712A (ko) 1999-04-15
KR100430202B1 true KR100430202B1 (ko) 2004-09-18

Family

ID=26138707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-1998-0700010A KR100430202B1 (ko) 1995-07-05 1996-06-25 등전성 집속에 의한 달바 헵티드 항생제의 정제

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5939523A (ko)
EP (1) EP0836619B1 (ko)
JP (1) JP4051421B2 (ko)
KR (1) KR100430202B1 (ko)
AT (1) ATE274524T1 (ko)
AU (1) AU701463B2 (ko)
CA (1) CA2226142C (ko)
DE (1) DE69633234T2 (ko)
DK (1) DK0836619T3 (ko)
ES (1) ES2224173T3 (ko)
IL (1) IL122151A (ko)
PT (1) PT836619E (ko)
WO (1) WO1997002288A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2250578C (en) * 1996-04-23 2003-06-24 Versicor Inc. Improved chemical process for preparing amide derivatives of antibiotic a 40926
AU4054900A (en) 1999-04-02 2000-10-23 Advanced Medicine East, Inc. Desleucyl glycopeptide antibiotics and methods of making same
US6699836B2 (en) 1999-04-02 2004-03-02 The Trustees Of Princeton University Vancomycin analogs
WO2002085403A1 (en) * 2001-04-25 2002-10-31 Wyeth Holdings Corporation Substantially pure glycopeptide antibiotics ac-98-1; ac-98-2; ac-98-3; ac-98-4 and ac-98-5
US6713448B2 (en) * 2001-04-25 2004-03-30 Wyeth Holdings Corporation Substantially pure glycopeptide antibiotics AC-98-1; AC-98-2; AC-98-3; AC-98-4 and AC-98-5
US20050090433A1 (en) * 2002-11-18 2005-04-28 Vicuron Pharmaceuticals, Inc Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections
US20070105757A1 (en) * 2005-10-31 2007-05-10 May Thomas B Vancomycin formulations having reduced amount of histamine
CN101851277B (zh) * 2009-03-12 2012-10-03 成都雅途生物技术有限公司 一种道古霉素关键中间体a40926 bo组分的纯化制备方法
CN105671110B (zh) * 2015-05-05 2019-02-01 重庆乾泰生物医药有限公司 一种生产达巴万星前体a40926的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0525499A1 (en) * 1991-07-29 1993-02-03 GRUPPO LEPETIT S.p.A. Amide derivatives of antibiotic A 40926

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2951766A (en) * 1957-07-15 1960-09-06 Le Roy A White Antiseptic plastic
US4322343A (en) * 1980-12-18 1982-03-30 Eli Lilly And Company Pseudo-aglycone of actaplanin
US4521335A (en) * 1983-07-13 1985-06-04 Smithkline Beckman Corporation Aglycone and pseudo-aglycones of the AAD 216 antibiotics
US4563442A (en) * 1983-10-21 1986-01-07 Eli Lilly And Company Glycopeptide bioconversion products
US4504467A (en) * 1983-10-21 1985-03-12 Eli Lilly And Company Glycopeptide derivatives
DE3572178D1 (en) * 1984-04-16 1989-09-14 Lilly Co Eli Improvements in and relating to antibiotics m43a, m43b, m43c and m43d
US4552701A (en) * 1984-04-16 1985-11-12 Eli Lilly And Company Glycopeptide antibiotics and process of preparation
GB8415092D0 (en) * 1984-06-13 1984-07-18 Lepetit Spa Ester derivatives
GB8425685D0 (en) * 1984-10-11 1984-11-14 Lepetit Spa Antibiotic a 40926 complex
IL78597A0 (en) * 1985-04-25 1986-08-31 Lilly Co Eli Novel glycopeptide derivatives
US4698327A (en) * 1985-04-25 1987-10-06 Eli Lilly And Company Novel glycopeptide derivatives
US4643987A (en) * 1985-08-14 1987-02-17 Eli Lilly And Company Modified glycopeptides
US4639433A (en) * 1985-08-14 1987-01-27 Eli Lilly And Company Glycopeptide derivatives
GB8522574D0 (en) * 1985-09-12 1985-10-16 Lepetit Spa Amides of teicoplanin compounds
GB8531846D0 (en) * 1985-12-30 1986-02-05 Lepetit Spa Antibiotic a 40926 mannosyl aglycon
US4946941A (en) * 1986-01-24 1990-08-07 Shionogi & Co., Ltd. Novel glycopeptide antibiotics
GB8608809D0 (en) * 1986-04-11 1986-05-14 Lepetit Spa Antibiotic
JP2516202B2 (ja) * 1986-07-10 1996-07-24 三共株式会社 グリコペプチド系抗生物質
GB8618445D0 (en) * 1986-07-29 1986-09-03 Lepetit Spa Antibiotic a 42867
US4742045A (en) * 1986-07-30 1988-05-03 Smithkline Beckman Corporation Glycopeptide antibiotics
DK363587A (da) * 1986-07-30 1988-01-31 Smithkline Beckman Corp Antibiotika og fremstilling heraf under anvendelseaf actinomadura parvosata
GB8621912D0 (en) * 1986-09-11 1986-10-15 Lepetit Spa Increasing ratio of components of anti-biotic complex
GR871488B (en) * 1986-10-10 1987-11-12 Lepetit Spa New antibiotics
GB8624806D0 (en) * 1986-10-16 1986-11-19 Pfizer Ltd Glycopeptide antibiotic
IE873523L (en) * 1986-12-30 1988-06-30 Memorex Corp Glycosylated glycopeptides
GB8701872D0 (en) * 1987-01-28 1987-03-04 Lepetit Spa N15-alkyl & n15,n15-dialkyl derivatives
EP0287513B1 (en) * 1987-04-11 1992-12-02 Ciba-Geigy Ag An isoelectric focusing process and a means for carrying out said process
GB8711066D0 (en) * 1987-05-11 1987-06-17 Lepetit Spa Teicoplanin derivatives
GB8715735D0 (en) * 1987-07-03 1987-08-12 Lepetit Spa De-mannosyl teicoplanin derivatives
US4882313A (en) * 1987-07-31 1989-11-21 Smithkline Beckman Corporation Carboxamide derivatives of glycopeptides
PT88523B (pt) * 1987-09-19 1992-11-30 Beecham Group Plc Processo para a producao de um antibiotico glicopeptidico
GB8802211D0 (en) * 1988-02-02 1988-03-02 Lepetit Spa Teicoplanin hydrazides
EP0368949A1 (en) * 1988-02-10 1990-05-23 Beecham Group Plc Novel antibiotic compounds
DK203089A (da) * 1988-04-28 1989-10-29 Beecham Group Plc Metaboliter
GB8817053D0 (en) * 1988-07-18 1988-08-24 Lepetit Spa Process for preparing n15 n15-dialkyl derivatives of teicoplanin compounds
GB8817052D0 (en) * 1988-07-18 1988-08-24 Lepetit Spa Process for preparing n15-alkyl derivatives of teicoplanin compounds
GB8817397D0 (en) * 1988-07-21 1988-08-24 Lepetit Spa N15-alkyl & n15 n15-di-alkyl derivatives of teicoplanin antibiotics carrying functional groups on alkyl side chain
GB8817736D0 (en) * 1988-07-26 1988-09-01 Lepetit Spa New teicoplanin antibiotics
IN167068B (ko) * 1988-08-27 1990-08-25 Hoechst India
CA1339808C (en) * 1988-10-19 1998-04-07 Manuel Debono Glycopeptide antibiotics
GB8827202D0 (en) * 1988-11-22 1988-12-29 Lepetit Spa Process for preparing 63-carboxyamides of teicoplanin antibiotics
US5194424A (en) * 1988-12-27 1993-03-16 Gruppo Lepetit Spa C63 -amide derivatives of 34-de(acetylglucosaminyl)-34-deoxy-teicoplanin and their use as medicaments against bacteria resistant to glycopeptide antibiotics
IE64155B1 (en) * 1989-03-29 1995-07-12 Lepetit Spa New substituted alkylamide derivatives of teicoplanin
US5185320A (en) * 1989-04-03 1993-02-09 Gruppo Lepetit S.P.A. O56 -alkyl derivatives of aglycone and pseudo aglycones of teicoplanin
ES2106738T3 (es) * 1990-03-28 1997-11-16 Lepetit Spa Procedimiento de preparacion de derivados de manosil-teicoplanina y de aglicona de manosil-teicoplanina.
HUT63860A (en) * 1990-12-05 1993-10-28 Lepetit Spa Process for producing 39-decarboxy-38-(hydroxymethyl) derivatives of teikoplanin antibiotics
HU210665B (en) * 1991-03-27 1995-06-28 Lepetit Spa Process for producing ester derivatives of the antibiotic a 40926 and pharmaceutical compositions containing them as active component

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0525499A1 (en) * 1991-07-29 1993-02-03 GRUPPO LEPETIT S.p.A. Amide derivatives of antibiotic A 40926

Also Published As

Publication number Publication date
AU701463B2 (en) 1999-01-28
EP0836619A1 (en) 1998-04-22
KR19990028712A (ko) 1999-04-15
CA2226142A1 (en) 1997-01-23
IL122151A (en) 2001-08-26
CA2226142C (en) 2007-11-13
DE69633234D1 (de) 2004-09-30
JPH11508572A (ja) 1999-07-27
AU6416196A (en) 1997-02-05
IL122151A0 (en) 1998-04-05
EP0836619B1 (en) 2004-08-25
US5939523A (en) 1999-08-17
ATE274524T1 (de) 2004-09-15
WO1997002288A1 (en) 1997-01-23
ES2224173T3 (es) 2005-03-01
JP4051421B2 (ja) 2008-02-27
DE69633234T2 (de) 2005-09-15
DK0836619T3 (da) 2004-12-06
PT836619E (pt) 2004-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Harwig et al. Purification of cysteine-rich bioactive peptides from leukocytes by continuous acid-urea-polyacrylamide gel electrophoresis
Leung-Tack et al. Neutrophil chemotactic activity is modulated by human cystatin C, an inhibitor of cysteine proteases
KR100430202B1 (ko) 등전성 집속에 의한 달바 헵티드 항생제의 정제
JPS6222799A (ja) 血液凝固阻害作用を有する新規ポリペプチド
EP0214659A2 (en) Peptide derivatives, process for the production thereof and pharmaceutical compositions containing same
EP0228452B1 (en) Protein purification
EP2004671B1 (en) Two-phase precipitation of proteins
KR100902209B1 (ko) 마가이닌 유도체
Lagu Applications of capillary electrophoresis in biotechnology
KR20030031502A (ko) 디디에스 화합물 및 그의 제조방법
Ettori et al. Purification of recombinant human growth hormone by isoelectric focusing in a multicompartment electrolyzer with Immobiline membranes
Hirose et al. cDNA cloning of rat liver 2, 4-dienoyl-CoA reductase
EP1132402B1 (en) Peptide fragments having cell death inhibitory activity
US4590003A (en) Platelet related growth regulator
WO1993021224A1 (en) Ultrapure human epidermal growth factor
JP3016793B2 (ja) 還元型の非グリコシル化組換ヒトｉｌ▲下２▼、その取得方法、及び薬物としてのその使用
King et al. Reaction of tobacco mosaic virus with maleic anhydride and some possible applications to X-ray diffraction analysis
Paukovits et al. The Granulocytic Chalone–A Specific Inhibitor of Granulopoiesis: Molecular Weight and Chemical Nature
CA1340281C (en) Process for preparing and purifying alpha-interferon
Liefländer et al. Structural elements of anaphylatoxin obtained by contact activation of hog serum
FI91484C (fi) Menetelmä uuden solun kasvua säätelevän tekijän, onkostatiini M:n valmistamiseksi
Lee et al. Distinctive properties of ferritin from the Reuber H-35 rat hepatoma
Webster et al. Isolation and partial characterization of transferrin in the sea lamprey, Petromyzon marinus
Akedo et al. Changes of isoelectric points of concanavalin A induced by the binding of carbohydrates
Bossi et al. Purification of glycopeptide antibiotics by isoelectric focusing in multicompartment electrolyzers with Immobiline membranes

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment
FPAY Annual fee payment
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160318

Year of fee payment: 13

EXPY Expiration of term