JP3016793B2 - 還元型の非グリコシル化組換ヒトｉｌ▲下２▼、その取得方法、及び薬物としてのその使用 - Google Patents
還元型の非グリコシル化組換ヒトｉｌ▲下２▼、その取得方法、及び薬物としてのその使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、還元型における生物学上活性な非グリコシ
ル化組換ヒトインタロイキン２（ｒ−hIL2として記載さ
れる）、その取得方法、及び薬物としてのその使用に関
するものである。
ル化組換ヒトインタロイキン２（ｒ−hIL2として記載さ
れる）、その取得方法、及び薬物としてのその使用に関
するものである。
［従来の技術］ 活性化Ｔ細胞の増殖を刺戟するリンホキンである天然
ヒトIL2は、蛋白のアミノ酸配列における位置58、105及
び125に位置する３個のシステインを有する。位置58及
び105におけるシステインはジスルフィド架橋により結
合されるのに対し、位置125におけるシステインは遊離
スルフヒドリル基を有する［R.J.ロブス等、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA（1
984）、第81巻、第6486〜6490頁］。
ヒトIL2は、蛋白のアミノ酸配列における位置58、105及
び125に位置する３個のシステインを有する。位置58及
び105におけるシステインはジスルフィド架橋により結
合されるのに対し、位置125におけるシステインは遊離
スルフヒドリル基を有する［R.J.ロブス等、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA（1
984）、第81巻、第6486〜6490頁］。
ADNの組換技術により対立遺伝子から或いは誘導体か
らヒトIL2を製造する方法が記載されている。たとえば
T.タニグチ等［ネイチャー（1983）、第302巻、第305〜
310頁］及びR.デボス等［ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ（1983）、第11巻、第4307〜4323頁］は微生物に
おけるヒトIL2遺伝子のクローン化及びその発現を記載
しており、さらにC.ジュー等［ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー（1987）、第262巻、第5723〜5731
頁］はIL2の組換誘導体の発現を得ている。さらに、IL2
は不溶性顆粒の状態で微生物に蓄積する際３個のチオー
ル基を有する還元型で見出されかつ活性が失われること
も知られている［日本国特許出願JP1257931号］。した
がって、活性IL2を得るためには顆粒中に蓄積した還元
型蛋白の酸化工程を必要とすることが認められている。
これを行なうには、蛋白を変性用媒体中に溶解させた
後、復元を必要とする適当なジスルフィド架橋58〜105
の形成を、調節された酸化媒体中で行なった。たとえば
酸素のみによる酸化（空気中での自己酸化）又は第二銅
イオン若しくはたとえばチオールのような弱酸化剤の存
在下での酸化或いはチオール−ジスルフィド混合物によ
る酸化のような種々異なる方法が記載されている［T.ツ
ジ等、バイオケミストリー（1987）、第26巻、第3129〜
3134頁］。
らヒトIL2を製造する方法が記載されている。たとえば
T.タニグチ等［ネイチャー（1983）、第302巻、第305〜
310頁］及びR.デボス等［ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ（1983）、第11巻、第4307〜4323頁］は微生物に
おけるヒトIL2遺伝子のクローン化及びその発現を記載
しており、さらにC.ジュー等［ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー（1987）、第262巻、第5723〜5731
頁］はIL2の組換誘導体の発現を得ている。さらに、IL2
は不溶性顆粒の状態で微生物に蓄積する際３個のチオー
ル基を有する還元型で見出されかつ活性が失われること
も知られている［日本国特許出願JP1257931号］。した
がって、活性IL2を得るためには顆粒中に蓄積した還元
型蛋白の酸化工程を必要とすることが認められている。
これを行なうには、蛋白を変性用媒体中に溶解させた
後、復元を必要とする適当なジスルフィド架橋58〜105
の形成を、調節された酸化媒体中で行なった。たとえば
酸素のみによる酸化（空気中での自己酸化）又は第二銅
イオン若しくはたとえばチオールのような弱酸化剤の存
在下での酸化或いはチオール−ジスルフィド混合物によ
る酸化のような種々異なる方法が記載されている［T.ツ
ジ等、バイオケミストリー（1987）、第26巻、第3129〜
3134頁］。
酸化復元の後、異性体分子内架橋58〜105及び105〜12
5並びに不活性であることが示されかつA.ワング等［サ
イエンス（1984）、第224巻、第1431〜1433頁］又はJ.
L.ブラウイング等［アナリチカル、バイオケミストリー
（1986）、第155巻、第123〜128頁］にしたがう逆相ク
ロマトグラフィーにより分離しうる分子内架橋の形成に
相当する酸化生成物を除去するには、クロマトグラフィ
ーによる精製を必要とする。
5並びに不活性であることが示されかつA.ワング等［サ
イエンス（1984）、第224巻、第1431〜1433頁］又はJ.
L.ブラウイング等［アナリチカル、バイオケミストリー
（1986）、第155巻、第123〜128頁］にしたがう逆相ク
ロマトグラフィーにより分離しうる分子内架橋の形成に
相当する酸化生成物を除去するには、クロマトグラフィ
ーによる精製を必要とする。
顆粒の形態で蓄積した蛋白から出発して適当な生物学
的活性を有する均質な酸化組換IL2を得るには、したが
って如何なる方法にしたがうにせよ、或る種の技術的問
題を提起する。何故なら、数段階の精製を必要とし、こ
れは求める生成物の低収率をもたらすからである。
的活性を有する均質な酸化組換IL2を得るには、したが
って如何なる方法にしたがうにせよ、或る種の技術的問
題を提起する。何故なら、数段階の精製を必要とし、こ
れは求める生成物の低収率をもたらすからである。
［発明の要点］ 本発明は、新規な還元型の非グリコシル化活性組換ヒ
トIL2、そしてIL2の生物学的活性を有する生成物を得る
ために再酸化工程を必要としない前記ヒトIL2の製造方
法に関する。
トIL2、そしてIL2の生物学的活性を有する生成物を得る
ために再酸化工程を必要としない前記ヒトIL2の製造方
法に関する。
即ち、本発明は、一方では、次のアミノ酸配列： （ここで、Ｘはメチオニン若しくは水素原子を示し、位
置58、105及び125における３個のシステインは還元型で
ある） を有し、他方では、同じ配列を有し且つ位置58−105に
ジスルフィド架橋を含有する酸化型IL2の生物学的活性
と類似の生物学的活性を有することを特徴とする、非グ
リコシル化組換ヒトインタロイキン２に関するものであ
る。
置58、105及び125における３個のシステインは還元型で
ある） を有し、他方では、同じ配列を有し且つ位置58−105に
ジスルフィド架橋を含有する酸化型IL2の生物学的活性
と類似の生物学的活性を有することを特徴とする、非グ
リコシル化組換ヒトインタロイキン２に関するものであ
る。
還元型という用語は、IL2を含有するシステイン残基
が遊離スルフヒドリル基を有するものと理解され、その
決定は例えばジチオピリジンをチオール試薬として用い
る分光光度法により行われる。本発明に関する還元型の
生物学的活性はジスルフィド架橋58〜105を有する対応
の酸化型と同様に決定され、テトラゾリウム塩での比色
試験によりIL2CTLL−２に応じたネズミの白血病細胞ラ
インの増殖を測定して行われる［T.J.モスマン、イミュ
ノロジカル・メソッズ（1983）、第65巻、第55〜63
頁］。
が遊離スルフヒドリル基を有するものと理解され、その
決定は例えばジチオピリジンをチオール試薬として用い
る分光光度法により行われる。本発明に関する還元型の
生物学的活性はジスルフィド架橋58〜105を有する対応
の酸化型と同様に決定され、テトラゾリウム塩での比色
試験によりIL2CTLL−２に応じたネズミの白血病細胞ラ
インの増殖を測定して行われる［T.J.モスマン、イミュ
ノロジカル・メソッズ（1983）、第65巻、第55〜63
頁］。
より具体的には、本発明は、一方では、次のアミノ酸配
列： （ここで、Ｘはメチオニン若しくは水素原子を示し、位
置58、105及び125における３個のシステインは還元型で
ある） を有し、他方では、少なくとも0.5×107U/mgの生物学的
活性を有することを特徴とする、非グリコシル化組換ヒ
トインタロイキン２に関する。
列： （ここで、Ｘはメチオニン若しくは水素原子を示し、位
置58、105及び125における３個のシステインは還元型で
ある） を有し、他方では、少なくとも0.5×107U/mgの生物学的
活性を有することを特徴とする、非グリコシル化組換ヒ
トインタロイキン２に関する。
IL2活性の単位は、試験において最大応答の50％をも
たらす量であると規定される。ナショナル・キャンサー
・インステイチュート（NCI）により提供される試料
「バイロジカル・リスｐンス・モヂファイヤ・プログラ
ム（BRMP）基準ヒト試薬IL2（jurkat）」を標準として
使用する。
たらす量であると規定される。ナショナル・キャンサー
・インステイチュート（NCI）により提供される試料
「バイロジカル・リスｐンス・モヂファイヤ・プログラ
ム（BRMP）基準ヒト試薬IL2（jurkat）」を標準として
使用する。
さらに特定すれば、本発明は、次のアミノ酸配列： （ここで、Ｘはメチオニン若しくは水素原子を示し、位
置58、105及び125における３個のシステインは還元型で
ある） を有し、かつ、天然ヒトIL2の生物学的活性と同様な生
物学的活性を示すことを特徴とする、非グリコシル化組
換ヒトインタロイキン２に関するものである。同様な活
性という表現は、白血病Jurkat細胞から単離された天然
IL2の活性と同じ比活性、すなわち1.3×107U/mg（標準B
RMP）又はこの比活性とは最高25％だけ相違する活性で
あると理解される。本発明に関する還元型IL2の配列
は、必要に応じこれを発現するたとえばイー・コリ（大
腸菌）のような形質転換された微生物に応じて追加のＮ
−末端メチオニンを有する。本発明の好適具体例におい
てはメチオニンを有する配列が好適であるが、メチオニ
ンを有する産生物とメチオニンを持たず或いはメチオニ
ンが除去された産生物との混合物も使用することができ
る。
置58、105及び125における３個のシステインは還元型で
ある） を有し、かつ、天然ヒトIL2の生物学的活性と同様な生
物学的活性を示すことを特徴とする、非グリコシル化組
換ヒトインタロイキン２に関するものである。同様な活
性という表現は、白血病Jurkat細胞から単離された天然
IL2の活性と同じ比活性、すなわち1.3×107U/mg（標準B
RMP）又はこの比活性とは最高25％だけ相違する活性で
あると理解される。本発明に関する還元型IL2の配列
は、必要に応じこれを発現するたとえばイー・コリ（大
腸菌）のような形質転換された微生物に応じて追加のＮ
−末端メチオニンを有する。本発明の好適具体例におい
てはメチオニンを有する配列が好適であるが、メチオニ
ンを有する産生物とメチオニンを持たず或いはメチオニ
ンが除去された産生物との混合物も使用することができ
る。
他の面によれば本発明は、先ず最初に形質転換された
微生物中に顆粒として蓄積したIL2をケイオトロピック
剤で還元性媒体中にて可溶化させることにより抽出し、
次いで沈澱に続く酸溶出剤での逆相高性能液体クロマト
グラフィーによって精製することからなる上記非グリコ
シル化組換ヒトIL2の製造方法を提供し、この方法は （ａ）前記クロマトグラフにて溶出された主フラクショ
ンを−20℃の範囲の温度まで冷却工程にかけ、次いで水
相を分離し、 （ｂ）これを酸媒体で希釈し、次いで酸媒体中にてさら
に逆相高性能液体クロマトグラフカラムにてクロマト処
理しかつ前記IL2を分離することを特徴とする。
微生物中に顆粒として蓄積したIL2をケイオトロピック
剤で還元性媒体中にて可溶化させることにより抽出し、
次いで沈澱に続く酸溶出剤での逆相高性能液体クロマト
グラフィーによって精製することからなる上記非グリコ
シル化組換ヒトIL2の製造方法を提供し、この方法は （ａ）前記クロマトグラフにて溶出された主フラクショ
ンを−20℃の範囲の温度まで冷却工程にかけ、次いで水
相を分離し、 （ｂ）これを酸媒体で希釈し、次いで酸媒体中にてさら
に逆相高性能液体クロマトグラフカラムにてクロマト処
理しかつ前記IL2を分離することを特徴とする。
高割合の発現のため、たとえばイー・コリのような形
質転換微生物により顆粒の形態で産生される組換IL
2は、たとえばグアニジン塩の６〜8M溶液のようなケイ
オトロピック剤の濃厚溶液により公知方法で可溶化する
ことができ、次いで好ましくはC3、C4、C8若しくはC18
のようなグラフト化シリカの市販支持体と１〜４のpH値
を有する酸溶出剤とを用いる逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー（以下、RP−HPLCと称する）によって精製する
ことができる。IL2は、たとえば酢酸若しくはトリフル
オロ酢酸（以下、TFAと称する）のような有機酸とたと
えばアセトニトリルのような有機溶剤とからなる濃度勾
配系によってカラムから溶出することができる。主フラ
クション、すなわち280nmにて分光光度法により検出さ
れる溶出物が、本発明による方法の１部を構成する適宜
の冷却工程に対する原料となる。冷却とは、室温で回収
された前記主フラクションを−20℃程度の温度を有する
環境に置くことを意味し、これは固液（水）相の順次の
形成を可能にし、その上澄フラクションをデカントによ
って除去することができる。必要に応じこのようにして
分離された水相は、希釈した後に本発明による方法の１
部を構成する下記の酸媒体におけるPR−HPLCのための原
料として役立つ。水相の希釈は１〜４、好ましくは２〜
３のpH値を有する酸媒体で行なわれる。希釈された水相
を、たとえば蛋白につき使用するのに適した寸法の細孔
（たとえば少なくとも150Åの直径）を有するグラフト
化シリカC3、C4、C8若しくはC18のような市販の支持体
を用いて逆相カラムでクロマト処理する。IL2の溶出に
は、水と混和しうる低級アルコールの濃度を増大させる
と共に有機酸を含有する濃度勾配を用いる。
質転換微生物により顆粒の形態で産生される組換IL
2は、たとえばグアニジン塩の６〜8M溶液のようなケイ
オトロピック剤の濃厚溶液により公知方法で可溶化する
ことができ、次いで好ましくはC3、C4、C8若しくはC18
のようなグラフト化シリカの市販支持体と１〜４のpH値
を有する酸溶出剤とを用いる逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー（以下、RP−HPLCと称する）によって精製する
ことができる。IL2は、たとえば酢酸若しくはトリフル
オロ酢酸（以下、TFAと称する）のような有機酸とたと
えばアセトニトリルのような有機溶剤とからなる濃度勾
配系によってカラムから溶出することができる。主フラ
クション、すなわち280nmにて分光光度法により検出さ
れる溶出物が、本発明による方法の１部を構成する適宜
の冷却工程に対する原料となる。冷却とは、室温で回収
された前記主フラクションを−20℃程度の温度を有する
環境に置くことを意味し、これは固液（水）相の順次の
形成を可能にし、その上澄フラクションをデカントによ
って除去することができる。必要に応じこのようにして
分離された水相は、希釈した後に本発明による方法の１
部を構成する下記の酸媒体におけるPR−HPLCのための原
料として役立つ。水相の希釈は１〜４、好ましくは２〜
３のpH値を有する酸媒体で行なわれる。希釈された水相
を、たとえば蛋白につき使用するのに適した寸法の細孔
（たとえば少なくとも150Åの直径）を有するグラフト
化シリカC3、C4、C8若しくはC18のような市販の支持体
を用いて逆相カラムでクロマト処理する。IL2の溶出に
は、水と混和しうる低級アルコールの濃度を増大させる
と共に有機酸を含有する濃度勾配を用いる。
特に本発明の方法は、適宜の冷却工程を約0.1％のト
リフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの水溶液で行
ない、この希釈をたとえばクエン酸のような有機酸の水
溶液で行ない、さらに前記IL2をイソプロパノールと水
とたとえばクエン酸のような有機酸とを含有する溶液で
第２クロマトグラフにて溶出させることを特徴とする。
本発明による適宜の冷却工程にかける好適混合物である
約0.1％のTFAを含有するアセトニトリルの水溶液は、第
１クロマトグラフで溶出される主フラクションに相当す
る。より好ましくは、水相の希釈は適宜の分離の直後に
或いは第１クロマトグラフの直後に行なわれる。この希
釈は、好ましくはたとえば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、
トリフルオロ酢酸若しくはクエン酸のような有機酸を0.
5〜２％含有する少なくとも２倍容積の水を添加して、
より好ましくは0.5％のクエン酸を含有する約２倍容積
の水を添加して行なわれる。本発明による方法の１部を
構成する第２クロマトグラフは、冷却工程の後に必要に
応じ分離されかつ次いで希釈された水相を少なくとも15
0Åの孔径を有するグラフト化シリカC3、C4、C8若しく
はC18のような市販の支持体を用いるPR−HPLCにかける
ことからなっている。好適支持体はグラフト化シリカC4
VYDAC300Åであって共有結合によりグラフト化ブチル
基を有するシリカゲルであり、その孔径は300Åの直径
を有すると共にその粒子は15〜20μｍの平均寸法を有す
る。本発明の方法に関するIL2の溶出は、たとえばプロ
パノール若しくはイソプロパノールのようなアルコール
とたとえば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢
酸若しくはクエン酸のような有機酸とからなる濃度勾配
系を用いて行なわれる。好適混合物はイソプロパノール
と水と好ましくは0.5〜２％、より好ましくは0.5％のク
エン酸とで構成され、かつイソプロパノールの濃度を増
大させる濃度勾配系を用い約48％のイソプロパノールに
て低級フラクションを溶出させ、次いで約59％のイソプ
ロパノールにより高級フラクションを溶出させ、後者が
還元型の非グリコシル化活性組換ヒトIL2を含む。
リフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの水溶液で行
ない、この希釈をたとえばクエン酸のような有機酸の水
溶液で行ない、さらに前記IL2をイソプロパノールと水
とたとえばクエン酸のような有機酸とを含有する溶液で
第２クロマトグラフにて溶出させることを特徴とする。
本発明による適宜の冷却工程にかける好適混合物である
約0.1％のTFAを含有するアセトニトリルの水溶液は、第
１クロマトグラフで溶出される主フラクションに相当す
る。より好ましくは、水相の希釈は適宜の分離の直後に
或いは第１クロマトグラフの直後に行なわれる。この希
釈は、好ましくはたとえば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、
トリフルオロ酢酸若しくはクエン酸のような有機酸を0.
5〜２％含有する少なくとも２倍容積の水を添加して、
より好ましくは0.5％のクエン酸を含有する約２倍容積
の水を添加して行なわれる。本発明による方法の１部を
構成する第２クロマトグラフは、冷却工程の後に必要に
応じ分離されかつ次いで希釈された水相を少なくとも15
0Åの孔径を有するグラフト化シリカC3、C4、C8若しく
はC18のような市販の支持体を用いるPR−HPLCにかける
ことからなっている。好適支持体はグラフト化シリカC4
VYDAC300Åであって共有結合によりグラフト化ブチル
基を有するシリカゲルであり、その孔径は300Åの直径
を有すると共にその粒子は15〜20μｍの平均寸法を有す
る。本発明の方法に関するIL2の溶出は、たとえばプロ
パノール若しくはイソプロパノールのようなアルコール
とたとえば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢
酸若しくはクエン酸のような有機酸とからなる濃度勾配
系を用いて行なわれる。好適混合物はイソプロパノール
と水と好ましくは0.5〜２％、より好ましくは0.5％のク
エン酸とで構成され、かつイソプロパノールの濃度を増
大させる濃度勾配系を用い約48％のイソプロパノールに
て低級フラクションを溶出させ、次いで約59％のイソプ
ロパノールにより高級フラクションを溶出させ、後者が
還元型の非グリコシル化活性組換ヒトIL2を含む。
さらに本発明の主題は、上記方法で得られる還元型の
非グリコシル化組換ヒトIL2である。
非グリコシル化組換ヒトIL2である。
得られる前記フラクションは約０〜−20℃にて保持す
ることができ、これらの条件にて安定である。さらに、
減圧下での共沸蒸溜によりイソロパノールを除去するこ
ともできる。得られた溶液は４℃で保持することがで
き、或いは本発明のIL2を凍結乾燥によって直ちに分離
することもできる。
ることができ、これらの条件にて安定である。さらに、
減圧下での共沸蒸溜によりイソロパノールを除去するこ
ともできる。得られた溶液は４℃で保持することがで
き、或いは本発明のIL2を凍結乾燥によって直ちに分離
することもできる。
本発明の変法で得られる希釈された主フラクションは
＋４℃で保持することができる。これは安定であり、か
つ本発明による方法の１部を構成する第２クロマトグラ
フィーの原料を構成する。
＋４℃で保持することができる。これは安定であり、か
つ本発明による方法の１部を構成する第２クロマトグラ
フィーの原料を構成する。
チオール基を加えた場合、本発明により得られるIL2
は３個の遊離スルフヒドリル基を有しかつCTLL−２ライ
ンの増殖試験にて0.7〜1.3×107U/mgの比活性、すなわ
ち天然IL2と同様な活性を示す。この活性は、上記還元
型の非グリコシル化組換ヒトIL2に関する本発明の一面
を、天然IL2と同様にたとえばM.フレッチャー等により
リンホキン・リサーチ、第６巻（1987）、第47〜57頁に
記載された免疫調節活性、並びにその抗腫瘍活性を利用
する各種の指針で薬物として使用することを可能にし、
これはたとえばＴ−リンパ球の増殖、NK（天然キラー）
細胞及びLAK（リンホキン活性化キラー）細胞の細胞毒
性の誘発、細胞免疫の復活、免疫不全症の場合の感染に
対する保護作用、又はワクチンに関するアジュバント作
用を含む。投与は直接行なうことができ、或いはS.A.ロ
ーゼンベルク等によりニュー・イングランド・ジャーナ
ル・メディスン（1985）、第313巻、第1485〜1492頁に
記載された公認免疫治療法に関する投与とすることもで
きる。
は３個の遊離スルフヒドリル基を有しかつCTLL−２ライ
ンの増殖試験にて0.7〜1.3×107U/mgの比活性、すなわ
ち天然IL2と同様な活性を示す。この活性は、上記還元
型の非グリコシル化組換ヒトIL2に関する本発明の一面
を、天然IL2と同様にたとえばM.フレッチャー等により
リンホキン・リサーチ、第６巻（1987）、第47〜57頁に
記載された免疫調節活性、並びにその抗腫瘍活性を利用
する各種の指針で薬物として使用することを可能にし、
これはたとえばＴ−リンパ球の増殖、NK（天然キラー）
細胞及びLAK（リンホキン活性化キラー）細胞の細胞毒
性の誘発、細胞免疫の復活、免疫不全症の場合の感染に
対する保護作用、又はワクチンに関するアジュバント作
用を含む。投与は直接行なうことができ、或いはS.A.ロ
ーゼンベルク等によりニュー・イングランド・ジャーナ
ル・メディスン（1985）、第313巻、第1485〜1492頁に
記載された公認免疫治療法に関する投与とすることもで
きる。
天然IL2と同様に、本発明のIL2はそれ自身で或いはた
とえばα−インタフェロン、γ−インフェロン及び（又
は）その他の治療剤のような他の免疫調節剤と共に使用
することができる。
とえばα−インタフェロン、γ−インフェロン及び（又
は）その他の治療剤のような他の免疫調節剤と共に使用
することができる。
最後に、本発明の主題は、上記還元型の非グリコシル
化組換ヒトIL2を活性成分として含有する医薬組成物で
ある。この組成物は固体若しくは液体とすることができ
る。本発明のIL2は有用な医薬組成物を製造する公知方
法にしたがって処方することができ、IL2を医薬上許容
しうる支持ビークルと組合せる。この組成物は、有効量
のIL2とヒトに投与するに適した適当量のビークルとを
含有する。この組成物は、減圧下に共沸蒸溜によりイソ
プロパノールを除去した後の本発明によるIL2の酸水溶
液から出発し、これに水溶性充填剤を添加しかつ凍結乾
燥して得ることができる。充填剤とは、混合物を再編成
する際に初期pH値を変化させない水溶性物質を意味する
と理解される。添加しうる充填剤の例はたとえばグルコ
ース、リボース、蔗糖、マルトース、トレハロース又は
たとえばマニトールのような還元糖などの糖類である。
マニトールが好適である。マニトールは、本発明による
IL2の濃度が0.05〜1mg/mlである場合は、投与すべき量
に応じて10〜50mg/ml、好ましくは50mg/mlの程度の濃度
で添加される。酸素の不存在下で無菌状態にて濾過され
た溶液を投入フラスコに分割し、かつ凍結乾燥する。凍
結乾燥された混合物は、フラスコ内でて非経口注射に適
した蒸溜水を注入して再編成することができる。
化組換ヒトIL2を活性成分として含有する医薬組成物で
ある。この組成物は固体若しくは液体とすることができ
る。本発明のIL2は有用な医薬組成物を製造する公知方
法にしたがって処方することができ、IL2を医薬上許容
しうる支持ビークルと組合せる。この組成物は、有効量
のIL2とヒトに投与するに適した適当量のビークルとを
含有する。この組成物は、減圧下に共沸蒸溜によりイソ
プロパノールを除去した後の本発明によるIL2の酸水溶
液から出発し、これに水溶性充填剤を添加しかつ凍結乾
燥して得ることができる。充填剤とは、混合物を再編成
する際に初期pH値を変化させない水溶性物質を意味する
と理解される。添加しうる充填剤の例はたとえばグルコ
ース、リボース、蔗糖、マルトース、トレハロース又は
たとえばマニトールのような還元糖などの糖類である。
マニトールが好適である。マニトールは、本発明による
IL2の濃度が0.05〜1mg/mlである場合は、投与すべき量
に応じて10〜50mg/ml、好ましくは50mg/mlの程度の濃度
で添加される。酸素の不存在下で無菌状態にて濾過され
た溶液を投入フラスコに分割し、かつ凍結乾燥する。凍
結乾燥された混合物は、フラスコ内でて非経口注射に適
した蒸溜水を注入して再編成することができる。
本発明の組成物は、丸薬若しくは連続灌流での静脈内
経路により或いは筋肉内、腹腔内、胸膜内若しくは皮下
経路によって投与することができる。投与経路及び処置
すべき病気に応じて本発明によるIL2の有効投与量は、
一般に成人若しくは子供において１×106U/M2/24h〜40
×106U/M2/24hの範囲、好ましくは20×106U/M2/24hの範
囲である。さらに、１日の投与量は投与期間に依存し、
上記投与量のみに限定されない。
経路により或いは筋肉内、腹腔内、胸膜内若しくは皮下
経路によって投与することができる。投与経路及び処置
すべき病気に応じて本発明によるIL2の有効投与量は、
一般に成人若しくは子供において１×106U/M2/24h〜40
×106U/M2/24hの範囲、好ましくは20×106U/M2/24hの範
囲である。さらに、１日の投与量は投与期間に依存し、
上記投与量のみに限定されない。
詳細には還元型の非グリコシル化組換ヒトIL2と水と
たとえばクエン酸のような有機酸とを含有することを特
徴とする。この種の組成物は本発明による凍結乾燥され
た医薬組成物から出発してこれを灌流の際に活性成分の
安定性に寄与するたとえばグルコースのような適するビ
ークルの存在下に溶解させて得ることができる。好適条
件は蒸溜水の注入により再編成された凍結乾燥混合物を
り再編成された凍結乾燥混合物を、投与すべき量に適す
るよう決定された所定容積のグルコース（たとえば500m
g/mlの濃度）を含有する灌流用ポケットに導入して希釈
することからなっている。
たとえばクエン酸のような有機酸とを含有することを特
徴とする。この種の組成物は本発明による凍結乾燥され
た医薬組成物から出発してこれを灌流の際に活性成分の
安定性に寄与するたとえばグルコースのような適するビ
ークルの存在下に溶解させて得ることができる。好適条
件は蒸溜水の注入により再編成された凍結乾燥混合物を
り再編成された凍結乾燥混合物を、投与すべき量に適す
るよう決定された所定容積のグルコース（たとえば500m
g/mlの濃度）を含有する灌流用ポケットに導入して希釈
することからなっている。
上記した全ての引例を本明細書中に参考のため引用す
る。
る。
［実施例］ 以下、限定はしないが実施例により本発明を説明す
る。
る。
例 1:顆粒から出発する還元型の生物活性ｒ−hIL2の精
製 天然IL2のコード配列を有するプラスミドにより形質
転換されかつ細胞の内部に顆粒としてIL2を蓄積しうる
イー・コリ菌株の培養物を遠心分離することにより、た
とえばT.サトー等、ジャーナル・バイオケミストリー
（1987）、第101巻、第525〜534頁に記載されたように
顆粒を得た。10の醗酵装置からこのような得られた菌
体を、マントン・ガウリン・ホモゲナイザーにて破砕処
理にかけた。分離されかつ洗浄された細胞残渣（90〜17
0gの湿潤重量）から出発し、IL2を8Mグアニジン塩酸塩
（Gu・HCl）と100mMジチオスレイトール（DDT）とを含
有する2.5容量のトリス緩衝液（HCl20mM、pH8）に溶解
した。溶解させた量のIL2（1.5〜2.5g）を、C4VYDACカ
ラム（0.46×15cm、300Å、５μｍ）にて2ml/minの流速
で0.1％のTFAを含有するアセトニトリルの線状濃度勾配
（30〜70％、10min）を用いて280nm若しくは210nmにお
ける分光光度法検出での分析RP−HPLCにより推定し、こ
こでピークの表面を標準IL2で検量した後に280nmにて評
価した（第1a図及び第1b図）。、次いで、Gu・HClの濃
度をDDTの存在下に2Mまで低下させることにより、IL2を
沈澱させた。上澄液につき5.0未満のpH値が得られるま
で0.1％のTFAの水溶液で沈澱物を洗浄した後、IL2を20
％のアセトニトリルと0.1％のTFAとの水溶液に溶解させ
た。分析RP−HPLC（第２図）にしたがい85％より多い還
元型IL2の含有量を有する得られた「再溶解物」は、0.0
1×107U/mg未満の還元型IL2の生物学的活性を有し、か
つ還元型IL2における2.85SH/モルのスルフヒドリル基の
含有量を有した。分析RP−HPLCにより推定して約200mg
のIL2に相当する得られた溶液の１フラクションを、10
％未満のアセトニトリルの濃度に調節するよう0.1％のT
FAで希釈し、次いでC4 VYDACカラム（5.7×30cm）に加
えた。IL2を、0.1％のTFAを含有するアセトニトリルの
線状濃度勾配（30〜80％、40min）により約60％のアセ
トニトリル中の濃度にて100ml/minの流速で溶出させ、2
80nmにて分光光度法により主ピークを検出しかつRP−HP
LCにより分析した。還元型IL2を含有する回収された
「主フラクション」を次いで室温から−20℃±１℃に至
る低速冷却工程にかけ、これはアセトニトリル中に濃縮
された上相の有機相をデカントにより除去することを可
能にした。水が多くかつIL2を含有する下相は、凍結状
態に保持することができる。解答した後、２倍容積の0.
5％クエン酸水溶液で希釈した後に得られた溶液をC4 V
YDACカラム（5.7×30cm）に加え、これを0.5％のクエン
酸を含有するイソプロパノールの線状濃度勾配（20〜70
％、40min）にて50ml/minの流速で展開した。流出液を2
80nmで分光光度測定し、約48％のイソプロパノール中の
濃度（フラクション「48」）における少量ピークと約59
％イソプロパノールの濃度（フラクション「59」）にお
ける多量ピークとの順次の溶出を示した（第３図）。フ
ラクション「59」を回収した。これは、０℃にて空気か
ら保護しながら少なくとも24時間保持した際に安定であ
った。
製 天然IL2のコード配列を有するプラスミドにより形質
転換されかつ細胞の内部に顆粒としてIL2を蓄積しうる
イー・コリ菌株の培養物を遠心分離することにより、た
とえばT.サトー等、ジャーナル・バイオケミストリー
（1987）、第101巻、第525〜534頁に記載されたように
顆粒を得た。10の醗酵装置からこのような得られた菌
体を、マントン・ガウリン・ホモゲナイザーにて破砕処
理にかけた。分離されかつ洗浄された細胞残渣（90〜17
0gの湿潤重量）から出発し、IL2を8Mグアニジン塩酸塩
（Gu・HCl）と100mMジチオスレイトール（DDT）とを含
有する2.5容量のトリス緩衝液（HCl20mM、pH8）に溶解
した。溶解させた量のIL2（1.5〜2.5g）を、C4VYDACカ
ラム（0.46×15cm、300Å、５μｍ）にて2ml/minの流速
で0.1％のTFAを含有するアセトニトリルの線状濃度勾配
（30〜70％、10min）を用いて280nm若しくは210nmにお
ける分光光度法検出での分析RP−HPLCにより推定し、こ
こでピークの表面を標準IL2で検量した後に280nmにて評
価した（第1a図及び第1b図）。、次いで、Gu・HClの濃
度をDDTの存在下に2Mまで低下させることにより、IL2を
沈澱させた。上澄液につき5.0未満のpH値が得られるま
で0.1％のTFAの水溶液で沈澱物を洗浄した後、IL2を20
％のアセトニトリルと0.1％のTFAとの水溶液に溶解させ
た。分析RP−HPLC（第２図）にしたがい85％より多い還
元型IL2の含有量を有する得られた「再溶解物」は、0.0
1×107U/mg未満の還元型IL2の生物学的活性を有し、か
つ還元型IL2における2.85SH/モルのスルフヒドリル基の
含有量を有した。分析RP−HPLCにより推定して約200mg
のIL2に相当する得られた溶液の１フラクションを、10
％未満のアセトニトリルの濃度に調節するよう0.1％のT
FAで希釈し、次いでC4 VYDACカラム（5.7×30cm）に加
えた。IL2を、0.1％のTFAを含有するアセトニトリルの
線状濃度勾配（30〜80％、40min）により約60％のアセ
トニトリル中の濃度にて100ml/minの流速で溶出させ、2
80nmにて分光光度法により主ピークを検出しかつRP−HP
LCにより分析した。還元型IL2を含有する回収された
「主フラクション」を次いで室温から−20℃±１℃に至
る低速冷却工程にかけ、これはアセトニトリル中に濃縮
された上相の有機相をデカントにより除去することを可
能にした。水が多くかつIL2を含有する下相は、凍結状
態に保持することができる。解答した後、２倍容積の0.
5％クエン酸水溶液で希釈した後に得られた溶液をC4 V
YDACカラム（5.7×30cm）に加え、これを0.5％のクエン
酸を含有するイソプロパノールの線状濃度勾配（20〜70
％、40min）にて50ml/minの流速で展開した。流出液を2
80nmで分光光度測定し、約48％のイソプロパノール中の
濃度（フラクション「48」）における少量ピークと約59
％イソプロパノールの濃度（フラクション「59」）にお
ける多量ピークとの順次の溶出を示した（第３図）。フ
ラクション「59」を回収した。これは、０℃にて空気か
ら保護しながら少なくとも24時間保持した際に安定であ
った。
減圧下に共沸蒸溜によりイソプロパノールを除去した
後、「59」フラクションを分析RP−HPLCで分析して約60
％のアセトニトリルで溶出された均質ピーク（第４図）
を与えたのに対し、基準酸化型IL2は約57％のアセトニ
トリルで溶出された（第1b図）。イソプロパノールを除
去した後に1mg/mlより高いIL2の濃度と３±0.5のpH値と
を有する「59」フラクションは、空気から保護して＋４
℃にて少なくとも１週間にわたり保持することができ、
或いは直ちに凍結乾燥し又は処方して医薬組成物を得る
ことができる。凍結乾燥された「59」フラクションは、
細胞CTLL−２の増殖に関するインビトロ試験にしたがい
生物学的活性にて投与することができ、かつ天然IL2と
同様な1.3±0.5×107U/mgの比活性を有する。
後、「59」フラクションを分析RP−HPLCで分析して約60
％のアセトニトリルで溶出された均質ピーク（第４図）
を与えたのに対し、基準酸化型IL2は約57％のアセトニ
トリルで溶出された（第1b図）。イソプロパノールを除
去した後に1mg/mlより高いIL2の濃度と３±0.5のpH値と
を有する「59」フラクションは、空気から保護して＋４
℃にて少なくとも１週間にわたり保持することができ、
或いは直ちに凍結乾燥し又は処方して医薬組成物を得る
ことができる。凍結乾燥された「59」フラクションは、
細胞CTLL−２の増殖に関するインビトロ試験にしたがい
生物学的活性にて投与することができ、かつ天然IL2と
同様な1.3±0.5×107U/mgの比活性を有する。
ジオチジピリジンでの比色測定法により決定される凍
結乾燥「59」フラクションの遊離スルフヒドリル基の含
有量は2.94SH/モルであって、酸化型基準IL2の0.76SH/
モルと対比される。
結乾燥「59」フラクションの遊離スルフヒドリル基の含
有量は2.94SH/モルであって、酸化型基準IL2の0.76SH/
モルと対比される。
分析RP−HPLCにより測定して150〜300mgの３個のSH基
を有し、生物学的活性であり、RP−HPLCにて均質である
還元型ｒ−hIL2が、10の醗酵装置から出発して「59」
フラクションで得られた（第５図の手順にしたがう）。
を有し、生物学的活性であり、RP−HPLCにて均質である
還元型ｒ−hIL2が、10の醗酵装置から出発して「59」
フラクションで得られた（第５図の手順にしたがう）。
例 2:生物学的活性の還元型ｒ−IL2の精製 手順は例１におけると同様であるが、ただし「主フラ
クション」を冷却工程に続くデカントによる分離にかけ
ず、２倍容積の0.5％クエン酸水溶液により直ちに希釈
した。「59」フラクションを回収しかつ例１と同様に処
理した。
クション」を冷却工程に続くデカントによる分離にかけ
ず、２倍容積の0.5％クエン酸水溶液により直ちに希釈
した。「59」フラクションを回収しかつ例１と同様に処
理した。
例 3:生物学的活性の還元型ｒ−hIL2の生化学的特性化 例１の「59」フラクションにおける本発明で得られた
還元型ｒ−hIL2を次の性質につき検査した： （１）均質性 SDS PAGE電気泳動を、10％のSDSを含有する２相のゲ
ル（それぞれ５％及び15％のアクリルアミド有する濃縮
ゲル及び移動ゲル）にて行なった。試料を先ず３％のSD
S及び５％のメルカプトエタノールと共に緩衝剤中で100
℃にて２分間加熱した。１％のSDSにて緩衝剤による移
動を銀での発色によって追跡し、これは99％より高い純
度の沈着物２μｇに相当する単一バンドを示した（第６
図）。
還元型ｒ−hIL2を次の性質につき検査した： （１）均質性 SDS PAGE電気泳動を、10％のSDSを含有する２相のゲ
ル（それぞれ５％及び15％のアクリルアミド有する濃縮
ゲル及び移動ゲル）にて行なった。試料を先ず３％のSD
S及び５％のメルカプトエタノールと共に緩衝剤中で100
℃にて２分間加熱した。１％のSDSにて緩衝剤による移
動を銀での発色によって追跡し、これは99％より高い純
度の沈着物２μｇに相当する単一バンドを示した（第６
図）。
（２）電気泳動による分子量 還元媒体において、約15Kdの見掛MWが決定され、計算
されたMWによれば15420であった（第６図）。
されたMWによれば15420であった（第６図）。
（３）アミノ酸の組成 水0.5ml中に本発明の還元型ｒ−hIL2の25μｇを含有
する試料をガラス加水分解チューブに入れ、これに0.5m
lの濃塩酸を31.7％のTFA及び4.8％のチオグリコール酸
と共に添加した。このチューブを減圧下で密封し、次い
で加水分解を155℃にて40分間行なった。次いで、加水
分解物を減圧下に蒸発乾固させた。残留物を0.7mlのク
エン酸緩衝液pH＝３に溶解させ、次いでこれをクエン酸
緩衝液におけるpH勾配（３〜５）及び塩化ナトリウム
（０〜70g/）により60℃にて0.5ml/minの流速でイン
ターアクションAA511カラム（0.46×15cm）にてアミノ
酸分析にかけ、かつカラム出口でオルトフタルアルデヒ
ドによる誘導化の後に蛍光により検出した。その結果を
第１表に示す。数値は、それぞれ２反復の加水分解物及
び２反復のクロマトグラフにつき得られた平均値であ
る。組成は、追加Ｎ−末端メチオニンを有する天然IL2
の組成と一致した。
する試料をガラス加水分解チューブに入れ、これに0.5m
lの濃塩酸を31.7％のTFA及び4.8％のチオグリコール酸
と共に添加した。このチューブを減圧下で密封し、次い
で加水分解を155℃にて40分間行なった。次いで、加水
分解物を減圧下に蒸発乾固させた。残留物を0.7mlのク
エン酸緩衝液pH＝３に溶解させ、次いでこれをクエン酸
緩衝液におけるpH勾配（３〜５）及び塩化ナトリウム
（０〜70g/）により60℃にて0.5ml/minの流速でイン
ターアクションAA511カラム（0.46×15cm）にてアミノ
酸分析にかけ、かつカラム出口でオルトフタルアルデヒ
ドによる誘導化の後に蛍光により検出した。その結果を
第１表に示す。数値は、それぞれ２反復の加水分解物及
び２反復のクロマトグラフにつき得られた平均値であ
る。組成は、追加Ｎ−末端メチオニンを有する天然IL2
の組成と一致した。
（４）Ｎ−末端アミノ酸の配列 エドマン自動減成法を用いるミクロ配列決定により、
Ｎ−末端配列を確認した。HPLC120Aと組合せた気相ミク
ロ配列決定アプライド・バイオシステムス470Aにおける
本発明による15μｇの生物学的活性の還元型ｒ−hIL2の
分析は、次のPTHアミノ酸を同定することができた： 20個のＮ−末端残基の配列は、天然IL2の理論的結合順
序と一致した。メチオニンを含まないIL2の約10％が観
察された。
Ｎ−末端配列を確認した。HPLC120Aと組合せた気相ミク
ロ配列決定アプライド・バイオシステムス470Aにおける
本発明による15μｇの生物学的活性の還元型ｒ−hIL2の
分析は、次のPTHアミノ酸を同定することができた： 20個のＮ−末端残基の配列は、天然IL2の理論的結合順
序と一致した。メチオニンを含まないIL2の約10％が観
察された。
（５）臭化シアノーゲンによるペプチド特性図 本発明による700μｇの還元型IL2残留物（約53ナノモ
ル）を、70％の蟻酸4mlに溶解させかつ5.6mgの臭化シア
ノゲンを添加した。この溶液を室温にて１晩撹拌し、水
で希釈し、次いで凍結乾燥した。反応性混合物をウボン
ダパックC18RPカラム（0.46×20cm）におけるRP−HPLC
によって分析し、その際0.1％のTFAを含有する０〜70％
の範囲で変化するアセトニトリルの濃度勾配を用いると
共に、1ml/minの流速及び室温を用い、かつ220nmにて分
光光度法で検出を行なった。還元型ｒ−hIL2のペプチド
特性図（第7a図）は基準酸化型IL2（第7b図）とは異な
る断片化を示した。
ル）を、70％の蟻酸4mlに溶解させかつ5.6mgの臭化シア
ノゲンを添加した。この溶液を室温にて１晩撹拌し、水
で希釈し、次いで凍結乾燥した。反応性混合物をウボン
ダパックC18RPカラム（0.46×20cm）におけるRP−HPLC
によって分析し、その際0.1％のTFAを含有する０〜70％
の範囲で変化するアセトニトリルの濃度勾配を用いると
共に、1ml/minの流速及び室温を用い、かつ220nmにて分
光光度法で検出を行なった。還元型ｒ−hIL2のペプチド
特性図（第7a図）は基準酸化型IL2（第7b図）とは異な
る断片化を示した。
（６）円形二色性 円形二色性スペクトル（CD）を、ジョビン・イボン・
マークＶスペクトログラフにより室温で決定した。還元
型ｒ−hIL2の試料を、例１における0.5％クエン酸の代
りに0.1％の蟻酸を用いたイソプロパノールの直線濃度
勾配にて行なったRP−HPLCの後に凍結乾燥し、次いでイ
ソプロパノールを蒸溜しかつ凍結乾燥させ、1mg/mlの濃
度にて酢酸中に溶解させた。使用した容器はペプチド領
域（185〜250nm）及び芳香族領域（260〜320nm）につき
それぞれ0.01cm及び0.5cmとした。溶剤スペクトルを、
各試料につきIL2のスペクトルから引算した。その結果
をエリプティシチー０にて示す（IL2の残留物当りの平
均重量＝116）。
マークＶスペクトログラフにより室温で決定した。還元
型ｒ−hIL2の試料を、例１における0.5％クエン酸の代
りに0.1％の蟻酸を用いたイソプロパノールの直線濃度
勾配にて行なったRP−HPLCの後に凍結乾燥し、次いでイ
ソプロパノールを蒸溜しかつ凍結乾燥させ、1mg/mlの濃
度にて酢酸中に溶解させた。使用した容器はペプチド領
域（185〜250nm）及び芳香族領域（260〜320nm）につき
それぞれ0.01cm及び0.5cmとした。溶剤スペクトルを、
各試料につきIL2のスペクトルから引算した。その結果
をエリプティシチー０にて示す（IL2の残留物当りの平
均重量＝116）。
第8a図は遠紫外におけるCDスペクトルを示す。本発明
による還元型の生物学的活性ｒ−hIL2は、規則的二次構
造の存在を示すスペクトルを有した。αヘリックス％の
測定は、酸化型基準IL2に対し殆んど有意の差を示さな
かった（％αヘリックス＝50％）。
による還元型の生物学的活性ｒ−hIL2は、規則的二次構
造の存在を示すスペクトルを有した。αヘリックス％の
測定は、酸化型基準IL2に対し殆んど有意の差を示さな
かった（％αヘリックス＝50％）。
第8b図は近紫外におけるCDスペクトルを示す。酸化型
基準IL2は芳香族残留物につき不整環境を示す有意のDC
を示すのに対し、本発明の還元型ｒ−hIL2は殆んど有意
でない異なるCDを示した。
基準IL2は芳香族残留物につき不整環境を示す有意のDC
を示すのに対し、本発明の還元型ｒ−hIL2は殆んど有意
でない異なるCDを示した。
例 4:生物学的活性 本発明による還元型ｒ−hIL2の生物学的効果をインビ
トロ若しくはエキソビボの実験で評価した。
トロ若しくはエキソビボの実験で評価した。
（１）ヒト細胞に対するインビトロ活性 a.リンパ芽球形質転換試験 IL2の生物学的測定を可能にするCTLL−２のようなネ
ズミの細胞ラインに対する増殖活性の他に、本発明の還
元型ｒ−hIL2は投与量に応じて勇糸分裂作用をも示し、
これはADNにてトリチウム化チミジンの組込みの測定に
より示される正常な循環ヒトリンパ球につき酸化型基準
IL2によって示される作用と同様である（第９図）。
ズミの細胞ラインに対する増殖活性の他に、本発明の還
元型ｒ−hIL2は投与量に応じて勇糸分裂作用をも示し、
これはADNにてトリチウム化チミジンの組込みの測定に
より示される正常な循環ヒトリンパ球につき酸化型基準
IL2によって示される作用と同様である（第９図）。
b.単核細胞の細胞毒性の誘発 この試験はIL2の存在下に培養されたヒト循環単核細
胞につき行ない、その細胞毒性作用をそれぞれ腫瘍標的
細胞と赤白血病ラインK562（NK細胞に対し感受性）とＢ
リンホームから誘導されたDAUDIライン（NK細胞に対し
耐性）につき決定し、その際Cr51の塩析を４時間で測定
した。106個の細胞当りの細胞溶解単位（UL/106）で現
す結果は、本発明の還元型ｒ−hIL2が投与量に応じてNK
の活性を増大し或いは腫瘍標的細胞に関するＴリンパ球
の細胞毒性を誘発する能力をそれぞれ天然IL2につき知
られたと同様に有することを示した（第10図） （２）ネズミに対するエキソビボ活性（腹腔内マクロフ
ァージの刺戟） 正常なBalb/c及びMRL＋／＋ネズミにおいて、最適量
以下（100〜3000U）にて組換γ−インタフェロンをラッ
トに順次に腹腔内注射し、次いで24時間後に本発明の還
元型ｒ−hIL2を注射すると、食細胞の酸化メカニズム
（ホルボールエステル（PMA）の存在下に化学発光を測
定して評価される）、すなわちIL2を注射してから24時
間後に殺したネズミの腹腔から除去された細胞の酸化メ
カニズムが発生する。投与量に応じたこの作用は、酸化
型基準IL2につき見られるものと同様であった。
胞につき行ない、その細胞毒性作用をそれぞれ腫瘍標的
細胞と赤白血病ラインK562（NK細胞に対し感受性）とＢ
リンホームから誘導されたDAUDIライン（NK細胞に対し
耐性）につき決定し、その際Cr51の塩析を４時間で測定
した。106個の細胞当りの細胞溶解単位（UL/106）で現
す結果は、本発明の還元型ｒ−hIL2が投与量に応じてNK
の活性を増大し或いは腫瘍標的細胞に関するＴリンパ球
の細胞毒性を誘発する能力をそれぞれ天然IL2につき知
られたと同様に有することを示した（第10図） （２）ネズミに対するエキソビボ活性（腹腔内マクロフ
ァージの刺戟） 正常なBalb/c及びMRL＋／＋ネズミにおいて、最適量
以下（100〜3000U）にて組換γ−インタフェロンをラッ
トに順次に腹腔内注射し、次いで24時間後に本発明の還
元型ｒ−hIL2を注射すると、食細胞の酸化メカニズム
（ホルボールエステル（PMA）の存在下に化学発光を測
定して評価される）、すなわちIL2を注射してから24時
間後に殺したネズミの腹腔から除去された細胞の酸化メ
カニズムが発生する。投与量に応じたこの作用は、酸化
型基準IL2につき見られるものと同様であった。
結果 例 5:注射用の医薬組成物 イソプロパノールが減圧下での共沸蒸溜により除去さ
れた本発明の「59」フラクションに相当する還元型ｒ−
hIL2の水溶液を、脱ガスされかつ窒素飽和されたマニト
ールの水溶液で100μg/mlの還元型IL2及び500mg/mlのマ
ニトールの割合にて即席希釈した。0.22μの膜で濾過
し、フラスコ内に1mlを無菌分配しかつ凍結乾燥した
後、フラスコ−内容物を窒素雰囲気下で密栓しかつ使用
するまで＋４℃の温度に保持した。
れた本発明の「59」フラクションに相当する還元型ｒ−
hIL2の水溶液を、脱ガスされかつ窒素飽和されたマニト
ールの水溶液で100μg/mlの還元型IL2及び500mg/mlのマ
ニトールの割合にて即席希釈した。0.22μの膜で濾過
し、フラスコ内に1mlを無菌分配しかつ凍結乾燥した
後、フラスコ−内容物を窒素雰囲気下で密栓しかつ使用
するまで＋４℃の温度に保持した。
例 6:連続灌流による医薬組成物 減圧下での共沸蒸溜によりイソプロパノールが除去さ
れた本発明の「59」フラクションに相当する還元型ｒ−
hIL2の水溶液を、脱ガスされかつ窒素飽和されたマニト
ールの水溶液で500μg/mlの還元型IL2及び50mg/mlのマ
ニトールの割合にて即席希釈した。0.22の膜で濾過し、
1mlをフラスコに無菌分配しかつ凍結乾燥した後、フラ
スコ内容物を窒素雰囲気下で密栓しかつ使用するまで４
℃の温度に保持した。次いで、各フラスコの内容物を1m
lの無菌蒸溜水の注入により溶解させた。７本のフラス
コに相当する溶液（約35.166単位）を、５％灌流におけ
るトラベノール（登録商標）グルコースのための溶液50
0mlを含有するビアフレックス（登録商標）容器に導入
した。
れた本発明の「59」フラクションに相当する還元型ｒ−
hIL2の水溶液を、脱ガスされかつ窒素飽和されたマニト
ールの水溶液で500μg/mlの還元型IL2及び50mg/mlのマ
ニトールの割合にて即席希釈した。0.22の膜で濾過し、
1mlをフラスコに無菌分配しかつ凍結乾燥した後、フラ
スコ内容物を窒素雰囲気下で密栓しかつ使用するまで４
℃の温度に保持した。次いで、各フラスコの内容物を1m
lの無菌蒸溜水の注入により溶解させた。７本のフラス
コに相当する溶液（約35.166単位）を、５％灌流におけ
るトラベノール（登録商標）グルコースのための溶液50
0mlを含有するビアフレックス（登録商標）容器に導入
した。
第1a図は例１の8Mグアニジンにおける粗抽出物のRP−HP
LCの分析クロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第1b図は標準の還元型及び酸化型におけるRP−HPLCの分
析クロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第２図は例１における「再可溶化」のRP−HPLCの分析ク
ロマトグラムであり、 第３図は例１の冷却工程後における「主フラクション」
のRP−HPLCのクロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第４図は例１におけるフラクション「59」のRP−HPLCの
分析クロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第５図は例１の精製工程図であり、 第６図は例２のSDC−PAGE電気泳動図であり、 第7a図及び第7b図は例２のペプチドの特性曲線図であ
り、 第8a図及び第8b図は例２のDC曲線図であり、 第９図は例３におけるヒトリンパ球に対する有糸分裂作
用の曲線図であり、 第10図はラインK562及びDAUDIにつき得られた毒性曲線
図である。
LCの分析クロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第1b図は標準の還元型及び酸化型におけるRP−HPLCの分
析クロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第２図は例１における「再可溶化」のRP−HPLCの分析ク
ロマトグラムであり、 第３図は例１の冷却工程後における「主フラクション」
のRP−HPLCのクロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第４図は例１におけるフラクション「59」のRP−HPLCの
分析クロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第５図は例１の精製工程図であり、 第６図は例２のSDC−PAGE電気泳動図であり、 第7a図及び第7b図は例２のペプチドの特性曲線図であ
り、 第8a図及び第8b図は例２のDC曲線図であり、 第９図は例３におけるヒトリンパ球に対する有糸分裂作
用の曲線図であり、 第10図はラインK562及びDAUDIにつき得られた毒性曲線
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ピエール・イブ・アブカシ フランス国パリ、スクワール・ビトリュ ブ、11 (56)参考文献 特開 昭63−123393（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−1393（ＪＰ，Ａ)
Claims (4)
- 【請求項１】一方では、次のアミノ酸配列： （ここで、Ｘはメチオニン若しくは水素原子を示し、位
置58、105及び125における３個のシステインは還元型で
ある） を有し、他方では、少なくとも0.5×102U/mgの生物学的
活性を有することを特徴とする非グリコシル化組換ヒト
インタロイキン２（IL2）であって、 先ず系質変換された微生物中に顆粒として蓄積したIL2
をケイオトロピック剤で還元性媒体中に可溶化させるこ
とにより抽出し、次いで沈澱に続く酸溶出剤での逆相高
性能液体クロマトグラフィーによって精製することから
なり、 （ａ）前記クロマトグラフィーから溶出された主フラク
ションを−20℃程度の温度まで冷却工程にかけ、次いで
水相を分離し、 （ｂ）これを酸媒体で希釈し、次いで酸媒体中にてさら
に逆相高性能液体クロマトグラフカラムでクロマト処理
し、前記IL2を分離する ことを特徴とする方法により製造されたものである、前
記の非グリコシル化組換ヒトインタロイキン２。 - 【請求項２】請求項１に記載の還元型の非グリコシル化
組換ヒトIL2からなる免疫の調節又は腫瘍の治療のため
の薬剤。 - 【請求項３】活性成分として請求項１記載の還元型の非
グリコシル化組換ヒトIL2を含有することを特徴とす
る、免疫の調節又は腫瘍の治療のための医薬組成物。 - 【請求項４】請求項１記載の還元型の非グリコシル化組
換ヒトIL2と水と有機酸とを含有することを特徴とす
る、免疫の調節又は腫瘍の治療のための医薬組成物。
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|---|---|---|---|
| FR88-10184 | 1988-07-28 | ||
| FR8810184A FR2635527B1 (fr) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | Il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite, son procede d'obtention et son application comme medicament |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02209896A JPH02209896A (ja) | 1990-08-21 |
| JP3016793B2 true JP3016793B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=9368873
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1192769A Expired - Lifetime JP3016793B2 (ja) | 1988-07-28 | 1989-07-27 | 還元型の非グリコシル化組換ヒトｉｌ▲下２▼、その取得方法、及び薬物としてのその使用 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0353150B1 (ja) |
| JP (1) | JP3016793B2 (ja) |
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| AT (1) | ATE110783T1 (ja) |
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| ES (1) | ES2058573T3 (ja) |
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| FR (1) | FR2635527B1 (ja) |
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| NZ (1) | NZ230111A (ja) |
| PT (1) | PT91295B (ja) |
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| FR2668368B1 (fr) * | 1990-10-30 | 1995-03-10 | Roussel Uclaf | Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour preparer une composition pharmaceutique destinee au traitement des tumeurs malignes epitheliales. |
| WO1992009623A1 (fr) * | 1990-11-23 | 1992-06-11 | Roussel-Uclaf | PROCEDE DE PREPARATION D'UNE PROTEINE COMPORTANT AU MOINS UN PONT DISULFURE INTRAMOLECULAIRE PAR OXYDATION, A UN pH INFERIEUR A 5,0, DE LA PROTEINE RECOMBINANTE REDUITE CORRESPONDANTE |
| FR2671728B1 (fr) * | 1991-01-17 | 1995-01-20 | Roussel Uclaf | Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement des pneumathorax. |
| FR2684878B1 (fr) * | 1991-12-12 | 1994-02-11 | Roussel Uclaf | Composition pharmaceutique stabilisee d'il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite et son procede de preparation. |
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| SI2251353T1 (sl) * | 2003-08-07 | 2013-10-30 | Zymogenetics, Inc. | Homogeni preparati il-29 |
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| US5643566A (en) * | 1982-09-23 | 1997-07-01 | Cetus Corporation | Formulation processes for lipophilic proteins |
| US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
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