HU207099B - Process for purifying reduced non glycosylated, recombinant human il and pharmaceutical composition comprising same - Google Patents

Process for purifying reduced non glycosylated, recombinant human il and pharmaceutical composition comprising same Download PDF

Info

Publication number
HU207099B
HU207099B HU893827A HU382789A HU207099B HU 207099 B HU207099 B HU 207099B HU 893827 A HU893827 A HU 893827A HU 382789 A HU382789 A HU 382789A HU 207099 B HU207099 B HU 207099B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
thr
lys
asn
ser
Prior art date
Application number
HU893827A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT51647A (en
Inventor
Danielle Lando
Philippe Riberon
Pierre Yves Abecassis
Original Assignee
Roussel Uclaf
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roussel Uclaf filed Critical Roussel Uclaf
Publication of HUT51647A publication Critical patent/HUT51647A/hu
Publication of HU207099B publication Critical patent/HU207099B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív, nem-glikozilezett, redukált rekombináns humán interleukin 2 (r-hlLzj) tisztítására.
A természetes humán IL2, amely az aktivált T-sejtek szaporodását stimuláló limfokin, a protein aminosav-szekvenciájában három ciszteint tartalmaz az 58, 105 és 125 helyzetben. Az 58 és 105 helyzetben lévő ciszteinek egy diszulfid-híddal kapcsolódnak, míg a 125 helyzetben lévő cisztein szabad tiocsoportot tartalmaz [Robb, R. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57,6486-6490(1984)].
Humán IL2 előállítása rekombináns DNS-technikával ismeretes, például Taniguchi, T. és munkatársai, Natúré 302, 305-310 (1983) és Devos R. és munkatársai Nucleic Acids Research 77 , 4307-4323 (1983) helyről, ahol ismertetik a humán IL2-gén klónozását és kifejezését mikroorganizmusokban, míg Ju, C. és munkatársai J. Bioi. Chem. 262, 5723-5731 (1987) helyen ismertetik a rekombináns IL2 kifejezését. Ismeretes továbbá, hogy ha az IL2 oldhatatlan granulák formájában felszaporodik a mikroorganizmusban, akkor redukált formában van, azaz három tiocsoportot tartalmaz, és így nem aktív (1257 931 számú japán szabadalmi bejelentés). Ahhoz tehát, hogy az aktív IL2-t megkapják, a granulátumokban felszaporodott redukált proteint oxidálni kellett. Ehhez, miután a proteint egy denaturáló közegben oldották, az alkalmas 58-105 diszulfid hidat, amelyet renaturalizálni kell, kontrollált oxidáló közegben képezték. Erre különböző eljárások ismeretesek, például oxidálás csak oxigénnel (autooxidáció levegőn) vagy rézionok jelenlétében vagy gyenge oxidálószer, például tiol segítségével vagy egy tiol és diszulfid keverékével [Tsuji, T. és munkatársai, Biochemistry 26, 3129-3134 (1987)].
Az oxidatív renaturalizálás után kromatográfiás úton, előnyösen inverz fázisú kromatográfiával történő tisztítással távolíthatók el az izomer 58-105 és 105— 125 intgramolekuláris hidak képződésének, valamint az olyan intramolekuláris hidak képződésének megfelelő inaktív oxidációs termékek [Wand, A. és munkatársai, Science 224, 1431-1433 (1984) és Browing, J. L. és munkatársai, Anal. Biochem. 755, 123-128 (1986)].
A szükséges biológiai aktivitással redelkező, homogén oxidált rekombináns IL2 előállítása a granulákban felszaporodott proteinből kiindulva tehát bizonyos technikai problémákat jelent, bármilyen módszerrel történik is, mivel többfokozatú tisztítás szükséges, ami a keresett termék kitermelésének sorozatos csökkenését okozza.
A találmány szerinti eljárásban nincs szükség reoxidálási lépésekre a biológiailag aktív IL2 előállításához.
A találmány tárgya tehát eljárás nem-glikozilezeit rekombináns humán interleukin 2 tisztítására, amelynek aminosav szekvenciája a következő: X-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-LeuGln-Leu-Glu-His-Leu-Leu-Leu-Asp-Leu-Gln-Met-IleLeu-Asn-Gly-Ile-Asn-Asn-Tyr-Lys-Asn-Pro-Lys-LeuThr-Arg-Met-Leu-Thr-Phe-Lys-Phe-Tyr-Met'-Pro-Lys2
Lys-Ala-Thr-Glu-Leu-Lys-His-Leu-Gln-Cys-Leu-GluGlu-Glu-Leu-Lys-Pro- Leu-Glu-Glu-Val-Leu-AsnLeu-Ala-Gln-Ser-Lys-Asn-Phe-His-Leu-Arg-Pro-ArgAsp-Leu-Ile-Ser-Asn-Ile-Asn-Val-Ile-Val-Leu-GluLeu-Lys-Gly-Ser-Glu-Thr-Thr-Phe-Met-Cys-Glu-TyrAla-Asp-Glu-Thr-Ala-Thr-Ile-Val-Glu-Phe-Leu-AsnArg-Trp-Ile-Thr-Phe-Cys-Gln-Ser-Ile-Ile -Ser-ThrLeu-Thr-NH2, ahol X jelentése metionin maradék vagy hidrogénatom, valamint ennek a polipeptidnek az olyan analógjai, illetve származékai amelyek azonos biológiai aktivitással rendelkeznek, és amelyben az 58, 105 és 125 helyzetben lévő három cisztein redukált formában van, és amely olyan biológiai aktivitással rendelkezik, amely összevethető az ugyanilyen szekvenciájú, 58-105 helyzetben diszulfid hidat tartalmazó oxidált IL2 aktivitásával.
Analógok és származékok alatt olyan aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptideket értünk, amelyekben az 58, 105 és 125 helyzetű ciszteintől eltérő aminosavak közül egyet vagy többet más aminosavra kicseréltünk, egy vagy több aminosav hiányzik, egy vagy több aminosavval több van jelen. A módosítás olyan mértékű, hogy ezek a termékek megtartják a redukált IL2 biológiai aktivitását. Ilyen módosítások létrehozása jól ismert módszer a rekombináns DNS-technikában, ilyen például az irányított mutagenezis módszere [Lather, R. F. és Lecoq, J. P., Genetic Engineering Academic Press 31-50 (1983) és Smith, M. és Gillam, S. Genetic Engineering principals and methods Plenum Press 3, 1-32 (1981)]. Redukált formán azt értjük, hogy az IL2-ben található cisztein maradékok szabad tiocsoportot tartalmaznak, ezek jelenlétét például spektrofotometriásán ditio-dipiridin mint tiol-reagens segítségével mutatjuk ki. A találmány szerinti eljárással előállított redukált forrna biológiai aktivitását a megfelelő, 58-105 diszulfid hidat tartalmazó oxidált formához hasonlóan határozzuk meg egerek leukémiás sejtvonalának IL2 CTLL-2-től függő szaporodása útján, kolorimetriás teszt segítségével, tetrazólium sóval [Mossman, T. J. Immunoi. Meth. 65, 55-63 (1983)].
A találmány tárgya közelebbről eljárás nem-glikozilezett rekombináns humán IL2 tisztítására, amely egyrészt a következő aminosav szekvenciával rendelkezik: X-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-LeuGln-Leu-GIu-His-Leu-Leu-Leu-Asp-Leu-Gln-Met-IleLeu-Asn-Gly-Ile-Asn-Asn-Tyr-Lys-Asn-Pro-Lys-LeuThr-Arg-Met-Leu-Thr-Phe-Lys-Phe-Tyr-Met-Pro-LysLys-Ala-Thr-Glu-Leu-Lys-His-Leu-Gln-Cys-Leu-GluGlu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-LeuAla-Gln-Ser-Lys-Asn-Phe-His-Leu-Arg-Pro-Arg-AspLeu-Ile-Ser-Asn-Ile-Asn-Val-Ile-Val-Leu-Glu-LeuLys-Gly-Ser-Glu-Thr-Phe-Met-Cys-Glu-Tyr-Ala-AspGlu-Thr-Ala-Thr-Ile-Val-Glu-Phe-Leu-Asn-Arg-TrpIle-Thr-Phe-Cys-Gln-Ser-Ile-Ile-Ser-Thr-Leu- ThrNH2, valamint ennek a polipeptidnek az olyan változatai, amelyek azonos biológiai aktivitással rendelkeznek, amelyben X metionint vagy hidrogénatomot képvisel,
HU 207 099 Β és amelynek az 58, 105 és 125 helyzetben lévő három cisztein maradéka redukált formában van, másrészt biológiai aktivitása legalább 0,5xl07 egység/mg. Az IL2 aktivitás egysége azt a mennyiséget jelenti, amely a tesztben a maximális válasz 50%-át hozza létre. Standardként National Cancer Institute (NCI) által szolgáltatott „Biological Response Modifier Program (BRMP) reference humán reagent IL2 (Jurkat)” mintát alkalmazunk.
A találmány tárgya még közelebbről eljárás nemglikozilezett, rekombináns humán interleukin 2 tisztítására, amelynek aminosav szekvenciája a következő: X-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-LeuGln-Leu-Glu-His-Leu-Leu-Leu-Asp-Leu-Gln-Met-IleLeu-Asn-Gly-Ile-Asn-Asn-Tyr-Lys-Asn-Pro-Lys-LeuThr-Arg-Met-Leu-Thr-Phe-Lys-Phe-Tyr-Met-Pro-LysLys-Ala-Thr-Glu-Leu-Lys-His-Leu-Gln-Cys-Leu-GluGlu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-AsnLeu-Ala-Gln-Ser-Lys-Asn-Phe-His-Leu-Arg-Pro-ArgAsp-Leu-Ile-Ser-Asn-Ile-Asn-Vai-Ile-Val-Leu-GluLeu-Lys-Gly-Ser-Glu-Thr-Thr-Phe-Met-Cys-Glu-TyrAla-Asp-Glu-Thr-Ala-Thr-Ile-Val-Glu-Phe-Leu-AsnArg-Trp-Ile-Thr-Phe-Cys-Gln-Ser- Ile-Ile-Ser-ThrLeu-Thr-NH2, amelyben X jelentése metionin maradék vagy hidrogénatom, és amelyben az 58, 105 és 125 helyzetű három cisztein maradék redukált formában van, és amelynek biológiai aktivitása hasonló a természetes humán IL2 aktivitásához. A hasonló aktivitás kifejezésen a leukémiás Jurkat sejtekből izolált természetes IL2 fajlagos aktivitásával azonos fajlagos aktivitást értünk, azaz l,3xl07 egység/mg (hivatkozás BRMP), vagy olyan aktivitást, amely legfeljebb 25%-ban tér el ettől a fajlagos aktivitástól. A találmány szerinti eljárással előállított redukált IL2 szekvenciája adott esetben egy kiegészítő N-terminális metionin maradékot tartalmaz a transzformált mikroorganizmusnak, például E. colinak megfelelően, amelyben kifejeződik. A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módjában olyan szekvencia előnyös, amely metionint tartalmaz, de a metionint tartalmazó termék és egy olyan termék elegye, amely nem tartalmaz metionint vagy amelyből a metionint eltávolítottuk, szintén alkalmazható.
A nem-glikozilezett, rekombináns humán IL2 redukált formájának tisztítása abban áll, hogy a transzformált mikroorganizmusban granulák formájában akkumulált ΙΙ^-t redukáló közegben, egy kaotropikus szerrel történő szolubilizálással extraháljuk, majd kicsapást követően inverz fázisú, nagysebességű folyadékkromatográfiával, savas eluálószerrel tisztítjuk. A találmány értelmében
i) a kromatográfiával kapott fő frakciót kívánt esetben
-20 °C körüli hőmérsékletre lehűtjük, a vizes fázist elválasztjuk, majd ii) savas közeggel hígítjuk, majd egy második inverz fázisú, nagysebességű folyadékkromatográfiás oszlopon savas közeggel kromatografáljuk, és a kapott terméket izoláljuk.
A transzformált mikroorganizmus, például E. coli nagy arányú expressziós képessége következtében granulák formájában termelt rekombináns IL2 ismert módszerekkel szolubilizálható, egy kaotropikus szer koncentrált oldatával, például 6-8 mól/literes guanidin-só oldattal, majd inverz fázisú nagysebességű folyadékkromatográfiával (a továbbiakban RP-HPLC) kereskedelemben kapható tölteteken, előnyösen módosított szilícium-dioxidon, mint például C3, C4, C8 vagy C18 tölteteken savas, 1-4 pH-értékű eluálószerrel tisztítható (1. EP-0156373-A2 számon közrebocsátott európai bejelentés). Az IL2 az oszlopról gradiens-rendszerrel eluálható, amely egy szerves savat, például ecetsavat vagy trifluor-ecetsavat (a továbbiakban TFA) és egy szerves oldószert, például acetonitrilt tartalmaz. A fő frakció, amelynek eluálását spektrofotometriásán 280 nm-nél detektáljuk, a kívánt esetben végzett hűtési lépés nyersanyaga, amely hűtési lépés a találmány szerinti eljárás egy része. Hűtésen azt értjük, hogy az említett fő frakciót szobahőmérsékleten összegyűjtjük és -20 °C körüli hőmérsékletű környezetbe helyezzük, amely a szilárd vizes fázis fokozott képződését teszi lehetővé, amelyről a felülúszót dekantáljuk. A kívánt esetben ilyen módon elválasztott vizes fázis hígítás után a továbbiakban ismertetett, a találmány szerinti eljárás részét képező, savas közeggel végzett RPHPLC nyersanyagként szolgál. A vizes fázis hígítását egy savas közeggel végezzük, amelynek pH-értéke 14, előnyösen 2-3. A hígított vizes fázist inverz fázisú oszlopon kromatografáljuk, kereskedelemben kapható tölteteken, például C3, C4, C8 vagy Cl8 módosított szilícium-dioxidokon, amelyeknek pórusmérete megfelelő a proteinekhez való alkalmazáshoz, például legalább 150 A átmérőjű. Az IL2 eluálását egy rövid szénláncú, vízzel elegyedő alkoholt emelkedő koncentrációban és egy szerves savat tartalmazó gradienssel végezzük.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint a kívánt esetben végzett hűtési lépést acetonitril vizes oldatában végezzük, amely kb. 0,1 térfogat% trifluor-ecetsavat tartalmaz; továbbá a hígítást egy szerves sav, például citromsav vizes oldatával végezzük; és az említett ΙΙ^-t a második kromatográfiában izopropanolt, vizet és egy szerves savat, például citromsavat tartalmazó oldattal eluáljuk. Az acetonitril vizes oldata, amely kb. 0,1 térfogat% TFA-t tartalmaz, amely a találmány szerinti eljárás kívánt esetben végzett hűtési lépéséhez az előnyös elegy, az első kromatográfiában eluált fő frakciónak felel meg. Előnyös, ha a vizes fázis hígítását közvetlenül vagy a kívánt esetben végzett elválasztás után, vagy az első kromatográfia után végezzük. A hígítást előnyösen legalább 2 térfogatrész víz adagolásával végezzük, amely 0,5-2 térfogat% szerves savat, például hangyasavat, ecetsavat, propionsavat, trifluor-ecetsavat vagy citromsavat tartalmaz, előnyösebben kb. 2 térfogatrész víz adagolásával végezzük, amely 0,5 térfogat% citromsavat tartalmaz. A második kromagotráfiát, amely a találmány szerinti eljárás részét képezi, úgy végezzük, hogy a vizes fázist, amelyet adott esetben a hűtési lépés után elválasztottunk, majd hígítottunk, kereskedelemben kapható tölteteken, például C3, C4, C8 vagy Cl8 módosított szilícium-dioxidokon, amelyeknek pórusát3
HU 207 099 B mérője legalább 150 Á, RP-HPLC-nek vetjük alá. Az előnyös töltet egy 300 A pórusátmérőjű C4 VYDAC jelű módosított szilikagél, amely a szilikagélen kovalensen köttöt butilcsoportokat tartalmaz, és amelynek pórusátmérője 300 A, és amelynek részecske mérete átlagosan 15-20 pm. Az IL2 eluálását a találmány szerinti eljárás értelmében úgy végezzük, hogy egy rövid szénláncú alkoholt, például propánok vagy izopropanolt és egy szerves savat, például hangyasavat, ecetsavat, propionsavat, trifluor-ecetsavat vagy citromsavat tartalmazó gradiens rendszert alkalmazunk. Az előnyös elegy izopropanolt, vizet és citromsavat tartalmaz előnyösen 0,5-2 térfogat%, előnyösebben 0,5 térfogat% mennyiségben, amelyben az izopropanol koncentrációja emelkedik, az alacsonyabb frakciók eluálását kb. 48 térfogat% izopropanol, majd a magasabb frakciók eluálását kb. 59 térfogat% izopropanol esetén biztosítja, ez utóbbi tartalmazza a nem-glikozilezett, aktív rekombináns humán IL2-t redukált formában.
A kapott frakció kb. 0 és -20 °C között tárolható, ilyen körülmények között stabil. Az izopropanol vákuumban végzett azeotróp-desztillációval is eltávolítható. A kapott oldat tárolható +4 °C-on is, vagy a találmány szerinti eljárással tisztított IL2 azonnal izolálható liofilizálásssal.
A találmány tárgykörébe tartozik az eljárásnak egy olyan változata is, amelynek során a fő frakciót a hűtési lépésnek és a vizes fázis elválasztásának nem vetjük alá.
Az említett változattal kapott hígított fő frakció szintén tárolható +4 °C-on. Ez stabil, és a találmány szerinti eljárás részét képező második kromatográfia nyersanyagát jelenti.
A találmány szerinti eljárással tisztított IL2 három szabad tiocsoportot tartalmaz, és 0,7-l,3xl07 egység/mg fajlagos aktivitást mutat a CTLL-2 vonalak szaporodási tesztjében, azaz a természetes IL2 aktivitásához hasonlót. Ezen aktivitási érték alapján a találmány szerinti eljárással tisztított nem-glikozilezett, rekombináns humán IL2 redukált formában gyógyszer hatóanyagaként a természetes IL2-höz hasonló módon alkalmazható, különböző indikációk esetén, ahol ezek immunmódosító aktivitását, valamint tumorellenes aktivitását használjuk ki, ahogyan azt például Fletcher, M. és munkatársai Lymphokine Research 6, 47-57 (1987) helyen ismertetik. Ilyen immunmódosító és tumorellenes aktivitás például a T-limfociták szaporítása, az NK (természetes ölő) sejtek és a LAK (limfokinnal aktivált ölő) sejtek citotoxicitásának indukálása, a sejtimmunitás helyreállítása, immun-elégtelenség esetén védőhatás vertőzések ellen és adjuváló hatás vakcinákkal. Az adagolás történhet közvetlenül vagy adoptív immunterápiás módszerrel kombinálva, ahogyan azt Rosenberg, S. A. és munkatársai N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492 (1985) helyen ismertetik.
A találmány szerinti eljárással tisztított IL2 a természetes IL2-höz hasonlóan alkalmazható önmagában vagy más immunmódosító szerekkel, például alfa-interferonnal, gamma-interferonnal és/vagy más terápiás szerekkel együtt.
A találmány szerinti eljárással tisztított nem-glikozilezett, rekombináns humán IL2 tehát gyógyszerkészítmények hatóanyagaként alkalmazható. Ezek a készítmények lehetnek szilárd vagy folyékony formájúak. Ilyenkor a találmány szerinti eljárással tisztított IL2-t farmakológiailag elfogadható hordozóanyagokkal és egyéb segédanyagokkal kombináljuk. A gyógyszerkészítmények az IL2 hatásos mennyiségét és a hordozó alkalmas mennyiségét tartalmazzák, amely lehetővé teszi az embernek történő adagolást. A készítmények előállíthatok a találmány szerinti eljárással tisztított IL2 vizes savas oldatából kiindulva, miután az izopropanolt vákuumban végzett azeotróp-desztillációval eltávolítottuk, amelyhez a vízoldható töltőanyagot adagoljuk és liofilizáljuk. Vízoldható töltőanyagon olyan vízoldható anyagot értünk, amely nem befolyásolja a kezdeti pH-értéket, amikor az elegyet rekonstruáljuk. Ilyen töltőanyagok lehetnek például a cukrok, mint például glükóz, ribóz, szacharóz, maltóz, trehalóz vagy redukált cukrok, mint például mannit. A mannit előnyös. A mannitot 10-50 mg/ml, előnyösen 50 mg/ml körüli mennyiségben adagoljuk, ha a találmány szerinti eljárással tisztított IL2 koncentrációja 0,05 és 1 mg/ml közötti, az adagolás dózisától függően. Az oldatot steril körülmények között, oxigén kizárása mellett dózisegységekre osztjuk és liofilizáljuk. A liofilizált elegy a flakonban vagy fiolában parenterális injekcióhoz alkalmas desztillált víz segítségével rekonstruálható.
A találmány szerinti eljárással előállított készítményt intravénás úton bolus vagy folyamatos perfúzió, intramuszkuláris, intraperitoneális, intrapleurális vagy szubkután úton adagolhatjuk. A találmány szerinti eljárással tisztított hatóanyag hatásos dózisa, amely függ az adagolás módjától és a kezelendő betegségtől, általában lxlO6 egység/M2 és 40x106 egység/m2, előnyösen 20x106 egység/M2 naponta felnőtteknek vagy gyerekeknek, A napi adag az adagolás időtartamától is függ és nem korlátozódik az előbb említett dózisra.
Perfúziós adagoláshoz a készítmény a nem-glikozilezett, rekombináns humán IL2 redukált formáját, vizet és egy szerves savat, például citromsavat tartalmaz. Egy ilyen kompozíciót előállíthatunk úgy, hogy a találmány szerinti eljárással előállított 1 iofilizált gyógyszerkészítményt olyan alkalmas vivőanyag jelenlétében oldunk, amely hozzájárul az aktív anyag stabilitásának biztosításához a perfúzió ideje alatt, ilyen például a glükóz. Előnyösen például úgy járunk el, hogy a desztillált vízzel rekonstituált liofilizált elegyet 50 mg/ml koncentrációjú glükóz oldat olyan mennyiségével hígítjuk, amelyet az adagolás dózisának megfelelően határozunk meg.
A mellékelt ábrák a találmány szerinti megoldást illusztrálják. Az la az 1. példa szerinti, 8 mól/literes guanidines nyers extraktum RP-HPLC analízis kromatogramja, az b ábra a standard redukált és oxidált IL2 RP-HPLC analízis kromatogramja, a
I
HU 207 099 B
2. ábra az 1. példa szerinti reszolubilizálás RPHPLC analízis kromatogramja, a
3. ábra az 1. példa szerinti hűtési fázis utáni fő frakció RP-HPLC kromatogramja, a
4. ábra az 1. példa szerinti 59. frakció RP-HPLC analízis kromatogramja, a
6. ábra a 2. példa szerinti SDS-PAGE elektroforézis gélt mutatja, a
7a és 7b ábra a 2. példa szerinti peptid tölteteket mutatja, a 8a és 8b ábra a 2. példa szerinti DC görbéket mutatja, a
9. ábra a 3. példában bemutatott kísérlet, a humán limfocitákra gyakorolt mitogenetikus hatás görbéjét mutatja, a
10. ábra a K 562 és DAUDI kapcsán kapott toxicitási görbét mutatja.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
Redukált, biológiailag aktív r-hIL2 tisztítása granulákból kiindulva
A természetes IL2-t kódoló szekvenciát tartalmazó plazmiddal transzformált, és az IL2-t ilyen formában a setj belsejében felhalmozni képes E. coli tenyészetének centrifugálásával granulákat nyerünk, ahogyan ezt például Sato, T. és munkatársai J. Biochem 101, 525-534 (1987) helyen ismertetik. Egy 10 1-es fermentorból így kapott sejteket egy Manton-Gaulin homogénizátorban feltárjuk. Az izolált és mosott sejt maradékból (90— 170 g nedves tömeg) kiindulva, az IL2-t 2,5-szeres térfogatú olyan oldattal szolubilizálja, amely 20 mmól/1 tris-hidrokloridot (pH = 8), 8 mól/l guanidin-hidrokloridot (Gu, HC1) és 100 mmól/1 ditiotreitolt (DTT) tartalmaz. Az IL2 szolubilizált mennyiségét (1,5-2,5 g) analitikai RP-HPLC-vel határozzuk meg, egy C4 VYDAC oszlopon (0,46x15 cm, 300 Á, 5 μτη), 2 ml/perc átfolyási sebességgel, acetonitril lineáris gradiensével (30-70 térfogat%, 10 perc), amely 0,1 térfogat% TFA-t tartalmaz. A spektrofotometriás detektálást 280 vagy 210 nm-nél végezzük, a csúcs területének kiértékelését 280 nm-nél, standard IL2-vel történt kalibrálás után végezzük (la és lb ábra). Az IL2-t ezután a Gu-hidroklorid koncentrációjának 2 mól/literre történő csökkentésével, DTT jelenlétében kicsapjuk. A csapadékot TFA 0,1 térfogat%-os vizes oldatával mossuk, amíg a pH 5',0-öt el nem éri a felülúszóban, ezután az IL2-t 20 térfogat% acetonitrilt és 0,1 térfogatié TFA-t tartalmazó vizes oldattal szolubilizáljuk. A kapott „reszolubilizált elegy”, amelynek redukált IL2 tartalma több mint 85% az analitikai RP-HPLC szerint (2. ábra), biológiai aktivitása kisebb mint Ο,ΟίχΙΟ7 egység/mg redukált IL2 és a tiocsoport tartalma 1 mól redukált IL2-re vonatkoztatva 2,85. A kapott oldat egy frakcióját, amely kb. 200 mg IL2-nek felel meg az analitikai RP-HPLC alapján, olyan módon hígítjuk, hogy az acetonitril tartalma kevesebb mint 10% legyen 0,1 %-os TFA-ban, majd egy C4 VYDAC oszlopra visszük (5,7x30 cm). Az IL2-t 100 ml/perc átfolyási sebességgel acetonitril lineáris gradiensével (30-80% 40 perc alatt) eluáljuk, amely 0,1% TFA-t tartalmaz a fő csúcsnál az acetonitrilben kb. 60% koncentrációban, amelyet spektrofotometriásán 280 nm-nél detektálunk, és RP-HPLC-vel meghatározunk. Az összegyűjtött fő frakciót, amely a redukált IL2-t tartalmazza, szobahőmérsékletről lassan -20±l °C-ra hűtjük le, így lehetővé válik, hogy a felső szerves fázist, amely acetonitrilben gazdag, dekantáljuk. A vízben gazdag, IL2-t tartalmazó alsó fázist fagyott állapotban tartjuk. Felolvasztás után a kapott oldatot, miután 2 térfogat 0,5%-os vizes citromsav oldattal hígítottuk, C4 VYDAC oszlopra viszszük (5,7x30 cm), amelyet izopropanol lineáris gradiensével (20-70% 40 perc alatt) fejlesztünk ki, amely 0,5% citromsavat tartalmaz, 50 ml/perc átfolyási sebességgel. Az eluátumban 280 nm-nél spektrofotometriásán követve egy kisebb csúcs megjelenése látható kb. 48%-nál az izopropanolban („48” frakció) és egy nagyobb csúcs kb. 59%-nál („59” frakció) (3. ábra). Az „59” frakciót összegyűjtjük. Ez 0 °C-on, levegőtől elzárva legalább 24 óra hosszat stabil.
Miután az izopropanolt azeotróp-desztillációval vákuumban eltávolítottuk, az „59” frakciót analitikai RPHPLC-vel megvizsgáljuk, így homogén csúcsot határozunk meg (4. ábra), amely kb. 60% koncentrációban eluálódott az acetonitrilben, míg a referencia oxidált IL2 kb. 57% koncentrációban eluálódott az acetonitrilben (lb ábra). Az „59”) frakció, amelynek IL2 koncentrációja az izopropil-alkohol eltávolítása után több mint 1 mg/ml és pH-ja 3±0,5, +4 °C-on levegőtől elzárva legalább egy hétig tárolható, vagy azonnal liofilizálható vagy gyógyszerkészítménnyé alakítható. A liofilizált „59” frakció biológiai aktivitását in vitro tesztben a CTLL-2 sejtek szaporodása alapján meghatároztuk, és megállapítottuk, hogy fajlagos aktivitása l,3±0,5xl07 egység/mg hasonlóan a természetes IL2 aktivitásához.
A liofilizált „59” frakció szabad tiocsoport tartalma kolorimetriás módon ditiopiridinnel meghatározva 2,94 SH/mól összevetve az oxidált referencia IL2 0,76 SH/mól értékével.
liter fermentléből kiindulva 150-300 mg redukált r-hIL2 nyerhető az „59” frakcióban az analitikai RP-HPLC szerint titrálva, amely IL2 három tiocsoportot tartalmaz, biológiailag aktív, RP-HPLC-ben homogén. A végzett eljárás vázlata:
FERMENTÁCIÓ —> (baktérium-maradék) EXTRAKCIÓ baktérium-koncentrátum felolvasztása vizes feltárás Manton-Gaulin homogenizátorban guanidines extrakció kicsapás a guanidin hígításával mosás TFA-tartalmú vízzel szolubilizálás TFA-tartalmú acetonitrillel
KROMATOGRÁFIA
RP-HPLC C4 aceton itril/TFA-gradiens hűtés -20 °C-ra
RP-HPLC C4 izopropanol/citromsav-gradiens izopropanol eltávolítása vákuum-desztillációval
LIOFILIZÁLÁS
HU 207 099 B
2. példa
Biológiailag aktív redukált r-hIL2 tisztítása
Az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a fő frakciót nem vetjük alá hűtési lépésnek, majd dekantálással végzett elválasztásnak, hanem közvetlenül két térfogatrész 0,5%-os vizes citromsav oldattal hígítjuk, Az „59” frakciót összegyűjtjük, és az 1. példa szerinti módon kezeljük.
3. példa
A biológiailag aktív redukált r-hIL2 fiziokémíai jellemzése
Az 1. példában kapott „59” frakciót, amely a találmány szerinti redukált r-hlL2-t tartalmazza, a következő tulajdonságokra nézve vizsgáljuk:
1. Homogenitás
Az SDS PAGE elektroforézist egy gélen két fázisban hajtjuk végre (koncentráló gél és migrációs gél 5, illetve 15% akrilamid tartalommal), amely 10% SDS-t tartalmaz. A mintákat először 2 percig 100 °C-on 3% SDS-t és 5% merkapto-etanolt tartalmazó pufferben hevítjük. Az 1% SDS tartalmú pufferrel végzett vándorlást ezüstnitráttal végzett kimutatással követjük [Henkeshoven J. és munkatársai, Electrophoresis 6, 103-112 (1985)], amely egyetlen foltot tesz láthatóvá, amely nagyobb mint 99%-os tisztaságnak felel meg egy 2μg-os mintában (6. ábra).
2. Molekulatömeg elektroforézissel
Redukáló közegben kb. 15 kD látszólagos molekulatömeget határozunk meg, amely közelíti a számított 15 420 molekulatömeget (6. ábra).
3. Aminosav összetétel
25gg találmány szerinti redukált r-hIL2 0,5 ml vízzel készült mintáját üveg hidrolizálócsőbe helyezzük, amelybe bemérünk 0,5 ml koncentrált sósavat, amely 31,7% TFA-t és 4,8% tioglikolsavat tartalmaz. A csövet vákuumban lezárjuk, majd a hidrolízist 155 °C-on 40 perc alatt hajtjuk végre. A hidrolizátumot ezután csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 0,7 ml citrát pufferben feloldjuk (pH = 3), majd egy Interaction AA 511 oszlopon (0,46x15 cm) aminosav elemzésnek vetjük alá, 60 °C-on citrát puffer segítségével, amelyben a pH-gradiens 3-5 és a nátrium-klorid gradiens 0-70 g/1, az átfolyási sebesség 0,5 ml/perc, a detektálást fluoreszcenciásan ortoftalaldehid segítségével végezzük. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze. Az értékek két hidrolízis és két kromatográfia eredményének az átlagai. Az összetétel megegyezik a természetes IL2 összetételével, amely kiegészítő N-terminális metionint tartalmaz.
/. táblázat INTERLEUKIN 2
Aminosav Elemzési szám Talált szám
GLN + GLU 18 17.56
ASN + ASP 12 12,61
THR 13 12,09
SER 8 7,05
PRO 5 ND*
GLY 2 2,59
ALA 5 5,50
VAL 4 4,34
MET 5 5,59
1LE 9 9,15
LEU 22 19,96
TYR 3 2,60
PHE 6 5,90
TRP 1 NC**
LYS 11 10,19
H1S 3 3,48
ARG 4 5,29
CYS 3 NC**
* ND = nem detektáltuk ** NC - nem számítottuk
4. N-terminális aminosav szekvencia
Az N-terminális szekvenciát mikroszekvenálással,
Edman automatikus degradációs módszerével határoz25 zuk meg: l5μg biológiailag aktív, redukált r-hIL2
HPLC 120A-val összekapcsolt Applied Biosystems 470A gázfázisú mikroszekvenálóban végzett analízise a következő PTH aminosavakat mutatja:
Fokozat PTHAA Fokozat PTH AA
1 Met Alá 11 Thr
2 Alá Pro 12 Gin
3 Pro Thr 13 Leu
4 Thr Ser 14 Gin
5 Ser 15 Leu
6 Ser 16 Glu
7 Ser 17 His
8 Thr 18 Leu
9 Lys 19 Leu
10 Lys 20 Leu
A 20-N terminális maradék szekvenciája megegyezik a természetes IL2 elméleti kapcsolódási sorrendjével, mintegy 10% metionin nélküli IL2-t figyelünk meg.
5. Peptid diagram cianogén-bromiddal
700μg redukált IL2-t (kb. 53 nmól), feloldunk 4 ml
70%-os hangyasavban, és hozzáadunk 5,6 mg cianogén-bromidot. Az oldatot egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, vízzel hígítjuk, majd liofilizáljuk. A reaktív elegyet RP-HPLC-vel· egy Bondapack C18 RP oszlopon elemezzük (0,46x20 cm) acetonitril 0-70%6
HU 207 099 Β ig változó gradiensével, amely 0,1% TFA-t tartalmaz, 1 ml/perc átfolyási sebességgel, szobahőmérsékleten. A detektálást 220 nm-nél spektrofotometriásán végezzük. A redukált r-hIL2 peptid diagramja (7a ábra) a referencia oxidált EL^től (7a ábra) eltérő fragmentációt mutat.
Cirkuláris dikroizmus
A cirkuláris dikroizmus spektrumot (CD) szobahőmérsékleten Jobin Yvon Mark V spektrográf segítségével határozzuk meg. A redukált r-hIL2 mintákat, amelyeket az 1. példa szerinti módon, 0,5% citromsav helyett 0,1% hangyasavat tartalmazó izopropanol lineáris gradiensével végzett RP-HPLC után liofílizáltunk, az izopropanol desztiliálása után liofilizáltunk, 1 mg/ml koncentrációban ecetsavval felvesszük. 0,01 cm, illetve 0,5 cm méretű tartókat használunk a peptid tartományban (185-250 nm) és az aromás tartományban (260-320 nm). Az oldat spektrumát levonjuk az IL2 spektrumából minden minta esetén. Az eredményeket nulla elliptikusságban adjuk meg (átlagtömeg/IL2 maradék= 116).
A 8a ábra a CD spektrumot mutatja a távoli ultravíolában: a találmány szerinti eljárással tisztított redukált, biológiailag aktív r-hIL2 olyan spektrummal rendelkezik, amely egy rendezett szekunder szerkezet jelenlétére utal. Az alfa helix % meghatározása azt mutatja, hogy kicsi a szignifikáns differencia az oxidált referencia IL2-höz képest (% alfa helix 50%).
A 8b ábra a CD spektrumot mutatja közeli ultraviolában: az oxidált referencia IL2 szignifikáns CD-vel rendelkezik, amely aszimmetrikus környezetet mutat az aromás maradékoknak, míg a találmány szerinti eljárással tisztított redukált r-hlLj kis szignifikanciájú, de eltérő CD-vel rendelkezik.
4. példa
Biológiai aktivitás
A találmány szerinti eljárással tisztított redukált rhIL2 biológiai hatásosságát in vitro és ex vivő kísérletekben határoztuk meg.
1. In vitro aktivitás humán sejtekre
a) Limfoblaszt transzformációs teszt
Az egér sejtvonalak, mint például CTLL2 szaporodási aktivitása mellett, amely az IL2 biológiai mértékszámát adja, a találmány szerinti eljárással tisztított redukált rhIL2 mitogén hatást mutat a dózistól függően, ahhoz hasonlót, mint az oxidált referencia IL2 normál cirkuláló humán limfocitákra, amelyet a tritiált timidin DNS-be történő beépülésének mértékével ábrázolunk (9. ábra).
b) Egymagvú sejtek citotoxicitásának indukálása
A vizsgálatot úgy végezzük, hogy humán cirkuláló egymagvú sejteket IL2 jelenlétében inkubálunk, amelyeknek citotoxikus hatását tumor célsejtekre, az eritroleukémiás K562 vonalra (NK sejtekre érzékeny) és a B limfómából származó DAUDI vonalra (NK sejtekre rezisztens) nézve határozzuk meg 4 óra alatt a Cr 51 kisózását mérve. Az eredmények, amelyeket lírikus egység/106 sejt (UL/106) formájában adtunk meg, azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással tisztított redukált r-hIL2 a dózistól függően fokozza az NK aktivitását, vagy a T-limfociták citotoxicitását indukálja a tumor célsejtekre nézve a természetes IL2 ismert hatásához hasonlóan (10. ábra).
2. Ex vivő aktivitás egerekre (peritoneális makrofágok stimulálása)
Normál Balb/c és MRL-+/+ egerekben szuboptimális dózisban (100-3000 egység) injektált patkány rekombináns gamma-inerferon, majd 24 órával később a találmány szerinti eljárással tisztított redukált r-hIL2 intraperitoneális injekciója megindítja a fagocitáló sejtek oxidatív mechanizmusát, ahogyan ezt az IL^ injektálása után 24 órával leölt egerek hasüregéből eltávolított sejtek forbál-észter (PMA) jelenlétében mért kemolumineszcenciával kiértékeltük. A dózistól függő hatás hasonló az oxidált referencia IL2 hatásához. Az eredményeket a következő táblázatban foglaltuk össze.
Injektált adag (mg/egér) Kemolumineszcencia (CPMxlO4) r-hIL2 injektálása után
Redukált Oxidált
0 5+2 4±3
1 7±3 5±1
3 90±5 71±5
10 130±10 140±70
30 350±50 400+70
100 710±20 695±25
300 375±25 350±20
5, példa
Injekciós gyógyszerkészítmény
A találmány szerinti eljárással tisztított, redukált r-hIL2 vizes oldatát, amely az „59” frakciónak felel meg, amelyből az izopropanolt azeotróp-desztíllációval vákuumban eltávolítottuk, gázmentesített és nitrogénnel telített vizes mannit oldattal hígítjuk úgy, hogy lOOpg/ml IL2-t és 50 pg/ml mannitot tartalmazzon. Az oldatot egy 0,22 pm pórusméretű membránon leszűrjük, 1 ml-enk sterilen flakonokba töltjük és liofilizáljuk, nitrogén atmoszférában lezárjuk, és +4 °C-on tároljuk felhasználásig.
6. példa
Infúziós készítmény
A találmány szerinti eljárással tisztított, redukált rhIL2 vizes oldatát, amely az „59” frakciónak felel meg, és amelyből az izopropanolt azeotróp-desztillációval vákuumban eltávolítottuk, mannit gázmentesített és nitrogénnel telített vizes oldatával hígítjuk olyan arányban, hogy ml-enként 500 pg redukált BL2-t és 50 mg mannitot tartalmazzon. Az oldatot egy 0,22pm pórusméretű membránon leszűrjük, 1 ml-enként sterilen flakonokba töltjük és liofilizáljuk, a flakonokat nitrogén atmoszférában lezárjuk, és felhasználásig +4 °C-on tároljuk. Felhasználáskor a flakonok tartalmát 1 ml steril desztillált vízzel feloldjuk, 7 flakon tartalmát (kb. 35xl06 egység) egy 500 ml 5%-os Travenol glükóz oldatot tartalmazó Viaflex tartályba adjuk.

Claims (5)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás nem-glikozilezett, rekombináns humán interleukin 2 (r-hIL2), amelynek aminosav szekvenciája: X-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-LeuGln-Leu-Glu-His-Leu-Leu-Leu-Asp-Leu-Gln-Met-IleLeu-Asn-Gly-Ile-Asn-Asn-Tyr-Lys-Asn-Pro-Lys-LeuThr-Arg-Met-Leu-Thr-Phe-Lys-Phe-Tyr-Met-Pro-LysLys-Ala-Thr-Glu-Leu-Lys-His-Leu-Gln-Cys-Leu-GluGlu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-LeuAla-Gln-Ser-Lys-Asn-Pbe-His-Leu-Arg-Pro-Arg-AspLeu-Ile-Ser-Asn-Ile-Asn-Val-Ile-Val-Leu-Glu-LeuLys-Gly-Ser-Glu~Thr-Thr-Phe-Met-Cys-Glu-Tyr-AlaAsp-Glu-Thr-Ala-Thr-Ile-Val-Glu-Phe-Leu-Asn-ArgTrp-Ile-Thr-Phe-Cys-Gln-Ser- Ile-Ile-Ser-Thr-LeuThr-NH2, ahol X jelentése metionin vagy hidrogénatom, valamint ezen polipeptid analógjai tisztítására, amelyekben az 58, 105 és 125 helyzetben lévő ciszteinek redukált formában vannak jelen, amely eljárás során a transzformáit mikroorganizmusokban granulák formájában felszaporodott r-hIL2-t extraháljuk, majd kicsapással és inverz fázisú nagysebességű folyadékkromatográfiával savas eluálószer segítségével tisztítjuk, azzal jellemezve, hogy
    i) a fenti folyadékkromatográfiás tisztítás során kapott fő frakciót kívánt esetben -20 °C körüli hőmérsékletre lehűtjük, a vizes fázist elválasztjuk, majd ii) savas közeggel hígítjuk, és egy második inverz fázisú nagysebességű folyadékkromatográfiának vetjük alá savas közeggel eluálva, és a kapott terméket izoláljuk.
  2. 2. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hígítást az eredeti térfogat legalább háromszorosára, 0,5-2 térf% szerves savat, előnyösen citromsavat tartalmazó vizes közeggel, és a második kromatográfiás eljárás során az r-hIL2 eluálását 0,5-2 térf% szerves savat, előnyösen citromsavat és egy rövid szénláncú alkanol, előnyösen izopropanol 20 térf%-tól 70 térf%-ig változó gradiensét tartalmazó vizes oldattal végezzük.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás legalább 0,5xl07 egység/mg biológiai aktivitású termék kinyerésére, azzal jellemezve, hogy a megfelelő frakciót alkalmazzuk.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, a természetes humán IL2 biológiai aktivitásával rendelkező termék előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő frakciót alkalmazzuk.
  5. 5. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással tisztított nem-glikozilezett, rekombináns humán interleukin 2-t vagy annak analógját a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
HU893827A 1988-07-28 1989-07-27 Process for purifying reduced non glycosylated, recombinant human il and pharmaceutical composition comprising same HU207099B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8810184A FR2635527B1 (fr) 1988-07-28 1988-07-28 Il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite, son procede d'obtention et son application comme medicament

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT51647A HUT51647A (en) 1990-05-28
HU207099B true HU207099B (en) 1993-03-01

Family

ID=9368873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU893827A HU207099B (en) 1988-07-28 1989-07-27 Process for purifying reduced non glycosylated, recombinant human il and pharmaceutical composition comprising same

Country Status (21)

Country Link
US (2) US5874076A (hu)
EP (1) EP0353150B1 (hu)
JP (1) JP3016793B2 (hu)
KR (1) KR0131070B1 (hu)
CN (1) CN1036532C (hu)
AT (1) ATE110783T1 (hu)
AU (1) AU624625B2 (hu)
DE (1) DE68917826T2 (hu)
DK (1) DK370489A (hu)
ES (1) ES2058573T3 (hu)
FI (1) FI96209C (hu)
FR (1) FR2635527B1 (hu)
HU (1) HU207099B (hu)
IE (1) IE64232B1 (hu)
IL (1) IL90975A (hu)
MX (1) MX16912A (hu)
NZ (1) NZ230111A (hu)
PT (1) PT91295B (hu)
RU (1) RU2105011C1 (hu)
UA (1) UA26846C2 (hu)
ZA (1) ZA895419B (hu)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2660863B1 (fr) * 1990-04-17 1994-01-21 Roussel Uclaf Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour preparer une composition pharmaceutique destinee au traitement de cancers primitifs de la plevre.
FR2668368B1 (fr) * 1990-10-30 1995-03-10 Roussel Uclaf Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour preparer une composition pharmaceutique destinee au traitement des tumeurs malignes epitheliales.
WO1992009623A1 (fr) * 1990-11-23 1992-06-11 Roussel-Uclaf PROCEDE DE PREPARATION D'UNE PROTEINE COMPORTANT AU MOINS UN PONT DISULFURE INTRAMOLECULAIRE PAR OXYDATION, A UN pH INFERIEUR A 5,0, DE LA PROTEINE RECOMBINANTE REDUITE CORRESPONDANTE
FR2671728B1 (fr) * 1991-01-17 1995-01-20 Roussel Uclaf Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement des pneumathorax.
FR2684878B1 (fr) * 1991-12-12 1994-02-11 Roussel Uclaf Composition pharmaceutique stabilisee d'il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite et son procede de preparation.
US6470207B1 (en) * 1999-03-23 2002-10-22 Surgical Navigation Technologies, Inc. Navigational guidance via computer-assisted fluoroscopic imaging
US20050203578A1 (en) * 2001-08-15 2005-09-15 Weiner Michael L. Process and apparatus for treating biological organisms
SI2251353T1 (sl) * 2003-08-07 2013-10-30 Zymogenetics, Inc. Homogeni preparati il-29
EP4090674A4 (en) 2020-01-14 2024-01-24 Synthekine Inc METHODS AND COMPOSITIONS OF BIASED IL2 MUTEINS

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341562C (en) * 1982-03-31 2007-11-27 Tadatsugu Taniguchi Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell
US5643566A (en) * 1982-09-23 1997-07-01 Cetus Corporation Formulation processes for lipophilic proteins
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
JPS60115528A (ja) * 1983-11-28 1985-06-22 Takeda Chem Ind Ltd ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物
US4569790A (en) * 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
US4604377A (en) * 1984-03-28 1986-08-05 Cetus Corporation Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2
EP0158487B1 (en) * 1984-04-09 1991-08-28 Takeda Chemical Industries, Ltd. Stable composition of interleukin-2
US4654830A (en) * 1984-11-27 1987-03-31 Monolithic Memories, Inc. Method and structure for disabling and replacing defective memory in a PROM
US4690915A (en) * 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
JPH0829113B2 (ja) * 1986-11-11 1996-03-27 武田薬品工業株式会社 ヒトインタ−ロイキン−２の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
HUT51647A (en) 1990-05-28
IE64232B1 (en) 1995-07-26
JPH02209896A (ja) 1990-08-21
US5814314A (en) 1998-09-29
RU2105011C1 (ru) 1998-02-20
IL90975A0 (en) 1990-02-09
EP0353150A1 (fr) 1990-01-31
DK370489A (da) 1990-01-29
CN1042377A (zh) 1990-05-23
IL90975A (en) 1994-11-28
PT91295A (pt) 1990-02-08
UA26846C2 (uk) 1999-12-29
DK370489D0 (da) 1989-07-27
EP0353150B1 (fr) 1994-08-31
FI893587A (fi) 1990-01-29
IE892443L (en) 1990-01-28
JP3016793B2 (ja) 2000-03-06
KR900001854A (ko) 1990-02-27
ZA895419B (en) 1990-09-26
KR0131070B1 (ko) 1998-04-11
ATE110783T1 (de) 1994-09-15
ES2058573T3 (es) 1994-11-01
MX16912A (es) 1993-10-01
US5874076A (en) 1999-02-23
CN1036532C (zh) 1997-11-26
FR2635527B1 (fr) 1992-06-12
FI96209B (fi) 1996-02-15
PT91295B (pt) 1995-03-01
FR2635527A1 (fr) 1990-02-23
DE68917826T2 (de) 1995-01-12
FI96209C (fi) 1996-05-27
NZ230111A (en) 1992-04-28
AU624625B2 (en) 1992-06-18
FI893587A0 (fi) 1989-07-27
AU3902489A (en) 1990-02-01
DE68917826D1 (de) 1994-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4604377A (en) Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2
CA1335925C (en) Process for recovering microbially produced interleukin-2
US5783416A (en) Human spasmolytic polypeptide in glycosylated form
JP2961189B2 (ja) ヒトインターロイキン２の活性を有するポリペプチドからなることを特徴とする白血病を治療するための医薬組成物
EP0748817A2 (en) Parathyroid hormone derivatives and their use
EP0211835B1 (en) Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2
EP0176299B1 (en) Mutual separation of proteins
HU207099B (en) Process for purifying reduced non glycosylated, recombinant human il and pharmaceutical composition comprising same
WO1994018233A1 (en) Thymosin alpha-1 derivatives
Lin et al. Interferon-β-1b (Betaseron®): A model for hydrophobic therapeutic proteins
EP0401379B1 (en) STABILIZED COMPOSITION OF INTERLEUKIN-1$g(b)
Geigert et al. Development and shelf-life determination of recombinant interleukin-2 (proleukin)
CA1283356C (en) Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2
Gu et al. Stability and Characterization of Human Interleukin-1 β
CN1316436A (zh) 水溶性缓释重组蛋白质的制备方法
JPH09100296A (ja) 蛋白質の相互分離方法
JPH07165792A (ja) 精製された蛋白質
JPH0764871B2 (ja) 蛋白質の相互分離方法

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: HOECHST MARION ROUSSEL, FR

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee