FI96209B - Menetelmä ei-glykosyloidun rekombinantti-humaani-IL2:n valmistamiseksi sen pelkistyneessä muodossa - Google Patents

Description

-.96209

Menetelmä ei-glykosyloidun rekombinantti-humaani-II^Jn valmistamiseksi sen pelkistyneessä muodossa

Kyseinen keksintö koskee menetelmää biologisesti 5 aktiivisen, ei-glykosyloidun rekombinantti-humaani-inter-leukiini-2:n (merkitään r-hIL2) valmistamiseksi sen pelkistyneessä muodossa.

Luontainen humaani-IL2, joka on aktivoitujen T-so-lujen jakaantumista stimuloiva lymfokiini, käsittää 3 kys-10 teiinijäännöstä, jotka sijaitsevat kyseisen proteiinin aminohapposekvenssissä asemissa 58, 105 ja 125. Kysteiine-jä asemissa 58 ja 105 yhdistää disulfiäisiltä, kun taas kysteiini asemassa 125 omaa vapaan sulfhydryyliryhmän (Robb, R.J. et♦ai., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 81 (1984) 15 6486 - 6490).

On kuvattu menetelmiä humaani-IL2:n, sekä sen al-leelien ja johdannaisten, valmistamiseksi DNA-rekombinaa-tiotekniikan avulla. Esimerkiksi Taniguchi, T. et.ai., Nature 302 (1983) 305 - 310, ja Devos, R. et♦ai., 20 Nucl.Acids Res. 11 (1983) 4307 - 4323, ovat kuvanneet humaani -IL2~geenin kloonausta ja sen ilmaisemista mikro-organismeissa, ja Ju, C. et.ai., J.Biol.Chem. 262 (1987) 5723 - 5731, ovat ilmaisseet IL2:n rekombinanttijohdannaisia. Toisaalta tiedetään, että IL2:n kerääntyessä mikro-25 organismiin ei-liukoisten rakeiden muodossa se on 3 tio-liryhmää käsittävässä pelkistyneessä muodossa ja vailla aktiivisuutta (JP-hakemusjulkaisu J6 1257931). Näin hyväksyttiin oikeaksi, että aktiivisuutta omaavan lL2:n saamiseksi rakeisiin kerääntynyt pelkistynyt proteiini oli ha-30 petettävä. Tämän suorittamiseksi proteiini liuotettiin denaturoivaan väliaineeseen, minkä jälkeen sopiva disul-fiäisiltä 58 - 105, jonka muodostus edellyttää denaturoin-nin purkamista, muodostettiin säädellysti hapettavassa ympäristössä. On kuvattu eri menetelmiä, kuten hapettami-35 nen hapella sellaisenaan (auto-oksidaatio ilmassa) tai 2 96209 hapettaminen kupari2+-ionien läsnä ollessa tai käyttäen heikkoa hapetinta kuten jotain tiolia tai edelleen tioli-disulfidiseosta (Tsuji, T. et.ai., Biochemistry 26 (1987) 3129 - 3134).

5 Hapettavan renaturoinnin jälkeen kromatografinen puhdistus on välttämätön sellaisten hapetustuotteiden poistamiseksi, joissa on muodostunut molekyylinsisäisiä isomeerisiä siltoja 58 - 125 ja 105 - 125 tai sitten molekyylinsisäisiä siltoja, joita vastaavien tuotteiden on 10 osoitettu olevan epäaktiivisia ja jotka voidaan poistaa käänteisfaasikromatografia-ajossa Wangin, A. et.ai., Science 224 (1984) 1431 - 1433, tai Brovmingin, J.L. et. ai., Anal.Biochem♦ 155 (1986) 123 - 128), mukaan.

Hapettuneen, homogeenisen ja sopivaa biologista 15 aktiivisuutta omaavan rekombinantti-IL2:n saaminen rakeik si kerääntyneestä proteiinista lähtien on siten teknisesti ongelmallista käytetystä menettelytavasta riippumatta, koska tarvitaan useita puhdistusvaiheita, mikä johtaa halutun tuotteen saannon alenemiseen.

20 Keksinnön mukaisessa menetelmässä ei tarvita uudel- leenhapetusvaihetta IL2:n biologista aktiivisuutta osoittavan tuotteen saamiseksi.

Keksinnön kohteena on menetelmä ei-glykosyloidun rekombinantti-humaani-interleukiini-2:n valmistamiseksi, 25 jolla on aminohapposekvenssi: X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ly» Ly» Thr 6ln L«u 6ln Leu 6lu Hl» Leu Leo Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Ly s Asn Pro Ly s Leu Thr

Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Ly» Lys Ala Thr Glu Leu Ly» Hi s Leu

Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Ly» Pro Leu 6lu Glu Vai Leu Asn Leu Ala Gin Ser

Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Vai Ile Vai Leu 30 Glu Leu Lys Gly Ser 6lu Thr Thr Phe Het Cys 6lu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

Ile Vai 6lu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr.

mukaan lukien tämän sekvenssin alleelit tai johdannaiset, jossa sekvenssissä X on metioniini tai vetyatomi ja jossa 35 esiintyvät kolme kysteiinijäännöstä asemissa 58, 105 ja 3 96209 125 ovat pelkistyneessä muodossa, ja jonka biologinen aktiivisuus on vähintään 0,5 x 107 U/mg, jossa menetelmässä IL2, joka on kerääntynyt rakeiksi transformoituun mikro-organismiin, eristetään liuottamalla pelkistävässä väliai-5 neessa kaotrooppista ainetta käyttäen, minkä jälkeen se puhdistetaan seostamalla ja sen jälkeen käänteisfaasi-kor-keapainenestekromatografiällä happamalla eluentilla.

Menetelmälle on tunnusomaista, että a) mainitussa kromatografia-ajossa eluoitu pääfrak-10 tio jäähdytetään tarvittaessa lämpötilaan noin -20 °C, minkä jälkeen vesifaasi erotetaan, ja b) vesifaasi laimennetaan happamalla väliaineella, minkä jälkeen suoritetaan kromatografia-ajo toisessa kään-teisfaasi-korkeapainenestekromatografiakolonnissa happa- 15 maila liuoksella eluoiden ja eristetään IL2.

Keksinnön mukaisesti valmistettu tuote osoittaa biologista aktiivisuutta, joka on verrattavissa saman sekvenssin omaavan sekä disulfidisillan asemassa 58 - 105 käsittävän hapettuneen IL2:n biologiseen aktiivisuuteen.

20 Alleeleihin ja johdannaisiin luetaan sekvenssit, joita on modifioitu korvaamalla, poistamalla tai lisäämällä yksi tai useampi muu aminohappojäännös kuin jokin kys-teiineistä 58, 105 tai 125 edellyttäen, että näillä tuotteilla on tallella pelkistyneelle IL2:lle tunnusomainen 25 biologinen aktiivisuus. Tällaisten modifikaatioiden suorittaminen tunnetaan hyvin DNA-rekombinaatiotekniikassa, ja tällöin käytetään esimerkiksi paikkaohjautuvan mutaation menettelyitä, joista yleiskatsauksen ovat esittäneet Lather, R.F. ja Lecoq, J.P. lähteessä Genetic Engineering, 30 Academic Press, 1983, s. 31 - 50, sekä Smith, M. ja

Gillam, S. lähteessä Genetic Engineering Principles and · Methods, Plenum Press, 3, 1981, s. 1 - 32. Pelkistyneellä muodolla tarkoitetaan, että IL2:n käsittämät kysteiini-jäännökset omaavat vapaan sulfhydryyliryhmän, joka määri-35 tetään esimerkiksi spektrofotometrisesti ditiodipyridiiniä - 96209 4 tiolireagenssina käyttäen. Keksinnön mukaisesti saadun pelkistyneen muodon biologinen aktiivisuus verrattuna di-sulfidisillan 58 - 105 käsittävän vastaavan hapettuneen muodon biologiseen aktiivisuuteen määritetään mittaamalla 5 IL2:sta riippuvaisen hiiren leukemiasolulinjan, CTLL-2, solujakaantuminen kolorimetrisesti tetratsoliumsuolaa k-äyttäen (Mossmann, T.J., Immunol.Meth. 65 (1983) 55 - 63).

IL2:n aktiivisuusyksiköksi määritellään määrä, joka antaa kokeessa 50 % maksimivasteesta. Standardina käyte-10 tään laitoksesta National Cancer Institute (NCI) saatua näytettä "Biological Response Modifier Program (BRMP) -mallireagenssi humaani-IL2 (Jurkat)".

Keksinnön mukaisesti valmistettu tuote osoittaa biologista aktiivisuutta, joka on verrattavissa natiivin 15 humaani-IL2:n biologiseen aktiivisuuteen. Verrattavalla aktiivisuudella tarkoitetaan samaa spesifistä aktiivisuutta kuin omaa luontainen, Jurkat-leukemiasoluista eristetty IL2, eli 1,3 x 107 U/mg (malli-BRMP), tai aktiivisuutta, joka poikkeaa korkeintaan 25 % tästä spesifisestä aktii-20 visuudesta. Keksinnön mukaan saadussa pelkistyneessä IL2-sekvenssissä esiintyy valinnaisesti ylimääräinen metionii-ni N-päädyssä riippuen transformoidusta mikro-organismista, esimerkiksi E. coli, jossa sekvenssi ilmaistaan. Keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa suoritusmuodossa 25 metioniinin käsittävä sekvenssi katsotaan edulliseksi, mutta yhtä hyvin voidaan käyttää seosta, jossa metioniinin käsittävää tuotetta on sekoitettu metioniinia vailla olevaan tuotteeseen, tai vailla metioniinia olevaa tuotetta.

Rakeiden muodossa transformoidussa mikro-organis-30 missä kuten E. colissa tehokkaasti ilmaisten tuotettu re-kombinantti-IL2 voidaan tunnettujen menetelmien mukaan saattaa liukoiseen muotoon käyttäen jonkin kaaotrooppisen aineen konsentroitua liuosta kuten 6 - 8 M guanidiinisuo-laliuosta, minkä jälkeen sitä puhdistetaan käänteisfaasi-35 korkeapainenestekromatografia-ajossa (merkitty seuraavassa s 96209 RP-HPLC) käyttäen kaupallisesti saatavana olevia kantaja-materiaaleja, edullisesti haaraketjuisia piidioksidijohdannaisia kuten C3, C4, C8 tai C18 sekä hapanta eluent-tia, jonka pH on 1 - 4. IL2 voidaan eluoida kolonnista 5 käyttäen gradienttijärjestelmää, joka käsittää orgaanista happoa kuten etikkahappoa tai trifluorietikkahappoa (merkitty seuraavassa TFA) ja orgaanista liuotinta kuten ase-tonitriiliä. Pääfraktio, jonka eluoituminen todetaan spektrofotometrisesti 280 nm:n aallonpituudella, muodostaa 10 ensisijaisen materiaalin valinnaiseen jäähdytysvaiheeseen, joka kuuluu kyseisen keksinnön mukaiseen menetelmään. Jäähdyttämisellä tarkoitetaan, että sanottu ympäristön lämpötilassa talteenotettu pääfraktio viedään ympäristöön, jossa lämpötila on noin -20 °C, mikä mahdollistaa kiinteää 15 ainetta sisältävän vesifaasin muodostumisen, jolloin su-pernatantin muodostava osuus voidaan poistaa dekantoimal-la. Valinnaisesti näin erotettua vesifaasia käytetään sen laimentamisen jälkeen pääasiallisena materiaalina RP-HPLC-ajossa happamassa ympäristössä, jota ajoa kuvataan jäljem-20 pänä ja joka kuuluu keksinnön mukaiseen menetelmään. Vesi-faasia laimennetaan happamalla liuoksella, jonka pH on 1 -4, edullisesti 2-3. Laimennetulla vesifaasilla suoritetaan kromatografia-ajo käänteisfaasikolonnissa käyttäen kaupallisesti saatavana olevia tukimateriaaleja kuten haa-25 raketjuisia piidioksidijohdannaisia C3, C4, C8 tai Cl8, jotka huokoskooltaan soveltuvat proteiinien yhteydessä käytettäviksi, jolloin huokoshalkaisija on esimerkiksi vähintään 150 A. IL2:n eluoinnissa käytetään jonkin veteen sekoittuvan alemman alkoholin kasvavaa pitoisuusgradient-30 tia alkoholin sisältäessä orgaanista happoa.

Valinnainen jäähdytysvaihe suoritetaan edullisesti *' asetonitriilin vesiliuoksessa, joka sisältää noin 0,1 % trifluorietikkahappoa, ja laimentaminen suoritetaan käyttäen jonkin orgaanisen hapon, kuten sitruunahapon vesi-35 liuosta, ja IL2 eluoidaan toisessa kromatografia-ajossa 6 96209 käyttäen liuosta, joka käsittää isopropanolia, vettä ja orgaanista happoa kuten sitruunahappoa. Noin 0,1 % TFA:ta sisältävä asetonitriilin vesiliuos, joka edullisesti on keksinnön mukaisessa valinnaisessa jäähdytysvaiheessa käy-5 tetty seos, vastaa ensimmäisessä kromatografia-ajossa eluoitua pääfraktiota. Erittäin edullisesti vesifaasia laimennetaan välittömästi joko mahdollisen erotuksen jälkeen tai ensimmäisen kromatografia-ajon jälkeen. Tämä laimentaminen suoritetaan lisäämällä edullisesti vähintään 2 10 tilavuutta vettä, joka sisältää 0,5 - 2 % orgaanista happoa kuten muurahais-, etikka-, propioni-, trifluorietikka-tai sitruunahappoa, edullisemmin lisäämällä noin 2 tilavuutta vettä, joka sisältää 0,5 % sitruunahappoa. Toisessa kromatografia-ajossa, joka kuuluu keksinnön mukaiseen me-15 netelmään, vesifaasilla, joka on valinnaisesti erotettu jäähdytysvaiheen jälkeen ja jota on sitten laimennettu, suoritetaan RP-HPLC-ajo käyttäen kaupallisesti saatavana olevia kantajamateriaaleja, kuten haaraketjuisia piidioksidi johdannaisia C3, C4, C8 tai C18, joiden huokoshalkai-20 sija on vähintään 150 A. Edullinen kantajamateriaali on haaraketjuinen piidioksidijohdannainen C4 Vydac 300 A, joka on kovalenttisesti sidottuja butyyliryhmiä käsittävä silikageeli, jonka huokoshalkaisija on 300 A ja keskimääräinen partikkelikoko 15 - 20 mikronia. Keksinnön mukai-25 sessa menetelmässä IL2 eluoidaan käyttäen gradienttijärjestelmää, joka käsittää alkoholin, kuten propanolin tai isopropanolin, sekä orgaanisen hapon, kuten muurahais-, etikka-, propioni-, trifluorietikka- tai sitruunahapon. Edullinen seos käsittää isopropanolia, vettä ja sitruunahappoa 30 edullisesti pitoisuutena 0,5 - 2 %, erittäin edullisesti pitoisuutena 0,5 %, ja sitä käyttämällä saadaan käyttäen gradienttijärjestelmää, jossa isopropanolin pitoisuus kasvaa, eluoiduksi vähäinen fraktio kohdassa noin 48 % isopropanolia ja sitten suurempi fraktio kohdassa noin 59 % 35 isopropanolia, jolloin viimeksi mainittu sisältää aktii- 7 96209 vista, ei-glykosyloitua rekombinantti-humaani-IL2: ta sen pelkistyneessä muodossa.

Kyseistä saatua fraktiota voidaan säilyttää noin -20-0 °C:ssa, joissa olosuhteissa se on stabiili. Voidaan 5 niinikään poistaa isopropanoli tyhjössä atseotrooppisesti tislaamalla. Saatua liuosta voidaan säilyttää +4 °C:ssa tai sitten kyseisen keksinnön mukainen IL2 eristetään saman tien kylmäkuivaamalla.

Keksintö koskee samoin menetelmämuunnosta, jonka 10 mukaan pääfraktiota ei jäähdytetä eikä vesifaasia eroteta.

Keksinnön mukaisen menetelmän muunnoksella saatua laimennettua pääfraktiota voidaan tarvittaessa säilyttää +4 °C:ssa. Se on stabiili ja muodostaa pääasiallisen materiaalin toiseen kromatografia-ajoon, joka kuuluu keksinnön 15 mukaiseen menetelmään.

Määritettäessä tioliryhmät todetaan keksinnön mukaisesti saadun IL2:n sisältävän 3 vapaata sulfhydryyliryh-mää, ja sen spesifiseksi aktiivisuudeksi saadaan 0,7 -1,3 x 107 U/mg CTLL-2-solulinjan solujakaantumiskokeessa, 20 eli natiiviin IL2:een verrattava spesifinen aktiivisuus.

Tämä aktiivisuus oikeuttaa tässä kuvatun mukaisen pelkistyneessä muodossa olevan, ei-glykosyloidun rekombinantti-humaani-IL2:n käyttämisen lääkkeenä samaan tapaan kuin na-tiivia IL2:ta käytetään lukuisten hoitoindikaatioiden yh-25 teydessä hyödyntäen sen immuunisäätelijäaktiivisuutta sekä sen kasvainvastaista aktiivisuutta, joita ovat kuvanneet esimerkiksi Fletcher, M. et.ai., Lymphokine Research 6 (1987) 47 - 57, ja joihin kuuluvat esimerkiksi T-imusolu-jen jakaantuminen, luontaisten tappaja- (NK-, Natural Kil-30 ler -) solujen ja lymfokiinilla aktivoitujen tappaja- (LAK, Lymphokine Activated Killer -) solujen solumyrkyl-lisyyden indusointi, soluimmuniteetin palauttaminen, tar-tuntavastainen suojavaikutus immuunipuutoksien yhteydessä sekä apuainevaikutus rokotteiden yhteydessä. Lääkettä voi-35 daan antaa sellaisenaan tai yhtä hyvin anto voi liittyä sovellettuun immuuniterapeuttiseen menetelmään, jota ovat 8 96209 kuvanneet Rosenberg, S.A. et.ai. lähteessä New Engl.J. Med. 313 (1985) 1485-1492.

Kuten natiivia IL2:ta, keksinnön mukaan saatua lL2:ta voidaan käyttää yksinään tai yhdessä muiden immuu-5 nisäätelijöiden, kuten alfa- tai gamma-interferonin tai muiden terapeuttisten aineiden kanssa.

Pelkistyneessä muodossa olevaa, ei-glykosyloitua rekombinantti-humaani-IL2: ta voidaan käyttää sitä vaikuttavana aineena sisältävien farmaseuttisten koostumuksien 10 valmistamiseksi.

Koostumus voi olla kiinteä tai nestemäinen. Kyseisen keksinnön mukaisesti valmistettu 1L2 voidaan koostaa tunnettujen menetelmien mukaan farmaseuttisesti hyödyllisen koostumuksen valmistamiseksi, jossa 1L2 on yhdistetty 15 farmaseuttisesti hyväksyttävään kantoaineeseen. Tämä koostumus sisältää tehokkaan määrän IL2:ta sekä sopivan määrän kantajaa ihmiselle antamista silmälläpitäen. Koostumus voidaan saada lähtien keksinnön mukaisen IL2:n happamasta vesiliuoksesta, josta isopropanoli on poistettu tyhjössä 20 atseotrooppisesti tislaamalla, jolloin kyseiseen liuokseen lisätään vesiliukoista täyteainetta ja joka sitten kylmä-kuivataan. Täyteaineella tarkoitetaan vesiliukoista ainetta, joka ei seosta rekonstituottaessa muuta sen alkuperäistä pH:ta. Lisättävinä kyseeseen tulevia täyteaineita 25 ovat esimerkiksi sokerit kuten glukoosi, riboosi, sakkaroosi, maltoosi, trehaloosi tai pelkistyneet sokerit kuten mannitoli. Edullinen on mannitoli, jota lisätään pitoisuus 10 - 50 mg/ml, edullisesti noin 50 mg/ml, jolloin kyseisen keksinnön mukaisen IL2:n pitoisuus on 0,05 - 1 mg/ml an-30 nettavasta annoksesta riippuen. Liuos suodatetaan sterii-listi hapettomassa ympäristössä, minkä jälkeen se jaetaan pieniin annospulloihin ja kylmäkuivataan nämä. Kylmäkuivattu seos voidaan rekonstituoida viemällä ruiskun avulla pulloon ruansulatuskanavan ulkopuoliseen ruiskeeseen sopi-35 vaa tislattua vettä.

9 96209

Koostumusta voidaan antaa kerta-annoksena laskimon-sisäisenä ruiskeena tai jatkuvan nestesiirron välityksellä, lihaksensisäisesti, vatsaontelon sisäisesti, keuhkon-sisäisesti tai ihon alle. Keksinnön mukaisesti valmistettu 5 IL2:n tehokas annos, joka on riippuvainen antotiestä sekä hoidettavasta potilaasta, on yleensä 1 x 106 U/M2/24 tuntia - 40 x 106 U/M2/24 tuntia, edullisesti noin 20 x 106 U/M2/24 tuntia täysikasvuiselle tai lapselle. Päiväannos riippuu myös lääkkeellä annetun hoidon kestosta, eikä ole tarpeen 10 rajoittua edellä mainittuihin annoksiin.

Lääkkeen antamiseksi nestesiirron välityksellä farmaseuttinen koostumus sisältää erityisesti pelkistyneessä muodossa olevaa, ei-glykosyloitua rekombinantti-humaani-IL2:ta, vettä ja orgaanista happoa kuten sitruunahappoa. 15 Tällainen koostumus voidaan saada lähtien keksinnön mukaisesta kylmäkuivatusta farmaseuttisesta koostumuksesta, joka liuotetaan sopivan kantoaineen läsnäollessa, joka myötävaikuttaa vaikuttavan aineen stabiilisuuteen neste-siirron aikana ja joka on esimerkiksi glukoosi. Edullises-20 ti kylmäkuivattu seos, joka on rekonstituoitu ruiskuttamalla siihen tislattua vettä, laimennetaan lisäämällä se nestesiirtopussiin, joka sisältää tietyn tilavuuden glu-koosiliuosta pitoisuutena 50 mg/ml, joka on katsottu annettavaan annokseen nähden sopivaksi.

25 Kaikki julkaisut, jotka on mainittu, sisällytetään viitteinä kyseisen patenttihakemuksen hakemustekstiin.

Oheiset kuviot havainnollistavat keksinnön tiettyjä näkökohtia:

Kuvio la on esimerkkiin 1 liittyvä kromatogrammi 30 raakauutteen analyyttisestä RP-HPLC-ajosta 8 M guanidiini-liuoksessa.

Kuvio Ib on kromatogrammi pelkistyneen ja hapettuneen standardi-IL2:n vastaavista analyyttisistä RP-HPLC-ajoista.

35 Kuvio 2 on kromatogrammi esimerkkin 1 "uudelleen- liuotteen" analyyttisestä RP-HPLC-ajosta.

10 96209

Kuvio 3 on kromatogranuni esimerkin 1 jäähdytysvai-heen jälkeisen "pääfraktion" RP-HPLC-ajosta.

Kuvio 4 on kromatogranuni esimerkin 1 fraktion "59" analyyttisestä RP-HPLC-ajosta.

5 Kuvio 5 esittää esimerkkiin 1 liittyvää puhdistus- menettely järjestystä.

Kuviossa 6 esitetään esimerkkiin 2 liittyvä SDS-PAGE-elektroforeesigeeli.

Kuviot 7a ja 7b ovat esimerkkiin 2 liittyvät pep-10 tidikartat.

Kuviot 8a ja 8b ovat esimerkkiin 2 liittyvät sirku-laaridikroismi- (DC-) käyrät.

Kuvio 9 esittää esimerkkiin 3 liittyvää kuvaajaa mitogeenisesta vaikutuksesta ihmisen imusoluihin.

15 Kuvion 10 kuvaaja esittää solulinjojen K 562 ja DAUDl suhteen todettua myrkyllisyyttä.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä sitä rajoittamatta.

Esimerkki 1 20 Biologisesti aktiivisen, pelkistyneessä muodossa olevan r-hlL2:n puhdistus rakeista lähtien

Rakeet saadaan sentrifugoimalla E. coli -kannan viljelmiä, joka kanta on transformoitu natiivia IL2:ta koo-daavan sekvenssin sisältävällä plasmidilla ja joka kykenee 25 keräämään IL2:ta tässä muodossa soluihinsa, kuten kuvanneet esimerkiksi Sato, T. et.ai., J.Biochem. 101 (1987) 525 - 534. 10 litran fermentorista täten saadut solut rikotaan Manton Gaulin -homogenisaattorissa. Eristetystä ja pestystä solujätteestä (90 - 170 g kosteapaino) IL2 liuote-30 taan 2,5 tilavuuteen Tris-puskuria, pH 8, joka käsittää pitoisuudet 20 mM HC1, 8 M guanidiinihydrokloridia ’* (Gu,HCl) ja 100 mM ditiotreitolia (DTT). Liuenneen IL2:n määrä (1,5 - 2,5 g) määritetään analyyttisen RP-HPLC-ajon avulla C4 Vydac -kolonnissa (0,46 x 15 cm), 300 A, 5 mik-35 ronia, jolloin virtausnopeus on 2 ml/min, jolloin käytetään lineaarista asetonitriiligradienttia (30 -» 70 % 10 si : s».μ nm m I m - 11 96209 minuutin aikana). Jossa 0,1 % TFA:ta, ja jolloin toteaminen suoritetaan spektrofotometrlsestl 280 tai 210 nm:n aallonpituudella määrittäen 280 nm:n aallonpituudella saadun pilkin pinta-ala IL2-standardilla kalibroinnin jälkeen 5 (kuviot la ja Ib). Sitten 1L2 saostetaan laskemalla Gu, HCl:n pitoisuus 2 molaarisen DTT:n läsnä ollessa. Sakkaa pestään TFA:n 0,l-%:isella vesiliuoksella, kunnes super-natantin pH on alle 5,0, minkä jälkeen IL2 liuotetaan 0,1 %:n TFA:ta sisältävään 20-%:iseen asetonitriilin vesi-10 liuokseen. Saadun "uudelleenliuotteen", jossa analyyttisen RP-HPLC:n (kuvio 2) mukaan pelkistyneessä muodossa olevan IL2:n pitoisuus on yli 85 %, biologinen aktiivisuus on alle 0,01 x 107 U/mg pelkistyneessä muodossa olevaa IL2:ta ja sulfhydryyliryhmien pitoisuus siinä on 2,85 SH/moolia pel-15 kistyneessä muodossa olevaa IL2:ta. Osa saadusta liuoksesta, joka vastaa analyyttisen RP-HPLC:n mukaan noin 200 mg IL2:ta, laimennetaan asetonitriilin pitoisuuden 0,l-%:ises-sa TFA:ssa laskemiseksi alle 10 %:n, minkä jälkeen liuos panostetaan C4 Vydac -kolonniin (5,7 x 30 cm). Virtausno-20 peutta 100 ml/min sekä lineaarista asetonitriiligradient-tia (30 -♦ 80 % 40 minuutin aikana), jossa 0,1 % TFA:ta, käyttäen IL2 eluoituu pitoisuudessa noin 60 % asetonitrii-liä suurena piikkinä, joka todetaan spektrofotometrisesti 280 nm:n aallonpituudella ja jota analysoidaan RP-HPLC-25 ajossa. IL2:n pelkistyneessä muodossa sisältävä "pääfrak-tio" jäähdytetään sitten hitaasti ei liian alhaisessa jäähdytyslämpötilassa -20 ± 1 °C, jolloin runsaasti aseto-nitriiliä sisältävä suuri orgaaninen faasi voidaan poistaa dekantoimalla. Pienempää vesipitoista faasia, joka sisäl-30 tää IL2:n, voidaan säilyttää jäädytettynä. Sulatuksen jälkeen saatua liuosta laimennetaan 2 tilavuudella sitruunahapon 0,5-%:ista vesiliuosta, minkä jälkeen se panostetaan C4 Vydac -kolonniin (5,7 x 30 cm), jota eluoidaan käyttäen lineaarista isopropanoligradienttia (20 -» 70 % 40 35 minuutin aikana), jossa 0,5 % sitruunahappoa, ja virtausnopeutta 50 ml/min. Seurattaessa eluaatin koostumusta 12 96209 spektrofotometrisesti 280 nm:n aallonpituudella todetaan, että toisiaan seuraten eluoituvat pieni piikki pitoisuudessa noin 48 % isopropanolia (fraktio "48") ja suurempi piikki pitoisuudessa noin 59 % isopropanolia (fraktio 5 "59") (kuvio 3). Otetaan talteen fraktio "59". Se on 0 °C:ssa säilytettynä ja ilmalta suojattuna stabiili ainakin 24 tunnin ajan.

Isopropanoli poistetaan atseotrooppisesti tislaamalla tyhjössä, minkä jälkeen fraktiota "59" analysoidaan 10 analyyttisen RP-HPLC-ajon avulla ja todetaan homogeeninen piikki (kuvio 4), joka eluoituu pitoisuudessa noin 60 % asetonitriiliä, kun puolestaan hapettunut malli-IL2 eluoituu pitoisuudessa noin 57 % asetonitriiliä (kuvio Ib). Isopropanolin poistamisen jälkeen fraktion "59" IL2-pitoi-15 suus on yli 1 mg/ml ja pH 3 ± 0,5, ja sitä voidaan säilyttää 4 °C:ssa ilmalta suojattuna ainakin viikon ajan tai se voidaan saman tien kylmäkuivata tai käyttää farmaseuttiseen koostumukseen. Määritetään kylmäkuivatun fraktion "59" biologinen aktiivisuus käyttäen CTLL-2-solujen ja-20 kaantumisen määritystä in vitro, ja spesifiseksi aktiivisuudeksi saadaan 1,3 ± 0,5 x 107 U/mg, joka on verrattavissa natiivin IL2:n spesifiseen aktiivisuuteen.

Vapaiden sulfhydryyliryhmien pitoisuus kylmäkuivatussa fraktiossa "59" määritetään kolorimetrisesti ditio-25 dipyridiiniä käyttäen ja saadaan 2,94 SH/moolia verrattuna arvoon 0,76 SH/moolia hapettuneelle malli-IL2:lie.

Kymmenen litran fermentorikasvatuksesta lähtien saadaan (kuviossa 5 esitetyn menettelyjärjestyksen mukaan) fraktiossa "59" analyyttisen RP-HPLC:n mukaan 150 - 300 mg 30 pelkistyneessä muodossa olevaa r-hIL2:ta, joka käsittää 3 SH-ryhmää, joka on biologisesti aktiivista ja RP-HPLC:n mukaan homogeenista.

Esimerkki 2

Biologisesti aktiviisen, pelkistyneessä muodossa 35 olevan r-hIL2:n puhdistus

Menetellään kuten esimerkissä 1 lukuun ottamatta, paitsi että "pääfraktiota" ei jäähdytetä eikä sen jälkeen 13 96209 eroteta dekantolmalla, vaan laimennetaan välittömästi lisäämällä 2 tilavuutta sitruunahapon 0,5-%:ista vesiliuosta. Fraktio "59" otetaan talteen ja sitä jatkokäsitellään kuten esimerkissä 1.

5 Esimerkki 3

Biologisesti aktiivisen, pelkistyneessä muodossa olevan r-hIL2:n fysikokemiallinen karakterisointi Tutkitaan esimerkissä 1 fraktiona "59" saadun, pelkistyneessä muodossa olevan r-hIL2:n seuraavia omina!suuk-10 siä: 1) Homogeenisuus SDS-PAGE-elektroforeesiajo suoritetaan 10 % SDS:ää sisältävässä kaksifaasigeelissä (konsentroitumis- ja mig-raatiogeeli, joissa akryyliamidipitoisuudet ovat vastaa-15 vast! 5 % ja 15 %). Näytettä kuumennetaan edeltä päin 2 minuutin ajan 100 °C:ssa 5 % merkaptoetanolia ja 3 % SDS:ää sisältävässä puskuriliuoksessa. Eluoinnissa käytetään 1 %:n SDS:ää sisältävää puskuria, ja eluoitumista seurataan hopeavärjäyksellä, jolloin todetaan yksi, yli 99 %:n puh-20 tausasteen omaava nauha 2 pg:n näytteelle (kuvio 6).

2) Molekyylipaino elektroforeettisesti määritettynä Pelkistävässä ympäristössä näennäiseksi molekyyli- painoksi määritetään noin 15 kD:tä, joka vastaa laskettua molekyylipainoa 15420 (kuvio 6).

, 25 3) Aminohappokoostumus Näyte, joka sisältää 25 pg keksinnön mukaista, pelkistyneessä muodossa olevaa r-hIL2:ta 0,5 ml:ssa vettä, sijoitetaan lasiseen hydrolyysiputkeen, johon lisätään 0,5 ml konsentroitua kloorivetyhappoa, jossa on 31,7 % 30 TFA:ta ja 4,8 % tioglykolihappoa. Putki suljetaan tyhjös sä, minkä jälkeen näyte hydrolysoidaan 155 °C:ssa 40 minuutin aikana. Sitten hydrolysaatti haihdutetaan kuiviin alipaineessa. Jäännös liuotetaan 0,7 ml:aan sitraattipus-kuria, pH 3, minkä jälkeen aminohapot analysoidaan Inter-35 action AA 511 -kolonnissa (0,46 x 15 cm), jolloin käytetään pH-gradienttia (3 -♦ 5) ja natriumkloridigradienttia 14 96209 (O -♦ 70 g/litra) sitruunahappopuskurissa, lämpötilaa 60 °C ja virtausnopeutta 0,5 ml/min, ja jolloin kolonnista poistuvat osuudet muutetaan ortoftalaldehydijohdannaisiksi ja todetaan sitten fluoroinnin nojalla. Tulokset on esitetty 5 taulukossa 1. Arvot ovat kahden hydrolyysitoistokerran ja vastaavasti kahden kromatografia-ajotoistokerran keskiarvoja. Koostumus vastaa ylimääräisen N-päätymetioniinin omaavan natiivin lL2:n koostumusta.

Taulukko 1 10 Interleukiini 2 I Aminohappo I Teoreettinen | Todettu | _____ __ lukumäärä lukumäärä | 6LN + GLU I 18 | 17,,56 | 15 | ASN + ASP | 12 | 12,61 | I THR | 13 | 12,09 | I SER | 8 | 7,05 | I PRO | 5 | ND* | I GLY | 2 | 2,59 | 2o | ALA | 5 | 5,50 | I VAL | 4 ' | 4,34 | I MET | 5 | 5,59 | .

I ILE | 9 | 9,15 | I LEU | 22 | 19,96 | 25 I TYR | 3 | 2,60 | ' | PHE | 6 | 5,90 |

I TRP | 1 I NC** I

I LYS I 11 I 10,19 I

I HIS I 3 I 3,48 I

30 I ARG | 4 | 5,29 | I CYS | 3 | NC** |

·. I I_I__I

* ND - ei todettu ** NC = ei laskettu - 96209 15 4) N-päädyn aminohapposekvenssi N-päädyn aminohapposekvenssi määritetään mikrosek-venssoimalla käyttäen automaattista Edman-pilkkomista; analysoimalla 15 yg keksinnön mukaista biologisesti aktii-5 vista, pelkistyneessä muodossa olevaa r-hIL2:ta valmistajan Applied Biosystems 470A -kaasufaasimikrosekvenssoijässä, johon on kytketty HPLC 120A -laite, saadaan tunnistetuksi seuraavat PTH-aminohapot (PTH-AA):

10 Kierros PTH AA Kierros PTH AA

1 Met 11 Thr

Ala 15 2 Ala 12 Gin

Pro 3 Pro 13 Leu

Thr " 20 4 Thr 14 Gin

Ser 5 Ser 15 Leu 25 6 Ser 16 Glu 7 Ser 17 His 30 8 Thr 18 Leu • 9 Ly s 19 Leu 10 Lys 20 Leu 16 96209 N-päädyn 20 aminohappojäännöksen sekvenssi vastaa natiivin IL2:n teoreettista ketjujärjestystä. Noin 10 % IL2:sta todetaan metioniinia vailla olevaksi.

5) Peptidikartta syaanibromidilla määritettynä 5 700 pg (noin 53 nmol) keksinnön mukaista pelkisty neessä muodossa olevaa IL2:ta liuotetaan 4 ml:aan 70-%:ista muurahaishappoa ja liuokseen lisätään 5,6 mg syaanibromidia. Liuosta sekoitetaan yön yli ympäristön lämpötilassa, minkä jälkeen sitä laimennetaan vedellä ja 10 kylmäkuivataan. Reaktioseosta analysoidaan RP-HPLC-ajossa uBondapack C18 RP -kolonnissa (0,46 x 20 cm), jolloin eluoinnissa käytetään asetonitriilipitoisuusgradienttia 0 -* 70 %, jossa 0,1 % TFA:ta ja virtausnopeutta 1 ml/min ympäristön lämpötilassa, ja jolloin toteaminen suoritetaan 15 spektrofotometrisesti 220 nm:n aallonpituudella. Pelkistyneessä muodossa olevan r-hIL2:n peptidikartasta (kuvio 7a) todetaan erilainen pilkkoutuminen kuin hapettuneen malli-IL2:n kartassa (kuvio 7b).

6) Sirkulaaridikroismi 20 Sirkulaaridikroismi- (DC-) spektrit määritetään ympäristön lämpötilassa käyttäen spektrografia Jobin Yvon Mark V. Pelkistyneessä muodossa oleva r-hlL2-näyte, joka näyte on kylmäkuivattu RP-HPLC-ajon jälkeen, jossa ajossa on käytetty lineaarista isopropanoligradienttia, jossa 25 0,5 % sitruunahappoa on esimerkin 1 mukaisesti korvattu 0,1 %:lla muurahaishappoa, ja josta näytteestä isopropano-li on sitten poistettu tislaamalla ja joka sen jälkeen on kylmäkuivattu, liuotetaan uudelleen pitoisuudeksi 1 mg/ml etikkahappoon. Käytetään 0,01 cm:n ja vastaavasti 0,5 cm:n 30 kyvettejä peptidialueelle (185 - 250 nm) ja toisaalta aromaattiselle alueelle (260 - 320 nm). Liuottimen spektri vähennetään IL2:n spektristä kullekin näytteelle. Tulokset on esitetty elliptisyytenä 0 (keskipaino IL2-jäännöstä kohden * 116).

35 Kuviossa 8a on esitetty DC-spektri kauko-UV-alueel la: keksinnön mukaisen, biologisesti aktiivisen ja pelkis- 17 96209 tyneessä muodossa olevan r-hIL2:n spektristä Ilmenee järjestäytyneen sekundäärlrakenteen läsnäolo. Alfa-heelik-sien %-osuuden määritys el osoita oleellista eroa hapettuneeseen malli-IL2:een nähden (alfa-heeliksien %-osuus 5 50 %).

Kuviossa 8b on esitetty DC-spektri lähi-UV-alueel-la: hapettunut IL2 omaa merkittävää sirkulaaridikroismia (DC:tä), mikä osoittaa aromaattisten jäännösten sijaitsevan asymmetrisesti, kun taas keksinnön mukaisen pelkisty-10 neessä muodossa olevan r-hIL2:n sirkulaaridikroismi (DC) on vähäinen, mutta edeltävästä poikkeava.

Esimerkki 4

Biologinen aktiivisuus

Keksinnön mukaisen pelkistyneessä muodossa olevan 15 r-hIL2:n biologinen teho määritetään in vitro - tai ex vivo -kokeilla.

1) Aktiivisuus in vitro ihmissolujen suhteen a. Varhaisimusolujen transformaatiokoe

Sen ohella, että keksinnön mukainen pelkistyneessä 20 muodossa oleva r-hIL2 osoittaa jakaantumista edistävää aktiivisuutta hiirisolulinjojen kuten CTLL-2-solujen suhteen, mikä mahdollistaa IL2:n biologisen määrittämisen, sillä on annoksesta riippuvainen, hapettuneen malli-IL2:n vaikutukseen verrattavissa oleva mitogeeninen vaikutus 25 normaaleihin, veressä kiertäviin ihmisen imusoluihin, joka vaikutus osoitetaan mittaamalla tritioidun tymidiinin siirtyminen DNA:hän (kuvio 9).

b. Yksitumaisten solujen solumyrkyllisyyden indu- sointi 30 Koe suoritetaan inkuboimalla ihmisen kiertäviä yk- situmasoluja IL2:n läsnäollessa, minkä jälkeen määritetään mainittujen solumyrkkyvaikutus kasvainkohdesoluihin, joina toimivat erytroleukemiasolulinja K 562 (altis NK-soluille) ja imusolukasvaimesta B saatu solulinja DAUDI (vastustaa 35 NK-soluja), mittaamalla Cr-vapautuminen 51 ja vastaavasti 4 tunnissa. Lyysiyksiköinä 106 solua (UL/106) ilmaistut tulokset osoittavat, että keksinnön mukainen pelkistynees- 18 96209 sä muodossa oleva r-hIL2 osoittaa annoksesta riippuvaista kykyä vastaavasti lisätä NK-aktiivisuutta tai indusoida T-imusolumyrkyllisyyttä kohdekasvainsoluja vastaan natii-ville lLz:lle tunnettuun verrattavalla tavalla (kuvio 10).

5 2) Aktiivisuus ex vivo hiiren suhteen (vatsaontelo- makrofagien stimulointi)

Normaaleissa Balb/c- ja MRL-+/+-hiirissä rotan re-kombinantti-gamma-interferonin toistuva ruiskuttaminen optimiarvon alittavina annoksina (100 - 3 000 U) vatsaon-10 teloon sekä sitten 24 tuntia kuluttua keksinnön mukaisen pelkistyneessä muodossa olevan r-hIL2:n ruiskuttaminen k-äynnistää syöjäsolujen hapettavat mekanismit, jotka määritetään mittaamalla kemiluminointi forboliesterin (PMA:n) läsnä ollessa, jolloin hiiret uhrataan 24 tunnin kuluttua 15 IL2:n ruiskuttamisesta ja solut otetaan niiden vatsaontelosta. Annoksesta riippuvainen vaikutus on verrattavissa hapettuneella malli-IL2:11a todettuun.

Tulokset: 2® I Ruiskutettu an- ! Kemiluminointi (CPM x 10^) | | nos (ng/hiiri) ! ruiskutettu r-hIL2: | I ! pelkistynyt hapettunut |

I_!_I

I I

25 I 0 ! 5 + 2 4 + 3 | I 1 ! 7 + 3 5 + 1 | I 3 ! 90+5 71+5 | I 10 ! 130+10 140+70 | I 30 ! 350 + 50 400 + 70 | 30 | 100 l 710 + 20 695 + 25 | I 300 ! 375 + 25 350 + 20 |

Esimerkki 5 35 Ruiskeena annettava farmaseuttinen koostumus

Pelkistyneessä muodossa olevan r-hIL2:n vesiliuosta, joka vastaa keksinnön mukaista fraktiota "59", josta 19 96209 isopropanoli on poistettu atseotrooppitislauksella tyhjössä, laimennetaan uutena menettelynä mannitolin vesiliuoksella, josta kaasut on poistettu ja joka on sitten kyllästetty typellä, pitoisuuteen 100 pg pelkistynyttä IL2:ta/ml 5 ja 50 mg/ml mannitolia. Liuos suodatetaan 0,22 mikronin kalvon läpi ja jaetaan sitten steriilisti 1 ml:n annoksiksi pieniin pulloihin, minkä jälkeen pullojen sisältö kylmäkuivataan, pullot täytetään typellä ennen sulkemista sekä säilytetään sitten käyttöön asti 4 °C:n lämpötilassa. 10 Esimerkki 6

Jatkuvan nestesiirron välityksellä annettava farmaseuttinen koostumus

Pelkistyneessä muodossa olevan r-hIL2:n vesiliuosta, joka vastaa keksinnön mukaista fraktiota "59", josta 15 isopropanoli on poistettu atseotrooppitislauksella tyhjössä, laimennetaan uutena menettelynä mannitolin vesiliuoksella, josta kaasut on poistettu ja joka on sitten kyllästetty typellä, pitoisuuteen 500 pg pelkistynyttä IL2:ta/ml ja 50 mg/ml mannitolia. Liuos suodatetaan 0,22 mikronin 20 kalvon läpi ja jaetaan sitten steriilisti 1 ml:n annoksiksi pieniin pulloihin, minkä jälkeen pullojen sisältö kylmäkuivataan, pullot täytetään typellä ennen sulkemista sekä säilytetään sitten 4 °C:n lämpötilassa käyttöön asti. Tällöin kunkin pullon sisältö liuotetaan ruiskuttamalla 25 pulloon 1 ml steriiliiä tislattua vettä. Seitsemän (7) annospullon sisältöä vastaava liuosmäärä (noin 35,16® yksikköä) siirretään ViaflexR-tiputuspulloon, jossa on 500 ml 5 % glukoosia sisältävää infuusioliuosta Travenol". 1

Claims (3)

96209

1. Menetelmä ei-glykosyloidun rekombinantti-humaa-ni-interleukiini-2:n valmistamiseksi, jolla on aminohappo- 5 sekvenssi: X-Al· Pro Tbr Ser Ser Ser Thr Ly» Ly1 Thr Gin Leu Gin Leu Glu H1» Leu Leu Leu Asp Leu Gin Het Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Ly1 Phe Tyr Met Pro Ly1 Ly1 Ala Thr Glu Leu Ly1 Hl1 Leu Gin Cys Leu 6lu Glu 6lu Leu Lys Pro Leu Glu 6lu Vai Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe Hi1 Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Vai Ile Vai Leu Glu Leu Lys Gly Ser 6lu Thr Thr Phe Het Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Vai 6lu Phe Leu A1n Arg Trp Ile Thr Phe Cy1 Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr. mukaan lukien tämän sekvenssin alleelit tai johdannaiset, jossa sekvenssissä X on metioniini tai vetyatomi ja jossa 15 esiintyvät kolme kysteiinijäännöstä asemissa 58, 105 ja 125 ovat pelkistyneessä muodossa, ja jonka biologinen aktiivisuus on vähintään 0,5 x 107 U/mg, jossa menetelmässä IL2, joka on kerääntynyt rakeiksi transformoituun mikro-organismiin, eristetään liuottamalla pelkistävässä väliai-20 neessa kaotrooppista ainetta käyttäen, minkä jälkeen se puhdistetaan seostamalla ja sen jälkeen käänteisfaasi-kor-keapainenestekromatografiällä happamalla eluentilla, tunnettu siitä, että: a) mainitussa kromatografia-ajossa eluoitu pääfrak-25 tio jäähdytetään tarvittaessa lämpötilaan noin -20 °C, minkä jälkeen vesifaasi erotetaan, ja b) vesifaasi laimennetaan happamalla väliaineella, minkä jälkeen suoritetaan kromatografia-ajo toisessa kään-teisfaasi-korkeapainenestekromatografiakolonnissa happa- 30 maila liuoksella eluoiden ja eristetään 1L2.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jäähdytysvaihe suoritetaan asetonitriilin vesiliuoksessa, joka sisältää noin 0,1 % trifluorietikkahappoa, laimentaminen suoritetaan käyttäen 35 orgaanisen hapon, kuten sitruunahapon vesiliuosta ja IL2 96209 eluoidaan toisessa kromatografia-ajossa käyttäen liuosta, joka sisältää isopropanolia, vettä ja orgaanista happoa, kuten sitruunahappoa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että pääfraktiota ei jäähdytetä eikä vesifaasia eroteta. 96209