DE68917826T2

DE68917826T2 - Rekombinantes, unglycosiliertes Human-IL2 in reduzierter Form, Herstellungsprozess und medizinische Anwendung.

Info

Publication number: DE68917826T2
Application number: DE68917826T
Authority: DE
Inventors: Pierre Yves Abecassis; Danielle Lando; Philippe Riberon
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1988-07-28
Filing date: 1989-07-26
Publication date: 1995-01-12
Anticipated expiration: 2009-07-27
Also published as: ES2058573T3; HU207099B; EP0353150B1; AU3902489A; FI893587A; DK370489A; RU2105011C1; ZA895419B; US5874076A; JPH02209896A; CN1036532C; FI96209B; IE892443L; CN1042377A; DE68917826D1; IL90975A0; IE64232B1; MX16912A; HUT51647A; FI96209C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes unglykosyliertes Human-Interleukin-2 (bezeichnet als r-hIL-2), in reduzierter Form und biologisch aktiv, sein Herstellungsverfahren und seine Anwendung als Arzneimittel.
Das natürliche Human-IL-2, ein Lymphokin, das die Proliferation der aktivierten T-Zellen stimuliert, besitzt 3 Cysteine, die in Position 58, 105 und 125 der Aminosäurensequenz des Proteins lokalisiert sind, Die Cysteine in 58 und 105 sind durch eine Disulfidbrücke verbunden, während das Cystein in 125 eine freie Sulfhydrylgruppe trägt (Robb, R.J. et al., Proc..Natl.Acad.Sci.USA (1984) 81 6486-6490).
Verfahren zur Herstellung von Human-IL-2, Allelen oder Derivaten mit der Technologie der rekombinanten DNA sind beschrieben. Zum Beispiel haben Taniguchi, T, et al., Nature (1983) 302 305-310 und Devos, R. et al., Nucleic Acids Research (1983) 11 4307-4323 die Clonierung des Gens für Human-IL-2 und seine Expression in Mikroorganismen beschrieben, und Ju, C. et al., J.Biol.Chem. (1987) 262 5723-5731 ist es gelungen, rekombinante Derivate von IL-2 zu exprimieren. Es ist andererseits bekannt, daß sich das IL-2, wenn es in einem Mikroorganismus im Zustand unlöslicher Granula angereichert wird, in der reduzierten Form befindet, die 3 Thiolgruppen enthält und keine Aktivität aufweist (Antrag für ein japanisches Patent J6 1257931). Es wurde also zugestanden, daß man eine Oxidation des in den Granula angereicherten reduzierten Proteins vornehmen mußte, um über ein aktives IL-2 zu verfügen. Um dies zu tun, erfolgte nach der Auflösung des Proteins in denaturierendem Medium die Bildung der passenden Disulfidbrücke zwischen 58 und 105, die eine Renaturierung erforderte, in kontrolliertem oxidierendem Medium. Verschiedene Methoden sind beschrieben wie die Oxidation mit Sauerstoff alleine (Autoxidation an der Luft) oder/und in Gegenwart von Kupferionen oder eines schwachen Oxidationsmittels wie eines Thiols oder auch mittels eines Thiol- Disulfid-Gemischs (Tsuji, T. et al., Biochemistry (1987) 26 3129-3134).
Nach der oxidativen Renaturierung ist eine Reinigung durch Chromatographie nötig, um die Oxidationsprodukte zu entfernen, die der Bildung isomerer intramolekularer Brücken 58-125 und 105-125 sowie intermolekularer Brücken entsprechen, die, wie man gezeigt hat, inaktiv sind und durch Chromatographie auf Umkehrphase nach Wang, A. et al., Science (1984) 224 1431-1433 oder Browing, I.L. et al., Anal. Biochem. (1986) 155 123-128 abgetrennt werden können.
Die Herstellung von rekombinantem oxidiertem homogenem IL-2 mit einer angemessenen biologischen Aktivität, ausgehend von dem in Form von Granula angereicherten Protein, wirft also technische Probleme auf, welches Verfahren auch immer man anwendet, da sie mehrere Reinigungsschritte erfordert, was zu einer Erniedrigung der Ausbeute an dem gesuchten Produkt führt.
Der vorliegende Antrag betrifft ein neuartiges rekombinantes unglykosyliertes aktives Human-IL-2 in reduzierter Form und ein Verfahren zur Herstellung dieses Produkts, das nicht den Arbeitsschritt der Reoxidation erfordert, um ein Produkt mit der biologischen Aktivität des IL-2 zu erhalten.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft das rekombinante unglykosylierte Human-Interleukin-2, das einerseits folgende Aminosäurensequenz aufweist:
sowie die Allele oder Derivate dieser Sequenz, in der X für ein Methionin oder ein Wasserstoffatom steht und dessen drei Cysteine in Position 58, 105 und 125 in reduzierter Form vorliegen, andererseits eine biologische Aktivität aufweist, die mit der des oxidierten IL-2 mit der gleichen Sequenz und einer Disulfidbrücke in Position 58-105 vergleichbar ist.
Zu den Allelen und Derivaten zählt man die durch Substitution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren außer den Cysteinen in 58, 105, 125 veränderten Sequenzen, soweit diese Produkte die charakteristische biologische Aktivität des reduzierten IL-2 beibehalten. Die Herstellung solcher Modifikationen ist in der Methode der rekombinanten DNA wohlbekannt, zum Beispiel mittels der Techniken der gesteuerten Mutagenese, die von Lather, R.F. und Lecoq, J.P. in Genetic Engineering Academic Press (1983) 31-50 oder Smith, M. und Gillam, S. in Genetik Engineering Principles and Methods, Plenum Press (1981) 3 1-32 übersichtsartig zusammengestellt sind. Unter reduzierter Form versteht man, daß die Cysteinreste, die das IL-2 enthält, eine freie Sulfhydrylgruppe enthalten, was zum Beispiel durch Spektrometrie mit Dithiodipyridin als Thiolreagenz nachgewiesen wird. Die biologische Aktivität der reduzierten Form, auf die sich die Erfindung bezieht, wird, vergleichbar mit der der entsprechenden oxidierten Form mit einer Disulfidbrücke 58-105, durch Messung der Proliferation von Stämmen leukämischer CTLL-2-Zellen von Mäusen nachgewiesen, die von IL-2 abhängig sind, und zwar durch einen kolorimetrischen Test mit Tetrazoliumsalz (Mossmann, T.J., J.Immunol.Meth. (1983) 65 55-63).
Die Erfindung betrifft auch ein rekombinantes unglykosyliertes Human-IL- 2, das einerseits folgende Aminosäurensequenz aufweist:
sowie die Allele oder Derivate dieser Sequenz, in der X für ein Methionin oder ein Wasserstoffatom steht und dessen drei Cysteine in Position 58, 105 und 125 in reduzierter Form vorliegen, und das andererseits eine biologische Aktivität von mindestens 0,5 x 10&sup7; U/mg aufweist. Die Einheit für die Aktivität von IL-2 ist definiert als die Menge, die 50% der Maximalrespons im Test hervorruft. Man verwendet als Standard eine Probe des "Biological Responce Modifier Program (BRMP) reference reagent human IL-2 (Jurkat)", das von dem National Cancer Institut (NCI) zur Verfügung gestellt wurde.
Die Erfindung betrifft genauer rekombinantes unglykosyliertes Human-Interleukin-2 mit folgender Aminosäurensequenz:
in der X für ein Methionin oder ein Wasserstoffatom steht und dessen drei Cysteine in Position 58, 105 und 125 in reduzierter Form vorliegen und das eine biologische Aktivität aufweist, die mit dem des nativen Human IL-2 vergleichbar ist. Unter vergleichbarer Aktivität versteht man die gleiche spezifische Aktivität wie die des natürlichen IL-2, das aus Jurkat-Leukämiezellen isoliert wurde, d.h. 1,3 x 10&sup7; U/mg (Referenz BRMP) oder eine Aktivität, die maximal 25% von dieser spezifischen Aktivität abweicht. Die Sequenz des reduzierten IL-2, auf das sich diese Erfindung bezieht, trägt gegebenenfalls ein zusätzliches N-terminales Methionin gemäß dem transformierten Organismus wie E.Coli, in dem es exprimiert wird. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung zieht man die Sequenz mit einem Methionin vor, man kann aber auch ein Gemisch aus dem Produkt mit Methionin und ohne Methionin verwenden oder das Produkt ohne Methionin.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem unglykosyliertem reduziertem Human-IL-2, das zuerst die Extraktion des in dem transformierten Organismus in Form von Granula angereicherten IL-2 beinhaltet, und zwar durch Solubilisierung in reduzierendem Medium mit einem chaotropen Mittel, dann die Reinigung durch Präzipitation, gefolgt von einer Hochleistungsflüssigchromatographie auf Umkehrphase mit einem sauren Fließmittel und das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) vorkommenden Falls die von der besagten Chromatographie eluierte Hauptfraktion auf eine Temperatur im Bereich von -20ºC abkühlt, dann die waßrige Phase abtrennt, die man
b) im saurem Medium verdünnt, dann über eine andere Hochleistungsflüssigchromatographiesäule auf Umkehrphase im sauren Medium chromatographisch auftrennt und das besagte IL-2 isoliert.
Das rekombinante IL-2, das in Form von Granula dank eines erhöhten Expressionsgrads von einem transformierten Mikroorganismus wie E.coli erzeugt wird, kann mittels wohlbekannter Methoden mit einer konzentrierten Lösung eines chaotropen Mittels wie einer 6 bis 8M Lösung eines Guanidinsalzes solubilisiert werden, dann durch Hochleistungsflüssigchromatographie auf Umkehrphase (im folgenden als RP-HPLC bezeichnet) mit im Handel erhaltlichen Trägern, vorzugsweise modifizierten Kieselsäuren wie C3, C4, C8 oder C18 mit einem sauren Fließmittel mit einem pH zwischen 1 und 4 gereinigt werden. Das IL-2 kann mit einem Gradientensystem aus einer organischen Säure wie Essigsäure oder Trifluoressigsäure (im folgenden als TFA bezeichnet) und einem organischen Lösungsmittel wie Acetonitril von der Säule eluiert werden. Die Hauptfraktion, deren Elution mittels Spektrophotometrie bei 280 nm detektiert wird, ist das Ausgangsmaterial für den etwaigen Schritt des Abkühlens, der Teil der vorliegenden Erfindung ist. Unter Abkühlung versteht man, daß die besagte Hauptfraktion, die bei Raumtemperatur gesammelt wurde, in eine Umgebung mit einer Temperatur im Bereich von -20ºC gebracht wird, die die fortschreitende Bildung einer festen wäßrigen Phase ermöglicht, von der man die überstehende Fraktion durch Dekantieren entfernen kann. Die waßrige Phase, die gegebenenfalls auf diese Weise abgetrennt wird, dient nach Verdünnung als Ausgangsmaterial für die RP-HPLC in saurem Milieu, die nachher beschrieben wird und die Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist. Die Verdünnung der wäßrigen Phase wird im sauren Milieu mit einem pH von 1 bis 4, vorzugsweise von 2 bis 3 durchgeführt. Man trennt die verdünnte wäßrige Phase auf einer Säule mit Umkehrphase chromatographisch auf, wobei man im Handel erhältlichen Träger wie die modifizierten Kieselsäuren C3, C4, C8 oder C18 verwendet, die Poren von einer für das Arbeiten mit Proteinen angemessenen Größe haben, zum Beispiel mit einem Durchmesser von wenigstens 150 Å. Bei der Elution wird ein ansteigender Konzentrationsgradient eines niedrigen Alkohols verwendet, der mit Wasser mischbar ist und eine organische Säure enthält.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders dadurch gekennzeichnet, daß der etwaige Schritt des Abkühlens in einer waßrigen Lösung von Acetonitril durchgeführt wird, die etwa 0, 1 % Trifluoressigsäure enthält, dadurch, daß die Verdünnung mit einer wäßrigen Lösung einer organischen Säure wie Citronensäure durchgeführt wird, und dadurch, daß das besagte IL-2 in der zweiten Chromatographie mit einer Lösung aus Isopropanol, Wasser und einer organischen Säure wie Citronensäure eluiert wird. Die wäßrige Acetonitrillösung mit etwa 0,1 % TFA, die das bevorzugte Gemisch für den etwaigen Schritt des Abkühlens darstellt, den die Erfindung beinhaltet, entspricht der bei der ersten Chromatographie eluierten Hauptfraktion. Am besten wird die Verdünnung der wäßrigen Phase sofort entweder nach der etwaigen Abtrennung oder nach der ersten Chromatographie vorgenommen. Diese Verdünnung erfolgt vorzugsweise durch Zugabe von wenigstens 2 Volumina Wasser mit 0,5 bis 2% einer organischen Säure wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Trifluoressigsäure oder Citronensäure, besser durch Zugabe von etwa 2 Volumina Wasser mit 0,5% Citronensäure. Die zweite Chromatographie, die Teil des beanspruchten erfindungsgemäßen Verfahrens ist, besteht darin, die waßrigen Phase, die gegebenenfalls nach den Schritt des Abkühlens abgetrennt, dann verdünnt wurde, einer RP-HPLC zu unterziehen, wobei im Handel erhältliche Träger wie modifizierte Kieselgele C3, C4, C8 oder C18 mit Porendurchmessern von wenigstens 150 Å verwendet werden. Der bevorzugte Träger ist eine modifizierte Kieselsäure C4 VYDAC 300Å, ein Kieselgel, das kovalent aufgepfropfte Butylgruppen enthält, dessen Poren einen Durchmesser von 300 Å haben und dessen Partikel eine mittlere Größe von 15 bis 20 um aufweisen. Die Elution von IL-2, die das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet, wird mit Hilfe eines Gradientensystems aus einem Alkohol wie Propanol oder Isopropanol und einer organischen Säure wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Trifluoressigsäure oder Citronensäure durchgeführt. Das bevorzugte Gemisch enthält Isopropanol, Wasser und Citronensäure, vorzugsweise 0,5 bis 2%, am besten 0,5%, und ermöglicht, mit einem Gradientensystem mit ansteigender Konzentration an Isopropanol, die Elution einer kleineren Fraktion bei etwa 48% Isopropanol, dann einer größeren Fraktion bei etwa 59% Isopropanol, wobei letztere das rekombinante unglykosylierte aktive Humen-IL-2 in reduzierter Form enthält.
Die Erfindung hat auch das rekombinante unglykosylierte Human IL-2 in reduzierter Form zum Inhalt, das mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens hergestellt werden kann.
Die besagte gewonnene Fraktion kann bei 0ºC bis etwa -20ºC aufbewahrt werden. Sie ist unter diesen Bedingungen stabil. Man kann auch den Isopropanol durch azeotrope Destillation unter Vakuum entfernen. Die erhaltene Lösung kann bei +4ºC aufbewahrt werden oder aber man isoliert direkt das IL-2 der vorliegenden Erfindung durch Lyophilisation.
Die Erfindung betrifft auch eine Variante des Verfahrens, in dem man die Hauptfraktion nicht dem Schritt des Abkühlens und der Abtrennung der wäßrigen Phase unterzieht.
Die verdünnte Hauptfraktion, die gemäß der beanspruchten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde, kann gegebenenfalls bei +4ºC aufbewahrt werden. Sie ist stabil und stellt das Ausgangsmaterial für die zweite Chromatographie dar, die Teil des beanspruchten erfmdungsgemäßen Verfahrens ist.
Wenn man die Thiolgruppen bestimmt, weist das gemäß der Erfindung erhaltene IL-2 3 freie Sulfhydrylgruppen auf und zeigt eine spezifische Aktivität von 0,7 bis 1,3 x 10&sup7; U/mg in dem Proliferationstest der CTLL-2-Stämme d.h. sie ist vergleichbar mit der des nativen IL-2. Diese Aktivität rechtfertigt einen der Gesichtspunkte der Erfindung, der das rekombinante unglykosylierte Human-IL-2 in reduzierter Form betrifft, wie es oben beschrieben ist, für seine Verwendung als Arzneimittel in der gleichen Weise wie das native IL-2 in einer Vielzahl von Indikationen, die aus seiner immunmodulativen Aktivität sowie aus seiner antitumoralen Aktivität Nutzen ziehen, die zum Beispiel von Fletcher M. et al., Lymphokine Resaerch (1987) 6, 47-57 beschrieben sind und die zum Beispiel beinhalten: die Proliferation der T-Lymphozyten, die Induktion der Cytotoxizität der NK-Zellen (natural killer) und der LAK-Zellen (Lymphokine activated killer), die Restauration der Zellimmunität, eine Schutzwirkung gegen die Infektion im Falle der Immundefizienz oder einen helfenden Effekt gegenüber Impfstoffen. Die Verabreichung kann direkt erfolgen oder verbunden mit einer Methode der adoptiven Immuntherapie, die von Rosenberg, S.A. et al. in N.Engl. J. Med. (1985) 313, 1485-1492 beschrieben wurde.
Wie das native IL-2 kann das erfindungsgemäße IL-2 alleine oder in Verbindung mit anderen Immunmodulatoren verwendet werden wie α- Interferon, γ-Interferon oder anderen therapeutischen Mitteln.
Die Erfindung hat endlich eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Inhalt, die das oben definierte rekombinante unglykosylierte Human-IL-2 in reduzierter Form als Wirkstoff enthält. Die Zusammensetzung kann fest oder flüssig sein. Das IL-2 der vorliegenden Erfindung kann gemäß den bekannten Methoden zur Herstellung einer brauchbaren pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden, in der das IL-2 mit einem pharmazeutisch verwendbarem Trägerhilfsstoff kombiniert ist. Diese Zusammensetzung enthält eine wirksame Menge an IL-2 in einer angemessenen Menge an Hilfsstoff, der für die Anwendung am Menschen geeignet ist. Die Formulierung kann nach der Entfernung des Isopropanols durch azeotrope Destillation im Vakuum hergestellt werden, ausgehend von der wäßrigen sauren Lösung des erfindungsgemaßen IL-2, der man ein in Wasser lösliches Füllmittel zugibt und die man lyophilisiert. Unter einem Füllmittel versteht man eine in Wasser lösliche Substanz, die den Anfangs-pH nicht verändert, wenn das Gemisch rekonstituiert wird. Beispiele für Füllmittel, die zugesetzt werden können, sind Zucker wie Glucose, Ribose, Saccharose, Maltose, Trehalose oder reduzierte Zucker wie Mannit. Mannit ist bevorzugt. Man gibt das Mannit in einer Konzentration von 10 bis 50 mg/ml zu, vorzugsweise im Bereich von 50 mg/ml, wenn die Konzentration des IL-2 der vorliegenden Erfindung zwischen 0,05 und 1 mg/ml liegt, gemäß der anzuwendenden Dosis. Die Lösung, die man steril unter Ausschluß von Sauerstoff fütriert hat, wird in Dosierfläschchen abgeteilt, und man lyophilisiert. Das lyophilisierte Gemisch kann durch Injektion von destilliertem, für die parenterale Injektion geeignetem Wasser in das Fläschchen rekonstituiert werden,
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann intravenös als Einzeldosis oder als kontinuierliche Perfusion angewendet werden, intramusculär, intraperitoneal, intrapleural oder subcutan. Die wirksame Dosis des erfindungsgemäßen IL-2, die von der Art der Anwendung und vom behandelten Patienten abhängt liegt im aligemeinen zwischen 1 x 10&sup6; U/m²/24 h und 40 x 10&sup6;/m²/24 h, vorzugsweise im Bereich von 20 x 10&sup6; U/m²/24 h beim Erwachsenen oder Kind. Die Tagesdosis hängt auch von der Dauer der Anwendung ab, und man braucht sich nicht auf die oben angegebenen Dosen zu beschränken.
Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Anwendung in Perfusion verwendet wird, ist sie insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß sie das rekombinante unglykosylierte IL-2 in reduzierter Form, Wasser und eine organische Säure wie Citronensäure enthält. Eine solche Zusammensetzung kann ausgehend von der erfindungsgemäßen lyophilisierten pharmazeutischen Zusammensetzung hergestellt werden, die man in Gegenwart eines geeigneten Hilfsstoffs löst, der zur Stabilität des Wirkstoffs während der Dauer der Perfusion beiträgt, zum Beispiel Glucose. Die bevorzugten Bedingungen bestehen darin, das lyophilisierte Gemisch, das durch Injektion von destilliertem Wasser rekonstituiert wurde, durch Einführung in eine Perfusionstasche zu verdünnen, die ein Volumen an Glucose mit einer Konzentration von 50 mg/ml enthält, das als angemessen für die anzuwendende Dosis bestimmt wurde.
Alle Veröffentlichungen, die zitiert sind, sind durch Bezug in den Text des vorliegenden Antrags eingeschlossen.
Die Abbildungen aus dem Anhang veranschaulichen bestimmte Aspekte der Erfindung:
Die Abbildung 1a ist ein Chromatogramm der analytischen RP-HPLC des Rohextrakts in 8M Guanidin von Beispiel 1
Die Abbildung 1b ist ein Chromatogramm der analytischen RP-HPLC des reduzierten und oxidierten Standard-IL-2.
Die Abbildung 2 ist ein Chromatogramm der analytischen RP-HPLC der "Resolubilisierung", von Beispiel 1.
Die Abbildung 3 ist ein Chromatogramm der RP-HPLC der Hauptfraktion nach dem Schrift des Abkühlens von Beispiel 1.
Die Abbildung 4 ist ein Chromatogramm der analytischen RP-HPLC der Fraktion "59" von Beispiel 1.
Die Abbildung 5 ist das Protokoll der Reinigung von Beispiel 1.
Die Abbildung 6 ist das Gel der SDS-PAG-Elektrophorese von Beispiel 2.
Die Abbildungen 7a und 7b sind die Peptidkarten von Beispiel 2.
Die Abbildungen 8a und 8b sind die CD-Kurven von Beispiel 2.
Die Abbildung 9 ist die Kurve des mitogenen Effekts auf die Human- Lymphozyten aus Beispiel 3.
Die Abbildung 10 ist die Toxizitätskurve, die gegenüber K 562- und DAUDI-Stämmen erhalten wurde.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1: Reinigung des reduzierten biologisch aktiven r-hIL-2 aus Granula

Die Granula werden durch Zentrifugation der Kulturen eines E.coli- Stammes erhalten, der mittels eines Plasmids mit der Sequenz transformiert ist, die das native IL-2 codiert und fähig ist, IL-2 in dieser Form im Innern der Zelle anzureichern, wie zum Beispiel von Sato, T. et al., J.Biochem. (1987) 101 525- 534 beschrieben. Die so in einem Fermenter von 10 l erhaltenen Zellen werden mit einem Manton-Gaulin-Homogenisator aufgebrochen. Aus den isolierten und gewaschenen Zellbruckstücken (90-170 g Feuchtgewicht) wird das IL-2 in 2,5 Volumina eines 20 mM Tris-HCl-Puffers, pH 8 solubilisiert, der 8 M Guanidinhydrochlorid (Gu,HCl) und 100 mM Dithiothreitol (DTT) enthält. Die Menge an solubilisiertem IL-2 (1,5 bis 2,5 g) wird durch analytische RP-HPLC über eine C4 VYDAC-Säule (0,46 x 15 cm), 300Å, 5 um, bestimmt mit einem Durchfluß von 2 ml/min mittels eines linearen Acetonitrilgradienten (30 bis 70% innerhalb von 10 min) mit 0,1% TFA und einer spektrophotometrischen Detektion bei 280 nm oder 210 nm, bei der man die Peakfläche bei 280 nm nach Kalibrierung mit einem Standard-IL-2 bestimmt (Abb. 1a und Abb. 1b). Das IL-2 wird dann durch Senken der Konzentration des Gu,HCl auf 2M in Gegenwart von DTT ausgefällt. Nach Waschen des Präzipitats mit einer wäßrigen 0,1%igen TFA-Lösung bis zu einem pH des Überstandes von weniger als 5,0 wird das IL-2 in einer wäßrigen 20%igen Acetonitrillösung mit 0,1% TFA solubilisiert. Die so erreichte "Resolubilisierung", die gemäß der analytischen RP-HPLC (Abb.2) einen Gehalt an reduziertem IL-2 von über 85% aufweist, hat eine biologische Aktivität von weniger als 0,01 x 10&sup7; U/mg an reduzieriem IL-2 und einen Gehalt an Sulfhydrylgruppen von 2,85 SH/Mol reduziertem IL-2.
Eine Fraktion der erhaltenen Lösung, die etwa 200 mg IL-2 entspricht, bestimmt durch analytische RP-HPLC, wird mit 0,1% TFA auf eine Acetonitrilkonzentration von weniger als 10% verdünnt, dann auf eine C4 VYDAC-Säule (5,7 x 30 cm) aufgetragen. Das IL-2 wird bei einem Durchfluß von 100 ml/min mittels eines linearen Acetonitrilgradienten (30 bis 80% innerhalb von 40 Minuten) mit 0,1% TFA eluiert, und zwar bei einer Konzentration von etwa 60% Acetonitril in einem größeren Peak, der durch Spektrometrie bei 280 nm detektiert und mittels RP-HPLC analysiert wird. Die gesammelte "Hauptfraktion", die das reduzierte IL-2 enthält, wird dann einer langsamen Abkühlung von Raumtemperatur auf -20ºC ± 1º unterzogen, die es ermöglicht, durch Dekantieren eine obere organische, an Acetonitril reiche Phase zu entfernen. Die unter Phase, die reich an Wasser ist und das IL-2 enthält, kann im gefrorenen Zustand aufbewahrt werden. Nach dem Auftauen, wird die erhaltene Lösung nach Verdünnen mit 2 Volumina wäßriger 0,5%iger Citronensäurelösung auf eine C4 VYDAC-Säule (5,7 x 30 cm) aufgetragen, die man mittels eines linearen Isopropanolgradienten (20 bis 70% innerhalb von 40 Minuten) mit 0,5% Citronensäure mit einem Durchfluß von 50 ml/min eluiert. Der Durchfluß, spektroskopisch bei 280 nm verfolgt, zeigt die aufeinanderfolgende Elution eines kleineren Peaks bei einer Konzentration von etwa 48% Isopropanol (Fraktion "48") und eines größeren Peaks bei einer Konzentration von etwa 59% Isopropanol (Fraktion "59") (Abb.3). Die Fraktion "59" wird gesammelt. Sie ist bei Aufbewahrung bei 0ºC wenigstens 24 h unter Ausschluß von Luft stabil.
Nach Entfernung des Isopropanols durch azeotrope Destillation unter Vakuum wird die Fraktion "59" mit analytischer RP-HPLC analysiert und gibt einen homogenen Peak (Abb. 4), der bei etwa 60% Acetonitril eluiert wird, während das oxidierte Referenz-IL-2 bei etwa 57% Acetonitril eluiert wird (Abb. lb). Die Fraktion "59", die nach Entfernung des Isopropanols eine Konzentration an IL-2 von über 1 mg/ml aufweist und einen pH von 3 + 0,5, kann bei +4ºC unter Ausschluß von Luft wenigstens eine Woche lang aufbewahrt oder sofort lyophilisiert werden oder zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden. Die lyophilisierte Fraktion "59" wird auf ihre biologische Aktivität getestet gemäß dem in vitro-Test der Proliferation von CTLL-2-Zellen und weist eine spezifische Aktivität von 1,3 + 0,5 x 10&sup7; U/mg auf, vergleichbar mit der des nativen IL-2.
Der Gehalt an freien Sulfhydrylgruppen der lyophilisierten Fraktion "59", bestimmt mit der kolorimetrischen Methode mit Dithiodipyridin, liegt bei 2,94 SH/Mol verglichen mit 0,76 SH/Mol für das oxidierte Referenz-IL-2.
150 bis 300 mg reduziertes IL-2, titriert mittels analytischer HPLC, das 3 SH-Gruppen aufweist, biologisch aktiv und in der RP-HPLC homogen ist, werden in der Fraktion "59" ausgehend von einem Fermenter von 10 l erhalten (gemäß Protokollschema Abb. 5).

Beispiel 2: Reinigung des reduzierten biologisch aktiven r-hiL-2

Man geht wie in Beispiel 1 vor, außer daß man die "Hauptfraktion" nicht dem Schritt der Abkühlung, dann der Trennung durch Dekantieren unterzieht, sondern sie direkt mit 2 Volumen waßriger 0,5%iger Citronensäurelösung verdünnt. Die "Fraktion 59" wird gesammelt und behandelt wie in Beispiel 1.

Beispiel 3: Physiochemische Charakterisierung des reduzierten biologisch aktiven r-hIL-2

Das reduzierte r-hIL-2, das gemäß der Erfindung in der Fraktion "59" des Beispiel 1 hergestellt wurde, wird auf folgende Eigenschaften hin untersucht:

1) Homogenität

Die SDS-PAG-Elektrophorese wird mit einem 2-phasigen Gel (Sammel- und Trenngel mit 5% bzw, 15% Acrylamid) durchgeführt, das 10% SDS enthält. Die Probe wird vorher 2 min lang auf 100ºC erhitzt in einem Puffer mit 3% SDS und 5% Mercaptoethanol. Nach Auftrennung in einem Puffer mit 1% SDS erfolgt eine Silberfärbung, die eine einzige Bande aufweist, was einer Reinheit von über 99% für einen Auftrag von 2 ug entspricht (Abb. 6).

2) Molekulargewicht durch Elektrophorese

Im reduzierenden Medium bestimmt man ein scheinbares MG von etwa 15 kD, in Übereinstimmung mit einem berechneten MG von 15420 (Abb.6).

3) Aminosäurenzusammensetzung

Eine Probe mit 25 ug des reduzierten erfindungsgemäßen IL-2 in 0,5 ml Wasser wird in ein Hydrolyserohr aus Glas gegeben, dem 0,5 ml konzentrierte Salzsäure mit 31,7% TFA und 4,8% Thioglykolsäure zugesetzt werden. Das Rohr wird unter Vakuum verschlossen, dann wird die Hydrolyse bei 155ºC 40 min lang durchgeführt. Das Hydrolysat wird dann unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 0,7 ml Citratpuffer pH=3 gelöst, dann einer Aminosäurenanalyse auf einer Interaction-Säule AA 511 (0,46 x 15 cm) unterzogen mit einem pH-Gradienten (3 bis 5) und einem Natriumchloridgradienten (0 bis 70 g/l) in einem Citratpuffer bei 60ºC mit einem Durchfluß von 0,5 ml/min und einer Fluoreszenzdetektion nach Derivatisierung mit Orthophthalaldehyd am Ausgang der Säule. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Die Werte sind Mittelwerte aus 2 wiederholten Hydrolysen und jeweils 2 wiederholten Chromatographien. Die Zusammensetzung stimmt mit der des nativen IL-2 mit einem zusätzlichen N-terminalen Methionin überein. TABELLE 1 INTERLEUKIN 2 Aminosäuren Theoret. Anzahl gefundene Anzahl *ND nicht detektlert ** NB nicht berechnet

4) N-terminale Aminosäurensequenz

Die N-terminale Aminosäurensequenz wird durch Mikrosequenzierung festgestellt, wobei man die automatisierte Edman-Abbaumethode anwendet: bei der Analyse von 15ug reduziertem blologisch aktivem erfindungsgemäßem r-hIL- 2 mit einem Gasphasen-Mikrosequenzierer 470A von Applied Biosystems, gekoppelt mit einem HPLC 120A, können folgende PTH-Aminosäuren identifiziert werden. Stufen PTH-AS
Die Sequenz der 20 N-termlnalen Reste stimmt mit der theoretischen Reihenfolge der Verknüpfung beim nativen IL-2 überein. Man beobachtet etwa 10% IL-2 ohne Methionin.

5) Peptidkarte mit Bromcyan

700 ug reduziertes erfindungsgemäßes IL-2 (etwa 53 nMol) werden in 4 ml 70%ige Ameisensäure gelöst und 5,6 mg Bromcyan zugegeben. Die Losung wird eine Nacht lang bei Raumtemperatur gerührt, mit Wasser verdünnt, dann lyophllisiert. Das Reaktionsgemisch wird mittels RP-HPLC auf einer uBondapak C18 RP-Säule (0,46 x 20 cm) analysiert mittels eines Acetonitrilkonzentrationsgradienten von 0 bis 70% mit 0,1% TFA, einem Durchfluß von 1 ml/min bei Raumtemperatur und mit einer spektrophotometrischen Detektion bei 220 nm. Die Peptidkarte des reduzierten r-hIL-2 (Abb. 7a) zeigt eine Fragmentierung, die sich von der des oxidierten Referenz-IL-2 unterscheidet (Abb. 7b).

6) Circulardichroismus

Die Circulardichroismusspektren (CD) werden bei Raumtemperatur mit einem Jobin Yvon Mark-Spektrograph bestimmt. Die Probe des reduzierten r- hIL-2, nach RP-HPLC lyophilisiert, die mit dem linearen Isopropanolgradienten durchgeführt wurde, bei dem man die 0,5%ige Citronensäure nach Beispiel 1 durch 0,1%ige Ameisensäure ersetzt hat, dann Destillation des Isopropropanols und Lyophilisation, wird in einer Konzentration von 1 mg/ml in Essigsäure aufgenommen. Es werden Küvetten mit 0,01 cm bzw. 0,5 cm für die Peptidregion (185-250 nm) und die aromatische Region (260-320 nm) verwendet. Das Spektrum des Lösungsmittels wird für jede Probe vom Spektrum des IL-2 abgezogen. Die Ergebnisse werden in Ellyptizität O angegeben (mittleres Gewicht des Rückstandes an IL-2 116).
Die Abbildung 8a zeigt das CD-Spektrum im fernen UV : Das reduzierte biologisch aktive erfindungsgemäße r-hIL-2 weist ein Spektrum auf, das die Anwesenheit einer geordneten Sekundärstruktur zeigt. Die Bestimmung der % des α-helikalen Anteils zeigt wenig signifikante Unterschiede zu dem oxidierten Referenz-IL-2 (% α-Helix # 50%).
Die Abbildung 8b zeigt das CD-Spektrum im nahe UV : das oxidierte Referenz-IL-2 hat einen signifikanien CD, was auf eine asymmetrisch Umgebung für die aromatischen Reste hinweist, während das reduzierte erfindungsgemäße r-hIL-2 einen wenig signifikanten, aber unterschiedlichen CD aufweist.

Beispiel 4: Biologische Aktivität

Die biologische Wirksamkeit des reduzierten erfindungsgemäßen r-hIL-2 wird in in-vitro- und ex-vivo-Versuchen bestimmt.

1) in-vitro-Aktivität auf Human-Zellen

a) Test auf lymphobiastische Transformation

Außer der proliferativen Wirksamkeit auf Zellstämme von Mäusen wie CTLL-2, die die biologische Dosierung des IL-2 ermöglicht, weist das reduzierte erfindungsgemäße r-hIL-2 einen dosisabhängigen mitogenen Effekt auf die normalen zirkulierenden Human-Lymphozyten auf, der mit dem des oxidierten Referenz-IL-2 vergleichbar ist, was durch Messung des Einbaus von tritiiertem Thymidin in die DNA gemessen wird (Abb. 9).

b) Induktion der Cytotoxizität mononuclearer Zellen

Die Untersuchung wird mit zirkulierenden mononuclearen Human- Zellen durchgeführt, die in Gegenwart von IL-2 inkubiert werden und deren cytotoxische Wirkung gegenüber tumoralen Zielzellen bestimmt wird, nämlich gegemüber dem erythroleukämischen Stamm K 562 (NK-Zellen-empfindlich) bzw. dem DAUDI-Stamm, der von einem Lymphom B abstammt (NK-Zellenresistent), und zwar durch Verlängerung des Cr 51 innerhalb von 4 Stunden.
Die Ergebnisse, ausgedrückt in lytischen Einheiten pro 10&sup6; Zellen (LE/ 10&sup6;) zeigen, daß das erfindungsgemäße reduzierte r-hIL-2 eine dosisabhängige Fähigkeit aufweist, die NK-Aktivität zu erhöhen bzw. die Cytotoxizität der T- Lymphozyten gegenüber tumoralen Zielzellen zu induzieren, und zwar in einer Art, die mit der für das native IL-2 bekannten vergleichbar ist (Abb. 10).

2) Ex-vivo-Aktivität auf die Maus (Stimulation der peritonealen Macrophagen)

Bei der normalen Balb/c- und MRL-+/+-Maus löst die aufeinanderfolgende peritoneale Injektion von rekombinantem γ-Interferon der Ratte in suboptimalen Dosen (100 bis 3000 U), dann 24 Stunden später von reduziertem erfindungsgemaßem r-hIL-2 die oxidativen Mechanismen der phagozitierenden Zellen aus, was durch Messung der Chemilumineszenz der aus der Bauchhöhle der 24 Stunden nach der IL-2-Injektion getöteten Mäuse entfernten Zellen in Gegenwart von Phorbolester (PMA) gemessen wird. Der dosisabhängige Effekt ist mit dem bei dem oxidierten Referenz-IL-2 beobachteten vergleichbar. Ergebnisse: Chemilumineszenz (CPM x 10&sup4;) nach Injektion von r-hIL-2 Injizierte Dosis (ng pro Maus) reduziert oxidiert

Beispiel 5: Pharmazeutische Zusammensetzung zur Injektion

Die wäßrige Lösung von reduziertem r-hIL-2, die der erfindungsgemäßen Fraktion "59" entspricht, von der man den Isopropanol durch azeotrope Destillation unter Vakuum entfernt hat, wird unverzüglich mit einer wäßrigen entgasten und mit Stickstoff gesättigten Mannitlösung auf etwa 100 ug reduziertes IL-2 /ml und 50 mg/ml Mannit verdünnt. Nach Filtration durch eine Membran von 0,22 um sterilem Abteilen von 1 ml-Portionen in Fläschchen und Lyophilisation werden die Dosierfläschchen unter Stickstoff verschlossen und vor der Verwendung bei einer Temperatur von +4ºC aufbewahrt,

Beispiel 6: Pharmazeutische Zusammensetzung zur kontinuierlichen Perfusion

Die wäßrige Lösung des reduzierten r-hIL-2, die der erfindungsgemäßen Fraktion "59" entspricht, bei der man den Isopropanol durch azeotrope Destillation unter Vakuum entfernt hat, wird unverzüglich mit einer wäßrigen entgasten und mit Stickstoff gesättigten Mannitlösung auf etwa 500 ug reduziertes IL-2/ml und 50 mg/ml Mannit verdünnt. Nach Filtration durch eine Membran von 0,22 um, steriler Abteilung von jeweils 1 ml in Fläschchen zur Lyophilisation, werden die Dosierfläschchen unter Stickstoff verschlossen und vor dem Gebrauch bei einer Temperatur von +4ºC aufbewahrt. Der Inhalt jedes Fläschchens wird dann durch Injektion von 1 ml destilliertem sterilem Wasser aufgelöst. Die Lösungen, die 7 Dosierfläschchen entsprechen (etwa 35,16&sup6; Einheiten), werden in einen Viaflex - Behälter eingeführt, der 500 ml 5%ige Travenol -Glucose-Perfusionslösung enthält.

Claims

1.- Rekombinantes unglykosyliertes Humen-Interleukin -2, das einerseits folgende Aminosäurensequenz aufweist:

sowie die Allele oder Derivate dieser Sequenz, in der X fur ein Methionin oder ein Wasserstoffatom steht und dessen drei Cysteine in Position 58, 105 und 125 in reduzierter Form vorliegen, andererseits eine bioiogische Aktivität aufweist die vergleichbar ist mit der des oxidierten IL-2 mit der gleichen Sequenz und mit einer Disulfidbrücke in Position 58-105.

2. Rekombinantes unglykosyliertes Human-Interleukin-2, das einerseits folgende Aminosäurensequenz auFweist:

sowie die Allele oder Derivate dieser Sequenz, in der X für ein Methionin oder ein Wasserstoffatom steht und dessen drei Cysteine in Position 58, 105 und 125 in reduzierter Form vorliegen, das andererseite eine biologische Aktivität von wenigstens 0,5 x 10&sup7; U/mg aufweist.

3. - Rekombinantes unglykosyliertes Human-Interleukin-2 mit folgender Aminosäurensequenz:

in der X für ein Methionin oder ein Wasserstoffatom steht und dessen drei Cysteine in Position 58, 105 und 125 in reduzierter Form vorliegen und das eine biologische Aktivität aufweist, die vergleichbar ist mit der des nativen Human-IL-2.

4. - Verfahren zur Herstellung von rekombinantem unglykosyliertem reduziertem Human-IL-2. wie es in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, ein Verfahren, das zuerst die Extraktion des IL-2 beinhaltet, das in Form von Granula in einem transformierten Mikroorganismus angereichert ist, und zwar durch Solubilisierung in reduzierendem Medium mit Hilfe eines chaotropen Mittels dann die Reinigung durch Präzipitation, gefolgt von einer Hochleistungsflüssigchromatographie auf Umkehrphase mit einem sauren Eluenten, und dadurch gekennzeichnet, daß man

a) vorkommendenfalls die eluierte Hauptphase der besagten Chromatographie auf eine Temperatur im Bereich von -20ºC abkühlt, dann die wäßrige Phase abtrennt, die man

b) in saurem Medium verdünnt, dann über eine andere Hochleistungsflüssigchromatographiesäule in Umkehrphase in saurem Medium chromatographisch auftrennt und besagtes IL-2 isoliert.

5. - Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Abkühlens in einer wäßrigen Acetonitrillösung durchgeführt wird, die etwa 0.1% Trifluoressigsäure enthalt, dadurch daß die Verdünnung mit Hilfe einer wäßrigen Lösung einer organischen Säure wie Citronensäure durchgeführt wird, und dadurch, daß besagtes IL-2 in der zweiten Chromatographie mit Hilfe einer Lösung aus Isopropanol, Wasser und einer organischen Säure wie Citronensäure eluiert wird.

6. - Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hauptfraktion nicht dein Schritt des Abkühlens und der Abtrennung der wäßrigen Phase unterzieht.

7. - Rekombinantes unglykosyliertes Human-IL-2 in reduzierter Form, die nach dem Verfahren nach einer der Andprüche 4 bis 6 erhalten werden kann.

8. - Rekombinantes unglykosyliertes IL-2 in reduzierter Form, wie es nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7 definiert ist, für seine Verwendung als Arzneimittel.

9. - Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff das rekombinante unglykosylierte Human-IL-2 in reduzierte Form enthält, wie es nach Anspruch 8 definiert ist.

10. - Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie das rekombinante unglykosylierte Human-IL-2 in reduzierter Form, wie es nach Anspruch 8 definiert ist, Wasser und eine organische Säure wie Citronensäure enthält.