JPH02209896A - 還元型の非グリコシル化組換ヒトｉｌ↓２、その取得方法、及び薬物としてのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、還元型における生物学上活性な非グリコシル
化組換ヒトインタロイキン２　（ｒ−ｈｆＬ２として記
載される）、その取得方法、及び薬物としてのその使用
に関するものである。

［従来の技術］ 活性化Ｔ細胞の増殖を刺戟するリンポキンである天然ヒ
ｔｉＬ２は、蛋白のアミノ酸配列にあける位置５８．１
０５及び１２５に位置する３個のシスチーインを有する
。位置５８及び１０５におけるシスティンはジスルフィ
ド架橋により結合されるのに対し、位置１２５における
システィンは遊離スルフヒドリル基を有する［Ｒ，Ｊ、
ＩＴＪブス等、プロシーディング・ナショナル・アカデ
ミ−・す゛イエシス・ＵＳＡ　（１９８４）　、第８１
巻、第６４８６〜６４９０頁］。

ＡＤＮの組換技術により対立遺伝子から或いは誘導体か
らヒトＩＬ２を製造する方法が記載されている。たとえ
ばＴ、タニグチ等［ネイチャー（１９８３）　、第３０
２巻、第３０５〜３１０頁］及びＲ。

デボス等［ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（１９８
３）　、第１１巻、第４３０７〜４３２３頁］は微生物
におけるヒトＩＬ２１伝子のクローン化及びその発現を
記載しており、ざらにＣ，ジュー等［シレーナル・バイ
オロジカル・ケミストリー（１９８７）、第２６２巻、
第５７２３〜５７３１頁］はＩＬ２の組換誘導体の発現
を１坪でいる。さらに、１１２は不溶性顆粒の状態で微
生物に蓄積する際３個のチオール基を有する還元型で見
出されかつ活性が失われることも知られている［日本国
特許出願Ｊ　Ｐ　１２５７９３１号］。したがって、活
性ＩＬ２を得るためには顆粒中に蓄積した還元型蛋白の
酸化工程を必要とすることが認められているにれを行な
うには、蛋白を変性用媒体中に溶解させた後、復元を必
要とする適当なジスルフィド架橋５８〜１０５の形成を
、調節された酸化媒体中で行なった。たとえば酸素のみ
による酸化（空気中での自己酸化）又は第二銅イオン若
しくはたとえばチオールのような弱酸化剤の存在下での
酸化或いはチオール−ジスルフィド混合物による酸化の
ような種々異なる方法が記載されている［Ｔ、ツジ等、
バイオケミストリー（１９８７）　、第２６巻、第３１
２９〜３１３４頁］。

酸化復元の後、異性体分子内架橋５８〜１０５及び１０
５〜１２５並びに不活性であることが示されかつＡ、ワ
ンプ等［サイエンス（１９８４）　、第２２４巻、第１
４３１〜１４３３頁］又はＪ、Ｌ、ブラウイング等（ア
ナリチカル、バイオケミストリー（１９８６）　、第１
５５巻、第１２３〜１２８頁］にしたがう逆相クロマト
グラフィーにより分離しうる分子内架橋の形成に相当す
る酸化生成物を除去するには、クロマトグラフィーによ
る精製を必要とする。

顆粒の形態で蓄積した蛋白から出発して適当な生物学的
活性を有する均質な酸化組換Ｉｔ２を得るには、したが
って如何なる方法にしたがうにせよ、成る種の技術的問
題を提起する。何枚なら、数段階の精製を必要とし、こ
れは求める生成物の低収率をもたらすからである。

［発明の要点］ 本発明は、新規な還元型の非グＩノコシル化活性組換ヒ
トＩＬ２、並びにＩＬ２の生物学的活性を有する生成物
を得るために再酸化工程を必要としないこの生成物の製
造方法に関するものである。

−面によれば本発明は、一方では次のアミノ酸配列： 並びにこの配列にてＸがメチオニン若しくは水素原子を
示しかつ位置５８．１０５及び１２５における３個のシ
スティンが還元型である対立遺伝子若しくは誘導体を有
し、かつ他方では同じ配列を有すると共に位置５８〜１
０５にジスルフィド架橋を有する酸化型ＩＬ２と同様な
生物学的活性を有する口とを特徴とする非グリコシル化
組換ヒトインクロイキン２に関するものである。

対立遺伝子及び誘導体という用語はシスティン５８．１
０５及び１２５以外の置換、欠失若しくは付加により改
変された１個若しくはそれ以上のアミノ酸の配列を包含
し、その程度はこれら生成物が還元ＩＬ２の特徴である
生物学的活性を保つ程度である。この種の改変を得るこ
とはＡＤＮの組換方法において周知されており、たとえ
ばＲ６Ｆ、ラザー及びＪ、Ｐ、レコダによりジエネテイ
ック・エンジニアリング、アカデミツク・プレス（１９
８３）　、第３１〜５０頁に又はＭ、スミス及びＳ。

ギラムによりジエネティツク・エンジニアリング・プリ
ンシプルス・アンド・メソツズ、プレナム・プレス（１
９８１）　、第３巻、第１〜３２頁に検討された誘導突
然変異技術により行なわれる。還元型という用語は１１
２を含有するシスティン残菊１が遊離スルフヒドリル基
を有するものと理解され、ぞの決定はたとえばジチオジ
ビリジンを一７″オール試薬として用いる分光光度法に
より行なわれる。

本発明に関する還元型の生物学的活性はジスルフィド架
橋５８〜１０５を有する対応の酸化型と同様に決定され
、テトラゾリウム塩での比色試験によりＩＬ２ＣＴＩＬ
−２に応じたネズミの白血病細胞ラインの増殖を測定し
て行なわれる［Ｔ、Ｊ。

モスマン、イミュノロジカル・メソツズ＜１９８３）、
第６５巻、第５５〜６３頁］。

ざらに本発明は、一方では次のアミノ酸配列：並びにこ
の配列にてＸがメチオニン若しくは水素原子を示しかつ
位置５８．１０５及び１２５におりる３個のシスティン
が還元型である対立遺伝子若しくは誘導体を有し、かつ
他方では少なくとも０．５ｘ１０７　Ｕ／ｍｇの生物学
的活性を有することを特徴とする非グリコシル化組換ヒ
１−ＩＬ２にも関１゛る。ＩＬ２活性の単位は、試験に
おいて最大応答の５０％をもたらす量であると規定され
る。ナショナル・キャンサー・インステイチゴート（Ｎ
ＣＩ）により提供される試料［バイオロジカル・リスポ
ンス・モデイフフイヤ・プログラム（ＢＲＭＰ）基準ヒ
ト試薬Ｉ　Ｌ２　　（Ｊｕｒｋａｔ）　Ｊを標準として
使用する。

より正確には本発明は、次のアミノ酸配列：を有し、こ
こでＸがメチオニン若しくは水素原子を示しかつ位置５
８．１０５及び１２５における３個のシスティンが還元
型であり、ざらに天然ヒトＩＬ２と同様な生物学的活性
を示すことを特徴とする非グリコシル化組換ヒトインタ
ロイキン２に関するものである。同様な活性という表現
は、白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞から単離された天然ＩＬ２
の活性と同じ比活性、すなわち１．３Ｘ　１０７　Ｕ／
ｍ（１（標準ＢＲＭＰ）又はこの比活性とは最高２５％
だけ相違する活性であると理解される。本発明に関する
還元型ＩＬ２の配列は、必要に応じこれを発現するたと
えばイー・コリ（大腸菌）のような形質転換された微生
物に応じて追加のＮ−末端メチオニンを有する。本発明
の好適具体例においてはメチオニンを有する配列が好適
であるが、メチオニンを有する産生物とメチオニンを持
たず或いはメチオニンが除去された産生物との混合物も
使用することができる。

他の面によれば本発明は、先ず最初に形質転換された微
生物中に顆粒として蓄積したＩＦ５をケイオトロビック
剤で還元性媒体中にて可溶化させることにより抽出し、
次いで沈澱に続く酸溶出剤での逆相高性能液体クロマト
グラフィーによって精製することからなる上記非グリコ
シル化組換ヒト［−２の製造方法を提供し、この方法は
（ａ）前記クロマトグラフにて溶出された主フラクショ
ンを必要に応じ一２０℃の範囲の淘ｆｆｌまで冷却工程
にかけ、次いで水相を分離し、（ｂ）これを酸媒体で希
釈し、次いで酸媒体中にてさらに逆相高性能液体クロマ
トグラフカラムにてクロマト処理しかつ前記ＩＬ２を分
離することを特徴とする。

高割合の発現のため、たとえばイー・コリのような形質
転換微生物により顆粒の形態で産生される組換ＩＬ２は
、たとえばグアニジン塩の６〜８Ｍ溶液のようなケイオ
トロビツク剤の濃厚溶液により公知方法で可溶化するこ
とができ、次いで好ましくはＣ３、Ｃ４、Ｃ８若しくは
Ｃ１８のようなグラフト化シリカの市販支持体と１〜４
のｐＨ値を有する酸溶出剤とを用いる逆相高性能液体ク
ロマトグラフィー（以下、ＲＰ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃと称す
る）によって精製することかできる。ＩＦ５は、たとえ
ば酢酸若しくはトリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと称す
る）のような有機酸とたとえばアセトニトリルのような
有機溶剤とからなるｙＡ度勾配系によってカラムから）
ｄ出することができる。主フラクション、すなわち２８
０ｎｍにて分光光度法により検出される溶出物が、本発
明による方法の１部を構成する適宜の冷却工程に対する
原料となる。

冷却とは、室温で回収された前記主フラクションを一２
０℃程度の温度を有する環境に置くことを意味し、これ
は固液（水）相の順次の形成を可能にし、その上澄フラ
クションをデカントによって除去することができる。必
要に応じこのようにして分離された水相は、希釈した後
に本発明による方法の１部を構成する下記の酸媒体にお
けるＲＰ−ＨＰＬＣのための原料として役立つ。水相の
希釈は１〜４、好ましくは２〜３のｐＨ値を有する酸媒
体で行なわれる。希釈された水相を、たとえば蛋白につ
き使用するのに適した寸法の細孔（たとえば少なくとも
１５０への直径）を有するグラフト化シリカＣ３、Ｃ４
、Ｃ８若しくは０１Ｂのような市販の支持体を用いて逆
相カラムでクロマト処理する。ＩＦ５の溶出には、水と
混和しうる低級アルコールの濃度を増大させると共に有
Ｉａ酸を含有する濃度勾配を用いる。

特に本発明の方法は、適宜の冷却工程を約０．１％のト
リフルオロ酢酸を含有するアセ１ヘニトリルの水溶液で
行ない、この希釈をたとえばクエン酸のような有機酸の
水溶液で行ない、ざらに前記ｌＮ−２をイソプロパノー
ルと水とたとえばクエン酸のような有機酸とを含有する
溶液で第２クロマトグラフにて溶出させることを特徴と
する。本発明による適宜の冷却工程にかける好適混合物
である約０．１％のＴＥＡを含有するアセトニトリルの
水溶液は、第１クロマトグラフで溶出される主フラクシ
ョンに相当する。より好ましくは、水相の希釈は適宜の
分離の直後に或いは第１クロマトグラフの直後に行なわ
れる。この希釈は、好ましくはたとえば！ｌｌ酸、酢酸
、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸若しくはクエン酸の
ような有機酸を０．５〜２％含有づる少なくとも２倍容
積の水を添加して、より好ましくは０．５％のクエン酸
を含有する約２倍容積の水を添加して行なわれる。本発
明による方法の１部を構成する第２クロマトグラフは、
冷却工程の後に必要に応じ分離されかつ次いで希釈され
た水相を少なくとも１５０人の孔径含有するグラフト化
シリカＣ３、Ｃ４、Ｃ８若しくはＣ１８のような市販の
支持体を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにかけることからなって
いる。好適支持イ本はグラフト化シリカＣ４ＶＹＤＡＣ
３００人であって共有結合によりグラフト化ブチル塞を
有するシリカゲルであり、その孔径は３００人の直径を
有すると共にその粒子は１５〜２０ＪＪＩｎの平均寸法
を有する。本発明の方法に関するＩＬ２の溶出は、たと
えばプロパツール若しくはイソプロパノールのようなア
ルコールとたとえば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、トリフ
ルオロ酢酸若しくはクエン酸のような有＠酸とからなる
濃度勾配系を用いて行なわれる。好適混合物はイソプロ
パノールと水と好ましくは０．５〜２％、より好ましく
は０．５％のクエン酸とで構成され、かつイソプロパノ
ールのｇ度を増大させる濃度勾配系を用い約４８％のイ
ソプロパノールにて低級フラクションを溶出さけ、次い
で約５９％のインプロパツールにより高級フラクション
を溶出させ、後者が還元型の非グリコシル化活性組換ヒ
１ｉＬ２を含む。

さらに本発明の主題は、上記方法で得られる還元型の非
グリコシル化組換ヒトＩＬ２である。

得られる前記フラクションは約０〜−２０°Ｃにて保持
することができ、これらの条件にて安定である。さらに
、減圧下での共沸蒸溜によりイソロバノールを除去する
こともできる。得られた溶液は４℃で保持することがで
き、或いは本発明のＩＬ２を凍結乾燥によって直ちに分
離することもできる。

ざらに本発明は、主フラクションを冷却工程および水相
の分離にかけない変法にも関するものである。

本発明の変法で得られる希釈された主フラクションは＋
４℃で保持することができる。これは安定であり、かつ
本発明による方法の１部を構成する第２クロマトグラフ
イーの原料を構成する。

チオール基を加えた場合、本発明により得られるＩＬ２
は３個の遊離スルフヒドリル基を右しかつＣＴ　Ｌ　Ｌ
　−２ラインの増殖試験にて０．７〜１．３ｘ１０７　
Ｕ／ｍｇの比活性、すなわち天然ＩＬ２と同様な活性を
承り。この活性は、上記還元型の非グリコシル化組換ヒ
トＩＬ２に関する本発明の一面を、天然ＩＬ２と同様に
たとえばＭ、フレクチャー等によりリンホキン・リサー
チ、第６巻（１９８７）　、第４７〜５７真に記載され
た免疫調節活性、並びにその抗腫瘍活性を利用する各種
の指針で薬物として使用することを可能にし、これはた
とえばＴ−リンパ球の増殖、ＮＫ（天然キラー）細胞及
びＬＡＫ（リンホキン活性化キラー）細胞の細胞毒性の
誘発、細胞免疫の復活、免疫不全症の場合の感染に対す
る保護作用、又はワクチンに関するアジュバント作用を
含む。投与は直接性なうことができ、或いはＳ、Ａ、ｒ
コービンベルク等によりニュー・イングランド・ジＶ−
ナル・メディスン（１９８５）　、第３１３巻、第１４
８５〜１４９２真に記載された公認免疫治療法に関する
投与とすることらできる。

天然１１２と同様に、本発明のＩＬ２はそれ自身で或い
はたとえばα−インクフェロン、γ−インノエロン及び
（又は）その仙の治療剤のような他の免疫調節剤と共に
使用することができる。

最後に、本発明の主題は、上記還元型の非グリコシル化
組換ヒトＩＬ２を活性成分として含有する医薬組成物で
ある。この組成物は固体若しくは液体とすることができ
る。本発明のＩＬ２は有用な医薬組成物を製造する公知
方法にしたがって処方することができ、ＩＬ２を医薬上
許容しつる支持ビークルと組合せる。この組成物は、有
効量のＩＬ２とヒトに投与するのに適した適当量のビー
クルとを含有する。この組成物は、減圧下に共沸蒸溜に
よりイソプロパノールを除去した後の本発明ににるＩＬ
２の酸水溶液から出発し、これに水溶性充填剤を添ｈ［
＋　シかつ凍結乾燥して得ることができる。充填剤とは
、混合物を再編成する際に初期ｐＨ値を変化させない水
溶性物質を意味すると理解される。添加しうる充填剤の
例はたとえばグルニ１−ス、リボース、原、（功、マル
トース、トレハロース又はたとえばマニトールのような
還元糖などの糖類である。マユ１〜−ルが好適である。

マニトールは、本発明によるｌＬ２の濃度が０．０５〜
１ｍｇ　／ｒｒｄｌである場合は、投与すべき量に応じ
て１０〜５０ｍｇ／ｍ、好ましくは５０ｍｇ／ｍＩｌの
程１衰の濃度で添加される。酸素の不存在下で無菌状態
にで濾過された溶液を投入フラスコに分割し、かつ凍結
乾燥する。凍結乾燥された混合物は、フラスコ内でて非
経口注射に適した蒸溜水を注入して再編成することがで
きる。

本発明の組成物は、丸薬若しくは連続潅流での静脈内経
路により或いは筋肉内、腹腔内、胸膜内若しくは皮下経
路によって投与することができる。

投与経路及び９８置すべき病気に応じて本発明によるＩ
Ｌ２の有効投与量は、一般に成人若しくは子供において
１ｘ１０６０７Ｍ２　／２４ｈ　〜４０ｘ１０６　ｔＪ
／Ｍ２　／２４ｈの範囲、好ましくは２０Ｘ１０６０７
Ｍ２　／２４ｈの範囲である。ざらに、１日の投り吊は
投与期間に依存し、上記投与量のみに限定されない。

詳細には還元型の非グリコシル化、ｉ′Ｉ］換ヒ１〜Ｉ
ｍ２と水とたとえばクエン酸のような有機酸とを含有づ
ることを特徴とする。この種の組成物は本発明による凍
結乾燥された医薬組成物から出発してこれを）Ｗ流の際
に活性成分の安定性に奇与するたとえばグルコースのよ
うな適す゛るビークルの存在下に溶解させて得ることが
できる。好適条イ′１は蒸溜水の注入により再編成され
た凍結乾燥ａＮ合物をり再編成された凍結乾燥混合物を
、投与プへき星に適するよう決定された所定容積のグル
コース（たとえば５０ｍＭ、ｍの濃度）を含有する潅流
用ポケットに導入して希釈することからなっている。

上記した全ての引例を本明細書中に参考のため引用する
。

［実施例］ 以下、限定はしないが実施例により本発明を説例　１：
顆粒から出発覆る還元型の生物活性ｒ゛天然Ｌ２の］−
ド配列を有するプラスミドにより形質転換されかつ細胞
の内部に顆粒としてＩＬ２を蓄積しうるイー・］り菌株
の培養物を遠心分離することにより、たとえば王、ザト
ー等、ジャーナル・バイオケミス１〜リ−（１９８７）
　、第１０１巻、第５２５〜５３４頁に記載されたよう
に顆粒を得た。ＩＯＮの醗酵装置からこのように得られ
た菌体を、マントン・ガラリン・ホモゲナイザーにて破
砕処理にかけた。分離されかつ洗浄された細胞残漬（９
０〜１７０ｇの湿潤重量〉から出発し、ＩＬ２を８Ｍグ
アニジン塩酸塩（Ｇｕ−ＨＣｊ）と１００ｍＭジチオス
レイトール（ＤＤＴ）とを含有すル２，５容量のトリス
ｔＭ　９ｒ液（１−Ｉ　ＣＥ　２０ｍ）ｌ、　Ｄ　ｌ−
１８）に溶解した。溶解させた晴のＩＬ２　　（１，５
〜２．５（Ｊ　）を、ＣｄＶＹＤＡＣカラム（０，４６
ｘ１５ｃｍ、３００人、５柳）にて２／、／ｍｉｎの流
速で０．１％の工ＦＡを含有するアセトニ！〜リルの線
状潤度勾配（３０〜７０％、１０ｍ１ｎ　）を用いて２
８０ｎｍ若しくは２１０ｎｍにおける分光光暦法検出で
の分析ＲＰ　−１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより推定し、ここ
でピークの表面を標準ＩＬ２で検量した後に２８０ｎｍ
にて評価した（第１ａ図及び第１ｂ図）。、次いで、Ｇ
ｕ・ＨＣｌの濃度をＤＤＴの存在下に２Ｍまで低下させ
ることにより、ＩＬ２を沈澱させた。上澄液につき５．
０未満のＤＨ値が得られるまで０．１％のＴＦＡの水溶
液で沈澱物を洗浄した後、ＩＬ２を２０％のアセトニト
リルと０１１％のＴＥＡとの水溶液に溶解させた。分析
ＲＰ−１−ＩＰＬＣ（第２図）にしたがい８５％より多
い還元型ＩＬ２の含有量を有する得られた「再溶解物」
は、０．０１　ｘ１０７　Ｕ／ｌｌｌＣｌ未満の還元型
ＩＬ２の生物学的活性を有し、かつ還元型ＩＬ２におけ
る２、８５３Ｈ１モルのスルフヒドリル基の含有量を有
した。分析ＲＰ−ＨＰ　Ｌ　Ｃにより推定して約２００
ｍｇのｌ　１−２　ニ相当する得られた溶液の１フラク
シヨンを、１０％未満のアセミル二１〜リルの温度に調
節するよう０，１％の丁ＦＡで希釈し、次いでＣ４ＶＹ
ＤＡＣカラム（５，７Ｘ３０ＣＩｎ）に加えた。１１．
−２を、０．１％のＴＦＡを含有するアセ１−二！・リ
ルの線状温度勾配（３０〜８０％、４（１ｍｉｎ　）に
より約６０％のアセトニトリル中の温度にて１００ｍ１
／ｍｉｎの流速で溶出させ、２８０ｎｍにて分光光度法
により主ピークを検出しかつＲＰ−ＨＰ　Ｌ　Ｃにより
分析した。還元型ＩＬ２を含有りる回収された「主フラ
クション」を次いで室温から一り０℃±１°Ｃに芋る低
速冷却工程にかけ、これはアセトニトリル中に濃縮され
た上相の＠機相をデカントにより除去することを可能に
した。水が多くかつＩＬ２を含有する下相は、凍結状態
に保持することができる。解凍した後、２倍容積の０．
５％クエン酸水溶液で希釈した後に得られた溶液をＣ４
ＶＹＤＡＣカラム（５，７Ｘ３０ｃｍ）に加え、これを
０．５％のクエン酸を含有するイソフｏハ／−／Ｌ／（
７）線状ａ度勾配（２０〜７０％、４０　ｍ１ｎ）にて
５０ｍ／ｍｉｎの流速で展開した。流出液を２８０ｎｍ
で分光光度測定し、約４８％のイソプロパノール中の）
間層（フラクションｒ４８Ｊ）における少量ピークと約
５９％イソプ「１パノールの温度（フラクションｒ５９
Ｊ　）における多早ピークとの順次の溶出を示した（第
３図）。フラクション［５９１を回収した。これは、０
℃にて空気から保護しながら少なくとも２４時間保持し
た際に安定であった。

減圧下に共沸蒸溜によりイソプロパノールを除去した後
、「５９」フラクションを分析ＲＰＨＰ　Ｌ　Ｃで分析
して約６０％のアセトニトリルで溶出された均質ピーク
（第４図）を与えたのに対し、基準酸化型ＩＬ２は約５
７％のアセトニトリルで溶出された（第１ｂ図）。イン
プロパツールを除去した後に１　ｍＱ／ｍ１より高いＩ
Ｌ２の濃度と３±０．５のｐ　ｌ−１値とを有する「５
９」フラクションは、空気から保護して＋４℃にて少な
くとも１週間にわたり保持することができ、或いは直ち
に凍結乾燥し又は処方して医薬組成物を１ｑることがで
きる。

凍結乾燥された「５９」フラクションは、細胞ＣＴｉ１
−２の増殖に関するインビトロ試験にしたがい生物学的
活性にて投与することができ、かつ天然ＩＬ２と同様な
１．３±０．５ｘ１０７　Ｕ／ｍｇの比活性を有り−る
。

ジチオジピリジンでの比色測定法により決定される凍結
乾燥［５９」フラクションのｊカ離スルフヒドリル塁の
含有量は２．９４　ＳＨ／−Ｅルであって、酸化型阜準
■Ｌ２の０．７６ＳＨ／’Ｅルと対比される。

分析ＲＰ−１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより測定して１５０〜
３００ｍｇの３個のＳＨ基を有し、生物学的活性であり
、ＲＰ−ＨＰＬＣにて均質である還元型ｒ−ｈＩＬ２が
、１０テの醗酵装置から出発して「５９」フラクション
で得られたく第５図の手順にしたがう）。

例　２：生　学的活性の還元型ｒ−ＩＬ２の精製手順は
例１にあけると同様であるが、ただし「主フラクション
」を冷却工程に続くデカントによる分離にかけず、２倍
容積の０，５％クエン酸水溶液により直ちに希釈した。

「５９」フラクションを回収しかつ例１と同様に処理し
た。

例　３：生物学的活性の還元型ｒ　−ｈＩ　ｌ　２の牛
化学的特性化 例１の「５９」フラクションにおける本発明で得られた
還元型ｒ−ｈＩＬ２を次の性質につき検査した： （１）均質性 ＳＤＳ　　ＰＡＧＥ電気泳動を、１０％のＳＤＳを含有
する２相のゲル（それぞれ５％及び１５％のアクリルア
ミド有する濃縮ゲル及び移動ゲル）にて行なった。試料
を先ず３％のＳＤＳ及び５％のメルカプトエタノールと
共に緩衝剤中で１００℃にて２分間加熱した。１％のＳ
ＤＳにて緩衝剤による移動を銀での発色によって追跡し
、これは９９％より高いＭ！度の沈着物２μ９に相当す
る単一バンドを示した（第６図）。

（２）電気法　による分子量 還元媒体において、約１５Ｋ　ｄの見掛ＭＷが決定され
、計痺されたＭＷによれば１５４２０であったく第６図
）。

〈３）Ｚ且Ｚ敢四Ｉ感 水０．５ｄ中に本発明の還元型ｒ−ｔ１１Ｌ２の２５ｕ
ｇを含有する試料をガラス加水分解デユープに入れ、こ
れに０．５ｍｌの濃塩酸を３１．７％のＴ「△及び４，
８％のヂオグリコール酸と共に添加した。このチ：ｌ−
ブを減圧下で密封し、次いで加水分解を１５５℃にて４
０分間行なった。次いで、加水分解物を減圧下に蒸発乾
固させた。残留物を０．７７のクエン酸緩衝液ｐＨ＝　
３に溶解させ、次いでこれをクエン酸緩衝液におけるｐ
　Ｈ勾配（３〜５）及び塩化プトリウム（Ｏ〜ｒｏｇ　
／　ｅ　）により６０℃にて０、５ｄ／　ｍｉｎの流速
でインターアクションＡＡ５１１カラム（０，４６ｘ１
５ｃｍ）にてアミノ酸分析にかけ、かつカラム出口でオ
ルトフタルアルデヒドによる誘導化の後に蛍光により検
出した。その結果を第１表に示す。数値は、それぞれ２
反復の加水分解物及び２反復のクロマトグラフにつき得
られた平均値である。組成は、追加Ｎ−末端メチオニン
を有する天然ＩＬ２の組成と一致した。

第１表 インタロイキン２ 第１表（続き） インタロイキン２ ＧＬＮ十ＧＩＬＪ ＡＳＮ＋ＡＳＰ ＨＲ ＥＲ ＲＯ ＬＹ ＬＡ ＡＬ ＥＴ ＬＥ ＥＵ ＹＲ Ｐ　）−Ｉ　Ｅ 　Ｒ　Ｐ 　ＹＳ トＩ　Ｉ　Ｓ １７、５６ １２、６１ １２、０９ ７、０５ ＮＤ＊ ２、５９ ５、５０ ４、３４ ５、５９ ９、１５ １９、９６ ２、６０ ５、９０ ｘ　Ｃ＊　＊ １０、１９ ３、４８ Ａ　１マ　Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４　　　　　　　　　　　　５．２９ＣＹＳ　　　　　
　　３　　　　　ＮＣ”＊ＮＤ＝検出せず ＊＊ＮＣ＝計算せず （４）Ｎ−末端アミノ酸の配列 エドマン自動減成法を用いるミクロ配列決定により、Ｎ
−末端配列を確認した。ＨＰＬＣ　１２０Ａと組合せた
気相ミクロ配列決定アプライド・バイオシステムス４７
０Ａにお（プる本発明による１５μ９の生物学的活性の
還元型ｒ−ｔｌｌＬ２の分析は、次のＰＴＩ〜１アミノ
酸を同定することができた：段階 ＰＴＨＡＡ 段階 ＰＴ　　ト（ＡＡ ｅｔ ｌａ １ａ ｐｒ。

ｐｒ。

ｈｒ ｈｒ ｅｒ ｅｒ ｅｒ ｅｒ ｈｒ ｙｓ ＶＳ ｈｒ （３Ｉ　ｎ −ｅｕ ｌｎ −ｅｕ ＩＬ１ １−（ｉｓ １、、−　ｅ　ｕ −ｅｕ −ｅｕ ２０個のＮ−末端残基の配列は、天然ＩＬ２の理論的結
合順序と一致した。メヂオニンを含まないＩＬ２の約１
０％が観察された。

（５）　化シアノーゲンによるペプチド特性図本発明に
よる７００μ９の還元型ＩＬ２残留物（約５３ノナモル
）を、７０％の蟻Ｍ４ｒｄに溶解させかつ５．６ｍｇの
臭化シアノグンを添加した。この溶液を室温にて１晩撹
拌し、水で希釈し、次いで凍結乾燥した。反応性混合物
をウボンダパックＣｌ８ＲＰカラム（０，４８ｘ２０ｃ
ｍ）におけるＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、その際０
．１％のＴＥＡを含有する０〜７０％の範囲で変化する
アセトニトリルの濃度勾配を用いると共に、１ｒＩｉｉ
／ｗｉｎの流速及び室温を用い、かつ２２０ｎｍにて分
光光度法で検出を行なった。還元型ｒ−ｈｌＬ２のペプ
チド特性図（第７ａ図）は基準酸化型［−２（第７ｂ図
）とは異なる断片化を示した。

（６）旦胆旦負■ 円形二色性スペクトル（ＣＤ）を、ジョビン・イボン・
マークＶスペクトログラフにより室温で決定した。還元
型ｒ−ｈｌＬ２の試料を、例１にお【プる０、５％クエ
ン酸の代りに０．１％の蟻酸を用いたイソプロパノール
の直線濃度勾配にて行なったＲＰ−ＨＰＬＣの後に凍結
乾燥し、次いでイソプロパノールを蒸溜しかつ凍結乾燥
させ、１ｍｇ／ｍｌの濃度にて酢酸中に溶解させた。使
用した容器はペプチド領域（１８５〜２５０ｎｍ　）及
び芳香族領域（２６０〜３２０ｎｍ　）につきそれぞれ
０．０１ｃｍ及び０、５ｃｍとした。溶剤スペクトルを
、各試料につきＩＬ２のスペクトルから引綽した。その
結果をエリプティシチー〇にて示す（Ｉ　Ｌ２の残留物
当りの平均重量＝　１１６）。

第８ａ図は遠紫外におけるＣＤスペクトルを示す。本発
明による還元型の生物学的活性ｒ−ｈＴＬ２は、規則的
二次構造の存在を示ずスペクトルを有した。αヘリツク
２％の測定は、酸化型基準ＩＬ２に対し殆んど有意の差
を示さなかった（％αへワックス＝５０％）。

第８ｂ図は近紫外におけるＣＤスペクトルを示す。酸化
型基準ＩＬ２は芳香族残留物につき不整環境を示す有意
のＤＣを示すのに対し、本発明の還元型ｒ−ｈＩＬ２は
殆んど有意でない異なるＣＤを示した。

例　４：生物学的活性ノ１ 本発明による還元’Ｊ　ｒ　　Ｆ）Ｉ　Ｌ−２の生物学
的効果をインビトロ若しくはエキソビボの実験で評価し
　Ｉこ　。

（１）ヒト細胞に対するインビト日活 ａ、リンパ芽球形貿転換試験 ＩＬ２の生物学的測定を可能にするＣＴＩＬ−２のよう
なネズミの細胞ラインに対する増殖活性の他に、本発明
の還元型ｒ−ｈＩＬ２は投与但に応じて有糸分裂作用を
も示し、これはＡＤＮにてトリチウム化チミジンの組込
みの測定により示される正常な循環ヒトリンパ球につき
酸化型基準ＩＬ２によって示される作用と同様である（
第９図）。

ｂ、単核細胞の細胞毒性の誘発 この試験はＩＬ２の存在下に培養されたヒト循環単核細
胞につき行ない、ぞの細胞毒性作用をそれぞれ腫瘍標的
細胞と赤白面病ラインに５６２（ＮＫ細胞に対し感受性
）と８リンホームから誘導されたＤＡＵＤＩライン（Ｎ
Ｋ細胞に対し耐性）につき決定し、その際Ｃｒ５１の塩
析を４時間で測定した。１０６個の細胞当りの細胞溶解
単位（Ｕｌ−／１ｏ６）で現す結果は、本発明の還元型
ｒ−ｈｌＬ２が投与量に応じてＮＫの活性を増大し或い
は腫瘍標的細胞に関するＴリンパ球の細胞毒性を誘発す
る能力をそれぞれ天然ＩＬ２につぎ知られたと同様に有
することを示した（第１０図）正常なりａ　ｌ　ｂ／ｃ
及びＭＲＬ＋／＋ネズミにおいて、最適量以下（１００
〜３０００Ｕ　）にて組＠Ｔインタフェロンをラッ］へ
に順次に腹腔内注射し、次いで２４時間後に本発明の還
元型ｒ’−ｔｌＩＬ２を注射すると、食細胞の酸化メカ
ニズム（ホルボールエステル（（ＤＭＡ）の存在下に化
学発光を測定して評価される）、すなわち［Ｌ２を注射
してから２４時間後に殺したネズミの腹腔から除去され
た細胞の酸化メカニズムが発生する。投！−ｊ＠に応じ
たこの作用は、酸化型基準ＩＬ２につぎ児られるものと
同様であった。

結果 注射量 （ネズミ１匹 当りの「）ｇ） ｒ−ｈＩＬ２を注射した後の 化学発光（ＣＰＭｘ１０４） 還元型　　　　　酸化型 ５±２ ７±３ ９０±５ １３０±１０ ３５０±５０ ７１０±２０ ３７５±２５ ４±３ ５±１ ７１±５ １４０±７０ ４００±７０ ６９５±２５ ３５０±２０ イソプロパノールが減圧下での共沸蒸溜により除去され
た本発明の「５９」フラクションに相当する還元型ｒ　
−ｈ　Ｉ　ｌ−，２の水溶液を、脱ガスされかつ窒素飽
和されたマニトールの水溶液で１０（）μ９／ｎ認の還
元型ＩＬ２及び５０ｍｇ／ｍのマニトールの３７１合Ｃ
ごて即席希釈した。０．２２　μの肱で濾過し、フラス
コ内に１威を無菌分配しかつ凍結乾燥した後、フラスコ
−内容物を窒素雰囲気下で密栓しかつ使用するまで＋４
°Ｃの温度に保持した。

例　６：連続）＃流による医薬組成物 減圧下での共沸蒸溜によりイソプロパノールが除去され
た本発明の「５９」フラクションに相当する還元型ｒ−
ｈＩＬ２の水溶液を、脱ガスされかつ窒素飽和されたマ
ニトールの水溶液で５００μ９／ｄの還元型ＩＬ２及び
５０ｍＭＩｎｆｌのマニトールの割合にて即席希釈した
。０．２２の膜で濾過し、１ｄをフラスコに無菌分配し
かつ凍結乾燥した俊、フラスコ内容物を窒素雰囲気上で
密栓しかつ使用刃゛るまで４℃の温度に保持した。次い
で、各フラスコの内容物を１ｍｌの無菌蒸溜水の注入に
より溶解させた。７本のフラスコに相当する溶液（約３
り、１６６単位）を、５％潅流にあけるトラベノール（
登録商標）グルー」−スのだめの溶液５００ｍ１を含有
するビアフレックス（登録商標）容器（こ導入した。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は例１の８Ｍグアニジンにお【プる粗抽出物の
ＲＰ−ＨＰＬＣの分析クロマトグラムを示す特性曲線図
であり、 第１ｂ図は標準の還元型及び酸化型におけるＲＰ−ＨＰ
ＬＣの分析クロマトグラムを示ず特性曲線図であり、 第２図は例１における「再可溶化」のＲＰＨＰＬＣの分
析クロマトグラムであり、第３図は例１の冷却工程後に
おけるＥ主フラクション」のＲＰ　−１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　
Ｃのクロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第４図は例１にあけるフラクション「５９」のＲＰ−Ｈ
ＰＬｃの分析クロマトグラムを示す特性曲線図であり、 第５図は例１の精製工程図であり、 第６図は例２の５ＤＣ−ＰＡＧＥ電気泳動図であり、 第７ａ図及び第７ｂ図は例２のペプチドの特性曲線図で
あり、 第８ａ図及び第８ｂ図は例２のＤＣ曲線図であり、 第９図は例３におけるヒトリンパ球に対する有糸分裂作
用の曲線図であり、 第１０図はラインに５６２及びＤＡｔＪＤＩにつき得ら
れた毒性曲線図である。 第２図 醗酵 抽出 第５ 図 第６図 １−遺尤−ｒ−ｈｒＬ２ ２−今子量根曵 第９図 第８ｂ図 Ｑ ＋００ ＋０００ １シメ一口イキ、２ ＩＵ／ｍｌ 第１θ図

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）一方では次のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 並びにこの配列にてＸがメチオニン若しくは水素原子を
   示しかつ位置５８、１０５及び１２５における３個のシ
   ステインが還元型である対立遺伝子若しくは誘導体を有
   し、かつ他方では同じ配列を有すると共に位置５８〜１
   ０５にジスルフィド架橋を有する酸化型ＩＬ＿２と同様
   な生物学的活性を有することを特徴とする非グリコシル
   化組換ヒトインタロイキン２。
2. （２）一方では次のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 並びにこの配列にてＸがメチオニン若しくは水素原子を
   示しかつ位置５８、１０５及び１２５における３個のシ
   ステインが還元型である対立遺伝子若しくは誘導体を有
   し、かつ他方では少なくとも０．５×１０＾７Ｕ／ｍｇ
   の生物学的活性を有することを特徴とする非グリコシル
   化組換ヒトインタロイキン２。
3. （３）次のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を有し、ここでＸがメチオニン若しくは水素原子を示し
   かつ位置５８、１０５及び１２５における３個のシステ
   インが還元型であり、さらに天然ヒトＩＬ＿２と同様な
   生物学的活性を示すことを特徴とする非グリコシル化組
   換ヒトインタロイキン２。
4. （４）先ず最初に、形質転換された微生物中に顆粒とし
   て蓄積したＩＬ＿２をケイオトロピツク剤で還元性媒体
   中にて可溶化させることにより抽出し、次いで沈澱に続
   く酸溶出剤での逆相高性能液体クロマトグラフィーによ
   つて精製することからなる請求項１〜３のいずれか一項
   に記載の非グリコシル化組換ヒトＩＬ＿２の製造方法に
   おいて、 （ａ）前記クロマトグラフィーから溶出された主フラク
   シヨンを必要に応じ−２０℃程度の温度まで冷却工程に
   かけ、次いで水相を分離し、（ｂ）これを酸媒体で希釈
   し、次いで酸媒体中にてさらに逆相高性能液体クロマト
   グラフカラムでクロマト処理し、かつ前記ＩＬ＿２を分
   離する ことを特徴とする非グリコシル化組換ヒト ＩＬ＿２の製造方法。
5. （５）冷却工程を０．１％のトリフルオロ酢酸を含有す
   るアセトニトリルの水溶液中で行ない、希釈をたとえば
   クエン酸のような有機酸で行ない、かつ前記ＩＬ＿２を
   イソプロパノールと水とたとえばクエン酸のような有機
   酸との溶液により第２クロマトグラフで溶出させること
   を特徴とする請求項４記載の方法。
6. （６）主フラクシヨンを冷却工程及び水相の分離にかけ
   ないことを特徴とする請求項４又は５記載の方法。
7. （７）請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法により
   得られる還元型の非グリコシル化組換ヒトＩＬ＿２。
8. （８）薬物として使用するための、請求項１〜３又は７
   のいずれか一項に記載の還元型の非グリコシル化組換ヒ
   トＩＬ＿２。
9. （９）活性成分として請求項８記載の還元型の非グリコ
   シル化組換ヒトＩＬ＿２を含有することを特徴とする医
   薬組成物。
10. （１０）請求項８記載の還元型の非グリコシル化組換ヒ
    トＩＬ＿２と水とたとえばクエン酸のような有機酸とを
    含有することを特徴とする医薬組成物。