JP2599903B2 - Ｉｌ−２の回収及び精製方法 - Google Patents
Ｉｌ−２の回収及び精製方法Info
- Publication number
- JP2599903B2 JP2599903B2 JP60062195A JP6219585A JP2599903B2 JP 2599903 B2 JP2599903 B2 JP 2599903B2 JP 60062195 A JP60062195 A JP 60062195A JP 6219585 A JP6219585 A JP 6219585A JP 2599903 B2 JP2599903 B2 JP 2599903B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- sds
- butanol
- gel filtration
- agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は生化学工学の分野に属す。さらに詳しく
は、この発明は、インターロイキン−２（IL−２）を産
生するために形質転換させられた微生物からIL−２を分
離しまたは回収する生化学的分離又は回収の方法に関す
るものである。
は、この発明は、インターロイキン−２（IL−２）を産
生するために形質転換させられた微生物からIL−２を分
離しまたは回収する生化学的分離又は回収の方法に関す
るものである。
天然のヒトIL−２は、抗原、マイトジン、及び同種抗
原により刺激された赤血球ロゼット陽性Ｔ細胞によって
産生される抗原−非特異な、遺伝的に制限されない可溶
性因子である。それは公表された分子量約13,000〜17,0
00ダイトン〔S.ギルそしてJ.ワトソン，ジャーナル オ
ブ イクスペリメンタル メソッド（S.Gillis and J.W
atson,J Exp Med）（1980）159:1709〕及び約pH6〜8.5
の範囲等電点を有するタンパク質である。ヒトIL−２
は、人間の末梢血液単核細胞又はマウス胞腺細胞の増殖
反応を高める事、細胞，寄生体，菌類，原生動物，及び
ビールスなどの感染に対するヒト及び動物の免疫反応を
高める事、並びに絶え間ないＴ−細胞系ほ増殖を支持す
る事などを含む多くのイン−ビトロ及びイン−ビボ効果
をもっている。
原により刺激された赤血球ロゼット陽性Ｔ細胞によって
産生される抗原−非特異な、遺伝的に制限されない可溶
性因子である。それは公表された分子量約13,000〜17,0
00ダイトン〔S.ギルそしてJ.ワトソン，ジャーナル オ
ブ イクスペリメンタル メソッド（S.Gillis and J.W
atson,J Exp Med）（1980）159:1709〕及び約pH6〜8.5
の範囲等電点を有するタンパク質である。ヒトIL−２
は、人間の末梢血液単核細胞又はマウス胞腺細胞の増殖
反応を高める事、細胞，寄生体，菌類，原生動物，及び
ビールスなどの感染に対するヒト及び動物の免疫反応を
高める事、並びに絶え間ないＴ−細胞系ほ増殖を支持す
る事などを含む多くのイン−ビトロ及びイン−ビボ効果
をもっている。
アミノ酸125位のシステイン残基がセリンに置き換え
られておりそして／又は最初のアラニンが取り除かれて
いるIL−２、及びIL−２ムテイン（Muteins）は遺伝子
工学技法によって微生物的に製造されている。微生物的
に産生されたIL−２はグリコシル化されておらず、そし
て微生物によって還元された状態で産生される。精製さ
れそして酸化された時、これらの微生物的に産生された
IL−２及びIL−２ムテインは天然のヒトIL−２に匹敵す
る活性を現す。
られておりそして／又は最初のアラニンが取り除かれて
いるIL−２、及びIL−２ムテイン（Muteins）は遺伝子
工学技法によって微生物的に製造されている。微生物的
に産生されたIL−２はグリコシル化されておらず、そし
て微生物によって還元された状態で産生される。精製さ
れそして酸化された時、これらの微生物的に産生された
IL−２及びIL−２ムテインは天然のヒトIL−２に匹敵す
る活性を現す。
Ｔ細胞から天然のIL−２を精製するための方法は次の
ような出版物に詳述されている；ワトソン,J,等，ジャ
ーナル オブ イクスメンタル メソド（J Exp Med）
（1979）150:849−861;ギル,S.,等，ジャーナル オブ
イミュノロジイ（J Immunology）（1980）124:1954−
1962;モチヅキ,D.Y.,等，ジャーナル オブ イミュノ
ロジカル メソド（J Immun Meth）（1980）39:185−20
1;ウエルト,K.等，ジャーナル オブ イクスペリメン
タル メソド（J Exp Med）（1982）156:454−464;及び
ヨーロッパ特許出願83103582.9（1983年の10月26日に第
92163号として公表された）及び83400937.3（1983年11
月16日に第94317号として公表された）。一般的に、こ
れらの方法は、硫酸アンモニウムにより培養上清液から
タンパク質を沈殿させそれからクロマトグラフィック分
別することを含んでいる。
ような出版物に詳述されている；ワトソン,J,等，ジャ
ーナル オブ イクスメンタル メソド（J Exp Med）
（1979）150:849−861;ギル,S.,等，ジャーナル オブ
イミュノロジイ（J Immunology）（1980）124:1954−
1962;モチヅキ,D.Y.,等，ジャーナル オブ イミュノ
ロジカル メソド（J Immun Meth）（1980）39:185−20
1;ウエルト,K.等，ジャーナル オブ イクスペリメン
タル メソド（J Exp Med）（1982）156:454−464;及び
ヨーロッパ特許出願83103582.9（1983年の10月26日に第
92163号として公表された）及び83400937.3（1983年11
月16日に第94317号として公表された）。一般的に、こ
れらの方法は、硫酸アンモニウムにより培養上清液から
タンパク質を沈殿させそれからクロマトグラフィック分
別することを含んでいる。
1984年５月22日に発行された米国特許第4,450,103号
及びダーイング,R.等，ネイチュア（Nature）（1980）2
87:193−197にはIFN−β生産性E.コライ（E.Coli）から
IFN−βを回収する為の方法が詳述されている。前記特
許はIFN−βを２−ブタノール又は２−メチル−２−ブ
タノールにより細胞物質から抽出する方法を詳述してい
る。
及びダーイング,R.等，ネイチュア（Nature）（1980）2
87:193−197にはIFN−β生産性E.コライ（E.Coli）から
IFN−βを回収する為の方法が詳述されている。前記特
許はIFN−βを２−ブタノール又は２−メチル−２−ブ
タノールにより細胞物質から抽出する方法を詳述してい
る。
この発明は次のような段階によって特徴づけられた,I
L−２−生産性微生物からIL−２を回収する為の方法で
ある。
L−２−生産性微生物からIL−２を回収する為の方法で
ある。
（ａ） 微生物の細胞膜を破壊； （ｂ） ケイオトロピック剤の水性溶液による破壊物の
抽出； （ｃ） IL−２と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤
の水溶液（この溶液は還元剤に含有する）による、抽出
混合物の固相中のIL−２の可溶化；及び （ｄ） 還元剤の存在下での（ｃ）で得られる溶液から
のIL−２の分離。
抽出； （ｃ） IL−２と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤
の水溶液（この溶液は還元剤に含有する）による、抽出
混合物の固相中のIL−２の可溶化；及び （ｄ） 還元剤の存在下での（ｃ）で得られる溶液から
のIL−２の分離。
この方法の好ましい態様において、ケイオトロピック
剤は抽出混合物中約3.5M〜約4.5Mの濃度の尿素であり、
可溶化剤はドデシル硫酸ナトリウム（SDS）又はナトリ
ウムラウリルサルコシン（サルコシン）であり、可溶化
されたIL−２は２−ブタノール又は２−メチル−２−ブ
タノールによりさらに抽出されそして最終分離はゲル
過によって行なわれ、そして得られたサイズ画分された
生成物は酸化され、そして酸化された生成物は逆相高速
液体クロマトグラフィ（RP−HPLC）によって精製され
る。
剤は抽出混合物中約3.5M〜約4.5Mの濃度の尿素であり、
可溶化剤はドデシル硫酸ナトリウム（SDS）又はナトリ
ウムラウリルサルコシン（サルコシン）であり、可溶化
されたIL−２は２−ブタノール又は２−メチル−２−ブ
タノールによりさらに抽出されそして最終分離はゲル
過によって行なわれ、そして得られたサイズ画分された
生成物は酸化され、そして酸化された生成物は逆相高速
液体クロマトグラフィ（RP−HPLC）によって精製され
る。
この明細書において“IL−2"という語は（ａ）天然ヒ
トのインターロイキン−２の遺伝子により、又は、天然
のヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列と少なくと
も実質的に同一であるようなアミノ酸配列をもつタンパ
ク質をコードするヒトインターリュウキン−２遺伝子の
変形体により形質転換させられた微生物によって産生さ
れ、そして、（ｂ）天然のヒトインターロイキン−２と
共通の生物学的活性をもつグリコシルされていないタン
パク質を意味する。アミノ酸配列の典型的な同一とは、
配列が同一であるか又は合成タンパク質と天然ヒトイン
ターロイキン−２との間に不都合な機能的相違を惹起し
ない１個もしくは複数個のアミノ酸変化（欠失，付加，
置換）によって異なっていることを意味する。そのよう
なタンパク質の例は1983年２月３日に出願されたヨーロ
ッパ特許出願83101035・０（1983年10月19日に公開第91
539号として公表）の中に、及び1982年12月22日に出願
されたヨーロッパ特許出願82307036.2（1983年９月14日
に第88195号として公開）の中に詳述されているIL−２
であり、1983年10月13日出願されたヨーロッパ特許出願
83306221.9（1984年５月30日第109748号として公表）の
中に詳述されているIL−２であり、そしてこの出願の例
の中で詳述されているIL−２である。
トのインターロイキン−２の遺伝子により、又は、天然
のヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列と少なくと
も実質的に同一であるようなアミノ酸配列をもつタンパ
ク質をコードするヒトインターリュウキン−２遺伝子の
変形体により形質転換させられた微生物によって産生さ
れ、そして、（ｂ）天然のヒトインターロイキン−２と
共通の生物学的活性をもつグリコシルされていないタン
パク質を意味する。アミノ酸配列の典型的な同一とは、
配列が同一であるか又は合成タンパク質と天然ヒトイン
ターロイキン−２との間に不都合な機能的相違を惹起し
ない１個もしくは複数個のアミノ酸変化（欠失，付加，
置換）によって異なっていることを意味する。そのよう
なタンパク質の例は1983年２月３日に出願されたヨーロ
ッパ特許出願83101035・０（1983年10月19日に公開第91
539号として公表）の中に、及び1982年12月22日に出願
されたヨーロッパ特許出願82307036.2（1983年９月14日
に第88195号として公開）の中に詳述されているIL−２
であり、1983年10月13日出願されたヨーロッパ特許出願
83306221.9（1984年５月30日第109748号として公表）の
中に詳述されているIL−２であり、そしてこの出願の例
の中で詳述されているIL−２である。
この明細書において“形質転換させられた微生物”と
いう語は天然のヒトインターロイキン−２活性をもつタ
ンパク質を産生するために遺伝学的に処理される微生物
という意味である。形質転換された微生物の例は前記の
ヨーロッパ特許出願88195,91539,及び109748並びにこの
出願の例に詳述されている。細胞はIL−２を生成する為
の好ましい微生物である。合成IL−２はまた適切に形質
転換した酵母又は哺乳動物細胞によっても作られる。E.
コライが特別に好ましい。
いう語は天然のヒトインターロイキン−２活性をもつタ
ンパク質を産生するために遺伝学的に処理される微生物
という意味である。形質転換された微生物の例は前記の
ヨーロッパ特許出願88195,91539,及び109748並びにこの
出願の例に詳述されている。細胞はIL−２を生成する為
の好ましい微生物である。合成IL−２はまた適切に形質
転換した酵母又は哺乳動物細胞によっても作られる。E.
コライが特別に好ましい。
形質転換された微生物は、適切な増殖培地の中で、典
型的には680nmにおいて少なくとも約30の光学濃度（O
D）へ、そして好ましくは680nmにおいて約20〜40の間の
ODへ増殖する。増殖培地の組成は用いられる特定の微生
物に依存するだろう。培地は、微生物の栄養要求を満た
す化合物を含むような水性培地である。増殖培地は、炭
素又は窒素、エネルギー源、マグネシウム、カリウム及
びナトリウムイオン並びに場合によってはアミノ酸及び
プリン及びピリミジン塩基などを典型的に含んでいるだ
ろう。〔リィビュウ オブ メディカル バイオロジイ
（Rewiew of Medical Biology），ラング メディカル
ハブリケーション，第14版80−95頁（1980.）を参照
のこと〕。trp−プロモーターを用いる発現ベクターに
おいては、培地中のトリプトファン濃度は、IL−２の発
現が望まれる時点で制限的になるよう、注意して制御さ
れている。E.コライの為の増殖培地は当業界においてよ
く知られている。
型的には680nmにおいて少なくとも約30の光学濃度（O
D）へ、そして好ましくは680nmにおいて約20〜40の間の
ODへ増殖する。増殖培地の組成は用いられる特定の微生
物に依存するだろう。培地は、微生物の栄養要求を満た
す化合物を含むような水性培地である。増殖培地は、炭
素又は窒素、エネルギー源、マグネシウム、カリウム及
びナトリウムイオン並びに場合によってはアミノ酸及び
プリン及びピリミジン塩基などを典型的に含んでいるだ
ろう。〔リィビュウ オブ メディカル バイオロジイ
（Rewiew of Medical Biology），ラング メディカル
ハブリケーション，第14版80−95頁（1980.）を参照
のこと〕。trp−プロモーターを用いる発現ベクターに
おいては、培地中のトリプトファン濃度は、IL−２の発
現が望まれる時点で制限的になるよう、注意して制御さ
れている。E.コライの為の増殖培地は当業界においてよ
く知られている。
培養物から細胞を収得した後、もし必要ならば、
過、遠心分離、又は他の常用の方法によって、細胞を約
20〜150mg/mlに、好ましくは80〜100mg/ml（680nmで40
〜300のOD、好ましくは160〜200のOD）に濃縮する。
過、遠心分離、又は他の常用の方法によって、細胞を約
20〜150mg/mlに、好ましくは80〜100mg/ml（680nmで40
〜300のOD、好ましくは160〜200のOD）に濃縮する。
濃縮に続いて微生物の細胞膜を破壊する。破壊の主目
的は次の抽出及び可溶化方法を促進する事である。工程
のこの段階でホモジニゼーション、超音波処理、又はプ
レッシャーサイクリング法のような常用の細胞破壊技法
を使用する。好まれる方法はマントン−ガウリン ホモ
ジナイザー（Monton−Gaulin Homogenizer）による超音
波処理又はホモジニゼーションである。破壊段階の終点
は懸濁液の光学濃度によって監視し、典型的には約65％
〜約85％低下する。いずれにしても破壊は、元のままの
細胞が次の可溶化段階へ実質的に持ち越されないよう
に、細胞のすべてを実質的に破壊すべきである。破壊の
前、もし必要ならば細胞の残骸中に不溶性複合体として
IL−２タンパク質を保持しながら、次の段階でE.コライ
タンパク質の除去を促進するような水準に濃縮物の液体
相のpHを調節する。pHは適切な緩衝液を添加する事によ
ってそのように調節する。ほとんどの場合、約８〜約8.
5の範囲内のpHが用いられるだろう。
的は次の抽出及び可溶化方法を促進する事である。工程
のこの段階でホモジニゼーション、超音波処理、又はプ
レッシャーサイクリング法のような常用の細胞破壊技法
を使用する。好まれる方法はマントン−ガウリン ホモ
ジナイザー（Monton−Gaulin Homogenizer）による超音
波処理又はホモジニゼーションである。破壊段階の終点
は懸濁液の光学濃度によって監視し、典型的には約65％
〜約85％低下する。いずれにしても破壊は、元のままの
細胞が次の可溶化段階へ実質的に持ち越されないよう
に、細胞のすべてを実質的に破壊すべきである。破壊の
前、もし必要ならば細胞の残骸中に不溶性複合体として
IL−２タンパク質を保持しながら、次の段階でE.コライ
タンパク質の除去を促進するような水準に濃縮物の液体
相のpHを調節する。pHは適切な緩衝液を添加する事によ
ってそのように調節する。ほとんどの場合、約８〜約8.
5の範囲内のpHが用いられるだろう。
破壊段階に続く回収工程中の段階は、IL−２を還元状
態に維持しながら、高収量で高レベルの純度（好ましく
は、少なくとも約95％及びさらに好まきくは少なくとも
約98％）に、E.コライタンパク質からIL−２を分離する
ために、まず第１に計画されている。同時に、これらの
精製方法は、組合わせにおいて、最終生成物中に発熱性
物質を患者への経腸投与の為に許容しうると信じられて
いる水準へ減少せしめる。
態に維持しながら、高収量で高レベルの純度（好ましく
は、少なくとも約95％及びさらに好まきくは少なくとも
約98％）に、E.コライタンパク質からIL−２を分離する
ために、まず第１に計画されている。同時に、これらの
精製方法は、組合わせにおいて、最終生成物中に発熱性
物質を患者への経腸投与の為に許容しうると信じられて
いる水準へ減少せしめる。
細胞を破壊した後、破壊物の液体相から粒状物を分離
しそして抽出の為の最適pHに緩衝された水性媒体に再懸
濁することができる。場合によってはこの段階で粒状物
を緩衝液によって洗浄し、この中に存在する水溶性のE.
コライタンパクを除去することができる。いずれにして
も、抽出にかけられる細胞懸濁液のタンパク質濃度は普
通、約５〜約60mg/ml、好ましくは20〜40mg/mlの範囲内
にある。
しそして抽出の為の最適pHに緩衝された水性媒体に再懸
濁することができる。場合によってはこの段階で粒状物
を緩衝液によって洗浄し、この中に存在する水溶性のE.
コライタンパクを除去することができる。いずれにして
も、抽出にかけられる細胞懸濁液のタンパク質濃度は普
通、約５〜約60mg/ml、好ましくは20〜40mg/mlの範囲内
にある。
粒状の細胞性物質からのE.コライタンパク質の抽出は
破壊と同時に又は破壊の後に引き続いて実施することが
できる。それは破壊に次ぐ分離された方法として、実行
するのが好ましい。抽出剤はケイオトロピック剤（すな
わち水素結合を解離しそしてタンパク質の三次構造に影
響を与える緩タンパク質変性剤）の水性溶液である。抽
出剤は、細胞残骸と関連する（それに含まれる又は結合
している）IL−２の少なくとも実質的な部分を残しなが
ら細胞残骸からE.コライタンパク質の大部分を選択的に
取り除く。選択性は、IL−２の疎水性によって、そして
タンパク質の等電点の近くのpHにおいて還元され、不溶
性の状態にそれがあるという事実によって、促進され
る。この上、IL−２の実質的な部分は、イン−ビボでは
E.コライの中に高いレベルで発現する他のクローン化さ
れたタンパク質がそうであったように有意な大きさの含
有体とに存在する。抽出剤の例は、尿素及びグアニジニ
ウムハイドロクロライド（SDSが可溶化剤として使用さ
れる次にはグアニジニウムハイドロクロライドを使用す
べきでない）である。抽出混合物の中のケイオトロピッ
ク剤の濃度は、使用される特定のケイオトロピック剤及
び抽出混合物中の細胞性物の量に依存する。尿素の場
合、25℃でのバッチ方法においては約3.5M〜4.5M間の、
好ましくは約4Mの濃度（最終濃度）が使用されるだろ
う。もし抽出を長時間連続的に基づいて行なう場合に
は、より低濃度を使用する事が望ましいであろう。一般
に抽出において20℃〜25℃の範囲の温度を使用し、便利
には室温を使用するであろう。典型的には溶液と粒状物
質との間の接触を強化する為に混合を使用し、そしてこ
のようにして細胞残骸から非IL−２タンパク質を抽出す
るのに必要な時間を短縮する。抽出工程の動力的分析
は、SDS−PAGEを使用しながら、上清液について実施さ
れ、そして抽出は15〜30分までに本質的に完了すること
が見出された。
破壊と同時に又は破壊の後に引き続いて実施することが
できる。それは破壊に次ぐ分離された方法として、実行
するのが好ましい。抽出剤はケイオトロピック剤（すな
わち水素結合を解離しそしてタンパク質の三次構造に影
響を与える緩タンパク質変性剤）の水性溶液である。抽
出剤は、細胞残骸と関連する（それに含まれる又は結合
している）IL−２の少なくとも実質的な部分を残しなが
ら細胞残骸からE.コライタンパク質の大部分を選択的に
取り除く。選択性は、IL−２の疎水性によって、そして
タンパク質の等電点の近くのpHにおいて還元され、不溶
性の状態にそれがあるという事実によって、促進され
る。この上、IL−２の実質的な部分は、イン−ビボでは
E.コライの中に高いレベルで発現する他のクローン化さ
れたタンパク質がそうであったように有意な大きさの含
有体とに存在する。抽出剤の例は、尿素及びグアニジニ
ウムハイドロクロライド（SDSが可溶化剤として使用さ
れる次にはグアニジニウムハイドロクロライドを使用す
べきでない）である。抽出混合物の中のケイオトロピッ
ク剤の濃度は、使用される特定のケイオトロピック剤及
び抽出混合物中の細胞性物の量に依存する。尿素の場
合、25℃でのバッチ方法においては約3.5M〜4.5M間の、
好ましくは約4Mの濃度（最終濃度）が使用されるだろ
う。もし抽出を長時間連続的に基づいて行なう場合に
は、より低濃度を使用する事が望ましいであろう。一般
に抽出において20℃〜25℃の範囲の温度を使用し、便利
には室温を使用するであろう。典型的には溶液と粒状物
質との間の接触を強化する為に混合を使用し、そしてこ
のようにして細胞残骸から非IL−２タンパク質を抽出す
るのに必要な時間を短縮する。抽出工程の動力的分析
は、SDS−PAGEを使用しながら、上清液について実施さ
れ、そして抽出は15〜30分までに本質的に完了すること
が見出された。
抽出に続いて、混合物を固相と液体相に分離する。次
に還元剤及び可溶化剤を含む中性の水性緩衝液と固相と
を接解せしめることにより、固相中のIL−２を選択的に
可溶化する。疎水性のIL−２を溶解する為に適切な疎水
性−親水性のバランスを持つ表面活性剤（洗剤）が使用
される。
に還元剤及び可溶化剤を含む中性の水性緩衝液と固相と
を接解せしめることにより、固相中のIL−２を選択的に
可溶化する。疎水性のIL−２を溶解する為に適切な疎水
性−親水性のバランスを持つ表面活性剤（洗剤）が使用
される。
10〜14個の炭素原子を持つアルカリ金属の硫酸塩化合
物及びアルカリ金属のアルキルサルコシネートが好まし
い可溶化剤であり、SDS及びサルコキシが特に好まし
い。
物及びアルカリ金属のアルキルサルコシネートが好まし
い可溶化剤であり、SDS及びサルコキシが特に好まし
い。
可溶化において使用される可溶化剤の量は特定の可溶
化剤に依存するだろう。SDS又はサルコシルを使用する
場合、SDS/サルコシルと固相部分との好ましい割合は約
0.5:1〜1.4:1である。可溶化媒体はまた可溶化されたIL
−２が有意な程度に酸化されるのを防ぐ為に十分に還元
剤を含んでいる。ジチオスレイトール（DTT）及び２−
メルカプトエタノールのようなタンパク質還元剤が使用
される。培地中でのDTTのような還元剤の濃度は普通、
約５〜20mMの間の範囲である。可溶化は典型的には固相
と可溶化媒体との間の接触を増す為に混合しながら、20
℃〜25℃の範囲の温度において実施されるだろう。より
高い温度は不所望なE.コライタンパクを可溶化する。可
溶化は、サンプルを15分そのままの状態においたとき、
又は溶液が半透明に変わる時完全とみなされる。不溶性
物質は、可溶化を完了にした後分離される。
化剤に依存するだろう。SDS又はサルコシルを使用する
場合、SDS/サルコシルと固相部分との好ましい割合は約
0.5:1〜1.4:1である。可溶化媒体はまた可溶化されたIL
−２が有意な程度に酸化されるのを防ぐ為に十分に還元
剤を含んでいる。ジチオスレイトール（DTT）及び２−
メルカプトエタノールのようなタンパク質還元剤が使用
される。培地中でのDTTのような還元剤の濃度は普通、
約５〜20mMの間の範囲である。可溶化は典型的には固相
と可溶化媒体との間の接触を増す為に混合しながら、20
℃〜25℃の範囲の温度において実施されるだろう。より
高い温度は不所望なE.コライタンパクを可溶化する。可
溶化は、サンプルを15分そのままの状態においたとき、
又は溶液が半透明に変わる時完全とみなされる。不溶性
物質は、可溶化を完了にした後分離される。
IL−２が可溶化された後、場合によっては、IL−２は
分子量がIL−２へひじょうに近い一定の汚染物を特に、
含んでいる追加のE.コライタンパク質を取り除く為に２
−ブタノール又は２−メチル−２−ブタノールによっ
て、還元条件下で水性溶液から抽出される。水性溶液及
びブタノールが実質的に混和しない条件下（たとえば0.
05 0.15の範囲でのイオン強度）で行なわれる。有機抽
出の実施において、水性溶液のタンパク質濃度は、もし
必要なら、約6mg/mlよりも少なく、好ましくは約0.5〜4
mg/mlに調整するのが好ましい。還元状態は、還元剤
（たとえばDTT）の存在下で抽出を実施する事によって
維持されている。ブタノールは一般的に、約1:1〜約3:1
（抽出物：水性溶液）の範囲の体積比で、好ましくは約
1:1で、可溶化されたIL−２の水性溶液へ、加えられる
であろう。抽出はバッチ又は連続の操作のもとに実施す
ることができる。温度は普通、20℃〜100℃の範囲内で
ありまたpHは普通、約４〜９、好ましくは約５〜６であ
るだろう。溶液とブタノールとの接触時間は臨界的では
なく、そして数分といった程度の比較的短時間で使用さ
れる。抽出が完了した後、水性相及びブタノール相を分
離しそしてIL−２をブタノール相から分離する。ブタノ
ール相からIL−２を分離する為の好ましい方法は酸沈殿
法である。これは、有機相が溶解されるまで（有機相の
体積に対して約２〜３緩衝液体積）、pH7.5の水性緩衝
液へブタノール相を加える事によって、そしてそれか
ら、IL−２を沈殿させる為に、pHを約5.5〜7.0、好まし
くは6.0〜6.2へ下げる事によって行われる。
分子量がIL−２へひじょうに近い一定の汚染物を特に、
含んでいる追加のE.コライタンパク質を取り除く為に２
−ブタノール又は２−メチル−２−ブタノールによっ
て、還元条件下で水性溶液から抽出される。水性溶液及
びブタノールが実質的に混和しない条件下（たとえば0.
05 0.15の範囲でのイオン強度）で行なわれる。有機抽
出の実施において、水性溶液のタンパク質濃度は、もし
必要なら、約6mg/mlよりも少なく、好ましくは約0.5〜4
mg/mlに調整するのが好ましい。還元状態は、還元剤
（たとえばDTT）の存在下で抽出を実施する事によって
維持されている。ブタノールは一般的に、約1:1〜約3:1
（抽出物：水性溶液）の範囲の体積比で、好ましくは約
1:1で、可溶化されたIL−２の水性溶液へ、加えられる
であろう。抽出はバッチ又は連続の操作のもとに実施す
ることができる。温度は普通、20℃〜100℃の範囲内で
ありまたpHは普通、約４〜９、好ましくは約５〜６であ
るだろう。溶液とブタノールとの接触時間は臨界的では
なく、そして数分といった程度の比較的短時間で使用さ
れる。抽出が完了した後、水性相及びブタノール相を分
離しそしてIL−２をブタノール相から分離する。ブタノ
ール相からIL−２を分離する為の好ましい方法は酸沈殿
法である。これは、有機相が溶解されるまで（有機相の
体積に対して約２〜３緩衝液体積）、pH7.5の水性緩衝
液へブタノール相を加える事によって、そしてそれか
ら、IL−２を沈殿させる為に、pHを約5.5〜7.0、好まし
くは6.0〜6.2へ下げる事によって行われる。
工程の次の段階は、IL−２、及び抽出の後に残留す
る、すべてのE.コライ汚染物を分離し、そして場合によ
っては可溶化剤から分離する事であるゲル過クロマト
グラフィ、RP−HPLC、又はゲル過クロマトグラフィと
RP−HPLCとの組合せが使用される。ゲル過クロマトグ
ラフィは好ましくは、発熱性成分及び、IL−２（IL−２
は約15.5kdの分子量を持つ）よりも高分子量もしくは低
分子量のタンパク質汚染物を取り除く２つの段階におい
て実施される。これらの汚染物からのIL−２の分離を可
能にする為に溶液を画分する事ができるゲルは商業的に
入手できる。セファクリルＳ−200は高分子成分を取り
除く為には好ましいゲルでありそしてセルファデックス
Ｇ−25,G−75又はＧ−100ゲルは低分子量汚染物を取り
除く為に好ましい。ゲル過は典型的には、可溶化剤約
1.0％〜1.0％及び還元剤約１〜10mMを含む緩衝溶液（pH
5.5〜7.0）の中で行なわれるだろう。カラムは、目的成
分の適切な分離を許容する大きさであるだろう。
る、すべてのE.コライ汚染物を分離し、そして場合によ
っては可溶化剤から分離する事であるゲル過クロマト
グラフィ、RP−HPLC、又はゲル過クロマトグラフィと
RP−HPLCとの組合せが使用される。ゲル過クロマトグ
ラフィは好ましくは、発熱性成分及び、IL−２（IL−２
は約15.5kdの分子量を持つ）よりも高分子量もしくは低
分子量のタンパク質汚染物を取り除く２つの段階におい
て実施される。これらの汚染物からのIL−２の分離を可
能にする為に溶液を画分する事ができるゲルは商業的に
入手できる。セファクリルＳ−200は高分子成分を取り
除く為には好ましいゲルでありそしてセルファデックス
Ｇ−25,G−75又はＧ−100ゲルは低分子量汚染物を取り
除く為に好ましい。ゲル過は典型的には、可溶化剤約
1.0％〜1.0％及び還元剤約１〜10mMを含む緩衝溶液（pH
5.5〜7.0）の中で行なわれるだろう。カラムは、目的成
分の適切な分離を許容する大きさであるだろう。
RP−HPLCはゲル過に代わるものである。またRP−HP
LCは、分子量がIL−２に近く、それゆえにゲル過によ
って完全に取り除く事ができないような分子を溶液から
取り除く事ができる。さらに、細胞性エンドトキシンの
ような汚染物もまたRP−HPLCによって有効に取り除かれ
る。従って、RP−HPLCは、また、ゲル過の後最終精製
方法としても用いられる。タンパク質の望ましい分離を
与える支持体（固定相）がRP−HPLCにおいて使用され
る。300オングストロールのポアーサイズの支持体であ
るＣ−4,C−8,もしくはＣ−18が好まれる支持体の例で
ある。分離は、IL−２を溶液状態に保持する為に約2.3
以下、普通2.1〜2.3の酸性pHで行なわれる。これに関し
ては、可溶化（ゲル過）からの溶液のpHをこの範囲に
調整するのが好ましいだろう。溶液はRP−HPLCカラムの
中へ負荷されそして固定相の上に吸収される。酢酸又は
トリフルオロ酢酸のような有機酸及びプロパノール又は
アセトニトリルのような有機溶媒を含むグラジエント溶
媒系カラムからIL−２を溶出するのに使用される。酢酸
−プロパノール，トリフルオロ酢酸−プロパノール，及
びトリフルオロアセテック酸−アセトナイトレイトが好
ましい溶媒系である。IL−２は酢酸−プロパノール系で
の約40％プロパノールにおいて、トリフルオロ酢酸−プ
ロパノール系での約50％プロパノールにおいて、そして
トリフルオロ酢酸−アセトナイトリル系での約62％アセ
トナイトリルにおいて溶出する。便宜上通常は、溶出液
中の有機溶媒含有量をIL−２が溶出する溶剤濃度より幾
分低いレベルまで急速に上昇せしめ、そして次に約0.1
〜1.0％／分の範囲でゆるやかなグラジエント変化を行
なう。IL−２がクロマトグラフィ処理から回収されるや
いなや、それは凍結乾燥され、そして還元剤（IL−２を
還元状態に保持する為）及び可溶化剤（それを溶液状態
に保持する為）を含む中性の水性緩衝液の中へ再懸濁さ
れる。IL−２はこの形においては安定してい、そしてさ
らにそれ以上の処理を行うため、及び利用される前に製
剤化する為に保存される。
LCは、分子量がIL−２に近く、それゆえにゲル過によ
って完全に取り除く事ができないような分子を溶液から
取り除く事ができる。さらに、細胞性エンドトキシンの
ような汚染物もまたRP−HPLCによって有効に取り除かれ
る。従って、RP−HPLCは、また、ゲル過の後最終精製
方法としても用いられる。タンパク質の望ましい分離を
与える支持体（固定相）がRP−HPLCにおいて使用され
る。300オングストロールのポアーサイズの支持体であ
るＣ−4,C−8,もしくはＣ−18が好まれる支持体の例で
ある。分離は、IL−２を溶液状態に保持する為に約2.3
以下、普通2.1〜2.3の酸性pHで行なわれる。これに関し
ては、可溶化（ゲル過）からの溶液のpHをこの範囲に
調整するのが好ましいだろう。溶液はRP−HPLCカラムの
中へ負荷されそして固定相の上に吸収される。酢酸又は
トリフルオロ酢酸のような有機酸及びプロパノール又は
アセトニトリルのような有機溶媒を含むグラジエント溶
媒系カラムからIL−２を溶出するのに使用される。酢酸
−プロパノール，トリフルオロ酢酸−プロパノール，及
びトリフルオロアセテック酸−アセトナイトレイトが好
ましい溶媒系である。IL−２は酢酸−プロパノール系で
の約40％プロパノールにおいて、トリフルオロ酢酸−プ
ロパノール系での約50％プロパノールにおいて、そして
トリフルオロ酢酸−アセトナイトリル系での約62％アセ
トナイトリルにおいて溶出する。便宜上通常は、溶出液
中の有機溶媒含有量をIL−２が溶出する溶剤濃度より幾
分低いレベルまで急速に上昇せしめ、そして次に約0.1
〜1.0％／分の範囲でゆるやかなグラジエント変化を行
なう。IL−２がクロマトグラフィ処理から回収されるや
いなや、それは凍結乾燥され、そして還元剤（IL−２を
還元状態に保持する為）及び可溶化剤（それを溶液状態
に保持する為）を含む中性の水性緩衝液の中へ再懸濁さ
れる。IL−２はこの形においては安定してい、そしてさ
らにそれ以上の処理を行うため、及び利用される前に製
剤化する為に保存される。
上記以外の好まれる方法は、ゲル過によって分離し
た後IL−２を酸化しそしてその酸化された生成物をRP−
HPLCによって、又はゲル過とそれに続くRP−HPLCとに
よって精製する方法である。この方法は、ゲル過にお
いて残存している汚染物及び不所望の酸化生成物の効果
的な除去をもたらす。好ましい酸化方法は、十分に還元
された微生物的に産生された合成タンパク質（このタン
パク質は有用タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列
を有し、このアミノ酸配列は複数のシステインを含有
し、このシステインは該有用なタンパク質中では分子内
結合してシスチンを形成している）を制御された態様で
酸化し、こうしてシステインを酸化して選択的にシスチ
ンを形成する方法である。この方法においては、十分に
還元された、微生物的に産生された合成タンパク質をｏ
−ヨードソベンゾエイトと反応せしめ、このｏ−ヨード
ソベンゾエイトは、前記のシステインのPKaよりも少な
くとも約1/2pHユニット低いpHにおいて水性媒体中で選
択的にシステインを酸化する。この場合、反応混合物中
の合成タンパク質の濃度は約5mg/mlよりも低くし、そし
てタンパク質に対するｏ−ヨードソベンゾエイトのモル
比は、反応の終期においてｏ−ヨードソベンゾエイトが
過剰に存在するという条件でもって、少なくとも化学量
論的にする。酸化された生成物のRP−HPLC精製は、還元
剤の非存在下及び記載したゲル過で用いたのと等しい
か又はそれより低い濃度での洗浄の存在下で、上記に記
載した条件のもとで実施される。
た後IL−２を酸化しそしてその酸化された生成物をRP−
HPLCによって、又はゲル過とそれに続くRP−HPLCとに
よって精製する方法である。この方法は、ゲル過にお
いて残存している汚染物及び不所望の酸化生成物の効果
的な除去をもたらす。好ましい酸化方法は、十分に還元
された微生物的に産生された合成タンパク質（このタン
パク質は有用タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列
を有し、このアミノ酸配列は複数のシステインを含有
し、このシステインは該有用なタンパク質中では分子内
結合してシスチンを形成している）を制御された態様で
酸化し、こうしてシステインを酸化して選択的にシスチ
ンを形成する方法である。この方法においては、十分に
還元された、微生物的に産生された合成タンパク質をｏ
−ヨードソベンゾエイトと反応せしめ、このｏ−ヨード
ソベンゾエイトは、前記のシステインのPKaよりも少な
くとも約1/2pHユニット低いpHにおいて水性媒体中で選
択的にシステインを酸化する。この場合、反応混合物中
の合成タンパク質の濃度は約5mg/mlよりも低くし、そし
てタンパク質に対するｏ−ヨードソベンゾエイトのモル
比は、反応の終期においてｏ−ヨードソベンゾエイトが
過剰に存在するという条件でもって、少なくとも化学量
論的にする。酸化された生成物のRP−HPLC精製は、還元
剤の非存在下及び記載したゲル過で用いたのと等しい
か又はそれより低い濃度での洗浄の存在下で、上記に記
載した条件のもとで実施される。
クロマトグラフィ処理の後、IL−２の純度は少なくと
も約95％でありそして普通は少なくとも約98％である。
このひじょうに純粋な物質は、100,000ユニットIL−２
活性につき約5ngよりも少ないエンドトキシンを、普通
約0.01ngよりも少ないエンドトキシンを含む。
も約95％でありそして普通は少なくとも約98％である。
このひじょうに純粋な物質は、100,000ユニットIL−２
活性につき約5ngよりも少ないエンドトキシンを、普通
約0.01ngよりも少ないエンドトキシンを含む。
この発明方法はさらに次の例によって詳述する。これ
らの例はこの発明を限定することをなんら意図するもの
ではない。
らの例はこの発明を限定することをなんら意図するもの
ではない。
例１ IL−２は、プラスミドpLW1により形質転換されたE.コ
ライＫ−12種MM294（1983年８月４日に受託番号39,405
としてアメリカン タイプ カルチャー コレクション
（American Type Culture Collection）に寄託されてい
る）から次のように回収した。
ライＫ−12種MM294（1983年８月４日に受託番号39,405
としてアメリカン タイプ カルチャー コレクション
（American Type Culture Collection）に寄託されてい
る）から次のように回収した。
E.コライを次のような増殖培地を用いて発酵器の中で
増殖せしめた。
増殖せしめた。
（NH4）2SO4 150 mM KH2PO4 21.6mM Ca3サイトレート 1.5mM ZnSO4・7H2O 30 mM MnSO4・H2O 30 mM CuSO4・5H2O １ mM pHはオートクレーブ殺菌した2.5Nの水酸化ナトリウム
により6.5に調整した。
により6.5に調整した。
無菌の付加物（オートクレーブの後） MgSO4・7H2O 3mM FeSO4 100μM Ｌ−トリプトファン 14mg/l サイアミン−HCl 20mg/l グルコース 5g/l テトラサイクリン 5mg/l エタノール（任意に） ２％ カガミノ酸 ２％ ダウ コーンニング アンティフォーム Ｂ（Dow Co
rning Antifoam B）の20％溶液、グルコースの50％溶液
及び5Nの水酸化カリウムを必要に応じ添加した。
rning Antifoam B）の20％溶液、グルコースの50％溶液
及び5Nの水酸化カリウムを必要に応じ添加した。
発酵槽のpHを5Nの水酸化カリウムで6.8に維持した。
残留グルコールは５〜10g/の間に、溶存酸素は40％
に、そして温度は37±１℃に維持した。カガミノ酸（20
％貯蔵溶液）をOD680が約10である時添加した。OD680が
約20に達した後３時間で収得を行なった。
残留グルコールは５〜10g/の間に、溶存酸素は40％
に、そして温度は37±１℃に維持した。カガミノ酸（20
％貯蔵溶液）をOD680が約10である時添加した。OD680が
約20に達した後３時間で収得を行なった。
収得された材料を中空繊維（Hollowfiber）過及び
／又は遠心分離によって濃縮した。20〜40g（温重量）
の濃縮物を、20mMのTris及び1mMのエチレンデアミン四
酢酸（EDTA）（8.1〜8.5のpH）の溶液（Tri/EDTA緩衝
液）200ml中に再懸濁した。この懸濁液を10分間3,000〜
4,000×ｇで遠心分離し、上清液を除去し、そして固形
物は、４℃の200ml Tris/EDTA緩衝液中へ再懸濁した。
この懸濁液を、音波処理機（ヒートシステム又は、モデ
ルＷ−375）の中へ入れ、そして出力設定“9"、50％負
荷でもってパルスしながら、大探針を用いて４℃で45分
間（終点＝約85％のOD680の低下）音波処理した。これ
に代る破壊技法は、Ｍ−１に設定してマントン−ガウリ
ン（Manton−Gaulin）乳化機の中に懸濁液を３回通すこ
とである。細胞残骸物は、10分間4,500×ｇで遠心分離
する事によって破壊物から分離した。
／又は遠心分離によって濃縮した。20〜40g（温重量）
の濃縮物を、20mMのTris及び1mMのエチレンデアミン四
酢酸（EDTA）（8.1〜8.5のpH）の溶液（Tri/EDTA緩衝
液）200ml中に再懸濁した。この懸濁液を10分間3,000〜
4,000×ｇで遠心分離し、上清液を除去し、そして固形
物は、４℃の200ml Tris/EDTA緩衝液中へ再懸濁した。
この懸濁液を、音波処理機（ヒートシステム又は、モデ
ルＷ−375）の中へ入れ、そして出力設定“9"、50％負
荷でもってパルスしながら、大探針を用いて４℃で45分
間（終点＝約85％のOD680の低下）音波処理した。これ
に代る破壊技法は、Ｍ−１に設定してマントン−ガウリ
ン（Manton−Gaulin）乳化機の中に懸濁液を３回通すこ
とである。細胞残骸物は、10分間4,500×ｇで遠心分離
する事によって破壊物から分離した。
細胞残骸物を室温で60mlのTris/EDTA緩衝液中に再懸
濁しそしてTris/EDTA緩衝液中8Mの尿素（スクワーズ／
マン（Schwarz/Mann）超純粋な）の同体積を５分以上の
急速な撹拌でもってこの懸濁液へ加えた（最終尿素濃度
は4M）。15〜30分間連続して低速度撹拌の後、押出され
た細胞残骸物を回収する為に懸濁液を12,000×ｇで15分
間遠心分離した。もし固相が生じないなら、上清液を取
り出しそして同体積のTris/EDTA緩衝液を加えそれから
混合物を再遠心分離する。
濁しそしてTris/EDTA緩衝液中8Mの尿素（スクワーズ／
マン（Schwarz/Mann）超純粋な）の同体積を５分以上の
急速な撹拌でもってこの懸濁液へ加えた（最終尿素濃度
は4M）。15〜30分間連続して低速度撹拌の後、押出され
た細胞残骸物を回収する為に懸濁液を12,000×ｇで15分
間遠心分離した。もし固相が生じないなら、上清液を取
り出しそして同体積のTris/EDTA緩衝液を加えそれから
混合物を再遠心分離する。
次に抽出された細胞残骸物を50mMのリン酸ナトリウム
（pH6.8）、1mMのEDTA及び10mMのDTTの溶液9ml中に20℃
で再懸濁する。20％のSDS1mlをその懸濁液へ加え、そし
て懸濁液を５分間激しく撹拌する。室温で10分間12,000
×ｇのもとで遠心分離する事により懸濁液から液相を回
収する。それから溶液中のIL−２が十分に還元されるの
を確実にする為に液相を15分間40℃に熱した。粗抽出物
のサンプルを15％のSDS−PAGEによって分析した。図１
は、その分析（方法1Aの生成物）の濃度記録計走査が示
される。これにより抽出物が約37％のIL−２を含有する
ことが示される。
（pH6.8）、1mMのEDTA及び10mMのDTTの溶液9ml中に20℃
で再懸濁する。20％のSDS1mlをその懸濁液へ加え、そし
て懸濁液を５分間激しく撹拌する。室温で10分間12,000
×ｇのもとで遠心分離する事により懸濁液から液相を回
収する。それから溶液中のIL−２が十分に還元されるの
を確実にする為に液相を15分間40℃に熱した。粗抽出物
のサンプルを15％のSDS−PAGEによって分析した。図１
は、その分析（方法1Aの生成物）の濃度記録計走査が示
される。これにより抽出物が約37％のIL−２を含有する
ことが示される。
IL−２をゲル過クロマトグラフィによって溶液から
次のようにして分離した。溶液を50mMのリン酸ナトリウ
ム（pH6.8）、1mMのEDTA、1mMのDTT、及び１％SDS中で
使用される2.6×100cmS−200カラム上へ負荷した。カラ
ム溶出液を4mlずつの画分に集め、そしてこの画分のサ
ンプルを15％のSDS−PAGEミニゲル中でコマアスイ ブ
ル（Coomassie blue）することにより分析した。最も少
ない汚染物（約35kd,16〜18kd,及び12kdの汚染物を最小
限にしながら）を含んでいる画分をプールし、そして限
外過（Amlcon YM5限外紙）によって５〜10mlに濃縮
した。この濃縮した。この濃縮物をSDS濃度が１％では
なくむしろ0.1％である事を除いて上のように行なわれ
る2.6×100cm G−100カラム上に負荷した。画分をSDS−
PAGEによって分析しそして最も純粋は画分をプールし
た。図はクロマトグラフィにかけられた成生物の濃度記
録計走査を表わしている。生成物は98％の純度であり、
そしてリーミュラス アメボサイト ライセート（limu
lus amebocyte lysate）分析〔アソシエイト オブ ケ
ープコッド，カンパニー.,ウッドホール，マサチュウセ
ッツ（Associates of Cape Cod,Inc.,Woods Hole,M
A）〕によって測定した場合、0.5ngのエンドトキシン/1
00,000ユニットのIL−２活性を含んでいるという事を分
析は示した。このIL−２のＮ−端アミノ酸配列は、最初
のＮ−端アラニンが足りないのを除いて生来の人間の分
子と同じである。
次のようにして分離した。溶液を50mMのリン酸ナトリウ
ム（pH6.8）、1mMのEDTA、1mMのDTT、及び１％SDS中で
使用される2.6×100cmS−200カラム上へ負荷した。カラ
ム溶出液を4mlずつの画分に集め、そしてこの画分のサ
ンプルを15％のSDS−PAGEミニゲル中でコマアスイ ブ
ル（Coomassie blue）することにより分析した。最も少
ない汚染物（約35kd,16〜18kd,及び12kdの汚染物を最小
限にしながら）を含んでいる画分をプールし、そして限
外過（Amlcon YM5限外紙）によって５〜10mlに濃縮
した。この濃縮した。この濃縮物をSDS濃度が１％では
なくむしろ0.1％である事を除いて上のように行なわれ
る2.6×100cm G−100カラム上に負荷した。画分をSDS−
PAGEによって分析しそして最も純粋は画分をプールし
た。図はクロマトグラフィにかけられた成生物の濃度記
録計走査を表わしている。生成物は98％の純度であり、
そしてリーミュラス アメボサイト ライセート（limu
lus amebocyte lysate）分析〔アソシエイト オブ ケ
ープコッド，カンパニー.,ウッドホール，マサチュウセ
ッツ（Associates of Cape Cod,Inc.,Woods Hole,M
A）〕によって測定した場合、0.5ngのエンドトキシン/1
00,000ユニットのIL−２活性を含んでいるという事を分
析は示した。このIL−２のＮ−端アミノ酸配列は、最初
のＮ−端アラニンが足りないのを除いて生来の人間の分
子と同じである。
例２ 可溶化剤として２％のSDSの代わりに２％のサーコシ
ル（Sarcosyl）を用い、そしてクロマトグラフィのカラ
ム中にSDSの代わりにサーコシルを用いて例１の方法を
くり返した。図１は、可溶化剤としてサーコシルを使用
するこの粗抽出物（方法1Bの粗抽出物）についての濃度
記録計走査を表わしている。示されるように、SDSの代
わりにサーコシルの使用は、類似のIL−２収量（50％対
60％）において改示された純度（58％対37％）を生ぜし
めた。
ル（Sarcosyl）を用い、そしてクロマトグラフィのカラ
ム中にSDSの代わりにサーコシルを用いて例１の方法を
くり返した。図１は、可溶化剤としてサーコシルを使用
するこの粗抽出物（方法1Bの粗抽出物）についての濃度
記録計走査を表わしている。示されるように、SDSの代
わりにサーコシルの使用は、類似のIL−２収量（50％対
60％）において改示された純度（58％対37％）を生ぜし
めた。
例３ 尿素抽出の前の段階まで例１の方法を繰り返し、そし
て次に記載されているようにして、可溶化し、そして浄
化した。
て次に記載されているようにして、可溶化し、そして浄
化した。
IL−２をRP−HPLCによって次のように溶液から分離し
た。溶液を0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）中に10倍に
希釈しそして0.1％のTFAで平衡化された内部直径4.6mm
で長さが5cmのブロウニリー アクゥアポート（Brownle
e Aquaport）RP−300カラムへ負荷した。IL−２を0.1％
のTFIを含む30％〜60％のアセトニトリルのグラジエン
トにより45分にわたって溶出した。HPLC後のIL−２活性
の収率は80〜100％であった。図２は、この生成物の銀
色に着色されたSDS−PAGE分析を表わしている。
た。溶液を0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）中に10倍に
希釈しそして0.1％のTFAで平衡化された内部直径4.6mm
で長さが5cmのブロウニリー アクゥアポート（Brownle
e Aquaport）RP−300カラムへ負荷した。IL−２を0.1％
のTFIを含む30％〜60％のアセトニトリルのグラジエン
トにより45分にわたって溶出した。HPLC後のIL−２活性
の収率は80〜100％であった。図２は、この生成物の銀
色に着色されたSDS−PAGE分析を表わしている。
例４ ゲル過のクロマトグラフィの前の段階まで例１の方
法をくり返した。可溶性の、洗浄され、そして還元され
た物質を例１に記載されたように0.1％のSDS中でのＧ−
100クロマトグラフィにかけた。IL−２のプールされた
ピーク画分を、例３で記載されたようにRP−HPLCによっ
てさらに精製した。得られた精製され、還元されたIL−
２を酸化しそして例３で記載されたようにして、RP−HP
LCにかけた。
法をくり返した。可溶性の、洗浄され、そして還元され
た物質を例１に記載されたように0.1％のSDS中でのＧ−
100クロマトグラフィにかけた。IL−２のプールされた
ピーク画分を、例３で記載されたようにRP−HPLCによっ
てさらに精製した。得られた精製され、還元されたIL−
２を酸化しそして例３で記載されたようにして、RP−HP
LCにかけた。
例５ Ｇ−100カラムの前の段階まで例１の方法をくり返し
た。1Mの酢酸中プロパノールの溶媒系を使用して例３の
為の方法をくり返した。35％〜60％プロパノールのグラ
ディエントにより200分にわたってIL−２を溶出した。
カラムの寸法は内部直径10cm×長さ30cmか内部直径48mm
×長さ50cmのどちらかでありそしてこのカラムに固定相
広孔シリカゲルを充填した。使用された固定相広孔シリ
カゲルはVydac TP214であった。生成物の純度及び収量
は例３のそれに匹敵した。
た。1Mの酢酸中プロパノールの溶媒系を使用して例３の
為の方法をくり返した。35％〜60％プロパノールのグラ
ディエントにより200分にわたってIL−２を溶出した。
カラムの寸法は内部直径10cm×長さ30cmか内部直径48mm
×長さ50cmのどちらかでありそしてこのカラムに固定相
広孔シリカゲルを充填した。使用された固定相広孔シリ
カゲルはVydac TP214であった。生成物の純度及び収量
は例３のそれに匹敵した。
例６ 0.1％のTFA中プロパノールの溶媒系を使用した例３の
方法をくり返した。IL−２は、35％〜60％プロパノール
のグラディエントにより120分にわたって溶出した。カ
ラム及び支持体物質は例５でのと同じであった。生成物
の純度及び収量は例３のそれに匹敵した。
方法をくり返した。IL−２は、35％〜60％プロパノール
のグラディエントにより120分にわたって溶出した。カ
ラム及び支持体物質は例５でのと同じであった。生成物
の純度及び収量は例３のそれに匹敵した。
例７ 例１の方法は、E.コライ−生産性IL−２がひとつの命
令されたdes−Ala Ser125IL−２である事を除いて、く
り返された。このIL−２のアミノ酸配列は、125位での
システインがセリンと交換されさらに最初のＮ−端アラ
ニン残基が足りないという事において、天然の分子のア
ミノ酸配列と異なる。このIL−２を産生するdes−Ala S
er125IL−２生産性E.コライの菌株は1984年の３月６日
に受託番号39,626号としてアメリキャン タイプ カル
チャー コレクション（American Type Culture Collec
tion）に寄託された。
令されたdes−Ala Ser125IL−２である事を除いて、く
り返された。このIL−２のアミノ酸配列は、125位での
システインがセリンと交換されさらに最初のＮ−端アラ
ニン残基が足りないという事において、天然の分子のア
ミノ酸配列と異なる。このIL−２を産生するdes−Ala S
er125IL−２生産性E.コライの菌株は1984年の３月６日
に受託番号39,626号としてアメリキャン タイプ カル
チャー コレクション（American Type Culture Collec
tion）に寄託された。
例８ 例１の方法をくり返した。但しプラスミドpLW55によ
り形質転換されたE.コライＫ−12株〔1983年の11月18日
受託番号39,516としてアメリキャン タイプ カルチャ
ー コレクション（American Type Culture Collectio
n）に寄託された〕からIL−２を回収した。この分子の
アミノ酸配列は、Ｎ−端メサイオニンを持ちさらに125
位のシステインがセリンに取り換えされているという点
において天然の分子配列と異なっている。
り形質転換されたE.コライＫ−12株〔1983年の11月18日
受託番号39,516としてアメリキャン タイプ カルチャ
ー コレクション（American Type Culture Collectio
n）に寄託された〕からIL−２を回収した。この分子の
アミノ酸配列は、Ｎ−端メサイオニンを持ちさらに125
位のシステインがセリンに取り換えされているという点
において天然の分子配列と異なっている。
例９ 例１の一般的方法を使用しながらdes−Ala Ser125IL
−２生産性E.コライを増殖せしめ細胞を破壊し、そして
細胞残骸を破壊物から回収した。細胞残骸を、50mMのTr
isと1mMのEDTAのpH8.5の緩衝液中に約1:4.5（w/v）の割
合で懸濁した。最終濃度が25mMになるようにDTTを添加
した。同じ緩衝液へ8Mの尿素を最終濃度が4Mになるよう
にかきまぜなからゆっくりと添加し、そして次の室温で
混合しながら30分間そのままに放置した。30分後、不溶
性残留物を遠心分離した。生じたペーストを50mMのリン
酸ナトリウム緩衝液（1mM EDTAを含有、pH7.6）中に再
懸濁した。最終濃度が５％（w/v）になるように固形SDS
を添加することによりその懸濁液を可溶化した。
−２生産性E.コライを増殖せしめ細胞を破壊し、そして
細胞残骸を破壊物から回収した。細胞残骸を、50mMのTr
isと1mMのEDTAのpH8.5の緩衝液中に約1:4.5（w/v）の割
合で懸濁した。最終濃度が25mMになるようにDTTを添加
した。同じ緩衝液へ8Mの尿素を最終濃度が4Mになるよう
にかきまぜなからゆっくりと添加し、そして次の室温で
混合しながら30分間そのままに放置した。30分後、不溶
性残留物を遠心分離した。生じたペーストを50mMのリン
酸ナトリウム緩衝液（1mM EDTAを含有、pH7.6）中に再
懸濁した。最終濃度が５％（w/v）になるように固形SDS
を添加することによりその懸濁液を可溶化した。
５％のSDS溶液を0.1Mのリン酸ナトリウムにより２％
のSDSになるよう薄めた。タンパク質濃度を決定し、pH
を8.5に調整し、そして50mMになるようDTT及び2mMにな
るようEDTAを添加した。この混合物をN2の存在下で40℃
に加熱することによりIL−２を還元した。この次に混合
物を冷却しそしてpHを5.0に調整した。
のSDSになるよう薄めた。タンパク質濃度を決定し、pH
を8.5に調整し、そして50mMになるようDTT及び2mMにな
るようEDTAを添加した。この混合物をN2の存在下で40℃
に加熱することによりIL−２を還元した。この次に混合
物を冷却しそしてpHを5.0に調整した。
次にその溶液を1mMのDTTを含む２−ブタノールにより
1:1の割合（w/v）において室温で抽出した。滞留時間は
２〜25分であった。抽出は、200ml/分の速流のもとに液
−液相分離機で実施した。有機抽出液を分離しそしてそ
のpHを水酸化ナトリウムにより8.0に調整した。次に抽
出液を、10mMのリン酸ナトリウム、2mMのDTT、pH6中0.1
％SDSにゆっくりと加えそして15〜20分間撹拌した。生
じた沈殿物を分離しそして生じたペーストをPBS中５％
のSDSに再懸濁した。その溶液を遠心分離によって透明
にしそして上のようにして還元した。還元の後、溶液を
酢酸によりpH5.5に調整した。この溶液を、Ｓ−200カラ
ム及びＧ−25カラムを使用してゲル過によって精製し
た。これにより得られた精製され、還元されたIL−２を
酸化し、そして酸化生成物を例３のようにしてＧ−25の
クロマトグラフィ及びこれに続くRP−HPLCによって精製
した。こうして得られた精製された組換体IL−２生成物
は、還元SDS−PAGE分析によって定量した場合約95％よ
りも多くのIL−２を含有し、約0.1ng/mgのIL−２よりも
少ないエンドトキシンを含有しそして3.3×105u/kgの投
与量でのU.S.Pウサギの発熱物質試験によって定量した
場合実質的に発熱物質を含んでいない。前に示された様
に、エンドトキシン含有量は、100,000ユニットのIL−
２活性に対して5ngよりも少なくそして好ましくは0.01n
gよりも少ない。典型的には、この発明の方法によって
精製された組換体IL−２生成物は上に示した様にエンド
トキシン及び発熱物質が実質的に無いという異に加え
て、図３に表わされているように、還元SDS−PAGE又はR
P−HPLCによって決定した場合98％よりも多くのIL−２
含有量を有した。
1:1の割合（w/v）において室温で抽出した。滞留時間は
２〜25分であった。抽出は、200ml/分の速流のもとに液
−液相分離機で実施した。有機抽出液を分離しそしてそ
のpHを水酸化ナトリウムにより8.0に調整した。次に抽
出液を、10mMのリン酸ナトリウム、2mMのDTT、pH6中0.1
％SDSにゆっくりと加えそして15〜20分間撹拌した。生
じた沈殿物を分離しそして生じたペーストをPBS中５％
のSDSに再懸濁した。その溶液を遠心分離によって透明
にしそして上のようにして還元した。還元の後、溶液を
酢酸によりpH5.5に調整した。この溶液を、Ｓ−200カラ
ム及びＧ−25カラムを使用してゲル過によって精製し
た。これにより得られた精製され、還元されたIL−２を
酸化し、そして酸化生成物を例３のようにしてＧ−25の
クロマトグラフィ及びこれに続くRP−HPLCによって精製
した。こうして得られた精製された組換体IL−２生成物
は、還元SDS−PAGE分析によって定量した場合約95％よ
りも多くのIL−２を含有し、約0.1ng/mgのIL−２よりも
少ないエンドトキシンを含有しそして3.3×105u/kgの投
与量でのU.S.Pウサギの発熱物質試験によって定量した
場合実質的に発熱物質を含んでいない。前に示された様
に、エンドトキシン含有量は、100,000ユニットのIL−
２活性に対して5ngよりも少なくそして好ましくは0.01n
gよりも少ない。典型的には、この発明の方法によって
精製された組換体IL−２生成物は上に示した様にエンド
トキシン及び発熱物質が実質的に無いという異に加え
て、図３に表わされているように、還元SDS−PAGE又はR
P−HPLCによって決定した場合98％よりも多くのIL−２
含有量を有した。
例９に記載した方法の変法、例えば大規模にIL−２を
製造するために使用されるような変法が図４に表示され
ている。図４に示された方法は、例９に記載した方法と
次のような点、すなわち（１）緩衝における小変化
（２）RP−HPLCにおける酢酸−プロパノール（例５）溶
媒系の使用、並びに（３）後酸化希釈／透析過、Ｓ−
200ゲル過、及び限外過方法などの使用において異
なる。図４に示されるような方法は、いろいろな工夫に
よって修正される。たとえば２度目の１％のSDS中での
Ｓ−200カラム通過に続いて、IL−２溶液を1:10の割合
で薄めて0.1％のSDS濃度とし、そして次にpH7.5及び5pp
mのSDSを含む10mMのリン酸緩衝液に対して透析過す
る。そしてこの溶液を適切な使用分量のために必要であ
れば濃縮する。
製造するために使用されるような変法が図４に表示され
ている。図４に示された方法は、例９に記載した方法と
次のような点、すなわち（１）緩衝における小変化
（２）RP−HPLCにおける酢酸−プロパノール（例５）溶
媒系の使用、並びに（３）後酸化希釈／透析過、Ｓ−
200ゲル過、及び限外過方法などの使用において異
なる。図４に示されるような方法は、いろいろな工夫に
よって修正される。たとえば２度目の１％のSDS中での
Ｓ−200カラム通過に続いて、IL−２溶液を1:10の割合
で薄めて0.1％のSDS濃度とし、そして次にpH7.5及び5pp
mのSDSを含む10mMのリン酸緩衝液に対して透析過す
る。そしてこの溶液を適切な使用分量のために必要であ
れば濃縮する。
図は、ゲル過クロマトグラフィを最終精製方法として
使用するこの発明方法の２つの具体例の流れ図を示して
いる。方法1Aと表示された具体例は可溶化剤としてSDS
を使用し；方法1Bと表示された具体例は可溶化剤として
サーコシルを使用する。この図は、この方法におけるい
ろいろな段階での生成物のSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS−PAGE）分析の濃度記録計走査を含ん
でいる。 図２は例３の生成物のHPLCクロマトグラム及びSDS−PAG
E分析の結果を示す図面に代る写真である。 図３は例９の生成物のHPLCクロマトグラムである。 図４は微生物的に生成されるIL−２を処理する為の好ま
しい方法の流れ図である。
使用するこの発明方法の２つの具体例の流れ図を示して
いる。方法1Aと表示された具体例は可溶化剤としてSDS
を使用し；方法1Bと表示された具体例は可溶化剤として
サーコシルを使用する。この図は、この方法におけるい
ろいろな段階での生成物のSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS−PAGE）分析の濃度記録計走査を含ん
でいる。 図２は例３の生成物のHPLCクロマトグラム及びSDS−PAG
E分析の結果を示す図面に代る写真である。 図３は例９の生成物のHPLCクロマトグラムである。 図４は微生物的に生成されるIL−２を処理する為の好ま
しい方法の流れ図である。
フロントページの続き (72)発明者 マイケル クニタニ アメリカ合衆国，カリフオルニア 94611，オークランド，ビユー ストリ ート 4314 (72)発明者 ケネス ウイルソン アメリカ合衆国，カリフオルニア 94598，ウオルナツト クリーク，ロモ ンド ランド 2249 (72)発明者 ウオルフガング トルムト ハニシユ アメリカ合衆国，カリフオルニア 94611，オークランド，バルサム ウエ イ 209，6808
Claims (7)
- 【請求項１】IL−２を含んでいる形質転換された微生物
からIL−２を回収する為の方法であって、 （ａ）微生物の細胞膜を破壊し； （ｂ）細胞物質から選択的に非IL−２タンパク質を抽出
するケイオトロピック剤の水性溶液によって前記破壊物
を抽出し； （ｃ）IL−２と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤の
水溶液により前記抽出混合物の固体相中のIL−２を可溶
化し；そして、 （ｄ）還元剤の存在下で、得られた溶液からIL−２を分
離する； ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記ケイオトロピック剤が尿素であり、そ
して可溶化剤がドデシル硫酸ナトリウム又はナトリウム
ラウリルサルコシンであることを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】前記の段階（ｂ）を塩基性pHにおいて実施
することを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項
に記載の方法。 - 【請求項４】前記の段階（ｄ）をゲル濾過又は逆相高速
液体クロマトグラフィによって実施することを特徴とす
る特許請求第１項，第２項，又は第３項に記載の方法。 - 【請求項５】前記の段階（ｄ）をゲル濾過によって溶液
からIL−２−含有画分を分離しそして逆相高速液体クロ
マトグラフィによって、得られたIL−２を画分から精製
することによって実施することを特徴とする特許請求の
範囲第１項，第２項，又は第３項に記載の方法。 - 【請求項６】前記の段階（ｄ）を、 （ｉ）２−ブタノール又は２−メチル−２−ブタノール
によって（ｃ）の水性溶液からIL−２を抽出し； （ii）この抽出液からIL−２を酸性沈殿せしめ；そして （iii）酸性沈殿したIL−２をゲル濾過により精製す
る； ことによって実施することを特徴とする特許請求の範囲
第１項，第２項，又は第３項に記載の方法。 - 【請求項７】段階（ｄ）の後、段階（ｄ）の前記生成物
を酸化しそしてその結果生じる酸化された生成物を逆相
高速液体クロマトグラフィによって精製することを特徴
とする特許請求の範囲第６項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/594,223 US4569790A (en) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| US594223 | 1984-03-28 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8143485A Division JP2648587B2 (ja) | 1984-03-28 | 1996-05-15 | 精製された変異型インターロイキン−２組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611393A JPS611393A (ja) | 1986-01-07 |
| JP2599903B2 true JP2599903B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=24378044
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60062195A Expired - Lifetime JP2599903B2 (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-28 | Ｉｌ−２の回収及び精製方法 |
| JP8143485A Expired - Lifetime JP2648587B2 (ja) | 1984-03-28 | 1996-05-15 | 精製された変異型インターロイキン−２組成物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8143485A Expired - Lifetime JP2648587B2 (ja) | 1984-03-28 | 1996-05-15 | 精製された変異型インターロイキン−２組成物 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4569790A (ja) |
| EP (2) | EP0156373B1 (ja) |
| JP (2) | JP2599903B2 (ja) |
| KR (1) | KR850007083A (ja) |
| AT (1) | ATE81674T1 (ja) |
| AU (1) | AU592751B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341083C (ja) |
| DE (2) | DE3588189T2 (ja) |
| DK (1) | DK166324C (ja) |
| ES (1) | ES8609362A1 (ja) |
| FI (1) | FI94960C (ja) |
| GR (1) | GR850741B (ja) |
| HK (1) | HK1004474A1 (ja) |
| IE (1) | IE59100B1 (ja) |
| IL (1) | IL74733A (ja) |
| IN (1) | IN162903B (ja) |
| NO (1) | NO851235L (ja) |
| NZ (1) | NZ211569A (ja) |
| PH (1) | PH21012A (ja) |
| PT (1) | PT80172B (ja) |
| ZA (1) | ZA852347B (ja) |
Families Citing this family (89)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
| US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
| US4853332A (en) * | 1982-10-19 | 1989-08-01 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins |
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| NZ210634A (en) * | 1983-12-23 | 1989-05-29 | Hoffmann La Roche | Purification of recombinant human interleukin - 2; pharmaceutical compositions |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| US4656132A (en) * | 1984-03-28 | 1987-04-07 | Cetus Corporation | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| EP0158487B1 (en) * | 1984-04-09 | 1991-08-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of interleukin-2 |
| US4908434A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Process for preparing purified interleukin-2 |
| US4908433A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Uses of interleukin-2 |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| DE3500681A1 (de) * | 1985-01-11 | 1986-07-17 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur isolierung und reinigung von lymphokinen |
| JPH0646957B2 (ja) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
| US5523215A (en) * | 1985-03-28 | 1996-06-04 | Chiron Corporation | Enhanced purification and expression of insoluble recombinant proteins |
| US5248769A (en) * | 1985-06-26 | 1993-09-28 | Cetus Oncology Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
| US4762784A (en) * | 1985-07-15 | 1988-08-09 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermemtation process for the high level production of bovine growth hormone |
| US4690915A (en) * | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| CA1297003C (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-10 | Jack H. Nunberg | Composition and method for treating animals |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| US4933433A (en) * | 1986-01-31 | 1990-06-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant interleukin-2 composition and process for making it |
| US5425940A (en) * | 1986-04-09 | 1995-06-20 | Cetus Oncology Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
| US4931544A (en) * | 1986-09-04 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions |
| US4683293A (en) * | 1986-10-20 | 1987-07-28 | Phillips Petroleum Company | Purification of pichia produced lipophilic proteins |
| US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
| US4879374A (en) * | 1987-03-13 | 1989-11-07 | Immunex Corporation | Bovine interleukin-1β DNA sequence |
| US5108911A (en) * | 1987-03-13 | 1992-04-28 | Immunex Corporation | Process for preparing bovine interleukin-Iβ |
| CA1339757C (en) | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| JPS6463395A (en) | 1987-05-04 | 1989-03-09 | Oncogen | Oncostatin m and novel composition having antitumor activity |
| US4931543A (en) * | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
| EP0368857B1 (en) * | 1987-05-11 | 1997-08-06 | Chiron Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| US5162507A (en) * | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| US4801691A (en) * | 1987-05-15 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for removing sodium dodecyl sulfate from sodium dodecyl sulfate solubilized protein solutions |
| WO1989001046A1 (en) * | 1987-07-29 | 1989-02-09 | Schering Biotech Corporation | Purification of human interleukin-4 expressed in escherichia coli |
| JP2669859B2 (ja) * | 1987-08-04 | 1997-10-29 | 協和醗酵工業株式会社 | タンパク質の再活性化法 |
| EP0337243A1 (en) * | 1988-04-14 | 1989-10-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for purifying recombinant human interleukin-2 |
| FR2635527B1 (fr) * | 1988-07-28 | 1992-06-12 | Roussel Uclaf | Il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite, son procede d'obtention et son application comme medicament |
| US4923967A (en) * | 1988-09-26 | 1990-05-08 | Eli Lilly And Company | Purification and refolding of recombinant proteins |
| US5830452A (en) * | 1990-11-20 | 1998-11-03 | Chiron Corporation | Method for enhancing the anti-tumor therapeutic index of interleukin-2 |
| WO1992009623A1 (fr) * | 1990-11-23 | 1992-06-11 | Roussel-Uclaf | PROCEDE DE PREPARATION D'UNE PROTEINE COMPORTANT AU MOINS UN PONT DISULFURE INTRAMOLECULAIRE PAR OXYDATION, A UN pH INFERIEUR A 5,0, DE LA PROTEINE RECOMBINANTE REDUITE CORRESPONDANTE |
| US5939524A (en) * | 1991-12-09 | 1999-08-17 | The Scripps Research Institute | Platelet GPIII P1A1 and P1A2 epitopes, their preparation and use |
| AU648214B2 (en) * | 1991-12-31 | 1994-04-14 | Lucky Limited | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc. |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US6063764A (en) * | 1992-06-01 | 2000-05-16 | Washington University & Chiron Corp. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| US20030171292A1 (en) * | 1992-06-01 | 2003-09-11 | Creasey Abla A. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| EP0672144A1 (en) * | 1992-10-20 | 1995-09-20 | Chiron Corporation | Interleukin-6 receptor antagonists |
| CN1051092C (zh) * | 1993-05-21 | 2000-04-05 | 沈阳军区后勤部军事医学研究所 | 一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2的方法 |
| US5632983A (en) | 1994-11-17 | 1997-05-27 | University Of South Florida | Method for treating secondary immunodeficiency |
| US5912327A (en) * | 1996-09-30 | 1999-06-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Method of purifying chemokines from inclusion bodies |
| US6632425B1 (en) | 1997-03-20 | 2003-10-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine compositions |
| EP1935431A3 (en) | 2000-05-15 | 2008-08-13 | Health Research, Inc. | Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2 |
| ATE418542T1 (de) | 2001-03-29 | 2009-01-15 | Schering Corp | Als ccr5-antagonisten verwendbare aryloxim- piperazine |
| HUP0501111A2 (en) * | 2001-10-15 | 2007-12-28 | Chiron Corp | Treatment of severe pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor |
| AU2002304965A1 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd | Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy |
| EP1608629A1 (en) | 2003-03-24 | 2005-12-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Benzyl-pyridazinons as reverse transcriptase inhibitors |
| DE602004023863D1 (de) * | 2003-09-09 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Chromatographische auftrennung therapeutischer polypeptide |
| AU2004283294B2 (en) | 2003-10-23 | 2011-03-17 | Kineta Two, Llc | Detection of mutations in a gene associated with resistance to viral infection, OAS1 |
| WO2005044854A2 (en) | 2003-11-04 | 2005-05-19 | Chiron Corporation | Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use |
| AU2005244249A1 (en) * | 2004-03-17 | 2005-11-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Treatment of severe community-acquired pneumonia by admistration of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) |
| CU23297A1 (es) * | 2004-11-16 | 2008-07-24 | Ct De Inmunologa A Molecular | Formulaciones inmunoterapã0/00uticas para la inducciã"n de autoanticuerpos bloqueadores de la uniã"n de interleucina-2 a su receptor. su uso en el tratamiento del cã ncer |
| DE102005005542A1 (de) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Herstellung von Aldesleukin für die pharmazeutische Verwendung |
| CN101291905A (zh) | 2005-10-19 | 2008-10-22 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 苯乙酰胺nnrt抑制剂 |
| RU2304586C1 (ru) * | 2006-03-27 | 2007-08-20 | Михаил Николаевич Смирнов | Препарат интерлейкина-2 и способ его получения |
| ES2360893T3 (es) | 2006-08-16 | 2011-06-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa. |
| KR101475091B1 (ko) | 2006-12-13 | 2014-12-22 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 비뉴클레오시드 역전사 효소 억제제로서 2-(피페리딘-4-일)-4-페녹시- 또는 페닐아미노-피리미딘 유도체 |
| EA016386B1 (ru) | 2007-05-30 | 2012-04-30 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы |
| AU2008340422B2 (en) | 2007-12-21 | 2014-06-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Heterocyclic antiviral compounds |
| US20120036767A1 (en) * | 2008-08-04 | 2012-02-16 | Larach Mario C | Continuous cultivation, harvesting, and extraction of photosynthetic cultures |
| CA3144697A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Nektar Therapeutics | Conjugates of an il-2 moiety and a polymer |
| EP2655409A4 (en) | 2010-12-22 | 2015-07-01 | Univ Leland Stanford Junior | SUPERAGONISTS AND ANTAGONISTS OF INTERLEUKIN-2 |
| CN104507953B (zh) * | 2012-05-31 | 2018-05-18 | 新加坡科技研究局 | 通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白质-污染物复合物和聚集物水平的方法 |
| CA2925421C (en) | 2013-09-24 | 2023-08-29 | Medicenna Therapeutics, Inc. | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof |
| EP3134102B1 (en) | 2014-04-24 | 2019-07-03 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2 |
| AU2015328163B2 (en) | 2014-10-09 | 2020-10-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Multiple-variable IL-2 dose regimen for treating immune disorders |
| CA3067909A1 (en) | 2017-06-19 | 2018-12-27 | Medicenna Therapeutics Inc. | Uses and methods for il-2 superagonists, agonists, and fusions thereof |
| AU2018300069A1 (en) | 2017-07-11 | 2020-02-27 | Synthorx, Inc. | Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof |
| CA3071013A1 (en) | 2017-08-03 | 2019-02-07 | Synthorx, Inc. | Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases |
| KR20200086722A (ko) | 2017-11-21 | 2020-07-17 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | 인터루킨-2의 부분 효능제 |
| CR20200546A (es) | 2018-05-21 | 2021-05-18 | Nektar Therapeutics | ESTIMULADOR SELECTIVO TREG RUR20kD-IL-2 Y COMPOSICIONES RELACIONADAS |
| SG11202012299SA (en) * | 2018-06-13 | 2021-01-28 | Akron Biotechnology Llc | Method to prepare therapeutically active aldesleukin highly stable in liquid pharmaceutical compositions |
| BR112021014415A2 (pt) | 2019-02-06 | 2021-09-21 | Synthorx, Inc. | Conjugados de il-2 e métodos de uso dos mesmos |
| CN114245802B (zh) | 2019-06-20 | 2024-10-15 | 石药集团巨石生物制药有限公司 | 修饰的il-2蛋白、peg偶联物及其用途 |
| KR102653906B1 (ko) | 2020-01-14 | 2024-04-03 | 신테카인, 인크. | 편향된 il2 뮤테인 방법 및 조성물 |
| CN111676261A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-18 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种高纯度重组白介素-2的制备工艺 |
| CN111793124A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-10-20 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种去除重组白介素-2内毒素的方法 |
| IL313567A (en) | 2021-12-14 | 2024-08-01 | Lilly Co Eli | Dose transmitters for selective TREG stimulator RUR20KD-IL-2 and related preparations |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
Family Cites Families (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3897309A (en) * | 1974-02-15 | 1975-07-29 | Merck & Co Inc | Process for removing pyrogenic material from aqueous solutions |
| JPS6030291B2 (ja) * | 1978-03-20 | 1985-07-16 | 森永乳業株式会社 | 人顆粒球の分化増殖を促進するｈｇｉ糖蛋白質、ｈｇｉ糖蛋白質の製造法及びｈｇｉ糖蛋白質を含有する白血球減少症治療剤 |
| IN150740B (ja) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| JPS55148098A (en) * | 1979-05-10 | 1980-11-18 | Toray Ind Inc | Concentration and purification of interferon |
| CH648331A5 (de) * | 1979-07-31 | 1985-03-15 | Hoffmann La Roche | Homogenes fibroblasten-interferon und dessen herstellung. |
| US4390623A (en) * | 1980-10-02 | 1983-06-28 | Hooper Trading Company | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| US4315852A (en) * | 1980-11-26 | 1982-02-16 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| US4448879A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-15 | Hooper Trading Company | High yield process for in vitro production of serum-free and mitogen-free interleukin-2 |
| US4464355A (en) * | 1981-03-26 | 1984-08-07 | Hooper Trading Co. | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| US4401756A (en) * | 1981-04-14 | 1983-08-30 | Immunex Corporation | Process for preparing human interleukin 2 |
| JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法 |
| US4450103A (en) * | 1982-03-01 | 1984-05-22 | Cetus Corporation | Process for recovering human IFN-β from a transformed microorganism |
| DE3377363D1 (en) * | 1982-03-31 | 1988-08-18 | Ajinomoto Kk | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| CA1341562C (en) * | 1982-03-31 | 2007-11-27 | Tadatsugu Taniguchi | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US4778879A (en) * | 1982-04-20 | 1988-10-18 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Highly purified human interleukin 2 and method |
| DE3378128D1 (en) * | 1982-04-20 | 1988-11-03 | Sloan Kettering Inst Cancer | Purification of interleukin 2 |
| US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
| JPS58198293A (ja) * | 1982-05-12 | 1983-11-18 | Shionogi & Co Ltd | インタ−ロイキン等免疫調節因子の製造方法 |
| US4490289A (en) * | 1982-09-16 | 1984-12-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous human interleukin 2 |
| US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
| US4462940A (en) * | 1982-09-23 | 1984-07-31 | Cetus Corporation | Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides |
| DE3242851A1 (de) * | 1982-11-19 | 1984-05-24 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verfahren zur reinigung von menschlichen lymphokinen |
| JPS59116231A (ja) * | 1982-12-13 | 1984-07-05 | スロ−ン−ケツタリング・インステイテユ−ト・フオ−・キヤンサ−・リサ−チ | 抗−インタ−ロイキン−２単クロ−ン抗体 |
| US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| AU579089B2 (en) * | 1983-02-08 | 1988-11-17 | Biogen, Inc. | Human interleukin-2-like polypeptides |
| IL71275A0 (en) * | 1983-03-21 | 1984-06-29 | Sparamedica Ag | Human interleukin-2-and its preparation |
| GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
| US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| US4582799A (en) * | 1983-04-15 | 1986-04-15 | Damon Biotech, Inc. | Process for recovering nonsecreted substances produced by cells |
| IL71951A0 (en) * | 1983-06-01 | 1984-09-30 | Hoffmann La Roche | Polypeptides having interferon activity,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| WO1985000606A1 (en) * | 1983-07-19 | 1985-02-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Human il-2 and process for its preparation |
| US4464295A (en) * | 1983-08-17 | 1984-08-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Simple and rapid method for extraction of proteins from bacteria |
| US4476049A (en) * | 1983-09-20 | 1984-10-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the extraction of immune interferon |
| GB8327880D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Ajinomoto Kk | Saccharomyces cerevisiae |
| US4675383A (en) * | 1983-11-15 | 1987-06-23 | The Salk Institute For Biological Studies | Purification of T-cell growth factor |
| NZ210634A (en) * | 1983-12-23 | 1989-05-29 | Hoffmann La Roche | Purification of recombinant human interleukin - 2; pharmaceutical compositions |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| DE3575072D1 (de) * | 1984-03-28 | 1990-02-08 | Cetus Corp | Pharmazeutische zusammensetzungen von mikrobenerzeugtem interleukin-2. |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| EP0158487B1 (en) * | 1984-04-09 | 1991-08-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of interleukin-2 |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| US4782139A (en) * | 1985-10-28 | 1988-11-01 | Eli Lilly And Company | Selective chemical removal of a protein amino-terminal residue |
| US4787658A (en) * | 1986-07-29 | 1988-11-29 | Harris Jr John | Unibody bumper system |
| US5156968A (en) * | 1988-06-24 | 1992-10-20 | Genentech, Inc. | Purified yeast ubiquitin hydrolase |
-
1984
- 1984-03-28 US US06/594,223 patent/US4569790A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-02-26 CA CA000475151A patent/CA1341083C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-25 PH PH32035A patent/PH21012A/en unknown
- 1985-03-25 IN IN220/CAL/85A patent/IN162903B/en unknown
- 1985-03-26 GR GR850741A patent/GR850741B/el unknown
- 1985-03-26 DK DK135985A patent/DK166324C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-03-26 NZ NZ211569A patent/NZ211569A/en unknown
- 1985-03-27 DE DE3588189T patent/DE3588189T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 PT PT80172A patent/PT80172B/pt unknown
- 1985-03-27 EP EP85103649A patent/EP0156373B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 IL IL74733A patent/IL74733A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 ES ES541608A patent/ES8609362A1/es not_active Expired
- 1985-03-27 EP EP91113235A patent/EP0470586B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 AT AT85103649T patent/ATE81674T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 NO NO851235A patent/NO851235L/no unknown
- 1985-03-27 DE DE8585103649T patent/DE3586762T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 FI FI851231A patent/FI94960C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 ZA ZA852347A patent/ZA852347B/xx unknown
- 1985-03-28 IE IE79985A patent/IE59100B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 AU AU40467/85A patent/AU592751B2/en not_active Expired
- 1985-03-28 KR KR1019850002078A patent/KR850007083A/ko not_active Application Discontinuation
- 1985-03-28 JP JP60062195A patent/JP2599903B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-06 US US07/879,753 patent/US5419899A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-25 US US08/428,895 patent/US5614185A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-15 JP JP8143485A patent/JP2648587B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-04 HK HK98103767A patent/HK1004474A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2599903B2 (ja) | Ｉｌ−２の回収及び精製方法 | |
| EP0217645B1 (en) | Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection | |
| US4604377A (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| US4931543A (en) | Process for recovering microbially produced interleukin-2 | |
| US4748234A (en) | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts | |
| KR940003475B1 (ko) | 재조합 단백질에서 디설파이드 결합형성을 촉진시키는 방법 | |
| US4894330A (en) | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC | |
| JPS6267032A (ja) | 組換ヒトβ―インターフェロンを含有する医薬組成物及びその製造方法 | |
| EP0211835B1 (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| US5643566A (en) | Formulation processes for lipophilic proteins | |
| JP2955294B2 (ja) | 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン‐２を回収する方法 | |
| CA1283356C (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| CA1337671C (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |