FI94960B - Menetelmä ihmisen interleukiini-2:n talteensaamiseksi - Google Patents

Description

94960

Menetelmä ihmisen interleukiini-2:n talteensaamiseksi Tämä keksintö liittyy yhdistelmägeenitekniikkaan. Erityisem-5 min tämä keksintö kohdistuu sellaiseen biokemialliseen erotus- tai talteenottomenetelmään, jossa interleukiini-2:ta (IL-2) erotetaan tai otetaan talteen mikro-organismeista, jotka on transformoitu tuottamaan IL-2:ta.

10 Ihmisen myötäsyntyinen IL-2 on antigeeneille epäspesifinen, geneettisesti rajoittamaton liukoinen tekijä, jota tuottavat antigeeneillä, mitogeeneillä ja alloantigeeneillä stimuloidut punasolujen ruusukkeen muotoiset positiiviset T-solut.

Se on proteiinia, jonka molekyylipainon on esitetty olevan 15 suurin piirtein alueella 13 000 - 17 000 Daltonia (S. Gillis ja J. Watson, J Exp Med (1980) 159:1709) ja jonka isoelekt-risen pisteen on esitetty olevan suurin piirtein alueella pH

6-8,5. Ihmisen IL-2:11a on useita in vitro- ja in vivo -vaikutuksia, joista mainittakoon muun muassa ihmisen ääreisve-20 ren yksitumaisten solujen tai hiiren tymosyyttien lisäänty-misreaktioiden elvyttäminen, immuunireaktioiden elvyttäminen ihmisissä ja eläimissä bakteerien, loisten, sienten, alku-eläinten ja virusten aiheuttamia tulehduksia vastaan sekä T-solujen jatkuvien sukupolvien kasvun ylläpitäminen.

25 IL-2:ta ja IL-2-muunnoksia, joissa aminohapossa 125 oleva kysteiinijäännös on korvautunut seriinillä ja/tai ensimmäinen alaniini puuttuu, on tuotettu mikrobien avulla geenitekniikkaa käyttäen. Mikrobien avulla tuotettu IL-2 ei ole gly-30 kosyloitu ja mikro-organismit tuottavat sitä pelkistyneessä muodossa. Kun nämä mikrobien avulla tuotetut IL-2:t puhdis-.1 tetaan ja hapetetaan, niiden aktiivisuus on verrannollinen ihmisen myötäsyntyisen IL-2:n aktiivisuuteen.

35 Toimenpiteitä myötäsyntyisen IL-2:n puhdistamiseksi T-so- luista on esitetty julkaisuissa Watson, J., et ai, J Exp Med (1979) 150:849-861: Gillis, S., et ai, J Immunology (1980) 124: 1954-1962; Mochizuki, D.Y., et ai, J Immun Meth (1980) 2 94960 39:185-201; Welte, K., et ai, J Exp Med (1982) 1££: 454-464; sekä EP-patenttihakemuksissa 83103582.9 (julkaistu lokakuun 26. päivänä 1983 numerolla 92163) ja 83400938.3 (julkaistu marraskuun 16. päivänä 1983 numerolla 94317). Yleisesti ot-5 taen nämä toimenpiteet käsittävät proteiinien saostamisen viljelyalustoista ammoniumsulfaatilla, mitä seuraa kromatografinen fraktiointi.

US-patenttijulkaisussa 4 450 103 ja julkaisussa Derynck, R., 10 et ai, Nature (1980) 287:193-197 esitetään toimenpiteet IFN-S:n talteenottamiseksi sellaisesta E. coli -bakteerista, joka tuottaa IFN-S:aa. Patenttijulkaisussa kuvataan menetelmä, jossa IFN-β uutetaan solumateriaalista 2-butanolilla tai 2 -metyyli- 2 -butanolilla.

15 Tämä keksintö on menetelmä glykosyloimattoman lL-2:n talteenottamiseksi IL-2:ta tuottavista mikro-organismeista, jonka menetelmän tunnusomaisina piirteinä ovat patenttivaatimuksen 1 mukaiset vaiheet.

20

Keksintö koskee myös menetelmää glykosyloimattoman IL-2:n pelkistyneen muodon talteenottamiseksi IL-2:ta tuottavista mikro-organismeista. Pelkistyneessä muodossa olevaa IL-2:ta käytetään välituotteena valmistettaessa IL-2:ta.

25 .· Tämän menetelmän suositeltavammassa suoritusmuodossa kao-trooppisena aineena käytetään ureaa pitoisuutena, joka on noin 3,5 M - 4,5 M uutettavassa seoksessa, liuottavana aineena käytetään natriumdodekyylisulfaattia (SDS) tai nat-30 riumlauryylisarkosiiniä (sarkosyyli), liukoiseksi tehtyä IL-2:ta uutetaan edelleen 2-butanolilla tai 2-metyyli-2-butano-•| lilla ja lopullinen erottaminen suoritetaan geelisuodatuk-sella, tuloksena oleva tietyn kokoinen tuote hapetetaan ja hapetettu tuote puhdistetaan korkean suorituskyvyn nestekro-35 matografiällä, käänteisfaasia käyttäen (RP-HPLC).

Kuvassa 1 nähdään keksinnön mukaisen menetelmän kahden vaihtoehtoisen suoritusmuodon virtauskaavio, jossa menetelmässä 3 94960 lopullisena puhdistusvaiheena käytetään geelisuodatuskroma-tografiaa. Suoritusmuodossa, jota kutsutaan menetelmäksi IA, käytetään liuottavana aineena SDS:ää, suoritusmuodossa, jota kutsutaan menetelmäksi IB, käytetään liuottavana aineena 5 sarkosyyliä. Kuvassa nähdään edelleen densitometrillä saadut pyyhkäisykuviot menetelmän eri vaiheissa analysoitaessa tuote elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidigeelillä (SDS-PAGE).

10 Kuvassa 2 nähdään esimerkin 3 mukaisen tuotteen HPLC-kroma-togrammi ja SDS-PAGE-analyysi.

Kuvassa 3 nähdään esimerkin 9 mukaisen tuotteen HPLC-kroma-togrämmi.

Kuvassa 4 nähdään virtauskaavio suositeltavimmasta menetel-15 mästä mikrobien avulla tuotetun IL-2:n jatkokäsittelemisek-si.

Tässä käytetyllä käsitteeltä "IL-2" tarkoitetaan glykosyloi-matonta proteiinia, joka (a) on sellaisen mikro-organismin 20 tuottamaa, joka mikro-organismi on transformoitu ihmisen interleukiini-2:n geenillä tai ihmisen interleukiini-2:n geenin muunnoksella, joka muunnos koodaa sellaista proteiinia, jonka (a) aminohappojärjestys on vähintään olennaisesti identtinen ihmisen myötäsyntyisen interleukiini-2:n amino-25 happojärjestyksen kanssa ja (b) jonka biologinen aktiivisuus on sama kuin ihmisen myötäsyntyisen interleukiini-2:n biologinen aktiivisuus. Aminohappojärjestysten olennainen identtisyys tarkoittaa sitä, että järjestykset ovat identtiset tai että ne eroavat yhden tai useamman aminohapon välisen 3C eroavaisuuden (puuttumiset, lisäykset, korvautumiset) suhteen, joka ero ei kuitenkaan aiheuta haitallista toiminnallista erilaisuutta synteettisen proteiinin ja ihmisen myötäsyntyisen interleukiini-2:n välillä. Esimerkkejä tällaisista proteiineista ovat ne IL-2:t, jotka on kuvattu EP-pa-35 tenttihakemuksessa 83101035.0 (julkaistu lokakuun 19. päivänä 1983 julkaisunumerolla 91 529) sekä EP-patenttihakemuk-sessa 82307036.2, (julkaistu syyskyyn 14. päivänä 1983 numerolla 88 195), ne IL-2:t, jotka on kuvattu EP-patenttihake- 4 94960 muksessa 83306221.9 (julkaistu toukokuun 30. päivänä 1984 numerolla 109 748) sekä ne IL-2:t, jotka kuvataan tämän hakemuksen esimerkeissä.

5 Ohessa käytetyllä käsitteeltä "transformoitu mikro-organismi" tarkoitetaan sellaista mikro-organismia, joka on geneettisesti muunnettu tuottamaan sellaista proteiinia, jolla on ihmisen myötäsyntyisen interleukiini-2:n aktiivisuutta. Esimerkkejä tällaisista transformoiduista mikro-organismeista 10 on kuvattu mainituissa EP-patenttijulkaisuissa 88 195, 91 539 ja 109 748 sekä tämän hakemuksen esimerkeissä. Bakteerit ovat suositeltavia mikro-organismeja IL-2:n tuottamiseen. Synteettistä IL-2:ta voidaan valmistaa myös sopivasti transformoidulla hiivalla ja nisäkässoluilla. E. coli -bak-15 teeri on erityisen suositeltava.

Transformoituja mikro-organismeja kasvatetaan sopivassa kasvualustassa tyypillisesti siten, että optisen tiheyden (OD) arvo on noussut vähintään noin 30:een aallonpituudella 680 20 nm ja mieluiten optiseen tiheyteen noin 20-40 aallonpituudella 680 nm. Kasvualustan koostumus riippuu käytetystä erityisestä mikro-organismista. Alusta on vettä sisältävää alustaa, joka täyttää mikro-organismin ravinnevaatimukset. Tyypillisesti kasvualusta sisältää hiilen ja typen assimi-25 loituvia lähteitä, energian lähteitä, magnesium-, kalium- ja natriumioneja, sekä valinnaisesti aminohappoja ja puriini-ja pyrimidiiniemäksiä. [Katso Review of Medical Biology,

Lange Medical Publications, 14. painos, sivut 80-95 (1980).] TRP-promoottorin sisältävien ekspressiovektoreiden tapauk-30 sessa alustan tryptofaanipitoisuutta säädetään huolellisesti siten, että siitä tulee rajoittava tekijä sillä hetkellä, . kun IL-2-ekspressio on toivottua. E. coli -bakteerinkasva-tusalustat ovat alalla hyvin tunnettuja.

3? Sen jälkeen, kun solut on otettu talteen viljelmistä, ne voidaan tarvittaessa konsentroida pitoisuuteen, joka on noin 20-150 mg/ml, mieluiten pitoisuuteen, joka on 80-100 mg/ml (optiseen tiheyteen 40-300, mieluiten optiseen tiheyteen 5 94960 160-200 aallonpituudella 680 nm) suodattamalla, sentrifugoi-malla tai muilla tavanomaisilla menetelmillä.

Konsentroinnin jälkeen mikro-organismien solukalvo rikotaan.

5 Rikkomisen pääasiallisena tarkoituksena on helpottaa seuraa-vaa uuttamisvaihetta ja liukoiseksitekemisvaihetta. Menetelmän tässä vaiheessa voidaan käyttää tavanomaisia solun rik-komistekniikoita, kuten homogenointia, sonikointia tai pai-nekierrätystä. Suositeltavimmat menetelmät ovat sonikointi 10 tai homogenointi Manton-Gaulin-homogenisaattorilla. Rikko- misvaiheen loppukohdan saavuttamista voidaan seurata optisen tiheyden avulla, tämän suspension optisen tiheyden alentuessa tyypillisesti noin 65-85 %. Joka tapauksessa rikkomisen tulisi hajottaa olennaisesti kaikki solut siten, ettei rik-15 koutumattomia soluja kulkeudu liukoiseksisaattamisvaihee-seen. Ennen rikkomista konsentroidun tuotteen nestemäisen faasin pH säädetään tarvittaessa sellaiselle tasolle, joka helpottaa E. coli -bakteerin proteiinien poistamista myöhemmissä vaiheissa, jolloin kuitenkin IL-2-proteiini jää liu-20 kenemattomana kompleksina solujätteisiin. pH:ta voidaan sovittaa tällä tavalla sopivia puskureita lisäämällä. Useimmissa tapauksissa käytetään alueella noin 8-8,5 olevia pH-arvoja.

25 Talteenottomenetelmässä rikkomisvaihetta seuraavissa vai-. heissä on tarkoitus erottaa IL-2 E. coli -bakteerin proteiineista erittäin puhtaana (mieluummin vähintään noin 95-prosenttisena ja mieluiten vähintään noin 98-prosenttisena) ja saannon ollessa hyvä, kuitenkin säilyttäen IL-2 pelkisty-30 neessä tilassaan.

Solujen rikkomisen jälkeen kiintoaines voidaan erottaa rikottujen solujen nestemäisestä faasista ja tämä kiintoaines suspendoidaan uudestaan vesipitoiseen alustaan, joka on pus-35 kuroitu uuttamista ajatellen optimaaliseen ph-arvoon. Valinnaisesti kiintoaines voidaan pestä tässä vaiheessa puskurilla kaikkien siinä vielä olevien E. coli -bakteerin vesiliukoisten proteiinien poistamiseksi. Joka tapauksessa uutetta- 6 94960 van solususpension proteiinipitoisuus on tavallisesti alueella noin 5-60 mg/ml, mieluiten 20-40 mg/ml.

E. coli -proteiinien uuttaminen kiinteästä solumateriaalista 5 voidaan suorittaa rikkomisen kanssa samanaikaisesti tai vaiheittain rikkomisen jälkeen. Se toteutetaan mieluiten erillisenä vaiheena rikkomisen jälkeen. Uuttava aine on kao-trooppisen aineen (toisin sanoen proteiineja lievästi denaturoiva aine, joka avaa vetysidoksia ja vaikuttaa proteii-10 nien tertiääriseen rakenteeseen) vesiliuos. Uuttava aine poistaa solujätteestä selektiivisesti suurimman osan E. coli -bakteerien proteiineista, jolloin kuitenkin vähintään olennainen osa IL-2:sta on liittyneenä solujätteeseen (se jää solujätteeseen tai se on sitoutuneena siihen). Selektiivi-15 syyttä helpottaa IL-2:n hydrofobisuus sekä se tosiseikka, että IL-2 on pelkistyneessä, liukenemattomassa tilassa sellaisessa pH:ssa, joka on lähellä proteiinin isoelektristä pistettä. Tämän lisäksi IL-2:n olennainen osa saattaa olla läsnä in vivo soluun sulkeutuneina osasina, joilla on mer-20 kittävä massa, kuten on myös todettu muilla sellaisilla kloonatuilla proteiineilla, joiden ekspressiotaso E. coli -bakteerissa on korkea. Esimerkkeinä uuttavista aineista mainittakoon urea ja guanidiinihydrokloridi (guanidiinihyd-rokloridia ei tulisi käyttää, kun liuottavana aineena käyte-25 tään SDS.-ää) . Urea on suositeltavinta. Kaotrooppisen aineen . pitoisuus uutettavassa seoksessa riippuu käytettävästä erityisestä aineesta sekä uutettavassa seoksessa olevan soluma-teriaalin määrästä. Urean tapauksessa (lopullisina) pitoisuuksina panosprosesseissa käytetään noin 3,5-4,5 M liuosta, 30 mieluiten 4 M liuosta lämpötilan ollessa 25°C. Mikäli uuttaminen suoritetaan jatkuvatoimisella menetelmällä pitkähköjen . ajanjaksojen ajan, saattaa olla toivottavaa käyttää alhaisempia pitoisuuksia. Uuttamisessa käytetään alueella 20-2°C olevia lämpötiloja, jolloin huoneen lämpötilaa käytetään 35 mukavuussyistä. Sekoitusta käytetään tavallisesti parantamaan liuoksen ja kiintoaineksen välistä kosketusta, jolloin lyhennetään sitä aikaa, joka tarvitaan uutettaessa solujät-teistä muut kuin IL-2-proteiinit. Uuttoprosessin supernatan- 7 94960 tin kineettinen analyysi suoritettiin SDS-PAGE-menetelmää käyttäen, ja uuttamisen todettiin olevan jokseenkin täydellistä 15-30 minuutissa.

5 Uuttamisen jälkeen seos erotetaan kiinteään ja nestemäiseen faasiin. Tämän jälkeen kiinteässä faasissa oleva IL-2 tehdään selektiivisesti liukoiseksi saattamalla kiinteä faasi kosketuksiin neutraalin vesipitoisen puskurin kanssa, joka puskuri sisältää pelkistävää ainetta sekä liuottavaa ainet-10 ta. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää pinta-aktiivisia aineita (detergenttejä), joiden hydrofobinen-hydrofiilinen tasapaino on sopiva tekemään hydrofobisen IL-2:n liukoiseksi. Suositeltavia liuottavia aineita ovat 10-14 hiiliatomia sisältävät aikaiimetallien sulfaatit ja alkalimetallien al-15 kyylisarkosinaatit, SDS:n ja sarkosyylin ollessa erityisen suositeltavia.

Liukoiseksi tekemisessä käytettävän liuottavan aineen määrä riippuu kyseessä olevasta aineesta. Käytettäessä SDS:ää tai 20 sarkosyyliä suositeltava SDS:n tai sarkosyylin ja kiinteässä faasissa olevan proteiinin välinen suhde (painosuhde) on noin 0,5:1 - 1,4:1. Liuottava aine sisältää myös riittävän määrän pelkistävää ainetta, jolla estetään liukoiseksi tehdyn lL-2:n merkittävä hapettuminen. Tähän tarkoitukseen voi-25 daan käyttää proteiineja pelkistäviä aineita kuten ditio-, treitolia (DTT) ja 2-merkaptoetanolia. Pelkistävän aineen, kuten DTT:n, pitoisuus alustassa vaihtelee tavallisesti alueella noin 5-20 mM. Yleensä liukoiseksi tekeminen suoritetaan alueella 20-25°C olevassa lämpötilassa käyttäen sekoi-30 tusta, joka helpottaa kiinteän faasin ja liuottavan aineen välistä kosketuksiin saattamista. Korkeammat lämpötilat , saattavat tehdä epätoivottuja E. coli -bakteerin proteiineja liukoisiksi. Liukoiseksi tekeminen katsotaan täydellisesti suoritetuksi, kun näyte on seisonut 15 minuuttia tai kun 35 liuos muuttuu läpikuultavaksi. Liukenematon materiaali erotetaan liukoiseksi tekemisen jälkeen.

8 94960 IL-2:n liukoiseksi tekemisen jälkeen IL-2 voidaan valinnaisesti uuttaa tästä vesiliuoksesta pelkistävissä olosuhteissa 2-butanolilla tai 2-metyyli-2-butanolilla edelleen muun E. coli -bakteerin proteiinin poistamiseksi, joka proteiini 5 sisältää erityisesti sellaisia tiettyjä kontaminantteja, joiden molekyylipaino on erittäin lähellä IL-2:n molekyyli-painoa. Tällöin käytetään sellaisia olosuhteita (esimerkiksi ionivahvuus on alueella 0,05 - 0,15), joissa vesiliuos ja butanoli ovat keskenään olennaisesti sekoittumattomia. Suo-10 ritettaessa uuttamista orgaanisella aineella vesiliuoksen proteiinipitoisuus säädetään tarvittaessa mieluummin siten, että se on vähemmän kuin noin 6 mg/ml, mieluiten noin 0,5-4 mg/ml. Pelkistävät olosuhteet säilytetään suorittamalla uuttaminen pelkistävän aineen (kuten DTT:n) läsnäollessa. Ta-15 vallisesti butanolia lisätään liukoiseksi tehdyn IL-2:n vesiliuokseen tilavuussuhteena, joka on suurin piirtein alueella 1:1 - 3:1 (uuttava aine:vesiliuos), ja joka mieluiten on noin 1:1. Uuttaminen voidaan suorittaa panoksena tai jatkuvatoimisena toimenpiteenä. Tavallisesti lämpötila on alu-20 eella 20-100°C ja pH on tavallisesti noin 4-9, mieluiten noin 5-6. Liuoksen ja butanolin välinen kosketusaika ei ole kriittinen, ja suhteellisen lyhyitä aikoja, suuruusluokaltaan muutama minuutti, voidaan käyttää. Sen jälkeen, kun uuttaminen on suoritettu loppuun, vesifaasi ja butanolifaasi 25 erotetaan ja IL-2 erotetaan butanolifaasista. Suositeltava • ; menetelmä IL-2:n erottamiseksi butanolifaasista on saostami-nen hapolla. Tämä suoritetaan siten, että butanolifaasi lisätään vesipitoiseen puskuriin, pH 7,5, kunnes orgaaninen faasi on liuennut (arviolta 2-3 tilavuusosaa puskuria or-30 gaanisen aineen tilavuusosaa kohden), minkä jälkeen pH:ta alennetaan noin arvoon 5,5 - 7,0, mieluiten arvoon 6,0 - 6,2 saamaan aikaan IL-2.-n saostuminen.

Menetelmän seuraavana vaiheena on IL-2:n ja uuttamisvaiheen 35 tai -vaiheiden jälkeen jääneiden E. coli -bakteerin kaikkien kontaminanttien erottaminen, mikä optimaalisesti suoritetaan liuottavasta aineesta. Tähän tarkoitukseen käytetään geeli -suodatuskromatografiaa, RP-HPLC:tä tai geelisuodatuskroma- 9 94960 tografian ja RP-HPLC:n yhdistelmää. Geelisuodatuskromatogra-fia toteutetaan mieluiten kahdessa vaiheessa, joissa poistetaan sekä sellaiset pyrogeeniset komponentit että proteii-nikontaminantit, joiden molekyylipaino on suurempi tai pie-5 nempi kuin IL-2:n. (IL-2:n molekyylipaino on suurin piirtein 15.5 kilodaltonia.) Kaupallisesti on saatavana sellaisia geelejä, jotka kykenevät fraktioimaan tämän liuoksen siten, että IL-2 saadaan erotettua näistä kontaminanteista. Sephac-ryl S-200 on suositeltava geeli molekyylipainoltaan suurem-

10 pien komponenttien poistamiseen ja Sephadex G-25, G-75 tai G-100 merkkiset geelit ovat suositeltavia geelejä molekyyli-painoltaan alhaisten kontaminanttien poistamiseen. Geelisuo-datukset ajetaan tavallisesti puskuroiduilla liuoksilla (pH

5.5 - 7,0), jotka sisältävät noin 0,1 % - 1,0 % liuottavaa 15 ainetta ja noin 1-10 mM pelkistävää ainetta. Kolonni mitoitetaan siten, että toivottujen komponenttien sopiva resoluutio saavutetaan.

RP-HPLC on vaihtoehto geelisuodatukselle. RP-HPLC:n avulla 20 voidaan myös liuoksesta poistaa sellaisia molekyylejä, joiden molekyylipainot ovat lähellä IL-2:n molekyylipainoa, mistä syystä niitä ei voida poistaa täydellisesti geelisuo-datuksella. Lisäksi RP-HPLC:llä saadaan myös kontaminantit, kuten bakteeriperäinen endotoksiini, tehokkaasti poistettua.

25 Tämän johdosta RP-HPLC:tä voidaan käyttää lopullisena puh-; distusvaiheena geelisuodatuksen jälkeen. Tällöin RP-HPLC:ssä voidaan käyttää sellaisia kantaja-aineita (stationäärifaaseja) , joiden avulla saavutetaan proteiinien hyvä resoluutio. Esimerkkejä suositeltavista kantaja-aineista ovat C-4-, C-8-30 tai C-18-faasit huokoskooltaan 300 Ängströmin kantaja-aineiden pinnalla. Erottaminen suoritetaan happamassa pH:ssa, joka on vähemmän kuin noin 2,3, tavallisesti 2,1 - 2,3, jotta IL-2 pysyy liuenneena. Tässä suhteessa liukoiseksi teke-misvaiheesta (geelisuodatus) peräisin olevan liuoksen pH 35 tulisi mielellään asettaa tälle alueelle. Liuos kaadetaan RP-HPLC-koionniin ja se adsorboituu stationäärifaasin pinnalle. IL-2:n eluoimiseen kolonnista käytetään vähitellen muuttuvaa liuotinjärjestelmää, joka käsittää orgaanisen ha- 10 94960 pon, kuten etikkahapon tai trifluoroetikkahapon, sekä orgaanisen liuottimen, kuten propanolin tai asetonitriilin. Suositeltavimmat liuotinjärjestelmät ovat etikkahappo - pro-panoli, trifluoroetikkahappo - propanoli ja trifluoroetikka-5 happo - asetonitriili. Käytettäessä etikkahappo - propanoli -järjestelmässä IL-2 eluoituu propanolipitoisuudessa noin 40 %, trifluoroetikkahappo - propanoli -järjestelmässä pro-panolipitoisuudessa noin 50 % ja trifluoroetikkahappo - asetonitriili -järjestelmässä asetonitriilipitoisuudessa noin 10 62 %. Mukavuussyistä eluentissa olevan orgaanisen liuottimen pitoisuus nostetaan tavallisesti nopeasti tasolle, joka on hieman sen liuotinpitoisuuden alapuolella, jossa pitoisuudessa IL-2 eluoituu, minkä jälkeen gradientin annetaan muuttua hitaasti, muutosnopeuden ollessa suurin piirtein alueel-15 la 0,1% -1,0% minuutissa.

Heti, kun IL-2 on saatu talteen kromatografiavaiheesta, se lyofilisoidaan ja suspendoidaan uudestaan neutraaliin vesipitoiseen puskuriin, joka sisältää pelkistävää ainetta (jot-20 ta IL-2 pysyisi pelkistyneessä tilassa) sekä liuottavaa ainetta (jotta se pysyisi liuenneena). Tässä muodossaan IL-2 on stabiili ja sitä voidaan säilyttää jatkokäsittelyjä tai muunlaista muuntamista varten ennen sen käyttää.

25 Vaihtoehtoinen ja suositeltava menetelmä on IL-2:n hapetta-minen sen jälkeen, kun se on erotettu geelisuodatuksella, jolloin hapetettu tuote puhdistetaan RP-HPLC:llä tai geeli-suodatuksella, mitä seuraa RP-HPLC-käsittely. Täten saadaan geelisuodatuksessa läpipäässeet kontaminantit sekä haitalli-30 set hapettumistuotteet tehokkaasti poistettua. Suositeltavassa hapettamismenetelmässä täysin pelkistynyt, mikrobien avulla tuotettu synteettinen proteiini, jonka aminohappojärjestys on olennaisesti identtinen jonkin hyödyllisen proteiinin aminohappojärjestyksen kanssa, jossa aminohappojärjes-35 tyksessä on kysteiinejä, jotka tässä hyödyllisessä proteiinissa ovat sitoutuneet molekyylin sisäisesti muodostaen kystiinin, hapetetaan halutulla tavalla siten, että kyste-iinit hapettuvat selektiivisesti muodostaen kystiinin. Tässä 11 94960 menetelmässä täysin pelkistyneen, mikrobien avulla tuotetun synteettisen proteiinin annetaan reagoida o-iodosobentsoaa-tin kanssa, joka o-iodosobentsoaatti hapettaa kysteiinejä selektiivisesti vesipitoisessa väliaineessa, pH-arvon olles-5 sa vähintään noin puoli pH-yksikköä mainittujen kysteiinien pK„-arvon alapuolella, jolloin synteettisen proteiinin pitoisuus reaktioseoksessa on vähemmän kuin noin 5 mg/ml, ja jolloin o-iodosobentsoaatin ja proteiinin välinen moolisuhde on vähintään stökiometrinen, kuitenkin edellyttäen että reakti-10 on loppujakson aikana o-iodosobentsoaattia on läsnä ylimäärin. Hapetetun tuotteen RP-HPLC-puhdistaminen voidaan suorittaa edellä esitetyissä olosuhteissa pelkistävän aineen puuttuessa ja käyttäen detergenttiä, jonka pitoisuus on yhtä suuri tai pienempi kuin edellä kuvatussa geelisuodatuksessa 15 käytettyjen detergenttien pitoisuudet.

Kromatografiavaiheen (-vaiheiden) jälkeen IL-2:n puhtaus on vähintään noin 95 % ja tavallisesti vähintään noin 98 %.

Tämä erittäin puhdas materiaali sisältää vähemmän kuin noin 20 5 ng endotoksiinia, tavallisesti vähemmän kuin noin 0,01 ng endotoksiinia 100 000 IL-2:n aktiivisuusyksikköä kohden.

Keksinnön mukaista menetelmää kuvataan edelleen seuraavissa esimerkeissä.

25 . Esimerkki 1 IL-2 otettiin talteen E. coli K-12 -bakteerin kannasta MM294, joka oli transformoitu plasmidilla pLWl (bakteeri on 30 tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection elokuun 4. päivänä 1983 taltiointinumerolla 39 405) seuraa-valla tavalla: Tätä E. coli -bakteeria kasvatettiin fermenttorissa käyttäen 35 seuraavaa kasvatusalustaa: 12 94960

(NH4)2S04 150 mM

KH2P04 21,6 mM

Ca3-sitraatti 1,5 mM

ZNS04 · 7H20 3 0 mM

5 MnS04 · H20 30 mM

CuS04 · 5H20 1 mM

pH on asetettu arvoon 6,5 2,5 N NaOH-liuoksella, autoklavoi-tu. Autoklavoinnin jälkeen lisättiin steriilisti 10

MgS04 · 7H20 3 mM

FeS04 100 μΜ L-tryptofaani 14 mg/1

Tiamiini-HCl 20 mg/l 15 Glukoosi 5 g/l

Tetrasykliini 5 mg/l

Etanoli (valinnainen) 2 %

Kasaminohapot 2 % 20 Tarvittaessa lisättiin vaahdonestoaineena Dow Corning Antifoam B:tä 20 % liuoksena, glukoosia 50 % liuoksena ja KOHrta 5N liuoksena.

Fermenttorin pH säilytettiin arvossa 6,8 5N KOH-liuoksella.

25 Jäännösglukoosin pitoisuus säilytettiin arvossa 5-10 g/l, liuennut happi 40 %:ssa ja lämpötila 37± i°C:ssa. Kasaminohapot (20 % varastoliuos) lisättiin, kun OD6go oli noin 10. Tuotteen talteenottaminen tapahtui kolmen tunnin kuluttua siitä, kun OD680 oli saavuttanut suurin piirtein arvon 20.

30

Talteenotettu materiaali konsentroitiin kuitusuodatuksella .! onttoja kuituja käyttäen ja/tai sentrifugoimalla 20-40 g (märkäpaino) tätä tiivistettä suspendoitiin uudestaan 200 ml:aan liuosta, joka käsitti 50 mM Trisrä ja 1 mM etyleeni-35 diamiinitetraetikkahappoa (EDTA) (pH 8,1 - 8,5) (Tris/EDTA-puskuri). Tätä suspensiota sentrifugoitiin nopeudella 3 000 - 4 000 x g 10 minuuttia, supernatantti poistettiin ja kiintoaines suspendoitiin uudestaan 200 ml:aan Tris/EDTA- 94960 13 puskuria 4°C:n lämpötilassa. Suspensio kaadettiin sonikoin-tilaitteeseen (Heat Systems, malli W-375) ja sitä sonikoi-tiin 4°C:ssa 45 minuuttia (loppupiste = noin 85 % alentunut OD680) käyttäen suurta mittapäätä, pulssittaen 50 % mekaani-5 sella teholla, jolloin tehon asetuksena oli "9". Vaihtoehtoinen rikkomistekniikka on suspension ohjaaminen kolmasti Manton-Gaulin-homogenisaattorin läpi asetusarvon ollessa M-l. Solujätteet erotettiin rikotusta solukosta sentrifugoi-malla nopeudella 4500 x g 10 minuuttia.

10

Solujätteet suspendoitiin uudestaan 60 ml Tris/EDTA-puskuria huoneen lämpötilassa ja tähän suspensioon lisättiin yhtä suuri tilavuus Tris/EDTA-puskurissa olevaa 8 M ureaa (Schwarz/Mann; erittäin puhdasta) viiden minuutin aikana 15 nopeasti sekoittaen (urean lopullinen pitoisuus oli 4 M) .

Sen jälkeen kun suspensiota oli sekoitettu jatkuvasti ja hitaasti 15-30 minuutin ajan, suspensio sentrifugoitiin nopeudella 12 000 x g 15 minuuttia uuttuneen solujätteen tal-teensaamiseksi. (Mikäli kiinteätä faasia ei muodostu, super-20 natantti otetaan talteen ja siihen lisätään yhtä suuri tilavuus Tris/EDTA-puskuria ja seos sentrifugoidaan uudestaan.) Tämän jälkeen uutettu solujäte suspendoidaan uudestaan 9 ml:aan liuosta, joka käsittää 50 mM natriumfosfaattia (pH 25 6,8), 1 mM EDTA:a, 10 mM DTT:ta 20°C:n lämpötilassa. Suspen- sioon lisätään 1 ml 20 % SDS:ää, ja suspensiota sekoitetaan voimakkaasti 5 minuuttia. Nestemäinen faasi otetaan talteen suspensiosta sentrifugoimalla nopeudella 12 000 x g 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen nestemäinen faa-30 si lämmitetään 40°C:n lämpötilaan, jossa sitä pidetään 15 minuuttia, jotta taattaisiin se, että liuoksessa oleva IL-2 pelkistyy täysin. Tästä raakauutteesta otettu näyte analysoitiin l5-%:isella SDS-PAGE-menetelmällä. Kuvassa 1 nähdään tämän analyysin densitometrinen pyyhkäisykuvio (menetelmän 35". IA tuote), joka osoittaa, että uute sisälsi noin 37 % IL-2: ta.

14 94960 IL-2 erotettiin liuoksesta geelisuodatuskromatografisesti seuraavalla tavalla. Liuos kaadettiin ulottuvuuksiltaan 2,6 cm x 100 cm olevaan S-200-kolonniin, jota eluoitiin liuoksella, jonka koostumus oli 50 mM natriumfosfaattia (pH 6,8), 5 1 mM EDTA:aa, 1 mM DTT:tä ja 1 % SDS:aa. Kolonnista eluoitu- nut liuos kerättiin 4 ml:n fraktioiksi, ja näiden fraktioiden näytteet analysoitiin 15 % SDS-PAGE-minigeeleillä, jotka värjättiin Coomassie-sinisellä. Ne fraktiot, jotka sisälsivät kaikkein vähiten kontaminantteja (kontaminantteja oli 10 kaikkein vähiten noin 35 kilodaltonin, 16-18 kilodaltonin ja 12 kilodaltonin kohdalla), yhdistettiin ja konsentroitiin 5-10 ml:ksi ultrasuodattamalla (Amicon YM5-ultrasuodatin). Tämä tiiviste kaadettiin ulottuvuuksiltaan 2,6 cm x 100 cm olevaan G-100-kolonniin, jota eluoitiin kuten edellä, paitsi 15 että SDS:n pitoisuus oli 0,1 % eikä 1 %. Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE-menetelmällä ja puhtaimmat fraktiot yhdistettiin. Piirustuksessa (fig. 1) nähdään kromatografisesti käsitellyn tuotteen densitometrillä saatu pyyhkäisykuvio. Analyysi osoitti, että tuote oli 98 % risen puhdasta. Tämän IL-20 2:n N-päätteinen aminohappojärjestys on sama kuin ihmisen myötäsyntyisessä molekyylissäkin, paitsi että N-pään ensimmäinen alaniini puuttuu.

Esimerkki 2 25 Esimerkin 1 toimenpiteet toistettiin käyttäen kuitenkin ·.’ liuottavana aineena 2 % sarkosyyliä 2 % SDSrn sijaan ja käyttäen sarkosyyliä SDSrn asemesta kromatografiakolonneis-sa. Kuvassa 1 nähdään tämän raakauutteen densitometrillä saatu pyyhkäisykuvio käyttäen liuottavana aineena sarkosyy-30 liä (menetelmän IB raakauute). Kuten voidaan todeta, käytettäessä sarkosyyliä SDSrn sijasta saatiin puhtaampaa tuotetta * (58-%:inen tuote verrattuna 37 %:iseen tuotteeseen) IL-2m • · saannon ollessa samaa suuruusluokkaa (50 % ja 60 %).

35 Esimerkki 3

Esimerkin 1 mukaisesta menetelmästä toistettiin ne vaiheet, jotka edelsivät urealla tapahtuvaa uuttoa, minkä jälkeen 15 94960 liukoiseksi tekeminen ja kirkastaminen suoritettiin esitetyllä tavalla.

IL-2 erotettiin liuoksesta RP-HPLC:tä käyttäen seuraavasti.

5 Liuos laimennettiin 10-kertaiseksi 0,1 % trifluoroetikkahap-poon (TFA) ja kaadettiin sisähalkaisijaltaan 4,6 mm:n ja pituudeltaan 5 cm:n Brownlee Aquaport RP-300-kolonniin, joka oli tasapainotettu 0,1 % TFA:11a. IL-2 eluoitiin 45 minuutin aikana asetonitriilin 30-60 % gradientilla, joka sisälsi 10 0,1 % TFA:ta. Kuvassa 2 esitetään tämän tuotteen hopealla värjätty SDS-PAGE-analyysi.

Esimerkki 4

Esimerkin 1 mukaisesta menetelmästä toistettiin ne vaiheet, 15 jotka edelsivät geelisuodatuskromatografiaa. Liukoinen, kirkastettu ja pelkistetty materiaali alistettiin G-100-geelil-lä suoritettuun kromatografiavaiheeseen käyttäen 0,1 % SDS:ää, kuten esimerkissä 1 on esitetty. Yhdistetyt, huipun sisältävät IL-2:n fraktiot puhdistettiin edelleen RP-HPLC:tä 20 käyttäen, kuten esimerkissä 3 on esitetty. Tuloksena oleva puhdistettu, pelkistetty IL-2 hapetettiin ja alistettiin edelleen RP-HPLC-käsittelyyn, kuten esimerkissä 3 esitetään.

Esimerkki 5 25 Esimerkin 1 mukaisesta menetelmästä toistettiin ne vaiheet, jotka edelsivät G-100-kolonnia. Esimerkin 3 mukainen menetelmä toistettiin käyttäen liuotinjärjestelmänä 1 M etikka-hapossa olevaa propanolia. IL-2 eluoitiin 200 minuutin aikana propanolin 35-60 % gradientilla. Kolonnin ulottuvuudet 3G olivat joko 10 mm sisähalkaisija x 30 cm pituus tai 48 mm sisähalkaisija x 50 cm pituus, ja kolonni oli pakattu sili-* · kageelillä, jonka huokoskoko oli suuri ja johon oli sidottu toinen faasi. Tämä käytetty, huokoskooltaan suuri silikagee-li, johon oli sidottu toinen faasi, oli Vydac TP214:ää.

35 Tuotteen puhtaus ja sen saanto olivat verrannolliset esimerkin 3 vastaaviin arvoihin.

94960 16

Esimerkki 6

Esimerkin 3 mukainen menetelmä toistettiin käyttäen liuotin-järjestelmänä 0,1 % TFA.-ssa olevaa propanolia. IL-2 eluoi-tiin 120 minuutin aikana propanolin 35-60 % gradientilla.

5 Kolonni ja kantaja-aineet olivat samat kuin esimerkissä 5. Tuotteen puhtaus ja sen saanto olivat verrannolliset esimerkin 3 vastaaviin arvoihin.

Esimerkki 7 10 Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin, paitsi että E.coli -bakteerin tuottama IL-2 oli sellaista, jota kuvataan merkinnällä des-Ala Ser125 IL-2. Tämän IL-2:n aminohappojärjestys poikkeaa synnynnäisen molekyylin aminohappojärjestyksestä siten, että aseman 125 kysteiini on muuttunut serii-15 niksi ja että N-pään ensimmäinen alaniinijäännös puuttuu. E. coli -bakteerin des-Ala Ser125 IL-2:ta tuottava kanta tallennettiin kantakokoelmaan American Type Culture Collection maaliskuun 6. päivänä 1984 numerolla 39 626.

20 Esimerkki 8

Esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin, paitsi että IL-2 otettiin talteen sellaisesta E. coli K-12 -bakteerin kannasta, joka oli transformoitu plasmidilla pLW55 (tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection marraskuun 25 18. päivänä 1983 numerolla 39 516). Tämän molekyylin amino- happojärjestys poikkeaa synnynnäisen molekyylin aminohappo-järjestyksestä siten, että sen N-päässä on metioniini ja että asemassa 125 oleva kysteiini on muuttunut seriiniksi.

3C Esimerkki 9

Des-Ala Ser125 IL-2 tuottavia E. coli -bakteereita kasvatet- * , tiin, solut rikottiin ja solujäte otettiin talteen rikotusta solukosta käyttäen esimerkin l mukaisia yleisiä toimenpiteitä. Solujäte suspendoitiin puskuriin, joka sisälsi 50 mM 35 Tris:a, 1 mM EDTA:aa, pH 8,5, suurin piirtein suhteessa 1:4,5 (w/v). DTT:tä lisättiin siten, että sen lopullinen pitoisuus oli 25 mM. Samassa puskurissa olevaa 8 M ureaa lisättiin hitaasti sekoittaen siten, että sen lopulliseksi

rl Mil «il» ( I I «I

17 94960

pitoisuudeksi saatiin 4 M, minkä jälkeen sekoittamista jatkettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. 30 minuutin kuluttua jäljelle jäänyt liukenematon materiaali sentrifugoi-tiin. Tuloksena oleva tahna suspendoitiin uudestaan 50 mM 5 natriumfosfaattipuskuriin, joka sisälsi 1 mM EDTA:aa, pH

7,0. Tämän jälkeen tämä suspensio tehtiin liukoiseksi lisäämällä siihen kiinteätä SDSrää siten, että sen lopullinen pitoisuus oli 5 % w/v.

10 5 % SDS-liuos laimennettin 2-%:iseksi SDS:n suhteen 0,1 M

Na2P04-liuoksella, pH 8,0. Proteiinipitoisuus määritettiin, pH asetettiin arvoon 8,5 ja DTTrtä lisättiin pitoisuudeksi 50 mM ja EDTA:aa lisättiin pitoisuudeksi 2 mM. Seos lämmitettiin 40°C:n lämpötilaan N2-ilmakehässä IL-2:n pelkistämi-15 seksi. Tämän jälkeen seos jäähdytettiin ja sen pH asetettiin arvoon 5,0.

Sitten tämä liuos uutettiin huoneen lämpötilassa suhteessa 1:1 (v/v) 2-butanolilla, joka sisälsi 1 mM DTT:tä. Viiveaika 20 oli 2-2,5 minuuttia. Uuttaminen suoritettiin neste-nestefaasien erottimessa käyttäen virtausnopeutta 200 ml/min. Orgaaninen uutos erotettiin ja sen pH asetettiin arvoon 8,0 NaOHrlla. Sitten tämä uutos lisättiin hitaasti liuokseen, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää, 10 mM Na2P04:ää, 2 mM DTTrtä, 25 pH 6, ja sekoitettiin 15-20 minuuttia. Tuloksena ollut sakka erotettiin ja tuloksena saatu tahna suspendoitiin uudestaan PBSrssä olevaan 5 % SDS:ään. Liuos kirkastettiin sentrifu-goimalla ja se pelkistettiin kuten edellä. Pelkistämisen jälkeen liuoksen pH asetettiin arvoon 5,5 etikkahapolla.

3C Liuos puhdistettiin geelisuodatuksella käyttäen S-200- ja G-25-kolonneja. Tuloksena saatu puhdistettu ja pelkistynyt IL-,· 2 hapetettiin ja hapetettu tuote puhdistettiin G-25-kromato- grafisesti, mitä seurasi RP-HPLC esimerkin 3 mukaisesti. Tuloksena olevan yhdistelmägeneettisen IL-2-tuotteen IL-2:n 35 pitoisuus on suurempi kuin noin 95 %, määritettynä pelkistävällä SDS-PAGE-analyysillä, sen endotoksiinipitoisuus on vähemmän kuin noin 0,1 nanogrammaa/mg IL-2:ta, ja se on olennaisesti vapaa pyrogeeneistä, määritettynä U.S.P.-jäniksen 18 94960 pyrogeenikokeella, käyttäen annostusta 3,3 x 10s yksikköä kilogrammaa kohden. Kuten edellä todettiin, endotoksiinien pitoisuus on vähemmän kuin noin 5 nanogrammaa, ja mieluiten vähemmän kuin noin 0,01 nanogrammaa endotoksiinia 100 000 5 IL-2:n aktiivisuusyksikköä kohden. Tavallisesti tämän keksinnön mukaisella menetelmällä puhdistettujen yhdistelmä-geneettisten IL-2-tuotteiden IL-2-pitoisuus on suurempi kuin 98 %, määritettynä pelkistävällä SDS-PAGE-analyysillä tai RP-HPLC-menetelmällä, kuten kuvasta 3 nähdään, minkä lisäksi 10 ne ovat olennaisesti vapaat endotoksiineista ja pyrogeeneis-tä, kuten edellä esitetään.

Esimerkissä 9 esitetyn menetelmän muunnos, jollaista voitaisiin käyttää tuotettaessa IL-2:ta suuremmassa mitassa, esi-15 tetään kuvassa 4. Kuvassa 4 esitetty menetelmä eroaa esimerkissä 9 kuvatusta menetelmästä siinä suhteessa, että (1) puskureissa on pieniä muutoksia, (2) etikkahapon ja propano-lin muodostamaa liuotinjärjestelmää (esimerkki 5) käytetään RP-HPLC-vaiheessa ja että (3) menetelmään on sisällytetty 20 hapettamisen jälkeen seuraava laimennus/diasuodatus S-200- geelisuodatuksena sekä ultrasuodatusvaihe. Kuvassa 4 esitettyä menetelmää voidaan muokata lukuisia parannuksia käyttäen, esimerkiksi toisen S-200-kolonnilla ja l % SDSrllä suoritetun vaiheen jälkeen IL-2-liuos laimennetaan 1:10, jol-25 loin SDS:n pitoisuudeksi saadaan 0,1 %, minkä jälkeen liuos Ί! diasuodatetaan 10 mM fosfaattipuskuria vastaan, pH:n ollessa 7,5 ja SDS:n pitoisuuden 5 ppm. Tämän jälkeen tämä liuos konsentroidaan siten, kuin sopivat käytetyt annostukset sitä vaativat.

• ·

Claims (10)

19 94960

1. Menetelmä ihmisen glykosyloimattoman interleukiini-2:n (IL-2) taiteensaamiseksi IL-2:ta sisältävästä transformoidusta mikro-organismista, tunnettu siitä, että menetelmä 5 käsittää vaiheet, joissa a) mikro-organismin solukalvo rikotaan; b) rikotut solut uutetaan sellaisen kaotrooppisen aineen, kuten urean, vesiliuoksella, joka uuttaa selektiivisesti muut kuin IL-2-proteiinit tästä solumateriaalista; 10 c) uuttoseoksen kiinteässä faasissa oleva IL-2 saatetaan liukoiseksi sellaisen liuottavan aineen, kuten sarko-syylin tai SDS:n, vesiliuoksella, joka liuottava aine muodostaa IL-2:n kanssa vesiliukoisen kompleksin, mainitun liuoksen sisältäessä pelkistävää ainetta, kuten 15 ditiotreolia tai 2-merkaptoetanolia; ja d) pelkistyneessä muodossa oleva IL-2 erotetaan tuloksena olevasta liuoksesta pelkistävissä olosuhteissa menetelmällä, joka on valittu seuraavista: geelisuodatus, käänteisfaasia käyttävä korkeapainenestekromatografia 20 (RP-HPLC), uutto tai jokin näiden yhdistelmä, e) vaiheesta (d) saatu IL-2 hapetetaan esimerkiksi O-jodo-sobentsoaatilla ja tuloksena oleva hapetettu IL-2 puhdistetaan korkeapainenestekromatografiän (HPLC) avulla käänteisfaasia käyttäen. 25 :, 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että kaotrooppinen aine on ureaa ja että liuottava aine on natriumdodekyylisulfaattia tai natriumlauryylisarkosii-nia. 30

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kannetecknat av att det 5 kaotropa ämnet är urea och det solubiliserande ämnet är nat- riumdodecylsulfat eller natriumlaurylsarkosin.

3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att steg b) utförs vid ett basiskt pH. 10

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet- ’ tu siitä, että vaihe (b) suoritetaan emäksisessä pH:ssa.

4. Förfarande enligt patentkrav l, 2 eller 3, kännetecknat av att steg d) utförs genom gelfiltrering eller genom omvänd fas högtrycksvätskekromatografi. 15 5. Förfarande enligt patentkrav 1, 2 eller 3, kännetecknat av att steg d) utförs genom att isolera en IL-2 innehällande fraktion frän lösningen genom gelfiltrering och att rena det resulterande IL-2:et frän fraktionen genom omvänd fas högtrycksvätskekromatograf i . 20

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tun- 35 nettu siitä, että vaihe (d) suoritetaan geelisuodatuksen avulla tai korkeapainenestekromatografiän avulla, jossa nes-tekromatografiässä käytetään käänteisfaasia. 20 94960

5. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe (d) suoritetaan siten, että IL-2:n sisältävä fraktio eristetään liuoksesta geelisuodatuksella, ja että tästä fraktiosta saatu, tuloksena oleva IL-2 puhdis- 5 tetaan korkeapainenestekromatografian avulla käänteisfaasia käyttäen.

6. Förfarande enligt patentkrav 1, 2 eller 3, kännetecknat av att steg d) utförs genom: i) att extrahera IL-2 frän den vattenhaltiga lösningen frän c) med 2-butanol eller 2-metyl-2-butanol; 25 ii) att utfälla IL-2 med syra frän extraktet; och ? iii) att rena det med syra utfällda IL-2:et genom gelfiltre ring.

6. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe (d) suoritetaan siten, että 10 i) IL-2 uutetaan vaiheen (c) vesiliuoksesta 2-butanolilla tai 2-metyyli-2-butanolilla; ii) IL-2 saostetaan hapolla tästä uutoksesta; ja iii) hapolla saostettu IL-2 puhdistetaan geelisuodatuksella.

7. Förfarande för att utvinna humant oglykosylerat inter-30 leukin-2 (IL-2) i reducerad form frän en transformerad mik- roorganism innehällande IL-2, kännetecknat av att förfaran-det innefattar stegen, a) att sönderdela mikroorganismens cellmembran; b) att extrahera de sönderdelade cellerna med en vatten- 35 haltig lösning av ett kaotropt ämne, säsom urea, som extraherar icke IL-2 proteiner selektivt frän det cel-lulära materialet; 23 94960 c) att solubilisera IL-2 i den fasta fasen av extraktions-blandningen med en vattenhaltig lösning av ett solubi-liserande äinne, säsom sarkosyl eller SDS, som bildar ett vattenlösligt komplex med IL-2, vilken lösning in- 5 nehäller ett reducerande ämne, säsom ditiotreol eller 2-merkaptoetanol; och d) att separera IL-2 i reducerad form frän den resulterän-de lösningen under reducerande betingelser med ett för-farande valt bland följande: gelfiltrering, omvänd fas 10 högtrycksvätskekromatografi (RP-HPLC), extrahering el ler nägon kombination av dessa.

7. Menetelmä pelkistyneessä muodossa olevan ihmisen gly- kosyloimattoman interleukiini-2:n (IL-2) talteensaamiseksi IL-2:ta sisältävästä transformoidusta mikro-organismista, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, joissa a) mikro-organismin solukalvo rikotaan; 20 b) rikotut solut uutetaan sellaisen kaotrooppisen aineen, kuten urean, vesiliuoksella, joka uuttaa selektiivisesti muut kuin IL-2-proteiinit tästä solumateriaalista; c) uuttoseoksen kiinteässä faasissa oleva IL-2 saatetaan liukoiseksi sellaisen liuottavan aineen, kuten sarko- 25 syylin tai SDS:n, vesiliuoksella, joka liuottava aine : muodostaa IL-2:n kanssa vesiliukoisen kompleksin, mai nitun liuoksen sisältäessä pelkistävää ainetta, kuten ditiotreolia tai 2-merkaptoetanolia; ja d) pelkistyneessä muodossa oleva IL-2 erotetaan tuloksena 30 olevasta liuoksesta pelkistävissä olosuhteissa menetel mällä, joka on valittu seuraavista: geelisuodatus, käänteisfaasia käyttävä korkeapainenestekromatografia (RP-HPLC), uutto tai jokin näiden yhdistelmä.

8. Mellanproduktskomposition av renad rekombinant interleukin-2 (IL-2) i reducerad form, kännetecknad av att IL-2 15 koncentrationen är minst 95 % bestämd med reducerande SDS- PAGE-analys och koncentrationen av endotoxiner är under cir-ka 0,1 nanogram/mg IL-2, och vilken är väsentligen fri frän pyrogener bestämd med U.S.P. hares pyrogentest med en dos av 3,3 x 105 enheter per kilogram, varvid IL-2 är erhället med 20 ett förfarande enligt patentkrav 7.

8. Puhdistettu rekombinanttinen interleukiini-2:n (IL-2) välituotekoostumus pelkistetyssä muodossa, tunnettu siitä, että IL-2:n pitoisuus on vähintään 95 % määritettynä pelkistävällä SDS-PAGE-analyysillä ja endotoksiinien pitoisuus on 21 94960 vähemmän kuin noin 0,1 nanogrammaa/mg IL-2:ta ja joka on olennaisesti vapaa pyrogeeneista määritettynä U.S.P. jäniksen pyrogeenikokeella käyttäen annostuksena 3,3 x 10J yksikköä kilogrammaa kohden, IL-2:n ollessa saatu patenttivaati-5 muksen 7 mukaisella menetelmällä.

9. Mellanproduktskomposition av renat rekombinant IL-2 i reducerad form enligt patentkrav 8, kännetecknad av att dess IL-2 koncentration är större än cirka 98 % bestämd med redu- 25 cerande SDS- PAGE-analys. »

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen puhdistettu rekombinant-tinen IL-2:n välituotekoostumus pelkistetyssä muodossa, tunnettu siitä, että sen IL-2-pitoisuus on suurempi kuin noin 10 98 % määritettynä pelkistävällä SDS-PAGE-analyysillä.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen puhdistettu rekom-binanttinen IL-2:n välituotekoostumus pelkistetyssä muodossa, tunnettu siitä, että tämä IL-2 on des-Ala Ser125 IL-2:ta. 15 l. Förfarande för att utvinna humant oglykosylerat interleukin- 2 (IL-2) frän en transformerad mikroorganism innehäl-lande IL-2, kannetecknat av att förfarandet innefattar ste- 20 gen, a) att sönderdela mikroorganismens cellmembran; b) att extrahera de sönderdelade cellerna med en vatten-haltig lösning av ett kaotropt ämne säsom urea som ex-traherar icke IL-2 proteiner selektivt frän det cellu- 25 lära materialet; : c) att solubilisera IL-2 i den fasta fasen av extraktions- blandningen med en vattenhaltig lösning av ett solubi-liserande ämne, säsom sarkosyl eller SDS, som bildar ett vattenlösligt komplex med IL-2, vilken lösning in- 30 nehäller ett reducerande ämne, säsom ditiotreol eller 2-merkaptoetanol; och d) att separera IL-2 i reducerad form frän den resulterän-de lösningen under reducerande betingelser med ett förfarande, valt bland följande: gelfiltrering, omvänd fas 35 högtrycksvätskekromatografi (RP-HPLC), extrahering el ler nägon kombination av dessa; e) att oxidera IL-2 erhället frän steget d) tili exempel med O-jodosobensoat och att rena det resulterande oxi- 22 94960 derade IL-2:et renas genom omvänd fas högtrycksvätske-kromatografi (HPLC).

10. Mellanproduktskomposition av renat rekombinant IL-2 i reducerad form enligt patentkrav 8 eller 9, kännetecknad av att detta IL-2 är des-Ala Ser125 IL-2.