DK166324B - Oprenset, rekombineret interleukin-2-sammensaetning og fremgangsmaade til udvinding af samme fra en transformeret mikroorganisme - Google Patents
Oprenset, rekombineret interleukin-2-sammensaetning og fremgangsmaade til udvinding af samme fra en transformeret mikroorganisme Download PDFInfo
- Publication number
- DK166324B DK166324B DK135985A DK135985A DK166324B DK 166324 B DK166324 B DK 166324B DK 135985 A DK135985 A DK 135985A DK 135985 A DK135985 A DK 135985A DK 166324 B DK166324 B DK 166324B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- purified
- sds
- solution
- extraction
- gel filtration
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
i
DK 166324 B
Opfindelsen angår en oprenset, rekombineret interleukin-2-sammen-sætning og en fremgangsmåde til udvinding af samme fra mikroorganismer, som er blevet transformeret til at producere IL-2.
5 Nativ human IL-2 er en antigen-uspecifik, genetisk ikke-begrænset opløselig faktor, som frembringes af erythrocytroset-positive T-celler stimuleret med antigener, mitogener og alloantigener. Det er et protein med en i litteraturen angiven molekylevægt i området fra ca. 13.000 - 17.000 dalton (S. Gi 11 i s og J. Watson, J. Exo Med 10 (1980) 159:1709) og et isoelektrisk punkt i det omtrentlige område mellem pH 6 og pH 8,5. Human IL-2 har en række virkninger in vitro og in vivo inklusiv forstærkning af det proliferative svar hos perifere, mononukleære humanbiodceller eller murine thymocyter, forstærkning af immunsvaret hos mennesker og dyr over for bakte-15 rielle, parasitiske, fungale, protozoiske og virale infektioner, samt understøttelse af væksten af kontinuerlige T-cellelinier.
IL-2 og IL-2-muteiner, i hvilke cysteinresten ved aminosyre 125 er blevet erstattet med serin og/eller det initielle alanin er blevet 20 elimineret, er blevet fremstillet mikrobielt ved gensplejsning. Mikrobielt fremstillet IL-2 er ikke glycosyleret og frembringes i en reduceret tilstand af mikroorganismerne. Når disse mikrobielt frembragte IL-2'er er oprenset og oxideret udviser de en aktivitet, der er sammenlignelig med nativ, human-IL-2.
25
Fremgangsmåder til oprensning af nativ IL-2 fra T-celler er blevet beskrevet af Watson, J. et al., J. Exp Med (1979) 150:849-861.
Gill is, S., et al., J. Immunology (1980) 124:1954-1962. Mochizuki, D. Y. et al, J. Immun. Meth. (1980) 39:185-201, Welte, K. et al., J. Exo. Med (1982) 156:454-464 og de europæiske patentansøgninger nr. 83103582.9 (publiceret 26. oktober 1983 under nr. 92163) og nr. 83400938.3 (publiceret 16. november 1983 under nr. 94317). Disse fremgangsmåder involverer generelt præcipi teringer af proteiner fra kultursupernatanter ved hjælp af ammoniumsulfat efterfulgt af en
5C
kromatografisk fraktionering.
US patent nr. 4.450.103 og Derynck, R. et al., Nature (1980) 287:193-197 omtaler fremgangsmåder til udvinding af IFN-jS fra IFN-jS-producerende E. coli. I patentet omtales en fremgangsmåde, 2
DK 166324 B
hvorved IFN-/I ekstraheres fra sekundært materiale ved hjælp af 2-butanol eller 2-methyl-2-butanol.
Det har« dog ikke hidtil været muligt at fremstille rekombinant-5 interleukin-2 med en sådan renhedsgrad og et så lavt endotoxin- indhold, at det umiddelbart var anvendeligt til terapeutisk anvendelse.
Med den foreliggende opfindelse er der imidlertid nu blevet 1° tilvejebragt en sådan rekombinant-interleukin-2-sammensætning (IL-2), som er umiddelbar anvendelig til terapeutiske formål, hvilken IL-2 er ejendommelig ved, at den har et IL-2-indhold på mindst ca. 95% bestemt ved reduceret SDS-PAGE-analyse, et endotoxin-indhold på mindre end ca. 0,1 ng/mg IL-2 og stort set er fri for 15 pyrogener bestemt ved U.S.P. kaninpyrogentesten ved en dosis på 3,3 x 105 U/kg.
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til udvinding af IL-2 ifølge opfindelsen fra en transformeret mikroorganisme indeholdende IL-2, 20 hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, (a) at mikroorganismens cellemembran brydes, (b) at de åbnede celler ekstraheres med en vandig opløsning af et chaotropt middel, som ekstraherer ikke-IL-2-proteiner selektivt 25 fra det cellulære materiale, (c) at IL-2'en i den faste fase af ekstraktionsblandingen opløses med en vandig opløsning af et opløsende middel, som danner et vandopløseligt kompleks med IL-2'en, hvilken opløsning indeholder et reducerende middel, 30 (d) at IL-2'en separeres fra den fremkomne opløsning i nærværelsen af det reducerende middel, (e) at IL-2'en om ønsket oxideres, og (f) at det oxiderede produkt oprenses ved omvendt fase, højeffektiv væskekromatografi.
35
Ved foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det chaotrope middel urinstof i en koncentration på fra ca. 3,5 M til ca. 4,5 M i ekstraktionsblandingen, det opløsende middel er natriumdodecylsulfat (SDS) eller natriumlaurylsarcosin 3
DK 166324 B
(sarcosyl), den opløste IL-2 ekstraheres yderligere med 2-butanol eller 2-methyl-2-butanol, og den endelige separation udføres ved gel filtrering, det resulterende, størrelsesseparerede produkt oxideres, og det oxiderede produkt oprenses ved RP-HPLC omvendt-5 fase, højeffektiv væskekromatografi.
På tegningen viser:
Fig. 1 et flowdiagram over alternative udførelsesformer for frem-1° gangsmåden ifølge opfindelsen, hvor gelfiltreringskromo- trografi anvendes som et afsluttende oprensningstrin. Ved udførelsesformen betegnet metode 1A anvendes SDS som et opløsende middel; ved udførelsesformen betegnet metode IB anvendes sarcosyl som det opløsende middel. Figuren indbe-15 fatter densitometerscanninger af SDS-polyacrylamidgel elek- troforeseanalyser (SDS-PAGE-analyser) af produktet på forskellige trin i fremgangsmåden.
Fig. 2 et HPLC-kromatogram og en SDS-PAGE-analyse af produktet fra 2(J eksempel 3.
Fig. 3 et HPLC-kromatogram af produktet fra eksempel 9.
Fig. 4 et flowdiagram af en foretrukken fremgangsmåde til forarbejdning af mikrobielt frembragt IL-2.
Det her anvendte udtryk "IL-2" betegner et ikke-glycosyleret protein, som frembringes af en mikroorganisme, der er blevet transformeret med et humant interleukin-2-gen eller en modifikation af det humane interleukin-2-gen, som koder for et protein, som har: (a) en aminosyresekvens, der stort set er identisk med aminosyre-sekvensen i det native, humane interleukin-2 og (b) en biologisk aktivitet, som er fælles med nativ human-interleukin-2. Med stort set identitet mellem aminosyresekvenser menes, at sekvenserne er 35 identisk eller adskiller sig ved en eller flere aminosyreændringer (deletioner, additioner, substitutioner), som ikke bevirker en ugunstig funktionel ulighed mellem det syntetiske protein og nativ, human-interleukin-2. Eksempler på sådanne proteiner er de IL-2'er, som omtales i Europæisk patentpublikation nr. 91539 og nr. 88195, de
DK 166324B
4 IL-2'er, som omtales i Europæisk patentpublikation nr. 109748, og de IL-2'er, der omtales i eksemplerne i den foreliggende ansøgning.
Med det her anvendte udtryk "transformeret mikroorganisme" menes en 5 mikroorganisme, som er blevet underkastet gensplejsning til frembringelse af et protien, som har nativ, human-interleukin-2-aktivitet.
Eksempler på transformerede mikroorganismer omtales i ovennævnte 10 europæiske patentpublikationer nr. 88195, nr. 91539 og nr. 109748 samt i eksemplerne i den foreliggende ansøgning. Bakterier er de foretrukne mikroorganismer til frembringelse af IL-2. Syntetisk IL-2 kan også fremstilles af hensigtsmæssigt transformerede gærceller og mammale celler. E. coli foretrækkes navnlig.
15
De transformerede mikroorganismer dyrkes i et egnet vækstmedium, typisk til en optisk densitet (OD) på mindst ca. 30 ved 680 nm og fortrinsvis til mellem ca. 20 og 40 ved 680 nm. Sammensætningen af vækstmediet vil afhænge af den specielle mikroorganisme, der er tale 20 om. Mediet er et vandigt medium indeholdende forbindelser, som opfylder mikroorganismernes næringskrav. Vækstmedier vil typisk indeholde assimilerbare kulstofkilder og nitrogenkilder, energikilder, magnesium-, kalium- og natriumioner og eventuelt aminosyrer samt purin- og pyrimidinbaser. (Se Review of Medical Biology. Lange 25 Medical Publications, 14. udgave side 80-95 (1980)). I ekspressionsvektorer, der involverer trp-promotoren, er tryptophankoncentra-tionen omhyggeligt styret til at være begrænsende på det tidspunkt, man ønsker IL-2 udtrykt. Vækstmedier for E. coli er velkendte.
30 Efter at cellerne er høstet fra kulturen, kan de koncentreres om nødvendigt til fra ca. 20 til 150 mg per milliliter, fortrinsvis fra 80 til 100 mg/ml (OD 40 til 300, fortrinsvis 160 til 200 ved 680 nm) ved filtrering, centrifugering eller andre traditionelle metoder.
35 Efter koncentrering brydes mikroorganismernes cellemembraner. Hovedformålet med denne behandling er at lette den efterfølgende ekstraktion og opløsning. Traditionelle celleåbningsmetoder, såsom homogenisering, sonikering eller trykcyklusser kan anvendes ved dette trin i fremgangsmåden. Foretrukne metoder er sonikering eller
DK 166324B
5 homogenisering med en Manton-Gaulinhomogenisator. Slutpunktet af dette behandlingstrin kan måles ved optisk densitet, idet den optiske densitet af suspensionen aftager fra ca. 65 til 85 %. I alle tilfælde skal celleåbningsbehandlingen stort set bryde alle 5 cellerne, således at der stort set ikke findes intakte celler, som overføres til det opløsende trin. Før celleåbningen indstilles pH-værdien af væskefasen i koncentratet om nødvendigt til et niveau, der letter fjernelse af E. coli-proteiner i de efterfølgende trin, medens IL-2-proteinet forbliver som et uopløseligt kompleks i de 10 cellulære rester. pH-Værdien kan indstilles ved at tilsætte egnede puffere. I de fleste tilfælde vil der blive anvendt pH-værdi er i området fra ca. 8 til ca. 8,5.
Trinnene i udvindingsprocessen efter åbning af cellerne er primært 15 beregnet til at separere IL-2'en fra E. coli-proteiner til opnåelse af et højt renhedsniveau (fortrinsvis mindst ca. 95% og mere fortrinsvis mindst ca. 98%) i et godt udbytte, medens IL-2'en holdes i en reduceret tilstand. Disse oprensningsprocesser reducerer ligeledes samtidig pyrogene substanser i slutproduktet til et 20 niveau, som antages at være acceptabel til parenteral indgivelse i patienter.
Efter at cellerne er blevet åbnet, kan det partikulære materiale adskilles fra den flydende fase i de åbnede celler og resuspenderes 25 i et vandigt medium pufferet til den optimale pH-værdi for ekstraktionen. Det partikulære materiale kan eventuelt vaskes med puffer på dette trin for at fjerne alle opløselige E. coli proteiner. I alle tilfælde vil proteinkoncentrationen i den cellesuspension, der udsættes for ekstraktionen, sædvanligvis ligge 30 i området fra ca. 5 til ca. 60 mg/ml, fortrinvis fra 20 til 40 mg/ml.
Ekstraktionen af E.coli-proteiner fra det partikulære, cellulære materiale kan udføres samtidig med åbningen af cellerne, eller den 33 kan fortrinsvis udføres som et separat trin efter åbning af cellerne. Ekstraktionsmediet af en vandig opløsning er et chaotropt middel (dvs. et mildt protein-denaturende middel, som dissocierer hydrogenbindinger og påvirker den tertiære struktur af proteiner). Ekstraktionsmediet fjerner selektivt hovedmængden af E. col i 6
DK 166324 B
proteiner fra de cellulære rester efterladende i det mindste en væsentlig del af IL-2'en forbundet med (indeholdt i eller bundet til) de cellulære rester. Selektiviteten fremmes af IL-2'ens hydrofobicitet og den kendsgerning, at den er i en reduceret, 5 uopløselig tilstand ved en pH-værdi nær det isoelektriske punkt for proteinet. Ydermere kan en væsentlig del af IL-2'en være til stede in vivo som inklusionslegemer af betragtelig masse, hvilket har været tilfældet med andre klonede proteiner udtrykt i høje niveauer i E. coli. Eksempler på ekstraktionsmidler er urinstof og 10 guanidiniumhydrochlorid (guanidiniumhydrochlorid bør ikke anvendes, når SDS anvendes som et opløsende middel). Urinstof foretrækkes. Koncentrationen af det chaotrope middel i ekstraktionsblandingen vil afhænge af det specielle middel, som anvendes, og mængden af cellulært materiale i ekstraktionsblandingen. I tilfælde med urinstof vil 15 (slut) koncentrationer på mellem ca. 3,5 M og 4,5 M, fortrinsvis ca.
4 M, blive anvendt i batch-fremgangsmåder ved 25°C. Hvis ekstraktionen foretages på kontinuerlig basis over længere tidsperioder kan det være ønskeligt at anvende lavere koncentrationer. Temperaturer i området fra 20°C til 25°C vil normalt blive anvendt ved ekstrak-20 tionen, idet stuetemperatur anvendes af bekvemmelighedsgrunde. Der vil typisk blive foretaget en blanding for at forøge kontakten mellem opløsningen og det partikulære materiale og hermed nedsætte den tid, der kræves til ekstraktion af ikke-IL-2-proteiner fra de cellulære rester. Kinetiske analyser af ekstraktionsproceduren blev 25 udført på supernatanterne under anvendelse af SDS-PAGE, og ekstraktionen fandtes at være stort set afsluttet efter 15-30 minutter.
Efter ekstraktionen separeres blandingen i en fast og flydende fase. IL-2'en i den faste fase opløses derefter selektivt ved at kontakte 30 den faste fase med en neutral, vandig puffer indeholdende et reducerende middel og et opløsende middel. Overfladeaktive midler (detergenter), som har en hensigtsmæssig hydrofob/hydrofil-balance til opløsning af den hydrofobe IL-2, kan anvendes. Al kalimetal sulfater indeholdende fra 10 til 14 carbonatomer og al kalimetal al kyl-35 sarkosinater er foretrukne opløsende midler, idet SDS og sarkosyl navnlig foretrækkes.
Mængden af opløsende middel, som anvendes i det opløsende trin, vil afhænge af det specielle middel. Når SDS eller sarkosyl anvendes
DK 166324B
7 ligger det foretrukne forhold (vægt/vægt) mellem SDS/ sarkosyl og fastfaseproteinerne mellem ca. 0,5:1 og 1,4:1. Det opløsende medium indeholder ligeledes en tilstrækkelig mængde reducerende middel til at forhindre den opløste IL-2 i at undergå oxidation i væsentlig 5 grad. Der kan anvendes proteinreducerende midler såsom dithio- threitol (DDT) og 2-mercaptoethanol. Koncentrationen af det reducerende middel, såsom DDT, i mediet vil sædvanligvis ligge mellem ca. 5 og 20 mM. Det opløsende trin vil typisk blive udført ved temperaturer i området fra 20°C til 25°C under blanding for at 10 fremme kontakten mellem den faste fase og det opløsende medium.
Højere temperaturer kan opløse uønskede E. coli-proteiner. Det opløsende trin betragtes som afsluttet, når prøven har henstået i 15 minutter, eller når opløsningen er blevet gennemsigtig. Uopløseligt materiale frasepareres efter afslutning af opløsningen.
15
Efter at IL-2'en er opløst, kan IL-2'en eventuelt ekstraheres fra den vandige opløsning under reducerende betingelser med 2-butanol eller 2-methyl-2-butanol til fjernelse af yderligere E. coli-proteiner, især indbefattende visse forurenende forbindelser, som 20 har molekylevægte meget tæt ved molekylevægten for IL-2. Der anvendes betingelser (for eksempel ionstyrker i området fra 0,05 til 0,15), ved hvilke den vandige opløsning og butanol stort set er ublandbare. Til udførelse af den organiske ekstraktion indstilles proteinkoncentrationen af den vandige opløsning fortrinsvis, og om 25 nødvendigt til mindre end ca. 6 mg/ml, fortrinsvis mellem ca. 0,5 og 4 mg/ml. Der opretholdes reducerende betingelser ved at udføre ekstraktionen i nærværelse af et reducerende middel (for eksempel DTT). Butanolen vil normalt blive sat til den vandige opløsning af opløst IL-2 i volumenforhold, der ligger i området fra ca. 1:1 til 30 ca. 3:1 (ekstraktionsmiddel:vandig opløsning), fortrinsvis 1:1. Ekstraktionen kan udføres ved en batch-operation eller ved kontinuerlig operation. Temperaturen vil normalt ligge i området fra 20°C til 100°C, og pH-værdien vil normalt være mellem ca. 4 og 9, fortrinsvis mellem 5 og 6. Kontakttiden mellem opløsningen og 35 butanolen er ikke kritisk, og der anvendes forholdsvis korte tider af størrelsesorden på nogle få minutter. Efter at ekstraktionen er afsluttet separeres den vandige fase og butanolfasen, og IL-2'en separeres fra butanolfasen. En foretrukken fremgangsmåde til at separere IL-2'en fra butanolfasen er syrepræcipitation. Dette gøres 8
DK 166324 B
ved at tilsætte butanolfasen en vandig puffer, pH 7,5, indtil den organiske fase er opløst (ca. 2 til 3 volumen puffer pr. volumen organisk fase), og sænke pH-værdien til fra ca. 5,5 til 7,0, fortrinsvis fra 5,0 til 6,2, for at bringe IL-2'en til at præcipitere.
5
Det næste trin i processen er at separere IL-2'en og enhver kontami-nerende forbindelse fra E. coli, som bliver tilbage efter ekstraktionen, og optimalt fra det opløsende middel. Der anvendes gelfiltreringskromatografi, RP-HPLC eller en kombination mellem gel fil-10 treringskromatografi og RP-HPLC. Gel filtreringskromatografi foretrækkes udført i to trin, som fjerner både pyrogene komponenter og proteinkontaminanter med molekylevægte, der er større eller lavere end molekylvægten for IL-2. (IL-2 har en molekylevægt på ca. 15,5 kD). Geler, som er i stand tiT at fraktionere opløsningen og tillade 15 separation af IL-2 fra disse kontaminerende forbindelser er kommercielt tilgængelige. Sephacryl S-200 er en foretrukken gel til fjernelse af højmolekylelære forbindeler, og sephadexgeler G-25, G-75 eller G-100 foretrækkes til fjernelse af lavmolekylelære kontaminerende forbindelser. Gel fil treri ngerne vil typisk blive 20 udført i pufrede opløsninger (pH 5,5 til 7,0) indeholdende fra ca. .
0,1% til 1,0% opløsende middel og fra ca. 1 til 10 mM reducerende middel. Søjlen vil have en størrelse, som tillader hensigtsmæssig opløsning af. de ønskede komponenter.
25 RP-HPLC er et alternativ til gel fil trering. RP-HPLC er også i stand til at fjerne molekyler fra opløsningen, som har molekylvægte tæt på molekylvægten for IL-2, og som derfor ikke kan fjernes fuldstændig ved gel fil trering. Ydermere kan kontaminerende forbindelser, såsom bakteriel endotoxin, ligeledes fjernes effektivt ved RP-HPLC.
30 RP-HPLC kan derfor også anvendes som et slutoprensningstrin efter gel filtrering. Bærematerialer (stationære faser), som tilvejebringer god opløsning af proteiner kan anvendes ved RP-HPLC. C-4, C-8 eller C-18 på bærematerialer med en porestørrelse på 300 Angstrom er eksempler på foretrukne bærematerialer. Separationen udføres ved en 35 sur pH-værdi på mindre end ca. 2,3, sædvanligvis fra 2,1 til 2,3, for at holde IL-2'en i opløsning. Under hensyn hertil vil pH-værdien af opløsningen fra det opløsende trin (gel fil trering) fortrinsvis blive indstillet til dette område. Opløsningen sættes på RP-HPLC-søjlen og adsorberes på den stationære fase. Et
DK 166324B
9 gradientsolventsystem omfattende en organiske syre, såsom eddikesyre eller tri fluoreddikesyre, og et organiske opløsningsmiddel, såsom propanol eller acetonitril, anvendes til at eluere IL-2'en fra søjlen. Eddikesyre-propanol, trifluoreddikesyre-propanol og tri -5 fluoreddikesyre-acetonotril er foretrukne solventsystemer. IL-2 elueres i eddikesyre-propanol-systemet ved ca. 40% propanol, i trifluoreddikesyre-propanolsystemet ved 50% propanol og i trifluoreddikesyre-acetonitril-systemet ved ca. 62% af acetonitril.
Af bekvemmelighedsgrunde vil indholdet af organisk opløsningsmiddel 10 i elueringsmidlet sædvanligvis blive forøget hurtigt til et niveau, som ligger noget under den koncentration af opløsningsmidler, ved hvilken IL-2 elueres, efterfulgt af en langsom gradientændring i en størrelsesorden på fra ca. 0,1% til 1,0%/min.
15 Så snart IL-2'en er udvundet fra kromotograferingstrinnet lyophili-seres den og resuspenderes i en neutral, vandig puffer indeholdende et reducerende middel (for at holde IL-2'en i en reduceret tilstand) og det opløsende middel for at holde den i opløsning. IL-2'en er stabil i denne form og kan opbevares til yderligere behandling og 20 formulering før den anvendes.
En alternativ og foretrukken fremgangsmåde er at oxidere IL-2'en, efter at den er separeret ved gelfiltrering, og oprense det oxiderede produkt ved RP-HPLC eller gelfiltrering efterfulgt af 25 RP-HPLC. Dette resulterer i effektiv fjernelse af kontaminerende forbindelser, som overlevede gel fil treri ngen, såvel som uønskede oxidationsprodukter. En foretrukken oxidationsfremgangsmåde er at oxidere et helt reduceret, mikrobielt fremstillet, syntetisk protein med en aminosyrésekvens, der stort set er identisk med sekvensen for 30 et nyttigt protein, hvis sekvens indbefatter cysteiner, som i det nyttige protein er forbundet intramolekylært til frembringelse af en cystin på en styret måde, således at cysteinerne oxideres selektivt til frembringelse af cystinen. Ved denne fremgangsmåde omsættes det helt reducerede, mikrobielt frembragte, syntetiske protein med 25 o-iodosobenzoat, som oxiderer cysteiner selektivt i et vandigt medium ved en pH-værdi på mindst ca. ¼ pH-enhed under pK -værdien α for cysteinerne, hvorhos koncentrationen af det syntetiske protein i reaktionsblandingen er mindre end ca. 5 mg/ml, og molforholdet mellem o-iodosobenzoat og protein er mindst støkiometrisk, under 10
DK 166324 B
forudsætning af, at o-iodosobenzoat er i overskud i den terminale del af reaktionen. RP-HPLC-oprensning af det oxiderede produkt kan udføres under de betingelser, som er beskrevet ovenfor i fravær af et reducerende middel og under tilstedeværelse af en detergent i en 5 koncentration, der er lig med eller mindre end de koncentrationer, der er anvendt ved den ovenfor beskrevne gel fil trering.
Renheden af IL-2'en efter kromatografitrinnene er mindst ca. 95% og sædvanligvis mindst ca. 98%. Dette meget rene materiale indeholder 10 mindre end ca. 5 ng endotoxin, sædvanligvis mindre end ca. 0,01 ng endotoxin per 100.000 enheder IL-2-aktivitet.
Opfindelsen beskrives yderligere ved de efterfølgende eksempler.
15 EKSEMPEL 1 IL-2 blev udvundet fra E. coli K-12, stamme MM294, som var blevet transformeret med pi asmidet pLWl (deponeret ved American Type Culture Collection 4. august, 1983 under deponeringsnr. 39.405) på 20 følgende måde.
E. coli blev dyrket i en fermentor under anvendelse af følgende vækstmedium: 25
(NH4)2S04 150 mM
KH2P04 21,6 mM
Ca^-citrat 1,5 mM
ZnS04-7 H20 - 30 mM
30 Mn$04· H20 30 mM
CuS04* 5 H20 1 mM
pH indstillet til 6,50 med 2,5 N NaOH og autoklaveret.
35
DK 166324B
11
Sterile tilsætninger (efter autoklavering):
MgS04· 7 H20 3 mM
FeS04 100 mM
5 L-tryptophan 14 mg/l
Thiamin-HCl 20 mg/l
Glucose 5 g/1
Tetracyklin 5 mg/l
Ethanol (valgfrit) 2% 10 Casaminosyrer 2%
Dow Corning Antifoam B, 20% opløsning, glucose, 50% opløsning, og Κ0Η 5 N, blev tilsat efter behov.
15 pH-værdien i fermentoren blev holdt ved 6,8 med 5N KOH. Residuel glucose blev holdt mellem 5 til 10 g/1, opløst oxygen ved 40% og temperaturen ved 37 % 1°C. Casaminosyrerne (20% stamopløsning) blev tilsat, når ODggQ-værdien var ca. 10. Der blev høstet 3 timer efter 0D680-værdien havde nået ca. 20.
20
Det indhøstede materiale blev koncentreret ved hul fiberfil trering og/eller centrifugering. 20 til 40 g (vådvægt) af koncentratet blev resuspenderet i 200 ml 50 mM Tris, 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (pH 8,1-8,5) (Tris/EDTA-puffer). Suspensionen blev centri-25 fugeret ved 3000 til 4000 x g i 10 minutter, supernatanten blev fjernet, og det faste materiale blev resuspenderet i 200 ml Tris/EDTA-buffer ved 4°C. Suspensionen blev nu indført i en soni-kator (Heat Systems, model W-375) og sonikeret ved 4°C i 45 minutter (slutpunkt = ODggg-reduktion på ca. 85%) under anvendelse af en stor 30 sonde, pulsering med 50% funktion ved kraftindstilling "9". En alternativ måde at åbne cellerne på er at føre suspensionen 3 gange gennem en Manton-Gaulin-homogenisator ved indstilling M-l. Cellulære rester blev separeret fra de åbnede celler ved centrifugering ved 4500 x g i 10 minutter.
35
De cellulære rester blev resuspenderet i 60 ml Tis/EDTA-puffer ved stuetemperatur, og et ligeså stort volumen 8 M urinstof (Schwarz/Mann, ultrarent) i Tris/EDTA-puffer blev tilsat suspensionen i løbet af 5 minutter under hurtig omrøring 12
DK 166324 B
(Siuturinstofkoncentration, 4M). Efter fortsat langsom omrøring i 15-30 minutter blev suspensionen centrifugeret ved 12.000 x g i 15 minutter til udvinding af ekstraherede cellerester. (Hvis der ikke fremkommer en fast fase fjernes supernatanten og et ligeså stort 5 volumen Tris/EDTA-puffer tilsættes, og blandingen gencentrifugeres).
De ekstraherede cellulære rester resuspenderedes i 9 ml 50 mM natriumphosphat (pH 6,8), 1 mM EDTA, 10 mM DTT ved 20°C. Der blev tilsat 1 ml 20% SDS til suspensionen, og suspensionen blev blandet 10 kraftigt i 5 minutter. Den flydende fase blev udvundet fra suspensionen ved centrifugering ved 12.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Den flydende fase blev opvarmet til 40°C i 15 minutter for at sikre, at IL-2'en i opløsningen er helt reduceret.
En prøve af dette råekstrakt blev analyseret ved 15% SDS-PAGE. Fig.
15 1 viser en densitometerscanning af denne analyse (produkt fra metode 1A), hvilket indicerede, at ekstraktet indeholdt ca. 37% IL-2.
IL-2 blev separeret fra opløsningen ved gelfiltreringskromatografi på følgende måde: Opløsningen blev overført på en 2,6 cm x 100 cm 20 s-200 søjle, som blev anvendt i 50 mM natriumphosphat (pH 6,8), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% SDS. Søjleafløbet blev opsamlet i 4 ml fraktioner, idet prøver af fraktionerne blev analyseret i 15% SDS-PAGE-minigeler farvet med Coomassie-blåt. De fraktioner, som indeholdt de færreste kontaminerende forbindelser (minimerende 25 kontami nerende forbindelser ved ca. 35 kD, 16-18 kD og 12 kD), blev hældt sammen og koncentreret til 5-10 ml ved ultrafiltrering (Amicon YM5-ultrafilter). Koncentratet blev overført på en 2,6 cm x 100 cm G-100 søjle, som blev drevet som ovenfor beskrevet med undtagelse af, at SDS-koncentrationen var 0,1 % i stedet for 1 %. Fraktionerne 3° blev analyseret ved SDS-PAGE, og de reneste fraktioner blev hældt sammen. Tegningen viser en densitometerscanning af det kromatogra-ferede produkt. Analysen indicerede, at produktet var 98% rent og indeholdt 0,5 ng endotoxin/100.000 enheder IL-2-aktivitet målt ved limulus-amoebocytlysatanalysen (Associates of Cape Cod, Inc., Woods 35 Hole, MA). Den N-terminale aminosyresekvens af denne IL-2 er den samme som i det native, humane molekyle med undtagelse af, at det initielle, N-terminale alanin mangler.
DK 166324 B
Eksempel 2 13
Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget under anvendelse af 2% sarcosyl i stedet for 2% SDS som opløsende middel og under 5 anvendelse af sarcosyl i stedet for SDS i kromatografi søjlerne.
Fig.l viser densitometerscanninger for dette råekstrakt under anvendelse af sarcosyl som et opløsende middel (råekstrakt i metode IB). Som angivet gav anvendelsen af sarcosyl i stedet for SDS forbedret renhed (58% versus 37%) ved lignende IL-2-udbytte (50% 10 versus 60%).
Eksempel 3
Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget i de trin, der ligger 15 forud for urinstofekstraktionen, og blandingen blev derefter opløst og klaret som beskrevet.
IL-2'en blev separeret fra opløsningen ved RP-HPLC på følgende måde: Opløsningen blev fortyndet 10 gange i 0,1% tri fluoreddikesyre (TFA) 20 og blev påsat en Brownlee Aquaport RP-300-søjle med en indre diameter på 4,6 mm og en længde på 5 cm og ækvilibreret i 0,1% TFA. IL-2'en blev elueret med en gradient af 30-60% acetonitril indeholdende 0,1% TFA i løbet af 45 minutter. Udbyttet af IL-2-aktivitet efter HPLC var 80-100%. Fig.2 viser en sølvfarvet 25 SDS-PAGE-analyse af dette produkt.
Eksempel 4
Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget for de trin, der ligger 30 forud for gel fil treringskromatografi. Det opløste, klarede, reducerede materiale blev udsat for G-100 kromatografi i 0,1% SDS som beskrevet i eksempel 1. De samlede topfraktioner af IL-2 blev yderligere oprenset ved RP-HPLC som beskrevet i eksempel 3. Den fremkomne, oprensede, reducerede IL-2 blev oxideret og udsat for 35 RP-HPLC som beskrevet i eksempel 3.
Eksempel 5
Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget for de trin, der ligger 14
DK 166324 B
forud for G-100-søjlen. Fremgangsmåden fra eksempel 3 blev gentaget under anvendelse af et solventsystem af propanol i 1 M eddikesyre. IL-2'en blev elueret med en gradient af 35-60% propanol i løbet af 200 minutter. Søjledimensionerne var enten en indre diameter på 10 5 mm og en længde på 30 cm eller en indre diameter på 48 mm og en længde på 50 cm, og søjlen blev pakket med en storporet silikagel med bunden fase. Den anvendte storporede silikagel med bunden fase var Vydac TP214. Renheden og udbytte af produktet var sammenlignelig med resultatet fra eksempel 3.
10
Eksempel 6
Fremgangsmåden i eksempel 3 blev gentaget under anvendelse af et sol ventsystem af propanol i 0,1% TFA. IL-2'en blev elueret med en 15 gradient af 35-60% propanol i løbet af 120 minutter. Søjlen og bærematerialet var det samme som i eksempel 5. Renheden og udbyttet af produktet var sammenlignelig med resultatet i eksempel 3.
Eksempel 7 20
Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget med den undtagelse, at den E.col i-producerede IL-2 var én betegnet des-Ala Ser^ IL-2. Aminosyresekvensen i denne IL-2 er forskellig fra aminosyresekvensen i det native molekyle, idet cysteinen i position 125 er blevet 25 ændret til serin, og den i niti elle N-terminale alaninrest mangler.
Den stamme af E.col i. som producerede denne des-Ala Ser^ IL-2 blev deponeret hos American Type Culture Collection, 6.marts 1984 under deponeringsnummer 39.626.
30 Eksempel 8
Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget med den undtagelse, at IL-2 udvundet fra en E.col i K-12 stamme, der var blevet transformeret med pi asmidet. pLW55 (deponeret hos American Type Culture 33 Collection, 18. november 1983 under deponeringsnummer 39.516). Aminosyresekvensen af dette molekyle er forskellig fra aminosyresekvensen af det native molekyle ved, at den har en N-terminal methionin, og cysteinen i position 125 er blevet ændret til serin.
DK 166324B
15
Eksempel 9
Den des-Ala-Serj25-IL-2-producerende E.coli blev dyrket, cellerne blev åbnet, og de cellulære rester blev udvundet efter åbningen af 5 cellerne under anvendelse af de almene fremgangsmåder i eksempel 1.
De cellulære rester blev suspenderet i 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,5 ved et forhold på ca. 1:4,5 (vægt/volumen). Der blev tilsat DTT til en slutkoncentration på 25 mM. Der blev langsomt tilsat 8 mM urinstof i samme puffer under omrøring til en slutkoncentration på 4 M, 10 og blandingen fik derefter lov til at henstå under omblanding ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter 30 minutter blev det tilbageværende uopløselige materiale centrifugeret. Den fremkomne pasta blev resuspenderet i 50 mM natriumphosphatpuffer, 1 mM EDTA, pH 7,0. Suspensionen blev derefter opløseliggjort ved tilsætning af fast SDS 13 til en slutkoncentration på 5% vægt/volumen.
5% SDS-opløsningen blev fortyndet til 2% SDS med 0,1 M NagPO^, pH
8,0. Proteinkoncentrationen blev bestemt, pH-værdien blev indstillet til 8,5, og der tilsattes DTT til 50 mM og EDTA til 2 mM. Blandingen 20 blev opvarmet til 40°C under ^ til reduktion af IL-2. Blandingen blev derefter afkølet, og pH-værdien blev indstillet til 5,0.
Opløsningen blev derefter ekstraheret ved et 1:1 forhold (volumen/volumen) med 2-butanol indeholdende 1 mM DTT ved stue-25 temperatur. Opholdstiden var 2-2,5 minutter. Ekstraktionen blev udført i en væske-væske faseseparator under anvendelse af en flow-hastighed på 200 ml/minut. Det organiske ekstrakt blev separeret, og dets pH-værdi blev indstillet til 8,0 med NaOH. Ekstraktet blev derefter langsomt sat til 0,1% SDS i 10 mM NagPO^, 2 mM DTT, pH 6 og 30 omrørt i 15-20 minutter. Det fremkomne præcipitat blev separeret, og den fremkomne pasta blev resuspenderet i 5% SDS i PBS. Opløsningen blev klaret ved centrifugering og reduceret som ovenfor nævnt. Efter reduktionen blev opløsningen indstillet til pH 5,5 med eddikesyre. Opløsningen blev oprenset ved gelfiltrering under anvendelse af 35 S-200 og G-25 søjler. Den fremkomne, oprensede, reducerede IL-2 blev oxideret, og det oxiderede produkt blev oprenset ved G-25 kromatografi efterfulgt af RP-HPLC som i eksempel 3. Det fremkomne, oprensede, rekombinerede IL-2 produkt havde et IL-2 indhold på mere end ca. 95% bestemt ved reducerende SDS-PAGE analyse, et 16
DK 166324 B
endotoxinindhold på mindre end ca. 0,1 ng/mg IL-2 og var stort set fri for pyrogener bestemt ved U.S.P. kaninpyrogentest ved en dosis på 3,5 gange 10® U/kg. Som tidligere anført er endotoxinindholdet mindre end ca. 5 ng og fortrinsvis mindre end 0,01 ng endotoxin pr.
5 100.000 enheder IL-2 aktivitet. De oprensede, rekombinerede IL-2 produkter oprenset ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har typisk et IL-2 indhold på over 98% bestemt ved reducerende SDS-PAGE eller RP-HPLC, som vist i fig. 3, ud over at de stort set er fri for endotoxiner og pyrogener som ovenfor anført.
10
En variation af fremgangsmåden beskrevet i eksempel 9, som kan anvendes til at fremstille IL-2 i stor skala, er vist i fig.4. Den i fig.4 viste fremgangsmåde adskiller sig fra den i eksempel 9 beskrevne, hvad angår (1) mindre ændringer i pufferne, (2) 15 anvendelse af et eddikesyre-propanol (eksempel 5) solventsystem i RP-HPLC-processen og (3) inklusionen af fortyndings/diafil trering S-200 gel fil trering og ultrafiltrering efter oxidation. Den i fig. 4 viste fremgangsmåde kan modificeres med forskellige raffinementer, f.eks. kan IL-2 opløsningen efter den anden passage gennem S-200 20 søjlen i 1% SDS fortyndes 1:10 til frembringelse af en 0,1% SDS koncentration og derefter diafiltreres mod 10 mM phosphatpuffer ved en pH-værdi på 7,5 og 5 ppm SDS. Opløsningen koncentreres derefter som nødvendig til hensigtsmæssige anvendelsesdoser.
25 30 35
Claims (9)
1. Oprenset, rekombinant-interleukin-2-sammensætning (IL-2), 5 kendetegnet ved, at den har et IL-2-indhold på mindst ca. 95% bestemt ved reduceret SDS-PAGE-analyse, et endotoxinindhold på mindre end ca. 0,1 ng/mg IL-2 og stort set er fri for pyrogener c bestemt ved U.S.P. kaninpyrogentesten ved en dosis på 3,3 x 10 U/kg. 10
2. Oprenset, rekombinant-IL-2-sammensætning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at IL-2-indhol det er større end ca. 98% bestemt ved reducerende SDS-PAGE.
3. Oprenset, rekombinant-IL-2-sammensætning ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at IL-2'en er des-Ala-Ser^g IL-2.
4. Fremgangsmåde til udvinding af IL-2 ifølge krav 1 fra en transformeret mikroorganisme indeholdende IL-2'en, kendeteg- 20 net ved, (a) at mikroorganismens cellemembran brydes, (b) at de åbnede celler ekstraheres med en vandig opløsning af et chaotropt middel, som ekstraherer ikke-IL-2-proteiner selektivt 25 fra det cellulære materiale, (c) at IL-2'en i den faste fase af ekstraktionsblandingen opløses med en vandig opløsning af et opløsende middel, som danner et vandopløseligt kompleks med IL-2'en, hvilken opløsning indeholder et reducerende middel, 30 (d) at IL-2'en separeres fra den fremkomne opløsning i nærværelsen af det reducerende middel, (e) at IL-2'en om ønsket oxideres, og (f) at det oxiderede produkt oprenses ved omvendt fase, højeffektiv væskekromatografi. 35
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4 k e n d e t e g n e t ved, at det chaotrope middel er urinstof, og at det opløsende middel er natriumdodecylsul fat eller natriumlaurylsarcosin. DK 166324 B
6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at trinnet (b) udføres ved en basisk pH-værdi.
7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-6, 5 kendetegnet ved, at trinnet (d) udføres ved gelfiltrering eller omvendt fase, højeffektiv væskekromatografi.
8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-6, kendetegnet ved, at trinnet (d) udføres ved at en
10 IL-2-holdig fraktion isoleres fra opløsningen ved gel fil trering, og at den fremkomne IL-2 oprenses fra fraktionen ved omvendt-fase, højeffektiv væskekromatografi.
9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-6, 15 kendetegnet ved, at trinnet (d) udføres ved: (i) at IL-2 ekstraheres fra den vandige opløsning fra trin (c) med 2-butanol eller 2-methyl-2-butanol, (ii) at IL-2'en syrepræcipiteres fra ekstraktet, og 20 (i i i) at det syrepræcipiterede IL-2 oprenses ved gel filtrering. 25 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59422384 | 1984-03-28 | ||
| US06/594,223 US4569790A (en) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK135985D0 DK135985D0 (da) | 1985-03-26 |
| DK135985A DK135985A (da) | 1985-09-29 |
| DK166324B true DK166324B (da) | 1993-04-05 |
| DK166324C DK166324C (da) | 1993-08-23 |
Family
ID=24378044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK135985A DK166324C (da) | 1984-03-28 | 1985-03-26 | Oprenset, rekombineret interleukin-2-sammensaetning og fremgangsmaade til udvinding af samme fra en transformeret mikroorganisme |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4569790A (da) |
| EP (2) | EP0470586B1 (da) |
| JP (2) | JP2599903B2 (da) |
| KR (1) | KR850007083A (da) |
| AT (1) | ATE81674T1 (da) |
| AU (1) | AU592751B2 (da) |
| CA (1) | CA1341083C (da) |
| DE (2) | DE3586762T2 (da) |
| DK (1) | DK166324C (da) |
| ES (1) | ES8609362A1 (da) |
| FI (1) | FI94960C (da) |
| GR (1) | GR850741B (da) |
| HK (1) | HK1004474A1 (da) |
| IE (1) | IE59100B1 (da) |
| IL (1) | IL74733A (da) |
| IN (1) | IN162903B (da) |
| NO (1) | NO851235L (da) |
| NZ (1) | NZ211569A (da) |
| PH (1) | PH21012A (da) |
| PT (1) | PT80172B (da) |
| ZA (1) | ZA852347B (da) |
Families Citing this family (88)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
| US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
| US4853332A (en) * | 1982-10-19 | 1989-08-01 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins |
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| NZ210634A (en) * | 1983-12-23 | 1989-05-29 | Hoffmann La Roche | Purification of recombinant human interleukin - 2; pharmaceutical compositions |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| US4656132A (en) * | 1984-03-28 | 1987-04-07 | Cetus Corporation | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| EP0158487B1 (en) * | 1984-04-09 | 1991-08-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of interleukin-2 |
| US4908434A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Process for preparing purified interleukin-2 |
| US4908433A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Uses of interleukin-2 |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| DE3500681A1 (de) * | 1985-01-11 | 1986-07-17 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur isolierung und reinigung von lymphokinen |
| JPH0646957B2 (ja) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
| US5523215A (en) * | 1985-03-28 | 1996-06-04 | Chiron Corporation | Enhanced purification and expression of insoluble recombinant proteins |
| US5248769A (en) * | 1985-06-26 | 1993-09-28 | Cetus Oncology Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
| US4762784A (en) * | 1985-07-15 | 1988-08-09 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermemtation process for the high level production of bovine growth hormone |
| US4690915A (en) * | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| CA1297003C (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-10 | Jack H. Nunberg | Composition and method for treating animals |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| US4933433A (en) * | 1986-01-31 | 1990-06-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant interleukin-2 composition and process for making it |
| US5425940A (en) * | 1986-04-09 | 1995-06-20 | Cetus Oncology Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
| US4931544A (en) * | 1986-09-04 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions |
| US4683293A (en) * | 1986-10-20 | 1987-07-28 | Phillips Petroleum Company | Purification of pichia produced lipophilic proteins |
| US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
| US4879374A (en) * | 1987-03-13 | 1989-11-07 | Immunex Corporation | Bovine interleukin-1β DNA sequence |
| US5108911A (en) * | 1987-03-13 | 1992-04-28 | Immunex Corporation | Process for preparing bovine interleukin-Iβ |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| CA1339757C (en) * | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| JPS6463395A (en) | 1987-05-04 | 1989-03-09 | Oncogen | Oncostatin m and novel composition having antitumor activity |
| US5162507A (en) * | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| US4931543A (en) * | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
| WO1988008849A1 (en) * | 1987-05-11 | 1988-11-17 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| US4801691A (en) * | 1987-05-15 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for removing sodium dodecyl sulfate from sodium dodecyl sulfate solubilized protein solutions |
| AU2257488A (en) * | 1987-07-29 | 1989-03-01 | Schering Biotech Corporation | Purification of human interleukin-4 expressed in escherichia coli |
| JP2669859B2 (ja) * | 1987-08-04 | 1997-10-29 | 協和醗酵工業株式会社 | タンパク質の再活性化法 |
| EP0337243A1 (en) * | 1988-04-14 | 1989-10-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for purifying recombinant human interleukin-2 |
| FR2635527B1 (fr) * | 1988-07-28 | 1992-06-12 | Roussel Uclaf | Il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite, son procede d'obtention et son application comme medicament |
| US4923967A (en) * | 1988-09-26 | 1990-05-08 | Eli Lilly And Company | Purification and refolding of recombinant proteins |
| US5830452A (en) * | 1990-11-20 | 1998-11-03 | Chiron Corporation | Method for enhancing the anti-tumor therapeutic index of interleukin-2 |
| EP0511964B1 (fr) * | 1990-11-23 | 1997-10-15 | Roussel Uclaf | PROCEDE DE PREPARATION D'UNE PROTEINE CHOISIE PARMI LES CYTOKINES, COMPORTANT AU MOINS UN PONT DISULFURE INTRAMOLECULAIRE PAR OXYDATION, A UN pH INFERIEUR A 5,0, DE LA PROTEINE RECOMBINANTE REDUITE CORRESPONDANTE |
| US5939524A (en) * | 1991-12-09 | 1999-08-17 | The Scripps Research Institute | Platelet GPIII P1A1 and P1A2 epitopes, their preparation and use |
| AU648214B2 (en) * | 1991-12-31 | 1994-04-14 | Lucky Limited | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc. |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US6063764A (en) * | 1992-06-01 | 2000-05-16 | Washington University & Chiron Corp. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| US20030171292A1 (en) * | 1992-06-01 | 2003-09-11 | Creasey Abla A. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| EP0672144A1 (en) * | 1992-10-20 | 1995-09-20 | Chiron Corporation | Interleukin-6 receptor antagonists |
| CN1051092C (zh) * | 1993-05-21 | 2000-04-05 | 沈阳军区后勤部军事医学研究所 | 一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2的方法 |
| US5632983A (en) | 1994-11-17 | 1997-05-27 | University Of South Florida | Method for treating secondary immunodeficiency |
| US5912327A (en) * | 1996-09-30 | 1999-06-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Method of purifying chemokines from inclusion bodies |
| US6632425B1 (en) | 1997-03-20 | 2003-10-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine compositions |
| EP1935431A3 (en) | 2000-05-15 | 2008-08-13 | Health Research, Inc. | Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2 |
| DE60230491D1 (de) | 2001-03-29 | 2009-02-05 | Schering Corp | Als ccr5-antagonisten verwendbare aryloxim-piperazine |
| WO2003055442A2 (en) * | 2001-10-15 | 2003-07-10 | Chiron Corporation | Treatment of sepsis by low dose administration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
| WO2003099320A1 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd | Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy |
| AU2004224191A1 (en) | 2003-03-24 | 2004-10-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors |
| ATE446967T1 (de) * | 2003-09-09 | 2009-11-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Chromatographische auftrennung therapeutischer polypeptide |
| EP2267154A1 (en) | 2003-10-23 | 2010-12-29 | Illumigen Biosciences, Inc. | Oligoadenylate synthetase |
| WO2005044854A2 (en) | 2003-11-04 | 2005-05-19 | Chiron Corporation | Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use |
| EP1729791A2 (en) * | 2004-03-17 | 2006-12-13 | Chiron Corporation | Treatment of severe community-acquired pneumonia by admistration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
| CU23297A1 (es) | 2004-11-16 | 2008-07-24 | Ct De Inmunologa A Molecular | Formulaciones inmunoterapã0/00uticas para la inducciã"n de autoanticuerpos bloqueadores de la uniã"n de interleucina-2 a su receptor. su uso en el tratamiento del cã ncer |
| DE102005005542A1 (de) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Herstellung von Aldesleukin für die pharmazeutische Verwendung |
| EP1940781A1 (en) | 2005-10-19 | 2008-07-09 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Phenyl-acetamide nnrt inhibitors |
| RU2304586C1 (ru) * | 2006-03-27 | 2007-08-20 | Михаил Николаевич Смирнов | Препарат интерлейкина-2 и способ его получения |
| BRPI0715193A2 (pt) | 2006-08-16 | 2013-10-01 | Hoffmann La Roche | inibidores nço-nucleosÍdicos da transcriptase reversa |
| BRPI0720436A2 (pt) | 2006-12-13 | 2014-01-07 | Hoffmann La Roche | Inibidores de transcriptase reversa de não-nucleosídeo |
| MX2009012704A (es) | 2007-05-30 | 2009-12-08 | Hoffmann La Roche | Inhibidores de transcriptasa inversa de no nucleosidos. |
| WO2009080534A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Heterocyclic antiviral compounds |
| AU2009279677A1 (en) * | 2008-08-04 | 2010-02-11 | Kai Bioenergy | Continuous cultivation, harvesting, and oil extraction of photosynthetic cultures |
| WO2012065086A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Nektar Therapeutics | Conjugates of an il-2 moiety and a polymer |
| EP3211001B1 (en) | 2010-12-22 | 2020-10-07 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Superagonists and antagonists of interleukin-2 |
| KR102067445B1 (ko) * | 2012-05-31 | 2020-01-17 | 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 | 양전하 유기 첨가물 처리에 의한 단백질-오염물 복합체 및 단백질 제제 내 응집체 레벨의 감소 방법 |
| US10781242B2 (en) | 2013-09-24 | 2020-09-22 | Medicenna Therapeutics Inc. | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof |
| WO2015164815A1 (en) | 2014-04-24 | 2015-10-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2 |
| EP3204119B1 (en) | 2014-10-09 | 2021-06-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Multiple-variable il-2 dose regimen for treating immune disorders |
| CA3067909A1 (en) | 2017-06-19 | 2018-12-27 | Medicenna Therapeutics Inc. | Uses and methods for il-2 superagonists, agonists, and fusions thereof |
| AU2018300069A1 (en) | 2017-07-11 | 2020-02-27 | Synthorx, Inc. | Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof |
| TWI757528B (zh) | 2017-08-03 | 2022-03-11 | 美商欣爍克斯公司 | 用於增生及感染性疾病治療之細胞激素結合物 |
| CN112399859A (zh) | 2018-05-21 | 2021-02-23 | 尼克塔治疗公司 | 选择性TREG刺激剂RUR20kD-IL-2和相关组合物 |
| KR20210021357A (ko) * | 2018-06-13 | 2021-02-25 | 아크론 바이오테크놀로지 엘엘씨 | 액체 약학적 조성물에서 매우 안정한 치료적으로 활성인 알데스루킨의 제조 방법 |
| AU2020218203A1 (en) | 2019-02-06 | 2021-08-26 | Synthorx, Inc. | IL-2 conjugates and methods of use thereof |
| CN114245802A (zh) | 2019-06-20 | 2022-03-25 | 石药集团巨石生物制药有限公司 | 修饰的il-2蛋白、peg偶联物及其用途 |
| WO2021146436A2 (en) | 2020-01-14 | 2021-07-22 | Synthekine, Inc. | Biased il2 muteins methods and compositions |
| CN111676261A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-18 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种高纯度重组白介素-2的制备工艺 |
| CN111793124A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-10-20 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种去除重组白介素-2内毒素的方法 |
| WO2023114833A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-22 | Eli Lilly And Company | Dosing regimens for selective treg stimulator rur20kd-il-2 and related compositions |
Family Cites Families (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3897309A (en) * | 1974-02-15 | 1975-07-29 | Merck & Co Inc | Process for removing pyrogenic material from aqueous solutions |
| JPS6030291B2 (ja) * | 1978-03-20 | 1985-07-16 | 森永乳業株式会社 | 人顆粒球の分化増殖を促進するｈｇｉ糖蛋白質、ｈｇｉ糖蛋白質の製造法及びｈｇｉ糖蛋白質を含有する白血球減少症治療剤 |
| IN150740B (da) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| JPS55148098A (en) * | 1979-05-10 | 1980-11-18 | Toray Ind Inc | Concentration and purification of interferon |
| CH648331A5 (de) * | 1979-07-31 | 1985-03-15 | Hoffmann La Roche | Homogenes fibroblasten-interferon und dessen herstellung. |
| US4390623A (en) * | 1980-10-02 | 1983-06-28 | Hooper Trading Company | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| US4315852A (en) * | 1980-11-26 | 1982-02-16 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| US4448879A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-15 | Hooper Trading Company | High yield process for in vitro production of serum-free and mitogen-free interleukin-2 |
| US4464355A (en) * | 1981-03-26 | 1984-08-07 | Hooper Trading Co. | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| US4401756A (en) * | 1981-04-14 | 1983-08-30 | Immunex Corporation | Process for preparing human interleukin 2 |
| JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法 |
| US4450103A (en) * | 1982-03-01 | 1984-05-22 | Cetus Corporation | Process for recovering human IFN-β from a transformed microorganism |
| EP0091539B2 (en) * | 1982-03-31 | 1996-11-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| CA1341562C (en) * | 1982-03-31 | 2007-11-27 | Tadatsugu Taniguchi | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US4778879A (en) * | 1982-04-20 | 1988-10-18 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Highly purified human interleukin 2 and method |
| US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
| EP0092163B1 (en) * | 1982-04-20 | 1988-09-28 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Purification of interleukin 2 |
| JPS58198293A (ja) * | 1982-05-12 | 1983-11-18 | Shionogi & Co Ltd | インタ−ロイキン等免疫調節因子の製造方法 |
| US4490289A (en) * | 1982-09-16 | 1984-12-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous human interleukin 2 |
| US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
| US4462940A (en) * | 1982-09-23 | 1984-07-31 | Cetus Corporation | Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides |
| DE3242851A1 (de) * | 1982-11-19 | 1984-05-24 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verfahren zur reinigung von menschlichen lymphokinen |
| JPS59116231A (ja) * | 1982-12-13 | 1984-07-05 | スロ−ン−ケツタリング・インステイテユ−ト・フオ−・キヤンサ−・リサ−チ | 抗−インタ−ロイキン−２単クロ−ン抗体 |
| US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| AU579089B2 (en) * | 1983-02-08 | 1988-11-17 | Biogen, Inc. | Human interleukin-2-like polypeptides |
| EP0119621A1 (en) * | 1983-03-21 | 1984-09-26 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Interleukin-2 |
| GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
| US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| US4582799A (en) * | 1983-04-15 | 1986-04-15 | Damon Biotech, Inc. | Process for recovering nonsecreted substances produced by cells |
| NZ208309A (en) * | 1983-06-01 | 1988-04-29 | Hoffmann La Roche | Recombinant leukocyte, fibroblast, or immune interferons (rifn-#a#, b or #g#) with one cys residue replaced |
| WO1985000606A1 (en) * | 1983-07-19 | 1985-02-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Human il-2 and process for its preparation |
| US4464295A (en) * | 1983-08-17 | 1984-08-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Simple and rapid method for extraction of proteins from bacteria |
| US4476049A (en) * | 1983-09-20 | 1984-10-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the extraction of immune interferon |
| GB8327880D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Ajinomoto Kk | Saccharomyces cerevisiae |
| US4675383A (en) * | 1983-11-15 | 1987-06-23 | The Salk Institute For Biological Studies | Purification of T-cell growth factor |
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| NZ210634A (en) * | 1983-12-23 | 1989-05-29 | Hoffmann La Roche | Purification of recombinant human interleukin - 2; pharmaceutical compositions |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| WO1985004328A1 (en) * | 1984-03-28 | 1985-10-10 | Cetus Corporation | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| EP0158487B1 (en) * | 1984-04-09 | 1991-08-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of interleukin-2 |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| US4782139A (en) * | 1985-10-28 | 1988-11-01 | Eli Lilly And Company | Selective chemical removal of a protein amino-terminal residue |
| US4787658A (en) * | 1986-07-29 | 1988-11-29 | Harris Jr John | Unibody bumper system |
| US5156968A (en) * | 1988-06-24 | 1992-10-20 | Genentech, Inc. | Purified yeast ubiquitin hydrolase |
-
1984
- 1984-03-28 US US06/594,223 patent/US4569790A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-02-26 CA CA000475151A patent/CA1341083C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-25 PH PH32035A patent/PH21012A/en unknown
- 1985-03-25 IN IN220/CAL/85A patent/IN162903B/en unknown
- 1985-03-26 NZ NZ211569A patent/NZ211569A/en unknown
- 1985-03-26 DK DK135985A patent/DK166324C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-03-26 GR GR850741A patent/GR850741B/el unknown
- 1985-03-27 DE DE8585103649T patent/DE3586762T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 ES ES541608A patent/ES8609362A1/es not_active Expired
- 1985-03-27 DE DE3588189T patent/DE3588189T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 PT PT80172A patent/PT80172B/pt unknown
- 1985-03-27 NO NO851235A patent/NO851235L/no unknown
- 1985-03-27 EP EP91113235A patent/EP0470586B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 AT AT85103649T patent/ATE81674T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 FI FI851231A patent/FI94960C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 IL IL74733A patent/IL74733A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 EP EP85103649A patent/EP0156373B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-28 KR KR1019850002078A patent/KR850007083A/ko not_active Application Discontinuation
- 1985-03-28 ZA ZA852347A patent/ZA852347B/xx unknown
- 1985-03-28 IE IE79985A patent/IE59100B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 AU AU40467/85A patent/AU592751B2/en not_active Expired
- 1985-03-28 JP JP60062195A patent/JP2599903B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-06 US US07/879,753 patent/US5419899A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-25 US US08/428,895 patent/US5614185A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-15 JP JP8143485A patent/JP2648587B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-04 HK HK98103767A patent/HK1004474A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK166324B (da) | Oprenset, rekombineret interleukin-2-sammensaetning og fremgangsmaade til udvinding af samme fra en transformeret mikroorganisme | |
| EP0217645B1 (en) | Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection | |
| US4748234A (en) | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts | |
| EP0357645B1 (en) | Improved process for recovering microbially produced interleukin-2 | |
| EP0215658B1 (en) | Improved formulation for recombinant beta-interferon processes for recovery and stabilization of beta-interferon and the use thereof | |
| Ejima et al. | High yield refolding and purification process for recombinant human interleukin‐6 expressed in Escherichia coli | |
| EP0211835B1 (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| US5162507A (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms | |
| EP0368857B1 (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms | |
| US4961969A (en) | Process for recovering microbially produced interferon-β | |
| AU631356B2 (en) | Improved process for recovering microbially produced interferon-beta | |
| JP2812760B2 (ja) | 微生物宿主から異種蛋白質を含有する屈折体を回収する方法 | |
| CA1283356C (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| CA1337671C (en) | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms | |
| JPS62209097A (ja) | 組換えヒトインタリユーキン−１αの精製法 | |
| BG60405B2 (bg) | фармацевтични състави от микробно произведен интерлевкин-2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed | ||
| PUP | Patent expired |