JP2648587B2 - 精製された変異型インターロイキン−２組成物 - Google Patents
精製された変異型インターロイキン−２組成物Info
- Publication number
- JP2648587B2 JP2648587B2 JP8143485A JP14348596A JP2648587B2 JP 2648587 B2 JP2648587 B2 JP 2648587B2 JP 8143485 A JP8143485 A JP 8143485A JP 14348596 A JP14348596 A JP 14348596A JP 2648587 B2 JP2648587 B2 JP 2648587B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sds
- immune response
- solution
- composition
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は生化学工学の分野
に属す。さらに詳しくは、この発明は、エンドトキシン
及び発熱物質を含有しない変異型インターロイキン−２
に関するものである。
に属す。さらに詳しくは、この発明は、エンドトキシン
及び発熱物質を含有しない変異型インターロイキン−２
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】天然のヒトＩＬ−２は、抗原、マイトジ
ン、及び同種抗原により刺激された赤血球ロゼット陽性
Ｔ細胞によって産生される抗原−非特異な、遺伝的に制
限されない可溶性因子である。それは公表された分子量
約１３，０００〜１７，０００ダルトン〔Ｓ．ギルそし
てＪ．ワトソン，ジャーナル オブイクスペリメンタル
ン、及び同種抗原により刺激された赤血球ロゼット陽性
Ｔ細胞によって産生される抗原−非特異な、遺伝的に制
限されない可溶性因子である。それは公表された分子量
約１３，０００〜１７，０００ダルトン〔Ｓ．ギルそし
てＪ．ワトソン，ジャーナル オブイクスペリメンタル
【０００３】メソッド（S. Gillis and J. Watson, J E
xp Med）（１９８０）１５９：１７０９〕及び約pH６〜
８．５の範囲等電点を有するタンパク質である。ヒトＩ
Ｌ−２は、人間の末梢血液単核細胞又はマウス胞腺細胞
の増殖反応を高める事、細菌、寄生体、菌類、原生動
物、及びビールスなどの感染に対するヒト及び動物の免
疫反応を高める事、並びに絶え間ないＴ−細胞系の増殖
を支持する事などを含む多くのイン−ビトロ及びイン−
ビボ効果をもっている。
xp Med）（１９８０）１５９：１７０９〕及び約pH６〜
８．５の範囲等電点を有するタンパク質である。ヒトＩ
Ｌ−２は、人間の末梢血液単核細胞又はマウス胞腺細胞
の増殖反応を高める事、細菌、寄生体、菌類、原生動
物、及びビールスなどの感染に対するヒト及び動物の免
疫反応を高める事、並びに絶え間ないＴ−細胞系の増殖
を支持する事などを含む多くのイン−ビトロ及びイン−
ビボ効果をもっている。
【０００４】アミノ酸１２５位のシステイン残基がセリ
ンに置き換えられておりそして／又は最初のアラニンが
取り除かれているＩＬ−２、及びＩＬ−２ムテイン（Ｍ
ｕｔｅｉｎｓ）は遺伝子工学技法によって微生物的に製
造されている。微生物的に産生されたＩＬ−２はグリコ
シル化されておらず、そして微生物によって還元された
状態で産生される。精製されそして酸化された時、これ
らの微生物的に産生されたＩＬ−２及びＩＬ−２ムテイ
ンは天然のヒトＩＬ−２に匹敵する活性を現す。
ンに置き換えられておりそして／又は最初のアラニンが
取り除かれているＩＬ−２、及びＩＬ−２ムテイン（Ｍ
ｕｔｅｉｎｓ）は遺伝子工学技法によって微生物的に製
造されている。微生物的に産生されたＩＬ−２はグリコ
シル化されておらず、そして微生物によって還元された
状態で産生される。精製されそして酸化された時、これ
らの微生物的に産生されたＩＬ−２及びＩＬ−２ムテイ
ンは天然のヒトＩＬ−２に匹敵する活性を現す。
【０００５】Ｔ細胞から天然のＩＬ−２を精製するため
の方法は次のような出版物に詳述されている；ワトソ
ン，Ｊ．，等、ジャーナル オブ イクスメンタル メ
ソド（J Exp Med ）（１９７９）１５０：８４９−８６
１；ギル，Ｓ．，等、ジャーナル オブ イミュノロジ
イ（J Immunology) （１９８０）１２４：１９５４−１
９６２；モチヅキ，Ｄ．Ｙ．，等、ジャーナル オブ
イミュノロジカル メソド（J Immun Meth）（１９８
０）３９：１８５−２０１；ウエルト，Ｋ．等、ジャー
ナル オブ イクスペリメンタル メソド（J Exp Med)
（１９８２）１５６：４５４−４６４；及びヨーロッパ
特許出願８３１０３５８２．９（１９８３年の１０月２
６日に第９２１６３号として公表された）及び８３４０
０９３８．３（１９８３年１１月１６日に第９４３１７
号として公表された）。一般的に、これらの方法は、硫
酸アンモニウムにより培養上清液からタンパク質を沈殿
させそれからクロマトグラフィック分別することを含ん
でいる。
の方法は次のような出版物に詳述されている；ワトソ
ン，Ｊ．，等、ジャーナル オブ イクスメンタル メ
ソド（J Exp Med ）（１９７９）１５０：８４９−８６
１；ギル，Ｓ．，等、ジャーナル オブ イミュノロジ
イ（J Immunology) （１９８０）１２４：１９５４−１
９６２；モチヅキ，Ｄ．Ｙ．，等、ジャーナル オブ
イミュノロジカル メソド（J Immun Meth）（１９８
０）３９：１８５−２０１；ウエルト，Ｋ．等、ジャー
ナル オブ イクスペリメンタル メソド（J Exp Med)
（１９８２）１５６：４５４−４６４；及びヨーロッパ
特許出願８３１０３５８２．９（１９８３年の１０月２
６日に第９２１６３号として公表された）及び８３４０
０９３８．３（１９８３年１１月１６日に第９４３１７
号として公表された）。一般的に、これらの方法は、硫
酸アンモニウムにより培養上清液からタンパク質を沈殿
させそれからクロマトグラフィック分別することを含ん
でいる。
【０００６】１９８４年５月２２日に発行された米国特
許第４，４５０，１０３号及びダーインク，Ｒ．等、ネ
イチュア（Nature）（１９８０）２８７：１９３−１９
７にはＩＦＮ−β生産性Ｅ．コライ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）か
らＩＦＮ−βを回収する為の方法が詳述されている。前
記特許はＩＦＮ−βを２−ブタノール又は２−メチル−
２−ブタノールにより細胞物質から抽出する方法を詳述
している。
許第４，４５０，１０３号及びダーインク，Ｒ．等、ネ
イチュア（Nature）（１９８０）２８７：１９３−１９
７にはＩＦＮ−β生産性Ｅ．コライ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）か
らＩＦＮ−βを回収する為の方法が詳述されている。前
記特許はＩＦＮ−βを２−ブタノール又は２−メチル−
２−ブタノールにより細胞物質から抽出する方法を詳述
している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、エンドトキ
シン及び発熱物質を含有しない、変異型インターロイキ
ン−２を提供するものである。
シン及び発熱物質を含有しない、変異型インターロイキ
ン−２を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記の課題を
解決するため、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定
された少なくとも約９５％のｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ
125 ＩＬ−２含有量、約０．１ng／mgのＩＬ−２よりも
少ないエンドトキシン含有量を有しそして３．３×１０
5 ｕ／kgの投与量でのＵ．Ｓ．Ｐ．ウサギ発熱原試験に
よって決定した場合発熱物質を実質的に含有しない精製
されたｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ125 ＩＬ−２組成物を提
供する。この組成物は、例えば次の方法により製造する
ことができる。
解決するため、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定
された少なくとも約９５％のｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ
125 ＩＬ−２含有量、約０．１ng／mgのＩＬ−２よりも
少ないエンドトキシン含有量を有しそして３．３×１０
5 ｕ／kgの投与量でのＵ．Ｓ．Ｐ．ウサギ発熱原試験に
よって決定した場合発熱物質を実質的に含有しない精製
されたｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ125 ＩＬ−２組成物を提
供する。この組成物は、例えば次の方法により製造する
ことができる。
【０００９】（ａ）微生物の細胞膜の破壊； （ｂ）ケイオトロピック剤の水性溶液による破壊物の抽
出； （ｃ）ＩＬ−２と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤
の水溶液（この溶液は還元剤を含有する）による、抽出
混合物の固相中のＩＬ−２の可溶化；及び （ｄ）還元剤の存在下での（ｃ）で得られる溶液からの
ＩＬ−２の分離。 この方法の好ましい態様において、ケイオトロピック剤
は抽出混合物中約３．５Ｍ〜約４．５Ｍの濃度の尿素で
あり、可溶化剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又
はナトリウムラウリルサルコシン（サルコシル）であ
り、可溶化されたＩＬ−２は２−ブタノール又は２−メ
チル−２−ブタノールによりさらに抽出されそして最終
分離はゲル濾過によって行なわれ、そして得られたサイ
ズ画分された生成物は酸化され、そして酸化された生成
物は逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
によって精製される。
出； （ｃ）ＩＬ−２と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤
の水溶液（この溶液は還元剤を含有する）による、抽出
混合物の固相中のＩＬ−２の可溶化；及び （ｄ）還元剤の存在下での（ｃ）で得られる溶液からの
ＩＬ−２の分離。 この方法の好ましい態様において、ケイオトロピック剤
は抽出混合物中約３．５Ｍ〜約４．５Ｍの濃度の尿素で
あり、可溶化剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又
はナトリウムラウリルサルコシン（サルコシル）であ
り、可溶化されたＩＬ−２は２−ブタノール又は２−メ
チル−２−ブタノールによりさらに抽出されそして最終
分離はゲル濾過によって行なわれ、そして得られたサイ
ズ画分された生成物は酸化され、そして酸化された生成
物は逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
によって精製される。
【００１０】
【発明の実施の形態】この明細書において“ＩＬ−２”
という語は（ａ）天然のヒトインターロイキン−２の遺
伝子により、又は、天然のヒトインターロイキン−２の
アミノ酸配列と少なくとも実質的に同一であるようなア
ミノ酸配列をもつタンパク質をコードするヒトインター
ロイキン−２遺伝子の変形体により形質転換させられた
微生物によって産生され、そして、（ｂ）天然のヒトイ
ンターロイキン−２と共通の生物学的活性をもつグリコ
シルされていないタンパク質を意味する。アミノ酸配列
の実質的な同一とは、配列が同一であるか又は合成タン
パク質と天然ヒトインターロイキン−２との間に不都合
な機能的相違を惹起しない１個もしくは複数個のアミノ
酸変化（欠失、付加、置換）によって異なっていること
を意味する。
という語は（ａ）天然のヒトインターロイキン−２の遺
伝子により、又は、天然のヒトインターロイキン−２の
アミノ酸配列と少なくとも実質的に同一であるようなア
ミノ酸配列をもつタンパク質をコードするヒトインター
ロイキン−２遺伝子の変形体により形質転換させられた
微生物によって産生され、そして、（ｂ）天然のヒトイ
ンターロイキン−２と共通の生物学的活性をもつグリコ
シルされていないタンパク質を意味する。アミノ酸配列
の実質的な同一とは、配列が同一であるか又は合成タン
パク質と天然ヒトインターロイキン−２との間に不都合
な機能的相違を惹起しない１個もしくは複数個のアミノ
酸変化（欠失、付加、置換）によって異なっていること
を意味する。
【００１１】そのようなタンパク質の例は１９８３年２
月３日に出願されたヨーロッパ特許出願８３１０１０３
５．０（１９８３年１０月１９日に公開第９１５３９号
として公表）の中に、及び１９８２年１２月２２日に出
願されたヨーロッパ特許出願８２３０７０３６．２（１
９８３年９月１４日に第８８１９５号として公開）の中
に詳述されているＩＬ−２であり、１９８３年１０月１
３日出願されたヨーロッパ特許出願８３３０６２２１．
９（１９８４年５月３０日第１０９７４８号として公
表）の中に詳述されているＩＬ−２であり、そしてこの
出願の例の中に詳述されているＩＬ−２である。
月３日に出願されたヨーロッパ特許出願８３１０１０３
５．０（１９８３年１０月１９日に公開第９１５３９号
として公表）の中に、及び１９８２年１２月２２日に出
願されたヨーロッパ特許出願８２３０７０３６．２（１
９８３年９月１４日に第８８１９５号として公開）の中
に詳述されているＩＬ−２であり、１９８３年１０月１
３日出願されたヨーロッパ特許出願８３３０６２２１．
９（１９８４年５月３０日第１０９７４８号として公
表）の中に詳述されているＩＬ−２であり、そしてこの
出願の例の中に詳述されているＩＬ−２である。
【００１２】この明細書において“形質転換させられた
微生物”という語は天然のヒトインターロイキン−２活
性をもつタンパク質を産生するために遺伝学的に処理さ
れる微生物という意味である。形質転換された微生物の
例は前記のヨーロッパ特許出願８８１９５，９１５３
９、及び１０９７４８並びにこの出願の例に詳述されて
いる。細菌はＩＬ−２を生成する為の好ましい微生物で
ある。合成ＩＬ−２はまた適切に形質転換した酵母及び
哺乳動物細胞によっても作られる。Ｅ．コライが特別に
好ましい。
微生物”という語は天然のヒトインターロイキン−２活
性をもつタンパク質を産生するために遺伝学的に処理さ
れる微生物という意味である。形質転換された微生物の
例は前記のヨーロッパ特許出願８８１９５，９１５３
９、及び１０９７４８並びにこの出願の例に詳述されて
いる。細菌はＩＬ−２を生成する為の好ましい微生物で
ある。合成ＩＬ−２はまた適切に形質転換した酵母及び
哺乳動物細胞によっても作られる。Ｅ．コライが特別に
好ましい。
【００１３】形質転換された微生物は、適切な増殖培地
の中で、典型的には６８０nmにおいて少なくとも約３０
の光学濃度（ＯＤ）へ、そして好ましくは６８０nmにお
いて約２０〜４０の間のＯＤへ増殖する。増殖培地の組
成は用いられる特定の微生物に依存するだろう。培地
は、微生物の栄養要求を満たす化合物を含むような水性
培地である。増殖培地は、炭素及び窒素、エネルギー
源、マグネシウム、カリウム及びナトリウムイオン並び
に場合によってはアミノ酸及びプリン及びピリミジン塩
基などを典型的に含んでいるだろう〔リィビュウ オブ
メディカル バイオロジイ（Review of Medical Biol
ogy ）、ラング メディカル ハブリケーション、第１
４版８０−９５項（１９８０．）を参照のこと〕。
の中で、典型的には６８０nmにおいて少なくとも約３０
の光学濃度（ＯＤ）へ、そして好ましくは６８０nmにお
いて約２０〜４０の間のＯＤへ増殖する。増殖培地の組
成は用いられる特定の微生物に依存するだろう。培地
は、微生物の栄養要求を満たす化合物を含むような水性
培地である。増殖培地は、炭素及び窒素、エネルギー
源、マグネシウム、カリウム及びナトリウムイオン並び
に場合によってはアミノ酸及びプリン及びピリミジン塩
基などを典型的に含んでいるだろう〔リィビュウ オブ
メディカル バイオロジイ（Review of Medical Biol
ogy ）、ラング メディカル ハブリケーション、第１
４版８０−９５項（１９８０．）を参照のこと〕。
【００１４】ｔｒｐ−プロモーターを用いる発現ベクタ
ーにおいては、培地中のトリプトファン濃度は、ＩＬ−
２の発現が望まれる時点で制限的になるよう、注意して
制御されている。Ｅ．コライの為の増殖培地は当業界に
おいてよく知られている。培養物から細胞を収得した
後、もし必要ならば、濾過、遠心分離、又は他の常用の
方法によって、細胞を約２０〜１５０mg／mlに、好まし
くは８０〜１００mg／ml（６８０nmで４０〜３００のＯ
Ｄ、好ましくは１６０〜２００のＯＤ）に濃縮する。
ーにおいては、培地中のトリプトファン濃度は、ＩＬ−
２の発現が望まれる時点で制限的になるよう、注意して
制御されている。Ｅ．コライの為の増殖培地は当業界に
おいてよく知られている。培養物から細胞を収得した
後、もし必要ならば、濾過、遠心分離、又は他の常用の
方法によって、細胞を約２０〜１５０mg／mlに、好まし
くは８０〜１００mg／ml（６８０nmで４０〜３００のＯ
Ｄ、好ましくは１６０〜２００のＯＤ）に濃縮する。
【００１５】濃縮に続いて微生物の細胞膜を破壊する。
破壊の主目的は次の抽出及び可溶化方法を促進する事で
ある。工程のこの段階でホモジニゼーション、超音波処
理、又はプレッシャーサイクリング法のような常用の細
胞破壊技法を使用する。好まれる方法はマントン−ガウ
リン ホモジナイザー（Monton-Gaulin Homogenizer）
による超音波処理又はホモジニゼーションである。
破壊の主目的は次の抽出及び可溶化方法を促進する事で
ある。工程のこの段階でホモジニゼーション、超音波処
理、又はプレッシャーサイクリング法のような常用の細
胞破壊技法を使用する。好まれる方法はマントン−ガウ
リン ホモジナイザー（Monton-Gaulin Homogenizer）
による超音波処理又はホモジニゼーションである。
【００１６】破壊段階の終点は懸濁液の光学濃度によっ
て監視し、典型的には約６５％〜約８５％低下する。い
ずれにしても破壊は、元のままの細胞が次の可溶化段階
へ実質的に持ち越されないように、細胞のすべてを実質
的に破壊すべきである。破壊の前、もし必要ならば細胞
の残骸中に不溶性複合体としてＩＬ−２タンパク質を保
持しながら、次の段階でＥ．コライタンパク質の除去を
促進するような水準に濃縮物の液体相のpHを調節する。
pHは適切な緩衝液を添加する事によってそのように調節
する。ほとんどの場合、約８〜約８．５の範囲内のpHが
用いられるだろう。
て監視し、典型的には約６５％〜約８５％低下する。い
ずれにしても破壊は、元のままの細胞が次の可溶化段階
へ実質的に持ち越されないように、細胞のすべてを実質
的に破壊すべきである。破壊の前、もし必要ならば細胞
の残骸中に不溶性複合体としてＩＬ−２タンパク質を保
持しながら、次の段階でＥ．コライタンパク質の除去を
促進するような水準に濃縮物の液体相のpHを調節する。
pHは適切な緩衝液を添加する事によってそのように調節
する。ほとんどの場合、約８〜約８．５の範囲内のpHが
用いられるだろう。
【００１７】破壊段階に続く回収工程中の段階は、ＩＬ
−２を還元状態で維持しながら、高収量で高レベルの純
度（好ましくは、少なくとも約９５％及びさらに好まし
くは少なくとも約９８％）に、Ｅ．コライタンパク質か
らＩＬ−２を分離するために、まず第１に計画されてい
る。同時に、これらの精製方法は、組合わせにおいて、
最終生成物中に発熱性物質を患者への経腸投与の為に許
容しうると信じられている水準へ減少せしめる。
−２を還元状態で維持しながら、高収量で高レベルの純
度（好ましくは、少なくとも約９５％及びさらに好まし
くは少なくとも約９８％）に、Ｅ．コライタンパク質か
らＩＬ−２を分離するために、まず第１に計画されてい
る。同時に、これらの精製方法は、組合わせにおいて、
最終生成物中に発熱性物質を患者への経腸投与の為に許
容しうると信じられている水準へ減少せしめる。
【００１８】細胞を破壊した後、破壊物の液体相から粒
状物を分離しそして抽出の為の最適pHに緩衝された水性
媒体に再懸濁することができる。場合によってはこの段
階で粒状物を緩衝液によって洗浄し、この中に存在する
水溶性のＥ．コライタンパク質を除去することができ
る。いずれにしても、抽出にかけられる細胞懸濁液のタ
ンパク質濃度は普通、約５〜約６０mg／ml、好ましくは
２０〜４０mg／mlの範囲内にある。
状物を分離しそして抽出の為の最適pHに緩衝された水性
媒体に再懸濁することができる。場合によってはこの段
階で粒状物を緩衝液によって洗浄し、この中に存在する
水溶性のＥ．コライタンパク質を除去することができ
る。いずれにしても、抽出にかけられる細胞懸濁液のタ
ンパク質濃度は普通、約５〜約６０mg／ml、好ましくは
２０〜４０mg／mlの範囲内にある。
【００１９】粒状の細胞性物質からのＥ．コライタンパ
ク質の抽出は破壊と同時に又は破壊の後に引き続いて実
施することができる。それは破壊に次ぐ分離された方法
として、実行するのが好ましい。抽出剤はケイオトロピ
ック剤（すなわち水素結合を解離しそしてタンパク質の
三次構造に影響を与える緩タンパク質変性剤）の水性溶
液である。抽出剤は、細胞残骸と関連する（それに含ま
れる又は結合している）ＩＬ−２の少なくとも実質的な
部分を残しながら細胞残骸からＥ．コライタンパク質の
大部分を選択的に取り除く。選択性は、ＩＬ−２の疎水
性によって、そしてタンパク質の等電点の近くのpHにお
いて還元され、不溶性の状態にそれがあるという事実に
よって、促進される。
ク質の抽出は破壊と同時に又は破壊の後に引き続いて実
施することができる。それは破壊に次ぐ分離された方法
として、実行するのが好ましい。抽出剤はケイオトロピ
ック剤（すなわち水素結合を解離しそしてタンパク質の
三次構造に影響を与える緩タンパク質変性剤）の水性溶
液である。抽出剤は、細胞残骸と関連する（それに含ま
れる又は結合している）ＩＬ−２の少なくとも実質的な
部分を残しながら細胞残骸からＥ．コライタンパク質の
大部分を選択的に取り除く。選択性は、ＩＬ−２の疎水
性によって、そしてタンパク質の等電点の近くのpHにお
いて還元され、不溶性の状態にそれがあるという事実に
よって、促進される。
【００２０】この上、ＩＬ−２の実質的な部分は、イン
−ビボではＥ．コライの中に高いレベルで発現する他の
クローン化されたタンパク質がそうであったように有意
な大きさの含有体とに存在する。抽出剤の例は、尿素及
びグアニジニウムハイドロクロライド（ＳＤＳが可溶化
剤として使用される時にはグアニジニウムハイドロクロ
ライドを使用すべきではない）である。抽出混合物の中
のケイオトロピック剤の濃度は、使用される特定のケイ
オトロピック剤及び抽出混合物中の細胞性物の量に依存
する。
−ビボではＥ．コライの中に高いレベルで発現する他の
クローン化されたタンパク質がそうであったように有意
な大きさの含有体とに存在する。抽出剤の例は、尿素及
びグアニジニウムハイドロクロライド（ＳＤＳが可溶化
剤として使用される時にはグアニジニウムハイドロクロ
ライドを使用すべきではない）である。抽出混合物の中
のケイオトロピック剤の濃度は、使用される特定のケイ
オトロピック剤及び抽出混合物中の細胞性物の量に依存
する。
【００２１】尿素の場合、２５℃でのバッチ方法におい
ては約３．５Ｍ〜４．５Ｍ間の、好ましくは約４Ｍの濃
度（最終濃度）が使用されるだろう。もし抽出を長時間
連続的に基づいて行なう場合には、より低濃度を使用す
る事が望ましいであろう。一般に抽出において２０℃〜
２５℃の範囲の温度を使用し、便利には室温を使用する
であろう。典型的には溶液と粒状物質との間の接触を強
化する為に混合を使用し、そしてこのようにして細胞残
骸から非ＩＬ−２タンパク質を抽出するのに必要な時間
を短縮する。抽出工程の動力学的分析は、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを使用しながら、上清液について実施され、そして
抽出は１５〜３０分までに本質的に完了することが見出
された。
ては約３．５Ｍ〜４．５Ｍ間の、好ましくは約４Ｍの濃
度（最終濃度）が使用されるだろう。もし抽出を長時間
連続的に基づいて行なう場合には、より低濃度を使用す
る事が望ましいであろう。一般に抽出において２０℃〜
２５℃の範囲の温度を使用し、便利には室温を使用する
であろう。典型的には溶液と粒状物質との間の接触を強
化する為に混合を使用し、そしてこのようにして細胞残
骸から非ＩＬ−２タンパク質を抽出するのに必要な時間
を短縮する。抽出工程の動力学的分析は、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを使用しながら、上清液について実施され、そして
抽出は１５〜３０分までに本質的に完了することが見出
された。
【００２２】抽出に続いて、混合物を固相と液体相に分
離する。次に還元剤及び可溶化剤を含む中性の水性緩衝
液と固相とを接解せしめることにより、固相中のＩＬ−
２を選択的に可溶化する。疎水性のＩＬ−２を溶解する
為に適切な疎水性−親水性のバランスを持つ表面活性剤
（洗剤）が使用される。１０〜１４個の炭素原子を持つ
アルカリ金属の硫酸塩化合物及びアルカリ金属のアルキ
ルサルコシネートが好ましい可溶化剤であり、ＳＤＳ及
びサルコシルが特に好ましい。
離する。次に還元剤及び可溶化剤を含む中性の水性緩衝
液と固相とを接解せしめることにより、固相中のＩＬ−
２を選択的に可溶化する。疎水性のＩＬ−２を溶解する
為に適切な疎水性−親水性のバランスを持つ表面活性剤
（洗剤）が使用される。１０〜１４個の炭素原子を持つ
アルカリ金属の硫酸塩化合物及びアルカリ金属のアルキ
ルサルコシネートが好ましい可溶化剤であり、ＳＤＳ及
びサルコシルが特に好ましい。
【００２３】可溶化において使用される可溶化剤の量は
特定の可溶化剤に依存するだろう。ＳＤＳ又はサルコシ
ルを使用する場合、ＳＤＳ／サルコシルと固相部分との
好ましい割合は約０．５：１〜１．４：１である。可溶
化媒体はまた可溶化されたＩＬ−２が有意な程度に酸化
されるのを防ぐ為に十分な量の還元剤を含んでいる。ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）及び２−メルカプトエタノ
ールのようなタンパク質還元剤が使用される。培地中で
のＤＴＴのような還元剤の濃度は普通、約５〜２０mMの
間の範囲である。可溶化は典型的には固相と可溶化媒体
との間の接触を増す為に混合しながら、２０℃〜２５℃
の範囲の温度において実施されるだろう。より高い温度
は不所望なＥ．コライタンパク質を可溶化する。可溶化
は、サンプルを１５分そのままの状態においたとき、又
は溶液が半透明に変わる時完全とみなされる。不溶性物
質は、可溶化を完了にした後分離される。
特定の可溶化剤に依存するだろう。ＳＤＳ又はサルコシ
ルを使用する場合、ＳＤＳ／サルコシルと固相部分との
好ましい割合は約０．５：１〜１．４：１である。可溶
化媒体はまた可溶化されたＩＬ−２が有意な程度に酸化
されるのを防ぐ為に十分な量の還元剤を含んでいる。ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）及び２−メルカプトエタノ
ールのようなタンパク質還元剤が使用される。培地中で
のＤＴＴのような還元剤の濃度は普通、約５〜２０mMの
間の範囲である。可溶化は典型的には固相と可溶化媒体
との間の接触を増す為に混合しながら、２０℃〜２５℃
の範囲の温度において実施されるだろう。より高い温度
は不所望なＥ．コライタンパク質を可溶化する。可溶化
は、サンプルを１５分そのままの状態においたとき、又
は溶液が半透明に変わる時完全とみなされる。不溶性物
質は、可溶化を完了にした後分離される。
【００２４】ＩＬ−２が可溶化された後、場合によって
は、ＩＬ−２は分子量がＩＬ−２に非常に近い一定の汚
染物を特に、含んでいる追加のＥ．コライタンパク質を
取り除く為に２−ブタノール又は２−メチル−２−ブタ
ノールによって、還元条件下で水性溶液から抽出され
る。水性溶液及びブタノールが実質的に混和しない条件
下（たとえば０．０５〜０．１５の範囲でのイオン強
度）で行なわれる。有機抽出の実施において、水性溶液
のタンパク質濃度は、もし必要なら、約６mg／mlよりも
少なく、好ましくは約０．５〜４mg／mlに調整するのが
好ましい。還元状態は、還元剤（たとえばＤＴＴ）の存
在下で抽出を実施する事によって維持されている。ブタ
ノールは一般的に、約１：１〜約３：１（抽出物：水性
溶液）の範囲の体積比で、好ましくは約１：１で、可溶
化されたＩＬ−２の水性溶液へ、加えられるであろう。
は、ＩＬ−２は分子量がＩＬ−２に非常に近い一定の汚
染物を特に、含んでいる追加のＥ．コライタンパク質を
取り除く為に２−ブタノール又は２−メチル−２−ブタ
ノールによって、還元条件下で水性溶液から抽出され
る。水性溶液及びブタノールが実質的に混和しない条件
下（たとえば０．０５〜０．１５の範囲でのイオン強
度）で行なわれる。有機抽出の実施において、水性溶液
のタンパク質濃度は、もし必要なら、約６mg／mlよりも
少なく、好ましくは約０．５〜４mg／mlに調整するのが
好ましい。還元状態は、還元剤（たとえばＤＴＴ）の存
在下で抽出を実施する事によって維持されている。ブタ
ノールは一般的に、約１：１〜約３：１（抽出物：水性
溶液）の範囲の体積比で、好ましくは約１：１で、可溶
化されたＩＬ−２の水性溶液へ、加えられるであろう。
【００２５】抽出はバッチ又は連続の操作のもとに実施
することができる。温度は普通、２０℃〜１００℃の範
囲内でありまたpHは普通、約４〜９、好ましくは約５〜
６であるだろう。溶液とブタノールとの接触時間は臨界
的ではなく、そして数分といった程度の比較的短時間が
使用される。抽出が完了した後、水性相及びブタノール
相を分離しそしてＩＬ−２をブタノール相から分離す
る。ブタノール相からＩＬ−２を分離する為の好ましい
方法は酸沈殿法である。これは、有機相が溶解されるま
で（有機相の体積に対して約２〜３緩衝液体積）、pH
７．５の水性緩衝液へブタノール相を加える事によっ
て、そしてそれから、ＩＬ−２を沈殿させる為に、pHを
約５．５〜７．０、好ましくは６．０〜６．２へ下げる
事によって行われる。
することができる。温度は普通、２０℃〜１００℃の範
囲内でありまたpHは普通、約４〜９、好ましくは約５〜
６であるだろう。溶液とブタノールとの接触時間は臨界
的ではなく、そして数分といった程度の比較的短時間が
使用される。抽出が完了した後、水性相及びブタノール
相を分離しそしてＩＬ−２をブタノール相から分離す
る。ブタノール相からＩＬ−２を分離する為の好ましい
方法は酸沈殿法である。これは、有機相が溶解されるま
で（有機相の体積に対して約２〜３緩衝液体積）、pH
７．５の水性緩衝液へブタノール相を加える事によっ
て、そしてそれから、ＩＬ−２を沈殿させる為に、pHを
約５．５〜７．０、好ましくは６．０〜６．２へ下げる
事によって行われる。
【００２６】工程の次の段階は、ＩＬ−２、及び抽出の
後に残留する、すべてのＥ．コライ汚染物を分離し、そ
して場合によっては可溶化剤から分離する事であるゲル
濾過クロマトグラフィ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、又はゲル濾過
クロマトグラフィとＲＰ−ＨＰＬＣとの組合せが使用さ
れる。ゲル濾過クロマトグラフィは好ましくは、発熱性
成分及び、ＩＬ−２（ＩＬ−２は約１５．５kdの分子量
を持つ）よりも高分子量もしくは低分子量のタンパク質
汚染物を取り除く２つの段階において実施される。
後に残留する、すべてのＥ．コライ汚染物を分離し、そ
して場合によっては可溶化剤から分離する事であるゲル
濾過クロマトグラフィ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、又はゲル濾過
クロマトグラフィとＲＰ−ＨＰＬＣとの組合せが使用さ
れる。ゲル濾過クロマトグラフィは好ましくは、発熱性
成分及び、ＩＬ−２（ＩＬ−２は約１５．５kdの分子量
を持つ）よりも高分子量もしくは低分子量のタンパク質
汚染物を取り除く２つの段階において実施される。
【００２７】これらの汚染物からのＩＬ−２の分離を可
能にする為に溶液を画分する事ができるゲルは商業的に
入手できる。セファクリルＳ−２００は高分子成分を取
り除く為には好ましいゲルでありそしてセファデックス
Ｇ−２５，Ｇ−７５又はＧ−１００ゲルは低分子量汚染
物を取り除く為に好ましい。ゲル濾過は典型的には、可
溶化剤約０．１％〜１．０％及び還元剤約１〜１０mMを
含む緩衝溶液（pH５．５〜７．０）の中で行なわれるだ
ろう。カラムは、目的成分の適切な分離を許容する大き
さであるだろう。
能にする為に溶液を画分する事ができるゲルは商業的に
入手できる。セファクリルＳ−２００は高分子成分を取
り除く為には好ましいゲルでありそしてセファデックス
Ｇ−２５，Ｇ−７５又はＧ−１００ゲルは低分子量汚染
物を取り除く為に好ましい。ゲル濾過は典型的には、可
溶化剤約０．１％〜１．０％及び還元剤約１〜１０mMを
含む緩衝溶液（pH５．５〜７．０）の中で行なわれるだ
ろう。カラムは、目的成分の適切な分離を許容する大き
さであるだろう。
【００２８】ＲＰ−ＨＰＬＣはゲル濾過に代わるもので
ある。またＲＰ−ＨＰＬＣは、分子量がＩＬ−２に近
く、それゆえにゲル濾過によって完全に取り除く事がで
きないような分子を溶液から取り除く事ができる。さら
に、細菌性エンドトキシンのような汚染物もまたＲＰ−
ＨＰＬＣによって有効に取り除かれる。従って、ＲＰ−
ＨＰＬＣは、また、ゲル濾過の後最終精製方法としても
用いられる。タンパク質の望ましい分離を与える支持体
（固定相）がＲＰ−ＨＰＬＣにおいて使用される。３０
０オングストロームのポアーサイズの支持体であるＣ−
４，Ｃ−８、もしくはＣ−１８が好まれる支持体の例で
ある。
ある。またＲＰ−ＨＰＬＣは、分子量がＩＬ−２に近
く、それゆえにゲル濾過によって完全に取り除く事がで
きないような分子を溶液から取り除く事ができる。さら
に、細菌性エンドトキシンのような汚染物もまたＲＰ−
ＨＰＬＣによって有効に取り除かれる。従って、ＲＰ−
ＨＰＬＣは、また、ゲル濾過の後最終精製方法としても
用いられる。タンパク質の望ましい分離を与える支持体
（固定相）がＲＰ−ＨＰＬＣにおいて使用される。３０
０オングストロームのポアーサイズの支持体であるＣ−
４，Ｃ−８、もしくはＣ−１８が好まれる支持体の例で
ある。
【００２９】分離は、ＩＬ−２を溶液状態に保持する為
に約２．３以下、普通２．１〜２．３の酸性pHで行なわ
れる。これに関して、可溶化（ゲル濾過）からの溶液の
pHをこの範囲に調整するのが好ましいだろう。溶液はＲ
Ｐ−ＨＰＬＣカラムの中へ負荷されそして固定相の上に
吸収される。酢酸又はトリフルオロ酢酸のような有機酸
及びプロパノール又はアセトニトリルのような有機溶媒
を含むグラジエント溶媒系がカラムからＩＬ−２を溶出
するのに使用される。酢酸−プロパノール、トリフルオ
ロ酢酸−プロパノール、及びトリフルオロアセテック酸
−アセトナイトレイトが好ましい溶媒系である。ＩＬ−
２は酢酸−プロパノール系での約４０％プロパノールに
おいて、トリフルオロ酢酸−プロパノール系での約５０
％プロパノールにおいて、そしてトリフルオロ酢酸−ア
セトナイトリル系での約６２％アセトナイトリルにおい
て溶出する。
に約２．３以下、普通２．１〜２．３の酸性pHで行なわ
れる。これに関して、可溶化（ゲル濾過）からの溶液の
pHをこの範囲に調整するのが好ましいだろう。溶液はＲ
Ｐ−ＨＰＬＣカラムの中へ負荷されそして固定相の上に
吸収される。酢酸又はトリフルオロ酢酸のような有機酸
及びプロパノール又はアセトニトリルのような有機溶媒
を含むグラジエント溶媒系がカラムからＩＬ−２を溶出
するのに使用される。酢酸−プロパノール、トリフルオ
ロ酢酸−プロパノール、及びトリフルオロアセテック酸
−アセトナイトレイトが好ましい溶媒系である。ＩＬ−
２は酢酸−プロパノール系での約４０％プロパノールに
おいて、トリフルオロ酢酸−プロパノール系での約５０
％プロパノールにおいて、そしてトリフルオロ酢酸−ア
セトナイトリル系での約６２％アセトナイトリルにおい
て溶出する。
【００３０】便宜上通常は、溶出液中の有機溶媒含有量
をＩＬ−２が溶出する溶剤濃度より幾分低いレベルまで
急速に上昇せしめ、そして次に約０．１〜１．０％／分
の範囲でゆるやかなグラジエント変化を行なう。ＩＬ−
２がクロマトグラフィ処理から回収されるやいなや、そ
れは凍結乾燥され、そして還元剤（ＩＬ−２を還元状態
に保持する為）及び可溶化剤（それを溶液状態に保持す
る為）を含む中性の水性緩衝液の中へ再懸濁される。Ｉ
Ｌ−２はこの形においては安定しており、そしてさらに
それ以上の処理を行うため、及び利用される前に製剤化
する為に保存される。
をＩＬ−２が溶出する溶剤濃度より幾分低いレベルまで
急速に上昇せしめ、そして次に約０．１〜１．０％／分
の範囲でゆるやかなグラジエント変化を行なう。ＩＬ−
２がクロマトグラフィ処理から回収されるやいなや、そ
れは凍結乾燥され、そして還元剤（ＩＬ−２を還元状態
に保持する為）及び可溶化剤（それを溶液状態に保持す
る為）を含む中性の水性緩衝液の中へ再懸濁される。Ｉ
Ｌ−２はこの形においては安定しており、そしてさらに
それ以上の処理を行うため、及び利用される前に製剤化
する為に保存される。
【００３１】上記以外の好まれる方法は、ゲル濾過によ
って分離した後ＩＬ−２を酸化しそしてその酸化された
生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって、又はゲル濾過とそれ
に続くＲＰ−ＨＰＬＣとによって精製する方法である。
この方法は、ゲル濾過において残存している汚染物及び
不所望の酸化生成物の効果的な除去をもたらす。好まし
い酸化方法は、十分に還元された微生物的に産生された
合成タンパク質（このタンパク質は有用タンパク質と実
質的に同一のアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列は
複数のシステインを含有し、このシステインは該有用な
タンパク質中では分子内結合してシスチンを形成してい
る）を制御された態様で酸化し、こうしてシステインを
酸化して選択的にシスチンを形成する方法である。
って分離した後ＩＬ−２を酸化しそしてその酸化された
生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって、又はゲル濾過とそれ
に続くＲＰ−ＨＰＬＣとによって精製する方法である。
この方法は、ゲル濾過において残存している汚染物及び
不所望の酸化生成物の効果的な除去をもたらす。好まし
い酸化方法は、十分に還元された微生物的に産生された
合成タンパク質（このタンパク質は有用タンパク質と実
質的に同一のアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列は
複数のシステインを含有し、このシステインは該有用な
タンパク質中では分子内結合してシスチンを形成してい
る）を制御された態様で酸化し、こうしてシステインを
酸化して選択的にシスチンを形成する方法である。
【００３２】この方法においては、十分に還元された、
微生物的に産生された合成タンパク質をｏ−ヨードソベ
ンゾエイトと反応せしめ、このｏ−ヨードソベンゾエイ
トは、前記のシステインのｐＫａよりも少なくとも約１
／２pHユニット低いpHにおいて水性媒体中で選択的にシ
ステインを酸化する。この場合、反応混合物中の合成タ
ンパク質の濃度は約５mg／mlよりも低くし、そしてタン
パク質に対するｏ−ヨードソベンゾエイトのモル比は、
反応の終期においてｏ−ヨードソベンゾエイトが過剰に
存在するという条件でもって、少なくとも化学量論的に
する。酸化された生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ精製は、還元
剤の非存在下及び上に記載したゲル濾過で用いたのと等
しいか又はそれより低い濃度での浄剤の存在下で、上に
記載した条件のもとで実施される。
微生物的に産生された合成タンパク質をｏ−ヨードソベ
ンゾエイトと反応せしめ、このｏ−ヨードソベンゾエイ
トは、前記のシステインのｐＫａよりも少なくとも約１
／２pHユニット低いpHにおいて水性媒体中で選択的にシ
ステインを酸化する。この場合、反応混合物中の合成タ
ンパク質の濃度は約５mg／mlよりも低くし、そしてタン
パク質に対するｏ−ヨードソベンゾエイトのモル比は、
反応の終期においてｏ−ヨードソベンゾエイトが過剰に
存在するという条件でもって、少なくとも化学量論的に
する。酸化された生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ精製は、還元
剤の非存在下及び上に記載したゲル濾過で用いたのと等
しいか又はそれより低い濃度での浄剤の存在下で、上に
記載した条件のもとで実施される。
【００３３】クロマトグラフィ処理の後、ＩＬ−２の純
度は少なくとも約９５％でありそして普通は少なくとも
約９８％である。このひじょうに純粋な物質は、１０
０，０００ユニットＩＬ−２活性につき約５ngよりも少
ないエンドトキシンを、普通約０．０１ngよりも少ない
エンドトキシンを含む。
度は少なくとも約９５％でありそして普通は少なくとも
約９８％である。このひじょうに純粋な物質は、１０
０，０００ユニットＩＬ−２活性につき約５ngよりも少
ないエンドトキシンを、普通約０．０１ngよりも少ない
エンドトキシンを含む。
【００３４】
【実施例】この発明方法はさらに次の例によって詳述す
る。これらの例はこの発明を限定することをなんら意図
するものではない。例１． ＩＬ−２は、プラスミドｐＬＷ１により形質転換
されたＥ．コライＫ−１２種ＭＭ２９４（１９８３年８
月４日に受託番号３９，４０５としてアメリカン タイ
プ カルチャー コレクション（American Type Cultur
e Collection）に寄託されている）から次のように回収
した。
る。これらの例はこの発明を限定することをなんら意図
するものではない。例１． ＩＬ−２は、プラスミドｐＬＷ１により形質転換
されたＥ．コライＫ−１２種ＭＭ２９４（１９８３年８
月４日に受託番号３９，４０５としてアメリカン タイ
プ カルチャー コレクション（American Type Cultur
e Collection）に寄託されている）から次のように回収
した。
【００３５】Ｅ．コライを次のような増殖培地を用いて
発酵器の中で増殖せしめた。 （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １５０mM ＫＨ2 ＰＯ4 ２１．６mM Ｃａ3 サイトレート １．５mM ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３０mM ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ３０mM ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ １mM pHはオートクレーブ殺菌した２．５Ｎの水酸化ナトリウ
ムにより６．５に調整した。
発酵器の中で増殖せしめた。 （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １５０mM ＫＨ2 ＰＯ4 ２１．６mM Ｃａ3 サイトレート １．５mM ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３０mM ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ３０mM ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ １mM pHはオートクレーブ殺菌した２．５Ｎの水酸化ナトリウ
ムにより６．５に調整した。
【００３６】無菌の付加物（オートクレーブの後） ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３mM ＦｅＳＯ4 １００μＭ Ｌ−トリプトファン １４mg／ｌ サイアミン−ＨＣｌ ２０mg／ｌ グルコース ５ｇ／ｌ テトラサイクリン ５mg／ｌ エタノール（任意に） ２％ カガミノ酸 ２％ ダウ コーンニング アンティフォーム Ｂ（Dow Corn
ing Antifoam B）の２０％溶液、グルコースの５０％溶
液及び５Ｎの水酸化カリウムを必要に応じ添加した。
ing Antifoam B）の２０％溶液、グルコースの５０％溶
液及び５Ｎの水酸化カリウムを必要に応じ添加した。
【００３７】発酵槽のpHを５Ｎの水酸化カリウムで６．
８に維持した。残留グルコースは５〜１０ｇ／ｌの間
に、溶存酸素は４０％に、そして温度は３７±１℃に維
持した。カガミノ酸（２０％貯蔵溶液）をＯＤ680 が約
１０である時添加した。ＯＤ680 が約２０に達した後３
時間で収得を行なった。収得された材料を中空繊維（Ho
llowfiber ）濾過及び／又は遠心分離によって濃縮し
た。２０〜４０ｇ（温重量）の濃縮物を、２０mMのＴｒ
ｉｓ及び１mMのエチレンデアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
（８．１〜８．５のpH）の溶液（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩
衝液）２００ml中に再懸濁した。
８に維持した。残留グルコースは５〜１０ｇ／ｌの間
に、溶存酸素は４０％に、そして温度は３７±１℃に維
持した。カガミノ酸（２０％貯蔵溶液）をＯＤ680 が約
１０である時添加した。ＯＤ680 が約２０に達した後３
時間で収得を行なった。収得された材料を中空繊維（Ho
llowfiber ）濾過及び／又は遠心分離によって濃縮し
た。２０〜４０ｇ（温重量）の濃縮物を、２０mMのＴｒ
ｉｓ及び１mMのエチレンデアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
（８．１〜８．５のpH）の溶液（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩
衝液）２００ml中に再懸濁した。
【００３８】この懸濁液を１０分間３，０００〜４，０
００×ｇで遠心分離し、上清液を除去し、そして固形物
は、４℃の２００mlＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中へ再懸
濁した。この懸濁液を、音波処理機（ヒートシステム又
は、モデルＷ−３７５）の中へ入れ、そして出力設定
“９”、５０％負荷でもってパルスしながら、大探針を
用いて４℃で４５分間（終点＝約８５％のＯＤ680 の低
下）音波処理した。これに代る破壊技法は、Ｍ−１に設
定してマントン−ガウリン（Manton-Gaulin ）乳化機の
中に懸濁液を３回通すことである。細胞残骸物は、１０
分間４，５００×ｇで遠心分離する事によって破壊物か
ら分離した。
００×ｇで遠心分離し、上清液を除去し、そして固形物
は、４℃の２００mlＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中へ再懸
濁した。この懸濁液を、音波処理機（ヒートシステム又
は、モデルＷ−３７５）の中へ入れ、そして出力設定
“９”、５０％負荷でもってパルスしながら、大探針を
用いて４℃で４５分間（終点＝約８５％のＯＤ680 の低
下）音波処理した。これに代る破壊技法は、Ｍ−１に設
定してマントン−ガウリン（Manton-Gaulin ）乳化機の
中に懸濁液を３回通すことである。細胞残骸物は、１０
分間４，５００×ｇで遠心分離する事によって破壊物か
ら分離した。
【００３９】細胞残骸物を室温で６０mlのＴｒｉｓ／Ｅ
ＤＴＡ緩衝液中に再懸濁しそしてＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩
衝液中８Ｍの尿素（スクワーズ／マン（Schwarz ／Man
n）超純粋な）の同体積を５分以上の急速な攪拌でもっ
てこの懸濁液へ加えた（最終尿素濃度は４Ｍ）。１５〜
３０分間連続した低速攪拌の後、抽出された細胞残骸物
を回収する為に懸濁液を１２，０００×ｇで１５分間遠
心分離した。もし固相が生じないなら、上清液を取り出
しそして同体積のＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液を加えそれ
から混合物を再遠心分離する。
ＤＴＡ緩衝液中に再懸濁しそしてＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩
衝液中８Ｍの尿素（スクワーズ／マン（Schwarz ／Man
n）超純粋な）の同体積を５分以上の急速な攪拌でもっ
てこの懸濁液へ加えた（最終尿素濃度は４Ｍ）。１５〜
３０分間連続した低速攪拌の後、抽出された細胞残骸物
を回収する為に懸濁液を１２，０００×ｇで１５分間遠
心分離した。もし固相が生じないなら、上清液を取り出
しそして同体積のＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液を加えそれ
から混合物を再遠心分離する。
【００４０】次に抽出された細胞残骸物を５０mMのリン
酸ナトリウム（pH６．８）、１mMのＥＤＴＡ及び１０mM
のＤＴＴの溶液９ml中に２０℃で再懸濁する。２０％の
ＳＤＳ１mlをその懸濁液へ加え、そして懸濁液を５分間
激しく攪拌する。室温で１０分間１２，０００×ｇのも
とで遠心分離する事により懸濁液から液相を回収する。
それから溶液中のＩＬ−２が十分に還元されるのを確実
にする為に液相を１５分間４０℃に熱した。粗抽出物の
サンプルを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し
た。図１は、その分析（方法１Ａの生成物）の濃度記録
計走査が示される。これにより抽出物が約３７％のＩＬ
−２を含有することが示される。
酸ナトリウム（pH６．８）、１mMのＥＤＴＡ及び１０mM
のＤＴＴの溶液９ml中に２０℃で再懸濁する。２０％の
ＳＤＳ１mlをその懸濁液へ加え、そして懸濁液を５分間
激しく攪拌する。室温で１０分間１２，０００×ｇのも
とで遠心分離する事により懸濁液から液相を回収する。
それから溶液中のＩＬ−２が十分に還元されるのを確実
にする為に液相を１５分間４０℃に熱した。粗抽出物の
サンプルを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し
た。図１は、その分析（方法１Ａの生成物）の濃度記録
計走査が示される。これにより抽出物が約３７％のＩＬ
−２を含有することが示される。
【００４１】ＩＬ−２をゲル濾過クロマトグラフィによ
って溶液から次のようにして分離した。溶液を５０mMの
リン酸ナトリウム（pH６．８）、１mMのＥＤＴＡ、１mM
のＤＴＴ、及び１％ＳＤＳ中で使用される２．６×１０
０cmＳ−２００カラム上へ負荷した。カラム溶出液を４
mlずつの画分に集め、そしてこの画分のサンプルを１５
％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル中でコマアスイ ブルー
（Coomassie blue）することにより分析した。最も少な
い汚染物（約３５kd、１６〜１８kd、及び１２kdの汚染
物を最小限にしながら）を含んでいる画分をプールし、
そして限外濾過（Amlcon YM 5 限外濾紙）によって５〜
１０mlに濃縮した。
って溶液から次のようにして分離した。溶液を５０mMの
リン酸ナトリウム（pH６．８）、１mMのＥＤＴＡ、１mM
のＤＴＴ、及び１％ＳＤＳ中で使用される２．６×１０
０cmＳ−２００カラム上へ負荷した。カラム溶出液を４
mlずつの画分に集め、そしてこの画分のサンプルを１５
％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル中でコマアスイ ブルー
（Coomassie blue）することにより分析した。最も少な
い汚染物（約３５kd、１６〜１８kd、及び１２kdの汚染
物を最小限にしながら）を含んでいる画分をプールし、
そして限外濾過（Amlcon YM 5 限外濾紙）によって５〜
１０mlに濃縮した。
【００４２】この濃縮物をＳＤＳ濃度が１％ではなくむ
しろ０．１％である事を除いて上のように行なわれる
２．６×１００cmＧ−１００カラム上に負荷した。画分
をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析しそして最も純粋な画
分をプールした。図はクロマトグラフィにかけられた成
生物の濃度記録計走査を表わしている。生成物は９８％
の純度であり、そしてリーミュラス アメボサイト ラ
イセート（limulus amebocyte lysate）分析〔アソシエ
イト オブ ケープ コッド，カンパニー．，ウッドホ
ール，マサチュウセッツ（Associates of Cape Cod, In
c., Woods Hole,MA）〕によって測定した場合、０．５n
gのエンドトキシン／１００，０００ユニットのＩＬ−
２活性を含んでいるという事を分析は示した。このＩＬ
−２のＮ−端アミノ酸配列は、最初のＮ−端アラニンが
足りないのを除いて生来の人間の分子と同じである。
しろ０．１％である事を除いて上のように行なわれる
２．６×１００cmＧ−１００カラム上に負荷した。画分
をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析しそして最も純粋な画
分をプールした。図はクロマトグラフィにかけられた成
生物の濃度記録計走査を表わしている。生成物は９８％
の純度であり、そしてリーミュラス アメボサイト ラ
イセート（limulus amebocyte lysate）分析〔アソシエ
イト オブ ケープ コッド，カンパニー．，ウッドホ
ール，マサチュウセッツ（Associates of Cape Cod, In
c., Woods Hole,MA）〕によって測定した場合、０．５n
gのエンドトキシン／１００，０００ユニットのＩＬ−
２活性を含んでいるという事を分析は示した。このＩＬ
−２のＮ−端アミノ酸配列は、最初のＮ−端アラニンが
足りないのを除いて生来の人間の分子と同じである。
【００４３】例２．可溶化剤として２％のＳＤＳの代わ
りに２％のサーコシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ）を用い、そ
してクロマトグラフィのカラム中にＳＤＳの代わりにサ
ーコシルを用いて例１の方法をくり返した。図１は、可
溶化剤としてサーコシルを使用するこの粗抽出物（方法
１Ｂの粗抽出物）についての濃度記録計走査を表わして
いる。示されるように、ＳＤＳの代わりにサーコシルの
使用は、類似のＩＬ−２収量（５０％対６０％）におい
て改示された純度（５８％対３７％）を生ぜしめた。
りに２％のサーコシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ）を用い、そ
してクロマトグラフィのカラム中にＳＤＳの代わりにサ
ーコシルを用いて例１の方法をくり返した。図１は、可
溶化剤としてサーコシルを使用するこの粗抽出物（方法
１Ｂの粗抽出物）についての濃度記録計走査を表わして
いる。示されるように、ＳＤＳの代わりにサーコシルの
使用は、類似のＩＬ−２収量（５０％対６０％）におい
て改示された純度（５８％対３７％）を生ぜしめた。
【００４４】例３．尿素抽出の前の段階まで例１の方法
を繰り返し、そして次に記載されているようにして、可
溶化し、そして浄化した。ＩＬ−２をＲＰ−ＨＰＬＣに
よって次のように溶液から分離した。溶液を０．１％の
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に１０倍に希釈しそして
０．１％のＴＦＡで平衡化された内部直径４．６mmで長
さが５cmのブロウニリー アクゥアポート（Brownlee A
quaport ）ＲＰ−３００カラムへ負荷した。ＩＬ−２を
０．１％のＴＦＡを含む３０％〜６０％のアセトニトリ
ルのグラジエントにより４５分にわたって溶出した。Ｈ
ＰＬＣ後のＩＬ−２活性の収率は８０〜１００％であっ
た。図２は、この生成物の銀色に着色されたＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析を表わしている。
を繰り返し、そして次に記載されているようにして、可
溶化し、そして浄化した。ＩＬ−２をＲＰ−ＨＰＬＣに
よって次のように溶液から分離した。溶液を０．１％の
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に１０倍に希釈しそして
０．１％のＴＦＡで平衡化された内部直径４．６mmで長
さが５cmのブロウニリー アクゥアポート（Brownlee A
quaport ）ＲＰ−３００カラムへ負荷した。ＩＬ−２を
０．１％のＴＦＡを含む３０％〜６０％のアセトニトリ
ルのグラジエントにより４５分にわたって溶出した。Ｈ
ＰＬＣ後のＩＬ−２活性の収率は８０〜１００％であっ
た。図２は、この生成物の銀色に着色されたＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析を表わしている。
【００４５】例４．ゲル濾過のクロマトグラフィの前の
段階まで例１の方法をくり返した。可溶性の、浄化さ
れ、そして還元された物質を例１に記載されたように
０．１％のＳＤＳ中でのＧ−１００クロマトグラフィに
かけた。ＩＬ−２のプールされたピーク画分を、例３で
記載されたようにＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製し
た。得られた精製され、還元されたＩＬ−２を酸化しそ
して例３で記載されたようにして、ＲＰ−ＨＰＬＣにか
けた。
段階まで例１の方法をくり返した。可溶性の、浄化さ
れ、そして還元された物質を例１に記載されたように
０．１％のＳＤＳ中でのＧ−１００クロマトグラフィに
かけた。ＩＬ−２のプールされたピーク画分を、例３で
記載されたようにＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製し
た。得られた精製され、還元されたＩＬ−２を酸化しそ
して例３で記載されたようにして、ＲＰ−ＨＰＬＣにか
けた。
【００４６】例５．Ｇ−１００カラムの前の段階まで例
１の方法をくり返した。１Ｍの酢酸中プロパノールの溶
媒系を使用して例３の為の方法をくり返した。３５％〜
６０％プロパノールのグラディエントにより２００分に
わたってＩＬ−２を溶出した。カラムの寸法は内部直径
１０mm×長さ３０cmか内部直径４８mm×長さ５０cmのど
ちらかでありそしてこのカラムに固定相広孔シリカゲル
を充填した。使用された固定相広孔シリカゲルはＶｙｄ
ａｃ ＴＰ２１４であった。生成物の純度及び収量は例
３のそれに匹敵した。
１の方法をくり返した。１Ｍの酢酸中プロパノールの溶
媒系を使用して例３の為の方法をくり返した。３５％〜
６０％プロパノールのグラディエントにより２００分に
わたってＩＬ−２を溶出した。カラムの寸法は内部直径
１０mm×長さ３０cmか内部直径４８mm×長さ５０cmのど
ちらかでありそしてこのカラムに固定相広孔シリカゲル
を充填した。使用された固定相広孔シリカゲルはＶｙｄ
ａｃ ＴＰ２１４であった。生成物の純度及び収量は例
３のそれに匹敵した。
【００４７】例６．０．１％のＴＦＡ中プロパノールの
溶媒系を使用して例３の方法をくり返した。ＩＬ−２
は、３５％〜６０％プロパノールのグラディエントによ
り１２０分にわたって溶出した。カラム及び支持体物質
は例５でのと同じであった。生成物の純度及び収量は例
３のそれに匹敵した。
溶媒系を使用して例３の方法をくり返した。ＩＬ−２
は、３５％〜６０％プロパノールのグラディエントによ
り１２０分にわたって溶出した。カラム及び支持体物質
は例５でのと同じであった。生成物の純度及び収量は例
３のそれに匹敵した。
【００４８】例７．例１の方法は、Ｅ．コライ−生産性
ＩＬ−２がひとつの命名されたｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ
125 ＩＬ−２である事を除いて、くり返された。このＩ
Ｌ−２のアミノ酸配列は、１２５位でのシステインがセ
リンと交換されさらに最初のＮ−端アラニン残基が足り
ないという事において、天然の分子のアミノ酸配列と異
なる。このＩＬ−２を産生するｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ
125 ＩＬ−２生産性Ｅ．コライの菌株は１９８４年の３
月６日に受託番号３９，６２６号としてアメリキャンタ
イプ カルチャー コレクション（American Type Cult
ure Collection）に寄託された。
ＩＬ−２がひとつの命名されたｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ
125 ＩＬ−２である事を除いて、くり返された。このＩ
Ｌ−２のアミノ酸配列は、１２５位でのシステインがセ
リンと交換されさらに最初のＮ−端アラニン残基が足り
ないという事において、天然の分子のアミノ酸配列と異
なる。このＩＬ−２を産生するｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ
125 ＩＬ−２生産性Ｅ．コライの菌株は１９８４年の３
月６日に受託番号３９，６２６号としてアメリキャンタ
イプ カルチャー コレクション（American Type Cult
ure Collection）に寄託された。
【００４９】例８．例１の方法をくり返した。但しプラ
スミドｐＬＷ５５により形質転換されたＥ．コライＫ−
１２株〔１９８３年の１１月１８日受託番号３９，５１
６としてアメリキャン タイプ カルチャー コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）に寄託され
た〕からＩＬ−２を回収した。この分子のアミノ酸配列
は、Ｎ−端メサイオニンを持ちさらに１２５位のシステ
インがセリンに取り換えられているという点において天
然の分子配列と異なっている。
スミドｐＬＷ５５により形質転換されたＥ．コライＫ−
１２株〔１９８３年の１１月１８日受託番号３９，５１
６としてアメリキャン タイプ カルチャー コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）に寄託され
た〕からＩＬ−２を回収した。この分子のアミノ酸配列
は、Ｎ−端メサイオニンを持ちさらに１２５位のシステ
インがセリンに取り換えられているという点において天
然の分子配列と異なっている。
【００５０】例９．例１の一般的方法を使用しながらｄ
ｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ125 ＩＬ−２生産性Ｅ．コライを
増殖せしめ細胞を破壊し、そして細胞残骸を破壊物から
回収した。細胞残骸を、５０mMのＴｒｉｓと１mMのＥＤ
ＴＡのpH８．５の緩衝液中に約１：４．５（ｗ／ｖ）の
割合で懸濁した。最終濃度が２５mMになるようにＤＴＴ
を添加した。同じ緩衝液へ８Ｍの尿素を最終濃度が４Ｍ
になるようにかきまぜながらゆっくりと添加し、そして
次に室温で混合しながら３０分間そのままに放置した。
３０分後、不溶性残留物を遠心分離した。生じたペース
トを５０mMのリン酸ナトリウム緩衝液（１mMＥＤＴＡを
含有、pH７．６）中に再懸濁した。最終濃度が５％（ｗ
／ｖ）になるように固形ＳＤＳを添加することによりこ
の懸濁液を可溶化した。
ｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ125 ＩＬ−２生産性Ｅ．コライを
増殖せしめ細胞を破壊し、そして細胞残骸を破壊物から
回収した。細胞残骸を、５０mMのＴｒｉｓと１mMのＥＤ
ＴＡのpH８．５の緩衝液中に約１：４．５（ｗ／ｖ）の
割合で懸濁した。最終濃度が２５mMになるようにＤＴＴ
を添加した。同じ緩衝液へ８Ｍの尿素を最終濃度が４Ｍ
になるようにかきまぜながらゆっくりと添加し、そして
次に室温で混合しながら３０分間そのままに放置した。
３０分後、不溶性残留物を遠心分離した。生じたペース
トを５０mMのリン酸ナトリウム緩衝液（１mMＥＤＴＡを
含有、pH７．６）中に再懸濁した。最終濃度が５％（ｗ
／ｖ）になるように固形ＳＤＳを添加することによりこ
の懸濁液を可溶化した。
【００５１】５％のＳＤＳ溶液を０．１Ｍのリン酸ナト
リウムにより２％のＳＤＳになるよう薄めた。タンパク
質濃度を決定し、pHを８．５に調整し、そして５０mMに
なるようＤＴＴ及び２mMになるようＥＤＴＡを添加し
た。この混合物をＮ2 の存在下で４０℃に加熱すること
によりＩＬ−２を還元した。この次に混合物を冷却しそ
してpHを５．０に調整した。
リウムにより２％のＳＤＳになるよう薄めた。タンパク
質濃度を決定し、pHを８．５に調整し、そして５０mMに
なるようＤＴＴ及び２mMになるようＥＤＴＡを添加し
た。この混合物をＮ2 の存在下で４０℃に加熱すること
によりＩＬ−２を還元した。この次に混合物を冷却しそ
してpHを５．０に調整した。
【００５２】次にその溶液を１mMのＤＴＴを含む２−ブ
タノールにより１：１の割合（ｖ／ｖ）において室温で
抽出した。滞留時間は２〜２５分であった。抽出は、２
００ml／分の流速のもとに液−液相分離機で実施した。
有機抽出液を分離しそしてそのpHを水酸化ナトリウムに
より８．０に調整した。次に抽出液を、１０mMのリン酸
ナトリウム、２mMのＤＴＴ、pH６中０．１％ＳＤＳにゆ
っくりと加えそして１５〜２０分間攪拌した。生じた沈
殿物を分離しそして生じたペーストをＰＢＳ中５％のＳ
ＤＳに再懸濁した。その溶液を遠心分離によって透明に
しそして上のようにして還元した。還元の後、溶液を酢
酸によりpH５．５に調整した。
タノールにより１：１の割合（ｖ／ｖ）において室温で
抽出した。滞留時間は２〜２５分であった。抽出は、２
００ml／分の流速のもとに液−液相分離機で実施した。
有機抽出液を分離しそしてそのpHを水酸化ナトリウムに
より８．０に調整した。次に抽出液を、１０mMのリン酸
ナトリウム、２mMのＤＴＴ、pH６中０．１％ＳＤＳにゆ
っくりと加えそして１５〜２０分間攪拌した。生じた沈
殿物を分離しそして生じたペーストをＰＢＳ中５％のＳ
ＤＳに再懸濁した。その溶液を遠心分離によって透明に
しそして上のようにして還元した。還元の後、溶液を酢
酸によりpH５．５に調整した。
【００５３】この溶液を、Ｓ−２００カラム及びＧ−２
５カラムを使用してゲル濾過によって精製した。これに
より得られた精製され、還元されたＩＬ−２を酸化し、
そして酸化生成物を例３のようにしてＧ−２５のクロマ
トグラフィ及びこれに続くＲＰ−ＨＰＬＣによって精製
した。こうして得られた精製された組換体ＩＬ−２生成
物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって定量した場合
約９５％よりもより多くのＩＬ−２を含有し、約０．１
ng／mgのＩＬ−２よりも少ないエンドトキシンを含有し
そして３．３×１０5 ｕ／kgの投与量でのＵ．Ｓ．Ｐウ
サギの発熱物質試験によって定量した場合実質的に発熱
物質を含んでいない。
５カラムを使用してゲル濾過によって精製した。これに
より得られた精製され、還元されたＩＬ−２を酸化し、
そして酸化生成物を例３のようにしてＧ−２５のクロマ
トグラフィ及びこれに続くＲＰ−ＨＰＬＣによって精製
した。こうして得られた精製された組換体ＩＬ−２生成
物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって定量した場合
約９５％よりもより多くのＩＬ−２を含有し、約０．１
ng／mgのＩＬ−２よりも少ないエンドトキシンを含有し
そして３．３×１０5 ｕ／kgの投与量でのＵ．Ｓ．Ｐウ
サギの発熱物質試験によって定量した場合実質的に発熱
物質を含んでいない。
【００５４】前に示された様に、エンドトキシン含有量
は、１００，０００ユニットのＩＬ−２活性に対して約
５ngよりも少なくそして好ましくは０．０１ngよりも少
ない。典型的には、この発明の方法によって精製された
組換体ＩＬ−２生成物は上に示した様にエンドトキシン
及び発熱物質が実質的に無いという事に加えて、図３に
表わされているように、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＲＰ
−ＨＰＬＣによって決定した場合９８％よりも多くのＩ
Ｌ−２含有量を有した。
は、１００，０００ユニットのＩＬ−２活性に対して約
５ngよりも少なくそして好ましくは０．０１ngよりも少
ない。典型的には、この発明の方法によって精製された
組換体ＩＬ−２生成物は上に示した様にエンドトキシン
及び発熱物質が実質的に無いという事に加えて、図３に
表わされているように、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＲＰ
−ＨＰＬＣによって決定した場合９８％よりも多くのＩ
Ｌ−２含有量を有した。
【００５５】例９に記載した方法の変法、例えば大規模
にＩＬ−２を製造するために使用されるような変法が図
４に表示されている。図４に示された方法は、例９に記
載した方法と次のような点、すなわち（１）緩衝におけ
る小変化（２）ＲＰ−ＨＰＬＣにおける酢酸−プロパノ
ール（例５）溶媒系の使用、並びに（３）後酸化稀釈／
透析濾過、Ｓ−２００ゲル濾過、及び限外濾過方法など
の使用において異なる。図４に示されるような方法は、
いろいろな工夫によって修正される。たとえば２度目の
１％のＳＤＳ中でのＳ−２００カラム通過に続いて、Ｉ
Ｌ−２溶液を１：１０の割合で薄めて０．１％のＳＤＳ
濃度とし、そして次にpH７．５及び５ppm のＳＤＳを含
む１０mMのリン酸緩衝液に対して透析濾過する。そして
この溶液を適切な使用分量のために必要であれば濃縮す
る。
にＩＬ−２を製造するために使用されるような変法が図
４に表示されている。図４に示された方法は、例９に記
載した方法と次のような点、すなわち（１）緩衝におけ
る小変化（２）ＲＰ−ＨＰＬＣにおける酢酸−プロパノ
ール（例５）溶媒系の使用、並びに（３）後酸化稀釈／
透析濾過、Ｓ−２００ゲル濾過、及び限外濾過方法など
の使用において異なる。図４に示されるような方法は、
いろいろな工夫によって修正される。たとえば２度目の
１％のＳＤＳ中でのＳ−２００カラム通過に続いて、Ｉ
Ｌ−２溶液を１：１０の割合で薄めて０．１％のＳＤＳ
濃度とし、そして次にpH７．５及び５ppm のＳＤＳを含
む１０mMのリン酸緩衝液に対して透析濾過する。そして
この溶液を適切な使用分量のために必要であれば濃縮す
る。
【図１】図１は、ゲル濾過クロマトグラフィを最終精製
方法として使用するこの発明方法の２つの具体例の流れ
図を示している。方法１Ａと表示された具体例は可溶化
剤としてＳＤＳを使用し；方法１Ｂと表示された具体例
は可溶化剤としてサーコシルを使用する。この図は、こ
の方法におけるいろいろな段階での生成物のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分
析の濃度記録計走査を含んでいる。
方法として使用するこの発明方法の２つの具体例の流れ
図を示している。方法１Ａと表示された具体例は可溶化
剤としてＳＤＳを使用し；方法１Ｂと表示された具体例
は可溶化剤としてサーコシルを使用する。この図は、こ
の方法におけるいろいろな段階での生成物のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分
析の濃度記録計走査を含んでいる。
【図２】図２は例３の生成物のＨＰＬＣクロマトグラム
及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析であり、電気泳動の結果を示
す図面代用写真である。
及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析であり、電気泳動の結果を示
す図面代用写真である。
【図３】図３は例９の生成物のＨＰＬＣクロマトグラム
である。
である。
【図４】図４は微生物的に生成されるＩＬ−２を処理す
る為の好ましい方法の流れ図である。
る為の好ましい方法の流れ図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マイケル クニタニ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611，オークランド，ビュー ストリ ート 4314 (72)発明者 ケネス ウィルソン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94598，ウォルナット クリーク，ロモ ンド ランド 2249 (72)発明者 ウォルフガング ヘルムト ハニシュ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611，オークランド，バルサム ウェ イ 209，6808
Claims (3)
- 【請求項１】 還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定
された少なくとも約９５％のｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ
125 ＩＬ−２含有量、約０．１ng／mgのＩＬ−２よりも
少ないエンドトキシン含有量を有しそして３．３×１０
5 ｕ／kgの投与量でのＵ．Ｓ．Ｐ．ウサギ発熱原試験に
よって決定した場合発熱物質を実質的に含有しない精製
されたｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ125 ＩＬ−２組成物であ
って、抗腫瘍、免疫反応の増強、ヒト末梢血単核細胞の
増殖反応の増強又は連続的Ｔ−細胞系の増殖の支持のた
めの組成物。 - 【請求項２】 前記免疫反応の増強が、細菌感染に対す
る免疫反応の増強、寄生体感染に対する免疫反応の増
強、菌類感染に対する免疫反応の増強、原生動物感染に
対する免疫反応の増強又はビールス感染に対する免疫反
応の増強である、請求項１に記載の精製されたｄｅｓ−
Ａｌａ Ｓｅｒ 125 ＩＬ−２組成物。 - 【請求項３】 前記のｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ125 ＩＬ
−２含有量が還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した場
合約９８％よりも大であることを特徴とする請求項１又
は２に記載の精製された組換体ＩＬ−２組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US594223 | 1984-03-28 | ||
| US06/594,223 US4569790A (en) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60062195A Division JP2599903B2 (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-28 | Ｉｌ−２の回収及び精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08332089A JPH08332089A (ja) | 1996-12-17 |
| JP2648587B2 true JP2648587B2 (ja) | 1997-09-03 |
Family
ID=24378044
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60062195A Expired - Lifetime JP2599903B2 (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-28 | Ｉｌ−２の回収及び精製方法 |
| JP8143485A Expired - Lifetime JP2648587B2 (ja) | 1984-03-28 | 1996-05-15 | 精製された変異型インターロイキン−２組成物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60062195A Expired - Lifetime JP2599903B2 (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-28 | Ｉｌ−２の回収及び精製方法 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4569790A (ja) |
| EP (2) | EP0470586B1 (ja) |
| JP (2) | JP2599903B2 (ja) |
| KR (1) | KR850007083A (ja) |
| AT (1) | ATE81674T1 (ja) |
| AU (1) | AU592751B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341083C (ja) |
| DE (2) | DE3588189T2 (ja) |
| DK (1) | DK166324C (ja) |
| ES (1) | ES8609362A1 (ja) |
| FI (1) | FI94960C (ja) |
| GR (1) | GR850741B (ja) |
| HK (1) | HK1004474A1 (ja) |
| IE (1) | IE59100B1 (ja) |
| IL (1) | IL74733A (ja) |
| IN (1) | IN162903B (ja) |
| NO (1) | NO851235L (ja) |
| NZ (1) | NZ211569A (ja) |
| PH (1) | PH21012A (ja) |
| PT (1) | PT80172B (ja) |
| ZA (1) | ZA852347B (ja) |
Families Citing this family (89)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
| US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
| US4853332A (en) * | 1982-10-19 | 1989-08-01 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins |
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| CA1340853C (en) * | 1983-12-23 | 1999-12-21 | Hsiang-Fu Kung | Purification of recombinant interleukin-2 |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| US4656132A (en) * | 1984-03-28 | 1987-04-07 | Cetus Corporation | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| DE3583880D1 (de) * | 1984-04-09 | 1991-10-02 | Takeda Chemical Industries Ltd | Stabile interleukin-2-zusammensetzung. |
| US4908434A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Process for preparing purified interleukin-2 |
| US4908433A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Uses of interleukin-2 |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| DE3500681A1 (de) * | 1985-01-11 | 1986-07-17 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur isolierung und reinigung von lymphokinen |
| JPH0646957B2 (ja) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
| US5523215A (en) * | 1985-03-28 | 1996-06-04 | Chiron Corporation | Enhanced purification and expression of insoluble recombinant proteins |
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US5248769A (en) * | 1985-06-26 | 1993-09-28 | Cetus Oncology Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
| US4762784A (en) * | 1985-07-15 | 1988-08-09 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermemtation process for the high level production of bovine growth hormone |
| US4690915A (en) * | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| CA1297003C (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-10 | Jack H. Nunberg | Composition and method for treating animals |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| US4933433A (en) * | 1986-01-31 | 1990-06-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant interleukin-2 composition and process for making it |
| US5425940A (en) * | 1986-04-09 | 1995-06-20 | Cetus Oncology Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
| US4931544A (en) * | 1986-09-04 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions |
| US4683293A (en) * | 1986-10-20 | 1987-07-28 | Phillips Petroleum Company | Purification of pichia produced lipophilic proteins |
| US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
| US4879374A (en) * | 1987-03-13 | 1989-11-07 | Immunex Corporation | Bovine interleukin-1β DNA sequence |
| US5108911A (en) * | 1987-03-13 | 1992-04-28 | Immunex Corporation | Process for preparing bovine interleukin-Iβ |
| CA1339757C (en) | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| JPS6463395A (en) | 1987-05-04 | 1989-03-09 | Oncogen | Oncostatin m and novel composition having antitumor activity |
| WO1988008849A1 (en) * | 1987-05-11 | 1988-11-17 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| US4931543A (en) * | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
| US5162507A (en) * | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| US4801691A (en) * | 1987-05-15 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for removing sodium dodecyl sulfate from sodium dodecyl sulfate solubilized protein solutions |
| AU2257488A (en) * | 1987-07-29 | 1989-03-01 | Schering Biotech Corporation | Purification of human interleukin-4 expressed in escherichia coli |
| JP2669859B2 (ja) * | 1987-08-04 | 1997-10-29 | 協和醗酵工業株式会社 | タンパク質の再活性化法 |
| EP0337243A1 (en) * | 1988-04-14 | 1989-10-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for purifying recombinant human interleukin-2 |
| FR2635527B1 (fr) * | 1988-07-28 | 1992-06-12 | Roussel Uclaf | Il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite, son procede d'obtention et son application comme medicament |
| US4923967A (en) * | 1988-09-26 | 1990-05-08 | Eli Lilly And Company | Purification and refolding of recombinant proteins |
| US5830452A (en) * | 1990-11-20 | 1998-11-03 | Chiron Corporation | Method for enhancing the anti-tumor therapeutic index of interleukin-2 |
| DK0511964T3 (da) * | 1990-11-23 | 1998-06-02 | Roussel Uclaf | Fremgangsmåde til fremstilling af et cytokin protein med mindst en intramolekylær disulfidbro ved reduktion af det tilsvarende reducerede rekombinante protein ved en pH-værdi lavere end 5,0 |
| US5939524A (en) * | 1991-12-09 | 1999-08-17 | The Scripps Research Institute | Platelet GPIII P1A1 and P1A2 epitopes, their preparation and use |
| AU648214B2 (en) * | 1991-12-31 | 1994-04-14 | Lucky Limited | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc. |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US20030171292A1 (en) * | 1992-06-01 | 2003-09-11 | Creasey Abla A. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| US6063764A (en) * | 1992-06-01 | 2000-05-16 | Washington University & Chiron Corp. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| CA2147466A1 (en) * | 1992-10-20 | 1994-04-28 | Just P. J. Brakenhoff | Interleukin-6 receptor antagonists |
| CN1051092C (zh) * | 1993-05-21 | 2000-04-05 | 沈阳军区后勤部军事医学研究所 | 一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2的方法 |
| US5632983A (en) | 1994-11-17 | 1997-05-27 | University Of South Florida | Method for treating secondary immunodeficiency |
| US5912327A (en) * | 1996-09-30 | 1999-06-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Method of purifying chemokines from inclusion bodies |
| US6632425B1 (en) | 1997-03-20 | 2003-10-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine compositions |
| EP1935431A3 (en) | 2000-05-15 | 2008-08-13 | Health Research, Inc. | Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2 |
| WO2002079157A1 (en) | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Schering Corporation | Aryl oxime-piperazines useful as ccr5 antagonists |
| BR0213292A (pt) * | 2001-10-15 | 2006-05-23 | Chiron Corp | tratamento de pneumonia severa por administração de inibidor da via de fator tecidual (tfpi) |
| AU2002304965A1 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd | Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy |
| CA2518823A1 (en) | 2003-03-24 | 2004-10-07 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Benzyl-pyridazinons as reverse transcriptase inhibitors |
| EP1664086B1 (en) * | 2003-09-09 | 2009-10-28 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Chromatographic separation of therapeutic polypeptides |
| EP1689888A2 (en) | 2003-10-23 | 2006-08-16 | Illumigen Biosciences Inc. | Detection of mutations in a gene associated with resistance to viral infection, oas1 |
| EP2248830A1 (en) | 2003-11-04 | 2010-11-10 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Use of antagonist anti-CD40 antibodies for treatment of autoimmune and inflammatory diseases and organ transplant rejection |
| CA2560103A1 (en) * | 2004-03-17 | 2005-11-24 | Chiron Corporation | Treatment of severe community-acquired pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
| CU23297A1 (es) | 2004-11-16 | 2008-07-24 | Ct De Inmunologa A Molecular | Formulaciones inmunoterapã0/00uticas para la inducciã"n de autoanticuerpos bloqueadores de la uniã"n de interleucina-2 a su receptor. su uso en el tratamiento del cã ncer |
| DE102005005542A1 (de) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Herstellung von Aldesleukin für die pharmazeutische Verwendung |
| BRPI0617720A2 (pt) | 2005-10-19 | 2011-08-02 | Hoffmann La Roche | compostos inibidores de nnrt de fenil-acetamida, usos dos referidos compostos e composição farmacêutica que os contém |
| RU2304586C1 (ru) * | 2006-03-27 | 2007-08-20 | Михаил Николаевич Смирнов | Препарат интерлейкина-2 и способ его получения |
| RU2451676C2 (ru) | 2006-08-16 | 2012-05-27 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы |
| RU2469032C2 (ru) | 2006-12-13 | 2012-12-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Производные 2-(пиперидин-4-ил)-4-фенокси- или фениламинопиримидина в качестве ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы |
| MX2009012704A (es) | 2007-05-30 | 2009-12-08 | Hoffmann La Roche | Inhibidores de transcriptasa inversa de no nucleosidos. |
| RU2495878C2 (ru) | 2007-12-21 | 2013-10-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Гетероциклические антивирусные соединения |
| US20120036767A1 (en) * | 2008-08-04 | 2012-02-16 | Larach Mario C | Continuous cultivation, harvesting, and extraction of photosynthetic cultures |
| RS61854B1 (sr) | 2010-11-12 | 2021-06-30 | Nektar Therapeutics | Konjugati il-2 dela i polimera |
| US9428567B2 (en) | 2010-12-22 | 2016-08-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Antagonists of interleukin-2 receptor |
| SG11201407812SA (en) | 2012-05-31 | 2014-12-30 | Agency Science Tech & Res | Methods for reducing levels of protein-contaminant complexes and aggregates in protein preparations by treatment with electropositive organic additives |
| WO2015042707A1 (en) | 2013-09-24 | 2015-04-02 | Medicenna Therapeutics Pte Ltd | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof |
| EP3134102B1 (en) | 2014-04-24 | 2019-07-03 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2 |
| EP3204119B1 (en) | 2014-10-09 | 2021-06-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Multiple-variable il-2 dose regimen for treating immune disorders |
| EP3641814A4 (en) | 2017-06-19 | 2021-06-23 | Medicenna Therapeutics Inc. | USES AND METHODS FOR IL-2 SUPERAGONISTS, AGONISTS, AND FUSIONS THEREOF |
| US20200131555A1 (en) | 2017-07-11 | 2020-04-30 | Synthorx, Inc. | Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof |
| KR102687649B1 (ko) | 2017-08-03 | 2024-07-26 | 신톡스, 인크. | 증식성 질환 및 감염성 질환의 치료를 위한 사이토카인 접합체 |
| AU2018372167B2 (en) | 2017-11-21 | 2023-12-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Partial agonists of interleukin-2 |
| EA202092489A1 (ru) | 2018-05-21 | 2021-03-16 | Нектар Терапьютикс | СЕЛЕКТИВНЫЙ СТИМУЛЯТОР Treg RUR20kD-IL-2 И РОДСТВЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ |
| SG11202012299SA (en) * | 2018-06-13 | 2021-01-28 | Akron Biotechnology Llc | Method to prepare therapeutically active aldesleukin highly stable in liquid pharmaceutical compositions |
| EP3923974A4 (en) | 2019-02-06 | 2023-02-08 | Synthorx, Inc. | IL-2 CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF |
| US20220324932A1 (en) | 2019-06-20 | 2022-10-13 | CSPC Megalith Biopharmaceutical Co., Ltd. | Modified il-2 proteins, peg conjugates, and uses thereof |
| MX2022008771A (es) | 2020-01-14 | 2022-10-07 | Synthekine Inc | Metodos y composiciones de muteinas de il2 sesgadas. |
| CN111676261A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-18 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种高纯度重组白介素-2的制备工艺 |
| CN111793124A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-10-20 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种去除重组白介素-2内毒素的方法 |
| KR20240123817A (ko) | 2021-12-14 | 2024-08-14 | 넥타르 테라퓨틱스 | 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2를 위한 투여 계획 및 관련 조성물 |
Family Cites Families (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3897309A (en) * | 1974-02-15 | 1975-07-29 | Merck & Co Inc | Process for removing pyrogenic material from aqueous solutions |
| JPS6030291B2 (ja) * | 1978-03-20 | 1985-07-16 | 森永乳業株式会社 | 人顆粒球の分化増殖を促進するｈｇｉ糖蛋白質、ｈｇｉ糖蛋白質の製造法及びｈｇｉ糖蛋白質を含有する白血球減少症治療剤 |
| IN150740B (ja) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| JPS55148098A (en) * | 1979-05-10 | 1980-11-18 | Toray Ind Inc | Concentration and purification of interferon |
| CH648331A5 (de) * | 1979-07-31 | 1985-03-15 | Hoffmann La Roche | Homogenes fibroblasten-interferon und dessen herstellung. |
| US4390623A (en) * | 1980-10-02 | 1983-06-28 | Hooper Trading Company | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| US4315852A (en) * | 1980-11-26 | 1982-02-16 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| US4448879A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-15 | Hooper Trading Company | High yield process for in vitro production of serum-free and mitogen-free interleukin-2 |
| US4464355A (en) * | 1981-03-26 | 1984-08-07 | Hooper Trading Co. | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| US4401756A (en) * | 1981-04-14 | 1983-08-30 | Immunex Corporation | Process for preparing human interleukin 2 |
| JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法 |
| US4450103A (en) * | 1982-03-01 | 1984-05-22 | Cetus Corporation | Process for recovering human IFN-β from a transformed microorganism |
| DE3377363D1 (en) * | 1982-03-31 | 1988-08-18 | Ajinomoto Kk | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| CA1341562C (en) * | 1982-03-31 | 2007-11-27 | Tadatsugu Taniguchi | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
| US4778879A (en) * | 1982-04-20 | 1988-10-18 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Highly purified human interleukin 2 and method |
| ATE37564T1 (de) * | 1982-04-20 | 1988-10-15 | Sloan Kettering Inst Cancer | Reinigung von interleukin-2. |
| JPS58198293A (ja) * | 1982-05-12 | 1983-11-18 | Shionogi & Co Ltd | インタ−ロイキン等免疫調節因子の製造方法 |
| US4490289A (en) * | 1982-09-16 | 1984-12-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous human interleukin 2 |
| US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
| US4462940A (en) * | 1982-09-23 | 1984-07-31 | Cetus Corporation | Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides |
| DE3242851A1 (de) * | 1982-11-19 | 1984-05-24 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verfahren zur reinigung von menschlichen lymphokinen |
| JPS59116231A (ja) * | 1982-12-13 | 1984-07-05 | スロ−ン−ケツタリング・インステイテユ−ト・フオ−・キヤンサ−・リサ−チ | 抗−インタ−ロイキン−２単クロ−ン抗体 |
| US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| AU579089B2 (en) * | 1983-02-08 | 1988-11-17 | Biogen, Inc. | Human interleukin-2-like polypeptides |
| IL71275A0 (en) * | 1983-03-21 | 1984-06-29 | Sparamedica Ag | Human interleukin-2-and its preparation |
| GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
| US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| US4582799A (en) * | 1983-04-15 | 1986-04-15 | Damon Biotech, Inc. | Process for recovering nonsecreted substances produced by cells |
| NZ208309A (en) * | 1983-06-01 | 1988-04-29 | Hoffmann La Roche | Recombinant leukocyte, fibroblast, or immune interferons (rifn-#a#, b or #g#) with one cys residue replaced |
| WO1985000606A1 (en) * | 1983-07-19 | 1985-02-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Human il-2 and process for its preparation |
| US4464295A (en) * | 1983-08-17 | 1984-08-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Simple and rapid method for extraction of proteins from bacteria |
| US4476049A (en) * | 1983-09-20 | 1984-10-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the extraction of immune interferon |
| GB8327880D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Ajinomoto Kk | Saccharomyces cerevisiae |
| US4675383A (en) * | 1983-11-15 | 1987-06-23 | The Salk Institute For Biological Studies | Purification of T-cell growth factor |
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| CA1340853C (en) * | 1983-12-23 | 1999-12-21 | Hsiang-Fu Kung | Purification of recombinant interleukin-2 |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| WO1985004328A1 (en) * | 1984-03-28 | 1985-10-10 | Cetus Corporation | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| DE3583880D1 (de) * | 1984-04-09 | 1991-10-02 | Takeda Chemical Industries Ltd | Stabile interleukin-2-zusammensetzung. |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| US4782139A (en) * | 1985-10-28 | 1988-11-01 | Eli Lilly And Company | Selective chemical removal of a protein amino-terminal residue |
| US4787658A (en) * | 1986-07-29 | 1988-11-29 | Harris Jr John | Unibody bumper system |
| US5156968A (en) * | 1988-06-24 | 1992-10-20 | Genentech, Inc. | Purified yeast ubiquitin hydrolase |
-
1984
- 1984-03-28 US US06/594,223 patent/US4569790A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-02-26 CA CA000475151A patent/CA1341083C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-25 IN IN220/CAL/85A patent/IN162903B/en unknown
- 1985-03-25 PH PH32035A patent/PH21012A/en unknown
- 1985-03-26 NZ NZ211569A patent/NZ211569A/en unknown
- 1985-03-26 DK DK135985A patent/DK166324C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-03-26 GR GR850741A patent/GR850741B/el unknown
- 1985-03-27 DE DE3588189T patent/DE3588189T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 EP EP91113235A patent/EP0470586B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 FI FI851231A patent/FI94960C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 PT PT80172A patent/PT80172B/pt unknown
- 1985-03-27 DE DE8585103649T patent/DE3586762T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 ES ES541608A patent/ES8609362A1/es not_active Expired
- 1985-03-27 IL IL74733A patent/IL74733A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 EP EP85103649A patent/EP0156373B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 NO NO851235A patent/NO851235L/no unknown
- 1985-03-27 AT AT85103649T patent/ATE81674T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 ZA ZA852347A patent/ZA852347B/xx unknown
- 1985-03-28 JP JP60062195A patent/JP2599903B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-28 IE IE79985A patent/IE59100B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 AU AU40467/85A patent/AU592751B2/en not_active Expired
- 1985-03-28 KR KR1019850002078A patent/KR850007083A/ko not_active Application Discontinuation
-
1992
- 1992-05-06 US US07/879,753 patent/US5419899A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-25 US US08/428,895 patent/US5614185A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-15 JP JP8143485A patent/JP2648587B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-04 HK HK98103767A patent/HK1004474A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2648587B2 (ja) | 精製された変異型インターロイキン−２組成物 | |
| US4816440A (en) | Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection | |
| US4604377A (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| US4992271A (en) | Formulation for lipophilic IL-2 proteins | |
| US4931543A (en) | Process for recovering microbially produced interleukin-2 | |
| CA1295087C (en) | Purification of recombinant beta-interferon incorporating rp-hplc | |
| JPH0636752B2 (ja) | 屈折体の回収方法 | |
| JPH0696600B2 (ja) | 蛋白質の酸化方法 | |
| EP0211835B1 (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
| US5643566A (en) | Formulation processes for lipophilic proteins | |
| US4675387A (en) | Method for extracting protein with organic acid | |
| Russell-Harde et al. | The use of zwittergent 3-14 in the purification of recombinant human interferon-β ser17 (Betaseron) | |
| JPS62209097A (ja) | 組換えヒトインタリユーキン−１αの精製法 | |
| CA1283356C (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |