NO851235L - Renset rekombinant interleukin-2 og fremstilling og rensing derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder biokjemisk teknikk. Mere spesielt angår oppfinnelsen en biokjemisk separering eller gjenvinningsprosess der interleukin-2, IL-2, separeres eller gjenvinnes fra mikroorganismer som er transformert for å fremstille IL-2.

Nativ human IL-2 er et antigen-ikke-spesifikt, genetisk ubegrenset oppløselig faktor fremstilt ved erytrocyttrosett positive T-celler stimulert med antigener, mitogener og alloantigener. Det er et protein med en angitt molekylvekt i det omtrentlige området 13000-17000 dalton (S. Gillis og J. Watson, "J. Exp. Med." (1980) 159:1709) og et isoelek-. trisk punkt i det omtrentlige området pH 6-8,5. Human IL-2 har et antall in vitro- og in vivo-virkninger inkludert

en økning av den proliferative respons hos human perifere blodmononukleære celler eller murintymocytter, en økning av immunresponsen hos mennesker og dyr mot bakterielle, parasitiske, fungale, protozon- og virale infeksjoner, og understøtter veksten av kontinuerlige T-cellelinjer.

IL-2 og IL-2-muteiner hvori cysteinresten ved aminosyre

125 er erstattet med serin og/eller initial-alaninet er eliminert, har vært fremstilt mikrobielt ved genetiske konstruksjonsteknikker. Mikrobielt fremstilt IL-2 er ikke glykosylert og fremstilles i redusert tilstand av mikroorganismene. Renset og oksydert viser disse mikrobielt fremstilte IL-2 aktivitet som kan sammenliknes med nativt human IL-2.

Prosedyrer for rensing av nativ IL-2 fra T-celler er beskrevet av Watson, J., et al, "J. Exp. Med." (1979) 150;849-

861; Gillis, S., et al, "J. Immunology" (1980) 124 :1954-

1962; Mochizuki, D.Y., et al, "J. Immun Meth." (1980) 39:185-201; Welte, K., et al, "J. Exp. Med." (1982) 156:454-464;

og europeisk publisert søknad nr. 92163 og 94317. Generelt involverer disse prosedyrer utfelling av proteiner fra kultursupernatanter med ammoniumsulfat fulgt av kromatogra-fisk fraksjonering.

US-PS 4.450.103 og Derynck, R., et al, "Nature" (1980) 287:193-197 beskriver prosedyrer for utvinning av IFN-

fra IFN- -produserende E. coli. Patentet beskriver en prosedyre der IFN- ekstraheres fra cellulært materiale med 2-butanol eller 2-metyl-2-butanol.

Foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av IL-2 fra en IL-2-produserende mikroorganisme og som karakteriseres ved: (a) å nedbryte cellemembranet til mikroorganismen;

(b) å ekstrahere den nedbrutte med en vandig oppløsning

av et kaotropisk middel; (c) å oppløseliggjøre IL-2 i fast fase fra ekstraksjonsblandingen med en vandig oppløsning av et oppløselig-gjørende middel som danner et vannoppløselig kompleks med IL-2, idet oppløsningen innholder et reduksjonsmiddel;

og

(d) å separere IL-2 fra den resulterende oppløsning i nærvær

av et reduksjonsmiddel.

I foretrukne utførelsesformer er ved denne prosess det kaotropiske middel urea i en konsentrasjon av ca. 3,5 M

til ca. 4,5 M i ekstraksjonsblandingen, det oppløselig-gjørende middel er natriumdodecylsulfat, SDS, eller natrium-laurylsarkosin (sarkosyl), videre blir oppløseliggjort IL-2 ekstrahert ytterligere med 2-butanol eller 2-metyl-2-butanol og sluttsepareringen gjennomføres ved gelfiltrering idet det resulterende tilpassede produkt oksyderes og det oksyderte produkt renses ved reversfase-høy-ytelses-væske-kromatografi, RP-HPLC.

Figur 1 viser et flytdiagram for to alternative utførelses-former av oppfinnelsens prosess, der gelfiltreringskromato-grafi benyttes som sluttrensetrinn. Den utførelsesform er som kalt metode IA benytter SDS som oppløseliggjørende middel, den utførelsesform som kalles metode IB benytter sarkosyl som oppløseliggjørende middel. Figuren inkluderer densitometeravføling av SDS-polyakrylamidgelelektroforese SDS-PAGE)-analyser av produktet på forskjellige trinn i prosessen.

Figur 2 er et PHLC-kromatogram og SDS-PAGE-analyse av produktet i eksempel 3. Figur 4 er et HPLC-kromatogram av produktet fra eksempel 9. Figur 4 er et flytdiagram av en foretrukket prosedyre for behandling av mikrobielt fremstilt IL-2.

Som benyttet heri angir uttrykket "IL-2" et ikke-glykosylert protein som er (a) fremstilt av en mikroorganisme som er transformert med et human interleukin-2-gen eller en modi-fikasjon av human interleukin-2-genet som koder et protein med: (a) en aminosyresekvens som er minst i det vesentlige identisk med aminosyresekvensen for nativ human interleukin-2 og (b) har biologisk aktivitet som er felles med nativ human interleukin-2. Vesentlig identitet for aminosyre-sekvensene betyr at sekvensene er identiske eller skiller seg ved en eller flere aminosyre-forandringer (utelatelser, tilføyelser, erstatninger) som ikke forårsaker ugunstig funksjonell ulikhet mellom det syntetiske protein og det native human interleukin-2. Eksempler på slike proteiner er de IL-2 som er beskrevet i europeisk publisert søknad 91539 og 88195 og de IL-2 som er beskrevet i publisert europeisk søknad nr. 109748 samt de IL-2 som beskrives i eksemplene ifølge søknaden.

Som benyttet heri angir uttrykket "transformert mikroorganisme" en mikroorganisme som er genetisk konstruert for å produsere et protein som har aktiviteten til nativ human interleukin-2. Eksempler på transformert mikroorganismer er beskrevet i de nevnte europeiske publikasjoner 88195, 91539 og 109748 samt foreliggende søknads eksempler.Bakte-rier er foretrukne mikroorganismer for fremstilling av IL-2. Syntetisk IL-2 kan også fremstilles ved egnet transformert: gjær og pattedyrceller. E. coli er spesielt foretrukket .

De transformerte mikroorganismer dyrkes i et egnet vekstmedium, karakteristisk til en optisk densitet, OD, på

minst ca. 30 ved 680 nm, og fortrinnsvis mellom ca. 20

og 40 ved 680 nm. Sammensetningen av dyrkningsmediet vil avhenge av den spesielle involverte mikroorganisme.. Mediet er et vandig medium inneholdende forbindelser som oppfyller næringskravene til mikroorganismen. Vekstmedia vil karakteristisk inneholde assimilerbare kilder for karbon og nitrogen, energikilder, magnesium-, kalium- og natriumioner, og eventuelt aminosyrer og purin- og pyrimidinbaser. (Se "Review of Medical Biology", Lange Medical Publications, 14. utg., s. 80-95 (1980). I ekspresjonsvektorer som involverer trp-promoteren blir tryptofankonsentrasjonen i mediet omhyggelig kontrollert for å bli begrensende på det tids-punkt IL-2-ekspresjonen er ønsket. Vekstmedia for E. coli er velkjente i denne teknikk.

Etter at cellene er høstet fra kulturen kan de hvis nødvendig, konsentreres til ca. 20-150 mg/ml, fortrinnsvis 80-100

mg/ml (OD 40-300, og fortrinsnvis 160-200 ved 680 nm) ved filtrering, sentrifugering eller andre konvensjonelle metoder.

Etter konsentrasjonen blir cellemembranet til mikroorganismene brutt opp. Hovedformålet med dette er å lette den derpå følgende ekstrahering og oppløseliggjøring. Konvensjonelle celleoppbrytingsteknikker slik som homogenisering, sonikering eller trykkcykler kan benyttes i dette trinn i prosessen. Foretrukne metoder er sonikering og homogenisering med en Manton-Gaulin-homogenisør. Sluttpunktet for oppbrytingstrinnet kan overvåkes ved den optiske densitet, idet den optiske densitet i suspensjonen karakteristisk synker ca. 65-85%. I ethvert tilfelle bør oppbrytingen bryte ned i det vesentlige alle celler slik at i det vesent lige ingen intakte celler føres igjennom til oppløselig-gjøringstrinnet. Før oppbrytingen blir, hvis nødvendig, pH-verdien i den flytende fase av konsentratet justert til et nivå som letter fjerning av E. coli-proteiner i etterfølgende trinn, mens man bibeholder IL-2-protein som uoppløselig kompleks i restene av cellene. pH-verdien kan så justeres ved å tilsette egnede buffere. I de fleste tilfeller vil pH-verdier innen området ca. 8 til ca. 8,5 benyttes.

Trinnene i fremstillingsprosessen etter oppbrytingstrinnet

er primært ment for separering av IL-2 fra E. coli-proteiner til en høy renhetsgrad (fortrinnsvis minst ca. 95% og helst minst ca. 98%) i gode utbytter, mens man holder IL-2 i redusert tilstand. På samme måte kan i kombinasjon disse renseprosesser også redusere pyrogene stoffer i sluttproduktet til et nivå som antas å være akseptabelt for parenteral administrering til pasienter.

Etter at cellene er brutt opp, kan partikkelformig materiale separeres fra væskefasen av oppbrutt materiale og suspenderes igjen i et vandig medium som er bufret til optimal pH-verdi for ekstrahering. Det partikkelformige materialet kan eventuelt vaskes med buffer på dette trinn for å fjerne alle vannoppløselige E. coli-proteiner. I ethvert tilfelle vil proteinkonsentrasjonen i cellesuspensjonen som underkastes ekstrahering vanligvis ligge innen området ca. 5 til ca.

60 mg/ml, fortrinnsvis 20-40 mg/ml.

Ekstraheringen av E. coli-proteiner fra partikkelformig cellulærmateriale kan gjennomføres i forbindelse med oppbrytingen eller sekvensielt etter denne. Den gjennomføres fortrinnsvis som et separat trinn etter oppbrytingen. Ekstraheringsmidlet er en vandig oppløsning av et kaotropi-sfk middel, dvs. et mildt protein-denaturerende middel som dissosierer hydrogenbindinger og bevirker proteinenes tertiær-struktur. Ekstraheringsmidlet fjerner selektivt massen av E. coli-proteiner fra cellulærrestene og etterlater minst en vesentlig andel av IL-2 sammen med (inneholdt i eller bundet til) cellulærrestene. Selektiviteten lettes ved IL-2's hydrofobisitet og det faktum at IL-2 befinner seg i redusert, uoppløselig tilstand ved en pH-verdi nær proteinets isoelektriske punkt. I tillegg kan en vesentlig andel av IL-2 være tilstede in vivo som inklusjonslegemer i betydelig mengde, slik tilfellet var med andre klonede proteiner uttrykt i høye nivåer i E. coli. Eksempler på ekstraheringsmidler er urea og guanidiniumhydroklorid (guanidiniumhydroklorid bør ikke benyttes når SDS benyttes som oppløseliggjørende middel). Urea er foretrukket. Konsentrasjonen av kaotropisk middel i ekstraheringsblandingen avhenger av det spesielle middel som benyttes og den mengde cellulærmateriale som foreligger i ekstraheringsblandingen. Når det gjelder urea, vil sluttkonsentrasjoner mellom ca.

3,5 og 4,5 M og helst ca. 4 M, benyttes i satsprosesser ved 250°C. Hvis ekstraheringen gjennomføres på kontinuerlig basis over lengre tidsrom, kan det være ønskelig å benytte lavere konsentrasjoner. Temperaturer i området 20-25°C

vil vanligvis benyttes ved ekstraheringen, mens romtemperatur benyttes for hensiktsmessighetens skyld. Blanding vil karakteristisk benyttes for å øke kontakten mellom oppløsning og partikkelformig materiale og reduserer således den tid som er nødvendig for å ekstrahere ikke-IL-2-proteiner fra cellulærrestene. Kinetisk analyse av ekstraheringsprosessen ble gjennomført på supernatantene ved bruk av SDS-PAGE,

og ekstraheringen ble funnet å være i det vesentlige total i løpet av 15-30 minutter..

Etter ekstraheringen blir blandingen separert i fast og flytende fase. IL-2 i fast fase oppløseliggjøres så selektivt ved å bringe den faste fase i kontakt med en nøytral, vandig buffer inneholdende et reduksjonsmiddel og et oppløse-liggjørende middel. Overflateaktive midler, såkalte deter-genter, som har en egnet hydrofob-hydrofil balanse til å oppløseliggjøre det hydrofobe IL-2 kan benyttes. Alkali-metallsulfater inneholder 10-14 karbonatomer og alkali- metallalkylsarkosinater er foretrukne oppløseliggjørende midler, mens SDS og sarkosyl er spesielt foretrukne.

Mengden oppløseliggjørende middel som benyttes ved oppløse-liggjøringen avhenger av det spesielle middel. Når SDS

eller sarkosyl benyttes, er det foretrukne vektforhold mellom SDS/sarkosyl og fast fase-protein ca. 0,5:1 til 1,4:1. Det oppløseliggjørende medium inneholder også en tilstrekkelig mengde reduksjonsmiddel til å forhindre at oppløseliggjort IL-2 oksyderes i vesentlig grad. Protein-reduksjonsmidler slik som ditiotreitol, DTT, og 2-merkapto-etanol, kan benyttes. Konsentrasjonen av reduksjonsmiddel slik som DTT i mediet vil vanligvis ligge mellom ca. 5

og 20 mM. Oppløseliggjøringen vil typisk gjennomføres ved en temperatur innen området 20-25°C med blanding for å lette kontakt mellom fast fase og oppløseliggjørende medium. Høyere temperaturer kan oppløseliggjøre uønskede E. coli-proteiner. Oppløseliggjøringen anses ferdig når prøven har stått 15 minutter eller oppløsningen blir translu-cent. Uoppløselig materiale separeres så etter fullført oppløseliggjøring.

Etter at IL-2 er oppløseliggjort, kan IL-2 eventuelt ekstraheres fra den vandige oppløsning under reduserende betingelser med 2-butanol eller 2-metyl-2-butanol for å fjerne ytterligere E. coli-proteiner, spesielt inkludert visse forurensninger

som har molekylvekter meget nær IL-2. Betingelser (f.eks. ionestyrke innen området 0,05 og 0,15) benyttes der den vandige oppløsning og butanolen er i det vesentlige ublandbar. Under utførelsen av den organiske ekstrahering blir proteinkonsentrasjonen i den vandige oppløsning fortrinnsvis justert til mindre enn ca. 6 mg/ml, fortrinnsvis 0,5 til 4 mg/ml. Reduserende betingelser opprettholdes ved å gjennomføre ekstraheringen i nærvær av et reduksjonsmiddel, f.eks.

DTT. Butanol vil vanligvis tilsettes til den vandige oppløs-ning av oppløseliggjort IL-2 i volumforhold innen området ca. 1:1 til ca. 3:1 (ekstraksjonsmiddel : vandig oppløsning),

og fortrinnsvis ca. 1:1. Ekstraheringen kan gjennomføres

ved sats- eller kontinuerlig drift. Temperaturen vil vanligvis ligge innen området 20-100°C og pH-verdien vil vanligvis være ca. 4-9 og fortrinnsvis ca. 5-6. Kontakttiden mellom oppløsning og butanol er ikke kritisk og relativt korte tider i størrelsesorden noen minutter kan benyttes. Etter at ekstraheringen er ferdig, blir vandig fase og butanolfase separert og IL-2 separeres fra butanolfasen. En foretrukket prosedyre for separering av IL-2 fra butanolfasen er syreutfelling. Dette skjer ved tilsetning av butanolfasen til vandig buffer, pH 7,5, inntil den organiske fase oppløses (ca. 2-3 volumer buffer pr. volum organisk materiale) og så å redusere pH-verdien til 5,5-7,0, fortrinnsvis 6,0-

6,2, for å bringe IL-2 til utfelling.

Det neste trinn i prosessen er å separere IL-2 og eventuelle

E. coli-forurensninger som forblir etter ekstrahering og optimalt fra det oppløseliggjørende middel. Gelfiltrerings-kromatografi, RP-HPLC, eller en kombinasjon av gelfiltrerings-kromatografi og RP-HPLC benyttes. Gelfiltreringskromatografien gjennomføres fortrinnsvis i to trinn som fjerner både pyrogene komponenter og proteinforurensninger med molekylvekter over eller under IL-2. (IL-2 har en molekylvekt på ca. 15,5 K dalton.) Geler som er i stand til fraksjonering av oppløsningen for å tillate separering av IL-2 fra disse forurensninger er kommersielt tilgjengelige. "Sephacryl S-200" er en foretrukket gel for fjerning av høyere molekyl-vektkomponenter og "Sephadex|i G-25-, G-75- eller G-100-

geler er fortrukne for fjerning av lave molekylvektsforu-rensninger. Gelfiltrering vil karakteristisk gjennomføres i bufrede oppløsninger ved pH 5,5-7,0 inneholdende ca. 0,1-1,0% oppløseliggjørende middel og ca. 1-10 mM reduksjonsmiddel. Kolonnen vil tilpasses for å tillate egnet oppløs-ning av ønskede komponenter.

RP-HPLC er et alternativ til gelfiltrering. Videre er

RP-HPLC i stand til å fjerne molekyler fra oppløsningen

som har molekylvekter nær IL-2 og derfor ikke helt kan fjernes ved gelfiltrering. I tillegg blir forurensninger

slik som bakterielt endotoksin også fjernet effektivt ved RP-HPLC. Derfor kan RP-HPLC også benyttes som sluttrensetrinn etter gelfiltrering. Bærere (stasjonære faser) som gir god proteinoppløsning kan benyttes ved RP-HPLC. C-4, C-8 eller C-18 på 300 Ångstrøm-bærere er eksempler på foretrukne bærere. Separeringen gjennomføres ved en sur pH-verdi på under ca. 2,3, vanligvis 2,1-2,3, for å holde IL-2 i oppløsning. I denne henseende vil pH-verdien i oppløsningen fra oppløseliggjøringen (gelfiltreringen) fortrinnsvis justeres til dette området. Oppløsningen fylles i RP-HPLC-kolonnen og adsorberes på den stasjonære fase. Et gradient oppløsningsmiddelsystem omfattende en organisk syre slik som eddiksyre eller trifluoreddiksyre og et organisk oppløsningsmiddel slik som propanol eller acetonitril, benyttes for å eluere IL-2 fra kolonnen.

Eddiksyre-propanol, trifluoreddiksyre-propanol samt trifluoreddiksyre-acetonitril er foretrukne oppløsningsmiddelsystemer. IL-2 elueres til eddiksyre-propanolsystemet ved ca. 40% propanol, til trifluoreddiksyre-propanolsystemet ved ca.

50% propanol og til trifluoreddiksyre-acetonitrilsystemet ved ca. 62% acetonitril. For hensiktsmessighetens skyld vil innholdet av organisk oppløsningsmiddel i elueringsmidlet vanligvis økes hurtig til et nivå noe under oppløsningsmiddel-konsentrasjonen ved hvilken IL-2 elueres, fulgt av en langsomt gradientendring i området ca. 0,1-1,0% pr. minutt.

Såsnart IL-2 er oppnådd fra kromatografitrinnet, blir det lyofilisert og suspendert igjen i en nøytral vandig buffer inneholdende reduksjonsmidlet (for å holde IL-2 i redusert tilstand) og oppløseliggjøringsmidlet (for å holde det i oppløsning). IL-2 er stabil i denne form og kan lagres for ytterligere behandling og formulering før bruk.

En alternativ og foretrukket prosedyre er å oksydere IL-2 etter separering ved gelfiltrering og så å rense det oksyderte produktet ved RP-HPLC eller gelfiltrering fulgt av RP-HPLC. Dette resulterer i effektiv fjerning av forurensninger som overlever gelfiltreringen så vel som uønskede oksydasjons-produkter. En foretrukken oksydasjonsprosedyre er å oksydere et fullt redusert mikrobielt produsert syntetisk protein med en aminosyresekvens i det vesentlige identisk den til et brukbart protein, hvilken sekvens inkluderer cysteiner som i det brukbare protein er bundet intramolekylært for å danne et cystin, på kontrollert måte slik at cysteinene selektivt oksyderes for å danne cystinet. I denne prosess omsettes det fullt reduserte mikrobielt fremstilte syntetiske protein med o-jodosobenzoat som oksyderer cysteiner selektivt i et vandig medium, ved en pH-verdi minst ca. h pH-enhet under cysteinenes pK a, hvori konsentrasjonen av syntetisk protein i reaksjonsblandingen er mindre enn ca. 5 mg/ml og molforholdet mellom o-jodosobenzoat og protein er minst støkiometrisk, forutsatt at o-jodosobenzoatet er i overskudd i sluttdelen av reaksjonen. RP-HPLC-rensing av det oksyderte produkt kan gjennomføres under de betingelser som er beskrevet ovenfor i fravær av et reduksjonsmiddel og i nærvær av en detergent ved en konsentrasjon lik eller mindre enn de som benyttes ved den ovenfor beskrevne gelfiltrering.

Renheten for IL-2 etter kromatografering er minst ca. 95%

og vanligvis minst ca. 98%. Dette meget rene materialet inneholder mindre enn ca. 5 ng endotoksin, vanligvis mindre enn ca. 0,01 ng endotoksin pr. 100.000 enheter IL-2-aktivitet.

Oppfinnelsens fremgangsmåte skal beskrives ytterligere

ved de følgende eksempler. Disse er ikke ment å begrense oppfinnelsen på noen måte.

Eksempel 1

IL-2 ble utvunnet fra E. coli K-12-stammen MM294 som var transformert med plasmidet pLWl (deponert i "American Type Culture Collection", ATCC, den 4. august 1983 under nummeret 39.405) som følger.

E. coli ble dyrket i en fermenter ved bruk av følgende vekstmedium:

pH-verdien ble justert til 6,5 med 2,5N autoklavert NaOH.

Sterile tilsetninger (etter autoklaven)

Kommersielt tilgjengelig "Antifoam B" i 20 %-ig oppløsning, glukose i 50 %-ig oppløsning og 5N KOH ble tilsatt etter behov.

pH-verdien i fermenteren ble holdt ved 6,8 med 5N KOH. Restglukose ble holdt mellom 5 og 10 g/l, oppløst oksygen på 40% og temperaturen ved 37±1°C. Casaminosyren (20% utgangsoppløsning) ble tilsatt når ODggg var ca. 10. Innhøsting skjedde tre timer etter at ODggg-verdien nådde ca. 20.

Det innhøstede materialet ble konsentrert ved hulfiber-filtrering og/eller sentrifugering. 20-40 g på våtvekt-basis av konsentratet ble resuspendert i 200 ml 50 mM tris, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) med pH 8,1-8,5 (tris/ EDTA-buffer). Suspensjonen ble sentrifugert ved 3000-4000 x g i 10 minutter, supernatanten ble fjernet og faststoffene resuspendert i 200 ml tris/EDTA-buffer ved 4°C. Suspensjonen ble fylt i en sonikator av kommersielt tilgjengelig type og sonikert ved 4°C i 45 minutter (sluttpunkt = ODg3o~reduksjon på ca. 85%) ved bruk av stor sonde, pulsing med 50% ytelse på energiinnstilling "9". En alternativ opp-brytingsteknikk er å føre suspensjonen tre ganger gjennom en Manton-Gaulin-homogenisør innstilt på M-l. Cellulære rester ble separert fra oppbrutt materiale ved sentrifugering ved 4500 x g i 10 minutter.

Cellerestene ble resuspendert i 60 ml tris/EDTA-buffer

ved romtemperatur og et tilsvarende volum 8 M urea (Schwarz/ Mann-ultrapure) i tris/EDTA-buffer ble tilsatt til suspensjonen i løpet av fem minutter under hurtig omrøring (slutt-ureakonsentrasjon 4 M). Etter fortsatt langsom omrøring i 15-30 minutter, ble suspensjonen sentrifugert ved 12000

x g i 15 minutter for å oppnå ekstraherte cellulærrester.

(Hvis det ikke danner seg en fast fase, trekkes supernatanten--^av, et likt volum tris/EDTA-buffer tilsettes og blandingen sentrifugeres igjen.)

Ekstraherte cellulærrester resuspenderes så i 9 ml 50 mM natriumfosfat med pH 6,8, 1 mM EDTA, 10 mM DTT ved 20°C. 1 ml 20 %-ig SDS tilsettes til suspensjonen og denne blandes heftig i 5 minutter. Den flytende fase gjenvinnes fra suspensjonen ved sentrifugering ved 12000 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Den flytende fase oppvarmes så til 40°C i 15 minutter for å sikre at IL-2 i oppløsningen helt reduseres. En prøve på denne råekstrakt ble analysert ved 15% SDS-PAGE. Figur 1 viser en densitometersveiping av analysen (produktet fra metode IA) som indikerer at ekstrakten inneholdt ca. 37% IL-2. IL-2 ble separert fra oppløsningen ved gelfiltreringskromato-grafi som følger. Oppløsningen ble fylt i en 2,6 cm x 100 cm S-200-kolonne kjørt med 50 mM oppløsning natriumfosfat med pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% SDS. Kolonneavløpet ble samlet i 4 ml fraksjoner med prøver av fraksjonene analysert i 15% SDS-PAGE-minigel flekket med Coomassie-blått. Fraksjonene som inneholdt de færreste forurensninger (minimalisering av forurensninger ved ca. 35K dalton, 16-

18K dalton og 12K dalton) ble slått sammen og konsentrert til 5-10 ml ved ultrafiltrering ved hjelp av et "Amicon YM5"-ultrafilter. Konsentratet ble fylt på en 2,6 cm x

100 cm G-100-kolonne, kjørt som ovenfor bortsett fra at SDS-konsentrasjonen var 0,1% i stedet for 1%. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE og de reneste fraksjoner slått sammen. Analyser indikerte at produktet var 98% rent og inneholdt 0,5 ng endotoksin pr. 100.000 enheter IL-2-aktivitet, målt ved hjelp av limulus-amebocyttlysat-analysen (Associates of Cape Cod, Inc., Woods Hole, MA). N-terminal-aminosyresekvensen for dette IL-2 er det samme som for nativ human molekylet bortsett fra at initial N-terminal-alaninet mangler.

Eksempel 2 Prosedyren ifølge eksempel 1 ble gjentatt ved bruk av 2% sarkosyl i stedet for 2% SDS som oppløseliggjøringsmiddel og ved bruk av sarkosyl i stedet for SDS i kromatografi-kolonnene. Figur 1 viser densitometersveipingen for denne råekstrakt ved bruk av sarkosyl som oppløseliggjøringsmiddel (råekstrakt fra metode IB). Som antydet ga bruken av sarkosyl i stedet for SDS forbedret renhet (58% mot 37%) ved et tilsvarende IL-2-utbytte (50% mot 60%).

Eksempel 3

Prosedyren ifølge eksempel 1 ble gjentatt gjennom trinnene før urea-ekstraheringen og ble så oppløseliggjort og klaret som beskrevet.

IL-2 ble separert fra oppløsningen ved RP-HPLC som følger. Oppløsningen ble fortynnet 10 ganger i 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) og ble tilført til en 4,6 mm indre diameter x 5 cm lengde "BrownleeAquaport RP-300"-kolonne ekvilibrert i 0,1% TFA. IL-2 ble eluert med en gradient på 30%-60% aceto nitril inneholdende 0,1% TFA over 45 minutter. Utbyttet av IL-2-aktivitet etter HPLC var 80-100%. Figur 2 viser en sølv-flekket SDS-PAGE-analyse av dette produkt.

Eksempel 4

Prosedyren ifølge eksempel 1 ble gjentatt gjennom trinnene før gelfiltreringskromatografien. Det oppløselige, klarede og reduserte materialet ble underkastet G-100-kromatografi i 0,1% SDS som beskrevet i eksempel 1. Sammenslåtte topp-fraksjoner av IL-2 ble ytterligere renset ved RP-HPLC som beskrevet i eksempel 3. Det resulterende, renset, redusert IL-2 ble oksydert og underkastet RP-HPLC som beskrevet

i eksempel 3.

Eksempel 5

Prosedyren i eksempel 1 ble gjentatt gjennom trinnene før G-100-kolonnen. Prosedyren for eksempel 3 ble gjentatt

ved bruk av et oppløsningsmiddelsystem av propanol i 1 M eddiksyre. IL-2 ble eluert med en gradient på 35-60% propanol over 200 minutter. Kolonnedimensjonene var enten 100 mm indre diameter x 30 cm lengde eller 48 mm ID x 50 cm L,

og kolonnen var fylt med en bundet fase vid-poret silikagel. Den benyttede var "Vydac TP214". Renheten og produktutbyttet var sammenliknbart med det som ble oppnådd i eksempel 3.

Eksempel 6

Prosedyren i eksempel 3 ble gjentatt ved bruk av et oppløs-ningsmiddelsystem av propanol i 0,1% TFA. IL-2 ble eluert med en gradient på 35-60% propanol over 120 minutter.

Kolonne og bærer var som i eksempel 5. Renhet og utbytte

for produktet var sammenliknbart med det i eksempel 3.

Eksempel 7

Prosedyren i eksempel 1 ble gjentatt bortsett fra at E. coli-produsert IL-2 var et kalt des-Ala Ser^2^-IL-2. Aminosyresekvensen for dette IL-2 er forskjellig fra den til nativ molekylet idet cysteinet i posisjon 125 er forandret til serin og initial N-terminal alaninresten mangler. Stammen av des-Ala Ser^25~<I>LE-2-produserende E. coli som produserte dette IL-2 ble deponert vedATCC den 6. mars 1984 under nummeret 3 9.626.

Eksempel 8

Prosedyren i eksempel 1 ble gjentatt bortsett fra at IL-2

ble utvunnet fra E. coli K-12-stamme som var transformert med plasmidet pLW55, deponert ved ATCC den 18. november 1983 under nummeret 39.516. Aminosyresekvensen for dette molekyl er forskjellig fra den til nativmolekylet idet den har et N-terminal metionin og cysteinet i posisjon 125 er endret til serin.

Eksempel 9

Des-Ala Ser^5IL-2-produserende E.. coli ble dyrket, cellene brutt opp og cellerestene gjenvunnet fra oppbrutt materiale ved bruk av de generelle prosedyrer i eksempel 1. Celle-restene ble suspendert i 50 mM tris, 1 mM EDTA pH 8,5-buffer i en mengde på ca. 1:4,5 (vekt/volum). DTT ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 25 mM. 8 M urea i den samme buffer ble langsomt tilsatt under omrøring til en sluttkonsentrasjon på 4 M og så tillatt blanding ved romtemperatur i 30 minutter. Etter 30 minutter ble det gjenværende uopp-løselige materialet sentrifugert. Den resulterende pasta ble resuspendert i 50 mM natriumfosfatbuffer, 1 mM EDTA

pH 7,0. Suspensjonen ble så oppløseliggjort ved tilset-

ning av fast SDS til en sluttkonsentrasjon på 5% vekt/volum.

Den 5 %-ig SDS-oppløsning ble fortynnet til 2% SDS med

0,1 mM Na2P0^, pH 8,0. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt,

pH ble justert til 8,5 og DTT til 50 mM og EDTA til 2 mM

ble tilsatt.Blandingen ble oppvarmet til 40°C under

for å redusere IL-2. Blandingen ble så avkjølt og pH-verdien justert til 5,0.

Oppløsningen ble så ekstrahert ved et l:l-forhold på volum-basis med 2-butanol inneholdende 1 mM DTT ved romtemperatur. Oppholdstiden var 2-2,5 minutter. Ekstraheringen ble gjennom-ført i en væske-væske-fase-separator ved bruk av en strøm-ningshastighet på 200 ml/min. Den organiske ekstrakt ble separert og pH-verdien justert il 8,0 med NaOH. Ekstrakten ble så tilsatt langsomt til 0,1% SDS i 10 mM Na2P04, 2 mM DTT, pH 6, og omrørt i 15-20 minutter. Det resulterende presipitat ble separert og den resulterende pasta resuspendert i 5% SDS i PBS. Oppløsningen ble klaret ved sentrifugering og redusert som angitt ovenfor. Etter reduksjon ble oppløs-ningen pH-justert til 5,5 med eddiksyre. Oppløsningen ble renset ved gelfiltrering ved bruk av S-200- og G-25-kolonner. Den resulterende rensede, reduserte IL-2 ble oksydert og det oksyderte produkt ble renset ved G-25-kromato-grafi fulgt av RP-HPLC som i eksempel 3. Det resulterende rekombinante IL-2-produktet hadde et IL-2-innhold over ca. 95%, bestemt ved reduserende SDS-PAGE-analyse, et endotoksin-innhold på mindre enn ca. 0,1 ng/mg IL-2, og er i det vesentlige fritt for pyrogenstof f er bestemt ved U.S.P.-.-kaninpyrogenprøven ved doseringer på 3,3 x 10 5 U/kg. Som tidligere antydet er endotoksin-innholdet mindre enn ca. 5 ng og fortrinnsvis mindre enn 0,01 ng endotoksin pr. 100.000 enheter IL-2-aktivitet. Karakteristisk har de rensede rekombinante lL-2-produkter som er renset ved frem-gangsmåten ifølge oppfinnelsen et IL-2-innhold på over 98%, bestemt ved reduserende SDS-PAGE eller RP-HPLC, slik som vist i figur 3, i tillegg til å være i det vesentlige frie for endotoksiner og pyrogener som angitt ovenfor.

En variasjon i den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel

9 slik som kan benyttes for å fremstille IL-2 i større målestokk, er vist i figur 4. Prosessen som vist i figur 4 skiller seg fra det som er beskrevet i eksempel 9 når det gjelder (1) mindre endringer i bufferen, (2) bruk av et eddiksyre-propanol (eksempel 5)-oppløsningsmiddelsystem ved RP-HPLC, og (3) innarbeiding av etteroksydasjonsfortyn-nings/diafiltrerings-S-200-gelfiltrering, og ultrafiltrerings-trinn. Prosessen som vist i figur 4 kan modifiseres med forskjellige raffinementer, f.eks. blir etter den andre S-200-kolonne-gjennomgang, i 1% SDS, IL-2-oppløsningen fortynnet 1:10 for å gi en 0,1% SDS-konsentrasjon og så diafiltrert mot 10 mM fosfatbuffer ved en pH på 7,5 og 5 ppm SDS. Oppløsningen blir så konsentrert som nødvendig for egnet bruksdosering.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for oppnåelse av IL-2 fra en transformert mikroorganisme inneholdende IL-2, karakterisert ved: (a) å rive opp cellemembranene i mikroorganismen; (b) ekstrahering av det oppnådde materialet med en vandig oppløsning av et kaotropisk middel som ekstraherer ikke-IL-2-proteiner selektivt fra cellematerialet; (c) oppløseliggjøring av IL-2 i den faste fase av ekstraksjonsblandingen med en vandig oppløsning av et oppløselig-gjøringsmiddel som danner et vannoppløselig kompleks med IL-2, idet oppløsningen inneholder et reduksjonsmiddel; og (d) separering av IL-2 fra den resulterende oppløsning i nærvær av et reduksjonsmiddel.

2 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det kaotrope middel er urea og at det oppløselig-gjørende middel er natriumdodecylsulfat eller natrium-laurylsarkosin.

3 . Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at trinn (b) utføres ved en basisk pH-verdi.

4 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1,

2 eller 3, karakterisert ved at trinn (d) gjennomføres ved gelfiltrering eller reversfase-høy-ytelsesvæskekromatografi.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1,

2 eller 3, karakterisert ved at trinn (d) gjennomføres ved isolering av en IL-2-holdig fraksjon fra oppløsningen ved gelfiltrering og rensing av den resulterende IL-2 fra fraksjonen ved reversfase-høy-ytelsesvæske-kromatografi.

6 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1,

2 eller 3, karakterisert ved at trinn (d) gjennomføres ved: (i) ekstrahering av IL-2 fra den vandige oppløsning fra (c) med 2-butanol eller 2-metyl-2-butanol; (ii) syreutfelling av IL-2 fra ekstrakten; og (iii) rensing av syreutfelt IL-2 ved gelfiltrering.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at produktet fra trinn (d) etter trinn (d) oksyderes og at det resulterende oksyderte produkt renses ved reversfase-høy-yteIsesvæskekromatografi.

8. Renset, rekombinant interleukin-2 (IL-2)-preparat med et IL-2-innhold på minst ca. 95%, bestemt ved reduserende SDS-PAGE-analyse, et endotoksin-innhold på mindre enn ca.

0,1 ng/mg IL-2 og i det vesentlige fritt for pyrogene stoffer, bestemt ved U.S.P.-kanin-pyrogenprøven i en dosering på 5

3,3 x 10 U/kg.

9. Renset, rekombinant IL-2-preparat ifølge krav 8, karakterisert ved at IL-2-innholdet er større enn ca. 98%, bestemt ved reduserende SDS-PAGE.

10. Rekombinant IL-2-preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 8 eller 9, karakterisert ved at dette IL-2 er des-Ala Ser,_c IL-2. IZd