JPH08332089A - 精製された変異型インターロイキン−2組成物 - Google Patents
精製された変異型インターロイキン−2組成物Info
- Publication number
- JPH08332089A JPH08332089A JP8143485A JP14348596A JPH08332089A JP H08332089 A JPH08332089 A JP H08332089A JP 8143485 A JP8143485 A JP 8143485A JP 14348596 A JP14348596 A JP 14348596A JP H08332089 A JPH08332089 A JP H08332089A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sds
- solution
- protein
- hplc
- extraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 エンドトキシン及び発熱物質を含有しない変
異型インターロイキン−2組成物の提供。 【解決手段】 還元SDS−PAGE分析によって決定
された少なくとも約95%のdes−Ala Ser
125 IL−2含有量、約0.1ng/mgのIL−2よりも
少ないエンドトキシン含有量を有しそして3.3×10
5 u/kgの投与量でのU.S.P.ウサギ発熱原試験に
よって決定した場合発熱物質を実質的に含有しない精製
されたdes−Ala Ser125 IL−2組成物。
異型インターロイキン−2組成物の提供。 【解決手段】 還元SDS−PAGE分析によって決定
された少なくとも約95%のdes−Ala Ser
125 IL−2含有量、約0.1ng/mgのIL−2よりも
少ないエンドトキシン含有量を有しそして3.3×10
5 u/kgの投与量でのU.S.P.ウサギ発熱原試験に
よって決定した場合発熱物質を実質的に含有しない精製
されたdes−Ala Ser125 IL−2組成物。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】この発明は生化学工学の分野
に属す。さらに詳しくは、この発明は、エンドトキシン
及び発熱物質を含有しない変異型インターロイキン−2
に関するものである。
に属す。さらに詳しくは、この発明は、エンドトキシン
及び発熱物質を含有しない変異型インターロイキン−2
に関するものである。
【0002】
【従来の技術】天然のヒトIL−2は、抗原、マイトジ
ン、及び同種抗原により刺激された赤血球ロゼット陽性
T細胞によって産生される抗原−非特異な、遺伝的に制
限されない可溶性因子である。それは公表された分子量
約13,000〜17,000ダルトン〔S.ギルそし
てJ.ワトソン,ジャーナル オブイクスペリメンタル
ン、及び同種抗原により刺激された赤血球ロゼット陽性
T細胞によって産生される抗原−非特異な、遺伝的に制
限されない可溶性因子である。それは公表された分子量
約13,000〜17,000ダルトン〔S.ギルそし
てJ.ワトソン,ジャーナル オブイクスペリメンタル
【0003】メソッド(S. Gillis and J. Watson, J E
xp Med)(1980)159:1709〕及び約pH6〜
8.5の範囲等電点を有するタンパク質である。ヒトI
L−2は、人間の末梢血液単核細胞又はマウス胞腺細胞
の増殖反応を高める事、細菌、寄生体、菌類、原生動
物、及びビールスなどの感染に対するヒト及び動物の免
疫反応を高める事、並びに絶え間ないT−細胞系の増殖
を支持する事などを含む多くのイン−ビトロ及びイン−
ビボ効果をもっている。
xp Med)(1980)159:1709〕及び約pH6〜
8.5の範囲等電点を有するタンパク質である。ヒトI
L−2は、人間の末梢血液単核細胞又はマウス胞腺細胞
の増殖反応を高める事、細菌、寄生体、菌類、原生動
物、及びビールスなどの感染に対するヒト及び動物の免
疫反応を高める事、並びに絶え間ないT−細胞系の増殖
を支持する事などを含む多くのイン−ビトロ及びイン−
ビボ効果をもっている。
【0004】アミノ酸125位のシステイン残基がセリ
ンに置き換えられておりそして/又は最初のアラニンが
取り除かれているIL−2、及びIL−2ムテイン(M
uteins)は遺伝子工学技法によって微生物的に製
造されている。微生物的に産生されたIL−2はグリコ
シル化されておらず、そして微生物によって還元された
状態で産生される。精製されそして酸化された時、これ
らの微生物的に産生されたIL−2及びIL−2ムテイ
ンは天然のヒトIL−2に匹敵する活性を現す。
ンに置き換えられておりそして/又は最初のアラニンが
取り除かれているIL−2、及びIL−2ムテイン(M
uteins)は遺伝子工学技法によって微生物的に製
造されている。微生物的に産生されたIL−2はグリコ
シル化されておらず、そして微生物によって還元された
状態で産生される。精製されそして酸化された時、これ
らの微生物的に産生されたIL−2及びIL−2ムテイ
ンは天然のヒトIL−2に匹敵する活性を現す。
【0005】T細胞から天然のIL−2を精製するため
の方法は次のような出版物に詳述されている;ワトソ
ン,J.,等、ジャーナル オブ イクスメンタル メ
ソド(J Exp Med )(1979)150:849−86
1;ギル,S.,等、ジャーナル オブ イミュノロジ
イ(J Immunology) (1980)124:1954−1
962;モチヅキ,D.Y.,等、ジャーナル オブ
イミュノロジカル メソド(J Immun Meth)(198
0)39:185−201;ウエルト,K.等、ジャー
ナル オブ イクスペリメンタル メソド(J Exp Med)
(1982)156:454−464;及びヨーロッパ
特許出願83103582.9(1983年の10月2
6日に第92163号として公表された)及び8340
0938.3(1983年11月16日に第94317
号として公表された)。一般的に、これらの方法は、硫
酸アンモニウムにより培養上清液からタンパク質を沈殿
させそれからクロマトグラフィック分別することを含ん
でいる。
の方法は次のような出版物に詳述されている;ワトソ
ン,J.,等、ジャーナル オブ イクスメンタル メ
ソド(J Exp Med )(1979)150:849−86
1;ギル,S.,等、ジャーナル オブ イミュノロジ
イ(J Immunology) (1980)124:1954−1
962;モチヅキ,D.Y.,等、ジャーナル オブ
イミュノロジカル メソド(J Immun Meth)(198
0)39:185−201;ウエルト,K.等、ジャー
ナル オブ イクスペリメンタル メソド(J Exp Med)
(1982)156:454−464;及びヨーロッパ
特許出願83103582.9(1983年の10月2
6日に第92163号として公表された)及び8340
0938.3(1983年11月16日に第94317
号として公表された)。一般的に、これらの方法は、硫
酸アンモニウムにより培養上清液からタンパク質を沈殿
させそれからクロマトグラフィック分別することを含ん
でいる。
【0006】1984年5月22日に発行された米国特
許第4,450,103号及びダーインク,R.等、ネ
イチュア(Nature)(1980)287:193−19
7にはIFN−β生産性E.コライ(E.Coli)か
らIFN−βを回収する為の方法が詳述されている。前
記特許はIFN−βを2−ブタノール又は2−メチル−
2−ブタノールにより細胞物質から抽出する方法を詳述
している。
許第4,450,103号及びダーインク,R.等、ネ
イチュア(Nature)(1980)287:193−19
7にはIFN−β生産性E.コライ(E.Coli)か
らIFN−βを回収する為の方法が詳述されている。前
記特許はIFN−βを2−ブタノール又は2−メチル−
2−ブタノールにより細胞物質から抽出する方法を詳述
している。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、エンドトキ
シン及び発熱物質を含有しない、変異型インターロイキ
ン−2を提供するものである。
シン及び発熱物質を含有しない、変異型インターロイキ
ン−2を提供するものである。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記の課題を
解決するため、還元SDS−PAGE分析によって決定
された少なくとも約95%のdes−Ala Ser
125 IL−2含有量、約0.1ng/mgのIL−2よりも
少ないエンドトキシン含有量を有しそして3.3×10
5 u/kgの投与量でのU.S.P.ウサギ発熱原試験に
よって決定した場合発熱物質を実質的に含有しない精製
されたdes−Ala Ser125 IL−2組成物を提
供する。この組成物は、例えば次の方法により製造する
ことができる。
解決するため、還元SDS−PAGE分析によって決定
された少なくとも約95%のdes−Ala Ser
125 IL−2含有量、約0.1ng/mgのIL−2よりも
少ないエンドトキシン含有量を有しそして3.3×10
5 u/kgの投与量でのU.S.P.ウサギ発熱原試験に
よって決定した場合発熱物質を実質的に含有しない精製
されたdes−Ala Ser125 IL−2組成物を提
供する。この組成物は、例えば次の方法により製造する
ことができる。
【0009】(a)微生物の細胞膜の破壊; (b)ケイオトロピック剤の水性溶液による破壊物の抽
出; (c)IL−2と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤
の水溶液(この溶液は還元剤を含有する)による、抽出
混合物の固相中のIL−2の可溶化;及び (d)還元剤の存在下での(c)で得られる溶液からの
IL−2の分離。 この方法の好ましい態様において、ケイオトロピック剤
は抽出混合物中約3.5M〜約4.5Mの濃度の尿素で
あり、可溶化剤はドデシル硫酸ナトリウム(SDS)又
はナトリウムラウリルサルコシン(サルコシル)であ
り、可溶化されたIL−2は2−ブタノール又は2−メ
チル−2−ブタノールによりさらに抽出されそして最終
分離はゲル濾過によって行なわれ、そして得られたサイ
ズ画分された生成物は酸化され、そして酸化された生成
物は逆相高速液体クロマトグラフィ(RP−HPLC)
によって精製される。
出; (c)IL−2と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤
の水溶液(この溶液は還元剤を含有する)による、抽出
混合物の固相中のIL−2の可溶化;及び (d)還元剤の存在下での(c)で得られる溶液からの
IL−2の分離。 この方法の好ましい態様において、ケイオトロピック剤
は抽出混合物中約3.5M〜約4.5Mの濃度の尿素で
あり、可溶化剤はドデシル硫酸ナトリウム(SDS)又
はナトリウムラウリルサルコシン(サルコシル)であ
り、可溶化されたIL−2は2−ブタノール又は2−メ
チル−2−ブタノールによりさらに抽出されそして最終
分離はゲル濾過によって行なわれ、そして得られたサイ
ズ画分された生成物は酸化され、そして酸化された生成
物は逆相高速液体クロマトグラフィ(RP−HPLC)
によって精製される。
【0010】
【発明の実施の形態】この明細書において“IL−2”
という語は(a)天然のヒトインターロイキン−2の遺
伝子により、又は、天然のヒトインターロイキン−2の
アミノ酸配列と少なくとも実質的に同一であるようなア
ミノ酸配列をもつタンパク質をコードするヒトインター
ロイキン−2遺伝子の変形体により形質転換させられた
微生物によって産生され、そして、(b)天然のヒトイ
ンターロイキン−2と共通の生物学的活性をもつグリコ
シルされていないタンパク質を意味する。アミノ酸配列
の実質的な同一とは、配列が同一であるか又は合成タン
パク質と天然ヒトインターロイキン−2との間に不都合
な機能的相違を惹起しない1個もしくは複数個のアミノ
酸変化(欠失、付加、置換)によって異なっていること
を意味する。
という語は(a)天然のヒトインターロイキン−2の遺
伝子により、又は、天然のヒトインターロイキン−2の
アミノ酸配列と少なくとも実質的に同一であるようなア
ミノ酸配列をもつタンパク質をコードするヒトインター
ロイキン−2遺伝子の変形体により形質転換させられた
微生物によって産生され、そして、(b)天然のヒトイ
ンターロイキン−2と共通の生物学的活性をもつグリコ
シルされていないタンパク質を意味する。アミノ酸配列
の実質的な同一とは、配列が同一であるか又は合成タン
パク質と天然ヒトインターロイキン−2との間に不都合
な機能的相違を惹起しない1個もしくは複数個のアミノ
酸変化(欠失、付加、置換)によって異なっていること
を意味する。
【0011】そのようなタンパク質の例は1983年2
月3日に出願されたヨーロッパ特許出願8310103
5.0(1983年10月19日に公開第91539号
として公表)の中に、及び1982年12月22日に出
願されたヨーロッパ特許出願82307036.2(1
983年9月14日に第88195号として公開)の中
に詳述されているIL−2であり、1983年10月1
3日出願されたヨーロッパ特許出願83306221.
9(1984年5月30日第109748号として公
表)の中に詳述されているIL−2であり、そしてこの
出願の例の中に詳述されているIL−2である。
月3日に出願されたヨーロッパ特許出願8310103
5.0(1983年10月19日に公開第91539号
として公表)の中に、及び1982年12月22日に出
願されたヨーロッパ特許出願82307036.2(1
983年9月14日に第88195号として公開)の中
に詳述されているIL−2であり、1983年10月1
3日出願されたヨーロッパ特許出願83306221.
9(1984年5月30日第109748号として公
表)の中に詳述されているIL−2であり、そしてこの
出願の例の中に詳述されているIL−2である。
【0012】この明細書において“形質転換させられた
微生物”という語は天然のヒトインターロイキン−2活
性をもつタンパク質を産生するために遺伝学的に処理さ
れる微生物という意味である。形質転換された微生物の
例は前記のヨーロッパ特許出願88195,9153
9、及び109748並びにこの出願の例に詳述されて
いる。細菌はIL−2を生成する為の好ましい微生物で
ある。合成IL−2はまた適切に形質転換した酵母及び
哺乳動物細胞によっても作られる。E.コライが特別に
好ましい。
微生物”という語は天然のヒトインターロイキン−2活
性をもつタンパク質を産生するために遺伝学的に処理さ
れる微生物という意味である。形質転換された微生物の
例は前記のヨーロッパ特許出願88195,9153
9、及び109748並びにこの出願の例に詳述されて
いる。細菌はIL−2を生成する為の好ましい微生物で
ある。合成IL−2はまた適切に形質転換した酵母及び
哺乳動物細胞によっても作られる。E.コライが特別に
好ましい。
【0013】形質転換された微生物は、適切な増殖培地
の中で、典型的には680nmにおいて少なくとも約30
の光学濃度(OD)へ、そして好ましくは680nmにお
いて約20〜40の間のODへ増殖する。増殖培地の組
成は用いられる特定の微生物に依存するだろう。培地
は、微生物の栄養要求を満たす化合物を含むような水性
培地である。増殖培地は、炭素及び窒素、エネルギー
源、マグネシウム、カリウム及びナトリウムイオン並び
に場合によってはアミノ酸及びプリン及びピリミジン塩
基などを典型的に含んでいるだろう〔リィビュウ オブ
メディカル バイオロジイ(Review of Medical Biol
ogy )、ラング メディカル ハブリケーション、第1
4版80−95項(1980.)を参照のこと〕。
の中で、典型的には680nmにおいて少なくとも約30
の光学濃度(OD)へ、そして好ましくは680nmにお
いて約20〜40の間のODへ増殖する。増殖培地の組
成は用いられる特定の微生物に依存するだろう。培地
は、微生物の栄養要求を満たす化合物を含むような水性
培地である。増殖培地は、炭素及び窒素、エネルギー
源、マグネシウム、カリウム及びナトリウムイオン並び
に場合によってはアミノ酸及びプリン及びピリミジン塩
基などを典型的に含んでいるだろう〔リィビュウ オブ
メディカル バイオロジイ(Review of Medical Biol
ogy )、ラング メディカル ハブリケーション、第1
4版80−95項(1980.)を参照のこと〕。
【0014】trp−プロモーターを用いる発現ベクタ
ーにおいては、培地中のトリプトファン濃度は、IL−
2の発現が望まれる時点で制限的になるよう、注意して
制御されている。E.コライの為の増殖培地は当業界に
おいてよく知られている。培養物から細胞を収得した
後、もし必要ならば、濾過、遠心分離、又は他の常用の
方法によって、細胞を約20〜150mg/mlに、好まし
くは80〜100mg/ml(680nmで40〜300のO
D、好ましくは160〜200のOD)に濃縮する。
ーにおいては、培地中のトリプトファン濃度は、IL−
2の発現が望まれる時点で制限的になるよう、注意して
制御されている。E.コライの為の増殖培地は当業界に
おいてよく知られている。培養物から細胞を収得した
後、もし必要ならば、濾過、遠心分離、又は他の常用の
方法によって、細胞を約20〜150mg/mlに、好まし
くは80〜100mg/ml(680nmで40〜300のO
D、好ましくは160〜200のOD)に濃縮する。
【0015】濃縮に続いて微生物の細胞膜を破壊する。
破壊の主目的は次の抽出及び可溶化方法を促進する事で
ある。工程のこの段階でホモジニゼーション、超音波処
理、又はプレッシャーサイクリング法のような常用の細
胞破壊技法を使用する。好まれる方法はマントン−ガウ
リン ホモジナイザー(Monton-Gaulin Homogenizer)
による超音波処理又はホモジニゼーションである。
破壊の主目的は次の抽出及び可溶化方法を促進する事で
ある。工程のこの段階でホモジニゼーション、超音波処
理、又はプレッシャーサイクリング法のような常用の細
胞破壊技法を使用する。好まれる方法はマントン−ガウ
リン ホモジナイザー(Monton-Gaulin Homogenizer)
による超音波処理又はホモジニゼーションである。
【0016】破壊段階の終点は懸濁液の光学濃度によっ
て監視し、典型的には約65%〜約85%低下する。い
ずれにしても破壊は、元のままの細胞が次の可溶化段階
へ実質的に持ち越されないように、細胞のすべてを実質
的に破壊すべきである。破壊の前、もし必要ならば細胞
の残骸中に不溶性複合体としてIL−2タンパク質を保
持しながら、次の段階でE.コライタンパク質の除去を
促進するような水準に濃縮物の液体相のpHを調節する。
pHは適切な緩衝液を添加する事によってそのように調節
する。ほとんどの場合、約8〜約8.5の範囲内のpHが
用いられるだろう。
て監視し、典型的には約65%〜約85%低下する。い
ずれにしても破壊は、元のままの細胞が次の可溶化段階
へ実質的に持ち越されないように、細胞のすべてを実質
的に破壊すべきである。破壊の前、もし必要ならば細胞
の残骸中に不溶性複合体としてIL−2タンパク質を保
持しながら、次の段階でE.コライタンパク質の除去を
促進するような水準に濃縮物の液体相のpHを調節する。
pHは適切な緩衝液を添加する事によってそのように調節
する。ほとんどの場合、約8〜約8.5の範囲内のpHが
用いられるだろう。
【0017】破壊段階に続く回収工程中の段階は、IL
−2を還元状態で維持しながら、高収量で高レベルの純
度(好ましくは、少なくとも約95%及びさらに好まし
くは少なくとも約98%)に、E.コライタンパク質か
らIL−2を分離するために、まず第1に計画されてい
る。同時に、これらの精製方法は、組合わせにおいて、
最終生成物中に発熱性物質を患者への経腸投与の為に許
容しうると信じられている水準へ減少せしめる。
−2を還元状態で維持しながら、高収量で高レベルの純
度(好ましくは、少なくとも約95%及びさらに好まし
くは少なくとも約98%)に、E.コライタンパク質か
らIL−2を分離するために、まず第1に計画されてい
る。同時に、これらの精製方法は、組合わせにおいて、
最終生成物中に発熱性物質を患者への経腸投与の為に許
容しうると信じられている水準へ減少せしめる。
【0018】細胞を破壊した後、破壊物の液体相から粒
状物を分離しそして抽出の為の最適pHに緩衝された水性
媒体に再懸濁することができる。場合によってはこの段
階で粒状物を緩衝液によって洗浄し、この中に存在する
水溶性のE.コライタンパク質を除去することができ
る。いずれにしても、抽出にかけられる細胞懸濁液のタ
ンパク質濃度は普通、約5〜約60mg/ml、好ましくは
20〜40mg/mlの範囲内にある。
状物を分離しそして抽出の為の最適pHに緩衝された水性
媒体に再懸濁することができる。場合によってはこの段
階で粒状物を緩衝液によって洗浄し、この中に存在する
水溶性のE.コライタンパク質を除去することができ
る。いずれにしても、抽出にかけられる細胞懸濁液のタ
ンパク質濃度は普通、約5〜約60mg/ml、好ましくは
20〜40mg/mlの範囲内にある。
【0019】粒状の細胞性物質からのE.コライタンパ
ク質の抽出は破壊と同時に又は破壊の後に引き続いて実
施することができる。それは破壊に次ぐ分離された方法
として、実行するのが好ましい。抽出剤はケイオトロピ
ック剤(すなわち水素結合を解離しそしてタンパク質の
三次構造に影響を与える緩タンパク質変性剤)の水性溶
液である。抽出剤は、細胞残骸と関連する(それに含ま
れる又は結合している)IL−2の少なくとも実質的な
部分を残しながら細胞残骸からE.コライタンパク質の
大部分を選択的に取り除く。選択性は、IL−2の疎水
性によって、そしてタンパク質の等電点の近くのpHにお
いて還元され、不溶性の状態にそれがあるという事実に
よって、促進される。
ク質の抽出は破壊と同時に又は破壊の後に引き続いて実
施することができる。それは破壊に次ぐ分離された方法
として、実行するのが好ましい。抽出剤はケイオトロピ
ック剤(すなわち水素結合を解離しそしてタンパク質の
三次構造に影響を与える緩タンパク質変性剤)の水性溶
液である。抽出剤は、細胞残骸と関連する(それに含ま
れる又は結合している)IL−2の少なくとも実質的な
部分を残しながら細胞残骸からE.コライタンパク質の
大部分を選択的に取り除く。選択性は、IL−2の疎水
性によって、そしてタンパク質の等電点の近くのpHにお
いて還元され、不溶性の状態にそれがあるという事実に
よって、促進される。
【0020】この上、IL−2の実質的な部分は、イン
−ビボではE.コライの中に高いレベルで発現する他の
クローン化されたタンパク質がそうであったように有意
な大きさの含有体とに存在する。抽出剤の例は、尿素及
びグアニジニウムハイドロクロライド(SDSが可溶化
剤として使用される時にはグアニジニウムハイドロクロ
ライドを使用すべきではない)である。抽出混合物の中
のケイオトロピック剤の濃度は、使用される特定のケイ
オトロピック剤及び抽出混合物中の細胞性物の量に依存
する。
−ビボではE.コライの中に高いレベルで発現する他の
クローン化されたタンパク質がそうであったように有意
な大きさの含有体とに存在する。抽出剤の例は、尿素及
びグアニジニウムハイドロクロライド(SDSが可溶化
剤として使用される時にはグアニジニウムハイドロクロ
ライドを使用すべきではない)である。抽出混合物の中
のケイオトロピック剤の濃度は、使用される特定のケイ
オトロピック剤及び抽出混合物中の細胞性物の量に依存
する。
【0021】尿素の場合、25℃でのバッチ方法におい
ては約3.5M〜4.5M間の、好ましくは約4Mの濃
度(最終濃度)が使用されるだろう。もし抽出を長時間
連続的に基づいて行なう場合には、より低濃度を使用す
る事が望ましいであろう。一般に抽出において20℃〜
25℃の範囲の温度を使用し、便利には室温を使用する
であろう。典型的には溶液と粒状物質との間の接触を強
化する為に混合を使用し、そしてこのようにして細胞残
骸から非IL−2タンパク質を抽出するのに必要な時間
を短縮する。抽出工程の動力学的分析は、SDS−PA
GEを使用しながら、上清液について実施され、そして
抽出は15〜30分までに本質的に完了することが見出
された。
ては約3.5M〜4.5M間の、好ましくは約4Mの濃
度(最終濃度)が使用されるだろう。もし抽出を長時間
連続的に基づいて行なう場合には、より低濃度を使用す
る事が望ましいであろう。一般に抽出において20℃〜
25℃の範囲の温度を使用し、便利には室温を使用する
であろう。典型的には溶液と粒状物質との間の接触を強
化する為に混合を使用し、そしてこのようにして細胞残
骸から非IL−2タンパク質を抽出するのに必要な時間
を短縮する。抽出工程の動力学的分析は、SDS−PA
GEを使用しながら、上清液について実施され、そして
抽出は15〜30分までに本質的に完了することが見出
された。
【0022】抽出に続いて、混合物を固相と液体相に分
離する。次に還元剤及び可溶化剤を含む中性の水性緩衝
液と固相とを接解せしめることにより、固相中のIL−
2を選択的に可溶化する。疎水性のIL−2を溶解する
為に適切な疎水性−親水性のバランスを持つ表面活性剤
(洗剤)が使用される。10〜14個の炭素原子を持つ
アルカリ金属の硫酸塩化合物及びアルカリ金属のアルキ
ルサルコシネートが好ましい可溶化剤であり、SDS及
びサルコシルが特に好ましい。
離する。次に還元剤及び可溶化剤を含む中性の水性緩衝
液と固相とを接解せしめることにより、固相中のIL−
2を選択的に可溶化する。疎水性のIL−2を溶解する
為に適切な疎水性−親水性のバランスを持つ表面活性剤
(洗剤)が使用される。10〜14個の炭素原子を持つ
アルカリ金属の硫酸塩化合物及びアルカリ金属のアルキ
ルサルコシネートが好ましい可溶化剤であり、SDS及
びサルコシルが特に好ましい。
【0023】可溶化において使用される可溶化剤の量は
特定の可溶化剤に依存するだろう。SDS又はサルコシ
ルを使用する場合、SDS/サルコシルと固相部分との
好ましい割合は約0.5:1〜1.4:1である。可溶
化媒体はまた可溶化されたIL−2が有意な程度に酸化
されるのを防ぐ為に十分な量の還元剤を含んでいる。ジ
チオスレイトール(DTT)及び2−メルカプトエタノ
ールのようなタンパク質還元剤が使用される。培地中で
のDTTのような還元剤の濃度は普通、約5〜20mMの
間の範囲である。可溶化は典型的には固相と可溶化媒体
との間の接触を増す為に混合しながら、20℃〜25℃
の範囲の温度において実施されるだろう。より高い温度
は不所望なE.コライタンパク質を可溶化する。可溶化
は、サンプルを15分そのままの状態においたとき、又
は溶液が半透明に変わる時完全とみなされる。不溶性物
質は、可溶化を完了にした後分離される。
特定の可溶化剤に依存するだろう。SDS又はサルコシ
ルを使用する場合、SDS/サルコシルと固相部分との
好ましい割合は約0.5:1〜1.4:1である。可溶
化媒体はまた可溶化されたIL−2が有意な程度に酸化
されるのを防ぐ為に十分な量の還元剤を含んでいる。ジ
チオスレイトール(DTT)及び2−メルカプトエタノ
ールのようなタンパク質還元剤が使用される。培地中で
のDTTのような還元剤の濃度は普通、約5〜20mMの
間の範囲である。可溶化は典型的には固相と可溶化媒体
との間の接触を増す為に混合しながら、20℃〜25℃
の範囲の温度において実施されるだろう。より高い温度
は不所望なE.コライタンパク質を可溶化する。可溶化
は、サンプルを15分そのままの状態においたとき、又
は溶液が半透明に変わる時完全とみなされる。不溶性物
質は、可溶化を完了にした後分離される。
【0024】IL−2が可溶化された後、場合によって
は、IL−2は分子量がIL−2に非常に近い一定の汚
染物を特に、含んでいる追加のE.コライタンパク質を
取り除く為に2−ブタノール又は2−メチル−2−ブタ
ノールによって、還元条件下で水性溶液から抽出され
る。水性溶液及びブタノールが実質的に混和しない条件
下(たとえば0.05〜0.15の範囲でのイオン強
度)で行なわれる。有機抽出の実施において、水性溶液
のタンパク質濃度は、もし必要なら、約6mg/mlよりも
少なく、好ましくは約0.5〜4mg/mlに調整するのが
好ましい。還元状態は、還元剤(たとえばDTT)の存
在下で抽出を実施する事によって維持されている。ブタ
ノールは一般的に、約1:1〜約3:1(抽出物:水性
溶液)の範囲の体積比で、好ましくは約1:1で、可溶
化されたIL−2の水性溶液へ、加えられるであろう。
は、IL−2は分子量がIL−2に非常に近い一定の汚
染物を特に、含んでいる追加のE.コライタンパク質を
取り除く為に2−ブタノール又は2−メチル−2−ブタ
ノールによって、還元条件下で水性溶液から抽出され
る。水性溶液及びブタノールが実質的に混和しない条件
下(たとえば0.05〜0.15の範囲でのイオン強
度)で行なわれる。有機抽出の実施において、水性溶液
のタンパク質濃度は、もし必要なら、約6mg/mlよりも
少なく、好ましくは約0.5〜4mg/mlに調整するのが
好ましい。還元状態は、還元剤(たとえばDTT)の存
在下で抽出を実施する事によって維持されている。ブタ
ノールは一般的に、約1:1〜約3:1(抽出物:水性
溶液)の範囲の体積比で、好ましくは約1:1で、可溶
化されたIL−2の水性溶液へ、加えられるであろう。
【0025】抽出はバッチ又は連続の操作のもとに実施
することができる。温度は普通、20℃〜100℃の範
囲内でありまたpHは普通、約4〜9、好ましくは約5〜
6であるだろう。溶液とブタノールとの接触時間は臨界
的ではなく、そして数分といった程度の比較的短時間が
使用される。抽出が完了した後、水性相及びブタノール
相を分離しそしてIL−2をブタノール相から分離す
る。ブタノール相からIL−2を分離する為の好ましい
方法は酸沈殿法である。これは、有機相が溶解されるま
で(有機相の体積に対して約2〜3緩衝液体積)、pH
7.5の水性緩衝液へブタノール相を加える事によっ
て、そしてそれから、IL−2を沈殿させる為に、pHを
約5.5〜7.0、好ましくは6.0〜6.2へ下げる
事によって行われる。
することができる。温度は普通、20℃〜100℃の範
囲内でありまたpHは普通、約4〜9、好ましくは約5〜
6であるだろう。溶液とブタノールとの接触時間は臨界
的ではなく、そして数分といった程度の比較的短時間が
使用される。抽出が完了した後、水性相及びブタノール
相を分離しそしてIL−2をブタノール相から分離す
る。ブタノール相からIL−2を分離する為の好ましい
方法は酸沈殿法である。これは、有機相が溶解されるま
で(有機相の体積に対して約2〜3緩衝液体積)、pH
7.5の水性緩衝液へブタノール相を加える事によっ
て、そしてそれから、IL−2を沈殿させる為に、pHを
約5.5〜7.0、好ましくは6.0〜6.2へ下げる
事によって行われる。
【0026】工程の次の段階は、IL−2、及び抽出の
後に残留する、すべてのE.コライ汚染物を分離し、そ
して場合によっては可溶化剤から分離する事であるゲル
濾過クロマトグラフィ、RP−HPLC、又はゲル濾過
クロマトグラフィとRP−HPLCとの組合せが使用さ
れる。ゲル濾過クロマトグラフィは好ましくは、発熱性
成分及び、IL−2(IL−2は約15.5kdの分子量
を持つ)よりも高分子量もしくは低分子量のタンパク質
汚染物を取り除く2つの段階において実施される。
後に残留する、すべてのE.コライ汚染物を分離し、そ
して場合によっては可溶化剤から分離する事であるゲル
濾過クロマトグラフィ、RP−HPLC、又はゲル濾過
クロマトグラフィとRP−HPLCとの組合せが使用さ
れる。ゲル濾過クロマトグラフィは好ましくは、発熱性
成分及び、IL−2(IL−2は約15.5kdの分子量
を持つ)よりも高分子量もしくは低分子量のタンパク質
汚染物を取り除く2つの段階において実施される。
【0027】これらの汚染物からのIL−2の分離を可
能にする為に溶液を画分する事ができるゲルは商業的に
入手できる。セファクリルS−200は高分子成分を取
り除く為には好ましいゲルでありそしてセファデックス
G−25,G−75又はG−100ゲルは低分子量汚染
物を取り除く為に好ましい。ゲル濾過は典型的には、可
溶化剤約0.1%〜1.0%及び還元剤約1〜10mMを
含む緩衝溶液(pH5.5〜7.0)の中で行なわれるだ
ろう。カラムは、目的成分の適切な分離を許容する大き
さであるだろう。
能にする為に溶液を画分する事ができるゲルは商業的に
入手できる。セファクリルS−200は高分子成分を取
り除く為には好ましいゲルでありそしてセファデックス
G−25,G−75又はG−100ゲルは低分子量汚染
物を取り除く為に好ましい。ゲル濾過は典型的には、可
溶化剤約0.1%〜1.0%及び還元剤約1〜10mMを
含む緩衝溶液(pH5.5〜7.0)の中で行なわれるだ
ろう。カラムは、目的成分の適切な分離を許容する大き
さであるだろう。
【0028】RP−HPLCはゲル濾過に代わるもので
ある。またRP−HPLCは、分子量がIL−2に近
く、それゆえにゲル濾過によって完全に取り除く事がで
きないような分子を溶液から取り除く事ができる。さら
に、細菌性エンドトキシンのような汚染物もまたRP−
HPLCによって有効に取り除かれる。従って、RP−
HPLCは、また、ゲル濾過の後最終精製方法としても
用いられる。タンパク質の望ましい分離を与える支持体
(固定相)がRP−HPLCにおいて使用される。30
0オングストロームのポアーサイズの支持体であるC−
4,C−8、もしくはC−18が好まれる支持体の例で
ある。
ある。またRP−HPLCは、分子量がIL−2に近
く、それゆえにゲル濾過によって完全に取り除く事がで
きないような分子を溶液から取り除く事ができる。さら
に、細菌性エンドトキシンのような汚染物もまたRP−
HPLCによって有効に取り除かれる。従って、RP−
HPLCは、また、ゲル濾過の後最終精製方法としても
用いられる。タンパク質の望ましい分離を与える支持体
(固定相)がRP−HPLCにおいて使用される。30
0オングストロームのポアーサイズの支持体であるC−
4,C−8、もしくはC−18が好まれる支持体の例で
ある。
【0029】分離は、IL−2を溶液状態に保持する為
に約2.3以下、普通2.1〜2.3の酸性pHで行なわ
れる。これに関して、可溶化(ゲル濾過)からの溶液の
pHをこの範囲に調整するのが好ましいだろう。溶液はR
P−HPLCカラムの中へ負荷されそして固定相の上に
吸収される。酢酸又はトリフルオロ酢酸のような有機酸
及びプロパノール又はアセトニトリルのような有機溶媒
を含むグラジエント溶媒系がカラムからIL−2を溶出
するのに使用される。酢酸−プロパノール、トリフルオ
ロ酢酸−プロパノール、及びトリフルオロアセテック酸
−アセトナイトレイトが好ましい溶媒系である。IL−
2は酢酸−プロパノール系での約40%プロパノールに
おいて、トリフルオロ酢酸−プロパノール系での約50
%プロパノールにおいて、そしてトリフルオロ酢酸−ア
セトナイトリル系での約62%アセトナイトリルにおい
て溶出する。
に約2.3以下、普通2.1〜2.3の酸性pHで行なわ
れる。これに関して、可溶化(ゲル濾過)からの溶液の
pHをこの範囲に調整するのが好ましいだろう。溶液はR
P−HPLCカラムの中へ負荷されそして固定相の上に
吸収される。酢酸又はトリフルオロ酢酸のような有機酸
及びプロパノール又はアセトニトリルのような有機溶媒
を含むグラジエント溶媒系がカラムからIL−2を溶出
するのに使用される。酢酸−プロパノール、トリフルオ
ロ酢酸−プロパノール、及びトリフルオロアセテック酸
−アセトナイトレイトが好ましい溶媒系である。IL−
2は酢酸−プロパノール系での約40%プロパノールに
おいて、トリフルオロ酢酸−プロパノール系での約50
%プロパノールにおいて、そしてトリフルオロ酢酸−ア
セトナイトリル系での約62%アセトナイトリルにおい
て溶出する。
【0030】便宜上通常は、溶出液中の有機溶媒含有量
をIL−2が溶出する溶剤濃度より幾分低いレベルまで
急速に上昇せしめ、そして次に約0.1〜1.0%/分
の範囲でゆるやかなグラジエント変化を行なう。IL−
2がクロマトグラフィ処理から回収されるやいなや、そ
れは凍結乾燥され、そして還元剤(IL−2を還元状態
に保持する為)及び可溶化剤(それを溶液状態に保持す
る為)を含む中性の水性緩衝液の中へ再懸濁される。I
L−2はこの形においては安定しており、そしてさらに
それ以上の処理を行うため、及び利用される前に製剤化
する為に保存される。
をIL−2が溶出する溶剤濃度より幾分低いレベルまで
急速に上昇せしめ、そして次に約0.1〜1.0%/分
の範囲でゆるやかなグラジエント変化を行なう。IL−
2がクロマトグラフィ処理から回収されるやいなや、そ
れは凍結乾燥され、そして還元剤(IL−2を還元状態
に保持する為)及び可溶化剤(それを溶液状態に保持す
る為)を含む中性の水性緩衝液の中へ再懸濁される。I
L−2はこの形においては安定しており、そしてさらに
それ以上の処理を行うため、及び利用される前に製剤化
する為に保存される。
【0031】上記以外の好まれる方法は、ゲル濾過によ
って分離した後IL−2を酸化しそしてその酸化された
生成物をRP−HPLCによって、又はゲル濾過とそれ
に続くRP−HPLCとによって精製する方法である。
この方法は、ゲル濾過において残存している汚染物及び
不所望の酸化生成物の効果的な除去をもたらす。好まし
い酸化方法は、十分に還元された微生物的に産生された
合成タンパク質(このタンパク質は有用タンパク質と実
質的に同一のアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列は
複数のシステインを含有し、このシステインは該有用な
タンパク質中では分子内結合してシスチンを形成してい
る)を制御された態様で酸化し、こうしてシステインを
酸化して選択的にシスチンを形成する方法である。
って分離した後IL−2を酸化しそしてその酸化された
生成物をRP−HPLCによって、又はゲル濾過とそれ
に続くRP−HPLCとによって精製する方法である。
この方法は、ゲル濾過において残存している汚染物及び
不所望の酸化生成物の効果的な除去をもたらす。好まし
い酸化方法は、十分に還元された微生物的に産生された
合成タンパク質(このタンパク質は有用タンパク質と実
質的に同一のアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列は
複数のシステインを含有し、このシステインは該有用な
タンパク質中では分子内結合してシスチンを形成してい
る)を制御された態様で酸化し、こうしてシステインを
酸化して選択的にシスチンを形成する方法である。
【0032】この方法においては、十分に還元された、
微生物的に産生された合成タンパク質をo−ヨードソベ
ンゾエイトと反応せしめ、このo−ヨードソベンゾエイ
トは、前記のシステインのpKaよりも少なくとも約1
/2pHユニット低いpHにおいて水性媒体中で選択的にシ
ステインを酸化する。この場合、反応混合物中の合成タ
ンパク質の濃度は約5mg/mlよりも低くし、そしてタン
パク質に対するo−ヨードソベンゾエイトのモル比は、
反応の終期においてo−ヨードソベンゾエイトが過剰に
存在するという条件でもって、少なくとも化学量論的に
する。酸化された生成物のRP−HPLC精製は、還元
剤の非存在下及び上に記載したゲル濾過で用いたのと等
しいか又はそれより低い濃度での浄剤の存在下で、上に
記載した条件のもとで実施される。
微生物的に産生された合成タンパク質をo−ヨードソベ
ンゾエイトと反応せしめ、このo−ヨードソベンゾエイ
トは、前記のシステインのpKaよりも少なくとも約1
/2pHユニット低いpHにおいて水性媒体中で選択的にシ
ステインを酸化する。この場合、反応混合物中の合成タ
ンパク質の濃度は約5mg/mlよりも低くし、そしてタン
パク質に対するo−ヨードソベンゾエイトのモル比は、
反応の終期においてo−ヨードソベンゾエイトが過剰に
存在するという条件でもって、少なくとも化学量論的に
する。酸化された生成物のRP−HPLC精製は、還元
剤の非存在下及び上に記載したゲル濾過で用いたのと等
しいか又はそれより低い濃度での浄剤の存在下で、上に
記載した条件のもとで実施される。
【0033】クロマトグラフィ処理の後、IL−2の純
度は少なくとも約95%でありそして普通は少なくとも
約98%である。このひじょうに純粋な物質は、10
0,000ユニットIL−2活性につき約5ngよりも少
ないエンドトキシンを、普通約0.01ngよりも少ない
エンドトキシンを含む。
度は少なくとも約95%でありそして普通は少なくとも
約98%である。このひじょうに純粋な物質は、10
0,000ユニットIL−2活性につき約5ngよりも少
ないエンドトキシンを、普通約0.01ngよりも少ない
エンドトキシンを含む。
【0034】
【実施例】この発明方法はさらに次の例によって詳述す
る。これらの例はこの発明を限定することをなんら意図
するものではない。例1. IL−2は、プラスミドpLW1により形質転換
されたE.コライK−12種MM294(1983年8
月4日に受託番号39,405としてアメリカン タイ
プ カルチャー コレクション(American Type Cultur
e Collection)に寄託されている)から次のように回収
した。
る。これらの例はこの発明を限定することをなんら意図
するものではない。例1. IL−2は、プラスミドpLW1により形質転換
されたE.コライK−12種MM294(1983年8
月4日に受託番号39,405としてアメリカン タイ
プ カルチャー コレクション(American Type Cultur
e Collection)に寄託されている)から次のように回収
した。
【0035】E.コライを次のような増殖培地を用いて
発酵器の中で増殖せしめた。 (NH4 )2 SO4 150mM KH2 PO4 21.6mM Ca3 サイトレート 1.5mM ZnSO4 ・7H2 O 30mM MnSO4 ・H2 O 30mM CuSO4 ・5H2 O 1mM pHはオートクレーブ殺菌した2.5Nの水酸化ナトリウ
ムにより6.5に調整した。
発酵器の中で増殖せしめた。 (NH4 )2 SO4 150mM KH2 PO4 21.6mM Ca3 サイトレート 1.5mM ZnSO4 ・7H2 O 30mM MnSO4 ・H2 O 30mM CuSO4 ・5H2 O 1mM pHはオートクレーブ殺菌した2.5Nの水酸化ナトリウ
ムにより6.5に調整した。
【0036】無菌の付加物(オートクレーブの後) MgSO4 ・7H2 O 3mM FeSO4 100μM L−トリプトファン 14mg/l サイアミン−HCl 20mg/l グルコース 5g/l テトラサイクリン 5mg/l エタノール(任意に) 2% カガミノ酸 2% ダウ コーンニング アンティフォーム B(Dow Corn
ing Antifoam B)の20%溶液、グルコースの50%溶
液及び5Nの水酸化カリウムを必要に応じ添加した。
ing Antifoam B)の20%溶液、グルコースの50%溶
液及び5Nの水酸化カリウムを必要に応じ添加した。
【0037】発酵槽のpHを5Nの水酸化カリウムで6.
8に維持した。残留グルコースは5〜10g/lの間
に、溶存酸素は40%に、そして温度は37±1℃に維
持した。カガミノ酸(20%貯蔵溶液)をOD680 が約
10である時添加した。OD680 が約20に達した後3
時間で収得を行なった。収得された材料を中空繊維(Ho
llowfiber )濾過及び/又は遠心分離によって濃縮し
た。20〜40g(温重量)の濃縮物を、20mMのTr
is及び1mMのエチレンデアミン四酢酸(EDTA)
(8.1〜8.5のpH)の溶液(Tris/EDTA緩
衝液)200ml中に再懸濁した。
8に維持した。残留グルコースは5〜10g/lの間
に、溶存酸素は40%に、そして温度は37±1℃に維
持した。カガミノ酸(20%貯蔵溶液)をOD680 が約
10である時添加した。OD680 が約20に達した後3
時間で収得を行なった。収得された材料を中空繊維(Ho
llowfiber )濾過及び/又は遠心分離によって濃縮し
た。20〜40g(温重量)の濃縮物を、20mMのTr
is及び1mMのエチレンデアミン四酢酸(EDTA)
(8.1〜8.5のpH)の溶液(Tris/EDTA緩
衝液)200ml中に再懸濁した。
【0038】この懸濁液を10分間3,000〜4,0
00×gで遠心分離し、上清液を除去し、そして固形物
は、4℃の200mlTris/EDTA緩衝液中へ再懸
濁した。この懸濁液を、音波処理機(ヒートシステム又
は、モデルW−375)の中へ入れ、そして出力設定
“9”、50%負荷でもってパルスしながら、大探針を
用いて4℃で45分間(終点=約85%のOD680 の低
下)音波処理した。これに代る破壊技法は、M−1に設
定してマントン−ガウリン(Manton-Gaulin )乳化機の
中に懸濁液を3回通すことである。細胞残骸物は、10
分間4,500×gで遠心分離する事によって破壊物か
ら分離した。
00×gで遠心分離し、上清液を除去し、そして固形物
は、4℃の200mlTris/EDTA緩衝液中へ再懸
濁した。この懸濁液を、音波処理機(ヒートシステム又
は、モデルW−375)の中へ入れ、そして出力設定
“9”、50%負荷でもってパルスしながら、大探針を
用いて4℃で45分間(終点=約85%のOD680 の低
下)音波処理した。これに代る破壊技法は、M−1に設
定してマントン−ガウリン(Manton-Gaulin )乳化機の
中に懸濁液を3回通すことである。細胞残骸物は、10
分間4,500×gで遠心分離する事によって破壊物か
ら分離した。
【0039】細胞残骸物を室温で60mlのTris/E
DTA緩衝液中に再懸濁しそしてTris/EDTA緩
衝液中8Mの尿素(スクワーズ/マン(Schwarz /Man
n)超純粋な)の同体積を5分以上の急速な攪拌でもっ
てこの懸濁液へ加えた(最終尿素濃度は4M)。15〜
30分間連続した低速攪拌の後、抽出された細胞残骸物
を回収する為に懸濁液を12,000×gで15分間遠
心分離した。もし固相が生じないなら、上清液を取り出
しそして同体積のTris/EDTA緩衝液を加えそれ
から混合物を再遠心分離する。
DTA緩衝液中に再懸濁しそしてTris/EDTA緩
衝液中8Mの尿素(スクワーズ/マン(Schwarz /Man
n)超純粋な)の同体積を5分以上の急速な攪拌でもっ
てこの懸濁液へ加えた(最終尿素濃度は4M)。15〜
30分間連続した低速攪拌の後、抽出された細胞残骸物
を回収する為に懸濁液を12,000×gで15分間遠
心分離した。もし固相が生じないなら、上清液を取り出
しそして同体積のTris/EDTA緩衝液を加えそれ
から混合物を再遠心分離する。
【0040】次に抽出された細胞残骸物を50mMのリン
酸ナトリウム(pH6.8)、1mMのEDTA及び10mM
のDTTの溶液9ml中に20℃で再懸濁する。20%の
SDS1mlをその懸濁液へ加え、そして懸濁液を5分間
激しく攪拌する。室温で10分間12,000×gのも
とで遠心分離する事により懸濁液から液相を回収する。
それから溶液中のIL−2が十分に還元されるのを確実
にする為に液相を15分間40℃に熱した。粗抽出物の
サンプルを15%のSDS−PAGEによって分析し
た。図1は、その分析(方法1Aの生成物)の濃度記録
計走査が示される。これにより抽出物が約37%のIL
−2を含有することが示される。
酸ナトリウム(pH6.8)、1mMのEDTA及び10mM
のDTTの溶液9ml中に20℃で再懸濁する。20%の
SDS1mlをその懸濁液へ加え、そして懸濁液を5分間
激しく攪拌する。室温で10分間12,000×gのも
とで遠心分離する事により懸濁液から液相を回収する。
それから溶液中のIL−2が十分に還元されるのを確実
にする為に液相を15分間40℃に熱した。粗抽出物の
サンプルを15%のSDS−PAGEによって分析し
た。図1は、その分析(方法1Aの生成物)の濃度記録
計走査が示される。これにより抽出物が約37%のIL
−2を含有することが示される。
【0041】IL−2をゲル濾過クロマトグラフィによ
って溶液から次のようにして分離した。溶液を50mMの
リン酸ナトリウム(pH6.8)、1mMのEDTA、1mM
のDTT、及び1%SDS中で使用される2.6×10
0cmS−200カラム上へ負荷した。カラム溶出液を4
mlずつの画分に集め、そしてこの画分のサンプルを15
%のSDS−PAGEミニゲル中でコマアスイ ブルー
(Coomassie blue)することにより分析した。最も少な
い汚染物(約35kd、16〜18kd、及び12kdの汚染
物を最小限にしながら)を含んでいる画分をプールし、
そして限外濾過(Amlcon YM 5 限外濾紙)によって5〜
10mlに濃縮した。
って溶液から次のようにして分離した。溶液を50mMの
リン酸ナトリウム(pH6.8)、1mMのEDTA、1mM
のDTT、及び1%SDS中で使用される2.6×10
0cmS−200カラム上へ負荷した。カラム溶出液を4
mlずつの画分に集め、そしてこの画分のサンプルを15
%のSDS−PAGEミニゲル中でコマアスイ ブルー
(Coomassie blue)することにより分析した。最も少な
い汚染物(約35kd、16〜18kd、及び12kdの汚染
物を最小限にしながら)を含んでいる画分をプールし、
そして限外濾過(Amlcon YM 5 限外濾紙)によって5〜
10mlに濃縮した。
【0042】この濃縮物をSDS濃度が1%ではなくむ
しろ0.1%である事を除いて上のように行なわれる
2.6×100cmG−100カラム上に負荷した。画分
をSDS−PAGEによって分析しそして最も純粋な画
分をプールした。図はクロマトグラフィにかけられた成
生物の濃度記録計走査を表わしている。生成物は98%
の純度であり、そしてリーミュラス アメボサイト ラ
イセート(limulus amebocyte lysate)分析〔アソシエ
イト オブ ケープ コッド,カンパニー.,ウッドホ
ール,マサチュウセッツ(Associates of Cape Cod, In
c., Woods Hole,MA)〕によって測定した場合、0.5n
gのエンドトキシン/100,000ユニットのIL−
2活性を含んでいるという事を分析は示した。このIL
−2のN−端アミノ酸配列は、最初のN−端アラニンが
足りないのを除いて生来の人間の分子と同じである。
しろ0.1%である事を除いて上のように行なわれる
2.6×100cmG−100カラム上に負荷した。画分
をSDS−PAGEによって分析しそして最も純粋な画
分をプールした。図はクロマトグラフィにかけられた成
生物の濃度記録計走査を表わしている。生成物は98%
の純度であり、そしてリーミュラス アメボサイト ラ
イセート(limulus amebocyte lysate)分析〔アソシエ
イト オブ ケープ コッド,カンパニー.,ウッドホ
ール,マサチュウセッツ(Associates of Cape Cod, In
c., Woods Hole,MA)〕によって測定した場合、0.5n
gのエンドトキシン/100,000ユニットのIL−
2活性を含んでいるという事を分析は示した。このIL
−2のN−端アミノ酸配列は、最初のN−端アラニンが
足りないのを除いて生来の人間の分子と同じである。
【0043】例2.可溶化剤として2%のSDSの代わ
りに2%のサーコシル(Sarcosyl)を用い、そ
してクロマトグラフィのカラム中にSDSの代わりにサ
ーコシルを用いて例1の方法をくり返した。図1は、可
溶化剤としてサーコシルを使用するこの粗抽出物(方法
1Bの粗抽出物)についての濃度記録計走査を表わして
いる。示されるように、SDSの代わりにサーコシルの
使用は、類似のIL−2収量(50%対60%)におい
て改示された純度(58%対37%)を生ぜしめた。
りに2%のサーコシル(Sarcosyl)を用い、そ
してクロマトグラフィのカラム中にSDSの代わりにサ
ーコシルを用いて例1の方法をくり返した。図1は、可
溶化剤としてサーコシルを使用するこの粗抽出物(方法
1Bの粗抽出物)についての濃度記録計走査を表わして
いる。示されるように、SDSの代わりにサーコシルの
使用は、類似のIL−2収量(50%対60%)におい
て改示された純度(58%対37%)を生ぜしめた。
【0044】例3.尿素抽出の前の段階まで例1の方法
を繰り返し、そして次に記載されているようにして、可
溶化し、そして浄化した。IL−2をRP−HPLCに
よって次のように溶液から分離した。溶液を0.1%の
トリフルオロ酢酸(TFA)中に10倍に希釈しそして
0.1%のTFAで平衡化された内部直径4.6mmで長
さが5cmのブロウニリー アクゥアポート(Brownlee A
quaport )RP−300カラムへ負荷した。IL−2を
0.1%のTFAを含む30%〜60%のアセトニトリ
ルのグラジエントにより45分にわたって溶出した。H
PLC後のIL−2活性の収率は80〜100%であっ
た。図2は、この生成物の銀色に着色されたSDS−P
AGE分析を表わしている。
を繰り返し、そして次に記載されているようにして、可
溶化し、そして浄化した。IL−2をRP−HPLCに
よって次のように溶液から分離した。溶液を0.1%の
トリフルオロ酢酸(TFA)中に10倍に希釈しそして
0.1%のTFAで平衡化された内部直径4.6mmで長
さが5cmのブロウニリー アクゥアポート(Brownlee A
quaport )RP−300カラムへ負荷した。IL−2を
0.1%のTFAを含む30%〜60%のアセトニトリ
ルのグラジエントにより45分にわたって溶出した。H
PLC後のIL−2活性の収率は80〜100%であっ
た。図2は、この生成物の銀色に着色されたSDS−P
AGE分析を表わしている。
【0045】例4.ゲル濾過のクロマトグラフィの前の
段階まで例1の方法をくり返した。可溶性の、浄化さ
れ、そして還元された物質を例1に記載されたように
0.1%のSDS中でのG−100クロマトグラフィに
かけた。IL−2のプールされたピーク画分を、例3で
記載されたようにRP−HPLCによってさらに精製し
た。得られた精製され、還元されたIL−2を酸化しそ
して例3で記載されたようにして、RP−HPLCにか
けた。
段階まで例1の方法をくり返した。可溶性の、浄化さ
れ、そして還元された物質を例1に記載されたように
0.1%のSDS中でのG−100クロマトグラフィに
かけた。IL−2のプールされたピーク画分を、例3で
記載されたようにRP−HPLCによってさらに精製し
た。得られた精製され、還元されたIL−2を酸化しそ
して例3で記載されたようにして、RP−HPLCにか
けた。
【0046】例5.G−100カラムの前の段階まで例
1の方法をくり返した。1Mの酢酸中プロパノールの溶
媒系を使用して例3の為の方法をくり返した。35%〜
60%プロパノールのグラディエントにより200分に
わたってIL−2を溶出した。カラムの寸法は内部直径
10mm×長さ30cmか内部直径48mm×長さ50cmのど
ちらかでありそしてこのカラムに固定相広孔シリカゲル
を充填した。使用された固定相広孔シリカゲルはVyd
ac TP214であった。生成物の純度及び収量は例
3のそれに匹敵した。
1の方法をくり返した。1Mの酢酸中プロパノールの溶
媒系を使用して例3の為の方法をくり返した。35%〜
60%プロパノールのグラディエントにより200分に
わたってIL−2を溶出した。カラムの寸法は内部直径
10mm×長さ30cmか内部直径48mm×長さ50cmのど
ちらかでありそしてこのカラムに固定相広孔シリカゲル
を充填した。使用された固定相広孔シリカゲルはVyd
ac TP214であった。生成物の純度及び収量は例
3のそれに匹敵した。
【0047】例6.0.1%のTFA中プロパノールの
溶媒系を使用して例3の方法をくり返した。IL−2
は、35%〜60%プロパノールのグラディエントによ
り120分にわたって溶出した。カラム及び支持体物質
は例5でのと同じであった。生成物の純度及び収量は例
3のそれに匹敵した。
溶媒系を使用して例3の方法をくり返した。IL−2
は、35%〜60%プロパノールのグラディエントによ
り120分にわたって溶出した。カラム及び支持体物質
は例5でのと同じであった。生成物の純度及び収量は例
3のそれに匹敵した。
【0048】例7.例1の方法は、E.コライ−生産性
IL−2がひとつの命名されたdes−Ala Ser
125 IL−2である事を除いて、くり返された。このI
L−2のアミノ酸配列は、125位でのシステインがセ
リンと交換されさらに最初のN−端アラニン残基が足り
ないという事において、天然の分子のアミノ酸配列と異
なる。このIL−2を産生するdes−Ala Ser
125 IL−2生産性E.コライの菌株は1984年の3
月6日に受託番号39,626号としてアメリキャンタ
イプ カルチャー コレクション(American Type Cult
ure Collection)に寄託された。
IL−2がひとつの命名されたdes−Ala Ser
125 IL−2である事を除いて、くり返された。このI
L−2のアミノ酸配列は、125位でのシステインがセ
リンと交換されさらに最初のN−端アラニン残基が足り
ないという事において、天然の分子のアミノ酸配列と異
なる。このIL−2を産生するdes−Ala Ser
125 IL−2生産性E.コライの菌株は1984年の3
月6日に受託番号39,626号としてアメリキャンタ
イプ カルチャー コレクション(American Type Cult
ure Collection)に寄託された。
【0049】例8.例1の方法をくり返した。但しプラ
スミドpLW55により形質転換されたE.コライK−
12株〔1983年の11月18日受託番号39,51
6としてアメリキャン タイプ カルチャー コレクシ
ョン(American Type Culture Collection)に寄託され
た〕からIL−2を回収した。この分子のアミノ酸配列
は、N−端メサイオニンを持ちさらに125位のシステ
インがセリンに取り換えられているという点において天
然の分子配列と異なっている。
スミドpLW55により形質転換されたE.コライK−
12株〔1983年の11月18日受託番号39,51
6としてアメリキャン タイプ カルチャー コレクシ
ョン(American Type Culture Collection)に寄託され
た〕からIL−2を回収した。この分子のアミノ酸配列
は、N−端メサイオニンを持ちさらに125位のシステ
インがセリンに取り換えられているという点において天
然の分子配列と異なっている。
【0050】例9.例1の一般的方法を使用しながらd
es−Ala Ser125 IL−2生産性E.コライを
増殖せしめ細胞を破壊し、そして細胞残骸を破壊物から
回収した。細胞残骸を、50mMのTrisと1mMのED
TAのpH8.5の緩衝液中に約1:4.5(w/v)の
割合で懸濁した。最終濃度が25mMになるようにDTT
を添加した。同じ緩衝液へ8Mの尿素を最終濃度が4M
になるようにかきまぜながらゆっくりと添加し、そして
次に室温で混合しながら30分間そのままに放置した。
30分後、不溶性残留物を遠心分離した。生じたペース
トを50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(1mMEDTAを
含有、pH7.6)中に再懸濁した。最終濃度が5%(w
/v)になるように固形SDSを添加することによりこ
の懸濁液を可溶化した。
es−Ala Ser125 IL−2生産性E.コライを
増殖せしめ細胞を破壊し、そして細胞残骸を破壊物から
回収した。細胞残骸を、50mMのTrisと1mMのED
TAのpH8.5の緩衝液中に約1:4.5(w/v)の
割合で懸濁した。最終濃度が25mMになるようにDTT
を添加した。同じ緩衝液へ8Mの尿素を最終濃度が4M
になるようにかきまぜながらゆっくりと添加し、そして
次に室温で混合しながら30分間そのままに放置した。
30分後、不溶性残留物を遠心分離した。生じたペース
トを50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(1mMEDTAを
含有、pH7.6)中に再懸濁した。最終濃度が5%(w
/v)になるように固形SDSを添加することによりこ
の懸濁液を可溶化した。
【0051】5%のSDS溶液を0.1Mのリン酸ナト
リウムにより2%のSDSになるよう薄めた。タンパク
質濃度を決定し、pHを8.5に調整し、そして50mMに
なるようDTT及び2mMになるようEDTAを添加し
た。この混合物をN2 の存在下で40℃に加熱すること
によりIL−2を還元した。この次に混合物を冷却しそ
してpHを5.0に調整した。
リウムにより2%のSDSになるよう薄めた。タンパク
質濃度を決定し、pHを8.5に調整し、そして50mMに
なるようDTT及び2mMになるようEDTAを添加し
た。この混合物をN2 の存在下で40℃に加熱すること
によりIL−2を還元した。この次に混合物を冷却しそ
してpHを5.0に調整した。
【0052】次にその溶液を1mMのDTTを含む2−ブ
タノールにより1:1の割合(v/v)において室温で
抽出した。滞留時間は2〜25分であった。抽出は、2
00ml/分の流速のもとに液−液相分離機で実施した。
有機抽出液を分離しそしてそのpHを水酸化ナトリウムに
より8.0に調整した。次に抽出液を、10mMのリン酸
ナトリウム、2mMのDTT、pH6中0.1%SDSにゆ
っくりと加えそして15〜20分間攪拌した。生じた沈
殿物を分離しそして生じたペーストをPBS中5%のS
DSに再懸濁した。その溶液を遠心分離によって透明に
しそして上のようにして還元した。還元の後、溶液を酢
酸によりpH5.5に調整した。
タノールにより1:1の割合(v/v)において室温で
抽出した。滞留時間は2〜25分であった。抽出は、2
00ml/分の流速のもとに液−液相分離機で実施した。
有機抽出液を分離しそしてそのpHを水酸化ナトリウムに
より8.0に調整した。次に抽出液を、10mMのリン酸
ナトリウム、2mMのDTT、pH6中0.1%SDSにゆ
っくりと加えそして15〜20分間攪拌した。生じた沈
殿物を分離しそして生じたペーストをPBS中5%のS
DSに再懸濁した。その溶液を遠心分離によって透明に
しそして上のようにして還元した。還元の後、溶液を酢
酸によりpH5.5に調整した。
【0053】この溶液を、S−200カラム及びG−2
5カラムを使用してゲル濾過によって精製した。これに
より得られた精製され、還元されたIL−2を酸化し、
そして酸化生成物を例3のようにしてG−25のクロマ
トグラフィ及びこれに続くRP−HPLCによって精製
した。こうして得られた精製された組換体IL−2生成
物は、還元SDS−PAGE分析によって定量した場合
約95%よりもより多くのIL−2を含有し、約0.1
ng/mgのIL−2よりも少ないエンドトキシンを含有し
そして3.3×105 u/kgの投与量でのU.S.Pウ
サギの発熱物質試験によって定量した場合実質的に発熱
物質を含んでいない。
5カラムを使用してゲル濾過によって精製した。これに
より得られた精製され、還元されたIL−2を酸化し、
そして酸化生成物を例3のようにしてG−25のクロマ
トグラフィ及びこれに続くRP−HPLCによって精製
した。こうして得られた精製された組換体IL−2生成
物は、還元SDS−PAGE分析によって定量した場合
約95%よりもより多くのIL−2を含有し、約0.1
ng/mgのIL−2よりも少ないエンドトキシンを含有し
そして3.3×105 u/kgの投与量でのU.S.Pウ
サギの発熱物質試験によって定量した場合実質的に発熱
物質を含んでいない。
【0054】前に示された様に、エンドトキシン含有量
は、100,000ユニットのIL−2活性に対して約
5ngよりも少なくそして好ましくは0.01ngよりも少
ない。典型的には、この発明の方法によって精製された
組換体IL−2生成物は上に示した様にエンドトキシン
及び発熱物質が実質的に無いという事に加えて、図3に
表わされているように、還元SDS−PAGE又はRP
−HPLCによって決定した場合98%よりも多くのI
L−2含有量を有した。
は、100,000ユニットのIL−2活性に対して約
5ngよりも少なくそして好ましくは0.01ngよりも少
ない。典型的には、この発明の方法によって精製された
組換体IL−2生成物は上に示した様にエンドトキシン
及び発熱物質が実質的に無いという事に加えて、図3に
表わされているように、還元SDS−PAGE又はRP
−HPLCによって決定した場合98%よりも多くのI
L−2含有量を有した。
【0055】例9に記載した方法の変法、例えば大規模
にIL−2を製造するために使用されるような変法が図
4に表示されている。図4に示された方法は、例9に記
載した方法と次のような点、すなわち(1)緩衝におけ
る小変化(2)RP−HPLCにおける酢酸−プロパノ
ール(例5)溶媒系の使用、並びに(3)後酸化稀釈/
透析濾過、S−200ゲル濾過、及び限外濾過方法など
の使用において異なる。図4に示されるような方法は、
いろいろな工夫によって修正される。たとえば2度目の
1%のSDS中でのS−200カラム通過に続いて、I
L−2溶液を1:10の割合で薄めて0.1%のSDS
濃度とし、そして次にpH7.5及び5ppm のSDSを含
む10mMのリン酸緩衝液に対して透析濾過する。そして
この溶液を適切な使用分量のために必要であれば濃縮す
る。
にIL−2を製造するために使用されるような変法が図
4に表示されている。図4に示された方法は、例9に記
載した方法と次のような点、すなわち(1)緩衝におけ
る小変化(2)RP−HPLCにおける酢酸−プロパノ
ール(例5)溶媒系の使用、並びに(3)後酸化稀釈/
透析濾過、S−200ゲル濾過、及び限外濾過方法など
の使用において異なる。図4に示されるような方法は、
いろいろな工夫によって修正される。たとえば2度目の
1%のSDS中でのS−200カラム通過に続いて、I
L−2溶液を1:10の割合で薄めて0.1%のSDS
濃度とし、そして次にpH7.5及び5ppm のSDSを含
む10mMのリン酸緩衝液に対して透析濾過する。そして
この溶液を適切な使用分量のために必要であれば濃縮す
る。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、ゲル濾過クロマトグラフィを最終精製
方法として使用するこの発明方法の2つの具体例の流れ
図を示している。方法1Aと表示された具体例は可溶化
剤としてSDSを使用し;方法1Bと表示された具体例
は可溶化剤としてサーコシルを使用する。この図は、こ
の方法におけるいろいろな段階での生成物のSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)分
析の濃度記録計走査を含んでいる。
方法として使用するこの発明方法の2つの具体例の流れ
図を示している。方法1Aと表示された具体例は可溶化
剤としてSDSを使用し;方法1Bと表示された具体例
は可溶化剤としてサーコシルを使用する。この図は、こ
の方法におけるいろいろな段階での生成物のSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)分
析の濃度記録計走査を含んでいる。
【図2】図2は例3の生成物のHPLCクロマトグラム
及びSDS−PAGE分析であり、電気泳動の結果を示
す図面代用写真である。
及びSDS−PAGE分析であり、電気泳動の結果を示
す図面代用写真である。
【図3】図3は例9の生成物のHPLCクロマトグラム
である。
である。
【図4】図4は微生物的に生成されるIL−2を処理す
る為の好ましい方法の流れ図である。
る為の好ましい方法の流れ図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェイムズ ウイリアム トムソン アメリカ合衆国,カリフォルニア 94706, アルバニー,タルボト アベニュ 811 (72)発明者 マイケル クニタニ アメリカ合衆国,カリフォルニア 94611, オークランド,ビュー ストリート 4314 (72)発明者 ケネス ウィルソン アメリカ合衆国,カリフォルニア 94598, ウォルナット クリーク,ロモンド ラン ド 2249 (72)発明者 ウォルフガング ヘルムト ハニシュ アメリカ合衆国,カリフォルニア 94611, オークランド,バルサム ウェイ 209, 6808
Claims (2)
- 【請求項1】 還元SDS−PAGE分析によって決定
された少なくとも約95%のdes−Ala Ser
125 IL−2含有量、約0.1ng/mgのIL−2よりも
少ないエンドトキシン含有量を有しそして3.3×10
5 u/kgの投与量でのU.S.P.ウサギ発熱原試験に
よって決定した場合発熱物質を実質的に含有しない精製
されたdes−Ala Ser125 IL−2組成物。 - 【請求項2】 前記のdes−Ala Ser125 IL
−2含有量が還元SDS−PAGEによって決定した場
合約98%よりも大であることを特徴とする請求項1に
記載の精製された組換体IL−2組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US594223 | 1984-03-28 | ||
US06/594,223 US4569790A (en) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60062195A Division JP2599903B2 (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-28 | Il−2の回収及び精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08332089A true JPH08332089A (ja) | 1996-12-17 |
JP2648587B2 JP2648587B2 (ja) | 1997-09-03 |
Family
ID=24378044
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60062195A Expired - Lifetime JP2599903B2 (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-28 | Il−2の回収及び精製方法 |
JP8143485A Expired - Lifetime JP2648587B2 (ja) | 1984-03-28 | 1996-05-15 | 精製された変異型インターロイキン−2組成物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60062195A Expired - Lifetime JP2599903B2 (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-28 | Il−2の回収及び精製方法 |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US4569790A (ja) |
EP (2) | EP0470586B1 (ja) |
JP (2) | JP2599903B2 (ja) |
KR (1) | KR850007083A (ja) |
AT (1) | ATE81674T1 (ja) |
AU (1) | AU592751B2 (ja) |
CA (1) | CA1341083C (ja) |
DE (2) | DE3588189T2 (ja) |
DK (1) | DK166324C (ja) |
ES (1) | ES8609362A1 (ja) |
FI (1) | FI94960C (ja) |
GR (1) | GR850741B (ja) |
HK (1) | HK1004474A1 (ja) |
IE (1) | IE59100B1 (ja) |
IL (1) | IL74733A (ja) |
IN (1) | IN162903B (ja) |
NO (1) | NO851235L (ja) |
NZ (1) | NZ211569A (ja) |
PH (1) | PH21012A (ja) |
PT (1) | PT80172B (ja) |
ZA (1) | ZA852347B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007526905A (ja) * | 2003-09-09 | 2007-09-20 | カイロン コーポレイション | 治療的ポリペプチドのクロマトグラフィー分離 |
Families Citing this family (88)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
US4853332A (en) * | 1982-10-19 | 1989-08-01 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins |
JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―2蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
CA1340853C (en) * | 1983-12-23 | 1999-12-21 | Hsiang-Fu Kung | Purification of recombinant interleukin-2 |
US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
US4656132A (en) * | 1984-03-28 | 1987-04-07 | Cetus Corporation | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria |
US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
DE3583880D1 (de) * | 1984-04-09 | 1991-10-02 | Takeda Chemical Industries Ltd | Stabile interleukin-2-zusammensetzung. |
US4908434A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Process for preparing purified interleukin-2 |
US4908433A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Uses of interleukin-2 |
US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
DE3500681A1 (de) * | 1985-01-11 | 1986-07-17 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur isolierung und reinigung von lymphokinen |
JPH0646957B2 (ja) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | インタ−ロイキン−2の製造方法 |
US5523215A (en) * | 1985-03-28 | 1996-06-04 | Chiron Corporation | Enhanced purification and expression of insoluble recombinant proteins |
US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
US5248769A (en) * | 1985-06-26 | 1993-09-28 | Cetus Oncology Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
US4762784A (en) * | 1985-07-15 | 1988-08-09 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermemtation process for the high level production of bovine growth hormone |
US4690915A (en) * | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
CA1297003C (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-10 | Jack H. Nunberg | Composition and method for treating animals |
US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
US4933433A (en) * | 1986-01-31 | 1990-06-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant interleukin-2 composition and process for making it |
US5425940A (en) * | 1986-04-09 | 1995-06-20 | Cetus Oncology Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
US4931544A (en) * | 1986-09-04 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions |
US4683293A (en) * | 1986-10-20 | 1987-07-28 | Phillips Petroleum Company | Purification of pichia produced lipophilic proteins |
US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
US4879374A (en) * | 1987-03-13 | 1989-11-07 | Immunex Corporation | Bovine interleukin-1β DNA sequence |
US5108911A (en) * | 1987-03-13 | 1992-04-28 | Immunex Corporation | Process for preparing bovine interleukin-Iβ |
CA1339757C (en) | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
JPS6463395A (en) | 1987-05-04 | 1989-03-09 | Oncogen | Oncostatin m and novel composition having antitumor activity |
WO1988008849A1 (en) * | 1987-05-11 | 1988-11-17 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
US4931543A (en) * | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
US5162507A (en) * | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
US4801691A (en) * | 1987-05-15 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for removing sodium dodecyl sulfate from sodium dodecyl sulfate solubilized protein solutions |
AU2257488A (en) * | 1987-07-29 | 1989-03-01 | Schering Biotech Corporation | Purification of human interleukin-4 expressed in escherichia coli |
JP2669859B2 (ja) * | 1987-08-04 | 1997-10-29 | 協和醗酵工業株式会社 | タンパク質の再活性化法 |
EP0337243A1 (en) * | 1988-04-14 | 1989-10-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for purifying recombinant human interleukin-2 |
FR2635527B1 (fr) * | 1988-07-28 | 1992-06-12 | Roussel Uclaf | Il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite, son procede d'obtention et son application comme medicament |
US4923967A (en) * | 1988-09-26 | 1990-05-08 | Eli Lilly And Company | Purification and refolding of recombinant proteins |
US5830452A (en) * | 1990-11-20 | 1998-11-03 | Chiron Corporation | Method for enhancing the anti-tumor therapeutic index of interleukin-2 |
DK0511964T3 (da) * | 1990-11-23 | 1998-06-02 | Roussel Uclaf | Fremgangsmåde til fremstilling af et cytokin protein med mindst en intramolekylær disulfidbro ved reduktion af det tilsvarende reducerede rekombinante protein ved en pH-værdi lavere end 5,0 |
US5939524A (en) * | 1991-12-09 | 1999-08-17 | The Scripps Research Institute | Platelet GPIII P1A1 and P1A2 epitopes, their preparation and use |
AU648214B2 (en) * | 1991-12-31 | 1994-04-14 | Lucky Limited | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc. |
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
US20030171292A1 (en) * | 1992-06-01 | 2003-09-11 | Creasey Abla A. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
US6063764A (en) * | 1992-06-01 | 2000-05-16 | Washington University & Chiron Corp. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
CA2147466A1 (en) * | 1992-10-20 | 1994-04-28 | Just P. J. Brakenhoff | Interleukin-6 receptor antagonists |
CN1051092C (zh) * | 1993-05-21 | 2000-04-05 | 沈阳军区后勤部军事医学研究所 | 一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2的方法 |
US5632983A (en) | 1994-11-17 | 1997-05-27 | University Of South Florida | Method for treating secondary immunodeficiency |
US5912327A (en) * | 1996-09-30 | 1999-06-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Method of purifying chemokines from inclusion bodies |
US6632425B1 (en) | 1997-03-20 | 2003-10-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine compositions |
EP1935431A3 (en) | 2000-05-15 | 2008-08-13 | Health Research, Inc. | Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2 |
WO2002079157A1 (en) | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Schering Corporation | Aryl oxime-piperazines useful as ccr5 antagonists |
BR0213292A (pt) * | 2001-10-15 | 2006-05-23 | Chiron Corp | tratamento de pneumonia severa por administração de inibidor da via de fator tecidual (tfpi) |
AU2002304965A1 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd | Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy |
CA2518823A1 (en) | 2003-03-24 | 2004-10-07 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Benzyl-pyridazinons as reverse transcriptase inhibitors |
EP1689888A2 (en) | 2003-10-23 | 2006-08-16 | Illumigen Biosciences Inc. | Detection of mutations in a gene associated with resistance to viral infection, oas1 |
EP2248830A1 (en) | 2003-11-04 | 2010-11-10 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Use of antagonist anti-CD40 antibodies for treatment of autoimmune and inflammatory diseases and organ transplant rejection |
CA2560103A1 (en) * | 2004-03-17 | 2005-11-24 | Chiron Corporation | Treatment of severe community-acquired pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
CU23297A1 (es) | 2004-11-16 | 2008-07-24 | Ct De Inmunologa A Molecular | Formulaciones inmunoterapã0/00uticas para la inducciã"n de autoanticuerpos bloqueadores de la uniã"n de interleucina-2 a su receptor. su uso en el tratamiento del cã ncer |
DE102005005542A1 (de) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Herstellung von Aldesleukin für die pharmazeutische Verwendung |
BRPI0617720A2 (pt) | 2005-10-19 | 2011-08-02 | Hoffmann La Roche | compostos inibidores de nnrt de fenil-acetamida, usos dos referidos compostos e composição farmacêutica que os contém |
RU2304586C1 (ru) * | 2006-03-27 | 2007-08-20 | Михаил Николаевич Смирнов | Препарат интерлейкина-2 и способ его получения |
RU2451676C2 (ru) | 2006-08-16 | 2012-05-27 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы |
RU2469032C2 (ru) | 2006-12-13 | 2012-12-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Производные 2-(пиперидин-4-ил)-4-фенокси- или фениламинопиримидина в качестве ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы |
MX2009012704A (es) | 2007-05-30 | 2009-12-08 | Hoffmann La Roche | Inhibidores de transcriptasa inversa de no nucleosidos. |
RU2495878C2 (ru) | 2007-12-21 | 2013-10-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Гетероциклические антивирусные соединения |
US20120036767A1 (en) * | 2008-08-04 | 2012-02-16 | Larach Mario C | Continuous cultivation, harvesting, and extraction of photosynthetic cultures |
RS61854B1 (sr) | 2010-11-12 | 2021-06-30 | Nektar Therapeutics | Konjugati il-2 dela i polimera |
US9428567B2 (en) | 2010-12-22 | 2016-08-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Antagonists of interleukin-2 receptor |
SG11201407812SA (en) | 2012-05-31 | 2014-12-30 | Agency Science Tech & Res | Methods for reducing levels of protein-contaminant complexes and aggregates in protein preparations by treatment with electropositive organic additives |
WO2015042707A1 (en) | 2013-09-24 | 2015-04-02 | Medicenna Therapeutics Pte Ltd | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof |
EP3134102B1 (en) | 2014-04-24 | 2019-07-03 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2 |
EP3204119B1 (en) | 2014-10-09 | 2021-06-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Multiple-variable il-2 dose regimen for treating immune disorders |
EP3641814A4 (en) | 2017-06-19 | 2021-06-23 | Medicenna Therapeutics Inc. | USES AND METHODS FOR IL-2 SUPERAGONISTS, AGONISTS, AND FUSIONS THEREOF |
US20200131555A1 (en) | 2017-07-11 | 2020-04-30 | Synthorx, Inc. | Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof |
KR102687649B1 (ko) | 2017-08-03 | 2024-07-26 | 신톡스, 인크. | 증식성 질환 및 감염성 질환의 치료를 위한 사이토카인 접합체 |
AU2018372167B2 (en) | 2017-11-21 | 2023-12-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Partial agonists of interleukin-2 |
EA202092489A1 (ru) | 2018-05-21 | 2021-03-16 | Нектар Терапьютикс | СЕЛЕКТИВНЫЙ СТИМУЛЯТОР Treg RUR20kD-IL-2 И РОДСТВЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ |
SG11202012299SA (en) * | 2018-06-13 | 2021-01-28 | Akron Biotechnology Llc | Method to prepare therapeutically active aldesleukin highly stable in liquid pharmaceutical compositions |
EP3923974A4 (en) | 2019-02-06 | 2023-02-08 | Synthorx, Inc. | IL-2 CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF |
US20220324932A1 (en) | 2019-06-20 | 2022-10-13 | CSPC Megalith Biopharmaceutical Co., Ltd. | Modified il-2 proteins, peg conjugates, and uses thereof |
MX2022008771A (es) | 2020-01-14 | 2022-10-07 | Synthekine Inc | Metodos y composiciones de muteinas de il2 sesgadas. |
CN111676261A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-18 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种高纯度重组白介素-2的制备工艺 |
CN111793124A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-10-20 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种去除重组白介素-2内毒素的方法 |
KR20240123817A (ko) | 2021-12-14 | 2024-08-14 | 넥타르 테라퓨틱스 | 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2를 위한 투여 계획 및 관련 조성물 |
Family Cites Families (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3897309A (en) * | 1974-02-15 | 1975-07-29 | Merck & Co Inc | Process for removing pyrogenic material from aqueous solutions |
JPS6030291B2 (ja) * | 1978-03-20 | 1985-07-16 | 森永乳業株式会社 | 人顆粒球の分化増殖を促進するhgi糖蛋白質、hgi糖蛋白質の製造法及びhgi糖蛋白質を含有する白血球減少症治療剤 |
IN150740B (ja) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
JPS55148098A (en) * | 1979-05-10 | 1980-11-18 | Toray Ind Inc | Concentration and purification of interferon |
CH648331A5 (de) * | 1979-07-31 | 1985-03-15 | Hoffmann La Roche | Homogenes fibroblasten-interferon und dessen herstellung. |
US4390623A (en) * | 1980-10-02 | 1983-06-28 | Hooper Trading Company | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
US4315852A (en) * | 1980-11-26 | 1982-02-16 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
US4448879A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-15 | Hooper Trading Company | High yield process for in vitro production of serum-free and mitogen-free interleukin-2 |
US4464355A (en) * | 1981-03-26 | 1984-08-07 | Hooper Trading Co. | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
US4401756A (en) * | 1981-04-14 | 1983-08-30 | Immunex Corporation | Process for preparing human interleukin 2 |
JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Il‐2をコードする新規伝令rnaの製造法 |
US4450103A (en) * | 1982-03-01 | 1984-05-22 | Cetus Corporation | Process for recovering human IFN-β from a transformed microorganism |
DE3377363D1 (en) * | 1982-03-31 | 1988-08-18 | Ajinomoto Kk | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
CA1341562C (en) * | 1982-03-31 | 2007-11-27 | Tadatsugu Taniguchi | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
US4778879A (en) * | 1982-04-20 | 1988-10-18 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Highly purified human interleukin 2 and method |
ATE37564T1 (de) * | 1982-04-20 | 1988-10-15 | Sloan Kettering Inst Cancer | Reinigung von interleukin-2. |
JPS58198293A (ja) * | 1982-05-12 | 1983-11-18 | Shionogi & Co Ltd | インタ−ロイキン等免疫調節因子の製造方法 |
US4490289A (en) * | 1982-09-16 | 1984-12-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous human interleukin 2 |
US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
US4462940A (en) * | 1982-09-23 | 1984-07-31 | Cetus Corporation | Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides |
DE3242851A1 (de) * | 1982-11-19 | 1984-05-24 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verfahren zur reinigung von menschlichen lymphokinen |
JPS59116231A (ja) * | 1982-12-13 | 1984-07-05 | スロ−ン−ケツタリング・インステイテユ−ト・フオ−・キヤンサ−・リサ−チ | 抗−インタ−ロイキン−2単クロ−ン抗体 |
US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
AU579089B2 (en) * | 1983-02-08 | 1988-11-17 | Biogen, Inc. | Human interleukin-2-like polypeptides |
IL71275A0 (en) * | 1983-03-21 | 1984-06-29 | Sparamedica Ag | Human interleukin-2-and its preparation |
GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
US4582799A (en) * | 1983-04-15 | 1986-04-15 | Damon Biotech, Inc. | Process for recovering nonsecreted substances produced by cells |
NZ208309A (en) * | 1983-06-01 | 1988-04-29 | Hoffmann La Roche | Recombinant leukocyte, fibroblast, or immune interferons (rifn-#a#, b or #g#) with one cys residue replaced |
WO1985000606A1 (en) * | 1983-07-19 | 1985-02-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Human il-2 and process for its preparation |
US4464295A (en) * | 1983-08-17 | 1984-08-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Simple and rapid method for extraction of proteins from bacteria |
US4476049A (en) * | 1983-09-20 | 1984-10-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the extraction of immune interferon |
GB8327880D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Ajinomoto Kk | Saccharomyces cerevisiae |
US4675383A (en) * | 1983-11-15 | 1987-06-23 | The Salk Institute For Biological Studies | Purification of T-cell growth factor |
JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―2蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
CA1340853C (en) * | 1983-12-23 | 1999-12-21 | Hsiang-Fu Kung | Purification of recombinant interleukin-2 |
US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
WO1985004328A1 (en) * | 1984-03-28 | 1985-10-10 | Cetus Corporation | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
DE3583880D1 (de) * | 1984-04-09 | 1991-10-02 | Takeda Chemical Industries Ltd | Stabile interleukin-2-zusammensetzung. |
US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
US4782139A (en) * | 1985-10-28 | 1988-11-01 | Eli Lilly And Company | Selective chemical removal of a protein amino-terminal residue |
US4787658A (en) * | 1986-07-29 | 1988-11-29 | Harris Jr John | Unibody bumper system |
US5156968A (en) * | 1988-06-24 | 1992-10-20 | Genentech, Inc. | Purified yeast ubiquitin hydrolase |
-
1984
- 1984-03-28 US US06/594,223 patent/US4569790A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-02-26 CA CA000475151A patent/CA1341083C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-25 IN IN220/CAL/85A patent/IN162903B/en unknown
- 1985-03-25 PH PH32035A patent/PH21012A/en unknown
- 1985-03-26 NZ NZ211569A patent/NZ211569A/en unknown
- 1985-03-26 DK DK135985A patent/DK166324C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-03-26 GR GR850741A patent/GR850741B/el unknown
- 1985-03-27 DE DE3588189T patent/DE3588189T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 EP EP91113235A patent/EP0470586B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 FI FI851231A patent/FI94960C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 PT PT80172A patent/PT80172B/pt unknown
- 1985-03-27 DE DE8585103649T patent/DE3586762T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 ES ES541608A patent/ES8609362A1/es not_active Expired
- 1985-03-27 IL IL74733A patent/IL74733A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 EP EP85103649A patent/EP0156373B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-27 NO NO851235A patent/NO851235L/no unknown
- 1985-03-27 AT AT85103649T patent/ATE81674T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 ZA ZA852347A patent/ZA852347B/xx unknown
- 1985-03-28 JP JP60062195A patent/JP2599903B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-28 IE IE79985A patent/IE59100B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 AU AU40467/85A patent/AU592751B2/en not_active Expired
- 1985-03-28 KR KR1019850002078A patent/KR850007083A/ko not_active Application Discontinuation
-
1992
- 1992-05-06 US US07/879,753 patent/US5419899A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-25 US US08/428,895 patent/US5614185A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-15 JP JP8143485A patent/JP2648587B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-04 HK HK98103767A patent/HK1004474A1/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007526905A (ja) * | 2003-09-09 | 2007-09-20 | カイロン コーポレイション | 治療的ポリペプチドのクロマトグラフィー分離 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2648587B2 (ja) | 精製された変異型インターロイキン−2組成物 | |
US4816440A (en) | Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection | |
US4604377A (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
US4992271A (en) | Formulation for lipophilic IL-2 proteins | |
US4748234A (en) | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts | |
US4931543A (en) | Process for recovering microbially produced interleukin-2 | |
JPH0696600B2 (ja) | 蛋白質の酸化方法 | |
EP0211835B1 (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 | |
US5643566A (en) | Formulation processes for lipophilic proteins | |
US4675387A (en) | Method for extracting protein with organic acid | |
JP2955294B2 (ja) | 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン‐2を回収する方法 | |
Russell-Harde et al. | The use of zwittergent 3-14 in the purification of recombinant human interferon-β ser17 (Betaseron) | |
JPS62209097A (ja) | 組換えヒトインタリユーキン−1αの精製法 | |
CA1283356C (en) | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |