JPS62209097A - 組換えヒトインタリユーキン−１αの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 文献によるとヒトインタリユーキン−１のα型およびβ
型をコードする２つの遺伝子が記載されテイル（例えば
Ｍａｒｃｈら、ＮａＬＬＩｒｅ３１５巻、６４１−６４
．７頁：１９８５年参照）。欧州特許申請公開Ｎｏ、２
００．９８６　（１９８６年１１月１２日公開、発明者
、Ｇｕｂｌｅｒら）は組換えヒトインタリユーキン−１
のクローニングおよび発現を記載しており、これは微生
物により生産したヒトインタリユーキン−１である。こ
の中で記載される生成方法は本蛋白質が宿主細菌細胞中
で不溶性のため問題があることを示している。この不溶
性の問題は蛋白質が適当な三次構造をとれない環境下で
高温度の蛋白質合成が起っているためと考えられている
。蛋白質三次構造形成の問題は細菌細胞内で封入体を形
成する結果となっている。このような封入体は尿素ヤグ
アニジン塩酸のような強い変性剤によってのみ可溶化さ
れる。

これらの強変性剤を用いた精製手段により精製した組換
えヒトインタリユーキン−１が得られている。しかし、
理由は完全に理解されていないが恐らく非生物環境下に
おける蛋白質の三次構造形成に［１連して、精製分子の
比活性はおよそ６×１０６単位／ＪＩｌ！Ｆを超えるこ
とはなかった。従って、本発明の目的は組換えヒトイン
タリユーキン−１、特に組換えヒトインタリユーキン−
１α、に関して目的の蛋白質を生物学的に適応した緩衝
系で精製、可溶化し、高い比活性を有する生成物を得る
ような精製工程を開発することであった。

本発明は組換えヒトインタリユーキン−１、特に組換え
ヒトインタリユーキン−１α、を生産するための改良法
に関するものであり、さらに詳しくは、第１図に示すア
ミノ酸配列を有するヒトインタリユーキン−１αを本質
的に均質蛋白質として、本質的に内毒素を含まず、高い
比活性、具体的には少なくともおよそ５×１０７単位／
ＩＩＩｇの比活性を有するヒトインタリユーキン−１α
の生産に関するものである。さらに、本発明は水沫によ
り生産される組換えヒトインタリユーキン−１に関する
もの、即ち、微生物により生産され、本質的に内［ｉを
含まず、本質的に均質であって少なくともおよそ５×１
０７単位／ＩＩｇの比活性を有するヒトインタリユーキ
ン−１に関するものである。

該ヒトインタリユーキン−１は病気の治療および予防の
ための医薬品として用いることが出来る。

さらに本発明は、該ヒトインタリユーキン−１を含有す
る医薬品組成物に関するものである。本技術に精通して
いる者には明かな通り、本発明のヒトインタリユーキン
−１はＮ−末端にメチオニン残基を含むこともある。

本発明の重要な局面は、細菌宿主、例えばＥ。

Ｃ０１ｉ、中で発現される組換えヒトインタリユーキン
−１は可溶性細胞質画分に於ける比活性が尿素抽出した
封入体の比活性よりかなり低いにも拘らずその大部分が
可溶性細胞質画分に存在するという偶然の発見から出て
きたものである。その上、ヒトインタリユーキン−１が
細胞質に存在するということのみでなく、それが簡単な
二段階または三段階のカラムクロマトグラフィー分離工
程により細胞質から精製できることを発見した。

本発明の方法の第一段階として、ヒトインタリユーキン
−１をコードする挿入遺伝子の発現を起す選択的な条件
下で培養した形質転換微生物宿主を破砕して可溶化画分
を得、それを従来発現したヒトインタリユーキン−１（
γＨＩＬ−１）の大部分が存在すると信じられていた封
入体を含む細胞不溶性物質と分離する。

細胞の破砕は本技術で良く知られる技術、例えばりゾヂ
ーム処理のような酵素分解の利用、ボールミルや類似の
道具、或いは超音波処理など用いる物理的破砕により行
なうことができる。可溶性細胞質画分の不溶性物質から
の分離は遠心分離、例えば２０．ＯＯＯｘｇで約３０分
間で最も便宜的に実施できる。可溶性γｌ−１１ＬＬ　
−１を含む細胞質画分を含有する上澄液は続いてゲル濾
過にかけ、Ｗ！ｌｉ塩溶液で溶出される。この工程に適
したカラムｔ、！ｔ７アクＩｌしく　　５ｅｐｈａｃｒ
ｙｌ■Ｈ）　３−２００カラム（ファルマシア・ファイ
ンケミカルスＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）である。

該緩％１ｍ溶液、好ましくはトリス−塩酸、ｐＩＩ８．
０、緩衝ＮａＣ１溶液、に蛋白質安定化剤として例えば
エチレンジアミンテトラアセティツクアシッド（ＥＤＴ
Ａ）を添加したものに含有されるゲル濾過クロマトグラ
フィーの分画につき測定をする。生物活性画分を集め、
緩衝塩溶液で希釈して本発明の第二段階に用いる。

クロマトグラフィー分画の測定は本技術でよく知られる
方法により行なう事が出来る。適当な測定はＨｉｚｅｌ
ら、Ｊ、　［ｍｍｕｕｏｌ、　１２０巻、１４９７−１
５０８頁（１９７８年）により記載されるネズミ胸腺［
ｌ胞増殖測定（ＬＡＦアツヒイ）である。

第二段階の工程はイオン交換クロマトグラフィー、好ま
しくはＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−−ｔ−）レロース力ラム、で
あり、緩衝液中で塩濃度勾配を用いたステップである。

好ましい実ｔＭ態様としては、該勾配が２５ｍＨトリス
ー塩酸、ｐＨ１３゜１の緩衝液中０−８００ｍ０−８Ｏ
０！の勾配であるものである。

大規模な精製工程では、細胞残漬を除去するための遠心
分離の後、細胞質画分中の核酸をストレプトマイシンｅ
［塩による沈澱で除去する。上澄液の１０分の１８の１
０％（Ｗ／Ｖ）ストレプトマイシンｌａｌ！ａｌ！！塩
酸を添加する。ｐＨは１Ｎ−酢酸にて６．２から６．４
に保持する。【Ｊん濁液を２０゜ｏｏｏｘｙで３０分間
遠心分離する。得られる上澄液中の蛋白質を硫酸アンモ
ニウムを６０％飽和に加えて濃縮する。けん濁液を２０
，０ＯＯｘｙで３０分間遠心分離し、得られるベレット
を最小ＦＩｔＯ）　２５　ｍＨｌ−ＩＪ　ス塩酸、ｐＨ
（８，０，８００１！ｌＮＮａＣｌに溶解する。

場合によっては、特に大規模処理に於いて、この時点で
内、毒素の債が許容量を超えている。従って必要に応じ
て内毒素を除去するために第三ステップを導入する。こ
の目的のために周知の方法が用いられるが、本発明によ
る好ましい手段としてはＤＥＡＥ−カラムクロマドグラ
フイーからの生成物溶液（２５ＩＩＨトリス塩１：１）
１１８．１で１＝１（ｖ／ｖ）に希釈）をブトキシゲル
（口ｅｔｏｘｉ　Ｇｅｔ”）（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　１米国イリノイ州ロックフ
ォード）を充填したカラムを製造元の指示に従って通過
させるものである。

本発明による精製ヒトインタリユーキン−１はそれ自体
知られる方法により例えば病原体に対する宿主防御応答
を改善するとか、ワクチンアジュバントとして作用する
とか、癌疾患に対する宿主防御を高めるなどして、患者
の免疫系を促進するための医薬品として用いることが出
来る。他の臨床利用としてはｉ！維芽ＩＩＩ胞の増殖を
促進することにより傷の治癒の助長および重病な、蛋白
質栄養失調患名の回復の改善などがある。

本発明のヒトインタリユーキン−１は上述の臨床利用の
目的で瀉血動物に投与される。投与は静注、皮下注射あ
るいは筋肉注射のような非経口投与など従来から知られ
る方法で行なう。必要な投与量は明かに治療しようとす
る状ｒフ、その型温度、治療期間および投与方法などに
より異なる。医薬品として使用する適当な投与剤はヒト
インタリユーキン−１を滅菌濾過して凍結乾燥し、従来
の方法により使用前に再構成して得られる。さらに緩衝
液、安定剤、殺菌剤および他の医薬品非経口剤によく用
いられる添加剤などを加えることも技術の範囲内である
。

□　実施例１ 組換えヒトインタリユーキン−１α（γＨＩ　１−−１
αと記す：このアミノ酸配列は第１図に示す。）をコー
ドする遺伝子を有する発現ベクターで形質転換したＥ、
ｃｏｉｉ　　ＭＣ１０６１株（ＡＴＣＣＮｏ、５３３３
８）を用いて７ＨＩＬ−１αを製造した。このＥ、ｃｏ
ｊ！ｉ　　ＭＣ１０６１株はプラスミドｐＲＫ２４８ｃ
　Ｉｔｓ（ＡＴＣＣＮｏ、３３７６６）を含有し、かっ
この発現ベクターはプラスミドｐ［３Ｒ３２２（ＡＴＣ
ＣＮｏ、３７０１７　）由来のもノテある。

この形質転換したＥ、ｃｏｊ！ｉ１［！胞をγＨＩ　Ｌ
−１αの発現に適した条ｆ１下で培養する。菌体を集め
て凍結する。γｌ−１［Ｌ　−１αの精製には、凍結Ｅ
、ＣＯｊ！　ｉ菌体を３０ｍＨｔ−リス塩酸、１）１１
８．０．５ｍＨＥＤＴＡ（１：５ｗ／ｖ）中でａ解する
。すｌυ濁菌体をブランソンＡ（［１胞破砕器（Ｂｒａ
ｎｓｏｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）　３５０　
（超音波処理）で破砕する。破砕細胞および封入体の形
で不溶化しているγｌ−（Ｉ　Ｌ　−１αを２０，０Ｏ
Ｏｘｓの遠心分離により除去する。可溶性γＨＩＬ−１
αを含む上澄液を３Ｈｈａｃｒｙｌ■Ｈ８−２００ゲル
濾過カラム（第２図）にかける。カラムは８０（ｌ）４
ＮａＣ１５ｍＨＥＤＴＡを含む３０Ｉｌ）ｌトリス塩酸
、ｐＨ３，０、中で平衡化しておく。生物活性画分を集
め、３０ｍ）１ｔ−リス塩酸、０１１８．０、で１：３
（ｖハ）に希釈し、ＤＥＡＥ−セルロース（陰イオン交
換Ｄ　Ｅ　５３　、ウアットマン社）で２５ｎＨトリス
塩酸、１）１１８．１、中０〜８００Ｉ＠ＨＮａＣ１の
線勾配を用いてクロマトグラフィーにかける。

５０％以上の生物活性が０．４〜１．０Ｘ１０７単位／
■蛋白質の比活性で１募られる。蛋白質の純１良　ｔよ
　Ｌａｅｍｍｌｉ　　　、　　Ｍａｔｕｒｅ　　　　２
　２　７　　巻　、　　６８０−６８５頁（１９７０年
）ににり記載される５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析（第４図〉および逆相
ＨＰＬＣにより確認した。５ｅｏｈａｃｒｙｌ■Ｈ８−
２００のクロマトグラフィーの後でγ）ＩＩＬ−１αは
１０００〜２０００内毒素単位／ｒｄの混在があるが［
）ＥＡＥ−り０マドグラフイーにより内毒素の９９％が
除去される。４℃で保存すると生物活性は少なくとも３
ｌ月間安定であることがわかった。

実７７ｉＷ４２ 上記工程をスケールアップして３２１ＦＩの本質的に純
粋なγｌ−１１１−１αを生産する。１００ｇの菌体ペ
ーストをマントン−ゴーリン（Ｈｅｔｈ。

ＥｕＺ■１ａＯ１００Ｖ　　２２巻、４８２−４８４頁
〔１９７１年〕）を通過さＵて処理し、得られる可溶性
物質をストレプトマイシン硫酸および硫酸アンモニウム
で処理して核酸除去および濃縮を行なう。得られる再溶
ｗＩ物を緩衝液中の１０リツトルの５ｅｐｈａｃｒｙｌ
”　　Ｓ　−２００カラムでクロマトグラフィーを行な
う。次に精製物質をＤＥＡＥ−セルロースカラムでクロ
マトグラフィーにかける。蛋白質は５ＤＳ−ＰＡＧＥに
よる分析で９５％以上の純度であった。全活性は１．６
Ｘ１０ｇ単位であり、平均比活性は５Ｘ１０７単位／Ｒ
ｇであった。

しかし、最初の予備試験に反して本標品には内毒素が混
在していた（５００内毒素単位／ｄまで）。

この内毒素は蛋白質溶液を製造元の指示に従って１）ｅ
ｔｏｘｉｃ＋ｃｌ”を充填したカラムを通過させること
により容易に除去できる。

次に図面について説明する。

第１図は＋４　ｉ　Ｌ　−１αのアミノ酸配列を示す。

第２図は可溶性γＨＩ　Ｌ　−１αを含むＥ。

Ｃｏ１１１１１１１胞質画分の５ｅｐｈａｃｒｙｌ”　
　Ｓ　−２００のゲル濾過のりＤマドグラムを示す。溶
出液は３αｍＨトリス−１ｇ、ｐＨ８，０１８００ｍＭ
ＮａＣ１である。分画の一部でＬＡＦアッセイによるｌ
し一１活性を測定した。

第３１ｉＨｊ；　５ｃｐｈａｃｒｙ１１１４Ｓ　−２０
０のＩＬ−１活性分画のＤＥＡＥ−セルロースクロマト
グラムを示ず。γｌ−１１１−１αは２５ｍＭトリス−
塩酸、ｐＨ８，１、中０〜８００ｍＨＮａＣｌの塩勾配
により溶出される。各分画についてＬＡＦアッセイで生
物活性を測定した。

第４図はγＨＩ　Ｌ　−１αの精製を示す。精製段階の
異なるステップの試料につぎ５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
た。

咎　Ｍ：分子司マーカー；Ｐ：超音波処理細胞け１ｖＷ
４液の遠心分離で得られたベレット：Ｓ：ａ胞質画分；
フラクション６４−６９およびフラクション７０−７７
　：　　５ｃｐｈａｃｒｙｌ”　　Ｓ　−２００カラム
クロマトグラフイーからの６４から７７までの名分画く
１で示す）。

■　Ｍ：分子量マーカー：　Ｏ：　　５ｅｐｈａｃｒｙ
ｌ”Ｓ−２００カラムクロマトグラフイーから集めた画
分；Ｏ”　：　　５ｅｐｈａｃｒｙｌ”　　Ｓ−２００
カラムクロマトグラフィーから集めた両分を３Ｏｎ＋Ｈ
トリス−塩酸、ｐＨ１８，１で１：３（ｖ／ｖ）に稀釈
した画分；フラクション６０−６５１ｊ３よびフラクシ
ョン６６−７３　：　ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグ
ラフィーで１！１られた６０から７３までの各分画（１
で示す）。

Ｍの列でのマーカー蛋白質の電気泳肋移肋度（フォスフ
ォリラーゼｂ　（Ｍｒ＝９４，０００）、ウシ血清アル
ブミンＣＭ、＝６７．０００）、卵アルブミンＣＭ、＝
４３，０００）　、カルボニックアンヒドラーゼＣＭ、
＝３０．０００）　、大豆トリプシンインヒビター（Ｍ
ｒ＝２０．０００）およびα−ラクトアルブミンＣＭ、
＝１４．０００））はＭ、値により矢印で示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬｌ　Ｉ　Ｌ　−１αのアミノ酸配列を示す模
式図である。第２図はγｌ−＋　１　Ｌ　−１αを含む
Ｅ。 ｃｏｔ　ｒの細胞質画分の５ｃｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ　
−２００ゲル濾過クロマトグラムを示すグラフである。 第３図ハ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ　−２００ゲル濾過
の活性画分のＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラムを示
すグラフである。第４図は７　ｔ（ｌ　Ｌ　−１αの各
精製段階のサンプルの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す電気
泳動図である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）本質的に内毒素を含まず、少なくともおよそ５×
   １０＾７単位／ｍｇの比活性を有する本質的に均質な蛋
   白質として微生物により生産されたヒトインタリユーキ
   ン−１。
2. （２）ヒトインタリユーキン−１αである特許請求の範
   囲第（１）項記載のヒトインタリユーキン−１。
3. （３）第１図に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範
   囲第（１）項記載のヒトインタリユーキン−１。
4. （４）医薬品としての特許請求の範囲第（１）項から第
   （３）項のいずれか記載のヒトインタリユーキン−１。
5. （５）組換えヒトインタリユーキン−１の遺伝子を含む
   発現ベクターで形質転換し、該遺伝子の発現を誘導した
   微生物細胞を破砕し、細胞質画分から不溶性細胞物質を
   分離し、該細胞質画分を緩衝塩溶液を用いてゲル濾過に
   かけ、該ゲル濾過の生物活性画分を集め、それを増加す
   る塩濃度勾配をかけた緩衝液を用いてイオン交換クロマ
   トグラフィーにかけることより成る特許請求の範囲第（
   １）項から第（３）項のいずれか一つに記載のヒトイン
   タリユーキン−１の製造方法。
6. （６）微生物細胞を超音波処理により破砕する特許請求
   の範囲第（５）項記載の方法。
7. （７）該ゲル濾過をセフアクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ
   ＾Ｔ＾Ｍ）Ｓ−２００カラムで行ない、該緩衝塩溶液が
   トリス塩酸食塩溶液である特許請求の範囲第（５）項ま
   たは第（６）項のいずれか一つに記載の方法。
8. （８）該イオン交換クロマトグラフィーをＤＥＡＥ−セ
   ルロースカラムを用いて行ない、該増加する塩濃度勾配
   の緩衝液がトリス−塩酸緩衝液中０〜８００ｍＭのＮａ
   Ｃｌ勾配である特許請求の範囲第（５）項から第（７）
   項のいずれか一つに記載の方法。
9. （９）特許請求の範囲第（１）項から第（３）項のいず
   れか一つに記載のヒトインタリユーキン−１を含有する
   医薬品組成物。
10. （１０）特許請求の範囲第（１）項から第（３）項のい
    ずれか一つに記載のヒトインタリユーキン−１を病気の
    治療および予防に使用すること。
11. （１１）特許請求の範囲第（５）項から第（８）項のい
    ずれか一つに記載の方法で調製したヒトインタリユーキ
    ン−１。