JP2590085B2 - 組換えヒトインタリユーキン−１αの精製法 - Google Patents
組換えヒトインタリユーキン−１αの精製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 文献によるとヒトインタリユーキン−１のα型および
β型をコードする２つの遺伝子が記載されている（例え
ばMarchら、Mature315巻、641−647頁:1985年参照）。
欧州特許申請公開No.200,986（1986年11月12日公開、発
明者、Gublerら）は組換えヒトインタリユーキン−１の
クローニングおよび発現を記載しており、これは微生物
により生産したヒトインタリユーキン−１である。この
中で記載される生成方法は本蛋白質が宿主細菌細胞中で
不溶性のため問題があることを示している。この不溶性
の問題は蛋白質が適当な三次構造をとれない環境下で高
濃度の蛋白質合成が起つているためと考えられている。
淡白質三次構造形成の問題は細菌細胞内で封入体を形成
する結果となつている。このような封入体は尿素やグア
ニジン塩酸のような強い変性剤によつてのみ可溶化され
る。
β型をコードする２つの遺伝子が記載されている（例え
ばMarchら、Mature315巻、641−647頁:1985年参照）。
欧州特許申請公開No.200,986（1986年11月12日公開、発
明者、Gublerら）は組換えヒトインタリユーキン−１の
クローニングおよび発現を記載しており、これは微生物
により生産したヒトインタリユーキン−１である。この
中で記載される生成方法は本蛋白質が宿主細菌細胞中で
不溶性のため問題があることを示している。この不溶性
の問題は蛋白質が適当な三次構造をとれない環境下で高
濃度の蛋白質合成が起つているためと考えられている。
淡白質三次構造形成の問題は細菌細胞内で封入体を形成
する結果となつている。このような封入体は尿素やグア
ニジン塩酸のような強い変性剤によつてのみ可溶化され
る。
これらの強変性剤を用いた精製手段により精製した組
換えヒトインタリユーキン−１が得られている。しか
し、理由は完全に理解されていないが恐らく非生物環境
下における蛋白質の三次構造形成に関連して、精製分子
の比活性はおよそ６×106単位/mgを超えることはなかつ
た。従つて、本発明の目的は組換えヒトインタリユーキ
ン−１、特に組換えヒトインタリユーキン−１α、に関
して目的の蛋白質を生物学的に適応した緩衝糸で精製、
可溶化し、高い比活性を有する生成物を得るような精製
工程を開発することであつた。
換えヒトインタリユーキン−１が得られている。しか
し、理由は完全に理解されていないが恐らく非生物環境
下における蛋白質の三次構造形成に関連して、精製分子
の比活性はおよそ６×106単位/mgを超えることはなかつ
た。従つて、本発明の目的は組換えヒトインタリユーキ
ン−１、特に組換えヒトインタリユーキン−１α、に関
して目的の蛋白質を生物学的に適応した緩衝糸で精製、
可溶化し、高い比活性を有する生成物を得るような精製
工程を開発することであつた。
本発明は組換えヒトインタリユーキン−１、特に組換
えヒトインタリユーキン−１α、を生産するための改良
法に関するものであり、さらに詳しくは、第１図に示す
アミノ酸配列を有するヒトインタリユーキン−１αを本
質的に均質蛋白質として、本質的に内毒素を含まず、高
い比活性、具体的には少なくともおよそ５×107単位/mg
の比活性を有するヒトインタリユーキン−１αの生産に
関するものである。さらに、本発明は本法により生産さ
れる組換えヒトインタリユーキン−１に関するもの、即
ち、微生物により生産され、本質的に内毒素を含まず、
本質的に均質であつて少なくともおよそ５×107単位/mg
の比活性を有するヒトインタリユーキン−１に関するも
のである。該ヒトインタリユーキン−１は病気の治療お
よび予防のための医薬品として用いることが出来る。さ
らに本発明は、該ヒトインタリユーキン−１を含有する
医薬品組成物に関するものである。本技術に精通してい
る者には明かな通り、本発明のヒトインタリユーキン−
１はＮ−末端にメチオニン残基を含むこともある。
えヒトインタリユーキン−１α、を生産するための改良
法に関するものであり、さらに詳しくは、第１図に示す
アミノ酸配列を有するヒトインタリユーキン−１αを本
質的に均質蛋白質として、本質的に内毒素を含まず、高
い比活性、具体的には少なくともおよそ５×107単位/mg
の比活性を有するヒトインタリユーキン−１αの生産に
関するものである。さらに、本発明は本法により生産さ
れる組換えヒトインタリユーキン−１に関するもの、即
ち、微生物により生産され、本質的に内毒素を含まず、
本質的に均質であつて少なくともおよそ５×107単位/mg
の比活性を有するヒトインタリユーキン−１に関するも
のである。該ヒトインタリユーキン−１は病気の治療お
よび予防のための医薬品として用いることが出来る。さ
らに本発明は、該ヒトインタリユーキン−１を含有する
医薬品組成物に関するものである。本技術に精通してい
る者には明かな通り、本発明のヒトインタリユーキン−
１はＮ−末端にメチオニン残基を含むこともある。
本発明の重要な局面は、細菌宿主、例えばE.coli、中
で発現される組換えヒトインタリユーキン−１は可溶性
細菌質画分に於ける比活性が尿素抽出した封入体の比活
性よりかなり低いにも拘らずその大部分が可溶性細胞質
画分に存在するという偶然の発見から出てきたものであ
る。その上、ヒトインタリユーキン−１が細胞質に存在
するということのみでなく、それが簡単な二段階または
三段階のカラムクロマトグラフイー分離工程により細胞
質から精製できることを発見した。
で発現される組換えヒトインタリユーキン−１は可溶性
細菌質画分に於ける比活性が尿素抽出した封入体の比活
性よりかなり低いにも拘らずその大部分が可溶性細胞質
画分に存在するという偶然の発見から出てきたものであ
る。その上、ヒトインタリユーキン−１が細胞質に存在
するということのみでなく、それが簡単な二段階または
三段階のカラムクロマトグラフイー分離工程により細胞
質から精製できることを発見した。
本発明の方法の第一段階として、ヒトインタリユーキ
ン−１をコードする挿入遺伝子の発現を起す選択的な条
件下で培養した形質転換微生物宿主を破砕して可溶化画
分を得、それを従来発現したヒトインタリユーキン−１
（γHIL−１）の大部分が存在すると信じられていた封
入体を含む細胞不溶性物質と分離する。
ン−１をコードする挿入遺伝子の発現を起す選択的な条
件下で培養した形質転換微生物宿主を破砕して可溶化画
分を得、それを従来発現したヒトインタリユーキン−１
（γHIL−１）の大部分が存在すると信じられていた封
入体を含む細胞不溶性物質と分離する。
細胞の破砕は本技術で良く知られる技術、例えばリゾ
チーム処理のような酸素分解の利用、ボールミルや類似
の道具、或いは超音波処理など用いる物理的破砕により
行なうことができる。可溶性細胞質画分の不溶性物質か
らの分離は遠心分離、例えば20,000×ｇで約30分間で最
も便宜的に実施できる。可溶性γHIL−１を含む細胞質
画分を含有する上澄液は続いてゲル濾過にかけ、緩衝塩
溶液で溶出される。この工程に適したカラムはセフアク
リル（SephacrylTM）Ｓ−200カラム（フアルマシア・フ
アインケミカルスAB、ウプサラ、スウエーデン）であ
る。
チーム処理のような酸素分解の利用、ボールミルや類似
の道具、或いは超音波処理など用いる物理的破砕により
行なうことができる。可溶性細胞質画分の不溶性物質か
らの分離は遠心分離、例えば20,000×ｇで約30分間で最
も便宜的に実施できる。可溶性γHIL−１を含む細胞質
画分を含有する上澄液は続いてゲル濾過にかけ、緩衝塩
溶液で溶出される。この工程に適したカラムはセフアク
リル（SephacrylTM）Ｓ−200カラム（フアルマシア・フ
アインケミカルスAB、ウプサラ、スウエーデン）であ
る。
該緩衝塩溶液、好ましくはトリス−塩酸、pH8.0、緩
衝NaCl溶液、に蛋白質安定化剤として例えばエチレンジ
アミンテトラアセテイツクアシツド（EDTA）を添加した
ものに含有されるゲル濾過クロマトグラフイーの分画に
つき測定をする。生物活性画分を集め、緩衝塩溶液で希
釈して本発明の第二段階に用いる。
衝NaCl溶液、に蛋白質安定化剤として例えばエチレンジ
アミンテトラアセテイツクアシツド（EDTA）を添加した
ものに含有されるゲル濾過クロマトグラフイーの分画に
つき測定をする。生物活性画分を集め、緩衝塩溶液で希
釈して本発明の第二段階に用いる。
クロマトグラフイー分画の測定は本技術でよく知られ
る方法により行なう事が出来る。適当な測定はMizel
ら、J.Immuuol.120巻、1497−1508頁（1978年）により
記載されるネズミ胸腺細胞増殖測定（LAFアツセイ）で
ある。
る方法により行なう事が出来る。適当な測定はMizel
ら、J.Immuuol.120巻、1497−1508頁（1978年）により
記載されるネズミ胸腺細胞増殖測定（LAFアツセイ）で
ある。
第二段階の工程はイオン交換クロマトグラフイー、好
ましくはDEAE−セルロースカラム、であり、緩衝液中で
塩濃度勾配を用いたステツプである。好ましい実施態様
としては、該勾配が25mMトリス−塩酸、pH8.1の緩衝液
中０−800mM NaClの勾配であるものである。
ましくはDEAE−セルロースカラム、であり、緩衝液中で
塩濃度勾配を用いたステツプである。好ましい実施態様
としては、該勾配が25mMトリス−塩酸、pH8.1の緩衝液
中０−800mM NaClの勾配であるものである。
大規模な精製工程では、細胞残渣を除去するための遠
心分離の後、細胞質画分中の核酸をストレプトマイシン
硫酸塩による沈澱で除去する。上澄液の10分の１量の10
％（w/v）ストレプトマイシン硫酸塩塩酸を添加する。p
Hは1N−酢酸にて6.2から6.4に保持する。けん濁液を20,
000×ｇで30分間遠心分離する。得られる上澄液中の蛋
白質の硫酸アンモニウムを60％飽和に加えて濃縮する。
けん濁液を20,000×ｇで30分間遠心分離し、得られるペ
レツトを最小量の25mMトリス塩酸、pH8.0、800mM NaCl
に溶解する。
心分離の後、細胞質画分中の核酸をストレプトマイシン
硫酸塩による沈澱で除去する。上澄液の10分の１量の10
％（w/v）ストレプトマイシン硫酸塩塩酸を添加する。p
Hは1N−酢酸にて6.2から6.4に保持する。けん濁液を20,
000×ｇで30分間遠心分離する。得られる上澄液中の蛋
白質の硫酸アンモニウムを60％飽和に加えて濃縮する。
けん濁液を20,000×ｇで30分間遠心分離し、得られるペ
レツトを最小量の25mMトリス塩酸、pH8.0、800mM NaCl
に溶解する。
場合によつては、特に大規模処理に於いて、この時点
で内毒素の量が許容量を超えている。従つて必要に応じ
て内毒素を除去するために第三ステツプを導入する。こ
の目的のために周知の方法が用いられるが、本発明によ
る好ましい手段としてはDEAE−カラムクロマトグラフイ
ーからの生成物溶液（25mMトリス塩酸:pH8.1で1:1（v/
v）に希釈）をデトキシゲル（Detoxi GelTM）（Pierce
Chemical Company、米国イリノイ州ロツクフオード）を
充填したカラムを製造元の指示に従つて通過させるもの
である。
で内毒素の量が許容量を超えている。従つて必要に応じ
て内毒素を除去するために第三ステツプを導入する。こ
の目的のために周知の方法が用いられるが、本発明によ
る好ましい手段としてはDEAE−カラムクロマトグラフイ
ーからの生成物溶液（25mMトリス塩酸:pH8.1で1:1（v/
v）に希釈）をデトキシゲル（Detoxi GelTM）（Pierce
Chemical Company、米国イリノイ州ロツクフオード）を
充填したカラムを製造元の指示に従つて通過させるもの
である。
本発明による精製ヒトインタリユーキン−１はそれ自
体知られる方法により例えば病原体に対する宿主防御応
答を改善するとか、ワクチンアジユバントとして作用す
るとか、癌疾患に対する宿主防御を高めるなどして、患
者の免疫系を促進するための医薬品として用いることが
出来る。他の臨床利用としては線維芽細胞の増殖を促進
することにより傷の治癒の助長および重病な、蛋白質栄
養失調患者の回復の改善などがある。
体知られる方法により例えば病原体に対する宿主防御応
答を改善するとか、ワクチンアジユバントとして作用す
るとか、癌疾患に対する宿主防御を高めるなどして、患
者の免疫系を促進するための医薬品として用いることが
出来る。他の臨床利用としては線維芽細胞の増殖を促進
することにより傷の治癒の助長および重病な、蛋白質栄
養失調患者の回復の改善などがある。
本発明のヒトインタリユーキン−１は上述の臨床利用
の目的で温血動物に投与される。投与は静注、皮下注射
あるいは筋肉注射のような非経口投与など従来から知ら
れる方法で行なう。必要な投与量は明かに治療しようと
する状態、その重篤度、治療期間および投与方法などに
より異なる。医薬品として使用する適当な投与剤はヒト
インタリユーキン−１を減菌濾過して凍結乾燥し、従来
の方法により使用前に再構成して得られる。さらに緩衝
液、安定剤、殺菌剤および他の医薬品非経口剤によく用
いられる添加剤などを加えることも技術の範囲内であ
る。
の目的で温血動物に投与される。投与は静注、皮下注射
あるいは筋肉注射のような非経口投与など従来から知ら
れる方法で行なう。必要な投与量は明かに治療しようと
する状態、その重篤度、治療期間および投与方法などに
より異なる。医薬品として使用する適当な投与剤はヒト
インタリユーキン−１を減菌濾過して凍結乾燥し、従来
の方法により使用前に再構成して得られる。さらに緩衝
液、安定剤、殺菌剤および他の医薬品非経口剤によく用
いられる添加剤などを加えることも技術の範囲内であ
る。
実施例１ 組換えヒトインタリユーキン−１α（γHIL−１αと
記す：このアミノ酸配列は第１図に示す。）をコードす
る遺伝子を有する発現ベクターで形質転換したE.coli
MC 1061株（ATCC No.53338）を用いてγHIL−１αを製
造した。このE.coli MC 1061株はプラスミドpRK248cI
ts（ATCC No.33766）を含有し、かつこの発現ベクター
はプラスミドpBR322（ATCC No.37017）由来のものであ
る。
記す：このアミノ酸配列は第１図に示す。）をコードす
る遺伝子を有する発現ベクターで形質転換したE.coli
MC 1061株（ATCC No.53338）を用いてγHIL−１αを製
造した。このE.coli MC 1061株はプラスミドpRK248cI
ts（ATCC No.33766）を含有し、かつこの発現ベクター
はプラスミドpBR322（ATCC No.37017）由来のものであ
る。
この形質転換したE.coli細胞をγHIL−１αの発現に
適した条件下で培養する。菌体を集めて凍結する。γHI
L−１αの精製には、凍結E.coli菌体を30mMトリス塩
酸、pH8.0、5mM EDTA（1:5w/v）中で融解する。けん濁
菌体をブランソン細胞破砕器（Branson Cell Disrupto
r）350（超音波処理）で破砕する。破砕細胞および封入
体の形で不溶化しているγHIL−１αを20,000×ｇの遠
心分離により除去する。可溶性γHIL−１αを含む上澄
液をSephacrylTM Ｓ−200ゲル濾過カラム（第２図）に
かける。カラムは800mM NaCl、5mM EDTAを含む30mMト
リス塩酸、pH8.0、中で平衡化しておく。生物活性画分
を集め、30mMトリス塩酸、pH8.0、で1:3（v/v）に希釈
し、DEAE−セルロース（陰イオン交換DE53、ウアツトマ
ン社）で25mMトリス塩酸、pH8.1、中０〜800mM NaClの
線勾配を用いてクロマトグラフイーにかける。50％以上
の生物活性が0.4〜1.0×107単位/mg蛋白質の比活性で得
られる。蛋白質の純度はLaemmli、Nature 227巻、680
−685頁（1970年）により記載されるSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）分析（第４図）およ
び逆相HPLCにより確認した。SephacrylTM Ｓ−200のク
ロマトグラフイーの後でγHIL−１αは1000〜2000内毒
素単位/mlの混在があるがDEAE−クロマトグラフイーに
より内毒素の99％が除去される。４℃で保存すると生物
活性は少なくとも３ケ月間安定であることがわかつた。
適した条件下で培養する。菌体を集めて凍結する。γHI
L−１αの精製には、凍結E.coli菌体を30mMトリス塩
酸、pH8.0、5mM EDTA（1:5w/v）中で融解する。けん濁
菌体をブランソン細胞破砕器（Branson Cell Disrupto
r）350（超音波処理）で破砕する。破砕細胞および封入
体の形で不溶化しているγHIL−１αを20,000×ｇの遠
心分離により除去する。可溶性γHIL−１αを含む上澄
液をSephacrylTM Ｓ−200ゲル濾過カラム（第２図）に
かける。カラムは800mM NaCl、5mM EDTAを含む30mMト
リス塩酸、pH8.0、中で平衡化しておく。生物活性画分
を集め、30mMトリス塩酸、pH8.0、で1:3（v/v）に希釈
し、DEAE−セルロース（陰イオン交換DE53、ウアツトマ
ン社）で25mMトリス塩酸、pH8.1、中０〜800mM NaClの
線勾配を用いてクロマトグラフイーにかける。50％以上
の生物活性が0.4〜1.0×107単位/mg蛋白質の比活性で得
られる。蛋白質の純度はLaemmli、Nature 227巻、680
−685頁（1970年）により記載されるSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）分析（第４図）およ
び逆相HPLCにより確認した。SephacrylTM Ｓ−200のク
ロマトグラフイーの後でγHIL−１αは1000〜2000内毒
素単位/mlの混在があるがDEAE−クロマトグラフイーに
より内毒素の99％が除去される。４℃で保存すると生物
活性は少なくとも３ケ月間安定であることがわかつた。
実施例２ 上記工程をスケールアツプして32mgの本質的に純粋な
γHIL−１αを生産する。100gの菌体ペーストをマント
ン−ゴーリン（Meth.Euzymology 22巻、482−484頁〔1
971年〕）を通過させて処理し、得られる可溶性物質を
ストレプトマイシン硫酸および硫酸アンモニウムで処理
して核酸除去および濃縮を行なう。得られる再溶解物を
緩衝液中の10リツトルのSephacrylTM Ｓ−200カラムで
クロマトグラフイーを行なう。次に精製物質をDEAE−セ
ルロースカラムでクロマトグラフイーにかける。蛋白質
はSDS−PAGEによる分析で95％以上の純度であつた。全
活性は1.6×109単位であり、平均比活性は５×107単位/
mgであつた。しかし、最初の予備試験に反して本標品に
は内毒素が混在していた（500内毒素単位/mlまで）。こ
の内毒素は蛋白質溶液を製造元の指示に従つてDetoxige
lTMを充填したカラムを通過させることにより容易に除
去できる。
γHIL−１αを生産する。100gの菌体ペーストをマント
ン−ゴーリン（Meth.Euzymology 22巻、482−484頁〔1
971年〕）を通過させて処理し、得られる可溶性物質を
ストレプトマイシン硫酸および硫酸アンモニウムで処理
して核酸除去および濃縮を行なう。得られる再溶解物を
緩衝液中の10リツトルのSephacrylTM Ｓ−200カラムで
クロマトグラフイーを行なう。次に精製物質をDEAE−セ
ルロースカラムでクロマトグラフイーにかける。蛋白質
はSDS−PAGEによる分析で95％以上の純度であつた。全
活性は1.6×109単位であり、平均比活性は５×107単位/
mgであつた。しかし、最初の予備試験に反して本標品に
は内毒素が混在していた（500内毒素単位/mlまで）。こ
の内毒素は蛋白質溶液を製造元の指示に従つてDetoxige
lTMを充填したカラムを通過させることにより容易に除
去できる。
次に図面について説明する。
第１図はHIL−１αのアミノ酸配列を示す。
第２図は可溶性γHIL−１αを含むE.coli細胞質画分
のSephacrylTM Ｓ−200のゲル濾過のクロマトグラムを
示す。溶出液は30mMトリス−塩酸、pH8.0、800mM NaCl
である。分画の一部でLAFアツセイによるIL−１活性を
測定した。
のSephacrylTM Ｓ−200のゲル濾過のクロマトグラムを
示す。溶出液は30mMトリス−塩酸、pH8.0、800mM NaCl
である。分画の一部でLAFアツセイによるIL−１活性を
測定した。
第３図はSephacrylTM Ｓ−200のIL−１活性画分のDE
AE−セルロースクロマトグラムを示す。γHIL−１αを2
5mMトリス−塩酸、pH8.1、中０〜800mM NaClの塩勾配
により溶出される。各分画についてLAFアツセイで生物
活性を測定した。
AE−セルロースクロマトグラムを示す。γHIL−１αを2
5mMトリス−塩酸、pH8.1、中０〜800mM NaClの塩勾配
により溶出される。各分画についてLAFアツセイで生物
活性を測定した。
第４図はγHIL−１αの精製を示す。精製段階の異な
るステツプの試料につきSDS−PAGEで分析した。
るステツプの試料につきSDS−PAGEで分析した。
（Ａ） M:分子量マーカー;P:超音波処理細胞けん濁液
の遠心分離で得られたペレツト;S:細胞質画分；フラク
シヨン64−69およびフラクシヨン70−77:SephacrylTM
Ｓ−200カラムクロマトグラフイーからの64から77まで
の各分画（１で示す）。
の遠心分離で得られたペレツト;S:細胞質画分；フラク
シヨン64−69およびフラクシヨン70−77:SephacrylTM
Ｓ−200カラムクロマトグラフイーからの64から77まで
の各分画（１で示す）。
（Ｂ） M:分子量マーカー;O:SephacrylTM Ｓ−200カ
ラムクロマトグラフイーから集めた画分;O＊:Sephacryl
TM Ｓ−200カラムクロマトグラフイーから集めた画分
を30mMトリス−塩酸、pH8.1で1:3（v/v）に希釈した画
分；フラクシヨン60−65およびフラクシヨン66−73:DEA
E−セルロースクロマトグラフイーで得られる60から73
までの各分画（１で示す）。
ラムクロマトグラフイーから集めた画分;O＊:Sephacryl
TM Ｓ−200カラムクロマトグラフイーから集めた画分
を30mMトリス−塩酸、pH8.1で1:3（v/v）に希釈した画
分；フラクシヨン60−65およびフラクシヨン66−73:DEA
E−セルロースクロマトグラフイーで得られる60から73
までの各分画（１で示す）。
Ｍの列でのマーカー蛋白質の電気泳動移動度（フオス
フオリラーゼｂ〔Mr＝94,000〕、ウシ血清アルブミン
〔Mr＝67,000〕、卵アルブミン〔Mr＝43,000〕、カルボ
ニツクアンヒドラーゼ〔Mr＝30,000〕、大豆トリプシン
インヒビター〔Mr＝20,000〕およびα−ラクトアルブミ
ン〔Mr＝14,000〕）はMr値により矢印で示した。
フオリラーゼｂ〔Mr＝94,000〕、ウシ血清アルブミン
〔Mr＝67,000〕、卵アルブミン〔Mr＝43,000〕、カルボ
ニツクアンヒドラーゼ〔Mr＝30,000〕、大豆トリプシン
インヒビター〔Mr＝20,000〕およびα−ラクトアルブミ
ン〔Mr＝14,000〕）はMr値により矢印で示した。
第１図はHIL−１αのアミノ酸配列を示す模式図であ
る。第２図はγHIL−１αを含むE.coliの細胞質画分のS
ephacryl Ｓ−200ゲル濾過クロマトグラムを示すグラ
フである。第３図はSephacryl Ｓ−200ゲル濾過の活性
画分のDEAE−セルロースクロマトグラムを示すグラフで
ある。第４図はγHIL−１αの各精製段階のサンプルのS
DS−PAGE分析を示す電気泳動図である。
る。第２図はγHIL−１αを含むE.coliの細胞質画分のS
ephacryl Ｓ−200ゲル濾過クロマトグラムを示すグラ
フである。第３図はSephacryl Ｓ−200ゲル濾過の活性
画分のDEAE−セルロースクロマトグラムを示すグラフで
ある。第４図はγHIL−１αの各精製段階のサンプルのS
DS−PAGE分析を示す電気泳動図である。
Claims (9)
- 【請求項１】本質的に内毒素を含まず、少なくともおよ
そ5x107単位/mgの比活性を有する本質的に均質な蛋白質
として微生物により生産されたヒトインターリューキン
−１α。 - 【請求項２】第１図に示すアミノ酸配列を有する特許請
求の範囲第（１）項記載のヒトインターリューキン−１
α。 - 【請求項３】医薬品としての特許請求の範囲第（１）項
または第（２）項のいずれか一つに記載のヒトインター
リューキン−１α。 - 【請求項４】組換えヒトインターリューキン−１αの遺
伝子を含む発現ベクターで形質転換し、該遺伝子の発現
を誘導した微生物細胞を破砕し、細胞質画分から不溶性
細胞物質を分離し、該細胞質画分を緩衝塩溶液を用いて
ゲル濾過にかけ、該ゲル濾過の生物活性画分を集め、そ
れを増加する塩濃度勾配をかけた緩衝液を用いてイオン
交換クロマトグラフィーにかけることにより成る、本質
的に内毒素を含まず、少なくともおよそ5x107単位/mgの
比活性を有する本質的に均質な蛋白質として微生物によ
り生産されたヒトインターリューキン−１αの製造方
法。 - 【請求項５】微生物細胞を超音波処理により破砕する特
許請求の範囲第（４）項記載の方法。 - 【請求項６】特許請求の範囲第（４）項に記載のゲル濾
過をセファクリル（SephacrylTTM）Ｓ−200カラムで行
い、同第（４）項に記載の緩衝塩溶液がトリス塩酸食塩
溶液である特許請求の範囲第（４）項または第（５）項
のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項７】特許請求の範囲第（４）項に記載のイオン
交換クロマトグラフィーをDEAE−セルロースカラムを用
いて行い、同第（４）項に記載の増加する塩濃度勾配の
緩衝液がトリス−塩酸緩衝液中０〜800mMのNaCl勾配で
ある特許請求の範囲第（４）項から第（６）項のいずれ
か一つに記載の方法。 - 【請求項８】本質的に内毒素を含まず、少なくともおよ
そ5x107単位/mgの比活性を有する本質的に均質な蛋白質
として微生物により生産されたヒトインターリューキン
−１αを含有するヒトインターリューキン−１感受性疾
患治療用医薬組成物。 - 【請求項９】組換えヒトインターリューキン−１αの遺
伝子を含む発現ベクターで形質転換し、該遺伝子の発現
を誘導した微生物細胞を破砕し、細胞質画分から不溶性
細胞物質を分離し、該細胞質画分を緩衝塩溶液を用いて
ゲル濾過にかけ、該ゲル濾過の生物活性画分を集め、そ
れを増加する塩濃度勾配をかけた緩衝液を用いてイオン
交換クロマトグラフィーにかけることより成る方法で調
製したヒトインターリューキン−１α。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US830406 | 1986-02-18 | ||
| US06/830,406 US5831022A (en) | 1986-02-18 | 1986-02-18 | Purification of recombinant human IL-1α |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62209097A JPS62209097A (ja) | 1987-09-14 |
| JP2590085B2 true JP2590085B2 (ja) | 1997-03-12 |
Family
ID=25256938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62034385A Expired - Lifetime JP2590085B2 (ja) | 1986-02-18 | 1987-02-17 | 組換えヒトインタリユーキン−１αの精製法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
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| JP (1) | JP2590085B2 (ja) |
| BE (1) | BE1000636A5 (ja) |
| CH (1) | CH676008A5 (ja) |
| DE (1) | DE3704868C2 (ja) |
| DK (1) | DK171419B1 (ja) |
| FR (1) | FR2595714B1 (ja) |
| GB (1) | GB2186580B (ja) |
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| NZ337543A (en) * | 1994-10-24 | 2002-06-28 | Allergan Inc | Composition comprising avian antitoxin against clostridial neurotoxin protein and method for producing recombinant antitoxin proteins are provided for |
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| CA1341562C (en) * | 1982-03-31 | 2007-11-27 | Tadatsugu Taniguchi | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
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| FR2550802B1 (fr) * | 1983-08-17 | 1986-04-11 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de production d'interleukine 1 humaine et medicaments correspondants |
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| JPS60197629A (ja) * | 1984-03-16 | 1985-10-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
| DE3419995A1 (de) * | 1984-05-29 | 1985-12-05 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-interleukin-2 und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| CA1341433C (en) * | 1984-06-19 | 2003-06-24 | Douglas P. Cerretti | Purification of interleukin 1 |
| JPS617296A (ja) * | 1984-06-19 | 1986-01-13 | イミユネツクス、コ−ポレ−シヨン | インタ−ロイキン１の遺伝子の精製、クロ−ニング及び特性づけ |
| DE3432196A1 (de) * | 1984-09-01 | 1986-03-06 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Neues mechanisches aufschlussverfahren von bakterienzellen zur isolierung von rekombinant hergestellten peptiden |
| EP0200986B2 (en) * | 1985-04-25 | 1998-03-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant human interleukin-1 |
| US4675387A (en) * | 1985-07-26 | 1987-06-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for extracting protein with organic acid |
| US5008374A (en) * | 1986-03-14 | 1991-04-16 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | IL-1α derivatives and drugs |
| US4801686A (en) * | 1986-09-04 | 1989-01-31 | Immunex Corporation | Purification of recombinant interleukin-1 |
-
1986
- 1986-02-18 US US06/830,406 patent/US5831022A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-01-13 CH CH98/87A patent/CH676008A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-12 FR FR878702010A patent/FR2595714B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-16 DK DK077387A patent/DK171419B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-02-16 DE DE3704868A patent/DE3704868C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-17 GB GB8703663A patent/GB2186580B/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-17 NL NL8700397A patent/NL8700397A/nl not_active Application Discontinuation
- 1987-02-17 JP JP62034385A patent/JP2590085B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-18 IT IT19420/87A patent/IT1202565B/it active
- 1987-02-18 BE BE8700134A patent/BE1000636A5/fr not_active IP Right Cessation
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|---|
| Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４５（２）（１９８４）Ｐ．４８３−４９０ |
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| NL8700397A (nl) | 1987-09-16 |
| JPS62209097A (ja) | 1987-09-14 |
| DK77387D0 (da) | 1987-02-16 |
| DE3704868C2 (de) | 1995-09-21 |
| DE3704868A1 (de) | 1987-08-20 |
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| CH676008A5 (ja) | 1990-11-30 |
| US5831022A (en) | 1998-11-03 |
| DK171419B1 (da) | 1996-10-21 |
| GB2186580A (en) | 1987-08-19 |
| FR2595714B1 (fr) | 1990-05-18 |
| GB2186580B (en) | 1990-08-22 |
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