JPS6267032A - 組換ヒトβ―インターフェロンを含有する医薬組成物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は生化学工学の一般的分野に属する。

さらに詳しくは、この発明はヒト−インターフェロンの
ごとき生物学的に活性な組換親油性蛋白質の製造に関す
る。さらに具体的には、この発明は、遺伝的に形質転換
された宿主生物から親油性蛋白質を製造、・回収するた
めの改良された方法、比較的高純度の親油性蛋白質調製
物、及びその療法的に許容される製剤に関する。

〔従来の技術〕

天然インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウィルス、２本積
ＲＮ　Ａ、他のポリヌクレオチド、抗原又はマイトジェ
ンによる誘導の後に種々の細胞により生産される種特異
的蛋白質、しばしば糖蛋白質である。インターフェロン
は、抗ウイルス機能、抗増殖機能、免疫調節機能及び抗
細胞機能のごとき多くの生物学的活性を示す。少なくと
も３つのタイプのヒト−インターフェロンが同定されて
おり、そしてそれらの抗ウィルス活性、抗増殖活性及び
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の活性化活性の点から特
徴付けられている。これらは、白血球、リンパ球、線維
芽細胞及び免疫系により生産され、そしてα、β、及び
Ｔインターフェロンとして分類される。これらは、異る
構造遺伝子によりコードされた異る蛋白質であると報告
されている。

天然ヒトβ−インターフェロン（β−旧ＦＮ）は一般に
、ヒト線維芽細胞培養物をポリ−ＩＣ（ポリ−リボイノ
シン酸及びポリシチジル酸）によりスーパーインデユー
スし、そしてこうして産生されたβ−ＨＩＦＮをクロマ
トグラフ法及び電気泳動法により単離及び精製すること
により製造される。

天然β−インターフェロン様の性質を示す蛋白質又はポ
リペプチドはまた、ウィルス的に誘導されたヒト細胞か
らポリーＡ−リッチ１２ＳメソセンジャーＲＮＡを抽出
し、このｍＲＮＡを鋳型として使用して２重鎖ｃＤＮＡ
を合成し、このｃＤＮＡを適当なりローニングベクター
に導入し、このベクターを用いて適当な微生物を形質転
換し、細菌を集め、そしてこの細菌からβ−ＨＩＦＮを
抽出することにより、組換ＤＮＡ技法を用いて製造され
得る。Ｎａｇｏｌａ　Ｓ。

等、Ｎａｔｕｒｅ、　２８４　　：　３１６（１９８０
）；　Ｇｏｅｄｄｅｌ　Ｄ’、Ｖ、等、１９８１年５月
６日に公開されたヨーロッパ特許出願１１＆Ｌ２８０３
３　１１９Ｂ１年７月１５日に公開されたヨーロッパ特
許出願１１ｈ３２１１３４　；　１９Ｂ１年８月２６日
に公開されたヨーロッパ特許出願Ｎ１３４３０７．及び
１９８１年６月１日に発行されたベルギー特許１’ｈ８
３７３９７は、組換ＤＮＡ技法を用いてβ−インターフ
ェロンの製造のために現在使用されている種々の方法を
記載している。発現した蛋白質又はポリペプチドは精製
されそして試験され、そして天然ＩＦＮの性質に類似す
る性質を示すことが見出されている。従って、細菌的に
製造されたＩＦＮは抗ウィルス剤及び抗腫瘍剤としての
潜在的な用途を有する様であり、そしてこのような細菌
発酵によるＩＦＮの製造は、臨床試験のために十分な量
のＩＦＮを比較的低コストで提供することが期待される
。

しかしながら、臨床研究において使用するための蛋白質
サンプルは比較的高純度でなければならず、そして毒性
の宿主細胞成分、細胞破片、並びに抽出及び精製の段階
で導入された他の外来化学物質により実質的に汚染され
ていてはならない。

細菌的に生産された蛋白質の調製、回収及び精製のため
に現在使用することができる幾つかの方法が存在する。

ＬｅｉｂｏｗｉＬｚの米国特許Ｎ１４，３１５，８５２
は、細菌細胞から白血球インターフェロンを酸抽出し、
そして抽出物を中和してインターフェロンを得る方法を
記載しそして特許請求している。

Ｄｅｒｙｎｃｋ等、Ｎａｔｕｒｅ、　２Ｂ７　：１９３
（１９８０）は、５Ｍ尿素、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＯ３）及び１％２−メルカプトエタノールを含有
する溶液を用いて、形質転換されたＥ、コリ　（ｔｉ、
ｃｏｌｉ）細胞を溶解することを教示している。クロマ
トグラフィーにより精製された細胞溶解物はインターフ
ェロン活性を示した。

５ｃａｎｄｅｌｌａ及びにｏｒｎｂｅｒｇ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒ　％　１０　：４４４７　（１９７１）
は、細胞膜をＳＤＳで可溶化しそして可溶化された蛋白
質を１−ブタノールで沈澱せしめることによる、Ｅ、コ
リがらのホスホリパーゼの調製を記載している。

Ｍｅｎｇｅ等の米国特許−４，３４３，７３５は、水性
多相系において、この系中に可溶でありそしてポリエー
テルの誘導体であるイオン交換体の存在下で、インター
フェロンを分配することによりインターフェロンを精製
する方法を教示している。

ＩＪｅｍｕｒａ等の米国特許Ｎａ４．３４３．７３６は
、水−不溶化ヘパリン上にインターフェロンを吸着せし
め、そして次に該インターフェロンを無機塩及びコンド
ロイチン硫酸塩の水性溶液により溶出することによるイ
ンターフェロンの回収方法を開示している。

Ｆｒ１ｅｓｅｎ等の米国特許Ｆｂ４．２８９，６８９は
、アフィニティークロマトグラフィー及び高圧液体クロ
マトグラフィーの使用によるヒト天然β−インターフェ
ロンの回収及び精製方法を開示している。

Ｙａｂｒｏｖ等の米国特許Ｎ１４，４６０．５７４は、
ヒト−インターフェロン感受性疾患の肛門又は尿性器治
療のために使用される天然ヒトα−及びβ−インターフ
ェロンを含んで成る医薬組成物を開示している。

Ｌｅｉｂｏｗｉ　ｔｚ等の米国特許１１ｈ４，３６４，
８６３は、低ｐＨ及び次に高ｐＨ抽出法を用いて細菌か
ら線維芽細胞インターフェロンを抽出する方法を記載し
ている。

Ｂｅｎｚｏｎ等のＰＣＴ　Ｗｏ　８０１０２２２９は、
親油性蛋白質ではないα（白血球）インターフェロンの
精製を開示している。

ＵＰ　４２，２４６は、組換インターフェロンが所望の
投与形のために適当な医薬として許容される非毒性担体
に溶解され得ることを開示しているが、これ以上の詳細
は記載していない。

米国特許１１ｈ４，４５０．１０３は、適当な溶解剤に
よる水性媒体中での蛋白質の可溶化、２−ブタノール又
は２−メチル−２−ブタノールによる水性媒体からの蛋
白質の抽出、及びアルコール相からの蛋白質の沈澱を記
載している。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅ　ｏｒｔｌ　
６２．１９００−１９０６（１９７８）及びＢＰ　８９
．２４５は、天然β−インターフェロンがヒト血清アル
ブミンと共に直接的に、ｐＨ７，２〜７．８の医薬とし
て適合性の水性媒体中に製剤化され得ることを■示して
いる。

α−インターフェロン及び天然β−インターフェロンは
親油性蛋白質ではない。従って、これらはヒト血清アル
ブミンのごとき安定剤を添加することにより生理的ｐＨ
の製剤に直接に安定化及び可溶化され得る。これに対し
て、組換β−インターフェロンのごとき親油性蛋白質は
ｐＨ６，８〜７．８でヒト血清アルブミンを添加するこ
とによっては可溶化されない。

親油性蛋白質の精製及び回収のための既存の方法の主た
る問題点は、蛋白質が臨床的及び療法的目的のために十
分に純粋な形で且つ十分に多量に製造されないこと、そ
してさらに得られた蛋白質調製物、特に組換ＤＮＡ技法
により製造された蛋白質調製物が残留毒性量の化学物質
、例えばＳＤＳ、並びに抽出及び精製段階において使用
された他の界面活性剤又は沈澱剤を含有することである
。

従って、これらの調製物は、これらの蛋白質の療法的使
用、及び適用の範囲を決定するために設計された臨床研
究のためには許容されない、従って、親油性蛋白質を臨
床的及び療法的適用のために毒性レベルのＳＤＳを伴わ
ないで且つ十分に多量に回収する方法を手にすることが
望まれる。

１９８５年１０月１５日に公開されたＥＰ　１５Ｂ、４
８７は、ヒト血清アルブミン、還元化合物又はその組合
わせを含んで成りそして溶液として３〜６のｐｕに調整
されたインターロイキン−２組成物を開示している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、この発明は比較的高純度の組換β−インターフ
ェロンのごとき親油性蛋白質の医薬として許容されるサ
ンプルを提供することを目的とする。

この発明の他の目的は、組換β−インターフェロンのご
とき親油性蛋白質の医薬として許容されるサンプルを又
は臨床的及び療法的用途のために十分な量において提供
することである。

この発明の他の目的は、ＳＤＳを実質上含有せず且つ生
物学的活性を喪失しておらず、又はこれらが医薬として
許容されるレベルにある親油性蛋白質、例えば組換β−
インターフェロン調製物を提供することである。

この発明の他の目的は、ＳＤＳのレベルが約１０ｐｐｍ
未満である組換β−インターフェロン及びサンプルを提
供することである。

米国特許ｍ４，４６２，９４０はヒト組換β−インター
フェロンのごとき親油性蛋白質の生産、回収及び精製の
ための改良された方法を記載しており、この方法は適当
な可溶化剤により蛋白質を水性媒体中に可溶化し、可溶
化された蛋白質を脂肪族アルコールにより抽出し、水性
緩衝液によりアルコール相から蛋白質を沈澱せしめ、そ
して約１０．５〜１２．５のｐＨ、好ましくは約１２の
ｐＨにおいて、約１Ｏ０５〜１２．５のｐＨ１好ましく
は約１２のｐＨに調整された水に対しであるいは約１０
．５〜１２．５のｐＨ１好まシ＜ハ約１２のｐＨに調整
された水と脂肪族アルコール好ましくはエタノール及び
グリセリンとの混合物に対して蛋白質をダイアフィルト
レートしてＳＤＳを実質的に除去するか又はその濃度を
医薬として許容されるレベルに低下せしめる。蛋白質は
場合によっては、ダイアフィルトレージョンの前にクロ
マトグラフィーのごとき常法により精製される。

上記の方法の好ましい具体例においては、細菌細胞を破
砕し、適当な可溶化剤によりインターフェロンを可溶化
し、可溶化されたインターフェロンを２〜６、好寞しく
は４〜６の炭素鎖長の脂肪族アルコールにより抽出し、
アルコール相からインターフェロンを沈澱せしめ、イン
ターフェロンを常法、好ましくはゲル濾過クロマトグラ
フィーによりさらに精製し、そしてインターフェロン画
分を約１０．５〜１２．５のｐＨ，好ましくは約１１の
ｐＨにおいて、やはり約１０．５〜１２．５のｐＨ１好
ましくは約１１のｐＨに調整された純水、又は水と脂肪
族アルコール、好ましくはメタノール、エタノール、プ
ロパツール、ブタノール、グリセリン等との混合物に対
してダイアフィルトレートすることにより、細菌により
生産されたヒトβ−インターフェロンを回収する。

〔問題点を解決するための手段〕

この発明は、蛋白質のための安定剤を含有するｐＨ２〜
４の非毒性で不活性な療法的に適合性の水性キャリヤー
媒体中に溶解した生物学的に活性な組換β−旧ＦＮの療
法的有効量を含んで成る安定な医薬組成物に関する。好
ましくは、安定剤はヒト血清アルブミン、ヒト血清アル
ブミンとデキストロースとの混合物、ヒト血５！蛋白質
画分、又は正常血清アルブミンである。

この発明はまた、宿主の細胞壁を破砕しそして破砕物中
の蛋白質を単離しそして精製することにより、β−ＨＩ
ＦＮを生産するために形質転換された宿主からβ−）１
１ＦＮを回収する方法において、（ａ）　β−ＨＩＦＮ
を含有する媒体のｐ＋＋を約２〜４に調整する段階； （ｂ）　β−旧ＦＮ媒体に、約２〜４のｐＨにあらがじ
め調整しておいたβ−ＨＩＦＮのための安定剤を添加す
る段階；及び （Ｃ）生じた組成物をおよそｐＨ２〜４において凍結乾
燥する段階； を含んで成る方法に関する。

ｐＨを約２〜４に調整した後、これを好ましくは６．８
〜７．８のｐＨ範囲に上昇せしめることができる。

この方法はさらに、この組成物に非毒性で不活性な医薬
として許容される水性担体を添加することができる。

〔具体的な説明〕

この明細書において、“親油性蛋白質”なる語は、ｐ）
ｌが約６．５〜７．８の間にあり室温及び大気圧の周囲
条件下で水性媒体中に溶解しないか又は容易には溶解し
ない蛋白質を意味する。このような蛋白質の例には、ヒ
ト組換β−インターフェロン、及びリシンＡのごとき細
胞毒性（変性）成分を乳癌のごとき病理状態に対する抗
体に接合せしめることにより調製されるイムノトキシン
が包含される。”組換蛋白質”なる語は、組換ＤＮＡ技
法により生産される蛋白質を意味し、この技法において
は一最にＤＮＡが適当な発現プラスミドに挿入され、こ
のプラスミドが、異種性蛋白質を生産するために形質転
換されるＤＮＡに対して本来的でない宿主生物に挿入さ
れる。宿主は、前記ＤＮＡに対して外的である任意の生
物、例えば細菌、酵母、ウィルス、哺乳類等である。好
ましくは、宿主は微生物であり、そして最も好ましくは
細菌である。

この明細書において使用する場合、“β−旧ＦＮ”はヒ
トβ−インターフェロン、又はβ−インターフェロン様
ポリペプチドであって、組換ＤＮＡ技法によって生産さ
れ、そしてそのアミノ酸配列が非グリコジル化及び／又
はグリコジル化天然β−インターフェロンと同一である
か又は類似しておりあるいは実質的に相同なものである
。

蛋白質の正確な化学構造は多４ｊＡｓｌｉＪ羊に依存す
るであろう。イオン化可能なアミノ基及びカルボキシル
基が分子中に存在する場合、特定の蛋白質を酸性もしく
は塩基性塩として、又は中性の形で得ることができる。

適当な環境条件下に置かれた場合にそれらの活性を保持
しているすべてのこのような調製物がこの発明の蛋白質
の定義の範囲に属する。さらに、蛋白質の一次アミノ酸
配列には糖成分を用いる誘導体化（グリコジル化）、又
は他の捕捉的分子、例えば脂質、リン酸、アセチル基等
による付加（ａｕｇｕ＋＋ｅｎｔ）、さらに一般的には
サツカライドとの接合による付加を行うことができる。

このような付加のある観点は生産宿主の翻訳後プロセシ
ング系により達成され、他のこのような修飾をインビト
ロで導入することができる。ともかく、このような修飾
は、上に定義した蛋白質の活性が破壊されない限り蛋白
質の範囲に含まれる。

言うまでもなく、このような修飾は種々のアッセイにお
いて蛋白質の活性を増強するか又は低下せしめることに
よりその活性に定性的又は定量的に影響を与えると予想
される。

鎖中の個々のアミノ酸残基を酸化、還元、又は他の誘導
体化により修飾することができ、そして蛋白質を切断し
て活性を維持している断片を得ることができる。活性を
破壊しないこのような変化はその蛋白質配列を上記の定
義から排除しない。

最後に、翻訳中に配列に導入されるアミノ酸の欠失、付
加、又は変化による一次構造それ自体の変更を蛋白質の
活性を破壊することなく行うことができる０例えば、生
物学的活性のために必須ではなく、生物学的に活性な蛋
白質中に存在し、そしてジスルフィド連結を形成するた
めに開放されている少なくとも１個のシスティン残基を
除去するか又は他のアミノ酸で置き換えることにより分
子間架橋のため又は正しくない分子内ジスルフィド結合
形成のための部位を除去することができる。

ミューティン（ｍｕｔｅｉｎ）として知られるこのよう
な変形された蛋白質は１９８５年５月２１日に発行され
た米国特許Ｎａ４．５１８，５８４に記載されている。

他の例において、ＩＦＮ−βのごとき生物学的に活性な
蛋白質の保存的アミノ酸がクロラミンＴ又は過酸化物酸
化に対して感受性の各メチオニン残基の代りに使用され
、追加の非感受性メチオニン残基はそのように置換され
ない、この文脈における保存的アミノ酸置換は、生物学
的活性に不都合な影響を与えないものでありそして中性
又は非極性アミノ酸置換あるいはメチオニンの欠失を含
むものとして定義される。

好ましくは、この発明において蛋白質はβ−ＨＩＦＮで
ある。最も好ましくは、蛋白質は、ヒトＩＦＮ−β遺伝
子により、又は（ａ）天然ヒトＩＦＮ−βのアミノ酸配
列と少なくとも実質的に同じアミノ酸配列及び（ｂ）天
然ヒ）　ＩＦＮ−βと共通な生物学的活性を有する蛋白
質をコードするヒトＩＦＮ−β遺伝子の変形体により形
質転換された微生物により生産される非グリコジル化β
−旧ＦＮである。アミノ酸配列の実質的同一とは、配列
が同一であるか、又は合成蛋白質と天然ヒトＩＦＮ−β
との関の不都合な機能的差異を生じさせない一右→嚇複
数のアミノ酸の変化（欠失、付加、置換）により異るこ
とを意味する。このような蛋白質の例は米国特許１ｍ　
４，５１８，５８４に記載されているＩＦＮ−β蛋白質
である。最も好ましくは、アミノ酸位置１７のシスティ
ン残基がセリン残基により置き換えられているｓｅｔ、
、　ＩＦＮ−βである。

この明細書において使用する場合、“生理的ｐｌ（”な
る語は咄乳頻にとって医薬的に許容されるｐＨ１すなわ
ち約７．２〜７．６のｐＨを意味する。

この明細書において使用する場合、親油性蛋白質に適用
する際の“安定剤”なる語は、ダイアフィルトレートさ
れた蛋白質を変性及び生物学的活性の喪失から安定化す
るのみならず、医薬組成物がダイアフィルトレートされ
た蛋白質のｐｔｔｅ、ａ〜７．８の水性溶液から成りこ
れから蛋白質が沈澱しないように親油性蛋白質を水性媒
体中に可溶化する非毒性、非療法性、非免疫原性組成物
を意味する。このような安定剤は、それらの可溶化機能
について当業界において知られていない。このような安
定剤の例には蛋白質及び炭水化物が含まれ、好ましくは
蛋白質はヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）及びヒト血漿蛋
白質画分（Ｐ　Ｐ　Ｐ）から選択され、そして炭水化物
はマンニトール、ソルビトール、グリセリン、デキスト
ロースから選択される。あるいはこれらの混合物から選
択される。しかし、これらに限定されない。

使用する安定剤のタイプ及びその濃度は主として使用さ
れるｐＨ法及び配合、並びに蛋白質に依存するであろう
。例えば、ＩＦＮ−βＳｅｒ　＋　１を用いる低ｐＨ配
合のためにはＰＰＰが好ましい。

ＰＰＰは商業的に入手可能であり、そして８３％以上の
アルブミン及び１７％未満のグロブリン（α及びβ）か
ら成り、γ−グロブリンは蛋白質の１％未満である。血
漿中のα−及びβ−グロブリンは幾つかの機能を果し、
その１つは比較的不溶性の血液成分、例えばコレステロ
ール、脂溶性ビタミン及びホルモン類を安定な水溶液に
維持することである。炭水化物安定剤はｐＨ２〜４に保
持され／凍結乾燥された配合においてのみ使用され得る
。

安定剤の最終濃度は一般に、主として蛋白質及び安定剤
のタイプ並びに使用するｐＨに依存して０．１−１０ｗ
／ｖ％の範囲であり、低いｐＨのためには高い範囲が好
ましい、β−ＨＩＦＮのためのＨ３Ａについては０．５
〜１０ｗ／ｖ％の範囲が典型的であり、そしてβ−ＨＩ
ＦＮのためのＰＰＰについては０、１〜５　ｗ　／　ｖ
％が典型的である。

親油性組換蛋白質、例えば細菌により生産されたβ−旧
ＦＮの回収のために使用される方法は、細胞性材料から
の蛋白質の可溶化及び単離のためのＳＤＳ又は類似の界
面活性剤並びにそれに続く蛋白質の取得のための酸沈澱
を用いる。中性又はそれに近いｐＨにおいて行われる他
の精製技法により最終蛋白質調製物中のＳＤＳレベルは
約０．１％に低下するが、しかしこのような残留レベル
でも動物に対する研究において毒性であり、そしてそれ
故に療法的又は臨床的適用のために許容されないことが
見出されている。４〜８のｐＨ範囲におけるダイアフィ
ルトレージョン技法によるＳＯ３のそれ以上の除去は、
蛋白質の凝集及び沈澱に基くほとんど完全なβ−旧ＦＮ
活性の喪失をもたらす。ダイアフィルトレージョン中に
失われるβ−ＨＩＦＮの生物学的活性はＳＤＳの添加に
より回復し得る。

遊離の又は非結合の溶質について、よく混合された容器
からのダイアフィルトレージョン中の除去速度は一次反
応速度に従う。その臨界ミセル濃度以下の非結合ＳＤＳ
は１０，０００ダルトンのカットオフの膜を通して障害
されないで通過するのに十分に小さい分子であるから、
その除去速度は一次速度に従うと予想され、そしてそう
であれば、約１０００μｇ／ｍｌの初期濃度のＳＤＳは
７容量の置喚の後１μｇ／ｍｊ！未満に低下するはずで
ある。

しかしながら、β−旧ＦＮからのＳＤＳの除去はこの理
論的モデルと合致しないことが見出され、ＳＤＳの除去
の速度に実質的に影響を与える蛋白質−５ＤＳ相互作用
が存在すること、及び４〜８のｐＨ（範囲におけるこの
結合状態からのＳＯ３の除去が蛋白質−蛋白質相互作用
を促進して蛋白質の凝集又は沈澱をもたらすことが示さ
れた。一層高いか又は一層低いｐＨにおいては幾つかの
蛋白質が変性することが知られているから、ＳＤＳの除
去のための一層高いか又は一層低いｐＨは好ましくない
と予想されるかも知れない。しかしながら、この発明に
従えば、低イオン強度でのダイアフィルトレージョンに
よるか又は脱塩によるＳＤＳの除去の後、それぞれ塩基
又は酸の添加によるｐＨの上昇又は低下が蛋白質を可溶
化し、そして配合物中のその生物学的活性を実質的に回
復せしめる。

従って、この発明は、ＳＤＳの除去による親油性蛋白質
の凝集及び沈澱並びに蛋白質活性の喪失の問題を解決す
る。米国特許−４，４６２，９４０中に記載されている
１つの問題解決策は、まずｐｇを約１Ｏ０５〜１２．５
に調整し、そして場合によっては蛋白質の部分的に精製
されたサンプルをジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はメ
ルカプトエタノール又はグルタチオン又はシスティンに
より約６０℃及び約８．５のｐＨにて還元した後に、ｔ
ｏ、ｏｏｏの分子量のカットオフの限外濾過膜を用いて
蒸留水又はアルコールの水性混合物に対してダイアフィ
ルトレートして蛋白質の凝集を回避することを含む、ア
ルコールの例にはエタノール、ブタノール、グリセリン
、マンニトール、ソルビトール、デキストロース等が含
まれる。

本発明の問題解決策は、精製された蛋白質プールのｐＨ
をまず約２〜４に調整し、あらかじめ２〜４のｐＨに調
整された安定剤を添加し、場合によってはこの混合物を
インキュベートし、そしてそのｐＨを６．８〜７．８に
上昇せしめることを含む。インキュベーション時間は、
主として蛋白質のタイプ、安定剤のタイプ、正確なｐＨ
１並びに蛋白質及び安定剤の濃度に依存し、そして典型
的には０〜１００分間、好ましくは１０〜１００分間、
さらに好ましくは１５〜６０分間、そして最も好ましく
は１５〜４５分間の範囲である。

さらに、他のしかしあまり好ましくない観点において、
この発明の問題解決策はｐＨが低い場合であり、安定剤
及び蛋白質プールを一緒に混合し、そして混合物のｐＨ
を２〜４に調製し、そしてこのｐｌ（を徐々に又は一度
に６．８〜７．８に上昇せしめる。

従ってこの発明は、ＳＤＳレベルが毒性レベルより低く
そして適当なキュリヤー媒体中療法的に許容される製剤
に再構成され得る比較的高純度の親油性組換蛋白質の回
収方法、及びＳＤＳレベルがｌ　Ｏｐ、ｐ、ｍ、未満で
あって通常２〜６　Ｌｐ、１１．の範囲にある親油性蛋
白１を組成物、最も好ましくはβ−ＨＩＦＮＭｉ成物に
関する。

この発明を実施するために、細菌が好ましい微生物宿主
であり、Ｅ、コリが最も好ましい。

−ａに、蛋白質は高アルカリ性ｐＨ範囲において変性、
ペプチド結合加水分解、個々のアミノ酸の加水分解、β
−エリミネーション、ラセミ化、異るアミノ酸の形成及
び類似の反応に対して感受性であるが、しかしβ−旧Ｆ
Ｎについては、上記の分解的反応は検出されない。他方
、この蛋白質が約１１のｐＨにおいてダイアフィルトレ
ートされる場合、得られるβ−ＨＩＦＮは純粋で且つ均
一であり、そして天然β−１１１ＦＮＯ比活性に近い高
い比活性を示す。

この発明の方法の好ましい態様においては、破砕された
細胞を処理してβ−旧ＦＮ蛋白質を単離しそして精製し
、そして次に下記の段階を行う。

（ｒ）蛋白質をＧ２５クロマトグラフイーによりｐＨ９
，２〜１１にて脱塩し； （ｓ）脱塩されたプールのｐＨを約３．５に澗製し；（
１）ヒト血清アルブミン又は血漿蛋白質画分の溶液のｐ
ＨをｐＨ３，５に調整し； （ｕ）前記ヒト血清アルブミン又は血漿蛋白質画分を前
記脱塩されたプールに添加し、そして１５〜４５分間イ
ンキュベートし； （ν）所望により、蛋白質サンプルを凍結乾燥し；そし
て （ｗ）所望により、凍結乾燥された蛋白質サンプルを再
溶解する。

この発明の他の態様においては、破砕された細胞を処理
してβ−ＨＩＦＮ蛋白質を単離しそして精製し、そして
次に下記の段階を行う。

（ｒ）蛋白質をＧ２５クロマトグラフイーによりｐＨ９
，２〜１１にて脱塩し； （ｓ）ヒト血清アルブミン又は血漿蛋白質画分を前記脱
塩されたプールに添加して混合物を形成し；（１）前記
混合物のｐＨを３〜４に低下せしめ；（ｕ）前記混合物
を１５〜４５分間インキュベートし；（ν）所望により
、蛋白質サンプルを凍結乾燥し；そして （ｗ）所望により、凍結乾燥された蛋白質サンプルを再
溶解する。

β−ＨＩＦＮは好ましくは、５ｈａｋｅｄ等の米国特許
隘４．５３０．７８７に記載されているように０−ヨー
ドソ安息香酸溶液を用いて、又は“組換蛋白質における
ジスルフィド結合の形成の促進方法”と題するにｏ　ｔ
ｈｓ等の米国特許１１１ａ　４，５７２．７９８に記載
されているように塩化銅を用いて、そのシスティン残基
が架橋されてシスチンを形成するように酸化される。

この特許の開示を引用によりこの明細書に組み入れる。

蒼白質を得るための詳細な方法は次の通りである。

形質転換された微生物を適当な増殖培地中で、典型的に
は６８０ｎｍにて約１０以上の光学濃度（ＯＤ）に、そ
して好ましくは６８０ｒ＋＋＋＋にて約５０〜１００の
ＯＤに増殖せしめる。増殖培地の組成は使用される特定
の微生物に依存するであろう。水性増殖培地は選択され
た微生物の栄養要求を満たす化合物を含有する。増殖培
地は典型的には資化性炭素源及び窒素源、エネルギー源
、マグネシウム、カリウム及びナトリウムのイオン、並
びに場合によってはアミノ酸並びにプリン及びピリミジ
ン塩基を含有するであろう。（Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｍ
ｅｄｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｌａｎｇｅ
　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第１４
版、８０−８５頁（１９８０）を参照のこと。〕Ｅ、コ
リのための増殖培地は、当業界においてよく知られてい
る。この発明の方法において使用される特定の可溶化剤
に依存して、該可溶化剤の水中での溶解性を低下せしめ
るであろう増殖培地中の物質量を最少にすることが望ま
しい。例えば、カリウムイオンはＳＤＳの溶解性に影響
を与え、そしてそのために、この方法においてＳＤＳが
使用される場合には最少に維持されるべきであり、ある
いは濃縮段階後のダイアフィルトレージョンにより除去
されるべきである。

培養物が所望の細胞濃度に達した後、場合によっては、
加熱により、又は細胞が死滅した後に容易に除去され得
る細胞変性剤、例えばクロロホルム又はトルエンを培地
に添加することにより、細胞を死滅せしめる。次に、場
合によっては細胞を約２０〜１５０　ｍ　ｇ　／　ｍ　
１、好ましくは８０〜１００　ｍ　ｇ／　ｍ　１　＜６
８０ｎｒｓにおけるＯ　Ｄ　：　４０〜３００　、好ま
しくは１６０〜２００）に、クロス−フロー濾過、遠心
、又は他の常用法により濃縮する。

この濃縮段階の後、微細物の細胞壁を破砕して濃縮物中
の粒状物の可溶化を促進する。生物学的活性につＬｌて
の蛋白質アッセイは、蛋白質の多くが細胞膜に聞這付け
られている（すなわち、その中に含有されているか、又
はそれに結合している）ことを示す。従って、細胞膜の
破壊が可溶化剤と膜との接触を増強し、そして、それ故
に膜の関連付けられているインターフェロンが溶液中に
移行する速度を上昇せしめる。常用の細胞破砕技法、例
えば均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）　、音波
処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、又は圧力循環（ｐｒｅ
ｓｓｕｒｅ　ｃｙｃｌｉｎｇ）を本発明のこの段階にお
いて使用することができる。必要であれば、破砕の前又
は後に、それぞれｔａ縮物又は破砕物の液相のｐＨを、
該濃縮物又は破砕物中の可溶化剤及び粒状物の溶解を促
進するしヘルに調整する。適当な緩衝液を添加すること
により、又はＮａＯＨによりｐＨをそのように調整する
ことができる。はとんどの場合、約７〜約８の範囲のｐ
Ｈが好ましい。

破砕された細胞を処理するために種々の技法を使用する
ことができる。１つの方法においては、細胞が破砕され
た後、粒状物を破砕物中液相から分離し、そして可溶化
のために最適なｐＨに緩衝化された水性媒体中に再懸濁
することができる。可７容化後の細胞懸濁液の蛋白質濃
度は約２〜約１５ｍ　ｇ　／　ｒｎ　１　、好ましくは
６〜８ｍｇ／ｍｌの範囲である。

親油性組換蛋白質を含む粒状細胞材料の可溶化は、破砕
と同時に又は破砕の後に引き続いて行うことができる。

破砕後の別個の段階として行うのが好ましい。可溶化は
好ましくは完全に行う。すなわち、破砕物中の粒状物（
例えば、蛋白質、脂質、核酸、リン脂質）の実質上すべ
てを水性媒体中に溶解せしめる。粒状物の実質的に完全
な溶解は、適当な可溶化剤を水性懸濁液に添加すること
によって達成される。蛋白質を可溶化するために適切な
疎水性−親水性バランスを有し、そして有機相に抽出さ
れ得る蛋白質と複合体を形成する界面活性剤（洗剤）を
この発明において使用することができる。天然又は合成
強陰イオン界面活性剤、例えば脂肪酸のアルカリ金属塩
及びアルカリ金属アルキルサルフェートを使用すること
ができる。

このような界面活性剤は通常１０〜１４個の炭素原子を
含有するであろう、ＳＤＳ及びラウリン酸ナトリウムが
特に好ましい可溶化剤である。この発明の方法において
使用することができる他の可溶化剤の例には、ドデシル
スルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、テトラ
デシル硫酸ナトリウム、トリデシルスルホン酸ナトリウ
ム、ミリスチン酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウム、
ナトリウムカブロイレート（ｓｏｄｉｕｍ　ｃａｐｒｏ
ｙｌａｔｅ）　、ナトリウムドデシルＮ−サルコシネー
ト、及びナトリウムテトラデシルＮ、−サルコシネート
が含まれるがこれらに限定されない。

可溶化において使用される可溶化剤の量は特定の可溶化
剤及び可溶化されるべき蛋白質の量に依存する。はとん
どの場合、約１：１〜１０：１の可溶化剤と蛋白質の重
量比で十分である。ＳＤＳが使用される場合、約１：ｌ
〜約５：ｌ、好ましくは約３：ｌのＳＤＳ対蛋対質白質
率が使用される。１５℃〜６０℃の範囲の温度が一般に
可溶化において使用される。溶液と粒状物との間の接触
を増強し、そしてそれによって細胞材料を溶解するため
に必要な時間を短縮するために混合を用いることができ
る。溶液が実質的に透明である場合に可溶化が完全であ
ると考えられる。２８０ｎｍにおける約４．０〜８．０
の光学濃度が可溶化工程の終点に特徴的である。

可溶化の後、必要であれば、溶液のイオン強度を、該溶
液と有機抽出剤とが実質的に不混和性であるレベルに調
整する。イオン強度は約０．０５〜０．１５の範囲であ
る。この目的のため、Ｎａｃｌ及び／又はこれに類似す
るものを包含する無機塩を溶液に加える。このようなイ
オン強度が、抽出後の相分離を可能にする。この工程で
使用される抽出剤はアルコール、例えば２−ブタノール
、２−メチル−２−ブタノール、又はこれらの混合物で
ある。混合物は好ましくは５０容量％未溝の２−メチル
−２−ブタノールを含有する。２−ブタノールが好まし
い抽出剤である。可溶化物から親油性蛋白質を抽出する
これらのアルコールの能力は特異的である。抽出剤は一
般に蛋白質の水性溶液と約ｏ、ａ：ｉ〜約３：１、好ま
しくは約】：１　（抽出剤：水性溶液）の範囲の容量比
で混合される。

抽出は常用の回分式又は連続式液−液抽出技法及び装置
を用いて行うことができる。抽出は一般に約２０℃〜１
００℃にて行い、約１分間〜１時間の接触時間を用いる
。最適接触時間は特定の可溶化剤及び抽出剤の組合わせ
に依存する。ＳＤＳを使用する場合、上記の範囲内で短
い時間を用いることができる。ラウリン酸ナトリウムを
使用する場合、上記範囲内で長い時間を用いなければな
らない。

抽出混合物のｐＨは約６〜９の範囲であり、ＳＤＳを使
用する場合には約７．５のｐＨが好ましく、そしてラウ
リン酸ナトリウムを使用する場合、約８．５のｐＨが好
ましい。

抽出が完了した後、水相及び抽出物相を分離し、そして
抽出物相から蛋白質を単離する。使用する特定の単離法
は使用する可溶化剤、及び最終生成物の純度の所望され
る程度に依存する０種々の単離技法、例えば沈澱、分子
篩クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、及び電気泳動等を使用することができる。ＳＤＳ
を使用する場合、抽出物溶液を水性緩衝液と約２．０：
１〜約５：１、好ましくは約３：１の容量比で混合し、
そしてｐＩＩを典型的には約５〜７の範囲に下げること
により、目的の親油性蛋白質を他の蛋白質と一諸に抽出
物から沈澱せしめる。第２図に示すように、ｐＨ４〜８
の範囲におけるβ−ＨＩＦＮの回収は、ｐＨの上昇に従
って蛋白質の回収が下降する傾向にあることを示してお
り、約８のｐＨにおいては約６０％より多くの回収ロス
が生ずる。上清からの沈澱物の分離及び該沈澱からの残
留抽出剤の蒸発により、沈澱段階のｐＨが５．５より高
い場合、蛋白質純度が約９０％より高い生成物が得られ
る。この生成物はさらに微量の核酸（ＩＷ％未満〜２Ｗ
％）及びＳＤＳ（１ｗ／ｖ％未満）を含有する。

当業界において公知の方法（クロマトグラフィーを含む
がこれに限定されない）によりさらに精製した後、ＳＤ
Ｓを、この発明の１つの態様においてはｐｌ（約１０．
５〜１２．５、好ましくはｐＨ約１２でのダイアフィル
トレージョンにより除去することができる。第２精製段
階は任意的であり、そしてダイアフィルトレージョンに
よるＳＤＳの除去のためには必要でない。可溶化剤とし
てラウリン酸ナトリウムを使用する場合、ｐ）ｌを下げ
た後に、これは蛋白質と一緒に抽出物から沈澱する。有
機溶剤、例えばアセトン、メタノール等を用いて蛋白質
からラウリン酸ナトリウムを抽出する。ダイアフィルト
レージョンに先立って、蛋白質を適当な還元剤により還
元する。この目的のためにメルカプトエタノール、グル
タチオン、システィン及びジチオスレイトール（ＤＴＴ
）を用いることができ、ＤＴＴが最も好ましい。

次に、こうして単離された蛋白質を上記の安定剤を用い
て水性キャリヤー媒体中に可溶化する。

しかしながら、可溶化が生ずるためには、安定剤を単に
蛋白質に混合することはできない、まず、適当な塩基を
用いて安定剤のｐＨを１０．５〜１２．５に、好ましく
は約１２に上昇せしめなければならず、次にこの安定剤
をｐｌｌｌｏ、５〜１２．５のダイアフィルトレートさ
れた蛋白質プールに加え、そして最後に得られた配合物
のｐＨを約６．８〜７．８に低下せしめる。　ｐＨを下
げた後、蛋白質は媒体中に可溶化する。

破砕された細胞を処理するための他の方法が第５図（ａ
）及び第５図（ｂ）に示されている。この図は異種性蛋
白質を含有する屈折体を微生物宿主から回収する方法を
要約したものである。この方法においては、蛋白質を屈
折体から抽出し、そしてＳＤＳのごとき変性剤により可
溶化する。後でＳＯ３を脱塩カラムにより除去する。溶
出液のｐ）１を２〜４に調整し、安定剤のｐ）ｌを別途
ｐＨ２〜４に調整し、安定剤を溶出液に加え、この混合
物場合によっては一般に、上記の因子に依存して約１０
〜１００分間インキュベートし、そしてｐＨを６．８〜
７．８に調整する。

他の方法においては、第６図に示すように、破砕物をチ
ャオトロビック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐＨｃ　ａｇｅｎｔ
）で抽出し、蛋白質を可溶化し、そして還元し、そして
還元された蛋白質を分離し、酸化し、精製し、そして回
収する。インキュベーション期間を用いる低ｐＨ調整法
を用いて第６図中の配合物が得られる。

療法的又は臨床的用途のための製剤に使用されるキャリ
ヤー担体は非毒性で不活性な水性ビヒクル、例えばヒト
又は動物に投与するための薬剤を製剤するために一般に
使用されるものである。キャリヤーはさらに、それが親
油性蛋白質の生物学的活性に影響を与えないように選択
される。

このようなキャリヤーの例には蒸留水、生理的塩水、リ
ンゲル溶液、デキストロース溶液、及びバンク溶液が含
まれる。凍結乾燥された親油性蛋白質を再溶解するため
に同じキャリヤーを使用することができる。

次の例により、この発明をさらに説明する。これらの例
は説明のために記載するものであり、この発明の範囲を
なんら限定するものではない。これらの例において特に
ことわらない限り、すべての部及び％は固体については
重ＭＬ準であり、そして液体については容量基準である
。すべての温度は℃で示す。

肛 ＩＦＮ−βｓ、ｒｕｔは微生物的に生産されたＩＦＮ　
−βのミューティンであり、アミノ酸位置１７のシステ
ィンがセリン残基により置き換えられている。

ＩＦＮｓ＊ｒＭ７は２個−の残りのアミノ酸残基を有し
、１つは位置３１に存在し、そして他方は位置１４１に
存在する。天然ＩＦＮ−βにおいて、位置３１及び１４
１のシスティンは相互反応してジスルフィド橋を形成す
る。　　ＩＦＮ−β１゜Ｐ＋７を製造するためにこの例
において使用される遺伝子操作されたＥ。

コリ株は、アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレク
ション、１２３０１バークラウンドライブ、ロックビル
、メリーランド２０８５２　、米国に、１９８３年１１
月１８日に受託番号１に３９，５１７として寄託されて
いる。

上記の遺伝子操作されたＥ、コリを下記の培地中で増殖
せしめた。

Ｎａ、サイトレート・２Ｈ２０３ｍＭ ｎｚｐｏ４３０　ｍＭ （ＮＨ４）ｔｓＯ，７４ｍＭ ＭｇＳＯｎ　　・ＨｚＯ３ｍ　Ｍ ＭｎＳＯ４・Ｈｚｏ　　　　　　　　　　　　４６　／
’　ＭＺｎＳＯ４Ｈ７Ｈｚ０　　　　　　　　　　４６
１Ｊ　ＭＣｕＳＯａ　　・５８ｔ０　　　　　　　　　
１　２／ｊＭＬ−トリプトフェン　　　　　　　３５０
μＭＦｅＳＯａ　　−７ＨｚＯ７４ｕ　Ｍ チアミン・ＩＩｃＩ！０．００２χ（−／ν）グルコー
ス　　　　　　　　　　　０．５χ（鍔／ｖ）ダウコー
ニング・アンチホームＢの２５％溶液、グルコースの５
０％溶液、及び５Ｎ　ＫＯ）ｌを必要により添加した。

温度は３７ｔ１℃に保持し、ｐＨはＮａ１ｌ（により６
．５±０．１に保持し、そして溶存酸素は空気飽和の３
０Ｗ／Ｗ％に保持した。光学濃度及び残留グルコース測
定値を１４時間目、及びその後約１時間ごとに取った。

グルコースの消費が４０ｔ６ｇ／　１　（６８０ｎｍで
の０Ｄ＝１０〜１１）に達した時、収得を行った。

収得材料を加圧下で微細孔クロス−フローフィルターを
通して循環せしめることによりそれを約３倍に濃縮した
。収得材料が４〜５倍に濃縮されるまで、濃縮された細
胞を脱イオン水に対してダイアフィルトレートした。次
に、細胞をＭａｎ　ｔｏｎ−Ｇｕａｌｉｎホモジナイザ
ーに４．１〜５．５　Ｘ　１０’　ｋｐａ（０，６〜０
．８ｐｓｉ）で通すことにより細胞を破砕した。最初の
通過の後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−リン酸
ナトリウム緩衝液を、２　ｗ　／　ｖ％（ＳＤＳ）及び
０．０８Ｍリン酸ナトリウムの最終濃度となるように添
加し、そして可溶化を１時間続けた。

次に、固体ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を５０ｍＭの
最終濃度に加え、そしてホモジネートを９０ｔ５℃に１
０分間加熱した。得られた細胞懸濁液を２−ブタノール
により、２−ブタノール：懸濁液の容量比１：１として
静置ミキサー中で抽出した０次に、混合物を遠心し、そ
して２−ブタノール−リッチ相を集めた。

２−ブタノール−リッチ相をリン酸緩衝化塩溶液（Ｐ　
Ｂ　Ｓ）中０．Ｉｗ／ｖ％ＳＤＳの２．５容量と混合し
た。固体ＤＴＴを１ｍＭの最終濃度に加えた。混合物の
ｐＨを氷酢酸により６．２±０．１に調整し、そしてこ
の混合物を遠心した。生じたペーストを集め、そしてＩ
Ｎ　ＮａＯＨによりｐＨを８．５±０．１に調整しなが
ら、ＰＢＳ及び１０ｗ／ｖ％ＳＤＳの混合物に再懸濁し
た。固体ＤＴＴを１００ｍＭの最終濃度に加え、そして
懸濁液を９０ｔ５℃に１０分間加熱した。次に、この懸
濁液を約２５℃に冷却し、氷酢酸によりｐＨを５．５±
０．１に調整し、そして溶液を濾過した。

次にこの溶液を、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ＃酸ナトリウム
、１ｍＭ　　ＩＥＤＴＡ（ｐＨ５，５）から成る緩衝液
と共にセファクリルＳ−２００プレカラムに通用した。

最高のインターフェロン活性を含む画分をプールし、そ
して１０キロダルトン分子量カットオフの限外濾過によ
り濃縮した。

５ｈａｋｅｄ等、前掲、の方法を用いて蛋白質を酸化し
てスルヒドリル結合を生じさせた。０−ヨードソ安息香
酸を水中で混合し、混合物を約５分間音波処理し、そし
て攪拌しそして２％ＮａＯＨをゆっくりと加えて８．２
±０．２の最終ｐＨを得ることによりｌｍＭｏ−ヨード
ソ安息香酸溶液を調製した（塩基の添加に代えて追加の
音波処理を用いることができる）。

Ｎａ４ＰｚＯ１Ｈ１０１５０を２ｍＭの４度に水に溶解
することにより反応緩衝媒体を調製した。１０％酢酸を
加えることによりこの溶液のｐ）ｌを９．０に調整し、
そしてＳＤＳを０．１％に、そしてエチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）を１ｍＭに、Ｏ−ヨードソ安息香酸溶
液を１５ＭＭになるように、溶液に添加した。

緩衝媒体を、マクネチソクスクーラー及び９．０にセッ
トしたｐＨ電極を装着した反応容器に入れた。

ＩＦＮ−、。ｒ＋？調製物及びＯ−ヨードソ安息香酸溶
液を、保持容器から、等モル比のＩＦＮ及び酸化剤導入
するように調整されたベリスタルポンプを用いて反応混
合物に導入した。必要に応じて０．２５Ｍ　ＮａＯＨを
ペリスタルポンプを介して５ｍ７！７時で加えることに
より、反応混合物のｐＨを９．０に調節した。ＩＦＮ−
β溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）中５　ｍ　
ｇ　／　ｍ　ＩＩ　）を２ｍ１／時（７，０μｍｏ１／
時）の流速で約７時間添加し、０−ヨードソ安息香酸溶
液を７ｍｆ／時（７μ＋ｎｏｉｌ　７時）で同し時間加
えた。その後酸溶液の添加を続けて１０＝１５μＭの最
終過剰量とした。反応を、逆相）ＩＰＬＣにより及びＦ
、ｌ１ｍａｎアッセイにより　ＩＦＮ−βｓ、ｒｕｔの
残留チオール含量をアッセイすることにより追跡した。

６．５時間後、１０％酢酸を反応混合物に加えてｐＨを
５．５にすることにより反応を停止した。

次に、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴ＾及び５０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）から成る緩衝液を用いて
セファクリル−２００カラム上に生成物を負荷した。こ
のカラムからのモノマーピークをプールし、そして０．
１％ＳＤＳ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、及び５０ｍＭ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５，５）から成る緩衝液を用いてセフ
ァデックスＧ−７５カラム上にプールした。

↓−」」翻ロス金 Ｇ−７５プールからの合計１．３　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ
のＩＦＮ−βの全部を、ｐＨＩＩの緩衝液により平衡化
された脱塩Ｇ２５セフアデツクスカラム上に負荷した。

合計２．２％の血漿蛋白質画分（ＰＰＰ）をｐＨ３に調
整し、そして０．２５ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのＩＦＮ−β
を含有する５、５６ｍ　ｌＯ脱塩ＩＦＮに加えた。ＰＰ
Ｐはコーンフラクション（Ｃｏｈｎ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ
）ＩＶ、に由来する。ＰＰＦはＩ　Ｓ　Ａに類似するが
、ＰＰＰはより多（のα−及びβ−グロブリンを有する
。フラクション［Ｖ、は最高量のα−及びβ−グロブリ
ンを有する。ＩＦＮ−β及びＰＰＰの混合物を約４５分
間インキュベートし、そしてｐＨ７，４に調整した。

ＩＩ　、　　ＰＰＰ／ｌｌ５Ａ配合 合計３　Ｑｍｌの上記Ｇ−７５１ＦＮ−βプールを１０
．５ｍｊ！に濃縮し、そしてｐｌ＋を１１に調整した。

ｐＨｌｌに十分に平衡化したＧ２５セフアデツクスカラ
ム上で濃縮物を脱塩した。ＩＦＮＯ脱塩されたプールを
使用して次の実験を行った。

０．２５ｍ　ｇ　／　ｍ　１のＬＦＮを含有する合計３
．３３ｍ１Ｏ脱塩ＩＦＮ−βを各実験において使用し、
そして各混合物のｐＨをインキュベーション前に３に調
整し、そしてインキュベーション後７．３〜７．５に調
整した。結果を次の表に示す。

ＩＳＡ　　　　２．５　　　　　４５　　　　　わずか
に曇るＩＳＡ　　　　５．０　　　　　　４５　　　　
　非常に透明ＩＳＡ　　　　２．５　　　　　１５　　
　　　わずかに曇るＩＳＡ　　　　５．０　　　　　１
５　　　　　非常に透明ＰＰＰ　　　　２．５　　　　
　　４５　　　　　非常に透明ＰＰＰ　　　　２．５　
　　　　　１５　　　　　非常に透明視覚的に試験した
場合、ＰＰＰ配合物が最良の透明度を有し、５％Ｈ３Ａ
が次に良く、２．５％ＩＳＡがこれに続くことが見出さ
れた。各配合物を凍結乾燥し、そして水で再溶解した場
合、ＨＳＡ配合物に比べてＰＰＰ配合物がより透明に再
溶解された。

インキュベーション期間を伴わないでｐＨ３〜４にて行
われた実験は、インキュベーション期間を経験した実験
からの明らかな差異を示さないようであった。しかしな
がら、ＰＰＰの濃度の変化は透明度の顕著な差異をもた
らした。

ｐＨ３配合物を最適化するための実験は、５％Ｈ３Ａ配
合物が２．５％Ｈ５Ａ配合物に比べて明らかに良好であ
ることを示した。さらに、１５分間から６０分間へのイ
ンキュベーション時間の延長が溶解性を助けた。しかし
ながら、５％Ｈ３Ａ１５分間のインキュベーションは２
．５％Ｈ３Ａ６０分間のインキュベーションより良好で
あることが見出された。

上記の結果は、ＩＦＮ−βのためにはＰＰＰがＨ３Ａよ
りも良好な安定剤であることを示している。さらに、ｐ
Ｈ３での代表的な配合された蛋白質の生物学的活性の試
験は、ＩＦＮ−βが生物学的に活性であることを示した
。

ｌ−應」肪５勺丑トー聚酷企 ｐＨが２〜４に保持され、そしてｐＨ２〜４において凍
結乾燥される場合、２〜４の低ｐＨにて組換βインター
フェロン製剤を安定化するために安定剤を使用すること
ができる。しかしながら、ｐＨが４以上に上昇すればマ
ンニトールのごとき炭水化物安定剤は親油性蛋白質を安
定化するために機能しないであろう。ｐｕが生理的ｐＨ
に上昇する場合、Ｈ５Ａのごとき蛋白質安定剤のみが蛋
白質を可溶化するであろう。

〔結　論〕

この明細書に記載したこの発明の方法及び組成物が、比
較的高純度であり、残留ＳＤＳレベルが約１０ｐｐａ＋
未満であり、そして臨床及び療法用の非毒性の不活性な
生理的に許容されるキャリヤー媒体中療法的に許容され
る調製物に製剤化され得る親油性蛋白質調製物をもたら
す。この発明の主たる利点は、蛋白質調製物中のＳＤＳ
レベル（若干の患者において肝臓毒性を相乗し得る）が
約２〜２０　ｐ、ｐ、ｍ、に、好ましくは約２０ｐ、ｐ
、ｍ、未満に、そしてさらに好ましくは約２〜６　ｐ、
ｐ、ｍ、に（これらは療法的に許容される）低下する点
にある。記載された好ましい具体例は特にβ−旧ＦＮに
関するが、この発明の精製法はβ−旧ＦＮに類似する親
脂性を有する他の蛋白質の精製に使用することができる
。

以上、この発明の好ましい態様を記載したが、この発明
の範囲がこの範囲に限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）及び第１図（ｂ）は、この発明の工程段階
のフローチャートを示し、この場合ｐＨはダイアフィル
トレージョン中アルカリ性ｐＨに上昇せしめる。 第２図は、組換ヒトβ−インターフェロンの全体に対す
る回収の％及び沈澱段階中の生成物の純度を、約４〜８
の範囲でのｐＨの関数としてプロットしたグラフである
。 第３図は、ビニルポリマーゲルカラムを３回通した後に
溶出された組換ヒトβ−インターフェロンの均一性を示
すクロマトグラフチャートの例である。 第４図は、組換ヒトβ−インターフェロンの抗ウィルス
活性を約６〜１２の範囲でのｐＨの関数としてプロント
したグラフである。 第５図（ａ）及び第５図（ｂ）は、この発明の工程段階
のフローチャートを逐次的に示しており、この方法にお
いては蛋白質は屈折体から回収され、そしてｐｎは安定
剤添加のために酸性ｐＨに低げられる。 第６図は、この発明の工程段階のフローチャートであり
、この方法においては蛋白質が抽出されそして安定化さ
れ、そして安定剤添加のためｐＨが酸性ｐＨに下げられ
る。 以下余白 低分子府ティル　　低分子量ティル　低分子量ティルＩ
ＦＩＩＣ，３ 正■Ｃ，４ ａ　　＠ａ　　　　　　　　　　　　　　ＰＨ５，５戸
　過　□ｐＨ（３，０，４５μｍフィルター■ 遠　　　し・ ■ ＩＩ　　塩−Ｇ２５セフアデツクスカラム　ｐＨ９，２
−１１にて配合　□２．Ｓ％　Ｈ５ＡｙＪ−ｉＰＰＦ　
（ｗ／ｖｌ、　ｐＨ２−４イ／キュベー／］７　　　　
　　　　　　　　　１５分間書 ｐＨ調整　　　　□ｐＨ７，５ 発酵 ２−、Ｔ　ｐ、ｔ　−ｙｖ 酸　化　　　□　ヨートノ安、Ｑ香酸 ＲＰ−ＨＰＬＣ□　　酢酸　、２−！ロ、Ｐノール限外
ｐ過　　　　□　２酬り／酸ナトリウム、ｐＨ７，５脱
　塩　　□　ＧＺＳカラム ｐＨ調整　　−−ｐＨ７，５ 凍結乾燥 ■ＩＩＣ，（６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、蛋白質のための安定剤を含有するｐＨ２〜４の非毒
   性で不活性な療法的に適合性の水性キャリヤー媒体中に
   溶解した生物学的に活性な組換β−ＨＩＦＮの療法的有
   効量を含んで成る安定な医薬組成物又はその凍結乾燥医
   薬組成物。 ２、前記安定剤がヒト血漿蛋白質画分であり、そして０
   ．１〜５ｗ／ｖ％の量で存在する、特許請求の範囲第１
   項に記載の組成物。 ３、前記安定剤がヒト血清アルブミンであり、そして約
   ０．５〜１０ｗ／ｖ％の濃度範囲で存在する、特許請求
   の範囲第１項に記載の組成物。 ４、前記安定剤がヒト血清アルブミンとデキストロース
   との混合物であり、そしてそれぞれが１．２５ｗ／ｖ％
   の量で存在する、特許請求の範囲第１項に記載の組成物
   。 ５、β−ＨＩＦＮの有効量が前記キャリヤーｍｌ当り０
   ．１〜１ｍｇの範囲である、特許請求の範囲第１項に記
   載の組成物。 ６、宿主の細胞壁を破砕しそして破砕物中の蛋白質を単
   離しそして精製することにより、β−ＨＩＦＮを生産す
   るために形質転換された宿主からβ−ＨＩＦＮを回収す
   る方法において、 （ａ）β−ＨＩＦＮを含有する媒体のｐＨを約２〜４に
   調整する段階： （ｂ）β−ＨＩＦＮ媒体に、約２〜４のｐＨにあらかじ
   め調整しておいたβ−ＨＩＦＮのための安定剤を添加す
   る段階；及び （ｃ）生じた組成物をおよそｐＨ２〜４において凍結乾
   燥段階； を含んで成る方法。 ７、前記安定剤がマンニトールである、特許請求の範囲
   第６項に記載の方法。 ８、宿主の細胞壁を破砕し、そして破砕物中の蛋白質を
   単離しそして精製することにより、β−ＨＩＦＮを生産
   するために形質転換された宿主からβ−ＨＩＦＮを回収
   する方法において、 （ａ）β−ＨＩＦＮを含有する媒体のｐＨを約２〜４に
   調製する段階； （ｂ）β−ＨＩＦＮ媒体に、約２〜４のｐＨにあらかじ
   め調整しておいたβ−ＨＩＦＮのための蛋白質安定剤を
   添加する段階；及び （ｃ）生ずる組成物のｐＨを６．８〜７．８に上昇せし
   める段階； を含んで成る方法。 ９、宿主の細胞壁を破砕し、そしてβ−ＨＩＦＮを単離
   しそして精製することにより、β−ＨＩＦＮを生産する
   ために形質転換された宿主からβ−ＨＩＦＮを回収する
   方法において、 （ａ）β−ＨＩＦＮを蛋白質安定剤と混合し、そして組
   成物のｐＨを約２〜４に調整する段階；及び（ｂ）生ず
   る組成物のｐＨを６．８〜７．８に上昇せしめる段階； を含んで成る方法。 １０、段階（ａ）の直前に、β−ＨＩＦＮをクロマトグ
   ラフィーによりｐＨ９．２〜１１において脱塩する、特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。