FI95002C - Menetelmä glykosyloimattoman yhdistelmäinterferoni- :n stabiilien, farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi - Google Patents

Description

95002

Menetelmä glykosyloimattoman yhdistelmäinterferoni-β:n stabiilien, farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee biotekniikan aluetta. Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö koskee menetelmää ihmisille terapeuttiseen annosteluun soveltuvan, biologisesti aktiivisen yhdistelmäinterferoni-β(IFN-β)-proteiinin parannetun farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi.

Luonnossa esiintyvät interferonit (IFN:t) ovat lajispesifisiä proteiineja, usein glykoproteiineja, joita erilaiset solut valmistavat virusten, kaksisäikeisten RNAriden, muiden poly-nukleotidien, antigeenien ja mitogeenien aikaansaaman induktion johdosta. Interferoneilla on monia biologisia aktiivisuuksia, kuten esimerkiksi virusten vastaista, lisääntymisen vastaista, immuniteettia muuttavaa ja solunvastaista toimintaa. On identifioitu ainakin kolme erillistä humaani inter-feronityyppiä, ja niitä on luonnehdittu niiden antiviraali-sen, kasvua estävän ja luonnonvaraisia tappajasoluja (NK) aktivoivan aktiivisuuden perusteella. Niitä valmistavat leukosyytit, lymfosyytit, fibroblastit sekä immuunijärjestelmä, ja ne luokitellaan α-, β- ja γ-interferoneiksi. Niiden on raportoitu olevan eri proteiineja, joita erilliset rakennegeenit • koodattavat.

Luonnossa esiintyvää humaani β-interferonia (HuINF-β) valmistetaan tavallisesti yli-indusoimalla fibroblastiviljel-miä poly-IC:n (polyriboinosiinihapon ja polyribosytidyyliha-pon) kanssa sekä eristämällä ja puhdistamalla täten valmis-tettu HuINF-β kromatografisin ja elektroforeettisin menetelmin. Proteiineja ja polypeptidejä, jotka näyttävät luonnossa esiintyvältä interferonilta, voidaan valmistaa myös käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa, siten että uutetaan poly-A:ta runsaasti sisältävä 12S lähetti-RNA viruksen indusoimista humaani soluista, syntetisoimalla kaksisäikeinen c-DNA

• käyttämällä m-RNA:a templaattina, siirtämällä c-DNA sopivaan kloonausvektoriin, transformoimalla sopivia mikro-organismeja 2 95002 vektorilla, kokoamalla bakteerit ja uuttamalla niistä HIFN-β. Nagola, S. et ai., Nature, 284:316 (1980); Goeddel. D.V. et ai., Nature, 287:411 (1980); Yelverton, E. et ai., Nuc. Acid. Res., 9:731 (1981); Streuli, M. et ai., Proc. Nat'1. Acad.

Sei. (U.S.), 78:2848 (1981); EP-patenttihakemukset n:ot 28033, 321134, 34307 ja BE-patentti 837397 kuvaavat tällä hetkellä käytettyä menetelmää β-interferonin valmistamiseksi yhdistelmä DNA-tekniikkaa käyttämällä Ilmennetyt proteiinit ja polypeptidit on puhdistettu ja tutkittu, ja niillä on havaittu ominaisuuksia, jotka ovat samanlaisia kuin luonnossa esiintyvillä IFN:illä. Bakteereiden valmistamilla IFN:illä näyttää täten olevan mahdollista, terapeuttista käyttöä anti-viraalisina ja kasvaimenvastäisinä aineina, ja sellaisten bakteerikäymisten avulla suoritetun IFN:ien valmistuksen odotetaan tuottavan riittävän suuria määriä IFN:a siten, että kliinisten kokeiden kustannukset ovat suhteellisen alhaiset.

Edelleen, HuIFN-β-geenejä, joita on muutettu esimerkiksi oli-gonukleotidiin suunnatun mutaation avulla, jotta valmistetaan sen IFN^-proteiinianalogeja, kuten esimerkiksi humaani yhdistelmä- interferoni^-analogeja (mutantteja), joista kyste-iini on poistettu tai joissa kysteiini on korvattu muulla aminohapolla, julkaistaan US-patentissa 4 588 585. Erityisesti tässä patentissa esitetään yhdistelmä-IFN^-mutantti, jossa kysteiini, joka sijaitsee asemassa 17, on korvattu neutraalilla aminohapolla, kuten esimerkiksi seriinillä. Viimeksi mainittu ΙΡΝ-β-mutantti on ΙΡΝ-β8βΓΐ7.

Menetelmä bakteerien avulla valmistettujen IFN:ien takaisin saamiseksi ja puhdistamiseksi kuvataan US-patenteissa n:ot 4 450 103, 4 315 852, 4 343 735 ja 4 343 736, sekä Derynck et ai. kuvaavat julkaisussa Nature (1980) 287:193-197. ja Scandella sekä Kornberg kuvaavat julkaisussa Biochemistry, 11):4447 (1971) . Yleensä ei näillä menetelmillä IFN:a valmisteta riittävän puhtaassa muodossa ja riittävän suuria määriä kliinisiin ja terapeuttisiin tarkoituksiin, ja yh-distelmä-DNA-menetelmillä saadut IFN-valmisteet sisältävät kemikaalien jäännösmääriä, kuten esimerkiksi 3 95002 natriumdodekyylisulfaattia (SDS) tai muita pinta-aktiivisia tai saostavia aineita, joita on käytetty uuttamis- tai puhdistusvai-heissa.

E. colin ilmentämät yhdistelmä-IFN-g sekä sen analogit ovat liukenemattomia liuoksiin, joiden pH on alueella 6-9. Sen tähden on suunniteltu erilaisia menetelmiä ja lisäaineita näiden proteiinien liuottamiseksi. Useita menetelmiä, jotka ovat tällä hetkellä saatavissa bakteereiden valmistamien proteiinien eristämiseen ja puhdistamiseen, on lueteltu alla.

US-patentti n:o 4 315 852 kuvaa menetelmää leukosyyttien interferonin uuttamiseksi hapolla bakteerisoluista sekä uutteen neutralointia interferonin saamiseksi.

US-patentissa n:o 4 343 735 kuvataan menetelmää interferonin puhdistamiseksi jakamalla se vettä sisältävässä monijaejärjestelmässä ioninvaihtajien läsnäollessa, jotka ovat järjestelmään liukoisia ja jotka ovat polyeettereiden johdannaisia.

US-patentti n:o 4 343 736 esittää menetelmän interferonin eristämiseksi veteen liukenemattoman hepariinin avulla suoritettavalla absorptiolla sekä eluoimalla interferoni epäorgaanisen suolan ja kondroitiinisulfaatin vesiliuoksella.

US-patentti n:o 4 289 689 esittää luonnossa esiintyvän humaani g-interferonin eristämisen ja puhdistamisen affiniteettikroma-tografian ja suurpainenestekromatografiän avulla.

US-patentti n:o 4 364 863 kuvaa menetelmää fibroblasti-interfe-ronin uuttamiseksi bakteereista alhaista pH:a käyttämällä, mitä seuraa uuttaminen korkeassa pHrssa.

US-patentti n:o 4 450 103 kuvaa proteiinin liuottamista vettä sisältävässä väliaineessa, jossa on sopivaa liuottavaa ainetta, proteiinin uuttamista vettä sisältävästä väliaineesta 2-butano-lilla tai 2-metyyli-2-butanolilla, sekä proteiinin saostamista ' alkoholijakeesta.

4 95002 US-patentti n:o 4 530 787 kuvaa yhdistelmäproteiinien, kuten esimerkiksi IFN-g:n hapettamista selektiivisesti ja stökiömetri-sesti o-jodibentsoehapolla sen seikan varmistamiseksi, että proteiini on luonnossa esiintyvän vastineensa toiminnallinen ekvivalentti .

Monet heterologiset proteiinit saostuvat solun sisällä valoa taittavien tai sulkeumaosasten muodossa, jotka tulevat näkyviin kirkkaina täplinä solun rajaamalla alueella, faasikontras-timikroskoopissa, 1000-kertaisiin suurennuksiin saakka. Katso esim. Miller et ai., Science (1982) 215:687-690; Cheng, Bio-chem. Biophys. Res. Comm., (1983) 111;104-111; Becker et ai., Biotech. Advs. (1983) 1^:247-261; Kleid et ai., kpl. 25 julkaisussa Developments in Industrial Michrobiology, osa 25. ss. 317-325 (Society for Industrial Michrobiology, Arlington, VA, 1984); Marston et ai., Bio/Technology (syyskuu, 1984), ss. 800-804.

Saostettujen, heterologisten proteiinien puhdistuksen ja aktiivisuuden varmistusta kuvataan myös US-patenteissa numeroissa 4 511 502, 4 511 503, 4 512 922, 4 599 127 ja 4 518 526, sekä EP 114 506.

EP 206 828 julkaisee parannettuja menetelmiä valoa taittavien osasten eristämiseksi ja puhdistamiseksi.

Wang et ai., julkaisussa J. Parenteral. Drug. Assoc., 452- 462 (1980) , antaa käyttöön selonteon, joka koskee täyteaineita ja pH-arvoja parenteraalisia valmisteita varten, joita käytetään Yhdysvalloissa. Julkaisun taulukossa I esitetään liuottavien aineiden ja lipidien luettelo, ja tämän taulukon osassa II, jonka otsikko on "Solubilizers, Wetting Agents or Emulsifiers", luetellaan mm. polyetyleeniglykoli 300, polysorbaatti 20, 40 ja 80 sekä propyleeniglykoli erilaisia lääkkeitä varten. Alla esitetään viitteenä joitakin esimerkkejä interferonista ja läheisistä formulaatioista.

US-patentissa n:o 4 647 454 esitetään menetelmä humaani fibro-blasti-interferonin stabiloimiseksi polyvinyylipyrrolidonilla.

* 95002 5 US-patentissa n:o 4 460 574 esitetään farmaseuttinen koostumus, joka käsittää luonnossa esiintyviä hiomaani ot- ja S-interferoneja, joita käytetään humaani interferonille herkkien sairauksien hoitoon peräsuolen ja virtsa- ja sukuelinten alueella.

US-patentissa n:o 4 462 940 ('940 patentti), esitetään interferonin formulointimenetelmä sekoittamalla interferonia ja proteiinia stabiloivaa ainetta, kuten esimerkiksi normaalia seerumin albumiinia, pH-arvossa noin 10,5 - 12,5, 5 minuutin ajan, ja säätämällä sitten pH arvoon 7,5, jotta saadaan liukoinen seos. '940 patentti kuvaa edelleen lipofiilisen proteiinin, kuten esimerkiksi yhdistelmäinterferoni-S:n tai IL-2:n eristys- ja puhdistusmenetelmää, jossa proteiini liuotetaan vettä sisältävään väliaineeseen sopivan liuottavan aineen, kuten esimerkiksi natriumdodekyylisulfaatin (SDS) avulla, liuotettu proteiini uutetaan alifaattisen alkoholin avulla, proteiini saostetaan alkoholi jakees ta vettä sisältävällä puskurilla ja proteiini dia-suodatetaan vettä vastaan noin pH 10,5 - 12,5:ssä tai veden ja alifaattisten alkoholien seoksia vastaan, joiden seosten pH on säädetty arvoon 10,5 - 12,5, jotta liuottava aine (SDS) poistetaan tai sen konsentraatiota vähennetään.

Eräs kyseessä olevan keksinnön näkökohta koskee menetelmää, joka on vaihtoehtoinen yllä kuvatulle menetelmälle ja jonka .· suhteen vaatimukset on esitetty US-patentissa n:o 4 462 940.

Mainitussa vaihtoehtoisessa menetelmässä vältetään korkeaa pH-aluetta (pH 10,5 - 12,5), jota tarvitaan tiettyjen liuottavien aineiden, kuten esimerkiksi SDS:n poistamiseen diasuodatuksen tai suolan poistamisen, mieluummin suolan poistamisen avulla.

r EP 215 658 esittää yhteenvedon menetelmästä, jossa käytetään korkeata pH:ta ja alhaista pH:ta lipofiilisten yhdistelmäprote-iinien, kuten esimerkiksi humaani IFN-E:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi, proteiinivalmisteen saamiseksi, joka voidaan formuloida kestävän farmaseuttisen koostumuksen muotoon. Mainittu koostumus, jossa on terapeuttisesti tehokas määrä biologisesti aktiivista, lipofiilistä proteiinia, myrkyttömään, inerttiin, terapeuttisesti yhteen sopivaan, vesipohjaiseen kantaja-ainee- 6 95002 seen liuotettuna pH-arvossa 6,8 - 7,8, sisältää myös proteiinin stabiloimisainetta, kuten esimerkiksi humaani seerumin albimii-nia, humaani seerumin albumiinia ja dekstroosia tai humaani plasman proteiinijauhetta.

EP 217 645 julkaisee farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät IFN-B:a tai interleukiini-2:a natriumulauraatilla stabiloituun kantaja-aineeseen liuotettuna pH-arvossa 7,0 - 8,0.

WO 87/00056 julkaisee farmaseuttisen koostumuksen, jossa yhdiste lmä-IFN-β :a , IL-2:a tai immunotoksiinia on vettä sisältävään kantaja-aineeseen liuotettuna, pH-arvossa 6-8 ilman liuottavaa ainetta. Proteiini liuotetaan konjugoimalla se selektiivisesti kytkentäaineen välityksellä vesiliukoiseen polymeeriin, joka on valittu polyetyleeniglykolihomopolymeerien tai polyetoksyloitu-jen polyolien joukosta.

Japanilainen Laid-Open patenttihakemus (Kokai) n:o 59-10524, jonka otsikko on "An Interferon Composition and a Method of Manufacturing the Same", julkaisee misellilioksen peräsuolen kautta suoritettavaa annostelua varten, joka liuos on valmistettu sekoittamalla (a) tyydyttymätön rasvahappo, (b) polyoksiety-leenirasvahappoesteri, alkyylipolyoksietyleenieetteri tai sakkaroosin rasvahappoesteri, (c) vesi sekä (d) interferoni.

EP 135 171 julkaisee pseudo-yksijakeisia mikroemulsiokoostumuk-sia interferonien, mieluummin leukosyyttien interferonin A paikallista annostelua varten. Koostumukset sisältävät terapeuttisesti tehokkaan määrän interferonia, 30-70 tilavuus-% pinta-aktiivista ainetta, jonka hydrofiilinen-lipofiilinen tasapaino (HLB) on 12-15 ja jolla on duaali liukoisuus vesi/öl jyssä; 5-45 % kasviöljyä ja 5-45 % vettä. Tässä yhteydessä julkaistut pinta-aktiiviset aineet ovat risiiniöljyn polyetyleeniglykoli-johdannaisia, jotka sisältävät keskimäärin 25-36 moolia etylee-nioksidia risiiniöljyn moolia kohti. Sellainen öljypohjainen mikroemulsio ei ole kestävä, ja sen jakeet erottuvat.

US-patentti n:o 4 507 281 julkaisee koostumuksia, joissa on 7 95002 noin 104 - 106 I.U. humaani leukosyytti-interferonia, noin 1-5 paino-% ionitonta pinta-aktiivista ainetta, jossa on ainakin yksi eetteri- tai amidisidos, sekä fysiologisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta. Sellaisia koostumuksia annetaan paikallisesti herpes simplex -infektioiden hoitoon, jolloin terapeuttinen vaikutus liittyy mainittujen ionittomien pin-ta-aktiivisten aineiden kykyyn liuottaa herpes viruksen lipidiä sisältävä kuori. Edullisiin ionittomiin pinta-aktiivisiin aineisiin, joihin mainitussa patentissa on viitattu, sisältyvät: nonyylifenoksipolyetoksietanoli (kauppanimi Nonoxynol-9); p-di-isobutyylifenoksipolyetoksietanoli (kauppanimi Triton X-100); polyoksietyleeni(10) oleyylieetteri (kauppanimi Brij-97); sekä onyksoli (kauppanimi Onyxol 345). Sellaisia farmaseuttisia koostumuksia annetaan mieluummin formu-laatioiden liuoksena, voiteena, öljynä tai emulsiona. Katso myös EP 77 063, joka on samanarvoinen edellä esitetyn patentin kanssa.

Jäljelle jää tarve saada formulaatioita biologisesti aktiivisista yhdistelmäinterferoni-P:ista, jotka ovat riittävän puhtaita kliiniseen annosteluun, mutta joista suurin piirtein tai kokonaan puuttuvat voimakkaiden detergenttien tähteet, kuten esimerkiksi SDS, jota on käytetty uuttamis- ja puhdistusmenetelmissä. Edelleen, tarvitaan formulaatioita, jotka tarjoavat vaihtoehtoja formulaatioille, jotka sisältävät non-IFN-β-proteiinia, kuten esimerkiksi sellaisille, jotka sisältävät albumiinia.

Edelleen, sellaisia biologisesti aktiivisia yhdistelmäinter-feroni*P:ja varten halutaan vaihtoehtoisia formulaatiomene-telmiä, joiden yhteydessä vältetään erittäin korkeita pH-alu-eita.

• 950C2

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän kestävien, farmaseuttisten koostumuksien valmistamiseksi, jotka soveltuvat paikalliseen annosteluun eläimille ja ihmisille ja jotka sisältävät terapeuttisesti tehokkaan määrän yhdistelmäinter-feroni-3*proteiinia liuotettuna kantaja-aineeseen, joka sisältää liuottavana aineena/stabiloivana aineena tehokkaan määrän yhtä tai useampaa biologisesti yhteen sopivaa ioniton-ta polymeeridetergenttiä. Sellaiset koostumukset voivat edelleen sisältää lisäksi tulevan liuottavan tai stabiloivan aineen, esimerkiksi natriumdodekyylisulfaattia (SDS) ja glyserolia.

Glyserolin käyttö yhdistettynä yhteen tai useampaan ionitto-maan, esillä olevan keksinnön mukaiseen detergenttiin tekee mahdolliseksi suuruusluokan laskun ionittomien detergenttien konsentraatioalueessa, joka tarvitaan liuottamaan/stabiloi-maan IFN-β.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetut formulaatiot voivat olla liuoksen muodossa tai lyofili-soituina.

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmiä yhdistelmä-interferonikin kestävien, farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi, jolloin yksi sellainen menetelmä käsittää seu-raavat vaiheet: (a) IFN-β:n uuttaminen proteiinin valmistamiseksi transformoidun isäntäorganismin hajottamistuotteesta; (b) IFN-β:n puhdistaminen käyttäen viimeisenä puhdistusvai-heena suolan poistovaihetta pH-alueella 8,5-10 ja eluutiopus-kurina puskuria, joka sisältää rasvahapon suolaa, jonka hii-livetyketjussa on noin 10 - 12 hiiliatomia, suolattoman poolin muodostamiseksi; 9 - 95002 (c) poolin, josta suolat on poistettu, pH säädetään arvoon noin 2-4, jolloin rasvahapon suola saostuu; (d) saostunut suola poistetaan poolista sentrifugoinnin tai suodatuksen avulla; (e) pooliin, josta suolat on poistettu, lisätään tehokas määrä yhtä tai useampaa biologisesti yhteen sopivaa polymee-ridetergenttiä tai yhden tai useamman biologisesti soveltuvan, ionittoman polymeeridetergentin ja muun liuottavan tai stabiloivan aineen yhdistelmää ΙΡΝ-β:η stabiloimiseksi ja liuottamiseksi tehokkaina määrinä, jolloin detergentti on etoksyloitu rasva-alkoholieetteri tai lauryylieetteri; oktyy-lifenoksipolyetoksietanoliyhdiste; modifioitu oksietyloitu tai oksipropyloitu suoraketjuinen alkoholi tai niiden seos; polyetyleeniglykolimono-oleaattiyhdiste; fenolinen rasva-al-koholieetteri; tai propyleenioksidin ja etyleenioksidin segment tikopolymeeri, jolloin mainittu koostumus edelleen sisältää SDS:ää tai glyserolia mainitun detergentin ollessa vain propyleenioksidin ja etyleenioksidin segmenttikopolymeeri; (f) poolin pH säädetään alueelle, joka on noin 4,0 - 8,0; (g) pooliin lisätään tehokas määrä täyteainetta/stabiloivaa ainetta; ja (h) formulaatio lyofilisoidaan; ja eräs toinen sellainen menetelmä koostuu seuraavista vaiheista: (a1) eristetään valoa taittavat, IFN-P:a sisältävät osaset isäntäorganismista, joka on transformoitu mainitun IFN-βιη valmistamiseksi; (b') mainitut valoa taittavat osaset liuotetaan natriumlau-raattia käyttämällä; 10 - 95002 (c1) mainittu IFN-β uutetaan ja puhdistetaan liuotetusta, valoa taittavasta aineesta käyttämällä natriumlauraattia ensisijaisena liuottavana aineena; (d1) puhdistetun IFN-P:n pH alennetaan noin 2-4:ään; (e1) puhdistetun IFN-p:n liuos sentrifugoidaan ja suodatetaan natriumlauraattisaostuman poistamiseksi IFN-β-ροοΙϊη muodostamiseksi; (f) IFN-β-poolista poistetaan suolat noin pH 2-4:ssä; (g1) IFN-P-proteiiniliuokseen lisätään tehokas määrä yhtä tai useampaa ionitonta, biologisesti yhteen sopivaa polymee-ridetergenttiä tai ionittoman, biologisesti yhteen sopivan detergentin ja muun liuottavan tai stabiloivan aineen yhdis-teläää IFN-β:n stabiloimiseksi tai liuottamiseksi, jolloin detergentti on etoksyloitu rasva-alkoholieetteri tai lauryy-lieetteri; oktyylifenoksipolyetoksietanoliyhdiste; modifioitu oksietyloitu tai oksipropyloitu suoraketjuinen alkoholi tai niiden seos; polyetyleeniglykolimono-oleaattiyhdiste; fenoli-nen rasva-alkoholieetteri; tai propyleenioksidin ja etylee-nioksidin segmenttikopolymeeri, jolloin mainittu koostumus edelleen sisältää SDS:ää tai glyserolia mainitun detergentin ollessa vain propyleenioksidin ja etyleenioksidin segmenttikopolymeeri; (h') IFN-β-liuoksen pH säädetään pH-alueelle 3,5 - 9,5; (i') liuokseen lisätään tehokas määrä täyteainetta/stabi- loivaa ainetta; ja (j') formulaatio lyofilisoidaan.

Seuraavassa kuvataan keksintöä piirrosten avulla, joissa:

Kuviot IA ja IB peräkkäin kuvaavat esillä olevan keksinnön edullisen suoritusmuodon vaiheita mikrobien avulla valmiste- • » X1 - 95002 tun IFN-β.-η uuttamiseksi, puhdistamiseksi ja formuloimiseksi. Tämän juoksukaavion mukaisesti natriumlauraattia käytetään primaarisena liuottavana aineena uuttamis- ja puhdistusmenetelmässä. Macol® LA-12 (0,15 %) on formuloiva aine (liuotta-va/stabiloiva aine formulaatiossa) ja dekstroosi (5 %) on massaa antava/stabiloiva aine.

Kuviot 2A ja 2B esittävät pääpiirteissään esillä olevan keksinnön erään toisen parempana pidetyn suoritusmuodon vaiheita, jossa SDS:aa käytetään primaarisena liuottavana aineena uuttamisen ja puhdistuksen aikana ja natriumlauraattia käytetään siirtokomponenttina suolojen poistossa, joka suoritetaan G-25-pylväässä SDS:n poistamiseksi. Plurafac® C-17 (0,1 %) on formulointiaine (liuottava/stabiloiva aine formulaatiossa) ja dekstroosi (5 %) on massaa antava/stabiloiva aine.

Kuviot 3-6 valaisevat graafisesti lineaaristen, ei isotermis-ten stabiilisuustutkimusten (LNS) tuloksia, joissa verrataan esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistettuja, edustavia formulaatioita natriumlauraatin ja humaani seerumin albumiinin (HSA) kanssa valmistettuihin IFN-β -formulaatioihin. HSA-formulaatiot esitetään näissä kuvioissa normaaleina, korkeina sekä alhaisina annoksina.

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän erittäin stabiilien farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi, jotka soveltuvat parenteraaliseen antamiseen eläimille ja ihmisille ja jotka käsittävät terapeuttisesti tehokkaan määrän yhdistelmä- interferoni -β -proteiinia liuotettuna inerttiin kantaja-väliaineeseen, joka sisältää yhden tai useampia biologisesti . 95002 yhteen sopivia, ionittomia polymeeridetergenttejä tai yhden tai useamman ionittoman, biologisesti yhteen sopivan polymee-ridetergentin yhdistelmän jonkin ylimääräisen liuottavan/-stabiloivan aineen kanssa.

Termillä "yhdistelmäinterferoni-β", lyhyesti merkittynä IFN-β, mieluummin humaani IFN-β, tarkoitetaan fibroblasti-interferonia, jonka biologinen aktiivisuus on verrattavissa luonnonmukaisen IFN-β:n aktiivisuuden kanssa ja jota valmistetaan yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla kyseisen tekniikan piirissä kuvatulla tavalla. Yleisesti sanottuna, geeni, joka koodittaa interferonia, poistetaan luonnonmukaisesta plasmidistaan ja insertoidaan kloonausta varten kloonausvektoriin ja sitten ilmentymisvektoriin, jota käytetään isäntäorganismin, mieluummin mikro-organismin ja mieluiten E. colin transformoin-tiin. Isäntäorganismi ilmentää vieraan interferonigeenin tietyissä olosuhteissa ΙΡΝ-β:η valmistamiseksi. Pikemminkin, IFN-β on muteiini, kuten kuvataan US-patentissa n:o 4 588 585, jossa muteiinissa kysteiini, joka normaalisti esiintyy villin tyyppisessä eli luonnonmukaisessa molekyylissä, on syrjäytetty neutraalilla aminohapolla, kuten esimerkiksi se-riinillä tai alaniinilla. Täsmällisemmin sanottuna, IFN-β -muteiini on ΙΡΝ-β5ΘΓΐ7.

IFN-β-proteiinin tarkka rakenne riippuu monista tekijöistä. Molekyylissä on ionisoituvia amino- ja karboksyyliryhmiä, tietty ΙΡΝ-β-proteiini saatetaan saada happamena tai emäksisenä suolana tai neutraalissa muodossa. Kaikki sellaiset val-. misteet, jotka säilyttävät biologisen aktiivisuutensa sopi vissa ympäristöolosuhteissa, sisällytetään tässä yhteydessä 13 .. 95002 IFN-P-proteiinien määritelmän piiriin. Edelleen, proteiinin primaarista aminohapposekvenssiä voidaan suurentaa johdannaisten avulla, käyttämällä sokeriosia (glykosylointia) tai muita täydentäviä molekyylejä, kuten esimerkiksi lipidejä, fosfaatteja, asetyyliryhmiä yms., tavallisemmin konjugointia sakkaridien kanssa. Sellaisen suurentamisen tietyt näkökohdat toteutetaan valmistukseen käytetyn isäntäorganismin translaation jälkeisten käsittelyjärjestelmien avulla; muut sellaiset muunnokset voidaan saada aikaan in vitro. Joka tapauksessa, sellaiset muunnokset tässä yhteydessä sisällytetään IFN-β -proteiinin määritelmän piiriin, sikäli kuin proteiinin biologinen aktiivisuus, kuten se on yllä määritelty, ei tuhoudu. Tietenkin on odotettavissa, että sellaiset muutokset voivat vaikuttaa aktiivisuuteen kvantitatiivisesti tai kvalitatiivisesti, joko lisäten tai vähentäen proteiinin aktiivisuutta erilaisissa määrityksissä.

Lisäksi voidaan ketjun yksittäisiä aminohappoja muuntaa hapetuksen, pelkistyksen tai muiden johdannaisten muodostamisen avulla, ja proteiini voidaan pilkkoa, jotta saadaan fragmentteja, jotka säilyttävät aktiivisuutensa. Sellaiset muutokset, jotka eivät tuhoa biologista aktiivisuutta, eivät poista pro-teiinisekvenssiä määritelmän piiristä.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetut farmaseuttiset koostumukset antavat käyttöön keinoja pitää yllä yhdistelmä-IFN-β:a liukoisessa muodossa ja sillä tavoin stabiloida se pH-alueissa, joissa yhdistelmä-IFN-β:a ei helposti liukene, käyttämällä yhtä tai useampaa kyseessä olevan keksinnön mukaista liuottavaa/stabiloivaa ainetta.

• · 14 95002

Yhdistelmä-IFN-P:n, luonnonmukaisesta IFN-P:sta poiketen, ajatellaan olevan lipofiilisen ja hydrofobisen, so. liukenemattoman tai ei herkästi veteen tai vettä sisältävään väliaineeseen liukoisen huoneenlämpötilan ja ilmakehän paineen mukaisissa ympäristön olosuhteissa, pH:ssa, joka on noin 5-8. Vaikeimmat IFN-P:n liukoisuusongelmat ovat ne, joita esiintyy glykosyloimattomalla IFN-P:lla, jota transformoitu bakteeri-isäntä, varsinkin E. coli, valmistaa. Sen tähden kyseessä olevan keksinnön mukaiset farmaseuttiset koostumukset ovat erityisen käyttökelpoisia liuotettaessa/stabiloitaessa glyko-syloimatonta, E. colissa valmistettua IFN-P:a, ja on edullista, että kyseessä olevan keksinnön mukaisten farmaseuttisten koostumusten yhdistelmä-IFN-P:a on sellaista alkuperää.

Tässä yhteydessä käytettynä, termi "fysiologinen pH" tarkoittaa pH.-a, joka soveltuu nisäkkäille. Neutraalilla pH: 11a tässä yhteydessä tarkoitetaan pH:a noin 6,0 - 8,5:n alueella, mieluummin noin pH 6,0 - 8,0.

Tässä yhteydessä käytettynä, termillä "stabiloiva aine/-liuottava aine", yhdistelmä-IFN-P-formulaatioihin viitattaessa tarkoitetaan oleellisesti koostumuksia, jotka ovat myrkyttömiä eivätkä ole immunogeenisia ja jotka yksinään tai yhdistettyinä eivät ainoastaan stabiloi IFN-P:a dena-turointia ja biologisen aktiivisuuden häviötä vastaan, vaan myös liuottavat lipofiilisen proteiinin vettä sisältävään väliaineeseen, niin että farmaseuttinen formulaa-tio koostuu IFN-P-proteiinin vesiliuoksesta, joka on pH

3,5 - 9,5:ssä, mieluummin noin 4-8:ssa, vielä mieluummin noin 5,5 - 6,5:ssä, ja mieluiten noin pH 6:ssa, josta m 15 -95002 proteiini ei saostu. Kyseessä olevan keksinnön mukaiset stabiloivan aineen/liuottavan aineen koostumukset sisältävät yhtä tai useampaa biologisesti yhteen sopivaa, ionitonta polymeeri-detergenttiä tai yhden tai useamman biologisesti yhteen sopivan, ionittoman polymeeridetergentin yhdistelmiä jonkin muun liuottavan aineen ja/tai stabiloivan aineen kanssa.

Termillä "primaarinen liuottava aine" tässä yhteydessä määriteltynä tarkoitetaan liuottavaa ainetta, mieluummin detergent-tiä ja/tai kaotrooppista ainetta, jota käytetään IFN-βιη liuottamiseksi puhdistetun IFN-βιη lyhennetyissä tai laajennetuissa etuosa menetelmissä (front-end processes), joita kuvataan jäljempänä. Primaarisen liuottavan aineen avulla varmistutaan sitten siitä, että IFN-β säilyy liuoksessa puhdistusmenetelmän ajan aina IFN-βιη poistamiseen saakka, mikä suoritetaan mieluummin suolan poiston avulla, ennen kuin puhdistettu IFN-β formuloidaan kyseessä olevan keksinnön mukaisten ionittomien deter-genttien avulla. Esimerkiksi puhdistuskaavioissa, jotka esitetään kuvioissa IA ja IB, natriumlauraatti on primaarinen liuottava aine, kun taas natriumdodekyylisulfaatti (SDS) on primaarinen liuottava aine menetelmässä, joka esitetään kuvioissa 2A ja 2B.

Tässä yhteydessä käytettynä termi "transformoitu" kuvattaessa isäntämikro-organismisoluviljelmiä, tarkoittaa mikro-organismia, jota on geneettisesti muutettu siten, että se valmistaa IFN-3:a, jolla on biologista aktiivisuutta, joka on verrattavissa luonnonmukaiseen IFN-β:aan. Bakteerit ovat edullisia mikro-organismeja IFN-βίη tuottamiseen. E. coli on erityisen edullinen.

"Kaotrooppinen ympäristö" tarkoittaa ympäristöä, jossa proteiinit denaturoituvat tai niiden konformaatiot muuttuvat niiden tavallisista konformaatioista. Kaotrooppisia ympäristöjä voidaan saada aikaan kaotrooppisten aineiden sopivien konsentraa-tioiden läsnäolon avulla, kuten alla kuvataan, tai ne voivat olla lämmön tai pH-muutosten aiheuttama tulos. Syntyvät ympäristöt voivat katkaista proteiinissa sijaitsevan vetysidoksen sekä muuttaa ympäristön termodynamiikkaa sillä tavoin, että vaihtoehtoiset kolmidimensionaaliset konformaatiot ovat kaotrooppisessa » 95002 ympäristössä etusijalla konformaatioihin verrattuna, joita esiintyy fysiologisesti paremmin soveltuvissa ympäristöissä.

Termillä "kaotrooppinen aine" tarkoitetaan yhdistettä tai yhdisteitä, jotka vesiliuoksessa ja sopivana konsentraationa luovat kaotrooppisen ympäristön ja voivat denaturoida IFN-8:n. Guani-diinisuolat (esim. hydrokloridi) sekä alkalimetallitiosyanaatit (esim. natriumtiosyanaatti) sekä urea konsentraatioina, jotka ovat 4-9-molaarisen, mieluummin 6-9-molaarisen konsentraation alueella, ovat esimerkkejä kaotrooppisista ympäristöistä, jotka liuottavat ja denaturoivat IFN-(3:a.

"Pelkistävät olosuhteet " ovat olosuhteet, jotka tarvitaan IFN-g:n kysteiinitähteiden pelkistämiseksi ja niiden säilyttämiseksi pelkistyneessä muodossa. Nämä olosuhteet voidaan yksinkertaisimmin saada aikaan käyttämällä sopivaa pelkistävää ainetta (erityisesti tiolia sisältävää pelkistävää ainetta),tai jos IFN-g on jo pelkistetty (esimerkiksi soluympäristössä), ilman ja hapettavien katalysaattoreiden tai reagenssien poistaminen saattaa riittää.

Biologisesti yhteen sopivat, ionittomat polymeeridetergentit ovat oleellisesti myrkyttömiä, pinta-aktiivisia aineita, joita käytetään elintarvike-, farmaseuttisessa ja kosmeettisessa teollisuudessa ja joiden molekyylipainot ovat alueella noin 100 -250 000, mieluummin noin 180 - 200 000. Termi "detergentti" tässä yhteydessä määritellään laajalti sisältämään yhdisteitä tai yhdisteiden seoksia, jotka aiheeseen perehtynyt tuntee de-tergentteinä, emulgaattoreina, liuottavina aineina, pinta-aktii-visina pesuaineina ja/tai pinta-aktiivisina aineina.

Biologisesti sopivia, ionittomia polymeeridetergenttejä, joita käytään liuottavina aineina/stabiloivina aineina kyseessä olevan keksinnön mukaisissa formulaatioissa, luonnehditaan niiden kyvyn perusteella joko yksinään tai yhdistettyinä toiseen ionittomaan detergenttiin tai tyypiltään toisenlaiseen liuottavaan/stabi-loivaan aineeseen, mieluummin natriumdodekyylisulfaattiin (SDS) tai glyseroliin yhdistettynä, liuottaa IFN-g:a pH-alueella noin 3,5 - 9,5, mieluummin noin pH 5-8:ssa.

95002 17

Ionittomien detergenttien amfifiilinen luonne ilmaistaan usein molekyylin hydrofobisten ja hydrofiilisten osien välisenä tasapainona. On suunniteltu hydrofiilisten-lipofiilisten tasa-painolukujen (HLB) kokeellinen mittakaava. HLB-luku on arvo, joka ulottuu 1:stä noin 50:een, mikä ilmaisee pinta-aktiivisen aineen hydrofiilisyyden tai lipofiilisyyden määrän. Hydrofii-lisemmillä pinta-aktiivisilla aineilla on korkeat HLB-luvut (enemmän kuin 10), kun taas pinta-aktiivisia aineita, joiden HLB-luvut ovat 1-10, pidetään lipofiilisinä.

Edullisilla, biologisesti yhteen sopivilla, ionittomilla po-lymeeridetergenteillä esillä olevan keksinnön mukaisissa for-mulaatioissa hydrofiiliset-lipofiiliset tasapaino-(HLB)-luvut ovat alueella noin 10-40, mieluummin noin 15-35, ja vielä mieluummin noin 12-30. Lisäksi sellaiset biologisesti yhteen sopivat, ionittomat detergentit valitaan mieluummin ryhmästä, johon kuuluu etoksyloituja rasva-alkoholien eettereitä ja lau-ryylieetteri, oktyylifenoksipolyetoksietanoliyhdisteitä, muunnettuja oksietyloituja ja/tai oksipropyloituja, suoraketjuisia alkoholeja, polyetyleeniglykolimono-oleaattiyhdisteitä, poly-oksietyleenisorbitaanirasvahappoestereitä, fenolirasva-alko-holieettereitä ja propyleenioksidin ja etyleenioksidin segment tikopolymeerejä (polyoksipropyleeni- ja polyoksietyleeni-kondensaatteja).

Edelleen, biologisesti yhteen sopiviin, ionittomiin polymeeri-detergentteihin, joita käytetään stabiloivina aineina/liuot-tavina aineina kyseessä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetuissa formulaatioissa, mieluummin sisältyy: 1. seos etoksiloituja rasva-alkoholieettereitä ja lauryyli-eettereitä, joilla on seuraava kaava:

CH3-(CH2)w-(OCH2CH2)n-0H

- 95002 18 jossa kaavassa n jakaantuu lukuarvojen noin 1-30 välille ja keskittyy mieluummin lukuarvoon n = 12 ja w jakaantuu lukuarvojen noin 9-17 välille sisältäen merkittävän osan w:n lukuarvoa 11; mieluummin etoksiloitujen rasva-alkoholieettereiden ja lauryylieetterin seos tunnetaan polyoksietyleeni-12-lauryyli-eetterinä tai polyoksietyleeni-12-lauryylialkoholina; vielä mieluummin mainittu seos valitaan ryhmästä, johon kuuluu kaupallisesti saatavia detergenttejä, jotka tunnetaan seuraavien kauppanimien, kuten Trycol® LAL-12, Macol® LA-12 ja Siponic® L-12 perusteella, mieluiten Macol LA-12; 2. Oktyylifenoksipolyoksietoksietanoliyhdiste, jolla on seu-raava kaava:

c8h17 O (OCH2)m-OH

jossa kaavassa m on kokonaisluku noin 5-60, mieluummin m on kokonaisluku noin 20-50, vielä mieluummin m on kokonaisluku noin 30-40, edelleen vielä mieluummin m on kokonaisluku joko 30 tai 40; mieluiten, kun m on 30, detergentti on Triton® X305, ja kun m on 40, detergentti on Triton® X405; 3. seos muunnettuja oksietyloituja ja/tai oksipropyloituja, suoraketjuisia alkoholeja, joilla on seuraavat kaavat:

H-(OCH2CH2)p-(OCH2CH2CH2)g-(CH2)r-0H

jossa p on kokonaisluku noin 1-10; jossa Q on 0 tai kokonaisluku noin 1-10; ja jossa r on kokonaisluku noin 6-14; mieluummin, jossa p on kokonaisluku noin 1-5; ja r on kokonaisluku noin 10-12, mieluiten, kun mainittu detergentti on Plurafac® C-17; 4. polyetyleeniglykolimono-oleaattiyhdiste, jolla on seuraa-va kaava: * i9 95002

H H O

I I II

CH3-(CH2)7-C-C-(CH2)7-C-O-(CH2CH20)g-H

jossa kaavassa s on kokonaisluku noin 1-10 ja mainitun yhdisteen molekyylipaino on alueella noin 300 - 750; mieluummin esitetyssä kaavassa s on kokonaisluku noin 2-6, ja kyseessä olevan yhdisteen molekyylipaino on noin 350 - 550; vielä mieluummin esitetyssä kaavassa s on 3 ja mainitun yhdisteen molekyylipaino on noin 400; ja mieluiten mainittu detergentti on Nopalcol® 4-0; 6. fenolirasva-alkoholieetteri, jolla on seuraava kaava:

(OCH2CH2)v-OH

jossa kaavassa v on kokonaisluku noin 10 - 200, mieluummin esitetyssä kaavassa v on kokonaisluku noin 50 - 150, ja mieluiten esitetyssä kaavassa v on noin 100 ja mainitulla eetterillä HLB on noin 19; ja 7. propyleenioksidin ja etyleenioksidin kopolymeerejä, jotka ovat Pluronic-polyoleja; mieluummin mainittu detergentti on Pluronic® F68.

Trycol® LAL-12 :n HLB on noin 14. Plurafac® C-17:n HLB on noin 16. Nopalcol® 4-0:n HLB on noin 12. Triton® X3 05:n HLB on noin 17,3. Triton® 405.-n HLB on noin 17,9. Pluronic® F68:n HLB on noin 29. Macol® LA-12:n ja Siponic® L-12:n HLB on molemmilla noin 14,5.

Laureth 12 -detergentit määritellään tässä yhteydessä ionit -tornina, biologisesti yhteen sopivina detergentteinä, jotka ovat etoksiioitujen rasva-alkoholieettereiden ja lauryylieet-tereiden seoksia, joiden kaava on esitetty edellä kohdassa l. Tässä yhteydessä termit Laureth 12, polyetoksietyleeni-12-, lauryylieetteri ja polyoksietyleeni-12-lauryylialkoholi, POE

(12) -lauryylieetteri ja POE (12) -lauryylialkoholi ovat keskenään vaihtoehtoisia. Sellaisten Laureth 12 -detergenttien 95002 20 edullisia tavaramerkkien nimiä ovat Macol® LA-13, Trycol® LAL-12 ja Siponic® L-12, joista Macol® LA- 12 on edullisin.

Edellä mainitut, biologisesti soveltuvat, ionittomat deter-gentit ovat kaikki kaupallisesti saatavissa yhtiöiltä, joiden osoitteet USA:ssa ovat seuraavat:

Plurafac® C-17 Pluronic® F68 BASF Wyandotte Corp. BASF Wyandotte Corp.

100 Cherry Hill Road 101 Cherry Hill Road

Parsippany, N.J. 07054 Parsippany, N.J.7054

Nopalco® 4-0 Siponic® L-12

Diamond Schamrock Alcolac Inc.

Process Chemicals Division 3440 Fairfield Road 350 Mt. Kemble Avenue Baltimore, MD 21226

Morristown, N.J. 07960-1931

Triton® X305 ja Triton® X405 Macol® LA-12

Rohm and Haas Delaware Mazer Chemicals, Inc.

Valley Inc. 3938 Porett Drive 500 Richmond Street Gurnee, IL 60031

Philadelphia, PA 19105

Trycol® LAL-12

Emery Chemicals P.O. Box 628 Mauldin, S.C. 29662

Edelleen, biologisesti yhteen sopivia, ionittomia polymeeri-detergenttejä, joilla on yllä mainitut parametrit, voidaan löytää julkaisun McCutcheon's Emulsifiers & Detergents painoksista, joita on julkaissut the McCutchion Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA). Sellaiset ionittomat polymeeridetergentit voidaan valita kyseessä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistettuja formu-. laatioita varten tässä yhteydessä jäljempänä esitettyjen seu lontamenetelmien avulla. Edelleen, mainittua seulontamenetelmää voidaan käyttää ionittomien detergenttien testaamiseen yksinään tai yhdistettyinä toisen liuottavan ja/tai stabiloivan aineen kanssa, mieluiten SDS:n tai glyserolin kanssa tai ilman toista liuottavaa tai stabiloivaa ainetta.

Useiden biologisesti yhteen sopivien, ionittomien polymeeri-detergenttien, kyseessä olevan keksinnön mukaiset liuotta 95002 21 vat/stabiloivat aineet mukaan luettuina, hankkijat tiedottivat niillä suoritettujen toksisuuskokeiden tuloksista seuraavasti :

Raportoitu toksikologia

Trycol® LAL (12) Akuutti oraalinen LD50 2,2 g/kg kaniineilla.

Nopalcol® 4-0 Akuutti oraalinen LD50 on suurempi kuin 21,5 ml/kg rotalla.

Laskimonsisäisesti LD5q on 1,08 g/kg hiirellä.

Esimerkki X, joka esitetään tässä julkaisussa myöhemmin, varmistaa biologisesti yhteen sopivien, ionittomien polymeeride-tergenttien, joita tässä yhteydessä käytetään stabiloivi-na/liuottavina aineina kyseessä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetuissa formulaatioissa, oleellisen myrkyt t ömyyden.

Spesifisiin esimerkkeihin ionittomia, biologisesti yhteen sopivia polymeeridetergenttejä, jotka ovat yhdistelmä-ΙΡΝβ:n normaalin annoksen (0,25 mg/ml) sopivia liuottajia/stabiloi-via aineita, sisältyy 0,15-prosenttisen polyetoksietylee-ni-12-lauryylieetterin (mieluummin valittu ryhmästä, johon . kuuluvat Trycol® LAL-12, Siponic® LA-12 ja Macol® LA-12) yh distelmä 0,05-prosenttisen Nopalcol 4-0:n kanssa; 0,1-prosenttinen Triton X305/0,05-prosenttinen Nopalcol 4-0; sekä 0,1-prosenttinen Triton X405/0,05-prosenttinen Nopalcol 4-0.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetut formulaatiot ovat liukoisina tai lyofilisoituina. Tässä yhteydessä ensiksi tarkastellut formulaatiot ovat nestemäisiä .

Nestemäiset formulaatiota säilytetään edullisesti lämpötila-alueella noin -70°C-+10°C. Jäähdytetyt formulaatiot säilytetään mieluummin lämpötila-alueella noin -70°C - 20°C, kun taas stabiloidut nestemäiset formulaatiot säilytetään mie- 95002 22 luuininin normaalissa jääkaapin lämpötilassa, joka on mieluummin noin +2°C - +8°C.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetut formulaatiot sisältävät: 1) yhdistelmätekniikalla valmistetun, puhdistetun IFN-βιη; 2) yhden tai useampia, biologisesti yhteen sopivia, ionit-tornia polymeeridetergenttejä tai yhden tai useamman ionittoman detergentin yhdistelmän toisen liuottavan/ stabiloivan aineen kanssa; ja 3) pienen määrän puskuria, joka pitää formulaation fysiologisella pH-alueella.

Nestemäiset formulaatiot tekevät mahdolliseksi käyttää glyserolia vaihtoehtoista liuottavaa ja/tai stabiloivaa ainetta, joka ei ole ioniton detergentti mutta, kun sitä käytetään yhdistettynä yhteen tai useampaan ionittomaan detergenttiin, se vähentää ionittornien detergenttien määrän suuruusluokkaa, joka tarvitaan liuottamaan/stabiloimaan IFN-β. Ilman glyserolin läsnäoloa edulliset konsentraatioalueet biologisesti soveltuville, ionittomille polymeeridetergenteille kyseessä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetuissa formulaatioissa liuottavina/stabiloivina aineina ovat noin 0,005 - 5 %, mieluummin noin 0,01 - 3 %, vielä mieluummin noin 0,05 - 1,5 %. (Esillä olevan keksinnön ionittoman detergentin, liuottavan aineen/stabiloivan aineen konsentraatioalueet ovat tilavuus/tilavuus-pohjaisia, paitsi propyleenioksidin ja etyleenioksidin segmenttikopolymeereil-le, kuten esimerkiksi Pluronic-polyoleille, joiden konsentraatioalueet perustuvat suhteeseen paino/tilavuus). Kuitenkin, kun glyserolia on esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetuissa formulaatioissa konsentraatio-alueella noin 5-50 tilavuus-%, mieluummin noin 20-30 tila-vuus-%, ja vielä mieluummin noin 25 tilavuus-%, yhtä tai useampaa ionitonta detergenttiä, joka toimii yhdistelmässä glyserolin kanssa, tarvitaan vain yksi kymmenes osa edellä esitetyistä konsentraatioista, ja edulliset konsentraatioalueet sellaisille ionittomille detergenteille, yksinään tai • 95002 23 yhdistelmissä, ovat noin 0,0005 - 5 %, mieluummin 0,001 - 1 %, ja vielä mieluummin noin 0,01 - 0,5 %.

Muita lisäksi tulevia liuottavia ja/tai stabiloivia aineita, joita voidaan käyttää yhdistelmässä esillä olevan keksinnön yhden tai useamman ionittoman detergentin kanssa, ovat voimakkaampia, liuottavia ja/tai stabiloivia aineita, mieluummin natriumdodekyylisulfaatti (SDS), jota voidaan käyttää sekä nestemäisissä että lyofilisoiduissa formulaatioissa. Vain hyvin pieniä määriä sellaisia voimakkaampia liuottavia ja/tai stabiloivia aineita tarvitaan yhdistelmissä yhden tai useamman ionittoman detergentin kanssa estämään IFN-P:n saostuminen esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetuista, nestemäisistä tai lyofilisoiduista/uudelleen muodostetuista formulaatioista, ja SDS:n tulisi mieluummin olla konsentraatioalueella, joka on noin 100 - 200 μg/ml yhdistelmä- IFN-P:a, ja vielä mieluummin noin 150 - 200 μg/mg yhdistelmä-IFN-p:a, ja yhä vielä mieluummin noin 150 - 173 μ^/mg yhdistelmä-IFN-P:a. Sellainen voimakkaampi, liuottava tai stabiloiva aine, kuten esimerkiksi SDS, vaikuttaa vähentäen ionittomien detergenttien konsentraatiota, joka tarvitaan liuottamaan ja stabiloimaan IFN-P:a neutraalissa pH:ssa.

Tietyt ionittomat detergentit eivät voi stabiloida/liuottaa IFN*P:a riittävästi, jotta IFN-P:n saostuminen estyy, ilman joko glyserolin tai SDS:n pienten määrien lisäystä. Esimerkkejä ovat pluronic-polyoli, Pluronic® F68, joka vaatii muita liuottavia ja/tai stabiloivia aineita, kuten esimerkiksi SDS:a tai glyserolia, jotta IFN-β pysyy liuoksessa tässä yhteydessä esitetyllä konsentraatioalueella. Jäljempänä esitetyt menetelmät ennakoivat tutkimussuunnitelmaa, joka sulkee sisäänsä koe-ehdokkaana ionittomia detergenttejä, joiden kanssa käytetään muita liuottavia ja/tai stabiloivia aineita, kuten esimerkiksi SDS:a ja glyserolia.

Nestemäiset formulaatiot voivat edelleen sisältää muun stabiloivan aineen, mieluummin yhtä tai useampaa hiilihydraat-·· tia, ja vielä mieluummin yhtä tai useampaa sokeria. Edulli siin stabiloiviin aineisiin kuuluu esimerkiksi sakkaroosi, 95002 24 dekstroosi, dekstraani, mannitoli, sorbitoli, inositoli, fruktoosi, galaktitoli, ksylitoli, laktoosi ja trehaloosi. Edullisempia ovat dekstroosi ja mannitoli, ja edullisin on dekstroosi. Muihin stabiloiviin aineisiin, jotka eivät ole hiilihydraatteja, kuuluu esimerkiksi humaani seerumin albumiini (HSA), jota voidaan käyttää yksinään tai yhdistettynä stabiloivan hiilihydraatin ja glysiinin kanssa ja jota mieluummin käytetään yhdistettynä stabiloivan hiilihydraatin kanssa. Sellaisia stabiloivia aineita käytetään mieluummin noin 0,025 - 10 %:n (paino/paino), mieluummin noin 0,05 -7 %:n ja vielä mieluummin noin 0,1 - 5 %:n konsentraatioalu-eella.

Puskuri, joka on valittu pitämään nestemäiset formulaatiot fysiologisesti hyväksyttävällä pH-alueella, on mieluummin noin 1-50-millimolaarisella konsentraatioalueella, vielä mieluummin noin 10-25 millimoolia.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetut lyofilisoidut formulaatiot sisältävät: 1) yhdistelmätek-niikalla valmistettua, puhdistettua IFN-P:a; 2) yhtä tai useampaa ionitonta detergenttiä tai yhden tai useamman ionit-toman detergentin yhdistelmää muun lyofilisoitavan, liuottavan ja/tai stabiloivan aineen kanssa; 3) kantaja-ainetta; ja 4) pienen määrän puskuria, joka antaa fysiologisesti hyväksyttävän pH-alueen liuosta uudelleen muodostettaessa.

Lyofilisoitava, lisäksi tuleva, liuottava/stabiloiva aine on mieluummin SDS (konsentraatioina, jotka edellä on esitetty nestemäisille formulaatioille). Glyserolia, konsentraatioalu-eilla, joita käytetään esillä olevan keksinnön mukaisissa koostumuksissa, pidetään ei-lyofilisoituvina, lisäksi tulevana, liuottavana ja/tai stabiloivana aineena, ja siitä syystä ionittomien detergenttien konsentraatiot esillä olevan keksinnön mukaisissa lyofilisoiduissa formulaatioissa ovat ne, jotka edellä on esitetty pääpiirteissään nestemäisille formulaatioille, joista glyseroli puuttuu.

95002 25

Mainittujen lyofilisoitujen formulaatioiden kantaja-aineisiin sisältyy stabiloivia hiilihydraatteja joko yksinään tai yhdistettyinä edellä nestemäisille formulaatioille esitetyllä tavalla ja samanlaisina konsentraatioina, sekä humaani seeru-mialbumiinia yksinään tai yhdistettynä mainittujen stabiloivien hiilihydraattien kanssa; kuitenkaan sellaisella valitulla kantaja-aineella ei tule olla ainoastaan stabiloivaa vaikutusta, vaan sen täytyy antaa massaa lyofilisoidulle valmisteelle ja siitä syystä sitä tässä yhteydessä nimitetään massaa antavaksi/stabiloivaksi aineeksi. Edullisiin, massaa an-taviin/stabiloiviin aineisiin edullisilla konsentraatio-alueilla tilavuutena ilmoitettuna, mikä mainitaan suluissa, kuuluu ainoastaan dekstroosi (noin 1-10 %; mieluummin noin 2-5 %); dekstroosin yhdistelmä (noin 0,1-5 %, mieluummin noin 0,1-0,2 %) mannitolin kanssa (noin 0,5-5 %) , mieluummin noin 1-3 %; tai humaani seerumialbumiinin kanssa (HSA) noin 1-5 %:n konsentraationa, mieluummin noin 1-2 %:n konsentraationa; ja HSA yksinään (mieluummin noin 1-5 %, vielä mieluummin noin 2,5 %) . Edullisempia massaa antavia/stabiloivia aineita ovat dekstroosi, mieluummin noin 5 %:n konsentraationa sekä dekstroosin ja mannitolin yhdistelmä, tilavuutena ilmaistuna konsentraatiosuhteena noin 1/5 - 1/20 (dekstroosi/mannitoli), ja vielä mieluummin konsentraatiosuhteena 1/10. Sellaiset dekstroosin ja mannitolin yhdistelmät ovat esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistettujen formulaa-tioiden kaikkein edullisimpia massaa antavia/stabiloivia aineita.

Lyofilisoituja formulaatioita varten puskuri valitaan mieluummin sitraatti-, maleaatti-, asetaatti- ja fosfaattipusku-reiden joukosta, vielä mieluummin asetaatti- tai fosfaatti-puskureiden, edelleen mieluummin fosfaattipuskureiden joukosta, joita käytetään samoina edullisina konsentraatioaluei-na kuin edellä mainittujen nestemäisten formulaatioiden suhteen. Edelleen, lyofilisoituja formulaatioita varten on edullista, että lyofilisoitavan koostumuksen (mieluummin IFN-β -poolin, josta suolat on poistettu) pH pidetään edullisella alueella, joka on noin 3,5-6,5, vielä mieluummin noin 4,0-6,0, ja edelleen vielä mieluummin noin 6, jotta estetään 95002 26 aggregaattien muodostuminen formulointimenetelmän kuluessa tehdasmaisen valmistuksen edellyttämien aikaviiveiden vuoksi. Kuitenkin, jos lyofilisointi on suoritettava noin tunnin kuluessa, mieluummin nopeammin kuin tunnin kuluttua neutraloinnista (tai jos formulaatio on nestemäinen), formulaatioiden pH voi olla alueella, joka on noin 3,5-9,5, mieluummin noin 4-8, vielä mieluummin noin 5,5-7,5, ja edelleen vielä mieluummin noin 6,0-7,2.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetut, sekä nestemäiset että lyofilisoidut, formulaatiot voivat sisältää vähäisempiä määriä säilöntäainetta kemiallisen pysyvyyden lisäämiseksi.

Käytetään tiettyjä biologisesti soveltuvia, ionittomia de-tergenttejä, ja niiden konsentraatio riippuu pääasiallisesti tietystä IFN-P-proteiinista tai analogista, joka on formuloitava, lisäksi tulevan liuottavan ja/tai stabiloivan aineen läsnäolosta tai puuttumisesta (varsinkin glyserolin), IFN-β:n konsentraatiosta ja formulaation pH:sta. Ionittoman detergen-tin optimi konsentraatio riippuu formulaation pH:sta. Esimerkiksi, kun käytetään Trycol® LAL-12:a tai Plurafac® C-17:a yksinään IFN-β:n normaalien annoskoostumusten liuot-tavana/stabiloivana aineena pH 5,0:ssa, molemmat ionittomat detergentit konsentraatioina, jotka ovat niin alhaisia kuin 0,01 %, voivat liuottaa IFN-P:a. pH 7,0:ssa 0,15-prosenttinen Trycol® LAL-12 voi liuottaa IFN-S-koostumusten normaalin annoksen siten, että aggregoituminen on vain vähäistä. Plurafac® C-17 0,05 prosentin konsentraationa voi liuottaa normaalin annoksen IFN-β-koostumuksia pH 6:ssa. Yleisesti sanottuna, mitä alhaisempi on formulaation pH, sitä alhaisempi ionittoman detergentin konsentraatio tarvitaan liuottamaan/stabiloimaan se.

Edelleen, biologisesti yhteensopivan, ionittoman polymeeri-detergentin konsentraatio vaihtelee formulaatioon sisältyvän IFN-β:n konsentraation mukana. Esimerkiksi, IFN-β:n korkean ’· annoksen sisältävä formulaatio on sellainen, että se sisältää noin 1-2 mg/ml IFN-P:a lopullisessa lääkepullossa (2-4 x 10® 27 - 95002 yksikköä mg kohti). Normaali annosformulaatio on 0,25 mg/ml IFN-P:a lopullisessa lääkepullossa (0,5 x 108 yksikköä/mg). Sitä vastoin alhaisen annoksen formulaatiossa on 0,125 mg/ml IFN-P:a lopullisessa lääkepullossa (0,25 x 108 yksikköä/mg). Liuottavan/stabiloivan aineen, joka sisältää yhtä tai useampaa ionitonta detergenttiä, edullinen konsentraatioalue korkean annoksen formulaatiolle on noin 0,1-5, mieluummin 0,25-3 % ja vielä mieluummin noin 0,5-2,0 %. IFN-8:n normaaleille annosformulaatioille ionittoman detergentin edullinen konsentraatioalue on noin 0,005-1,0 %, mieluummin noin 0,075-0,5 %, ja edelleen vielä mieluummin noin 0,01-0,3 %.

ΙΡΝ-β:η alemmat annosformulaatiot samalla tavalla edellyttäisivät käytetyn, biologisesti yhteen sopivan polymeerideter-gentin alempia konsentraatioalueita.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetun, lyofilisoidun, normaalin annosformulaation edullisin esimerkki sisältää: 0,25 mg/ml yhdistelmä IFN-P:a 0,15 % (tilavuus/tilavuus) polyoksietyleeni-12-lauryylieetteriä ; 20 millimolaarista natriumfosfaattipuskuria; 0,2 % dekstroosia; ja 2 % mannitolia.

On edullista, että polyoksietyleeni-12-lauryylieetteri on Macol® LA-12.

Monet menetelmistä, joita käytetään lipofUlisten yhdis-telmäproteiinien, kuten esimerkiksi bakteereiden valmistaman IFN-P:n takaisin saamiseen, käyttävät hyväksi SDS:a tai samankaltaisia pinta-aktiivisia aineita primaarisina liuottavina aineina proteiinin liuottamiseen ja eristämiseen solumateriaalista ja sitä seuraavaa hapolla suoritettavaa saostamista varten proteiinin • · 95002 28 saamiseksi. Käytettäessä lisäpuhdistusmenetelmiä, jotka suoritetaan neutraalissa pH:ssa tai lähellä sitä, SDS:n tasot lopullisissa proteiinivalmisteissa vähenevät noin 0,1 %:iin. Diasuoda-tus- ja suolanpoistotekniikoin pH 3-8:n alueella suoritettava enempi poistaminen ei noudata ensimmäisen kertaluokan kinetiikkaa, mikä johtuu proteiinin ja SDS:n välisistä vuorovaikutuksista, joka merkittävästi vaikuttaa SDS:n poiston kinetiikkaan. Havaittiin, että SDS:n poistaminen yhdistelmäproteiineista edistää proteiinien välisiä vuorovaikutuksia pH-alueella 3-8, mistä seuraa proteiinin saostuminen tai aggregaatio sekä sitä seuraava aktiivisuuden häviö.

Erästä ratkaisua sellaisen aggregaation ja saostumisen ongelmaan SDS:n poistamisen aikana kuvataan US-patentissa n:o 4 462 940, joka on esitetty yllä, ja mainittu patentti on tähän yhteyteen liitetty viitteenä. Tuossa menetelmässä käytetään korkeaa pH-alu-etta (10,5 - 12,5) diasuodatuksen ja suolanpoiston aikana. Vaikka US-patentin n:o 4 462 940 mukaista menetelmää, samoin kuin mitä tahansa muita tunnettuja menetelmiä, voidaan käyttää, jotta saadaan puhdistettua IFN-E:a formulaatiota varten kyseessä olevan keksinnön mukaisten stabiloivien aineiden/liuottavien aineiden kanssa, samoin kuin mitä tahansa muita tunnettuja takaisinsaanti-, eristys- ja puhdistusmenetelmiä, tässä yhteydessä esitettyjä menetelmiä pidetään edullisimpina menetelminä, jotka ovat tuttuja patentin hakijoille.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti ratkaistaan IFN-6:n aggre-goitumis-, saostumis- ja proteiinin aktiivisuuden menetysongelma poistamalla SDS:n tai samankaltaiset liuottavat aineet menetelmin, joissa vältetään US-patentin n:o 4 462 940 mukaisessa menetelmässä käytettyä, korkeaa pH-aluetta (10,5 - 12,5).

Sen tähden kyseessä olevan keksinnön eräänä näkökohtana on välttää sellaista korkeaa pH:ta diasuodatus- tai suolanpoisto-olosuhteissa käyttämällä miedompaa detergenttiä tai kaotrooppista ainetta siirtokomponenttina diasuodatuksen tai suolan poiston aikana voimakkaampien liuottavien aineiden korvaamiseksi, kuten esimerkiksi korvattaessa SDS:a, jota käytetään uutettaessa ja 29 95002 puhdistettaessa yhdistelmä-IFN-g:a isäntäorganismeista. Sellaisia miedompia detergenttejä/kaotrooppisia aineita käytetään siir-tokomponentteina, jotka tekevät mahdolliseksi IFN-g:n diasuoda-tuksen tai suolanpoiston alemmalla ρΗ-alueella, esimerkiksi noin 8,5-10:ssä, mieluummin 9-9,5:ssä. Siirtokomponentteina käytettävien detergenttien/kaotrooppisten aineiden esimerkkeihin sisältyy rasvahappojen suoloja, joissa hiilivetyketjun pituus on noin 10-13 hiiliatomia, mieluummin 11-12 hiiliatomia ja mieluiten 12 hiiliatomia. On edullista, että rasvahapposuola voi olla lauraattisuola, ja edullisimmin sellainen lauraattisuola on natriumlauraatti.

Mainitun siirtokomponentin konsentraatioalue eluutiopuskurissa, mieluummin eluutiopuskurissa, jonka ionivahvuus on alhainen, on noin 0,05 - 2 %, mieluummin 0,1-1 % (tilavuus/tilavuus).

Sellaisten rasvahapposuolojen lisäksi voidaan käyttää monia muita mietoja detergenttejä/kaotrooppisia aineita, esimerkiksi ureaa (5-7-molaarista, mieluummin 6-molaarista) tai mieluummin guanidiinin hydrokloridia (5-7-molaarista, mieluummin 6-molaa-rista).

Edelleen, on mahdollista käyttää kyseessä olevan keksinnön mukaisia, ionittomia, biologisesti yhteen sopivia polymeerideter-genttejä siirtokomponentteina sekä liuottavina/stabiloivina aineina, edellyttäen, että pH ja muut menetelmän mukaiset olosuhteet ovat parhaat mahdolliset kullekin käytetyistä, yksittäisistä ionitonta detergenttiä sisältävistä liuottavista/stabiloi-vista aineista.

Puhdistetun IFN-g-poolin pH, joka vallitsee diasuodatuksen tai suolan poiston, mieluummin suolan poiston jälkeen, jossa käytetään puskuria, jonka ionivahvuus on alhainen ja joka sisältää siirtokomponentin, säädetään sitten noin 2-4:ään, mieluummin 3-4:ään ja mieluiten noin 3:een, jossa siirtokomponentti, mieluummin natriumlauraatti saostuu liuoksesta. Saostettu siirto-· komponentti poistetaan sitten suodattamalla tai muilla tavoin, jotka ovat tunnettuja aiheeseen perehtyneille.

30 95002

Esimerkissä 1, jäljempänä tässä julkaisussa kuvatussa esimerkki-menetelmässä, havaittiin natriumlauraattisiirtokomponentin poistuvan tasoille, jotka olivat menetelmän, jossa käytettiin stan-dardiproteiini-RP-HPLC-järjestelmää sekä UV-ilmaisua, havaitse-misrajan alapuolella (se on noin 10 moolia lauraattia moolia kohti IFN~6:a).

Proteiinipooliin voidaan sitten lisätä stabiloiva/1luottava aine, joka sisältää yhtä tai useampaa biologisesti yhteen sopivaa, ionitonta polymeeridetergenttiä. Valinnaisesti, mainittu seos voidaan säilyttää, ennen kuin pH nostetaan 3,5:stä 9,5:een, mieluummin 4,0:sta 8,0:aan, ja vielä mieluummin 5,5:stä 7,5:een. Aika, jonka verran liuosta voidaan säilyttää, riippuu pääasiallisesti tietystä IFN-g-analogista, käytetyn stabiloivan/liuot-tavan aineen erityisestä koostumuksesta, täsmällisestä pH:sta ja IFN-β-proteiinin sekä stabiloivan/liuottavan ainekoostumuksen konsentraatioista ja normaalisti ajan pituudesta, joka on 0-240 minuuttia, mieluummin 10-180 minuuttia.

Esillä olevan keksinnön lisänäkökohtana on tarjota uuttamisen, puhdistamisen ja formuloinnin käyttöön menetelmiä, joissa formuloitu yhdistelmä-IFN-g on kokonaan tai suurin piirtein puhdas SDS:n tai muiden vähemmän toivottujen liuottavien aineiden suhteen. Mainittuihin, parannettuihin menetelmiin sisältyy myrkyttömän, miedomman detergentin/kaotrooppisen aineen käyttö primaarisena, liuottavana aineena SDS:n tai muiden voimakkaiden, kemiallisten, stabiloivien aineiden sijaan yhdistelmä-IFN-g:n uuttamisen, puhdistamisen ja talteen ottamisen aikana. Sellaisiin myrkyttömiin detergentteihin/kaotrooppeihin kuuluu rasvahappojen suoloja, joita yllä on mainittu siirtokomponentteina, mieluummin lauraattisuoloja ja mieluiten natriumlauraatti (0,5 - 3 %, mieluummin 1 - 2 %). Edullinen pH-alue sellaisille rasvahapposuolastabilisaattoreille olisi 9-10, mieluummin 9 - 9,5.

On edullista, että kun rasvahapposuolaa, kuten esimerkiksi nat-riumlauraattia, käytetään primaarisena liuottavana aineena, se on puskurissa, kuten esimerkiksi fosfaatti-, Tris · HCl- tai

II

31 95002 asetaattipuskurissa, jolloin puskurin molaarisuusalue on noin 5-40-millimolaarinen, mieluummin 10-30-millimolaarinen ja mieluiten noin 20-millimolaarinen. Edelleen on edullista, että liuottamismenetelmä suoritetaan hitaasti, pidennetyn ajan kuluessa, noin 1-24 tunnissa, ja suoritetaan äänikäsittely liuottamisen edistämiseksi. Pelkistäviä aineita, kuten esimerkiksi ditiotreitolia (DTT) tai β-merkaptoetanolia (β-mer) voidaan myös mielellään käyttää rasvahapposuolan kanssa liuottamisen edistämiseksi.

Muihin miedompiin detergentteihin/kaotrooppisiin aineisiin, jotka ovat käyttökelpoisia primaaristen, liuottavien aineiden vaihtoehtona, kuuluu guanidiinin hydrokloridi (4-8-molaari-nen, mieluummin 5-7-molaarinen, mieluiten noin 6-molaarinen) pelkistävän aineen, kuten esimerkiksi DTT:n tai β-merkapto-etanolin (β-mer) (30-70-millimolaarinen, mieluummin 40-60 millimolaarinen, mieluiten noin 50 millimolaarinen) kanssa.

Kun sellaista rasvahappoa tai guanidiinin hydrokloridia käytetään primaarisena, liuottavana aineena vaihtoehtona deter-genteille, kuten esimerkiksi SDS.-lle, on edullista, että valoa taittavia osasia, jotka sisältävät yhdistelmäinterferoni-β:3, on konsentraationa noin 15-5 mg/ml, mieluummin noin 10-5 mg/ml, ja vielä mieluummin noin 8 mg/ml. Kun sellaisia primaarisia, liuottavia aineita käytetään, valmistetuista formu-laatioista puuttuu SDS, joko kokonaan tai oleellisesti ne ovat ilman SDS:a.

Rasvahapposuolan, kuten esimerkiksi natriumlauraatin, käyttö antaa käyttöön lisämenetelmän korkeiden alkalisten olo-suhteiden ja IFN-βιη aggregaation, saostumisen ja aktiivi-suu-den häviön aiheuttamien ongelmien välttämiseksi diasuodatuk-sen ja suolojen poiston aikana. Kun sellaista rasvahapposuo-laa, kuten esimerkiksi natriumlauraattia käytetään primaarisena, liuottavana aineena talteenoton ja puhdistuksen aikana, ei ole tarpeellista poistaa suoloja ΙΕΝ-β-poolista tai diasuodattaa sitä puhdistuksen viimeisenä vaiheena, paitsi jos tällaista menettelyä tarvitaan muiden pienimolekyylisten komponenttien, kuten esimerkiksi EDTA:n, poistamiseen. Kun kerran IFN-β on puhdistettu riittä- 32 95002 västi, IFN-β-ροοϋη pH voidaan alentaa noin 2-4:ään, mieluummin 3-4:ään, ja vielä mieluummin 3-3,5reen, jossa pHrssa rasvahappo-suola saostuu. Saostuma voidaan poistaa sentrifugoinnin tai suodatuksen avulla tai muilla, aiheeseen perehtyneelle tunnetuilla tavoilla. Sitten IFN-ftliuos voidaan stabiloida kyseessä olevan keksinnön mukaisen, sopivan liuottavan/stabiloivan aineen avulla, ja sen pH voidaan säätää formulaatiolle sopivaan pH-arvoon. Jos mainittu pH:n säätö suoritetaan 6,5:n yläpuolelle, mieluummin lisätään välittömästi jatkuvana sarjana massaa lisäävää/sta-biloivaa ainetta, ja liuos, joka on valinnaisesti esisuodatettu sekä suodattamalla steriloitu, lyofilisoidaan. Yllä käytetty termi "välitön" tarkoittaa tässä yhteydessä lyhyempää aikaa kuin yhtä tuntia. Jos pH on 6,5:n alapuolella, mieluummin 6 tai sen alapuolella, massaa lisäävän/stabiloivan aineen lisäyksen sarjan sekä valinnaisesti esisuodatetun ja steriiliksi suodatetun liuoksen lyofilisoinnin ei tarvitse tapahtua välittömästi.

On edullista, kun dekstroosia käytetään esillä olevan keksinnön mukaisten lyofilisoitujen formulaatioiden kantaja-aineena, että lyofilisointisvkli suoritetaan hitaasti, kaksivaiheisesti porrastaen. Edullinen lyofilisointiohjelma, jota käytetään, kun dekstroosi on kantaja-aineena, on esimerkiksi seuraavanlainen: (a) jäädytä 4 tunnin ajan -30°C:ssa; (b) lyofilisoi mainitussa lämpötilassa 24 tunnin ajan; (c) nosta lämpötilaa portaittain 6°C/h +5°C:een saakka; (d) pidä lämpötila +5°C:ssa 12 tunnin ajan; (e) nosta lämpötilaa portaittain 6°C/h +15°C:een saakka; ja (f) pidä lämpötila +15°C:ssa ainakin 12 tunnin ajan.

Vaiheen (a) jäähdyttämisaika voi olla noin 2-6 tuntia lämpötila-alueella noin -70 - -20°C. Vaiheen (b) lyofilisointiaika voi olla noin 12 - 48 tuntia. Portaittainen lämpötilan muutosnopeus vaiheissa (c) ja (e) voi olla noin 3°C - 12°C/h vastaavilla lämpötila-alueilla, jotka ovat noin -5°C:sta noin +10°C:een (vaiheet c ja d) ja noin +10°C:sta noin +25°C:een (vaihe e). Lämpötilan ylläpitoaika vaiheessa (d) voi olla noin 6 tunnista noin • 18 tuntiin.

95002 33

Edelleen, esillä oleva menetelmä antaa käyttöön tunnettujen, biologisesti yhteen sopivien polymeeridetergenttien, mainittujen detergenttien yhdistelmien ja yhden tai useamman mainitun detergentin ja muun liuottavan ja/tai stabiloivan aineen yhdistelmien seulontamenetelmiä stabiloivien/liuotta-vien aineiden löytämiseksi esillä olevan keksinnön mukaisille yhdistelmä-IFN-β-formulaatioille. Sellaisen seulontamenetelmän edullinen esimerkki käsittää seuraavat vaiheet: (a) puhdistetun, yhdistelmä-IFN-β:n, joka on 0,l-%:isessa SDS:ssä, annetaan läpäistä suolanpoistopylväs, joka on tasapainotettu 0,l-%:isessa natriumlauraatissa, eluointipusku-rissa, pH 9,0-10,0:ssa; (b) eluaatin pH alennetaan sopivan happaman aineen avulla noin pH 2-4:ään; (c) pooliin, josta suolat on poistettu, lisätään sopiva kon-sentraatio ehdokkaana olevaa, biologisesti yhteen sopivaa po-lymeeridetergenttiä, mainittujen detergenttien yhdistelmää tai mainittujen detergenttien yhdistelmää muun liuottavan ja/tai stabiloivan aineen kanssa, jotka yhdistelmät ovat ehdokkaina ; (d) pH säädetään arvoon välille 3,5 - 9,5 sopivan emäksisen aineen avulla; ja (e) mainitun liuoksen annetaan seisoa 24 tunnin ajan pH-ar-vossa 3,5 - 9,5.

Termillä puhdistettu yhdistelmä-IFN-β, seulontavaiheessa (a) edellä, tarkoitetaan mieluummin IFN^:a, joka on puhdistettu G-75-pylväällä suoritettavan, kokoon perustuvan lajittelun avulla, jota kuvataan jäljempänä esimerkissä 1 ja kuvioissa 2A sekä 2B. Kuitenkin sellainen seulontamenetelmä on esimerkin luonteinen, ja muut seulontamenetelmät, joissa käytetään muita menetelmiä puhdistetun yhdistelmätekniikalla valmistetun IFN-β :n seulomiseksi, sisältyvät esillä olevan keksinnön piiriin.

Jos ehdokkaana oleva stabiloiva/liuottava aine pitää yhdistelmä- IFN-β:n liuoksessa arvossa 3,5 - 9,5 24 tunnin ajan, “ sen katsotaan sisältyvän esillä olevan keksinnön mukaisen me netelmän avulla valmistettaviin prototyyppiformulaatioihin.

34 95002

Edulliseen seulontamenetelmään sisältyy IFN-β-poolista, josta suolat on poistettu, saostetun natriumlauraatin, joka koostuu vaiheesta (b), suodatusvaihe.

Esillä olevan keksinnön mukainen, edullinen seulontamenetelmä on sellainen, jossa pH-alue vaiheelle (a) on 9-9,5, vaiheelle (b) se on 3-4 ja muut vaiheet (d) ja (e) suoritetaan pH-alueella noin 4-8. Vielä edullinen seulontamenetelmä on sellainen, jossa pH-alue vaiheelle (a) on 9-9,2, vaiheelle (b) se on noin 3-3,5 ja jossa vaiheet (d) ja (e) suoritetaan pH-alueella, joka on noin 5,5-7,5.

Vaiheen (a) eluointipuskuri on mieluummin Tris-HCl, jonka pH on 9-9,8; boraatti, jonka pH on 9,0-9,8; natriumfosfaatti, jonka pH on 9,0-9,8; asetaatti, jonka pH on 9,0-9,8; tai natriumpyro-fosfaatti, jonka pH on 9,0-9,8.

Seuraava seulontaa koskeva juoksukaavio valaisee graafisesti esillä olevan keksinnön mukaisen IFN-6:n formulaatioreagenssien seulontamentelmiä, jotka seuraavassa esitetään esimerkkeinä. Termit G-75 ja G-25 ovat geelisuodatuspylväitä, jotka on sijoitettu kyseessä olevan esimerkin 1 mukaiseen, IFN-6:n tyypilliseen puhdistusmenetelmään.

Seulontaa koskeva juoksukaavio

Menetelmä IFN~B;n valmistamiseksi formulaatiotutkimuksia varten G-75-pooli G-25-pylväs lauraattipuskurissa, pH 9,2 i

Lauraattisaostuma, pH 3

Sentrifugointi ja suodatus lauraatin poistamiseksi Φ

Formulaatioreagenssien lisäys ja pH:n säätö Säilytys 4°C:ssa Ί'

Sentrifugointi A20Q, biologinen aktiivisuus tai muut määritysmenetelmät 35 95002

Prototyyppiformulaatioiden analysoimiseksi käytetään ultra-sentrifugointia yksinkertaisena menetelmänä suurimolekyylipai-noisten aggregaattien havaitsemiseksi. Sellaiset ehdokkaana olevat formulaatiot voidaan seuloa myös SDS-PAGE:n avulla olosuhteissa, jotka eivät ole pelkistäviä, sekä Western-blottien avulla.

Yhdistelmä-IFN-3:n edullinen alue sellaisissa formulaatioissa on noin 0,05 - 10 mg/ml, mieluummin 0,1-5 mg/ml, ja vielä mieluummin 0,1 - 2,0 mg/ml.

Edullinen menetelmä esillä olevan keksinnön mukaisten, lyofi-lisoitujen IFN-β-formulaatioiden valmistamiseksi käsittää seu-raavat vaiheet: (a) yhdistelmä-beta-interferonin uuttamisen isän-täorganismin, joka on transformoitu proteiinin tuottamiseksi, pirstomistuotteista; (b) IFN-g-proteiinin puhdistuksen· käyttäen viimeisenä puhdistusvaiheena suolan poistoa pH-alueella noin 8,5-10, jossa käytetään 0,05-2-prosenttista natriumlauraattia siirtokomponenttina; (c) pH:n alentamisen poolissa, josta suolat on poistettu, jonkin happamen aineen avulla noin pH-arvoon 2-4; (d) saostetun natriumlauraatin poistamisen sentrifugoimalla tai suodattamalla; (e) pooliin suoritettavan tehokkaan määrän lisäyksen yhtä tai useampaa biologisesti yhteen soveltuvaa poly-meeridetergenttiä tai yhden tai useamman polymeeridetergentin yhdistelmää muun liuottavan ja/tai stabiloivan aineen kanssa, IFN-$:n stabiloimiseksi/liuottamiseksi; (f) poolin pH:n säädön sopivalla emäksisellä aineella pH-alueelle 3,5-9,5; (g) massaa lisäävän/stabiloivan aineen tehokkaan määrän lisäyksen; (h) liuoksen esisuodatuksen ja steriilisuodatuksen; sekä (i) formu-laation lyofilisoinnin.

Jos pH:n säätö vaiheessa (f) suoritetaan tasolle 6,5, vaiheet (f) - (i) suoritetaan mieluummin nopeana, jatkuvana sarjana, jotta vältetään IFN-6-aggregaattien muodostuminen. Havaittiin, että näytteen jäähdyttäminen kuivajäässä ja etanolissa välittömästi pH 6,5:een ja sitä korkempaan pH-arvoon suoritetun neutraloinnin jälkeen, ei tuotannut aggregaatteja, kun taas näytteiden hidas jäähdyttäminen, joka suoritettiin asettamalla huoneenlämpöiset näytteet -20°C:een, aiheutti jonkin verran 36 95002 aggregaattien muodostumista. Kun formulaatiot neutraloitiin pH 6,5:een tai sen yläpuolelle neljä tuntia ennen lyofili-sointia, saatiin 30-40 %:n lisäys aggregaattien määrässä, kun verrattiin näytteisiin, jotka oli neutraloitu välittömästi ennen lyofilisointia. Sen tähden on edullista, että lyofilisointi suoritetaan välittömästi ennen pH 6,5:een tai sen yläpuolelle suoritettavaa neutralointia, missä tapauksessa tuloksena on aggregaattien erittäin alhainen taso. Kuitenkin, kun neutralointivaihe (f) suoritetaan pH 6,5:een tai sen alapuolelle, mieluummin pH 6,0:ssa tai sen alapuolella, näytteissä ei ole mitään merkittävää aggregaa-tiota, kun ne jätetään huoneen lämpötilaan 24 tunniksi ennen lyofilisointia.

Edelleen suolojen poistovaihe suoritetaan mieluummin pH-alueella noin 9-9,5. Vaiheen (c) pH-alue on 3-4 ja mieluummin noin 3,0 ja vaiheessa (f) se on 4-8, mieluummin 4,0-6,5,- ja vielä mieluummin 4,0-6,0. Edelleen, vaihetta (c) varten pH-alue on noin 3,5 ja vaihetta (f) varten noin 5,5-6,5.

Esillä olevan keksinnön edullisissa suoritusmuodoissa ionittomat, biologisesti yhteen sopivat polymeeridetergent-tistabilisaattorit/liuottavat aineet tai niiden yhdistelmät ovat Laureth 12 -detergenttejä, Plurafac® C-17, Laureth 12/Nopalcol, tilavuussuhteissa noin 2:1 tai Triton X305 tai X405/Nopalcol, tilavuussuhteessa 2:1. Edelleen, noin 0,01 %:n konsentraatio on edullinen mitä tahansa edullista, ionitonta detergenttiä (Pluronic® F68 mukaanluettuna) glyserolin kanssa, jota on tällöin noin 25 %.

«

Esillä olevan keksinnön toteuttamistarkoituksiin bakteerit ovat edullisia mikro-organismeja, E. colin ollessa edullisin.

Yleisesti sanottuna talteenotto-, puhdistus- ja formulointi- »t 37 95002 menetelmiin tässä yhteydessä sisältyy isäntäorganismin, joka on transformoitu ilmentämään IFN-B:a, fermentointi, solunsei-nämän ja solumembraanin pirstominen, valoa taittavan materiaalin, joka sisältää yhdistelmä-IFN-6:n erottaminen solupirsta-leiden jäännöksestä, valoa taittavan materiaalin liuottaminen vettä sisältävässä puskurissa pelkistävissä olosuhteissa, IFN-S:n uuttaminen 2-butanolilla tai 2-metyyli-2-butanolilla, uutetun IFN-6:n kromatografinen puhdistus ja sitten diasuodatus tai suolojen poisto, mieluummin suolojen poisto, liuottavan aineen poisto IFN-B:sta valinnaisesti käyttämällä sopivaa siirtokomponent-tia sekä formulointi yllä kuvatulla tavalla.

Kuviot IA ja IB esittävät esillä olevan keksinnön edullista suoritusmuotoa, jossa natriumlauraattia käytetään primaarisena liuottavana aineena ja siirtokomponenttina.

Kuviot 2A ja 2B esittävät esillä olevan keksinnön edullisia suoritusmuotoja, joissa käytetään dodekyylisulfaattia (SDS) primaarisena liuottavana aineena ja natriumlauraattia käytetään siirtokomponenttina suolan poistovaiheessa, joka suoritetaan © suoloja poistavassa Sephadex G-25-pylväässä. Edelleen, kuviot 2A ja 2B valaisevat esillä olevan keksinnön edullisen suoritusmuodon yksittäisiä menetelmävaiheita, mukaan luettuna transformoitujen mikro-organismien viljeleminen sopivassa fermentoinnin väliaineessa aina lopulliseen vaiheeseen saakka, jossa puhdistettu IFN-β stabiloidaan ja sitten lyofilisoidaan sekä muodostetaan uudelleen terapeuttisiksi formulaatioiksi. Esillä olevan keksinnön erään suoritusmuodon erään sellaisen esimerkin yksittäiset menetelmävaiheet esitetään yhteenvetona seuraavasti: (a) transformoitujen bakteeri-isäntien kasvattaminen sopivassa fermentoinnin väliaineessa; (b) bakteereiden konsentrointi fermentoinnin väliaineessa poi-kittaisvirtaussuodatuksen avulla, sentrifugoinnilla tai muiden tavanomaisten menetelmien avulla; (c) bakteereiden solunseinämän ja solumembraanin pirstominen; ·· (d) suuremman osan kuin 99 paino-% suuruisen määrän poistaminen mainitun pirstomistuotteen sisältämistä suoloista diasiodatuk-sen tai sentrifugoinnin avulla; 38 95002 (e) pirstotun tuotteen, josta suolat on poistettu, uudelleen pirstominen; (f) materiaalin lisääminen pirstottuun tuotteeseen viimeksi mainitun tiheyden tai viskositeetin lisäämiseksi tai tiheys- tai viskositeettigradientin muodostamiseksi pirstomistuotteeseen sisältyvässä nesteessä; (g) valoa taittavan materiaalin erottaminen solupirstaleista suurella sentrifugointinopeudella; (h) valoa taittavan materiaalin liuottaminen puskurin vesi-liuoksessa, joka sisältää pelkistävää ainetta; (i) liuotetun, valoa taittavan aineen uuttaminen orgaanisella aineella, mieluummin 2-butanolilla tai 2-metyyli-2-butanolilla; (j) valoa taittavan aineen erottaminen uutteesta, mieluummin käyttämällä hapanta saostusvaihetta, jota sentrifugointi seuraa; (k) muodostuvan IFN-g-partikkelisuspension liuottaminen tislatulla vedellä tai SDS:n vesiliuoksella siten, että IFN-g:n suhde SDSrään on 1:3; (l) liuoksen pH:n säätö noin 9,5:een ja liuotetun IFN-g:n pelkistäminen; (m) pelkistetyn IFN-g:n puhdistaminen kromatografisesti; (n) vaiheesta m saadun IFN-g:n hapettaminen; (o) hapetetun IFN-g:n puhdistaminen edelleen geelikromatogra-fian avulla ja puhdistettua IFN-g:a sisältävän eluaatin kokoaminen; (p) suolojen poistaminen puhdistetusta IFN-g-eluaatista suoloja poistavassa pylväässä, joka tasapainoitetaan ja ajetaan 0,1-prosenttisessa natriumlauraatissa, joka on 10-millimolaari-sessa Tris-HCl:ssä, pH 9,2:ssa; (q) eluaatin pH:n alentaminen nopeasti pH 3,0:aan sopivan hap-pamen aineen avulla; (r) IFN-β-ροοϋη sentrifugointi ja suodatus; (s) ionitonta, biologisesti yhteen sopivaa polymeeridetergent- *' tiä sisältävän liuottavan aineen/stabiloivan aineen tehokkaan määrän lisäyksen; 39 95002 (t) liuoksen pH:n säätö lähelle fysiologista pH-arvoa; (u) sopivan massaa lisäävän/stabiloivan aineen lisäys noin 0,25 - 10 %:n konsentraationa; (v) liuoksen suodattaminen; (w) lyofilisoidun IFN-β-näytteen uudelleen muodostaminen, kun sitä halutaan; (x) lyofilisoidun IFN-β-näytteen uudelleen muodostaminen haluttaessa.

10 millimoolia ditiotreitolia voidaan valinnaisesti sisällyttää ensimmäiseen liuotusvaiheeseen, ja seos voidaan kuumentaa noin 50°C:een 10 minuutin ajaksi. Lisäksi, IFN-β hapetetaan mieluummin siten, että sen kysteiinitähteet muodostavat sillan muodostaen kysteiinejä, kuten US-patentissa n:o 4 530 787 kuvataan, käyttämällä o-jodibentsoehappoliuosta, tai kuten US-patentissa n:o 4 572 798, jonka otsikko on "Method for Promoting Disulfide Bond Formation in Recombinant Proteins" ja jonka mukaan hapet-tamiseen käytetään kuparikloridia. Mieluummin käytetään o-jodi-bentsoehappoa hapetukseen.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän toisessa edullisessa suoritusmuodossa pirstottuja soluja käsitellään interferoni-β-proteiinin eristämiseksi ja puhdistamiseksi, ja sitten suoritetaan seuraavat vaiheet: (a) suolojen poistaminen IFN^-proteii- nista G25-kromatografiän avulla, pH 9-9,2:ssa, käyttämällä eluointipuskuria, joka sisältää 0,05 - 2 % natriumlauraattia siirtokomponenttina; (b) poolin, josta suolat on poistettu, pH:n säätö noin 3,5:een; (c) sentrifugointi ja suodatus saoste-tun siirtokomponentin poistamiseksi; (d) stabiloivan/liuottavan aineen koostumuksen lisäys pooliin, josta suolat on poistettu; (e) IFN-3~seoksen pH:n säätö neutraaliin pH-arvoon; (f) massaa lisäävän stabiloivan aineen tehokkaan määrän lisäys; (g) poolin suodattaminen; (h) IFN-8-proteiininäytteen välitön lyofi-lisointi neutraloinnin ja massaa lisäävän/stabiloivan aineen lisäyksen jälkeen; ja (i) lyofilisoidun IFN-8-proteiininäytteen ; uudelleen muodostaminen, jos niin halutaan.

40 9 5 0 0 2 EP 206 828 esittää yksityiskohtaisesti uuttamis- ja puhdistus-menetelmiä yhdistelmäproteiinia, kuten esimerkiksi IFN-g:a varten, joka sijaitsee isäntäorganismin sisällä, valoa taittavissa osasissa. Mainittu julkaisu keskittyy valoa taittavien aineiden eristämiseen alkupään menetelmien avulla, joita nimitetään termein joko "lyhennetty" tai "laajennettu". Mainittuja menetelmiä koskeva yleiskatsaus esitetään seuraavassa.

Transformoituja mikro-organismeja kasvatetaan sopivassa elatus-aineessa, normaalisti ainakin optisen tiheyden (OD) arvoon noin 30 saakka 680 nm:ssä mitattuna, ja mieluummin optisen tiheyden arvojen 20 ja 40 välille 680 nm:ssä mitattuna. Elatusaineen koostumus riippuu tietystä, kyseessä olevasta mikro-organismista. Elatusaine on vettä sisältävä elatusaine, joka sisältää yhdisteitä, jotka täyttävät kyseessä olevan mikro-organismin ravinto-vaatimukset. Elatusaine sisältää normaalisti hiilen ja typen assimiloituvia lähteitä, energialähteitä, magnesiumia, kalium-ja natriumioneja ja valinnaisesti aminohappoja sekä puriini- ja pyrimidiiniemäksiä. (Katso Review of Medical Biology, Lange Medical Publications, 14. painos, ss. 80-85 (1980)). Ilmentymis-vektoreissa on trp-promoottori, tryptofaanin konsentraatiota elatusaineessa säädellään huolellisesti, jotta siitä tulee rajoittava tekijä IFN-6:n ilmentymisen ajankohtana, jos niin halutaan. E. colin elatusaine on tutkimustyössä hyvin tunnettu.

Sen jälkeen kun solut on koottu viljelmästä, ne voidaan konsentroida, jos on tarpeellista, konsentraatioon noin 20 - 510 mg/ml, mieluummin konsentraatioon 80 - 100 mg/ml (OD 40 - 300, mieluummin 160 - 200, 680 nm:ssä) poikittaisvirtaussuodatuksen, sentri-fugoinnin tai muiden tavanomaisten menetelmien avulla. Yhdiste on mieluummin ihmisille myrkytön, esimerkiksi 1-oktanoli, määrällisesti sitä käytetään noin l-paino-% kokonaiskomponenttien painosta, ja se lisätään fermentteriin ennen solujen konsentroin-tia tai konsentroinnin aikana, jotta varmistutaan siitä, että eläviä yhdistelmäorganismeja ei jää jäljelle, ennen kuin fer-mentterin sisältö rikotaan.

Kootun viljelmän konsentroinnin jälkeen mikro-organismien solu- • 41 95002 membraanit rikotaan. Tässä menetelmän vaiheessa voidaan käyttää tavanomaisia solun pirstomismenetelmiä, kuten esimerkiksi ho-mogenointia, äänikäsittelyä tai painekierrätystä. Edullisia menetelmiä ovat äänikäsittely tai homogenointi homogenisaattorin avulla. Pirstomisen päätepiste voidaan määrittää tarkastelemalla suspension optista tiheyttä mittaamalla 260 nmrssä sen absorbanssi, joka normaalisti lisääntyy solujen hajotessa. Joka tapauksessa, pirstomisen tulisi rikkoa suurin piirtein kaikki solut, niin että yksikään ehjä solu ei läpäise liuotusvaihetta. Ennen pirstomista konsentraatin nestefaasin pH säädetään tasolle, joka helpottaa E. colin proteiinien poistamista seuraavissa vaiheissa, kun taas heterologiset proteiinit säilytetään liukenemattomana kompleksina solunpirstaleissa.

Sen jälkeen kun solut on rikottu, pirstomistuotteeseen lisätään ionitonta vettä ja siitä poistetaan enemmän kuin 99 paino-% sen sisältämistä suoloista. Näiden suolojen poistaminen pirsto-mistuotteen ionivahvuuden vähentämiseksi voidaan suorittaa dia-suodatuksen avulla, käyttämällä ionitonta vettä, joka huuhtoo ionit pois, tai solujen pirstaleiden ja valoa taittavien osasten sentrifugointia saostumaksi, joka lietetään uudelleen ionitto-maan veteen.

Sen jälkeen kun oleellisesti kaikki suolat on poistettu, voidaan pirstomistuotteeseen, josta suolat on poistettu, valinnaisesti lisätä jotain yhdistettä, kuten esimerkiksi 1-oktanolia, jos sitä ei ole lisätty aiemmin, sen seikan varmistamiseksi, että yhtään elävää organismia ei jää jäljelle. Pirstomistuote, josta suolat on poistettu, pirstotaan uudelleen, kuten yllä kuvataan aluksi suoritettavan solujen rikkomisen yhteydessä.

Uudelleen suoritetun pirstomisen jälkeen, pirstomistuotteen sisältämän nesteen tiheyttä tai viskositeettia lisätään ja/tai siinä muodostetaan gradientti sentrifugoinnin aikana lisäämällä pirstomistuotteeseen jotain ainetta.

Lyhennetyn "alkupään" menetelmän lopullisessa vaiheessa, valoa taittavien osasten talteen ottamiseksi, valoa taittavat osaset, 42 9 5 0 0 2 jotka sisältävät halutun proteiinin, erotetaan solunpirstaleis-ta suuren sentrifugointinopeuden avulla. "Suurella sentrifu-gointinopeudella" tarkoitetaan suspension sentrifugointia nopeudella, joka on noin 10 000 - 40 000 kertaa maan vetovoima, mieluummin noin 10 000 - 20 000 x g, sopivan ajan verran, joka riippuu tilavuudesta, yleensä se on noin 10 minuuttia - 22 tuntia. Saostumaa, joka saadaan sentrifugoinnin avulla, nimitetään "partikkelisaostumaksi" tai "partikkelitahnaksi". Lyhennettyä alkupään menetelmää käytetään mieluiten, kun natriumlauraatti on primaarinen liuottava aine.

Vaihtoehtoisessa, laajennetussa "alkupään menetelmässä" valoa taittavien osasten saamiseksi, lyhennetyn alkupään menetelmän viimeisestä sentrifugointivaiheesta saatu partikkelisaostuma liuotetaan, pelkistetään ja sitten se uutetaan vettä sisältävästä väliaineesta 2-butanolilla tai 2-metyyli-2-butanolilla. Sitten uutejae saostetaan hapolla ja sentrifugoidaan, jotta saadaan "lopullinen saostuma" tai "lopullinen tahna", joka sitten puhdistetaan edelleen esitetyllä tavalla.

Vaihtoehtoinen, laajennettu alkupään menetelmä eroaa lyhennetystä alkupään menetelmästä siinä, että se koostuu useista lisä-vaiheista seuraavalla tavalla: valoa taittavat osaset liuotetaan pelkistävissä olosuhteissa; liuotettu, valoa taittava materiaali uutetaan orgaanisella aineella; ja mainittu, valoa taittava aine eristetään uutteesta. Pohjimmiltaan, lopullisen saostuman lisääntynyt puhtaus vastakohtana partikkelisaostumalle vähentää jatkojalostusmenetelmän puhdistuksen määrää. Alkupään ja loppupään menetelmän puhdistusvaiheiden valinnan välillä ei vallitse riippuvuutta, kun halutaan saavuttaa lopullisen tuotteen tietty puhtaustaso. Kun valoa taittavien osasten talteen ottamiseksi tietty menetelmä on valittu alkupäässä alla esitetyistä, vaihtoehtoisista puhdistusmenetelmistä, voidaan suorittaa valinta lopullisen tuotteen halutun puhtaustason saavuttamiseksi.

Käytetään sitten lyhennettyä tai laajennettua alkupään menetelmää IFN-6:a sisältävien, valoa taittavien osasten talteenottamiseksi, puhdistuksen seuraava vaihe on partikkelisaostuman tai lopullisen 43 95002 saostuman, joka sisältää valoa taittavan materiaalin, liuottaminen. Voidaan käyttää seuraavia liuottavia aineita: natriumdode-kyylisulfaattia (SDS) , natriumlauraattia, ureaa, natriumdodekyy-lisulfonaattia, natriumdekyylisulfaattia, natriumtetradekyyli-sulfaattia, natriumtridekyylisulfonaattia, natriumdodekyyli-N-sarkosinaattia, natriumtetradekyyli-N-sarkosinaattia, natrium-dioktyylisulfosukkinaattia sekä guanidiinihydrokloridia. Edullisia liuottavia aineita ovat SDS, natriumlauraatti tai guanidii-nihydrokloridi. Edullisin on natriumlauraatti tai guanidiini-hydrokloridi, konsentraatioina tai alle konsentraatioiden, jotka yllä on esitetty, jotta poistetaan mahdollisuus, että SDS:a on lopullisessa valmisteessa.

Liuottava aine on puskurin vesiliuoksessa, mieluummin fosfaatilla puskuroidussa keittosuolaliuoksessa. Liuottavan aineen edullinen prosentuaalinen määrä on alueella 1-5 % (paino/tilavuus). (Prosentit tässä yhteydessä tarkoittavat paino/tilavuus-suhtei-ta). Edullisia liuottavia aineita ovat fosfaatilla puskuroitu keittosuolaliuos, jossa on 1-2 % natriumlauraattia (20 millimoo-lia NaPO^) pH 9-10:ssä, sekä 6-molaarinen guanidiinin hydroklo-ridi 50-millimolaarisessa g-merkaptoetanolissa. Äänikäsittelvä käytetään mieluummin, kun liuottavana aineena liuottamisen edistämiseksi käytetään joko natriumlauraattia tai guanidiinin hyd-rokloridia.

Pelkistäviin aineisiin, joita voidaan käyttää liuottamisvaiheen aikana, kuuluvat: g-merkaptoetanoli (g-mer), glutationi, kys-teiini ja ditiotreitoli (DTT). DTT ja g-mer ovat edullisimmat, pelkistävät aineet. On edullista käyttää pelkistäviä aineita, kun joko natriumlauraattia tai guanidiinin hydrokloridia käytetään primaarisena liuottavana aineena.

Liuottaminen suoritetaan normaalisti lämpötiloissa, jotka ovat alueella 20 - 25°C, samalla sekoittaen, jotta helpotetaan liuottavan aineen ja kiinteän jakeen välistä kosketusta. Valinnaisesti voidaan pelkistysvaihe suorittaa tässä kohdassa. pH, jos on tarpeen, voidaan säätää alueelle 8,5 - 10, mieluummin noin 9:ään. Suspensiota voidaan kuumentaa 50 + 5°C:een, 5-15 minuutin 44 9 5 0 0 2 ajan, typpikehän alla. Sen jälkeen reaktioseos tulisi jäähdyttää noin 25°C:een. Liuottamisen katsotaan olevan täydellisen, kun näyte on seisonut 15 minuutin ajan tai liuos on muuttunut läpikuultavaksi. Valinnaisesti, tässä vaiheessa voidaan liukenematon aine erottaa sentrifugoimalla tai suodattamalla sen jälkeen, kun liukeneminen on täydellistä.

Sen jälkeen kun proteiini on liuotettu, syntyvä suspensio voidaan valinnaisesti sentrifugoida 10 000 x 40 000 x g:llä, mieluummin 10 000 x 15 000 x g:llä, jotta saadaan saostuma, joka muun muassa sisältää muita isäntäorganismin (esim. E. colin) proteiineja, joihin huomattavasti sisältyy tiettyjä kontaminant-teja, joiden molekyylipainot ovat lähellä halutun proteiinin molekyylipainoa. Sentrifugoinnin tarkka nopeus ei ole kriittinen, koska suurin osa liukenemattomasta aineesta erottuu, vieläpä alhaisilla nopeuksilla. Saostuma heitetään pois, ja superna-tantti, joka sisältää proteiinin, säilytetään, ja sitä käsitellään edelleen halutun proteiinin saamiseksi.

Jos pelkistysvaihetta ei suoriteta liuottamisen aikana, seuraa-van vaiheen tulisi menetelmässä olla liuotetun, valoa tavattavista osasista saadun proteiinin pelkistämisen. Edullinen, pelkistävä aine on ditiotreitoli (DTT). Pelkistysolosuhteisiin voi myös sisältyä kelatoivan aineen, kuten esimerkiksi etyleenidi-amiinitetraetikkahapon (EDTA) lisäys.

Menetelmän seuraavana vaiheena on supernatanttiin sisältyvän proteiinin erottaminen kaikista isäntäorganismeista peräisin olevista epäpuhtauksista, jotka jäävät jäljelle sentrifugoinnin tai suodatuksen jälkeen, ja valinnaisesti liuottavasta aineesta. Voidaan käyttää geelisuodatuskromatografiaa, käänteisjae, suuren erotuskyvyn nestekromatografiaa (RP-HPLC) tai geelisuodatuskromatograf iän ja RP-HPLC:n yhdistelmää. Geelisuodatuskromatograf ia suoritetaan mieluummin kahdessa vaiheessa, jotta poistetaan pyrogeenikomponentit ja proteiinikomponentit, joiden molekyylipaino on suurempi tai alhaisempi kuin halutun proteii-. nin molekyylipaino. Geelejä, jotka voivat fraktioida liuoksen ja sallivat proteiinin erottamisen näistä epäpuhtauksista, on 45 95C02 kaupallisesti saatavilla. Sephacryl® S-200 on edullinen geeli suurempimolekyylipainoisten komponenttien poistamiseksi, ja Sephadex G-75- tai G-100-geelit ovat edullisia pienimolekyyli-painoisten epäpuhtauksien poistamiseen. Geelisuodatukset suoritetaan normaalisti puskuroiduissa liuoksissa (pH 5,5 - 7,0), jotka sisältävät noin 0,1 - 1,5 % liuottavaa ainetta ja noin 0,5 - 10 millimoolia pelkistävää ainetta. Pylvään koon tulee olla sellaisen, että se tekee mahdolliseksi haluttujen komponenttien sopivan resoluution.

RP-HPLC on geelisuodatukselle vaihtoehtoinen menetelmä. Samaten, RP-HPLC pystyy erottamaan liuoksesta molekyylejä, joiden mole-kyylipainot ovat lähellä kyseessä olevan proteiinin molekyyli-painoja ja joita sen tähden ei voida täydellisesti poistaa gee-lisuodatuksen avulla. Lisäksi, epäpuhtaudet, kuten esimerkiksi bakteereiden endotoksiinit, voidaan myös tehokkaasti poistaa RP-HPLC:n avulla. Sen tähden RP-HPLC:a voidaan käyttää myös lopullisena puhdistusvaiheena geelisuodatuksen jälkeen.

Vaihtoehtoinen ja edullinen menetelmä on IFN-g-proteiinin hapettaminen selektiivisesti, kontrolloiduissa olosuhteissa sen jälkeen, kun se on erotettu geelisuodatuksen avulla, kuten US-pa- tentissa n:o 4 572 798 (jossa käytetään hapettumisen edistäjää, + 2 joka sisältää Cu -kationeja) ja US-patentissa n:o 4 530 787 (jossa käytetään o-jodibentsoehappoa), kuvataan. Hapetettu tuote puhdistetaan RP-HPLC:n avulla tai geelisuodatuksella, jota RP-HPLC seuraa.

On edullista, kyseessä olevan keksinnön mukaista menetelmää suoritettaessa, että viimeinen puhdistusvaihe ennen formulaation stabilointia on suolojen poistamisvaihe, jossa käytetään siirto-komponenttia, kuten esimerkiksi natriumlauraattia pH-alueella noin 8,5 - 10. Proteiinin puhdistus kromatografiavaiheen (vaiheiden) jälkeen on vähintään noin 95 % tai korkeampi, ja tavallisesti se on ainakin noin 98 %. Tämä erittäin puhdas aine sisältää vähemmän kuin noin 2 ng endotoksiina, tavallisesti vähemmän kuin noin 0,01 ng endotoksiinia 100 000 yksikköä kohti proteiinin biologista aktiivisuutta.

46 9 5 0 0 2

Esillä olevan keksinnön mukaisen proteiinin formulointi suoritetaan sitten kuten yllä on kuvattu. Se voidaan suorittaa erillisenä toimenpiteenä käyttämällä puhdistettua, selektiivisesti hapetettua proteiinia yhden toimenpiteen yhteydessä, johon on yhdistetty selektiivisesti hapetetun proteiinin puhdistus. Viimeksi mainitussa tapauksessa formulaation lähtömateriaalina on proteiinia sisältävä tuote, joka on saatu selektiivisesti hapetetun tuotteen RP-HPLC-käsittelystä. Tuote, joka on selektiivisesti hapetettu RP-HPLC-tuotteen (poolin) avulla, käsittää proteiinin liuoksen veden ja orgaanisen liuottimen seoksessa. Orgaanisen liuottimen luonne riippuu RP-HPLC:ssä käytetystä liuotinjärjestelmästä. Esimerkkejä järjestelmistä, joita voidaan käyttää, ovat orgaanisen hapon, kuten esimerkiksi etikkahapon, trifluori-etikkahapon tai heptafluorivoihapon ja orgaanisen liuottimen, kuten esimerkiksi propanolin tai asetonitriilin yhdistelmät.

Edelleen muita tavanomaisia, kiinteitä, ei proteiinityyppisiä, massaa antavia aineita/stabiloivia aineita, joita käytetään farmaseuttisissa tablettiformulaatioissa, voidaan käyttää kantaja-aineena. Nämä materiaalit ovat vesiliukoisia aineita, jotka eivät reagoi IFN-g-proteiinin kanssa ja jotka itse ovat stabiileja. Ne eivät mieluummin myöskään ole herkkiä vedelle, se merkitsee, että ne eivät ole hygroskooppisia. Sellaisten muiden kantaja-aineiden ehdokkaiden spesifisiin esimerkkehin sisältyy tärkkelyksiä ja tärkkelyksen hydrolysaatteja, jotka ovat peräisin vehnästä, maissista ja perunoista, sekä mikrokiteisiä selluloosia .

Yksikköannosmäärät, se on, noin 0,125 - 2 mg, mieluummin 0,25 - 1 mg, yhdistelmä-beta-interferonia liuoksessa jaetaan säiliöihin, säiliöt peitetään uritetuilla korkeilla, ja sisällöt lyofili-soidaan tavanomaisia jäähdytyskuivausolosuhteita ja -laitteita käyttäen.

Lyofilisoidut formulaatiot voidaan muodostaa uudelleen ruiskuttamalla pulloon tavanomaista, parenteraalista vesiruiskeliuos-. ta, kuten esimerkiksi tislattua vettä ruisketta varten, Ringle- *· rin ruiskeliuosta, D5W-glukoosiliuosta, Hankin ruiskeliuosta, 47 95002 dekstroosiruiskeliuosta, dekstroosi- ja suolaruiskeliuosta, fysiologista keittosuolaliuosta tai ynnä muuta sellaista, mieluummin laimenninta, vielä mieluummin NaCl-liuosta, joka tuottaa isotonisen liuoksen liuosta uudelleen muodostettaessa. Nesteen ruiskuttaminen pulloon tulisi tapahtua pullon kylkeä myöten, ylimääräisen vaahtoamisen välttämiseksi. Pulloon lisätyn ruiskeen määrä on normaalisti noin 1 - 5 ml, mieluummin l - 2 ml.

Uudelleen muodostettu formulaatio, joka valmistetaan edellä kuvatulla tavalla, soveltuu parenteraaliseen antamiseen ihmisille ja muille nisäkkäille terapeuttisesti tehokkaina määrinä (esimerkiksi määrinä, jotka poistavat potilaan patologisen tilan tai vähentävät sitä), hoidoksi kyseessä olevalle kohteelle. IFN-p-hoito soveltuu syövänvastäiseen, viruksenvastaiseen ja psoriasiksen vastaiseen hoitoon.

Esillä olevan keksinnön mukaiset formulaatiot ovat käyttökelpoisia parenteraaliseen annosteluun, esimerkiksi laskimonsisäi-seen, henkitorvensisäiseen, ihonalaiseen, vatsaontelonsisäi-seen, lihaksensisäiseen, silmäkuopansisäiseen, silmiin tapahtuvaan, kapselin sisällä tapahtuvaan, selkäytimensisäiseen ja paikalliseen antamiseen, nenän sisään annettavaan aerosoliin, naarmuttamiseen sekä myös suun kautta suoritettavaan antamiseen. Annostelun edullisia teitä ovat lihaksensisäinen, ihonalainen sekä laskimonsisäinen ruiske ja paikallinen antaminen. Ionittomien detergenttien käyttö on erityisen edullista paikallisesti annettavia formulaatioita varten, niiden kyvyn vuoksi tunkeutua ihon pinnan lävitse.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. Seuraavat esimerkit valaisevat edelleen esillä olevan keksinnön mukaisia formulaatioita sekä niiden valmistusta. Näiden esimerkkien tarkoituksena ei ole rajoittaa keksintöä millään tavoin. Näissä esimerkeissä kaikki lämpötilat ovat Celsius-asteina, ellei muuten ole mainittu.

Esimerkki 1 .. IFN-βιη analogi, jota merkitään IFN-Pserl7:ksi, otettiin tal teen E. colista. Tämän yhdistelmä-IFN-βιη aminohapposekvenssi 48 9 5 0 0 2 eroaa luonnonmukaisesta humaani IFN-8:sta siinä, että asemassa 17 sijaitseva kysteiini on vaihdettu seriiniin. E. colin kanta (K12/MM294-1), joka valmistaa IFN-β :a, ja jossa on plasmi- di pSY2501 ja jota käytettiin tässä esimerkissä, tallennettiin Type Culture Collectioniin marraskuun 18. päivänä 1983 tulonu-merolla 39,517. Mainittua analogia kuvataan US-patenteissa n: ot 4 518 584 sekä 5 588 585.

Täten transformoitua E. colia kasvatettiin 1000 litran vetoisessa fermenttorissa 37°C:ssa. Liuenneen hapen konsentraatio pidettiin noin 40 %:ssa, sikäli kuin oli tarpeellista; (1) lisäämällä ravistelua; (2) lisäämällä ilmaa; ja (3) lisäämällä happea.

Kun fermentteri oli täytetty vedellä toimintatilavuuteen saakka, lisättiin seuraavia hivenaineita:

ZnS04 · 7H20 72 mM

MnS04 · 4H20 30 ^um

CuS04 · 5H20 3 yUm

Na^-sitraatti · 2H20 1,5 mM

KH2P04 21 mM

(NH4)2S04 72 mM

Fermentterin syöttö- ja lisäysastiat steriloitiin sitten normaalien toimintamenetelmien mukaisesti. Suoritettiin seuraavat steriilit lisäykset:

MgS04 * 7H20 20 mM

FeS04 · 7H20 100 ^urn L-tryptofaania 70 mg/1 tiamiinia · HCl 20 mg/1 glukoosia 5 g/1

Fermentteri jäähdytettiin ja ympättiin jäädytetyllä tai E. colin ymppiviljelmällä, konsentraationa 2 mg/1. Käytettiin glukoosin syöttöä hyväksi pitämään glukoosin konsentraatio arvossa 5-10 g/1. Noin 15 tunnin kuluttua käymisen alkamisesta, säädettiin .. pH KOH:lla 6,8:ksi. Näytteiden optisen tiheyden ja jäännösglu- koosin mittaukset suoritettiin 14-16 tunnin kuluttua ja tämän jälkeen noin tunnin välein.

49 9 5 0 0 2 IFN-gser27:n valmistuksen induktio suoritettiin viljelmän ela-tusaineen optisen tiheyden ollessa noin OD6g0=10, siten että L-tryptofaani poistettiin elatusaineesta, ja tämän jälkeen lisättiin kasaminohappoja siten, että lopulliseksi konsentraa-tioksi tuli 2 %, ODggQ=15:ssä. Viljelmät koottiin, kun glukoosin kulutus saavutti arvon 40+6 g/1.

Sitten eristettiin valoa taittavat osaset, jotka sisälsivät IFN-j3ser-j^-proteiinin. Koottu materiaali väkevöitiin noin 5-10 kertaa kierrättämällä koottua materiaalia paineen alla, UF-poi-kittaisvirtauspatruunoiden läpi, katkaisurajän ollessa 100 K:n molekyylipaino. Solut pirstottiin antamalla niiden läpäistä kolme kertaa Manton-Gaulin suurpainehomogenisaattori, jossa paine oli 41340 - 55120 kPa.

Pirstottuun massaan lisättiin EDTA:a siten, että lopulliseksi konsenteaatioksi tuli 5 millimoolia. Sitten suspensio diasuoda-tettiin 5 tilavuutta vastaan ionitonta vettä.

EDTAra lisättiin sitten 2 millimoolin lopulliseen konsentraa-tioon saakka. Oktanolia lisättiin 1 %:iin (tilavuus/tilavuus) saakka jäljelle jääneiden elävien bakteereiden tappamiseksi dia-suodatetussa tuotteessa. Suspensio pirstottiin uudelleen antamalla sen kaksi kertaa läpäistä Manton-Gaulin suurpainehomogenisaattori paineessa 41340 - 55120 kPa.

Uudelleen pirstottuun tuotteeseen lisättiin sakkaroosia siten, että lopulliseksi konsentraatioksi tuli 23 % (paino/paino) ja että muodostui lopullinen tiheysgradientti, joka oli välillä 1,1 - 1,25 g/ml. Seosta sentrifugoitiin nopeudella 10 000 -15 000 x g, ja partikkelisaostuma tai -tahna koottiin. Pidettiin yllä ainakin 20°C:n lämpötilaa ennen sentrifugointia ja sen aikana.

Partikkelisaostuma liuotettiin sitten fosfaatilla puskuroituun keittosuolaliuokseen, jossa oli 2 % SDS:a. Kiinteää DTT:a ja EDTA:a lisättiin niin, että lopulliseksi konsentraatioksi vastaavasti tuli 10 millimoolia ja 2 millimoolia. Suspensiota so 95002 kuumennettiin 50 + 5°C:een 10 minuutin ajan typen alla. Sitten reaktioseos jäähdytettiin noin 25°C:een ja seoksen pH säädettiin arvoon 7,4.

Mitattiin 2-butanolia tilavuus, joka oli yhtä suuri kuin suspension kokonaistilavuus. Suspensio ja orgaaninen liuos pumpattiin erikseen, mutta samanaikaisesti, virtausnopeuksilla 1,1 - 1,3 litraa minuutissa, staattisen sekoittajan läpi ja sitten jatkuvaan sentrifugiin (Westfalia, nopeudella noin 11 770 x g) faasien erottamiseksi. Koottiin 2-butanolia runsaasti sisältävä jae, jossa IFN“Bseri7 °li (orgaaninen jae).

2-butanoliuute sekoitettiin 2,5 tilavuuden kanssa 0,1-prosent-tista SDS:a, joka oli fosfaatilla puskuroidussa keittosuolaliuoksessa. Kiinteätä DDT:a lisättiin siten, että lopulliseksi kon-sentraatioksi tuli 2 millimoolia. Orgaanisen uutteen ja puskurin muodostavien liuosten pH säädettiin 6,2 + 0,l:ksi jääetik-kalla (hapan saostuma).

Sitten seosta sentrifugoitiin (Sharples-sentrifugi, nopeudella 13 200 x g) noin 2-6 tunnin ajan, supernatantti dekantoitiin ja sitten koottiin lopullinen saostuma (Final Pellet), joka sisälsi noin 81 % IFN~8:a. Lopullinen saostuma, joka sisälsi valoa taittavaa materiaalia, puhdistettiin sitten edelleen jatkojalostusmenetelmän avulla.

Lopullinen saostuma lietettiin uudelleen 2 %:sen SDS:n avulla, joka oli 50-millimolaarisessa fosfaattipuskurissa ja 5-millimo-laarisessa EDTArssa. Kiinteätä DTT:a lisättiin 20 millimoolin lopulliseen konsentraatioon saakka, ja pH säädettiin 8,5:ksi NaOHrlla. Suspensiota kuumennettiin 50 + 5°C:een, 10 minuutin ajan, typpikehän alla, ja sitten se jäähdytettiin noin 25°C:een. Sitten pH säädettiin 5,5:een jääetikalla ja liuos suodatettiin 0,65 ^,um:n suodattimen läpi.

Suodosta käsiteltiin sitten esipylväskromatografiän avulla käyt-täen Sephacryl S200-pylvästä ja kokoamalla jakeet puhtaisiin astioihin, joista pyrogeenit oli poistettu, käyttäen eluointi- si 95002 puskuria, joka sisälsi 50 millimoolia asetaattia, pH 5,5, 1 millimoolin EDTA:a sekä 1 %:n SDS:a. Jakeet, jotka sisälsivät IFN-g-monomeerin, koottiin.

Esipylväästä saatu pooli väkevöitiin sitten ontelokuitu-ultra-suodatusyksikköä käyttäen, jossa oli 10K:n molekyylipainon kat-kaisuraja.

Väkevöity, esipylväästä saatu pooli hapetettiin sitten käyttämällä o-jodibentsoehappoa (IBA). Hapettaminen suoritettiin lisäämällä yhtä suuret moolimäärät proteiinia ja IBA:a reaktio-astiaan, joka sisälsi 2 millimoolia natriumpyrofosfaattia, 0,1 % SDS:a sekä 1 millimoolin EDTA:a. Hapetuksen lopussa oli läsnä 20 ^um:n ylimäärä IBA:a. Hapetuksen aikana pH säädettiin 9,0 + 0,l:ksi NaOH:n avulla, ja hapetuksen päätyttyä pH säädettiin 5,5 + 0,2:ksi jääetikan avulla.

IFN-g-proteiini väkevöitiin käyttäen ontelokuitu-ultrasuodatus-yksikköä, jonka katkaisuraja oli 10K:n molekyylipaino.

Sitten proteiini sijoitettiin pääpylvääseen (Sephacryl® S200-A), ja jakeet koottiin puhtaisiin astioihin, joista pyrogeenit oli poistettu, käyttäen eluointipuskuria, jossa oli 50 millimoolia asetaattia, pH 5,5, 1 millimoolia EDTA:a sekä 0,1 % SDS:a.

SDS-PAGE suoritettiin näytteille, jotka oli saatu kustakin ja-keesta, aloittaen poolattavan huipun alusta huipun loppuun saakka. SDS-PAGE:a käyttäen määritettiin jakeet, joissa ei ollut yhtään suurimolekyylipainoisia epäpuhtauksia. Sitten nämä jakeet yhdistettiin.

Pääpylväästä saatu pooli väkevöitiin sitten käyttäen ontelokui-tu-ultrasuodatusyksikköä, jonka katkaisuraja oli molekyylipaino 10K.

Yllä esitetty pääpylväässä suoritettu menettely toistettiin Sephadex G-75-pylväässä. SDS-PAGE-tuloksia hyväksi käyttäen, jakeet, joissa ei ollut pieni- eikä suurimolekyylipainoisia epäpuhtauksia, yhdistettiin.

52 9 5 0 0 2

Suolojen poistovaihe suoritettiin pH 9,2:ssa, ja 0,1-prosenttis-ta natriumlauraattia käytettiin siirtokomponenttina seuraavalla tavalla. pH säädettiin sopivan emäksisen aineen, kuten esimerkiksi 1-millimolaarisen NaOH:n avulla.

Sephadex® G-25-pylväs tasapainoitettiin 0,1-prosenttisella nat-riumlauraatilla, joka oli 10-millimolaarisessa Tris-HCl:ssä, pH 9,2, ja siihen pantiin Sephadex G-75:stä saatu pooli, joka sisälsi 0,1 % SDS:a. Prosessin kromatogrammia hyväksi käyttäen koottiin IFN~3ser^-piikki. Eluaatin pH alennettiin sitten nopeasti 1,O-normaalisella HCl:lla pH 3,0:ksi, mikä saosti nat-riumlauraatin, mutta jätti lFN-β r^;n liuokseen.

Seosta sentrifugoitiin nopeudella 35 000 x g 30 minuutin ajan, ja supernatantti suodatettiin 0,22 mikronin nitroselluloosasuo-dattimen läpi. SDS:n konsentraatio määritettiin akridiiniorans-sin avulla. /^Sokoloff et ai., "Rapid Spectrophotometric Assay of Dodecyl Sulfate Using Acridine Orange", Anal. Biochem., 118: 138-141 (1981]_7· Saanto G-25-poolista oli yli 85 %, ja SDS:n konsentraatio oli vähentynyt 10 ^ug/mg:n alapuolelle.

Sitten suodatettu supernatantti stabiloitiin lisäämällä 0,15 % 0

Trycol LAL-12:a. Formuloidun valmisteen pH nostettiin noin 7,0 + 0,3:een NaOH:n avulla. Massaa lisäävää/stabiloivaa ainetta, 5-prosenttista dekstroosia lisättiin. Liuos esisuodatettiin ja suodatettiin steriiliksi vastaavasti 0,45:n ja 0,22 mikronin nitroselluloosasuodattimen avulla. Välittömästi sen jälkeen oi-

O

keat annosmäärät IFN-(3serl7 :a, 0,25 mg, joka sisälsi 0,5 x 10 yksikköä, täytettiin aseptisesti steriileihin pulloihin, jotka oli varustettu steriilein korkein, hygieenisissä ja steriileissä olosuhteissa, joita tarkkailtiin huolellisesti. Pullot asetettiin sitten nopeasti lyofilisointilaitteeseen, johon oli kiinnitetty sopivat lämpökytkimet. Pullot jäähdytettiin -35 - -45° C:een. Lyofilisoinnin ollessa täydellisen pullot suljettiin tyhjössä.

Esimerkki 2

Kyseessä olevassa esimerkissä noudatetaan menetelmiä, jotka 53 9 5 0 0 2 ovat samankaltaisia kuin esimerkissä 1 esitetyt menetelmät, pääasiallisen eron ollessa sen, että primaarisena liuottavana aineena käytetään natriumlauraattia pikemminkin kuin SDS:a.

Muut erot esitetään alla.

Kyseessä olevassa esimerkissä esitetyt menetelmät vastaavat pääasiallisesti kuvioissa IA ja IB esitettyjä menetelmiä. Sitä ennen, tahnan liuottamisen kohdassa, 2-prosenttisen SDS:n asemesta käytetään 1-2-prosenttista natriumlauraattia 20-millimo-laarisessa dinatriumfosfaatissa, joka sisältää myös pelkistävän aineen (50 millimoolia DTT:a), partikkelisaostuman liuottamiseen. pH säädettiin noin 9:ään NaOH:n avulla. Liuottamisen edistämiseksi käytetään mielellään äänikäsittelyä.

Esimerkistä 1 eroten on myös poistettu laajennetun etupäämene-telmän vaiheiden ensimmäinen pelkistys, mukaan luettuina orgaaninen uutto, hapolla suoritettu saostaminen, sentrifugointi, happosaostuman liuottaminen sekä toinen pelkistys. Puskuri on 10-millimolaarinen Tris*HCL oikemminkin kuin 50-millimolaarinen asetaatti Sephacryl® S200- ja Sephadex® G-75-pylväillä suoritettavia geelikromatografiavaiheita varten. Edelleen, sellainen geelikromatografia suoritetaan pH 9,2:ssa mieluummin kuin pH 5,5:ssä, kuten konsentrointivaiheet.

Ensimmäinen S200-pylvään eluointipuskuri sisältää 1-2 % natriumlauraattia mieluummin kuin 1-prosenttista SDS:a, kuten esimerkissä 1. Toisen S200-pylvään eluonintipuskuri sisältää 0,1-0,5 % natriumlauraattia mieluummin kuin 0,1-prosenttista SDS:a, ja puskuri G-75-pylvästä varten sisältää 0,1 - 0,5-prosenttista natriumlauraattia mieluummin kuin 0,1-prosenttista SDS:a.

Hapetusvaiheen aikana käytetään 1-2-prosenttista natriumlauraattia mieluummin kuin 0,1-prosenttista SDS:a.

Kuten esimerkissä 1, IFN-$ser·^ formuloidaan alentamalla eluaa-tin pH noin 3:een, sentrifugoiden tai suodattaen saostuneen natriumlauraatin poistamiseksi lisäämällä tehokas määrä yhtä tai • « useampaa, biologisesti yhteen sopivaa, ionitonta polymeeri- 54 95002 detergenttiä tai sellaisten ionittomien detergenttien ja muun liuottavan aineen yhdistelmää, säätämällä pH noin fysiologiseen pH-arvoon, lisäämällä sopivaa massaa lisäävää/liuottavaa ainetta, mieluummin dekstroosia tai mannitolia, esisuodattamalla ja suodattamalla pooli steriiliksi sekä välittömästi lyofilisoiden formuloitu, neutraloitu pooli.

Tämän esimerkin mukaisten menetelmien ensisijaisena etuna on saada formulaatio, josta SDS puuttuu täydellisesti tai suurimmaksi osaksi.

Esimerkki 3

Yllä esimerkissä 1 esitetty menettely, jossa natriumlauraattia käytettiin siirtokomponenttina G-25-pylväässä, jota käytettiin suolojen poistamiseen, toistettiin käyttämällä Pharmacia K50-pylvästä (1700 ml, pakatun kolonnin tilavuus). Viisikymmentä ml G-75:stä saatua eluaattia (noin 3,64 mg/ml IFN-£:a) pantiin K50-pylvääseen, joka oli tasapainoitettu 0,1 %:sella lauraa-tilla, joka oli 20-millimolaarisessa natriumfosfaatissa, ja joka ajettiin pH 9,2:ssa. IFN-βίη saanto oli 68 %, ja SDS:n taso oli alle 10 ^ug/mg proteiinia tai vähemmän kuin 1 miljoonasosa. pH 3:ssa IFN-β oli liukoinen ilman detergenttiä, kuten UV-spektrin avulla todettiin.

Esimerkki 4

Valmistettiin seuraavat IFN-6:n formulaatiot suurin piirtein esimerkissä 1 esitetyn menetelmän mukaisesti, jossa menetelmässä käytettiin 0,1-prosenttista natriumlauraattia siirtokomponenttina. Formulaatioihin ei kuitenkaan lisätty mitään massaa lisää-viä/stabiloivia aineita, eikä niitä lyofilisoitu. Saostumista tarkasteltiin visuaalisesti ja UV-spektrin avulla. Taulukko I esittää tulokset.

55 9 5 0 0 2

Taulukko I

Durfax® 80/SDS 0,1 %/200 /Ug/mg l

Polysorbaatti UV-spektrin perusteella jää liukoiseksi useiksi päiviksi neutraalissa pH-arvossa.

Trycol® LAL(12)/Nopalcol 0,1 %/0,05 % POE(12)-lauryylieetteri/PEG(400)-mono-oleaatti UV-spektrin perusteella jää liukoiseksi useiden päivien ajaksi pH:ssa 7,0 (20 ^ug/mg SDS).

Triton® X305/Nopalcol 0,1 %/0,05 %

CgHi7-f enyyli- (OCI^CI^) 3QOH/PEG(400) -mono-oleaatti UV-spektrin perusteella säilyy liukoisena yön yli pH 7,0:ssa, useita päiviä pH 5,0:ssa. Detergentti-liuos ilman IFN-gra on vähän samea (45 ^,ug/mg SDS) .

Trycol LAL(12) 0,1-prosenttinen POE(12)-lauryylieetteri liukoinen pH 6,5:ssä ja 6,0:ssa. Parempi UV-spektri pH 6,0:ssa (10 ^ug/mg SDS).

Plurafac® C-17 0,1-prosenttinen, oksietyloitu, suoraketjui- nen rasva-alkoholi.

Liukoinen pH 6,0:ssa useita päiviä (10 ^,ug/mg SDS). Esimerkki 5

Ultrasentrifugoinnin tulokset

Ultrasentrifugointi on yksinkertainen menetelmä suurimolekyyli-painoisten aggregaattien ja oligomeerien havaitsemiseksi kyseessä olevan keksinnön mukaisissa formulaatioissa. Ultrasentrifugointi suoritettiin Beckman L8-70:llä, jossa roottorina oli 70.1 Ti-tyyppinen roottori. Viisi millilitraa formuloitua valmistetta, joka oli lyofilisoitu ja muodostettu uudelleen, sent-rifugoitiin nopeudella 55 000 kierrosta minuutissa yhden tunnin ajan. Supernatantista mitattiin absorbanssi 280 nmrssä. Mainittua absorbanssia verrattiin sitten aiempaan sentrifugoitniin. Taulukko II alla esittää vertailevia tuloksia joukosta formu-laatioita, joista muutamat eivät sisällä biologisesti yhteen 56 95002 sopivia, ionittomia polymeeridetergenttejä ja on sijoitettu tutkittaviksi vertailun vuoksi.

Taulukko II Ultrasentrifugointi 500 kierr/min - 60 minuutin ajan A280 A280 Saanto _Näytteet_ ennen jälkeen prosenttia 1,25 %:nen (humaaniseerumin 1,696 0,543 32 % albumiini) 0,1 %:nen SDS pH 7,5 0,257 0,238 93 % 0,1 %:nen lauraatti pH 7,5 0,408 0,392 96 % 0,1 %:nen Durfax® 80/150 ,ug/ml 0,306 0,116 39 % SDS pH 7,0 ' 0,1 %:nen Durfax® 80/200 »ug/mg 0,419 0,442 105 % SDS pH 7,0 ' 0,1 %:nen Triton® X305/0,05 %:nen 0,140 0,061 46 %

Nopalcol® pH 7,0 0,1 %:nen Trycol®/0,05 %:nen 0,357 0,387 108 %

Nopalcol pH 7,0 0,1 %:nen Plurafac® C-17 pH 6,0 0,530 0,456 86 % 0,1 %:nen Trycol® pH 6,5 0,475 0,415 87 %

Taulukon I lukuarvot ilmaisevat, että IFN-g:n formulaatioilla, jotka on muodostettu 0,1 %:sen Trycol :n kanssa pH 6,5:ssä, 0,1 %:sen Plurafac C-17:n kanssa pH 6,0:ssa, 0,1 %:sen Trycolin®/ 0,05 %:sen Nopalcol :n kanssa pH 7,0:ssa sekä 0,1 %:sen Dur-fax 80/200 yug/mg SDS:n kanssa pH 7,0:ssa, on kaikilla merkittävästi alhaisemmat molekyylipainotyypit kuin HSA-formulaatiolla.

Esimerkki 6 IFN-(3:n formulaatiot, jotka on lueteltu taulukossa I, sekä IFN-g:n formulaatiot, jotka on valmistettu 0,1 %:sen natriumlauraatin kanssa pH 7,5:ssä sekä 1,25 %:sen normaaliseerumin kanssa, analysoitiin SDS-page-elektroforeesin avulla, olosuhteissa, joissa pelkistymistä ei tapahtunut. Edelleen, kontrollina tutkittiin puhdistetun IFN-g-eluaatin nävte, joka oli saatu G-25-poolista ja joka oli formuloimaton. Natriumlauraatti, Trycol® LAL(12)-Nopalcol®; Plurafac® C-17 ja Trvcol® LAL(12) eivät eronneet 57 95002 merkittävästi G-25-poolista SDS-page-analyysissä. Triton X30 5- ® ®

Nopalcol :n ja Durfax 80/SDS-page-tuloksissa oli yksi ylimääräinen vyöhyke. Kuitenkin suoritettiin Western blot-analyysi, joka ilmaisi, että mainittu vyöhyke ei värjäytynyt kuten IFN-β.

Esimerkki 7

Dekstroosissa lyofilisoidut formulaatiot

Ionittoman detergentin kanssa muodostetut formulaatiot, jotka on lueteltu taulukossa I, samoin kuin formulaatiot, joissa on 0,1 %:nen lauraatti, sekä formulaatio, jossa on 1,25 %:nen humaani seerumialbumiini, tutkittiin ultrasentrifugoinnin avulla, sen jälkeen kun ne oli kuivattu jäädyttämällä 1,25 %:sessa dektroosissa. Taulukko III on yhteenveto ultrasentrifugointitu-loksista, jotka koskevat dekstroosin avulla formuloituja, lyo-filisoituja näytteitä. Ultrasentrifugointimenettely oli sama kuin esimerkissä 5 kuvattu menettely. Trycol LAL(12) 0,1 %:sena konsentraationa sekä pH 6,5:ssä ei näyttänyt liuottavan ® IFN-β:aa uudelleen lyofilisoinnin jälkeen. Tutkittiin Trycol LAL(12):n suurempia konsentraatioita, ja havaittiin, että 0,15 ® %:n konsentraationa Trvcol ovstvi liuottamaan IFN-β:n pH 7,0:ssa, aqqreqaation ollessa tällöin vähäistä.

Koska kliinisesti voidaan sietää hiukan alhaisempia pH-arvoja, Trvcol® LAL(12) ia Plurafac® C-17 tutkittiin pH 5,0:ssa, sen seikan havaitsemiseksi, liuottaisivatko pinta-aktiivisten ainei-• den alemmat konsentraatiot IFN-β:a tässä pH-arvossa. UV-spektrit osoittavat, että molemmat detergentit pystyivät liuottamaan IFN-β:a pH 5,0:ssa, konsentraatioina, jotka olivat alhaisempia kuin 0,01 %.

« 53 95002

Taulukko III

Dekstroosin kanssa lyofilisoidut formulaatiot _Näyte_ A280 ennen A280 0alkeen Saanto-%

Lauraatti 1,023 0,485 47

Triton® X305/Nopalcol 1,325 0,960 72

Trycol® LAL(12)/Nopalcol 0,628 0,463 74

Durfax® 80/SDS 0,688 0,289 42

Trycol® LAL(12) (0,1 % pH 6,5) 1,210 0,245 20

Plurafac® C-17 (pH 6,0) 0,561 0,394 70 HSA-formulaatio 1,469 0,814 55 Lähtö-pH 3,0 0,329 0,244 75

Esimerkki 8 ®

Yhdistelmä-IFN-6:a, joka oli formulaatioissa 0,15 %:sen Trycol :n kanssa pH 7,0:ssa, kokeiltiin muiden massaa lisäävien aineiden/ stabiloivien aineiden (ei-pelkistävien sokereiden kanssa) esimerkin 1 formulointimenetelmän mukaisesti. Kuitenkin, joissakin tapauksissa formulaatioita ei jäädytetty, jotkut niistä jäädytettiin, ja jotkut niistä jäädytettiin hitaasti. Sellaisille näytteille ultrasentrifugointi suoritettiin esimerkin 5 menetelmän mukaisesti. Koetulokset on sisällytetty taulukkoon IV alla. Tulokset ilmaisevat, että erilaisilla sokereilla ei ole mitään vaikutusta IFN-6:n liukoisuuteen. Kuitenkin näytteiden jäädyttäminen vaikutti siihen, muodostuiko aggreoaatteja. Nävtteiden jäädyttäminen nopeasti kuivajäässä ja etanolissa ei tuottanut aggregaatteja, kun taas hidastettu jäädyttäminen asettamalla huoneenlämpöiset näytteet -20°C:een aiheutti jossain määrin aggregaattien muodostumista.

59 95002

Taulukko IV Ultrasentrifugointl IFN-β 0,15-prosenttisessa Trycol :ssä, pH 7,0 5 %:n kanssa erilaisia sokereita . . . ... , , A„Qn ennen A_Qn jälkeen Saanto-% Näytteet Käsittely 280_ 280 J_ _ 1. I^O (ei mas- Ei mitään 0,400 0,367 91,8 saa lisäävää ainetta) 2. Mannitoli Ei mitään 0,400 0,370 92,5 3. Sorbitoli Ei mitään 0,409 0,378 92,4 4. Dekstroosi Ei mitään 0,496 0,484 97,6 5. Inositoli Ei mitään 0,403 0,351 87,1 6. H20 Jäädytetty 0,388 0,384 99,0 7. Mannitoli Jäädytetty 0,412 0,379 92,0 8. Sorbitoli Jäädytetty 0,404 0,384 95,1 9. Dekstroosi Jäädytetty 0,601 0,579 96,3 10.Inositoli Jäädytetty 0,397 0,375 94,5 11. Dekstroosi Jäädytetty 0,656 0,584 89,0 hitaasti 12. Mannitoli Jäädytetty 0,296 0,249 84,1 hitaasti

Esimerkki 9

Lineaarista, ei-isotermistä säilyvyyttä koskevat tutkimukset Vaikka lineaaristen, ei-isotermisten säilyvyyskokeiden (LNS) perusteella ei voida ennustaa annetun formulaation ehdotonta, pitkäaikaista säilyvyyttä, ne ovat käyttökelpoinen keino verrattaessa erilaisten formulaatioiden suhteellista pysyvyyttä, kun on kysymys päivistä. Näytteet valmistettiin säilyvyystutkimuksia varten kromatografiän avulla käyttäen suoloja poistavaa G-25-pylvästä ja 0,1-prosenttista natriumlauraattia siirtokomponent-tina, kuten kuvataan esimerkissä 1. Kaikkiin formulaatioihin, jotka tutkittiin LNS-tutkimusten avulla, sisältyi 5 % mannito-lia, ja niitä säilytettiin 4°C:ssa, kunnes ne käytettiin tutkimukseen. Lineaariset ei-isotermiset säilyvyys-(LNS)-kokeet suoritettiin ajamalla lineaarinen lämpötilagradientti 50°C:sta 90°C:een, käyttäen lämpötilan nousua l,5°C/h. Biologinen aktiivisuus mitattiin saannon vähenemistä koskevan määritysmenetelmän mukaisesti, jota Steward ja Lockhart ovat kuvanneet julkaisussa 60 95002 J. of Virol., 6:795-799 (1970).

Edeltäkäsin säädetyin väliajoin kustakin pullosta poistettiin 0,5 ml steriilien muoviruiskujen avulla ja siirrettiin muovisiin määritysputkiin sekä jäädytettiin -20°C:een määrittämiseen saakka. Aikavälit olivat noin 24 tunnin mittaisia. Sitten näytteet sulatettiin, sekoitettiin ja otettiin sitten saannon vähentymistä koskevaan määritykseen joko 1., 2. tai 3. päivänä.

Kuvio 3 esittää LNS-tutkimuksen tulokset IFN-3:n normaalin, korkean sekä alhaisen annoksen humaani seerumialbumiiniformulaa-tioille sekä IFN-B:n 1-prosenttisille natriumlauraattiformu-laatioille. Kuvion 3 mukainen graafinen esitys ilmaise, että korkean annoksen HSA-formulaatio on suhteellisesti kestävämpi kuin normaalin annoksen HSA-formulaatio, joka on vuorostaan kestävämpi kuin alhaisen annoksen HSA- tai lauraattiformulaatiot.

Kuvio 4 vertailee kyseessä olevan keksinnön mukaisten kolmen mannitoliformulaation suhteellista kestävyyttä. Mittakaava on sama kuin kuviossa 3. Kuvioiden 3 ja 4 välisen vertailun perusteella voidaan päätellä, että Triton X305/Nopalcol-formulaatio on yhtä kestävä kuin normaali annos HSA:n kanssa formuloitua IFN-6:a, ja että Plurafac C-17-formulaatio on yhtä kestävä kuin suuri annos HSA:n avulla formuloitua IFN-6:a.

Kuvio 5 valaisee HSA:n avulla formuloidun β-IFNsn normaalin ja suuren annoksen sekä IFN-(3:n f ormulaation, jonka konsentraatio on 0,25 mg/ml 5-prosenttisessa mannitolissa 0,1-prosenttisen Plurafac C-17:n kanssa sekä pH 6,0:ssa sekä 0,01-prosenttisen Plurafac C-17-formulaation, joka on pH 5:ssä ja joka on vinoneliöin esitetty kuviossa 5, suhteellista kestävyyttä. Tulokset osoittavat, että 0,1-prosenttinen Plurafac C-17-formulaatio on vähintään yhtä kestävä kuin suuriannoksinen humaani seeru-mialbumiiniformulaatio. Edelleen, LNS-tutkimuksen perusteella on ennustettavissa, että 0,01-prosenttisella Plurafac C-17-formulaatiolla pH 5:ssä on myös hyvä pitkäaikainen kestävyys. Trycol LAL(12):n 0,15-prosenttisena formulaationa pH 7:ssä ennustetaan LNS-tutkimuksen perusteella olevan yhtä kestävän 6i 95002 kuin suuriannoksisen HSA-formulaation, kun taas Trycol LAL(12)-Nopalcol-formulaation tulisi olla kestävämmän kuin HSA:n avulla formuloidun normaalin annoksen.

Esimerkki 10 Toksisuustutkimukset IFN-$ puhdistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, siten että SDS poistettiin G - 75-poolista poistamalla suolat G-25-pylvääs-sä, joka ajettiin 0,1-prosenttisessa natriumlauraatissa, joka toimi siirtokomponenttina. Formulointi kyseessä olevan keksinnön mukaisten formulanttien kanssa suoritettiin kuvatulla tavalla.

Näitä toksisuuskokeita varten kahdeksan hiirtä (4 naaras- ja 4 koiraspuolista) tutkittiin formulaatiota kohti. Tutkitut, esimerkkeinä esitetyt formulaatiot sisälsivät kukin yhtä liuot-tavien/stabiloivien aineiden koostumuksista, jotka on lueteltu tämän julkaisun taulukossa I, 5 % mannitolia ja 0,25 mg/ml IFN-6:a. Kaikki formulaatiot lyofilisoitiin ja muodostettiin uudelleen steriloituun veteen. Kuhunkin eläimeen ruiskutettiin 0,2 ml laskimonsisäisesti lateraaliseen häntälaskimoon. Lisäksi, neljään hiireen (2 naaras- ja 2 koiraspuoliseen) ruiskutettiin 0,2 ml täyteainetta, joka sisälsi 0,1 % detergenttiä. Nämä tok-sisuuskokeet eivät aiheuttaneet yhtään kuolemaa eikä painon muutosta tutkituilla hiirillä. Sellaiset tulokset varmistavat oraalisia, toksisuutta koskevia tietoja, joita on annettu käyttöön esillä olevan keksinnön mukaisissa formulaatioissa esimerkkeinä käytettyjen ionittomien, pinta-aktiivisten aineiden valmistuksessa, kuten keksinnön tiivistelmässä mainitaan.

Esimerkki 11

Formulointivaiheiden ajoitus

Formulointivaihe suoritettiin vuorokausi sen jälkeen, kun suo-lanpoistovaihe oli suoritettu käyttämällä natriumlauraattia siirtokomponenttina G-25-pylväässä (katso esimerkki 1) ja nat-riumlauraatti oli poistettu. Formuloimatonta IFN-^a pidettiin pH 3:ssa ja +4°C:n lämpötilassa yli yön ennen formulointia.

Näitä formulaatioita verrattiin formulaatioihin, jotka oli valmistettu välittömästi G-25-pylvään ajon jälkeen. Tulokset ilmai 62 95002 sevat, että suolanpoisto G-25-pylväällä 24 tuntia ennen formulointia ei nosta aggregaattien tasoa.

Kun G-25-pylväs ajettiin päivää ennen ja IFN-β säilytettiin jääkaapissa yli yön pH 3,0:ssa ja formulaatiot neutraloitiin pH 7:ään neljäksi tunniksi ennen lyofilisointia, saatiin 30-40 %:n lisäys aggregaattien määrässä, kun verrattiin näytteisiin, jotka neutraloitiin välittömästi ennen lyofilisointia. Tulokset alla taulukossa V ilmaisevat, että lyofilisoinnin ajoitus esillä olevan keksinnön mukaisten formulaatioiden ollessa kyseessä on kriittinen aggregaattien muodostumisen suhteen. Lyofilisointi, joka suoritetaan välittömästi IFN-g-proteiiniliuoksen neutraloinnin jälkeen, antaa tulokseksi aggregaattien hyvin alhaisia tasoja.

Taulukko V

Lyofilisoinnin ajoitus 4 h Välittömästi

Triton X305/Nopalcol 58 % 92 %

Plurafac C-17 50 % 85 %

Esimerkki 12

Mannitoliformulaatiot verrattuina dekstroosiformulaatioihin Taulukko VI ilmaisee ultrasentrifugointitulokset vastaavasti 5-prosenttisille mannitoli-, 2,5-prosenttisille mannitoli- ja 5-prosenttisille dekstroosiformulaatioille, joissa Trycol® 0,5-prosenttisena pH 7:ssä on stabiloivana/liuottavana aineena. Sellaisten formulaatioiden, jotka on valmistettu esimerkin I mukaisesti, ultrasentrifugointitulokset ilmaisevat, että mannitoli jollain tavoin näyttää häiritsevän IFN-β:n liukoisuutta.

Sen tähden dekstroosin yksinään ajatellaan olevan edullisemman massaa lisäävän/stabiloivan aineen kuin mannitoli on kyseessä olevan keksinnön mukaisille formulaatioille.

Taulukko VI

Mannitolin ultrasentrifugointi verrattuna dekstroosin ultra- sentrifugointiin 5-prosenttinen mannitoli —r^co—->15%, pH 7,0 ^ 79,5% 2,5-prosenttinen mannitoli 84,5% 5-prosenttinen dekstroosi 90,5% r 63 9 5 0 0 2

Esimerkki 13

Dekstroosia ja mannitolia sisältävien formulaatioiden LNS-tutkimukset LNS-tutkimukset suoritettiin esillä olevan keksinnön mukaisille esimerkkiformulaatioille dekstroosin ja mannitolin vertailemiseksi esillä olevan keksinnön yhteydessä käytettyinä massaa an-tavina/stabiloivina aineina. Trycol® LAL(12) IFN-g-koostumuk-set, jotka oli valmistettu esimerkin 1 mukaisesti, formuloitiin vastaavasti 5-prosenttisen dekstroosin ja 5-prosenttisen mannitolin kanssa. LNS-tulokset esitetään kuviossa 6. Vertailu, joka on suoritettu normaalin ja suuren HSA-annoksen kanssa formuloitujen IFN-g-formulaatioiden välillä, ilmaisee, että ionitonta, pinta-aktiivista ainetta sisältävien formulaatioiden voidaan ennustaa olevan vähintään yhtä kestävien kuin HSA:n normaalin annoksen sisältävän IFN-g-formulaation. Mitään eroa kestävyydessä ei havaittu mannitolin ja dekstroosin avulla formuloitujen koostumusten välillä.

Esimerkki 14 Tämä esimerkki esittää ehdokkaana olevia formulointiaineita koskevan, esillä olevan keksinnön mukaisen seulontamenetelmän esimerkin. G-75:llä puhdistettu IFN-g eluoitiin G-25-Sephadex-pyl-väässä, joka oli tasapainoitettu lauraattipuskurissa (fosfaatti) , pH 9,2:ssa. Natriumlauraatti saostettiin pH 3:ssa esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Liukoinen IFN-g erotettiin sentri-fugoiden, ja se lisättiin pH 3:ssa ei detergenttinä toimivaan, stabiloivaan aineeseen, glyseroliin, jonka konsentraatio oli 25 tilavuusprosenttia, ja tähän lisättiin taulukossa VII alla esitettyä ionitonta detergenttiä 0,01 %:n konsentraatio. Liuoksen pH nostettiin sitten 5:een. Kromatografia suoritettiin huoneen lämpötilassa. Formulaatioiden valmistuksen jälkeen niitä tarkkailtiin saostuman muodostumisen suhteen; havainnot merkittiin muistiin; ja sitten näytteitä pidettiin 4°C:ssa 24 tunnin -useiden viikkojen ajan.

Kaikki näytteet sentrifugoitiin esimerkin 5 menetelmän mukaises--- ti, ja liuokseen jäävän IFN-8:n määrä laskettiin A280:n perus teella. Erät biologista määritystä varten /^sytopaattisen vaiku- T-- 64 95002 tuksen määritysmenetelmä, jota Steward on kuvannut julkaisussa The Interferon System, s. 17 (1981^7 otettiin ajanhetkellä =0, 24 h, 48 h ja 1 viikko.

Sellaisten kokeiden tulokset esitetään taulukoissa VII ja VIII. Taulukko VII ilmaisee, että 96-100 % IFN-6:sta, joka on formuloitu 25-prosenttisen glyserolin ja 0,01-prosenttisen, tarkoin määritellyn, ionittoman detergentin kanssa, jää liukoiseksi. Taulukko VIII esittää biologisen määritysmenetelmän tuloksia sellaisille näytteille. Formuloinnin jälkeen kaikki näytteet säilyttävät biologisen aktiivisuuden yhden viikon ajan 4°C:ssa.

Taulukko VII

Supernatantin sisältämän proteiinin talteenotto erilaisia formulaatioita varten

Saostuminen 5 Saanto-% Saanto-%

Formulaatio min kohdalla Alpilla (24 h) Alpilla (1 viik.)

Kaikki näytteet 25 %:sessa glyserolissa ja 25-millimolaarisessa NaPO,:ssä -4- 0,01 % Trycol LAL- 0 100 96 12, pH 5 0,01 % Tween 80, 0 100 105 pH 5 0,01 % Pluronic 0 97 102 F-68, pH 5

Taulukko VIII

Erilaisten formulaatioiden spesifinen aktiivisuus (CPE-määritys) (U/mg x 107) Näyte 0 h 24 h 48 h 1 viikko 25 % glyserolia _ _ Λ „ 0,01 % Trycolia, pH 5 3,0 0,5 0,3 0,9 25 % glyserolia , _ _ , Λ , _ 0,01 % Tween 80:a, 10,0 10,5 7'4 4/5 pH 5 25 % glyserolia 0,01 % Pluronicia 10,0 9,7 9,7 4,1 F-68, pH 5 c 65 9 5 0 0 2

Esimerkki 15

Esillä oleva esimerkki valaisee monia erilaisia massaa lisää-vien/stabiloivien aineiden yhdistelmiä IFN-0:n lyofilisoituja formulaatioita varten. Esillä olevassa esimerkissä käytetty IFN-S uutettiin ja puhdistettiin suurin piirtein esimerkin 1 mukaisesti, aina siihen saakka ja se vaihe mukaan lukien, jossa IFN-6-suodos stabiloitiin lisäämällä 0,15-prosenttista Trycol LAL-12:a. Sitten lisättiin 5-prosenttista dekstroosia (paino/tilavuus) 10 ml:n suuruiseen erään IFN-βζη stabiloitua suodosta, ja seuraavia massaa lisäävien/stabiloivien aineiden yhdistelmiä lisättiin vastaavasti 10 ml:n suuruisiin eriin IFN-B:n suodosta (kaikki prosentit ovat konsentraatio-olosuhtei-ta, painoa tilavuutta kohti): 0,1 % dekstroosia/2 % mannitolia; 0,2 % dekstroosia/2 % mannitolia; ja 0,1 % dekstroosia/2 % gly-siiniä. Kukin 10 ml:n suuruisen erän pH nostettiin noin 6,0:aan NaOHrn avulla. Liuokset esisuodatettiin ja suodatettiin steriileiksi käyttäen vastaavasti 0,45 ja 0,22 mikronin nitrosellu-loosasuodattimia. IFN-0ser^ :n oikeat annosmäärät (0,25 mg/ml) täytettiin aseptisesti hygieenisissä, steriileissä olosuhteissa, joita tarkkailtiin huolellisesti, steriileihin pulloihin, jotka oli varustettu steriilein korkein.

Pullot asetettiin sitten lyofilisaattoriin, johon oli kytketty sopivat lämpöparit. Lyofilisointi suoritettiin seuraavasti: lämpötila alennettiin -30°C:een, jossa lämpötilassa pulloja pidettiin esikuvausta varten (tyhjössä) noin 12 tunnin ajan; lämpötilaa nostettiin kahdessa vaiheessa, siten että ensimmäisessä vaiheessa lämpötilaa nostettiin 3°C/h aina 5°C:n lämpötilaan saakka, jossa niitä pidettiin 12 tunnin ajan, ja toisessa vaiheessa lämpötilaa nostettiin 3°C/h aina 15°C:n lämpötilaan saakka, jossa pulloja pidettiin 24 tunnin ajan. Sitten pulloja säilytettiin 2 - 8°C:ssa, kunnes valmisteet liuotettiin vedellä ruisketta varten, lisättiin suhteessa 1/1 (tilavuus/tilavuus) ja tutkittiin ultrasentrifugoinnin ja UV-spektrin avulla, yllä esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Ultrasentrifugointitulokset esitetään alla taulukossa IX.

66 9 5 0 0 2

Taulukko IX

IFN-β, joka on formuloitu Trycol® LAL-12:n ja erilaisten massaa antavien/stabiloivien aineiden kanssa_

Massaa antavat/stabiloivat Ultrasentrifugoinnin reagenssit % (paino/tilavuus) saanto (%)_ 5 % dekstroosia 95 % 0,1 % dekstroosia/2 % mannitolia 88 % 0,2 % dekstroosia/2 % mannitolia 89 % 0,1 % dekstroosia/2 % glysiiniä 76 %

Kunkin suljetun formulaation ulkonäkö oli hyvä. Jos suoritettiin normaali lyofilisointimenettely, esimerkiksi siten, että ensikuivausjaksoa -30°C:ssa, joka oli 12 tunnin mittainen, seurasi lämpötilan nousu porrastaen 12°C/h aina 15°C:een saakka, 5 % dekstroosia sisältävä suljettu formulaatio näyttää jonkin verran menneen kokoon, vaikka ultrasentrifugoinnin saanto ja UV-spektrin tulokset ovat samanarvoiset kuin tulokset, jotka on saavutettu yllä kuvatulla, hitaalla, kaksivaiheisella lyofili-sointimenettelyllä. Kuitenkin suljettujen formulaatioiden ulkonäkö, muiden kuin niiden, jotka sisältävät 5 % dekstroosia massaa antavana, stabiloivana aineena ja jotka on lyofilisoitu normaalin menettelytavan mukaisesti, on samanlainen kuin for-mulaatiolla, jonka lyofilisoinnissa on käytetty kaksivaiheista, lämpötilan portaattaiseen laskuun perustuvaa menettelyä.

UV-spektrin tulokset ilmaisivat hyvin vähän aggregaatiota for-mulaatioissa, jotka sisälsivät 5 % dekstroosia, 0,1 % dekstroosia/2 % mannitolia tai 0,2 % dekstroosia/2 % mannitolia massaa antavina/stabiloivina aineina; kuitenkin enemmän aggregaatiota oli nähtävissä formulaatiossa, joka sisälsi 0,1 % dekstroosia/ 2 % glysiiniä massaa lisäävänä/stabiloivana aineena, mikä tekee sen vähemmän edulliseksi massaa lisäävän/stabiloivan aineen yhdistelmäksi kuin muut tutkitut yhdistelmät.

Yhteenvetona voidaan nähdä, että esillä olevan keksinnön mukaiset IFN-B-formulaatiot, jotka sisältävät biologisesti soveltuvia, ionittomia, polymeeridetergenttejä, jotka on seulottu esillä olevan keksinnön menetelmän mukaisesti, sekä massaa lisäävän/ 67 95002 stabiloivan aineen, ovat haluttuja, farmaseuttisia koostumuksia. Mainitut IFN-g-formulaatiot ovat ainakin yhtä kestäviä kuin HSA-formulaatiot, eivätkä ne sisällä merkittäviä määriä aggregaatteja. Tässä yhteydessä kuvataan myös formulointimene-telmiä, joiden avulla saadaan formulaatioita, joissa on hyvin vähän aggregaatteja ja muita mahdollisesti immunogeenisia ominaispiirteitä ja vähän tai ei yhtään voimakkaita liuottavia aineita, kuten esimerkiksi SDS:a. Esillä olevan keksinnön mukaiset formulaatiot ovat edelleen myrkyttömiä ja niillä on pitkä varasto intiaika.

Tallennukset

Kuten yllä on mainittu, E. colin K12/MM294-1, jossa on plasmidi pSY2501, viljelmä tallennettiin American Type Culture Collectio-niin 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, marraskuun 18. päivänä 1983, tulonumerolla ATCC n:o 39 157.

Mainittu tallennus tehtiin sopimuksen mukaisesti, joka on tehty ATCC:n ja esillä olevan patenttihakemuksen luovutuksen saajan, Cetus Corporationin kanssa. Sopimus, joka on tehty ATCC:n kanssa, tekee yleisölle mahdolliseksi saada jatkuvasti käyttää mainittua kantaa ja sen jälkeläisiä sen jälkeen, kun on julkaistu US-patentti, joka koskee tätä hakemusta, joka kuvaa ja identifioi tallennuksen, tai sen jälkeen kun on julkaistu ja saatettu yleisön saataville mikä tahansa USA:n tai vieras patenttihakemus, kumpi hyvänsä tulee ensin, ja antaa mahdollisuuden saada käyttöön kanta ja sen jälkeläiset sellaisen, jonka U.S. Commissioner of Patents and Trademarks on määritellyt olevan siihen oikeutetun 35 USC §122:n mukaan ja the Commissionerin sääntöjen mukaisesti (mukaan luettuna 37 CFR §1.14, viitaten erityisesti 886 OG 638:aan). Kyseessä olevan patenttihakemuksen luovutuksen saaja on suostunut siihen, että jos tallennettu kanta kuolisi tai katoaisi tai tuhoutuisi, kun sitä on kasvatettu sopivissa olosuhteissa, se tulisi nopeasti ilmoituksen jälkeen korvata saman kannan elävällä viljelmällä.

"The Budapest Treaty assuren" ilmausten mukaisesti tallennettua viljelmää tulee pitää elävänä ja kontaminoimattomana ainakin 68 9 5 0 0 2 viiden vuoden ajan, sen jälkeen kun ATCC on saanut viimeisimmän pyynnön toimittaa tallennetun mikro-organismin näytettä, ja joka tapauksessa, ainakin 30 vuoden ajan tallennuspäivän jälkeen.

Viljelmä tehtiin saatavilla olevaksi toukokuun 21. päivänä 1985. Tallennetun kannan saatavuutta ei ole järjestetty lisenssin avulla kyseessä olevan keksinnön toteuttamiseksi ristiriidassa oikeuksien kanssa, jotka on myönnetty minkä tahansa hallinnon määräysvallan alla, sen patenttilakien mukaisesti.

Niinpä, kyseessä olevaa keksintöä ei ole konstruoitu rajoitetusti tallennetun kannan piiriin, koska tallennettujen patentin suoritusmuotojen tarkoituksena on ainoastaan valaista kyseessä olevan keksinnön tiettyjä piirteitä. Mikä tahansa mikro-organismin, joka toiminnallisesti on saman arvoinen tallennetun mikro-organismin kanssa, katsotaan kuuluvan kyseessä olevan keksinnön piiriin. Edelleen, kyseessä olevan keksinnön erilaisten muunnosten niiden lisäksi, joita esitetään ja joita on kuvattu kyseessä olevan keksinnön piirissä ja jotka aiemman kuvauksen perusteella ovat selviä aiheeseen perehtyneelle, katsotaan kuuluvan liitteenä esitettyjen patenttivaatimusten piiriin.

Claims (5)

69 95002

1. Menetelmä glykosyloimattoman yhdistelmäinterferoni-B.-n (IFN-S:n) stabiilien, farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) IFN-β.-η uuttamisen proteiinin valmistamiseksi transformoidun isäntäorganismin pirstomistuotteesta; (b) IFN-S:n puhdistamisen käyttäen viimeisenä puhdistusvai-heena suolojen poistoa pH-alueella noin 8,5 - 10, käyttämällä eluutiopuskuria, joka sisältää rasvahapon suolan, jossa hiiliketjun pituus on noin 10 - 12 hiiliatomia, suolattoman poolin muodostamiseksi; (c) poolin, josta suolat on poistettu, pH:n alentamisen noin 2-4:ään, jolloin rasvahapposuola saostuu; (d) saostuneen suolan poistamisen sentrifugoimisen ja suodatuksen avulla; (e) pooliin, josta suolat on poistettu, tehokkaan määrän lisäämisen yhtä tai useampaa biologisesti yhteen sopivaa polymeeridetergenttiä tai yhden tai useamman, biologisesti soveltuvan, ionittoman polymeeridetergentin ja muun liuottavan tai stabiloivan aineen yhdistelmää tehokkaina määrinä IFN-S:n stabiloimiseksi ja liuottamiseksi, jolloin deter-gentti on etoksyloitu rasva-alkoholieetteri tai lauryylieet-teri; oktyylifenoksipolyetoksietanoliyhdiste; modifioitu oksietyloitu tai oksipropyloitu suoraketjuinen alkoholi tai niiden seos; polyetyleeniglykolimono-oleaattiyhdiste; feno-linen rasva-alkoholieetteri; tai propyleenioksidin ja ety-leenioksidin segmenttikopolymeeri, jolloin mainittu koostumus edelleen sisältää SDS:ää tai glyserolia mainitun detergent in ollessa vain propyleenioksidin ja etyleenioksidin segmenttikopolymeeri; (f) poolin pH:n säätämisen pH-alueelle noin 4,0 - 8,0; (g) tehokkaan määrän täyte/stabilointiainetta lisäämisen pooliin; ja (h) formulaation lyofilisoinnin. 95002

2. Förfarande enligt patentkrav l, kännetecknat av att nämnda detergenter valts i gruppen bestdende av: (a) en blandning av etoxylerade fettalkoholeter- och lau-ryleterföreningar med följande formel: CH3-(CH2)w-(OCH2CH2)n-OH i vilken n betyder fördelning frän ca 1 tili ca 30 och kon-centreras tili värdet n = 12, och w betyder fördelning fran ca 9 tili ca 17, innehällande en betydande del w = 11; (b) en oktylfenoxipolyetoxietanolförening med följande formel : C8H17-^y>" (OCH2CH2) m-OH i vilken m är ett heltal mellan ca 5 - 60; (c) blandningar av omvandlade oxietylerade eller oxipropy-lerade, rakkedjiga alkoholer eller vardera, med följande formel: H-(0CH2CH2)p-(OCH2CH2CH2)q-(CH2)r-OH i vilken p är ett heltal mellan cirka 1-10; q är 0 eller ett heltal mellan cirka 1 - 10; och r är ett heltal mellan cirka 6 - 14; 95002 (d) en polyetylenglykolmonooleatförening med följande for-mel: H H O I I II CH3-(CH2)7-C=C-(CH2)7-C-O-(CH2CH20)s-H i vilken s är ett heltal mellan ca 1 - 10; (e) en fenolfettalkoholeter med följande formel: ^~~^)-(och2ch2)v-oh i vilken v är ett heltal mellan cirka 10 - 200; eller (f) segmentkopolymer av propylenoxid och etylenoxid (Pluronic®-polyoler) .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että mainitut detergentit on valittu ryhmästä, j ohon kuuluvat: (a) seos etoksyloituja rasva-alkoholieetteri- js lauryyli-eetteriyhdisteitä, joilla on seuraava kaava: CH3-(CH2)w-(OCH2CH2)n-OH jossa n merkitsee jakaumaa noin l:stä noin 30:een ja keskittyy arvoon n = 12, ja w merkitsee jakaumaa noin 9:stä noin 17:ään, sisältäen merkittävän osan w = 11; (b) oktyylifenoksipolyetoksietanoliyhdiste, jolla on seuraava kaava: ca7^C)- (OCH2CH2)m-OH jossa m on kokonaisluku noin 5-60; (c) muunnettujen oksietyloitujen tai oksipropyloitujen, suoraketjuisten alkoholien tai molempien seoksia, joilla on seuraava kaava: H- (OCH2CH2)p-(OCH2CH2CH2)q-(CH2)r-OH jossa p on kokonaisluku väliltä noin 1-10; q on 0 tai kokonaisluku väliltä noin 1 - 10; ja r on kokonaisluku noin 6 -14; (d) polyetyleeniglykolimono-oleaattiyhdiste, jolla on seuraava kaava: H H O I I II ch3- (ch2) 7-c=c- (CH2)7-C-0- (CH2CH20)s-H jossa s on kokonaisluku noin 1-10; (e) fenolirasva-alkoholieetteri, jolla on seuraava kaava: <^~^-(och2ch2)v-oh ·. jossa v on kokonaisluku noin 10 - 200; tai 95002 (f) propyleenioksidin ja etyleenioksidin segmenttikopoly-meerit (Pluronic®-polyoleja).

3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att nämnda andra losande eller stabiliserande medel är glycerol, som används i en koncentration av cirka 5 - 50 % (volym/volym), eller dodekylsulfat, som används i en koncentration av cirka 100 - 200 μg per mg av IFN-β.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että mainittu muu liuottava tai stabiloiva aine on glyseroli, jota käytetään noin 5 - 50 %:n konsentraationa (tilavuus/tilavuus), tai dodekyylisulfaatti, jota käytetään noin 100 - 200 μg:n konsentraationa IFN-β.-η mg kohti.

4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att koncentrationsomrädet (volym/volym) för nämnda en eller flera jonfria detergenten är cirka 0,0005 - 5 %.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että mainittujen yhden tai useamman ionittoman detergentin konsentraatioalue (tilavuus/tilavuus) on noin 0,0005 - 5 %.

5. Menetelmä glykosyloimattoman yhdistelmäinterferoni-β-proteiinin stabiilien, farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraa-vat vaiheet: (a) IFN-E:a sisältävien valoa taittavien osasten eristämisen isäntäorganismista, joka on transformoitu mainitun IFN-E:n valmistamiseksi; (b) mainittujen, valoa taittavien osasten liuottamisen nat-riumlauraattia käyttäen; (c) mainitun IFN-fi:n uuttamisen ja puhdistamisen liuotetusta, valoa taittavasta materiaalista käyttämällä natriumlau-raattia ensisijaisena, liuottavana aineena; (d) puhdistetun IFN-fi:n pH:n alentamisen noin pH 2-4:ään; (e) puhdistetun IFN-β-iuoksen sentrifugoinnin ja suodattamisen natriumlauraattisaostuman poistamiseksi, IFN-β-ροοΙίη muodostamiseksi; (f) suolojen poiston IFN-B-poolista noin pH 2-4:ssä; (g) IFN-fi-proteiiniliuoksen tehokkaan määrän lisäyksen yhtä tai useampaa, ionitonta, biologisesti yhteen soveltuvaa po-lymeeridetergenttiä, tai ionittoman, biologisesti yhteen sopivan polymeeridetergentin ja muun liuottavan tai stabiloivan aineen yhdistelmää IFN-B:n stabiloimiseksi tai liuottamiseksi, jolloin detergentti on etoksyloitu rasva-alkoho-lieetteri tai lauryylieetteri; oktyylifenoksipolyetoksi-etanoliyhdiste; modifioitu oksietyloitu tai oksipropyloitu 95002 suoraketjuinen alkoholi tai niiden seos; polyetyleeniglyko-limono-oleaattiyhdiste; fenolinen rasva-alkoholieetteri; tai propyleenioksidin ja etyleenioksidin segmenttikopolymeeri, jolloin mainittu koostumus edelleen sisältää SDS:ää tai glyserolia mainitun detergentin ollessa vain propyleenioksidin ja etyleenioksidin segmenttikopolymeeri; (h) IFN-β:n liuoksen säädön pH-alueelle 3,5 - 9,5; (i) liuokseen tehokkaan määrän lisäämisen massaa lisäävää/ stabiloivaa ainetta; ja (j) formulaation lyofilisoinnin. l. Förfarande för framställning av stabila, farmaceutiska sammansättningar av oglykosylerat rekombinantinterferon-β (IFN-β), kännetecknat av att det omfattar föl-jande steg: (a) extraktion av IFN-β för framställning av protein frän fragmentationsprodukten av den transformerade värdorganis-men; (b) rengöring av IFN-β genom att som sista rengöringssteg använda saltavlägsning inom pH-omrädet ca 8,5 - 10, genom att använda en elutionsbuffert, som innehäller ett sait av fettsyra, i vilken kolkedjan har en längd pä ca 10 - 12 kol-atomer, för att bilda en saltfri pool; (c) sänkning av pH för poolen, frän vilken salterna avlägs-nats, tili ca 2 - 4, varvid fettsyrasalt utfälls; (d) avlägsning av det utfällda saltet med hjälp av centri-fugering och filtrering; (e) tillsats tili poolen, frän vilken salterna avlägsnats, av en effektiv mängd av en eller flera biologiskt kompatibla polymerdetergenter eller effektiva mängder av en kombination av en eller flera biologiskt effektiva, jonfria polymerdetergenter och nägot annat lösande eller stabiliserande medel för stabilisering och lösning av IFN-β varvid detergenten är en etoxylerad fettalkoholeter eller lauryleter; oktylfenoxi-polyetoxietanolförening; modifierad oxietylerad eller oxi-propylerad rakkedjig alkohol eller en blandning av dessa; en polyetylenglykolmonooleatförening; en fenolisk fettalkohol- 95002 eter; eller ett segmentkopolymer av propylenoxid och etylen-oxid, varvid nämnda sammansättning vidare innehäller SDS eller glycerol medan nämnda detergent endast är ett segmentkopolymer av propylenoxid och etylenoxid; (f) regiering av pH hos poolen tili pH-omrädet ca 4,0 - 8,0; (g) tillsats av en effektiv mängd fyllnads/stabiliserings-medel i poolen; och (h) lyofilisering av formulationen.

5. Förfarande för framställning av stabila, farmaceutiska sammansättningar av oglykosylerat rekombinantinterferon-β-protein, kännetecknat av att det omfattar följande steg: (a) isolering av ljusbrytande fraktioner innehällande IFN-β frän värdorganismen, som transformerats för framställning av nämnda IFN-β; (b) upplösning av nämnda ljusbrytande fraktioner med hjälp av natriumlaurat; (c) extraktion och rengöring av nämnda IFN-β ur det upp-lösta, ljusbrytande materialet genom att använda natriumlaurat som primärt lösningsmedel; 95002 (d) sänkning av pH hos det rengjorda IFN-β tili ca 2-4; (e) centrifugering och filtrering av den rengjorda lFN-β-lösningen för att avlägsna natriumlauratutfällning i avsikt att bilda en IFN-β-ροοΙ; (f) saltavlägsning ur ΙΡΝ-β-poolen vid ett pH pä cirka 2-4; (g) tillsats tili IFN-P-proteinlösningen av en effektiv mängd av en eller flera biologiskt kompatibla polymerdeter-genter eller effektiva mängder av en kombination av en eller flera biologiskt effektiva, jonfria polymerdetergenter och nägot annat lösande eller stabiliserande medel för stabili-sering och lösning av IFN-β, varvid detergenten är en etoxy-lerad fettalkoholeter eller lauryleter; oktylfenoxipoly-etoxietanolförening; modifierad oxietylerad eller oxipropy-lerad rakkedjig alkohol eller en blandning av dessa; en po-lyetylenglykolmonooleatförening; en fenolisk fettalkohol-eter; eller ett segmentkopolymer av propylenoxid och etylen-oxid, varvid nämnda sainmansättning vidare innehäller SDS eller glycerol medan nämnda detergent endast är ett segmentkopolymer av propylenoxid och etylenoxid; (h) regiering av pH hos IFN-β-lösningen tili pH-omrädet 3,5 - 9,5; (i) tillsats tili lösningen av en effektiv mängd massaökan-de/statiliserande medel; och (j) lyofilisering av formulationen.