CN107106669A - 用于治疗过度表达HIF‑1α的癌症的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文中描述了包括特异性结合Hsp90α的单克隆抗体的组合物和使用所述组合物来治疗过度表达HIF‑1α的癌症的方法。在一些实施方案中,所述癌症是乳癌或肺癌。所述单克隆抗体结合以下表位:Hsp90α中的TKPIWTRNP或Hsp90α中的VKHFSVEGQ。
Description
相关申请的交叉引用
本申请还主张2014年11月4日提交的美国序列号62/075,129(其内容以引用的方式并入本文中)的优先权。
政府许可权利
本发明是根据国立卫生研究院颁予的资助号GM066193、GM067100、GMAR67100-01、AR33625和AR46538,在政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定权利。
技术领域
本文中描述了包含治疗性抗体的组合物和所述组合物用于治疗癌症的用途。
背景技术
本领域中需要新颖的治疗剂用来治疗癌症。热休克蛋白-90(Hsp 90)支援肿瘤的生成。尽管如此,仍有极少的证据证明Hsp90的细胞内抑或分泌形式起着主要作用且应在治疗上被靶向。本文中,本发明人证明分泌的而不是细胞内的Hsp90α负责肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。MDA-MB-231细胞中Hsp90α的敲除特别是完全破坏了肿瘤细胞的内在运动性和侵袭性。通过添加重组Hsp90α,而不是Hsp90β蛋白质至Hsp90α敲除的细胞来完全拯救了这些缺陷。本文中描述的靶向肿瘤细胞分泌的Hsp90α的F-5表位的单克隆抗体1G6-D7和5C4-D阻断肿瘤细胞的迁移和侵袭。本发明人确定,Hsp90α中的Lys-270和Lys-277决定着分泌的Hsp90α的独特功能,并且足够将Hsp90β转变成Hsp90α样分子,从而拯救了Hsp90α敲除的细胞中的运动性和侵袭性缺陷。因此,本文中提供了新型标靶(例如肿瘤分泌的Hsp90α的双赖氨酸区)和靶向Hsp90α的新型治疗性抗体(IG6-D7和5C4-D)。
发明内容
本文中提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含Hsp90α抑制剂和药学上可接受的载剂。在一些实施方案中,所述抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的氨基酸Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是识别且结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP(SEQ ID NO:1)的1G6-D7单克隆抗体或其功能片段。在另一实施方案中,抗体是识别且结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ(SEQID NO:2)的5C4-D4单克隆抗体或其功能片段。在一些实施方案中,1G6-D7和5C4-D4单克隆抗体经人源化。1G6-D7和5C4-D4单克隆抗体的功能片段保留对应全长抗体的至少一个抗原结合区。
本文中还提供了治疗、抑制有需要的受试者的过度表达HIF-1α的癌症、预防癌症转移、预防癌症复发和/或降低癌症严重程度的方法。所述方法包括提供包含Hsp90α抑制剂的组合物,并向受试者施用治疗有效量的组合物,以便治疗、抑制受试者的过度表达HIF-1α的癌症、预防癌症转移、预防癌症复发和/或降低癌症严重程度。在一些实施方案中,所述方法进一步包括提供其它癌症治疗(与本文中描述的组合物同时或相继)。其它癌症治疗包括(但不限于)主动监视、观测、外科手术、化学疗法、免疫疗法、放射疗法(例如外束放射、立体定向放射外科(γ刀)和分次立体定向放射疗法(FSR))、病灶疗法、全身疗法、疫苗疗法、病毒疗法、分子靶向疗法或其组合。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP的1G6-D7单克隆抗体或其功能片段。在另一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ的5C4-D4单克隆抗体或其功能片段。在一实施方案中,抑制剂包括同时或相继施用的单克隆抗体1G6-D7与5C4-D4或其片段的组合。在一些实施方案中,1G6-D7和5C4-D4单克隆抗体是人源化或人类抗体。
本文中还提供了治疗、抑制有需要的受试者的乳癌、预防乳癌转移、预防乳癌复发和/或降低乳癌严重程度的方法。所述方法包括提供包含Hsp90α抑制剂的组合物,并向受试者施用治疗有效量的组合物,以便治疗、抑制受试者的乳癌、预防乳癌转移、预防乳癌复发和/或降低乳癌严重程度。在一些实施方案中,所述方法进一步包括提供其它乳癌治疗(与本文中描述的组合物同时或相继)。其它癌症治疗包括(但不限于)主动监视、观测、外科手术、化学疗法、免疫疗法、放射疗法(例如外束放射、立体定向放射外科(γ刀)和分次立体定向放射疗法(FSR))、病灶疗法、全身疗法、疫苗疗法、病毒疗法、分子靶向疗法或其组合。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP的1G6-D7单克隆抗体或其功能片段。在一些实施方案中,1G6-D7单克隆抗体是人类或人源化抗体。在另一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ的5C4-D4单克隆抗体或其功能片段。在一些实施方案中,5C4-D4单克隆抗体是人类或人源化抗体。在一实施方案中,抑制剂包括同时或相继施用的单克隆抗体1G6-D7与5C4-D4或其片段的组合。在一些实施方案中,1G6-D7和5C4-D4单克隆抗体是人源化或人类抗体。
本文中还提供了治疗、抑制有需要的受试者的肺癌、预防肺癌转移、预防肺癌复发及/或降低肺癌严重程度的方法。所述方法包括提供包含Hsp90α抑制剂的组合物,并向受试者施用治疗有效量的组合物,以便治疗、抑制受试者的肺癌、预防肺癌转移、预防肺癌复发和/或降低肺癌严重程度。在一些实施方案中,所述方法进一步包括提供其它肺癌治疗(与本文中描述的组合物同时或相继)。其它癌症治疗包括(但不限于)主动监视、观测、外科手术、化学疗法、免疫疗法、放射疗法(例如外束放射、立体定向放射外科(γ刀)和分次立体定向放射疗法(FSR))、病灶疗法、全身疗法、疫苗疗法、病毒疗法、分子靶向疗法或其组合。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP的1G6-D7单克隆抗体或其功能片段。在一些实施方案中,1G6-D7单克隆抗体是人类或人源化抗体。在另一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ的5C4-D4单克隆抗体或其功能片段。在一些实施方案中,5C4-D4单克隆抗体是人类或人源化抗体。在一实施方案中,抑制剂包括同时或相继施用的单克隆抗体1G6-D7与5C4-D4或其片段的组合。在一些实施方案中,1G6-D7和5C4-D4单克隆抗体是人源化或人类抗体。
在各种实施方案中,经静脉内、经肌肉内、经腹膜内、经口或经由吸入施用Hsp90α抑制剂。Hsp90α抑制剂(例如1G6-D7和/或5C4-D4抗体)的有效量是约1-5毫克/天、5-10毫克/天、10-50毫克/天、50-100毫克/天、100-150毫克/天、150-200毫克/天、100-200毫克/天、200-300毫克/天、300-400毫克/天、400-500毫克/天、500-600毫克/天、600-700毫克/天、700-800毫克/天、800-900毫克/天、900-1000毫克/天、1000-1100毫克/天、1100-1200毫克/天、1200-1300毫克/天、1300-1400毫克/天、1400-1500毫克/天、1500-1600毫克/天、1600-1700毫克/天、1700-1800毫克/天、1800-1900毫克/天、1900-2000毫克/天、2000-2100毫克/天、2100-2200毫克/天、2200-2300毫克/天、2300-2400毫克/天、2400-2500毫克/天、2500-2600毫克/天、2600-2700毫克/天、2700-2800毫克/天、2800-2900毫克/天或2900-3000毫克/天。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂(例如1G6-D7和/或5C4-D4抗体或其片段)的有效量是约10-30毫克/公斤/天。
附图说明
示例性实施方案在参考图中予以说明。意图本文中公开的实施方案和图视为说明性的,而非限制性的。
图1A至图1D描绘了根据本发明的一个实施方案,在无血清条件下展示基本运动性和侵袭性的MDA-MB-231细胞中两池稳定状态的Hsp90蛋白质。在血清饥饿的MDA-MB-231细胞中,(图1A)通过对总细胞溶解产物(TL)进行免疫印迹,将Hsp90α(图a,泳道4、5、6)和Hsp90β(图b,泳道4、5、6)与已知量的重组Hsp90α和Hsp90β蛋白质(泳道1、2、3)相比较。重组蛋白质的分子质量由于其His标签而略微较高。(图1B)与已知量的重组Hsp90α和Hsp90β(泳道1、2、3)相比较,针对分泌的Hsp90α(图a,泳道4、5、6)和Hsp90β(图b,泳道4、5、6)的存在,对无血清的条件培养基(CM)进行蛋白质印迹分析。(图1C)使用胶体金迁移分析法,在无(上图)或有(下图)10%胎牛血清下,将MDA-MB-231细胞的内在运动性与未转化的HBL-100和人类角化细胞(HK)的迁移相比较。在每个图像下方,电脑辅助的对细胞迁移的定量展示为迁移指数(MI)(材料与方法)。(图1D)使用基质胶侵袭分析法(方法)比较MDA-MB-231细胞、HBL-100细胞和HK的侵袭性。定量呈现在代表性图像下方(Inv.%)。数据表示为平均值±SEM。p<0.05。
图2A至图2I描绘了根据本发明的一个实施方案,Hsp90α选择性地决定MDA-MB-231细胞的运动性和侵袭性,而Hsp90β是细胞生命所需要的。(图2A)在CRISPR-Cas9Hsp90α基因(图a、b和c)或Hsp90β基因(图d、e和f)敲除后,在药物选择中MDA-MB-231细胞的存活。(图2B)两个Hsp90α敲除的纯系(KO-α#1和KO-α#2)展示与亲代对照细胞(泳道1)或慢病毒介导的shRNA-Hsp90α敲低的细胞(泳道2)相比,Hsp90α蛋白质(图a,泳道3和4)完全缺乏,并展示Hsp90β略微升高(图b,泳道3和4)。(图2C)亲代shRNA-Hsp90α敲减(shRNA-α)和Hsp90α-敲除(KO-a)的MDA-MB-231细胞的生长曲线(±10%FBS)。(图2D),Hsp90α基因敲除对所指示的回应于EGF或TGFα的信号传导通路的作用。(图2E)Hsp90α基因敲除对Hsp90α和Hsp90β分泌的作用。(图2F)在10%胎牛血清缺乏(图a至d)或存在(图e至h)下亲代Hsp90α敲低和Hsp90α敲除的MDA-MB-231细胞的胶体金迁移分析法。迁移指数(MI)展示在代表性图像下方。(图2G)展示相同细胞的基质胶侵袭分析法且定量呈现为百分比(Inv.%)。至少在四个(n≥4)独立实验中可再现这些结果。数据表示为平均值±SEM。p<0.05。(图2H)展示所指示的细胞的基质胶侵袭分析法且定量呈现为侵袭的细胞对比总接种细胞的百分比(Inv.%)(n≥4)。(图2I)展示注射至乳腺脂肪垫的亲代LM2-4175细胞(5×106)的肿瘤形成和从五只小鼠去除的肿瘤(图a和b)。注射的Hsp90α敲除的LM2-4175细胞的肿瘤形成和去除的肿瘤(图c和d)。亲代或Hsp90α敲除的LM2-4175细胞的注射部位的苏木精和曙红(H&E)染色的代表性图像(图e和g)。在所指示的细胞系(图f和h)的实验(注射后4周)结束(尸体解剖)时收获代表性肺切片并进行H&E染色。T,肿瘤;N,正常组织。4/5,五只小鼠中的四只。
图3A至图3I描绘了根据本发明的一个实施方案,分泌的Hsp90α负责肿瘤细胞的基本运动性和侵袭性。为了拯救KO-α细胞的运动性和侵袭缺陷,(图3A)通过慢病毒感染将GFP标记的野生型和三磷酸腺苷酶缺陷型(D93N)Hsp90αcDNA引入KO-α细胞中,并通过抗Hsp90α特异性抗体证实表达(图a,泳道3、4对比泳道1、2)。(图3B)如通过总细胞溶解产物的蛋白质印迹分析所示,利用抗Hsp90β特异性抗体(图c)或抗Hsp90全(α和β)抗体(图d),野生型Hsp90βcDNA在KO-α细胞中表达。(图3C)经FPLC纯化的重组Hsp90α和Hsp90β蛋白质的SDS-PAGE与考马斯亮蓝染色(泳道4和5)。(图3D)野生型与D93N突变型Hsp90a都拯救了KO-α细胞的运动性缺陷(图c和d对比图b)和侵袭缺陷(图h和i对比图g)。当Hsp90β基因用于拯救运动性(图e)或侵袭(图j)时,发生很少的恢复。(图3E)单独细胞外Hsp90α蛋白质拯救了所有缺陷。(图3F)重组Hsp90α(图c’对比b’)而非Hsp90β(图d’)的添加拯救了MDA-MB-231-KO-α细胞的运动性(图a’至d’)和侵袭(图e’至h’)缺陷。(图3G)亲代MDA-MB-231肿瘤细胞无需拯救,因为所述细胞分泌并使用其自身的Hsp90α。(图3H)最关键地,MDA-MB-231-KO-α细胞不能在小鼠中形成肿瘤(图a),但经纯化的Hsp90α蛋白质的添加完全拯救了细胞的致肿瘤性(图b和c)。Hsp90β蛋白质的拯救少得多(图d和e),且Hsp90α-G/T突变体一点都未拯救(如所预期,图f)。(图3I)组织化学(H&E)分析展示在注射部位(乳腺脂肪垫)存在(图i和k)或不存在(图g和m)的肿瘤细胞以及肺中存在(图j)或不存在(图h、l和n)的肿瘤细胞(图j)。包括迁移(MI,%)和侵袭(Inv.%)的定量。重复运动性分析法四次,并重复侵袭分析法三次。数据表示为平均值±SEM。p<0.05。
图4A至图4H描绘了根据本发明的一个实施方案,mAb 1G6-D7和mAb 5C4-D4通过靶向分泌的Hsp90α的F-5区,阻断肿瘤细胞的运动性和侵袭。(图4A)两种新型单克隆抗体1G6-D7和5C4-D4以及所述抗体定位在Hsp90α的F-5区内的表位的示意图。(图4B)经纯化的1G6-D7(泳道2)和5C4-D4(泳道3)用于这些研究中。(图4C)1G6-D7(图c)和5C4-D4(图d),而不是对照IgG(图b)或抗Hsp90β抗体(图e),阻断MDA-MB-231细胞的基本运动性(图a)。通过添加过量的F-5(30μg/ml)(图f和g)蛋白质,逆转了1G6-D7和5C4-D4所实现的抑制。迁移实验(n=4,p<0.05)的数据定量为MI(%),如所示。(图4D)1G6-D7(图a、b、c)和5C4-D4(图d、e、f)抗体以剂量依赖性方式阻断MDA-MB-231细胞侵袭(图a’至f’)。通过添加增加量的F-5(图h’、i’和图k’、l’对比图g’和j’),逆转了该阻断。(图4E)侵袭的定量展示为穿过基质胶细胞外基质侵袭的细胞的百分比(Inv.%)。(图4F)1G6-D7阻断小鼠中MDA-MB-231细胞的肿瘤形成,(图4G),F中的数据定量。(图4H)在乳腺脂肪垫(图a和b)和肺中(图c和d)的肿瘤细胞的组织化学分析。重复实验四次(n=4)并展示代表性实验的结果。数据表示为平均值±SEM。p<0.05。
图5A至图5D描绘了根据本发明的一个实施方案,赖氨酸-270和赖氨酸277决定Hsp90α的促运动活性。(图5A)仍保留全长Hsp90α的促运动活性的截短Hsp90α肽的概述。在有或者没有所列肽之一的情况下,在无血清培养基中进行胶体金迁移分析法,MI(%)如所示(对于每种肽,n=3,p<0.05)。(图5B)F-8与F8β肽之间的氨基酸序列的比较,八个氨基酸残基的差异用颜色标出。(图5C)来自Hsp90α的F-8的合成肽的示意图,其中F-8β中八个氨基酸残基(红色)经个别取代。(图5D)使用迁移可由Hsp90α诱导的人类角化细胞测试每种突变肽的促运动活性(注意:MDA-MB-231细胞固有地分泌Hsp90α且不再对所添加的Hsp90α作出回应。迁移数据的定量(n=5,p<0.05)呈现为MI(%)。数据表示为平均值±SEM。
图6A至图6F描绘了根据本发明的一个实施方案,赖氨酸-270和赖氨酸277将Hsp90α与Hsp90β区别开并将Hsp90β转变以在功能上类似于Hsp90α。(图6A)其中赖氨酸-270和赖氨酸-277分别经甘氨酸和苏氨酸取代的全长Hsp90α的示意图。此突变的Hsp90α被称为Hsp90α-G/T突变体。相反,其中甘氨酸-262和苏氨酸-269经赖胺酸取代的突变Hsp90α被称为Hsp90β-K/K突变体。包括两种非特异性突变Hsp90α-D271K和Hsp90β-K262D作为阴性对照物。(图6B)指示量的牛血清白蛋白(BSA,泳道1、2和3)、经纯化的野生型Hsp90α和Hsp90α突变体(泳道4、5、6)以及野生型和突变Hsp90β(泳道7、8、9)的经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶。(图6C)通过添加重组Hsp90α和Hsp90β野生型和突变蛋白质至细胞培养基,拯救KO-α细胞的运动性缺陷。迁移数据的定量(n=3,p<0.05)呈现为MI(%)。(图6D)通过添加野生型和突变重组Hsp90α和Hsp90β蛋白质,拯救KO-α细胞的侵袭缺陷。侵袭的定量(n=4,p<0.05)是基于穿透基质胶细胞外基质进入下腔室的细胞的百分比(Inv.(%)。数据表示为平均值±SEM。(图6E)Hsp90α-G/T和Hsp90β-K/K突变蛋白质剂量依赖性地诱发细胞运动。人类真皮成纤维细胞生长至大约80%汇合,并在培养基中剥夺血清16小时。回应于对照物(-)、FBS(10%)、野生型(wt)重组Hsp90α或指示浓度的Hsp90α-G/T和Hsp90β-K/K突变蛋白质,细胞进行胶体金迁移分析法。此处展示迁移指数(%)。(图6F)K270G/K277G突变体充当需要分泌的Hsp90α自分泌信号传导的MDA-MB-231细胞迁移的显性负性因子。此发现表明了K270G/K277G突变选择性地影响促运动活性,而不影响其与LRP-1受体的结合。重复每个实验两次。数据表示为平均值±SEM。*p<0.0。
具体实施方式
本文中引用的所有参考文献都以引用的方式整体并入,如同完整阐述一般。除非另外定义,否则本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义。Allen等人,Remington:The Science and Practice of Pharmacy第22版,Pharmaceutical Press(2012年9月15日);Hornyak等人,Introduction to Nanoscienceand Nanotechnology,CRC Press(2008);Singleton和Sainsbury,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第3版,修订版,J.Wiley&Sons(New York,NY2006);Smith,March’s Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms andStructure第7版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013);Singleton,Dictionary of DNA andGenome Technology第3版,Wiley-Blackwell(2012年11月28日);以及Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(Cold Spring Harbor,NY 2012),为本领域技术人员提供了本申请中所用的许多术语的通用指南。关于如何制备抗体的参考文献,参看Greenfield,Antibodies ALaboratory Manual第2版,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013);和Milstein,Derivation of specific antibody-producing tissue cultureand tumor lines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976年7月,6(7):511-9;Queen和Selick,Humanized immunoglobulins,美国专利No.5,585,089(1996年12月);以及Riechmann等人,Reshaping human antibodies for therapy,Nature 1988年3月24日,332(6162):323-7。
关于儿科学的参考文献,参看Schwartz等人,The 5-Minute Pediatric Consult第4版,Lippincott Williams&Wilkins,(2005年6月16日);Robertson等人,The HarrietLane Handbook:A Manual for Pediatric House Officers第17版,Mosby(2005年6月24日);以及Hay等人,Current Diagnosis and Treatment in Pediatrics(CurrentPediatrics Diagnosis&Treatment)第18版,McGraw-Hill Medical(2006年9月25日)。
本领域技术人员将认识到与本文中描述的方法和材料类似或同等的许多方法和材料,所述方法和材料可用于实施本发明。实际上,本发明决不限于所描述的方法和材料。为了本发明,下文定义以下术语。
如本文所用,术语“施用”是指如本文中公开的药剂通过一种使所述药剂至少部分定位在所需部位的方法或途径放入受试者中。
“有益结果”可包括(但决不限于)减轻或缓解疾病病状的严重程度、预防疾病病状恶化、治愈疾病病状、预防疾病病状发展、降低患者发展疾病病状的机会以及延长患者生命或预期寿命。有益或所需临床结果包括(但不限于)缓解一种或多种症状、降低缺陷程度、稳定癌症进展状态(即不恶化)、延迟或减缓转移或侵袭以及改善或缓和与癌症有关的症状。治疗还包括与未接受治疗的受试者相比,死亡率下降或受试者的寿命增加。
如本文所用,“病状”和“疾病病状”可包括但(决不限于)癌症的任何形式。在一实施方案中,癌症是过度表达HIF-1α的癌症。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要进行诊断、预后或治疗的任何受试者,尤其是哺乳动物受试者。在一些实施方案中,受试者患有癌症。在一些实施方案中,受试者在受试者一生中的某些时刻患有癌症。在各种实施方案中,受试者的癌症处于症状缓解中,复发,或非复发。受试者可以是人类或动物。通常,动物是脊椎动物,例如灵长类动物、啮齿类动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猿和猕猴,例如恒河猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动动包括母牛、马、猪、鹿、美洲野牛、水牛、猫科物种(例如家猫)和犬科物种(例如狗、狐狸、狼)。术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。在一实施方案中,受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或母牛,(但不限于)这些实例。另外,本文中描述的方法可用于治疗家畜和/或宠物。该术语不表示具体年龄或性别。因此,成年和新生的受试者以及胎儿,无论雄性抑或雌性,都意图包括在此术语的范围内。
如本文所用,“哺乳动物”是指哺乳类的任何成员,包括(但不限于)人类、家畜、农畜、动物园动物、运动动物、宠物(例如狗、猫、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、母牛);灵长类动物,例如猿、猴、猩猩和黑猩猩;犬科动物,例如狗和狼;猫科动物,例如猫、狮子和虎;马科动物,例如马、驴和斑马;食用肉畜,例如母牛、猪和绵羊;有蹄类动物,例如鹿和长颈鹿;啮齿类动物,例如小鼠、大鼠、仓鼠和天竺鼠等等。在某些实施方案中,哺乳动物是人类受试者。该术语不表示具体年龄或性别。因此,成年和新生的受试者以及胎儿,无论雄性抑或雌性,都意图包括在此术语的范围内。
如本文所用,“治疗剂”是指用于例如治疗、抑制、预防疾病、减轻疾病的影响、降低疾病的严重程度、降低发展疾病的可能性、减缓疾病进展和/或治愈疾病的药剂。治疗剂所靶向的疾病包括(但不限于)癌症。
如本文所用,术语“有效量”是指包含如本文中公开的一种或多种肽或其突变体、变异体、类似物或衍生物的药物组合物减少疾病或病症的至少一种或更多种症状的量,且是指药理学组合物足以提供预期效果的量。如本文所用,短语“治疗有效量”意指组合物在适用于任何医学治疗的合理益处/风险比下足以治疗病症的量。
治疗上或预防上症状的明显减少是与对照物或未治疗的受试者或在施用肽前的受试者状态相比,所测量的参数例如变化达至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%、至少约125%、至少约150%或更多。测量或可测量的参数包括临床可检测的疾病标记物,例如升高或减少的生物标记物含量,以及与临床公认的纤维化和/或发炎的症状或标记物尺度相关的参数。然而,应了解,如本文中公开的组合物和配方的总日用量将由主治医师在合理医学判断内决定。所需要的准确量将取决于例如所治疗的疾病类型、受试者的性别、年龄和体重等因素而变化。
如本文所用,“化学治疗药物”或“化学治疗剂”是指用于治疗癌症的药物,包括(但不限于)白蛋白结合的太平洋紫杉醇(paclitaxel)(nab-太平洋紫杉醇)、放线菌素(Actinomycin)、阿利维A酸(Alitretinoin)、全反式视黄酸(All-trans retinoic acid)、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、贝伐单抗(Bevacizumab)、博莱霉素(Bexatotene)、博莱霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、西妥昔单抗(Cetuximab)、顺铂(Cisplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、氟尿嘧啶(Cytarabine)、道诺霉素(Daunorubicin)、多西紫杉醇(Docetaxel)、脱氧氟尿苷(Doxifluridine)、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、埃博霉素(Epothilone)、埃罗替尼(Erlotinib)、依托泊苷(Etoposide)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、伊马替尼(Imatinib)、依匹木单抗(Ipilimumab)、依立替康(Irinotecan)、二氯甲基二乙胺(Mechlorethamine)、美法仑(Melphalan)、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、欧瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕尼单抗(Panitumab)、培美曲塞(Pemetrexed)、利妥昔单抗(Rituximab)、塔福泊苷(Tafluposide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Tioguanine)、托泊替康(Topotecan)、维甲酸(Tretinoin)、戊柔比星(Valrubicin)、维罗非尼(Vemurafenib)、长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、伏瑞斯特(Vorinostat)、罗咪酯肽(Romidepsin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、氟尿苷(Floxuridine)、氟达拉滨(Fludarabine)、喷司他丁(Pentostatin)、丝裂霉素(Mitomycin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、雌氮芥(Estramustine)或其组合。
如本文所用,术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善”是指治疗性治疗,其中目标是逆转、缓和、改善、抑制、减缓或终止与疾病或病症有关的病状的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或缓和例如癌症等病状、疾病或病症的至少一个副作用或症状。如果一种或多种症状或临床标记物减少,那么治疗一般是“有效”的。或者,如果疾病的进展减弱或停止,那么治疗是“有效”的。也就是说,“治疗”不仅包括症状或标记物的改善,而且还包括在缺乏治疗时预期的症状的进展或恶化至少减缓的停止。有益或所需临床结果包括(但不限于)缓解一种或多种症状、降低疾病程度、稳定疾病状态(即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及症状缓解(无论部分抑或全部),无论这些可检测抑或不可检测。术语疾病的“治疗”还包括减轻疾病的症状或副作用(包括缓解性治疗)。
如本文所用,“癌症”或“肿瘤”是指细胞不受控制的生长,其干扰身体器官和系统的正常功能。患有癌症或肿瘤的受试者是受试者体内存在可客观测量的癌细胞的受试者。此定义中包括良性和恶性癌症,以及休眠肿瘤或微转移。从原始位置迁移并在重要器官播种的癌症最终可通过患病器官的功能退化引起受试者死亡。如本文所用,术语“癌瘤”是指起于上皮细胞的癌症。如本文所用,术语“侵袭性”是指能够渗透和破坏周围组织。黑素瘤是皮肤肿瘤的一种侵袭形式。癌症的实例包括(但不限于)B细胞淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)和/或非霍奇金氏淋巴瘤)、脑肿瘤、乳癌、结肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、癌瘤、黑素瘤、头颈部癌、脑癌和前列腺癌,包括(但不限于)雄激素依赖性前列腺癌和非雄激素依赖性前列腺癌。
如本文所用,“HIF-1”是指低氧诱导因子-1。过度表达HIF-1α的癌症是指其中HIF-1α在肿瘤细胞中过度表达的癌症。至少15种器官中的大多数常见人类癌症过度表达HIF-1α(完整清单参见G.L.Semenza(2007)Drug Discovery Today,第12卷,第853-859页)。
如本文所用,“LRP-1”或“LRP1”是指低密度脂蛋白受体相关蛋白1,又称为α-2-巨球蛋白受体(A2MR)、阿朴脂蛋白E受体(APOER)或分化簇91(CD 91)。LRP-1是Hsp90α的受体。
如本文所用,“HSP90α”或“Hsp90α”是指热休克蛋白90α。
如本文所用,“经分离的Hsp90α”、“经纯化的Hsp90α”、“经分离的Hsp90α片段”或“经纯化的Hsp90α片段”是指表达并从非Hsp90α或其片段去除和/或从与Hsp90α或其片段有关或削弱其活性的细胞成分去除的Hsp90α蛋白质或其片段。
如本文所用,“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体和其片段,例如Fab、F(ab’)2、Fv和保留亲本抗体的抗原结合功能的其它片段。在一实施方案中,抗体特异性结合如本文中描述的Hsp90α。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体和其片段,例如Fab、F(ab’)2、Fv和保留亲本抗体的唾液酸酶活性的其它片段。抗体可以是重组抗体。术语“重组人类抗体”可包括使用重组DNA技术产生的人类抗体。
如本文所用,“单克隆抗体”是指具有均质抗体群体的抗体组合物。关于抗体的物种或来源,该术语不受限制,也不意图受其制备方式的限制。该术语涵盖整个免疫球蛋白以及片段,例如Fab、F(ab’)2、Fv和保留抗体的抗原结合功能的其它片段。任何哺乳动物物种的单克隆抗体都可以用于本发明。然而,实际上,抗体通常将来源于兔或鼠类,因为兔或鼠类细胞系可用于制造所需杂交细胞系或杂交瘤以产生单克隆抗体。“人类单克隆抗体”可包括例如通过重组方法,例如通过噬菌体库、通过淋巴细胞或通过杂交瘤细胞产生而产生的具有基本上或完全人类CDR氨基酸序列的单克隆抗体。
如本文所用,“人源化抗体”意指免疫球蛋白的构架区的至少一部分来源于人类免疫球蛋白序列。术语“人源化抗体”可意指来自蛋白质序列经修饰以增强与在人类中天然产生的抗体的相似性的非人类物种(例如小鼠)的抗体。
如本文所用,“单链抗体”是指通过确定结合抗体的结合域(重链与轻链)并供应容许维持结合功能的连接部分而制备的抗体。实质上,此形成了根本上缩短的抗体,仅仅具有结合抗原所需的那一部分可变域。Ladner等人的美国专利No.4,946,778中描述了单链抗体的确定和构筑。
术语“抗原结合区”可意指对标靶抗原,例如HSP90α蛋白质或其表位具有特异性结合亲和力的抗体区域。结合区可以是高变CDR或其功能部分。术语CDR的“功能部分”可意指CDR内对标靶抗原展示特异性亲和力的序列。CDR的功能部分可包含特异性结合Hsp90α蛋白质的配体。
术语“CDR”可意指可变重链与轻链中的高变区。在抗体的重链与轻链每一者中可有一个、两个、三个或更多个CDR。通常,每个链上存在至少三个CDR,这些CDR在配置在一起时,形成抗原结合位点,即抗原结合或特异性反应的三维组合位点。然而,已经假定,一些抗体的重链中可能有四个CDR。
CDR的定义还包括当彼此比较时重叠的氨基酸残基或氨基酸残基子集。涵盖具体CDR或其功能部分的准确残基数目将取决于CDR的序列和尺寸变化。本领域技术人员可以按常规,在假定抗体的可变区氨基酸序列下,确定哪些残基构成具体CDR。
抗体的术语“功能片段”可意指保留功能活性的抗体的一部分。功能活性可以是例如抗原结合活性或特异性。功能活性还可以是例如由抗体恒定区提供的效应功能。术语“功能片段”还意图包括例如通过蛋白酶消化或还原人类单克隆抗体和通过本领域技术人员已知的重组DNA方法产生的片段。人类单克隆抗体功能片段包括例如个别重链或轻链和其片段,例如VL、VH和Fd;单价片段,例如Fv、Fab和Fab';二价片段,例如F(ab')2;单链Fv(scFv);和Fc片段。
术语“VL片段”可意指人类单克隆抗体的轻链的片段,所述片段包括轻链可变区全部或一部分,包括CDR在内。VL片段可进一步包括轻链恒定区序列。
术语“VH片段”可意指人类单克隆抗体的重链的片段,所述片段包括重链可变区全部或一部分,包括CDR在内。
术语“Fd片段”可意指偶合于重链可变区和恒定区的轻链可变区和恒定区,即VL、CL和VH、CH-1。
术语“Fv片段”可意谓人类单克隆抗体的单价抗原结合片段,包括重链和轻链的可变区全部或一部分,且缺乏重链和轻链的恒定区。重链和轻链的可变区包括例如CDR。举例来说,Fv片段包括重链与轻链的约110个氨基酸的氨基端可变区全部或一部分。
术语“Fab片段”可意谓比Fv片段大的人类单克隆抗体的单价抗原结合片段。举例来说,Fab片段包括重链和轻链的可变区,以及第一恒定域全部或一部分。因此,Fab片段另外包括例如重链和轻链的约110至约220个氨基酸残基。
术语“Fab'片段”可意谓比Fab片段大的人类单克隆抗体的单价抗原结合片段。举例来说,Fab'片段包括轻链全部、重链可变区全部以及重链的第一和第二恒定域全部或一部分。举例来说,Fab'片段可另外包括重链的氨基酸残基220至330中的一些或全部。
术语“F(ab')2片段”可意指人类单克隆抗体的二价抗原结合片段。F(ab')2片段包括例如两个重链和两个轻链的可变区全部或一部分,并可进一步包括两个重链和两个轻链的第一恒定域全部或一部分。
术语“单链Fv(scFv)”可意谓用短连接肽连接的重链(VH)与轻链(VL)的可变区的融合物。
术语“双特异性抗体(BsAb)”可意指包含两个彼此由较短的连接肽连接的scFv的双特异性抗体。
热休克蛋白-90(Hsp90)被称为三磷酸腺苷酶驱动的细胞内伴侣蛋白,并有望成为抗肿瘤治疗剂的标靶,不过在患者临床试验中靶向Hsp90蛋白质的三磷酸腺苷酶的小分子抑制剂尚未获得成功。尽管如此,仍有极少的证据证明Hsp90的细胞内抑或分泌形式起着主要作用且因此应在治疗上被靶向。本发明人发现∶1)是Hsp90α的分泌形式(不是细胞内Hsp90α,也不是细胞内或细胞外Hsp90β)负责肿瘤细胞运动性和侵袭;2)Hsp90α中的Lys-270和Lys-277决定了分泌的Hsp90α的独特功能且经两个赖胺酸取代足以将Hsp90β转变成Hsp90α样分子;3)新研发的靶向肿瘤分泌的Hsp90α中的关键表位F-5的单克隆抗体1G6-D7和5C4-D展示强治疗潜能。此研究表明选择性靶向肿瘤分泌的Hsp90α是一种更安全且更有效的抗癌方法。
本文中提供了治疗有需要的受试者的过度表达HIF-1α的癌症的方法。所述方法包括提供包含Hsp90α抑制剂的组合物,并向受试者施用治疗有效量的组合物,以便治疗受试者的过度表达HIF-1α的癌症。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP的1G6-D7单克隆抗体或其功能片段。在另一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ的5C4-D4单克隆抗体或其功能片段。在一个实施方案中,癌症是乳癌。在另一实施方案中,癌症是肺癌。
本文中还提供了抑制有需要的受试者的过度表达HIF-1α的癌症的方法。所述方法包括提供包含Hsp90α抑制剂的组合物,并向受试者施用治疗有效量的组合物,以便治疗受试者的过度表达HIF-1α的癌症。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP的1G6-D7单克隆抗体或其功能片段。在另一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ的5C4-D4单克隆抗体或其功能片段。在一实施方案中,癌症是乳癌。在另一实施方案中,癌症是肺癌。
本文中还提供了预防有需要的受试者的过度表达HIF-1α的癌症的转移的方法。所述方法包括提供包含Hsp90α抑制剂的组合物,并向受试者施用治疗有效量的组合物,以便预防受试者的过度表达HIF-1α的癌症的转移。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP的1G6-D7单克隆抗体或其功能片段。在另一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ的5C4-D4单克隆抗体或其功能片段。在一实施方案中,癌症是乳癌。在另一实施方案中,癌症是肺癌。
本文中还提供了降低有需要的受试者的过度表达HIF-1α的癌症的严重程度的方法。所述方法包括提供包含Hsp90α抑制剂的组合物,并向受试者施用治疗有效量的组合物,以便降低受试者的过度表达HIF-1α的癌症的严重程度。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP的1G6-D7单克隆抗体。在另一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ的5C4-D4单克隆抗体。在一实施方案中,癌症是乳癌。在另一实施方案中,癌症是肺癌。
在各种实施方案中,本文中描述的方法进一步包括提供其它癌症治疗(同时或相继)。其它癌症治疗包括(但不限于)主动监视、观测、外科手术、化学疗法、免疫疗法、放射疗法(例如外束放射、立体定向放射外科(γ刀)和分次立体定向放射疗法(FSR))、病灶疗法、全身疗法、疫苗疗法、病毒疗法、分子靶向疗法或其组合。在一些实施方案中,本文中描述的抗体结合于治疗剂,以形成例如抗体-蛋白质毒素结合物(免疫毒素)、抗体-放射性核素结合物、抗体-药物结合物(Teicher和Chari,Clin Cancer Re 2011年10月15日,第17卷;6389-6397)。
在一些实施方案中,化学治疗剂可选自以下中的任一者或多者:细胞毒性抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、烷基化剂、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、核苷类似物、植物碱和毒素;以及其合成衍生物。示例性化合物包括(但不限于)烷基化剂∶曲奥舒凡(treosulfan)和曲磷胺(trofosfamide);植物碱∶长春花碱、太平洋紫杉醇、多西紫杉醇;DNA拓扑异构酶抑制剂∶多柔比星、表柔比星、依托泊苷、喜树碱、托泊替康、依立替康、替尼泊苷、克立那托(crisnatol)和丝裂霉素;抗叶酸剂∶甲氨蝶呤、霉酚酸和羟基脲;嘧啶类似物:5-氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷和阿糖胞苷;嘌呤类似物∶巯基嘌呤和硫鸟嘌呤;DNA抗代谢物∶2’-脱氧-5-氟尿苷、阿非迪霉素甘氨酸酯(aphidicolin glycinate)和吡唑并咪唑;和抗有丝分裂剂∶软海绵素、秋水仙碱和根霉素(rhizoxin)。还可以使用包含一种或多种化学治疗剂的组合物(例如FLAG、CHOP)。FLAG包含氟达拉滨、阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和强的松(prednisone)。在另一实施方案中,使用PARP(例如PARP-1和/或PARP-2)抑制剂且此类抑制剂为本领域中众所周知(例如奥拉帕尼(Olaparib)、ABT-888、BSI-201、BGP-15(N-Gene Research Laboratories公司);INO-1001(Inotek Pharmaceuticals公司);PJ34(Soriano等人,2001;Pacher等人,2002b);3-氨基苯甲酰胺(Trevigen);4-胺基-1,8-萘二甲酰亚胺(Trevigen);6(5H)-菲啶酮(Trevigen);苯甲酰胺(美国专利Re.36,397);和NU1025(Bowman等人)。
在各种实施方案中,其它疗法包括例如放射疗法。用于放射疗法的放射线可以是电离辐射。放射疗法还可以是γ射线、X射线或质子束。放射疗法的实例包括(但不限于)外部束放射疗法、间质植入放射性同位素(I-125、钯、铱)、放射性同位素(例如锶-89)、胸部放射疗法、腹膜内P-32放射疗法和/或全腹部和骨盆放射疗法。关于放射疗法的一般概述,参见Hellman,第16章:Principles of Cancer Management:Radiation Therapy,第6版,2001,DeVita等人编辑,J.B.Lippencott公司,Philadelphia。放射疗法可以呈外束放射线或其中放射线从远端源引导而来的远程疗法施用。放射治疗还可以呈其中放射源放在身体内接近癌细胞或肿瘤块处的内部疗法或近距疗法施用。还涵盖光动力学疗法的使用,光动力学疗法包含施用光敏剂,例如血卟啉和其衍生物、维替泊芬(Vertoporfin,BPD-MA)、酞菁、光敏剂Pc4、脱甲氧基-竹红菌素A;和2BA-2-DMHA。
在各种实施方案中,其它疗法包括例如免疫疗法。免疫疗法可以包含例如癌症疫苗和/或敏化抗原呈递细胞的使用。在一些实施方案中,疗法包括靶向肿瘤微环境中的细胞或靶向免疫细胞。免疫疗法可以涉及用于短期保护宿主的被动免疫,此通过施用预先形成的针对癌症抗原或疾病抗原的抗体(例如向肿瘤抗原施用单克隆抗体,视情况连接于化学治疗剂或毒素)来实现。免疫疗法还可以集中于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别的表位。
在各种实施方案中,其它疗法包括例如激素疗法。激素治疗性治疗可以包含例如激素促效剂、激素拮抗剂(例如氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、乙酸亮脯利特(leuprolide acetate)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂以及类固醇(例如地塞米松、类视色素、类德尔素(deltoid)、倍他米松(betamethasone)、氢化可的松(cortisol)、可的松、强的松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质素类、雌激素、睾丸激素、孕激素)、维生素A衍生物(例如全反式视黄酸(ATRA));维生素D3类似物;抗促孕激素(例如米非司酮(mifepristone)、奥那司酮(onapristone))或抗雄激素物质(例如乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate))。
在各种实施方案中,Hsp90α抑制剂(例如单克隆抗体1G6-D7、5C4-D4或其组合)的有效量是以下中的任一者或多者:约0.01至0.05微克/公斤/天、0.05-0.1微克/公斤/天、0.1至0.5微克/公斤/天、0.5至5微克/公斤/天、5至10微克/公斤/天、10至20微克/公斤/天、20至50微克/公斤/天、50至100微克/公斤/天、100至150微克/公斤/天、150至200微克/公斤/天、200至250微克/公斤/天、250至300微克/公斤/天、300至350微克/公斤/天、350至400微克/公斤/天、400至500微克/公斤/天、500至600微克/公斤/天、600至700微克/公斤/天、700至800微克/公斤/天、800至900微克/公斤/天、900至1000微克/公斤/天、0.01至0.05毫克/公斤/天、0.05-0.1毫克/公斤/天、0.1至0.5毫克/公斤/天、0.5至1毫克/公斤/天、1至5毫克/公斤/天、5至10毫克/公斤/天、10至15毫克/公斤/天、15至20毫克/公斤/天、20至50毫克/公斤/天、50至100毫克/公斤/天、100至200毫克/公斤/天、200至300毫克/公斤/天、300至400毫克/公斤/天、400至500毫克/公斤/天、500至600毫克/公斤/天、600至700毫克/公斤/天、700至800毫克/公斤/天、800至900毫克/公斤/天、900至1000毫克/公斤/天或其组合。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂(例如1G6-D7和/或5C4-D4抗体或其片段)的有效量是约10-30毫克/公斤/天。Hsp90α抑制剂的有效量的典型剂量可以在制造商推荐的其中使用已知的治疗化合物的范围内,以及如熟练技术人员,通过体外反应或在动物模型中的反应所指示。此类剂量通常可以在浓度或量上减少多达约一个数量级,而不丧失相关生物活性。实际剂量可以取决于医师的判断、患者的状况以及治疗方法的有效性,有效性是基于例如相关培养细胞或组织培养的组织样品(例如活组织检查的恶性肿瘤)的体外反应,或适当动物模型中观测到的反应。在各种实施方案中,包含Hsp90α抑制剂的本发明的组合物可以一天一次(SID/QD)、一天两次(BID)、一天三次(TID)、一天四次(QID)或更多次施用,以便向受试者施用有效量的Hsp90α抑制剂,其中有效量是本文中描述的任一种或多种剂量。
在本文中描述的方法的各种实施方案中,治疗组合物包含Hsp90α抑制剂和靶向癌细胞表面上的标记物的靶向元件。可由本文中描述的组合物的靶向元件靶向的癌细胞表面上的标记物包括(但不限于)4-1BB、5T4、腺癌抗原、α-甲胎蛋白、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EGFRVIII、EpCAM、CD3、FAP、纤维结合蛋白外结构域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人类分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整联蛋白α5β1、整联蛋白αvβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、ROR1、ROR2、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2或波形蛋白。癌症所特有的其它抗原将为本领域技术人员显而易见,并可以结合本发明的替代实施方案使用。
药物组合物
在各种实施方案中,本发明提供了药物组合物,所述药物组合物包括药学上可接受的赋形剂以及治疗有效量的Hsp90α抑制剂,以便治疗、抑制有需要的受试者的过度表达HIF-1α的癌症、预防癌症转移和/或降低癌症严重程度。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP的1G6-D7单克隆抗体。在另一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ的5C4-D4单克隆抗体。
“药学上可接受的赋形剂”意谓可用于制备一般安全、无毒并合乎需要的药物组合物的赋形剂,并包括适用于兽医学用途以及人类药学用途的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体或在气溶胶组合物的情况下,是气态的。
在各种实施方案中,根据本发明的药物组合物可以调配成经由任何施用途径递送。“施用途径”可指本领域中已知的任何施用通路,包括(但不限于)气溶胶、经鼻、口腔、经粘膜、经皮、不经肠或经肠道。“不经肠”是指一般与注射有关的施用途径,包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。经由不经肠途径,组合物可以呈溶液或悬浮液形式用于输注或注射,或呈冻干粉末。经由不经肠途径,组合物可以呈溶液或悬浮液形式用于输注或注射。经由经肠道途径,药物组合物可以呈片剂、凝胶胶囊、糖衣片剂、糖浆、悬浮液、溶液、粉末、颗粒、乳液、微球体或纳米球或脂囊泡或聚合物囊泡的形式,允许控制释放。通常,抗体通过静脉内或腹膜内注射来施用。用于这些施用的方法为本领域技术人员已知。
根据本发明的药物组合物还可以含有任何药学上可接受的载剂。如本文所用,“药学上可接受的载剂”是指参与将相关化合物从一个组织、器官或身体部分运载或输送至另一个组织、器官或身体部分的药学上可接受的物质、组合物或媒介物。举例来说,载剂可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封物质或其组合。载剂的每种组分必须是“药学上可接受的”,因为所述组分必须与配方的其它成分相容。所述组分还必须适于与其可能接触的任何组织或器官接触使用,意指所述组分不能带有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或过度超过其治疗益处的任何其它并发症的风险。
根据本发明的药物组合物还可以囊封、制片或制备成乳液或糖浆中供口服。可以添加药学上可接受的固体或液体载剂以增强或稳定组合物,或促进组合物的制备。液体载剂包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇和水。固体载剂包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂或凝胶。载剂还可以包括持续释放物质,例如单独或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
按照习知药学技术,对于片剂形式来说,包括研磨、混合、造粒和必要时压缩,或对于硬明胶胶囊形式来说,包括研磨、混合和填充,来制造药物制剂。当使用液体载剂时,制剂将呈糖浆、酏剂、乳液或水性或非水性悬浮液形式。此类液体配方可以直接经口施用或填充至软明胶胶囊中。
根据本发明的药物组合物可以呈治疗有效量递送。准确的治疗有效量是在既定受试者中,根据治疗功效,将产生最有效结果的组合物的量。此量将取决于多种因素变化,包括(但不限于)治疗化合物的特征(包括活性、药物动力学、药效学和生物利用率)、受试者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、整体身体状态、对所给剂量的反应以及药物治疗类型)、配方中的药学上可接受的载剂的特性以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验,例如通过监测受试者对施用化合物的反应并因此调整剂量来确定治疗有效量。关于额外指导,参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro编辑第20版,Williams&Wilkins PA,USA)(2000)。
在施用至患者前,配方制剂可以添加至抗体(例如本文中描述的Hsp90α抑制剂)。液体配方可为优选。举例来说,这些配方制剂可以包括油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲液、白蛋白、表面活性剂、膨胀剂或其组合。
碳水化合物配方制剂包括糖或糖醇,例如单糖、二糖或聚糖或水溶性葡聚糖。糖类或葡聚糖可以包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、右旋糖酐、普鲁兰多糖、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素或其混合物。“糖醇”被定义为具有--OH基团的C4至C8烃,并包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、丙三醇和阿拉伯糖醇。上述这些糖或糖醇可以个别或组合使用。对用量无固定限制,只要糖或糖醇可溶于水性制剂即可。在一个实施方案中,糖或糖醇浓度在1.0w/v%与7.0w/v%之间,更优选在2.0与6.0w/v%之间。
氨基酸配方制剂包括肉毒碱、精氨酸和甜菜碱的左旋(L)形式;然而,可以添加其它氨基酸。
在一些实施方案中,作为配方制剂的聚合物包括平均分子量在2,000与3,000之间的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),或平均分子量在3,000与5,000之间的聚乙二醇(PEG)。
此外,优选在组合物中使用缓冲液,以将冻干前或复原后溶液中的pH值改变减至最少。可以使用大多数生理缓冲液,包括(但不限于)柠檬酸盐、磷酸盐、丁二酸盐和谷氨酸盐缓冲液或其混合物。在一些实施方案中,浓度是0.01至0.3摩尔浓度。可以添加至调配物的表面活性剂展示于EP No.270,799和268,110中。
另外,抗体(例如本文中描述的Hsp90α特异性抗体)可以通过共价结合于聚合物进行化学改性,以例如增加其循环半衰期。优选聚合物和聚合物附接至肽的方法展示于美国专利No.4,766,106、4,179,337、4,495,285和4,609,546中,这些专利都以引用的方式整体并入本文中。优选聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下可溶于水中,且在一些实施方案中,具有1000与40,000之间,2000与20,000之间,或3,000与12,000之间的平均分子量。在一些实施方案中,PEG具有至少一个羟基,例如末端羟基。羟基可活化以与抑制剂上的游离氨基反应。然而,将了解,反应基团的类型和量可以变化,以实现本发明的共价结合的PEG/抗体。
水溶性聚氧乙基化多元醇也可用于本发明。所述水溶性聚氧乙基化多元醇包括聚氧乙基化山梨糖醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化丙三醇(POG)等。POG是优选的。一个原因是因为聚氧乙基化丙三醇的丙三醇主链是例如动物和人类中单酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯中天然存在的相同主链。因此,此分支未必在体内被视为外来物。POG的分子量在与PEG相同的范围内。POG的结构展示于Knauf等人,1988,J.Bio.Chem.263:15064-15070中且POG/IL C 2结合物的讨论可见于美国专利No.4,766,106中,两者都以引用的方式整体并入本文中。
用于增加循环半衰期的另一个药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统的方法论述于Gabizon等人,Cancer Research(1982)42:4734;Cafiso,Biochem Biophys Acta(1981)649:129;以及Szoka,Ann Rev Biophys Eng(1980)9:467中。其它药物递送系统为本领域中已知并描述于例如Poznansky等人,Drug Delivery Systems(R.L.Juliano编辑,Oxford,N.Y.1980),第253-315页;M.L.Poznansky,Pharm Revs(1984)36:277。
在制备液体药物组合物后,所述组合物可以冻干以防降解并保持无菌。本领域技术人员已知将液体组合物冻干的方法。在即将使用时,组合物可以用可以包括其它成分的无菌稀释剂(例如林格氏溶液(Ringer’s solution)、蒸馏水或无菌盐水)复原。在复原后,使用本领域技术人员已知的那些方法,向受试者施用组合物。
施用剂量和模式将取决于个体。一般来说,施用组合物,以使得抗体以1mg/kg与20mg/kg之间、20mg/kg与10mg/kg之间、1mg/kg与7mg/kg之间的剂量给与。在一些实施方案中,其呈大丸剂剂量给与,以增加循环水平达10-20倍并在大丸剂剂量后历时4-6小时。在大丸剂剂量后,还可以使用连续输注。如果是这样的话,抗体可以呈5毫克/公斤/分钟与20毫克/公斤/分钟之间或7毫克/公斤/分钟与15毫克/公斤/分钟之间的剂量输注。
本发明的试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒,所述试剂盒治疗、抑制有需要的受试者的过度表达HIF-1α的癌症、预防癌症转移和/或降低癌症严重程度。该试剂盒包含药物组合物,该药物组合物包括药学上可接受的赋形剂以及治疗有效量的Hsp90α抑制剂,以便治疗、抑制有需要的受试者的过度表达HIF-1α的癌症、预防癌症转移和/或降低癌症严重程度。在一实施方案中,癌症是肺癌。在另一实施方案中,癌症是乳癌。在一些实施方案中,Hsp90α抑制剂包括(但不限于)小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子中的任一者或多者。在各种实施方案中,抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。在一实施方案中,抑制剂是靶向Hsp90α的Lys-270、Lys-277或其组合的核酸分子(例如siRNA)。在另一实施方案中,抑制剂是特异性识别且结合Hsp90α的单克隆抗体。在一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP的1G6-D7单克隆抗体。在另一实施方案中,抗体是结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ的5C4-D4单克隆抗体。
试剂盒是包括至少一种本发明组合物在内的物质或组分的集合。因此,在一些实施方案中,试剂盒含有包括通过本文中描述的方法,如上所述产生的具有唾液酸酶活性的催化活性抗体的组合物。
本发明的试剂盒中配置的组分的准确性质取决于其所欲目的。在一个实施方案中,试剂盒被配置成具体用于人类受试者。在其它实施方案中,试剂盒被配置成用于兽医学应用,治疗例如(但不限于)农畜、家畜和实验室动物等受试者。
使用说明书可以包括在试剂盒中。“使用说明书”通常包括描述用于使用试剂盒的组分实现所需结果,例如治疗、抑制受试者的自身免疫疾病和/或癌症、减少自身免疫疾病和/或癌症的症状和/或促进自身免疫疾病和/或癌症的预防的技术的有形表示。任选地,试剂盒还含有其它有用组分,例如测量工具、稀释剂、缓冲液、药学上可接受的载剂、注射器或如本领域技术人员容易认识到的其它适用的随身用具。
集合在试剂盒中的物质或组分可以提供给开业医生,以保留其可操作性和效用的任何方便和适合的方式存储。举例来说,组分可以呈溶解、脱水或冻干形式;组分可以提供在室温、冷藏温度或冷冻温度下。组分通常含于适合的包装材料中。如本文中采用,短语“包装材料”是指一种或多种用于容纳试剂盒的内含物,例如本发明的组合物等的物理结构。包装材料通过众所周知的方法构造,优选提供无菌的无污染的环境。如本文所用,术语“包装”是指能够容纳个别试剂盒组分的适合的固体基质或材料,例如玻璃、塑料、纸、箔等等。因此,举例来说,包装可以是瓶子,瓶子用于含有适合量的含有通过本文中描述的方法产生的具有唾液酸酶活性的催化活性的抗体的本发明组合物。包装材料一般具有外部标记,该外部标记指示试剂盒和/或其组分的内含物和/或目的。
实施例
本发明人确定了Hsp90α和Hsp90β中的哪个同工型,以及这些蛋白质的什么位置,细胞外抑或细胞内,直接负责癌细胞迁移、侵袭和肿瘤形成。本发明人还鉴别出了决定Hsp90蛋白质的细胞外功能的分子基础。最后,新研发的靶向癌细胞分泌的Hsp90α的关键表位的单克隆抗体1G6-D7和5C4-D4展示治疗癌症的强治疗潜能。
实施例1
实验方法
使用八种人类乳癌细胞系和一种对照(未转化)乳腺上皮细胞系(图S1A)。所有细胞都在补充有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养,以及对于一些细胞系来说,使用ATCC建议的培养基培养。在增殖和侵袭分析法中,使用DMEM或特定培养基,例如McCoy’s5A,未观测到显著差异。在实验前,细胞被剥夺血清并在无血清条件下培育16小时。接着这些细胞经受细胞生长曲线、细胞运动性和细胞侵袭分析。用于蛋白质印迹分析的抗Hsp90α特异性抗体是从Calbiochem(Darmstadt,Germany)购买。抗Hsp90β特异性抗体(中和以及蛋白质印迹)来自于StressMarq Biosciences公司(Victoria,BC Canada)。这些抗体在Hsp90α与Hsp90β之间不交叉反应。本文中描述了单克隆抗体1G6-D7和5C4-D4的研发。胶体金珠粒是从Sigma-Aldrich(St.Louis,MI)购买。XL-10Gold超感受态细胞(XL-10Gold)来自于Stratagene(La Jolla,CA)。用于在大肠杆菌中产生蛋白质的pET系统(pET15b)是从Novagen(Madison.WI)购买。基质胶侵袭室(354480)和方案来自于BD Biosciences(Bedford,MA)。
单克隆抗体的产生
抗原制备∶将F-5片段的cDNA克隆至pET-15b his-标签表达系统(Novagen)中并在BL-21-codonPlus(DE3)-RP细菌中,回应于IPTG诱发而进行表达。使经亲和力纯化的His-F-5蛋白质进行凝血酶消化(RECOMT,Sigma),以去除His标签并过滤/洗涤,以恢复至等渗状态。无His标签的F-5(泳道6)通过FPLC,经分子筛柱进一步纯化,并使用胶体金迁移分析法,测试在原代人类角化细胞和皮肤成纤维细胞上的促运动活性。高度纯化和功能性的F-5蛋白质用于小鼠中免疫接种。
免疫接种:以每次注射150mg F-5蛋白质将三只小鼠免疫接种。在抗血清筛选后,选择一只小鼠(#1)进行融合和产生单克隆抗体的细胞的筛选。抗血清展示与F-5抗原的反应性,且大部分阳性克隆是IgG型。
前血清和抗血清测试∶按照上述ELISA筛选,使用蛋白质印迹和中和(F-5刺激的人类皮肤细胞迁移的抑制)分析法测试来自三只免疫接种的小鼠的抗血清。来自三只F-5免疫接种的小鼠中的每一只的抗血清都强烈识别F-5蛋白质。在氧正常(21%O2)下,人类皮肤成纤维细胞展示基线迁移,且低氧(1%O2)促进迁移。所有三种抗血清,而不是免疫前血清,抑制低氧诱发的人类皮肤成纤维细胞迁移。
融合与筛选:选择在所有三个分析法(即ELISA、蛋白质印迹和细胞迁移的抑制)中血清展示最强反应的小鼠的脾细胞用于融合(与HL-1骨髓瘤细胞)并经受连续筛选过程,以获得“母本”克隆。使用ELISA筛选大约800个融合克隆,并缩小至24个母本克隆。这24个克隆进行进一步ELISA和功能分析法(即Hsp90α触发的细胞迁移的抑制),产生四个母本克隆。
同种型与表位定位:最后确定两个杂交瘤克隆1G6-D7和5C4-D4并在含有所有必需生长因子和营养素的HL-1培养基中培养,直到所述克隆生长至约2.5×106个细胞/毫升密度。将细胞培养物移至无血清培养基并再培育5天。收集条件培养基并通过蛋白G琼脂糖亲和色谱法纯化抗体。发现条件培养基通常含有3-5μg/ml IgG。
使用小鼠单克隆抗体同种型分析试剂盒(IsoStrip,目录号11493027001)对来自两个克隆的纯化抗体进行同种型定位。发现一种mAb 1G6-D7为IgG1κ且第二mAb 5C4-D4为IgG2aκ。将这两个mAb送至GenScript(Piscataway,NJ)进行表位定位。1G6-D7和5C4-D4的表位分别定位在F-5区内的TKPIWTRNP和VKHFSVEGQ处。
用于上调或下调标靶基因的慢病毒系统
pRRLsinh-CMV系统用于过度表达外源性Hsp90基因。pHR-CMV-puro RNAi递送系统用于递送针对Hsp90α的shRNA,GGAAAGAGCTGCATATTAA(有义),和针对Hsp90β的shRNA,GCATCTATCGCATGATCAA(有义)。
Hsp90α和Hsp90β基因的CRISPR-Cas9(质粒和转染)敲除
利用先前报道的指导RNA(gRNA)合成方案(Mali等人,2013Science 339,823-826)。首先,根据在人类Hsp90α基因(基因ID:3320)和人类Hsp90β基因(基因ID:3326)的标靶位点附近的形式5’-N20NGG-3’,鉴别出所有23bp基因组位点,选择以下基因组位点∶5’-GACCCAAGACCAACCGATGGAGG-3’(Hsp90α)或5'-GCTGATCTCATAAATAATTTGGG-3'(Hsp90β),用于合成gRNA。接着,将所选标靶序列的5’-20bp,即5’-GACCCAAGACCAACCGATGG-3’(Hsp90α)或5'-GCTGATCTCA TAAATAATTT-3'(Hsp90β)并入(斜体)载有gRNA表达所需的所有组件的455bp DNA片段,即U6启动子+标靶序列+指导RNA骨架+终止信号,如下∶TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACCCAAGACCAACCGATGG(Hsp90α)或GCTGATCTCATAAATAATTT(Hsp90β)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTA。整个DNA片段由Integrated DNATechnologies公司(Coraville,IA)合成为指导块(gBlock)。为构筑gRNA质粒,通过PCR使用引物(gRNA-块-EcoRI(F)∶GCGGAATTCTGTACAAAAAAGCAGGC和gRNA-块-EcoRI(R)∶GCGGAATTCTAATGCCAACTTTGTACA)扩增gBlock。对PCR扩增子进行纯化并经受EcoRI消化,且使用载体上的EcoRI位点亚克隆至PiggyBac载体中。
将大约1×106个MDA-MB-231细胞涂铺至6孔盘中的每个孔中,使用 LTX&Plus试剂(Life Technologies,Grand Island,NY)用gRNA构筑体和hCas9质粒进行转染。具有G418抗性基因的hCas9质粒、mPB转座酶和具有杀稻瘟菌素S脱氨基酶(BSD)抗性基因的PiggyBac载体是由Dr.Qilong Ying(USC Stem Cell Institute)慷慨提供。转染了24小时后,将培养基替换成含有10μg/ml BSD和2μg/ml G418的新鲜培养基,并再培育4-5天。每天监测细胞。在通过使用“环选殖”技术进行药物选择后,分离药物抗性克隆,并将克隆的细胞涂铺至60mm组织培养皿。在细胞克隆扩大后,通过蛋白质印迹来分析细胞中Hsp90家族蛋白质的含量。
无血清条件培养基的制备
用于培养细胞、改变培养基、培育时间、收集无血清条件培养基、浓缩以及通过西方免疫印迹进行分析的详细方案如先前所描述(Cheng等人,2008Mol Cell Biol 28,3344-3358)。
侵袭分析法
遵循如来自BD BioCoatTM基质胶侵袭室(354480)(BD Biosciences,Bedford,MA)的制造商的说明书所述的基本程序。Corning Biocoat基质胶侵袭室(目录号354480)用于侵袭研究。将0.5ml无血清培养基中血清饥饿的2×104个细胞接种至24孔组织培养盘中的细胞培养插入物中。每个插入物具有0.3平方厘米的表面积和经基质胶基质覆盖的8微米孔径PET膜(来自EHS小鼠肉瘤的溶解基底膜制剂)。在下室中,含有10%FBS的DMEM培养基用作化学引诱物。使用无菌钳并在细胞培养罩中,将插入物小心地转移至含有化学引诱物的孔中,避免任何气泡。整个设置在5%CO2下在37℃下培育22小时。第二天,通过用棉拭子刷洗,从插入物的上室去除未侵袭细胞。在插入物的底表面的侵袭细胞用100%甲醇固定并用结晶紫(1%,2分钟)染色。将插入物用蒸馏水洗涤两次以去除过量染色剂并进行风干。接着在显微镜(Zeiss Imager.A2)下以10x放大率在明视场下目测插入物。使用Axiovision软件,在不同视场中拍摄侵袭细胞,并计算每个插入物的五个显微镜视场。按照下式计算侵袭%∶
重组Hsp90(Hsp90α和Hsp90β以及突变体)的产生和纯化
按照制造商提供的方案,将pET15b-Hsp90构筑体转化至BL21-codonPlus(DE3)-RP感受态细胞(Stratagene)中。通过在到达生长对数期后添加0.25mM IPTG(Sigma,I5502-09)至细菌培养物来诱发蛋白质合成,并在25℃下再培育五小时。根据pET-15b系统制造商说明书(EMD biosciences公司,San Diego CA)加工细菌。首先通过Ni-NTA柱与HisBind纯化试剂盒(EMD biosciences公司)部分纯化his标记的蛋白质。蛋白质在Amicon Ultra离心柱(10x或50x)(Millipore,Billerica,MA)中浓缩至约4ml,过滤(0.22μm),接着负载至Superdex-200或75HiLoad凝胶过滤柱(GE healthcare,Piscataway,NJ)上并通过快速蛋白质液相色谱法(FPLC)分离。通过DPBS缓冲液(1ml/min)将肽溶离,浓缩至1mg/ml并于10%丙三醇-DPBS中存储在-80℃下。
圆二色性(CD)光谱法
通过四次超滤-稀释循环(1:10稀释),将Hsp90α、Hsp90β和突变变异体交换成5mMK2HPO4/KH2PO4溶液,pH 7.4。在25℃下在JASCO J-810分光偏振计上,通过在1mm通路长度的石英池中获得190至260nm的10mM样品的光谱来进行CD测量。累积32次扫描,以0.1nm步长,在50nm/min的速度下记录,频带宽度为0.1nm且积分时间为0.5s。针对溶剂贡献来校正光谱。将以毫度为单位的所观测到的椭圆率转变为平均残基椭圆率。
统计学分析
数据是基于三个独立的实验。通过每个实验条件,测量20个任意选择的个别细胞的个别踪迹,来实现胶体金盐迁移分析法的定量,其中实验中的每个条件都重复至少三次。数据呈平均值±s.d.呈现。通过每个实验条件,测量五个任意选择的区域来实现基质胶侵袭分析法的定量。使用双尾史氏测试比较两组或使用方差分析比较超过两组来评估统计学差异。p<0.05视为显著的。
实施例2
Hsp90β针对肿瘤细胞的存活和Hsp90α针对肿瘤细胞的基本运动性和侵袭性
首先筛选八种通常研究的ER+、HER2+或三阴性乳癌细胞系,以鉴别出最具侵袭性的细胞系并使用其作为细胞模型。MDA-MB-231细胞展示比细胞系其余细胞的侵袭性高六至十倍,其中未转化的乳腺上皮细胞系HBL-100(Gaffney.,1982Cell Tissue Res.227:563-568)作为基线对照物。MDA-MB-231细胞维持Hsp90蛋白质的稳态水平在总细胞蛋白的3.5%左右,显著高于正常细胞中的1%-2%(Sahu等人,2012Mol Biol Cell 23,602-613)。使用在抗原之间不交叉反应的抗体,检查内部和外部池的Hsp90α和Hsp90β。如图1A中所示,在增加体积的细胞溶解产物中,检测到增加量的Hsp90α(图a,泳道4-6)和Hsp90β(图b,泳道4-6),其中包括纯化的重组Hsp90α(图a,泳道1-3)和Hsp90α(图b,泳道1-3)蛋白质作为对照物。还检测到Hsp90α和Hsp90β从细胞的无血清条件培养基固有分泌(图1B,图a和b,泳道4至6)。如图1C中指明,MDA-MB-231细胞甚至在无血清条件下也维持基本和饱和运动性(图a),因为血清的添加展示很少进一步加强(图b)。比较起来,血清饥饿的正常人类乳腺上皮细胞系HBL-100(图c和d)或原代人类角化细胞(图e和f)展示在血清缺乏下很少的基础运动性(图c和e)并显示在血清存在下显著加强的运动性(图d和f)。同样,MDA-MB-231细胞是高度侵袭性的,如所述细胞能够在无血清条件下穿透基质胶屏障所说明(图1D,图a’)。相比之下,两个正常细胞系在相似条件下展示很少的侵袭性(图b’和c’)。因此,MDA-MB-231细胞满足关键参数,即HIF-1α阳性、LRP-1阳性和分泌Hsp90α的人类乳癌细胞模型。
在体外研究Hsp90α抑或Hsp90β抑或两者决定乳癌细胞的内在运动性和侵袭性。选择通过CRISPR-Cas9技术,敲除MDA-MB-231中的Hsp90α和Hsp90β基因。如图2A中所示,显著数目的细胞从针对Hsp90α基因敲除的药物选择中存活下来(图c对比图a和b)。几乎所有的经受针对Hsp90β基因敲除的药物选择的细胞都停止了增殖和分离(图f对比图d和e)。
Hsp90α基因被敲除的直接证明呈现在图2B中。与亲代MDA-MB-231细胞(泳道1)相比,从存活的细胞分离的两个独立的细胞克隆展示完全缺乏Hsp90α蛋白质(图a,泳道3和4)。比较之下,包括通过慢病毒表达的针对Hsp90α的shRNA,将Hsp90α敲减,其中检测到少量的Hsp90α蛋白质(泳道2)。在Hsp90α敲除的细胞克隆中,还注意到Hsp90β蛋白质的含量略微增加(图b,泳道3和4,对比泳道1和2)。如图2C中所示,在血清缺乏或存在下,无法区别Hsp90α敲除与Hsp90α敲减的细胞两者的增殖潜能与未受扰乱的亲代MDA-MB-231细胞。此外,Hsp90α敲除看起来未改变细胞信号转导。以EGFR信号传导为例,如图2D中所示,在亲代与Hsp90α敲除的细胞中检测到基本ERK1/2磷酸化(图d)。TGFα和EGF刺激的p38磷酸化保持不变(图e)。在Hsp90α敲除的细胞中TGFα,而不是EGF,刺激Akt磷酸化(S-473)(图f)。此减少可能是由于TGFα,而不是EGF,刺激Hsp90α分泌且分泌的Hsp90α经由自分泌机制活化Akt(Cheng等人,2008Mol Cell Biol 28,3344-3358;Tsen等人,2013Mol Cell Biol.,33:4947-4953)。虽然Akt磷酸化仍然可通过生长因子刺激来诱发,但PRAS40磷酸化是基本的(图g),表明Akt可能不是直接将PRAS40磷酸化(在苏氨酸-246)的唯一上游激酶,如先前所提出(Kovacina等人2003J Biol Chem 278:10189-10194)。然而,如所预期,分泌的Hsp90α不再可从Hsp90α敲除的细胞的条件培养基检测出,因为Hsp90α在细胞内的存储已经耗尽(图2E,图g,泳道5对比泳道4)。相比之下,Hsp90α敲除的细胞仍如亲代对照细胞一样,分泌Hsp90β(图2E的图h,泳道5对比泳道4)。总之,以上发现表明在缺乏Hsp90α下单独Hsp90β足够履行细胞内伴侣职责,而单独Hsp90α在缺乏Hsp90β下则不是如此。这些细胞发现与以下在小鼠遗传研究中的发现一致:Hsp90β基因敲除引起胚胎死亡(Voss等人,2000Development 127,1-11),而Hsp90α敲除的小鼠存活并正常发育(Grad等人,2010PLoSOne 5,e15770;Imai等人,2011Proc Natl Acad Sci U S A 108,16363-16368)。
虽然Hsp90α的耗尽不影响细胞存活和生长,但在体外Hsp90α敲除的MDA-MB-231细胞丧失了其内在运动性和侵袭性。如图2F中所示,如通过单细胞的迁移指数(MI,%)所测量,Hsp90α敲减(图b)和Hsp90α敲除(图c和d)的细胞变成不运动的(图a)。此运动性缺陷特别是归因于Hsp90α的耗尽,而不是该基因敲减或敲除所引起的某些过度细胞毒性或对细胞基本机制的一般有害作用,因为血清的添加仍可刺激相同细胞的迁移,类似于正常对照细胞(图f至h)。类似地,如图2G中所示,Hsp90α敲减(图b)和Hsp90α敲除(图c和d)的细胞不再能够穿过模拟组织基底膜屏障的基质胶侵袭。这些发现表明了仍存在于Hsp90α敲除的细胞中的Hsp90β不能支持细胞在无血清条件下迁移和侵袭的能力。此外,此Hsp90β的失效不是因为这些细胞中Hsp90蛋白质的总含量降低(图3)。
发现Hsp90α敲除的肿瘤细胞完全丧失了其在体外侵袭基质胶并在小鼠中在乳腺脂肪垫(用于例如对肿瘤生物学和治疗反应的宿主-肿瘤相互作用等乳癌研究的原位部位)形成肿瘤并转移至肺的能力。如图2H中所示,Hsp90α敲除的细胞克隆中没有一个能够侵袭(图b和c),不像其高度侵袭性的亲代细胞(图a)。类似地,在五只小鼠中的四只中注射至裸小鼠的乳腺脂肪垫的亲代LM2-4175细胞在四周内形成肿瘤(图2I,图a)。相比之下,仅在注射Hsp90α敲除的细胞的组中五只小鼠中的一只中发现一个小的肿瘤(图c)。切除肿瘤并测量肿瘤体积(TV)(图b和d)。从注射部位切除的具有对应尺寸的肿瘤或组织的组织学分析证实了Hsp90α敲除的细胞对比其亲代对应物形成肿瘤的能力显著下降(图g对比图e)。此外,由亲代LM2-4175(肺转移的乳癌细胞系)细胞形成的肿瘤转移至肺(图f)。相比之下,未检测到肿瘤从注射Hsp90α敲除的细胞进行肺转移(图h)。
实施例3
分泌的Hsp90α负责肿瘤细胞运动性和侵袭性。
研究Hsp90α的细胞内抑或分泌形式负责肿瘤细胞的运动性和侵袭性。使用Hspα敲除的细胞系,进行“内至外”和“外至内”基因拯救实验。如图3A中所示,将GFP标记的野生型(wt)和三磷酸腺苷酶缺陷型突变体(D93N)Hsp90α基因(泳道3和4对比泳道1)外源性表达。独立地,还在Hsp90α敲除的细胞中表达野生型Hsp90β基因,以通过使Hsp90(即单独Hsp90β)的总量与亲代细胞中Hsp90α与Hsp90β的组合量相同的方式,补充细胞溶质Hsp90蛋白质的量。如图3B中所示,如通过使用抗Hsp90β特异性抗体的蛋白质印迹分析所测定,感染运载人类Hsp90β基因的慢病毒的Hsp90α敲除的细胞显示增加的Hsp90β的表达(图c,泳道3对比泳道1和2)。泳道2(对比泳道1)中Hsp90β略微增加归因于Hsp90α的敲除。用全抗Hsp90抗体(标记Hsp90β与Hsp90α两者)进行印迹展示过度表达Hsp90β的Hsp 90α敲除的细胞中Hsp90的总量类似于亲代细胞(图d,泳道3和泳道1)。相比之下,单独载体感染的Hsp90α敲除的细胞展示低含量的Hsp90(即仅具有内源性Hsp90β)。外源性过度表达Hsp90α和Hsp90β的Hsp90α敲除的细胞的建立允许我们寻找Hsp90α抑或Hsp90β控制癌细胞运动性和侵袭的答案。
如图3D中所示,发现在Hsp90α敲除的细胞中过度表达的野生型和D93N突变型Hsp90α能够拯救运动性缺陷(图c和d对比图b)与侵袭缺陷(图h和i对比图g)。这些数据表明Hsp90α所实现的拯救是经由非三磷酸腺苷酶依赖性机制。相比之下,Hsp90β的过度表达不能校正运动性或侵袭缺陷(图e和j)。拯救归因于分泌的Hsp90α的细胞外作用。如图3E中所示,将重组Hsp90α蛋白质添加至Hsp90β敲除的细胞足够使所述细胞迁移和侵袭的能力恢复(图3E,图c’和g’)。相比之下,重组Hsp90β蛋白质不能如此(图d’和h’)。用于以上测试的重组Hsp90α或Hsp90β蛋白质的纯度展示于图3C中(泳道4和5)。重组Hsp90α和Hsp90β蛋白质的剂量依赖性作用展示于图3F和3G中。
如图3I中所示,在所有五只小鼠中Hsp90α敲除的细胞不能形成肿瘤(图a)。Hsp90α敲除的细胞与重组Hsp90α蛋白质共同注射不仅足以使Hsp90α敲除的细胞在组中的五只小鼠中的五只中形成肿瘤,此外,还使五只小鼠中的三只中的肿瘤尺寸在两周而不是如亲代肿瘤细胞所需的四周内达到IACUC限度(图b)。与重组Hsp90β蛋白质共同注射也展示拯救作用,但基于切除肿瘤的TV值,比重组Hsp90α弱50至100倍(图3I,图c对比e)。
实施例4
靶向Hsp90α的F-5区的单克隆抗体1G6-D7和5C4-D4阻断肿瘤细胞运动性和侵袭。
为进一步证明是Hsp90α的分泌形式,而不是细胞内形式,负责MDA-MB-231细胞的基本运动性和侵袭性,研发两个靶向115氨基酸片段F-5的单克隆抗体品系,F-5位于Hsp90α的连接子区域和中央结构域(Cheng等人,2011J Clin Invest 121,4348-4361)。进行免疫原制备、免疫接种、筛选和抗体表位定位,其中通过筛选超过800个潜在克隆,克隆两个杂交瘤品系1G6-D7和5C4-D4。如图4A中示意性展示,1G6-D7和5C4-D4在Hsp90α中的表位分别定位在F-5区内的TKPIWTRNP和VKHFSVEGQ序列处。纯化抗体展示于图4B中(泳道2和3),其中以已知量的市售小鼠IgG作为对照物(泳道1)。如图4C中所示,1G6-D7和5C4-D4的添加以剂量依赖性方式阻断MDA-MB-231细胞的基本运动性(图c和d对比图a和b)(图4E)。相比之下,抗Hsp90β抗体展示很少的作用。1G6-D7和5C4-D4所实现的抑制归因于抗体特异性结合于Hsp90α的F-5区,因为过量重组F-5肽的添加以剂量依赖性方式逆转了1G6-D7(图f)和5C4-D4(图g)的抑制作用(图4E)。
类似地,1G6-D7和5C4-D阻断亲代MDA-MB-231细胞的侵袭。如图4D中指明,对照IgG的添加展示很少的作用(图d’对比图a’)。然而,1G6-D7(图b’和c’对比图a’和d’)与5C4-D4(图e’和f’对比图a’和d’)以剂量依赖性方式抑制肿瘤细胞侵袭。该抑制特别是因为肿瘤细胞分泌的Hsp90α的中和,因为重组F-5的添加逆转了1G6-D7(图h’和i’对比图g’)和5C4-D4(图k’和l’对比图j’)所实现的抑制。总之,这些结果确定了分泌的Hsp90α在肿瘤细胞运动性和侵袭中的特定作用并支持IG6-D7和/或5C4-D4单克隆抗体的治疗用途。
1G6-D7以剂量依赖性方式阻断亲代LM2-4175细胞的侵袭。通过添加过量的F-5肽逆转了1G6-D7所实现的抑制的观测结果,证实了1G6-D7所实现的抑制的特异性。静脉内注射1G6-D7至小鼠阻止细胞形成肿瘤和转移至肺。如图4F中所示,亲代LM2-4175细胞在注射对照小鼠IgG的五只小鼠(#1至#5)中的五只中形成大的肿瘤(图4F,图a)。然而,注射1G6-D7几乎完全阻止了肿瘤形成(#6至#10)。当在四周时期内计算来自多个实验的活小鼠上的肿瘤的平均肿瘤体积(图4G)时,注意到注射1G6-D7的小鼠中的肿瘤试图在头两周内生长,但最终无法跟上注射对照IgG的小鼠中其亲代对应细胞的步伐(箭头)。组织学分析证实经1G6-D7处理的小鼠中缺少肿瘤形成(图4H,图b对比图a)。从注射对照小鼠IgG的小鼠切除的所有肺样品都展示转移的肿瘤细胞(图4H,图c)。相比之下,在注射1G6-D7的小鼠中未发现可检测的肿瘤至肺的转移(图4H,图d)。
实施例5
F-5区内的赖氨酸-270和赖氨酸-277决定Hsp90α的细胞外功能。
通过集中在F-5区,研究决定Hsp90的细胞外功能的分子基础。进行连续的突变诱发以鉴别出必需氨基酸残基。如图5A中所示,缺失型突变诱发允许进一步缩小F-5片段的促运动活性至54氨基酸片段F-6,并接着缩小至27氨基酸肽F-8。接着利用以下事实:Hsp90β不像Hsp90α,其不具有任何细胞外促运动活性和促侵袭活性;并将F-8的27氨基酸序列与来自Hsp90β的其对应序列F-8β比较。如图5B中所示,F-8中的八个氨基酸经F-8β中的变异氨基酸取代。此发现表明Hsp90α与Hsp90β之间的细胞外功能的差异存在于该八个氨基酸残基内。为了测试此假设,针对促进细胞迁移的能力,对其中F-8中八个氨基酸中的每一个经来自F-8β的对应氨基酸残基中的每一个替换的八个合成肽进行筛选(图5C)。因为MDA-MB-231细胞已由于其固有地分泌Hsp90α而展示饱和的运动性基本水平且不再对外源性添加的Hsp90α作出反应而展现运动性的进一步增加(图3G),所以使用原代人类角化细胞测试这些肽,因为如先前所示,重组Hsp90α蛋白质强烈刺激这些细胞的迁移(Cheng等人,2011J ClinInvest 121,4348-4361)。如图5D中所示,赖氨酸-270(图h)和赖氨酸-277(图c)的取代显著减弱F-8肽的促运动活性(图b对比图a)。相比之下,其它点突变未展示对F-8的促运动活性。如所预期,F-8β未展示任何可检测的活性(图l)。在每个迁移图像下方,迁移的定量展示为迁移指数(MI,%)。
测试突变Hsp90α,其中赖氨酸-270和赖氨酸-277经来自Hsp90β的对应残基甘氨酸和苏氨酸替换的Hsp90α-G/T,是否能够促进Hsp90α敲除的细胞的肿瘤形成。与野生型Hsp90α蛋白质(参见图3I,图b)对比,发现Hsp90α-G/T无法支援Hsp90α敲除的细胞的肿瘤形成(图3I,图f)。组织学分析证实补充有野生型Hsp90α或野生型Hsp90β蛋白质的Hsp90α敲除的细胞在乳腺脂肪垫处形成肿瘤(图3J,图I和k)。然而,在所有五只小鼠中的四只中,仅仅共同注射的Hsp90α(图3J,图j),而不是Hsp90β(图3J,图l)蛋白质能够驱动Hsp90α敲除的细胞转移至肺(图3J,图j)。相比之下,未检测到单独的Hsp90α敲除的细胞(图3J,图g和h)或补充有Hsp90α-G/T突变蛋白质的相同细胞的肿瘤形成和肺转移(图3J,图m和n)。总之,以上发现表明赖氨酸-270和赖氨酸-277,而不是三磷酸腺苷酶,决定Hsp90α的细胞外致癌活性并为潜在治疗靶向呈现位点。
在全长Hsp90基因中进行突变诱发研究以展示赖氨酸-270和赖氨酸-277界定了Hsp90蛋白质家族的细胞外非伴侣功能的分子基础。如图6A中示意性展示,将全长Hsp90α中的赖氨酸残基用来自Hsp90β的两个对应残基(即甘氨酸-262和苏氨酸-269)取代,以产生Hsp90α-G/T突变体。相反,将全长Hsp90β基因中的甘氨酸-262和苏氨酸-269用赖氨酸残基替换,以产生Hsp90β-K/K突变体。包括两种其它非特异性突变体Hsp90α-D271K和Hsp90β-K263D作为阴性对照物。全长Hsp90α和Hsp90β的六个经纯化的野生型和突变蛋白质如图6B中所示(泳道4至7)。接着通过计算机模拟和圆二色性(CD)分析Hsp90α、Hsp90β和其突变蛋白质的二级结构剖面。Hsp90α结构由三个结构域组成∶含有三磷酸腺苷酶的N端结构域(NTD)通过带高电荷且非结构化的连接子区连接至中央结构域(MD),中央结构域之后为C端二聚结构域(CTD)。Lys-270和Lys-277位于连接子区,因此不影响整体蛋白质结构。CD分析的结果进一步证明此。发现Hsp90α和Hsp90β的CD谱是含有二级结构元件的混合物的折叠蛋白质所特有的。Hsp90β在222nm下的椭圆率略低于Hsp90α,揭露了Hsp90β的螺旋含量更高。Hsp90α和Hsp90β每一者的突变变异体与野生型蛋白质不可区别。突变不会影响整体蛋白质结构,而是调节此动态连接子区的局部结构。因此,假定Hsp90α中的甘氨酸-270和苏氨酸-277取代特别会使其功能失效,且相反,Hsp90β中的赖氨酸-262和赖氨酸-269替换将Hsp90β转变成能够促进肿瘤细胞运动性和侵袭的Hsp90α样分子。
使用Hsp90α敲除的MDA-MB-231细胞克隆测试六种重组蛋白质中的哪一个拯救无血清条件下细胞的运动性和侵袭缺陷。如图6C中所示,参考亲代对照细胞,KO-α细胞丧失其运动性(图b对比图a)。如所预期,野生型Hsp90α蛋白质的添加拯救了运动性缺陷(图c)。相比之下,Hsp90α-G/T突变体无法拯救运动性缺陷(图d对比图c)。如所预期,非特异性Hsp90α-D271K突变体行为如同野生型Hsp90α一样(图e对比图c)。如所预期,野生型Hsp90β蛋白质不能拯救运动性缺陷(图f)。Hsp90β-K/K突变蛋白质行为如同野生型Hsp90α一样,拯救Hsp90α敲除的细胞的运动性缺陷(图g对比图f)。相比之下,非特异性Hsp90β-K263D突变体行为仍如同野生型Hsp90β蛋白质(图h)。Hsp90α-G/T和Hsp90β-K/K突变体对细胞运动性的剂量依赖作用展示于图6E中。此外,因为Hsp90α-G/T突变体展示对MDA-MB-231细胞内在运动性的显著负面作用(图6F),所以赖氨酸-270和赖氨酸-277可能界定该活性,而不是Hsp90α与其标靶蛋白的结合。
通过侵袭分析法证实Hsp90α-G/T突变体的功能缺失作用和Hsp90α-K/K突变体的功能获得作用。如图6D中所示,野生型Hsp90α有效地拯救了KO-α细胞的侵袭缺陷(图c’对比图b’),而Hsp90α-G/T突变体的拯救能力显著减弱(图d’)。非特异性Hsp90α-D271K突变体行为仍如同野生型Hsp90α蛋白质(图e’)。如所预期,野生型Hsp90β展示很少的拯救作用(图f’)。然而,Hsp90β-K/K突变体基本上转变成能够拯救KO-α细胞侵袭的野生型Hsp90α样分子(图g’对比图b’)。总之,提出,区别Hsp90α与Hsp90β的赖氨酸-270和赖氨酸-277残基如同决定Hsp90家族蛋白质的细胞内伴侣功能的N端三磷酸腺苷酶结构域一样,决定肿瘤分泌的Hsp90α的细胞外功能。
靶向癌症中Hsp90的新范例是∶i)选择性地抑制肿瘤细胞分泌的Hsp90α(而不是其细胞内对应物),以及ii)特异性靶向位于蛋白质的连接子区的双赖氨酸区域。例如本文中描述的单克隆抗体等具备这两个特性的抑制剂应实现改善的治疗功效与最低的毒性。
上述各种方法和技术提供了许多实施本申请的方式。当然,应了解,不一定所有描述的目标或优点都可以根据本文中描述的任何具体实施方案来实现。因此,举例来说,本领域技术人员将认识到,所述方法可以通过实现或最佳化如本文中教示的一个优点或一组优点同时无需实现如本文中教示或提出的其它目标或优点的方式进行。本文中提及多种替代方案。应了解,某些优选实施方案特别包括一个、另一个或若干特征,而其它实施方案特别排除一个、另一个或若干特征,而还有其它实施方案通过包括一个、另一个或若干有利的特征而减轻一具体特征。
此外,熟练技术人员将认识到可应用来自不同实施方案的各种特征。类似地,以上论述的各种元件、特征和步骤以及其它已知的每个此类元件、特征或步骤的同等物可以由本领域技术人员以各种组合采用,以根据本文中描述的原则进行方法。在各种元件、特征和步骤中,特别包括一些,而在多种实施方案中特别排除其它。
虽然已经在某些实施方案和实施例的背景下公开本申请,但本领域技术人员应了解,本申请的实施方案超越特别公开的实施方案,延伸至其它的替代实施方案和/或用途以及其修改和同等物。
本文中描述了本申请的优选实施方案,包括本发明人已知的实施本申请的最佳方式。本领域技术人员在阅读以上描述后,那些优选实施方案的变化将变得显而易见。预期熟练技术人员可以视情况使用此类变化,且本申请可以通过不同于本文中特别描述的方式实施。因此,本申请的许多实施方案包括如适用法律许可下随附权利要求书中叙述的主题的所有修改和同等物。此外,除非本文中另有指示或者上下文另外明显矛盾,否则涵盖上述元件呈其所有可能变体的任何组合。
本文中提及的所有专利、专利申请、专利申请的公布以及其它材料(例如文章、书籍、说明书、公布、文献、物件等等)通过引用的方式整体并入本文中以达成所有目的,除非有与其有关的任何起诉文件历史、与本文献不一致或相矛盾的任一内容或在当前或以后对与本文献有关的权利要求书的最宽泛范围可能具有限制性影响的任一内容。例如,如果在与任何并入材料有关的术语的描述、定义和/或使用与同本文献有关的术语的描述、定义和/或使用之间存在任何不一致或矛盾,那么本文献中术语的描述、定义和/或使用将为准。
最后,应了解,本文中公开的本申请的实施方案说明本申请的实施方案的原则。可以采用的其它修改会在本申请的范围内。因此,举例来说(而不是限制),可以根据本文中的教示,利用本申请的实施方案的替代配置。因此,本申请的实施方案不局限于精确展示和描述的实施方案。
序列表
<110> 南加利福尼亚大学
LI, Wei
WOODLEY, David
CHEN, Mei
SAHU, Divya
DONG, Hangming
ZOU, Mengchen
<120> 用于治疗过度表达HIF-1α的癌症的组合物和方法
<130> 065715-000025WO10
<150> 62/075,129
<151> 2014-11-04
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 1
Thr Lys Pro Ile Trp Thr Arg Asn Pro
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 2
Val Lys His Phe Ser Val Glu Gly Gln
1 5
Claims (20)
1.一种治疗或预防有需要的受试者的过度表达HIF-1α的癌症的转移的方法,所述方法包括:
a.提供包含Hsp90α抑制剂的组合物;以及
b.向所述受试者施用治疗有效量的所述组合物,以便治疗所述受试者的HIF-1阳性癌症,
以便治疗或预防过度表达HIF-1α的癌症的转移。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述癌症是乳癌。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述癌症是肺癌。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述Hsp90α抑制剂靶向Hsp90α的F-5表位。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述Hsp90α抑制剂选自由小分子、肽、抗体或其片段以及核酸分子组成的组。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述Hsp90α抑制剂是Hsp90α受体的抑制剂并选自由小分子、肽、抗体或其片段或者核酸分子组成的组。
7.如权利要求6所述的方法,其中所述核酸分子是siRNA分子。
8.如权利要求5所述的方法,其中所述核酸抑制剂靶向氨基酸Lys-270、Lys-277或其组合。
9.如权利要求5所述的方法,其中所述抗体选自由单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体和单链抗体组成的组。
10.如权利要求5所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述抗体是1G6-D7或5C4-D或其组合。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述1G6-D7单克隆抗体结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP。
13.如权利要求11所述的方法,其中所述5C4-D4单克隆抗体结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ。
14.如权利要求1中任一项所述的方法,其中经静脉内、经肌肉内、经腹膜内、经口或经由吸入施用所述Hsp90α抑制剂。
15.如权利要求1中任一项所述的方法,其中所述Hsp90α抑制剂或其片段的有效量为约1-5毫克/公斤/天、5-10毫克/公斤/天、10-50毫克/公斤/天或10-30毫克/公斤/天。
16.一种药物组合物,所述药物组合物包含Hsp90α抑制剂和药学上可接受的载剂。
17.如权利要求16所述的药物组合物,其中所述抑制剂是特异性结合Hsp90α的单克隆抗体。
18.如权利要求17所述的药物组合物,其中所述抗体是1G6-D7或5C4-D或其组合。
19.如权利要求18所述的药物组合物,其中所述1G6-D7单克隆抗体结合Hsp90α中的氨基酸序列TKPIWTRNP。
20.如权利要求18所述的药物组合物,其中所述5C4-D4单克隆抗体结合Hsp90α中的氨基酸序列VKHFSVEGQ。
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