CN106132992A - 针对muc1‑c/胞外结构域(muc1‑c/ecd)的抗体 - Google Patents

针对muc1‑c/胞外结构域(muc1‑c/ecd)的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN106132992A
CN106132992A CN201580011813.3A CN201580011813A CN106132992A CN 106132992 A CN106132992 A CN 106132992A CN 201580011813 A CN201580011813 A CN 201580011813A CN 106132992 A CN106132992 A CN 106132992A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cell
muc1
seq
chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580011813.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106132992B (zh
Inventor
D·W·库弗
S·克哈班达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dana Farber Cancer Institute Inc
Genus Oncology LLC
Original Assignee
Dana Farber Cancer Institute Inc
Genus Oncology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dana Farber Cancer Institute Inc, Genus Oncology LLC filed Critical Dana Farber Cancer Institute Inc
Publication of CN106132992A publication Critical patent/CN106132992A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106132992B publication Critical patent/CN106132992B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及结合至MUC1‑C/胞外结构域(MUC1‑C/ECD)的抗体和使用这样的抗体以治疗表达MUC1抗原的癌症的方法。

Description

针对MUC1-C/胞外结构域(MUC1-C/ECD)的抗体
发明背景
本申请要求2014年1月29日提交的美国临时申请序列号61/933,001(其完整内容通过引用并入本文)的优先权的益处。
名称为“GENUP0032WO_ST25.txt”的文件中含有的序列表，其为40KB(在Microsoft中测量)且在2015年1月29日创建，在此通过电子提交方式一起提交，且通过引用并入本文。
1.发明领域
本发明总体涉及医学、肿瘤学和免疫治疗学的领域。更具体地，其涉及开发免疫试剂用于检测和治疗MUC1-阳性癌症。
2.发明背景
粘蛋白是广泛O-糖基化的蛋白质，其主要由上皮细胞表达。分泌的和膜结合的粘蛋白形成物理屏障，其保护上皮细胞的顶边界不受由毒素、微生物和发生在与外部环境的界面处的其它形式压力诱导的损伤。跨膜粘蛋白1(MUC1)也可通过其胞质结构域信号传导至细胞内部。除了存在海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白(sea urchin sperm protein-enterokinase-agrin，SEA)结构域，MUC1没有与其它膜结合的粘蛋白的序列相似性(Duraisamy等人，2006)。在这方面，MUC1被翻译为单一多肽，然后在SEA结构域经历自切割(Macao，2006)。
本发明人和其他人已经广泛研究了MUC1在癌症中的作用。如上所讨论，人MUC1是异二聚糖蛋白质，被翻译为单一多肽且在内质网中裂解为N-和C-末端亚基(MUC1-N和MUC1-C)(Ligtenberg等人,1992；Macao等人,2006；Levitin等人,2005)。MUC1的异常表达，如大多数人癌症中所发现(Kufe等人,1984)，赋予锚定非依赖性的生长和致瘤性(Li等人,2003a；Huang等人,2003；Schroeder等人,2004；Huang等人,2005)。其它研究已经表明，MUC1的过表达赋予对氧化应激和遗传毒性抗癌剂诱导的细胞凋亡的抗性(Yin和Kufe,2003；Ren等人,2004；Raina等人,2004；Yin等人,2004；Raina等人,2006；Yin等人,2007)。
栓系(tethered)和分泌的粘蛋白的家族在提供上皮细胞表面的保护性屏障中发挥功能。在上皮层受损时，邻近细胞之间的紧密连接被破坏，由于细胞开始调蛋白(heregulin)诱导的修复程序而丧失极性(Vermeer等人，2003)。MUC1-N从细胞表面脱落(Abe和Kufe，1989)，留下MUC1-C以作为至细胞内部的环境压力信号的转导物发挥功能。在这方面，MUC1-C与ErbB受体家族成员形成细胞表面复合物，而且MUC1-C响应于调蛋白刺激而靶向至核(Li等人，2001；Li等人，2003c)。MUC1-C还通过MUC1胞质结构域(CD)与联蛋白家族成员的直接相互作用而整合ErbB受体和Wnt信号转导通路来发挥功能(Huang等人,2005；Li等人,2003c；Yamamoto等人,1997；Li等人,1998；Li等人,2001；Li和Kufe,2001)。其它研究已经表明，MUC1-CD被糖原合酶激酶3β、c-Src、蛋白激酶Cδ和c-Abl磷酸化(Raina等人,2006；Li等人,1998；Li等人,2001；Ren等人,2002)。抑制任何前述相互作用代表MUC1相关癌症的治疗性干预的潜在点。
发明概述
因此，根据本发明，提供了选择性结合至通过SEQ ID NO:2定义的MUC1-C/胞外结构域(MUC1-C/ECD)的抗体，其中所述抗体：
(a)是IgG抗体；
(b)抑制癌细胞生长；
(c)诱导癌细胞死亡；
(d)分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含各自与SEQ ID NO:3、4、和5、或6、7和8、或27、28和29、或42、43和44、或45、46和47、或48、49和50具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域，所述可变轻链包含各自与SEQ ID NO:9、10和11或12、13和14、或30、31和32、或51、52、和53、或54、55和56、或57、58和59具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域；
(e)分别包含与SEQ ID NO:15、19、23、60、64或68具有80％或更高同源性的可变重链和与SEQ ID NO:17、21、25、62、66、70具有80％或更高同源性的可变轻链；和/或
(f)分别包含由与SEQ ID NO:16、20、24、61、65或69具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链和由与SEQ ID NO:18、22、26、63、67或71具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链。
所述重链和轻链可以分别与SEQ ID NO:15、19、23、60、64或68、和17、21、25、62、66或70具有85％、90％、95％或99％同源性。所述重链和轻链可以分别由与SEQ ID NO:16、20、24、61、65或69、和18、22、26、63、67或71具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。在一个实施方案中，所述抗体不结合至SEQ ID NO:33、34或35。
所述抗体可以是单链抗体、单结构域抗体、嵌合抗体或Fab片段。所述抗体可以是对于MUC1-C/ECD和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体。所述抗体可以是鼠抗体、IgG、人源化抗体或人源化IgG。所述抗体可以进一步包含标记，诸如肽标签，酶，磁性颗粒，生色团，荧光分子，化学发光分子，或染料。所述抗体可以进一步包含与之连接、诸如通过光不稳定的接头或酶促切割的接头至所述抗体的抗肿瘤药物。所述抗肿瘤药物可以是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。所述抗体可以缀合至纳米颗粒或脂质体。细胞死亡的诱导可以包括抗体依赖的细胞细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
还提供了治疗癌症的方法，其包括在受试者中使MUC1-阳性癌细胞与如上所述的抗体接触。所述MUC1-阳性细胞可以是实体瘤细胞，诸如肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、子宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食道癌细胞，或者可以是白血病或骨髓瘤，诸如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病或多发性骨髓瘤。
所述方法可以进一步包括使所述MUC1-阳性癌细胞与第二抗癌剂或治疗诸如化疗、放疗、免疫疗法、激素疗法或毒素疗法接触。所述第二抗癌剂或治疗可以抑制胞内MUC1功能。所述第二抗癌剂或治疗可以在与所述第一药剂相同的时间给予，或在所述第一药剂之前和/或之后给予。所述MUC1-阳性癌细胞可以是转移性癌细胞、多重耐药癌细胞或复发性癌细胞。
所述抗体可以是单链抗体、单结构域抗体、嵌合抗体或Fab片段。所述抗体可以是对于MUC1-C/ECD和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体。所述抗体可以是鼠抗体、IgG、人源化抗体或人源化IgG。所述抗体可以进一步包含标记，诸如肽标签，酶，磁性颗粒，生色团，荧光分子，化学发光分子，或染料。所述抗体可以进一步包含与之连接、诸如通过光不稳定的接头或酶促切割的接头至所述抗体的抗肿瘤药物。所述抗肿瘤药物可以是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。所述抗体可以缀合至纳米颗粒或脂质体。
还提供了融合蛋白质，其包含：
(i)选择性结合至通过SEQ ID NO:2定义的MUC1-C/胞外结构域(MUC1-C/ECD)的第一单链抗体，其中所述抗体：
(a)是IgG抗体；
(b)抑制癌细胞生长；
(c)诱导癌细胞死亡；
(d)分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含各自与SEQ ID NO:3、4、和5、或6、7和8、或27、28和29、或42、43和44、或45、46和47、或48、49和50具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域，所述可变轻链包含各自与SEQ ID NO:9、10和11或12、13和14、或30、31和32、或51、52、和53、或54、55和56、或57、58和59具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域；
(e)分别包含与SEQ ID NO:15、19、23、60、64或68具有80％或更高同源性的可变重链和与SEQ ID NO:17、21、25、62、66、70具有80％或更高同源性的可变轻链；和/或
(f)分别包含由与SEQ ID NO:16、20、24、61、65或69具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链和由与SEQ ID NO:18、22、26、63、67或71具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链；和
(ii)结合至T或B细胞的第二单链抗体。
所述第二单链抗体可以结合至CD3、T细胞或B细胞。所述融合蛋白质可以进一步包含标记或治疗性部分。在一个实施方案中，所述第一单链抗体不结合至SEQ ID NO:3、4或5。
在另一个实施方案中，提供了嵌合抗原受体，其包含：
(i)包含单链抗体可变区的胞外结构域，所述单链抗体可变区选择性结合至通过SEQ ID NO:2定义的MUC1-C/胞外结构域(MUC1-C/ECD)，其中所述抗体：
(a)是IgG抗体；
(b)抑制癌细胞生长；
(c)诱导癌细胞死亡；
(d)分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含各自与SEQ ID NO:3、4、和5、或6、7和8、或27、28和29、或42、43和44、或45、46和47、或48、49和50具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域，所述可变轻链包含各自与SEQ ID NO:9、10和11或12、13和14、或30、31和32、或51、52、和53、或54、55和56、或57、58和59具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域；
(e)分别包含与SEQ ID NO:15、19、23、60、64或68具有80％或更高同源性的可变重链和与SEQ ID NO:17、21、25、62、66、70具有80％或更高同源性的可变轻链；和/或
(f)分别包含由与SEQ ID NO:16、20、24、61、65或69具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链和由与SEQ ID NO:18、22、26、63、67或71具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链；且
具有在所述单链抗体可变区的C末端处附接的柔性铰链；
(ii)跨膜结构域；和
(iii)胞内结构域，
其中当所述单链抗体可变区与MUC1接合时，所述胞内结构域包含信号转导功能。
所述跨膜和胞内结构域可以源自相同分子。所述胞内结构域包含CD3-ζ结构域或高亲和力FcεRI。所述柔性铰链可以来自CD8α或Ig。还提供了表达该嵌合抗原受体的细胞。在一个实施方案中，所述单链可变区不结合至SEQ ID NO:3、4或5。
考虑本文描述的任何方法或组合物可以就本文描述的任何其它方法或组合物来实施。
在权利要求和/或说明书中当与术语“包含(comprising)”结合使用时，词语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用可以意指“一个/种(one)”，但其也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“多于一个/种”的含义一致。词语“约”表示所述数字的正负5％。
本发明的其它目标、特征和优点将从以下详述变得显而易见。然而，应该理解，详述和具体实施例尽管说明本发明的具体实施方案，但仅是通过举例说明的方式给出，因为从该详述中本发明的精神和范围内的多种改变和变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图简述
以下附图构成本说明书的部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。本发明可以通过参考这些附图中的一个或多个并组合本文呈现的具体实施方案的详述而被更好理解。
图1A-B.(图1A)MUC1-C/ECD的氨基酸序列(58aa:SEQ ID NO:2)。(图1B)在CHO-K1细胞中稳定表达构建体mFc-接头-MUC1-C/ECD-信号序列。该蛋白质纯化自CHO细胞汤，并用于免疫小鼠。相同的蛋白质用于加强小鼠。测定血清滴度，并且在阳性滴度之后，将融合脾以生成杂交瘤。
图2.(保留)
图3.合成来自MUC1-C/ECD蛋白质的三个重叠肽，以用于使用ELISA测定针对阳性Mab克隆的线性表位作图。三个肽的序列是：P1:SVVVQLTLAFREGTINVHDVET(SEQ ID NO:33)；P2:VETQFNQYKTEAASRYNLTISD(SEQ ID NO:34)；P3:TISDVSVSDVPFPFSAQSGAG(SEQ ID NO:35)。
图4.生成具有几个点突变(如上所述)的MUC1-C/ECD cDNA(ECD-WT–SEQ ID NO:2；ECD-L6A–SEQ ID NO:36；ECD-L8A–SEQ ID NO:37；ECD-L6,8A-SEQ ID NO:38；ECD-Q23V–SEQID NO 39；ECD-Q26V–SEQ ID NO:40；ECD-N36A–SEQ ID NO:41)。用这些cDNA各自单独转染CHO-K1细胞以表达和分泌蛋白质。纯化蛋白质，并将其用于使用ELISA测定针对阳性Mab克隆定义构象表位。阳性对照将是从CHO-K1细胞表达和纯化的wtmFc-MUC1-C/ECD蛋白质。
图5.(保留)
图6A-C.(图6A)免疫之后，对小鼠采血并通过用MUC1-C/ECD蛋白质免疫印迹而分析免疫血清。MUC1-C/CD蛋白质用作阴性对照。(图6B)通过用从CHO-K1细胞纯化的mFc-和hFc-MUC1-C/ECD蛋白质免疫印迹而分析MAb克隆8E1、8F1、2A6和6A6。二抗：抗-小鼠-HRP(F(ab)2特异性)(1:5000)(图6C)通过用克隆6A6抗体免疫印迹而分析MUC1-阴性293T细胞、NSCLC H-1975和MCF-7&ZR-75-1乳腺癌细胞裂解物。
图7.通过用从细菌产生和纯化的mFc-MUC1-C/ECD(p58-mFc)、MUC1-SEA结构域(p62-mFc)和仅p62蛋白质免疫印迹而分析MAb克隆8E1、6A6、2G11和2H11。
图8.通过用从细菌纯化的mFc-MUC1-C/ECD(p58-mFc)、MUC1-SEA结构域(p62-mFc)和仅p62蛋白质免疫印迹而分析MAb克隆8E1、6A6、2G11和2H11。
图9.通过用从细菌纯化的mFc-MUC1-C/ECD(p58-mFc)、MUC1-SEA结构域(p62-mFc)和仅p62蛋白质免疫印迹而分析MAb克隆8E1、6A6、2G11和2H11。
图10.通过流式细胞术使用MV4-11、MOLM-14(AML)；U266、RPMI8226(多发性骨髓瘤)和原代AML细胞分析MAb克隆8E1、6A6和阳性对照DF3。
图11.通过流式细胞术使用K562/CsiRNA和K562/MUC1siRNACML细胞分析MAb克隆8E1和6A6。
图12.使用H-1975非小细胞肺癌细胞，在37℃持续3小时，FITC-标记的抗-MUC1-C/ECD MAb 8E1的内化。晚期内体/溶酶体囊泡中的帽化和点状染色(箭头)。
图13.使用H-1975非小细胞肺癌细胞，在37℃持续3小时，FITC-标记的抗-MUC1-C/ECD MAb 6A6的内化。晚期内体/溶酶体囊泡中的帽化和点状染色(箭头)。
图14.使用ZR-75-1乳腺癌细胞，在37℃持续3小时，Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体6A6的内化。
图15.使用MUC1-阴性HEK-293T细胞，在4℃或37℃持续3小时，Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体6A6的较少染色，如果有的话。
图16.使用MOLM-14AML细胞，在37℃持续3小时，Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体8E1的内化。
图17.使用K562/MUC1siRNA和K562/CsiRNA CML细胞，在37℃持续3小时，AlexaFluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体8E1内化。
图18.在4℃，ZR-75-1乳腺癌细胞中的Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体6A6的质膜染色及其与RFP早期内体标志物的共定位。
图19.在37℃，ZR-75-1乳腺癌细胞中的Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体6A6的内化及其与RFP-细胞内含物标志物的共定位。
图20.在37℃，H-1975NSCLC细胞中的Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体6A6的内化及其与RFP-细胞内含物标志物的共定位(箭头)。
图21.在37℃，H-1975NSCLC细胞中的Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体8E1的内化及其与RFP-细胞内含物标志物的共定位(箭头)。
图22.在37℃，H-1975NSCLC细胞中的Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体8E1的内化及其与RFP-溶酶体标志物的共定位(箭头)。
图23.在37℃，H-1975NSCLC细胞中的Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体6A6的内化及其与RFP-溶酶体标志物的共定位(箭头)。
图24.使用小鼠NSCLC(KW-814)细胞，在37℃持续3小时，Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体6A6的内化。
图25.使用K562CML细胞，在37℃持续3小时，Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体8E1和6A6的内化。IgG标记用作阴性对照。RFP-溶酶体IF用作阳性对照。
图26.RFP-细胞内含物标志物转染的H-1975NSCLC细胞在37℃的免疫荧光(右小图)。与Alexa Fluor 488-标记的同种型对照IgG抗体孵育的RFP-细胞内含物标志物转染的H-1975细胞的染色(中间小图)。
图27.RFP-溶酶体标志物转染的H-1975NSCLC细胞在37℃的免疫荧光(右小图)。与Alexa Fluor 488-标记的同种型对照IgG抗体孵育的RFP-溶酶体标志物转染的H-1975细胞的染色(中间小图)。
图28.在37℃，H-1975NSCLC细胞中的Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD抗体8E1的内化及其与RFP-溶酶体标志物的共定位。
图29.从小鼠384免疫选择抗体克隆。
图30.抗-MUC1-C/ECD抗体与细菌中制备的MUC1蛋白质的相互作用。
图31.将HCT-116/载体和HCT-116/MUC1细胞与7B8或小鼠IgG孵育30分钟，洗涤，与山羊抗小鼠免疫球蛋白-荧光素-缀合的抗体(Santa Cruz Biotechnology)孵育，并固定于1％甲醛/PBS中。通过免疫荧光FACScan检测反应性。结果表明，与HCT-116/载体细胞(MUC1-阴性)相反，在MUC1-阳性HCT-116/MUC1细胞中看到7B8的强反应性。
图32.将ZR-75-1乳腺癌细胞与7B8或小鼠IgG孵育30分钟，洗涤，与山羊抗小鼠免疫球蛋白-荧光素-缀合的抗体(Santa Cruz Biotechnology)孵育，并固定于1％甲醛/PBS中。通过免疫荧光FACScan检测反应性。结果表明，与IgG对照相反，7B8与ZR-75-1细胞强烈反应。
图33.将ZR-75-1乳腺癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞和HCT-116/MUC1结肠癌细胞与7B8孵育30分钟，洗涤，与山羊抗小鼠免疫球蛋白-荧光素-缀合的抗体(Santa CruzBiotechnology)孵育，并固定于1％甲醛/PBS中。通过免疫荧光FACScan检测反应性。结果表明，7B8与所有这些细胞类型都强烈反应。
图34.将MDA-MB-468/CshRNA和MDA-MB-468/MUC1 shRNA三重乳腺癌细胞MCF-7乳腺癌细胞与IgG或与7B8孵育30分钟，洗涤，与山羊抗小鼠免疫球蛋白-荧光素-缀合的抗体(Santa Cruz Biotechnology)孵育，并固定于1％甲醛/PBS中。通过免疫荧光FACScan检测反应性。结果表明，与MDA-MB-468/MUC1shRNA(MUC1-下调)细胞相反，在MUC1-阳性MDA-MB-468/CshRNA细胞中看到7B8的强反应性。
图35.将ZR-75-1乳腺癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞和HCT-116/MUC1结肠癌细胞与2B11孵育30分钟，洗涤，与山羊抗小鼠免疫球蛋白-荧光素-缀合的抗体(Santa CruzBiotechnology)孵育，并固定于1％甲醛/PBS中。通过免疫荧光FACScan检测反应性。结果表明，2B11与所有三种细胞类型都强烈反应。
图36.将ZR-75-1乳腺癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞和HCT-116/MUC1结肠癌细胞与4G5孵育30分钟，洗涤，与山羊抗小鼠免疫球蛋白-荧光素-缀合的抗体(Santa CruzBiotechnology)孵育，并固定于1％甲醛/PBS中。通过免疫荧光FACScan检测反应性。结果表明，4G5与所有三种细胞类型都强烈反应。
图37.将HCT116/MUC1-野生型和HCT116/MUC1-CQC→AQA突变型细胞与7B8孵育30分钟，洗涤，与山羊抗小鼠免疫球蛋白-荧光素-缀合的抗体(Santa Cruz Biotechnology)孵育，并固定于1％甲醛/PBS中。通过免疫荧光FACScan检测反应性。结果表明7B8与两种细胞类型的强反应性，表明7B8的结合不需要MUC1-C/MUC1-C二聚化。
图38.通过用抗原包被板和与多种不同浓度的纯化抗体7B8、4G5和2B11的反应性进行ELISA测定。结合曲线表明与所有三种抗体类似的反应性。
图39.来自7B8、2B11和4G5克隆的结果的概述。
图40.通过用野生型抗原包被板和不同突变蛋白质(LTL→ATA；QFNQ→AFNQ和QFNA)与不同的纯化抗体7B8、4G5和2B11的反应性进行ELISA测定。图中描述了不同抗体克隆对于突变蛋白质的灵敏度。
图41.来自2B11克隆的重链和轻链的CDR区域的序列分析。
图42.来自4G5克隆的重链和轻链的CDR区域的序列分析。
图43.来自7B8克隆的重链和轻链的CDR区域的序列分析。
图44.结肠癌的FFPE切片中使用7B8抗体的IHC分析。
图45.分析7B8在使用全细胞裂解物的Western印迹中的表现，并且结果证明抗-MUC1-C/ECD抗体与MUC1-C蛋白质的特异性反应性。293T细胞不表达MUC1，并且因此在western印迹分析中是阴性的。
图46.使用2B11、7B8和4G5抗体进行ELISA测定。结果表明没有抑制这些抗体中的三种与任何肽的反应性，表明表位不是线性的。
图47.7B8和3D1克隆的线性表位作图：重叠肽。合成跨越整个MUC1-C/ECD区域(58个氨基酸)的三个重叠肽。通过用MUC1-C/ECD抗原包被板且在P1、P2或P3肽存在或不存在的情况下与7B8或3D1纯化抗体孵育而进行ELISA测定。
图48A-B:使用点突变对7B8和3D1构象表位作图。在MUC1-C/ECD区域中生成八个关键单独点突变，并且纯化各自的蛋白质。用这八种纯化蛋白质包被分开的96孔板。将7B8和3D1纯化抗体与这些板各自孵育，并且进行ELISA测定。
图49.7B8和3D1的构象表位作图。ZR-75-1乳腺癌细胞获得自ATCC，并且维持于具有10％热灭活的胎牛血清加上抗生素的DMEM中。将细胞与纯化的MUC1-C/ECD蛋白质或与相应体积的PBS孵育。孵育之后，添加7B8或3D1抗体，并且制备细胞用于流式细胞术分析。DF3抗体用作阳性对照，并且抗-MUC1-C/CD抗体(CD1)用作阴性对照。适当步骤之后，通过FLOW分析细胞。
图50.杂交瘤441.3.3D1.D6.D11.B1.F10的单克隆抗体测序。从冷冻杂交瘤细胞提取总RNA，并且从RNA合成cDNA。然后进行PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)，然后将其分别克隆入标准的克隆载体并测序。对五个具有正确的VH和VL插入物大小的单菌落进行测序。图中以正常字体显示前导氨基酸序列(重链)和前导氨基酸序列(轻链)，CDR加下划线，且构架区域呈粗体。重链＝SEQ ID NO:82；轻链＝SEQ ID NO:83。
图51A-B.7B8和3D1抗体的抗体-药物缀合物(ADC)和这些抗体-药物缀合物的生物活性。
图52A-B.提供的杂交瘤536064-1的总RNA的琼脂糖凝胶电泳。(图52A)DNA标记III。(图52B)泳道M，DNA标记III；泳道R，536064-1的总RNA。
图53.536064-1的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。泳道M，DNA标记III；泳道1，VH536064-1；泳道2，VL 536064-1。
说明性实施方案的描述
本发明人已经产生针对MUC1-C蛋白质的外部结构域的58氨基酸非脱落部分的抗体。已经表明这些抗体选择性结合至MUC1-C的该部分，因此，呈现了在切割N-末端区域之后阻断MUC1的活性的机会。它们也可以用于将治疗有效载荷递送至表达MUC1的癌细胞，甚至在切割N-末端MUC1结构域之后。下面更详细描述本发明的这些和其它方面。
I.MUC1
A.结构
MUC1是粘蛋白型糖蛋白，其表达于正常分泌性上皮细胞的顶边界(Kufe等人，1984)。MUC1在合成为单一肽合成并在内质网中将前体切割成两个亚基之后形成异源二聚体(Ligtenberg等人，1992)。切割可由自催化过程介导(Levitan等人，2005)。>250kDaMUC1N-末端(MUC1N-ter，MUC1-N)亚基含有可变数目的20个氨基酸串联重复，其因高度保守变化而不完美并且被O-连接的聚糖修饰(Gendler等人，1988；Siddiqui等人，1988)。MUC1-N通过与～23kDa C-末端亚基(MUC1C-ter，MUC1-C)二聚化而栓系于细胞表面，所述C-末端亚基包含58氨基酸胞外区、28氨基酸跨膜结构域和72氨基酸胞质结构域(CD)(Merlo等人，1989)。其为本发明的抗体结合的MUC1-C/ECD的58氨基酸部分(斜体)。下面显示人MUC1-C序列：
VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFP
粗体序列表示CD，且加下划线部分是寡聚化抑制肽。随着正常上皮转化成癌，MUC1在胞质溶胶内和整个细胞膜上异常过表达(Kufe等人，1984；Perey等人，1992)。细胞膜结合的MUC1通过网格蛋白介导的内吞作用靶向至内涵体(Kinlough等人，2004)。此外，MUC1-C、而不是MUC1-N，被靶向至核(Baldus等人,2004；Huang等人,2003；Li等人,2003a；Li等人,2003b；Li等人,2003c；Wei等人,2005；Wen等人,2003)和线粒体(Ren等人,2004)。
B.功能
MUC1-C与ErbB受体家族的成员(Li等人，2001b；Li等人，2003c；Schroeder等人，2001)和Wnt效应物、β-联蛋白(Yamamoto等人，1997)相互作用。表皮生长因子受体和c-Src将MUC1胞质结构域(MUC1-CD)的Y-46磷酸化，由此增加MUC1和β-联蛋白的结合(Li等人，2001a；Li等人，2001b)。MUC1和β-联蛋白的结合也被糖原合酶激酶3β和蛋白激酶Cδ调节(Li等人，1998；Ren等人，2002)。MUC1与β-联蛋白共定位于核内(Baldus等人，2004；Li等人，2003a；Li等人，2003c；Wen等人，2003)，并共同活化Wnt目标基因的转录(Huang等人，2003)。其它研究已经显示MUC1还直接结合至p53并调节p53目标基因的转录(Wei等人，2005)。值得注意的是，MUC1-C的过表达足以诱导非锚定依赖的生长和致瘤性(Huang等人，2003；Li等人，2003b；Ren等人，2002；Schroeder等人，2004)。
II.产生单克隆抗体
A.总体方法
针对MUC1-C/ECD的抗体可以通过如本领域中众所周知的方法来产生(参见例如Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；美国专利4,196,265)。用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常与用于制备多克隆抗体的方法沿相同路线开始。这两种方法的第一步是免疫合适宿主或鉴定由于之前天然感染而被免疫的受试者。如本领域中众所周知，用于免疫的给定组合物可以在其免疫原性上不同。因此，加强宿主免疫系统通常是必要的，如同可以通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。示例性且优选的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白诸如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可以用作载体。用于缀合多肽与载体蛋白的方法是本领域中众所周知的，并且包括戊二醛、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双重氮联苯胺。本领域中还众所周知的是，特定免疫原组合物的免疫原性可以通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。示例性且优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有杀灭的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的免疫应答非特异性刺激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而不同。多种途径可用于施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。多克隆抗体的产生可以通过在免疫后多个点取样经免疫的动物的血液来监测。还可以给予第二次加强注射。重复加强和滴定的过程，直到达到合适的滴度。当获得期望水平的免疫原性时，可以将免疫的动物放血并分离血清并储存，和/或将动物用于产生MAb。
免疫之后，具有产生抗体潜力的体细胞(具体为B淋巴细胞(B细胞))选择用于MAb产生方案。这些细胞可以从活检的脾或淋巴结或从循环血中获得。来自免疫的动物的产生抗体的B淋巴细胞然后与无限增殖的骨髓瘤细胞(通常为与已免疫的动物相同的物种或人或人/小鼠嵌合细胞之一)的细胞融合。适合用于产生杂交瘤融合程序的骨髓瘤细胞系优选为非抗体产生性的，具有高融合效率，和酶缺乏，所述酶缺乏进而使得无法在某些仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的选择性培养基中生长。
可以使用大量骨髓瘤细胞的任何一种，如本领域技术人员所知的(Goding,第65-66页,1986；Campbell,第75-83页,1984)。例如，当免疫的动物是小鼠时，技术人员可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠，技术人员可以使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；并且U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6与人细胞融合相关均为可用的。一种具体的鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)，其通过要求细胞系储存号GM3573可容易地获自NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository。可以使用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性的小鼠鼠骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。更近地，已描述了用于与人B细胞使用的额外的融合伴侣系，包括KR12(ATCC CRL-8658；K6H6/B5(ATCC CRL-1823 SHM-D33(ATCC CRL-1668)和HMMA2.5(Posner等人，1987)。本发明中的抗体使用SP2/0/mIL-6细胞系(SP2/0系的分泌IL-6的衍生物)生成。
用于生成产生抗体的脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂交物的方法通常包括在促进细胞膜融合的一种或多种试剂(化学的或电的)存在的情况下，将体细胞与骨髓瘤细胞以2:1比例混合，尽管该比例可以分别从约20:1至约1:1变化。使用仙台病毒的融合方法已由Kohler和Milstein(1975；1976)描述，以及使用聚乙二醇(PEG)的方法，诸如37％(v/v)PEG，由Gefter等(1977)描述。电诱导的融合方法的使用也是合适的(Goding,pp.71-74,1986)。
融合程序通常以低频率(约1×10-6至1×10-8)产生活的杂交物。然而，这不会产生问题，因为通过在选择性培养基上培养，活的、融合的杂交物与亲代、未融合的(infused)细胞(特别是未融合的骨髓瘤细胞，其将通常持续不确定地分裂)被区分。选择性培养基通常是含有阻断组织培养基中核苷酸的重新合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤、和偶氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的重新合成，而偶氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。在使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，培养基补充有次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。在使用偶氮丝氨酸时，培养基补充有次黄嘌呤。如果B细胞来源是转化EB病毒(EBV)的人B细胞系，则加入哇巴因，以排除未与骨髓瘤融合的EBV转化的系。
优选的选择培养基是HAT或具有哇巴因的HAT。只有能够运行核苷酸补救途径的细胞才能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，并且它们无法存活。B细胞可以运行该途径，但它们在培养中具有有限的生存期，并且通常在约两周内死亡。因此，只有能够在选择性培养基中存活的细胞是那些从骨髓瘤和B细胞形成的杂交物。当用于融合的B细胞来源是EBV转化的B细胞系时，同样，也使用哇巴因用于杂交物的药物选择，因为EBV转化的B细胞对于药物杀死是易感的，而所用的骨髓瘤伴侣被选为哇巴因抗性的。
培养提供了杂交瘤的群体，从中选择特定的杂交瘤。通常，通过培养细胞由在微量滴定板中单克隆稀释，随后测试单独的克隆上清液(在约2至3周后)的期望的反应性来完成杂交瘤的选择。测定应该是灵敏、简单且快速的，诸如放射性免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、点免疫结合测定等。
然后将所选的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并克隆入单独的抗体产生细胞系，该克隆可以随后不确定地繁殖以提供mAb。可以以两种基本方式开发细胞系的MAb产生。可以将杂交瘤样品注射(通常注射入腹膜腔)入动物(例如小鼠)。任选地，注射前用烃引发动物，尤其是油诸如姥鲛烷(四甲基十五烷)。当以这种方式使用人杂交瘤时，优选注射无免疫应答的小鼠，诸如SCID小鼠，以防止肿瘤排斥。注射的动物发生由融合的细胞杂交物产生的分泌特异性单克隆抗体的肿瘤。动物的体液诸如血清或腹水液可随后放出以提供高浓度的MAb。单独的细胞系还能够体外培养，其中MAb天然分泌入培养基中，从中可以容易地将它们以高浓度获得。或者，可以体外使用人杂交瘤细胞系来在细胞上清液中产生免疫球蛋白。细胞系可以适应于在无血清培养基中生长以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。
如需要，由任一种方法产生的MAb可以进一步纯化，其使用过滤、离心和多种层析方法诸如FPLC或亲和层析。本发明的单克隆抗体的片段可以获自纯化的单克隆抗体，其通过包括用酶诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化在内的方法，和/或通过化学还原裂解二硫键。或者，本发明包括的单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪来合成。
还考虑的是可以使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。为此，可以从杂交瘤系分离RNA并通过RT-PCR获得抗体基因并克隆入免疫球蛋白表达载体。或者，从分离自细胞系的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并通过使用病毒抗原淘选来选择表达合适抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优点是多至大约104倍的抗体可以在单一轮次中产生并筛选，并且通过H链和L链组合产生新的特异性，其进一步增加了发现合适抗体的机会。
教导了用于本发明中的抗体产生的其它美国专利(其每一个通过引用并入本文)包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；和美国专利4,867,973，其描述了抗体治疗剂缀合物。
B.本发明的抗体
在第一种情况下，本发明的抗体可以通过其结合特异性来定义，所述结合特异性在该情况下对于MUC1-C/ECD，具体而言：
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG
(SEQ ID NO:2)。通过使用本领域技术人员众所周知的技术来评估给定抗体的结合特异性/亲和力，本领域技术人员能够确定这样的抗体是否落入本权利要求的范围内。
在一个实施方案中，所述抗体是免疫球蛋白质G(IgG)抗体同种型。占人中的血清免疫球蛋白的约75％，IgG是循环中发现的最富集的抗体同种型。IgG分子由血浆B细胞合成和分泌。人中存在四种IgG亚类(IgG1、2、3和4)，以它们在血清中的丰度的顺序进行命名(IgG1是最富集的)。对于Fc受体具有高亲和力至无亲和力的范围。
IgG是血液和细胞外液中发现的主要抗体同种型，允许其直接控制身体组织的感染。通过结合多种病原体-代表病毒、细菌和真菌-IgG保护身体免于感染。其经由几种免疫机制做到这一点：病原体的IgG介导的结合引起其经由凝集固定和结合在一起；病原体表面的IgG包被(也称为调理作用)允许通过吞噬免疫细胞识别和摄取它们；IgG活化补体系统的经典途径，导致病原体消除的免疫蛋白质产生的级联；IgG也结合并中和毒素。IgG还在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和胞内抗体介导的蛋白质水解中发挥重要作用，其中其结合至TRIM21(人中对于IgG具有最大亲和力的受体)，以便将标记版本引导至胞质溶胶中的蛋白酶体。IgG还与II型和III型超敏性相关。IgG抗体在抗体应答的类型转换和成熟之后生成，因此主要参与次级免疫应答。IgG作为单体分泌，所述单体尺寸小，允许其容易输注组织。其为具有受体以促进穿过人胎盘的唯一同种型。连同母乳中分泌的IgA，通过胎盘吸收的剩余IgG在新生儿自身的免疫系统发育之前为其提供体液免疫。初乳含有高百分比的IgG，尤其是牛初乳。在具有对病原体的先前免疫的个体中，IgG在抗原刺激之后约24-48小时出现。
在另一个方面，所述抗体可以通过确定其结合特异性的其可变序列来定义。下面提供了实例：
表1–抗体CDR序列
另外，抗体序列也可与上面提供的序列不同，其任选地使用下面更详细讨论的方法。例如，氨基酸序列与上述序列不同之处可在于：
(a)可变区可与轻链的恒定区分离，(b)氨基酸可与上述序列不同，同时由此不急剧影响残基的化学特性(所谓的保守取代)，(c)氨基酸可与上述序列相差给定百分比，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。或者，编码抗体的核酸可以(a)与轻链的恒定结构域分离，(b)与上述序列不同，同时不改变由此编码的残基，(c)可与上述序列相差给定百分比，例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，或(d)凭借在高严格条件下杂交的能力与上述序列不同，所述高严格条件如例举为低盐和/或高温条件，诸如由约50℃至约70℃的温度下的约0.02M至约0.15MNaCl所提供。
在氨基酸序列中进行保守改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予对蛋白质的相互作用的生物学功能上的重要性是本领域通常理解的(Kyte和Doolittle,1982)。接受的是氨基酸的相关亲水特征促成产生的蛋白质的二级结构，其进而定义蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
在本领域还理解的是基于亲水性可以有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(其通过引用并入本文)陈述了蛋白质的最高局部平均亲水性(由其相邻的氨基酸的亲水性所控制)与蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中详述，以下亲水性值已分配于氨基酸残基：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性、非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)，含硫的氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性、非芳香族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性、芳香族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
应当理解的是氨基酸可以取代为另一个具有相似亲水性的氨基酸，并且产生生物学上或免疫学上修饰的蛋白质。在这样的改变中，优选其亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，在±1以内的那些是尤其优选的，并且在±0.5以内的那些是甚至更尤其优选的。
如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑多种前述特征的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
C.抗体序列的工程改造
在各个实施方案中，可以由于多种原因选择来工程改造鉴定的抗体的序列，诸如改进表达、改进交叉反应性、消除脱靶(off-target)结合或废除一种或多种天然效应功能，诸如活化补体或招募免疫细胞(例如，T细胞)。具体而言，IgM抗体可以被转化为IgG抗体。以下内容是用于抗体工程改造的相关技术的一般讨论。
可以培养杂交瘤，然后裂解细胞，并提取总RNA。可以使用随机六聚物用RT来产生RNA的cDNA拷贝，并随后使用预期扩增全部人可变基因序列的PCR引物的多重混合物来进行PCR。可以将PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体，然后通过自动DNA测序使用标准载体引物来测序。结合和中和测定可以使用从杂交瘤上清液收集并通过FPLC使用蛋白质G柱纯化的抗体来进行。重组全长IgG抗体可以通过将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆入LonzapConIgG1或pConK2质粒载体，转染入293自由式(Freestyle)细胞或Lonza CHO细胞来产生，并且从CHO细胞上清液中收集并纯化。
在与最后cGMP制造过程相同的宿主细胞和细胞培养过程中生产的抗体的快速可获得性具有缩短工艺开发程序的持续时间的潜力。Lonza已经开发了使用CDACF培养基中生长的合并的转染物的通用方法，其用于在CHO细胞中快速产生少量(多达50g)抗体。尽管比真实瞬时系统稍慢，但优点包括更高的产物浓度，和使用与生产细胞系相同的宿主和过程。在可丢弃的生物反应器中表达模式抗体的GS-CHO合并物的生长和产生的实例：在分批补料模式下操作的可丢弃袋式生物反应器培养物中(5L工作体积)，在9周的转染内实现了2g/L的收获抗体浓度。
pCon VectorsTM是再表达完整抗体的简单方法。恒定区载体是一组提供一定范围的克隆入pEE载体中的免疫球蛋白恒定区载体的载体。这些载体提供具有人恒定区的全长抗体的简单构建和GSSystemTM的便利。
抗体分子将包含片段(诸如F(ab’)、F(ab’)2)，其例如通过mAb或例如可经重组方法产生的单链免疫球蛋白的蛋白水解切割来产生。这样的抗体衍生物是单价的。在一个实施方案中，这样的片段可以彼此组合，或与其它抗体片段或受体配体组合，以形成“嵌合”结合分子。值得注意的是，这样的嵌合分子可以含有能够结合相同分子的不同表位的取代基(substituent)。
可期望当在人疗法中使用时，将非人宿主中产生的抗体“人源化”以减轻任何免疫反应。可以在体外或体内背景下研究这样的人源化抗体。人源化抗体可以例如通过用相应、但非免疫原性部分来替代抗体的免疫原性部分来产生(即嵌合抗体)。PCT申请PCT/US86/02269；EP申请184,187；EP申请171,496；EP申请173,494；PCT申请WO86/01533；EP申请125,023；Sun等人(1987)；Wood等人(1985)；和Shaw等人(1988)；所有这些参考文献均通过引用并入本文。“人源化”嵌合抗体的总体综述由Morrison(1985)提供；其也通过引用并入本文。“人源化”抗体可以另外由CDR或CEA取代来产生。Jones等人(1986)；Verhoeyen等人(1988)；Beidler等人(1988)；其所有均通过引用并入本文。
在相关的实施方案中，所述抗体是公开的抗体的衍生物，例如包含与公开的抗体中的CDR序列相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合、人源化或CDR移植抗体)。在又进一步的实施方案中，所述抗体是完全人重组抗体。
本发明还考虑同种型修饰。通过修饰Fc区以具有不同的同种型，可以实现不同的功能性。例如，对IgG4的改变可以减少与其它同种型相关的免疫效应功能。
修饰抗体可以通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，包括通过标准分子生物学技术表达，或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文件中别处提及。
D.表达
根据本发明的核酸将编码抗体，所述抗体任选地连接至其它蛋白质序列。如本申请中所使用，术语“编码MUC1-C抗体的核酸”是指已经分离的不含总细胞核酸的核酸分子。在某些实施方案中，本发明涉及由本文所述的任何序列编码的抗体。
表2–密码子
本发明的DNA区段包括编码上述序列的生物功能等同的蛋白质和肽的那些。这样的序列可以因已知在核酸序列和因此编码的蛋白质中自然发生的密码子冗余和氨基酸功能等同性而产生。或者，可以经由应用重组DNA技术来生成功能等同的蛋白质或肽，其中可以基于所更换的氨基酸的特性的考虑来工程改造蛋白质结构中的变化。由人设计的变化可以通过应用定点诱变技术来引入或者可以随机引入并在之后针对期望功能进行筛选，如下文所述。
在某些实施方案内，使用表达载体来表达MUC1-C配体俘获物以产生和分离由其表达的多肽。在其它实施方案中，表达载体用于基因疗法中。表达要求载体中提供适当的信号，其包括多种调节元件，诸如驱动宿主细胞中的目标基因的表达的来自病毒和哺乳动物来源两者的增强子/启动子。还定义了设计为优化宿主细胞中的信使RNA稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用许多显性药物选择标记用于建立表达产物的持久、稳定细胞克隆的条件，这是将药物选择标记的表达与多肽的表达联系的元件。
在整个本申请中，术语“表达构建体”意在包括任何类型的含有编码基因产物的核酸的遗传构建体，其中部分或所有编码序列的核酸能够被转录。转录物可以被翻译为蛋白质，但其不需如此。在某些实施方案中，表达包括基因的转录和mRNA翻译为基因产物二者。在其它实施方案中，表达仅包括编码目标基因的核酸的转录。
术语“载体”用于指载体核酸分子，其中可以插入用于引入其可在其中复制的细胞中的核酸序列。核酸序列可以是“外源性的”，这意指其对于其中引入了载体的细胞是外来的，或所述序列对于细胞中的序列是同源的，但在宿主细胞核酸内的位置不是通常发现序列的位置。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员充分能够通过标准重组技术来构建载体(其描述于Sambrook等人(1989)和Ausubel等人(1994)，两者均通过引用并入本文)。
术语“表达载体”是指含有编码能够被转录的基因产物的至少部分的核酸序列的载体。在一些情况下，然后将RNA分子翻译成蛋白质、多肽或肽。在其它情况下，例如，在反义分子或核糖酶的产生中，这些序列没有被翻译。表达载体可以含有各种“控制序列”，这是指可操作连接的编码序列在特定宿主生物体中转录和可能翻译所必需的核酸序列。除了支配转录和翻译的控制序列以外，载体和表达载体可以含有同样发挥其它功能的核酸序列并且下文描述。
1.调节元件
“启动子”是在控制起始和转录速率的核酸序列的区域的控制序列。其可以含有调节蛋白质和分子诸如RNA聚合酶和其它转录因子可以结合的遗传元件。短语“可操作放置”、“可操作连接”、“在…控制下”和“在转录控制下”意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或取向中，来控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可以与或可以不与“增强子”结合使用，所述“增强子”是指参与核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列。
启动子可以是天然与基因或序列相关的启动子，其可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码区来获得。这样的启动子可以被称为“内源的”。类似地，增强子可以是天然与核酸序列相关的增强子，其位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸区段放置在重组或异源启动子的控制下而获得特定优势，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中天然不与核酸序列缔合的启动子。
重组或异源增强子也是指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，从任何其它原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子，和非“天然存在的”启动子或增强子，即，含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列以外，可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCRTM，结合本文公开的组合物，来产生序列(参见美国专利4,683,202、美国专利5,928,906，其各自通过引用并入本文)。此外，考虑同样可以利用指导序列在无核细胞器(诸如线粒体、叶绿体等)内转录和/或表达的控制序列。
当然，利用有效地指导DNA区段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中表达的启动子和/或增强子是重要的。分子生物学领域的技术人员通常知道使用启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达，例如，参见Sambrook等人，(1989)，其通过引用并入本文。利用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的，和/或在适当条件下可用于指导引入的DNA区段的高水平表达，诸如在重组蛋白质和/或肽的大规模生产中是有利的。所述启动子可以是异源的或内源的。
表3列出可以在本发明的背景下用于调节基因的表达的几种元件/启动子。该列表不意欲穷举参与促进表达的所有可能的元件，但仅仅是其示例。表4提供作为可以响应于特定刺激物活化的核酸序列的区域的诱导型元件的实例。
组织特异性启动子或元件的身份，以及表征其活性的测定法，是本领域技术人员众所周知的。这样的区域的实例包括人LIMK2基因(Nomoto等人，1999)、生长激素抑制素受体2基因(Kraus等人，1998)、鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等人，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等人，1998)、小鼠α2(XI)胶原蛋白(Tsumaki等人，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee等人，1997)、胰岛素-样生长因子II(Wu等人，1997)、人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等人，1996)。肿瘤特异性启动子也将发现用于本发明中。一些这样的启动子记载于表5中。
表5-用于癌症基因疗法的候选组织特异性启动子
编码序列的有效翻译也可以需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可以需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始信号。本领域普通技术人员将容易地能够确定这并提供必需信号。众所周知的是起始信号必须与期望编码序列的阅读框是“同框的”以确保完整插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过包括适当的转录增强子元件来增强表达的效率。
2.IRES
在本发明的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来生成多基因或多顺反子信使。IRES元件能够绕过5’-甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg,1988)，以及来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以连接至异源开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，各自通过IRES隔开，生成多顺反子信使。凭借IRES元件，各开放阅读框易接近于用于有效翻译的核糖体。可以使用单一启动子/增强子来转录单一信使而有效表达多个基因(参见美国专利5,925,565和5,935,819，其通过引用并入本文)。
3.多目的克隆位点
载体可以包括多克隆位点(MCS)，其是含有多个限制性酶位点的核酸区，其中任一个可以与标准重组技术结合使用，以消化载体。参见，Carbonelli等人，1999，Levenson等人，1998，和Cocea，1997，其通过引用并入本文。“限制性酶消化”是指用仅在核酸分子中的特定位置发挥功能的酶催化核酸分子的切割。这些限制性酶中的许多是商购的。使用这样的酶是本领域技术人员广泛理解的。通常，使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或片段化，使得能够将外源序列连接至载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，其可以是或可以不是彼此邻接的。涉及限制性酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员众所周知的。
4.剪接位点
大部分转录的真核RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物去除内含子。含有基因组真核序列的载体可需要供体和/或受体剪接位点来确保转录物的正确加工用于蛋白质表达(参见，Chandler等人，1997，其通过引用并入本文)。
5.终止信号
本发明的载体或构建体通常将包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与通过RNA聚合酶特异性终止RNA转录的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，考虑结束RNA转录物的产生的终止信号。终止子可以对于获得所需信使水平是体内必需的。
在真核系统中，终止子区域还可以包含允许新转录物的位点特异性切割、使得暴露聚腺苷酸化位点的特异性DNA序列。这信号传导至专化内源性聚合酶，将一段约200A残基(polyA)添加至转录物的3’端。用该polyA尾部修饰的RNA分子似乎更稳定并且更有效地翻译。因此，在涉及真核细胞的其它实施方案中，优选终止子包含用于RNA的切割的信号，并且更优选终止子信号促进信使的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可以用于增强信使水平和/或尽可能降低从盒通过至其它序列的阅读。
考虑用于本发明中的终止子包括本文所述的或本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列，诸如例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，诸如例如SV40终止子。在某些实施方案中，诸如由于序列截短，终止信号可以缺乏可转录或可翻译的序列。
6.聚腺苷酸化信号
在表达中，特别是真核表达，通常将包括聚腺苷酸化信号来实现转录物的正确聚腺苷酸化。认为聚腺苷酸化信号的性质对于本发明的成功实践不是关键的，和/或可以利用任何这样的序列。优选的实施方案包括在各种目标细胞中方便的和/或已知很好发挥功能的SV40聚腺苷酸化信号和/或牛生长激素聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化可以增加转录物的稳定性或可以便于胞质转运。
7.复制起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，其可以含有一个或多个复制起点(常常称为“ori”)，其是起始复制的特定核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以使用自主复制序列(ARS)。
8.可选择和可筛选标记
在本发明的某些实施方案中，可以通过在表达载体中包括标记而在体外或体内鉴定含有本发明的核酸构建体的细胞。这样的标记将可鉴定变化赋予细胞，允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。通常，可选择标记是赋予允许选择的特性的标记。阳性可选择标记是标记的存在允许其选择的标记，而阴性可选择标记是其存在防止其选择的标记。阳性可选择标记的实例是药物抗性标记。
通常，包括药物选择标记有助于转化子的克隆和鉴定，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇的抗性的基因是有用的可选择标记。除了赋予允许基于条件实施而区分转化子的表型的标记以外，还考虑其它类型的标记，包括可筛选标记，诸如GFP，其基础是比色分析。或者，可以利用可筛选酶，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。本领域技术人员也知道如何可能结合FACS分析利用免疫标记。认为使用的标记不是重要的，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达。可选择和可筛选标记的进一步实例是本领域技术人员众所周知的。
9.病毒载体
某些病毒载体有效地感染或进入细胞以整合入宿主细胞基因组并稳定表达病毒基因的能力已经导致许多不同病毒载体系统的开发和应用(Robbins等人，1998)。目前正在开发病毒系统用作离体和体内基因转移的载体。例如，目前正在针对疾病诸如癌症、囊性纤维化、戈谢病、肾病和关节炎的治疗评估腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒和腺相关病毒(Robbins和Ghivizzani，1998；Imai等人，1998；美国专利5,670,488)。取决于特定基因治疗应用，下述各种病毒载体呈现特定优点和缺点。
腺病毒载体。在具体实施方案中，考虑腺病毒表达载体用于递送表达构建体。“腺病毒表达载体”意指包括含有腺病毒序列的那些构建体，所述腺病毒序列足以(a)支持构建体的包装和(b)最终表达其中已经克隆的组织或细胞特异性构建体。
腺病毒包含具有大小范围为30至35kb的基因组的线性、双链DNA(Reddy等人,1998；Morrison等人,1997；Chillon等人,1999)。根据本发明的腺病毒表达载体包含腺病毒的遗传工程改造的形式。腺病毒基因转移的优点包括感染多种多样的细胞类型、包括非分裂细胞的能力，中型基因组，易于操作，高感染性和生长至高滴度的能力(Wilson,1996)。进一步，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以附加体方式复制，而没有与其它病毒载体相关的潜在遗传毒性。腺病毒也是结构稳定的(Marienfeld等人,1999)，并且在大量扩增之后没有检测到基因组重排(Parks等人,1997；Bett等人,1993)。
腺病毒基因组的显著特征是早期区域(E1、E2、E3和E4基因)，中间区域(pIX基因、Iva2基因)，晚期区域(L1、L2、L3、L4和L5基因)，主要晚期启动子(MLP)，反向末端重复(ITR)和ψ序列(Zheng,等人,1999；Robbins等人,1998；Graham和Prevec,1995)。早期基因E1、E2、E3和E4在感染之后从病毒表达，并且编码调节病毒基因表达、细胞基因表达、病毒复制和细胞凋亡的抑制的多肽。更进一步，在病毒感染过程中，MLP被活化，导致编码腺病毒衣壳化所需的多肽的晚期(L)基因的表达。中间区域编码腺病毒衣壳的组分。腺病毒反向末端重复(ITR；长度为100-200bp)是顺式元件，并且作为复制起点发挥功能，并且是病毒DNA复制所必需的。ψ序列是腺病毒基因组的包装所需的。
用于生成用于用作基因转移载体的腺病毒的常见方法是缺失E1基因(E1-)，其参与E2、E3和E4启动子的诱导(Graham and Prevec,1995)。随后，可以重组一种或多种治疗性基因代替E1基因，其中一种或多种治疗性基因的表达由E1启动子或异源启动子驱动。E1-、复制缺陷的病毒然后在“辅助”细胞系(例如，人胚胎肾细胞系293)中增殖，所述“辅助”细胞系可以反式提供E1多肽。因此，在本发明中，在已经去除E1编码序列的位置引入转化构建体可以是方便的。然而，腺病毒序列内插入构建体的位置对于本发明不是关键的。或者，可以缺失E3区域、E4区域的部分或两者，其中将在真核细胞中可操作的启动子的控制下的异源核酸序列插入用于基因转移的腺病毒基因组(美国专利5,670,488；美国专利5,932,210，其各自具体通过引用并入本文)。
尽管基于腺病毒的载体提供了相比于其它载体系统的几个独特的优点，但它们经常受限于载体免疫原性、用于插入重组基因的大小限制和低水平的复制。缺失所有开放阅读框且包含全长肌营养不良蛋白基因和复制所需的末端重复的腺病毒载体的制备(Haecker等人,1996)提供了相比于上述腺病毒缺点的一些可能有希望的优势。所述载体与辅助病毒在293细胞中生长至高滴度，并且能够在mdx小鼠中，在肌管(在体外)和肌纤维(在体内)中有效地转导肌营养不良蛋白。下面讨论辅助依赖性病毒载体。
使用腺病毒载体中的主要担忧是在包装细胞系中的载体产生过程中或个体的基因疗法治疗过程中生成能够复制的病毒。能够复制的病毒的生成可以为患者造成意外的病毒感染和病理学后果的严重威胁。Armentano等人(1990)描述了复制缺陷的腺病毒载体的制备，其要求消除能够复制的腺病毒的无意生成的潜能(美国专利5,824,544，其具体通过引用并入本文)。复制缺陷的腺病毒方法包括缺失的E1区域和重定位的蛋白质IX基因，其中所述载体表达异源的哺乳动物基因。
除了腺病毒载体是复制缺陷的或至少条件性缺陷的要求以外，腺病毒载体的性质不被认为对于本发明的成功实施是至关重要的。所述腺病毒可以是42种不同的已知血清型和/或亚群A-F中的任一种。亚群C的5型腺病毒是优选的起始材料，以便获得条件性复制缺陷的腺病毒载体用于在本发明中使用。这是因为5型腺病毒是关于其大量生物化学和遗传信息是已知的人腺病毒，并且其在历史上已经用于采用腺病毒作为载体的大多数构建。
如上所述，根据本发明的典型载体是复制缺陷的，并且不具有腺病毒E1区域。腺病毒生长和操作是本领域技术人员已知的，并且表现出体外和体内的广泛宿主范围(美国专利5,670,488；美国专利5,932,210；美国专利5,824,544)。该组病毒可以以高滴度(例如，109至1011个空斑形成单位/ml)获得，并且它们是高感染性的。腺病毒的生命周期不要求整合入宿主细胞基因组。由腺病毒载体递送的外来基因是附加型的，因此，对宿主细胞具有低基因毒性。目前正在研究许多实验、创新、临床前研究和临床试验用于使用腺病毒作为基因递送载体。例如，正在开发基于腺病毒递送基因的基因疗法用于肝脏疾病(Han等人,1999)、精神疾病(Lesch,1999)、神经疾病(Smith,1998；Hermens和Verhaagen,1998)、冠状动脉疾病(Feldman等人,1996)、肌肉疾病(Petrof,1998)、胃肠道疾病(Wu,1998)和各种癌症诸如结肠直肠癌(Fujiwara和Tanaka,1998；Dorai等人,1999)、胰腺疾病、膀胱疾病(Irie等人,1999)、头颈疾病(Blackwell等人,1999)、乳房疾病(Stewart等人,1999)、肺部疾病(Batra等人,1999)和卵巢疾病(Vanderkwaak等人,1999)。
逆转录病毒载体。在本发明的某些实施方案中，考虑使用逆转录病毒用于基因递送。逆转录病毒是包含RNA基因组的RNA病毒。当逆转录病毒感染宿主细胞时，基因组RNA被逆转录成DNA中间体，所述DNA中间体被整合入受感染细胞的染色体DNA。该整合的DNA中间体被称为前病毒。逆转录病毒的特别优点是，它们可以通过整合入宿主DNA而用目标基因(例如，治疗性基因)稳定地感染正在分裂的细胞，而不表达免疫原性病毒蛋白质。理论上，整合的逆转录病毒载体将被保持持续受感染宿主细胞的生命，表达目标基因。
逆转录病毒基因组和前病毒DNA具有三种基因：gag、pol和env，其侧接两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)，且env基因编码病毒包膜糖蛋白质。5'和3'LTR起作用以促进病毒粒子RNA的转录和多聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其它顺式作用序列。
本发明的重组逆转录病毒可以以一定方式遗传修饰，所述方式使得天然病毒的一些结构、感染性基因已经被缺失且被替代为待递送至目标细胞的核酸序列(美国专利5,858,744；美国专利5,739,018，其各自通过引用并入本文)。病毒感染细胞之后，病毒将其核酸注入细胞，且逆转录病毒遗传物质可以整合入宿主细胞基因组中。转移的逆转录病毒遗传物质在宿主细胞内被转录并翻译成蛋白质。如同其它病毒载系统，在载体产生过程中或在疗法过程中生成能够复制的逆转录病毒是主要担忧。适用于本发明中使用的逆转录病毒载体是通常缺陷的逆转录病毒载体，其能够感染目标细胞，逆转录其RNA基因组，且将逆转录的DNA整合入目标细胞基因组，但不能在目标细胞内复制以产生感染性逆转录病毒颗粒(例如，转移入目标细胞的逆转录病毒基因组是gag(编码病毒粒子结构蛋白质的基因)和/或pol(编码基因逆转录酶的基因)缺陷的。因此，在适当的辅助病毒存在的情况下或在含有能够衣壳化、而不同时产生污染性辅助病毒的适当序列的细胞系中，发生前病毒的转录和组装成感染性病毒。
逆转录病毒的生长和维持是本领域中已知的(美国专利5,955,331；美国专利5,888,502，其各自具体通过引用并入本文)。Nolan等人描述了包含异源基因的稳定的高滴度、无辅助的逆转录病毒的产生(美国专利5,830,725，其具体通过引用并入本文)。本发明考虑用于构建可用于生成具有双嗜性或亲嗜性宿主范围的无辅助的重组逆转录病毒的方法，以及使用重组逆转录病毒以便将目标基因体内和体外引入真核细胞的方法(美国专利5,955,331)。
目前，载体介导的基因递送的所有临床试验中的大多数使用基于鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒载体基因递送(Robbins等人,1998；Miller等人,1993)。逆转录病毒基因递送的缺点包括要求正在进行的细胞分裂用于稳定感染和防止大基因的递送的编码能力。然而，可以感染某些非正在分裂的细胞的载体诸如慢病毒(例如，HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和马感染性贫血病毒(EIAV)的新近发展可能允许体内使用逆转录病毒载体用于基因疗法应用(Amado和Chen,1999；Klimatcheva等人,1999；White等人,1999；Case等人,1999)。例如，基于HIV的载体已经用于感染非正在分裂的细胞，诸如神经元(Miyatake等人,1999)、胰岛(Leibowitz等人,1999)和肌细胞(Johnston等人,1999)。目前正在评价经由逆转录病毒的基因的治疗性递送用于治疗各种疾病，诸如炎性疾病(Moldawer等人,1999)、AIDS(Amado和Chen,1999；Engel和Kohn,1999)、癌症(Clay等人,1999)、脑血管疾病(Weihl等人,1999)和血友病(Kay,1998)。
疱疹病毒载体。单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型和Ⅱ型含有约150kb的双链、线性DNA基因组，其编码70-80个基因。野生型HSV能够裂解性地感染细胞且在某些细胞类型(例如，神经元)中建立潜伏。类似于腺病毒，HSV还可以感染多种细胞类型，包括肌肉(Yeung等人,1999)、耳(Derby等人,1999)、眼(Kaufman等人,1999)、肿瘤(Yoon等人,1999；Howard等人,1999)、肺(Kohut等人,1998)、神经元(Garrido等人,1999；Lachmann和Efstathiou,1999)、肝脏(Miytake等人,1999；Kooby等人,1999)和胰岛(Rabinovitch等人,1999)。
HSV病毒基因通过细胞RNA聚合酶II转录，并且受时间调节，导致转录和随后合成大致三种可辨别阶段或动力学类型的基因产物。这些阶段的基因被称为立即早期(IE)或α基因、早期(E)或β基因和晚期(L)或γ基因。病毒基因组到达新感染细胞的核中之后，立即转录IE基因。这些基因的有效表达不需要先前病毒蛋白质合成。需要IE基因的产物活化转录和调节病毒基因组的剩余部分。
对于治疗性基因递送中的使用，必须使HSV复制缺陷。已经描述了用于生成复制缺陷的HSV无辅助病毒的细胞系的方案(美国专利5,879,934；美国专利5,851,826，其各自具体以其整体通过引用并入本文)。一种IE蛋白质，ICP4，也称为α4或Vmw175，对于病毒感染性和从IE转变为晚期转录两者均为绝对需要的。因此，由于其在HSV基因表达的调控中的复杂、多功能性质和中心作用，ICP4通常是HSV基因研究的目标。
缺失ICP4的HSV病毒的表型研究表明，这样的病毒将可能可用于基因转移目的(Krisky等人,1998a)。使它们期望用于基因转移的缺失ICP4的病毒的一种特性是它们仅表达五种其它IE基因：ICP0、ICP6、ICP27、ICP22和ICP47(DeLuca等人,1985)，而不表达编码指导病毒DNA合成的蛋白质以及病毒的结构蛋白质的病毒基因。该特性对于尽可能减少对基因转移之后的宿主细胞代谢或免疫应答的可能的有害影响是期望的。除了ICP4以外，IE基因ICP22和ICP27的进一步缺失，显著改善HSV细胞毒性的降低且防止早期和晚期病毒基因表达(Krisky等人,1998b)。
已经在各种体外模型系统和体内用于疾病诸如帕金森氏病(Yamada等人,1999)、视网膜母细胞瘤(Hayashi等人,1999)、脑内和皮内肿瘤(Moriuchi等人,1998)、B-细胞恶性肿瘤(Suzuki等人,1998)、卵巢癌(Wang等人,1998)和杜氏肌营养不良症(Huard等人,1997)中表明了HSV在基因转移中的治疗潜能。
腺相关病毒载体。腺相关病毒(AAV)，细小病毒家族的成员，是越来越多地用于基因递送疗法的人病毒。AAV具有其它病毒系统中未发现的几个有利特征。首先，AAV可以感染范围广泛的宿主细胞，包括非正在分裂的细胞。第二，AAV可以感染来自不同物种的细胞。第三，AAV还没有与任何人或动物疾病相关，并且似乎不改变整合后宿主细胞的生物学特性。例如，据估计，人群体中的80-85％已经暴露于AAV。最后，AAV在宽范围的物理和化学条件下是稳定的，其适合于生产、储存和运输要求。
AAV基因组是含有4681个核苷酸的线性、单链DNA分子。AAV基因组通常包含在每一端侧接长度为约145bp的反向末端重复(ITR)的内部非重复基因组。ITR具有多种功能，包括DNA复制起点，并且作为病毒基因组的包装信号。基因组的内部非重复部分包括两个大开放阅读框，其被称为AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。rep和cap基因编码允许病毒复制和将病毒基因组包装为病毒粒子的病毒蛋白质。至少四种病毒蛋白质的家族从AAV rep区域表达，Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40，其根据其表观分子量命名。AAV cap区域编码至少三种蛋白质，VP1、VP2和VP3。
AAV是辅助依赖性病毒，其需要与辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘)共感染以形成AAV病毒粒子。在与辅助病毒的共感染不存在的情况下，AAV建立潜伏状态，其中病毒基因组插入宿主细胞染色体，但不产生感染性病毒粒子。随后辅助病毒的感染“拯救”整合的基因组，允许其复制和将其基因组包装成感染性AAV病毒粒子。尽管AAV可以感染来自不同物种的细胞，但辅助病毒必须是与宿主细胞相同物种的(例如，人AAV将在与犬腺病毒共感染的犬细胞中复制)。
已经通过缺失AAV基因组的内部非重复部分和在ITR之间插入异源基因而工程改造AAV以递送目标基因。可以将异源基因功能性连接至能够驱动目标细胞中的基因表达的异源启动子(组成型的，细胞特异性的，或可诱导的)。为了产生含有外源基因的感染性重组AAV(rAAV)，用含有异源基因的rAAV载体转染合适的生产细胞系。用具有在其各自内源启动子或异源启动子的控制下的AAV rep和cap基因的第二质粒同时感染生产细胞。最后，用辅助病毒感染生产细胞。
一旦这些因素聚集在一起，复制和包装异源基因，好像其为野生型AAV基因组。当用所得rAAV病毒粒子感染目标细胞时，异源基因进入并在目标细胞中表达。因为目标细胞缺乏rep和cap基因和腺病毒辅助基因，所以rAAV无法进一步复制、包装或形成野生型AAV。
然而，辅助病毒的使用呈现许多问题。首先，在rAAV生产系统中使用腺病毒引起宿主细胞产生rAAV和感染性腺病毒两者。污染的感染性腺病毒可以通过热处理灭活(56℃，1小时)。然而，热处理导致功能性rAAV病毒粒子的滴度下降约50％。第二，在这些制备物中存在不同量的腺病毒蛋白质。例如，在这样的rAAV病毒粒子制备物中获得的总蛋白质的约50％或更多是游离的腺病毒纤维蛋白质。如果不完全去除，这些腺病毒蛋白质具有从患者引发免疫应答的潜能。第三，采用辅助病毒的AAV载体生产方法需要使用和操作大量高滴度感染性辅助病毒，其呈现许多健康和安全问题，特别是关于疱疹病毒的使用。第四，在rAAV病毒粒子生产细胞中伴随产生辅助病毒颗粒从rAAV病毒粒子生产转移掉大量宿主细胞资源，可能导致较低的rAAV病毒粒子得率。
慢病毒载体。慢病毒是复合型逆转录病毒，除了一般逆转录病毒基因gag、pol和env基因以外，其还含有其它具有调节或结构功能的基因。这种较高复杂性使得病毒能够调节其生命周期，如在潜伏感染的进程中。一些慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。已经通过将HIV致病基因多重减弱而生成慢病毒载体，例如，缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef，使得载体生物安全。
重组慢病毒载体能够感染非正在分裂的细胞并且可以用于核酸序列的体内和离体基因转移和表达。慢病毒基因组和前病毒DNA具有逆转录病毒中发现的三种基因：gag、pol和env，其侧接两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白质。5’和3’LTR起作用以促进病毒粒子RNA的转录和多聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其它顺式作用序列。慢病毒具有额外基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。
5'LTR邻近的是基因组(tRNA引物结合位点)的逆转录和病毒RNA有效衣壳化成颗粒(Psi位点)必需的序列。如果衣壳化(或逆转录病毒RNA包装成感染性病毒粒子)必需的序列从病毒基因组丢失，则顺式缺陷阻止基因组RNA的衣壳化。然而，所得突变体仍然能够指导所有病毒粒子蛋白质的合成。
慢病毒载体是本领域中已知的，参见Naldini等人,(1996)；Zufferey等人,(1997)；美国专利6,013,516；和5,994,136。通常，这些载体是基于质粒的或基于病毒的，并且经配置以携带用于并入外源核酸、选择和将核酸转移入宿主细胞的必要序列。目标载体的gag、pol和env基因也是本领域中已知的。因此，将相关基因克隆入选择的载体，然后用于转化感兴趣的目标细胞。
能够感染非正在分裂的细胞的重组慢病毒(其中用携带包装功能(即gag、pol和env以及rev和tat)的两种或更多种载体转染合适的宿主细胞)描述于通过引用并入本文的美国专利5,994,136中。这描述了可以提供编码病毒gag和pol基因的核酸的第一载体和可以提供编码病毒env的核酸的另一载体，以产生包装细胞。将提供异源基因诸如本发明中的STAT-1α基因的载体引入该包装细胞得到生产细胞，其释放携带外源目标基因的感染性病毒颗粒。env优选为双嗜性包膜蛋白质，其允许转导人和其他物种的细胞。
可以通过连接包膜蛋白质与用于靶向至特定细胞类型的受体的抗体或特定配体而靶向重组病毒。通过将目标序列(包括调节区)与编码特定目标细胞上的受体的配体的另一基因一起插入病毒载体，例如，所述载体现在是目标特异性的。
提供病毒env核酸序列的载体与调节序列(例如，启动子或增强子)可操作缔合。所述调节序列可以是任何真核启动子或增强子，包括，例如，莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件，人巨细胞病毒增强子或牛痘P7.5启动子。在一些情况(诸如莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件)下，启动子-增强子元件位于LTR序列之内或邻近于LTR序列。
异源或外来核酸序列诸如本文的编码STAT-1α的多核苷酸序列与调节核酸序列可操作连接。优选地，所述异源序列与启动子连接，导致产生嵌合基因。异源核酸序列也可以在病毒LTR启动子-增强子信号或内部启动子的控制下，并且逆转录病毒LTR内保留的信号仍然可以导致转基因的有效表达。标志物基因可以用于测定载体的存在，并且因此，证实感染和整合。标志物基因的存在确保仅表达插入物的那些宿主细胞的选择和生长。典型的选择基因编码赋予针对抗生素和其它毒性物质(例如，组氨醇、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、甲氨蝶呤等)的抗性的蛋白质，和细胞表面标志物。
经由转染或感染入包装细胞系而引入载体。包装细胞系产生含有载体基因组的病毒颗粒。用于转染或感染的方法是本领域技术人员众所周知的。将包装载体和转移载体共转染至包装细胞系之后，从培养基回收重组病毒并通过本领域技术人员使用的标准方法滴定。因此，可以通过磷酸钙转染、脂转染或电穿孔，通常连同显性可选择标记，诸如neo、DHFR、Gln合成酶或ADA，随后在适当药物存在的情况下选择和分离克隆，而将包装构建体引入人细胞系。可选择标记基因可以在构建体中与包装基因物理连接。
慢病毒转移载体Naldini等人(1996)已经用于体外感染生长停滞的人细胞，并且在直接注射入成年大鼠的脑部之后转导神经元。该载体在将标志物基因体内转移入神经元方面是有效的，并且实现在可检测的病理不存在的情况下的长期表达。单次注射载体之后十个月分析的动物显示转基因表达的平均水平没有下降且没有组织病理学和免疫应答的迹象(Blomer等人,1997)。因此，在本发明中，可以离体接枝或移植被重组慢病毒感染的细胞，或体内感染细胞。
其它病毒载体。用于基因递送的病毒载体的开发和效用不断改进和进化。其它病毒载体诸如痘病毒；例如，牛痘病毒(Gnant等人,1999；Gnant等人,1999)，α病毒；例如，辛德毕斯病毒，塞姆利基森林病毒(Lundstrom,1999)，呼肠孤病毒(Coffey等人,1998)和甲型流感病毒(Neumann等人,1999)被考虑用于本发明中的使用，并且可以根据目标系统的必要特性进行选择。
在某些实施方案中，牛痘病毒载体被考虑用于本发明中使用。牛痘病毒是用于表达异源基因的特别有用的真核病毒载系统。例如，当适当工程改造重组牛痘病毒时，合成、加工蛋白质，并将其转运至质膜。近来已经表明牛痘病毒作为基因递送载体将基因转移至人肿瘤细胞，例如，EMAP-II(Gnant等人,1999)，内耳(Derby等人,1999)，神经胶质瘤细胞，例如，p53(Timiryasova等人,1999)和各种哺乳动物细胞，例如，P450(美国专利5,506,138)。牛痘病毒的制备、生长和操作描述于美国专利5,849,304和美国专利5,506,138(各自通过引用并入本文)。
在其它实施方案中，辛德毕斯病毒载体被考虑用于基因递送中使用。辛德毕斯病毒是α病毒属的种(Garoff和Li,1998)，其包括重要病原体诸如委内瑞拉、西部和东部马脑炎病毒(Sawai等人,1999；Mastrangelo等人,1999)。在体外，辛德毕斯病毒感染各种禽类、哺乳动物、爬行动物和两栖动物细胞。辛德毕斯病毒的基因组由长度为11,703个核苷酸的单链RNA的单分子组成。基因组RNA是感染性的，在5'末端加帽和在3'末端聚腺苷酸化，且充当mRNA。牛痘病毒26S mRNA的翻译产生多蛋白质，其被病毒和推测宿主编码的蛋白酶的组合翻译时和翻译后切割以得到三种病毒结构蛋白质，一种衣壳蛋白质(C)和两种包膜糖蛋白质(E1和PE2，病毒粒子E2的前体)。
辛德毕斯病毒的三个特征表明，其将是用于表达异源基因的有用载体。第一，其性质和实验室两者中的广泛宿主范围。第二，基因表达在宿主细胞的细胞质中发生，并且是快速和有效的。第三，RNA合成中的温度敏感的突变是可用的，其可以通过在感染之后的各个时间将培养物简单地移至非容许温度来调节异源编码序列的表达。辛德毕斯病毒的生长和维持是本领域中已知的(美国专利5,217,879，其具体通过引用并入本文)。
嵌合病毒载体。嵌合或杂合病毒载体正在开发用于治疗性基因递送中使用，且被考虑用于本发明中使用。已经描述了嵌合痘病毒/逆转录病毒载体(Holzer等人,1999)、腺病毒/逆转录病毒载体(Feng等人,1997；Bilbao等人,1997；Caplen等人,1999)和腺病毒/腺相关病毒载体(Fisher等人,1996；美国专利5,871,982)。
这些“嵌合”病毒基因转移系统可以利用两种或更多种亲本病毒物种的有利特征。例如，Wilson等人提供了嵌合载体构建体，其包含腺病毒的部分，AAV 5'和3'ITR序列和选择的转基因，如下所述(美国专利5,871,983，其具体通过引用并入)。
腺病毒/AAV嵌合病毒使用腺病毒核酸序列作为穿梭物以便将重组AAV/转基因基因组递送至目标细胞。杂合载体中利用的腺病毒核酸序列的范围可以为最小序列量(其需要使用辅助病毒来产生杂合病毒颗粒)至腺病毒基因的仅选择缺失(所述缺失的基因产物可以由选择的包装细胞在杂合病毒产生过程中供应)。至少，pAdA穿梭载体中利用的腺病毒核酸序列是腺病毒基因组序列，其中缺失所有病毒基因，且仅含有将腺病毒基因组DNA包装为预形成的衣壳头部所需的那些腺病毒序列。更具体地，利用的腺病毒序列是腺病毒的顺式作用的5'和3'反向末端重复(ITR)序列(其作为复制起点发挥功能)和天然5'包装/增强子结构域，其含有包装线性Ad基因组所需的序列和E1启动子的增强子元件。可以修饰腺病毒序列以含有期望的缺失、取代或突变，条件是没有消除期望的功能。
可用于上述嵌合载体的AAV序列是其中缺失rep和cap多肽编码序列的病毒序列。更具体地，利用的AAV序列是顺式作用的5'和3'反向末端重复(ITR)序列。这些嵌合体的特征在于高滴度转基因递送至宿主细胞和将转基因稳定整合入宿主细胞染色体的能力(美国专利5,871,983，其具体通过引用并入)。在杂合载体构建体中，所述AAV序列侧接以上讨论的选择的腺病毒序列。5'和3'AAV ITR序列本身侧接下述选择的转基因序列和相关的调节元件。因此，通过转基因形成且侧接5'和3'AAV序列的序列可以在载体的腺病毒序列的任何缺失位点处插入。例如，所述AAV序列期望地在腺病毒的缺失的E1a/E1b基因的位点处插入。或者，所述AAV序列可以在E3缺失、E2A缺失等等处插入。如果仅腺病毒5'ITR/包装序列和3'ITR序列用于杂合病毒中，则所述AAV序列在它们之间插入。
载体和重组病毒的转基因序列可以是基因、核酸序列或其反向转录物，对于编码蛋白质、多肽或目标肽片段的腺病毒序列是异源的。所述转基因以允许转基因转录的方式与调节组分可操作连接。转基因序列的组成将取决于所得杂合载体将投入的用途。例如，仅一种类型的转基因序列包括在宿主细胞中表达期望的基因产物的治疗性基因。这些治疗性基因或核酸序列通常编码产物，所述产物用于在患者中体内或离体施用和表达，以替代或校正遗传或非遗传的基因缺陷或治疗表观遗传病症或疾病。
10.非病毒转化
用于本发明中的用于细胞器、细胞、组织或生物体的转化的核酸递送的合适方法据信实际上包括可以将核酸(例如，DNA)引入细胞器、细胞、组织或生物体中的任何方法，如本文所述或如本领域普通技术人员已知。这样的方法包括，但不限于，DNA的直接递送，诸如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，其各自通过引用并入本文)，包括微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利5,789,215，其通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利5,384,253，其通过引用并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等人，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖，随后为乙二醇(Gopal，1985)；通过直接超声波加载(Fechheimer等人，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987；Wong等人，1980；Kaneda等人，1989；Kato等人，1991)；通过微粒轰击(PCT申请号WO94/09699和95/06128；美国专利5,610,042；5,322,783，5,563,055，5,550,318，5,538,877和5,538,880，其各自通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等人，1990；美国专利5,302,523和5,464,765，其各自通过引用并入本文)；或通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等人，1993；美国专利4,684,611和4,952,500，其各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA吸收(Potrykus等人，1985)。通过诸如这些的技术的应用，可以稳定或瞬时转化细胞器、细胞、组织或生物体。
注射。在某些实施方案中，可以经由一次或多次注射(即，针注射)，诸如，例如，皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内，将核酸递送至细胞器、细胞、组织或生物体。疫苗的注射方法是本领域普通技术人员众所周知的(例如，注射包含组合物的盐水溶液)。本发明的进一步实施方案包括通过直接微注射引入核酸。直接微注射已经用于将核酸构建体引入爪蟾(Xenopus)卵母细胞(Harland和Weintraub，1985)。
电穿孔。在本发明的某些实施方案中，经由电穿孔，将核酸引入细胞器、细胞、组织或生物体。电穿孔涉及将细胞和DNA的悬浮液暴露于高压放电。在该方法的一些变化中，利用某些细胞壁降解酶，诸如果胶降解酶，使得目标受体细胞比未处理的细胞更容易通过电穿孔转化(美国专利5,384,253，其通过引用并入本文)。或者，可以通过机械伤害，使受体细胞更容易转化。
使用电穿孔的真核细胞的转染已经非常成功。以该方式，已经用人κ-免疫球蛋白基因转染小鼠前-B淋巴细胞(Potter等人，1984)，并且已经用氯霉素乙酰转移酶基因转染大鼠肝细胞(Tur-Kaspa等人，1986)。
为了在细胞诸如例如植物细胞中通过电穿孔实现转化，可以采用脆弱组织诸如细胞或胚性愈伤组织的悬浮培养物，或者另外可以直接转化未成熟的胚胎或其它有机化组织。在该技术中，可以通过将所选细胞的细胞壁暴露于果胶降解酶(果胶酶)或者以受控的方式进行机械创伤，而部分降解它们。已经通过完整细胞的电穿孔转化的一些物种的实例包括玉米(美国专利5,384,253；Rhodes等人,1995；D’Halluin等人,1992)、小麦(Zhou等人,1993)、番茄(Hou和Lin,1996)、大豆(Christou等人,1987)和烟草(Lee等人,1989)。
也可以采用原生质体用于电穿孔转化植物细胞(Bates,1994；Lazzeri,1995)。例如，Dhir和Widholm在国际专利申请号WO92/17598(其通过引用并入本文)中描述了通过源自子叶的原生质体的电穿孔生成转基因大豆植物。已经描述原生质体转化的物种的其它实例包括大麦(Lazerri,1995)、高粱(Battraw等人,1991)、玉蜀黍(Bhattacharjee等人,1997)、小麦(He等人,1994)和番茄(Tsukada,1989)。
磷酸钙。在本发明的其它实施方案中，使用磷酸钙沉淀将核酸引入细胞中。已经使用该技术用腺病毒5DNA转染人KB细胞(Graham和VanDer Eb，1973)。还以该方式，用新霉素标记基因转染小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和Hela细胞(Chen和Okayama，1987)，并且用各种标记基因转染大鼠肝细胞(Rippe等人，1990)。
DEAE-葡聚糖：在另一个实施方案中，使用DEAE-葡聚糖、随后聚乙二醇将核酸递送入细胞中。以该方式，将报告子质粒引入小鼠骨髓瘤和红白血病细胞中(Gopal，1985)。
超声波加载。本发明的额外实施方案包括通过直接超声波加载引入核酸。已经通过超声波加载用胸苷激酶基因转染LTK-成纤维细胞(Fechheimer等人，1987)。
脂质体介导的转染。在本发明的一个进一步实施方案中，可以将核酸俘获于脂质复合物，诸如，例如，脂质体。脂质体是特征在于磷脂双层膜和内部含水介质的囊泡结构。多层脂质体具有由含水介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量水溶液中时，它们自发形成。在闭合结构形成前脂质组分经历自我重排，并且将水和溶解的溶质俘获在脂质双层之间(Ghosh和Bachhawat，1991)。还考虑与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)复合的核酸。
脂质体介导的核酸递送和外源DNA的体外表达已经非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987)。也已经表明了脂质体介导的递送以及培养的鸡胚、Hela和肝癌细胞中的外源DNA的表达的可行性(Wong等人，1980)。
在本发明的某些实施方案中，脂质体可以与凝血病毒(HVJ)复合。这已经显示出便于与细胞膜的融合并促进脂质体包裹的DNA的细胞进入(Kaneda等人，1989)。在其它实施方案中，脂质体可以与核非组蛋白染色体蛋白质(HMG-1)结合复合或利用(Kato等人，1991)。在又进一步实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1两者结合复合或利用。在其它实施方案中，递送载体可以包含配体和脂质体。
受体介导的转染。又进一步，可以经由受体介导的递送媒介物将核酸递送至目标细胞。这些利用将在目标细胞中发生的受体介导的胞吞作用的大分子的选择性摄取。鉴于各种受体的细胞类型特异性的分布，该递送方法给本发明增加另一程度的特异性。
某些受体介导的基因靶向媒介物包含细胞受体特异性配体和核酸结合剂。其它包含已经可操作附接的待递送核酸的细胞受体特异性配体。几种配体已经用于受体介导的基因转移(Wu和Wu，1987；Wagner等人，1990；Perales等人，1994；Myers，EPO0273085)，这确立了技术的可操作性。已经描述了另一种哺乳动物细胞类型的背景下的特异性递送(Wu和Wu，1993；其通过引用并入本文)。在本发明的某些方面中，将选择配体以对应于目标细胞群上特异性表达的受体。
在其它实施方案中，细胞特异性核酸靶向载体的核酸递送媒介物组分可以包含结合脂质体的特异性结合配体。将待递送的核酸置于脂质体内，并且将特异性结合配体功能性并入脂质体膜中。脂质体因此将特异性地结合至目标细胞的受体并将内含物递送至细胞。这样的系统已经显示是功能性的，其使用其中例如将表皮生长因子(EGF)用于受体介导的核酸递送至表现出EGF受体的上调的细胞中的系统。
在又进一步实施方案中，靶向的递送媒介物的核酸递送媒介物组分可以是脂质体自身，其将优选包含一种或多种指导细胞特异性结合的脂质或糖蛋白。例如，乳糖-神经酰胺，一种半乳糖末端无唾液酸神经节苷脂，已经并入脂质体中，并且观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取的增加(Nicolau等人，1987)。考虑了本发明的组织特异性转化构建体可以以类似方式特异性地递送至目标细胞中。
11.表达系统
存在包含至少部分或所有上面讨论的组合物的各种表达系统。基于原核生物和/或真核生物的系统可以用于与本发明一起使用来产生核酸序列，或其同源多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统是商业上和广泛可得的。
昆虫细胞/杆状病毒系统可以产生异源核酸区段的高水平的蛋白质表达，诸如美国专利号5,871,986和4,879,236(其两者均通过引用并入本文)中所述，并且所述系统可以例如依据名称2.0从2.0购得，以及来自的BacPackTM杆菌表达系统。
表达系统的其它实例包括的Complete ControlTM诱导型哺乳动物表达系统，其涉及合成的蜕皮激素诱导型受体，或其pET表达系统，大肠杆菌表达系统。诱导型表达系统的另一个实例可得自其携带T-RexTM(四环素调节的表达)系统，一种使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。还提供被称为甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)表达系统的酵母表达系统，其设计用于在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平产生重组蛋白质。本领域技术人员将知道如何表达载体，诸如表达构建体，来产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质或肽。
原代哺乳动物细胞培养物可以各种方法制备。为了使细胞在体外以及与表达构建体接触时保持存活，必需确保细胞保持与正确比率的氧和二氧化碳以及营养物接触，但被保护免于微生物污染。充分记载了细胞培养技术。
前述的一个实施方案涉及使用基因转移来使细胞永生化用于产生蛋白质。可以如上所述将目标蛋白质的基因转移入适当的宿主细胞中，随后在适当条件下进行细胞培养。可以以该方式采用事实上任何多肽的基因。上文讨论了重组表达载体和其中包括的元件的生成。或者，待产生的蛋白质可以是由所讨论的细胞通常合成的内源蛋白质。
有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是Vero和Hela细胞和中国仓鼠卵巢细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、NIH3T3、RIN和MDCK细胞。此外，可以选择以期望方式调节插入序列的表达、或修饰和加工基因产物的宿主细胞系。蛋白质产物的这样的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可以是重要的。对于蛋白质的翻译后加工和修饰，不同宿主细胞具有特征性和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。
可以使用许多选择系统，包括，但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。此外，可以采用抗代谢物抗性作为针对以下选择的基础：dhfr，其赋予抗性；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性；neo，其赋予对氨基糖苷G418的抗性；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性。
E.纯化
在某些实施方案中，可以纯化本发明的抗体。如本文所使用的术语“纯化的”意指组合物，其可从其它组分中分离，其中将所述蛋白质纯化至相对于其天然可获状态的任何程度。因此，纯化的蛋白质还指这样的蛋白质，其从它可能天然存在的环境中分离出来。当使用术语“基本上纯化的”时，该用法将指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成了所述组合物的主要组分，诸如构成所述组合物中约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的蛋白质。
蛋白质纯化技术对于本领域技术人员是众所周知的。这些技术在一个水平上涉及细胞环境至多肽和非多肽级分的粗分级。已将多肽从其它蛋白质中分离后，目标多肽可以使用层析和电泳技术进一步纯化以实现部分或完全的纯化(或纯化至同质性)。尤其适合于制备纯肽的分析方法是离子交换层析、排阻层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。蛋白质纯化的其它方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀或通过热变性，随后离心；凝胶过滤、反向、羟基磷灰石和亲和层析；和这些及其它技术的组合。
在纯化本发明的抗体中，可以期望在原核生物或真核生物表达系统中表达多肽，并使用变性条件提取蛋白质。多肽可以使用亲和柱(其结合多肽的标记化部分)从其它细胞组分中纯化。如本领域中通常众所周知的，认为可以改变进行多个纯化步骤的次序，或者可以去除某些步骤，并仍产生用于制备基本上纯化的蛋白质或肽的合适方法。
通常，完全抗体是分级的利用试剂(即，蛋白质A)，其结合抗体的Fc部分。或者，抗原可以同时用于纯化并选择合适抗体。这样的方法通常利用结合至支持物(诸如柱、滤器或珠)上的选择剂。将抗体结合至支持物上，去除污染物(例如洗掉)，并通过施用条件(盐、热等)将抗体释放。
定量蛋白质或肽纯化的程度的多种方法对于本领域技术人员在本公开的教导下将是已知的。这些包括例如确定活性级分的比活，或者通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的量。用于评估级分的纯度另一个方法是计算所述级分的比活，将其与起始提取物的比活比较，并因而计算纯化程度。用于代表活性的量的实际单位将当然依赖于所选的进行纯化的具体测定技术和表达的蛋白质或肽是否展示出可检测的活性。
已知用不同的SDS/PAGE条件，多肽的迁移可以改变，有时显著地改变(Capaldi等人，1977)。因此，应理解在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可以改变。
F.单链/单结构域抗体
单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合体，用短(通常为丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起。该嵌合分子，也被称为单结构域单体，保留原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头肽。该修饰通常使特异性未改变。这些分子历史上产生以促进噬菌体展示，其中极大地方便于表达作为单一肽的抗原结合域。或者，scFv可以直接从来源于杂交瘤的亚克隆的重链和轻链产生。单结构域或单链可变分子缺少在完整抗体分子中发现的恒定Fc区，并因此缺少用于纯化抗体的常用结合位点(例如，蛋白质A/G)(单链抗体包括Fc区域)。这些片段常常可以使用蛋白质L来纯化/固定，因为蛋白质L与κ轻链的可变区相互作用。
柔性接头通常由促螺旋和促转角(helix-and turn-promoting)氨基酸残基诸如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸构成。然而，其它残基也可以起作用。Tang等(1996)使用噬菌体展示作为快速选择来自蛋白质接头文库的单链抗体(scFvs)的定制接头的方法。构建随机接头文库，其中重链和轻链可变域的基因通过编码可变组成的18个氨基酸多肽的区段来连接。scFv所有组成成分(约5×106个不同成员)在丝状噬菌体上展示并进行用半抗原的亲和力选择。选择的变体的群展示出结合活性中的显著增加，但保留了相当大的序列多样性。筛选1054个单独的变体随后产生了以可溶形式有效产生的催化活性的scFv。序列分析揭示了接头中在VH C末端后两个残基的保守脯氨酸和在其它位置处精氨酸和脯氨酸的丰富，其作为所选范围的唯一共同特征。
本发明的重组抗体还可能涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。这样的序列包括来源于IgA的那些，其允许缀合有J链的多聚物的形成。另一个多聚化结构域是Gal4二聚化结构域。在其它实施方案中，链可以用试剂诸如生物素/抗生物素蛋白来修饰，其允许两种抗体的组合。
在一个单独的实施方案中，单链抗体可以通过使用非肽接头或化学单元将受体轻链和重链结合来产生。通常，轻链和重链将在不同细胞中产生，纯化并随后以合适方式连接在一起(即，重链的N末端经合适的化学桥键(chemical bridge)连接至轻链的C末端)。
使用交联剂来形成将两个不同分子的官能团连在一起形成分子桥键，例如稳定剂和混凝剂。然而，应考虑可以产生相同类似物的二聚体或多聚体或者不同类似物构成的异聚化复合体(heteromeric complex)。为了以分步(step-wise)方式连接两种不同的化合物，可以使用消除不想要的均聚物形成的异-双功能交联剂(hetero-bifunctional cross-linker)。
示例性异-双功能交联剂包含两个反应基团：一个与伯胺基反应(即N-羟基琥珀酰亚胺)并且另一个与巯基反应(例如吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)。经伯胺反应基团，交联剂可以与一个蛋白质(例如选择的抗体或片段)的一个或多个赖氨酸残基反应并且经过巯基反应基团，已连接至第一蛋白质的交联剂可以与另一个蛋白质(例如选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
优选将使用在血液中具有合理的稳定性的交联剂。许多类型的含二硫键的接头是已知的，其可以成功用于缀合靶向剂和治疗/预防剂。含有为空间位阻的二硫键的接头可以证实提供更大的体内稳定性，防止靶向肽在达到作用位点之前释放。这些接头因此是一组连接剂。
另一种交联剂是SMPT，其是含有二硫键的双功能交联剂，所述二硫键通过邻近的苯环和甲基而是“空间位阻的”。认为二硫键的空间位阻起到保护键免于硫醇盐阴离子(诸如谷胱甘肽，其可能存在于组织和血液中)的攻击的作用，并由此帮助防止在递送连接的试剂到目标位点前缀合物的解偶联。
SMPT交联剂，如同许多其它已知的交联剂一样，带来交联官能团诸如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)的能力。另一种可能类型的交联剂包括异-双功能光反应性苯基叠氮化物，其含有可裂解的二硫键，诸如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对-叠氮水杨酰基氨基)乙基-1,3'-二硫代丙酸盐/酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应并且苯基叠氮化物(光裂解后)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
除了位阻的交联剂外，无位阻的接头也可以一同使用。其它有用的交联剂(不考虑含有或生成受保护的二硫化物)包括SATA，SPDP和2-亚氨基硫烷(iminothiolane)(Wawrzynczak和Thorpe,1987)。使用这样的交联剂是本领域众所周知的。另一个实施方案涉及使用柔性接头。
美国专利4,680,338描述了用于产生配体与含胺的聚合物和/或蛋白质的缀合物，尤其是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物的双功能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了含有在许多温和条件下可裂解的不稳定键的可裂解的缀合物。该接头尤其可用于目标试剂可以与接头直接成键并且裂解导致释放活性试剂的情况中。具体用途包括向蛋白质(诸如抗体)或药物添加游离氨基或游离巯基。
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽组分以形成融合蛋白质例如单链抗体的肽接头。该接头长度多至约50个氨基酸，含有至少出现一次的带电荷的氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)随后为脯氨酸，并且其特征在于更大的稳定性和降低的聚集。美国专利5,880,270公开了含氨基氧基的接头，其用于多种免疫诊断和分离技术。
G.修饰的抗体
1.CARs
人工T细胞受体(也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体、嵌合抗原受体(CARs))是工程改造的受体，其将任意特异性接枝至免疫效应细胞上。通常，这些受体用于将单克隆抗体的特异性接枝至T细胞上，其中转移由逆转录病毒载体促进的其编码序列。以该方式，可以生成大量癌症特异性T细胞用于过继细胞转移。该方法的I期临床研究显示效力。
这些分子的最常见形式是融合至CD3-ζ跨膜和胞内结构域的源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合体。这样的分子导致响应于scFv对其目标的识别的ζ信号的传输。这样的结构的一个实例是14g2a-ζ，其为源自杂交瘤14g2a的scFv的融合体(其识别双唾液酸神经节苷脂GD2)。当T细胞表达该分子(通常通过癌逆转录病毒载体传导实现)时，它们识别并杀死表达GD2的目标细胞(例如，神经母细胞瘤细胞)。为了靶向恶性B细胞，研究人员已经使用对于B-谱系分子CD19特异性的嵌合免疫受体重定向T细胞的特异性。
免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通过柔性接头融合，以形成scFv。该scFv之前为信号肽，以便将新生蛋白质引导至内质网和随后的表面表达(其被切割)。柔性间隔基允许scFv以不同方向定向以实现抗原结合。所述跨膜结构域是通常源自信号传导胞内结构域的初始分子的典型的疏水性α螺旋，其突出进入细胞，并传输期望的信号。
I型蛋白质事实上是通过之间的跨膜α螺旋连接的两个蛋白质结构域。跨膜结构域穿过的细胞膜脂质双层起作用以便从外部部分(胞外结构域)分离内侧部分(胞内结构域)。不那么令人惊讶的是，将来自一种蛋白质的胞外结构域附接至另一种蛋白质的胞内结构域导致组合前者的识别与后者的信号的分子。
胞外结构域。信号肽将新生蛋白质引导入内质网。如果受体被糖基化且锚定于细胞膜中，这是必要的。任何真核信号肽序列通常工作很好。通常，使用天然附接至最氨基末端的组分的信号肽(例如，在具有取向轻链-接头-重链的scFv中，使用轻链的天然信号。
抗原识别结构域通常是scFv。然而存在许多替代方案。已经描述了来自天然T细胞受体(TCR)α和β单链的抗原识别结构域，其具有简单胞外结构域(例如，识别HIV感染的细胞的CD4胞外结构域)和更多的外来识别组分诸如连接的细胞因子(其导致具有细胞因子受体的细胞的识别)。事实上，以高亲和力结合给定目标的几乎任何物质都可以用作抗原识别区域。
间隔区将抗原结合结构域连接至跨膜结构域。其应该足够柔性以允许抗原结合结构域以不同方向上取向，以促进抗原识别。最简单的形式是来自IgG1的铰链区。替代方案包括免疫球蛋白的CH2CH3区域和CD3的部分。对于大多数基于scFv的构建体，IgG1铰链就足够。然而，最好的间隔基经常必须凭经验确定。
跨膜结构域。跨膜结构域是跨越膜的疏水α螺旋。通常，使用来自胞内结构域的最接近膜组分的跨膜结构域。有趣的是，使用CD3-ζ跨膜结构域可以导致人工TCR并入天然TCR，取决于天然CD3-ζ跨膜带电的天冬氨酸残基的存在的因素。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。CD28跨膜结构域导致产生明显表达的稳定受体。
胞内结构域。这是受体的“业务-末端(business-end)”。抗原识别之后，受体簇和信号被传输至细胞。最常用的胞内结构域组分是含有3个ITAM的CD3-ζ。结合抗原之后，这将活化信号传输至T细胞。CD3-ζ可能无法提供全能活化信号，并且需要额外的共刺激信号。例如，嵌合CD28和OX40可以与CD3-ζ一起用于传输增殖/存活信号，或可以一起使用所有三种。
“第一代”CAR通常具有来自CD3ξ-链的胞内结构域，所述CD3ξ-链是来自内源TCR的信号的主要传输者。“第二代”CAR将来自各种共刺激蛋白质受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的胞内信号传导结构域添加至CAR的胞质尾部，以便将额外信号提供给T细胞。临床前研究已经表明，第二代的CAR设计改善了T细胞的抗肿瘤活性。更近来，“第三代”CAR组合多个信号传导结构域，诸如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以进一步增强功效。
表达嵌合抗原受体的T细胞的过继转移是有希望的抗癌疗法，因为可以工程改造CAR修饰的T细胞以靶向几乎任何肿瘤相关的抗原。该方法存在很大潜能以深刻的方式改善患者特异性的癌症疗法。收集患者的T细胞之后，将细胞基因工程改造以表达特异性针对患者的肿瘤细胞上的抗原的CAR，然后注入回患者。尽管CAR修饰的T细胞的过继转移是独特的且有希望的癌症疗法，所以存在显著的安全担忧。该疗法的临床试验已经揭示当健康组织表达与肿瘤细胞相同的目标抗原时这些CAR的潜在的毒性作用，导致与移植物抗宿主病(GVHD)类似的结果。对该问题的潜在解决方案是将自杀基因工程改造入修饰的T细胞。以该方式，施用经设计以在GVHD过程中活化自杀基因的前体药物触发自杀基因活化的CAR T细胞中的细胞凋亡。已经在造血干细胞移植(HSCT)中安全且有效地使用该方法。将自杀基因疗法采用于CAR修饰的T细胞过继细胞转移的临床应用具有缓解GVHD、同时改善整体抗肿瘤效力的潜能。
2.ADCs
抗体药物缀合物或ADC是一类新的设计为用于治疗具有癌症的人的靶向疗法的高度有效的生物制药药物。ADC是由经由具有不稳定的键的稳定的化学接头连接至生物活性的细胞毒性(抗肿瘤)有效载荷或药物的抗体(完整mAb或抗体片段，诸如单链可变片段，或scFv)组成的复杂分子。抗体药物缀合物是生物缀合物和免疫缀合物的实例。
通过组合单克隆抗体的独特靶向功能与细胞毒性药物的肿瘤杀伤能力，抗体-药物缀合物允许灵敏区分健康和患病组织。这意味着，与传统的化疗剂相反，抗体-药物缀合物靶向和攻击癌细胞，使得健康细胞不太被严重影响。
在开发基于ADC的抗肿瘤疗法中，抗癌药(例如，细胞毒素或细胞毒素)偶联至特异性靶向某些肿瘤标志物(例如，理想地仅在肿瘤细胞之中或之上发现的蛋白质；在该情况下，MUC1)的抗体。抗体在体内追踪下这些蛋白质，并将其自身附接至癌细胞的表面。抗体和目标蛋白质(抗原)之间的生物化学反应触发肿瘤细胞中的信号，其然后吸附或内化抗体连同细胞毒素。内化ADC之后，细胞毒性药物被释放并杀死癌症。由于该靶向，理想地，药物具有较低的副作用，并且给出比其它化疗剂更宽的治疗窗口。
抗体和细胞毒性(抗癌)剂之间的稳定联系是ADC的一个重要方面。接头基于化学基序，包括二硫化物、腙或肽(可切割)或硫醚(不可切割)，并且控制细胞毒性剂分布和递送至目标细胞。已经证明可切割和不可切割类型的接头在临床前和临床试验中是安全的。Brentuximab vedotin包括酶敏感的可切割接头，其将有效且高毒性的抗微管剂单甲基auristatin E或MMAE(合成的抗肿瘤剂)递送至人特定CD30阳性恶性细胞。因为其高毒性，MMAE(其通过阻断微管蛋白的聚合而抑制细胞分裂)无法用作单一药剂化疗药物。然而，连接至抗CD30单克隆抗体(cAC10，肿瘤坏死因子或TNF受体的细胞膜蛋白质)的MMAE的组合证明在细胞外液中是稳定的，可被组织蛋白酶切割的，并且对于疗法是安全的。曲妥珠单抗emtansine，其它批准的ADC，是通过稳定的、不可切割的接头附接的微管形成抑制剂mertansine(DM-1)(美登素的衍生物)和抗体曲妥珠单抗(/Genentech/Roche)的组合。
更好且更稳定的接头的可用性已经改变了化学键的功能。接头的类型，可切割或不可切割的，为细胞毒性(抗肿瘤)药物赋予特定特性。例如，不可切割的接头将药物保持在细胞内。作为结果，整个抗体、接头和细胞毒性(抗肿瘤)剂进入被靶向的癌细胞，在所述被靶向的癌细胞中，抗体被降解至氨基酸的水平。所得复合物-氨基酸、接头和细胞毒性剂-现在变为活性药物。相反，可切割的接头被癌细胞中的酶催化，在所述癌细胞中，其释放细胞毒性剂。差异在于经由可切割的接头递送的细胞毒性有效负载可以从被靶向的细胞逃逸，并且在被称为“旁观者杀伤”的过程中，攻击相邻癌细胞。
目前正在开发的另一种类型的可切割的接头在细胞毒性药物和切割位点之间增加了额外分子。该接头技术允许研究人员生成具有更高柔性的ADC，而无需担心改变切割动力学。研究人员也正在开发基于Edman降解的肽切割的新方法，测序肽中的氨基酸的方法。ADC的开发的未来方向还包括开发位点特异性缀合(TDC)以进一步改善稳定性和治疗指数和α发射免疫缀合物和抗体缀合的纳米颗粒。
3.BitES
双特异性T细胞接合剂(BiTEs)是研究用于用作抗癌药物的一类人工双特异性单克隆抗体。它们引导宿主的免疫系统，更具体地，T细胞的细胞毒性活性，针对癌细胞。BiTE是Micromet AG的注册商标。
BiTE是约55千道尔顿的单一肽链上的不同抗体或来自四个不同基因的氨基酸序列的两个单链可变片段(scFv)组成的融合蛋白质。scFv之一经由CD3受体结合至T细胞，另一者经由肿瘤特异性分子(在该情况下，MUC1)结合至肿瘤细胞。
像其它双特异性抗体，而不像普通的单克隆抗体，BiTE形成T细胞和肿瘤细胞之间的连接。这引起T细胞通过产生蛋白质像穿孔蛋白和颗粒酶而对肿瘤细胞发挥细胞毒性活性，这不依赖于MHC I或共刺激分子的存在。这些蛋白质进入肿瘤细胞，并起始细胞的细胞凋亡。该作用模拟T细胞攻击肿瘤细胞过程中观察到的生理过程。
直至2010年7月在临床试验中的BiTE包括针对CD19(B细胞上表达的表面分子)的用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤和急性淋巴细胞性白血病的Blinatumomab(MT103)；和针对EpCAM抗原的用于治疗胃肠道和肺癌的MT110。
利用相同的技术，可以靶向黑色素瘤(用MCSP特异性的BiTE)和急性髓性白血病(用CD33特异性的BiTE)。该领域中的研究目前正在进行中。新颖抗癌疗法的另一个途径是使用BiTE方法重新工程改造一些目前使用的常规抗体像曲妥珠单抗(靶向HER2/neu)、西妥昔单抗和帕尼单抗(两者均靶向EGF受体)。同样正在开发针对CD66e和EphA2的BiTE。
III.药物制剂和癌症的治疗
A.癌症
癌症由来自组织的细胞克隆群体的过度生长导致。癌症的发展(被称为癌发生)可以以多种方式模型化和表征。已经长时间理解癌症的发展和炎症之间的关系。炎性应答参与针对微生物感染的宿主防御，并且也驱动组织修复和再生。相当多的证据指向炎症和发展癌症的风险之间的联系，即慢性炎症可以导致发育异常。
可以应用本发明的方法的癌细胞通常包括表达MUC1、更具体地过表达MUC1的任何细胞。适当的癌细胞可以是乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌(例如白血病或淋巴瘤)、神经组织癌、黑色素瘤、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌或膀胱癌细胞。此外，本发明的方法可被应用于范围广泛的物种，例如人、非人灵长类(例如猴、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。癌症也可以是复发的、转移的和/或多重耐药的，并且本发明的方法可以特别适用于这样的癌症，以便使它们可切除，延长或重新诱导缓解，抑制血管生成，预防或限制转移，和/或治疗多重耐药的癌症。在细胞水平，这可以转化为杀死癌细胞，抑制癌细胞生长，或以其它方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型。
B.制剂和施用
本发明提供包含抗-MUC1-C抗体的药物组合物。在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指通过联邦或州政府的管理机构批准或列于美国药典或其它通常认可的用于动物且更具体为人中的药典里。术语“载体”指稀释剂、赋形剂、或媒介物，用其可施用治疗剂。这样的药学上载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。其它合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、盐水、右旋糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
所述组合物可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子诸如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些形成的盐，和与阳离子诸如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些形成的盐。
本发明的抗体可以包括经典的药物制备物。施用这些根据本发明的组合物将是经由任何常见的途径，只要目标组织经由该途径是可得的。这包括经口、经鼻、经颊、直肠、阴道或局部。或者，施用可以是通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射。这样的组合物将通常作为药学上可接受的组合物施用，如上文所述。特别感兴趣的是直接瘤内施用，肿瘤的输注或向肿瘤局部或区域性施用，例如在局部或区域性脉管系统或淋巴系统中，或在经切除的瘤床中。
活性化合物也可以肠胃外或腹膜内施用。可在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。也可在甘油、液态聚乙二醇，及其混合物中以及在油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物的生长。
C.组合疗法
在本发明的背景下，还考虑本文所述的抗-MUC1-C抗体可以类似地与化学或放射治疗性干预或其它治疗结合使用。具体而言，组合抗-MUC1-C/ECD抗体与靶向MUC1功能的不同方面的其它疗法，诸如靶向MUC1胞质结构域的肽和小分子，也可以证明是有效的。
为了使用本发明的方法和组合物杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管发生或者另外逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，通常将使“目标”细胞与根据本发明的抗-MUC1-C抗体和至少一种其它药剂接触。将以有效杀死或抑制细胞的增殖的组合量提供这些组合物。该方法可以涉及使细胞与根据本发明的抗-MUC1-C抗体和其它药剂或因子同时接触。这可以通过使细胞与包括两种药剂的单一组合物或药物制剂接触，或通过使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包括根据本发明的抗-MUC1-C抗体且另一种包括其它药剂。
或者，抗-MUC1-C抗体疗法可以以范围在数分钟至数周的时间间隔在其它药剂治疗之前或之后。在其中其它药剂和抗-MUC1抗体分开应用于细胞的实施方案中，技术人员应通常保证在每次递送时刻之间重要的时间周期没有失效，从而使药剂和表达构建体仍能够实施对细胞的有利地组合效果。在这种情况下，考虑可以在彼此的约12-24小时内并且更优选在彼此的约6-12小时内(其中最优选仅约12小时的延迟时间)使细胞与两种药物手段(modality)接触。在某些情况下，可以期望明显延长治疗时间周期，然而，其中在各次施用之间过去了几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
也可设想将期望多于一次施用抗-MUC1抗体或其它药剂。可采用各种组合，其中根据本发明的抗-MUC1-C抗体疗法是“A”，且其它疗法是“B”，如下所例举：
考虑其它组合。再次，为了实现细胞杀死，以有效杀死细胞的组合量向细胞递送两种药剂。
适合于癌症疗法的药剂或因素包括当被应用于细胞时诱导DNA损伤的任何化学化合物或治疗方法。这样的药剂或因素包括诱导DNA损伤的辐射和波，诸如照射、微波、电子发射等。可以使用各种化学化合物(也被描述为“化疗剂”或“遗传毒性剂”)。这可以通过照射局部的肿瘤部位而实现；或者，可以通过向受试者施用治疗有效量的药物组合物而使肿瘤细胞与药剂接触。
考虑用于与本发明使用的各类化疗剂。例如，选择性雌激素受体拮抗剂(“SERMs”)，诸如他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬(阿非昔芬(Afimoxfene))、Falsodex、雷洛昔芬、巴多昔芬、氯米芬、Femarelle、拉索昔芬、奥美昔芬和托瑞米芬。
考虑有用的化疗剂包括，例如喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C。本发明还包括使用一种或多种DNA损伤剂(无论是基于辐射的还是实际的化合物)的组合，诸如使用X-射线与顺铂或使用顺铂与依托泊甙。如上所述，通过将药剂与MUC1肽组合，所述药剂可以作为组合的治疗组合物或药剂盒制备和使用。
热激蛋白90是在许多真核细胞中发现的调节蛋白质。已显示HSP90抑制剂可用于治疗癌症。这样的抑制剂包括格尔德霉素、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、PU-H71和利福布汀。
也设想直接交联DNA或形成加合物的药剂。可以使用药剂，诸如顺铂，和其它DNA烷化剂。顺铂已经被广泛用于治疗癌症，其中在临床应用中使用的有效剂量为20mg/m2，每三周使用5天，总共三个疗程。顺铂不被经口吸收，并且因此必须经由静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射而递送。
损伤DNA的药剂还包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这样的化疗化合物包括阿霉素(也被称为多柔比星)、依托泊甙、维拉帕米、鬼臼毒素等。在用于治疗肿瘤的临床环境中广泛使用，通过静脉内推注注射而施用这些化合物，剂量范围为25-75mg/m2(对于多柔比星，以21天时间间隔)至35-50mg/m2(对于静脉内依托泊甙)，或者口服是静脉内剂量的二倍。还考虑微管抑制剂，诸如紫杉烷类。这些分子是由紫杉属的植物产生的二萜类，并且包括紫杉醇和多西他赛(docetaxel)。
表皮生长因子受体抑制剂，诸如艾瑞莎，mTOR(雷帕霉素的哺乳动物目标)(也被称为FK506-结合蛋白12-雷帕霉素相关蛋白1(FRAP1))，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动性、细胞存活、蛋白质合成和转录。因此，考虑将雷帕霉素及其类似物用于根据本发明的癌症疗法。
另一种可能的疗法是TNF-α(肿瘤坏死因子-α)，其为参与全身性炎症的细胞因子和刺激急性期反应的细胞因子组的成员。TNF的主要作用是调节免疫细胞。TNF还能够诱导凋亡性细胞死亡、诱导炎症、以及抑制肿瘤发生和病毒复制。
破坏核酸前体和亚基的合成和保真度的药剂也导致DNA损伤。因此，已经开发了许多核酸前体。特别有用的是已经经历广泛测试并且容易获得的药剂。因此，药剂(诸如5-氟尿嘧啶(5-FU))优先地被肿瘤组织使用，使得所述药剂特别可用于靶向肿瘤细胞。尽管相当有毒，5-FU可适用于宽范围的载体中(包括局部的)，然而，通常使用以范围为3至15mg/kg/天的剂量的静脉内施用。
引起DNA损伤且已经广泛使用的其它因素包括通常被称为γ-射线、x-射线的因素，和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑其它形式的DNA损伤因素，诸如微波和UV-照射。最可能的是所有这些因素在DNA的前体、DNA的复制和修复和染色体的组装和维持上实现宽范围的DNA损伤。x-射线的剂量范围为50至200伦琴的日剂量(对于长时间段，3-4周)到2000至6000伦琴的单一剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型、以及被肿瘤细胞的摄取。
此外，还考虑可以使用免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和外科手术。具体而言，可以采用靶向疗法，诸如阿瓦斯丁(Avastin)、爱必妥(Erbitux)、格列卫(Gleevec)、赫赛汀(Herceptin)和美罗华(Rituxan)。
组合疗法的一种特别有利的方法是选择靶向MUC1的第二药剂。在本发明人申请的共同在审的申请中，公开了抑制受试者中的MUC1-阳性肿瘤细胞的方法，其包括向所述受试者施用至少4个连续MUC1残基和不超过20个连续MUC1残基且包含序列CQC的MUC1肽，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-末端被至少一个氨基酸残基覆盖，所述至少一个氨基酸残基不必对应于天然MUC-1跨膜序列。所述肽可以包含至少5个连续MUC1残基、至少6个连续MUC1残基、至少7个连续MUC1残基、至少8个连续MUC1残基，且所述序列可以更具体地包含CQCR(SEQ ID NO:XX)、CQCRR(SEQ ID NO:XX)、CQCRRR(SEQ ID NO:XX)、CQCRRRR(SEQ IDNO:XX)、CQCRRK(SEQ ID NO:XX)、CQCRRKN(SEQ ID NO:XX)或RRRRRRRRRCQCRRKN(SEQ IDNO:XX)。所述肽可以含有MUC1的不超过10个连续残基、11个连续残基、12个连续残基、13个连续残基、14个连续残基、15个连续残基、16个连续残基、17个连续残基、18个连续残基或19个连续残基。所述肽可以融合至细胞递送结构域，诸如聚-D-R、聚-D-P或聚-D-K。所述肽可以包含所有L氨基酸、所有D氨基酸或L和D氨基酸的混合物。参见美国专利号8,524,669。
该技术的变型描述于美国专利申请序列号13/026,858中。在该申请中，公开了抑制MUC1-阳性癌细胞的方法，其包括使所述细胞与至少4个连续MUC1残基和不超过20个连续MUC1残基且包含序列CQC的MUC1肽接触，其中(i)CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH2-末端被至少一个氨基酸残基覆盖，所述至少一个氨基酸残基不必对应于天然MUC-1跨膜序列；且(ii)所述肽除了对应于天然MUC1残基的那些带正电的氨基酸残基以外还包含3-5个连续带正电的氨基酸残基。所述MUC1-阳性细胞可以是实体瘤细胞，诸如肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、子宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食道癌细胞。所述MUC1-阳性细胞可以是白血病或骨髓瘤细胞，诸如急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。所述肽可以是装订肽、环化肽、拟肽或类肽。所述方法可以进一步包括将所述细胞与第二抗癌剂接触，诸如其中在所述肽之前、所述肽之后或与所述肽同时接触所述第二抗癌剂。抑制可以包括抑制癌细胞生长、癌细胞增殖或诱导癌细胞死亡，诸如通过细胞凋亡。
由本发明人推进的另一种技术(参见美国专利申请序列号13/045,033)涉及抑制细胞中的炎性信号传导的方法，其包括使所述细胞与具有以下结构的黄酮或其盐接触：
其中：
R1是H，–OH，＝O，取代或未取代的烷基(C1-8)，烷氧基(C1-8)，卤代烷基(C1-8)，取代的苯基或未取代的苯基，其中，如果R1是＝O，则C7–C8是双键；
R2是H，-OH，烷基(C1-8)，取代的苯基，未取代的苯基，苯基，苯基噻唑，咪唑，吡唑或呋喃；
R3是H，-OH，＝O，卤素，卤代烷基(C1-8)，取代或未取代的烷基(C1-8)，取代的苯基或未取代的苯基，其中，如果R3是＝O，则C8–C9是双键；
R4是H或–OH；
R5是H，-OH，取代或未取代的烷基(C1-8)或烷氧基(C1-8)，或OR8，其中R8是烷基(C1-8)，酯或酰胺；
R6是H，-OH，取代或未取代的烷基(C1-8)或烷氧基(C1-8)，或OR8，其中R8是烷基(C1-8)，酯或酰胺；且
R7是H，-OH或取代或未取代的烷基(C1-8)，
条件是R1和R3不能均为＝O。
R1可以是＝O。
R3可以是＝O。
所述黄酮是桑色素、芹菜配基、山奈素、漆树黄酮、PD98059、7-(苄氧基)-4-(三氟甲基)-2H-色烯-2-酮或7-[(3-氧代丁-2-基)氧基]-4-苯基-2H-色烯-2-酮或任何前述的盐。
技术人员涉及“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第15版，第33章，具体624-652页。根据所治疗的受试者的状况将必要进行一些剂量变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体受试者的适当剂量。而且，对于人施用，制备物应当满足如FDA生物制品标准处所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
IV.抗体缀合物
抗体可以与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了增加抗体分子作为诊断剂或治疗剂的效力，它通常用于连接至少一个期望分子或部分或与其共价结合或与其形成复合体。这样的分子或部分可以是但不限于至少一种效应物或报道分子。效应物分子包含具有期望活性例如免疫抑制/抗炎的分子。上面记载了这样的分子的非限制性实例。这样的分子任选经由设计为允许所述分子在目标部位上或其附近释放的可切割的接头连接。
相反，报道分子定义为可以使用测定检测的任何部分。已与抗体缀合的报道分子的非限定性实例包括酶、放射标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、光亲和性分子、有色颗粒或配体，诸如生物素。
抗体缀合物通常优选用作诊断剂。抗体诊断剂通常落入两个类别，用于体外诊断剂的那些，诸如在多种免疫测定中，和用于体内诊断方案的那些，通常称为“抗体定向成像”。许多合适的成像剂是本领域已知的，以及用于它们连接抗体的方法是已知的(参见例如，美国专利5,021,236、4,938,948、和4,472,509)。所用的成像部分可以是顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测的物质和X射线成像剂。
在顺磁离子的情况下，可以举例提及离子诸如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，并且钆是尤其优选的。用于其它情况诸如X射线成像中的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，并且尤其是铋(III)。
在用于治疗性和/或诊断性应用的放射性同位素的情况下，可以提及砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝(technicium)99m和/或钇90。125I通常优选用于某些实施方案中，并且锝(technicium)99m和/或铟111也通常优选，这是由于它们的低能量和长范围检测的适应性。放射性标记的单克隆抗体可以根据本领域中众所周知的方法来产生。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂诸如次氯酸钠或酶促氧化剂诸如乳酸过氧化物酶接触来碘化。单克隆抗体可以用锝99m通过配体交换方法来标记，例如，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，螯合还原的锝至Sephadex柱并应用抗体至该柱。或者，可以使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂诸如SNCl2、缓冲溶液诸如邻苯二甲酸钠-钾溶液和抗体。中间官能团通常用于将放射性同位素结合至抗体，并且作为金属离子存在，是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
在考虑用作缀合物的荧光标记中包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红。
考虑的抗体缀合物的另一类型是旨在主要用于体外的那些，其中将抗体与在与生色底物接触后将产生有色产物的二级结合配体和/或酶(酶标记)连接。合适酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的二级结合配体为生物素和抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白化合物。这样的标记的用途对于本领域技术人员是众所周知，并例如描述于美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中。
又另一个已知的分子位点特异性连接至抗体的方法包括抗体与基于半抗原的亲和力标记的反应。基本上，基于半抗原的亲和力标记与抗原结合位点中的氨基酸反应，由此破坏该位点并阻断特异性的抗原反应。然而，这可能不是有利的，因为它导致抗体缀合物的抗原结合丧失。
含有叠氮基的分子也可以用于经反应性氮烯中间体(其通过低强度紫外线产生)形成与蛋白质的共价键(Potter和Haley,1983)。尤其是，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮类似物已用作位点定向光探针来鉴定粗细胞提取物中的的核苷酸结合蛋白质(Owens和Haley,1987；Atherton等人，1985)。2-和8-叠氮核苷酸也已用于定位纯化的蛋白质的核苷酸结合结构域(Khatoon等人，1989；King等人，1989；Dholakia等人，1989)并可用作抗体结合剂。
本领域中已知用于将抗体连接或缀合至其缀合物部分的几种方法。一些连接方法涉及使用金属螯合络合物，利用例如有机螯合剂如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；乙烯三胺四乙酸；N-氯-对-甲苯磺酰胺；和/或连接至抗体的四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体还可以与酶在偶联剂诸如戊二醛或高碘酸盐存在的情况反应。与荧光素标记物的缀合物在这些偶联剂存在情况下或通过与异硫氰酸盐/酯反应来制备。在美国专利4,938,948中，乳腺肿瘤的成像使用单克隆抗体来实现，并且可检测的成像部分使用接头诸如甲基-对-羟基苯甲亚胺酸酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯连接至抗体。
在其它实施方案中，考虑使用不改变抗体结合位点的反应条件，通过在免疫球蛋白的Fc区选择性地引入巯基来衍生化免疫球蛋白。公开了根据该方法学产生的抗体缀合物以显示改进的寿命、特异性和灵敏度(美国专利5,196,066，其通过引用并入本文)。效应物或报道物分子的位点特异性连接(其中报道物或效应物分子缀合至Fc区中的碳水化物残基)也已公开于文献中(O’Shannessy等人，1987)。已报道该方法以产生诊断上和治疗上有希望的抗体，其目前处于临床评价中。
V.免疫检测方法
在还进一步的实施方案中，存在用于结合、纯化、去除、定量或另外一般性检测MUC1及其相关抗原的免疫检测方法。一些免疫检测方法包括，且举几种，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和Western印迹。尤其是，还提供检测并定量MUC1-C抗体的竞争性测定。多种可用的免疫检测方法的步骤已描述于科学文献中，诸如例如Doolittle和Ben-Zeev(1999)、Gulbis和Galand(1993)、DeJager等(1993)、和Nakamura等(1987)。通常，免疫结合方法包括获得样品，并使样品与根据本文讨论的实施方案的第一抗体接触，且情况可能是在有效使免疫复合体形成的条件下。
在有效条件下将所选的生物样品与抗体接触并持续足以允许免疫复合体(初级免疫复合体)形成的时间周期通常为简单地将抗体组合物添加至样品中并孵育混合物一段对于抗体足够长以与存在的MUC1形成免疫复合体(即结合至存在的肺炎链球菌或抗原)的时间周期的事件。在此时间后，样品-抗体组合物诸如组织切片、ELISA板、斑点印迹或Western印迹将通常洗涤以去除任何非特异性结合的抗体种类，允许仅那些在初级免疫复合体内特异性结合的抗体被检测。
通常，免疫复合体形成的检测是本领域中众所周知的，并且可通过应用许多方法来实现。这些方法通常基于检测标记或标记物，诸如任何那些放射性、荧光、生物和酶标记。涉及使用这样的标记的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，可以通过使用第二结合配体诸如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列发现另外的优点，如本领域中已知。
用于检测的抗体可以自身连接至可检测的标记，其中将随后简单检测该标记，由此允许组合物中的初级免疫复合体的量被测定。或者，在初级免疫复合体中结合的第一抗体可以通过对抗体具有结合亲和力的第二结合配体来检测。在这些情况下，第二结合配体可以连接至可检测的标记。第二结合配体本身通常是抗体，其可以因此命名为“二级”抗体。在有效条件下将初级免疫复合体与标记的、二级结合配体或抗体结合，并持续足以允许二级免疫复合体形成的时间周期。二级免疫复合体随后通常洗涤以去除任何非特异性结合的标记的二级抗体或配体，并且随后检测二级免疫复合体中剩余的标记。
进一步方法包括通过两步方法检测初级免疫复合体。第二结合配体诸如对抗体具有结合亲和力的抗体用于形成二级免疫复合体，如上所述。洗涤后，将二级免疫复合体与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体接触，再次在有效的条件下并持续足以允许免疫复合体(三级免疫复合体)形成的时间周期。第三配体或抗体连接至可检测标记，允许因此形成的三级免疫复合体的检测。如需要，该系统可以提供信号扩增。
免疫检测的一种方法使用两种不同的抗体。使用第一生物素化的抗体检测靶抗原，并且随后使用第二抗体来检测连接至形成复合体的生物素的生物素。在该方法中，待检测的样品首先在含有第一步抗体的溶液中孵育。如果靶抗原存在，一些抗体结合抗原以形成生物素化的抗体/抗原复合体。抗体/抗原复合体随后通过在链霉抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)、生物素化的DNA、和/或互补的生物素化的DNA的连续溶液中孵育来扩增，每一步骤向抗体/抗原复合体添加额外的生物素位点。重复扩增步骤直至实现合适水平的扩增，在那时将样品在含有针对生物素的第二步抗体的溶液中孵育。将该第二步抗体标记，如例如用酶，所述酶能够用于通过使用色素原底物的组织酶学来检测抗体/抗原复合体的存在。通过合适扩增，可以产生肉眼可见的缀合物。
免疫检测的另一个已知方法利用免疫-PCR(聚合酶链反应)方法学。直至与生物素化的DNA孵育，PCR方法都与Cantor方法类似，然而，代替使用多轮的链霉抗生物素蛋白和生物素化的DNA孵育，将DNA/生物素/链霉抗生物素蛋白/抗体复合体用释放抗体的低pH或高盐缓冲液来洗掉。所获的洗涤溶液随后用于用合适的引物与合适对照来进行PCR反应。至少理论上，PCR的巨大的扩展能力和特异性可以用于检测单个抗原分子。
A.ELISA
免疫测定在它们最简单的意义上是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域中已知的多种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。然而，将容易理解检测不限于这样的技术，并且也可以使用Western印迹、斑点印迹、FACS分析等。
在一个示例性ELISA中，将本发明的抗体固定化至选择的展示蛋白质亲和力的表面上，诸如聚苯乙烯微量滴定板的孔。然后，将怀疑含有MUC1的检测组合物添加至孔中。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合体后，可以检测结合的抗原。检测可以通过添加另一种连接至可检测标记的抗MUC1-C抗体来实现。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测可以这样实现：通过添加第二抗MUC1-C抗体，随后添加对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，并且所述第三抗体连接至可检测的标记。
在另一个示例性的ELISA中，怀疑含有MUC1抗原的样品固定至孔表面，并随后与抗-MUC1-C抗体接触。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合体后，检测结合的抗-MUC1-C抗体。在初始抗-MUC1-C抗体连接至可检测标记的情况下，免疫复合体可以直接检测。再次，免疫复合体可以使用对第一抗-MUC1-C抗体具有结合亲和力的第二抗体检测，并且第二抗体连接至可检测的标记。
无论所用的形式，ELISA具有某些共同的特征，诸如包被、孵育和结合、洗涤以去除非特异性结合的种类，并检测结合的免疫复合体。这些在下文描述。
在用抗原或抗体包被板中，通常将板的孔与抗原或抗体的溶液孵育，或者过夜或者持续几小时的特定时期。板的孔随后将洗涤以去除不完全吸收的材料。孔的任何其余可用表面随后用对于测试抗血清是抗原上中性的非特异性蛋白质“包被”。这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。包被允许封闭固定化表面上的非特异性吸收位点，并因此降低了由抗血清非特异性结合至表面上造成的背景。
在ELISA中，可能更习惯使用二级或三级检测方法而非直接的程序。因此，在蛋白质或抗体与孔结合，用非反应性材料包被以降低背景，并洗涤以去除未结合的材料后，固定化表面与待测试的生物样品在有效地使免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下接触。免疫复合体的检测随后需要标记的二级结合配体或抗体、与标记的三级抗体或第三结合配体缀合的二级结合配体或抗体。
“在有效使免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下”意指条件优选包括用溶液诸如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)/Tween稀释抗原和/或抗体。这些添加的试剂还旨在帮助降低非特异性背景。
“合适的”条件还意指在一定温度下孵育或持续足以允许有效结合的时间周期。孵育步骤通常从约1至2至大约4小时，在优选25℃至27℃等级的温度下，或可以在约大约4℃下过夜。
在ELISA中的所有孵育步骤后，将接触的表面洗涤以去除未形成复合体的材料。优选的洗涤程序包括用溶液诸如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液洗涤。在检测材料和最初结合的材料之间形成特异性免疫复合体和随后的洗涤之后，甚至微量的免疫复合体的出现可以被测定到。
为了提供检测方法，第二或第三抗体将具有连接的标记以允许检测。优选地，这将是这样的酶，其在与合适的显色底物孵育后将产生显色。因此，例如，将期望将第一或第二免疫复合体与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触或孵育一段时间并在利于进一步的免疫复合体形成发生的条件下(例如，在室温下在含PBS的溶液中诸如PBS-Tween中孵育2小时)。
在与标记的抗体孵育并随后洗涤以去除未结合的材料后，对标记的量定量，例如，在过氧化酶作为酶标记的情况下通过与显色底物诸如尿素、或溴甲酚紫、或2,2'-叠氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、或H2O2孵育。随后通过测量产生的颜色的程度(例如使用可见光谱分光光度计)来实现定量。
B.Western印迹
Western印迹(或者，蛋白质免疫印迹)是用于检测给定的组织匀浆或提取物的样品中特定蛋白质的分析技术。它使用凝胶电泳通过多肽的长度(变性条件)或通过蛋白质的3-D结构(天然/非变性条件)来分离天然的或变性的蛋白质。然后将蛋白质转移至膜(通称为硝酸纤维素或PVDF)，其中使用对靶蛋白质特异性的抗体将它们探测(检测)。
可以从完整组织或从细胞培养物中获取样品。在大部分情况下，固体组织首先使用搅拌器(对于更大的样品体积)、使用匀浆器(更小体积)、或通过超声来机械打碎。细胞也可以通过上述机械方法之一而破开(broken open)。然而，应注意细菌、病毒或环境样品可能是蛋白质来源，因此Western印迹不仅限于细胞学研究。分类的去污剂、盐和缓冲液可以用于促进细胞裂解并促进蛋白溶解。蛋白酶和硫酸酶抑制剂常常添加以防止样品被其自身的酶所消化。组织制备通常在低温下进行以避免蛋白质变性。
使用凝胶电泳将样品的蛋白质分离。蛋白质的分离可以通过等电点(pI)、分子量、电荷、或这些因素的组合。分离的性质依赖于样品的处理和凝胶的性质。这是非常有用的测定蛋白质的方法。还可以使用双向(2-D)凝胶，其以双向将蛋白质从单一样品中分离出。在第一向中根据等电点(它们具有中性净电荷的pH)分离蛋白质，并且在第二向中根据它们的分子量来分离蛋白质。
为了使蛋白质能够进行抗体检测，将它们从凝胶内转移至由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上。将膜置于凝胶顶部，并将一叠滤纸置于其顶部。将整个层叠置于缓冲溶液中，其通过毛细作用将蛋白质与其带着向纸上移动。另一种转移蛋白质的方法称为电印迹并使用电流来将蛋白质从凝胶中拉入PVDF或硝酸纤维素膜。蛋白质从凝胶中移动到膜上，同时保留它们在凝胶中具有的组构(organization)。作为该印迹方法的结果，蛋白质暴露于薄的表面层上用于检测(参见下文)。由于它们非特异性蛋白质结合特性(即，结合所有蛋白质同样地好)选择两种膜。蛋白质结合基于疏水性相互作用，以及膜和蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比PVDF更廉价，但更加易碎的多，并且对重复探测支持不好。从凝胶转移蛋白质至膜的均一性和总体有效性可以通过用考马斯亮蓝或丽春红S染料染色膜来检查。一旦转移，使用标记的一级抗体或未标记的一级抗体随后为使用标记的蛋白质A或结合至一级抗体的Fc区的二级标记的抗体直接检测来检测蛋白质。
C.免疫组织化学
抗体也可以与制备用于通过免疫组织化学(IHC)研究的新鲜冷冻和/或福尔马林固定、石蜡包埋的组织块结合使用。从这些微粒样本制备组织块的方法已经成功用于先前的各种预后因子的IHC研究中，并且是本领域技术人员众所周知的(Brown等人,1990；Abbondanzo等人,1990；Allred等人,1990)。
简言之，冷冻组织切片可以通过室温在小塑料胶囊中的磷酸缓冲盐水(PBS)中再水化50ng冷冻的“粉碎”组织；通过离心沉淀颗粒；在粘性包埋介质(OCT)中重悬浮它们；翻转胶囊和/或通过离心再次沉淀；在-70℃异戊烷中速冻；切割塑料胶囊和/或驱逐组织的冷冻筒；在低温冷冻切片机卡盘上固定组织筒；和/或从胶囊切割25-50个连续切片。或者，整个冷冻的组织样品可用于连续组织切片切割。
永久切片可以通过类似方法制备，所述方法涉及：在塑料微离心管中再水化50mg样品；沉淀；在10％福尔马林中重悬浮而固定4小时；洗涤/沉淀；在温热2.5％琼脂中重悬浮；沉淀；在冰水中冷却使琼脂变硬；从管中取出组织/琼脂块；在石蜡中浸润和/或包埋组织块；和/或切割多达50个永久切片。再次，可以替代整个组织样品。
D.免疫检测试剂盒
在又进一步的实施方案中，存在用于上文描述的免疫检测方法的免疫检测试剂盒。免疫检测试剂盒因此将在合适的容器装置中包含结合MUC1抗原的第一抗体和任选免疫检测试剂。
在某些实施方案中，MUC1-C抗体可以预结合至固体支持物上，诸如柱基质和/或微量滴定板的孔。试剂盒的免疫检测试剂可以采用多种形式的任一种，包括那些与给定抗体相关或连接的可检测的标记。也考虑与二级结合配体相关或连接的可检测标记。示例性的二级配体是对第一抗体具有结合亲和力的那些二级抗体。
用于本试剂盒中的进一步合适的免疫检测试剂包括双组分试剂，其包括对第一抗体具有结合亲和力的二级抗体，以及对二级抗体具有结合亲和力的第三抗体，第三抗体连接至可检测标记。如上所述，多种示例性标记是本领域中已知的，并且所有这样的标记可以连同本文讨论的实施方案一起使用。
试剂盒可以进一步包含MUC1抗原的合适地等分试样的组合物，无论标记的或未标记的，可用于制备检测测定的标准曲线。试剂盒可以包含抗体-标记缀合物，或者以完全缀合的形式、以中间体的形式、或作为由试剂盒的使用者来缀合的单独的部分。试剂盒的组分可以以含水介质或以冷冻干燥形式包装。
试剂盒的容器装置将通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器装置，抗体可以置于其中，或者优选地，合适地等分入其中。试剂盒还将包括密闭(closeconfinement)含有抗体、抗原、和任何其它试剂容器的用于市售的装置。这样的容器可以包括注塑或吹塑的(injection or blow-molded)塑料容器，其中含有需要的小瓶。
VI.实施例
包括以下实施例来说明优选的实施方案。本领域技术人员应理解随后实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实施实施方案中运行良好的技术，并因此可以考虑构成其实施的优选的方式。然而，本领域技术人员在本公开的教导下，应该理解在公开的具体实施方案中可以进行许多改变，并仍获得类似的或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1-抗体产生和筛选方法
免疫和测试免疫血清。用含有融合至小鼠免疫球蛋白的Fc部分的MUC1-C的ECD(MUC1-C/ECD-mFc)的蛋白质免疫C57Bl/6小鼠。将两个小鼠用与弗氏完全佐剂(FCA)混合的100μg MUC1-C/ECD-mFc免疫，并且3天之后，用PBS中的100μg MUC1-C/ECD-mFc免疫。用FCA中的50μg MUC1-C/ECD-mFc、交替PBS中的50μg MUC1-C/ECD-mFc，每3天重复8次加强小鼠，如表6中所示。检查免疫血清之后，用50μg抗原静脉内进行最终加强。收集免疫前血清以用作阴性对照。根据时间表在第7次注射之后收集免疫血清，并且根据下述方法通过Western印迹和ELISA两者测试血清。
ELISA.通过用100μl 1μg/ml MUC1-C/ECD-hFc或MUC1-C/ECD-mFc或hFc包被板而进行ELISA(作为阴性对照)。通过与板孵育1小时而针对包被蛋白质筛选杂交瘤上清液或免疫血清。通过与缀合至HRP(辣根过氧化物酶)的特异性二抗(抗小鼠Ig，F(ab)2特异性)孵育而检测结合的抗体。进一步，将反应用HRP-特异性底物显色30分钟，并且将板在405nm处读取。
Western印迹.如下评价抗体在使用全细胞裂解物的Western印迹中的表现。使来自ZR-75-1乳腺癌、MCF-7乳腺癌、H441非小细胞肺癌和293T细胞的总细胞裂解物进行SDS-PAGE，并转移至硝酸纤维素膜。将纯化的单克隆抗体与膜孵育，并且用HRP-缀合的山羊抗小鼠Ig,F(ab)2特异性(1:5000稀释；GE Healthcare)、随后增强的化学发光(GE Healthcare)检测结合至抗原的抗体。
表6-免疫时间表和细节
用于杂交瘤和初步筛选的融合体。基于获得自ELISA的结果，来自两个小鼠的脾脏用于与骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤。通过在聚乙二醇(PEG)存在的情况下以1:3比率混合小鼠骨髓瘤细胞sp2/0-Ag14和脾细胞而进行脾-骨髓瘤融合。在选择性HAT培养基中实施融合后细胞培养。通过使用重组MUC-C/ECD-mFc或MUC1-C/ECD-hFc作为抗原的间接ELISA或Western印迹选择杂交瘤，并且将其通过有限稀释方案进行亚克隆，直到克隆变得稳定。获得自小鼠1的脾脏的融合克隆被称为315.1克隆，并且类似地获得自小鼠2的脾脏的融合克隆被称为315.2克隆。来自其它免疫批次的获得自小鼠1的脾脏的融合克隆被称为384克隆。从315.2克隆鉴定了7个亲本阳性克隆(3G1、3H7、4A11、4H3、5A4、8E1和8F1)。从小鼠315.1选择了6个亲本阳性克隆(1A4、1G4、2A6、6D12、6A6、5G6)。从小鼠384选择了两个亲本阳性克隆(2G11、2H11)。通过ELISA重新证实这些克隆，并且在筛选的同时，我们排除了与单独的hFc蛋白质反应的任何克隆，因为小鼠用MUC1-C/ECD-hFc作为抗原进行免疫。
二次筛选。所选亲本克隆通过96孔板中的有限稀释进行亚克隆，并且来自这些孔的上清液通过ELISA进行进一步筛选。具有较高吸光度值的亚克隆在较大孔中扩增，并且选择上清液用于通过ELISA证实。在该阶段，从各亲本克隆选择最多3个亚克隆。证实这些所选亚克隆仅与MUC1-C/ECD蛋白质反应，但不与hFc蛋白质反应。来自315.1和315.2小鼠的所选亚克隆：
315.1克隆 315.2克隆
315.1.2A6.E7 315.2.8E1.F7
315.1.2A6.H5 315.2.8F1.B5
315.1.2A6.H6 315.2.8F1.D2
315.1.6A6.A3 315.2.8F1.F12
315.1.6A6.C8
315.1.6A6.C11
315.1.6D12.H3
315.1.6D12.G6
315.1.6D12.H10
用哺乳动物mFc-MUC1-C/ECD免疫的小鼠384导致产生两个额外克隆2G11和2H11(图29)。在western印迹分析中，这些克隆与细菌产生的MUC1-C/ECD蛋白质阳性反应(图30)。因此，这些克隆的特征不同于6A6、8E1、2A6和8F1(图30)。
最终克隆的选择。根据上述标准选择亚克隆，并且继续用于产生和纯化mAb或根据克隆的纯度(单细胞克隆)和稳定性进行进一步亚克隆。因此，亚克隆至稳定之后，最终选择以下亚克隆用于生产和纯化：
315.1.6D12.G6
315.1.2A6.H6.F7
315.1.6A6.C11.G5
315.2.8F1.D2.D1
315.2.8E1.F7.C3.H7.H8.F5
384.1.2G11.H5.E4
384.1.2H11.F2.G6
抗-MUC1-C/ECD单克隆抗体的纯化。使杂交瘤在补充含有低牛IgG的10％FBS的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中生长。使用Akta Xpress FPLC系统(AmershamPharmacia,Piscataway,NJ)将培养上清液通过用50mM磷酸钠/300mM NaCl平衡的蛋白质A琼脂糖。洗涤之后，使用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱抗体。将洗脱的级分中和，合并，针对PBS透析，并使用Amicon Ultracel 10K过滤器(Millipore,Billerica,MA)浓缩。将所有这些纯化的抗体在ELISA中以不同的稀释度对于其针对Muc1-ECD的反应性进行测试。
抗MUC1-C/ECD抗体的命名。本发明人已经开发并纯化了7种不同的针对MUC1-C蛋白质的ECD的单克隆抗体，将其在纯化它们的亚克隆的名称之后进行标识。然而，由于简化原因，他们在其亲本克隆之后对它们命名，如下表示。
表7-克隆命名
克隆的名称 简称
315.1.6D12.G6(IgM) 6D12(IgM)
315.1.2A6.H6.F7 2A6(IgG)
315.1.6A6.C11.G5 6A6(IgG)
315.2.8F1.D2.D1 8F1(IgG)
315.2.8E1.F7.C3.H7.H8.F5 8E1(IgG)
384.2G11.H5.E4 2G11(IgG)
384.2H11.F2.G6 2H11(IgG)
400.6.2B11.D5.F6 2B11(IgG1)
400.6.4G5.E11.G2 4G5(IgG1)
400.6.7B8.G3.G1 7B8(IgG2a)
Western印迹分析。分析抗体在Western印迹中的表现。MUC1-ECD-mFc和/或MUC1-ECD-hFc(0.5和1μg/泳道)进行SDS-PAGE，并且以20V持续60分钟转移至硝酸纤维素膜。将单克隆抗体与膜孵育，并且用HRP-缀合的山羊抗小鼠Ig,F(ab)2特异性(1:5000稀释；GEHealthcare)、随后增强的化学发光(GE Healthcare)检测结合至抗原的抗体。
流式细胞术分析。通过流式细胞术分析抗体结合至细胞表面MUC1-C蛋白质的能力。将细胞与抗-MUC1-C/ECD抗体或小鼠IgG孵育30分钟，洗涤，与山羊抗小鼠免疫球蛋白荧光素缀合的抗体(Santa Cruz Biotechnology)孵育，并固定于1％甲醛/PBS中。通过免疫荧光FACScan检测反应性。通过免疫荧光FACScan检测反应性(表8)。
表8–流式细胞术数据
细胞生长抑制测定/台盼蓝排除。台盼蓝排除测定。将基于其生长速率估计的数目的细胞铺板于24孔板中。使细胞在孔中过夜生长之后，在37℃、5％CO2下以各种时间间隔(例如，三天一次)添加2-4μg/ml抗体并混合至培养物。与抗体孵育6天之后，通过胰蛋白酶消化收获细胞，并且通过台盼蓝排除法计数活细胞。
细胞生长抑制测定/Alamar蓝。或者，将细胞铺板于96孔板中。过夜生长之后，用从10μg/ml开始两倍系列稀释的各种浓度的抗体处理细胞。用抗体处理4-6天之后，将alamar蓝试剂添加至各孔并孵育3-5小时，并且通过使用Thermomax读板器(Molecular Devices)在570nm(激发波长)和600nm(发射波长)处读板而测量吸光度。在测定中，alamar蓝的百分比降低与活细胞的百分比成正比，并且其使用SoftMax Pro软件计算并绘制为4-参数曲线。
ZR-75-1乳腺癌细胞和H-1975肺癌细胞中的抗-MUC1-C/ECD MAbs 8E1和6A6的细胞内化。MAbs 6A6和8E1用FITC或Alexa Fluor 488直接标记，并且在标记之后，根据制造商的说明纯化抗体。在玻璃底培养板上生长的ZR-75-1或H-1975细胞上评价免疫荧光。以4和2μg/ml的浓度使用FITC-或Alexa Fluor 488-缀合的MAbs 6A6或8E1。MUC1阴性的HEK-293T细胞用作阴性对照。最初，在4℃实施表面标记60分钟。通过在37℃在培养基中再孵育3小时而起始表面结合的抗体的内化。随后用落射荧光显微镜使用适当波长分析活细胞。
ZR-75-1乳腺癌和H-1975NSCLC细胞中MAbs 6A6和8E1与内体标志物的共定位。使人ZR‐75‐1和H‐1975细胞在含有10％热-灭活的胎牛血清、链霉素(100mg/ml)、青霉素(100U/ml)和2mML-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。标记前48小时，用RPMI-1640将细胞以15,000个细胞/板接种入玻璃底培养板。以4和2μg/ml的浓度使用Alexa Fluor 488-缀合的MAbs 6A6或8E1。Alexa Fluor 488-标记的非特异性IgG(同种型对照抗体)用作阴性对照。MUC1阴性的HEK-293T细胞用作额外阴性对照。用RFP-细胞内含物标志物(Invitrogen)转染ZR-75-1或H-1975细胞，然后与MAbs孵育16‐18小时。在适当时，将细胞用PBS洗涤并用0.5％BSA/PBS封闭。Alexa Fluor 488-标记的MAb 8E1或6A6(2μg/ml)用于在4℃标记细胞60分钟。
孵育之后，随后将细胞用PBS洗涤三次，并且允许在培养基中在4℃再孵育3小时以监测膜结合，或者在37℃再孵育3小时而用于内化。在处理期结束时，将细胞用PBS洗涤三次，并且使用Nikon去卷积宽场落射荧光系统使用60X油浸物镜进行检查，并且使用NIS-元件软件(Nikon)捕获图像。使用Image J软件分析所有图像。
实施例2-抗体产生和筛选结果
Western印迹的结果表明抗-MUC1-C/ECD抗体与MUC1-C/ECD蛋白质的特异性反应性，并且不与MUC1-CD蛋白质(阴性对照)反应。表9至27中已经呈现通过台盼蓝排除法获得的细胞活力测定结果。结果清楚地表明，抗-MUC1-C/ECD抗体对细胞生长抑制具有独特且选择性的影响。细胞的活力随着抗体浓度增加而降低。然而，当抗体浓度增加至超过2mg/ml时，其不影响活力。该数据证实同时使用台盼蓝排除法进行的测定。使用MCF-7细胞表明抗体在抑制某些类型细胞中的选择性，当用6D12抗体处理时，所述MCF-7细胞未显示任何主要的细胞生长抑制。
表9
细胞对照 100
2A6(4ug/ml) 64.2
6A8(4ug/ml) 128.2
用4μg/ml抗-p59抗体2A6和6A6处理H1975细胞。抗-MUC1 CD(4μg/ml)用作对照。将8000个细胞/孔/ml RPMI铺板于24孔板中。第二天开始用抗体处理。每天处理细胞，持续6天。
表10
细胞对照 100
2A6(4ug/ml) 64.2
6A6(4ug/ml) 128.2
用4μg/ml抗-p59抗体2A6和6A6处理H-1975细胞。将8000个细胞/孔/ml RPMI铺板于24孔板中。第二天开始用抗体处理。每天处理细胞，持续6天。
表11
细胞对照 100
2A6(4ug/ml) 110.2
6A6(4ug/ml) 121.4
用4μg/ml抗-p59抗体2A6和6A6处理293T细胞。抗-MUC1-CD(4μg/ml)用作对照。将4500个细胞/孔/ml DMEM铺板于24孔板中。第二天开始用抗体处理。每天处理细胞，持续6天。
表12
细胞对照 100
2A6(4ug/ml) 128.8
6A6(4ug/ml) 68
用4μg/ml抗-p59抗体-2A6和6A6处理ZR75-1细胞。抗-MUC1-CD(4μg/ml)用作对照。将10,000个细胞/孔/ml RPMI铺板于24孔板中。第二天开始处理。每天处理细胞，持续6天。
表13
用4μg/ml抗-p59抗体8F1、2A6和6A6处理ZR75-1细胞。抗-MUC1-CD 4μg/ml用作对照。将10,000个细胞/孔/ml RPMI铺板于24孔板中。同一天(接种细胞日)进行抗体的处理。在第7天收获细胞。
表14
细胞对照 100
8F1(4ug/ml) 66.1
2A6(4ug/ml) 80.2
6A6(4ug/ml) 92.2
用4μg/ml抗-p59抗体8F1、2A6和6A6处理ZR75-1细胞。抗-MUC1-CD(4μg/ml)用作对照。将5000个细胞/孔/ml RPMI铺板于24孔板中。(仅在接种细胞日)进行抗体的处理。在第9天、同一天收获。
表15
细胞对照 100
8F1(2ug/ml) 80.7
8F1(4ug/ml) 90.6
用2和4μg/ml抗-p59抗体(315.2.8F1.D2.D1)处理H1650细胞。以2和4μg/ml使用抗-MUC1-CD抗体作为同种型匹配的对照(IgG1κ)。将8，000个细胞/孔/800μl RPMI铺板于24孔板中。持续6天进行处理。
表16
细胞对照 100
8F1(4ug/ml) 97.3
用4μg/ml抗-p59抗体(315.2.8F1.D2.D1)处理H1975细胞。抗-MUC1-CD(4μg/ml)用作对照。将8,000个细胞/孔/800μl RPMI铺板于24孔板中。第二天开始用抗体处理。每天处理细胞，持续6天。
表17
用4μg/ml抗-p59抗体(315.2.8F1.D2.D1)处理H1975细胞。抗-MUC1-CD(4μg/ml)用作对照。将8,000个细胞/孔/800μl RPMI铺板于24孔板中。第二天开始用抗体处理。每天处理细胞，持续6天。
表18
细胞对照 100
8F1(4ug/ml) 94.5
用4μg/ml抗-p59抗体(315.2.8F1.D2.D1)处理HEK293T细胞。抗-MUC1-CD(4μg/ml)用作对照。将4,500个细胞/孔/800μl RPMI铺板于24孔板中。第二天开始用抗体处理。计划每天处理细胞，持续6天。然而，细胞生长得快，因此在处理5天之后收获。
表19
细胞对照 100
2ug/ml8F1 55.4
4ug/ml8F1 53.9
用2和4μg/ml抗-p59抗体(315.2.8F1.D2.D1)处理ZR-75.1细胞。将10,000个细胞/孔/800μl RPMI铺板于24孔板中。持续6天进行处理。
表20
细胞对照 100
8F1(4ug/m 63.4
用4μg/ml抗-p59抗体(315.2.8F1.D2.D1)处理ZR75细胞。抗-MUC1-CD(4μg/ml)用作对照。将10,000个细胞/孔/800μl RPMI铺板于24孔板中。第二天开始用抗体处理。每天处理细胞，持续6天。
表21–表面染色：用克隆6A6在MM、AML和CML细胞系流上的抗体测试(流式细胞术)
*2μg抗体/样品；PE-缀合的山羊抗小鼠二抗
表22–表面染色：在乳腺癌细胞系和原发性乳腺癌患者细胞上的抗体测试(流式细胞术)
*2μg抗体/样品；PE-缀合的山羊抗小鼠二抗
表23–表面染色：在慢性髓细胞性白血病(CML)细胞系上的抗体测试(流式细胞术)
*2μg抗体/样品；PE-缀合的山羊抗小鼠二抗。
表24–表面染色：抗体测试(流式细胞术)
*2μg抗体/样品；PE-缀合的山羊抗小鼠二抗。
固定样品并在4℃保持4天。
表25–表面染色：抗体测试(流式细胞术)
*2μg抗体/样品；PE-缀合的山羊抗小鼠二抗。
表26
用4μg/ml抗-p59抗体2A6和6A6处理H1975细胞。抗-MUC1-CD(4μg/ml)用作对照。将8000个细胞/孔/ml RPMI铺板于24孔板中。第二天开始用抗体处理。每天处理细胞，持续6天。
表27
用5μg/ml抗-p59抗体或IgM对照抗体处理SKOV3细胞。将10,000个细胞/800μlRPMI铺板于24孔板中。第二天开始用抗体处理。每天处理细胞，持续6天。
使用ZR-75-1乳腺癌和H-1975NSCLC细胞系评价缀合至FITC或Alexa Fluor 488的MAbs 6A6和8E1的内化。作为对照，MUC1阴性的HEK293T细胞用于针对结合和内化定义选择性。结果表明当H-1975NSCLC细胞与标记抗体在37℃孵育3小时时FITC-标记的6A6和8E1的显著内化(图12和13)。当在37℃在ZR-75-1乳腺癌细胞中使用Alexa Fluor 488-标记的6A6持续3小时时，获得类似的结果(图14)。当在4℃或37℃孵育3小时时，无一抗体结合至MUC1阴性的HEK-293T细胞(图15和未显示的数据)。
本发明人最初在4℃评价Alexa Fluor 488-6A6MAb与ZR-75-1乳腺癌细胞的结合。免疫荧光分析证实在4℃在质膜处MAb 6A6抗体与ZR-75-1的结合(图18)。当ZR-75-1细胞与RFP内体标志物孵育并在4℃分析时，观察到类似的免疫荧光表面染色。而且，在细胞膜处可检测到Alexa Fluor 488-标记的6A6(绿色)，在细胞膜处其在4℃与早期内体共定位(橙色/黄色的区域)。在37℃再孵育3小时导致MAb 6A6运动入细胞质，在细胞质中，其与RFP内体标志物共定位。在37℃3小时之后晚期内体内的Alexa Fluor 488-标记的6A6抗体的这种内化和定位通过重叠图中的橙色而明显(白色箭头，图19)。这些发现表明，大部分的荧光标记的6A6抗体可能已经移出早期内吞隔室(4℃)，并在37℃与晚期内体/溶酶体共定位。
H-1975非小细胞癌细胞中的抗-MUC1-C/ECD Mabs与内体标志物的内化和共定位。本发明人接下来评价H-1975NSCLC细胞中的Alexa Fluor 488-6A6和8E1MAbs的内化。对于共定位研究，用RFP-细胞内含物标志物转染H-1975细胞，然后与抗‐MUC1‐C/ECD Mabs 6A6或8E1孵育16‐18小时。此外，作为对照，RFP-细胞内含物标志物转染的H-1975细胞也分别与Alexa Fluor 488‐标记的同种型对照抗体(IgG)孵育。免疫荧光分析证实了用RFP-细胞内含物标志物转染细胞之后内体的染色(图26)。重要的是，结果表明当与IgG同种型对照抗体孵育时细胞的较少染色，如果有的话(图26)。此外，免疫荧光分析表明当在37℃孵育三小时时H-1975细胞中的Alexa Fluor 488-标记的MAb 6A6的内化(图20)。当用RFP-内体标志物转染H-1975细胞并在37℃分析时，观察到类似的染色。更重要的是，结果表明Alexa Fluor488-标记的6A6在37℃与内体明显共定位。在37℃3小时之后晚期内体内的Alexa Fluor488-标记的6A6抗体的这种内化和定位通过重叠图中的橙色/黄色而明显(图19)。当RFP-细胞内含物标志物转染的H-1975细胞与Alexa Fluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD 8E1 Mab孵育时，获得类似的结果(图21)。
通过评估MUC1-阴性的HEK-293T细胞中的荧光标记的6A6的结合而进一步检查缀合物的特异性。结果表明当HEK-293T细胞与标记的抗体在4℃或在37℃孵育3小时时AlexaFluor 488-标记的6A6抗体的较少染色，如果有的话(图26)。此外，当在ZR-75-1细胞中在4℃或在37℃使用Alexa Fluor 488-标记的同种型对照(IgG)抗体3小时时，未观察到免疫荧光(数据未显示)。
H-1975非小细胞癌细胞中的抗-MUC1-C/ECD Mabs与溶酶体标志物的内化和共定位。本发明人接下来评价H-1975NSCLC细胞中的Alexa Fluor 488-6A6和8E1 MAbs的内化及其与溶酶体的共定位。对于共定位研究，用RFP-溶酶体标志物转染H-1975细胞，然后与抗‐MUC1‐C/ECD Mabs 6A6或8E1孵育16‐18小时。此外，作为对照，RFP-溶酶体标志物转染的H-1975细胞也分别与Alexa Fluor 488‐标记的同种型对照抗体(IgG)孵育。
免疫荧光分析证实了用RFP-溶酶体标志物转染细胞之后溶酶体的染色(图27)。有趣的是，结果表明当与IgG同种型对照抗体孵育时细胞的较少染色，如果有的话(图27)。此外，免疫荧光分析表明当在37℃孵育三小时时H-1975细胞中的Alexa Fluor 488-标记的MAb 8E1的内化(图28)。当用RFP-溶酶体标志物转染H-1975细胞并在37℃分析时，观察到类似的染色。更有趣的是，结果表明Alexa Fluor 488-标记的8E1在37℃与溶酶体明显共定位。在37℃3小时之后溶酶体内的Alexa Fluor 488-标记的8E1抗体的这种内化和定位通过重叠图中的橙色/黄色而明显(图28)。当RFP-溶酶体标志物转染的H-1975细胞与AlexaFluor 488-标记的抗-MUC1-C/ECD 6A6 MAb孵育时，获得类似的结果(图23)。
图3显示来自MUC1-C/ECD(58aa)的三种重叠肽的序列。所有描述的抗体都不能与这三种肽中的任一种反应。
总之，已经进行了关于反应性和同种型的ELISA数据、流式数据(特异性和选择性)、Western印迹分析(纯化的蛋白质和细胞裂解物)、免疫荧光(内化；与内体和溶酶体的共定位)、线性和构象表位作图(使用重叠ECD肽和多个单点突变体)和生物活性研究(体外多个细胞系)。鉴定了多个IgG克隆(6A6、8E1/8F1、2A6、2G11、2H11)并在下面进一步描述。
7B8和3D1抗体的表征。合成跨越整个MUC1-C/ECD区域(58个氨基酸)的三个重叠肽，并使用其进行7B8和3D1克隆的线性表位作图。在P1、P2或P3肽存在或不存在的情况下使用7B8或3D1纯化的抗体进行ELISA测定。图47中显示的结果表明这三个重叠肽中的任一个都不抑制7B8和3D1结合至抗原。通过ELISA使用MUC1-C/ECD区域中的八个关键单独点突变进行7B8和3D1的构象表位作图。结果表明抗体3D1至少部分对于MUC1-C/ECD中存在的D19氨基酸是敏感的(图48A-B)。这些结果表明，D19是3D1结合的构象核心/口袋的一部分。使用ZR-75-1乳腺癌细胞，以与MUC1-C/ECD的竞争性形式测定7B8或3D1抗体结合，并通过FLOW分析。结果表明，与7B8相反，细胞与MUC1-C/ECD蛋白质的孵育完全废除3D1的结合(图49)。这些发现表明，7B8和3D1的构象结合表位是不同的。对于杂交瘤3D1的测序结果显示于图50中，并在下面更详细地讨论。
通过经由可切割的接头缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基(Val-Cit-PAB)将2mg各单克隆抗体缀合至单甲基auristatin F(MMAF)而生成7B8和3D1的抗体-药物缀合物(ADC)。MMAF是具有带电的C-末端苯丙氨酸(其减弱其细胞毒活性)的新的auristatin衍生物。生成的ADC的结构如下所示。
本发明人测定使用可切割接头的7B8-MMAF和3D1-MMAF缀合物的体外效力。在多种培养的MUC1-阳性细胞系上评估7B8和3D1缀合物的抗增殖作用。重要的是，通过可切割接头连接至MMAF的7B8和3D1表现出与连接至MMAF的CD1(靶向MUC1-C的内部胞质结构域的抗体)相比显著的抗增殖活性。7B8和3D1抗体缀合物在ZR-75-1乳腺癌细胞中诱导了增殖的剂量依赖的抑制，其中IC50值分别为～860pM和1.32nM(图51A)。当用7B8或3D1MMAF缀合物处理MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞时，获得类似的结果(图51B)。
实施例3-抗体测序方法和结果
8E1/8F1.使用Qiagen试剂盒从杂交瘤提取总RNA。使用OneStep RT-PCR试剂盒(目录号210210)。用对于重链和轻链特异性的引物组进行RT-PCR。对于各RNA样品，使用覆盖可变区的前导序列的简并正向引物混合物设置12个单独重链和11个轻链RT-PCR反应。反向引物位于重链和轻链的恒定区中。未将限制性位点工程改造入引物。
反应设置如下：
PCR条件如下：
在第二轮PCR中进一步扩增来自第一轮反应的RT-PCR产物。使用对于抗体可变区特异性的半巢式引物组设置12个单独重链和11个轻链RT-PCR反应。
反应设置如下：
PCR条件如下：
在95℃初始变性5min，
25个循环的95℃，25sec,
57℃，30sec,
68℃，30sec,
最终延伸为68℃10min。
完成PCR之后，PCR反应样品跑至琼脂糖凝胶上以显现扩增的DNA片段。正确的抗体可变区DNA片段应当具有400-500碱基对之间的大小。
通过TOPO克隆PCR阳性条带，然后PCR扩增，随后凝胶电泳并从琼脂糖凝胶回收。将约24个克隆测序，并使用测序数据进行CDR分析，并且鉴定了两个重链和一个轻链，其显示如下：
下面显示重链氨基酸和核苷酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGESLKLSCESNEYEFPSHDMSWVRKTPEKRLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFIISRDNTKKTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRLYYGNVMDYWGQGTSVTVSS
(SEQ ID NO:15)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGAGTCCCTGAAACTCTCCTGTGAATCCAATGAATACGAATTCCCTTCCCATGACATGTCTTGGGTCCGCAAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAGCCATTAATAGTGATGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACACCATGGAGAGACGATTCATCATCTCCAGAGACAATACCAAGAAGACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCTTGTATTACTGTGTAAGACTCTACTATGGTAATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
(SEQ ID NO:16)
下面显示轻链氨基酸和核苷酸序列：
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK
(SEQ ID NO:19)
TCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTATATTGGTACCTACAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC
(SEQ ID NO:20)
6A6.使用RNeasy Mini试剂盒(目录号74104)从杂交瘤提取总RNA。第一轮RT-PCR使用OneStep RT-PCR试剂盒(目录号210210)。用对于重链和轻链特异性的引物组进行RT-PCR。对于各RNA样品，使用覆盖可变区的前导序列的简并正向引物混合物设置12个单独重链和11个轻链RT-PCR反应。反向引物位于重链和轻链的恒定区中。未将限制性位点工程改造入引物。
反应设置如下：
PCR条件如下：
第二轮半巢式PCR在第二轮PCR中进一步扩增来自第一轮反应的RT-PCR产物。使用对于抗体可变区特异性的半巢式引物组设置12个单独重链和11个轻链RT-PCR反应。
反应设置如下：
2x PCR混合物10.0μl
引物组2.0μl
第一轮PCR产物8.0μl
总体积20.0μl
PCR条件如下：
完成PCR之后，在琼脂糖凝胶上分析PCR反应样品以显现扩增的DNA片段。正确的抗体可变区DNA片段应当具有400-500碱基对之间的大小。通过TOPO克隆PCR阳性条带，然后PCR扩增，随后凝胶电泳并从琼脂糖凝胶回收。将约24个克隆测序，并使用测序数据进行CDR分析(使用万维网vbase2.org的VBASE2定义CDR区域)。鉴定了一个重链和一个轻链：
下面显示重链氨基酸和核苷酸序列：
QVQLKESGPGLVAPSQSLSMTCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSPLKSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQADDTAIYYCAKNYLGSLDYWGQGTSVTVSS
(SEQ ID NO:17)
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCGCAGAGCCTGTCCATGACATGCACCGTCTCAGGGTTTTCATTAACTACCTATGGTGTTCACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGTAGTGATATGGAGTGATGGAAGCACAACCTATAATTCACCTCTCAAGTCCAGACTGAGCATCAGCAGGGACAACTCCAAGAGCCAAGTATTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAGCTGATGACACAGCCATCTACTACTGTGCCAAAAATTACCTCGGTAGTCTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
(SEQ ID NO:18)
下面显示轻链氨基酸和核苷酸序列：
DVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTFKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELK
(SEQ ID NO:21)
GATGTTGTGTTGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAATAATGGAGACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACATTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAACTACACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC
(SEQ ID NO:22)
2H11.下面显示重链氨基酸和核苷酸序列：
QIQLVQSGPELKKPGETVKTSCKASGYTFTGYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTY
ADDFKGRFALSLETSASTTYLQINNLKNEDTATYFCVRGTGGDDWGQGTTLTVSSAKTTP
(SEQ.ID NO:23)
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGACC
TCCTGCAAGGCCTCTGGTTATACCTTCACAGGCTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCT
CCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATAT
GCAGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTGTCTCTGGAAACCTCTGCCAGCACTACCTAT
TTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGTTAGGGGGACG
GGGGGTGACGACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCC
(SEQ.ID NO:24)
下面显示轻链氨基酸和核苷酸序列：
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQGTHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTV
(SEQ.ID NO:25)
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCGCTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCC
ATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGG
TACCTTCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGGTTT
TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATC
AACAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAGGTACACATGTTCCT
CCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA
(SEQ.ID NO:26)
2B11.下面显示重链氨基酸和核苷酸序列：
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAIGFTFNYFWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTGSTNYNEKFKGKAIFTADTSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCVRYDYTSSMDYWGQGTSVTVSS
(SEQ ID NO:60)
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAAATTTCCTGCAAGGCTATTGGCTTCACATTCAATTACTTCTGGATAGAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGGCATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAACTGGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGTAAGATACGAC TATACCTCTTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG
(SEQ ID NO:61)
下面显示轻链氨基酸和核苷酸序列：
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPNRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYYCGQSYSYPWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:62)
AACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACCTTGACCTGC AAGGCCAGTGAGAATGTGGGTACTTATGTATCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAGTCTCCTAAACTACTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCAATCGCTTCACGGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATTACTGTGGACAGAGTTACAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC
(SEQ ID NO:63)
4G5.下面显示重链氨基酸和核苷酸序列：
QITLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLSHIYWDDDKRYNPSLKSRLSISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCAPGVSSWFPYWGPGTLVTVSA
(SEQ ID NO:64)
CAGATTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAATGGCTGTCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGACTCTCAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCCCGGC GTATCCTCATGGTTTCCTTACTGGGGCCCAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAG
(SEQ ID NO:65)
下面显示轻链氨基酸和核苷酸序列：
SIVMTQTPKFLPVSAGDRVTVTCKASQSVGNYVAWYQQKPGQSPKLLIYFASNRYSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQVEDLAVYFCQQHYIFPYTFGSGTKLEIK
(SEQ ID NO:66)
AGTATTGTGATGACCCAGACTCCCAAATTCCTGCCTGTATCAGCAGGAGACAGGGTTACCGTGACCTGC AAGGCCAGTCAGAGTGTGGGTAATTATGTAGCCTGGTACCAACAGAAGCCAGGACAGTCTCCTAAACTACTGATATACTTTGCATCCAATCGCTATAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGTTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGCATTATATCTTTCCGTATACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAC
(SEQ ID NO:67)
7B8.下面显示重链氨基酸和核苷酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASEKLSCKASGHTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTYYNENFKTKATLTVDKYSSSASMQLRSLTSEDSAVYYCASDGDYVSGFAYWGQGTTLTVSS
(SEQ ID NO:68)
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGAGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGGCACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAGCAACGGTCGTACTTACTACAATGAGAACTTCAAGACCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATATTCCAGCTCAGCCTCCATGCAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGTGATGGT GACTACGTCTCGGGCTTTGCCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAG
(SEQ ID NO:69)
下面显示轻链氨基酸和核苷酸序列：
DIVLTQSPGSLAVSLGQSVTISCRASESVQYSGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYGASNVETGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQNWKVPWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:70)
GACATTGTGCTCACCCAATCTCCAGGTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGTGTCACCATCTCCTGC AGAGCCAGTGAAAGTGTTCAATATTCTGGCACTAGTTTAATGCACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGGTGCATCCAACGTAGAGACTGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGATGATATTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAATTGGAAGGTTCCTTGG ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC
(SEQ ID NO:71)
3D1.遵循试剂的技术手册从客户提供的冷冻杂交瘤细胞提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA。遵循PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒的技术手册使用同种型特异性的反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。根据GenScript的RACE的标准操作程序扩增VH和VL的抗体片段。
使用标准亚克隆程序将扩增的抗体片段分别克隆入标准克隆载体。进行菌落PCR筛选以鉴定具有正确大小的插入物的克隆。对于各抗体片段，测序不少于五个具有正确大小的插入物的单菌落。
在1.5％琼脂糖/GelRedTM凝胶上一起运行样品的分离RNA和DNA标记III(Tiangen目录号MD103)(图52)。在1.5％琼脂糖/GelRedTM凝胶上一起运行四微升各样品的PCR产物和DNA标记Marker III(图53)。纯化PCR产物并储存在-20℃，直到进一步使用。
将五个具有正确的VH和VL插入物大小的单菌落送去测序。五个不同的克隆的VH和VL基因(对于序列和序列比对详见所附文件)被发现几乎是相同的。下面列出的共有序列被认为是由杂交瘤441.3.3D1.D6.D11.B1.F10产生的抗体的序列(抗-Muc-1)。
下面显示重链核苷酸和氨基酸序列：
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGACTTCTGGCTATGCATTCAGTAACTTCTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTAGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGACACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGTCTAACATCTGAGGCCTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGGTCCTAC TATAGGTCGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCTCTGTCTCTGCA
(SEQ ID NO:72)
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKTSGYAFSNFWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEASAVYFCARSYYRSAWFAYWGQGTLVSVSA
(SEQ ID NO:73)
下面显示重链核苷酸和氨基酸序列：
GACATCTTGCTAACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGCATTGGCACAAGCATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTAATAACTGGCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
(SEQ ID NO:74)
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNNWPLTFGAGTKLELK
(SEQ ID NO:75)
*****************
在本公开内容的教导下，本文公开并要求保护的所有组合物和方法可以被制备或实行，而不需要过度的实验。尽管本发明的组合物和方法已经以优选的实施方案的形式进行了描述，但对于本领域技术人员显而易见的是可以对组合物和方法以及在本文描述的方法的步骤中或步骤的顺序中产生变化而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，可以用化学上和生理上相关的某些试剂来替代本文描述的试剂，同时会实现相同或相似的结果，这也将是显而易见的。认为对于本领域技术人员显而易见的所有这样的相似的替代和修改处于由所附的权利要求所确定的发明的精神、范围和概念之内。
VII.参考文献
以下参考文献在它们提供了补充本文描述内容的的示例性程序或其它细节的程度上通过引用明确地并入本文。
美国专利3,817,837
美国专利3,850,752
美国专利3,939,350
美国专利3,996,345
美国专利4,196,265
美国专利4,275,149
美国专利4,277,437
美国专利4,366,241
美国专利4,472,509
美国专利4,554,101
美国专利4,680,338
美国专利4,683,202
美国专利4,684,611
美国专利4,816,567
美国专利4,867,973
美国专利4,879,236
美国专利4,938,948
美国专利4,952,500
美国专利5,021,236
美国专利5,141,648
美国专利5,196,066
美国专利5,217,879
美国专利5,302,523
美国专利5,322,783
美国专利5,384,253
美国专利5,464,765
美国专利5,506,138
美国专利5,538,877
美国专利5,538,880
美国专利5,550,318
美国专利5,563,055
美国专利5,563,250
美国专利5,565,332
美国专利5,580,859
美国专利5,589,466
美国专利5,610,042
美国专利5,656,610
美国专利5,670,488
美国专利5,702,932
美国专利5,736,524
美国专利5,739,018
美国专利5,780,448
美国专利5,789,215
美国专利5,824,544
美国专利5,830,725
美国专利5,849,304
美国专利5,851,826
美国专利5,856,456
美国专利5,858,744
美国专利5,871,982
美国专利5,871,983
美国专利5,871,986
美国专利5,879,934
美国专利5,880,270
美国专利5,888,502
美国专利5,925,565
美国专利5,928,906
美国专利5,932,210
美国专利5,935,819
美国专利5,945,100
美国专利5,955,331
美国专利5,981,274
美国专利5,994,136
美国专利5,994,624
美国专利6,013,516
美国专利序列号12/789,127
美国专利序列号13/026,858
美国专利序列号13/045,033
“Antibodies:A Laboratory Manual,”Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY,1988.
Abbondanzo等人,Am.J.Pediatr.Hematol.Oncol.,12(4),480-489,1990.
Allred等人,Arch.Surg.,125(1),107-113,1990.
Almendro等人,J.Immunol.,157(12):5411-5421,1996.
Amado和Chen,Science,285(5428):674-676,1999.
Angel等人,Cell,49:729,1987a.
Angel等人,Cell,49:729,1987b.
Armentano等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87(16):6141-6145,1990.
Atchison和Perry,Cell,46:253,1986.
Atchison和Perry,Cell,48:121,1987.
Atherton等人,Biol.of Reproduction,32,155-171,1985.
Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.,1994.
Baldus等人,Clin.Cancer Res.,10(8):2790-2796,2004.
Banerji等人,Cell,27:299,1981.
Banerji等人,Cell,33(3):729-740,1983.
Bates,Mol.Biotechnol.,2(2):135-145,1994.
Batra等人,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,21(2):238-245,1999.
Battraw和Hall,Theor.App.Genet.,82(2):161-168,1991.
Beidler等人,J.Immunol.,141(11):4053-4060,1988.
Berkhout等人,Cell,59:273-282,1989.
Bett等人,J.Virololgy,67(10):5911-5921,1993.
Bhattacharjee等人,J.Plant Bioch.Biotech.,6(2):69-73.1997.
Bilbao等人,FASEB J.,11(8):624-634,1997.
Blackwell等人,Arch.Otolaryngol Head Neck Surg.,125(8):856-863,1999.
Blanar等人,EMBO J.,8:1139,1989.
Blomer等人,J.Virol.,71(9):6641-6649,1997.
Bodine和Ley,EMBO J.,6:2997,1987.
Boshart等人,Cell,41:521,1985.
Bosze等人,EMBO J.,5(7):1615-1623,1986.
Braddock等人,Cell,58:269,1989.
Brown等人,J.Immunol.Meth.,12；130(1),:111-121,1990.
Bulla和Siddiqui,J.Virol.,62:1437,1986.
Campbell和Villarreal,Mol.Cell.Biol.,8:1993,1988.
Campbell,于:Monoclonal Antibody Technology,LaboratoryTechniques inBiochemistry and Molecular Biology,Vol.13,Burdenand Von Knippenberg,Eds.pp.75-83,Amsterdam,Elsevier,1984.
Campere和Tilghman,Genes and Dev.,3:537,1989.
Campo等人,Nature,303:77,1983.
Capaldi等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.,74(2):425-433,1977.
Caplen等人,Gene Ther.,6(3):454-459,1999.
Carbonelli等人,FEMS Microbiol.Lett.,177(1):75-82,1999.
Case等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96(6):2988-2993,1999.
Celander和Haseltine,J.Virology,61:269,1987.
Celander等人,J.Virology,62:1314,1988.
Chandler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(8):3596-601,1997.
Chang等人,Mol.Cell.Biol.,9:2153,1989.
Chatterjee等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9114,1989.
Chen和Okayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745-2752,1987.
Chillon等人,J.Virol.,73(3):2537-2540,1999.
Choi等人,J.Mol.Biol.,262(2):151-167,1996.
Christou等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84(12):3962-3966,1987.
Clay等人,J.Immunol.,162:1749,1999.
Cocea,Biotechniques,23(5):814-816,1997.
Coffey等人,Science,282(5392):1332-1334,1998.
Cohen等人,J.Cell.Physiol.,5:75,1987.
Costa等人,Mol.Cell.Biol.,8:81-90,1988.
Cripe等人,EMBO J.,6:3745,1987.
Culotta和Hamer,Mol.Cell.Biol.,9:1376-1380,1989.
D’Halluin等人,Plant Cell,4(12):1495-1505,1992.
Dandolo等人,J.Virology,47:55-64,1983.
De Jager等人,Semin.Nucl.Med.23(2),165-179,1993.
DeLuca等人,J.Virol.,56(2):558-570,1985.
Derby等人,Hear Res,134(1-2):1-8,1999.
Deschamps等人,Science,230:1174-1177,1985.
Dholakia等人,J.Biol.Chem.,264,20638-20642,1989.
Doolittle和Ben-Zeev,Methods Mol.Biol.,109,:215-237,1999.
Dorai等人,Int.J.Cancer,82(6):846-52,1999.
Duraisamy等人,Gene,373:28-34,2006.
Edbrooke等人,Mol.Cell.Biol.,9:1908-1916,1989.
Edlund等人,Science,230:912-916,1985.
Engel和Kohn,Front Biosci,4:e26-33,1999.
EP申请125,023
EP申请171,496
EP申请173,494
EP申请184,187
EPO 0273085
Fechheimer等人,Proc Natl.Acad.Sci.USA,84:8463-8467,1987.
Feldman等人,Cardiovasc.Res.,32(2):194-207,1996.
Feldman等人,Semin.Interv.Cardiol.,1(3):203-208,1996.
Feng和Holland,Nature,334:6178,1988.
Feng等人,Nat.Biotechnol.,15(9):866-870,1997.
Firak和Subramanian,Mol.Cell.Biol.,6:3667,1986.
Fisher等人,Hum.Gene Ther.,7(17):2079-2087,1996.
Foecking和Hofstetter,Gene,45(1):101-105,1986.
Fraley等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348-3352,1979.
Fujita等人,Cell,49:357,1987.
Fujiwara和Tanaka,Nippon Geka Gakkai Zasshi,99(7):463-468,1998.
Garoff和Li,Curr.Opin.Biotechnol.,9(5):464-469,1998.
Garrido等人,J.Neurovirol.,5(3):280-288,1999.
Gefter等人,Somatic Cell Genet.,3:231-236,1977.
Gendler等人,J.Biol.Chem.,263:12820–12823,1988.
Ghosh和Bachhawat,于:Liver Diseases,Targeted Diagnosis and TherapyUsing Specific Receptors and Ligands,Wu等人(Eds.),Marcel Dekker,NY,87-104,1991.
Gillies等人,Cell,33:717,1983.
Gloss等人,EMBO J.,6:3735,1987.
Gnant等人,Cancer Res.,59(14):3396-403,1999.
Gnant等人,J.Natl.Cancer Inst.,91(20):1744-1750,1999.
Godbout等人,Mol.Cell.Biol.,8:1169,1988.
Goding,于:Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,2d ed.,Orlando,Fla.,Academic Press,60-61,65-66,71-74,1986.
Goodbourn和Maniatis,Cell,41(2):509-520,1985.
Goodbourn等人,Cell,45:601,1986.
Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190,1985.
Graham和Prevec,Mol Biotechnol,3(3):207-220,1995.
Graham和Van Der Eb,Virology,52:456-467,1973.
Greene等人,Immunology Today,10:272,1989.
Grosschedl和Baltimore,Cell,41:885,1985.
Gulbis和Galand,Hum.Pathol.24(12),1271-1285,1993.
Haecker等人,Hum.Gene Ther.,7(15):1907-1914,1996.
Han等人,J.Infect.Dis.,179:230-233,1999.
Harland和Weintraub,J.Cell Biol.,101(3):1094-1099,1985.
Haslinger和Karin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:8572,1985.
Hauber和Cullen,J.Virology,62:673,1988.
Hayashi等人,Neurosci.Lett.,267(1):37-40,1999.
He等人,Plant Cell Reports,14(2-3):192-196,1994.
Hen等人,Nature,321:249,1986.
Hensel等人,Lymphokine Res.,8:347,1989.
Hermens和Verhaagen,Prog.Neurobiol.,55(4):399-432,1998.
Herr和Clarke,Cell,45:461,1986.
Hirochika等人,J.Virol.,61:2599,1987.
Hirsch等人,Mol.Cell.Biol.,10:1959,1990.
Holbrook等人,Virology,157:211,1987.
Holzer等人Virology,253(1):107-114,1999.
Horlick和Benfield,Mol.Cell.Biol.,9:2396,1989.
Hou和Lin,Plant Physiology,111:166,1996.
Howard等人,Ann.NY Acad.Sci.,880:352-365,1999.
Huang等人,Cell,27:245,1981.
Huard等人,Neuromuscul Disord,7(5):299-313,1997.
Hug等人,Mol.Cell.Biol.,8:3065-3079,1988.
Hwang等人,Mol.Cell.Biol.,10:585,1990.
Imagawa等人,Cell,51:251,1987.
Imai等人,Nephrologie,19(7):397-402,1998.
Imbra和Karin,Nature,323:555,1986.
Imler等人,Mol.Cell.Biol.,7:2558,1987.
Imperiale和Nevins,Mol.Cell.Biol.,4:875,1984.
Irie等人,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.,9(4):341-349,1999.
Jakobovits等人,Mol.Cell.Biol.,8:2555,1988.
Jameel和Siddiqui,Mol.Cell.Biol.,6:710,1986.
Jaynes等人,Mol.Cell.Biol.,8:62,1988.
Johnson等人,Mol.Cell.Biol.,9(8):3393-3399,1989.
Johnston等人,J.Virol.,73(6):4991-5000,1999.
Jones等人,Nature,321:522-525,1986.
Kadesch和Berg,Mol.Cell.Biol.,6:2593,1986.
Kaeppler等人,Plant Cell Rep.,8:415–418,1990.
Kaneda等人,Science,243:375-378,1989.
Karin等人,Mol.Cell.Biol.,7:606,1987.
Karin等人,Mol.Cell.Biol.,7:606,1987.
Katinka等人,Cell,20:393,1980.
Katinka等人,Nature,290:720,1981.
Kato等人,J.Biol.Chem.,266:3361-3364,1991.
Kaufman等人,Arch.Ophthalmol.,117(7):925-928,1999.
Kawamoto等人,Mol.Cell.Biol.,8:267,1988.
Kay,Haemophilia,4(4):389-392,1998.
Khatoon等人,Ann.of Neurology,26,210-219,1989.
Kiledjian等人,Mol.Cell.Biol.,8:145,1988.
King等人,J.Biol.Chem.,269,10210-10218,1989.
Kinlough等人,J.Biol.Chem.,279(51):53071-53077,2004.
Kinoshita等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,394:205-210,2010.
Klamut等人,Mol.Cell.Biol.,10:193,1990.
Klimatcheva等人,Front Biosci,4:D481-496,1999.
Koch等人,Mol.Cell.Biol.,9:303,1989.
Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.,6,511-519,1976.
Kohler和Milstein,Nature,256,495-497,1975.
Kohut等人,Am.J.Physiol.,275(6Pt1):L1089-1094,1998.
Kooby等人,FASEB J,13(11):1325-34,1999.
Kraus等人FEBS Lett.,428(3):165-170,1998.
Kriegler和Botchan,Mol.Cell.Biol.,3:325,1983.
Kriegler等人,Cell,38:483,1984a.
Kriegler等人,于:Cancer Cells 2/Oncogenes and Viral Genes,Van de Woude等人eds,Cold Spring Harbor,Cold Spring Harbor Laboratory,1984b.
Krisky等人,Gene Ther,5(11):1517-1530,1998a.
Krisky等人,Gene Ther,5(12):1593-1603,1998b.
Kuhl等人,Cell,50:1057,1987.
Kunz等人,Nucl.Acids Res.,17:1121,1989.
Kyte和Doolittle,J.Mol.Biol.,157(1):105-132,1982.
Lachmann和Efstathiou,Curr.Opin.Mol.Ther.,1(5):622-632,1999..
Lareyre等人,J.Biol.Chem.,274(12):8282-8290,1999.
Larsen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:8283,1986.
Laspia等人,Cell,59:283,1989.
Latimer等人,Mol.Cell.Biol.,10:760,1990.
Lazzeri,Methods Mol.Biol.,49:95-106,1995.
Lee等人,Environ.Mol.Mutagen.,13(1):54-59,1989.
Lee等人,Nature,294:228,1981.
Lee等人,Nucleic Acids Res.,12:4191-206,1984.
Lee等人,DNA Cell Biol.,16(11):1267-1275,1997.
Leibowitz等人,Diabetes,48(4):745-753,1999.
Lesch,Biol Psychiatry,45(3):247-253,1999.
Levenson等人,Hum.Gene Ther.,9(8):1233-1236,1998.
Li等人,Cancer Biol.Ther.,2:187-193,2003b.
Lin等人,Mol.Cell.Biol.,10:850,1990.
Lundstrom,J.Recept Signal Transduct.Res.,19(1-4):673-686,1999.
Luria等人,EMBO J.,6:3307,1987.
Lusky和Botchan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:3609,1986.
Lusky等人,Mol.Cell.Biol.,3:1108,1983.
Macejak和Sarnow,Nature,353:90-94,1991.
Majors和Varmus,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:5866,1983.
Marienfeld等人,Gene Ther.,6(6):1101-1113,1999.
Mastrangelo等人,Biotechnol.Bioeng.,65(3):298-305,1999.
McNeall等人,Gene,76:81,1989.
Miksicek等人,Cell,46:203,1986.
Miller等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,264:11-16,1993.
Miyatake等人,Gene Ther.,6:564-572,1999.
Moldawer等人,Shock,12(2):83-101,1999.
Mordacq和Linzer,Genes and Dev.,3:760,1989.
Moreau等人,Nucl.Acids Res.,9:6047,1981.
Moriuchi等人,Cancer Res,58(24):5731-5737,1998.
Morrison等人,J.Gen.Virol.,78(Pt 4):873-878,1997.
Morrison,Science,229(4719):1202-1207,1985.
Muesing等人,Cell,48:691,1987.
Nakamura等人,于:Enzyme Immunoassays:Heterogeneous and HomogeneousSystems,Chapter 27,1987.
Naldini等人,Science,272(5259):263-267,1996.
Neuberger等人,Nucleic Acids Res.,16(14B):6713-6724,1988.
Neumann等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96(16):9345-9350,1999.
Ng等人,Nuc.Acids Res.,17:601,1989.
Nicolau和Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982.
Nicolau等人,Methods Enzymol.,149:157-176,1987.
Nomoto等人,Gene,236(2):259-271,1999.
Omirulleh等人,Plant Mol.Biol.,21(3):415-428,1993.
Omitz等人,Mol.Cell.Biol.,7:3466,1987.
Ondek等人,EMBO J.,6:1017,1987.
O'Shannessy等人,J.Immun.Meth.,99,153-161,1987.
Owens和Haley,J.Biol.Chem.,259,14843-14848,1987.
Palmiter等人,Cell,29:701,1982.
Parks等人,J.Virol.,71(4):3293-8,1997.
PCT申请PCT/US86/02269
PCT申请WO 86/01533
PCT申请WO 92/17598
PCT申请WO 94/09699
PCT申请WO 95/06128
Pech等人,Mol.Cell.Biol.,9:396,1989.
Pelletier和Sonenberg,Nature,334(6180):320-325,1988.
Perales等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:4086-4090,1994.
Perez-Stable和Constantini,Mol.Cell.Biol.,10:1116,1990.
Petrof,Eur Respir J,11(2):492-497,1998.
Picard和Schaffner,Nature,307:83,1984.
Pinkert等人,Genes and Dev.,1:268,1987.
Ponta等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:1020,1985.
Posner等人,Hybridoma 6,611-625,1987.
Potrykus等人,Mol.Gen.Genet.,199(2):169-177,1985.
Potter和Haley,Meth.Enzymol.,91,613-633,1983.
Potter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:7161-7165,1984.
Queen和Baltimore,Cell,35:741,1983.
Quinn等人,Mol.Cell.Biol.,9:4713,1989.
Rabinovitch等人,Diabetes,48(6):1223-1229,1999.
Reddy等人,Virology,251(2):414-26,1998.
Redondo等人,Science,247:1225,1990.
Reisman和Rotter,Mol.Cell.Biol.,9:3571,1989.
Remington’s Pharmaceutical Sciences,15th Ed.,33:624-652,1990.
Resendez Jr.等人,Mol.Cell.Biol.,8:4579,1988.
Rhodes等人,Methods Mol.Biol.,55:121-131,1995.
Rippe等人,Mol.Cell.Biol.,9(5):2224-22277,1989.
Rippe,等人,Mol.Cell Biol.,10:689-695,1990.
Rittling等人,Nucl.Acids Res.,17:1619,1989.
Robbins和Ghivizzani,Pharmacol Ther,80(1):35-47,1998.
Robbins等人,Trends Biotechnol.,16(1):35-40,1998.
Sambrook等人,于:Molecular cloning:a laboratory manual,2ndEd.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989.
Sawai等人Mol.Genet.Metab.,67(1):36-42,1999.
Schaffner等人,J.Mol.Biol.,201:81,1988.
Searle等人,Mol.Cell.Biol.,5:1480,1985.
Sharp和Marciniak,Cell,59:229,1989.
Shaul和Ben-Levy,EMBO J.,6:1913,1987.
Shaw等人,J.Natl.Cancer Inst.,80(19):1553-1559,1988.
Sherman等人,Mol.Cell.Biol.,9:50,1989.
Sleigh和Lockett,J.EMBO,4:3831,1985.
Smith等人,Neuron.,20:1093-1102,1998.
Spalholz等人,Cell,42:183,1985.
Spandau和Lee,J.Virology,62:427,1988.
Spandidos和Wilkie,EMBO J.,2:1193,1983.
Stephens和Hentschel,Biochem.J.,248:1,1987.
Stewart等人,Arch.Biochem.Biophys.365:71-74；1999.
Stuart等人,Nature,317:828,1985.
Sullivan和Peterlin,Mol.Cell.Biol.,7:3315,1987.
Sun等人,J.Steroid Biochem.,26(1):83-92,1987.
Suzuki等人,Biochem Biophys Res Commun,252(3):686-90,1998.
Swartzendruber和Lehman,J.Cell.Physiology,85:179,1975.
Takebe等人,Mol.Cell.Biol.,8:466,1988.
Tavernier等人,Nature,301:634,1983.
Taylor和Kingston,Mol.Cell.Biol.,10:165,1990a.
Taylor和Kingston,Mol.Cell.Biol.,10:176,1990b.
Taylor等人,J.Biol.Chem.,264:15160,1989.
Thiesen等人,J.Virology,62:614,1988.
Timiryasova等人,Int.J.Oncol.,14(5):845-854,1999.
Treisman,Cell,42:889,1985.
Tronche等人,Mol.Biol.Med.,7:173,1990.
Tronche等人,Mol.Cell.Biol.,9:4759,1989.
Trudel和Constantini,Genes and Dev.,6:954,1987.
Tsukada等人,Plant Cell Physiol.,30(4)599-604,1989.
Tsumaki等人,J.Biol.Chem.,273(36):22861-22864,1998.
Tur-Kaspa等人,Mol.Cell Biol.,6:716-718,1986.
Tyndall等人,Nuc.Acids.Res.,9:6231,1981.
Vanderkwaak等人,Gynecol Oncol,74(2):227-234,1999.
Vasseur等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:1068,1980.
Verhoeyen等人,Science,239(4847):1534-1536,1988.
Wagner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(9):3410-3414,1990.
Wang和Calame,Cell,47:241,1986.
Wang等人,Infect.Immun.,66:4193-202,1998.
Wawrzynczak&Thorpe,Cancer Treat Res.,37:239-51,1988.
Weber等人,Cell,36:983,1984.
Wei等人,Cancer Cell,7:167-178,2005.
Weihl等人,Neurosurgery,44(2):239-252,1999.
Wen等人,J.Biol.Chem.,278:38029–38039,2003.
White等人J.Virol.,73(4):2832-2840,1999.
Wilson,J.Clin.Invest.,98(11):2435,1996.
Winoto和Baltimore,Cell,59:649,1989.
Wong等人,Gene,10:87-94,1980.
Wood等人,J.Clin.Lab.Immunol.,17(4):167-171,1985.
Wu和Wu,Adv.Drug Delivery Rev.,12:159-167,1993.
Wu和Wu,J.Biol.Chem.,262:4429-4432,1987.
Wu等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,233(1):221-226,1997.
Wu等人,Cancer Res.,58(8):1605-8,1998.
Yamada等人,Brain Res.,833(2):302-307,1999.
Yeung等人,Gene Ther.,6(9):1536-1544,1999.
Yoon等人,J.Gastrointest.Surg.,3(1):34-48,1999.
Yutzey等人Mol.Cell.Biol.,9:1397,1989.
Zhao-Emonet等人,Biochim.Biophys.Acta,1442(2-3):109-119,1998.
Zheng等人,J.Gen.Virol.,80(Pt 7):1735-1742,1999.
Zhou等人,Nature,361(6412):543-547,1993.
Zufferey等人,Nat.Biotechnol.,15(9):871-875,1997.

Claims (63)

1.抗体，其选择性结合至通过SEQ ID NO:1定义的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)，其中所述抗体：
(a)是IgG抗体；
(b)抑制癌细胞生长；
(c)诱导癌细胞死亡；
(d)分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含各自与SEQ ID NO:3、4、和5、或6、7和8、或27、28和29、或42、43和44、或45、46和47、或48、49和50、或76、77和78具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域，所述可变轻链包含各自与SEQ ID NO:9、10和11或12、13和14、或30、31和32、或51、52、和53、或54、55和56、或57、58和59、或79、80和81具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域；
(e)分别包含与SEQ ID NO:15、19、23、60、64、68或73具有80％或更高同源性的可变重链和与SEQ ID NO:17、21、25、62、66、70或75具有80％或更高同源性的可变轻链；和/或
(f)分别包含由与SEQ ID NO:16、20、24、61、65、69或72具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链和由与SEQ ID NO:18、22、26、63、67、71或74具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单链抗体。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单结构域抗体。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体是Fab片段。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体是对于MUC1-C/ECD和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体。
7.权利要求1的抗体，其中所述抗体是鼠抗体。
8.权利要求7的抗体，其中所述鼠抗体是IgG。
9.权利要求1的抗体，其中抗体是人源化抗体。
10.权利要求9的抗体，其中所述人源化抗体是IgG。
11.权利要求1的抗体，其中所述抗体进一步包含标记。
12.权利要求11的抗体，其中所述标记是肽标签、酶、磁性颗粒、生色团、荧光分子、化学发光分子或染料。
13.权利要求1的抗体，其中所述抗体进一步包含与之连接的抗肿瘤药物。
14.权利要求13的抗体，其中所述抗肿瘤药物通过光不稳定的接头连接至所述抗体。
15.权利要求13的抗体，其中所述抗肿瘤药物通过酶促切割的接头连接至所述抗体。
16.权利要求13的抗体，其中所述抗肿瘤药物是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
17.权利要求1的抗体，其中所述重链和轻链分别与SEQ ID NO:15、19、23、60、64、68或73和17、21、25、62、66、70或75具有85％、90％、95％或99％同源性。
18.权利要求1的抗体，其中所述重链和轻链由分别与SEQ ID NO:14、18、24、61、65、69或72和18、22、26、63、67、71或74具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。
19.权利要求1的抗体，其中所述抗体缀合至纳米颗粒或脂质体。
20.权利要求1的抗体，其中细胞死亡的诱导包含抗体依赖的细胞细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
21.治疗癌症的方法，其包括使受试者中的MUC1-阳性癌细胞与权利要求1的抗体接触。
22.权利要求21的方法，其中所述MUC1-阳性癌细胞是实体瘤细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述实体瘤细胞是肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、子宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食道癌细胞。
24.权利要求21的方法，其中所述MUC1-阳性癌细胞是白血病或骨髓瘤。
25.权利要求24的方法，其中所述白血病或骨髓瘤是急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。
26.权利要求21的方法，其进一步包括使所述MUC1-阳性癌细胞与第二抗癌剂或治疗接触。
27.权利要求26的方法，其中所述第二抗癌剂或治疗选自化疗、放疗、免疫疗法、激素疗法或毒素疗法。
28.权利要求26的方法，其中所述第二抗癌剂或治疗抑制胞内MUC1功能。
29.权利要求26的方法，其中在与所述第一药剂相同的时间给予所述第二抗癌剂或治疗。
30.权利要求26的方法，其中在所述第一药剂之前和/或之后给予所述第二抗癌剂或治疗。
31.权利要求21的方法，其中所述MUC1-阳性癌细胞是转移性癌细胞、多重耐药癌细胞或复发性癌细胞。
32.权利要求21的方法，其中所述抗体是单链抗体。
33.权利要求21的方法，其中所述抗体是单结构域抗体。
34.权利要求21的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。
35.权利要求21的方法，其中所述抗体是Fab片段。
36.权利要求21的方法，其中所述抗体是对于MUC1-C/ECD和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体。
37.权利要求21的方法，其中所述抗体是鼠抗体。
38.权利要求37的方法，其中所述鼠抗体是IgG。
39.权利要求21的方法，其中抗体是人源化抗体。
40.权利要求39的方法，其中所述人源化抗体是IgG。
41.权利要求21的方法，其中所述抗体进一步包含与之连接的抗肿瘤药物。
42.权利要求41的方法，其中所述抗肿瘤药物通过光不稳定的接头连接至所述抗体。
43.权利要求41的方法，其中所述抗肿瘤药物通过酶促切割的接头连接至所述抗体。
44.权利要求41的方法，其中所述抗肿瘤药物是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
45.权利要求21的方法，其中所述抗体进一步包含标记。
46.权利要求45的方法，其中所述标记是肽标签、酶、磁性颗粒、生色团、荧光分子、化学发光分子或染料。
47.权利要求21的方法，其中所述重链和轻链分别与SEQ ID NO:15、19、23、60、64、68或73和17、21、25、62、66、70或75具有85％、90％、95％或99％同源性。
48.权利要求21的方法，其中所述重链和轻链由分别与SEQ ID NO:14、18、24、61、65、69或72和18、22、26、63、67、71或74具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。
49.权利要求21的方法，其中所述抗体缀合至脂质体或纳米颗粒。
50.权利要求21的方法，其中所述抗体导致细胞死亡的诱导，诸如通过抗体依赖的细胞细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
51.融合蛋白质，其包含：
(i)选择性结合至通过SEQ ID NO:1定义的MUC1-C/胞外结构域(ECD)的第一单链抗体，其中所述抗体：
(a)是IgG抗体；
(b)抑制癌细胞生长；
(c)诱导癌细胞死亡；
(d)分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含各自与SEQ ID NO:3、4、和5、或6、7和8、或27、28和29、或42、43和44、或45、46和47、或48、49和50、或76、77和78具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域，所述可变轻链包含各自与SEQ ID NO:9、10和11或12、13和14、或30、31和32、或51、52、和53、或54、55和56、或57、58和59、或79、80和81具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域；
(e)分别包含与SEQ ID NO:15、19、23、60、64、68或73具有80％或更高同源性的可变重链和与SEQ ID NO:17、21、25、62、66、70或75具有80％或更高同源性的可变轻链；和/或
(f)分别包含由与SEQ ID NO:16、20、24、61、65、69或72具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链和由与SEQ ID NO:18、22、26、63、67、71或74具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链；和
(ii)结合至T或B细胞的第二单链抗体。
52.权利要求51的融合蛋白质，其中所述第二单链抗体结合至CD3。
53.权利要求51的融合蛋白质，其中所述第二单链抗体结合至T细胞。
54.权利要求51的融合蛋白质，其中所述第二单链抗体结合至B细胞。
55.权利要求51的融合蛋白质，其中所述融合蛋白质进一步包含标记或治疗性部分。
56.嵌合抗原受体，其包含：
(i)包含单链抗体可变区的胞外结构域，所述单链抗体可变区选择性结合至通过SEQID NO:1定义的MUC1-C/胞外结构域(MUC1-C/ECD)，其中所述抗体：
(a)是IgG抗体；
(b)抑制癌细胞生长；
(c)诱导癌细胞死亡；
(d)分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含各自与SEQ ID NO:3、4、和5、或6、7和8、或27、28和29、或42、43和44、或45、46和47、或48、49和50、或76、77和78具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域，所述可变轻链包含各自与SEQ ID NO:9、10和11或12、13和14、或30、31和32、或51、52、和53、或54、55和56、或57、58和59、或79、80和81具有90％或更高同源性的CDR1、CDR2和CDR3区域；
(e)分别包含与SEQ ID NO:15、19、23、60、64、68或73具有80％或更高同源性的可变重链和与SEQ ID NO:17、21、25、62、66、70或75具有80％或更高同源性的可变轻链；和/或
(f)分别包含由与SEQ ID NO:16、20、24、61、65、69或72具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链和由与SEQ ID NO:18、22、26、63、67、71或74具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链；和
具有在所述单链抗体可变区的C末端处附接的柔性铰链；
(ii)跨膜结构域；和
(iii)胞内结构域，
其中当所述单链抗体可变区与MUC1接合时，所述胞内结构域包含信号转导功能。
57.权利要求56的受体，其中所述跨膜和胞内结构域源自相同分子。
58.权利要求56的受体，其中所述胞内结构域包含CD3-ζ结构域或高亲和力FcεRI。
59.权利要求56的受体，其中所述柔性铰链来自CD8α或Ig。
60.表达权利要求56的嵌合抗原受体的细胞。
61.权利要求60的细胞，其中所述跨膜和胞内结构域源自相同分子。
62.权利要求60的细胞，其中所述胞内结构域包含CD3-ζ结构域或高亲和力FcεRI。
63.权利要求60的细胞，其中所述柔性铰链来自CD8α或Ig。
CN201580011813.3A 2014-01-29 2015-01-29 针对muc1-c/胞外结构域(muc1-c/ecd)的抗体 Active CN106132992B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461933001P 2014-01-29 2014-01-29
US61/933,001 2014-01-29
PCT/US2015/013410 WO2015116753A1 (en) 2014-01-29 2015-01-29 Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106132992A true CN106132992A (zh) 2016-11-16
CN106132992B CN106132992B (zh) 2020-08-07

Family

ID=52463213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580011813.3A Active CN106132992B (zh) 2014-01-29 2015-01-29 针对muc1-c/胞外结构域(muc1-c/ecd)的抗体

Country Status (11)

Country Link
US (3) US10059775B2 (zh)
EP (1) EP3099719B1 (zh)
JP (2) JP6908381B2 (zh)
KR (1) KR102448454B1 (zh)
CN (1) CN106132992B (zh)
AU (1) AU2015211034B2 (zh)
CA (1) CA2938111C (zh)
ES (1) ES2794088T3 (zh)
IL (1) IL246997A0 (zh)
MX (1) MX2016009954A (zh)
WO (1) WO2015116753A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109336980A (zh) * 2017-07-27 2019-02-15 上海细胞治疗研究院 一种靶向Muc1的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102448454B1 (ko) * 2014-01-29 2022-09-28 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. Muc1-c/세포외 도메인 (muc1-c/ecd)에 대한 항체
ES2924393T3 (es) * 2014-04-16 2022-10-06 Inst Nat Sante Rech Med Anticuerpos para la prevención o el tratamiento de episodios hemorrágicos
WO2016130726A1 (en) 2015-02-10 2016-08-18 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-muc1* antibodies
JP6996728B2 (ja) * 2016-01-07 2022-01-17 学校法人自治医科大学 グルコーストランスポーター１発現用アデノ随伴ウイルスベクター
GB201610902D0 (en) * 2016-06-22 2016-08-03 Bergen Teknologioverforing As And Bergenbio As Anti-Axl Antagonistic Antibodies
US20190328784A1 (en) * 2016-07-15 2019-10-31 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors (cars) specific for muc1 and methods for their use
JOP20170154B1 (ar) * 2016-08-01 2023-03-28 Omeros Corp تركيبات وطرق لتثبيط masp-3 لعلاج أمراض واضطرابات مختلفة
US10617773B2 (en) 2016-08-05 2020-04-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against the MUC1-C/extracellular domain (MUC1-C/ECD)
US20190290692A1 (en) * 2016-10-11 2019-09-26 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-muc1* antibodies and use of cleavage enzyme
EP3538141A4 (en) * 2016-11-10 2020-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. ILT3 LIGAND
WO2018174544A2 (ko) * 2017-03-21 2018-09-27 주식회사 펩트론 Muc1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
CA3056582C (en) * 2017-03-21 2022-05-31 Peptron, Inc. Antibody binding specifically to muc1 and use thereof
KR20200029469A (ko) * 2017-07-18 2020-03-18 쿄와 기린 가부시키가이샤 항인간 ccr1 모노클로날 항체
GB201806333D0 (en) * 2018-04-18 2018-05-30 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Parvovirus vector production
PL3794041T3 (pl) 2018-05-18 2023-08-28 Glycotope Gmbh Przeciwciało anty-muc1
JP2022538778A (ja) * 2019-06-14 2022-09-06 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド Ｍｕｃ１に対する抗体およびその使用方法
JP2023534959A (ja) * 2020-07-16 2023-08-15 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド Ｍｕｃ１－ｃ／細胞外ドメイン（ｍｕｃ１－ｃ／ｅｃｄ）に対する抗体
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
WO2022150803A1 (en) * 2021-01-05 2022-07-14 Musc Foundation For Research Development AN AGR2Xcd3 BISPECIFIC ENGAGER FOR THE TREATMENT OF CANCER
EP4298129A1 (en) * 2021-02-26 2024-01-03 Teneobio, Inc. Anti-muc1-c antibodies and car-t structures
KR20240021828A (ko) * 2021-05-28 2024-02-19 자이온 테라퓨틱스 인코포레이티드 Muc1-c/세포외 도메인(muc1-c/ecd)에 대한 다중-특이적 항체 작제물
WO2023240135A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Actinium Pharmaceuticals, Inc. Bifunctional chelators and conjugates
WO2024159087A1 (en) * 2023-01-26 2024-08-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Developing a car-engager platform to enhance the functionality and/or persistence of car t cells
US20240261406A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Minerva Biotechnologies Corporation Chimeric antigen receptor compositions and methods for treating muc1* diseases

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004005470A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Immunogen, Inc. Antibodies to non-shed muc1 and muc16, and uses thereof
US20050042209A1 (en) * 2000-09-11 2005-02-24 KUFE Donald W. MUC1 extracellular domain and cancer treatment compositions and methods derived therefrom

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4957939A (en) 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
NL8200523A (nl) 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
IL82104A0 (en) 1986-04-08 1987-10-30 Usa Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus genes and method for producing htlb-iii envelope proteins
EP0273085A1 (en) 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
US5164313A (en) 1987-06-05 1992-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus encoding cytochromes P-450
US5563250A (en) 1987-12-02 1996-10-08 Neorx Corporation Cleavable conjugates for the delivery and release of agents in native form
US5141648A (en) 1987-12-02 1992-08-25 Neorx Corporation Methods for isolating compounds using cleavable linker bound matrices
US4952500A (en) 1988-02-01 1990-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
EP0432216A1 (en) 1988-09-01 1991-06-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
AU7766391A (en) * 1990-04-23 1991-11-11 Corvas International N.V. Thrombus-specific antibody derivatives
JPH049249A (ja) 1990-04-27 1992-01-14 Kusuda:Kk 塗型剤吹き付け機
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
WO1992017598A1 (en) 1991-03-29 1992-10-15 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Production fo transgenic soybean plants
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
AU670316B2 (en) 1992-07-27 1996-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of (agrobacterium)-mediated transformation of cultured soybean cells
US5879934A (en) 1992-07-31 1999-03-09 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains for gene transfer
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
TW442569B (en) 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
AU3258295A (en) 1994-09-08 1996-03-27 Boehringer Mannheim Gmbh Retroviral vector hybrids and the use thereof for gene transfer
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5707618A (en) 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
US5830725A (en) 1995-04-28 1998-11-03 The Board Of Trustees For The Leland Stanford Junior University Rapid, stable high-titre production of recombing retrovirus
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5851826A (en) 1995-07-26 1998-12-22 Children's Medical Center Corporation Helper virus-free herpesvirus vector packaging system
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
US5739018A (en) 1996-08-07 1998-04-14 The Regents Of The University Of California Packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors
US5871983A (en) 1996-09-13 1999-02-16 Eli Lilly And Company Glucosyltransferase gene GTFE from amycolatopsis orientalis
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
EP2322929B1 (en) 2000-11-27 2016-04-06 Minerva Biotechnologies Corporation diagnostics, drug screening and treatment for cancer
US20050019324A1 (en) 2001-03-29 2005-01-27 Wreschner Daniel H. Peptides and antibodies to muc 1 proteins
EP4083072A1 (en) * 2008-10-06 2022-11-02 Minerva Biotechnologies Corporation Muc1* antibodies
CN102245632B (zh) 2008-10-17 2018-10-12 达娜-法勃肿瘤研究所公司 Muc-1胞质结构域肽作为癌症的抑制剂
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione
KR102448454B1 (ko) 2014-01-29 2022-09-28 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. Muc1-c/세포외 도메인 (muc1-c/ecd)에 대한 항체

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050042209A1 (en) * 2000-09-11 2005-02-24 KUFE Donald W. MUC1 extracellular domain and cancer treatment compositions and methods derived therefrom
WO2004005470A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Immunogen, Inc. Antibodies to non-shed muc1 and muc16, and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAN REN等: "Human MUC1 carcinoma-associated protein confers resistance to genotoxic anticancer agents", 《CANCER CELL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109336980A (zh) * 2017-07-27 2019-02-15 上海细胞治疗研究院 一种靶向Muc1的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
CN109336980B (zh) * 2017-07-27 2022-04-12 上海细胞治疗研究院 一种靶向Muc1的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
ES2794088T3 (es) 2020-11-17
CA2938111C (en) 2024-02-06
IL246997A0 (en) 2016-09-29
AU2015211034B2 (en) 2020-04-09
MX2016009954A (es) 2017-02-23
AU2015211034A1 (en) 2016-08-11
JP2017505625A (ja) 2017-02-23
CA2938111A1 (en) 2015-08-06
JP2021100942A (ja) 2021-07-08
KR20160132012A (ko) 2016-11-16
CN106132992B (zh) 2020-08-07
EP3099719B1 (en) 2020-04-01
JP7117410B2 (ja) 2022-08-12
US10059775B2 (en) 2018-08-28
US20180312605A1 (en) 2018-11-01
US20160340442A1 (en) 2016-11-24
JP6908381B2 (ja) 2021-07-28
WO2015116753A1 (en) 2015-08-06
US20220049014A1 (en) 2022-02-17
KR102448454B1 (ko) 2022-09-28
EP3099719A1 (en) 2016-12-07
US11136410B2 (en) 2021-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220049014A1 (en) Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)
JP2017505625A5 (zh)
JP4854912B2 (ja) 癌に対する抗体
JP7448299B2 (ja) Ｂａｆｆ－ｒ抗体及びその使用
JP7169298B2 (ja) ヒトアルファフェトタンパク質特異的ｔ細胞受容体およびその使用
CN105407922A (zh) 涉及癌症干细胞的癌症的诊断与治疗
UA118950C2 (uk) Поліпептид, який зв'язує специфічний мембранний антиген простати та комплекс т-клітинного рецептора
CN107098970A (zh) 结合细胞内prl‑1多肽或prl‑3多肽的抗体
CN110520156A (zh) 针对外源抗原和/或自身抗原的免疫调控方法
US20180036441A1 (en) Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)
CN112805036A (zh) 通过施用抗体-药物缀合物对转移性脑肿瘤的治疗
IL257763A (en) Genetically engineered cells that are resistant to drugs and methods of use
US20230265208A1 (en) Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)
CN103037896B (zh) 癌胚抗原的n‑结构域及其组合物、方法和用途
JP2023545394A (ja) 抗ｐｄ－ｌ１抗体およびその用途
US20240262930A1 (en) Multi-specific antibody constructs against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ed)
CN107106669A (zh) 用于治疗过度表达HIF‑1α的癌症的组合物和方法
CN116333143A (zh) Scube2中和抗体及其医药用途
BR112020010336A2 (pt) composições e métodos para terapia de câncer

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant