BR112020010336A2 - composições e métodos para terapia de câncer - Google Patents

composições e métodos para terapia de câncer Download PDF

Info

Publication number
BR112020010336A2
BR112020010336A2 BR112020010336-5A BR112020010336A BR112020010336A2 BR 112020010336 A2 BR112020010336 A2 BR 112020010336A2 BR 112020010336 A BR112020010336 A BR 112020010336A BR 112020010336 A2 BR112020010336 A2 BR 112020010336A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
lrp10
seq
antibody
cdr3
cdr2
Prior art date
Application number
BR112020010336-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Bruce Beutler
Evan Nair-Gill
Xue Zhong
Jinglei Zhang
Pingping Wang
Original Assignee
Board Of Regents Of The University Of Texas System
Exphenom, Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Board Of Regents Of The University Of Texas System, Exphenom, Llc filed Critical Board Of Regents Of The University Of Texas System
Publication of BR112020010336A2 publication Critical patent/BR112020010336A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

A presente divulgação refere-se de forma geral a composições e métodos para imunoterapia de câncer, bem como para recuperação hematopoiética após o tratamento de câncer tal como quimioterapia ou irradiação.

Description

“COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TERAPIA DE CÂNCER” RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS CORRELATOS
[001] Este Pedido de Patente reivindica prioridade e o benefício do Pedido de Patente U.S. Provisório No. 62/591,874 depositado em 29 de novembro de 2017, cuja divulgação é incorporada aqui como referência em sua totalidade.
CAMPO
[002] A presente divulgação refere-se de forma geral a composições e métodos para imunoterapia de câncer, bem como para recuperação hematopoiética após o tratamento de câncer tal como quimioterapia ou irradiação.
ANTECEDENTES
[003] Apesar das inúmeras abordagens preventivas e terapêuticas, o câncer é uma das causas principais de morte no mundo todo. Entre 2010 e 2020, espera-se que o número de novos casos de câncer nos Estados Unidos da América aumente em aproximadamente 24% em homens para mais de 1 milhão de casos por ano e em aproximadamente 21% em mulheres para mais de 900.000 casos por ano. Os tipos de câncer esperados que aumentem mais são melanoma tanto em homens quanto em mulheres; cânceres de próstata, renais, hepáticos e de bexiga em homens; e cânceres de pulmão, mama, uterinos e de tireoide em mulheres. O câncer continua sendo a segunda causa mais comum de morte nos EUA, responsável por quase 1 de cada 4 mortes. Muitos cânceres são difíceis ou impossíveis de tratar com as abordagens atuais. Muitos cânceres escapam dos regimes de tratamento atuais, ficam resistentes ao tratamento ou ocorrem novamente após o tratamento.
Por exemplo, a quimioterapia citotóxica, uma das opções de tratamento sistêmico mais comuns para câncer, tem eficácia limitada, especialmente no tratamento de tumores sólidos.
[004] A recuperação hematopoiética é um dos fatores importantes que afetam o resultado da quimioterapia. A recuperação mais rápida da medula óssea leva a menos consequências adversas e possibilita que os pacientes continuem nos cursos adicionais de quimioterapia sem atraso. Uma recuperação atrasada da medula óssea pode levar a uma infecção descontrolada que resulta na falha do tratamento. A toxicidade hematopoiética da quimioterapia é um fator importante na determinação das doses para regimes de tratamento. Fármacos tais como NEULASTA® e NEUPOGEN® (G-CSF) são atualmente utilizados para ajudar na recuperação hematopoiética após a quimioterapia. Entretanto, estes fármacos são amplificadores de neutrófilos. Atualmente não há um fármaco que promova a recuperação linfoide. Dessa maneira, existe uma necessidade de métodos e composições eficientes para promover a recuperação hematopoiética, preferencialmente todas as linhagens hematopoiéticas incluindo células linfoides, após a quimioterapia.
SUMÁRIO
[005] São fornecidos aqui composições e métodos para imunoterapia de câncer, bem como para recuperação hematopoiética após o tratamento de câncer tal como quimioterapia.
[006] Em um aspecto, é fornecido um método de fornecimento de imunoterapia de câncer, que compreende a inibição de LRP10 em um indivíduo que necessita do mesmo. Em algumas modalidades, a dita inibição aumenta a infiltração no tumor de linfócitos, preferencialmente células T CD8+ e linfócitos T citotóxicos, fornecendo assim imunoterapia de câncer.
[007] Outro aspecto refere-se a um método de aumento da recuperação hematopoiética, que compreende a inibição de LRP10 em um indivíduo que necessita do mesmo. Em várias modalidades, a dita inibição aumenta a recuperação de todas as linhagens hematopoiéticas, preferencialmente linhagens linfoides. Em algumas modalidades, o indivíduo recebeu quimioterapia e/ou radioterapia.
[008] Em várias modalidades, os métodos e o uso divulgados aqui podem incluir a administração ao indivíduo de uma quantidade eficiente de anticorpo anti-LRP10 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um receptor solúvel para um ou mais ligantes de LRP10 (por exemplo, uma quimera LRP10-Fc).
[009] Outro aspecto refere-se ao uso de um inibidor ou um competidor de LRP10 para a manufatura de um medicamento para imunoterapia de câncer. Em algumas modalidades, o dito inibidor ou competidor de LRP10 aumenta a infiltração no tumor de linfócitos, preferencialmente células T CD8+ e linfócitos T citotóxicos, fornecendo assim imunoterapia de câncer.
[0010] Um aspecto adicional refere-se ao uso de um inibidor ou um competidor de LRP10 para a manufatura de um medicamento para recuperação hematopoiética. Em algumas modalidades, o dito inibidor ou competidor de LRP10 aumenta a recuperação de todas as linhagens hematopoiéticas, preferencialmente linhagens linfoides, em um paciente que recebeu quimioterapia e/ou radioterapia.
[0011] Em certas modalidades, o dito inibidor de LRP10 é anticorpo anti-LRP10 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga preferencialmente ao ectodomínio de LRP10. Em algumas modalidades, o dito competidor de LRP10 é um receptor solúvel engenheirado para um ou mais ligantes de LRP10, em que o dito receptor compete pela ligação com LRP10 endógeno (por exemplo, uma quimera LRP10-Fc).
[0012] Também é divulgado aqui um anticorpo anti-LRP10 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, opcionalmente para uso na imunoterapia de câncer e/ou na recuperação hematopoiética, que compreende uma ou mais das CDRs a seguir: VL CDR1 (SEQ ID NO: 33): RASQSISSYLN VL CDR2 (SEQ ID NO: 62): X1ASX2LQS (X1=N, A, R, D; X2=D, P, R, A, L, T) VL CDR3 (SEQ ID NO: 63): QQX3X4X5X6PX7T (X3=S, V, P, A, I, T, N; X4=S, A, T, D, K; X5=R, S, T, A, Y; X6=T, L, Y, R, G; X7=T, N, L, G) VH CDR1 (SEQ ID NO: 64): SX8AMS (X8=Q, Y) VH CDR2 (SEQ ID NO: 65): X9IX10X11X12GX13X14TX15YADSVKG (X9=S, Q, V; X10=P, G, S, Q, A, Y; X11=P, T, R, S; X12=G, M, T, Q, R, S; X13=P, R, N, T, Q, A; X14=N, P, S, G, A, T; X15=K, T, Y, E) VH CDR3 (SEQ ID NO: 66): X16X17X18X19FDY (X16=S, D, N; X17=Y, G, A, S, R, T; X18=P, K, T, R, H, A; X19=S, K, T)
[0013] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento do mesmo pode incluir uma ou mais das CDRs a seguir: VL CDR1 (SEQ ID NO: 33): RASQSISSYLN VL CDR2 (SEQ ID NO: 34): NASDLQS VL CDR2 (SEQ ID NO: 35): AASPLQS VL CDR2 (SEQ ID NO: 36): RASRLQS VL CDR2 (SEQ ID NO: 37): AASALQS VL CDR2 (SEQ ID NO: 38): DASLLQS VL CDR2 (SEQ ID NO: 39): AASTLQS VL CDR3 (SEQ ID NO: 40): QQSSRTPTT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 41): QQVARTPNT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 42): QQPTSLPLT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 43): QQADSYPTT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 44): QQIKTRPTT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 45): QQTSAGPGT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 46): QQNDYYPTT
VH CDR1 (SEQ ID NO: 47): SQAMS
VH CDR1 (SEQ ID NO: 48): SYAMS
VH CDR2 (SEQ ID NO: 49): QIGTMGRPTTYADSVKG
VH CDR2 (SEQ ID NO: 50): SISTTGNSTYYADSVKG
VH CDR2 (SEQ ID NO: 51): VIQRQGTGTEYADSVKG
VH CDR2 (SEQ ID NO: 52): SIPSRGQATKYADSVKG
VH CDR2 (SEQ ID NO: 53): SIATTGNTTYYADSVKG
VH CDR2 (SEQ ID NO: 54): SIPPGGPNTKYADSVKG
VH CDR2 (SEQ ID NO: 55): SIYTSGAATTYADSVKG
VH CDR3 (SEQ ID NO: 56): SYPSFDY
VH CDR3 (SEQ ID NO: 57): SGKKFDY
VH CDR3 (SEQ ID NO: 58): DATSFDY
VH CDR3 (SEQ ID NO: 59): NSRTFDY
VH CDR3 (SEQ ID NO: 60): SRHTFDY VH CDR3 (SEQ ID NO: 61): NTATFDY
[0014] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento do mesmo pode ter uma sequência de VL selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 1, 5, 7, 11, 15, 19 e 23 e uma sequência de VH selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 2, 8, 12, 16, 20, 24, 27 e 29.
[0015] Um aspecto adicional refere-se a um receptor solúvel para um ou mais ligantes de LRP10, em que o dito receptor solúvel compete com o LRP10 endógeno pela ligação com o um ou mais ligantes de LRP10. Em algumas modalidades, o receptor solúvel é uma quimera LRP10-Fc.
[0016] Em algumas modalidades, em um ensaio de migração, uma célula (por exemplo, célula tronco hematopoiética ou célula T) colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo ou o receptor solúvel para um ou mais ligantes de LRP10 (por exemplo, uma quimera LRP10-Fc) migra em direção a um estímulo quimiotático mais rapidamente do que uma célula de controle que não é colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo ou o receptor solúvel, em que preferencialmente o estímulo quimiotático é selecionado de quimiocina 12 do motivo C-X-C (CXCL12), quimiocina 10 do motivo C- X-C (CXCL10), esfingosina-1-fosfato (S1P), ligante 2 do motivo C-C (CCL2) e/ou ligante 21 do motivo C-C (CCL21).
[0017] Em certas modalidades, uma célula (por exemplo, célula tronco hematopoiética ou célula T) colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo ou o receptor solúvel para um ou mais ligantes de LRP10 (por exemplo, uma quimera LRP10-Fc) exibe maior expressão de Frizzled e/ou P21 comparada com uma célula de controle que não é colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo ou o receptor solúvel.
[0018] Também é fornecida aqui uma composição farmacêutica para imunoterapia de câncer e/ou recuperação hematopoiética, que compreende o anticorpo ou o fragmento do mesmo e/ou o receptor solúvel para um ou mais ligantes de LRP10 (por exemplo, uma quimera LRP10-Fc) divulgado aqui e um carreador farmaceuticamente aceitável. O uso do anticorpo ou do fragmento do mesmo e/ou do receptor solúvel para um ou mais ligantes de LRP10 (por exemplo, uma quimera LRP10- Fc) divulgado aqui, para a manufatura de um medicamento para imunoterapia de câncer e/ou recuperação hematopoiética, também é fornecido.
[0019] Também é fornecido um método para identificação de um inibidor de LRP10, que compreende o contato de uma célula (por exemplo, célula tronco hematopoiética ou célula T) com um agente de teste, em que um aumento na migração em direção a um estímulo quimiotático comparada com a de uma célula de controle que não é colocada em contato com o agente de teste indica que o agente de teste é um inibidor de LRP10, em que preferencialmente o estímulo quimiotático é selecionado de quimiocina 12 do motivo C-X-C (CXCL12), quimiocina 10 do motivo C-X-C (CXCL10), esfingosina-1-fosfato (S1P), ligante 2 do motivo C-C (CCL2) e/ou ligante 21 do motivo C-C (CCL21). Em algumas modalidades, o agente de teste é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um receptor solúvel para um ou mais ligantes de LRP10 (por exemplo, uma quimera LRP10- Fc).
[0020] Também é fornecido outro método para identificação de um inibidor de LRP10, que inclui o contato de uma célula (por exemplo, célula tronco hematopoiética ou célula T) com um agente de teste, em que um aumento na expressão de p21 comparada com uma célula de controle que não é colocada em contato com o agente de teste indica que o agente de teste é um inibidor de LRP10. Em algumas modalidades, o agente de teste é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um receptor solúvel para um ou mais ligantes de
LRP10 (por exemplo, uma quimera LRP10-Fc).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0021] A FIG. 1 é um esquema que mostra o transplante de células da medula óssea de camundongos C57BL/6 (CD45.1), camundongos CRISPR-Lrp10 KO (CD45.2) ou uma mistura 1:1 para camundongos receptores Rag2-/- irradiados.
[0022] A FIG. 2 mostra os resultados da citometria de fluxo das células T, células CD4+, células CD8+, células B e células NK no sangue periférico de quimeras doadoras (mistura 1:1 de CD45.1 e CD45.2) em camundongos Rag2-/- irradiados após o transplante.
[0023] A FIG. 3 mostra a porcentagem de populações de linfócitos diferentes (células T, células CD4+, células CD8+, células B e células NK) no sangue periférico de quimeras doadoras (mistura 1:1 de CD45.1 e CD45.2) em camundongos Rag2-/- irradiados após o transplante, sugerindo que homozigotos chowmein exibem um aumento no potencial competitivo de células tronco hematopoiéticas.
[0024] A FIG. 4 mostra a porcentagem de populações mieloides diferentes (células de macrófagos e neutrófilos) no sangue periférico de quimeras doadoras (mistura 1:1 de CD45.1 e CD45.2) em camundongos Rag2-/- irradiados após o transplante, sugerindo que homozigotos chowmein exibem um aumento no potencial competitivo de células tronco hematopoiéticas.
[0025] A FIG. 5 mostra que linfócitos T periféricos Lrp10-/- (círculos claros) migram a uma velocidade maior do que Lrp10+/+ (círculos escuros) em um ensaio de quimiotaxia.
[0026] A FIG. 6 mostra a expressão significativamente maior de Frizzled e P21 em células T Lrp10-/ e progenitores hematopoiéticos do que em células Lrp10+/+.
[0027] A FIG. 7 mostra que homozigotos Lrp10-/- exibiram maior proporção de células T CD4 e CD8.
[0028] A FIG. 8 mostra que o crescimento do melanoma é retardado ou interrompido em camundongos que não têm Lrp10.
[0029] A FIG. 9 mostra que homozigotos Lrp10-/- desafiados com células B16 de melanoma exibiram maior quantidade de células T CD8+ ativas no sangue.
[0030] A FIG. 10 mostra a expressão e a purificação de 9 anticorpos.
[0031] A FIG. 11 mostra resultados de ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima) da ligação do anticorpo a LRP10.
[0032] A FIG. 12 mostra que o anticorpo monoclonal anti-Lrp10 humano pode ativar p21 em células T de camundongo.
[0033] A FIG. 13 mostra que tanto AB2 quanto AB7 aumentam a migração de células T em resposta a SDF12.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0034] Deverá ser entendido que tanto a descrição geral anterior quanto a descrição detalhada a seguir são apenas exemplos e explicativos e não são restritivos das composições e dos métodos da presente divulgação.
[0035] São divulgados aqui composições e métodos relacionados à inibição de LRP10, ao aumento da recuperação hematopoiética em um indivíduo após a quimioterapia ou a irradiação e/ou ao aprimoramento da imunoterapia de câncer, bem como kits que podem ser utilizados nestes métodos. Um aspecto da presente divulgação refere-se à descoberta surpreendente de que uma mutação em Lrp10 ou um nocaute de Lrp10, causa um fenótipo caracterizado pela maior velocidade de recuperação hematopoiética e no caso de quimeras misturadas, superação das células do tipo selvagem (WT) pelas células mutantes. Dessa maneira, um inibidor de LRP10, tal como um anticorpo, pode ser utilizado para promover a recuperação hematopoiética em um indivíduo, por exemplo, após a quimioterapia ou a irradiação. Em adição, sem desejar ficar limitado à teoria, acredita-se que o bloqueio de LRP10 pode ser equivalente a um bloqueio de ponto de verificação, que permite que as células T CD8+ se infiltrem nos tumores de forma mais eficiente do que fariam de outra maneira. Dessa maneira, a inibição de LRP10 também pode ser utilizada para aumentar o tratamento de imunoterapia de um câncer (por exemplo, através do aumento do número de linfócitos T que se infiltram no tumor).
[0036] LRP10 é um receptor que atravessa uma vez a membrana plasmática, anteriormente com a função desconhecida. Inesperadamente, células T Lrp10 KO migram em direção a um estímulo quimiotático mais rapidamente do que as células WT. Além disso, as células T Lrp10 KO exibem alta expressão de Fizzled e p21, p21 sendo um produto final da via de sinalização não canônica de Wnt. Em algumas modalidades, em um ensaio de migração quimiotática, a expressão de Frizzled e/ou a expressão de p21 pode ser utilizada como um marcador na seleção de inibidores de LRP10.
[0037] Portanto, inibidores de LRP10 tais como os anticorpos e os receptores solúveis divulgados aqui, podem ser utilizados para tratar um indivíduo, através do aumento da recuperação hematopoiética após a quimioterapia ou a irradiação e/ou do aprimoramento da imunoterapia de câncer.
Definições
[0038] Para conveniência, certos termos empregados no Relatório Descritivo, nos exemplos e nas Reivindicações em anexo são reunidos aqui. A não ser que seja definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado que é comumente entendido pelo perito comum na técnica à qual esta divulgação pertence.
[0039] Como utilizado aqui, é pretendido que os termos e as expressões a seguir tenham os seguintes significados:
[0040] Os artigos “um”, “uma”, “o” e “a” são utilizados aqui para se referirem a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Com a finalidade de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.
[0041] Como utilizado aqui, o termo “aproximadamente” significa variações aceitáveis dentro de 20%, mais preferencialmente dentro de 10% e mais preferencialmente dentro de 5% do valor citado.
[0042] “Lrp10” e “LRP10”, também conhecidos como LRP9, LRP-10, MST087 ou MSTP087 são utilizados de forma intercambiável e referem- se à proteína 10 relacionada ao receptor de LDL, com “Lrp10” geralmente se referindo ao gene ou ao mRNA e ao produto proteico “LRP10” a não ser que seja citado o contrário. Deve ser entendido que os termos incluem o gene completo, a sequência de cDNA, a sequência de aminoácidos completa ou qualquer fragmento ou variante dos mesmos. Em algumas modalidades, o LRP10 é o LRP10 humano.
[0043] Como utilizado aqui, é pretendido que o termo “inibidor de LRP10” inclua agentes terapêuticos que inibem, modulam para menos, suprimem ou regulam para menos a atividade de LRP10. É pretendido que o termo inclua compostos químicos, tais como inibidores de moléculas pequenas e agentes biológicos (por exemplo, anticorpos), RNA interferente (shRNA, siRNA), antagonistas solúveis, ferramentas de edição/silenciamento de gentes (CRISPR/Cas9, TALENs) e similares.
[0044] Um “anticorpo anti-LRP10” é um anticorpo que se liga de forma imunoespecífica ao LRP10 (por exemplo, seu domínio extracelular). O anticorpo pode ser um anticorpo isolado. Tal ligação ao LRP10 exibe uma Kd com um valor de, por exemplo, não mais que 1 µM, não mais que 100 nM ou não mais que 50 nM. A Kd pode er medida através de quaisquer métodos conhecidos por um perito na técnica, tal como um ensaio de ressonância de plasmon de superfície ou um ensaio de ligação celular. Um anticorpo anti-LRP10 pode ser um anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo. Exemplos de anticorpos anti-LRP10 podem inibir a ligação ao LRP10 com seu(s) ligante(s) (por exemplo, um ligante endógeno).
[0045] Um “anticorpo”, como utilizado aqui é uma proteína que consiste de um ou mais polipeptídeos que compreendem domínios de ligação que se ligam a um epítopo alvo. O termo anticorpo inclui anticorpos monoclonais que compreendem moléculas das cadeias pesada e leve da imunoglobulina, anticorpos de domínio variável de cadeia pesada única e variantes e derivados dos mesmos, incluindo variantes quiméricas de anticorpos monoclonais e de domínio variável de cadeia pesada única. Os domínios de ligação são substancialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina, em que a proteína se liga de forma imunoespecífica a um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes das regiões constantes kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e um, bem como uma grande quantidade de genes de região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Para a maioria dos organismos vertebrados, incluindo seres humanos e espécies de camundongos, a unidade estrutural típica da imunoglobulina compreende um tetrâmero que é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia “leve” (aproximadamente 25 kD) e uma cadeia “pesada” (aproximadamente 50-70 kD). “VL” e VH″ referem-se aos domínios variáveis destas cadeias leve e pesada respectivamente. “CL” e CH″ referem-se aos domínios constantes das cadeias leve e pesada. Alças de filamentos β, três cada nos VL e VH são responsáveis pela ligação ao antígeno e são referidas como as “regiões de determinação de complementaridade” ou “CDRs”. A região “Fab” (fragmento, ligação ao antígeno) inclui um domínio constante e uma variável de cada uma das cadeias pesada e leve do anticorpo, isto é, VL, CL, VH e CH1.
[0046] Os anticorpos incluem imunoglobulinas intactas bem como fragmentos de ligação ao antígeno das mesmas. O termo “fragmento de ligação ao antígeno” refere-se a um fragmento polipeptídico de um anticorpo que se liga ao antígeno ou compete com o anticorpo intacto (isto é, com o anticorpo intacto do qual foi derivado) pela ligação ao antígeno (isto é, ligação específica). Os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser produzidos através de métodos recombinantes ou bioquímicos que são bem conhecidos na técnica. Exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem Fv, Fab, Fab', (Fab')2, CDR, paratope e anticorpos Fv de cadeia única (scFv) nos quais uma cadeia VH e uma VL são unidas (diretamente ou através de um ligante peptídico) para formar um polipeptídeo contínuo.
[0047] Outra classe de anticorpos conhecidos como anticorpos de cadeia pesada (HCA, também referidos como duas cadeias ou anticorpos de cadeia pesada de duas cadeias) foi relatada em camelídeos tais como tais como dromedário, camelos, camelos bactrianos, camelos bactrianos selvagens, lhamas, alpacas, vicunhas e guanacos (Hamers-Casterman et al., Nature, 363, 446-448 (1993); Wesolowski et al., Med. Microbiol. Immunol (2009) 198:157-174; ver também Pat. U.S. No. 5.759.808; Pat. U.S. No. 5.800.988; Pat. U.S. No.
5.840.526; e Pat. U.S. No. 5.874.541). Comparados com as imunoglobulinas de quatro cadeias convencionais do tipo IgG, que também são produzidas por camelídeos, estes anticorpos não têm as cadeias leves e os domínios CH1 de imunoglobulinas convencionais e seus domínios variáveis são algumas vezes denominados “VHH”. VHH pode incluir quatro regiões framework ou “FR”, FR1, FR2, FR3 e FR4. As regiões framework são interrompidas por três CDRs, CDR1, CDR2 e CDR3. Uma das características evidentes destes que ocorrem naturalmente anticorpos de cadeia pesada é a presença predominante de Glu, Arg e Gly nas posições de interface VL 44, 45 e 47 (numeração de Kabat), respectivamente, de seus VHH. As mesmas posições no VH de anticorpos de quatro cadeias convencionais (são quase exclusivamente ocupadas por Gly, Leu e Trp. Acredita-se que estas diferenças sejam responsáveis pela alta solubilidade e estabilidade do domínio variável de
HCA de camelídeo (VHH), quando comparadas com a insolubilidade relativa do domínio VH dos anticorpos de quatro cadeias convencionais. Duas características mais evidentes dos domínios VHH de camelídeo são sua CDR3 comparativamente mais longa e alta incidência de pares de cisteína nas CDRs. Parece que os pares de cisteína medeiam a formação de uma ponte dissulfeto e, portanto, estão envolvidos na modulação da topologia de superfície do sítio de combinação do anticorpo. Na estrutura de cristal de um complexo de sdAb-lisozima de camelo, uma alça rígida que se projeta do sdAb e é parcialmente estabilizada por uma ligação dissulfeto da CDR se estende para fora do sítio de combinação e penetra profundamente no sítio ativo da lisozima (Desmyter et al., Nature Struct. Biol., 3, 803-811 (1996)).
[0048] Os anticorpos também incluem variantes, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. O termo “variante de anticorpo” como utilizado aqui refere-se a um anticorpo com uma única mutação ou várias nas cadeias pesadas e/ou nas cadeias leves. Em algumas modalidades, as mutações ocorrem na região variável. Em algumas modalidades, as mutações ocorrem na região constante. “Anticorpos quiméricos” refere-se àqueles anticorpos em que uma parte de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve é homóloga às das sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe particular, enquanto que o segmento remanescente das cadeias é homólogo ao das sequências correspondentes em outro. Tipicamente, nestes anticorpos quiméricos, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada imita as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamífero, enquanto que as partes constantes são homólogas às sequências nos anticorpos derivados de outra. Uma vantagem evidente para estas formas quiméricas é que, por exemplo, as regiões variáveis podem ser convenientemente derivadas das fontes conhecidas atualmente utilizado hibridomas ou células B de organismos não humanos disponíveis facilmente em combinação com regiões constantes derivadas, por exemplo, de preparações de células humanas. Embora a região variável tenha a vantagem de facilidade de preparação e a especificidade não seja afetada por sua fonte, é menos provável que a região constante, que é humana, induza uma resposta imunológica de um indivíduo humano quando os anticorpos são injetados do que iria a região constante de uma fonte não humana. Entretanto, a definição não é limitada a este exemplo particular. Anticorpos “humanizados” referem- se a uma molécula que tem um sítio de ligação ao antígeno que é substancialmente derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana e o restante da estrutura da imunoglobulina da molécula baseado na estrutura e/ou na sequência de uma imunoglobulina humana. O sítio de ligação ao antígeno pode compreender domínios variáveis completos fundidos sobre os domínios constantes ou somente as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) enxertadas sobre as regiões framework apropriadas nos domínios variáveis. Os sítios de ligação ao antígeno podem ser do tipo selvagem ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos, por exemplo, modificados para se assemelharem mais à imunoglobulina humana. Algumas formas de anticorpos humanizados preservem todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas as seis CDRs dos anticorpos de camundongo). Outras formas de anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) que são alteradas em relação ao anticorpo original, que também são denominadas uma ou mais CDRs “derivadas de” uma ou mais CDRs.
[0049] Como descrito aqui, os resíduos de aminoácidos de um anticorpo, incluindo VHH, podem ser numerados de acordo com a numeração geral de Kabat (Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD).
[0050] O termo “ligação” como utilizado aqui no contexto de ligação entre um anticorpo, tal como um VHH e um epítopo de LRP10 como um alvo, refere-se ao processo de uma interação não covalente entre as moléculas. Preferencialmente, a dita ligação é específica. A especificidade de um anticorpo pode ser determinada com base na afinidade. Um anticorpo específico pode ter uma afinidade de ligação ou uma constante de dissociação Kd por seu epítopo menor que 10-7 M, preferencialmente menor que 10-8 M.
[0051] O termo “afinidade” refere-se à força de uma reação de ligação entre um domínio de ligação de um anticorpo e um epítopo. É a soma das forças de atração e repulsão que operam entre o domínio de ligação e o epítopo. O termo afinidade, como utilizado aqui, refere-se à constante de dissociação, Kd.
[0052] O termo “antígeno” refere-se a uma molécula ou uma parte de uma molécula capaz de ser ligada por um agente de ligação seletivo, tal como um anticorpo e adicionalmente capaz de ser utilizada em um animal para produzir anticorpos capazes de se ligar a um epítopo daquele antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais epítopos.
[0053] O termo “câncer” se refere de forma ampla a um crescimento anormal descontrolado das células do próprio hospedeiro que leva à invasão do tecido circundante e potencialmente do tecido distal do sítio inicial de crescimento celular anormal no hospedeiro. As classes principais incluem carcinomas que são cânceres do tecido epitelial (por exemplo, pele, células escamosas); sarcomas que são cânceres do tecido conjuntivo (por exemplo, osso, cartilagem, gordura, músculo, vasos sanguíneos etc.); leucemias que são cânceres do tecido que forma o sangue (por exemplo, tecido da medula óssea); linfomas e mielomas que são cânceres de células imunológicas; e cânceres do sistema nervoso central que incluem cânceres do cérebro e do tecido da medula espinhal. “Câncer(es)”, “neoplasma(s)” e “tumor(es)” são utilizados aqui de forma intercambiável. Como utilizado aqui, “câncer” refere-se a todos os tipos de câncer ou neoplasma ou tumores malignos incluindo leucemias, carcinomas e sarcomas, sejam novos ou recorrentes. Exemplos específicos de cânceres são: carcinomas,
sarcomas, mielomas, leucemias, linfomas e tumores do tipo misto. Exemplos não limitantes de cânceres são cânceres novos ou recorrentes do cérebro, melanoma, de bexiga, mama, colo do útero, cólon, cabeça e pescoço, rim, pulmão, pulmão de célula não pequena, mesotelioma, ovário, próstata, sarcoma, estômago, útero e meduloblastoma.
[0054] O termo “aumento celular” ou “aumento da imunoterapia” refere-se de forma ampla ao influxo de células ou à expansão de células em um ambiente que não estão substancialmente presentes no ambiente antes da administração de uma composição e não presentes na própria composição. As células que são aumentadas no ambiente incluem células imunológicas, células de estroma, células bacterianas e fúngicas. Os ambientes de interesse particular são os microambientes nos quais as células cancerosas residem ou se localizam. Em alguns casos, o microambiente é um microambiente de tumor ou um nódulo linfático que drena o tumor. Em outros casos, o microambiente é um sítio de tecido pré-canceroso ou o sítio da administração local de uma composição ou um sítio no qual a composição irá se acumular após a administração remota.
[0055] O termo “epítopo” inclui qualquer determinante, preferencialmente um determinante polipeptídico, capaz de se ligar de forma específica a uma imunoglobulina ou um receptor de célula T. Em certas modalidades, os determinantes de epítopo incluem grupamento de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforila ou sulfonila e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Em certas modalidades, diz-se que um anticorpo se liga de forma específica a um antígeno quando este reconhece preferencialmente seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Os métodos para mapeamento dos epítopos são bem conhecidos na técnica, tais como cocristalografia de raios X, verificação de oligopeptídeos com base em arranjos, mutagênese direcionada ao sítio, mapeamento por mutagênese de alto desempenho e troca de hidrogênio-deutério.
[0056] O sítio no anticorpo que se liga ao epítopo é referido como “parátopo”, que tipicamente inclui resíduos de aminoácidos que estão muito próximos do epítopo uma vez que é ligado. Ver Sela-Culang et al., Front Immunol. 2013; 4: 302.
[0057] “Imunohistoquímica” ou “IHC” refere-se ao processo de detecção de um antígeno nas células de uma seção de tecido que permite a ligação e a detecção subsequente de anticorpos que reconhecem de forma imunoespecífica o antígeno de interesse em um tecido biológico. Para uma revisão da técnica de IHC, ver, por exemplo, Ramos-Vara et al., Veterinary Pathology January 2014 vol. 51 no. 1, 42- 87, incorporado aqui como referência em sua totalidade. Para avaliar os resultados da IHC, foram desenvolvidos sistemas de classificação qualitativos e semi-quantitativos diferentes. Ver, por exemplo, Fedchenko et al., Diagnostic Pathology, 2014; 9: 221, incorporado aqui como referência em sua totalidade. Um exemplo é o H-score, determinado pela adição dos resultados da multiplicação da porcentagem de células com valor ordinal de intensidade de coloração (classificadas partindo de 0 para “nenhum sinal” a 3 para “sinal forte”) com 300 valores possíveis.
[0058] “Imunoespecíficos” ou “imunoespecificamente” (algumas vezes utilizados de forma intercambiável com “especificamente”) referem-se a anticorpos que se ligam através dos domínios substancialmente codificados pelos genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina a um ou mais epítopos de uma proteína de interesse, mas que não reconhecem e se ligam substancialmente a outras moléculas em uma amostra contendo uma população mista de moléculas antigênicas. Tipicamente, um anticorpo se liga imunoespecificamente a um antígeno cognato com uma Kd com um valor de não mais que 50 nM, que é medido através de um ensaio de ressonância de plasmon de superfície ou um ensaio de ligação celular. O uso de tais ensaios é bem conhecido na técnica.
[0059] O termo “resposta imunológica” inclui célula respostas imunológicas mediadas por células T e/ou mediadas por células B. Exemplos de respostas imunológicas incluem respostas de células T, por exemplo, produção de citocinas e citotoxicidade celular. Em adição, o termo resposta imunológica inclui respostas imunológicas que são indiretamente realizadas pela ativação de células T, por exemplo, produção de anticorpos (respostas humorais) e ativação de células que respondem às citocinas, por exemplo, macrófagos.
[0060] “Imunoterapia” é um tratamento que utiliza o sistema imunológico de um indivíduo para tratar câncer e inclui, por exemplo imunoterapia inata, transferência adotiva de linfócitos que se infiltram no tumor (“TIL”), imunoterapia específica ativa (“ASI”), imunoterapia celular adotiva (“ACI”), imunoterapia adoptiva, imunoterapia de antígeno de câncer (“CAI”), imunoterapia de câncer que expressa citocinas, anticorpos monoclonais, vacinas terapêuticas para câncer, imunoterapia com vírus oncolítico, transferência de célula T adotiva, imunoterapia com citocinas, imunoterapia adjuvante.
[0061] O termo “agente imunoterapêutico” pode incluir qualquer molécula, peptídeo, anticorpo ou outro agente que possa estimular o sistema imunológico de um hospedeiro para gerar uma resposta imunológica para um tumor ou câncer no indivíduo. Vários agentes imunoterapêuticos são úteis nas composições e nos métodos descritos aqui.
[0062] Os termos “compete de forma cruzada”, “competição cruzada”, “bloqueio cruzado”, “bloqueado(a) de forma cruzada” e “que bloqueia(m) de forma cruzada” são utilizados aqui de forma intercambiável para significar a capacidade de um anticorpo ou fragmento do mesmo de interferir com a ligação diretamente ou indiretamente através da modulação alostérica dos anticorpos anti- LRP10 da presente divulgação ao LRP10 alvo. A extensão até a qual um anticorpo ou fragmento do mesmo é capaz de interferir com a ligação de outro ao alvo e, portanto, o fato de se poder dizer que bloqueia de forma cruzada ou compete de forma cruzada de acordo com a presente divulgação, pode ser determinada utilizando ensaios de ligação de competição. Um ensaio de competição cruzada quantitativo particularmente adequado utiliza uma abordagem baseada em FACS ou AlphaScreen para medir a competição entre o anticorpo ou um fragmento do mesmo marcado (por exemplo marcado com His, biotinilado ou marcado radioativamente) e o outro anticorpo ou fragmento do mesmo em termos de sua ligação ao alvo. Em geral, um anticorpo ou fragmento do mesmo que compete de forma cruzada é, por exemplo, um que pode se ligar ao alvo no ensaio de competição cruzada de forma que, durante o ensaio e na presença de um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo, o deslocamento registrado do domínio variável único da imunoglobulina ou polipeptídeo de acordo com a divulgação seja de até 100% (por exemplo, no ensaio baseado em FACS) do deslocamento teórico máximo (por exemplo, deslocamento por anticorpo frio (por exemplo, não marcado) ou fragmento do mesmo que precisa ser bloqueado de forma cruzada) pelo anticorpo que potencialmente bloqueia de forma cruzada ou fragmento do mesmo testado que está presente em certa quantidade. Preferencialmente, os anticorpos que competem de forma cruzada ou fragmentos dos mesmos têm um deslocamento registrado que fica entre 10% e 100%, mais preferencialmente entre 50% a 100%.
[0063] Os termos “suprimir”, “supressão”, “inibir”, “inibição”, “neutralizar” e “neutralização” que são utilizados aqui de forma intercambiável, referem-se a qualquer redução estatisticamente significativa na atividade biológica (por exemplo, atividade de LRP10 ou crescimento de célula tumoral), incluindo o bloqueio total da atividade. Por exemplo, “inibição” pode se referir a uma redução de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% da atividade biológica.
[0064] O termo “indivíduo” ou “paciente” inclui um ser humano ou outro animal mamífero que recebe tratamento profilático ou terapêutico.
[0065] Os termos “tratar”, “tratando” e “tratamento”, como utilizados aqui, referem-se a medidas terapêutico ou preventivas tais como as descritas aqui. Os métodos de “tratamento” empregam a administração a um paciente de um inibidor de LRP10 fornecido aqui, por exemplo, um paciente que tem um câncer, com a finalidade de prevenir, curar, retardar, reduzir a gravidade de ou melhorar um ou mais sintomas do câncer ou do câncer recorrente ou para prologar a sobrevivência de um paciente além da esperada na ausência de tal tratamento. Os métodos de “tratamento” também empregam a administração a um paciente de um inibidor de LRP10 fornecido aqui (por exemplo, um anticorpo) para aumentar a recuperação hematopoiética após a quimioterapia ou a irradiação e/ou aprimorar a imunoterapia de câncer em um paciente além da esperada na ausência de tal tratamento.
[0066] O termo “quantidade eficiente”, como utilizado aqui, refere- se àquela quantidade de um agente, tal como um inibidor de LRP10, por exemplo, um anticorpo anti-LRP10, que é suficiente para promover a recuperação hematopoiética em um indivíduo após a quimioterapia ou a irradiação e/ou realizar o tratamento (por exemplo, imunoterapia), prognóstico ou diagnóstico de um câncer, quando administrada a um paciente. Uma quantidade terapeuticamente eficiente variará dependendo do paciente e da condição de doença que serão tratados, do peso e da idade do paciente, da gravidade da condição de doença, do modo de administração e similares, que podem ser facilmente determinados por um perito comum na técnica. As dosagens para administração podem variar de, por exemplo, aproximadamente de 1 ng a aproximadamente 10.000 mg, aproximadamente de 5 ng a aproximadamente 9.500 mg, aproximadamente de 10 ng a aproximadamente 9.000 mg, aproximadamente de 20 ng a aproximadamente 8.500 mg, aproximadamente de 30 ng a aproximadamente 7.500 mg, aproximadamente de 40 ng a aproximadamente de 7.000 mg, aproximadamente de 50 ng a aproximadamente de 6.500 mg, aproximadamente de 100 ng a aproximadamente de 6.000 mg, aproximadamente de 200 ng a aproximadamente de 5.500 mg, aproximadamente de 300 ng a aproximadamente de 5.000 mg, aproximadamente de 400 ng a aproximadamente de 4.500 mg, aproximadamente de 500 ng a aproximadamente de 4.000 mg, aproximadamente de 1 μg a aproximadamente de 3.500 mg, aproximadamente de 5 μg a aproximadamente de 3.000 mg, aproximadamente de 10 μg a aproximadamente de 2.600 mg, aproximadamente de 20 μg a aproximadamente de 2.575 mg, aproximadamente de 30 μg a aproximadamente de 2.550 mg, aproximadamente de 40 μg a aproximadamente de 2.500 mg, aproximadamente de 50 μg a aproximadamente de 2.475 mg, aproximadamente de 100 μg a aproximadamente de 2.450 mg, aproximadamente de 200 μg a aproximadamente de 2.425 mg, aproximadamente de 300 μg a aproximadamente de 2.000, aproximadamente de 400 μg a aproximadamente de 1.175 mg, aproximadamente de 500 μg a aproximadamente de 1.150 mg, aproximadamente de 0,5 mg a aproximadamente de 1.125 mg, aproximadamente de 1 mg a aproximadamente de 1.100 mg, aproximadamente de 1,25 mg a aproximadamente de 1.075 mg, aproximadamente de 1,5 mg a aproximadamente de 1.050 mg, aproximadamente de 2,0 mg a aproximadamente de 1.025 mg, aproximadamente de 2,5 mg a aproximadamente de 1.000 mg, aproximadamente de 3,0 mg a aproximadamente de 975 mg, aproximadamente de 3,5 mg a aproximadamente de 950 mg, aproximadamente de 4,0 mg a aproximadamente de 925 mg, aproximadamente de 4,5 mg a aproximadamente de 900 mg, aproximadamente de 5 mg a aproximadamente de 875 mg, aproximadamente de 10 mg a aproximadamente de 850 mg, aproximadamente de 20 mg a aproximadamente de 825 mg, aproximadamente de 30 mg a aproximadamente de 800 mg, aproximadamente de 40 mg a aproximadamente de 775 mg, aproximadamente de 50 mg a aproximadamente de 750 mg, aproximadamente de 100 mg a aproximadamente de 725 mg, aproximadamente de 200 mg a aproximadamente de 700 mg, aproximadamente de 300 mg a aproximadamente de 675 mg, aproximadamente de 400 mg a aproximadamente de 650 mg, aproximadamente de 500 mg ou aproximadamente de 525 mg a aproximadamente de 625 mg, de um anticorpo ou parte de ligação ao antígeno do mesmo, que é fornecido aqui. A dosagem por ocorrer, por exemplo, toda semana, a cada 2 semanas, a cada três semanas, a cada 4 semanas, a cada 5 semanas ou a cada 6 semanas. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta terapêutica ótima. Uma quantidade eficiente também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais (efeitos colaterais) do agente são minimizados e/ou superados pelos efeitos benéficos. A administração pode ser intravenosa a exatamente ou aproximadamente de 6 mg/kg ou 12 mg/kg por semana ou 12 mg/kg ou 24 mg/kg a cada duas semanas. Regimes de dosagem adicionais são descritos a seguir.
[0067] Outros termos utilizados nos campos da tecnologia de ácidos nucleicos recombinantes, da microbiologia, da imunologia, da engenharia de anticorpos e da biologia molecular e celular que são utilizados aqui serão geralmente entendidos por um perito comum nas técnicas aplicáveis. Por exemplo, técnicas convencionais podem ser utilizadas para a preparação de DNA recombinante, para a realização da síntese de oligonucleotídeos e para a prática da cultura e da transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, transfecção ou lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como são comumente realizadas na técnica ou como são descritas aqui. As técnicas e os procedimentos anteriores podem ser geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e que são descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo de todo o presente Relatório Descritivo. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que é incorporado aqui como referência para qualquer finalidade. A não ser que sejam fornecidas definições específicas, a nomenclatura utilizada em associação aos procedimentos de laboratório e às técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritos aqui é aquela bem conhecida e comumente utilizada na técnica. Técnicas padronizadas podem ser utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e fornecimento de produtos farmacêuticos e tratamento de pacientes.
[0068] Como utilizado aqui o termo “compreendendo” ou “compreende” é utilizado em referência a composições, métodos e seu(s) respectivo(s) componente(s), que estão presentes em certa modalidade, ainda aberta à inclusão de elementos não especificados.
[0069] Como utilizado aqui o termo “consistindo essencialmente de” refere-se aos elementos necessários para certa modalidade. O termo permite a presença de elementos adicionais que não afetam de forma material a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) ou funcional(is) de tal modalidade da divulgação.
[0070] O termo “consistindo de” refere-se a composições, métodos e seus respectivos componentes que são descritos aqui, que são exclusivos de qualquer elemento não citado na descrição da modalidade.
[0071] Como utilizado neste Relatório Descritivo e nas Reivindicações em anexo, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plural a não ser que o contexto determine claramente o contrário. Assim, por exemplo, referências a “o método” incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito aqui e/ou que se tornarão evidentes para os peritos na técnica após a leitura desta divulgação e assim por diante.
[0072] Vários aspectos e modalidades são descritos em mais detalhes nas subseções a seguir.
LRP10
[0073] O receptor de lipoproteína de densidade baixa (LDLR) é um receptor de supefície celular que medeia o metabolismo de lipoproteína no corpo. Nos humanos, o gene do LDLR reside no cromossomo 19 na banda 19p13.2 e é dividido em 18 éxons. Deficiências genéticas do gene do LDLR dão origem à hipercolesterolemia familiar, uma das doenças genéticas mais comuns nos humanos (Goldstein, J. L. et al. The Metabolic Basis of Inherited Disease, sixth ed., McGraw-Hill, New York, 1989, pp. 1215–1250). O gene do LDLR codifica uma única proteína transmembrana que consiste de cinco domínios funcionais: um domínio de ligação ao ligante composto de inúmeras repetições ricas em cisteína; um domínio de homologia do precursor do fator de crescimento epidérmico (EGF) com a sequência Tyr-Trp-Thr-Asp (YWTD) que forma uma estrutura de propulsor β; um domínio de açúcar ligado a O; um domínio transmembrana; e um domínio citoplasmático com um sinal de direcionamento pit revestido (coated pit targeting signal) (H. Tolleshaug, J.L. et al., Cell, 30 (1982), pp. 715–724). Em adição ao LDLR, os receptores a seguir são considerados como fazendo parte da família dos genes de LDLR nos mamíferos: receptor de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDLR); receptor 2 da apolipoproteína E (ApoER2 também conhecido como LRP8); proteína-1 relacionada ao LDLR (LRP1 também conhecido como receptor de CD91 ou de α2macroglobulina, α2MR); LRP2 (também conhecido como megalina ou glicoproteína 330, GP330); LRP3 (se assemelha muito com ST7 e LRP9); LRP4 (também conhecido como corina); LRP5 (também conhecido como LRP7); LRP6 (também conhecido como ADCAD2 ou STHAG7); LRP10 (também conhecido como LRP9, LRP-10, MST087 ou MSTP087) e LR11 (também conhecido como sorLA) (Jeong, Y.H. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Jan
1;391(1):1110-5). A maioria da família dos genes de LDLR é estruturalmente similar ao LDLR, de forma que se acredita que a maioria dos membros desta família desempenhe uma função primária no metabolismo das lipoproteínas. Outras funções para a família dos genes de LDLR são as seguintes: (1) VLDLR e ApoER2 transmitem o sinal de Reelin extracelular para os neurônios migratórios, que controla o assentamento neuronal do cérebro durante o desenvolvimento embrionário do cérebro (Trommsdorff, M. e al., Cell, 97 (1999), pp. 689– 701); (2) LRP1 regula a entrada de vírus e toxinas nas células e protege da aterosclerose através da modulação da sinalização do receptor β do fator de crescimento derivado de plaquetas na parede vascular (Herz, J. et al., Curr. Opin. Lipidol., 15 (2004), pp. 175–181); (3) LRP2 atua como um receptor endocítico que medeia a disponibilidade de várias moléculas de sinalização extracelular tais como vitamina D, vitamina A e esteroides sexuais (Hammes, A. et al., Cell, 122 (2005), pp. 751–762); (4) LRP3 modula a captação celular de β-VLDL; (5) LRP4 serve como uma serina protease transmembrana do tipo II e como uma enzima que converte o peptídeo natriurético pró-atrial que regula a pressão sanguínea (Yan, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (2000), pp. 8525–8529); (6) LRP5 e LRP6 se ligam às proteínas Wnt e Frizzled e ativam a via de sinalização de Wnt envolvida na proliferação celular, na polaridade celular e na determinação do destino celular (Tami, K. et al., Nature, 407 (2000), pp. 530–535) e (7) LR11 pode participar do desenvolvimento da doença de Alzheimer através da modulação da endocitose da proteína precursora amiloide, que gera o peptídeo amiloide β (Herz, J. et al., Curr. Opin. Lipidol., 15 (2004), pp. 175–181).
[0074] O LRP10 é um receptor que atravessa uma vez a membrana plasmática e consiste de cinco domínios funcionais característicos da família dos genes de LDLR. A organização estrutural do LRP10 prevê que o LRP10 pode se ligar a ligantes de forma similar à da família dos genes de LDLR e que provavelmente o LRP10 atua como um receptor endocítico ou um transdutor de sinal (Jeong, Y.H. Biochem Biophys Res
Commun. 2010 Jan 1;391(1):1110-5). Antes da presente divulgação, a função de LRP10 não tinha sido elucidada.
[0075] A sequência gênica completa do LRP10 humano tem 9.968 pb de comprimento (GenBank ID No. NC_000014.9). A proteína de membrana do tipo I madura contém 696 aminoácidos e tem uma massa molecular calculada de 74,8 kD (Sugiyama, T. et al., Biochemistry 39: 15817-15825, 2000). A sequência de cDNA humana do precursor da isoforma 2 da proteína 10 relacionada ao receptor de lipoproteína de densidade baixa tem 4.785 pb de comprimento (GenBank ID No. NM_001329226) e a sequência de cDNA humana do precursor da isoforma 1 da proteína 10 relacionada ao receptor de lipoproteína da densidade baixa tem 6.930 pb de comprimento (GenBank ID No. NM_014045). A sequência gênica completa do gene Lrp10 de camundongo tem 7.334 pb de comprimento (GenBank ID No. NC_000080.6).
[0076] São também fornecidas composições para inibição de LRP10 e assim, para aumento da recuperação hematopoiética em um indivíduo após a quimioterapia ou a irradiação e/ou para aprimorar a imunoterapia de câncer em um indivíduo. A composição pode incluir um ou mais anticorpos anti-LRP10 divulgados aqui ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-LRP10 divulgados aqui podem impedir que um ligante de LRP10 (por exemplo, na circulação) se ligue ao LRP10. Em algumas modalidades, outros inibidores de LRP10 tais como compostos de molécula pequena também podem ser utilizados para inibir uma ou mais atividades do LRP10, que incluem a ligação entre LRP10 e seus ligantes. Em certas modalidades, pode ser engenheirada uma versão solúvel do LRP10 que pode agir competindo com a proteína LRP10 de membrana endógena pela ligação ao ligante de LRP10, dessa maneira inibindo indiretamente a ligação entre o LRP10 endógeno e seu ligante.
Inibidor de LRP10
[0077] A inibição de LRP10 pode aumentar a recuperação hematopoiética em um indivíduo, por exemplo, após a quimioterapia ou a irradiação e/ou fornecer imunoterapia de câncer em um indivíduo. Dessa maneira, os inibidores de LRP10 podem ser utilizados como um agente eficiente na terapia de câncer.
[0078] Vários inibidores de LRP10 são incluídos na presente divulgação. Exemplos incluem compostos químicos, tais como inibidores de molécula pequena e agentes biológicos (por exemplo, anticorpos) que podem se ligar a LRP10 e inibir ou reduzir sua atividade, por exemplo, em um ensaio de migração quimiotática ou ensaio de expressão de Frizzled e/ou p21. Outro exemplo de inibidor de LRP10 é um receptor decoy solúvel que se liga a um ou mais ligantes de LRP10. Também são incluídos os agentes que regulam o nível de expressão gênica de Lrp10, tais como RNA interferente (shRNA, siRNA) e ferramentas de edição/silenciamento gênico (CRISPR/Cas9, TALENs, nucleases de dedo de zinco) que são projetados especificamente para se direcionarem ao gene Lrp10 ou uma sequência reguladora do mesmo.
[0079] Em algumas modalidades, é fornecido um método para identificação de um inibidor de LRP10, que pode incluir o contato de uma célula com um agente de teste, em que um aumento na migração em direção a um estímulo quimiotático comparada com uma célula de controle que não é colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo indica que o agente de teste é um inibidor de LRP10, em que preferencialmente o estímulo quimiotático é selecionado de quimiocina 12 do motivo C-X-C (CXCL12), quimiocina 10 do motivo C-X-C (CXCL10), esfingosina-1-fosfato (S1P), ligante 2 do motivo C-C (CCL2) e/ou ligante 21 do motivo C-C (CCL21).
[0080] Outro método para identificação de um inibidor de LRP10 pode incluir o contato de uma célula com um agente de teste, em que um aumento na expressão de Frizzled e/ou P21 comparada com uma célula de controle que não é colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo indica que o agente de teste é um inibidor de
LRP10.
[0081] O inibidor de LRP10 pode ser caracterizado pela inibição pelo menos parcial da proliferação (por exemplo, em pelo menos 10% em relação ao controle) de células cancerosas ou pela inibição pelo menos parcial do crescimento do tumor (por exemplo, volume e/ou metástase) in vivo no paciente. Sem desejar ficar limitado à teoria, acredita-se que no câncer, um dos problemas principais é uma falha das células T CD8 e seus descendentes, linfócitos T citotóxicos, de se infiltrarem nas massas de tumor com a finalidade de matar as células tumorais. A falha em fazer isso pode depender da sinalização via LRP10. Assim, a inibição funcional de LRP10 utilizando, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao LRP10 pode permitir que esta infiltração ocorra.
[0082] Em certas modalidades, o inibidor de LRP10 é um anticorpo anti-LRP10, por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas modalidades, o anticorpo anti-LRP10 pode ser um anticorpo modificado, por exemplo, quimérico ou humanizado anticorpo derivado de um anticorpo anti-LRP10 de camundongo. Os métodos para produção de anticorpos modificados são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- LRP10 é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um epítopo presente na proteína do LRP10 humano, por exemplo, no ectodomínio extracelular ou uma parte do mesmo.
[0083] Em alguma modalidade, o anticorpo anti-LRP10 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender uma ou mais das seguintes sequências de VL (SEQ ID NOS: 1, 5, 7, 11, 15, 19, 23) e VH (SEQ ID NOS: 2, 8, 12, 16, 20, 24, 27, 29). Observar que para a sequência de anticorpo completa, cada VL pode ser ligado a uma região constante de cadeia leve tal como Ck (SEQ ID NO: 31) para formar uma cadeia leve completa e cada VH pode ser ligado a uma região constante de cadeia pesada tal como CH123 de IgG1 humana
(SEQ ID NO: 32) para formar uma cadeia presada completa.
VL (SEQ ID NO: 1):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNA SDLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSRTPTTFGQGT
KVEIK VL (SEQ ID NO: 5):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAA SPLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVARTPNTFGQGT
KVEIK VL (SEQ ID NO: 7):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPTSLPLTFGQGT
KVEIK VL (SEQ ID NO: 11):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAA SALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADSYPTTFGQGT
KVEIK VL (SEQ ID NO: 15):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIKTRPTTFGQGT
KVEIK VL (SEQ ID NO: 19):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDA SLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSAGPGTFGQGT
KVEIK VL (SEQ ID NO: 23):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAA STLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNDYYPTTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 2):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSQAMSWVRQAPGKGLE WVSSIPPGGPNTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
KSYPSFDYWGQGTLVTVSS VH (SEQ ID NO: 8):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSQIGTMGRPTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
SGKKFDYWGQGTLVTVSS VH (SEQ ID NO: 12):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRLAPGKGLEW VSSISTTGNSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
DATSFDYWGQGTLVTVSS VH (SEQ ID NO: 16):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSVIQRQGTGTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
KNSRTFDYWGQGTLVTVSS VH (SEQ ID NO: 20):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSSIPSRGQATKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
SRHTFDYWGQGTLVTVSS VH (SEQ ID NO: 24):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSSIATTGNTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
NTATFDYWGQGTLVTVSS VH (SEQ ID NO: 27):
MAEVQLLESGGGLVQLGGSLRLSCAASGFTFSSQAMSWVRQAPGKGLE WVSSIPPGGPNTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
KSYPSFDYWGQGTLVTVSS VH (SEQ ID NO: 29):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSSIYTSGAATTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
SYPSFDYWGQGTLVTVSS Sequência de aminoácidos de Ck (SEQ ID NO: 31):
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGEC Sequência de aminoácidos de CH123 da IgG1 (SEQ ID NO: 32):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0084] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LRP10 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender uma ou mais das CDRs a seguir:
VL CDR1 (SEQ ID NO: 33): RASQSISSYLN
VL CDR2 (SEQ ID NO: 34): NASDLQS
VL CDR2 (SEQ ID NO: 35): AASPLQS
VL CDR2 (SEQ ID NO: 36): RASRLQS
VL CDR2 (SEQ ID NO: 37): AASALQS
VL CDR2 (SEQ ID NO: 38): DASLLQS
VL CDR2 (SEQ ID NO: 39): AASTLQS
VL CDR3 (SEQ ID NO: 40): QQSSRTPTT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 41): QQVARTPNT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 42): QQPTSLPLT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 43): QQADSYPTT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 44): QQIKTRPTT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 45): QQTSAGPGT
VL CDR3 (SEQ ID NO: 46): QQNDYYPTT
VH CDR1 (SEQ ID NO: 47): SQAMS
VH CDR1 (SEQ ID NO: 48): SYAMS
VH CDR2 (SEQ ID NO: 49): QIGTMGRPTTYADSVKG
VH CDR2 (SEQ ID NO: 50): SISTTGNSTYYADSVKG VH CDR2 (SEQ ID NO: 51): VIQRQGTGTEYADSVKG VH CDR2 (SEQ ID NO: 52): SIPSRGQATKYADSVKG VH CDR2 (SEQ ID NO: 53): SIATTGNTTYYADSVKG VH CDR2 (SEQ ID NO: 54): SIPPGGPNTKYADSVKG VH CDR2 (SEQ ID NO: 55): SIYTSGAATTYADSVKG VH CDR3 (SEQ ID NO: 56): SYPSFDY VH CDR3 (SEQ ID NO: 57): SGKKFDY VH CDR3 (SEQ ID NO: 58): DATSFDY VH CDR3 (SEQ ID NO: 59): NSRTFDY VH CDR3 (SEQ ID NO: 60): SRHTFDY VH CDR3 (SEQ ID NO: 61): NTATFDY
[0085] Os alinhamentos das sequências de CDR são mostrados nas Tabelas 1-6.
Tabela 1. Alinhamento das sequências de CDR1 do VL Clone No. Posição do aminoácido (numeração de Kabat) L24 L25 L26 L27 L27A L28 L29 L30 L31 L32 L33 L34 AB1: R A S Q - S I S S Y L N L1+H1 AB2: R A S Q - S I S S Y L N L2+H1
AB3: R A S Q - S I S S Y L N L3+H2 AB4: R A S Q - S I S S Y L N L4+H3 AB5: R A S Q - S I S S Y L N L5+H4 AB6: R A S Q - S I S S Y L N L6+H5 AB7: R A S Q - S I S S Y L N L7+H6 AB8: R A S Q - S I S S Y L N L1+H7 AB9: R A S Q - S I S S Y L N L1+H8 Sequência R A S Q - S I S S Y L N conservada
Tabela 2. Alinhamento das sequências de CDR2 do VL
Clone No.
Posição do aminoácido (numeração de Kabat) L50 L51 L52 L53 L54 L55 L56 AB1: L1+H1 N A S D L Q S AB2: L2+H1 A A S P L Q S AB3: L3+H2 R A S R L Q S AB4: L4+H3 A A S A L Q S AB5: L5+H4 R A S R L Q S
AB6: L6+H5 D A S L L Q S AB7: L7+H6 A A S T L Q S AB8: L1+H7 N A S D L Q S AB9: L1+H8 N A S D L Q S Sequência conservada X1 A S X2 L Q S
(X1=N, A, R, D; X2=D, P, R, A, L, T)
Tabela 3. Alinhamento de sequências de CDR3 do VL
Clone No.
Posição do aminoácido (numeração de Kabat) L89 L90 L91 L92 L93 L94 L95 L95A L96 L97 AB1: L1+H1 Q Q S S R T P - T T AB2: L2+H1 Q Q V A R T P - N T AB3: L3+H2 Q Q P T S L P - L T AB4: L4+H3 Q Q A D S Y P - T T AB5: L5+H4 Q Q I K T R P - T T AB6: L6+H5 Q Q T S A G P - G T AB7: L7+H6 Q Q N D Y Y P - T T
AB8: L1+H7 Q Q S S R T P - T T AB9: L1+H8 Q Q S S R T P - T T Sequência conservada Q Q X3 X4 X5 X6 P - X7 T
(X3=S, V, P, A, I, T, N; X4=S, A, T, D, K; X5=R, S, T, A, Y; X6=T, L, Y, R, G; X7=T, N, L, G)
Tabela 4. Alinhamento das sequências de CDR1 do VH
Clone No.
Posição do aminoácido (numeração de Kabat) H31 H32 H33 H34 H35 H35A AB1: L1+H1 S Q A M S - AB2: L2+H1 S Q A M S - AB3: L3+H2 S Y A M S - AB4: L4+H3 S Y A M S - AB5: L5+H4 S Y A M S - AB6: L6+H5 S Y A M S - AB7: L7+H6 S Y A M S - AB8: L1+H7 S Q A M S -
AB9: L1+H8 S Y A M S - Sequência conservada S X8 A M S -
(X8=Q, Y)
Tabela 5. Alinhamento das sequências de CDR2 do VH
Clone No.
Posição do aminoácido (numeração de Kabat) H50 H51 H52 H52AH53H54H55 H56 H57H58 H59H60 H61 H62H63 H64H65 AB1: L1+H1 S I P P G G P N T K Y A D S V K G AB2: L2+H1 S I P P G G P N T K Y A D S V K G AB3: L3+H2 Q I G T M G R P T T Y A D S V K G AB4: L4+H3 S I S T T G N S T Y Y A D S V K G AB5: L5+H4 V I Q R Q G T G T E Y A D S V K G AB6: L6+H5 S I P S R G Q A T K Y A D S V K G AB7: L7+H6 S I A T T G N T T Y Y A D S V K G AB8: L1+H7 S I P P G G P N T K Y A D S V K G AB9: L1+H8 S I Y T S G A A T T Y A D S V K G Sequência conservada X9 I X10 X11 X12 G X13 X14 T X15 Y A D S V K G
(X9=S, Q, V; X10=P, G, S, Q, A, Y; X11=P, T, R, S; X12=G, M, T, Q, R, S;
X13=P, R, N, T, Q, A; X14=N, P, S, G, A, T; X15=K, T, Y, E) Tabela 6. Alinhamento das sequências de CDR3 do VH Clone No. Posição do aminoácido (numeração de Kabat) H95 H96 H97 H98 H99 H100 H100A H101 H102 AB1: L1+H1 S Y P S F - - D Y AB2: L2+H1 S Y P S F - - D Y AB3: L3+H2 S G K K F - - D Y AB4: L4+H3 D A T S F - - D Y AB5: L5+H4 N S R T F - - D Y AB6: L6+H5 S R H T F - - D Y AB7: L7+H6 N T A T F - - D Y AB8: L1+H7 S Y P S F - - D Y AB9: L1+H8 S Y P S F - - D Y Sequência conservada X16 X17 X18 X19 F - - D Y (X16=S, D, N; X17=Y, G, A, S, R, T; X18=P, K, T, R, H, A; X19=S, K, T)
[0086] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LRP10 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender uma ou mais das CDRs a seguir:
VL CDR1 (SEQ ID NO: 33): RASQSISSYLN VL CDR2 (SEQ ID NO: 62): X1ASX2LQS (X1=N, A, R, D; X2=D, P, R, A, L, T) VL CDR3 (SEQ ID NO: 63): QQX3X4X5X6PX7T (X3=S, V, P, A, I, T, N; X4=S, A, T, D, K; X5=R, S, T, A, Y; X6=T, L, Y, R, G; X7=T, N, L, G) VH CDR1 (SEQ ID NO: 64): SX8AMS (X8=Q, Y) VH CDR2 (SEQ ID NO: 65): X9IX10X11X12GX13X14TX15YADSVKG (X9=S, Q, V; X10=P, G, S, Q, A, Y; X11=P, T, R, S; X12=G, M, T, Q, R, S; X13=P, R, N, T, Q, A; X14=N, P, S, G, A, T; X15=K, T, Y, E) VH CDR3 (SEQ ID NO: 66): X16X17X18X19FDY (X16=S, D, N; X17=Y, G, A, S, R, T; X18=P, K, T, R, H, A; X19=S, K, T)
[0087] Os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos que competem de forma cruzada com qualquer um do anticorpo anti-LRP10 ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado aqui em um ensaio de competição de ligação também são incluídos na presente divulgação. Em algumas modalidades, estes anticorpos que competem de forma cruzada podem se ligar ao mesmo epítopo que o anticorpo anti-LRP10 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado aqui.
[0088] Em certa modalidade, o anticorpo anti-LRP10 pode compreender uma mistura ou um coquetel, de dois ou mais anticorpos anti-LRP10, cada um se ligando ao mesmo epítopo ou a um diferente no LRP10. Em uma modalidade, a mistura ou o coquetel, compreende três anticorpos anti-LRP10, cada um se ligando ao mesmo epítopo ou a um diferente no LRP10.
[0089] Em outra modalidade, o inibidor de LRP10 pode incluir uma molécula de ácido nucleico, tal como uma molécula de RNA, que inibe a expressão ou a atividade de LRP10. Os RNAs interferentes específicos para Lrp10, tais como shRNAs ou siRNAs que inibem especificamente a expressão e/ou a atividade de Lrp10, podem ser planejados de acordo com os métodos conhecidos na técnica.
Competidor de LRP10
[0090] Em algumas modalidades, o dito competidor de LRP10 pode ser um receptor decoy solúvel que pode se ligar a um ou mais ligantes de LRP10, dessa maneira competido e inibindo ou reduzido a ligação do ligante ao LRP10 endógeno. Por exemplo, o receptor decoy pode conter uma sequência de aminoácidos que corresponde a todo a uma parte do ectodomínio de LRP10 e é desprovido de uma região transmembrana. A sequência de aminoácidos pode conter uma ou mais substituições, deleções e/ou adições comparada com a sequência do tipo selvagem do tipo selvagem, enquanto mantém ou aumenta sua atividade de ligação com um ou mais ligantes de LRP10. A sequência de aminoácidos pode ser fundida ou enxertada na extremidade constante de um anticorpo (por exemplo, IgG1) e assim, se torna solúvel na circulação. Em algumas modalidades, o receptor decoy pode ser uma quimera de LRP10 humano-fragmento Fc do anticorpo (LRP10-Fc).
[0091] Em algumas modalidades, o domínio Fc é um domínio de IgG, por exemplo, um domínio Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende um domínio CH2 e um domínio CH3. Em algumas modalidades, o domínio Fc tem atividade de dimerização.
[0092] Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende um domínio Fc de IgG1 da SEQ ID NO: 67 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o mesmo.
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 67)
[0093] Em modalidades, o domínio Fc é um domínio Fc com o efetor atenuado. Em modalidades, o domínio Fc com o efetor atenuado tem atividade do efetor reduzida, por exemplo, comparado com um domínio Fc de IgG1 do tipo selvagem, por exemplo, comparado com um domínio Fc de IgG1 do tipo selvagem da SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, a atividade do efetor compreende toxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em modalidades, a atividade do efetor é reduzida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em um ensaio de ADCC, por exemplo, comparada com a de um domínio Fc de IgG1 do tipo selvagem da SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, a atividade do efetor compreende citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Em modalidades, a atividade do efetor é reduzida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em um ensaio de CDC tal como um ensaio de CDC descrito em Armour et al., “Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor I binding and monocyte triggering activities.” Eur J Immunol (1999) 29:2613-24” por exemplo, comparada com a de um domínio Fc de IgG1 do tipo selvagem da SEQ ID NO: 67.
[0094] Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma região constante de IgG2 da SEQ ID NO: 68 ou um fragmento da mesma ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma.
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPA PPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP
PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 68)
[0095] Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende um domínio Fc de IgG2 humana, por exemplo, um domínio de IgG2 humana da SEQ ID NO: 69 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma.
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 69)
[0096] Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende um domínio Fc de IgG2Da da SEQ ID NO: 80 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma. Em modalidades, o domínio Fc compreende uma ou ambas as mutações A330S e P331S utilizando o sistema de numeração de Kabat. Em modalidades, o domínio Fc é um descrito em Armour et al. “Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor I binding and monocyte triggering activities.” Eur J Immunol (1999) 29:2613-24.
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPssIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 70)
[0097] Em várias modalidades, o receptor decoy pode ser preparado de forma que seja estável na circulação. Em algumas modalidades, o receptor decoy neutraliza e/ou inibe um ou mais ligantes de LRP10, por exemplo, através da competição, dessa maneira reduzindo ou prevenindo a ligação dos ligantes de LRP10 com o LRP10 endógeno. Em certas modalidades, o receptor decoy pode agir de forma mais eficiente que o ectodomínio de LRP10 sozinho.
[0098] O receptor solúvel pode ser preparado através dos métodos conhecidos na técnica de forma a produzir uma proteína de fusão através da tecnologia do DNA recombinante. O ectodomínio de LRP10 ou uma parte funcional do mesmo (por exemplo, o fragmento de ligação ao ligante) pode ser fundido com a extremidade constante de um anticorpo (por exemplo, IgG1). Por exemplo, a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de LRP10 humano ou uma parte funcional do mesmo, pode ser engenheirada para se ligar, opcionalmente através de um ligante, à sequência de DNA que codifica o gene humano para a extremidade Fc da IgG1. O DNA engenheirado pode então ser expresso para produzir uma proteína que se liga o ectodomínio de LRP10 ao Fc de IgG1.
Preparação de Anticorpos Anti-LRP10
[0099] Os anticorpos anti-LRP10 podem ser produzidos utilizando vários métodos geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, a tecnologia de exibição em fagos pode ser utilizada para verificar uma biblioteca de anticorpos humanos, para produzir um anticorpo monoclonal totalmente humano para terapia. Ligantes de alta afinidade podem ser considerados candidatos para os estudos de neutralização. Alternativamente, pode ser utilizada uma abordagem monoclonal convencional, na qual camundongos ou coelhos podem ser imunizados com a proteína humana, os ligantes candidatos identificados e testados e um anticorpo humanizado finalmente produzido através do enxerto dos sítios de combinação de cadeias pesada e leve dentro de uma sequência codificadora de anticorpo humano.
[00100] Os anticorpos compreendem tipicamente dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia “leve” de comprimento completo (que tem tipicamente um peso molecular de aproximadamente 25 kDa) e uma cadeia “pesada” de comprimento completo (que tem tipicamente um peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). A parte amino-terminal de cada cadeia inclui tipicamente uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos que é tipicamente responsável pelo reconhecimento do antígeno. A parte carbóxi-terminal de cada cadeia tipicamente define uma região constante responsável pela função efetora. As regiões variáveis de cada uma das cadeias pesadas e cadeias leves exibem tipicamente a mesma estrutura geral que compreende quatro regiões framework (FR) relativamente conservadas unidas por três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são tipicamente alinhadas pelas regiões framework, cujo alinhamento pode possibilitar a ligação a um epítopo específico. Do terminal N para o terminal C, as regiões variáveis de ambas as cadeias leve e pesada tipicamente compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio é tipicamente realizada de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteínas of Immunological Interest (1987 e 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917 ou Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883).
[00101] Os anticorpos se tornaram úteis e interessantes como agentes farmacêuticos com o desenvolvimento de anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais são produzidos utilizando qualquer método que produza moléculas de anticorpo por linhagens de células contínuas em cultura. Exemplos de métodos adequados para a preparação de anticorpos monoclonais incluem os métodos de hibridoma de Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497) e o método de hibridoma com células B humanas (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; e Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63).
[00102] Os anticorpos monoclonais podem ser modificados para uso como agentes terapêuticos. Um exemplo é um anticorpo “quimérico” no qual uma parte da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica ou homóloga a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou uma subclasse de anticorpo particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo. Outros exemplos são fragmentos destes anticorpos, contanto que exibam a atividade biológica desejada. Ver, a Pat. U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855. Um desenvolvimento relacionado é o anticorpo “enxertado com CDR”, em que o anticorpo compreende uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou uma subclasse de anticorpo particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) do anticorpo é idêntico ou homólogo a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertence a outra classe ou subclasse de anticorpo.
[00103] Outro desenvolvimento é o anticorpo “humanizado”. Os métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica (ver as Pat. U.S. Nos. 5.585.089 e 5.693.762; ver também Cécile Vincke et al. J. Biol. Chem. 2009;284:3273-3284 para humanização de anticorpos de lhama). Geralmente, um anticorpo humanizado é produzido por um animal não humano e então certos resíduos de aminoácidos, tipicamente de partes do anticorpo que não reconhecem o antígeno, são modificados para serem homólogos aos ditos resíduos em um anticorpo humano de isotipo correspondente. A humanização pode ser realizada, por exemplo, utilizando métodos descritos na técnica (Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536), através da substituição de pelo menos uma parte de uma região variável de roedor pelas regiões correspondentes de um anticorpo humano.
[00104] É mais recente o desenvolvimento de anticorpos humanos sem a exposição do antígeno aos seres humanos (“anticorpos totalmente humanos”). Através da utilização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas de camundongo, estes anticorpos são produzidos através da imunização com um antígeno (que tem tipicamente pelo menos 6 aminoácidos contíguos), opcionalmente conjugado a um carreador. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; e Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. Em um exemplo destes métodos, os animais transgênicos são produzidos através da incapacitação dos loci de imunoglobulina endógena de camundongo que codificam as cadeias de imunoglobulina pesada e leve de camundongo ali e da inserção dos loci que codificam as proteínas das cadeias pesada e leve humanas no seu genoma. Os animais parcialmente modificados, que têm menos que o complemento complete de modificações, são então cruzados para obtenção de um animal que tem todas as modificações desejadas do sistema imunológico. Quando um imunógeno é administrado, estes animais transgênicos produzem anticorpos que são imunoespecíficos para estes antígenos que têm sequências de aminoácidos humana (no lugar das de camundongo), incluindo regiões variáveis. Ver as Publicações PCT Nos. WO96/33735 e WO94/02602, incorporadas como referência. Métodos adicionais são descritos na Pat. U.S. No. 5.545.807, nas Publicações PCT Nos. WO91/10741, WO90/04036 e nas EP 546073B1 e EP 546073A1, incorporadas como referência. Os anticorpos humanos também podem ser produzidos através da expressão de DNA recombinante em células hospedeiras ou através da expressão em células de hibridoma como descrito aqui.
[00105] Em algumas modalidades, a tecnologia de exibição em fagos pode ser utilizada para selecionar anticorpos terapêuticos. Na exibição em fagos, os repertórios de anticorpos podem ser exibidos sobre a superfície de bacteriófago filamentoso e a biblioteca construída pode ser verificada em relação a fagos que se ligam ao imunógeno. O fago com anticorpo se baseia na engenharia genética de bacteriófagos e rodadas repetidas de seleção guiada pelo antígeno e propagação de fagos. Esta técnica permite a seleção in vitro de anticorpos monoclonais para LRP10. O processo de exibição em fagos começa com a preparação da biblioteca de anticorpos seguida pela ligação dos produtos da PCR das cadeias variáveis pesadas (VH) e das cadeias variáveis leves (VL) dentro de um vetor de exibição em fago, culminando na análise de clones de anticorpos monoclonais. Os produtos da PCR de VH e VL, que representam o repertório de anticorpos, são ligados dentro de um vetor de exibição em fago (por exemplo, o fagemídeo pComb3X) que é engenheirado para expressar VH e VL na forma de um scFv fundido com a proteína de capsídeo menor pIII de um bacteriófago filamentoso de Escherichia coli que foi originalmente derivada do bacteriófago M13. Entretanto, o vetor de exibição em fago pComb3X não tem todos os outros genes necessários para codificar um bacteriófago inteiro em E. coli. Para estes genes, um fago helper é adicionado à E. coli que é transformado com a biblioteca de vetores de exibição em fago. O resultado é uma biblioteca de fagos, cada um expressando sobre sua superfície um anticorpo monoclonal para LRP10 e carregando o vetor com a respectiva sequência de nucleotídeos lá dentro. A exibição em fagos também pode ser utilizada para produzir o próprio anticorpo monoclonal para LRP10 (não ligado às proteínas do capsídeo do fago) em certas cepas de E. coli. O cDNA adicional é engenheirado no vetor de exibição em fago, após as sequências de VL e VH para permitir a caracterização e a purificação do mAb produzido. Especificamente, o anticorpo recombinante pode ter um tag de epítopo de hemaglutinina (HA) e uma polihistidina para permitir a purificação fácil partindo da solução.
[00106] Diversas bibliotecas de fago com anticorpo são produzidas partindo de ~108 transformantes de E. coli independentes infectados com o fago helper. Através da utilização de biopanning (separação biológica), uma biblioteca pode ser verificada em relação à ligação do fago à sequência imunogênica listada anteriormente ou um fragmento da mesma, através da expressão na superfície do anticorpo monoclonal. A separação cíclica permite obter clones de ligação ao antígeno potencialmente muito raros e consiste de várias rodadas de ligação do fago ao antígeno (imobilizado sobre placas de ELISA ou em solução sobre as superfícies das células), lavagem, eluição e reamplificação das ligantes do fago em E. coli. Durante cada rodada, os ligantes específicos são selecionados do grupo através da eliminação por lavagem dos que não são ligantes e da eluição de forma seletiva de clones de fagos que se ligam. Após três ou quatro rodadas, a ligação altamente específica de clones de fagos através de seu anticorpo monoclonal para LRP10 na superfície é característica para a seleção direcionada sobre o imunógeno imobilizado.
[00107] Outro método é a adição de um His tag C-terminal, adequado para a purificação por cromatografia de afinidade, à sequência imunogênica listada anteriormente. A proteína purificada pode ser inoculada nos camundongos junto com um agente adequado. Os anticorpos monoclonais produzidos nos hibridomas podem ser testados em relação à ligação ao imunógeno e os ligantes positivos podem ser verificados como descrito nos ensaios apresentados aqui.
[00108] Os anticorpos totalmente humanos também podem ser produzidos partindo das bibliotecas de exibição em fagos (como divulgado em Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Estes processos imitam a seleção imunológica através da exibição de repertórios de anticorpos sobre a superfície de bacteriófago filamentoso e da seleção subsequente do fago através de sua ligação a um antígeno de escolha. Uma técnica desse tipo é descrita na Publicação de PCT No. WO99/10494, incorporada como referência, que descreve o isolamento de anticorpos agonistas de alta afinidade e funcionais para receptores de MPL e msk utilizando tal abordagem.
[00109] Em algumas modalidades, o ectodomínio de LRP10 humano, que consiste dos aminoácidos 18-713 da sequência da proteína LRP10 humana de 713 aminoácidos, pode ser utilizado como o imunógeno. Um fragmento ou uma parte do ectodomínio de LRP10 também pode ser utilizada como o imunógeno. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando um ou mais imunógenos. Podem ser gerados anticorpos anti-LRP10 terapêuticos potenciais.
[00110] Em um exemplo, utilizando um modelo de camundongo que tem o ectodomínio de LRP10 humano nocauteado dentro do gene Lrp10 de camundongo e células T humanas (Jurkat ou células T primárias de doadores humanos), os anticorpos monoclonais que copiam o fenótipo da mutação de nocaute poderiam ser testados e identificados como candidatos a anticorpos anti-LRP10 potenciais. Os anticorpos monoclonais que copiam o fenótipo da mutação de nocaute incluem aqueles que têm um número elevado de células T (por exemplo, CD4+ e CD8+) no sangue, baixa proporção de células B:T e/ou baixa contagem de células NK. Estes testes incluem a verificação de ponto(s) final(is), tal(is) como o aumento da expressão de Frizzled e/ou da proteína P21 detectado, por exemplo, em Western blot e secundariamente, o aumento da migração de células e maior reconstituição hematopoiética após a irradiação ou a quimioterapia. Após a verificação, os anticorpos monoclonais totalmente humanos podem ser desenvolvidos para teste pré-clínico e então testados em testes clínicos em humanos em relação à segurança e à eficácia. Estes anticorpos podem ser candidatos clínicos que podem aumentar a recuperação hematopoiética em um indivíduo após a quimioterapia ou a irradiação e/ou aprimorar a imunoterapia de câncer (por exemplo, através do aumento do número de linfócitos que se infiltram no tumor).
[00111] Podem ser determinadas as sequências de nucleotídeos que codificam os anticorpos descritos acima. Depois disso, quimérico, anticorpos humanizados enxertados com CDR e totalmente humanos também podem ser produzidos através de métodos recombinantes. Ácidos nucleicos que codificam os anticorpos podem ser introduzidos nas células hospedeiras e expressos utilizando materiais e procedimentos geralmente conhecidos na técnica.
[00112] A divulgação fornece um ou mais anticorpos monoclonais contra LRP10. Preferencialmente, os anticorpos se ligam ao ectodomínio de LRP10. Em modalidades preferidas, a divulgação fornece sequências de nucleotídeos que codificam e sequências de aminoácidos que compreendem moléculas de imunoglobulina de cadeias pesada e leve, particularmente sequências que correspondem às suas regiões variáveis. Em modalidades preferidas, são fornecidas as sequências que correspondem às CDRs, especificamente da CDR1 até a CDR3. Em modalidades adicionais, a divulgação fornece linhagens de células de hibridoma que expressam tais moléculas de imunoglobulina e anticorpos monoclonais produzidos partindo das mesmas, preferencialmente anticorpos monoclonais humanos purificados contra LRP10 humano.
[00113] As CDRs das regiões variáveis de cadeias leve e pesada dos anticorpos anti-LRP10 da divulgação podem ser enxertadas em regiões framework (FRs) da mesma espécie ou de uma outra. Em certas modalidades, as CDRs das regiões variáveis de cadeias leve e pesada do anticorpo anti-LRP10 podem ser enxertadas em FRs humanas consenso. Para criar FRs humanas consenso, FRs de várias sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou de cadeia leve humanas são alinhadas para identificar uma sequência de aminoácidos consenso. As FRs da cadeia pesada ou da cadeia leve do anticorpo anti-LRP10 podem ser substituídas pelas FRs de uma cadeia pesada ou uma cadeia leve diferente. Os aminoácidos raros nas FRs das cadeias pesada e leve do anticorpo anti-LRP10 tipicamente não são substituídos, enquanto que o restante dos aminoácidos das FRs pode ser substituído. Os aminoácidos raros são aminoácidos específicos que ficam em posições nas quais eles não são geralmente encontrados nas FRs. As regiões variáveis enxertadas provenientes dos anticorpos anti-LRP10 da divulgação podem ser utilizadas com uma região constante que é diferente da região constante do anticorpo anti-LRP10. Alternativamente, as regiões variáveis enxertadas fazem parte de um anticorpo de Fv de cadeia única. O enxerto de CDRs é descrito, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 6.180.370, 5.693.762, 5.693.761, 5.585.089 e 5.530.101, que são incorporadas aqui como referência para qualquer finalidade.
[00114] Em algumas modalidades, os anticorpos da divulgação podem ser produzidos por linhagens de hibridoma. Nestas modalidades, os anticorpos da divulgação se ligam ao LRP10 com uma constante de dissociação (Kd) entre aproximadamente 4 pM e 1 µM. Em certas modalidades da divulgação, os anticorpos se ligam ao LRP10 com uma Kd menor que aproximadamente 100 nM, menor que aproximadamente 50 nM ou menor que aproximadamente 10 nM.
[00115] Em modalidades preferidas, os anticorpos da divulgação são do isotipo IgG1, IgG2 ou IgG4, com o isotipo IgG1 sendo mais preferido. Em modalidades preferidas da divulgação, os anticorpos compreendem uma cadeia leve kappa humana e uma cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana. Em modalidades particulares, as regiões variáveis dos anticorpos são ligadas a uma região constante sem ser a região constante para o isotipo IgG1, IgG2 ou IgG4. Em certas modalidades, os anticorpos da divulgação foram clonados para expressão em células de mamíferos.
[00116] Em modalidades alternativas, os anticorpos da divulgação podem ser expressos em linhagens de células que não são linhagens de células de hibridoma. Nestas modalidades, as sequências que codificam anticorpos particulares podem ser utilizadas para a transformação de uma célula hospedeira de mamífero adequada. De acordo com estas modalidades, a transformação pode ser conseguida utilizando qualquer método conhecido para introdução de polinucleotídeos em uma célula hospedeira, que inclui, por exemplo, o empacotamento do polinucleotídeo dentro de um vírus (ou dentro de um vetor viral) e a transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor) ou através de procedimentos de transfecção conhecidos na técnica. Tais procedimentos são exemplificados pelas Pat. U.S. Nos. 4.399.216,
4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455 (das quais todas são incorporadas aqui como referência para qualquer finalidade). Geralmente, o procedimento de transformação utilizado pode depender do hospedeiro que será transformado. Os métodos para introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a, transfecção mediada por dextran, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomos e microinjeção direta do DNA dentro dos núcleos.
[00117] De acordo com certas modalidades dos métodos da divulgação, uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada, uma região variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve ou uma região variável de cadeia leve de um anticorpo para LRP10 da divulgação é inserida em um vetor de expressão apropriado utilizando técnicas de ligação padronizadas. Em uma modalidade preferida, a região constante de cadeia pesada ou leve de LRP10 é ligada ao terminal C da região variável apropriada e é ligada dentro de um vetor de expressão. O vetor é tipicamente selecionado para ser funcional na célula hospedeira particular empregada (isto é, o vetor é compatível com o maquinário da célula hospedeira de forma que a amplificação do gene e/ou a expressão do gene possa ocorrer). Para uma revisão dos vetores de expressão, ver, Goeddel (ed.), 1990, Meth. Enzymol. Vol. 185, Academic Press. N.Y.
[00118] Tipicamente, os vetores de expressão utilizados em qualquer uma das células hospedeiras podem conter sequências para a manutenção de plasmídeos e para a clonagem e a expressão de sequências de nucleotídeos exógenas. Tais sequências tipicamente incluem uma ou mais das sequências de nucleotídeos a seguir: um promotor, uma ou mais sequências intensificadoras, uma origem de replicação, uma sequência de término da transcrição, uma sequência intrônica completa que contém um sítio de splice doador e receptor, uma sequência que codifica uma sequência líder para secreção do polipeptídeo, um sítio de ligação de ribossomas, uma sequência de poliadenilação, uma região poliligante para inserção do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo que será expresso e um elemento marcador selecionável. Estas sequências são bem conhecidas na técnica.
[00119] Os vetores de expressão da divulgação podem ser construídos partindo de um vetor inicial tal como um vetor disponível comercialmente. Tais vetores podem ou não conter todas as sequências flanqueadoras desejadas. Quando uma ou mais das sequências flanqueadoras descritas aqui ainda não estiverem presentes no vetor, estas podem ser individualmente obtidas e ligadas dentro do vetor. Os métodos utilizados para a obtenção de cada uma das sequências flanqueadoras são bem conhecidos por um perito na técnica.
[00120] Após o vetor ter sido construído e uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada ou a cadeia leve e a cadeia pesada que compreende um anticorpo anti-LRP10 ter sido inserida no sítio apropriado do vetor, o vetor completado pode ser inserido em uma célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão do polipeptídeo. A transformação de um vetor de expressão para um anticorpo anti-LRP10 em uma célula hospedeira selecionada pode ser realizada através de métodos bem conhecidos que incluem transfecção, infecção, coprecipitação com fosfato de cálcio,
eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE- dextran ou outras técnicas conhecidas. O método selecionado será em parte uma função do tipo de célula hospedeira que será utilizado. Estes métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos pelo perito na técnica e são apresentados, por exemplo, em Sambrook et al., supra.
[00121] A célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, sintetiza um anticorpo anti-LRP10 que pode ser subsequentemente coletado do meio de cultura (se a célula hospedeira secretá-lo dentro do meio) ou diretamente da célula hospedeira que o produz (se não for secretado). A seleção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários fatores, tais como os níveis de expressão desejados, as modificações polipeptídicas que são desejadas ou necessárias para a atividade (tal como glicosilação ou fosforilação) e facilidade de se dobrar em uma molécula biologicamente ativa.
[00122] As linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não são limitadas a, muitas linhagens de células imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, mas não limitadas a células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa,m células renais de hamster bebê (BHK), células renais de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e um número de outras linhagens de células. Em certas modalidades, podem ser selecionadas linhagens de células através da determinação de quais linhagens de células têm altos níveis de expressão e produzem anticorpos com propriedades de ligação ao LRP10 constitutivas. Em outra modalidade, pode ser selecionada uma linhagem de célula da linhagem de células B que não produz seu próprio anticorpo, mas tem uma capacidade de produzir e secretar um anticorpo heterólogo (por exemplo, linhagens de células mieloma de camundongo NS0 e SP2/0).
Composições Farmacêuticas e Seus Usos
[00123] Em um aspecto, é fornecido o uso de inibidor ou competidor de LRP10 para a manufatura de um medicamento para imunoterapia de câncer e/ou recuperação hematopoiética. Em outro aspecto, é fornecido um método de supressão do crescimento do tumor em um paciente, o método compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade eficiente de um inibidor ou um competidor de LRP10.
[00124] Em outro aspecto, são fornecidas composições farmacêuticas que podem ser utilizadas nos métodos divulgados aqui, isto é, composições farmacêuticas para aumentar a recuperação hematopoiética em um indivíduo, por exemplo, após a quimioterapia ou a irradiação e/ou para fornecer imunoterapia de câncer.
[00125] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um inibidor ou um competidor de LRP10 e um carreador farmaceuticamente aceitável. O inibidor ou o competidor de LRP10 pode ser formulado com o carreador farmaceuticamente aceitável em uma composição farmacêutica. Adicionalmente, a composição farmacêutica pode incluir, por exemplo, instruções para uso da composição para o tratamento de pacientes para aumentar a hematopoiética em um indivíduo após a quimioterapia ou a irradiação e/ou fornecer imunoterapia de câncer.
[00126] Em uma modalidade, o inibidor de LRP10 pode ser um anticorpo anti-LRP10 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00127] Como utilizado aqui, “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção, tampões e outros excipientes que são fisiologicamente compatíveis. Preferencialmente, o carreador é adequado para parenteral, administração oral ou tópica. Dependendo da rota de administração, o composto ativo, por exemplo, molécula pequena ou agente biológico, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.
[00128] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis, bem como excipientes convencionais para a preparação de comprimidos, pílulas, cápsulas e similares. O uso de tais meios e agentes para a formulação de substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto quando qualquer meio ou agente convencional for incompatível com o composto ativo, é considerado o seu uso nas composições farmacêuticas fornecidas aqui. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[00129] Um carreador farmaceuticamente aceitável pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol e similares; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares.
[00130] Exemplos de carreadores aquosas e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas fornecidas aqui incluem água, etanol, poliois (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares) e misturas adequadas dos mesmos e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Quando necessário, a fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e através do uso de tensoativos. Em muitos casos, pode ser útil incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tal como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada através da inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[00131] Estas composições também podem conter excipientes funcionais tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes e dispersão.
[00132] As composições terapêuticas tipicamente têm que ser estéreis, não filogênicas e estáveis sob as condições de manufatura e armazenamento. A composição pode ser formulada na forma de uma solução, uma microemulsão, um lipossomo ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco.
[00133] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, quando necessário, seguida pela esterilização, por exemplo, por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação incluem secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução esterilizada por filtração previamente do mesmo. O(s) agente(s) ativo(s) pode(m) ser misturado(s) sob condições estéreis com carreador(es) farmaceuticamente aceitável(is) adicional(is) e com quaisquer conservantes, tampões ou propelentes que possam ser necessários.
[00134] A prevenção da presença de micro-organismos pode ser garantida tanto através de procedimentos de esterilização, supra quanto através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol ácido sórbico e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Em adição, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada através da inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
[00135] As composições farmacêuticas que compreendem um inibidor de LRP10 podem ser administradas individualmente ou em terapia de combinação. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição fornecida aqui que compreende um inibidor de LRP10 e pelo menos um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como um ou mais agentes quimioterapêuticos conhecidos na técnica, discutidos em maiores detalhes a seguir. As composições farmacêuticas também podem ser administradas em associação à terapia de radiação e/ou cirurgia.
[00136] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolo, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada quando indicado pelas exigências da situação terapêutica.
[00137] Exemplos de faixas de dosagem para administração de um anticorpo incluem: 10-1000 mg (de anticorpo)/kg (de peso corporal do paciente), 10-800 mg/kg, 10-600 mg/kg, 10-400 mg/kg, 10-200 mg/kg, 30-1000 mg/kg, 30-800 mg/kg, 30-600 mg/kg, 30-400 mg/kg, 30-200 mg/kg, 50-1000 mg/kg, 50-800 mg/kg, 50-600 mg/kg, 50-400 mg/kg, 50-200 mg/kg, 100-1000 mg/kg, 100-900 mg/kg, 100-800 mg/kg, 100-700 mg/kg, 100-600 mg/kg, 100-500 mg/kg, 100-400 mg/kg, 100-300 mg/kg e 100-200 mg/kg. Exemplos de programações de dosagem incluem uma vez a cada três dias, uma vez a cada cinco dias, uma vez a cada sete dias (isto é, uma vez por semana), uma vez a cada 10 dias, uma vez a cada 14 dias (isto é, uma vez a cada duas semanas), uma vez a cada 21 dias (isto é, uma vez a cada três semanas), uma vez a cada 28 dias (isto é, uma vez a cada quatro semanas) e uma vez ao mês.
[00138] Pode ser vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária que é utilizada aqui se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os pacientes que serão tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de agente ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação a qualquer carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagens unitárias é determinada e diretamente dependente (a) das características únicas do composto ativo e do efeito particular que será atingido e (b) das limitações inerentes da técnica de produção de compostos tal como a sensibilidade nos indivíduos a um composto ativo para o tratamento.
[00139] Os níveis de dosagens atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas divulgadas aqui podem ser variados de forma a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficiente para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, uma composição e um modo de administração particular, sem ser tóxica para o paciente. “Parenteral” como utilizado aqui no contexto de administração significa modos de administração que não são administrações entérica e tópica, geralmente através de injeção e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosas, intramusculares, intra- arteriais, intratecais, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intradérmicas, intraperitoneais, transtraqueais, subcutâneas, subcuticulares, intra-articulares, subcapsulares, subaracnoides, intraespinhais, epidurais e intraesternais.
[00140] As expressões “administração parenteral” e “administrado de forma parenteral” como são utilizadas aqui se referem aos modos de administração que não são administrações entérica (isto é, através do trato digestivo) e tópica, geralmente através de injeção ou infusão e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosas,
intramusculares, intra-arteriais, intratecais, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intradérmicas, intraperitoneais, transtraqueais, subcutâneas, subcuticulares, intra-articulares, subcapsulares, subaracnoides, intraespinhais, epidurais e intraesternais. A injeção e a infusão intravenosas são frequentemente (mas não exclusivamente) utilizadas para administração de anticorpos.
[00141] Quando os agentes fornecidos aqui forem administrados na forma de agentes farmacêuticos a seres humanos ou animais, estes podem ser fornecidos individualmente ou na forma de uma composição farmacêutica que contém, por exemplo, 0,001 a 90% (por exemplo, 0,005 a 70%, por exemplo, 0,01 a 30%) de ingrediente ativo em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00142] Em certas modalidades, os métodos e os usos fornecidos aqui para aumentar a recuperação hematopoiética em um indivíduo após a quimioterapia ou a irradiação e/ou aprimorar a imunoterapia de câncer, pode compreender a administração de um inibidor de LRP10 e pelo menos um agente anticâncer adicional que não é um inibidor de LRP10.
[00143] Em uma modalidade, o pelo menos um agente anticâncer adicional compreende pelo menos um fármaco quimioterapêutico. Exemplos não limitantes de tais fármacos quimioterapêuticos incluem fármacos para quimioterapia à base de platina (por exemplo, cisplatina, carboplatina), taxanos (por exemplo, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), EndoTAG-1™ (uma formulação de paclitaxel encapsulado em complexos à base de lipídeos carregados positivamente; MediGene), Abraxane® (uma formulação de paclitaxel ligado ao alumínio)), inibidores de tirosinas quinases (por exemplo, imatinib/Gleevec®, sunitinib/Sutent®, dasatinib/Sprycel®) e combinações dos mesmos.
[00144] Em outra modalidade, o pelo menos um agente anticâncer adicional compreende um inibidor de EGFR, tal como um anticorpo anti-EGFR ou um inibidor de molécula pequena da sinalização de EGFR. Um exemplo de anticorpo anti-EGFR é cetuximab (Erbitux®).
Cetuximab está disponível comercialmente na ImClone Systems Incorporated. Outros exemplos de anticorpos anti-EGFR incluem matuzumab (EMD72000), panitumumab (Vectibix®; Amgen); nimotuzumab (TheraCIM™) e mAb 806. Um exemplo de inibidor de molécula pequena da via de sinalização de EGFR é gefitinib (Iressa®), que está disponível comercialmente na AstraZeneca e Teva. Outros exemplos de inibidores de molécula pequena da via de sinalização de EGFR incluem erlotinib HCL (OSI-774; Tarceva®, OSI Pharma); lapatinib (Tykerb®, GlaxoSmithKline); canertinib (dicloridrato de canertinib, Pfizer); pelitinib (Pfizer); PKI-166 (Novartis); PD158780; e AG 1478 (4-(3-Cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina).
[00145] Ainda em outra modalidade, o pelo menos um agente anticâncer adicional compreende um inibidor de VEGF. Um exemplo de inibidor de VEGF compreende um anticorpo anti-VEGF, tal como bevacizumab (Avastatin®; Genentech).
[00146] Ainda em outra modalidade, o pelo menos um agente anticâncer adicional compreende um anticorpo anti-ErbB2. Os anticorpos anti-ErbB2 adequados incluem trastuzumab e pertuzumab.
[00147] Em um aspecto, a efetividade aprimorada de uma combinação de acordo com a divulgação pode ser demonstrada atingindo a sinergia terapêutica.
[00148] O termo “sinergia terapêutica” é utilizado quando a combinação de dois produtos nas doses fornecidas for mais eficaz do que a melhor de cada um dos dois produtos individualmente nas mesmas doses. Em um exemplo, a sinergia terapêutica pode ser avaliada através da comparação de uma combinação com o melhor agente individual utilizando estimativas obtidas de uma análise de variância de duas vias com medidas repetidas (por exemplo, fator de tempo) sobre o parâmetro volume de tumor.
[00149] O termo “aditivo” refere-se a quando a combinação de dois ou mais produtos nas doses fornecidas é igualmente eficaz à soma das eficácias obtidas com cada um dos dois ou mais produtos, enquanto que o termo “superaditivo” refere-se a quando a combinação é mais eficaz do que a soma das eficácias obtidas com cada um dos dois ou mais produtos.
[00150] Outra medida através da qual a efetividade (incluindo a efetividade de combinações) pode ser quantificada é através do cálculo do log10 de morte celular, que é determinado de acordo com a equação a seguir: log10 de morte celular=T−C(dias)/3,32×Td em que T−C representa o retardo no crescimento das células, que é o tempo médio, em dias, para que os tumores do grupo tratado (T) e os tumores do grupo de controle (C) atinjam um valor predeterminado (1 g ou 10 mL, por exemplo) e Td representa o tempo, em dias, necessário para que o volume do tumor dobre nos animais de controle. Quando se aplica esta medida, é considerado que um produto é ativo se o log10 de morte celular for maior ou igual a 0,7 e é considerado que um produto é muito ativo se o log10 de morte celular for maior que 2,8.
[00151] Utilizando esta medida, uma combinação utilizada em sua própria dose máxima tolerada, na qual cada um dos constituintes está presente em uma dose geralmente menor ou igual a sua dose máxima tolerada, exibe sinergia terapêutica quando o log10 de morte celular é maior que o valor do log10 de morte celular do melhor constituinte quando este for administrado individualmente. Em um exemplo de caso, o log10 de morte celular da combinação excede o valor do log10 de morte celular do melhor constituinte da combinação em pelo menos um log de morte celular.
[00152] São divulgados aqui composições e métodos para o fornecimento de imunoterapia de câncer. O método pode incluir a inibição de LRP10 ou a competição pela ligação com o LRP10 endógeno em um indivíduo que necessita do mesmo. Em certas modalidades, a inibição de LRP10 ou a competição pela ligação com o LRP10 endógeno pode aumentar a infiltração no tumor de linfócitos, preferencialmente células T CD8+ e linfócitos T citotóxicos, fornecendo assim imunoterapia de câncer. A inibição de LRP10 (por exemplo, um anticorpo anti-LRP10) pode ser utilizada como uma imunoterapia de câncer individual, por exemplo, através do aumento da infiltração no tumor de linfócitos T citotóxicos. Em algumas modalidades, a inibição de LRP10 pode ser utilizada em associação a outra imunoterapia de câncer.
[00153] Também é fornecido aqui um método de aumento da recuperação hematopoiética, que compreende a inibição de LRP10 ou a competição pela ligação com o LRP10 endógeno em um indivíduo que necessita do mesmo. Em certas modalidades, a dita inibição aumenta a recuperação de todas as linhagens hematopoiéticas, preferencialmente linhagens linfoides. Em algumas modalidades, o indivíduo recebeu quimioterapia e/ou radioterapia.
[00154] Em várias modalidades, os métodos divulgados aqui podem incluir a administração ao indivíduo de uma quantidade eficiente de anticorpo anti-LRP10 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um LRP10 solúvel decoy. Em geral, a quantidade eficiente pode ser administrada de forma terapêutica e/ou profilática.
[00155] O tratamento pode ser apropriadamente administrado a indivíduos, particularmente humanos, que sofrem, têm, são suscetíveis ou estão em risco de desenvolver tal câncer. A determinação dos indivíduos “em risco” pode ser feita através de qualquer determinação objetiva ou subjetiva por um teste de diagnóstico ou opinião de um indivíduo ou um profissional de saúde (por exemplo, teste genético, marcador enzimático ou proteico, histórico familiar e similares). A identificação de um indivíduo que precisa de tal tratamento pode ocorrer à critério de um indivíduo ou um profissional de saúde e pode ser subjetivo (por exemplo, opinião) ou objetivo (por exemplo, mensurável por um teste ou método de diagnóstico).
Administração da Formulação
[00156] As formulações da presente divulgação, que incluem, mas não são limitadas a formulações reconstituídas e líquidas, são administradas a um mamífero que necessita de tratamento com os anticorpos anti-LRP10, preferencialmente um ser humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa na forma de um bolo ou através de infusão contínua ao longo de um período de tempo, através das rotas intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinhal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica ou inalação.
[00157] Em modalidades preferidas, as formulações são administradas ao mamífero através da administração subcutânea (isto é, embaixo da pele). Para estas finalidades, a formulação pode ser injetada utilizando uma seringa. Entretanto, estão disponíveis outros dispositivos para administração da formulação tais como dispositivos de injeção (por exemplo, os dispositivos INJECT-EASE™ e GENJECT™); canetas injetoras (tal como a GENPEN™); dispositivos autoinjetores, dispositivos sem agulha (por exemplo, MEDIJECTOR™ e BIOJECTOR™); e sistemas de fornecimento por emplastros subcutâneos.
[00158] Em uma modalidade específica, a presente divulgação está voltada para kits para uma unidade de administração em dose única. Estes kits compreendem um recipiente de uma formulação aquosa de proteína ou anticorpo terapêutico, que inclui seringas preenchidas individuais ou de várias câmaras. Exemplos de seringas preenchidas estão disponíveis na Vetter GmbH, Ravensburg, Alemanha.
[00159] A dosagem apropriada (“quantidade terapeuticamente eficiente”) da proteína dependerá, por exemplo, do estado de saúde que será tratado, da gravidade e do curso do estado de saúde, seja a proteína administrada com finalidade preventiva ou terapêutica, da terapia prévia, do histórico clínico do paciente e da resposta ao anticorpo anti-LRP10, do formato da formulação utilizada e do critério do médico atendente. O anticorpo anti-LRP10 é apropriadamente administrado ao paciente uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos e pode ser administrado ao paciente a qualquer momento a partir do diagnóstico em diante. O anticorpo anti-LRP10 pode ser administrado na forma do tratamento individual ou em associação a outros fármacos ou terapias úteis no tratamento do estado de saúde em questão.
[00160] Para anticorpos anti-LRP10, uma dosagem candidata inicial pode variar de aproximadamente 0,1-20 mg/kg para administração ao paciente, que pode tomar a forma de uma ou mais administrações separadas. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso da terapia é facilmente monitorado através de técnicas convencionais.
[00161] De acordo com certas modalidades da presente divulgação, várias doses de um anticorpo anti-LRP10 (ou uma composição farmacêutica que compreende uma combinação de um anticorpo anti- LRP10 e qualquer um dos agentes terapeuticamente ativos adicionais mencionados aqui) podem ser administradas a um indivíduo ao longo de um curso de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da divulgação compreendem a administração sequencial a um indivíduo de várias doses de um anticorpo anti-LRP10 da divulgação. Como utilizado aqui, “administração sequencial” significa que cada dose de anticorpo anti-LRP10 é administrada ao indivíduo em um ponto de tempo diferente, por exemplo, em dias diferentes separados por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, semanas ou meses). A presente divulgação inclui métodos que compreendem a administração sequencial ao paciente de uma dose inicial individual de um anticorpo anti-LRP10, seguida por uma ou mais doses secundárias do anticorpo anti-LRP10 e opcionalmente seguidas por uma ou mais doses terciárias do anticorpo anti-LRP10. O anticorpo anti-LRP10 pode ser administrado em uma dose entre 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.
[00162] Os termos “dose inicial”, “doses secundárias” e “doses terciárias” referem-se à sequência de administração temporal do anticorpo anti-LRP10 da divulgação. Assim, a “dose inicial” é a dose que é administrada no início do regime de tratamento (também referida como a “dose de linha de base”); as “doses secundárias” são as doses que são administradas após a dose inicial; e as “doses terciárias” são as doses que são administradas após as doses secundárias. Todas as doses iniciais, secundárias e terciárias podem conter a mesma quantidade de anticorpo anti-LRP10, mas geralmente podem diferir uma das outras em termos de frequência de administração. Em certas modalidades, entretanto, a quantidade de anticorpo anti-LRP10 contida nas doses iniciais, secundárias e/ou terciárias varia uma das outras (por exemplo, ajustada para mais ou menos quando apropriado) durante o curso de tratamento. Em certas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) doses são administradas no início do regime de tratamento como “doses de carga” seguidas por doses subsequentes que são administradas em uma base menos frequente (por exemplo, “doses de manutenção”).
[00163] Em certos exemplos de modalidades da presente divulgação, cada dose secundária e/ou dose terciária é administrada 1 a 26 (por exemplo, 1, 1 ½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11 , 11 ½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21 , 21 ½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½ ou mais) semanas após a dose imediatamente precedente. A expressão “a dose imediatamente precedente” como utilizado aqui, significa, em uma sequência de várias administrações, a dose de anticorpo anti-LRP10 que é administrada a um paciente antes da administração da dose bem a seguir na sequência sem doses intermediárias.
[00164] Os métodos de acordo com este aspecto da divulgação podem compreender a administração a um paciente de qualquer número de doses secundárias e/ou terciárias de um anticorpo anti- LRP10. Por exemplo, em certas modalidades, apenas uma única dose secundária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) doses secundárias são administradas ao paciente. Similarmente, em certas modalidades, apenas uma única dose terciária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) doses terciárias são administradas ao paciente.
[00165] Em modalidades que envolvem várias doses secundárias, cada dose secundária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses secundárias. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente 1 a 2 semanas ou 1 a 2 meses após a dose imediatamente precedente. Similarmente, em modalidades que envolvem várias doses terciárias, cada dose terciária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente 2 a 12 semanas após a dose imediatamente precedente. Em certas modalidades da divulgação, a frequência na qual as doses secundárias e/ou terciárias são administradas a um paciente pode variar ao longo do curso do regime de tratamento. A frequência de administração também pode ser ajustada durante o curso de tratamento por um médico dependendo das necessidades do paciente individual após o exame clínico.
[00166] A presente divulgação inclui regimes de administração nos quais 2 a 6 doses de carga são administradas a um paciente a uma primeira frequência (por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez ao mês, uma vez a cada dois meses etc.), seguidos pela administração de duas ou mais doses de manutenção ao paciente em uma base menos frequente. Por exemplo, de acordo com este aspecto da divulgação, se as doses de carga forem administradas a uma frequência de, por exemplo, uma vez ao mês (por exemplo, duas, três, quatro ou mais doses de carga administradas uma vez ao mês), então, as doses de manutenção podem ser administradas ao paciente uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada dez semanas, uma vez a cada doze semanas etc.).
EXEMPLOS
[00167] Os exemplos a seguir, incluindo os experimentos realizados e os resultados atingidos são fornecidos apenas com a finalidade de ilustração e não devem ser interpretados como limitantes da divulgação.
Exemplo 1. Descoberta de LRP10 como alvo de anticorpo para uso em humanos Sumário
[00168] Utilizando mutagênese com ENU os presentes inventores criaram mutações de linhagem germinativa aleatórias e até agora, selecionaram um total de 65.130 camundongos G3 mutantes de 2.289 pedigrees em relação a fenótipos por citometria de fluxo incomuns no sangue periférico. Estes camundongos foram portadores de um total de
126.220 mutações pontuais afetando a codificação ou o splicing ao longo do proteoma. Um pedigree (R0765) exibiu um fenótipo em que números elevados de células T (tanto células CD4 quanto CD8) estavam presentes no sangue. Outras anormalidades incluíam uma baixa proporção de células B:T e uma baixa contagem de células NK. A mutação causadora foi identificada em Lrp10 (também conhecido com Lrp9), um gene que codifica um membro da família de receptores de LDL. Descobertas similares foram observadas subsequentemente com outros alelos mutantes do gene e o direcionamento de CRISPR/Cas9 verificou o efeito com uma mutação de deleção de mudança de quadro de 8 pb.
[00169] Utilizando os camundongos com nocaute de CRISPR, células T mutantes homozigotas foram verificadas em relação à atividade de migração em resposta ao estímulo com uma quimiocina,
CXCL12. As células exibiram migração enormemente aumentada em direção a este estímulo.
[00170] Quando misturadas com medula óssea WT a uma proporção de 50:50 e transplantadas em camundongos WT irradiadas, foi observado que as células mutantes superaram enormemente as células WT, sugerindo atividade proliferativa muito mais forte.
[00171] Os presentes inventores propuseram que a neutralização de LRP10 com um anticorpo monoclonal adequado ajudaria na recuperação hematopoiética após a quimioterapia ou a irradiação, que é necessária durante a quimioterapia de câncer. Os presentes inventores também propuseram que o bloqueio de LRP10 poderia ser equivalente a um bloqueio de pontos de verificação, permitindo que as células T CD8 se infiltrassem nos tumores de forma muito mais eficiente do que se infiltrariam de outra maneira.
Camundongos Mutantes e Seleção
[00172] Machos com background de C57BL/6J puros de oito a dez semanas de idade obtidos no The Jackson Laboratory foram submetidos à mutagênese com N-etil-N-nitrosoureia (ENU) para criar mutações de linhagem germinativa aleatórias, que são descritas anteriormente (Wang T. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Feb 3;112(5), PMID: 25605905). Os machos G0 submetidos à mutagênese foram cruzados com fêmeas C57BL/6J e os machos G1 resultantes foram cruzados com fêmeas C57BL/6J para produzir camundongos G2. As fêmeas G2 foram cruzadas de volta com seus genitores G1 para produzir camundongos G3. Os camundongos G3 foram selecionados em relação a fenótipos de citometria de fluxo incomuns no sangue periférico. Até agora, um total de 65.130 camundongos G3 mutantes foi selecionado partindo de 2.289 pedigrees. Estes camundongos foram portadores de um total de
126.220 mutações pontuais afetando a codificação ou o splicing ao longo do proteomo.
Análise de FACS
[00173] Camundongos G3 mutantes foram gerados através de mutagênese com ENU (N-eil-N-nitrosoureia) e cruzamento estratégico como descrito anteriormente. O sangue periférico foi coletado de camundongos G3 >6 semanas de idade através do sangramento das bochechas. As RBCs foram lisadas com tampão hipotônico (ebiosceince, # 00-4300-54). As amostras foram lavadas com tampão de coloração de FACs (PBS com 1% (p/v) de BSA) uma vez a 500xg durante 6 minutos. As amostras com as RBCs eliminadas foram coradas durante 1 hora a 4 ºC, em 100 μL de coquetel 1:200 de anticorpos conjugados com fluorescência para 15 marcadores de superfície celular abrangendo as linhagens imunológicas principais: B220 (BD Pharmingen, # 557957); CD19 (BD Biosceince, # 563557); IgM (BD Pharmingen, # 550881); IgD, CD3ε (BD Horizon, # 553062); CD4 (BD Horizon, # 562464); CD8α (Biolegend, # 100752); CD11b (Biolegend, # 101237); CD11c (BD Horizon, # 563048); F4/80 (Tonbo Bioscience, # 50-4801-U100); CD44 (BD Horizon, # 562464); CD62L (Tonbo Bioscience, # 60-0621-U100); CD5 (BD Horizon, # 562739); CD43 (BD Pharmingen, # 560663); NK 1.1 (Biolegend, # 564143) e 1:200 Fc block (Fisher Scientific, # 352235). Os dados de citometria de fluxo foram coletados em um analisador de células BD LSR Fortessa e as proporções de populações de células imunológicas em cada camundongo G3 foram analisadas com o software FlowJo. Os dados de separação resultantes foram uploaded no Mutagenetix para mapeamento automatizado de alelos causadores.
Descoberta de LRP10 como um modulador de imunidade
[00174] Utilizando o método de separação acima, vários camundongos G3 do pedigree R0765 de camundongos submetidos à mutagênese com ENU exibiram uma maior proporção de células T CD4+ e CD8+ no sangue periférico. Outras anormalidades incluíam uma baixa proporção de células B:T e uma baixa contagem de células NK.
Este fenótipo foi chamado de chowmein e mapeado em uma mutação de sentido errado provavelmente danificadora na sequência codificadora do gene que codifica o receptor 10 relacionado à lipoproteína de densidade baixa (Lrp10), um gene que codifica um membro da família de receptores de LDL. Descobertas similares foram observadas com outros alelos mutantes do gene e o direcionamento de CRISPR/Cas9 verificou o efeito com uma mutação de deleção de mudança de quadro de 8 pb. O alelo ENU resultou em uma mudança de ácido aspártico para tirosina na posição 246 da cadeia polipeptídica (D246Y), dentro do ectodomínio da proteína do receptor que atravessa uma vez.
[00175] Para confirmar a causa e o efeito, fêmeas de camundongos C57BL/6J foram superovuladas por injeção com 6,5 U de gonadotropina do soro de égua prenhe (PMSG; Millipore, #367222), então com 6,5 U de gonadotropina coriônica humana (hCG; Sigma- Aldrich, #C1063) 48 horas depois. As fêmeas de camundongos superovuladas foram subsequentemente cruzadas com machos de camundongos C57BL/6J durante toda a noite. No dia seguinte, os óvulos fertilizados foram coletados dos ovidutos e o mRNA de Cas9 transcrito in vitro (50 ng/μL) e o RNA guia de pareamento de bases pequeno de Lrp10 (50 ng/μL; 5′- ACAGCCCTGGACTTGAGTTA-3′) foram injetados no citoplasma ou no pró-núcleo dos embriões. Os iniciadores da PCR eram: (Para frente) AGTCCCCCAGGAAGAGGCAA (SEQ ID NO: 71) (Inverso) TCACCTAGGTTCTCACTAGCCCC GT (SEQ ID NO: 72)
[00176] O iniciador de sequenciamento era tgggagttctggcacttccctg. Os embriões injetados foram cultivados em meio M16 (Sigma-Aldrich, #M7292) a 37ºC e 95% de ar/5% de CO2. Para a produção de camundongos mutantes, os embriões no estágio de 2 células foram transferidos para dentro da âmbula do oviduto (10-20 embriões por oviduto) de fêmeas Hsd:ICR (CD-1) pseudoprenhes (Harlan Laboratories,
#030). Os camundongos Lrp10-/- fundadores têm uma deleção de 8 pb no quinto éxon (CCTGGACTTGAG(TTACGGAG)ATGCAGTGCA) (SEQ ID NO: 73) com a deleção de 8 pb representada em parênteses), resultando em uma mudança de quadro prevista de causar término imaturo após 117 aminoácidos comparada com a proteína LPR10 do tipo selvagem de 713 aminoácidos. A cepa CRISPR Lrp10 KO foi submetida à separação com FACS e repetiu as células T CD4+ e CD8+ periféricas aumentadas observadas em chowmein.
Quimeras de Medula Óssea
[00177] Os camundongos receptores receberam uma exposição de 6 Gy pelo irradiador de raios X duas vezes em um intervalo de 5 horas. Água com antibiótico foi fornecida aos receptores após a irradiação.
[00178] Os fêmures de camundongos doadores C57BL/6 (CD45.1), CRISPR-Lrp10 KO (CD45.2) homozigotos foram colocados em uma pequena placa (em gelo) contendo meio [meio RPMI-1640 (Life Technologies, # 72400-120) suplementado com 10% (v/v) de FBS (Life Technologies, # 10082-147), 10 unidades/mL de penicilina e estreptomicina (Life Technologies, # 15140-122). Os fêmures foram lavados com este meio utilizando uma agulha de 25G. Para remover pedaços pequenos de osso, a medula foi homogeneizada e a solução foi colocada passada através de uma peneira de célula de nylon de 40 µm estéril (BD Biosciences, # 352340) e coletada em um tubo de 50 mL. O volume foi levado a 50 mL com meio e então centrifugado a 700 x g durante 5 min a 4º C. As células foram então ressuspensas em 5 mL de tampão de lise de células vermelhas do sangue (Sigma-Aldrich, # R7757) e incubadas durante 1 a 2 min. 5 mL de PBS estéril foram adicionados ao tubo e 10 μL de células e 10 μL de Trypan Blue foram misturados para contar o número total de células. A seguir, as células foram centrifugadas a 700 x g durante 5 min e as células foram então ressuspensas em 1 mL de PBS e transferidas para tubos Eppendorf de
1,5 mL tubes e mantidas em gelo. As células da medula óssea de camundongos C57BL/6 (CD45.1), camundongos CRISPR-Lrp10 KO (CD45.2) ou de uma mistura 1:1 foram transferidas para os camundongos receptores indicados através de injeção retro-orbital (FIG. 1). O sangue periférico foi amostrado em pontos de tempo após o transplante e a fração de quimeras doadoras dentro das populações de células imunológicas principais foi avaliada com citometria de fluxo utilizando anticorpos conjugados com fluorescência contra os marcadores congênicos CD45 (CD45.1 Biolegend, # 110732, CD45.2 Biolegend, # 109814) e CD3ε (BD Horizon, # 553062), CD4 (BD Horizon, # 562464), CD8α (Biolegend, # 100752), B220 (BD Pharmingen, # 557957), CD19 (BD Biosceince, # 563557), CD11b (Biolegend, # 101237) e NK 1.1 (Biolegend, # 564143). De forma geral, em cada experimento, foi observado que as células mutantes provenientes dos camundongos CRISPR-Lrp10 KO (CD45.2) superaram significativamente as células dos camundongos do tipo selvagem C57BL/6 (CD45.1), que sugeriu uma atividade proliferativa muito mais forte (FIG. 2, FIG. 3 e FIG. 4).
Ensaio de migração de células T e HSC
[00179] Utilizando os camundongos com nocaute de CRISPR, as células T mutantes homozigotas foram examinadas em relação à atividade migratória em resposta ao estímulo com quimiocina 12 do motivo C-X-C (CXCL12) (FIG. 5). Para realizar este experimento, as células T totais foram isoladas dos baços e dos nódulos linfáticos de camundongos C57BL/6 e CRISPR-Lrp10 KO homozigotos utilizando um kit de seleção negativa (StemCell Technologies, #19851). As células tronco hematopoiéticas (HSCs) foram então isoladas da medula óssea destes camundongos utilizando um kit de enriquecimento de HSC (StemCell Technologies, #19756). A seguir, 10 μL de células e 10 μL de Trypan Blue foram misturados juntos para contar o número total de células. As células foram então ressuspensas em RPMI contendo (p/v)
1% de BSA a uma densidade de 107/mL. 100 μL desta suspensão (106 células) foram adicionados na câmara superior de uma placa Transwell de 24 poços contendo insertos de membrana de policarbonato de 5 microns (Corning, #CLS3421-48EA). 600 μL de RPMI/(p/v)1% de BSA contendo 0, 20 ou 200 ng/mL de fator 1 derivado de célula do estroma (SDF-1) (Peprotech, #250-20A), também conhecido como CXCL12, foram adicionados na câmara inferior. As placas Transwell foram incubadas a 37 graus durante 3,5 horas. Após a incubação, a camada superior foi descartada e as células que migraram para a camada inferior foram coradas com anticorpos conjugados com fluorescência para CD4 (BD Horizon, # 562464) e CD8α (Biolegend, # 100752). As contagens de células foram avaliadas através da medida dos eventos totais coletados em 30s em um LSR Fortessa. A porcentagem de células migratórias foi calculada através da divisão do número de eventos coletados em cada concentração de quimiocina pelo número de eventos coletados em 30s partindo de uma diluição 1:6 da população de células de entrada. De forma geral, as células mutantes provenientes dos camundongos CRISPR-Lrp10 KO exibiram migração enormemente aumentada em direção ao estímulo com a quimiocina CXCL12 comparadas com as células de camundongo C57BL/6 do tipo selvagem (FIG. 5).
Ensaios de Western blot para p21 e Frizzled-6:
[00180] As vias de sinalização de Wnt desempenham papéis fundamentais na diferenciação, na proliferação e nas funções de muitas células bem como em processos de desenvolvimento, crescimento e homeostáticos nos animais. A proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de densidade baixa (LDLR) (LRP) 5 e a LRP6 são co- receptores das proteínas Wnt junto com os receptores de Frizzled, provocando a ativação da sinalização canônica de Wnt/beta-catenina. Para entender como a LRP10 regula a sinalização de Wnt/β-catenina,
as células T e as HSCs foram enriquecidas como descrito anteriormente.
Células não estimuladas (~106) foram então lisadas em tampão contendo 1% de SDS (ThermoFisher, #AM9820), 1:10.000 Benzonase (Sigma, #E1014) e 1:100 de Coquetel Inibidor de Protease (Cell Signaling Technology, #5871S) em tampão A (50 mM de HEPES, 2 mM de MgCl2, 10 mM de KCl). A concentração de proteína foi medida utilizando o ensaio de BCA (Pierce). Os extratos de células (20 μL cada; equivalente a ~1×106 células) foram separados em géis de proteína NuPAGETM NovexTM 4-12% Bis-Tris (Life Technologies, # NP0336BOX) e as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Bio- Rad, # 162-0115) durante 1 hora em 12 volts.
Após o bloqueio em solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% (v/v) de Tween-20 (TBS-T) com 5% (p/v) de BSA à temperatura ambiente durante 2 horas, a membrana foi incubada com durante toda a noite o anticorpo primário anti-P21 (Santa Cruz Bio Tech, # SC-6246), anti-Frizzled (Santa Cruz Bio Tech, # SC-393113) e anti-βActina (Cell Signaling, # 3700S) a 4ºC em 5% (p/v) de BSA em TBS-T com agitação suave.
A membrana foi então incubada com o anticorpo secundário IgM-HRP anticamundongo caprino (Southern Biotech, # 1021-05), IgG-HRP anticoelho caprino (Thermo fisher, # A16096) ou IgG-HRP anticoelho caprino (Thermo fisher, # A16096) durante 1 hora à temperatura ambiente.
O sinal de quimioluminescência foi revelado através da utilização do kit SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Fisher Scientific, # PIA34075) e detectado por um sistema G:Box Chemi XX6 (Syngene). Como mostrado na FIG. 6, as células T Lrp10-/- e as células hematopoiéticas Lrp10-/- têm maior expressão de p21, que é um produto final da sinalização de Wnt.
Ainda, tanto as células T Lrp10-/- quanto as células hematopoiéticas Lrp10-/- expressam o receptor de transposição transmembrana, Fizzled 6. Juntos, estes dados demonstram que o maior potencial competitivo das células T Lrp10-/- e das células hematopoiéticas Lrp10-/- é dependente de uma via de sinalização de Wnt/β-catenina não canônica.
Citometria de fluxo:
[00181] As células do sangue periférico foram isoladas e o tampão de lise de células vermelhas do sangue (RBC) foi adicionado para remover as RBCs. As células foram coradas em uma diluição 1:200 com 15 anticorpos monoclonais de camundongo conjugados com fluorocromo específico para os seguintes marcadores de superfície celular de camundongo abrangendo as linhagens imunológicas principais: B220, CD19, IgM, IgD, CD3ε, CD4, CD5, CD11c, CD44, CD43, CD25, CD21, CD23, BP-1 (BD Pharmingen), CD8α, CD11b, NK1.1 (Biolegend), F4/80, CD62L (Tonbo Biosciences) e na presença de anticorpo anti-CD16/32 de camundongo (Tonbo Biosciences) durante 1h a 4ºC. Após a coloração, as células foram lavadas duas vezes em PBS e analisadas por citometria de fluxo.
[00182] Como mostrado na FIG. 7, uma mutação pontual no domínio extracelular de Lrp10 (D246Y) foi criada durante a mutagênese com ENU. Os camundongos homozigotos para esta mutação exibiram uma proporção maior de CD3+, CD4+ e células T CD8+ em seu sangue periférico e foram chamados de chowmein (Lrp10ch/ch). Esta mutação tinha um modo de herança recessivo como heterozigotos (Lrp10+/ch) e os camundongos do tipo selvagem (Lrp10+/+) não eram afetados.
Inoculação de Tumor, Tratamento anti-PD-1 e Medida do Tumor:
[00183] Células de melanoma B16F10 foram crescidas em DMEM contendo 10% vol/vol de FBS. Um total de 2X105 células B16F10 em 100 μL de DPBS foi injetado s.c. no flanco direito de camundongos C57BL/6J, do tipo selvagem, camundongos LRP10 CRISPR KO heterozigotos e homozigotos para estabelecer tumores. Para o tratamento anti-PD-1, 300 μg de anti-PD-1 em 200 μL de DPBS foram injetados i.p. nos camundongos nos dias 5, 8 e 11 após a inoculação de tumor. Os tumores foram medidos com um calibrador digital (Fisher) e os tamanhos dos tumores foram calculados utilizando a fórmula a seguir: volume = 0,5 × comprimento × largura2. Os camundongos foram mortos quando o comprimento ou a largura dos tumores atingiram 2 cm.
[00184] Como mostrado na FIG. 8, os camundongos com nocaute de Lrp10 (Lrp10-/-) foram produzidos utilizando CRISPR-Cas9. Os camundongos Lrp10+/+ e Lrp10-/- receberam injeção subcutânea com a linhagem de célula tumoral de melanoma B16 singênico. 7 dias após a injeção das células tumorais, os camundongos receberam uma injeção intraperitoneal com anti-PD1 para bloqueio de pontos de verificação. O volume dos tumores foi medido nos dias 17, 19 e 24 após a injeção de tumor. Lrp10-/- exibiram volume de tumor médio significativamente menor nestes pontos de tempo.
[00185] Como mostrado na FIG. 9, no dia 19 após a injeção de tumor, o sangue periférico foi coletado de camundongos Lrp10+/+ e Lrp10-/- portando B16. Os camundongos Lrp10-/- portando tumor tinham uma proporção de células T totais maior no sangue periférico. Em contraste com Lrp10-/- naïve para tumor, somente as células T CD8+ estavam elevadas nos camundongos Lrp10-/- portando tumor e estes tinham um fenótipo efetor ativado que é medido pela expressão de CD44.
Exemplo 2: Produção de anticorpo monoclonal para LRP10
[00186] Com base na análise do LRP10 de Mus musculus do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/65107), foi determinado que dois fragmentos (XP_006519421.1 e NP_075369.2) de LRP10 de Mus musculus eram previstos como produtos da transcrição alternativamente spliced de bibliotecas de Lrp10 EST. Ainda, com base na análise de LRP10 de Homo sapiens (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/26020) (também conhecido como LRP9 em Homo sapiens), foi determinado que três fragmentos (NP_001316155.1, NP_054764.2, XP_005267567) do LRP10 de Homo sapiens eram previstos como produtos da transcrição alternativamente spliced de bibliotecas de Lrp10 EST. Tanto NP_054764.2 humana quanto NP_075369.2 de camundongo, como proteínas LRP10 canônicas, têm 713 resíduo de comprimento com peptídeos sinais de 17 resíduos, como analisadas por SignalP 4.1 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). A proteína LRP10 humana tem 88% de identidade com a proteína LRP10 de camundongo. Variantes de proteína LRP10 de Homo sapiens, incluindo as variantes de 516, 713 ou 721 resíduos, foram alinhadas por ClustalW. Comparando com a proteína canônica, duas isoformas não possuem os resíduos 135-143 e a isoforma 2 de LRP10 humana não possui os últimos 157 resíduos. A proteína LRP10 canônica humana tem um ectodomínio que consiste dos primeiros 440 resíduos, um domínio transmembrana que consiste dos resíduos 441-463 e um domínio intracelular que consiste dos resíduos 464-713. Para se direcionar a todas as isoforms da proteína LRP10 humana, a isoforma 2 foi analisada por Lasergene/Protean. Com base nesta análise, os polipeptídeos com os 159o-192o, 294o-360o e 378o-434o resíduos são candidatos para os anticorpos anti-LRP10 humana.
[00187] A sequência de aminoácidos dos primeiros 420 aminoácidos da proteína, que pode ser expressa para uso como um imunógeno, é a seguinte: >sp|Q7Z4F1|LRP10_HUMAN Proteína 10 relacionada ao receptor de lipoproteína de densidade baixa OS=Homo sapiens GN=LRP10 PE=1 SV=2 (SEQ ID NO: 74)
MLLATLLLLLLGGALAHPDRIIFPNHACEDPPAVLLEVQGTLQRPLVRDSRT SPANCTWLILGSKEQTVTIRFQKLHLACGSERLTLRSPLQPLISLCEAPPSPL QLPGGNVTITYSYAGARAPMGQGFLLSYSQDWLMCLQEEFQCLNHRCVSA VQRCDGVDACGDGSDEAGCSSDPFPGLTPRPVPSLPCNVTLEDFYGVFSS PGYTHLASVSHPQSCHWLLDPHDGRRLAVRFTALDLGFGDAVHVYDGPG PPESSRLLRSLTHFSNGKAVTVETLSGQAVVSYHTVAWSNGRGFNATYHV RGYCLPWDRPCGLGSGLGAGEGLGERCYSEAQRCDGSWDCADGTDEED CPGCPPGHFPCGAAGTSGATACYLPADRCNYQTFCADGADERRCRHCQP GNFRCRDEKCVYETWVCDGQPDCADGSDEWDCSYVLPRK
[00188] Uma parte do ectodomínio acima, ao invés de o comprimento completo, também pode ser utilizada como um imunógeno. Métodos conhecidos na técnica diferentes e aqueles que foram divulgados aqui, podem ser utilizados para gerar anticorpos anti-LRP10 totalmente humanos ou humanizados. Por exemplo, como descrito anteriormente, os anticorpos para LRP10 totalmente humanos também podem ser produzidos partindo de bibliotecas de exibição em fago. Os anticorpos anti-LRP10 humanizados podem ser preparados através da humanização de anticorpos monoclonais obtidos de hibridomas.
[00189] Por exemplo, um C-terminal His tag, adequado para purificação por cromatografia de afinidade, pode ser adicionado ao imunógeno. A proteína purificada pode ser inoculada nos camundongos junto com um adjuvante adequado. Os anticorpos monoclonais produzidos nos hibridomas podem ser testados em relação à ligação ao imunógeno e ligantes positivos podem ser selecionados em relação à capacidade de neutralizar a migração de células T ou de afetar a expressão de Frizzled e/ou p21 nas células linfoides humanas nos ensaios que são descritos anteriormente. Depois disso, os anticorpos podem ser humanizados para estudos pré-clínicos e clínicos.
Biopanning e Separação:
[00190] Uma biopanning típica inclui 3-5 rodadas para atingir um enriquecimento aceitável.
1. Biopanning da Biblioteca 1) Revestir cada poço de uma placa de ELISA com 2 μg de alvo de interesse em 50 μL de Tampão de Revestimento (0,1 M de
NaHCO3, pH 9,6) e incubar durante toda a noite a 4ºC. Descartar a solução de revestimento e lavar os poços com tampão de lavagem de 0,1% de PBST [PBS com 0,1% (v/v) de Tween 20] 3 vezes e bloquear os poços através da adição de 300 μL de Tampão de Bloqueio [2% de PBSM (PBS contendo 2% de leite desnatado)]. Selar e incubar durante toda a noite a 4ºC. 2) Descartar o Tampão de Bloqueio e adicionar 50-100 μL de biblioteca de fagos (~1011 partículas de fago) em cada poço (4 poços). Selar e incubar durante 2 h a 37ºC. 3) Remover a solução de fagos esgotada. Lavar a superfície revestida 9 times utilizando uma máquina de lavar placas de ELISA 4) Após remover a solução de lavagem final, adicionar 200 μL de Tampão de Eluição, incubar durante 10 min a 37ºC. Pipetar vigorosamente para cima e para baixo 10 vezes. Tranferir o eluato para um tubo de microcentrífuga contendo 100 μL de Tampão de neutralização.
2. Titulação dos Fagos 1) Fazer diluições em série de fagos em 2×YT Medium (Para a inserção de fagos, esperar títulos de 1012-13 fagos/mL. Fazer diluições entre 10-8 e 10-10. Para a retirada dos fagos, fazer diluições entre 10-1 e 10-4 para a Rodada 1, enquanto faz diluições entre 10-2 e 10-6 para as Rodadas 2 e 3). 2) Adicionar 500 μL de E. coli TG1s na fase log (DO600≈0,5) (30 min 37ºC). 3) Plaquear 100 μL de células infectadas sobre 2×YT ágar contendo 2% de glicose e 100 μg/mL de ampicilina e crescer a 37ºC durante toda a noite.
3. Recuperação dos Fagos Selecionados 1) Infectar E. coli TG1 com o fago produzido eluído através da adição da produção total em 6 mL de TG1 (DO600 ≈ 0,5). 2) Permitir que a infecção seja incubada em banho de água a 37ºC durante 30 min. 3) Adicionar 9 mL de 2×YT-AG Medium. Crescer durante toda a noite a 37ºC. 4) Centrifugar a 5.000 rpm durante 15 min a 4ºC. Ressuspender a pelota em 2×YT Medium contendo 15% de glicerol e armazenar a -80ºC. Estoque máster que será recuperado para seleções futuras.
4. Amplificação dos Fagos para a Rodada Seguinte de Biopanning 1) Inocular parte do estoque em glicerol recuperado em 25 mL de 2×YT-AG Medium. 2) Crescer até a fase exponencial (DO600 ≈ 0,5) através de agitação a 37ºC. 3) Adicionar ~ 2×1011 ufp de Fago Helper M13KO7. 4) Permitir que a infecção seja incubada em banho de água a 37ºC durante 30 min. 5) Centrifugar a 5.000 rpm durante 15 min. 6) Ressuspender a pelota em 25 mL de 2×YT-AK Medium. 7) Tranferir para um frasco de 250 mL. Crescer com agitação (225 rpm) durante toda a noite a 30ºC.
5. Purificação dos Fagos para a Rodada Seguinte de Biopanning 1) Centrifugar a cultura em um tubo de centrífuga de 50 mL a
4.000g durante 20 min para produzir uma pelota de bactérias. 2) Ao sobrenadante, adicionar 1/5o do volume de 5×PEG/NaCl e deixar no gel durante pelo menos 1 h. 3) Produzir pelotas dos fagos através de centrifugação a 12.000g durante 15 min a 4ºC. 4) Descartar o sobrenadante.
5) Ressuspender a pelota em 1 mL de PBS estéril. 6) Tranferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. 7) Centrifugar na microcentrífuga (2 min, g máximo) para remover as bactérias remanescentes. 8) Tranferir o sobrenadante para um tubo novo. Os fagos estão agora prontos para uso nas rodadas de separação adicionais ou nos ensaios de seleção. O fago pode ser armazenado a 4ºC sem muita redução do título. Para armazenamento em prazos longos, adicionar glicerol até 20% e armazenar a -80ºC.
Expressão e Purificação de Anticorpos:
1. Os cDNAs de cadeia leve e de cadeia pesada do anticorpo foram sintetizados quimicamente com otimização para expressão em mamíferos. Os cDNAs foram clonados no vetor de expressão.
2. Os genes codificadores de cadeia leve e de cadeia pesada foram cotransfectados com 30 mL de células 293F. O sobrenadante foi coletado no dia 6 após a transfecção.
3. Os anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade utilizando a proteína A imobilizada.
1) Tranferir 1 mL de resina pura com Proteína A para uma nova coluna de fluxo por gravidade de plástico descartável. Lavar a resina com 10 volumes de coluna (CVs) de água ultrapura e então equilibrar com 10 CVs de tampão TBS, pH 7,5/8,0. 2) Aplicar o sobrenadante de anticorpo filtrado na coluna e permitir que escoe por gravidade. Lavar a resina duas vezes com 10 CVs de PBS. Coletar as frações não adsorvidas (flow-through) tanto do sobrenadante quanto das lavagens e mantê-las em gelo ou a 4 oC para análise adicional. 3) Para eluição do anticorpo ligado, adicionar 4 mL de tampão de eluição de glicina-HCl (pH 2,7) e coletar a fração não adsorvida em tubos preenchidos previamente com 1 mL de solução de Tris-
HCl (pH 7,6). Coletar as frações adicionais como citado anteriormente. Cessar a eluição quando a DO280 nm das frações for zero (isto ocorre geralmente após três a cinco frações). 4) Após a eluição, submeter a resina a lavagens sequenciais com 10 CVs de glicina–HCl (pH 2,7), 10 CVs de PBS, 10 CVs de água ultrapura e 10 CVs de 20% (vol/vol) de etanol. Armazenar a resina em 20% (vol/vol) de etanol a 4 ºC para uso futuro. 5) Analisar todas as frações por SDS-PAGE. 6) Combinar as frações com bandas de proteína visíveis e submeter à diálise contra ≥30 volumes de tampão PBS com baixo teor de endotoxinas durante pelo menos 2 h a 4 ºC utilizando tubulação de diálise. 7) Concentrar a proteína dialisada utilizando um concentrador centrífugo (faixa de ≤10 kDa) pré-lavado com PBS. 8) Filtrar a amostra concentrada através de um filtro de 0,22 μm acionado por seringa e calcular a concentração de proteína através do método BCA.
Teste de ELISA: 1) Revestir a proteína LR10 alvo (1 μg/mL, 0,1 μg/poço) em certo tampão de revestimento (0,1 M de NaHCO3, pH 9,6). Incubar durante toda a noite a 4ºC. 2) Lavar os poços 3 vezes com 300 μL de tampão de lavagem (0,1% de PBST) por poço. 3) Bloquear os poços com 300 μL tampão de bloqueio (3% de BSA) durante 1 h a 37ºC. 4) Descartar o tampão de bloqueio e lavar a placa 3 vezes com o tampão de lavagem, batendo na placa de cabeça para baixo sobre uma seção limpa de papel toalha cada vez. 5) Adicionar 100 μL de uma diluição em série de anticorpos por poço. Incubar a 37ºC durante 1h.
6) Lavar 3 vezes com o tampão de lavagem. Diluir HRP-anti-IgG humana de caprino (1:4.000) no tampão de bloqueio (3% de BSA). Adicionar 100 μL de conjugado diluído por poço e incubar a 37 ºC durante 1 h. 7) Lavar 3 vezes com o tampão de lavagem. Dissolver o substrato de Tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma, USA) em 0,1 mmol/L de tampão citrato-fosfato e adicionar 1 μL/mL de H2O2 à solução. Adicionar 100 μL de solução de substrato por poço e incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos. 8) Adicionar 100 μL de 2 moles/L de solução de H2SO4 para cessar a reação. 9) Ler as placas utilizando uma leitora de microplacas ajustada em 490 nm.
Resultados:
[00191] A Phage Display HuScl-2TM Library da Creative Biolabs Inc. foi utilizada para 3 rodadas de biopinning. A proteína LRP10 humana recombinante com His-ta, LRP10-516H foi utilizado como antígeno. O sequenciamento da sub biblioteca proveniente da 3a rodada de biopanning identificou 9 clones únicos que têm as sequências de VL e VH a seguir (tanto sequências de aminoácidos quanto de nucleotídeos). Observar que para a sequência de anticorpo completa, cada VL pode ser ligada a uma região constante de cadeia leve tal como Ck (SEQ ID NO: 31) para formar uma cadeia leve completa e cada VH pode ser ligada a uma região constante de cadeia pesada tal como CH123 de IgG1 humana (SEQ ID NO: 32) para formar uma cadeia pesada completa.
Clone 1 (AB1) Sequência de proteína VL (SEQ ID NO: 1):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNA SDLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSRTPTTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 2):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSQAMSWVRQAPGKGLE WVSSIPPGGPNTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
KSYPSFDYWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeos VL (SEQ ID NO: 3):
ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCT ATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATAATGCATCCGATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTG AAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCGTCGCGGACGCCTACGAC
GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA VH (SEQ ID NO: 4):
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCA GCTAGGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGGTCTCATCTATTCCTCCGGGTGGTCCTAATACAAAGTACGCAGACT CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAC TGTGCGAAAAGTTATCCTTCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGG
TCACCGTCTCGAGC Clone 2 (AB2)
Sequência de proteína VL (SEQ ID NO: 5):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAA SPLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVARTPNTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 2):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSQAMSWVRQAPGKGLE WVSSIPPGGPNTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
KSYPSFDYWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeos VL (SEQ ID NO: 6):
ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCT ATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATGCGGCATCCCCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGTGGCTCGTACGCCTAATAC
GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA VH (SEQ ID NO: 4):
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCA GCTAGGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGGTCTCATCTATTCCTCCGGGTGGTCCTAATACAAAGTACGCAGACT CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAC TGTGCGAAAAGTTATCCTTCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGG
TCACCGTCTCGAGC Clone 3 (AB3) Sequência de proteína VL (SEQ ID NO: 7):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPTSLPLTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 8):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSQIGTMGRPTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
SGKKFDYWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeos VL (SEQ ID NO: 9):
ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCT ATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATAGGGCATCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTG AAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGCCGACTTCGTTGCCTCTGACG
TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA VH (SEQ ID NO: 10):
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCA GCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGGTCTCATAGATTGGGACGATGGGTCGGCCGACAACTTACGCAGAC TCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTA CTGTGCGAAAAGTGGGAAGAAGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCT
GGTCACCGTCTCGAGC Clone 4 (AB4) Sequência de proteína VL (SEQ ID NO: 11):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAA SALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADSYPTTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 12):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRLAPGKGLEW VSSISTTGNSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
DATSFDYWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeos VL (SEQ ID NO: 13):
ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCT ATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATGCTGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTG AAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCTGATTCTTATCCTACTACGT
TCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA VH (SEQ ID NO: 14):
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCA GCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCTGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGGTCTCATCTATTTCTACTACTGGTAATAGTACATATTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAC TGTGCGAAAGATGCTACTAGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGG
TCACCGTCTCGAGC Clone 5 (AB5) Sequência de proteína VL (SEQ ID NO: 15):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRA SRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIKTRPTTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 16):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSVIQRQGTGTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
KNSRTFDYWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeos VL (SEQ ID NO: 17):
ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCT ATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATCGTGCATCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTG AAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGATTAAGACAAGGCCTACGACG
TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA VH (SEQ ID NO: 18):
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCA GCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGGTCTCAGTTATTCAGCGTTAGGGTACTGGTACAGAGTACGCAGACT CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAC TGTGCAAAAAATTCGCGGACGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG
GTCACCGTCTCGAGC Clone 6 (AB6) Sequência de proteína VL (SEQ ID NO: 19):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDA SLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSAGPGTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 20):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSSIPSRGQATKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
SRHTFDYWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeos VL (SEQ ID NO: 21):
ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCT ATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATGATGCATCCCTTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTG AAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACTTCTGCGGGTCCTGGTACG
TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA VH (SEQ ID NO: 22):
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCA GCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGGTCTCAAGTATTCCTAGTCGTGGTTAGGCAACAAAGTACGCAGACT CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAC TGCGCGAAATCGCGTCATACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG
GTCACCGTCTCGAGC Clone 7 (AB7) Sequência de proteína VL (SEQ ID NO: 23):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAA STLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNDYYPTTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 24):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSSIATTGNTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
NTATFDYWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeos VL (SEQ ID NO: 25):
ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCT ATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTG AAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAATGATTATTATCCTACTACGT
TCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA VH (SEQ ID NO: 26):
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCA GCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGGTCTCATCTATTGCTACTACTGGTAATACTACATATTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAC TGTGCGAAAAATACTGCTACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGG
TCACCGTCTCGAGC Clone 8 (AB8) Sequência de proteína VL (SEQ ID NO: 1):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNA SDLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSRTPTTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 27):
MAEVQLLESGGGLVQLGGSLRLSCAASGFTFSSQAMSWVRQAPGKGLE WVSSIPPGGPNTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KSYPSFDYWGQGTLVTVSS
Sequência de nucleotídeos VL (SEQ ID NO: 3):
ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCT ATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATAATGCATCCGATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTG AAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCGTCGCGGACGCCTACGAC
GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA VH (SEQ ID NO: 28):
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCTT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCA GCTAGGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGGTCTCATCTATTCCTCCGGGTGGTCCTAATACAAAGTACGCAGACT CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAC TGTGCGAAAAGTTATCCTTCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGG
TCACCGTCTCGAGC Clone 9 (AB9) Sequência de proteína VL (SEQ ID NO: 1):
TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNA SDLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSRTPTTFGQGT
KVEIK VH (SEQ ID NO: 29):
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSSIYTSGAATTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
SYPSFDYWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeos VL (SEQ ID NO: 3):
ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCT ATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATAATGCATCCGATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTG AAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCGTCGCGGACGCCTACGAC
GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA VH (SEQ ID NO: 30):
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCA GCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG TGGGTCTCATCTATTTATACTTCTGGTGCTGCTACAACTTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAC TGTGCGAAAAGTTATCCTTCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGG
TCACCGTCTCGAGC Sequência de aminoácidos de Ck (SEQ ID NO: 31):
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGEC Sequência de aminoácidos de IgG1 CH123 (SEQ ID NO: 32):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[00192] Os presentes inventores sintetizaram os cDNAs destes anticorpos para expressão em células de mamíferos. Os genes de cadeia leve e cadeia pesada foram clonados no vetor de expressão, respectivamente e co-transfectados nas células 293F. Os presentes inventores utilizaram primeiro uma cultura de 80 mL para cada clone para o teste de expressão de anticorpo. Como mostrado na FIG. 10, 8 anticorpos foram expressos de forma bem sucedida, enquanto que a expressão de AB5 era muito baixa para ser detectada. Após a purificação por cromatografia de afinidade com base na Proteína A, todos os 8 anticorpos atingiram alta pureza.
[00193] Para o clone AB5, os presentes inventores também tentaram o sistema de expressão em CHO, mas seu nível de expressão era ainda bastante baixo. Isto indica que a capacidade de expressão baixa deste clone é devida à sequência do próprio anticorpo.
[00194] Para os anticorpos expressos em 8 poços, foram testadas suas atividades de ligação com o antígeno alvo por ELISA (Tabela 7 e FIG. 11). Dentre os 8 clones, 5 [AB1 (L1+H1), AB2 (L2+H1), AB3 (L3+H2), AB7(L7+H6) e AB8 (L1+H7)] destes exibiram alta afinidade pelo antígeno, enquanto que os outros 3 anticorpos não exibiram atividades de ligação.
[00195] Para os 5 anticorpos de alta afinidade, AB1 e AB2 exibiram a melhor atividade de ligação, que era coerente com os resultados do sequenciamento que estas duas sequências tinham as frequências mais altas.
Tabela 7: Resultados de ELISA Con.(ng/ml) AB1 (L1+H1) AB2 (L2+H1) AB3 (L3+H2) AB4 (L4+H3) 1000 2,4919 2,5264 2,6404 2,6633 2,6678 2,6894 0,1135 0,108 250 2,4027 2,3947 2,3273 2,5826 2,4178 2,4264 0,0754 0,0744 62,5 2,1695 2,2884 2,1059 2,3035 1,878 1,7456 0,0768 0,0789 15,63 1,3403 1,4688 1,3149 1,4561 0,8578 0,8585 0,0612 0,0662 3,91 0,527 0,5902 0,5337 0,5752 0,318 0,3198 0,0591 0,0582 0,98 0,1853 0,1948 0,1855 0,2099 0,1201 0,1158 0,057 0,0598 0,24 0,0871 0,0916 0,0904 0,0906 0,0625 0,0596 0,0533 0,0578 0 0,0508 0,0592 0,0592 0,0697 0,0393 0,0575 0,0609 0,0664 EC50 12,97 14,78 34,87 Con.(ng/ml) AB6 (L6+H5) AB7(L7+H6) AB8 (L1+H7) AB9 (L1+H8) 1000 0,2887 0,3495 3,1821 3,1195 1,872 1,8043 0,0561 0,052 250 0,1284 0,1332 2,7589 2,915 1,7051 1,7107 0,0665 0,0619 62,5 0,09 0,0989 2,168 2,0191 1,6008 1,6468 0,066 0,0548 15,63 0,0659 0,0656 0,9558 1,072 1,0632 1,1305 0,0619 0,0519 3,91 0,0615 0,0582 0,3916 0,3886 0,3891 0,4484 0,0523 0,0586 0,98 0,0588 0,0556 0,1293 0,0523 0,1585 0,1749 0,057 0,0464 0,24 0,0606 0,0573 0,0723 0,0801 0,0851 0,0859 0,0619 0,053 0 0,0595 0,0594 0,073 0,0579 0,0546 0,0515 0,0512 0,0452 EC50 35,68 11,71 Exemplo 3. Teste funcional dos anticorpos monoclonais Western blot
[00196] A expressão de P21 foi verificada em relação ao bloqueio das funções de Lrp10 pelos anticorpos humanos. Para a análise de Western blot direta nas células T pan do baço purificadas isoladas utilizando um método de seleção negativa (StemCell Technologies, #19851) estas foram cultivadas com ou sem 100 ug/mL dos anticorpos humanos anti-LRP10 AB1, AB2, AB3, AB4, AB6, AB7, AB8 ou AB9 durante 4 h e lisadas em tampão (1% (p/v) de SDS (Thermo), 0,01% (p/v) de Benzonase (Sigma), coquetel de inibidor de protease (Cell Signaling Technology) em tampão A (50 mM de HEPES, 2 mM de MgCl2, 10 mM de KCl). A concentração de proteína foi medida utilizando um ensaio de BCA (Pierce). Dez microgramas de proteína foram separados em géis de proteína com 4-12% de Bris-Tris (Life Technologies) e as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad) durante 45 minutos a 13 volts. Após o bloqueio na solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% (v/v) de Tween-20 (TBS-T) com 5% (p/v) de leite em pó desnatado (NFDM) à temperatura ambiente durante 1 hora, a membrana foi incubada durante toda a noite com anticorpo primários anti-P21 (Santa Cruz) e anti-βActina (Cell Signaling Technology), a 4ºC em 5% (p/v) de BSA em TBS-T com agitação suave. A membrana foi então incubada com anticorpo secundário IgG-HRP anticoelho ou camundongo caprino (Thermo fisher) durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. O sinal quimioluminescente foi revelado através a utilização do kit SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Fisher) e detectado por um sistema G:Box Chemi XX6 (Syngene). De forma geral, AB2 exibiu expressão de P21 muito aumentada nas células de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem.
[00197] Os presentes inventores observaram anteriormente que as células T purificadas partindo dos camundongos Lrp10-/- tinham maior expressão do inibidor do ciclo celular p21 comparadas com as células Lrp10+/+. As células T foram purificadas dos baços de camundongos Lrp10+/+ e incubadas com clones anti-LRP10 humano diferentes. Os níveis de expressão de P21 foram medidos com Western blot. Como mostrado na FIG. 12, não havia ali diferença na expressão de p21 entre células T não tratadas e células T tratadas com anticorpos anti-LRP10.
As células T tratadas com o anticorpo 2 exibiram uma banda imunorreativa intensa em ~35 kD que pode refletir a indução de uma modificação pós-tradução (por exemplo, glicosilação ou sumoilação). Os painéis à esquerda e à direita mostram dois experimentos separados.
Ensaio de migração de células T
[00198] Utilizando C57BL/6 as células T foram verificadas em relação à for atividade migratória em resposta ao estímulo com quimiocina 12 do motivo C-X-C (CXCL12). Para realizar este experimento, as células T totais foram isoladas dos baços e dos nódulos linfáticos dos camundongos C57BL/6 utilizando um kit de seleção negativa (StemCell Technologies, #19851). A seguir, 10 μL de células e 10 μL de Trypan Blue foram misturados para contar o número total de células. As células foram então ressuspensas em RPMI contendo (p/v) 1% de BSA a uma densidade de 107/mL. 100 μL desta suspensão (106 células) foram pré-tratados com ou sem 50 ug/mL de anticorpo para Lrp10 durante meia hora e então as células foram adicionadas na camada superior de uma placa Transwell de 24 poços contendo insertos de membrana de policarbonato de 5 microns (Corning, #CLS3421- 48EA). 600 μL de RPMI/(p/v)1% de BSA contendo 200 ng/mL de fator 1 derivado de células do estroma (SDF-1) (Peprotech, #250-20A), também conhecido como CXCL12, com ou sem 50 ug/mL de anticorpo para Lrp10, foram adicionados na camada inferior. As placas Transwell foram incubadas a 37 graus durante 3,5 horas. Após a incubação, a camada superior foi descartada e as células que migraram para a camada inferior foram avaliadas através da medida dos eventos totais coletados em 60s em um LSR Fortessa. A porcentagem de células migratórias foi calculada através da divisão do número de eventos coletados em cada concentração de quimiocina em 60s partindo de uma diluição 1:6 da população de células inseridas. De forma geral, AB2 e AB7 exibiram migração enormemente aumentada em direção ao estímulo com a quimiocina CXCL12 nas células de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem.
[00199] A significância estatística das diferenças entre os grupos foi analisada utilizando GraphPad através da realização dos testes estatísticos indicados. As diferenças nos valores brutos entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando P < 0,05. Os valores de P são representados por * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001; ns, não significativo com P > 0,05.
[00200] Os presentes inventores observaram anteriormente que as células T Lrp10-/- exibiam uma taxa de migração maior em resposta a SDF-1 (Cxcl12, ligante para CXCR4) em um ensaio em Transwell. Os esplenócitos Lrp10+/+ foram incubados com clones de anticorpo anti- LRP10 diferentes ou com veículo e colocados no poço superior de uma câmara Transwell. A camada inferior continha SDF-1 a 200 ng/mL. Foi permitido que as células migrassem durante 3,5h. Depois disso, o número de células T migradas na camada inferior foi contado em um citômetro de fluxo. A taxa de migração é apresentada como o número de células T que migraram em relação ao número inserido. Como mostrado na FIG. 13, todos os anticorpos anti-LRP10 induziram uma taxa de migração mais alta comparados com o veículo sozinho. Os anticorpos 2, 7 e 8 induziram a taxa de migração mais alta, aproximadamente 2 vezes mais alta que o veículo, em resposta a SDF-1.
[00201] Vários aspectos da presente divulgação podem ser utilizados individualmente, em combinação ou em uma variedade de arranjos não discutidos especificamente nas modalidades descritas no que foi citando anteriormente e, portanto, não são limitados em sua aplicação aos detalhes e à disposição de componentes apresentado na descrição anterior ou ilustrados nos desenhos. Por exemplo, os aspectos descritos em uma modalidade podem ser combinados de qualquer maneira com os aspectos descritos em outras modalidades.
[00202] Embora tenham sido discutidas as modalidades específicas da presente divulgação, o Relatório Descritivo acima é ilustrativo e não restritivo. Muitas variações da divulgação se tornarão evidentes para os peritos na técnica após a revisão deste Relatório Descritivo. O âmbito complete da divulgação deve ser determinado como referência às Reivindicações, junto com seu âmbito completo de equivalentes e Relatório Descritivo, junto com tais variações.
INCORPORAÇÃO COMO REFERÊNCIA
[00203] Todas as publicações, as Patentes e os Pedidos de Patentes referidos neste Relatório Descritivo são incorporados aqui como referência em sua totalidade para todas as finalidades até a mesma extensão como se cada publicação, Patente ou Pedido de Patente individual fosse especificamente indicado como sendo assim incorporado como referência.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Uso de Inibidor ou Competidor de LRP10, caracterizado por que é para o fabrico de um medicamento para imunoterapia de câncer.
2. Uso de Inibidor ou Competidor de LRP10, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o dito inibidor ou competidor de LRP10 aumenta a infiltração no tumor de linfócitos, preferencialmente células T CD8+ e linfócitos T citotóxicos, fornecendo assim imunoterapia de câncer.
3. Uso de Inibidor ou Competidor de LRP10, caracterizado por que é para o fabrico de um medicamento para recuperação hematopoiética.
4. Uso de Inibidor ou Competidor de LRP10, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por que o dito inibidor ou competidor de LRP10 aumenta a recuperação de todas as linhagens hematopoiéticas, preferencialmente linhagens linfoides, num paciente que recebeu quimioterapia e/ou radioterapia.
5. Uso de Inibidor ou Competidor de LRP10, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4, caracterizado por que o dito inibidor de LRP10 é anticorpo anti-LRP10 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que preferencialmente se liga ao ectodomínio de LRP10.
6. Uso de Inibidor ou Competidor de LRP10, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4, caracterizado por o dito competidor de LRP10 é um receptor solúvel engenheirado para um ou mais ligantes de LRP10, em que o dito receptor compete pela ligação com o LRP10 endógeno (por exemplo, uma quimera LRP10-Fc).
7. Anticorpo Anti-LRP10 ou Fragmento de Ligação ao Antígeno do Mesmo, opcionalmente para uso na imunoterapia de câncer e/ou na recuperação hematopoiética, caracterizado por que compreende uma ou mais das CDRs a seguir: VL CDR1 (SEQ ID NO: 33): RASQSISSYLN; VL CDR2 (SEQ ID NO: 62): X1ASX2LQS (X1=N, A, R, D; X2=D, P, R, A, L, T); VL CDR3 (SEQ ID NO: 63): QQX3X4X5X6PX7T (X3=S, V, P, A, I, T, N; X4=S, A, T, D, K; X5=R, S, T, A, Y; X6=T, L, Y, R, G; X7=T, N, L, G); VH CDR1 (SEQ ID NO: 64): SX8AMS (X8=Q, Y); VH CDR2 (SEQ ID NO: 65): X9IX10X11X12GX13X14TX15YADSVKG (X9=S, Q, V; X10=P, G, S, Q, A, Y; X11=P, T, R, S; X12=G, M, T, Q, R, S; X13=P, R, N, T, Q, A; X14=N, P, S, G, A, T; X15=K, T, Y, E); VH CDR3 (SEQ ID NO: 66): X16X17X18X19FDY (X16=S, D, N; X17=Y, G, A, S, R, T; X18=P, K, T, R, H, A; X19=S, K, T).
8. Anticorpo Anti-LRP10 ou Fragmento de Ligação ao Antígeno do Mesmo, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que compreende uma ou mais das CDRs a seguir: VL CDR1 (SEQ ID NO: 33): RASQSISSYLN; VL CDR2 (SEQ ID NO: 34): NASDLQS; VL CDR2 (SEQ ID NO: 35): AASPLQS; VL CDR2 (SEQ ID NO: 36): RASRLQS; VL CDR2 (SEQ ID NO: 37): AASALQS; VL CDR2 (SEQ ID NO: 38): DASLLQS;
VL CDR2 (SEQ ID NO: 39): AASTLQS;
VL CDR3 (SEQ ID NO: 40): QQSSRTPTT;
VL CDR3 (SEQ ID NO: 41): QQVARTPNT;
VL CDR3 (SEQ ID NO: 42): QQPTSLPLT;
VL CDR3 (SEQ ID NO: 43): QQADSYPTT;
VL CDR3 (SEQ ID NO: 44): QQIKTRPTT;
VL CDR3 (SEQ ID NO: 45): QQTSAGPGT;
VL CDR3 (SEQ ID NO: 46): QQNDYYPTT;
VH CDR1 (SEQ ID NO: 47): SQAMS;
VH CDR1 (SEQ ID NO: 48): SYAMS;
VH CDR2 (SEQ ID NO: 49): QIGTMGRPTTYADSVKG;
VH CDR2 (SEQ ID NO: 50): SISTTGNSTYYADSVKG;
VH CDR2 (SEQ ID NO: 51): VIQRQGTGTEYADSVKG;
VH CDR2 (SEQ ID NO: 52): SIPSRGQATKYADSVKG;
VH CDR2 (SEQ ID NO: 53): SIATTGNTTYYADSVKG;
VH CDR2 (SEQ ID NO: 54): SIPPGGPNTKYADSVKG;
VH CDR2 (SEQ ID NO: 55): SIYTSGAATTYADSVKG;
VH CDR3 (SEQ ID NO: 56): SYPSFDY;
VH CDR3 (SEQ ID NO: 57): SGKKFDY;
VH CDR3 (SEQ ID NO: 58): DATSFDY; VH CDR3 (SEQ ID NO: 59): NSRTFDY; VH CDR3 (SEQ ID NO: 60): SRHTFDY; VH CDR3 (SEQ ID NO: 61): NTATFDY.
9. Anticorpo Anti-LRP10 ou Fragmento de Ligação ao Antígeno do Mesmo, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que compreende uma sequência de VL selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1, 5, 7, 11, 15, 19 e 23 e uma sequência de VH selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 2, 8, 12, 16, 20, 24, 27 e 29.
10. Anticorpo Anti-LRP10 ou Fragmento de Ligação ao Antígeno do Mesmo, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que em um ensaio de migração, uma célula (por exemplo, célula tronco hematopoiética ou célula T) colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo migra em direção a um estímulo quimiotático mais rapidamente do que uma célula de controle que não é colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo, em que preferencialmente o estímulo quimiotático é selecionado de quimiocina 12 do motivo C-X-C (CXCL12), quimiocina 10 do motivo C-X-C (CXCL10), esfingosina-1-fosfato (S1P), ligante 2 do motivo C-C (CCL2) e/ou ligante 21 do motivo C-C (CCL21).
11. Anticorpo Anti-LRP10 ou Fragmento de Ligação ao Antígeno do Mesmo, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que uma célula (por exemplo, célula tronco hematopoiética ou célula T) colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo exibe maior expressão de Frizzled e/ou P21 comparada com uma célula de controle que não é colocada em contato com o anticorpo ou o fragmento do mesmo.
12. Anticorpo ou Fragmento de Ligação ao Antígeno do Mesmo, caracterizado por que compete de forma cruzada com o anticorpo ou o fragmento do mesmo conforme definidos em qualquer uma das Reivindicações de 7 a 11 num ensaio de competição de ligação.
13. Receptor Solúvel, para um ou mais ligantes de LRP10, opcionalmente para uso na imunoterapia de câncer e/ou na recuperação hematopoiética, caracterizado por que o dito receptor solúvel compete com o LRP10 endógeno pela ligação com o um ou mais ligantes de LRP10, em que preferencialmente o receptor solúvel é uma quimera LRP10-Fc.
14. Composição Farmacêutica, para imunoterapia de câncer e/ou recuperação hematopoiética, caracterizada por que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo conforme definidos em qualquer uma das Reivindicações de 7 a 11 ou o receptor solúvel conforme definido na Reivindicação 13 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
15. Método para Identificar Inibidor de LRP10, que compreende o contato de uma célula com um agente de teste, caracterizado por que um aumento na migração em direção a um estímulo quimiotático comparada com uma célula de controle que não é colocada em contato com o agente de teste indica que o agente de teste é um inibidor de LRP10, em que preferencialmente o estímulo quimiotático é selecionado de quimiocina 12 do motivo C-X-C (CXCL12), quimiocina 10 do motivo C-X-C (CXCL10), esfingosina-1-fosfato (S1P), ligante 2 do motivo C-C (CCL2) e/ou ligante 21 do motivo C-C (CCL21).
16. Método para Identificar Inibidor de LRP10, que compreende o contato de uma célula com um agente de teste, caracterizado por que um aumento na expressão de Frizzled e/ou p21 comparada com uma célula de controle que não é colocada em contato com o agente de teste indica que o agente de teste é um inibidor de LRP10.
17. Método para Identificar Inibidor de LRP10, de acordo com a Reivindicação 15 ou 16, caracterizado por que o agente de teste é um anticorpo anti-LRP10 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um receptor solúvel para um ou mais ligantes de LRP10 (por exemplo, uma quimera LRP10-Fc).
BR112020010336-5A 2017-11-29 2018-11-29 composições e métodos para terapia de câncer BR112020010336A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762591874P 2017-11-29 2017-11-29
US62/591,874 2017-11-29
PCT/US2018/063082 WO2019108806A1 (en) 2017-11-29 2018-11-29 Compositions and methods for cancer therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020010336A2 true BR112020010336A2 (pt) 2020-11-10

Family

ID=66665786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020010336-5A BR112020010336A2 (pt) 2017-11-29 2018-11-29 composições e métodos para terapia de câncer

Country Status (12)

Country Link
US (2) US11365250B2 (pt)
EP (1) EP3716994A4 (pt)
JP (1) JP2021504492A (pt)
KR (1) KR20200106495A (pt)
CN (1) CN112040970A (pt)
AU (1) AU2018375719A1 (pt)
BR (1) BR112020010336A2 (pt)
CA (1) CA3083969A1 (pt)
IL (1) IL274866A (pt)
MX (1) MX2020005424A (pt)
SG (1) SG11202004907SA (pt)
WO (1) WO2019108806A1 (pt)

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7049136B2 (en) * 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
CN1852974A (zh) * 2003-06-09 2006-10-25 密歇根大学董事会 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法
CA2612021A1 (en) 2005-06-13 2006-12-28 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
GB0624500D0 (en) * 2006-12-07 2007-01-17 Istituto Superiore Di Sanito A novel passive vaccine for candida infections
KR101801454B1 (ko) * 2007-03-21 2017-11-24 랩터 파마슈티컬스 인코포레이티드 환형의 수용체-연관된 단백질(ｒａｐ) 펩티드
ES2752192T3 (es) * 2012-05-04 2020-04-03 Samumed Llc 1H-pirazolo [3,4-b]piridinas y usos terapéuticos de las mismas
WO2015142880A1 (en) * 2014-03-18 2015-09-24 Sanford Health Reagents and methods for breast cancer detection
CA2874083C (en) * 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
WO2017093478A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biparatopic polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
US20170319688A1 (en) * 2016-04-14 2017-11-09 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
IL274866A (en) 2020-07-30
JP2021504492A (ja) 2021-02-15
EP3716994A1 (en) 2020-10-07
EP3716994A4 (en) 2021-09-01
AU2018375719A1 (en) 2020-05-28
US11365250B2 (en) 2022-06-21
CA3083969A1 (en) 2019-06-06
KR20200106495A (ko) 2020-09-14
SG11202004907SA (en) 2020-06-29
WO2019108806A1 (en) 2019-06-06
MX2020005424A (es) 2020-12-03
US20200385459A1 (en) 2020-12-10
US20220162303A1 (en) 2022-05-26
CN112040970A (zh) 2020-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11795219B2 (en) Antibody molecules for cancer treatment
US20210101969A1 (en) High Affinity Human Antibodies to Human Angiopoietin-2
US9926369B2 (en) Methods for treating hepatocellular cancer by administering an anti-Ang-2 antibody
CN103917562B (zh) 抗-ErbB3抗体及其用途
KR20180133399A (ko) 인간 폴리오바이러스 수용체(ｐｖｒ)에 특이적인 항체
KR20210058811A (ko) 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제 및 그의 용도
KR20150023387A (ko) 항-ｅｇｆｒ 항체 및 이의 용도
CN106459210A (zh) 用于治疗糖尿病黄斑性水肿的组合物和方法
US20210163581A1 (en) Connexin 43 antibodies and use thereof
CN107613974A (zh) 抗‑met抗体及其使用方法
US20120189635A1 (en) Methods for Treating or Preventing Malaria by Administering an Antibody that Specifically Binds Angiopoietin-2 (Ang-2)
US20220162303A1 (en) Compositions and methods for cancer therapy
JP6811186B2 (ja) イヌ血管内皮成長因子へ結合する抗体およびイヌ血管新生関連疾患の処置におけるその使用
EA042707B1 (ru) Антитело к pd1, способы его получения и применения для лечения злокачественного новообразования

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 5A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2750 DE 19-09-2023 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.