KR20200029469A - 항인간 ccr1 모노클로날 항체 - Google Patents

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마코토 다케토
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히데요 히라이
요시하루 사카이
다이라 마에카와
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쿄와 기린 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 인간 CC 케모카인 수용체1(CCR1)에 결합하여, 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은, 인간 CCR1의 세포 외 영역에 결합하여, 인간 CC 케모카인 리간드 15(CCL15)에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 해당 항체를 산생하는 하이브리도마, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 코드하는 염기 서열을 갖는 핵산, 해당 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포, 해당 하이브리도마 또는 해당 형질 전환 세포를 사용하는 해당 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는 치료약 및 진단약, 그리고 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 CCR1 관련 질환의 치료 방법 및 진단 방법에 관한 것이다.

Description

항인간 CCR1 모노클로날 항체
본 발명은, 인간 CC 케모카인 수용체1(CC chemokine receptor 1, 이하, 인간 CCR1이라고 기재함)의 세포 외 영역에 결합하여, 인간 CC 케모카인 리간드(이하, 인간 CCL이라고 기재함) 15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 해당 항체를 산생하는 하이브리도마, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 코드하는 염기 서열을 갖는 핵산, 해당 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포, 해당 하이브리도마 또는 해당 형질 전환 세포를 사용하는 해당 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는 치료약 및 진단약, 그리고 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 CCR1 관련 질환의 치료 방법 및 진단 방법에 관한 것이다.
CCR1은, 표면 항원 분류(cluster of differentiation, CD) 191, CKR-1, HM145, Macrophage inflammatory protein 1α receptor(마크로파지 염증 단백질 1α 수용체)(MIP1α R), CMKBR1 또는 SCYAR1 등의 별명이 있다.
인간 CCR1을 코드하는 유전자는, 1993년에 동정되어 있다(비특허문헌 1). 인간 CCR1의 cDNA 서열(서열 번호 1) 및 아미노산 서열(서열 번호 2)은 공개되어 있고, 예를 들어 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서는, cDNA 서열은 NM_001295, 단백질의 아미노산 서열은 NP_001286으로부터 참조할 수 있다. 마우스 CCR1의 cDNA 서열(서열 번호 3) 및 아미노산 서열(서열 번호 4)도 공개되어 있고, NCBI에서는, cDNA 서열은 NM_009912, 단백질의 아미노산 서열은 NP_034042로부터 참조할 수 있다.
CCR1은, 7회 막 관통형의 구조를 갖는 G단백질 공액형 수용체(G protein-coupled receptor; 이하 GPCR)이고, 전체 길이 355아미노산을 포함하는 막 단백질이다. 인간 CCR1의 리간드로서 인간 CCL3, CCL5, CCL8, CCL14, CCL15, CCL16 및 CCL23이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 또한, 마우스 CCR1의 리간드로서 마우스 CCL3, CCL5, CCL7 및 CCL9가 보고되어 있다(비특허문헌 3).
인간 CCL15는 C-C케모카인 패밀리에 포함되는 리간드이고, 전체 길이 92아미노산을 포함한다. CCR1과 CCR3이 CCL15의 수용체로서 기능하는 것이 알려져 있다. CCL15는 단백질 분해 효소의 작용에 의해 N말단이 분해되고, 68아미노산 전후의 활성화형으로 됨으로써 더 강력한 활성을 발휘하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 4).
CCR1을 포함하는 케모카인 수용체의 활성화는, 이하의 2개의 스텝을 거쳐서 일어나는 것으로 여겨지고 있다(비특허문헌 5). 스텝 1로서 케모카인(리간드)과, 수용체의 N말단 세포 외 영역의 상호 작용이 발생한다. 스텝 2로서 케모카인의 N말단 영역이, 수용체의 세포 외 루프 영역과 상호 작용하여, 수용체의 구조 변화가 일어난 결과, 세포 내에 시그널이 전달된다.
GPCR의 세포 내 시그널 전달에 있어서는, 리간드의 결합에 의해 발생한 GPCR의 구조 변화에 따라, GPCR의 C말단에 회합한 G단백질 α, β, γ삼량체가 활성화되고, α서브유닛이 βγ복합체로부터 해리된다. α서브유닛은 또한 하류의 인자에 작용하여, 시그널 전달 경로를 활성화한다. α서브유닛의 활성화에 의해 포스폴리파아제C(phospholipase C, 이하 PLC)가 활성화되면, 포스파티딜이노시톨(4,5)2인산[phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate, PIP2]이 분해되어, 이노시톨3인산(Inositol triphosphate, IP3)과 디아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)이 산생된다.
IP3은 소포체에 작용하여, 칼슘 이온(Ca2+)을 세포 내에 방출시켜, 칼모듈린을 통해 다양한 세포 반응을 일으킨다. 이 세포 내 칼슘 농도의 상승은, 형광 칼슘 인디케이터 등을 사용하여 측정할 수 있고, GPCR의 활성화의 지표라고 할 수 있다. CCR1에 대해서도 이 방법으로 세포 내 시그널의 활성화를 측정하는 것이 가능하다.
호중구, 호산구, 호염기구, 단구, 마크로파지, 수상 세포, NK 세포, T 세포 또는 B 세포 등, 다양한 혈구 세포에 있어서의 인간 CCR1의 발현이 지금까지 보고되어 있다(비특허문헌 6 내지 10). 또한 근년, 암 미소 환경 중에 존재하여, 암의 진전을 촉진하는 미성숙 골수구(immature myeloid cell, 이하 iMC), 골수 유래 면역 제어성 세포(myeloid derived suppressor cell, 이하 MDSC)라고 불리는 세포군이 CCR1을 발현하고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 11 및 12).
CCR1은 관절 류머티즘, 다발성 경화증, 만성 폐색성 폐질환 등, 다양한 자기 면역성 질환, 염증성 질환에 대한 관여가 시사되어 있다(비특허문헌 13). 또한, 상기한 iMC 및 MDSC에 발현되어 있는 점에서, 암의 진전 및 증악 과정에 대한 CCR1의 기여가 시사되어 있다(비특허문헌 11 및 12).
예를 들어, 인간 대장암에 있어서는, 어느 빈도로, 암 억제 유전자인 SMAD4의 변이 또는 SMAD4 단백질의 소실이 보이는 것이 알려져 있고, SMAD4의 결손은 예후 불량 인자라고 여겨지고 있다. 근년, SMAD4의 결손이, CCL15의 발현 상승을 통해, 종양 환경 중에 CCR1 양성의 iMC 또는 MDSC 등을 인입하는 요인으로 되어 있는 것, 또한 이들 세포가 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease, MMP)의 분비나 면역 제어 작용에 의해 암의 침윤 또는 전이를 보조하여, 환자의 예후를 악화시키는 등의 기서가 명확하게 되어 있다(비특허문헌 11 및 12).
기존의 저분자 CCR1 저해제로서는 CP481, 715(Pfizer사), MLN3897(Millennium사), BX-471(Berlex사), CCX-354(Chemocentryx사) 등을 들 수 있다. 이들 저분자 저해제에 대해서는, 관절 류머티즘, 다발성 경화증, 만성 폐색성 폐질환 등의 자기 면역성 또는 염증성 질환의 환자에 대한 임상 시험이 행해졌지만, 모두 유효성을 나타내는 것으로 되어 있지 않다(비특허문헌 14).
기존의 항CCR1 항체 중, 문헌 등에서 CCR1 활성화의 저해 효과가 보고되어 있는 것으로서는, 141-2(MBL사, #D063-3)(비특허문헌 15), 53504(R&D Systems사, #MAB145)(비특허문헌 16) 및 2D4(Millennium사)(특허문헌 1)를 들 수 있다.
미국 특허 제6,756,035호 명세서
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상기한 비특허문헌 15, 비특허문헌 16 및 특허문헌 1 등에 기재된 기존의 항CCR1 항체에는 의약품으로서 개발된 것은 없고, 항체 의약품으로서의 성능에 관한 정보는 충분하지 않다. 따라서, 본 발명은, 인간 CCR1에 결합하여, 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 해당 항체를 산생하는 하이브리도마, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 코드하는 염기 서열을 갖는 핵산, 해당 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포, 해당 하이브리도마 또는 해당 형질 전환 세포를 사용하는 해당 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는 치료약 및 진단약, 및 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 CCR1 관련 질환의 치료 방법 및 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제의 해결 수단으로서, 본 발명은 인간 CCR1의 세포 외 영역에 결합하여, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 인간 CCR1 모노클로날 항체를 제공한다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) 내지 (27)에 관한 것이다.
(1) 인간 CCR1의 세포 외 영역에 결합하여, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(2) 인간 CCL15에 의해 유도되는 인간 CCR1 발현 세포의 유주를 저해하는 (1)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(3) 인간 CCR1의 세포 외 루프2 영역의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는, (1) 또는 (2)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(4) 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (n)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(a) 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region; 이하, VH라고 약기함)의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; 이하 CDR이라고 약기함)1 내지 3이, 각각 서열 번호 69, 70 및 71에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄 가변 영역(light chain variable region; 이하, VL이라고 약기함)의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 72, 73 및 74에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(b) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 75, 76 및 77에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 78, 79 및 80에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(c) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 81, 82 및 83에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 84, 85 및 86에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(d) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 87, 88 및 89에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 90, 91 및 92에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(e) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 93, 94 및 95에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 96, 97 및 98에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(f) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 99, 100 및 101에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 102, 103 및 104에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(g) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 105, 106 및 107에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 108, 109 및 110에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(h) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 111, 112 및 113에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 114, 115 및 116에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(i) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 117, 118 및 119에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 120, 121 및 122에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(j) VH의 CDR1이 서열 번호 75에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, VH의 CDR2가 서열 번호 76에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 76에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Ile를 Thr로, 9번째의 Val을 Ala로, 14번째의 Phe를 Ala로, 및 15번째의 Ile를 Ala로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VH의 CDR3이, 서열 번호 77에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 77에 기재되는 아미노산 서열 중 5번째의 Tyr을 Ala로, 및 7번째의 Thr을 Ala로 치환하는 개변의 적어도 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VL의 CDR1이, 서열 번호 126에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 126에 기재되는 아미노산 서열 중 15번째의 Phe를 Ala로 치환하는 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VL의 CDR2가, 서열 번호 127에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 127에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val를 Ile로, 및 5번째의 Arg를 Lys로 치환하는 개변의 적어도 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VL의 CDR3이, 서열 번호 128에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(k) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 75, 131 및 77에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 126, 134 및 128에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(l) 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 적어도 하나의 항체와, 인간 CCR1로의 결합에 대하여 경합하는 항체.
(m) 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체.
(n) 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
(5) 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (j)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(a) VH가 서열 번호 51에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 52에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(b) VH가 서열 번호 53에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 54에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(c) VH가 서열 번호 55에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 56에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(d) VH가 서열 번호 57에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 58에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(e) VH가 서열 번호 59에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 60에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(f) VH가 서열 번호 61에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 62에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(g) VH가 서열 번호 63에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 64에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(h) VH가 서열 번호 65에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 66에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(i) VH가 서열 번호 67에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 68에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(j) VH가 서열 번호 130에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 133에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(6) 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(a) VH가 서열 번호 136에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 136에 기재되는 아미노산 서열 중 6번째의 Glu를 Gln으로, 20번째의 Leu를 Ile로, 27번째의 Gly를 Phe로, 29번째의 Val을 Leu로, 30번째의 Ser을 Asn으로, 37번째의 Ile를 Val로, 48번째의 Ile를 Leu로, 67번째의 Val을 Leu로, 71번째의 Val을 Lys로, 73번째의 Thr을 Asp로, 76번째의 Asn을 Ser로, 78번째의 Phe를 Val로, 80번째의 Leu를 Phe로, 82번째의 Leu를 Met로, 85번째의 Val을 Leu로, 92번째의 Val을 Ile로, 및 97번째의 Arg를 Lys로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 135에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 135에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Ile를 Val로, 15번째의 Pro를 Leu로, 50번째의 Gln을 Lys로, 92번째의 Tyr을 Phe로, 및 109번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(b) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열 중 4번째의 Leu를 Val로, 44번째의 Gly를 Arg로, 49번째의 Ser을 Ala로, 92번째의 Ala를 Gly로, 93번째의 Val을 Met로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 98번째의 Lys를 Arg로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Ile를 Val로, 15번째의 Ser을 Leu로, 19번째의 Ala를 Val로, 43번째의 Gln을 Lys로, 50번째의 Gln을 Lys로, 및 109번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(c) VH가 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열 중 42번째의 Asp를 Glu로, 87번째의 Lys를 Arg로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환하는 아미노산 개변의 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열 중 38번째의 Gln을 His로, 및 43번째의 Ala를 Gly로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(7) 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (h)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, (1) 내지 (4) 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(a) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 135에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(b) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 137에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(c) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 138에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(d) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 139에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(e) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 140에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(f) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 141에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(g) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 142에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(h) VH가 서열 번호 143에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 142에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(8) 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (w)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, (1) 내지 (4) 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(a) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(b) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 147에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(c) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 148에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(d) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 149에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(e) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 150에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(f) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(g) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 152에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(h) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 153에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(i) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(j) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 147에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(k) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 148에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(l) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 149에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(m) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 150에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(n) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(o) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 152에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(p) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 153에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(q) VH가 서열 번호 154에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(r) VH가 서열 번호 155에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(s) VH가 서열 번호 156에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(t) VH가 서열 번호 157에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(u) VH가 서열 번호 158에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(v) VH가 서열 번호 159에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(w) VH가 서열 번호 160에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(9) 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (f)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인, (1) 내지 (4) 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(a) VH가 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(b) VH가 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 164에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(c) VH가 서열 번호 165에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(d) VH가 서열 번호 165에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 164에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(e) VH가 서열 번호 166에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(f) VH가 서열 번호 166에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 164에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(10) 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(11) 유전자 재조합 항체가, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 어느 하나의 유전자 재조합 항체인, (10)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(12) 항체 단편이, Fab, Fab', (Fab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V영역(diabody), 디술피드 안정화 V영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 어느 하나의 항체 단편인, (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 항체 단편.
(13) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.
(14) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 코드하는 염기 서열을 갖는 핵산.
(15) (14)에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포.
(16) (13)에 기재된 하이브리도마 또는 (15)에 기재된 형질 전환 세포를 배양하고, 배양액으로부터 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 채취하는 것을 포함하는, (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법.
(17) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는, 인간 CCR1의 검출 또는 측정용 시약.
(18) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는, 인간 CCR1 관련 질환의 진단약.
(19) 인간 CCR1 관련 질환이 암, 자기 면역 질환 또는 염증성 질환인, (18)에 기재된 진단약.
(20) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 인간 CCR1 관련 질환의 치료약.
(21) 인간 CCR1 관련 질환이 암, 자기 면역 질환 또는 염증성 질환인, (20)에 기재된 치료약.
(22) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 인간 CCR1 관련 질환의 진단 방법.
(23) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 인간 CCR1 관련 질환의 치료 방법.
(24) 인간 CCR1 관련 질환의 진단약을 제조하기 위한, (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 사용.
(25) 인간 CCR1 관련 질환의 치료약을 제조하기 위한, (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 사용.
(26) 인간 CCR1 관련 질환의 치료약으로서의 사용을 위한, (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(27) 인간 CCR1 관련 질환의 진단약으로서의 사용을 위한, (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은, 인간 CCR1의 세포 외 영역에 결합하여, 인간 CCR1 활성화에 수반하는 다양한 반응을 저해한다. 그 때문에, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은, 인간 CCR1 관련 질환의 치료약 및 진단약으로서 이용할 수 있다.
도 1의 (a) 및 도 1의 (b)는, 항인간 CCR1 항체에 대하여, 활성화 인간 CCL15에 의한 THP-1의 유주를 저해하는 활성을 측정한 결과이다. 도 1의 (a) 및 도 1의 (b)의 종축은, THP-1 세포의 유주(%)를 나타내고, DPBS와 활성화 CCL15를 첨가했을 때에, Transwell(트랜스웰)의 하층으로 이동한 세포수를 100%로 했다. 도 1의 (a) 및 도 1의 (b)의 횡축은, THP-1 세포에 첨가한 항체, 리간드 및 이들의 농도를 나타내고 있다. 도 1의 (a) 및 도 1의 (b) 중에는, DPBS를 첨가한 샘플을 DPBS, 활성화 인간 CCL15를 첨가하지 않은 샘플을 No ligand, 활성화 인간 CCL15를 첨가한 샘플을 hCCL15(68aa)라고 기재했다. 항인간 CCR1 항체로서는, KM5907 항체, KM5908 항체, KM5909 항체, KM5911 항체, KM5915 항체, KM5916 항체, KM5954 항체, KM5955 항체 및 KM5956 항체를 사용했다.
도 2는 항인간 CCR1 항체에 대하여, 활성화 인간 CCL15에 의한 THP-1의 유주를 저해하는 활성을 측정한 결과이다. 도 2의 종축은, Transwell의 하층으로 이동한 세포수를 CellTiter-Glo로 측정했을 때의 발광량(relative light unit; RLU)을 나타낸다. 도 2의 횡축은, THP-1 세포에 첨가한 항체, 리간드 및 이들의 농도를 나타내고 있다. 도 2 중에는, DPBS를 첨가한 샘플을 DPBS, 활성화 인간 CCL15를 첨가하지 않은 샘플을 No ligand, 활성화 인간 CCL15를 첨가한 샘플을 hCCL15(68aa)라고 기재했다. 항인간 CCR1 항체로서는, 2D4 항체(Millennium사), 53504 항체(R&D Technologies사), 141-2 항체(MBL사, #D063-3), KM5908 항체 및 KM5916 항체를 사용했다.
도 3은 항인간 CCR1 항체에 대하여, 활성화 인간 CCL15에 의한 THP-1의 유주를 저해하는 활성을 측정한 결과이다. 도 3의 종축은, Transwell의 하층으로 이동한 세포수를 CellTiter-Glo로 측정했을 때의 발광량(relative light unit; RLU)을 나타낸다. 도 3의 횡축은, THP-1 세포에 첨가한 항체, 리간드 및 이들의 농도를 나타내고 있다. 도 3 중에는, 항체를 첨가하지 않은 샘플을 No mAb, 활성화 인간 CCL15를 첨가하지 않은 샘플을 No ligand, 활성화 인간 CCL15를 첨가한 샘플을 hCCL15라고 기재했다. 항인간 CCR1 항체로서는, chKM5908 항체 및 chKM5908' 항체를 사용했다. 실험은 N=3으로 실시하고, 그래프에는 그 평균값 및 표준 편차를 나타냈다.
도 4는 항인간 CCR1 항체에 대하여, 활성화 인간 CCL15에 의한 THP-1의 유주를 저해하는 활성을 측정한 결과이다. 도 4의 종축은, Transwell의 하층으로 이동한 세포수를 CellTiter-Glo로 측정했을 때의 발광량(relative light unit; RLU)을 나타낸다. 도 4의 횡축은, THP-1 세포에 첨가한 항체, 리간드 및 이들의 농도를 나타내고 있다. 도 4 중에는, 항체를 첨가하지 않은 샘플을 No mAb, 활성화 인간 CCL15를 첨가하지 않은 샘플을 No ligand, 활성화 인간 CCL15를 첨가한 샘플을 hCCL15라고 기재했다. 항인간 CCR1 항체로서는, chKM5908 항체, chKM5908' 항체, chKM5908'mut02 항체, chKM5908'mut22 항체 및 chKM5908'mut25 항체를 사용했다. 실험은 N=3으로 실시하고, 그래프에는 그 평균값 및 표준 편차를 나타냈다.
도 5는 시그널 서열을 포함하지 않는 mAb5-06 항체의 VL 및 mAb5-06 인간화 항체(이하, hzmAb5-06 항체라고 기재함)의 VL(LV0, LV1a, LV1b, LV2a, LV2b, LV4 및 LV5)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중 프레임으로 둘러싸인 영역은, CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 6은 시그널 서열을 포함하지 않는 mAb5-06 항체의 VH 및 hzmAb5-06 항체의 VH(HV0, HV14 및 HV17)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중 프레임으로 둘러싸인 영역은, CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 7은 시그널 서열을 포함하지 않는 KM5907 항체의 VL 및 KM5907 인간화 항체(이하, hzKM5907 항체라고 기재함)의 VL(LV0, LV1a, LV1b, LV1c, LV2a, LV2b, LV4 및 LV6)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중 프레임으로 둘러싸인 영역은, CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8은 시그널 서열을 포함하지 않는 KM5907 항체의 VH 및 hzKM5907 항체의 VH(HV0, HV1, HV2a, HV2b, HV3a, HV3b, HV3c, HV4 및 HV7)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중 프레임으로 둘러싸인 영역은, CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 9는 시그널 서열을 포함하지 않는 KM5916 항체의 VL 및 KM5916 인간화 항체(이하, hzKM5916 항체라고 기재함)의 VL(LV0 및 LV1a)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중 프레임으로 둘러싸인 영역은, CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 10은 시그널 서열을 포함하지 않는 KM5916 항체의 VH 및 hzKM5916 항체의 VH(HV0, HV1 및 HV3)의 아미노산 서열을 나타낸다. 각 서열 중 프레임으로 둘러싸인 영역은, CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 11은 항인간 CCR1 항체에 대하여, 활성화 인간 CCL15에 의한 THP-1의 유주를 저해하는 활성을 측정한 결과이다. 도 11의 종축은, Transwell의 하층으로 이동한 세포수를 CellTiter-Glo로 측정했을 때의 발광량(relative light unit; RLU)을 나타낸다. 도 11의 횡축은, THP-1 세포에 첨가한 항체, 리간드 및 이들의 농도를 나타내고 있다. 도 11 중에는, 항체를 첨가하지 않은 샘플을 No mAb, 활성화 인간 CCL15를 첨가하지 않은 샘플을 No ligand, 활성화 인간 CCL15를 첨가한 샘플을 hCCL15라고 기재했다. 항인간 CCR1 항체로서는, hzmAb5-06 LV5HV14, hzKM5907 LV2bHV3a 및 hzKM5916 LV2HV0을 사용했다. 실험은 N=3으로 실시하고, 그래프에는 그 평균값 및 표준 편차를 나타냈다.
본 발명은, 인간 CCR1의 세포 외 영역에 결합하여, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편에 관한 것이다.
CCR1은, CD191, CKR-1, HM145, Macrophage inflammatory protein 1α receptor(MIP1αR), CMKBR1 및 SCYAR1 등이라고도 한다. CCR1은, 7회 막 관통형의 구조를 갖는 GPCR이고, 전체 길이 355아미노산을 포함하는 막 단백질이다.
CCR1을 포함하는 GPCR에 있어서, 세포 표면 상의 GPCR는, 리간드가 결합함으로써 활성화되어, 해당 세포 내에 해당 수용체 의존적인 시그널이 전달됨과 동시에, 해당 세포 내의 칼슘 이온 농도가 상승한다. 그 결과, 해당 세포에 대하여, 세포 유주, 케모카인의 산생, 매트릭스 메탈로프로테아제 MMP의 산생 등이 발생하는 것이 알려져 있다.
즉, CCR1의 기능으로서는, 리간드가 세포 표면 상의 CCR1에 결합함으로써, 해당 세포 내에 CCR1 의존적인 시그널이 전달됨과 동시에, 해당 세포 내의 칼슘 이온 농도가 상승한 결과, 해당 세포에 대하여 세포 유주, 케모카인의 산생 또는 MMP의 산생 등을 일으키는 것 등을 들 수 있다.
인간 CCR1의 리간드로서는, 예를 들어 인간 CCL3, CCL5, CCL8, CCL14, CCL15, CCL16 및 CCL23 등을 들 수 있다. 마우스 CCR1의 리간드로서는, 예를 들어 마우스 CCL3, CCL5, CCL7 및 CCL9 등을 들 수 있다.
인간 CCL15는 C-C케모카인 패밀리에 포함되는 리간드이고, 전체 길이 92아미노산을 포함한다. 인간 CCL15는 단백질 분해 효소의 작용에 의해 N말단이 분해되어, 68아미노산 전후의 활성화형[이하, 본 발명에서는 활성화 인간 CCL15 또는 hCCL15(68aa)라고 기재함]으로 됨으로써, 전체 길이의 CCL15(이하, 본 발명에서는 전체 길이 CCL15라고 기재함)보다도 강력한 활성을 발휘하는 것이 알려져 있다.
인간 CCL15가 세포 표면 상의 인간 CCR1에 결합하여, 해당 수용체가 활성화되면, 해당 세포 내에 CCR1 의존적인 시그널이 전달되어, 포스폴리파아제C(PLC)의 활성화, 세포 내의 칼슘 이온 농도의 상승 또는 nuclear factor(핵 인자)-κB(NF-κB)의 활성화 등이 일어난다. 그 결과, 해당 세포에 대하여, 세포 유주 등이 발생한다.
본 발명의 모노클로날 항체(이하, 본 발명의 항체라고도 줄인다.)로서는, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1 활성화에 수반하는 다양한 반응의 적어도 하나를 저해하는 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체로서 구체적으로는, 예를 들어 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1 발현 세포 내에서의 CCR1 의존적인 시그널 전달, PLC의 활성화, 세포 내 칼슘 이온 농도의 상승, NF-κB의 활성화 및 CCR1 발현 세포의 유주로부터 선택되는 적어도 하나의 반응을 저해하는 항체 등을 들 수 있다. 이 중, 본 발명의 항체로서는, 인간 CCL15에 의해 유도되는 인간 CCR1 발현 세포의 유주를 저해하는 항체인 것이 바람직하다.
본 발명의 항체로서는, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1 활성화에 수반하는 상기한 반응에 대하여, 인간 CCL15만을 첨가하고, 항체를 첨가하지 않는 컨트롤과 비교하여, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 저해하는 항체를 들 수 있다. 인간 CCL15의 농도는, 측정계에 따라 인간 CCL15 첨가 시의 상기 반응의 활성이 최댓값으로 되는 농도로 적절히 조정할 수 있다. 예를 들어, 본원 실시예에 기재하는 방법으로 CCR1 발현 세포의 유주를 측정하는 경우에는, CCL15의 농도는 1ng/mL인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 항체 농도에 대해서도 측정계에 의해 적절히 조정할 수 있다. 예를 들어, 본 실시예에 기재하는 방법으로 CCR1 발현 세포의 유주를 측정하는 경우에는, 본 발명의 항체 농도는, 0.3μg/mL 이상, 바람직하게는 1μg/mL 이상, 보다 바람직하게는 3μg/mL 이상, 가장 바람직하게는 10μg/mL 이상인 것을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 인간 CCL15는, CCR1을 활성화하는 것이라면, 전체 길이 CCL15 및 활성화 인간 CCL15의 어느 CCL15여도 된다.
인간 CCR1 발현 세포로서는, 인간 CCR1을 발현하고 있는 세포라면 어느 세포여도 되고, 예를 들어 인간 세포, 인간 세포주 및 인간 CCR1 강제 발현주 등을 들 수 있다.
인간 CCR1을 발현하고 있는 인간 세포로서는, 예를 들어 호중구, 호산구, 호염기구, 단구, 마크로파지, 수상 세포, NK 세포, T 세포, B 세포, 미성숙 골수구(iMC) 및 골수 유래 면역 제어성 세포(MDSC) 등을 들 수 있다.
인간 CCR1의 세포 외 영역으로서는, 인간 CCR1의 아미노산 서열의 N말단으로부터 1 내지 31번째의 아미노산 서열을 포함하는 N말단 영역, 97 내지 103번째의 아미노산 서열을 포함하는 세포 외 루프1 영역, 172 내지 195번째의 아미노산 서열을 포함하는 세포 외 루프2 영역 및 266 내지 278번째의 아미노산 서열을 포함하는 세포 외 루프3 영역을 들 수 있다[Cell 72.3(1993): 415-425].
N말단 영역, 세포 외 루프1 영역, 세포 외 루프2 영역 및 세포 외 루프3 영역으로서, 구체적으로는, 각각 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서의 1 내지 31번째, 97 내지 103번째, 172 내지 195번째 및 266 내지 278번째의 아미노산 서열을 들 수 있다.
본 발명의 항체로서는, 상기한 인간 CCR1의 세포 외 영역에 결합하는 항체라면 어떤 것이어도 되지만, 인간 CCR1의 세포 외 루프2 영역의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항체인 것이 바람직하다. 이러한 항체로서는, 서열 번호 2의 아미노산 서열 172 내지 195번째의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항체 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항체로서 보다 구체적으로는, 하기 (a) 내지 (n)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 들 수 있다.
(a) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 69, 70 및 71에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 72, 73 및 74에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(b) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 75, 76 및 77에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 78, 79 및 80에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(c) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 81, 82 및 83에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 84, 85 및 86에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(d) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 87, 88 및 89에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 90, 91 및 92에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(e) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 93, 94 및 95에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 96, 97 및 98에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(f) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 99, 100 및 101에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 102, 103 및 104에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(g) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 105, 106 및 107에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 108, 109 및 110에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(h) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 111, 112 및 113에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 114, 115 및 116에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(i) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 117, 118 및 119에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 120, 121 및 122에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(j) VH의 CDR1이 서열 번호 75에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, VH의 CDR2가 서열 번호 76에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 76에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Ile를 Thr로, 9번째의 Val을 Ala로, 14번째의 Phe를 Ala로, 및 15번째의 Ile를 Ala로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VH의 CDR3이, 서열 번호 77에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 77에 기재되는 아미노산 서열 중 5번째의 Tyr을 Ala로, 및 7번째의 Thr을 Ala로 치환하는 개변의 적어도 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1이, 서열 번호 126에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 126에 기재되는 아미노산 서열 중 15번째의 Phe를 Ala로 치환하는 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VL의 CDR2가, 서열 번호 127에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 127에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val를 Ile로, 및 5번째의 Arg를 Lys로 치환하는 개변의 적어도 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VL의 CDR3이, 서열 번호 128에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(k) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 75, 131 및 77에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 126, 134 및 128에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(l) 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 적어도 하나의 항체와, 인간 CCR1로의 결합에 대하여 경합하는 항체.
(m) 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체.
(n) 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
본 발명의 항체로서는, 상기 (a) 내지 (k)에 기재되는 어느 하나의 항체의 VH의 CDR1 내지 3 및 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열과, 각각 90% 이상의 상동성을 나타내는 항체의 VH의 CDR1 내지 3 및 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 90% 이상의 상동성이란, 구체적으로는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상의 상동성 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 내지 (i)에 기재되는 항체의 일 형태로서는, 각각 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체 KM5907 항체, KM5908 항체, KM5909 항체, KM5911 항체, KM5915 항체, KM5916 항체, KM5954 항체, KM5955 항체 및 KM5956 항체를 들 수 있다. 상기 (a) 내지 (i)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 각각 항인간 CCR1 키메라 항체 chKM5907 항체, chKM5908 항체, chKM5909 항체, chKM5911 항체, chKM5915 항체, chKM5916 항체, chKM5954 항체, chKM5955 항체 및 chKM5956 항체를 들 수 있다. 상기 (a) 및 (f)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 각각 인간화 항인간 CCR1 항체 hzKM5907 항체 및 hzKM5916 항체를 들 수 있다. 상기 (j)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 항인간 CCR1 키메라 항체 개변체 chKM5908' 항체, chKM5908'mut 01 내지 32 항체 및 인간화 항인간 CCR1 항체 hzmAb5-06 항체를 들 수 있다. 상기 (k)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 항인간 CCR1 키메라 항체 개변체 chKM5908'mut 22 항체(mAb5-06이라고도 기재함) 및 인간화 항인간 CCR1 항체 hzmAb5-06 항체를 들 수 있다. 상기 (a) 내지 (k)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 그 외에는 상기 (a) 내지 (k)에 기재되는 어느 하나의 항체 VH의 CDR1 내지 3 및 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 인간 항체 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 (l)의 항체란, 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 항체를 제1 항체로 했을 때에, 해당 제1 항체와 인간 CCR1의 결합을 저해하는 제2 항체를 말한다. 본 발명의 상기 (m)의 항체란, 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 항체를 제1 항체 및 제1 항체가 결합하는 에피토프를 제1 에피토프라고 한 경우, 당해 제1 에피토프를 포함하는, 제2 에피토프에 결합하는 제2 항체를 말한다. 또한, 본 발명의 상기 (n)의 항체란, 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 항체를 제1 항체 및 제1 항체가 결합하는 에피토프를 제1 에피토프라고 한 경우에, 당해 제1 에피토프에 결합하는 제2 항체를 말한다.
또한, 본 발명의 항체로서, 구체적으로는, 하기 (1)-(a) 내지 (j), (2)-(a) 내지 (c), (3)-(a) 내지 (h), (4)-(a) 내지 (w) 및 (5)-(a) 내지 (f)로부터 선택되는 어느 하나의 항체도 들 수 있다.
(1)-(a) VH가 서열 번호 51에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 52에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(1)-(b) VH가 서열 번호 53에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 54에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(1)-(c) VH가 서열 번호 55에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 56에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(1)-(d) VH가 서열 번호 57에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 58에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(1)-(e) VH가 서열 번호 59에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 60에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(1)-(f) VH가 서열 번호 61에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 62에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(1)-(g) VH가 서열 번호 63에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 64에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(1)-(h) VH가 서열 번호 65에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 66에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(1)-(i) VH가 서열 번호 67에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 68에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(1)-(j) VH가 서열 번호 130에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 133에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(2)-(a) VH가 서열 번호 136에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 136에 기재되는 아미노산 서열 중 6번째의 Glu를 Gln으로, 20번째의 Leu를 Ile로, 27번째의 Gly를 Phe로, 29번째의 Val을 Leu로, 30번째의 Ser을 Asn으로, 37번째의 Ile를 Val로, 48번째의 Ile를 Leu로, 67번째의 Val을 Leu로, 71번째의 Val을 Lys로, 73번째의 Thr을 Asp로, 76번째의 Asn을 Ser로, 78번째의 Phe를 Val로, 80번째의 Leu를 Phe로, 82번째의 Leu를 Met로, 85번째의 Val을 Leu로, 92번째의 Val을 Ile로, 및 97번째의 Arg를 Lys로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 135에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 135에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Ile를 Val로, 15번째의 Pro를 Leu로, 50번째의 Gln을 Lys로, 92번째의 Tyr을 Phe로, 및 109번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(2)-(b) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열 중 4번째의 Leu를 Val로, 44번째의 Gly를 Arg로, 49번째의 Ser을 Ala로, 92번째의 Ala를 Gly로, 93번째의 Val을 Met로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 98번째의 Lys를 Arg로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Ile를 Val로, 15번째의 Ser을 Leu로, 19번째의 Ala를 Val로, 43번째의 Gln을 Lys로, 50번째의 Gln을 Lys로, 및 109번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(2)-(c) VH가 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열 중 42번째의 Asp를 Glu로, 87번째의 Lys를 Arg로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환하는 아미노산 개변의 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열 중 38번째의 Gln을 His로, 및 43번째의 Ala를 Gly로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(3)-(a) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 135에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(3)-(b) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 137에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(3)-(c) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 138에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(3)-(d) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 139에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(3)-(e) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 140에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(3)-(f) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 141에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(3)-(g) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 142에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(3)-(h) VH가 서열 번호 143에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 142에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(a) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(b) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 147에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(c) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 148에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(d) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 149에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(e) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 150에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(f) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(g) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 152에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(h) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 153에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(i) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(j) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 147에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(k) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 148에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(l) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 149에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(m) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 150에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(n) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(o) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 152에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(p) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 153에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(q) VH가 서열 번호 154에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(r) VH가 서열 번호 155에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(s) VH가 서열 번호 156에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(t) VH가 서열 번호 157에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(u) VH가 서열 번호 158에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(v) VH가 서열 번호 159에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(4)-(w) VH가 서열 번호 160에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(5)-(a) VH가 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(5)-(b) VH가 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 164에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(5)-(c) VH가 서열 번호 165에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(5)-(d) VH가 서열 번호 165에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 164에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(5)-(e) VH가 서열 번호 166에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(5)-(f) VH가 서열 번호 166에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 164에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
본 발명의 항체로서는, 상기 (1)-(a) 내지 (j), (2)-(a) 내지 (c), (3)-(a) 내지 (h), (4)-(a) 내지 (w) 및 (5)-(a) 내지 (f)에 기재되는 어느 하나의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열과, 각각 90% 이상의 상동성을 나타내는 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 90% 이상의 상동성이란, 구체적으로는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상의 상동성 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (1)-(a) 내지 (i)에 기재되는 항체의 일 형태로서는, 각각 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체 KM5907 항체, KM5908 항체, KM5909 항체, KM5911 항체, KM5915 항체, KM5916 항체, KM5954 항체, KM5955 항체 및 KM5956 항체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (1)-(a) 내지 (i)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 각각 항인간 CCR1 키메라 항체 chKM5907 항체, chKM5908 항체, chKM5909 항체, chKM5911 항체, chKM5915 항체, chKM5916 항체, chKM5954 항체, chKM5955 항체 및 chKM5956 항체를 들 수 있다. 또한 상기 (1)-(j)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 항인간 CCR1 키메라 항체 개변체 chmAb5-06을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (2)-(a) 내지 (c)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 각각 인간화 항인간 CCR1 항체 hzmAb5-06 항체, hzKM5907 항체, 및 hzKM5916 항체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (3)-(a) 내지 (h)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 각각 인간화 항인간 CCR1 항체 hzmAb5-06 LV0HV17 항체, hzmAb5-06 LV1aHV17 항체, hzmAb5-06 LV1bHV17 항체, hzmAb5-06 LV2aHV17 항체, hzmAb5-06 LV2bHV17 항체, hzmAb5-06 LV4HV17 항체, hzmAb5-06 LV5HV17 항체 및 hzmAb5-06 LV5HV14 항체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (4)-(a) 내지 (w)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 각각 인간화 항인간 CCR1 항체 hzKM5907 LV0HV0 항체, hzKM5907 LV1aHV0 항체, hzKM5907 LV1bHV0 항체, hzKM5907 LV1cHV0 항체, hzKM5907 LV2aHV0 항체, hzKM5907 LV2bHV0 항체, hzKM5907 LV4HV0 항체, hzKM5907 LV6HV0 항체, hzKM5907 LV0HV7 항체, hzKM5907 LV1aHV7 항체, hzKM5907 LV1bHV7 항체, hzKM5907 LV1cHV7 항체, hzKM5907 LV2aHV7 항체, hzKM5907 LV2bHV7 항체, hzKM5907 LV4HV7 항체, hzKM5907 LV6HV7 항체, hzKM5907 LV2bHV1 항체, hzKM5907 LV2bHV2a 항체, hzKM5907 LV2bHV2b 항체, hzKM5907 LV2bHV3a 항체, hzKM5907 LV2bHV3b 항체, hzKM5907 LV2bHV3c 항체 및 hzKM5907 LV2bHV4 항체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (5)-(a) 내지 (f)에 기재되는 항체의 일 형태로서, 각각 인간화 항인간 CCR1 항체 hzKM5916 LV0HV0 항체, hzKM5916 LV2HV0 항체, hzKM5916 LV0HV1 항체, hzKM5916 LV2HV1 항체, hzKM5916 LV0HV3 항체 및 hzKM5916 LV2HV3 항체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 인간 CCR1로서는, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 혹은 NCBI 액세션 번호 NP_001286의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 혹은 NCBI 액세션 번호 NP_001286의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CCR1의 기능을 갖는 폴리펩티드, 혹은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 혹은 NCBI 액세션 번호 NP_001286의 아미노산 서열과 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CCR1의 기능을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_001286으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 부위 특이적 변이 도입법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997), Nucleic acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)] 등을 사용하여, 예를 들어 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA에, 부위 특이적 변이를 도입함으로써 얻을 수 있다.
결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개 내지 수십개, 예를 들어 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 수개, 예를 들어 1 내지 5개의 아미노산이다.
인간 CCR1을 코드하는 유전자로는 서열 번호 1에 기재된 염기 서열, 및 NCBI 액세션 번호 NM_001295의 염기 서열을 들 수 있다. 서열 번호 1에 기재된 염기 서열 혹은 NM_001295의 염기 서열에 있어서, 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열을 포함하고, 또한 인간 CCR1의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 포함하는 유전자, 서열 번호 1에 기재된 염기 서열 혹은 NM_001295의 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 인간 CCR1의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 포함하는 유전자 또는 서열 번호 1에 기재된 염기 서열, 혹은 NM_001295의 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 DNA를 포함하고, 인간 CCR1의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자 등도 본 발명의 인간 CCR1을 코드하는 유전자에 함유된다.
엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 DNA로서는, 서열 번호 1에 기재된 염기 서열 또는 NM_001295의 염기 서열을 포함하는 DNA를 프로브에 사용한, 콜로니·하이브리다이제이션법, 플라크·하이브리다이제이션법, 서던 블롯·하이브리다이제이션법 또는 DNA 마이크로 어레이법 등에 의해 얻어지는 하이브리다이즈 가능한 DNA를 말한다.
구체적으로는, 하이브리다이즈한 콜로니 혹은 플라크 유래의 DNA, 또는 해당 서열을 갖는 PCR 산물 혹은 올리고 DNA를 고정화한 필터 혹은 슬라이드 글래스를 사용하여, 0.7 내지 1.0mol/L의 염화나트륨 존재 하에서, 65℃에서 하이브리다이제이션법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)]을 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mmol/L 염화나트륨, 15mmol/L 시트르산나트륨을 포함함)을 사용하여, 65℃ 조건 하에서 필터 또는 슬라이드 글래스를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다.
하이브리다이즈 가능한 DNA로서는 서열 번호 1에 기재된 염기 서열 또는 NM_001295의 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
진핵 생물의 단백질을 코드하는 유전자의 염기 서열에는, 종종 유전자의 다형이 인정된다. 본 발명에 있어서 사용되는 유전자에, 이와 같은 다형에 의해 염기 서열에 소규모의 변이가 발생한 유전자도 본 발명의 인간 CCR1을 코드하는 유전자에 함유된다.
본 발명에 있어서의 상동성의 수치는, 특별히 명시한 경우를 제외하고, 당업자에게 공지의 상동성 검색 프로그램을 사용하여 산출되는 수치여도 되지만, 염기 서열에 대해서는, BLAST[J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등, 아미노산 서열에 대해서는, BLAST2[Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997), Genome Res., 7, 649(1997), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL]에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다.
디폴트의 파라미터로서는, G(Cost to open gap)가 염기 서열인 경우는 5, 아미노산 서열인 경우는 11, -E(Cost to extend gap)가 염기 서열인 경우는 2, 아미노산 서열인 경우는 1, -q(Penalty for nucleotide mismatch)가 -3, -r(reward for nucleotide match)이 1, -e(expect value)가 10, -W(wordsize)가 염기 서열인 경우는 11잔기, 아미노산 서열인 경우는 3잔기, -y[Dropoff(X) for blast extensions in bits]가 blastn인 경우는 20, blastn 이외의 프로그램에서는 7, -X(X dropoff value for gapped alignment in bits)가 15 및 -Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits)가 blastn인 경우는 50, blastn 이외의 프로그램에서는 25이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL/blastcgihelp.htmL).
서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_001286의 아미노산 서열 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드는, 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 구체적으로는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코드하는 DNA의 일부를 결실시키고, 이것을 포함하는 발현 벡터를 도입한 형질 전환체를 배양함으로써 제작할 수 있다. 또한, 상기와 동일한 방법에 의해, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 또는 NCBI 액세션 번호 NP_001286의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 혹은 NCBI 액세션 번호 NP_001286의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 혹은 NCBI 액세션 번호 NP_001286의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 플루올레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)법, t-부틸옥시카르보닐(tBoc)법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 항체로서는, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 올리고클로날 항체의 어느 항체든 포함한다. 폴리클로날 항체란, 상이한 클론의 항체 산생 세포가 분비되는 항체 분자의 집단을 말한다. 모노클로날 항체란, 단일 클론의 항체 산생 세포가 분비되는 항체이고, 단, 하나의 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 인식하여, 모노클로날 항체를 구성하는 아미노산 서열(1차 서열)이 균일한 항체를 말한다. 올리고클로날 항체란, 복수의 상이한 모노클로날 항체를 혼합한 항체 분자의 집단을 말한다.
본 발명에 있어서의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 산생되는 항체, 또는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질 전환한 형질 전환체에 의해 산생되는 유전자 재조합 항체를 들 수 있다.
에피토프란, 모노클로날 항체가 인식하고, 결합하는 단일의 아미노산 서열, 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조, 번역 후 수식에 의해 수식된 아미노산 서열 및 해당 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조 등을 들 수 있다.
번역 후 수식에 의해 수식된 아미노산 서열로서는, 당쇄가 OH 치환기를 갖는 Tyr 및 Ser에 결합한 O 결합형 당쇄, NH2 치환기를 갖는 Gln 및 Asn에 결합한 N결합형 당쇄, 그리고 황산 분자가 OH 치환기를 갖는 Tyr 및 Ser에 결합한 황산기 등이 결합한 아미노산 서열을 들 수 있다.
본 발명의 항체가 인간 CCR1의 세포 외 영역에 결합하는 것은, 인간 CCR1 발현 세포에 대한 본 발명의 항체 결합성을, ELISA, 플로우 사이토메트리 및 표면 프라즈몬 공명법 등을 사용하여 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, 공지의 면역학적 검출법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등을 조합하여 확인할 수도 있다.
본 발명의 항체가 결합하는 인간 CCR1의 아미노산 잔기 또는 에피토프는, 인간 CCR1의 일부 도메인을 결실시킨 결손체, 다른 단백질 유래의 도메인과 치환시킨 변이체 및 인간 CCR1의 부분 펩티드 단편 등을 사용하여 항체의 결합 실험을 행함으로써 결정할 수 있다. 또한, 상기 결손체 또는 변이체의 발현 세포를 사용하여 항체의 결합 실험을 행할 수도 있다.
또는, 본 발명의 항체가 결합하는 인간 CCR1의 아미노산 잔기 또는 에피토프는, 단백질 분해 효소에 의해 소화한 인간 CCR1의 펩티드 단편에 본 발명의 항체를 첨가하고, 기지의 질량 분석법을 사용하여 에피토프 매핑을 행함으로써도 결정할 수 있다.
본 발명의 항체가 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 것은, 예를 들어 인간 CCR1 발현 세포 내에서의 CCR1 의존적인 시그널 전달, PLC의 활성화, 세포 내의 칼슘 이온 농도 상승, NF-κB 활성화, 또는 인간 CCR1 발현 세포의 유주 등 적어도 하나를 지표로 하여 확인할 수 있다.
세포의 유주는, 이하에 기재하는 주화성 어세이를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 주화성 어세이 챔버의 상부에 인간 CCR1 발현 세포를, 해당 챔버의 하부에 1) 배지 또는 DPBS 등의 네거티브 컨트롤, 2) 인간 CCL15 및 3) 인간 CCL15와 본 발명의 항체를 각각 첨가하여, 일정 시간 배양한 후에, 해당 챔버 하부에 존재하는 인간 CCR1 발현 세포수를 적당한 방법으로 측정한다. 얻어진 결과에 대하여, 인간 CCL15를 첨가했을 때의 세포수가, 배지를 첨가했을 때의 세포수보다도 증가하는 조건 하에서, 인간 CCL15와 본 발명의 항체를 첨가했을 때의 세포수가, 인간 CCL15를 첨가했을 때의 세포수보다도 감소하고 있으면, 본 발명의 항체는, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해한다고 판정할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체가, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 것은, 인간 CCR1 발현 세포 내에서의 칼슘 이온 농도의 변화를 지표로 하여 확인할 수 있다. 세포 내의 칼슘 이온 농도의 변화는, 공지의 방법으로 측정할 수 있고, 예를 들어 세포 내 Ca 측정 키트(Wako사제) 등을 사용하여, 첨부한 프로토콜에 따라 측정할 수 있다.
확인 방법으로서는, 예를 들어 인간 CCR1 발현 세포에, 1) 배지 또는 DPBS 등의 네거티브 컨트롤, 2) 인간 CCL15 및 3) 인간 CCL15와 본 발명의 항체를 각각 첨가했을 때의 세포 내 칼슘 이온 농도의 변화를, 상기한 방법에 따라 측정한다. 인간 CCL15를 첨가했을 때의 세포 내 칼슘 이온 농도가, 배지를 첨가했을 때의 세포 내 칼슘 이온 농도보다도 증가하는 조건 하에서, 인간 CCL15와 본 발명의 항체를 첨가했을 때의 세포 내 칼슘 이온 농도가, 인간 CCL15를 첨가했을 때의 세포 내 칼슘 이온 농도보다도 감소하고 있으면, 본 발명의 항체는, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해한다고 판정할 수 있다.
항체 분자는 이뮤노글로불린(이하, Ig라고 표기함)이라고도 칭해지고, 인간 항체는, 분자 구조의 차이에 따라, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM의 아이소 타입으로 분류된다. 아미노산 서열의 상동성이 비교적 높은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 총칭하여 IgG라고도 한다.
항체 분자는 중쇄(Heavy chain, 이하 H쇄라고 기재함) 및 경쇄(Light chain, 이하 L쇄라고 기재함)라고 불리는 폴리펩티드로 구성된다. 또한, H쇄는 N말단측으로부터 VH, H쇄정상 영역(CH라고도 표기됨), L쇄는 N말단측으로부터 VL, L쇄 정상 영역(CL이라고도 표기됨)의 각 영역에 의해, 각각 구성된다. CH는 각 서브클래스마다, α, δ, ε, γ 및 μ쇄가 각각 알려져 있다. CH는 또한, N말단측으로부터 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인의 각 도메인에 의해 구성된다. 도메인이란, 항체 분자의 각 폴리펩티드를 구성하는 기능적인 구조 단위를 말한다. 또한, CH2 도메인과 CH3 도메인을 합하여 Fc 영역 또는 단순히 Fc라고 한다. CL은, Cλ쇄 및 Cκ쇄가 알려져 있다.
본 발명에 있어서의 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 Fc 영역은, EU 인덱스 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]에 의해, N말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호로 특정할 수 있다. 구체적으로는, CH1은 EU 인덱스 118 내지 215번의 아미노산 서열, 힌지는 EU 인덱스 216 내지 230번의 아미노산 서열, CH2는 EU 인덱스 231 내지 340번의 아미노산 서열, CH3은 EU 인덱스 341 내지 447번의 아미노산 서열이라고 각각 특정된다.
본 발명의 항체로서는, 특히 유전자 공학적으로 제작된 재조합 마우스 항체, 재조합 래트 항체, 재조합 래빗 항체, 인간형 키메라 항체(이하, 단순히 키메라 항체라고도 약기함), 인간화 항체(인간형 상보성 결정 영역 CDR 이식 항체라고도 함) 및 인간 항체 등의 유전자 재조합 항체도 포함된다. 또한, 본 발명의 항체에는, 상이한 2종류의 항체 유래의 H쇄(또는 VH)와 L쇄(또는 VL)를 재조합하여 제작되는 유전자 재조합 항체(VL 치환 항체라고도 함)도 포함된다. 상이한 2종류의 항체는, 하이브리도마 유래의 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체의 어느 것이어도 된다. 또한 본 발명의 항체로서는, 상술한 유전자 재조합 항체를 제작하는 데 있어서, 적당한 아미노산 잔기 치환을 더한 유전자 재조합 항체도 포함된다.
키메라 항체란, 인간 이외의 동물(비인간 동물)의 항체의 VH 및 VL과, 인간 항체의 CH 및 CL을 포함하는 항체를 의미한다. 비인간 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗 등, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하면, 어느 것이든 사용할 수 있다.
하이브리도마란, 비인간 동물에 항원을 면역하여 취득된 B 세포와, 마우스 등에 유래하는 미엘로마 세포를 세포 융합시켜 얻어지는, 원하는 항원 특이성을 가진 모노클로날 항체를 산생하는 세포를 말한다. 따라서, 하이브리도마가 산생되는 항체를 구성하는 가변 영역은, 비인간 동물 항체의 아미노산 서열을 포함한다.
인간형 키메라 항체는, 모노클로날 항체를 생산하는 비인간 동물 세포 유래의 하이브리도마로부터, 해당 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 취득하여, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포로 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서의 키메라 항체 개변체는, 어느 키메라 항체의 VL을, 별도의 키메라 항체의 VL과 치환한 항체(VL 치환 키메라 항체라고도 함), 및/또는 해당 항체의 VL 또는 VH의 1 또는 복수의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 항체를 말한다.
키메라 항체 개변체는, 어느 모노클로날 항체를 생산하는 비인간 동물 세포 유래의 하이브리도마로부터, 해당 모노클로날 항체의 VH를 코드하는 cDNA를 취득하고, 별도의 모노클로날 항체를 생산하는 비인간 동물 세포 유래의 하이브리도마로부터, 해당 모노클로날 항체의 VL을 코드하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하고, 상이한 하이브리도마 클론 유래의 VH 및 VL을 조합한 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다. 또한, 키메라 항체 또는 VL 치환 키메라 항체의 VH 또는 VL의 아미노산에 대하여, 1 또는 복수의 아미노산 잔기를, 하이브리도마로부터 얻어진 것과는 별도의 아미노산 잔기로 치환한 DNA를 제작하여, 해당 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 이 벡터를 사용하여 마찬가지로 발현시키고, 제조할 수 있는 항체에 대해서도, 키메라 항체 개변체라고 칭한다.
인간화 항체란, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL이 대응하는 CDR로 이식한 항체를 말한다. VH 및 VL의 CDR 이외의 영역은 프레임워크 영역(이하, FR로 표기함)이라고 칭해진다.
인간화 항체는, 비인간 동물 항체의 VH의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA와, 비인간 동물 항체의 VL의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포로 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
인간 항체는, 원래, 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 항체는, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 유지하는 마우스(Tomizuka K. et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 722-7, 2000)에 원하는 항원을 면역함으로써, 취득할 수 있다. 또한, 인간 유래의 B 세포로부터 항체 유전자를 증폭시킨 phage display(파지 디스플레이) 라이브러리를 사용함으로써, 원하는 결합 활성을 갖는 인간 항체를 선택함으로써, 면역을 행하지 않고 인간 항체를 취득할 수 있다(Winter G. et. al., Annu Rev Immunol. 12:433-55. 1994). 또한, EB 바이러스를 사용하여 인간 B 세포를 불사화함으로써, 원하는 결합 활성을 갖는 인간 항체를 생산하는 세포를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다(Rosen A. et. al., Nature 267, 52-54. 1977).
인간 체내에 존재하는 항체는, 예를 들어 인간 말초혈로부터 단리된 림프구를, EB 바이러스 등을 감염시킴으로써 불사화한 후, 클로닝함으로써, 해당 항체를 산생하는 림프구를 얻을 수 있고, 해당 림프구를 배양한 배양물 중으로부터 해당 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 표면에 발현시킨 파지의 라이브러리이다. 해당 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 해당 항체 단편은, 또한 유전자 공학적 방법에 의해, 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄를 포함하는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 산생 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 숙주 동물의 염색체 내에 내장된 동물을 말한다. 구체적으로는, 마우스 ES 세포로 인간 항체 유전자를 도입하고, 해당 ES 세포를 다른 마우스의 초기배로 이식 후, 발생시킴으로써 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물을 제작할 수 있다. 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법은, 통상의 인간 이외의 포유 동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법에 의해 인간 항체 산생 하이브리도마를 취득하여, 배양함으로써 배양물 중에 인간 항체를 산생 축적시킬 수 있다.
본 발명의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열 또는 비인간 동물 항체의 CDR을, 임의의 인간 항체의 프레임워크로 이식한 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 어느 것이어도 된다.
본 발명의 항체에 있어서의 CL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 아미노산 서열 또는 비인간 동물 항체의 아미노산 서열의 어느 것이어도 되지만, 인간 항체의 아미노산 서열 Cκ 또는 Cλ가 바람직하다.
본 발명의 항체의 CH로서는, 이뮤노글로불린에 속하면 어떤 것이어도 되지만, 바람직하게는 IgG 클래스에 속하는 서브클래스, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3) 및 γ4(IgG4) 모두 사용할 수 있다.
본 발명의 항체로서는, Fc와 항체 단편이 결합한 Fc 융합 단백질, Fc와 천연으로 존재하는 리간드 또는 수용체가 결합한 Fc 융합 단백질(이뮤노아드헤신이라고도 함), 복수의 Fc 영역을 융합시킨 Fc 융합 단백질 등도 본 발명에 포함된다. 또한, 항체를 안정화시키기 위해 및 혈중 반감기를 제어하기 위해, 아미노산 잔기를 개변한 Fc 영역 등도 본 발명의 항체에 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편은, 번역 후 수식된 어떤 아미노산 잔기를 포함하는 항체도 포함한다. 번역 후 수식으로서는, 예를 들어 H쇄의 C말단에 있어서의 리신 잔기의 결실[리신·클리핑(lysine clipping)] 또는 폴리펩티드의 N말단에 있어서의 글루타민 잔기의 피로글루타민(pyroGlu)으로의 변환 등을 들 수 있다[Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736(2013)].
본 발명에 있어서, 항체 단편이란, 인간 CCR1의 세포 외 영역에 결합하여, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 본 발명에 있어서 항체 단편으로서는, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, diabody, dsFv 또는 복수의 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다. Fab는, IgG 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기에 의해 절단됨), H쇄의 N말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디술피드 결합(S-S 결합)으로 결합한, 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
F(ab')2는, IgG를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기에 의해 절단됨), Fab가 힌지 영역의 S-S 결합을 통해 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. Fab'은, 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 S-S 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
scFv는, 1개의 VH와 1개의 VL을 4개의 Gly 및 1개의 Ser 잔기를 포함하는 링커(G4S)를 임의의 개수 연결시킨 링커 펩티드 등의 적당한 펩티드 링커(P)를 사용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드에서, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Diabody는, 항원 결합 특이성이 동일하거나 또는 상이한 scFv가 이량체를 형성한 항체 단편이고, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 상이한 항원에 대한 특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
dsFv는, VH 및 VL 중 각각 1아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 해당 시스테인 잔기 사이의 S-S 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다.
CDR을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는, CDR끼리를 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킬 수 있다. 본 발명의 개변 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코드하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물로 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩티드는, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 모노클로날 항체에는, 본 발명의 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 방사성 동위 원소, 저분자의 약제, 고분자의 약제, 단백질 또는 항체 의약 등을 화학적 또는 유전자 공학적으로 결합시킨 항체의 유도체를 포함한다.
항체의 유도체는, 본 발명의 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 H쇄 혹은 L쇄의 N말단측, C말단측, 항체 분자 중의 적당한 치환기 또는 측쇄 혹은 당쇄 등에, 방사성 동위 원소, 저분자의 약제, 고분자의 약제, 면역 부활제, 단백질, 항체 의약 또는 핵산 의약 등을 화학적 방법[항체 공학 입문, 지인서관(1994)]에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 코드하는 DNA와, 결합시키고 싶은 단백질 또는 항체 의약을 코드하는 DNA를 연결시켜 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 적당한 숙주 세포로 도입하여, 발현시키는 유전자 공학적 방법으로부터 제조할 수 있다.
방사성 동위 원소로서는, 예를 들어 111In, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu 또는 211At 등을 들 수 있다. 방사성 동위 원소는, 클로라민T법 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 방사성 동위 원소를 킬레이트하는 물질을 항체에 결합시켜도 된다. 킬레이트제로서는, 예를 들어 1-이소티오시아네이트벤질-3-메틸디에틸렌트리아민펜타아세트산(MX-DTPA) 등을 들 수 있다.
저분자의 약제로서는, 예를 들어 알킬화제, 니트로소우레아제, 대사 길항제, 항생 물질, 식물 알칼로이드, 토포이소메라아제 저해제, 호르몬 요법제, 호르몬 길항제, 아로마타아제 저해제, P당 단백 저해제, 백금 착체 유도체, M기 저해제 혹은 키나아제 저해제 등의 항암제[임상 종양학, 암과 화학 요법사(1996)], 하이드로코르티손 혹은 프레드니손 등의 스테로이드제, 아스피린 혹은 인도메타신 등의 비스테로이드제, 금 티오말레이트 혹은 페니실라민 등의 면역 조절제, 사이클로포스파미드 혹은 아자티오프린 등의 면역 제어제 또는 말레산클로르페니라민 혹은 클레마스틴과 같은 항히스타민제 등의 항염증제[염증과 항염증 요법, 이시야쿠 출판 가부시키가이샤(1982)] 등을 들 수 있다.
항암제로서는, 예를 들어 아미포스틴(에티올), 시스플라틴, 다카르바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민(질소머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 겜시타빈(겜자르), 다우노루비신, 프로카르바진, 마이토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 다우노마이신, 페플로마이신, 에스트라무스틴, 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소텔), 알데스류킨, 아스파라기나아제, 부술판, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 클라드리빈, 캄토테신, 10-히드록시-7-에틸-캄토테신(SN38), 플록스우리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸(CPT-11), 노기테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 히드록시카르바미드, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 타목시펜, 고세렐린, 류플로레닌, 플루타미드, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실머스타드, 비노렐빈, 클로람부실, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸 프레드니솔론, 빈데신, 니무스틴, 세무스틴, 카페시타빈, 토뮤덱스, 아자시티딘, UFT, 옥살로플라틴, 게피티닙(이렛사), 이마티닙(STI571), 에를로티닙, FMS-like tyrosine kinase 3(FMS 유사 티로신 키나아제 3)(Flt3) 저해제, vascular endothelial growth factor receptor(혈관 내피 성장 인자 수용체)(VEGFR) 저해제, fibroblast growth factor receptor(섬유 아세포 성장 인자 수용체)(FGFR) 저해제, 이렛사 혹은 타세바 등의 epidermal growth factor receptor(표피 성장 인자 수용체)(EGFR) 저해제, 라디시콜, 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신, 라파마이신, 암사크린, 올-트랜스레티노산, 탈리도마이드, 레날리드마이드, 아나스트로졸, 파드로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 금 티오말레이트, D-페니실라민, 부실라민, 아자티오프린, 미조리빈, 시클로스포린, 라파마이신, 히드로코르티손, 벡사로텐(타그레틴), 타목시펜, 덱사메타손, 프로게스틴류, 에스트로겐류, 아나스트로졸(아리미덱스), 류프린, 아스피린, 인도메타신, 셀레콕시브, 페니실라민, 금 티오말레이트, 말레산 클로르페니라민, 클로르페니라민, 클레마스틴, 트레티노인, 벡사로텐, 비소, 보르테조밉, 알로푸리놀, 칼리케아마이신, 이브리투모맙티욱세탄, 타르그레틴, 오조가민, 클래리스로마이신, 류코보린, 케토코나졸, 아미노글루테티미드, 수라민 또는 메이탄시노이도 혹은 그의 유도체 등을 들 수 있다.
저분자의 약제와 항체를 결합시키는 방법으로서는, 예를 들어, 글루타르알데히드를 통해 약제와 항체의 아미노기 사이를 결합시키는 방법 또는 수용성 카르보디이미드를 통해 약제의 아미노기와 항체의 카르복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
고분자의 약제로서는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG라고 표기함), 알부민, 덱스트란, 폴리옥시에틸렌, 스티렌말레산코폴리머, 폴리비닐피롤리돈, 피란코폴리머, 또는 히드록시프로필메타크릴아미드 등을 들 수 있다. 이들 고분자 화합물을 항체 또는 그 항체 단편에 결합시킴으로써, (1) 화학적, 물리적 혹은 생물적인 다양한 인자에 대한 안정성의 향상, (2) 혈중 반감기의 현저한 연장, 또는 (3) 면역원성의 소실 혹은 항체 산생의 억제 등의 효과가 기대된다[바이오 콘쥬게이트 의약품, 히로카와 쇼텐(1993)].
예를 들어, PEG와 항체를 결합시키는 방법으로서는, PEG화 수식 시약과 반응시키는 방법 등을 들 수 있다[바이오 콘쥬게이트 의약품, 히로카와 쇼텐(1993)]. PEG화 수식 시약으로서는, 리신의 ε-아미노기로의 수식제(일본 특허 공개 소61-178926호 공보), 아스파르트산 및 글루탐산의 카르복실기로의 수식제(일본 특허 공개 소56-23587호 공보), 또는 아르기닌의 구아니디노기로의 수식제(일본 특허 공개 평2-117920호 공보) 등을 들 수 있다.
면역 부활제로서는, 이뮤노 아쥬반트로서 알려져 있는 천연물이어도 되고, 구체예로서는, 면역을 항진하는 약제가, β(1→3)글루칸(예를 들어, 렌티난 또는 시조피란) 또는 α갈락토실세라마이드(KRN7000) 등을 들 수 있다.
단백질로서는, 예를 들어 NK 세포, 마크로파지 또는 호중구 등의 면역 담당 세포를 활성화하는 사이토카인 혹은 증식 인자 또는 독소 단백질 등을 들 수 있다.
사이토카인 또는 증식 인자로서는, 예를 들어 인터페론(이하, IFN이라고 기재함)-α, IFN-β, IFN-γ, 인터류킨(이하, IL이라고 기재함)-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 등을 들 수 있다. 독소 단백질로서는, 예를 들어 리신, 디프테리아 독소 또는 ONTAK 등을 들 수 있고, 독성을 조절하기 위해 단백질에 변이를 도입한 단백 독소도 포함된다.
항체 의약으로서는, 예를 들어 항체의 결합에 의해 아포토시스가 유도되는 항원, 종양의 병태 형성에 관계되는 항원, 면역 기능을 조절하는 항원 또는 병변 부위의 혈관 신생에 관여하는 항원에 대한 항체를 들 수 있다.
항체의 결합에 의해 아포토시스가 유도되는 항원으로서는, 예를 들어 cluster of differentiation(분화 클러스터)(이하, CD라고 기재함)19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86(B7.2), human leukocyte antigen(인간 백혈구 항원)(HLA)-Class II 또는 Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR) 등을 들 수 있다.
종양의 병태 형성에 관계되는 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항체의 항원으로서는, 예를 들어 CD4, CD40, CD40 리간드, B7 패밀리 분자(예를 들어, CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3 또는 B7-H4), B7 패밀리 분자의 리간드(예를 들어, CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 또는 BTLA), OX-40, OX-40 리간드, CD137, tumor necrosis factor(종양 괴사 인자)(TNF) 수용체 패밀리 분자(예를 들어, DR4, DR5, TNFR1 또는 TNFR2), TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor(TNF 관련 세포 자멸사 유발 리간드 수용체)(THRAIL) 패밀리 분자, TRAIL 패밀리 분자의 수용체 패밀리(예를 들어, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 또는 TRAIL-R4), receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 액티베이터)(RANK), RANK 리간드, CD25, 엽산 수용체, 사이토카인[예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, transforming growth factor(종양 증식 인자)(TGF)β 또는 TNFα 등] 혹은 이들 사이토카인의 수용체, 또는 케모카인(예를 들어, SLC, ELC, I-309, TARC, MDC 또는 CTACK 등) 혹은 이들 케모카인의 수용체를 들 수 있다.
병변 부위의 혈관 신생을 저해하는 항체의 항원으로서는, 예를 들어 vascular endothelial growth factor(혈관 내피 성장 인자)(VEGF), angiopoietin(앙기오포이에틴), fibroblast growth factor(섬유 아세포 성장 인자)(FGF), EGF, hepatocyte growth factor(간세포 성장 인자)(HGF), platelet-derived growth factor(혈소판 유래 성장 인자)(PDGF), insulin-like growth factor(인슐린 유사 성장 인자)(IGF), erythropoietin(에리스로포이에틴)(EPO), TGFβ, IL-8, ephrin 또는 SDF-1 혹은 이들의 수용체 등을 들 수 있다.
단백질 또는 항체 의약과의 융합 항체는, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코드하는 cDNA에 단백질 또는 항체 의약에 포함되는 항체를 코드하는 cDNA를 연결시켜, 융합 항체를 코드하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵 생물 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물로 도입함으로써 발현시켜, 융합 항체를 제조할 수 있다.
핵산 의약으로서는, 예를 들어 유전자의 기능을 제어함으로써 생체에 작용하는 small interference ribonucleic acid(작은 간섭 리보핵산)(siRNA) 또는 microRNA 등의 핵산을 포함하는 의약품을 들 수 있다. 예를 들어, Th17 세포의 마스터 전사 인자 RORγt를 억제하는 핵산 의약과의 콘쥬게이트가 생각된다.
본 발명의 항체의 유도체를 인간 CCR1의 검출 및 측정 및 인간 CCR1 관련 질환의 진단에 사용하는 경우에, 당해 항체에 결합하는 약제로서는, 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에서 사용되는 표지체를 들 수 있다. 표지체로서는, 예를 들어 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제 혹은 루시페라아제 등의 효소, 아크리디늄에스테르 혹은 로핀 등의 발광 물질, 또는 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC) 혹은 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은, 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명은, 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 인간 CCR1 관련 질환의 치료약에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 인간 CCR1 관련 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
인간 CCR1 관련 질환으로서는, 인간 CCR1 또는 인간 CCR1의 리간드가 관여하는 질환이라면 어떤 것이어도 되고, 예를 들어 암, 자기 면역 질환 및 염증성 질환을 들 수 있다. 암 질환으로서는, 예를 들어 미만성 대세포형 B 세포성 림프종, 여포성 림프종, B세포 임파종, T세포 임파종, 형질 세포성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 유모 세포 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 여포 변연대 림프종, 소림프 구성 림프종, 다발성 골수종, 간세포암, 결장 직장암, 비소 세포 폐암, 구강 편평 상피암, 난소암, 전립선암, 유방암, 신경 교종 또는 골육종 등을 들 수 있다. 자기 면역 질환 또는 염증성 질환으로서는, 예를 들어 관절 류머티즘, 다발성 경화증, 만성 폐색 폐질환, 전신성 에리테마토데스, 르프스 신장염, 천식, 아토피성 피부염, 염증성 대장염, 크론병 또는 베체트병 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 해당 항체 또는 해당 항체 단편만을 포함하는 것이어도 되지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에 있어서 공지의 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는, 치료 시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 혹은 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥 내 투여를 들 수 있다. 투여 형태로서는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
투여량 또는 투여 횟수는, 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령 및 체중 등에 의해 상이하지만, 통상 성인 1일당 10μg/kg 내지 10mg/kg이다.
본 발명은 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 함유하는, CCR1의 검출 혹은 측정용 시약, 또는 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 CCR1의 검출 혹은 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서 인간 CCR1을 검출 또는 측정하는 방법으로서는, 임의의 공지의 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 면역학적 검출 또는 측정 방법 등을 들 수 있다.
면역학적 검출 또는 측정 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 사용하여, 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 면역학적 검출 또는 측정 방법으로서는, 예를 들어, 방사성 물질 표지 면역 항체법(RIA), 효소 면역 측정법(EIA 또는 ELISA), 형광 면역 측정법(FIA), 발광 면역 측정법(luminescent immunoassay), 웨스턴 블로트 법 또는 물리 화학적 방법 등을 들 수 있다.
본 발명은 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는, CCR1 관련 질환의 진단약, 또는 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여 CCR1의 검출 또는 측정을 하는 것을 포함하는, CCR1 관련 질환의 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 상기한 방법에 따라 인간 CCR1이 발현한 세포를 검출 또는 측정함으로써, 인간 CCR1이 관련되는 질환을 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서 인간 CCR1을 검출 또는 측정하는 대상으로 되는 생체 시료로서는, 예를 들어 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 췌액, 소변, 분변, 조직액 또는 배양액 등, 인간 CCR1 또는 인간 CCR1이 발현되어 있는 세포를 포함할 가능성이 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 함유하는 진단약은, 목적의 진단법에 따라, 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약, 해당 반응의 검출용 시약을 포함해도 된다. 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약으로서는, 완충제, 염 등을 들 수 있다. 검출용 시약으로서는, 해당 모노클로날 항체 혹은 그 항체 단편을 인식하는 표지된 이차 항체, 또는 표지에 대응한 기질 등의 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에 사용되는 시약을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 CCR1 관련 질환의 치료약 혹은 진단약의 제조를 위한, 항인간 CCR1 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 사용에 관한 것이다.
이하에, 본 발명의 항체 제조 방법, 질환의 치료 방법, 및 질환의 진단 방법에 대하여, 구체적으로 설명한다.
1. 항체의 제조 방법
(1) 항원의 조제
항원이 되는 인간 CCR1 또는 인간 CCR1 발현 세포는, 인간 CCR1 전체 길이 또는 그 부분 길이를 코드하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를, 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입함으로써 얻을 수 있다. 또한, 인간 CCR1은, 인간 CCR1을 다량으로 발현하고 있는 각종 인간 세포주, 인간 세포 및 인간 조직 등으로부터 인간 CCR1을 정제함으로써도 얻을 수 있다. 또한, 이들 인간 세포주, 인간 세포 및 인간 조직 등을 그대로 항원으로서 사용할 수도 있다. 또한, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 인간 CCR1의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드를 조제하여, 항원에 사용할 수도 있다. 인간 CCR1 또는 인간 CCR1의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드에는, C말단 또는 N말단에 FLAG 또는 His 등의 공지된 태그가 부가되어 있어도 된다.
본 발명에서 사용되는 인간 CCR1은, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)나 Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997) 등에 기재된 방법 등을 사용하여, 예를 들어 이하의 방법에 의해, 해당 인간 CCR1을 코드하는 DNA를 숙주 세포 중에서 발현시켜, 제조할 수 있다.
먼저, 인간 CCR1을 코드하는 부분을 포함하는 완전 길이 cDNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다. 상기 완전 길이 cDNA 대신에, 완전 길이 cDNA를 바탕으로 하여 조제된, 폴리펩티드를 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 사용해도 된다. 이어서, 얻어진 해당 재조합 벡터를, 해당 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 폴리펩티드를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포에 있어서의 자율 복제 또는 염색체 중으로의 내장이 가능하고, 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에, 적당한 프로모터를 함유하고 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 숙주 세포로서는, 대장균 등의 에스케리키아속 등에 속하는 미생물, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다.
대장균 등의 원핵 생물을 숙주 세포로서 사용하는 경우, 재조합 벡터는, 원핵 생물 중에서 자율 복제가 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 인간 CCR1을 코드하는 부분을 포함하는 DNA, 및 전사 종결 서열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 해당 재조합 벡터에는, 전사 종결 서열은 반드시 필요하지 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 해당 재조합 벡터에는, 프로모터를 제어하는 유전자를 포함하고 있어도 된다.
해당 재조합 벡터로서는, 리보솜 결합 서열인 샤인ㆍ달가노 서열(SD 서열이라고도 함)과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예를 들어, 6 내지 18염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 해당 인간 CCR1을 코드하는 DNA의 염기 서열로서는, 숙주 내에서의 발현에 최적인 코돈으로 되도록 염기를 치환할 수 있고, 이에 의해 목적으로 하는 인간 CCR1의 생산율을 향상시킬 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, pBTrp2, pBTac1, pBTac2(이상, 로슈·다이아그노스틱사제), pKK233-2(파르마시아사제), pSE280(인비트로젠사제), pGEMEX-1(프로메가사제), pQE-8(퀴아젠사제), pKYP10(일본 특허 공개 소58-110600호 공보), pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669(1984)], pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], pBluescript II SK(-)(스트라타진사제), pTrs30[대장균 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로 조제], pTrs32[대장균 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로 조제], pGHA2[대장균 IGHA2(FERM BP-400)로 조제, 일본 특허 공개 소60-221091호 공보], pGKA2[대장균 IGKA2(FERM BP-6798)로 조제, 일본 특허 공개 소60-221091호 공보], pTerm2(미국 특허 제4,686,191호 명세서, 미국 특허 제4,939,094호 명세서, 미국 특허 제160,735호 명세서), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392(1990)], pGEX(파르마시아사제), pET시스템(노바젠사제) 또는 pME18SFL3 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이라면 어떤 것이어도 된다. 예를 들어, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 또는 T7 프로모터 등의, 대장균 또는 파지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한, 예를 들어 Ptrp을 2개 직렬시킨 탠덤 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터 또는 letI 프로모터 등의 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서는, 예를 들어 대장균 XL1-Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No.49, 대장균 W3110, 대장균 NY49 또는 대장균 DH5α 등을 들 수 있다.
숙주 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 사용하는 숙주 세포로 DNA를 도입하는 방법이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, 칼슘 이온을 사용하는 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972), Gene, 17, 107(1982), Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)]을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 발현 벡터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, pcDNAI, pCDM8(후나코시사제), pAGE107[일본 특허 공개 평3-22979호 공보; Cytotechnology, 3, 133(1990)], pAS3-3(일본 특허 공개 평2-227075호 공보), pCDM8[Nature, 329, 840(1987)], pcDNAI/Amp(인비트로젠사제), pcDNA3.1(인비트로젠사제), pREP4(인비트로젠사제), pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307(1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호), N5KG1val(미국 특허 제6,001,358호 명세서), INPEP4(Biogen-IDEC사제) 및 트랜스포존 벡터(국제 공개 제2010/143698호) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV)의 immediate early(전초기)(IE) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로치오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터 또는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 프로모터 혹은 인핸서를 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
숙주 세포로서는, 예를 들어 인간 백혈병 세포 Namalwa 세포, 원숭이 세포 COS 세포, 차이니즈·햄스터 난소 세포 CHO 세포[Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968); Genetics, 55, 513(1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115(1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275(1968); Cell, 6, 121(1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II(pp. 883-900)], 디히드로 엽산 환원 효소 유전자(이하, dhfr이라고 표기함)가 결손된 CHO 세포(CHO/DG44 세포) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)], CHO-K1(ATCC CCL-61), DUkXB11(ATCC CCL-9096), Pro-5(ATCC CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat#11619), Pro-3, 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL. P2. G11.16Ag. 20(또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NSO, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14, 시리안 햄스터 세포 BHK 또는 HBT5637(일본 특허 공개 소63-000299호 공보) 등을 들 수 있다.
숙주 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, 일렉트로포레이션법[Cytotechnology, 3, 133(1990)], 인산칼슘법(일본 특허 공개 평2-227075호 공보) 또는 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 인간 CCR1을 코드하는 DNA를 내장한 재조합 벡터를 보유하는 미생물 또는 동물 세포 등의 유래의 형질 전환체를 배지 중에서 배양하고, 배양액 중에 해당 인간 CCR1을 생성 축적시켜, 해당 배양액으로부터 채취함으로써, 인간 CCR1을 제조할 수 있다. 해당 형질 전환체를 배지 중에서 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 행할 수 있다.
진핵 생물 유래의 세포에서 발현시킨 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 인간 CCR1을 얻을 수 있다.
유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터에 의해 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터에 의해 형질 전환한 미생물을 배양하는 경우에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터에 의해 형질 전환한 미생물을 배양하는 경우에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.
동물 세포를 숙주로서 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 예를 들어 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)], Eagle의 MEM 배지[Science, 122, 501(1952)], 둘베코 개변 MEM 배지[Virology, 8, 396(1959)], 199 배지[Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)] 혹은 Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) 배지 또는 이들 배지에 소태아 혈청(FBS) 등을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은, 통상 pH6 내지 8, 30 내지 40℃, 5% CO2 존재 하 등의 조건 하에서 1 내지 7일간 행한다. 또한, 배양 중에 필요에 따라, 카나마이신 또는 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
인간 CCR1을 코드하는 유전자의 발현 방법으로서는, 예를 들어, 직접 발현 이외에, 분비 생산 또는 융합 단백질 발현 등의 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]을 들 수 있다.
인간 CCR1의 생산 방법으로서는, 예를 들어, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 외에 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법을 들 수 있고, 사용하는 숙주 세포 또는 생산시키는 인간 CCR1의 구조를 바꿈으로써, 적절한 방법을 선택할 수 있다.
인간 CCR1이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법[J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)], 일본 특허 공개 평05-336963호 공보 또는 국제 공개 제94/23021호 등에 기재된 방법을 사용함으로써, 인간 CCR1을 숙주 세포 외에 적극적으로 분비시킬 수 있다. 또한, 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계(일본 특허 공개 평2-227075호 공보)를 이용하여 인간 CCR1의 생산량을 상승시킬 수도 있다.
얻어진 인간 CCR1은, 예를 들어 이하와 같이 하여 단리, 정제할 수 있다. 인간 CCR1이 세포 내에 용해 상태로 발현된 경우에는, 배양 종료 후에 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤 가우린 호모지나이저 또는 다이노 밀 등을 사용하여 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 해당 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 단백질의 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 유안 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미쯔비시 가가쿠사제) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(파르마시아사제) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토그래피 포커싱법, 또는 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 방법을 단독 또는 조합하여 사용하여, 정제 표품을 얻을 수 있다.
인간 CCR1이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현된 경우는, 상기와 마찬가지로 세포를 회수 후 파쇄하고, 원심 분리를 행함으로써, 침전 분획으로서 해당 인간 CCR1의 불용체를 회수한다. 회수한 해당 인간 CCR1의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 해당 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 해당 인간 CCR1을 정상적인 입체 구조로 복귀시킨 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 폴리펩티드의 정제 표품을 얻을 수 있다.
인간 CCR1 또는 그 당 수식체 등의 유도체가 세포 밖으로 분비된 경우에는, 배양 상청에 있어서 해당 인간 CCR1 또는 그 당 수식체 등의 유도체를 회수할 수 있다. 해당 배양물을 상기와 마찬가지로 원심 분리 등의 방법에 의해 처리함으로써 가용성 분획을 취득하고, 해당 가용성 분획으로부터, 상기와 동일한 단리 정제법을 사용함으로써, 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 사용되는 인간 CCR1은, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스트 켐테크사제, 퍼킨·엘머사제, 파르마시아사제, 프로테인테크노로지 인스트루먼트사제, 신디사이저 셀-베가사제, 퍼셉티브사제 또는 시마즈 세이사쿠쇼사제 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
(2) 동물의 면역과 융합용 항체 산생 세포의 조제
3 내지 20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터 등의 동물에, (1)에서 얻어지는 항원을 면역하고, 그 동물의 비장, 림프절, 말초혈 중의 항체 산생 세포를 채취한다. 또한, 마우스 CCR1 넉아웃 마우스를 피면역 동물로서 사용할 수도 있다.
면역은, 동물의 피하, 정맥 내 또는 복강 내에, 예를 들어 프로인드의 완전 아쥬반트 또는 수산화알루미늄 겔과 백일해균 백신 등의 적당한 아쥬반트와 함께 항원을 투여함으로써 행한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는, BSA(소혈청 알부민) 또는 KLH[Keyhole Limpet hemocyanin(키홀 림펫 헤모사이아닌)] 등의 캐리어 단백질과 콘쥬게이트를 제작하고, 이것을 면역원으로서 사용한다.
항원의 투여는, 1회째의 투여 후, 1 내지 2주일 간격으로 5 내지 10회 행한다. 각 투여 후 3 내지 7일째에 안저 정맥총으로부터 채혈하고, 그 혈청의 항체값을 효소 면역 측정법[Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 사용하여 측정한다. 면역에 사용한 항원에 대하여, 그 혈청이 충분한 항체값을 나타낸 동물을 융합용 항체 산생 세포의 공급원으로 한다.
항원의 최종 투여 후 3 내지 7일째에, 면역된 동물로부터 비장 등의 항체 산생 세포를 포함하는 조직을 적출하여, 항체 산생 세포를 채취한다. 비장 세포를 사용하는 경우에는, 비장을 세단, 푼 후, 원심 분리하고, 또한 적혈구를 제거하여 융합용 항체 산생 세포를 취득한다.
(3) 골수종 세포의 조제
골수종 세포로서는, 마우스로부터 얻어진 주화 세포를 사용하여, 예를 들어 8-아자 구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1(1978)], P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6, 511(1976)], SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269(1978)], P3-X63-Ag8653(653) [J. Immunology, 123, 1548(1979)] 또는 P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495(1975)] 등이 사용된다.
해당 골수종 세포는, 정상 배지(글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타마이신, FBS, 및 8-아자 구아닌을 첨가한 RPMI1640 배지)에서 계대하고, 세포 융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지에 계대하여, 융합 당일 2×107개 이상의 세포수를 확보한다.
(4) 세포 융합과 모노클로날 항체 산생 하이브리도마의 조제
(2)에서 얻어지는 융합용 항체 산생 세포와 (3)에서 얻어지는 골수종 세포를 Minimum Essential Medium(MEM) 배지 또는 PBS(인산이나트륨 1.83g, 인산-칼륨 0.21g, 식염 7.65g, 증류수 1리터, pH7.2)로 잘 세정하여, 세포수가, 융합용 항체 산생 세포:골수종 세포=5 내지 10:1로 되도록 혼합하고, 원심 분리한 후, 상청을 제외한다. 침전한 세포군을 잘 푼 후, 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000), MEM 배지 및 디메틸술폭시드의 혼합액을 37℃에서, 교반하면서 첨가한다. 또한 1 내지 2분간마다 MEM 배지 1 내지 2mL를 수회 더한 후, MEM 배지를 더하여 전량이 50mL로 되도록 한다. 원심 분리 후, 상청을 제외한다. 침전한 세포군을 부드럽게 푼 후, 융합용 항체 산생 세포에 HAT 배지[히포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린을 더한 정상 배지] 중에 부드럽게 세포를 현탁한다. 이 현탁액을 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 7 내지 14일간 배양한다.
배양 후, 배양 상청의 일부를 발취하고, 후술하는 바인딩 어세이 등의 하이브리도마의 선택 방법에 의해, 인간 CCR1을 포함하는 항원에 반응하고, 인간 CCR1을 포함하지 않는 항원에 반응하지 않는 세포군을 선택한다. 이어서, 한계 희석법에 의해 클로닝을 행하고, 안정적이고 강한 항체값이 인정된 것을 모노클로날 항체 산생 하이브리도마로서 선택한다.
(5) 정제 모노클로날 항체의 조제
프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(Pristane)0.5mL를 복강 내 투여하여, 2주일 사육한다]한 8 내지 10주령의 마우스 또는 누드 마우스에, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 복강 내에 주사한다. 10 내지 21일에 하이브리도마는 복수암화한다. 이 마우스로부터 복수를 채취하고, 원심 분리하여 고형분을 제거 후, 40 내지 50% 황산암모늄으로 염석하여, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로스 칼럼, 단백질A-칼럼 또는 겔 여과 칼럼에 의한 정제를 행하고, IgG 또는 IgM 분획을 모아, 정제 모노클로날 항체로 한다.
또한, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를, 10% FBS를 첨가한 RPMI1640 배지 등에서 배양한 후, 원심 분리에 의해 상청을 제외하고, Hybridoma SFM 배지에 현탁하여, 3 내지 7일간 배양한다. 얻어진 세포 현탁액을 원심 분리하고, 얻어진 상청으로부터 단백질 A-칼럼 또는 단백질 G-칼럼에 의한 정제를 행하고, IgG 분획을 모아, 정제 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다. 또한, Hybridoma SFM 배지에는 5% 다이고 GF21을 첨가할 수도 있다.
항체의 서브클래스의 결정은, 서브클래스 타이핑 키트를 사용하여 효소 면역 측정법에 의해 행한다. 단백질량의 정량은, 로리법 또는 280nm에서의 흡광도로부터 산출한다.
(6) 모노클로날 항체의 선택
모노클로날 항체의 선택은 이하에 기재한 바와 같이, 플로우 사이토메트리를 사용하여, 인간 CCR1 발현 세포로의 항체의 결합성을 측정하는 것 등에 의해 행한다. 인간 CCR1 발현 세포는, 세포 표면 상에 인간 CCR1이 발현되어 있으면 어느 세포여도 되고, 예를 들어 인간 세포, 인간 세포주 및 (1)에서 얻어지는 인간 CCR1 강제 발현 세포주 등을 들 수 있다.
인간 CCR1 발현 세포를 96웰 플레이트 등의 플레이트에 분주한 후, 제1 항체로서 혈청, 하이브리도마의 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 분주하여, 반응시킨다. 반응 후의 세포를 1 내지 10% bovine serum albumin(소혈청 알부민)(BSA)을 포함하는 PBS(이하, BSA-PBS라고 기재함) 등으로, 잘 세정한 후, 제2 항체로서 형광 시약 등으로 표지한 항 이뮤노글로불린 항체를 분주하여 반응시킨다. BSA-PBS 등으로 잘 세정한 후, 플로우 사이토미터를 사용하여 표지화 항체의 형광량을 측정함으로써, 인간 CCR1 발현 세포에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 선택한다.
또한, 본 발명의 항체와 경합하여 인간 CCR1에 결합하는 항체는, 상술한 플로우 사이토메트리를 사용한 측정계에, 피검 항체를 첨가하여 반응시킴으로써 취득할 수 있다. 즉, 피검 항체를 첨가했을 때에 본 발명의 항체와 인간 CCR1의 결합이 저해되는 항체를 스크리닝함으로써, 인간 CCR1의 아미노산 서열, 또는 그 입체 구조로의 결합에 대하여, 본 발명의 항체와 경합하는 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체는, 상술한 스크리닝 방법으로 취득된 항체의 에피토프를 공지의 방법으로 동정하고, 동정한 에피토프를 포함하는 합성 펩티드 또는 에피토프의 입체 구조에 의태시킨 합성 펩티드 등을 제작하고, 면역함으로써 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 CCR1에 결합하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프와, 동일한 에피토프에 결합하는 항체는, 상술한 스크리닝 방법으로 취득된 항체의 에피토프를 동정하고, 동정한 에피토프의 부분적인 합성 펩티드, 또는 에피토프의 입체 구조에 의태시킨 합성 펩티드 등을 제작하고, 면역함으로써 취득할 수 있다.
2. 유전자 재조합 항체의 제작
유전자 재조합 항체의 제작예로서, 이하에 인간형 키메라 항체, 인간형 키메라 항체 개변체 및 인간화 항체의 제작 방법을 나타낸다. 유전자 재조합의 마우스 항체, 래트 항체 및 래빗 항체 등도 동일한 방법으로 제작할 수 있다.
(1) 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 구축
유전자 재조합 항체 발현용 벡터는, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA가 내장된 동물 세포용 발현 벡터이고, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체의 γ1서브클래스의 CH 및 κ클래스의 CL 등을 사용한다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA에는, cDNA를 사용하지만, 액슨과 인트론을 포함하는 염색체 DNA를 사용할 수도 있다. 동물 세포용 발현 벡터에는, 인간 항체의 C 영역을 코드하는 유전자를 내장하여 발현할 수 있는 것이라면 어떤 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGE107[Cytotechnol., 3, 133(1990)], pAGE103[J. Biochem., 101, 1307(1987)], pHSG274[Gene, 27, 223(1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981)], pSG1bd2-4[Cytotechnol., 4, 173(1990)] 또는 pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol., 13, 79(1993)] 등을 사용한다. 동물 세포용 발현 벡터 중 프로모터와 인핸서에는, SV40의 초기 프로모터[J. Biochem., 101, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)] 또는 면역 글로불린 H쇄의 프로모터[Cell, 41, 479(1985)]와 인핸서[Cell, 33, 717(1983)] 등을 들 수 있다.
유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, 유전자 재조합 항체 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물 세포로의 도입의 용이함, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형된 것 등의 점에서, 항체 H쇄 및 L쇄가 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤형)의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터[J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)]를 사용하지만, 항체 H쇄 및 L쇄가 따로 따로의 벡터 상에 존재하는 타입을 사용할 수도 있다. 탠덤형의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호), pEE18[Hybridoma, 17, 559(1998)] 등을 사용한다.
(2) 인간 이외의 동물 유래의 항체의 V영역을 코드하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석
비인간 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석은 이하와 같이 하여 행할 수 있다.
비인간 항체를 산생하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하고, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 해당 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 코드하는 DNA를 프로브로서 사용하여, VH 혹은 VL을 코드하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적으로 하는 마우스 항체의 VH 또는 VL의 전체 염기 서열을 각각 결정하여, 염기 서열로부터 VH 또는 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정한다.
비인간 항체를 산생하는 하이브리도마 세포를 제작하는 인간 이외의 동물에는, 마우스, 래트, 햄스터 또는 래빗 등을 사용하지만, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면, 어떤 동물이든 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터의 전체 RNA의 조제에는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법[Methods in Enzymol., 154, 3(1987)], 또는 RNA easy kit(퀴아젠사제) 등의 키트 등을 사용한다.
전체 RNA로부터의 mRNA의 조제에는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 또는 Oligo-dT30<Super>mRNA Purification(등록 상표) Kit(다카라 바이오사제) 등의 키트 등을 사용한다. 또한, Fast Track mRNA Isolation(등록 상표) Kit(인비트로젠사제), 또는 QuickPrep mRNA Purification(등록 상표) Kit(파르마시아사제) 등의 키트를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제할 수도 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리의 제작에는, 공지의 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)], 또는 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(인비트로젠사제) 혹은 ZAP-cDNA Synthesis(등록 상표) Kit(스트라테이진사제) 등의 키트 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리의 제작 시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA를 내장하는 벡터에는, 해당 cDNA를 혼입할 수 있는 벡터라면 어떤 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP Express[Strategies, 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)], λZAPII(Stratagene사제), λgt10, λgt11[DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49(1985)], Lambda BlueMid(클론테크사제), λExCELL, pT7T3-18U(파르마시아사제), pCD2[Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)] 또는 pUC18[Gene, 33, 103(1985)] 등을 사용한다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균에는, 해당 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이라면 어떤 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, XL1-Blue MRF'[Strategies, 5, 81(1992)], C600[Genetics, 39, 440(1954)], Y1088, Y1090[Science, 222, 778(1983)], NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1(1983)], K802[J. Mol. Biol., 16, 118(1966)] 또는 JM105[Gene, 38, 275(1985)] 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리로부터의 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA 클론의 선택에는, 동위 원소 혹은 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니·하이브리다이제이션법, 또는 플라크·하이브리다이제이션법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 등을 사용한다.
또한, 프라이머를 조제하고, mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, Polymerase Chain Reaction법(폴리메라아제 쇄 반응법)[이하, PCR법이라고 표기하는, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)]을 행하는 것으로부터 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를 조제할 수도 있다.
선택된 cDNA를, 적당한 제한 효소 등으로 절단 후, pBluescript SK(-)(스트라테이진사제) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법 등에 의해 해당 cDNA의 염기 서열을 결정한다. 염기 서열 해석 방법에는, 예를 들어 디데옥시법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)] 등의 반응을 행한 후, ABI PRISM3700(PE바이오 시스템즈사제) 또는 A. L. F. DNA 시퀀서(파르마시아사제) 등의 염기 서열 자동 분석 장치 등을 사용한다.
결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 각각 확인한다. 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 관해서는, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가 그것들이 속하는 서브 그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 기지의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써 발견할 수 있다.
또한, 얻어진 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 사용하여, 예를 들어 SWISS-PROT 또는 PIR-Protein 등의 임의의 데이터베이스에 대하여 BLAST법[J. Mol. Biol., 215, 403(1990)] 등의 상동성 검색을 행하여, VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열이 신규의 것인지를 확인할 수 있다.
(3) 인간형 키메라 항체 발현 벡터 또는 인간형 키메라 항체 개변체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코드하는 각각의 유전자의 상류에, 각각 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를 각각 클로닝함으로써, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
어느 모노클로날 항체에 유래하는 VH를 코드하는 cDNA와, 별도의 모노클로날 항체에 유래하는 VL을 코드하는 cDNA를 사용함으로써, 인간형 키메라 항체 개변체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
또한, 해당 cDNA 혹은 이미 제작한 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 PCR의 주형으로 하여, 바람직한 아미노산 개변 부위에 점 변이를 도입하는 PCR 프라이머를 사용하여 유전자 단편을 증폭시키고, (1)에서 얻어지는 벡터에 클로닝하여 연결시킴으로써, 인간형 키메라 항체 개변체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 개변 부위가 복수 개소에 미치는 경우는, 인공 DNA 합성에 의해 제작한 유전자 단편을 사용할 수도 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA의 3' 말단측과, 인간 항체의 CH 또는 CL의 5' 말단측을 연결하기 위해, 연결 부분의 염기 서열이 적절한 아미노산을 코드하고, 또한 적당한 제한 효소 인식 서열로 되도록 설계한 VH 및 VL의 cDNA를 제작한다. 제작된 VH 및 VL의 cDNA를, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코드하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터 또는 인간형 키메라 항체 개변체 발현 벡터를 구축한다.
또한, 비인간 항체 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를, 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA를 사용하여 PCR법에 의해 각각 증폭하여, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 클로닝할 수도 있다.
(4) 인간화 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA의 구축
인간화 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA는, 이하와 같이 하여 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하기 위한, 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열을 각각 선택한다. 선택하는 FR의 아미노산 서열에는, 인간 항체 유래의 것이라면, 어떤 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, Protein Data Bank(단백질 데이타 뱅크) 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 FR의 아미노산 서열, 또는 인간 항체의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)] 등을 사용한다. 항체의 결합 활성의 저하를 억제하기 위해, 원래의 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60% 이상)의 FR의 아미노산 서열을 선택한다.
이어서, 선택한 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열에, 원래의 항체의 CDR의 아미노산 서열을 각각 이식하고, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 각각 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에 보이는 코돈의 사용 빈도[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]를 고려하여 DNA 서열로 변환하고, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 각각 설계한다.
설계한 DNA 서열에 기초하여, 100염기 전후의 길이를 포함하는 몇 개의 합성 DNA를 합성하고, 그것들을 사용하여 PCR 반응을 행한다. 이 경우, PCR 반응에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터, 바람직하게는 VH, VL 각각에 대하여 각 6개의 합성 DNA를 설계한다. 또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 또는 3' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 인간화 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터로 용이하게 클로닝할 수 있다.
PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(스트라테이진사제) 등의 플라스미드에 각각 클로닝하고, (2)에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해, 염기 서열을 결정하여, 원하는 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
또는, 설계한 DNA 서열에 기초하여, VH 전체 길이 및 VL 전체 길이를 각각 1개의 장쇄 DNA로서 합성한 것을, 상기 PCR 증폭 산물 대신에 사용할 수도 있다. 또한, 합성 장쇄 DNA의 양단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 인간화 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터로 용이하게 클로닝할 수 있다.
(5) 인간화 항체의 V 영역의 아미노산 서열 개변
인간화 항체는, 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 비인간 항체에 비해 저하된다[BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)]. 인간화 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기, CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 아미노산 잔기, 및 항체의 입체 구조를 유지하여, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하고, 그것들의 아미노산 잔기를 원래의 비인간 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 저하된 항원 결합 활성을 상승시킬 수 있다.
항원 결합 활성에 관계되는 FR의 아미노산 잔기를 동정하기 위해, X선 결정 해석[J. Mol. Biol., 112, 535(1977)] 또는 컴퓨터 모델링[Protein Engineering, 7, 1501(1994)] 등을 사용함으로써, 항체의 입체 구조의 구축 및 해석을 행할 수 있다. 또한, 각각의 항체에 대하여 수종의 개변체를 제작하여, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 것을 반복하고, 시행 착오함으로써 필요한 항원 결합 활성을 갖는 인간화 항체를 취득할 수 있다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기는, 개변용 합성 DNA를 사용하여 (4)에 기재된 PCR 반응을 행함으로써, 개변시킬 수 있다. PCR 반응 후의 증폭 산물에 대하여 (2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하여, 목적의 개변이 실시된 것을 확인한다.
(6) 인간화 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코드하는 각각의 유전자의 상류에, 구축한 유전자 재조합 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를 각각 클로닝하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
예를 들어, (4) 및 (5)에서 얻어지는 인간화 항체의 VH 또는 VL을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 또는 3' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코드하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝한다.
또한, 상술 키메라 항체, 인간화 항체 등의 유전자 재조합 항체를 제작하는 경우에, 상이한 2종류의 항체 유래의 H쇄(또는 VH)와 L쇄(또는 VL)를 재조합한 항체 발현용 벡터를 제작함으로써, VL 치환 키메라 항체 발현용 벡터를 구축할 수 있다.
(7) 유전자 재조합 항체의 일과성 발현
(3) 및 (6)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현 벡터, 또는 그것들을 개변한 발현 벡터를 사용하여 유전자 재조합 항체의 일과성 발현을 행하여, 제작한 다종류의 인간형 키메라 항체, 인간화 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가할 수 있다.
발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포라면, 어떤 세포라도 사용할 수 있지만, 예를 들어 COS-7 세포[American Type Culture Collection(ATCC) 번호: CRL1651]를 사용한다[Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283(1991)].
COS-7 세포로의 발현 벡터의 도입에는, DEAE-덱스트란법[Methods in Nucleic Acids Res., CRC press(1991)], 또는 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 사용한다.
발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등을 사용하여 측정한다.
(8) 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주의 취득과 유전자 재조합 항체의 조제
(3) 및 (6)에서 얻어진 유전자 재조합 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.
숙주 세포로의 발현 벡터의 도입에는, 일렉트로포레이션법[일본 특허 공개 평2-257891호 공보, Cytotechnology, 3, 133(1990)] 등을 사용한다.
유전자 재조합 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포라면, 어떤 세포라도 사용할 수 있다. 예를 들어, CHO-K1(ATCC CCL-61), DUKXB11(ATCC CCL-9096), Pro-5(ATCC CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat#11619), 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL. P2. G11. 16 Ag. 20(ATCC 번호: CRL1662, 또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NS0, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14(ATCC 번호: CRL1581), 마우스 P3X63-Ag 8.653 세포(ATCC 번호: CRL1580), 디히드로 엽산 환원 효소 유전자(Dihydroforate Reductase, 이하, dhfr이라고 표기함)가 결손된 CHO 세포(CHO/DG44 세포)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)] 등을 사용한다.
또한, 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 등의 단백질, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위에 푸코오스의 1위가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 등의 단백질 혹은 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질 등의 활성이 저하 또는 결실된 숙주 세포, 예를 들어 α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호), 렉틴 내성을 획득한 Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55(1986)] 등을 사용할 수도 있다.
발현 벡터의 도입 후, 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주는, G418 황산염(이하, G418이라고 표기함) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택한다(일본 특허 공개 평2-257891호 공보).
동물 세포 배양용 배지에는, RPMI1640 배지(인비트로젠사제), GIT 배지(니혼 세이야쿠사제), EX-CELL301 배지(JRH사제), IMDM 배지(인비트로젠사제) 혹은 Hybridoma-SFM 배지(인비트로젠사제), 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용한다. 얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 유전자 재조합 항체를 발현 축적시킨다. 배양 상청 중인 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, dhfr 유전자 증폭계(일본 특허 공개 평2-257891호 공보) 등을 이용하여, 형질 전환주의 산생하는 유전자 재조합 항체의 발현량을 향상시킬 수 있다.
유전자 재조합 항체는, 형질 전환주의 배양 상청으로부터 단백질 A-칼럼을 사용하여 정제한다[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]. 또한, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등의 단백질의 정제에서 사용되는 방법을 조합할 수도 있다.
정제한 유전자 재조합 항체의 H쇄, L쇄 혹은 항체 분자 전체의 분자량은, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법[Nature, 227, 680(1970)] 또는 웨스턴 블로팅법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 사용하여 측정할 수 있다.
3. 정제 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 활성 평가
정제한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 활성 평가는, 이하와 같이 행할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편의 인간 CCR1에 대한 결합 활성은, 전술한 1-(6)에 기재된 플로우 사이토메트리를 사용하여 측정한다. 또한, 형광 항체법[Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)] 등을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편의 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1 발현 세포의 유주를 저해하는 활성은, 상술한 주화성 어세이를 사용하여 측정할 수 있다.
인간 CCR1 발현 세포에 대한 CDC 활성, 또는 ADCC 활성은 공지의 측정 방법[Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993); Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coliganet al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)]에 의해 측정할 수 있다.
4. 항체의 이펙터 활성을 제어하는 방법
본 발명의 모노클로날 항체의 이펙터 활성을 제어하는 방법으로서는, 항체의 Fc 영역의 297번째의 아스파라긴(Asn)에 결합하는 N결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 α1,6 결합하는 푸코오스(코어 푸코오스라고도 함)의 양을 제어하는 방법(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제2002/31140호, 국제 공개 제00/61739호), 또는 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 제어하는 방법 등이 알려져 있다. 본 발명의 모노클로날 항체에는 어떤 방법을 사용해도, 이펙터 활성을 제어할 수 있다.
이펙터 활성이란, 항체의 Fc 영역을 통해 야기되는 항체 의존성의 활성을 말하고, ADCC 활성, CDC 활성, 또는 마크로파지 혹은 수상 세포 등의 식세포에 의한 항체 의존성 패거사이토시스(Antibody-dependent phagocytosis, ADP 활성) 등이 알려져 있다.
이펙터 활성의 측정법으로서, 예를 들어 표적으로서 염증성 세포, 이펙터로서 인간 말초혈 단핵구(PBMC), 그리고 염증성 세포 특이적인 항체를 혼합하여, 4시간 정도 인큐베이션한 후, 세포 상해의 지표로서 유리해 온 락트산 탈수소 효소(LDH)를 측정할 수 있다. 혹은, 인간 전혈에, 예를 들어 CD20과 같은 혈액 세포 특이적인 항원을 인식하는 항체를 첨가하여, 인큐베이션한 후, 표적이 되는 혈액 세포수의 감소를 이펙터 활성으로서 측정할 수 있다. 또는, 예를 들어 인간 전혈에 별도의 표적 세포를 혼합하고, 또한 표적 세포에 특이적인 항체를 첨가하여 인큐베이션한 후, 표적 세포수의 감소를 이펙터 활성으로서 측정할 수 있다. 어떤 경우에 있어서도 이펙터 활성은, 유리 LDH법, 유리51Cr법 또는 플로우 사이토메트리법 등에 의해 측정할 수 있다.
항체의 Fc의 N결합 복합형 당쇄의 코어 푸코오스의 함량을 제어함으로써, 항체의 이펙터 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 항체의 Fc에 결합되어 있는 N결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코오스의 함량을 저하시키는 방법으로서는, α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포를 사용하여 항체를 발현함으로써, 푸코오스가 결합되어 있지 않은 항체를 취득할 수 있다. 푸코오스가 결합되어 있지 않은 항체는 높은 ADCC 활성을 갖는다.
한편, 항체의 Fc에 결합되어 있는 N결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코오스의 함량을 증가시키는 방법으로서는, α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자를 도입한 숙주 세포를 사용하여 항체를 발현시킴으로써, 푸코오스가 결합되어 있는 항체를 취득할 수 있다. 푸코오스가 결합되어 있는 항체는, 푸코오스가 결합되어 있지 않은 항체보다도 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
또한, 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0148165호 명세서에 기재된 Fc 영역의 아미노산 서열을 사용함으로써, 항체의 CDC 활성을 증가시킬 수 있다.
또한, 미국 특허 제6,737,056호 명세서, 미국 특허 제7,297,775호 명세서 또는 미국 특허 제7,317,091호 명세서에 기재된 아미노산 개변을 행함으로써, ADCC 활성 또는 CDC 활성을, 증가시킬 수도 있고 저하시킬 수도 있다. 또한 본 발명의 항체에는, 상술한 항체 정상 영역에 있어서의 아미노산 개변 또는 당쇄 개변에 맞추어, 예를 들어 일본 특허 공개 제2013-165716호 공보 또는 일본 특허 공개 제2012-021004호 공보 등에 기재된 아미노산 개변을 행함으로써, Fc 수용체로의 반응성을 제어함으로써 혈중 반감기를 제어한 항체도 포함된다.
또한, 상술한 방법을 조합하여, 하나의 항체에 사용함으로써, 항체의 이펙터 활성이나 혈중 반감기가 제어된 항체를 취득할 수 있다.
5. 본 발명의 항인간 CCR1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용한 질환의 치료 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, 인간 CCR1 의존적인 세포 유주, 병변 등 CCR1이 관련되는 질환이라면, 어떤 인간 CCR1 관련 질환의 치료에도 사용할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 해당 항체 또는 해당 항체 단편만을 포함하는 것이어도 되지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에 있어서 공지의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공된다.
투여 경로로서는, 예를 들어 경구 투여, 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 혹은 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있다. 투여 형태로서는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로서는, 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등을 들 수 있다.
유제 또는 시럽제와 같은 액체 조제물은, 물, 자당, 소르비톨 혹은 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜 혹은 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 호마유, 올리브유 혹은 대두유 등의 유류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제 또는 스트로베리 플레이버 혹은 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.
캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등은, 유당, 포도당, 자당 혹은 만니톨 등의 부형제, 전분 혹은 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 혹은 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스 혹은 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면 활성제 또는 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는, 주사제, 좌제 또는 분무제 등이다. 주사제는, 염용액 혹은 포도당 용액, 또는 그 양자의 혼합물을 포함하는 담체 등을 사용하여 제조한다. 좌제는 카카오 버터, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 제조한다.
분무제는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 미세한 입자로서 분산시켜, 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 제조한다. 담체로서는, 예를 들어 유당 또는 글리세린 등을 사용한다. 또한, 에어로졸 또는 드라이 파우더로서 제조할 수도 있다. 또한, 상기 비경구제에 있어서도, 경구 투여에 적당한 제제로 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
6. 본 발명의 항인간 CCR1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용한 질환의 진단 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 인간 CCR1 또는 인간 CCR1이 발현한 세포를 검출 또는 측정함으로써, 인간 CCR1 관련 질환을 진단할 수 있다.
인간 CCR1 관련 질환인 암 질환, 자기 면역성 질환 및 염증성 질환의 진단은, 예를 들어 환자 체내에 존재하는 인간 CCR1을 면역학적 방법에 의해 검출 또는 측정하여 행할 수 있다. 또한, 환자 체내의 세포에 발현되어 있는 인간 CCR1을 플로우 사이토메트리 등의 면역학적 방법을 사용하여 검출함으로써 진단을 행할 수 있다.
면역학적 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 사용하여, 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 예를 들어, 방사성 물질 표지 면역 항체법, 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 발광 면역 측정법, 웨스턴 블로트법 또는 물리 화학적 방법 등을 사용한다.
방사성 물질 표지 면역 항체법은, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에, 본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 반응시키고, 다시 방사선 표지를 실시한 항 이뮤노글로불린 항체 또는 해당 항체 단편을 반응시킨 후, 신틸레이션 카운터 등으로 측정한다.
효소 면역 측정법은, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에, 본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 반응시키고, 다시 효소 등으로 표지를 실시한 항 이뮤노글로불린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 기질을 첨가하여 반응액의 흡광도를 흡광 광도계로 측정한다. 예를 들어, 샌드위치 ELISA법 등을 사용한다. 효소 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는, 공지[효소 면역 측정법, 의학서원(1987)]의 효소 표지를 사용할 수 있다.
예를 들어, 알칼리 포스파타아제 표지, 퍼옥시다아제 표지, 루시페라아제 표지 또는 비오틴 표지 등을 사용한다. 샌드위치 ELISA법은, 고상에 항체를 결합시킨 후, 검출 또는 측정 대상인 항원을 트랩시키고, 트랩된 항원에 제2 항체를 반응시키는 방법이다. 해당 ELISA법에서는, 검출 또는 측정하고 싶은 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편이며, 항원 인식 부위의 상이한 2종류의 항체를 준비하고, 그중, 제1 항체 또는 항체 단편을 미리 플레이트(예를 들어, 96웰 플레이트)에 흡착시키고, 이어서 제2 항체 또는 항체 단편을 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소 또는 비오틴 등으로 표지해 둔다. 상기한 항체가 흡착한 플레이트에, 생체 내로부터 분리된, 세포 또는 그 파쇄액, 조직 또는 그 파쇄액, 세포 배양 상청, 혈청, 흉수, 복수 또는 안액 등을 반응시킨 후, 표지한 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 반응시켜, 표지 물질에 따른 검출 반응을 행한다. 농도 기지의 항원을 단계적으로 희석하여 작성한 검량선으로부터, 피검 샘플 중의 항원 농도를 산출한다. 샌드위치 ELISA법에 사용하는 항체로서는, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 어느 것을 사용해도 되고, Fab, Fab' 또는 F(ab)2 등의 항체 프래그먼트를 사용해도 된다. 샌드위치 ELISA법에서 사용하는 2종류의 항체의 조합으로서는, 상이한 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편의 조합이어도 되고, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 또는 항체 단편의 조합이어도 된다.
형광 면역 측정법은, 문헌[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 형광 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는, 공지[형광 항체법, 소프트 사이언스사(1983)]의 형광 표지를 사용할 수 있다. 예를 들어, FITC 또는 RITC 등을 사용한다.
발광 면역 측정법은 문헌[생물 발광과 화학 발광 임상 검사 42, 히로카와 쇼텐(1998)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 발광 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는, 공지의 발광체 표지를 들 수 있고, 아크리디늄에스테르 또는 로핀 등을 사용한다.
웨스턴 블로트법은, 항원 또는 항원을 발현한 세포 등을 SDS(도데실황산나트륨)-PAGE(폴리아크릴아미드 겔)[Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]로 분획한 후, 해당 겔을 폴리불화비닐리덴(PVDF)막 또는 니트로셀룰로오스막에 블로팅하고, 해당 막에 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편을 반응시키고, 다시 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소 표지 또는 비오틴 표지 등을 실시한 항 마우스 IgG 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 해당 표지를 가시화함으로써 측정한다.
일례를 이하에 나타낸다. 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포나 조직을 용해하고, 환원 조건 하에서 레인당의 단백량으로서 0.1 내지 30μg을 SDS-PAGE법에 의해 영동한다. 영동된 단백질을 PVDF막에 트랜스퍼하여 1 내지 10% BSA를 포함하는 PBS(이하, BSA-PBS라고 표기함)에 실온에서 30분간 반응시켜 블로킹 조작을 행한다. 여기서 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시켜, 0.05 내지 0.1%의 Tween-20을 포함하는 PBS(이하, Tween-PBS라고 표기함)로 세정하고, 퍼옥시다아제 표지한 염소 항 마우스 IgG를 실온에서 2시간 반응시킨다. Tween-PBS로 세정하고, ECL Western Blotting Detection Reagents(아머샴사제) 등을 사용하여 모노클로날 항체가 결합한 밴드를 검출함으로써, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 검출한다. 웨스턴 블로팅에서의 검출에 사용되는 항체로서는, 천연형의 입체 구조를 유지하고 있지 않은 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체가 사용된다.
물리 화학적 방법은, 예를 들어 항원인 인간 CCR1과 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 결합시킴으로써 응집체를 형성시키고, 이 응집체를 검출함으로써 행한다. 그밖에 물리 화학적 방법으로서, 모세관법, 일차원 면역 확산법, 면역 비탁법 또는 라텍스 면역 비탁법[임상 검사법 제요, 가네하라 출판(1998)] 등을 사용할 수도 있다. 라텍스 면역 비탁법은, 항체 또는 항원을 감작시킨 입경 0.1 내지 1μm 정도의 폴리스티렌 라텍스 등의 담체를 사용하여, 대응하는 항원 또는 항체에 의해 항원 항체 반응을 일으키게 하면, 반응액 중의 산란광은 증가하고, 투과광은 감소한다. 이 변화를 흡광도 또는 적분구 탁도로서 검출함으로써 피검 샘플 중의 항원 농도 등을 측정한다.
인간 CCR1이 발현하고 있는 세포의 검출 또는 측정은, 공지의 면역학적 검출법을 사용할 수 있지만, 그 중에서도, 면역 침강법, 면역 세포 염색법, 면역 조직 염색법 또는 형광 항체 염색법 등을 사용하는 것이 바람직하다.
면역 침강법은, 인간 CCR1을 발현한 세포 등을 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편과 반응시킨 후, 단백질 G-세파로스 등의 이뮤노글로불린에 특이적인 결합능을 갖는 담체를 더하여 항원 항체 복합체를 침강시킨다. 또는 이하와 같은 방법에 의해서도 행할 수 있다. ELISA용 96웰 플레이트에 상술한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 고상화한 후, BSA-PBS에 의해 블로킹한다. 항체가, 예를 들어 하이브리도마 배양 상청 등의 정제되어 있지 않은 상태인 경우에는, 항 마우스 이뮤노글로불린, 항 래트 이뮤노글로불린, 단백질-A 또는 단백질-G 등을 미리 ELISA용 96웰 플레이트에 고상화하고, BSA-PBS로 블로킹한 후, 하이브리도마 배양 상청을 분주하여 결합시킨다. 이어서, BSA-PBS를 버리고 PBS로 잘 세정한 후, 인간 CCR1을 발현하고 있는 세포나 조직의 용해액을 반응시킨다. 잘 세정한 후의 플레이트로부터 면역 침강물을 SDS-PAGE용 샘플 버퍼에 의해 추출하고, 상기한 웨스턴 블로팅에 의해 검출한다.
면역 세포 염색법 또는 면역 조직 염색법은, 항원을 발현한 세포 또는 조직 등을, 경우에 따라서는 항체의 통과성을 양호하게 하기 위해 계면 활성제나 메탄올 등으로 처리한 후, 본 발명의 모노클로날 항체와 반응시키고, 다시 FITC 등의 형광 표지, 퍼옥시다아제 등의 효소 표지 또는 비오틴 표지 등을 실시한 항 이뮤노글로불린 항체 또는 그 결합 단편과 반응시킨 후, 해당 표지를 가시화하고, 현미경으로 관찰하는 방법이다. 또한, 형광 표지의 항체와 세포를 반응시켜, 플로우사이트미터에 의해 해석하는 형광 항체 염색법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)]에 의해 검출을 행할 수 있다. 특히, 인간 CCR1에 결합하는, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, 형광 항체 염색법에 의해 천연형의 입체 구조를 유지하여 발현하고 있는 세포의 검출을 할 수 있다.
또한, 형광 항체 염색법 중, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오 시스템사제) 등을 사용한 경우에는, 형성된 항체-항원 복합체와, 항체-항원 복합체의 형성에 관여하고 있지 않은 유리의 항체 또는 항원을 분리하지 않고, 항원량 또는 항체량을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] 인간, 마우스 CCR1의 발현 벡터의 제작
(1) 각 CCR1 유전자의 제작
하기, 1 내지 7의 인간 또는 마우스의 CCR1 혹은 CCR1-CCR3 키메라 수용체를 코드하는 DNA를 합성했다(젠스크립트 재팬사). 합성 시에는 각 벡터에 내장하기 위한 제한 효소 사이트(BamHI 및 NotI)와, Kozak 서열을 부가했다.
1. 인간 CCR1(이하, hCCR1)을 코드하는 cDNA 서열(서열 번호 1)
2. 마우스 CCR1(이하, mCCR1)을 코드하는 cDNA 서열(서열 번호 3)
3. 인간 CCR3(이하, hCCR3)을 코드하는 cDNA 서열(서열 번호 5)
4. 인간 CCR1의 1번째 내지 31번째의 아미노산 서열을 인간 CCR3의 대응하는 N말단의 아미노산 서열로 치환한 키메라 수용체(이하, NC3-hCCR1)를 코드하는 cDNA 서열(서열 번호 6)
5. 마우스 CCR1의 1번째 내지 31번째의 아미노산 서열을 인간 CCR3의 대응하는 N말단의 아미노산 서열로 치환한 키메라 수용체(이하, NC3-mCCR1)를 코드하는 cDNA 서열(서열 번호 7)
6. 인간 CCR3의 171번째 내지 194번째의 아미노산 서열을 인간 CCR1의 171번째 내지 194번째의 아미노산 서열로 치환한 키메라 수용체(이하, hCCR3_EL2hCCR1)를 코드하는 cDNA 서열(서열 번호 8)
7. 인간 CCR3의 171번째 내지 194번째의 아미노산 서열을 마우스 CCR1의 171번째 내지 194번째의 아미노산 서열로 치환한 키메라 수용체(이하, hCCR3_EL2mCCR1)를 코드하는 cDNA 서열(서열 번호 9)
(2) 인간 CCR1 발현 벡터의 제작
상기 (1)-1에서 합성한 hCCR1을 코드하는 DNA를 제한 효소 BamHI 및 NotI(New England Biolab사)에서 처리하여, DNA 단편을 정제했다. Tol2 트랜스포존 벡터(국제 공개 제2010/143698호)(이하, Tn-pMug-Hygro라고 기재함)를 동 제한 효소로 처리하고, CCR1을 코드하는 DNA 단편과 섞은 후, DNA ligase(다카라 바이오사) 처리에 의해 연결했다. 라이게이션 후의 DNA를 대장균 적격 세포(다카라 바이오사)에 도입하고, 약제 내성을 획득한 콜로니 중에서 목적의 플라스미드 DNA를 갖는 대장균주를 선택했다. 이 대장균주를 다시 배양하고, 배양액으로부터 트랜스펙션용의 DNA를 정제했다(이하, 이와 같이 제작한 플라스미드를 hCCR1/Tn-pMug-Hygro라고 나타낸다.).
(3) 각종 CCR 발현 벡터의 제작
상기 (2)와 동일한 방법으로, 상기 (1)에서 합성한 mCCR1, hCCR3, NC3-hCCR1, NC3-mCCR1, hCCR3_EL2hCCR1, hCCR3_EL2mCCR1을 Tn-pMug-Hygro에 연결시켜, 발현 벡터를 구축했다(이하, 각각 mCCR1/Tn-pMug-Hygro, hCCR3/Tn-pMug-Hygro, NC3-hCCR1/Tn-pMug-Hygro, NC3-mCCR1/Tn-pMug-Hygro, hCCR3_EL2hCCR1/Tn-pMug-Hygro, hCCR3_EL2mCCR1/Tn-pMug-Hygro라고 나타낸다.).
(4) mCCR1 발현 벡터의 제작
상기 (2)와 동일한 방법으로, 상기 (1)에서 합성한 mCCR1을 코드하는 DNA를, pCAGGS[Gene. 1991 Dec 15; 108(2): 193-9.]에 internal ribosomal entry site(내부 리보솜 유입점)(IRES)와 네오마이신 내성 유전자가 부가된 벡터인 pCAG-IRES-neo에 연결시켜, 발현 벡터를 구축했다(이하, mCCR1/pCAG-IRES-neo라고 나타낸다.).
[실시예 2] CCR1 발현 세포주의 제작
(1) hCCR1 발현 세포의 제작
실시예 1에서 제작한 플라스미드 DNA인 hCCR1/Tn-pMug-Hygro와 Tol2 transposase(유전자 전위 효소) 발현 벡터 TPEX_pMug(국제 공개 제2013/005649호)를 CHO-S(Thermo Fisher Scientific사)에 공동 도입하여, 발현 세포주를 제작했다. 유전자 도입은 Fugene HD(프로메가사)를 사용하여 하기와 같이 행하였다. 1×105세포/mL로 조제한 세포를 6웰 플레이트에 2.5mL씩 파종하고, 24시간 후에, hCCR1/Tn-pMug-Hygro, TPEX_pMug, Fugene HD의 혼합물을 배양액에 첨가했다. 첨가 후 72시간 후에 1mg/mL의 하이그로마이신(Invitrogen사)을 첨가하고, 약 2주일의 약제 선택을 행하였다. 약제 내성을 획득한 세포를 회수하여, 플로우 사이토메트리(FACS Calibur, BD Biosciences사)에 의한 발현 해석을 행한바, 도입한 hCCR1의 발현이 확인되었다. 이 세포주를 CHO-S-hCCR1이라고 나타낸다.
(2) 각종 CCR 발현 세포의 제작
실시예 1에서 제작한 mCCR1/Tn-pMug-Hygro, hCCR3/Tn-pMug-Hygro, NC3-hCCR1/Tn-pMug-Hygro, NC3-mCCR1/Tn-pMug-Hygro, hCCR3_EL2hCCR1/Tn-pMug-Hygro 및 hCCR3_EL2mCCR1/Tn-pMug-Hygro에 대하여, 상기 (1)과 동일한 방법으로 CHO-S 세포에 도입하여, 발현 세포주를 제작했다. 이하, 이들 세포주를 각각 CHO-S-mCCR1, CHO-S-hCCR3, CHO-S-NC3-hCCR1, CHO-S-NC3-mCCR1, CHO-S-hCCR3_EL2hCCR1 및 CHO-S-hCCR3_EL2mCCR1이라고 나타낸다.
(3) RL33-hCCR1 세포의 제작
실시예 1에서 제작한 hCCR1/Tn-pMug-Hygro와 Tol2 transposase 발현 벡터 TPEX_pMug(국제 공개 제2013/005649호)를 토끼 세포주 RL-33[Yoshii et al., Jpn J Med Sci Biol. 1977 Jun; 30(3): 149-57]에 공동 도입하여, hCCR1 발현 세포주를 제작했다. 유전자 도입은 Lipofectamine LTX(Thermo Fisher Scientific사)를 사용하여, 이하와 같이 행하였다. 1×105세포/mL로 조제한 세포를 6웰 플레이트에 2mL씩 파종하고, 2.5μg의 플라스미드 DNA, 5μL의 Lipofectamine LTX의 혼합물을 배지 중에 첨가했다. 첨가 후 72시간 후에 1mg/mL의 하이그로마이신을 첨가하고, 약 2주일의 약제 선택을 행하였다. 약제 내성을 획득한 세포를 회수하고, 플로우 사이토메트리에 의한 발현 해석을 행한바, 도입한 hCCR1의 발현이 확인되었다. 이하, 이 세포주를 RL33-hCCR1이라고 나타낸다.
(4) RL33-mCCR1 세포의 제작
실시예 1 (4)에서 제작한 mCCR1/pCAG-IRES-neo를 상기 (3)과 동일한 방법으로 RL-33에 도입하여, 발현 세포주를 제작했다. 약제 선택은 0.5mg/mL의 G418로 행하였다. 이하, 이 세포주를 RL33-mCCR1이라고 나타낸다.
[실시예 3] 항CCR1 토끼 폴리클로날 항체의 제작
이하의 방법으로 항CCR1 토끼 폴리클로날 항체를 제작했다. 인간 CCR1의 N말단 펩티드(서열 번호 10)를 합성하여, 2마리의 토끼(New Zealand White(뉴질랜드 화이트))를 2주 간격으로 5회 면역했다. 면역은, 첫회만 Complete Freund's Adjuvant(완전 프로인트 항원 보강제)(CFA)를 사용하고, 2회째 이후는 Incomplete Freund's Adjuvant(불완전 프로인트 항원 보강제)(IFA)를 사용하여, 배면부의 복수 개소에 피하 주입으로 행하였다. 면역 후에 항체값이 상승한 개체로부터 혈청을 채취하고, Protein A 칼럼(GE Healthcare사)에 의한 어피니티 정제로 IgG를 정제했다. 이와 같이 하여 제작한 항CCR1 토끼 폴리클로날 항체는 E5971이라고 나타낸다.
[실시예 4] 플로우 사이토메트리에 의한 발현 해석
(1) CCR1 발현의 확인
실시예 2에서 제작한 CCR1 발현 세포주에 대하여, 실시예 3에서 제작한 항CCR1 토끼 폴리클로날 항체 E5971을 사용하여 염색하고, 플로우 사이토메트리(FCM)로 CCR1의 발현을 확인했다. FCM 해석은 이하와 같이 행하였다. 세포를 96웰 플레이트에 2×105세포/웰로 파종하고, 염색 버퍼[3% FBS(Thermo Fisher Scientific사)/DPBS(나카라이테스크사)/0.1% 아지드화나트륨(나카라이테스크사)]으로 세정했다. 해당 세포를 10μg/mL의 E5971에 의해 1시간 빙상으로 처리하고, 염색 버퍼에 의한 세정 후, 2차 항체 Alexa Fluor 647 goat Anti-Rabbit IgG(Thermo Fisher Scientific사제)를 최종 농도 1μg/mL로 첨가하고, 실온에서 30분간 처리했다. 해당 세포에 대하여, 다시 염색 버퍼에 의한 세정을 행한 후에, 염색 버퍼로 현탁하고, BD FACSCalibur(BD Biosciences사)를 사용하여 해석을 행하였다. 이에 의해, 제작한 CCR1 발현 세포주에 대하여, 도입한 CCR1이 발현되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
(2) CCR3 발현의 확인
실시예 2에서 제작한 CHO-S-hCCR3에 대해서도, 상기 (1)과 동일한 방법으로 CCR3의 발현을 확인했다. 1차 항체에는, 시판되고 있는 항CCR3 항체인 444-11 항체(MBL사)를, 2차 항체에는 Alexa Fluor 647 goat Anti-mouseIgG(H+L)(Thermo Fisher Scientific사)를 사용했다. 이에 의해, CHO-S-hCCR3에 의해 도입한 CCR3이 발현되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] CCR1 넉아웃 마우스를 사용한 모노클로날 항체의 제작
마우스 교차성 항체를 얻기 위해, 시판되고 있는 CCR1 녹아웃(KO) 마우스(B6. 129S4-Ccr1tm1Gao N10+N5)(Taconic사)를 사용하여 모노클로날 항체를 제작했다. 항체 제작은 이하의 수순으로 행하였다.
(1) 면역 감작
면역원으로서, 실시예 2에서 제작한 CHO-S-hCCR1, CHO-S-mCCR1, RL33-hCCR1, 및 RL33-mCCR1을 사용했다. 1회의 면역당 1×107세포/마리를 사용했다. 5 내지 9주령의 CCR1KO 마우스에, 첫회 면역 시에만 아쥬반트로서 Alum 겔(LSL사)(80μL/마리) 및 백일해 백신(나카라이테스크사)(1×107세포/마리)을 더하여 복강 내 투여에 의해 면역 감작을 행하였다. 어느 면역이든 투여량이 500μL/마리로 되도록 PBS로 조제했다. 첫회 면역 2주일 후에 2회째, 또한 1주일 후에 3회째의 면역을 행하고, 3일 후에 부분 채혈을 행하였다.
(2) 항혈청 평가(FCM)
실시예 2에서 제작한 각종 CCR1 발현 세포를 사용하여, 혈청 중의 특이적 항체값을 FCM으로 측정했다. 측정은 이하의 수순으로 행하였다. 세포를 각각 1×105세포/웰로 되도록, 1% BSA(나카라이테스크사)-PBS(나카라이테스크사)[0.02% EDTA(나카라이테스크사), 0.05% NaN3(나카라이테스크사)를 포함함]로 조제하고, 96웰 세포 배양용 플레이트 U바닥에 50μL/웰로 분주했다. 거기로 피검 샘플로서 피면역 동물로부터 채취한 혈청을, 최종 농도 200배 희석, 1000배 희석 및 5000배 희석으로 되도록 1% BSA-PBS(0.02% EDTA, 0.05% NaN3)로 조제하여 50μL/웰로 분주하고, 4℃에서 30분간 방치했다. 원심 분리(2000rpm, 2분간)한 후에 상청을 흡인하고, 플레이트 셰이커에 의해 세포의 펠릿을 풀었다. 1% BSA-PBS(0.02% EDTA, 0.05% NaN3)를 200μL/웰로 분주하고, 다시 원심 분리(2000rpm, 2분간)한 후에 상청을 흡인하고, 플레이트 셰이커에 의해 세포의 펠릿을 풀었다. 거기에 Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG(H+L), 혹은 Alexa Fluor488 goat anti-mouse IgG(H+L)를 최종적으로 300배 희석으로 되도록 1% BSA-PBS(0.02% EDTA, 0.05% NaN3)로 조제하고, 50μL/웰로 분주하여 차광 하에서 4℃에서 30분간 방치했다. 원심 분리(2000rpm, 2분간)한 후에 상청을 흡인하고, 플레이트 셰이커에 의해 세포의 펠릿을 풀었다. 1% BSA-PBS(0.02% EDTA, 0.05% NaN3)를 200μL/웰로 분주하고, 다시 원심 분리(2000rpm, 2분간)한 후에 상청을 흡인하고, 플레이트 셰이커에 의해 세포의 펠릿을 풀었다. 거기로 1% BSA-PBS(0.02% EDTA, 0.05% NaN3)를 50μL/웰로 분주하고, 플로우 사이토미터[FACSCanto(상표) II/BD]로 형광 강도를 측정했다. 이에 의해, 항체값의 상승이 확인된 개체를 선택하여, 비장을 적출했다.
(3) 세포 융합에 의한 하이브리도마 제작
마우스 미엘로마 세포주 P3-U1(P3X63Ag8U. 1, ATCC CRL-1597)을 에스클론 클로닝 메디움(에이디어사)으로 배양하여 무혈청 순화한 후, 세포 융합의 구주로서 사용했다. 피면역 동물의 비장을 무균적으로 채취하여 RED BLOOD CELL LYSING BUFFER(Sigma-Aldrich사)로 용혈 후, PBS로 2회 세정하고, 비세포와 P3-U1의 세포수가, 비장 세포:P3-U1=8:1로 되도록 혼합하고, 원심 분리(1200rpm, 5분간)했다. 얻어진 침전 분획의 세포군을 잘 푼 후, 교반하면서 37℃에서 1g의 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000, 준세 가가쿠사), 1mL의 MEM 배지(나카라이테스크사) 및 0.35mL의 디메틸술폭시드(Sigma-Aldrich사)의 혼합액을 0.5mL 더하고, 거기에 1분간마다 1mL의 MEM 배지를 5회 더한 후, MEM 배지를 더하여 전체 양이 50mL로 되도록 했다. 세포 현탁액을 원심 분리(900rpm, 5분간)하고, 얻어진 침전 분획의 세포를 부드럽게 푼 후, HAT SUPPLEMENT(Thermo Fisher Scientific사)를 첨가한 에스클론 클로닝 메디움으로 비장 세포 1.5×107세포/9mL의 세포 농도로 현탁했다. 사전에 96웰 배양용 플레이트에는 HAT 첨가 클로닝 메디움을 100μL/웰로 분주해 두고, 거기로 세포 현탁액을 100μL/웰씩 분주하고, CO2 인큐베이터(5% CO2, 37℃)에서 8 내지 10일간 배양했다.
(4) 하이브리도마의 스크리닝
하이브리도마 배양 상청에 포함되는 항체의 CCR1로의 결합 활성을 FCM으로 평가했다. 피검 샘플에는 하이브리도마 배양 상청을 사용하여, 염색과 측정은 상기 (2)와 동일한 수순으로 실시했다.
(5) 하이브리도마의 서브클로닝
스크리닝에서 양성이었던 웰의 세포에 대하여 서브클로닝을 행하고, 클로닝 메디움 중에서 7 내지 10일 정도 배양했다.
(6) 항체 서브클래스의 결정
서브클래스 특이적인 2차 항체를 사용한 FCM으로 각 항체의 서브클래스를 결정했다. 염색, 측정의 수순은 상기 (2)와 마찬가지로 행하였다. 피검 샘플에는 하이브리도마 배양 상청을 사용했다. 검출 항체에는 Alexa Fluor488 goat anti-mouse IgG(H+L)(Thermo Fisher Scientific사), 및 각 서브클래스 특이적인 항체(Alexa Fluor488 goat anti-mouse IgG1(Thermo Fisher Scientific사), Alexa Fluor488 goat anti-mouse IgG2a(Thermo Fisher Scientific사), Alexa Fluor488 goat anti-mouse IgG2b(Thermo Fisher Scientific사), Alexa Fluor488 goat anti-mouse IgG3)(Thermo Fisher Scientific사)를 사용했다.
(7) 하이브리도마 배양 상청으로부터의 항체 정제
상기와 같이 클로닝한 하이브리도마의 배양 상청으로부터 항체를 정제했다. 정제는 Protein G Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare사)를 사용했다. 배양 상청을 원심 분리하여 침전물을 제외하고, 필터로 여과했다. 칼럼에 400μL의 담체를 충전하고, DPBS에 의해 버퍼를 치환했다. 배양 상청을 첨가하고, 단체에 항체를 흡착시킨 후에, 10mL의 DPBS로 2회 세정했다. 0.4mL의 IgG Elution Buffer(Thermo Fisher Scientific사)를 첨가하여 용출하고, 직후에 0.1mL의 1M Tris-HCl(닛폰 진 사) pH8.6으로 중화했다. NAP 칼럼(GE Healthcare사)을 사용하여 탈염과 DPBS로의 버퍼 치환을 행하여, 이후의 해석에 사용했다. 제작된 항체의 클론명, 유래, 및 서브클래스를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
[실시예 6] THP-1 유주(주화성) 어세이
CCR1을 발현하는 인간 세포주로서는 인간 단구성 백혈병 세포주 THP-1이 알려져 있다. 본 세포는 CCL3, CCL5, CCL15 또는 CCL23 등의 CCR1 리간드의 농도 구배에 대하여 주화성을 나타내는 것이 알려져 있고, THP-1을 사용한 유주 어세이는 CCR1 저해제의 평가계로서 범용되는 계이다. 따라서, 실시예 5에서 얻어진 항인간 CCR1 항체에 대해서도, 이 실험계를 사용하여 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해할지 여부를 평가했다.
유주 어세이의 방법을 이하에 기재한다. THP-1 세포는 ATCC로부터 입수했다. THP-1 세포를 5μM All-trans-retinoic acid(ATRA)(와코 준야쿠 고교사) 존재 하에서 3일간 배양하여 분화 유도한 후에 회수하고, 37℃에서 가온한 어세이 배지[1% FBS(Thermo Fisher Scientific사)/RPMI1640(나카라이테스크사)]으로 세정 후, 동 배지에 재현탁했다. 1×106세포/mL로 조제하고, 포어 사이즈 5μm의 Transwell(Corning사, #3421)의 상층에 100μL/웰로 세포를 분주했다. 하층에는 화학 유도 물질로서, 1ng/mL의 재조합 인간 CCL15(68aa)(R&D technologies사, #628-LK)를 첨가한 어세이 배지를 넣고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 내에서 4-6시간 배양한 후에, 하층으로 이동한 세포수를 Celltiter-Glo(프로메가사)로 정량했다.
본 측정계를 사용하여 정제 항체의 세포 유주를 평가할 때에는, 미리 1.5mL 튜브 내에서 90μL의 세포 현탁액과 10μL의 정제 항체 용액을 혼합하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 세포를 Trasnwell의 상층에 분주했다. 항체는, 최종 농도를 0.3, 1, 3 및 10μg/mL로 조정하여, 측정에 사용했다.
얻어진 결과를 도 1의 (a) 및 도 1의 (b)에 도시한다. 도 1의 (a) 및 도 1의 (b)에 도시한 바와 같이, 실시예 5에서 얻어진 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체 KM5907 항체, KM5908 항체, KM5909 항체, KM5911 항체, KM5915 항체, KM5916 항체, KM5954 항체, KM5955 항체 및 KM5956 항체는, 모두 활성화 CCL15에 의해 유도되는 THP-1의 유주를 농도 의존적으로 저해했다.
이상으로부터, 본 발명의 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체는, 모두 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 항체인 것이 명확해졌다.
[실시예 7] 항인간 CCR1 항체의 인간 CCR1 결합 영역의 결정
실시예 5에서 얻어진 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체의 인간 CCR1의 결합 영역을, CCR1-CCR3 키메라 수용체 발현 세포를 사용하여 FCM으로 조사했다. 측정은 실시예 4와 동일한 방법으로 행하였다.
CCR1-CCR3 키메라 수용체 발현 세포로서, 실시예 2에서 제작한 CHO-S-hCCR3, CHO-S-NC3-hCCR1, CHO-S-NC3-mCCR1, 및 CHO-S-hCCR3_EL2hCCR1을 사용했다. 또한, 네거티브 컨트롤로서 CHO-S를 사용했다.
피검 항체로서는, 10배 희석한 각 하이브리도마 배양 상청, 기존의 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체 53504 항체(R&D Technologies사) 및 마우스 항인간 CCR3 모노클로날 항체 444-11 항체(MBL사)를 사용했다.
측정 결과에 대하여, 어느 세포를, 어느 피검 항체(각 하이브리도마 배양 상청, 53504 항체 또는 444-11 항체) 및 2차 항체로 염색했을 때의 형광 강도를, 해당 세포를 2차 항체만으로 염색했을 때의 형광 강도로 제산했다. 얻어진 수치가 10 이상일 때는, 해당 피검 항체는 해당 세포에 결합한다고 판정하고, 10 미만일 때는, 해당 피검 항체는 해당 세포에 결합하지 않는다고 판정하고, 표 2 중에 각각 ○, ×로 나타냈다.
Figure pct00002
표 2로부터, 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체 KM5907 항체, KM5908 항체, KM5909 항체, KM5911 항체, KM5915 항체, KM5916 항체, KM5954 항체, KM5955 항체 및 KM5956 항체는, 모두 CHO-S-hCCR3에는 결합하지 않고, CHO-NC3-hCCR1 및 CHO-S-hCCR3_EL2hCCR1의 양쪽에 결합했다. 따라서 본 발명의 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체는 모두 인간 CCR1의 세포 외 루프2에 결합하는 것이 명확해졌다.
[실시예 8] 기존의 항인간 CCR1 항체와 항인간 CCR1 항체를 사용한 주화성 어세이
(1) 기존의 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체 2D4 항체의 조제
기존의 항인간 CCR1 항체인 2D4 항체(미국 특허 제6,756,035호 명세서)를 산생하는 하이브리도마(LS-125-2D4-11-10-1)를 ATCC로부터 입수했다. 본 하이브리도마를 Hybridoma-SFM(Thermo Fisher Scientific사)을 사용하여 배양하고, 배양 상청으로부터 항체를 정제했다. 정제는 Protein G Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare사)를 사용했다. 배양 상청을 원심 분리하고, 얻어진 배양 상청을 필터로 여과했다. 칼럼에 400μL의 담체를 충전하고, DPBS에 의해 버퍼를 치환했다. 해당 칼럼에 해당 배양 상청을 첨가하고, 담체에 항체를 흡착시킨 후에, 10mL의 DPBS로 2회 세정했다. 해당 칼럼에 0.4mL의 IgG Elution Buffer(Thermo Scientific사)를 첨가하여 항체를 용출시키고, 바로 0.1mL의 1M Tris-Cl(나카라이테스크사) pH8.6으로 항체 용액을 중화했다. NAP 칼럼(GE Healthcare사)을 사용하여 해당 항체 용액의 탈염과 DPBS로의 버퍼 치환을 행하여, 이후의 해석에 사용했다.
정제한 2D4 항체에 대하여, 환원 조건에서의 SDS-PAGE를 통상의 방법으로 행하여, 항체가 정제되어 있는 것을 확인했다.
또한, 2D4 항체의 인간 CCR1로의 결합 활성을, 실시예 4에 기재하는 방법에 준하여 FCM으로 확인했다. 2D4 항체는 0.1, 1μg/mL로 반응시키고, 세포는, 인간 CCR1 발현 세포로서 CHO-S-hCCR1을, 네거티브 컨트롤로서 CHO-S를 사용했다. 그 결과, 2D4 항체는, CHO-S에는 결합하지 않고, CHO-S-hCCR1에는 농도 의존적으로 결합했다. 따라서, 정제한 2D4 항체는, 시판되고 있는 141-2 항체(MBL사) 및 53504 항체(R&D Systems사)와 마찬가지로, 인간 CCR1로의 결합성을 갖고 있는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 주화성 어세이
기존의 항인간 CCR1 항체와, 실시예 5에서 얻어진 마우스 항인간 CCR1 항체 모노클로날 항체 KM5908 항체 및 KM5916 항체에 대하여, 실시예 6에 기재한 방법에 준하여 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 활성을 측정하고, 얻어진 결과를 항체마다 비교했다.
기존의 항인간 CCR1 항체로서는, (1)에서 제작한 2D4 항체 및 시판되고 있는 141-2 항체 및 53504 항체를 사용했다.
얻어진 결과를 도 2에 도시한다. 도 2에 도시한 바와 같이, 기존의 항인간 CCR1 항체인 2D4 항체, 141-2 항체, 및 53504 항체는, 모두 활성화 CCL15에 의해 유도되는 THP-1 세포의 유주를 저해하지 않는 한편, 본 발명의 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체 KM5908 항체 및 KM5916 항체는, 모두 농도 의존적으로 상기 세포의 유주를 저해했다.
실시예 6에서 기재한 바와 같이, 실시예 5에서 취득한 항인간 CCR1 항체는, 모두 본 실시예와 동일한 실험 조건에서, 항체 농도 의존적으로 활성화 CCL15에 의해 유도되는 THP-1 세포의 유주를 저해했다[도 1의 (a) 및 도 1의 (b)].
따라서, 기존의 항인간 CCR1 항체는, 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하지 않는 한편, 실시예 5에서 얻어진 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체 KM5907 항체, KM5908 항체, KM5909 항체, KM5911 항체, KM5915 항체, KM5916 항체, KM5954 항체, KM5955 항체 및 KM5956 항체는, 모두 인간 CCL15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 항체인 것이 나타났다.
[실시예 9] 유전자 재조합 항체의 제작
(1) 항체 가변 영역 유전자의 클로닝과 서열 결정
실시예 5에서 클로닝한 하이브리도마로부터 Trizol(Life Technologies사)을 사용하여 토탈 RNA를 추출하고, 5'-RACE법에 의해 항체 유전자를 증폭시켰다. RACE용 cDNA의 합성에는 SMARTer RACE Kit(Clontech사)를 사용했다. RACE용 cDNA 합성 과정에서 부가되는 서열에 특이적인 프라이머와, 마우스 Ig gamma쇄 또는 kappa쇄 증폭용 프라이머(서열 번호 11-14)를 사용한 PCR에 의해 항체 가변 영역 단편을 증폭시키고, 클로닝하여 해당 DNA 단편의 염기 서열을 확인했다.
실시예 5에서 얻어진 각 항인간 CCR1 항체에 대하여, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열, 해당 염기 서열로부터 추정되는 아미노산 서열 및 해당 아미노산 서열로부터 시그널 서열을 제외한 아미노산 서열을 나타내는 서열 번호를, 각각 표 3에 나타낸다. 또한, 본 발명의 각 항체의 CDR의 아미노산 서열을 나타내는 서열 번호를, 각각 표 4에 나타낸다.
Figure pct00003
Figure pct00004
(2) 키메라 항체의 발현 벡터의 제작
실시예 5에서 제작한 각 항인간 CCR1 항체에 대하여, 정상 영역을 S228P, L235E 및 R409K의 아미노산 개변을 포함하는 인간 IgG4 정상 영역(인간 IgG4PE_R409K)으로 치환한 키메라 항체를 이하에 기재하는 방법으로 제작했다. (1)에서 제작한 각 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열이 클로닝된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여, 상동 재조합용의 염기 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR으로 각 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 증폭시켰다. In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech사)를 사용하여, 해당 염기 서열을, N5KG4PE R409K 벡터[N5KG1 벡터(미국 특허 제6,001,358호 명세서) 중의 인간 IgG1의 정상 영역을 코드하는 염기 서열을, 상기한 아미노산 개변을 포함하는 변이 인간 IgG4의 정상 영역을 코드하는 염기 서열로 치환한 벡터(이하, N5KG4PE R409K 벡터라고 기재함)]에 연결시켜, 키메라 항체의 발현 벡터를 제작했다. 실험의 수순은 키트에 부속된 매뉴얼을 따랐다.
(3) 키메라 항체의 산생과 정제
(2)에서 제작한 발현 벡터 및 Expi293 Expression System(Life Technologies사)을 사용하여, 키메라 항체를 산생했다. 수순은 부속 매뉴얼에 따라 이하와 같이 행하였다. Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific사)를 2×106세포/mL의 밀도로 37℃, 24시간 배양하고, 그 후, 1반응당 1.25×108세포를, 42.5mL의 Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific사)에 더했다. Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific사)에 50μg의 플라스미드 DNA와 ExpiFectamin 293 Reagent(Thermo Fisher Scientific사)를 첨가하여, 30분간 정치한 후에, 해당 플라스미드 용액을 상기한 세포액에 첨가했다. 또한 하룻밤의 배양 후에, 해당 세포액에 ExpiFectamin 293 Transfection Enhancer를 첨가했다(배양 볼륨은 토탈 50mL). 해당 세포액을 7 내지 10일간 배양한 후에, 배양 상청을 회수했다.
항체의 정제에는, Protein G Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare사)를 사용했다. 회수한 배양 상청을 원심 분리하고, 얻어진 배양 상청을 필터로 여과했다. 칼럼에 400μL의 담체를 충전하고, DPBS에 의해 버퍼를 치환했다. 해당 칼럼에 배양 상청을 첨가하고, 단체에 항체를 흡착시킨 후에, 해당 칼럼을 10mL의 DPBS로 2회 세정했다. 해당 칼럼에 0.4mL의 IgG Elution Buffer(Thermo Scientific사)를 첨가하여 항체를 용출시키고, 곧 해당 항체 용액에 0.1mL의 1M Tris-Cl pH8.6을 더하여 중화했다. NAP 칼럼(GE Healthcare사)을 사용하여 해당 항체 용액을 탈염하고, 이후의 해석에 사용했다.
이와 같이 하여 얻어진 마우스 항인간 CCR1 모노클로날 항체 KM5907 항체, KM5908 항체, KM5909 항체, KM5911 항체, KM5915 항체, KM5916 항체, KM5954 항체, KM5955 항체 및 KM5956 항체의 키메라 항체를, 각각 chKM5907 항체, chKM5908 항체, chKM5909 항체, chKM5911 항체, chKM5915 항체, chKM5916 항체, chKM5954 항체, chKM5955 항체 및 chKM5956 항체라고 기재한다.
[실시예 10] 키메라 항체의 결합성의 평가
실시예 9에서 제작한 키메라 항체 chKM5907 항체, chKM5908 항체, chKM5909 항체, chKM5911 항체, chKM5915 항체, chKM5916 항체, chKM5954 항체, chKM5955 항체 및 chKM5956 항체에 대하여, 인간 및 마우스 CCR1로의 결합성을 실시예 4에 기재하는 방법에 준하여 FCM으로 측정했다. 인간 CCR1 발현 세포 및 마우스 CCR1 발현 세포로서는, 각각 실시예 2에서 제작한 CHO-S-hCCR1, CHO-S-mCCR1을 사용했다. 그 결과, chKM5955 항체는, 인간 CCR1에 결합하는 것이 나타났다. 기타의 키메라 항체는, 인간 및 마우스 CCR1의 양쪽에 결합하는 것이 나타났다.
[실시예 11] 키메라 항체를 사용한 주화성 어세이
실시예 9에서 제작한 키메라 항체 chKM5907 항체, chKM5908 항체, chKM5909 항체, chKM5911 항체, chKM5915 항체, chKM5916 항체, chKM5954 항체, chKM5955 항체 및 chKM5956 항체에 대하여, 실시예 6에 기재하는 방법에 준하여, 인간 CCR1 활성화를 저해하는 활성 측정했다. 그 결과, 어느 키메라 항체든, 활성화 인간 CCL15에 의한 THP-1의 유주를 저해하는 것이 나타났다.
[실시예 12] VL을 치환한 chKM5908 항체 개변체의 제작
chKM5908 항체의 가일층의 개량을 위해, chKM5908 항체의 VL을 다른 항 CCR1 키메라 항체의 VL과 치환한 항체의 제작을 검토했다. 치환하는 VL로서, 실시예 5에 기재된 방법으로 취득된 마우스 항인간 CCR1 항체를 바탕으로, 실시예 10에 기재된 방법으로 제작된 키메라 항체의 VL을 복수 종류 검토했다. 이 중, THP-1 유주 활성 등의 기준으로 선발된, VL이 chKM5914 항체의 것으로 치환된 chKM5908 항체 개변체의 제작에 대하여 이하에 기재한다.
(1) VL 치환 키메라 항체의 설계
치환되는 chKM5914의 VL은, chKM5908의 VL의 아미노산 서열과의 상동성이 높기 때문에 선택되었다. chKM5914 항체의 VL의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열, 해당 염기 서열로부터 추정되는, 시그널 서열을 포함하는 아미노산 서열 및 해당 아미노산 서열로부터 시그널 서열을 제외한 아미노산 서열을 각각 서열 번호 123, 124 및 125에 나타낸다. 또한, chKM5914 항체의 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을, 각각 서열 번호 126 내지 128에 나타낸다.
(2) 발현 벡터의 제작
chKM5914 항체의 VL 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열이 클로닝된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여, 상동 재조합용의 염기 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR로 각 항체의 VL 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 증폭시켰다. chKM5908VH 가변 영역에 대해서도 마찬가지로 증폭시켰다. In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech사)를 사용하여, 해당 염기 서열을, N5hK 벡터(L쇄용 발현 벡터) 또는 N5hG4PE_R409K 벡터(H쇄용 발현 벡터)에 연결시켜, 키메라 항체의 발현 벡터를 제작했다. 실험의 수순은 키트에 부속된 매뉴얼을 따랐다. 대장균 DH5α 적격 세포(다카라 바이오사)를 형질 전환하고, 얻어진 플라스미드의 시퀀스를 확인했다. 올바른 염기 서열이 삽입된 플라스미드를 산생하는 대장균의 콜로니를 선발하고, Nucleo Bond Xtra Midi EF 키트(다카라 바이오사)를 사용하여 플라스미드를 조제했다.
(3) VL 치환 키메라 항체의 산생과 정제
목적의 VL 치환 키메라 항체를, Expi293 Expression System Kit(Life Technologies사)를 사용하여 일과성으로 발현시켰다. 플라스미드의 도입의 방법은 첨부 서류를 따랐다. 경쇄의 발현 벡터와 중쇄의 발현 벡터는, 1:2의 비율로 혼합하여 도입했다. 플라스미드 도입 후의 세포를, 120mL의 배양액 중에서, 37℃, 5% CO2, 125rpm의 조건 하에서, 3일간 배양했다. 그 후, 세포 배양 현탁액의 원심 분리를 행하고, 0.2μm 필터(Thermo Scientific사)를 통해 배양 상청을 회수했다. 배양 상청으로부터 Mab Select SuRe(GE Healthcare사)를 사용한 어피니티 정제에 의해, 정제 항체를 취득했다.
구체적으로는, 칼럼에 충전한 레진을 PBS으로 평형화한 후, 당해 칼럼에 배양 상청을 첨가하고, PBS로 2회 세정하고, Wash 버퍼 1(PBS with 1M NaCl), Wash 버퍼 2(20mM 시트르산, 50mM NaCl, pH5.0)로 각 1회 세정 후, 용출 버퍼(20mM 시트르산, 50mM NaCl, pH3.4)를 사용하여 항체를 용출했다.
얻어진 항체 용액에 중화 버퍼(1M 인산-NaOH, pH7.0)를 1/10양 더하여 중화하고, NAP25(GE Healthcare사)를 사용하여 항체 용액의 용매를 PBS로 치환했다. 버퍼 치환 후의 항체 용액에 대하여, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units(밀리포어사)를 사용하여 한외 여과에 의한 농축을 행하고, Nanodrop(Thermo Scientific사)을 사용하여 흡광도 A280을 측정하고, 항체 용액의 농도의 측정과 조정을 행하였다. 이와 같이 하여 얻어진, chKM5908 항체의 VH와 chKM5914 항체의 VL을 포함하는 키메라 항체 개변체를, 이후의 기술에 있어서는 chKM5908' 항체라고 기재한다.
[실시예 13] chKM5908' 항체의 항원 결합 활성 및 THP-1 유주 저해 활성의 평가
실시예 2에서 제작한 CHO-S-hCCR1 세포를 사용한 플로우 사이토메트리에 의해, VL 치환 키메라 항체인 chKM5908' 항체의 항원 결합 활성을 측정했다. 세포를 원심 분리하여 모아서 상청을 제외하고, 2% 소 태아 혈청(FBS), 0.05% NaN3 및 1mM EDTA를 포함하는 PBS(Staining Medium, 이하 SM이라고 약기함)로 현탁했다. 이어서, 세포수를 1웰당 1×105개로 되도록 96웰 플레이트에 파종하고, 10000, 2000, 400, 80, 16 및 3.2ng/mL의 각 최종 농도의 chKM5908' 항체를 첨가하고, 4℃에서 60분간의 반응을 행하였다. 세포를 SM으로 세정한 후, SM으로 500배로 희석한 Goat F(ab')2 Anti-Human IgG PE(γchain specific)(Southern Biotech사)를 첨가하여, 4℃에서 60분간의 반응을 행하였다. SM으로 세포를 세정한 후, 세포를 50μL의 SM으로 재현탁하고, 형광 강도를 플로우 사이토메트리(FACS CantoII, BD 바이오사이언스사)로 측정했다.
데이터는 FlowJo 7.65(토미 디지털 바이오로지사)에 의해 해석하고, 각 농도에 있어서의 Geomean값으로부터 결합 강도를 비교했다. 그 결과, chKM5908' 항체는, CHO-S-hCCR1 세포에 대하여, chKM5908과 동등한 결합 활성을 갖고 있는 것을 알 수 있었다.
또한, chKM5908' 항체에 대하여, 실시예 6에 나타낸 방법으로, THP-1 유주 저해 활성의 측정을 행하였다. 항체 농도는 1μg/mL의 농도로 첨가했다. 그 결과, 도 3에 도시한 바와 같이, chKM5908' 항체는, chKM5908 항체와 동등 이상의 THP-1 유주 저해 활성을 갖고 있는 것을 알 수 있었다.
[실시예 14] CDR 개변 chKM5908' 항체 개변체의 제작 및 평가
(1) CDR의 아미노산을 개변한 키메라 항체 개변체의 제작과 평가
chKM5908' 항체를 기초로 하여 다시 CDR 개변을 행하는 것을 시도했다. 설계한 chKM5908 VH의 개변 VH를 표 5에 나타낸다. 또한 설계한 chKM5914 VL의 개변 VL을 표 6에 나타낸다. 또한, 이것들을 조합한 CDR 개변 키메라 항체 개변체를 표 7에 나타낸다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
이들 키메라 항체 개변체를 발현하기 위해 필요한 염기 서열을, 전합성에 의해, 또는 대응하는 변이를 도입한 프라이머를 사용한 어셈블 PCR에 의해 제작하고, 실시예 12-(2)에 나타낸 방법을 사용하여 발현 벡터에 도입하여 필요한 플라스미드를 제작했다. 이어서, 실시예 12-(3)에 나타낸 방법을 사용하여 키메라 항체 개변체를 취득했다.
얻어진 CDR 개변 키메라 항체 개변체 각각에 대하여 실시예 13에 나타낸 방법을 사용하여 항원 결합 활성을 측정하고, 아이소 타입 컨트롤 키메라 항체[Mol Immunol. 1996 Jun; 33(9): 759-68.에 기재된 DNP-1 항체의 VL 및 VH(GenBank 액세션 No.: VL U16688, VH U116687)를 코드하는 벡터를 사용하여, 실시예 12-(3)에 기재된 방법에 준하여 제작한 항체. 이하 chDNP1이라고 기재한다.)]에 비해 10배 이상의 형광 강도를 나타내는 것을, 인간 CCR1에 결합한다고 판정했다. 그 결과, 어느 CDR 개변 키메라 항체 개변체든, 항체 농도가 적어도 80ng/mL로부터, 인간 CCR1로의 결합성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
또한, 각각의 CDR 개변 항체에 대하여 실시예 13에 나타낸 방법을 사용하여 THP-1 유주 저해 활성을 평가했다. 그 결과, 어느 CDR 개변 키메라 항체 개변체든 활성화 인간 CCL15에 의한 THP-1의 유주를 저해하는 것을 알 수 있었다.
chKM5908' mut02, chKM5908' mut22 및 chKM5908' mut25에 대해서는 또한, 항체 농도가 10, 3, 1, 0.75, 0.5, 0.3, 0.1 및 0.05μg/mL의 조건에서 THP-1 유주 저해 활성의 측정을 행하였다. 결과를 도 4에 도시한다.
도 4에 도시한 바와 같이, 어느 항체든 항체 농도 의존적으로 THP-1 세포 유주를 저해했다. 또한, chKM5908' mut22는 chKM5908', chKM5908' mut02 및 chKM5908' mut25와 비교하여 동등 또는 그 이상의 저해 활성을 갖고 있는 것이 명확해졌다.
이후의 기술에 있어서는, chKM5908' mut22를 mAb5-06이라고 기재한다. mAb5-06의 VH 및 VL의 염기 서열 및 아미노산 서열 및 VH 및 VL 각각의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열의 서열 번호를 표 8에 나타낸다.
Figure pct00008
[실시예 15] mAb5-06, chKM5907, 및 chKM5916의 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 설계
(1) mAb5-06 인간화 항체의 VL 및 VH의 아미노산 서열의 설계
이하에 기재하는 방법으로, mAb5-06 인간화 항체의 각종 VL 및 VH의 아미노산 서열을 설계했다. 이후의 기술에서는 다양한 VL, VH의 아미노산 서열을 갖는 mAb5-06 인간화 항체의 총칭으로서, hzmAb5-06 항체라고 기재한다. VL 및 VH의 각각에 대하여, mAb5-06 항체의 FR의 아미노산 서열과, Kabat 등[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]에 보고되어 있는 인간 FR 콘센서스 서열과의 상동성을 비교했다. 그 결과, human subgroup(인간 서브그룹) L chain II(hSGLII) 및 human subgroup H chain II(hSGHII)가, 각각 mAb5-06 항체의 VL 및 VH의 FR의 아미노산 서열과 가장 상동성이 높았다.
따라서, hSGLII의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, 각각 서열 번호 126, 134 및 128로 표현되는 mAb5-06 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 이식하고, hzmAb5-06 LV0(서열 번호 135)을 설계했다. 또한, hSGHII의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, 각각 서열 번호 75, 131 및 77로 표현되는 mAb5-06 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 이식하고, hzmAb5-06 HV0(서열 번호 136)을 설계했다.
상기와 같이 설계한 hzmAb5-06 LV0 및 hzmAb5-06 HV0는, 선택한 인간 항체의 FR의 아미노산 서열에, 마우스 유래 항체의 CDR 개변체인 mAb5-06 유래의 CDR의 아미노산 서열만을 이식한 아미노산 서열이다. 그러나, 일반적으로, 인간화 항체를 제작하는 경우에는, 단순히 설치류 유래 항체의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 FR의 아미노산 서열로 이식하는 것만으로는, 인간화 항체의 생물 활성이 저하되어 버리는 경우가 많다. 이와 같은 결합 활성의 저하를 회피하기 위해, CDR의 아미노산 서열의 이식과 함께, 인간 항체와 설치류 항체에서 상이한 FR의 아미노산 잔기 중, 항체의 결합 활성에 영향을 끼친다고 생각되는 아미노산 잔기를 개변하는 것이 행해지고 있다. 그래서, 본 실시예에 있어서도, 항체의 결합 활성에 영향을 끼친다고 생각되는 FR의 아미노산 잔기를 이하와 같이 하여 동정하고, 개변했다.
이후의 기술에 있어서는, 상기에서 설계한 hzmAb5-06 LV0 및 hzmAb5-06 HV0을 각각 VL, VH에 갖는 항체를 hzmAb5-06 LV0HV0 항체 또는 단순히 hzmAb5-06 LV0 HV0이라고 기재한다. 다른 hzmAb5-06 항체에 대해서도 동일한 방법으로 기재한다. hzmAb5-06 LV0HV0 항체의 가변 영역의 삼차원 구조를 컴퓨터 모델링의 방법을 사용하여 구축했다.
삼차원 구조 좌표 제작 및 삼차원 구조의 표시에는, Discovery Studio(BIOVIA사)를 사용했다. 또한, mAb5-06 항체의 가변 영역의 삼차원 구조의 컴퓨터 모델도 마찬가지로 하여 구축했다. 또한, hzmAb5-06 LV0HV0 항체의 VL 및 VH의 FR의 아미노산 서열 중에서, mAb5-06 항체와 상이한 아미노산 잔기를, mAb5-06 항체의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 치환한 아미노산 서열을 작성하고, 마찬가지로 삼차원 구조 모델을 구축했다. 이들 제작한 mAb5-06 항체, hzmAb5-06 LV0HV0 항체 및 개변체의 가변 영역의 삼차원 구조를 비교하여, 항체의 결합 활성에 영향을 끼친다고 예측되는 아미노산 잔기를 동정했다.
그 결과, hzmAb5-06 LV0HV0 항체의 가변 영역의 FR의 아미노산 잔기 중에서, 항원 결합 부위의 삼차원 구조를 변화시켜, 항체의 결합 활성에 영향을 끼친다고 생각되는 아미노산 잔기로서, VL에서는, 서열 번호 135로 표현되는 아미노산 서열의 2번째의 Ile, 15번째의 Pro, 50번째의 Gln, 92번째의 Tyr, 및 109번째의 Val을, VH에서는, 서열 번호 136으로 표현되는 아미노산 서열의 6번째의 Glu, 20번째의 Leu, 27번째의 Gly, 29번째의 Val, 30번째의 Ser, 37번째의 Ile, 48번째의 Ile, 67번째의 Val, 71번째의 Val, 73번째의 Thr, 76번째의 Asn, 78번째의 Phe, 80번째의 Leu, 82번째의 Leu, 85번째의 Val, 92번째의 Val, 및 97번째의 Arg를, 각각 선택했다. 이들 선택한 아미노산 잔기 중, 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기를, mAb5-06 항체의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하여, 다양한 개변을 갖는 인간화 항체의 VL 및 VH를 설계했다.
구체적으로는, VL에 대해서는, 서열 번호 135로 표현되는 아미노산 서열의 2번째의 Ile를 Val로, 15번째의 Pro를 Leu로, 50번째의 Gln을 Lys로, 92번째의 Tyr을 Phe로, 및 109번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변을 도입했다. 이에 의해, hzmAb5-06 항체의 VL로서, hzmAb5-06 LV0(서열 번호 135), LV1a(서열 번호 137), LV1b(서열 번호 138), LV2a(서열 번호 139), LV2b(서열 번호 140), LV4(서열 번호 141), 및 LV5(서열 번호 142)를 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 5에 도시한다.
또한, VH에 대해서는, 서열 번호 136으로 표현되는 아미노산 서열의 6번째의 Glu를 Gln으로, 20번째의 Leu를 Ile로, 27번째의 Gly를 Phe로, 29번째의 Val을 Leu로, 30번째의 Ser을 Asn으로, 37번째의 Ile를 Val로, 48번째의 Ile를 Leu로, 67번째의 Val을 Leu로, 71번째의 Val을 Lys로, 73번째의 Thr을 Asp로, 76번째의 Asn을 Ser로, 78번째의 Phe를 Val로, 80번째의 Leu를 Phe로, 82번째의 Leu를 Met로, 85번째의 Val을 Leu로, 92번째의 Val을 Ile로, 및 97번째의 Arg를 Lys로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변을 도입했다. 이에 의해, hzmAb5-06 항체의 VH로서, hzmAb5-06 HV0(서열 번호 136), HV14(서열 번호 143), 및 HV17(서열 번호 144)을 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 6에 도시한다.
(2) chKM5907 인간화 항체의 VL 및 VH의 아미노산 서열의 설계 chKM5907 인간화 항체의 각종 VL 및 VH의 아미노산 서열에 대해서도, 실시예 15 (1)과 동일한 방법으로 설계했다. 이후의 기술에서는 다양한 VL, VH의 아미노산 서열을 갖는 chKM5907 인간화 항체의 총칭으로서, hzKM5907 항체라고 기재한다. GenBank 액세션 넘버 ABG38363.1(immunoglobulin light chain variable region, partial[Homo sapiens])로 표현되는 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, KM5907 항체의 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열(각각 서열 번호 72, 73 및 74)을 이식함으로써, hzKM5907 LV0(서열 번호 145)을 설계했다.
또한, 인간 중쇄 V영역 점 라인 VH3-23(FR1 내지 3) 및 hSGHI(FR4)를 결합한 인간 항체의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, KM5907 항체 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열(각각 서열 번호 69, 70 및 71)을 이식함으로써, hzKM5907 HV0(서열 번호 146)을 설계했다.
hzKM5907 항체의 결합 활성에 영향을 끼친다고 생각되는 FR의 아미노산 잔기에 대해서도, hzmAb5-06 항체의 경우와 동일한 방법으로 VL, VH에 관하여 각각 선택했다. 선택한 아미노산 잔기 중, 적어도 하나 이상의 아미노산 서열을 KM5907 항체가 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하고, 다양한 개변을 갖는 인간화 항체의 VL 및 VH를 설계했다.
구체적으로는, VL에 대해서는, 서열 번호 145로 표현되는 아미노산 서열의 2번째의 Ile를 Val로, 15번째의 Ser을 Leu로, 19번째의 Ala를 Val로, 43번째의 Gln을 Lys로, 50번째의 Gln을 Lys로, 및 109번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변을 도입했다. 이에 의해, hzKM5907 항체의 VL로서, hzKM5907 LV0(서열 번호 145), LV1a(서열 번호 147), LV1b(서열 번호 148), LV1c(서열 번호 149), LV2a(서열 번호 150), LV2b(서열 번호 151), LV4(서열 번호 152), 및 LV6(서열 번호 153)을 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 7에 도시한다.
또한, VH에 대해서는, 서열 번호 146으로 표현되는 아미노산 서열의 4번째의 Leu를 Val로, 44번째의 Gly를 Arg로, 49번째의 Ser을 Ala로, 92번째의 Ala를 Gly로, 93번째의 Val을 Met로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 98번째의 Lys를 Arg로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변을 도입했다. 이에 의해, hzKM5907 항체의 VH로서, hzKM5907 HV0(서열 번호 146), HV1(서열 번호 154), HV2a(서열 번호 155), HV2b(서열 번호 156), HV3a(서열 번호 157), HV3b(서열 번호 158), HV3c(서열 번호 159), HV4(서열 번호 160), 및 HV7(서열 번호 161)을 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 8에 도시한다.
이후의 기술에 있어서는, hzKM5907 LV0 및 hzKM5907 HV0을 각각 VL, VH에 갖는 항체를 hzKM5907 LV0HV0 항체 또는 hzKM5907 LV0HV0이라고 기재한다. 기타의 hzKM5907 항체에 대해서도 동일한 방법으로 기재한다.
(3) chKM5916 인간화 항체의 VL 및 VH의 아미노산 서열의 설계 chKM5916인간화 항체의 각종 VL 및 VH의 아미노산 서열에 대해서도, 실시예 15 (1)과 동일한 방법으로 설계했다. 이후의 기술에서는 다양한 VL, VH의 아미노산 서열을 갖는 chKM5916 인간화 항체의 총칭으로서, hzKM5916 항체라고 기재한다. PIR 액세션 넘버 S52789(Ig kappa chain V region-human(fragment))로 표현되는 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, KM5916 항체의 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열(각각 서열 번호 102, 103 및 104)을 이식함으로써, hzKM5916 LV0(서열 번호 162)을 설계했다.
또한, GenBank 액세션 넘버 AAX82494.1(anti-Plasmodium falciparum merozoite surface protein 3 immunoglobulin heavy chain variable region, partial[Homo sapiens])로 표현되는 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, KM5916 항체 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열(각각 서열 번호 99, 100 및 101)을 이식함으로써, hzKM5916 HV0(서열 번호 163)을 설계했다.
hzKM5916 항체의 결합 활성에 영향을 끼친다고 생각되는 FR의 아미노산 잔기에 대해서도, hzmAb5-06 항체의 경우와 동일한 방법으로 VL, VH에 관하여 각각 선택했다. 선택한 아미노산 잔기 중, 적어도 하나 이상의 아미노산 서열을 KM5916 항체의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하여, 다양한 개변을 갖는 인간화 항체의 VL 및 VH를 설계했다.
구체적으로는, VL에 대해서는, 서열 번호 162로 표현되는 아미노산 서열의 38번째의 Gln을 His로, 및 43번째의 Ala를 Gly로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변을 도입했다. 이에 의해, hzKM5916 항체의 VL로서, hzKM5916 LV0(서열 번호 162), 및 LV2(서열 번호 164)를 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 9에 도시한다.
또한, VH에 대해서는, 서열 번호 163으로 표현되는 아미노산 서열의 42번째의 Asp를 Glu로, 87번째의 Lys를 Arg로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변을 도입했다. 이에 의해, hzKM5916 항체의 VH로서, hzKM5907 HV0(서열 번호 163), HV1(서열 번호 165), 및 HV3(서열 번호 166)을 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 도 10에 도시한다.
이후의 기술에 있어서는, hzKM5916 LV0 및 hzKM5916 HV0을 각각 VL, VH에 갖는 항체를 KM5916 LV0HV0 항체 또는 hzKM5916 LV0HV0이라고 기재한다. 기타의 hzKM5916 항체에 대해서도 동일한 방법으로 기재한다.
(4) 인간화 항체의 가변 영역 유전자의 설계 표 9에 나타내는 인간화 항체(hzmAb5-06 항체, hzKM5907 항체, hzKM5916 항체)의 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을, 동물 세포에서 고빈도로 사용되는 코돈을 사용하여 설계했다.
Figure pct00009
[실시예 16] 인간화 항체의 제작 및 평가
실시예 15-(4)에서 설계한 염기 서열을, 실시예 12-(2)에 나타낸 방법을 사용하여 발현 벡터에 도입하여 필요한 플라스미드를 제작했다. 단, VL 발현 벡터로서는 시그널 서열 및 인간 κ쇄 정상 영역 서열을 가진 pCI-OtCMV_hK 벡터를, VH 발현 벡터로서는 시그널 서열 및 인간 γ쇄 정상 영역 서열을 가진 pCI-OtCAG_hG4PE(R409K) 벡터를 사용했다.
이어서, 실시예 12-(3)에 나타낸 방법을 사용하여 개변 항체의 취득을 행하였다. SDS-PAGE에 의한 품질 확인을 행한 후에, 실시예 13에 나타낸 방법을 사용하여 항원 결합 활성의 측정을 행하고, 아이소타입 컨트롤 인간화 항체[chDNP1을 바탕으로 실시예 15에 기재된 방법에 준하여 설계(인간 FR 서열로서는 콘센서스 서열을 사용)하고, 실시예 12-(3)에 기재된 방법에 준하여 제작한 항체이고, 각각 서열 번호 167 및 168로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 VH를 갖는다. 이하 hzDNP1이라고 기재한다.)]에 비해 10배 이상의 형광 강도를 나타내는 것을, 인간 CCR1에 결합한다고 판정했다. 그 결과, 어느 인간화 항체든, 항체 농도가 적어도 80ng/mL로부터, 인간 CCR1로의 결합성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
이어서, 제작한 모든 인간화 항체에 대하여, THP-1 유주 저해 활성의 평가를 행하였다. 그 결과, 어느 인간화 항체든 THP-1 유주 저해 활성을 갖는 것이 나타났다. hzmAb5-06 LV5HV14, hzKM5907 LV2bHV3a 및 hzKM5916 LV2HV0에 대해서는 또한, 항체 농도가 10, 3, 1, 0.75, 0.5, 0.3, 0.1 및 0.05μg/mL의 조건에서 THP-1 유주 저해 활성을 평가했다. 그 결과, 도 11에 도시한 바와 같이, 어느 인간화 항체든 항체 농도가 0.3μg/mL 이상이면 THP-1 유주 저해 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
본 발명을 특정한 양태를 참조하여 상세하게 설명했지만, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나는 일 없이 다양한 변경 및 수정이 가능한 것은, 당업자에게 있어서 명확하다. 또한, 본 출원은, 2017년 7월 18일자로 출원된 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2017-139157)에 기초하고, 그 전체가 인용에 의해 원용된다. 또한, 여기에 인용되는 모든 참조는 전체적으로 도입된다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 6-인공 서열의 설명: NC3-hCCR1의 염기 서열
서열 번호 7-인공 서열의 설명: NC3-mCCR1의 염기 서열
서열 번호 8-인공 서열의 설명: hCCR3_EL2hCCR1의 염기 서열
서열 번호 9-인공 서열의 설명: hCCR3_EL2mCCR1의 염기 서열
서열 번호 10-인공 서열의 설명: N말단 hCCR1 peptide의 아미노산 서열
서열 번호 11-인공 서열의 설명: 프라이머_mouse_gamma_r1의 염기 서열
서열 번호 12-인공 서열의 설명: 프라이머_mouse_gamma_r2의 염기 서열
서열 번호 13-인공 서열의 설명: 프라이머_mouse_kappa_r1의 염기 서열
서열 번호 14-인공 서열의 설명: 프라이머_mouse_kappa_r2의 염기 서열
서열 번호 51-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5907 VH의 아미노산 서열
서열 번호 52-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5907 VL의 아미노산 서열
서열 번호 53-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5908 VH의 아미노산 서열
서열 번호 54-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5908 VL의 아미노산 서열
서열 번호 55-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5909 VH의 아미노산 서열
서열 번호 56-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5909 VL의 아미노산 서열
서열 번호 57-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5911 VH의 아미노산 서열
서열 번호 58-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5911 VL의 아미노산 서열
서열 번호 59-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5915 VH의 아미노산 서열
서열 번호 60-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5915 VL의 아미노산 서열
서열 번호 61-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5916 VH의 아미노산 서열
서열 번호 62-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5916 VL의 아미노산 서열
서열 번호 63-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5954 VH의 아미노산 서열
서열 번호 64-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5954 VL의 아미노산 서열
서열 번호 65-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5955 VH의 아미노산 서열
서열 번호 66-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5955 VL의 아미노산 서열
서열 번호 67-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5956 VH의 아미노산 서열
서열 번호 68-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 KM5956 VL의 아미노산 서열
서열 번호 69-인공 서열의 설명: KM5907 VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 70-인공 서열의 설명: KM5907 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 71-인공 서열의 설명: KM5907 VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 72-인공 서열의 설명: KM5907 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 73-인공 서열의 설명: KM5907 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 74-인공 서열의 설명: KM5907 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 75-인공 서열의 설명: KM5908 VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 76-인공 서열의 설명: KM5908 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 77-인공 서열의 설명: KM5908 VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 78-인공 서열의 설명: KM5908 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 79-인공 서열의 설명: KM5908 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 80-인공 서열의 설명: KM5908 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 81-인공 서열의 설명: KM5909 VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 82-인공 서열의 설명: KM5909 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 83-인공 서열의 설명: KM5909 VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 84-인공 서열의 설명: KM5909 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 85-인공 서열의 설명: KM5909 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 86-인공 서열의 설명: KM5909 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 87-인공 서열의 설명: KM5911 VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 88-인공 서열의 설명: KM5911 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 89-인공 서열의 설명: KM5911 VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 90-인공 서열의 설명: KM5911 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 91-인공 서열의 설명: KM5911 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 92-인공 서열의 설명: KM5911 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 93-인공 서열의 설명: KM5915 VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 94-인공 서열의 설명: KM5915 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 95-인공 서열의 설명: KM5915 VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 96-인공 서열의 설명: KM5915 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 97-인공 서열의 설명: KM5915 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 98-인공 서열의 설명: KM5915 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 99-인공 서열의 설명: KM5916 VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 100-인공 서열의 설명: KM5916 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 101-인공 서열의 설명: KM5916 VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 102-인공 서열의 설명: KM5916 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 103-인공 서열의 설명: KM5916 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 104-인공 서열의 설명: KM5916 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 105-인공 서열의 설명: KM5954 VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 106-인공 서열의 설명: KM5954 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 107-인공 서열의 설명: KM5954 VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 108-인공 서열의 설명: KM5954 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 109-인공 서열의 설명: KM5954 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 110-인공 서열의 설명: KM5954 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 111-인공 서열의 설명: KM5955 VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 112-인공 서열의 설명: KM5955 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 113-인공 서열의 설명: KM5955 VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 114-인공 서열의 설명: KM5955 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 115-인공 서열의 설명: KM5955 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 116-인공 서열의 설명: KM5955 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 117-인공 서열의 설명: KM5956 VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 118-인공 서열의 설명: KM5956 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 119-인공 서열의 설명: KM5956 VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 120-인공 서열의 설명: KM5956 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 121-인공 서열의 설명: KM5956 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 122-인공 서열의 설명: KM5956 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 125-인공 서열의 설명: 시그널 서열을 제외한 chKM5914 VL의 아미노산 서열
서열 번호 126-인공 서열의 설명: chKM5914 VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 127-인공 서열의 설명: chKM5914 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 128-인공 서열의 설명: chKM5914 VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 129-인공 서열의 설명: mAb5-06 VH의 염기 서열
서열 번호 130-인공 서열의 설명: mAb5-06 VH의 아미노산 서열
서열 번호 131-인공 서열의 설명: mAb5-06 VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 132-인공 서열의 설명: mAb5-06 VL의 염기 서열
서열 번호 133-인공 서열의 설명: mAb5-06 VL의 아미노산 서열
서열 번호 134-인공 서열의 설명: mAb5-06 VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 135-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 LV0의 아미노산 서열
서열 번호 136-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 HV0의 아미노산 서열
서열 번호 137-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 LV1a의 아미노산 서열
서열 번호 138-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 LV1b의 아미노산 서열
서열 번호 139-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 LV2a의 아미노산 서열
서열 번호 140-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 LV2b의 아미노산 서열
서열 번호 141-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 LV4의 아미노산 서열
서열 번호 142-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 LV5의 아미노산 서열
서열 번호 143-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 HV14의 아미노산 서열
서열 번호 144-인공 서열의 설명: hzmAb5-06 HV17의 아미노산 서열
서열 번호 145-인공 서열의 설명: hzKM5907 LV0의 아미노산 서열
서열 번호 146-인공 서열의 설명: hzKM5907 HV0의 아미노산 서열
서열 번호 147-인공 서열의 설명: hzKM5907 LV1a의 아미노산 서열
서열 번호 148-인공 서열의 설명: hzKM5907 LV1b의 아미노산 서열
서열 번호 149-인공 서열의 설명: hzKM5907 LV1c의 아미노산 서열
서열 번호 150-인공 서열의 설명: hzKM5907 LV2a의 아미노산 서열
서열 번호 151-인공 서열의 설명: hzKM5907 LV2b의 아미노산 서열
서열 번호 152-인공 서열의 설명: hzKM5907 LV4의 아미노산 서열
서열 번호 153-인공 서열의 설명: hzKM5907 LV6의 아미노산 서열
서열 번호 154-인공 서열의 설명: hzKM5907 HV1의 아미노산 서열
서열 번호 155-인공 서열의 설명: hzKM5907 HV2a의 아미노산 서열
서열 번호 156-인공 서열의 설명: hzKM5907 HV2b의 아미노산 서열
서열 번호 157-인공 서열의 설명: hzKM5907 HV3a의 아미노산 서열
서열 번호 158-인공 서열의 설명: hzKM5907 HV3b의 아미노산 서열
서열 번호 159-인공 서열의 설명: hzKM5907 HV3c의 아미노산 서열
서열 번호 160-인공 서열의 설명: hzKM5907 HV4의 아미노산 서열
서열 번호 161-인공 서열의 설명: hzKM5907 HV7의 아미노산 서열
서열 번호 162-인공 서열의 설명: hzKM5916 LV0의 아미노산 서열
서열 번호 163-인공 서열의 설명: hzKM5916 HV0의 아미노산 서열
서열 번호 164-인공 서열의 설명: hzKM5916 LV2의 아미노산 서열
서열 번호 165-인공 서열의 설명: hzKM5916 HV1의 아미노산 서열
서열 번호 166-인공 서열의 설명: hzKM5916 HV3의 아미노산 서열
서열 번호 167-인공 서열의 설명: hzDNP1 VL의 아미노산 서열
서열 번호 168-인공 서열의 설명: hzDNP1 VH의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> National University Corporation, Kyoto University Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Anti-human CCR1 monoclonal antibody <130> W525071 <140> JP2017-139157 <141> 2017-07-18 <160> 168 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1068 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1068) <400> 1 atg gaa act cca aac acc aca gag gac tat gac acg acc aca gag ttt 48 Met Glu Thr Pro Asn Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Thr Thr Thr Glu Phe 1 5 10 15 gac tat ggg gat gca act ccg tgc cag aag gtg aac gag agg gcc ttt 96 Asp Tyr Gly Asp Ala Thr Pro Cys Gln Lys Val Asn Glu Arg Ala Phe 20 25 30 ggg gcc caa ctg ctg ccc cct ctg tac tcc ttg gta ttt gtc att ggc 144 Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Val Ile Gly 35 40 45 ctg gtt gga aac atc ctg gtg gtc ctg gtc ctt gtg caa tac aag agg 192 Leu Val Gly Asn Ile Leu Val Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Lys Arg 50 55 60 cta aaa aac atg acc agc atc tac ctc ctg aac ctg gcc att tct gac 240 Leu Lys Asn Met Thr Ser Ile Tyr Leu Leu Asn Leu 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912 Ile Ala Tyr Thr His Cys Cys Val Asn Pro Ile Ile Tyr Val Phe Val 290 295 300 ggt gaa cgg ttc tgg aag tac ctt cgg cag ctg ttt caa agg cat gtg 960 Gly Glu Arg Phe Trp Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe Gln Arg His Val 305 310 315 320 gct ata cca ctg gca aaa tgg ctg ccc ttc ctc tct gtg gac caa cta 1008 Ala Ile Pro Leu Ala Lys Trp Leu Pro Phe Leu Ser Val Asp Gln Leu 325 330 335 gaa agg acc agt tct ata tct cca tcc aca gga gaa cat gag ctc tct 1056 Glu Arg Thr Ser Ser Ile Ser Pro Ser Thr Gly Glu His Glu Leu Ser 340 345 350 gct ggc ttc tga 1068 Ala Gly Phe 355 <210> 4 <211> 355 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Glu Ile Ser Asp Phe Thr Glu Ala Tyr Pro Thr Thr Thr Glu Phe 1 5 10 15 Asp Tyr Gly Asp Ser Thr Pro Cys Gln Lys Thr Ala Val Arg Ala Phe 20 25 30 Gly Ala Gly Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Ile Gly 35 40 45 Val Val Gly Asn Val Leu Val Ile Leu Val Leu Met Gln His Arg Arg 50 55 60 Leu Gln Ser Met Thr Ser Ile Tyr Leu Phe Asn Leu Ala Val Ser Asp 65 70 75 80 Leu Val Phe Leu Phe 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Val Asn Pro Ile Ile Tyr Val Phe Val 290 295 300 Gly Glu Arg Phe Trp Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe Gln Arg His Val 305 310 315 320 Ala Ile Pro Leu Ala Lys Trp Leu Pro Phe Leu Ser Val Asp Gln Leu 325 330 335 Glu Arg Thr Ser Ser Ile Ser Pro Ser Thr Gly Glu His Glu Leu Ser 340 345 350 Ala Gly Phe 355 <210> 5 <211> 1068 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgacaacct cactagatac agttgagacc tttggtacca catcctacta tgatgacgtg 60 ggcctgctct gtgaaaaagc tgataccaga gcactgatgg cccagtttgt gcccccgctg 120 tactccctgg tgttcactgt gggcctcttg ggcaatgtgg tggtggtgat gatcctcata 180 aaatacagga ggctccgaat tatgaccaac atctacctgc tcaacctggc catttcggac 240 ctgctcttcc tcgtcaccct tccattctgg atacactatg tcagggggca taactgggtt 300 tttggccatg gcatgtgtaa gctcctctca gggttttatc acacaggctt gtacagcgag 360 atctttttca taatcctgct gacaatcgac aggtacctgg ccattgtcca tgctgtgttt 420 gcccttcgag cccggactgt cacttttggt gtcatcacca gcatcgtcac ctggggcctg 480 gcagtgctag cagctcttcc tgaatttatc ttctatgaga ctgaagagtt gtttgaagag 540 actctttgca gtgctcttta cccagaggat acagtatata gctggaggca tttccacact 600 ctgagaatga ccatcttctg tctcgttctc cctctgctcg ttatggccat ctgctacaca 660 ggaatcatca aaacgctgct gaggtgcccc agtaaaaaaa agtacaaggc catccggctc 720 atttttgtca tcatggcggt gtttttcatt ttctggacac cctacaatgt ggctatcctt 780 ctctcttcct atcaatccat cttatttgga aatgactgtg agcggagcaa gcatctggac 840 ctggtcatgc tggtgacaga ggtgatcgcc tactcccact gctgcatgaa cccggtgatc 900 tacgcctttg ttggagagag gttccggaag tacctgcgcc acttcttcca caggcacttg 960 ctcatgcacc tgggcagata catcccattc cttcctagtg agaagctgga aagaaccagc 1020 tctgtctctc catccacagc agagccggaa ctctctattg tgttttag 1068 <210> 6 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : nucleotide sequence of NC3-hCCR1 <400> 6 atgacaacct cactagatac agttgagacc tttggtacca catcctacta tgatgacgtg 60 ggcctgctct gtgaaaaagc tgataccaga gcatttgggg cccaactgct gccccctctg 120 tactccttgg tatttgtcat tggcctggtt ggaaacatcc tggtggtcct ggtccttgtg 180 caatacaaga ggctaaaaaa catgaccagc atctacctcc tgaacctggc catttctgac 240 ctgctcttcc tgttcacgct tcccttctgg atcgactaca agttgaagga tgactgggtt 300 tttggtgatg ccatgtgtaa gatcctctct gggttttatt acacaggctt gtacagcgag 360 atctttttca tcatcctgct gacgattgac aggtacctgg ccatcgtcca cgccgtgttt 420 gccttgcggg cacggaccgt cacttttggt gtcatcacca gcatcatcat ttgggccctg 480 gccatcttgg cttccatgcc aggcttatac ttttccaaga cccaatggga attcactcac 540 cacacctgca gccttcactt tcctcacgaa agcctacgag agtggaagct gtttcaggct 600 ctgaaactga acctctttgg gctggtattg cctttgttgg tcatgatcat ctgctacaca 660 gggattataa agattctgct aagacgacca aatgagaaga aatccaaagc tgtccgtttg 720 atttttgtca tcatgatcat cttttttctc ttttggaccc cctacaattt gactatactt 780 atttctgttt tccaagactt cctgttcacc catgagtgtg agcagagcag acatttggac 840 ctggctgtgc aagtgacgga ggtgatcgcc tacacgcact gctgtgtcaa cccagtgatc 900 tacgccttcg ttggtgagag gttccggaag tacctgcggc agttgttcca caggcgtgtg 960 gctgtgcacc tggttaaatg gctccccttc ctctccgtgg acaggctgga gagggtcagc 1020 tccacatctc cctccacagg ggagcatgaa ctctctgctg ggttctga 1068 <210> 7 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : nucleotide sequence of NC3-mCCR1 <400> 7 atgacaacct cactagatac agttgagacc tttggtacca catcctacta tgatgacgtg 60 ggcctgctct gtgaaaaagc tgataccaga gcatttgggg ctggactcct gccccccctg 120 tattctctag tgttcatcat tggagtggtg ggcaatgtcc tagtgattct ggtgctcatg 180 cagcatagga ggcttcaaag catgaccagc atctacctgt tcaacctggc tgtctctgat 240 ctggtcttcc ttttcacttt acctttctgg attgactaca agttgaaaga cgactggatt 300 tttggtgatg ccatgtgcaa gcttctctct gggttttatt acctgggttt atacagtgag 360 atcttcttta tcatcctgtt gacgattgac agatacctgg ccattgtcca tgctgtgttt 420 gccctgaggg cccgaactgt tacttttggc atcatcacca gtattatcac ctgggcccta 480 gccatcttag cttccatgcc tgccttatac ttttttaagg cccagtggga gttcactcac 540 cgtacctgta gccctcattt cccctacaag agcctgaagc agtggaagag gtttcaagct 600 ctaaagctaa accttcttgg actaattttg cctctgttag tcatgataat ctgctatgca 660 gggatcatca gaattctgct cagaagaccc agtgagaaga aggtcaaagc cgtgcgtctg 720 atatttgcta ttactcttct attcttcctc ctctggaccc cctacaatct gagtgtattt 780 gtttctgctt tccaagatgt tctattcacc aatcagtgtg agcagagtaa gcaactggac 840 ctggccatgc aggtgactga ggtgattgcc tacacccact gttgtgtcaa cccaatcatt 900 tatgtttttg tgggtgaacg gttctggaag taccttcggc agctgtttca aaggcatgtg 960 gctataccac tggcaaaatg gctgcccttc ctctctgtgg accaactaga aaggaccagt 1020 tctatatctc catccacagg agaacatgag ctctctgctg gcttctga 1068 <210> 8 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : nucleotide sequence of hCCR3_EL2hCCR1 <400> 8 atgacaacct cactagatac agttgagacc tttggtacca catcctacta tgatgacgtg 60 ggcctgctct gtgaaaaagc tgataccaga gcactgatgg cccagtttgt gcccccgctg 120 tactccctgg tgttcactgt gggcctcttg ggcaatgtgg tggtggtgat gatcctcata 180 aaatacagga ggctccgaat tatgaccaac atctacctgc tcaacctggc catttcggac 240 ctgctcttcc tcgtcaccct tccattctgg atacactatg tcagggggca taactgggtt 300 tttggccatg gcatgtgtaa gctcctctca gggttttatc acacaggctt gtacagcgag 360 atctttttca taatcctgct gacaatcgac aggtacctgg ccattgtcca tgctgtgttt 420 gcccttcgag cccggactgt cacttttggt gtcatcacca gcatcgtcac ctggggcctg 480 gcagtgctag cagctcttcc tgaatttatc ttttccaaga cccaatggga attcactcac 540 cacacctgca gccttcactt tcctcacgaa agcctacgag agtggaggca tttccacact 600 ctgagaatga ccatcttctg tctcgttctc cctctgctcg ttatggccat ctgctacaca 660 ggaatcatca aaacgctgct gaggtgcccc agtaaaaaaa agtacaaggc catccggctc 720 atttttgtca tcatggcggt gtttttcatt ttctggacac cctacaatgt ggctatcctt 780 ctctcttcct atcaatccat cttatttgga aatgactgtg agcggagcaa gcatctggac 840 ctggtcatgc tggtgacaga ggtgatcgcc tactcccact gctgcatgaa cccggtgatc 900 tacgcctttg ttggagagag gttccggaag tacctgcgcc acttcttcca caggcacttg 960 ctcatgcacc tgggcagata catcccattc cttcctagtg agaagctgga aagaaccagc 1020 tctgtctctc catccacagc agagccggaa ctctctattg tgttttag 1068 <210> 9 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : nucleotide sequence of hCCR3_EL2mCCR1 <400> 9 atgacaacct cactagatac agttgagacc tttggtacca catcctacta tgatgacgtg 60 ggcctgctct gtgaaaaagc tgataccaga gcactgatgg cccagtttgt gcccccgctg 120 tactccctgg tgttcactgt gggcctcttg ggcaatgtgg tggtggtgat gatcctcata 180 aaatacagga ggctccgaat tatgaccaac atctacctgc tcaacctggc catttcggac 240 ctgctcttcc tcgtcaccct tccattctgg atacactatg tcagggggca taactgggtt 300 tttggccatg gcatgtgtaa gctcctctca gggttttatc acacaggctt gtacagcgag 360 atctttttca taatcctgct gacaatcgac aggtacctgg ccattgtcca tgctgtgttt 420 gcccttcgag cccggactgt cacttttggt gtcatcacca gcatcgtcac ctggggcctg 480 gcagtgctag cagctcttcc tgaatttatc ttttttaagg cccagtggga gttcactcac 540 cgtacctgta gccctcattt cccctacaag agcctgaagc agtggaggca tttccacact 600 ctgagaatga ccatcttctg tctcgttctc cctctgctcg ttatggccat ctgctacaca 660 ggaatcatca aaacgctgct gaggtgcccc agtaaaaaaa agtacaaggc catccggctc 720 atttttgtca tcatggcggt gtttttcatt ttctggacac cctacaatgt ggctatcctt 780 ctctcttcct atcaatccat cttatttgga aatgactgtg agcggagcaa gcatctggac 840 ctggtcatgc tggtgacaga ggtgatcgcc tactcccact gctgcatgaa cccggtgatc 900 tacgcctttg ttggagagag gttccggaag tacctgcgcc acttcttcca caggcacttg 960 ctcatgcacc tgggcagata catcccattc cttcctagtg agaagctgga aagaaccagc 1020 tctgtctctc catccacagc agagccggaa ctctctattg tgttttag 1068 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of N-terminal hCCR1 peptide <400> 10 Cys Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Thr Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Gly Asp 1 5 10 15 Ala Thr Pro Ala Gln Lys 20 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : primer mouse_gamma_r1 <400> 11 gcacacyrct ggacagggat ccagagttcc 30 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : primer mouse_gamma_r2 <400> 12 cckyggtsyt gctggcyggg tg 22 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : primer mouse_kappa_r1 <400> 13 gaagcacacg actgaggcac ctccagatgt 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : primer_mouse_kappa_r2 <400> 14 gtaggtgctg tctttgctgt cctgatcagt 30 <210> 15 <211> 411 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(411) <400> 15 atg aac ttc ggg ctc agc ttg att ttc ctt gcc ctt att tta aaa ggt 48 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg cag gtg gtg gag tct ggg gga aac tta gtg aaa 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Lys 20 25 30 cct gga ggg tcc ctg aaa ctt tcc tgt tca gcc tct gga ttc act ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt cgc tat ggc atg tcc tgg gtt cgc cag act cca gac aag agg ctg 192 Ser Arg Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 gag tgg gtc gca tcc att agt gct act ttt act tac acc tac tat aca 240 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ala Thr Phe Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr 65 70 75 80 gac aat gtg aag ggg cgt ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac 288 Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 acc ctg tac cta caa atg agc agt ctg agg tct gag gac aca ggc atg 336 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Met 100 105 110 tat tac tgt aca aga caa gat aat tac gcc tgg ttt gat tcc tgg ggc 384 Tyr Tyr Cys Thr Arg Gln Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Asp Ser Trp Gly 115 120 125 caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca 411 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 16 <211> 137 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Arg Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ala Thr Phe Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Gln Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Asp Ser Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 17 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 17 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gtt 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Val 1 5 10 15 tcc aac agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Asn Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gtc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt att 144 Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 gtg cat agt aat gga aac acc ttt tta gaa tgg tac ctg aag aaa cca 192 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Lys Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tat aaa gtt tcc agc cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aag atc agg aga gtg gag gct gac gat ctg gga gtt tat tac tgc 336 Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 ttt caa ggt tca cat att ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aac ctg 384 Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu 115 120 125 gaa atc aaa 393 Glu Ile Lys 130 <210> 18 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Val 1 5 10 15 Ser Asn Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Lys Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu 115 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gct ggt gac act gcc ata tac 336 Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 tac tgt gcc aaa gac ggt agt aga tat tat act gct atg gac tac tgg 384 Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 414 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 20 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Met Ala Val Leu Val Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Asn Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Ala Gly Thr Thr Val Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 21 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 21 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 acc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cct cgc tcc ctg cct gtc 96 Thr Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Arg Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct cgt cag agc ctt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu 35 40 45 att cac agt aat gga atc acc ttt tta cat tgg tac ctg cag aag gca 192 Ile His Ser Asn Gly Ile Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ala 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc agg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336 Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 tct caa ggt aca cat gtt cct ccc acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384 Ser Gln Gly Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gaa atc aaa 393 Glu Ile Lys 130 <210> 22 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Thr Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Arg Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu 35 40 45 Ile His Ser Asn Gly Ile Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ala 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Gly Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 23 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(414) <400> 23 atg aac ttc ggg ctc agc ttg att ttc ctt gcc ctt att tta aaa ggt 48 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtg aag 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc tta 144 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 35 40 45 agt aat tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gac aag agg ctg 192 Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 gaa tgg gtc gca tcc att agt att ggc aat tac atc tat tat cta gac 240 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ile Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp 65 70 75 80 agt gtg aag ggg cga ttc acc atc tac aga gac aat gcc aag aac acc 288 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 ctg ttc ctg caa atg agg agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat 336 Leu Phe Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 cac tgt gca aga cag ggg aat gat tac gac tgg ttt act tac tgg ggc 384 His Cys Ala Arg Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Thr Tyr Trp Gly 115 120 125 caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc 414 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 130 135 <210> 24 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 35 40 45 Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ile Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Phe Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 His Cys Ala Arg Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Thr Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 130 135 <210> 25 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 25 atg aag ttg cct gtt aga ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gtt 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Val 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc gtt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val 35 40 45 gta cat act aat gga aac acc tat tta gag tgg tac ctg cag aaa cca 192 Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aag atc aac aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc 336 Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 ttt caa ggt tca cat ctt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aaa ctg 384 Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gag atc aaa 393 Glu Ile Lys 130 <210> 26 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Val 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val 35 40 45 Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 27 <211> 420 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 27 atg aac ttc ggg ctc aga ttg att ttc ctt gtc ctt act tta aaa ggt 48 Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gac gtg aag ttg gtg gag tct ggg gaa ggc tta gtg aag 96 Val Gln Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys 20 25 30 cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gct gcc tct gga ttc acg ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agc aga aat gcc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gag aag agg atg 192 Ser Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Met 50 55 60 gag tgg gtc gca tac att agt agt ggt ggt gat tac atc tac tat gca 240 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 gac act gtg aag ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aat gcc agg aac 288 Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 85 90 95 acc ctg tac ctg cga atg agc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg 336 Thr Leu Tyr Leu Arg Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 tat tac tgt aca aga ttc tcc tat ggt tac gca aaa aat gct ctg gac 384 Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Ser Tyr Gly Tyr Ala Lys Asn Ala Leu Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 28 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Met 50 55 60 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Arg Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Ser Tyr Gly Tyr Ala Lys Asn Ala Leu Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 29 <211> 378 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <400> 29 atg aga ccg tct att cag ttc ctg ggg ctc ttg ttg ttc tgg ctt cat 48 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 ggt gct cag tgt gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct 96 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gca tct ttg gga ggc aaa gtc acc atc act tgc aag gca agc caa gac 144 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 att aag aag tat ata gct tgg tac caa cac aag cct gga aaa ggt cct 192 Ile Lys Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 agg ctg ctc ata cat tac aca tct tca tta cag cca ggc atc cca tca 240 Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt gga agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 aac ctg gag cct gag gat att gca act tat tat tgt cta cag tat gat 336 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 tat ctt atg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 378 Tyr Leu Met Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 30 <211> 126 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Lys Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Tyr Leu Met Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 31 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(414) <400> 31 atg aac ttc ggg ctc agc ttg att ttc ctt gcc ctt att tta aaa ggt 48 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtg aag 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt aac tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gac aag agg ctg 192 Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 gag tgg gtc gca tcc att agt att ggc agt tac atc tat tat cta gac 240 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp 65 70 75 80 agt gtg aag ggg cga ttc acc atc tac aga gac aat gcc aag aac acc 288 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 ctg ttc ctg caa atg agg agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat 336 Leu Phe Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 cac tgt gca aga cag ggg aat gat tac gac tgg ttt gct tac tgg ggc 384 His Cys Ala Arg Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc 414 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 130 135 <210> 32 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Phe Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 His Cys Ala Arg Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 130 135 <210> 33 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <400> 33 atg aag ttg cct gtt aga ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag aac att 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile 35 40 45 gta cat act aat gga aac acc tat tta gag tgg tac ctg cag aaa cca 192 Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 ttt caa ggt tca cat ctt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384 Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gag atc aaa 393 Glu Ile Lys 130 <210> 34 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile 35 40 45 Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 35 <211> 420 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 35 atg aac ttc ggg ctc aga ttg att ctc ctt gtc ctt act tta aaa ggt 48 Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Leu Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc caa tgt gac gtg aag ctg gtg gag tct ggg gaa ggc tta gtg aag 96 Val Gln Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys 20 25 30 cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acg ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agc aga aat gcc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gag aag agg ctg 192 Ser Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 gag tgg gtc gca tac att agt agt ggt agt gat tac atc tac tat gca 240 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 gac act gtg aag ggc cga ttc act gtc tcc aga gac aat gcc agg aac 288 Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 85 90 95 acc ctg tac ctg caa atg acc agt ctg agg tct gag gac aca gcc atg 336 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 tat ttc tgt aca aga ttc tcg tat ggt tac gga aaa aat gct ccg gac 384 Tyr Phe Cys Thr Arg Phe Ser Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Ala Pro Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 36 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Leu Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Thr Arg Phe Ser Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Ala Pro Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 37 <211> 378 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <400> 37 atg aga ccg tct att cag ttc ctg ggg ctc ttg ttg ttc tgg ctt cat 48 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 ggt act cag tgt gac atc cag atg aca cag tca cca tcc tca ctg tct 96 Gly Thr Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gca tct ctg gga ggc aaa gtc acc atc act tgc aag gca agc caa gac 144 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 att aac aag tat ata gcg tgg tac caa cac aag cct gga caa ggt cct 192 Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Gly Pro 50 55 60 agg ctg ctc ata cat tac aca tct tca tta cag cca ggc atc cca tca 240 Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt gga agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 aac ctg gag cct gaa gat att gca act tat tat tgt cta cag tat gat 336 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 tat act atg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aga 378 Tyr Thr Met Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 115 120 125 <210> 38 <211> 126 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Thr Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Tyr Thr Met Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 115 120 125 <210> 39 <211> 429 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(429) <400> 39 atg gct gtc ctg gcg cta ctc ctc tgc ctg gtg act ttc cca agc tgt 48 Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 gcc ctg tcc cag gtg cag ctg aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg 96 Ala Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30 ccc tca caa agc ctg tcc atc aca tgc act gtc tct ggg ttc tca ttg 144 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 ccc aga tat act ata acc tgg gtt cgc cag cca cca gga aag ggt ctg 192 Pro Arg Tyr Thr Ile Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg ctt gga tta ata agg act ggt gga ggc aca att tat aat tca 240 Glu Trp Leu Gly Leu Ile Arg Thr Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Ser 65 70 75 80 gct ctc aaa tcc aga ctg agc atc agc aaa gac aac tcc aag agt caa 288 Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 gtt ttc ttg aaa atg aac agt ctg caa agt ggt gac aca gcc agg tac 336 Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Thr Ala Arg Tyr 100 105 110 tac tgt gcc aga aat gga gcc tac tat agt aag tcc ggt tct tac tgg 384 Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Ala Tyr Tyr Ser Lys Ser Gly Ser Tyr Trp 115 120 125 tac ttc gat gtc tgg ggc aca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 429 Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val 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aga gga caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 atg tct gta tct cta ggg gag gag atc acc cta acc tgc agt gcc agc 144 Met Ser Val Ser Leu Gly Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 tcg agt gta agt tac atg cac tgg tac cag cag aag tca ggc act tct 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser 50 55 60 ccc aaa ctc ttg att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct 240 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 tct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc ttt tat tct ctc aca atc 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 agc agt gtg gag gct gaa gat gct gcc gat tat tac tgt cat cag tgg 336 Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp 100 105 110 agt agt cat cca tgc acg ttc gga ggg gga acc aag ctg gaa ata aaa 384 Ser Ser His Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 42 <211> 128 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musculus <400> 44 Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 35 40 45 Arg Asp Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Thr Ala Ile Ser Tyr Val 65 70 75 80 Asp Lys Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Pro Tyr Ser Lys Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 45 <211> 396 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(396) <400> 45 atg aag ctg cct gtt ctg cta gtg gtg ctg cta ttg ttc acg agt cca 48 Met Lys Leu Pro Val Leu Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Thr Ser Pro 1 5 10 15 gcc tca agc agt gat gtt gtt ctg acc caa act cca ctc tct ctg cct 96 Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Leu Thr 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Pro Val Leu Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Thr Ser Pro 1 5 10 15 Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Asn Ile Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ile Lys Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Leu Lys 130 <210> 47 <211> 429 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(429) <400> 47 atg gct gtc ctg gcg cta ctc ctc tgc ctg gtg act ttc cca agc tgt 48 Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 gcc ctg tcc cag gtg cag ctg aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg 96 Ala Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30 ccc tca caa agc ctg tcc atc 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Mus musculus <400> 48 Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Ala Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Ala Arg Tyr Thr Ile Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Leu Ile Arg Thr Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Thr Ala Arg Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Gly Ser Tyr Trp 115 120 125 Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 49 <211> 384 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <400> 49 atg gat ttt cag gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt gcc tca 48 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 gtc atg atg tcc aga gga caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc 96 Val Met Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 atg tct gca tct cta ggg gag gag atc acc cta acc tgc agt gcc agc 144 Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 tcg agt gta act tac atg cac tgg tac cag cag aag tca ggc act tct 192 Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser 50 55 60 ccc aaa ctc ttg att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct 240 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 tct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc ttt tat tct ctc aca atc 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 agc agt gtg gag gct gaa gat gct gcc gat tat tac tgt cat cag tgg 336 Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp 100 105 110 agt agt cat cca tgc acg ttc gga ggg ggg gcc aag ctg gaa ata aaa 384 Ser Ser His Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Ala Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 50 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile 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amino acid sequence of KM5908 VL CDR1 <400> 78 Arg Ser Arg Gln Ser Leu Ile His Ser Asn Gly Ile Thr Phe Leu His 1 5 10 15 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5908 VL CDR2 <400> 79 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5908 VL CDR3 <400> 80 Ser Gln Gly Thr His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5909 VH CDR1 <400> 81 Asn Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5909 VH CDR2 <400> 82 Ser Ile Ser Ile Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5909 VH 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artificial sequence : amino acid sequence of KM5915 VH CDR2 <400> 94 Ser Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5915 VH CDR3 <400> 95 Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 96 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5915 VL CDR1 <400> 96 Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5915 VL CDR2 <400> 97 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5915 VL CDR3 <400> 98 Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 99 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5916 VH CDR1 <400> 99 Arg Asn Ala Met Ser 1 5 <210> 100 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5916 VH CDR2 <400> 100 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5916 VH CDR3 <400> 101 Phe Ser Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Ala Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 102 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5916 VL CDR1 <400> 102 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of KM5916 VL CDR2 <400> 103 Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro 1 5 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence : amino acid 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Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Thr Met Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 165 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> description of the artificial sequence: amino acid sequence of hzKM5916 HV1 <400> 165 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Ser Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Ala Pro Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 166 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> description of the artificial sequence: amino acid sequence of hzKM5916 HV3 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Claims (27)

  1. 인간 CC 케모카인 수용체1(CC chemokine receptor 1; 이하 CCR1이라고 약기함)의 세포 외 영역에 결합하여, 인간 CC 케모카인 리간드(chemokine ligand)(이하, CCL이라고 약기함)15에 의한 인간 CCR1의 활성화를 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, 인간 CCL15에 의해 유도되는 인간 CCR1 발현 세포의 유주를 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 CCR1의 세포 외 루프2 영역의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (n)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
    (a) 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region; 이하, VH라고 약기함)의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; 이하 CDR이라고 약기함)1 내지 3이, 각각 서열 번호 69, 70 및 71에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄 가변 영역(light chain variable region; 이하, VL이라고 약기함)의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 72, 73 및 74에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (b) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 75, 76 및 77에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 78, 79 및 80에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (c) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 81, 82 및 83에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 84, 85 및 86에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (d) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 87, 88 및 89에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 90, 91 및 92에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (e) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 93, 94 및 95에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 96, 97 및 98에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (f) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 99, 100 및 101에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 102, 103 및 104에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (g) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 105, 106 및 107에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 108, 109 및 110에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (h) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 111, 112 및 113에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 114, 115 및 116에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (i) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 117, 118 및 119에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 120, 121 및 122에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (j) VH의 CDR1이 서열 번호 75에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, VH의 CDR2가 서열 번호 76에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 76에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Ile를 Thr로, 9번째의 Val을 Ala로, 14번째의 Phe를 Ala로, 및 15번째의 Ile를 Ala로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VH의 CDR3이, 서열 번호 77에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 77에 기재되는 아미노산 서열 중 5번째의 Tyr을 Ala로, 및 7번째의 Thr을 Ala로 치환하는 개변의 적어도 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VL의 CDR1이, 서열 번호 126에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 126에 기재되는 아미노산 서열 중 15번째의 Phe를 Ala로 치환하는 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VL의 CDR2가, 서열 번호 127에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 127에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val를 Ile로, 및 5번째의 Arg를 Lys로 치환하는 개변의 적어도 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, VL의 CDR3이, 서열 번호 128에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (k) VH의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 75, 131 및 77에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL의 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 126, 134 및 128에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (l) 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 적어도 하나의 항체와, 인간 CCR1로의 결합에 대하여 경합하는 항체.
    (m) 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체.
    (n) 상기 (a) 내지 (k)에 기재된 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (j)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
    (a) VH가 서열 번호 51에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 52에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (b) VH가 서열 번호 53에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 54에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (c) VH가 서열 번호 55에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 56에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (d) VH가 서열 번호 57에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 58에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (e) VH가 서열 번호 59에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 60에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (f) VH가 서열 번호 61에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 62에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (g) VH가 서열 번호 63에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 64에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (h) VH가 서열 번호 65에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 66에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (i) VH가 서열 번호 67에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 68에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (j) VH가 서열 번호 130에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 133에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
    (a) VH가 서열 번호 136에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 136에 기재되는 아미노산 서열 중 6번째의 Glu를 Gln으로, 20번째의 Leu를 Ile로, 27번째의 Gly를 Phe로, 29번째의 Val을 Leu로, 30번째의 Ser을 Asn으로, 37번째의 Ile를 Val로, 48번째의 Ile를 Leu로, 67번째의 Val을 Leu로, 71번째의 Val을 Lys로, 73번째의 Thr을 Asp로, 76번째의 Asn을 Ser로, 78번째의 Phe를 Val로, 80번째의 Leu를 Phe로, 82번째의 Leu를 Met로, 85번째의 Val을 Leu로, 92번째의 Val을 Ile로, 및 97번째의 Arg를 Lys로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 135에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 135에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Ile를 Val로, 15번째의 Pro를 Leu로, 50번째의 Gln을 Lys로, 92번째의 Tyr을 Phe로, 및 109번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (b) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열 중 4번째의 Leu를 Val로, 44번째의 Gly를 Arg로, 49번째의 Ser을 Ala로, 92번째의 Ala를 Gly로, 93번째의 Val을 Met로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 98번째의 Lys를 Arg로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열 중 2번째의 Ile를 Val로, 15번째의 Ser을 Leu로, 19번째의 Ala를 Val로, 43번째의 Gln을 Lys로, 50번째의 Gln을 Lys로, 및 109번째의 Val을 Leu로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (c) VH가 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열 중 42번째의 Asp를 Glu로, 87번째의 Lys를 Arg로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환하는 아미노산 개변의 어느 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열 중 38번째의 Gln을 His로, 및 43번째의 Ala를 Gly로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  7. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (h)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
    (a) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 135에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (b) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 137에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (c) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 138에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (d) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 139에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (e) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 140에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (f) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 141에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (g) VH가 서열 번호 144에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 142에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (h) VH가 서열 번호 143에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 142에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  8. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (w)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
    (a) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (b) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 147에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (c) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 148에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (d) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 149에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (e) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 150에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (f) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (g) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 152에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (h) VH가 서열 번호 146에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 153에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (i) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 145에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (j) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 147에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (k) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 148에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (l) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 149에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (m) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 150에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (n) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (o) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 152에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (p) VH가 서열 번호 161에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 153에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (q) VH가 서열 번호 154에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (r) VH가 서열 번호 155에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (s) VH가 서열 번호 156에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (t) VH가 서열 번호 157에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (u) VH가 서열 번호 158에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (v) VH가 서열 번호 159에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (w) VH가 서열 번호 160에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 151에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  9. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하기 (a) 내지 (f)로부터 선택되는 어느 하나의 항체인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
    (a) VH가 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (b) VH가 서열 번호 163에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 164에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (c) VH가 서열 번호 165에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (d) VH가 서열 번호 165에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 164에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (e) VH가 서열 번호 166에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 162에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
    (f) VH가 서열 번호 166에 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL이 서열 번호 164에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  11. 제10항에 있어서, 유전자 재조합 항체가, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 하나의 유전자 재조합 항체인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이, Fab, Fab', (Fab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V영역(diabody), 디술피드 안정화 V영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 하나의 항체 단편인 항체 단편.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 코드하는 염기 서열을 갖는 핵산.
  15. 제14항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포.
  16. 제13항에 기재된 하이브리도마 또는 제15항에 기재된 형질 전환 세포를 배양하고, 배양액으로부터 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 채취하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는 인간 CCR1의 검출 또는 측정용 시약.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는 인간 CCR1 관련 질환의 진단약.
  19. 제18항에 있어서, 인간 CCR1 관련 질환이 암, 자기 면역 질환 또는 염증성 질환인 진단약.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 인간 CCR1 관련 질환의 치료약.
  21. 제20항에 있어서, 인간 CCR1 관련 질환이 암, 자기 면역 질환 또는 염증성 질환인 치료약.
  22. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 인간 CCR1 관련 질환의 진단 방법.
  23. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 인간 CCR1 관련 질환의 치료 방법.
  24. 인간 CCR1 관련 질환의 진단약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 사용.
  25. 인간 CCR1 관련 질환의 치료약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 사용.
  26. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CCR1 관련 질환의 치료약으로서의 사용을 위한 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  27. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CCR1 관련 질환의 진단약으로서의 사용을 위한 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
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