TWI707868B - 抗人類Ｇａｓ６單株抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種單株抗體或該抗體片段，該單株抗體係與人類生長抑制特異性蛋白6(hGas6，Human Growth Arrest Specific 6)特異性地結合之抗體，並且與人類Gas6之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基結合；包含編碼上述抗體或抗體片段之鹼基序列之核酸；包含含有上述核酸之載體之轉形細胞；上述抗體或抗體片段之製造方法；包含上述抗體或抗體片段之Gas6之檢測或測定用試劑；包含上述抗體或抗體片段作為有效成分之Gas6相關疾病之治療藥或診斷藥；或用以製造Gas6相關疾病之治療藥或診斷藥之上述抗體或抗體片段之用途。

Description

抗人類Gas6單株抗體
[相關申請]
本說明書包含作為本案之優先權基礎的美國臨時申請案US62/066,687(2014年10月21日提出申請)之說明書中所記載之內容。本發明係關於一種單株抗體或該抗體片段，該單株抗體係與人類生長抑制特異性蛋白6(hGas6，Human Growth Arrest Specific 6)特異性地結合之抗體，且與人類Gas6之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基結合；包含編碼上述抗體或抗體片段之鹼基序列之核酸；包含上述核酸之轉形細胞；上述抗體或抗體片段之製造方法；使用上述抗體或抗體片段之Gas6之檢測或測定用試劑；包含上述抗體或抗體片段作為有效成分之Gas6相關疾病之治療藥或診斷藥；或用以製造Gas6相關疾病之治療藥或診斷藥之上述抗體或抗體片段之用途。
生長抑制特異性蛋白6(Gas6，Growth Arrest Specific 6)(AXL酪胺酸激酶受體配體(AXL tyrosine kinase receptor ligand)；亦稱為AXLLG)係作為於血清饑餓狀態之細胞中表現亢進之基因之一而在1998年被選殖出(非專利文獻1)。Gas6由678個胺基酸構成，自N末端側起包含如下3個區之蛋白質：γ-羧基麩胺酸(Gla，γ-carboxy glutamic acid)區、表皮生長因子(EGF，epidermal growth factor)樣區、及包含2 個層連結蛋白G型(LG，laminin G)區之性激素結合球蛋白(SHBG，sex hormone binding globulin)樣區(非專利文獻2)。
關於Gas6，蛋白S與胺基酸序列之同源性高(44%)，被分類為與蛋白S相同之維生素K依賴性之Gla蛋白質家族。所謂Gla係麩胺酸殘基之γ位之碳被γ-麩胺醯羧化酶(GGCX)羧基化而成者(非專利文獻3)。未經Gla化之Gas6相較於經Gla化之Gas6，與受體之結合活性降低至十分之一左右(非專利文獻4)，生理活性亦降低。又，已知C末端之SHBG區係與受體Axl結合之區(非專利文獻5)。
作為其他維生素K依賴性蛋白質之凝血酶原或第X因子等主要於肝臟中合成，但Gas6於肝臟中幾乎未檢測到mRNA(非專利文獻2)。於人體內觀察到於肺、腸、骨髄、內皮中之mRNA表現，此外於小鼠體內於心臟或胃、腎臟中確認到mRNA表現。又，關於蛋白質濃度，確認到於人類血漿中以13~23ng/mL存在，且明確不存在因年齡或性別引起之偏差。除此以外，有報告稱Gas6剔除(KO)小鼠之妊娠、分娩正常，且於出生幼仔之體重、大小及繁殖能力方面並無問題(非專利文獻6)。
作為Gas6之受體，已知有Axl(Axl酪胺酸激酶(Axl receptor tyrosine kinase))、Sky(Rse、Tyro3蛋白酪胺酸激酶(Tyro3 protein tyrosine kinase))、Mer TK(Mer酪胺酸激酶原致癌基因(Mer tyrosine kinase protooncogene))之3種。該等3個受體均為1次跨膜型之酪胺酸激酶，細胞外區繼兩個免疫球蛋白(immunoglobulin)樣區之後，由兩個纖維結合蛋白(fibronectin)-III樣區構成(非專利文獻7)。Gas6與該等3種受體之親和性非常高。文獻所報告之解離常數(Kd值)不同，報告稱關於親和性較高者，於Axl時為5×10-11M，於Sky時為3×10-11M，於Mer時為3×10-10M(非專利文獻8)。
已知Gas6及Axl於腎病中表現量亢進(非專利文獻9、10)。又，於 使用作為進行性絲球體腎炎模型之NTN(Nephrotoxic nephritis，腎毒性腎炎)模型之試驗中，與野生型小鼠相比，對於Gas6 KO小鼠確認到顯著之病症抑制。又，確認到對於Gas6 KO小鼠被抑制之病症因投予Gas6而再次惡化(非專利文獻11)。進而，於表現出腎小球膜增殖性絲球體腎炎樣之病症之Thy1腎炎大鼠之腎臟中，確認到因引發病症所致之Gas6與Axl之表現亢進，於對Thy1腎炎大鼠投予Axl之Fc體之實驗中，確認到病症大幅度改善(非專利文獻12)。於作為慢性疾病之I型糖尿病性腎病(STZ(Streptozotocin，鏈佐黴素))模型中，亦確認到對於Gas6 KO小鼠病症得到抑制(非專利文獻13)。作為因Gas6之中和引起之腎病之惡化得到抑制之作用機理，報告有PDGF(Platelet Derived Growth Factor，血小板源性生長因子)之表現及腎小球膜細胞之增殖之抑制(非專利文獻14)、抗炎症作用(非專利文獻15)、或抗血小板作用(非專利文獻16、17)等。
又，近年來，關於Gas6及Gas6受體與癌之病症之關係亦有大量報告(非專利文獻18、19、20、21)。
迄今為止，作為抗人類Gas6單株抗體，已知有WG1(專利文獻1)及CNTO300(非專利文獻22)。有報告稱WG1及CNTO300具有於活體外抑制Gas6與作為其受體之Axl之結合之活性。又，尚不知曉其他Gas6中和抗體。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]US7547767
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Cell 54, 787-793 (1988)
[非專利文獻2]Mol Cell Biol 13, 4976-4985 (1993)
[非專利文獻3]Journal of Thrombosis and Haemostasis 3, 1873- 1878 (2005)
[非專利文獻4]FEBS Lett 408, 306-310 (1997)
[非專利文獻5]EMBO J 25, 80-87, (2006)
[非專利文獻6]Nat Med 7, 215-221, (2001)
[非專利文獻7]J Thromb Haemost 3, 733-741, (2005)
[非專利文獻8]Biochem J 387, 727-735, (2005)
[非專利文獻9]Am J Kidney Dis 43, 286-295 (2004)
[非專利文獻10]Transplant 27: 4166-4172 (2012)
[非專利文獻11]J Clin Invest 110, 239-246, doi: 10.1172/jci14861 (2002)
[非專利文獻12]Am J Pathol 158, 1423-1432, (2001)
[非專利文獻13]The Journal of biological chemistry 278, 20, 18229-18234 (2003)
[非專利文獻14]The Journal of biological chemistry 276, 45, 42364-42369 (2001)
[非專利文獻15]Blood 111, 8, 4096-4105 (2008)
[非專利文獻16]The Journal of Clinical Investigation 115, 237-246 (2005)
[非專利文獻17]Nature Medicine 7, 2, 215-221 (2001)
[非專利文獻18]The Journal of Clinical Investigation 123, 8, 3231-3242 (2013)
[非專利文獻19]Expert Opin Ther Targets. 14, 19, 1073-1090 (2010)
[非專利文獻20]Nature genetics 44, 8, 852-860 (2012)
[非專利文獻21]JOURNALOF CELLULAR PHYSIOLOGY 204, 36-44 (2005)
[非專利文獻22]Biochem. J., 727-735 387 (2005)
本發明之課題在於提供一種與人類Gas6之特定部位特異性地結合，具有較高之中和活性之新穎抗人類Gas6單株抗體、以及利用上述抗體之Gas6相關疾病之治療藥及診斷藥。
作為解決上述問題之方法，本發明提供一種人類Gas6單株抗體，其與人類Gas6之第314號、第315號及第316號中之至少一個胺基酸殘基結合。
即，本發明係關於以下之(1)至(19)。
(1)一種單株抗體或該抗體片段，其與人類Gas6之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基結合。
(2)如(1)中所記載之單株抗體或該抗體片段，其中單株抗體係與人類Gas6之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基結合者。
(3)如(1)或(2)中所記載之單株抗體或該抗體片段，其中單株抗體為選自下述(a)至(e)中之任一種抗體，(a)抗體之VH之CDR(complementarity determining region，互補決定區)1~3之胺基酸序列分別為序列編號79、80及81所記載之胺基酸序列，且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號82、83及84所記載之胺基酸序列之抗體；(b)抗體之VH之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號85、86及87所記載之胺基酸序列，且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號88、89及90所記載之胺基酸序列之抗體；(c)與上述(a)或(b)中所記載之抗體針對向人類Gas6之結合進行競爭之抗體； (d)與包含上述(a)或(b)中所記載之抗體所結合之抗原決定基之抗原決定基結合的抗體，即，針對向包含上述(a)或(b)中所記載之抗體所結合之抗原決定基之抗原決定基之結合進行競爭的抗體；(e)與和上述(a)或(b)中所記載之抗體所結合之抗原決定基相同之抗原決定基結合的抗體，即，針對向上述(a)或(b)中所記載之抗體所結合之抗原決定基之結合進行競爭的抗體。
(4)如(1)至(3)中任一項所記載之單株抗體或該抗體片段，其中單株抗體為選自下述(a)至(e)中之任一種抗體，(a)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號69所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號72所記載之胺基酸序列之抗體；(b)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號75所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號78所記載之胺基酸序列之抗體；(c)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號135所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號123所記載之胺基酸序列之抗體；(d)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號195所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號174所記載之胺基酸序列之抗體；(e)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號186所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號180所記載之胺基酸序列之抗體。
(5)如(1)至(4)中任一項所記載之單株抗體或該抗體片段，其中單株抗體為基因重組抗體。
(6)如(5)中所記載之單株抗體或該抗體片段，其中基因重組抗體係選自人類型嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體中之基因重組抗體。
(7)如(1)至(6)中任一項所記載之抗體片段，其中抗體片段係選自Fab、Fab'、(Fab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚物化V區(diabody，雙功能抗體)、二硫鍵穩定化V區(dsFv)及包含CDR之肽中。
(8)一種核酸，其具有編碼如(1)至(7)中任一項所記載之抗體或該 抗體片段之鹼基序列。
(9)一種轉形細胞，其包含如(8)中所記載之核酸。
(10)一種如(1)至(7)中所記載之抗體或該抗體片段之製造方法，其包括如下步驟：於培養基中培養如(9)中所記載之細胞，並自培養液採集該抗體或該抗體片段。
(11)一種Gas6之檢測或測定用試劑，其包含如(1)至(7)中所記載之抗體或該抗體片段(及視需要之藥理學上可容許之載體)。
(12)一種Gas6相關疾病之治療藥，其包含如(1)至(7)中所記載之抗體或該抗體片段(及視需要之藥理學上可容許之載體)作為有效成分。
(13)如(12)中所記載之治療藥，其中Gas6相關疾病為腎或癌之疾病。
(14)如(13)中所記載之治療藥，其中腎之疾病為進行性絲球體腎炎、腎小球膜增殖性絲球體腎炎、糖尿病性腎病或IgA腎病。
(15)如(13)中所記載之治療藥，其中癌之疾病為肺癌、乳癌、卵巢癌、攝護腺癌、胰臟癌、腎癌或神經膠母細胞瘤。
(16)一種Gas6相關疾病之診斷藥，其包含如(1)至(7)中所記載之抗體或該抗體片段(及視需要之藥理學上可容許之載體)作為有效成分。
(17)一種Gas6相關疾病之診斷方法，其包括如下步驟：使用如(1)至(7)中所記載之抗體或該抗體片段進行Gas6之檢測或測定。
(18)一種如(1)至(7)中任一項所記載之抗體或該抗體片段之用途，其用以製造Gas6相關疾病之治療藥。
(19)一種如(1)至(7)中任一項所記載之抗體或該抗體片段之用途，其用以製造Gas6相關疾病之診斷藥。
本發明之單株抗體係與人類Gas6之特定部位特異性地結合，抑制Gas6與Gas6受體之結合，而抑制Gas6受體表現細胞內之訊號傳遞之活化，或抑制Gas6受體表現細胞之細胞增殖之亢進。因此，本發明之單株抗體可用作Gas6相關疾病之治療藥及診斷藥。
圖1係藉由ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酶結合免疫吸附分析法)測定所取得之抗Gas6單株抗體對各種抗原之結合性而獲得之結果。ELISA係以N=2實施，於圖表中表示其平均值。任一圖表均以縱軸表示吸光度，且以橫軸表示抗體濃度(μg/mL)。使用(A)人類Gas6-F、(B)食蟹猴(Macaca fascicularis)Gas6-F、(C)大鼠Gas6-F、(D)小鼠Gas6-F、(E)BAP(Bone Alkaline Phosphatase，骨源性鹼性磷酸酶)-F、(F)蛋白S作為抗原。○為KM5320-mKG1抗體之結果，□為KM5321-mKG1抗體之結果，▲為CNTO抗體之結果。
圖2係針對抗Gas6單株抗體，評價各種Gas6與Axl之結合抑制活性((A)人類、(B)大鼠、(C)小鼠、(D)食蟹猴)而獲得之結果。實驗係以N=2實施，於圖表中表示其平均值。任一圖表均以縱軸表示吸光度，且以橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。○為KM5320-mKG1抗體之結果，■為KM5321-mKG1抗體之結果，▲為CNTO抗體之結果。
圖3係藉由報導基因分析(reporter assay)，評價抗Gas6單株抗體對細胞內訊號傳遞之作用而獲得之結果。實驗係以N=3實施，於圖表中表示其平均值。又，誤差條係使用標準偏差(SD)之值。圖表之縱軸表示發光強度，橫軸表示於細胞中強制表現之Gas6受體。白色柱為KM5320-mKG1抗體之結果，劃橫線之柱為KM5321-mKG1抗體之結果，黑色柱為同型對照之結果，劃斜線之柱為僅有培養基之結果。
圖4係針對抗Gas6單株抗體，藉由西方墨點法(western blotting)評價對因人類Gas6引起之Akt之磷酸化水準亢進之作用而獲得之結果。 關於圖中之記載為hGas6之項目，藉由+表示添加0.1μg/mL之hGas6時，且藉由-表示未添加hGas6時。圖中之記載為Ab之項目表示添加至孔中之試驗物質。KM5320表示KM5320-mKG1抗體，KM5321表示KM5321-mKG1抗體，同型表示IgG1同型對照(isotype control)(陰性對照)，Axl-hFc表示Axl受體之細胞外區與人類IgG1抗體之Fc區之融合蛋白(陽性對照)。各試驗物質名之下部所記載之數值表示濃度(μg/mL)。圖中之Axl、Akt及p-Akt分別表示Axl受體、Akt蛋白質、及磷酸化Akt蛋白質。
圖5係評價本發明之抗Gas6單株抗體KM5320抗體、KM5321抗體與CNTO抗體是否競爭地與hGas6結合而獲得之結果。實驗係以N=2實施，於圖表中表示其平均值。圖表之縱軸表示吸光度，且橫軸表示抗體濃度(μg/mL)。◇為僅為1%BSA(Bull Serum Albumin，牛血清蛋白)-PBS(Phosphate Buffer Solution，磷酸鹽緩衝液)(緩衝液)之結果，■為CNTO抗體之結果，▲為KM5320-mKG1抗體之結果，×為KM5321-mKG1抗體之結果。
圖6係針對抗Gas6單株抗體，評價癌細胞之細胞增殖抑制活性而獲得之結果。圖表之縱軸表示螢光量，橫軸表示添加至孔中之樣品名。圖中之Gas6表示hGas6-F，Axl-Fc表示Axl受體之細胞外區與IgG1抗體之人類Fc之融合蛋白(陽性對照)，KM5320表示KM5320-rKG1抗體，KM5321表示KM5321-rKG1抗體，DNP表示抗DNP(Dinitrophenol，二硝基苯酚)抗體(陰性對照)。
圖7表示不含訊號序列之KM5320抗體之輕鏈可變區及KM5320人類化抗體(以下記載為hzKM5320抗體)之輕鏈可變區(LV0、LV1a、LV1b、LV2a、LV2b、LV3、LV5、LV6)之胺基酸序列。各序列中之框所包圍之區域表示CDR之胺基酸序列。
圖8表示不含訊號序列之KM5320抗體之重鏈可變區及hzKM5320 抗體之重鏈可變區(HV0、HV1、HV2、HV3a、HV3b、HV3c、HV4、HV6、HV8)之胺基酸序列。各序列中之框所包圍之區域表示CDR之胺基酸序列。
圖9表示不含訊號序列之KM5321抗體之輕鏈可變區及KM5321人類化抗體(以下記載為hzKM5321抗體)之輕鏈可變區(LV0、LV1a、LV1b、LV1c、LV3、LV4、LV6、LV7a、LV7b、LV9)之胺基酸序列。各序列中之框所包圍之區域表示CDR之胺基酸序列。
圖10表示不含訊號序列之KM5321抗體之重鏈可變區及hzKM5321抗體之重鏈可變區(HV0、HV1、HV2a、HV2b、HV3a、HV3b、HV4a、HV4b、HV5、HV7)之胺基酸序列。各序列中之框所包圍之區域表示CDR之胺基酸序列。
圖11表示(A)KM5320嵌合抗體及hzKM5320抗體、(B)KM5321嵌合抗體及hzKM5321抗體對人類Gas6蛋白質之結合活性。實驗係以N=2實施，於圖表中表示其平均值。任一圖表均以縱軸表示吸光度，且以橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。(A)中，■表示KM5320嵌合抗體，◇表示hzKM5320 LV5HV2，●表示hzKM5320 LV1bHV0，○表示陰性對照抗DNP抗體。(B)中，■表示KM5321嵌合抗體，◇表示hzKM5321 LV6HV2b，●表示hzKM5321 LV7bHV0，○表示陰性對照抗DNP抗體。
圖12表示(A)KM5320嵌合抗體及hzKM5320抗體、(B)KM5321嵌合抗體及hzKM5321抗體之人類Gas6蛋白質與Axl之結合抑制活性。實驗係以N=2實施，於圖表中表示其平均值。任一圖表均以縱軸表示吸光度，且以橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。(A)中，■表示KM5320嵌合抗體，◇表示hzKM5320 LV5HV2，●表示hzKM5320 LV1bHV0，○表示陰性對照抗DNP抗體。(B)中，■表示KM5321嵌合抗體，◇表示hzKM5321 LV6HV2b，●表示hzKM5321 LV7bHV0，○表示陰性對 照抗DNP抗體。
本發明係關於一種與人類Gas6之胺基酸序列之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基中之至少1個胺基酸殘基結合之單株抗體或該抗體片段。具體而言，本發明係關於一種與人類Gas6之胺基酸序列之SHBG區所存在之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基中之至少1個胺基酸殘基結合之單株抗體或該抗體片段；與包含序列編號4所表示之胺基酸序列之人類Gas6之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基中之至少1個胺基酸殘基結合之單株抗體或該抗體片段。作為本發明之抗體，可列舉：與包含序列編號4所表示之胺基酸序列之人類Gas6之第314號之胺基酸殘基結合之抗體、與第315號之胺基酸殘基結合之抗體、與第316號之胺基酸殘基結合之抗體、與第314號及第315號之胺基酸殘基結合之抗體、與第314號及第316號之胺基酸殘基結合之抗體、與第315號及第316號之胺基酸殘基結合之抗體或與第314號、第315號及第316號胺基酸殘基結合之抗體。
又，作為本發明之抗體，具體而言，可列舉選自下述(a)至(e)中之任一種抗體。
(a)抗體之重鏈可變區(Heavy chain variable region)(以下稱為VH)之互補決定區(Complementarity Determining Region)(以下稱為CDR)1~3之胺基酸序列分別為序列編號79、80及81所記載之胺基酸序列，且輕鏈可變區(Light chain variable region)(以下稱為VL)之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號82、83及84所記載之胺基酸序列之抗體。
(b)抗體之VH之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號85、86及87所記載之胺基酸序列，且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號88、89及90所記載之胺基酸序列之抗體。
(c)與上述(a)或(b)中所記載之抗體針對向人類Gas6之結合進行競 爭之抗體。
(d)與包含上述(a)或(b)中所記載之抗體所結合之抗原決定基之抗原決定基結合之抗體。
(e)與和上述(a)或(b)中所記載之抗體所結合之抗原決定基相同之抗原決定基結合之抗體。
於本發明中，上述(a)中所記載之抗體中，作為抗體之VH之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號79、80及81所記載之胺基酸序列，且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號82、83及84所記載之胺基酸序列之抗體之一態樣，可列舉：小鼠抗人類Gas6單株抗體KM5320-mKG1、抗人類Gas6小鼠-大鼠嵌合KM5320-rKG1及抗人類Gas6人類化抗體hzKM5320等。
於本發明中，上述(a)中所記載之抗體中，作為抗體之VH之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號85、86及87所記載之胺基酸序列，且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號88、89及90所記載之胺基酸序列之抗體之一態樣，可列舉：小鼠抗人類Gas6單株抗體KM5321-mKG1、抗人類Gas6小鼠-大鼠嵌合抗體KM5321-rKG1、抗人類Gas6人類化抗體hzKM5321等。
又，本發明之上述(c)之抗體於將上述(a)中所記載之抗體設為第1抗體、及將第1抗體所結合之抗原決定基設為第1抗原決定基之情形時，係指包含該第1抗原決定基之與第2抗原決定基結合之第2抗體。
又，作為本發明之抗體，具體而言，亦可列舉選自下述(a)~(e)中之任一種抗體。
(a)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號69所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號72所記載之胺基酸序列之抗體。
(b)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號75所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號78所記載之胺基酸序列之抗體。
(c)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號135所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號123所記載之胺基酸序列之抗體。
(d)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號195所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號174所記載之胺基酸序列之抗體。
(e)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號186所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號180所記載之胺基酸序列之抗體。
作為上述(a)之抗體之一態樣，可列舉：KM5320-mKG1、KM5320-rKG1等。作為上述(b)之抗體之一態樣，可列舉：KM5321-mKG1、KM5321-rKG1等。作為上述(c)之抗體之一態樣，可列舉抗人類Gas6人類化抗體hzKM5320 LV5HV2等。作為上述(d)之抗體之一態樣，可列舉抗人類Gas6人類化抗體hzKM5321 LV6HV2b等。作為上述(e)之抗體之一態樣，可列舉抗人類Gas6人類化抗體hzKM5321 LV7bHV0等。
於本發明中，生長抑制特異性蛋白6(Gas6)亦稱為AXL受體激酶配體(AXLLG，AXL receptor kinase ligand)或AXL刺激因子(AXSF，AXL stimulatory factor)。
於本發明中，作為人類Gas6，可列舉：包含序列編號4所記載之胺基酸序列或者NCBI(National Center of Biotechnology Information，美國國家生物技術信息中心)寄存編號NP_000811之胺基酸序列之多肽；包含於序列編號4所記載之胺基酸序列或NCBI寄存編號NP_000811之胺基酸序列中缺失、取代或附加1個以上之胺基酸之胺基酸序列，且具有人類Gas6之功能之多肽；或包含與序列編號4所記載之胺基酸序列或NCBI寄存編號NP_000811之胺基酸序列具有60%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上、最佳為95%以上之同源性之胺基酸序列且具有人類Gas6之功能之多肽等。
具有序列編號4所記載之胺基酸序列或於NCBI寄存編號 NP_000811所表示之胺基酸序列中缺失、取代或附加1個以上之胺基酸之胺基酸序列的多肽可藉由如下方法獲得：使用部位特異突變法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、Nucleic acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等，對例如編碼包含序列編號4之胺基酸序列之多肽的DNA導入部位特異突變。
缺失、取代或附加之胺基酸之數量並無特別限定，較佳為1個~數十個、例如1~20個，更佳為1個~數個、例如1~5個胺基酸。
作為編碼人類Gas6之基因，可列舉：序列編號3所記載之鹼基序列、NCBI寄存編號NM_000820之鹼基序列。包含編碼包含序列編號3所記載之鹼基序列或者NM_000820之鹼基序列中缺失、取代或附加1個以上之鹼基之鹼基序列，且具有人類Gas6之功能之多肽的DNA的基因；包含編碼包含與序列編號3所記載之鹼基序列或者NM_000820之鹼基序列具有至少60%以上之同源性之鹼基序列、較佳為具有80%以上之同源性之鹼基序列、進而較佳為具有95%以上之同源性之鹼基序列，且具有人類Gas6之功能之多肽的DNA的基因；或包含於嚴格之條件下與包含序列編號3所記載之鹼基序列、或者NM_000820之鹼基序列之DNA雜交之DNA，且編碼具有人類Gas6之功能之多肽之基因等亦包括在本發明之編碼人類Gas6之基因中。
作為於嚴格之條件下雜交之DNA，係指使用包含序列編號3所記載之鹼基序列或NM_000820之鹼基序列之DNA作為探針，藉由菌落雜交法、噬菌斑雜交法、南方墨點雜交法或DNA微陣列法等而獲得之可雜交之DNA。具體而言，可列舉能夠藉由如下方法進行鑑定之 DNA：使用固定有源自雜交之菌落或噬菌斑之DNA、或具有該序列之PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)產物或者寡聚DNA的過濾器或者載玻片，於0.7~1.0mol/L之氯化鈉之存在下，於65℃下實施雜交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、DNA Cloning 1：Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University,(1995)]，然後使用0.1~2倍濃度之SSC(saline sodium citrate，生理食鹽水-檸檬酸鈉)溶液(1倍濃度之SSC溶液之組成包含150mmol/L氯化鈉、15mmol/L檸檬酸鈉)，於65℃條件下洗淨過濾器或載玻片。作為可雜交之DNA，可列舉與序列編號3所記載之鹼基序列、或NM_000820之鹼基序列具有至少60%以上之同源性之DNA、較佳為具有80%以上之同源性之DNA、進而較佳為具有95%以上之同源性之DNA。
編碼真核生物之蛋白質之基因的鹼基序列經常可見基因之多型。對於本發明中所使用之基因藉由此種多型於鹼基序列中產生小規模之變異而成之基因亦包含於本發明之編碼人類Gas6之基因中。
除了特別明確說明之情形以外，本發明中之同源性之數值可為使用從業者公知之同源性檢索程式所算出之數值，關於鹼基序列，可列舉使用BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中預設之參數所算出之數值等，關於胺基酸序列，可列舉使用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997)、Genome Res.,7,649(1997)、http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.ht mL]中預設之參數所算出之數值等。
作為預設之參數，G(起始空位罰分(Cost to open gap))於鹼基序列之情形時為5，於胺基酸序列之情形時為11，-E(延伸空位罰分， Cost to extend gap)於鹼基序列之情形時為2，於胺基酸序列之情形時為1，-q(核苷酸錯配罰分，Penalty for nucleotide mismatch)為-3，-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)為1，-e(期望值，expect value)為10，-W(字長(wordsize))於鹼基序列之情形時為11個殘基，於胺基酸序列之情形時為3個殘基，-y[非空位延伸下降之閾值，Dropoff(X)for blast extensions in bits]於blastn之情形時為20，於blastn以外之程式中為7，-X(空位比對之下降閾值，X dropoff value for gapped alignment in bits)為15，及-Z(最終空位比對之下降值，final X dropoff value for gapped alignment in bits)於blastn之情形時為50，於blastn以外之程式中為25(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL/blastcgihelp.htmL)。
包含序列編號4所記載之胺基酸序列或NCBI寄存編號NP_000811之胺基酸序列之部分序列的多肽可藉由從業者公知之方法而製作。具體而言，可藉由使編碼序列編號4之胺基酸序列之DNA之一部分缺失，並對導入有包含其之表現載體之轉形體進行培養而製作。又，藉由與上述同樣之方法，可獲得具有於序列編號4所記載之胺基酸序列或NCBI寄存編號NP_000811之胺基酸序列中缺失、取代或附加1個以上之胺基酸之胺基酸序列的多肽。進而，包含序列編號4所記載之胺基酸序列或者NCBI寄存編號NP_000811之胺基酸序列之多肽、或具有於序列編號4所記載之胺基酸序列或者NCBI寄存編號NP_000811之胺基酸序列中缺失、取代或附加1個以上之胺基酸而成之胺基酸序列的多肽亦可藉由茀基甲氧基羰基(Fmoc)法、第三丁氧基羰基(tBoc)法等化學合成法而製造。
作為本發明中之單株抗體，可列舉：由融合瘤所產生之抗體、或由利用包含抗體基因之表現載體進行轉形而成之轉形體所產生之基因重組抗體。
所謂單株抗體係單純系之抗體產生細胞所分泌之抗體，識別僅一個抗原決定基(亦稱為抗原決定基)，構成單株抗體之胺基酸序列(一次序列)均一。
所謂抗原決定基，可列舉被單株抗體識別、結合之單一之胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、藉由轉譯後修飾而經修飾之胺基酸序列及包含該胺基酸序列之立體結構等。
作為藉由轉譯後修飾而經修飾之胺基酸序列，可列舉糖鏈與具有OH取代基之Tyr及Ser結合之O結合型糖鏈、糖鏈與具有NH2取代基之Gln及Asn結合之N結合型糖鏈、以及硫酸分子與具有OH取代基之Tyr結合之硫酸基等所結合之胺基酸序列。
作為本發明之抗體所結合之人類Gas6上所存在之胺基酸殘基或抗原決定基，可列舉：與Gas6受體之結合部分之抗原決定基、存在於人類Gas6之SHBG區之抗原決定基、包含選自存在於人類Gas6之胺基酸序列之SHBG區之第314號、第315號及第316號中之至少1個胺基酸殘基之抗原決定基、包含存在於人類Gas6之胺基酸序列之SHBG區之第314號、第315號及第316號之抗原決定基。
本發明之抗體與人類Gas6結合之情況可藉由使用固相夾層法等之放射免疫分析法、或使用酶免疫測定法(ELISA)等之針對人類Gas6之公知之免疫學檢測法、或使用Bicacore系統(GE healthcare公司製造)等之表面電漿子共振法等進行確認。又，亦可將公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；單純系抗體實驗手冊，Kodansha Scientific，(1987)]等組合而進行確認。
本發明之抗體所結合之人類Gas6之胺基酸殘基或抗原決定基可藉由使用使人類Gas6之一部分區缺失之缺損體、與源自其他蛋白質之 區置換之變異體及人類Gas6之部分肽片段等進行抗體之結合實驗而確定。或者，本發明之抗體所結合之人類Gas6之胺基酸殘基或抗原決定基亦可藉由在利用蛋白分解酶進行消化後之人類Gas6之肽片段中添加本發明之抗體，使用已知之質譜法進行抗原決定基定位(epitope mapping)而確定。
又，作為本發明之抗體，具體而言，可列舉與人類Gas6之胺基酸序列之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基中之至少1個胺基酸殘基結合，結果對人類Gas6具有結合活性及中和活性之抗體。
作為人類Gas6之功能，已知Gas6與Gas6受體結合而使該受體活化，結果引起細胞內訊號傳遞之活化、細胞增殖之亢進。
於本發明中，作為Gas6受體，具體而言，可列舉：Axl、Sky、Mer TK等。
於本發明中所謂和活性係抑制人類Gas6之功能，係指抑制上述Gas6受體活化及活化所伴隨之各種反應之活性。具體而言，可列舉：抑制Gas6與Gas6受體之結合，結果抑制Gas6受體之活性之活性；抑制由添加Gas6所產生之Gas6受體表現細胞內之訊號傳遞之活化的活性；或抑制由添加Gas6所產生之Gas6受體表現細胞之細胞增殖之亢進的活性等。
本發明之抗體與Gas6特異性地結合之情況、及具有抑制Gas6與Gas6受體之結合之活性之情況可藉由ELISA等公知免疫學檢測法、使用Biacore(註冊商標)系統(GE healthcare公司製造)等之表面電漿子共振法或該等之組合而進行確認。
本發明之抗體具有抑制由Gas6結合所產生之Gas6受體表現細胞內之訊號傳遞之活化的活性之情況可藉由使用公知之報導基因分析而檢測特定基因產物之表現量，或使用西方點墨法或者流式細胞儀等而檢測特定之訊號傳遞物質之磷酸化水準而進行確認。或者，亦可藉由 使用微陣列，全面地檢測基因之活化狀態或表現量等而進行確認。
本發明之抗體具有抑制因Gas6引起之Gas6受體表現細胞之細胞增殖之亢進的活性，可使用公知之細胞增殖分析法而進行確認。所謂公知之細胞增殖分析法，具體而言，可列舉：使用MTT(Methyl thiazolyl tetrazolium，四甲基噻唑基四唑鎓)或WST-1(Water soluble tetrazolium-1，水溶性四唑鎓-1)等四唑鎓鹽而測定細胞生存活性之方法；或使用[3H]-胸苷等放射性同位素而測定細胞內之DNA合成之方法等。
於本發明中，本發明之單株抗體所具有之所謂較高之結合活性或較高之中和活性，係指結合活性或中和活性強於公知之抗人類Gas6抗體或市售之抗人類Gas6抗體所具有之對hGas6之結合活性或中和活性。具體而言，係指本發明之抗hGas6單株抗體與抗hGas6單株抗體WG1(US7,547,767)相比，具有對hGas6之更高之結合活性及更高之中和活性。
抗體分子亦稱為免疫球蛋白(以下表記為Ig)，人類抗體根據分子結構之不同而分類為IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgM之同型。亦將胺基酸序列之同源性相對較高之IgG1、IgG2、IgG3及IgG4統稱為IgG。
抗體分子由稱為重鏈(Heavy chain，以下記載為H鏈)及輕鏈(Light chain，以下記載為L鏈)之多肽所構成。又，H鏈自N末端側起由H鏈可變區(亦表述為VH)、H鏈恆定區(亦表述為CH)所構成，L鏈自N末端側起由L鏈可變區(亦表述為VL)、L鏈恆定區(亦表述為CL)所構成。CH於各亞型中分別已知有α、δ、ε、γ及μ鏈。CH進而自N末端側起由CH1區、鉸鏈區、CH2區、CH3區之各區所構成。所謂區係指構成抗體分子之各多肽之功能性結構單元。又，將CH2區與CH3區合併稱為Fc區或簡稱為Fc。CL已知有Cλ鏈及Cκ鏈。
本發明中之CH1區、鉸鏈區、CH2區、CH3區及Fc區可根據EU索引[Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]，以自N末端起之胺基酸殘基之編號進行特定。具體而言，CH1被特定為EU索引第118號~第215號之胺基酸序列，鉸鏈被特定為EU索引第216號~第230號之胺基酸序列，CH2被特定為EU索引第231號~第340號之胺基酸序列，CH3被特定為EU索引第341號~第447號之胺基酸序列。
作為本發明之抗體，尤其是亦包含藉由基因工程學方法所製作之小鼠抗體、大鼠抗體、人類型嵌合抗體(以下亦簡稱為嵌合抗體)、人類化抗體[亦稱為人類型互補決定區(CDR，Complementarity Determining Region)移植抗體]及人類抗體等基因重組抗體。
所謂嵌合抗體係指包含人類以外之動物(非人類動物)之抗體之VH及VL、與人類抗體之CH及CL的抗體。作為非人類動物，只要可製作融合瘤，則可使用小鼠、大鼠、倉鼠、兔等任意者。
所謂融合瘤係指使令非人類動物對抗原免疫而取得之B細胞與源自小鼠等之骨髓瘤細胞融合而獲得之產生具有所需之抗原特異性之單株抗體的細胞。因此，構成融合瘤所產生之抗體之可變區包含非人類動物抗體之胺基酸序列。
人類型嵌合抗體可藉由自源自生產單株抗體之非人類動物細胞之融合瘤取得編碼該單株抗體之VH及VL的cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互補脫氧核糖核酸)，分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體，構建人類型嵌合抗體表現載體，並導入至動物細胞中進行表現而製造。
所謂人類化抗體係指將非人類動物抗體之VH及VL之CDR之胺基酸序列移植至人類抗體之VH及VL之對應之CDR而獲得之抗體。VH及VL之CDR以外之區域稱為架構區(以下表記為FR)。
人類化抗體可藉由構建編碼包含非人類動物抗體之VH之CDR之胺基酸序列與任意人類抗體之VH之FR的胺基酸序列之VH之胺基酸序列之cDNA、與編碼包含非人類動物抗體之VL之CDR之胺基酸序列與任意人類抗體之VL之FR的胺基酸序列之VL之胺基酸序列之cDNA，分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體中，構建人類化抗體表現載體，並導入至動物細胞中進行表現而製造。
作為本發明之人類化抗體，具體而言，關於KM5320，可列舉CDR1~3分別包含含有序列編號79~81所表示之胺基酸序列的抗體之VH，且CDR1~3分別包含含有序列編號82~84所表示之胺基酸序列的抗體之VL的人類化抗體。關於KM5321，可列舉CDR1~3分別包含含有序列編號85~87所表示之胺基酸序列的抗體之VH，且CDR1~3分別包含含有序列編號88~90所表示之胺基酸序列的抗體之VL的人類化抗體。
作為本發明之人類化抗體，具體而言，關於KM5320，可列舉包含以下之(a)VL及(b)VH之至少一者之人類化抗體，關於KM5321，可列舉包含以下之(c)VL及(d)VH之至少一者之人類化抗體。
(a)包含序列編號105所表示之胺基酸序列、或序列編號105所表示之胺基酸序列中之選自第2號之Val、第15號之Leu、第46號之Leu、第73號之Leu、第78號之Leu、及第87號之Tyr中之至少1個胺基酸殘基被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(b)包含序列編號129所表示之胺基酸序列、或序列編號129所表示之胺基酸序列之選自第2號之Val、第9號之Ser、第20號之Val、第38號之Arg、第46號之Glu、第77號之Ser、第93號之Val、及第95號之Tyr中之至少1個胺基酸殘基被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VH
(c)包含序列編號156所表示之胺基酸序列、或序列編號156所表示之胺基酸序列中之選自第4號之Leu、第13號之Ala、第15號之Val、第43號之Ala、第64號之Gly、第73號之Leu、第78號之Leu、第85號之Thr、及第104號之Val中之至少1個胺基酸殘基被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(d)包含序列編號186所表示之胺基酸序列、或序列編號186所表示之胺基酸序列之選自第2號之Val、第9號之Ser、第38號之Arg、第46號之Glu、第79號之Ser、第93號之Val、及第112號之Val中之至少1個胺基酸殘基被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VH
進而，作為本發明之KM5320人類化抗體中所含之VL，較佳為以下(1)~(7)之VL。
(1)序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val、第15號之Leu、第46號之Leu、第73號之Leu、第78號之Leu、及第87號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(2)序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val、第46號之Leu、第73號之Leu、第78號之Leu、及第87號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(3)序列編號105所表示之胺基酸序列中之第46號之Leu、第73號之Leu、及第87號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(4)序列編號105所表示之胺基酸序列中之第15號之Leu、及第73號之Leu被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(5)序列編號105所表示之胺基酸序列中之第78號之Leu、及第87號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(6)序列編號105所表示之胺基酸序列中之第78號之Leu被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(7)序列編號105所表示之胺基酸序列中之第87號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
作為上述VL之胺基酸序列，例如可列舉導入有選自將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第15號之Leu取代為Ala，將第46號之Leu取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之改型中之至少1種改型之胺基酸序列。
作為導入有6個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉導入有將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第15號之Leu取代為Ala，將第46號之Leu取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列。
作為導入有5個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第46號之Leu取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(2)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第15號之Leu取代為Ala，將第46號之Leu取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(3)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第15號之Leu取代為Ala，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(4)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第15號之Leu取代為Ala，將第46號之Leu取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
作為導入有4個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第46號之Leu取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(2)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(3)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第46號之Leu取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，及將第78號之Leu取代為Val之胺基酸序列
(4)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第15號之Leu取代為Ala，將第73號之Leu取代為Phe，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
作為導入有3個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第46號之Leu取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(2)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第15號之Leu取代為Ala，將第46號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(3)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第15號之Leu取代為Ala，將第46號之Leu取代為Val，及將第78號之Leu取代為Val之胺基酸序列
(4)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第46號之Leu取代為 Val，將第73號之Leu取代為Phe，及將第78號之Leu取代為Val之胺基酸序列
作為導入有2個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第78號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(2)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第15號之Leu取代為Ala，及將第73號之Leu取代為Phe之胺基酸序列
(3)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第46號之Leu取代為Val，及將第78號之Leu取代為Val之胺基酸序列
(4)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，及將第15號之Leu取代為Ala之胺基酸序列
作為導入有1個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile之胺基酸序列
(2)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第46號之Leu取代為Val之胺基酸序列
(3)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第78號之Leu取代為Val之胺基酸序列
(4)將序列編號105所表示之胺基酸序列中之第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
又，作為本發明之KM5320人類化抗體中所含之VH，較佳為以下之(1)~(8)之VH。
(1)包含序列編號129所表示之胺基酸序列中之第2號之Val、第9號之Ser、第20號之Val、第38號之Arg、第46號之Glu、第77號之Ser、 第93號之Val、及第95號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(2)包含序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser、第20號之Val、第38號之Arg、第46號之Glu、第93號之Val、及第95號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(3)包含序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser、第46號之Glu、第93號之Val、及第95號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(4)包含序列編號129所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu、第93號之Val、及第95號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(5)包含序列編號129所表示之胺基酸序列中之第2號之Val、第20號之Val、及第95號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(6)包含序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser、第38號之Arg、及第46號之Glu被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(7)包含序列編號129所表示之胺基酸序列中之第93號之Val、及第95號之Tyr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(8)包含序列編號129所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
作為上述VH之胺基酸序列，例如可列舉導入有選自將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第9號之Ser取代為Pro，將第20號之Val取代為Ile，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第77號之Ser取代為Thr，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之改型中之至少1種改型之胺基酸 序列。
作為導入有8個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉導入有將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第9號之Ser取代為Pro，將第20號之Val取代為Ile，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第77號之Ser取代為Thr，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列。
作為導入有6個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第20號之Val取代為Ile，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第77號之Ser取代為Thr，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(2)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第9號之Ser取代為Pro，將第20號之Val取代為Ile，將第38號之Arg取代為Lys，將第77號之Ser取代為Thr，及將第93號之Val取代為Thr之胺基酸序列
(3)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第20號之Val取代為Ile，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(4)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第77號之Ser取代為Thr，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
作為導入有4個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉 以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第20號之Val取代為Ile，將第46號之Glu取代為Lys，及將第93號之Val取代為Thr之胺基酸序列
(2)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第46號之Glu取代為Lys，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(3)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第20號之Val取代為Ile，將第46號之Glu取代為Lys，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(4)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
作為導入有3個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉選自以下之(1)~(4)中之1個胺基酸序列。
(1)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第20號之Val取代為Ile，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(2)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，及將第46號之Glu取代為Lys之胺基酸序列
(3)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu取代為Lys，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(4)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基 酸序列
作為導入有2個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，及將第38號之Arg取代為Lys之胺基酸序列
(2)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第20號之Val取代為Ile，及將第77號之Ser取代為Thr之胺基酸序列
(3)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu取代為Lys，及第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
(4)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
作為導入有1個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第20號之Val取代為Ile之胺基酸序列
(2)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg取代為Lys之胺基酸序列
(3)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu取代為Lys之胺基酸序列
(4)將序列編號129所表示之胺基酸序列中之第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸序列
又，作為本發明之KM5320人類化抗體之具體例，可列舉以下之(1)~(3)之人類化抗體等。
(1)抗體之VH包含序列編號135所表示之胺基酸序列及/或抗體之VL包含序列編號123所表示之胺基酸序列的人類化抗體
(2)抗體之VH包含圖8所表示之任一種胺基酸序列及/或抗體之VL 包含序列編號123所表示之胺基酸序列的人類化抗體
(3)抗體之VH包含序列編號135所表示之胺基酸序列及/或抗體之VL包含圖7所表示之任一種胺基酸序列的人類化抗體
進而，作為本發明之KM5321人類化抗體中所含之VL，較佳為以下之(1)~(7)之VL。
(1)序列編號156所表示之胺基酸序列中之第4號之Leu、第13號之Ala、第15號之Val、第43號之Ala、第64號之Gly、第73號之Leu、第78號之Leu、第85號之Thr、及第104號之Val被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(2)序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala、第15號之Val、第64號之Gly、第73號之Leu、第78號之Leu、第85號之Thr、及第104號之Val被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(3)序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala、第15號之Val、第43號之Ala、第73號之Leu、第78號之Leu、及第85號之Thr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(4)序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala、第15號之Val、第73號之Leu、及第78號之Leu被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(5)序列編號156所表示之胺基酸序列中之第15號之Val、第78號之Leu、及第85號之Thr被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(6)序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala、及第43號之Ala被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(7)序列編號156所表示之胺基酸序列中之第43號之Ala被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
作為上述VL之胺基酸序列，例如可列舉導入有選自將序列編號 156所表示之胺基酸序列中之第4號之Leu取代為Val，將第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Thr，將第85號之Thr取代為Asp，及將第104號之Val取代為Leu之改型中之至少1種改型之胺基酸序列。
作為導入有9個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第4號之Leu取代為Val，將第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Thr，將第85號之Thr取代為Asp，及將第104號之Val取代為Leu之胺基酸序列。
作為導入有7個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第4號之Leu取代為Val，將第13號之Ala取代為Val，將第64號之Gly取代為Ser，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Thr，將第85號之Thr取代為Asp，及將第104號之Val取代為Leu之胺基酸序列
(2)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Thr，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
(3)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第4號之Leu取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第78號之Leu取代為Thr，將第85號之Thr取代為Asp，及將第104號之Val取代為Leu之胺基酸序列
(4)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第4號之Leu取代為 Val，將第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Thr，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
作為導入有6個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第4號之Leu取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第85號之Thr取代為Asp，及將第104號之Val取代為Leu之胺基酸序列
(2)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第78號之Leu取代為Thr，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
(3)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Thr，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
(4)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Thr，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
作為導入有4個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第4號之Leu取代為Val，將第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，及將第43號之Ala取代為Pro之胺基酸序列
(2)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
(3)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第73號之Leu取代為Phe，及將第78號之Leu取代為Thr之胺基酸序列
(4)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第73號之Leu取代為Phe，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
作為導入有3個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，及將第73號之Leu取代為Phe之胺基酸序列
(2)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
(3)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第15號之Val取代為Thr，將第78號之Leu取代為Thr，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
(4)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第43號之Ala取代為Pro，將第73號之Leu取代為Phe，及將第78號之Leu取代為Thr之胺基酸序列
作為導入有2個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為 Val，及將第15號之Val取代為Thr之胺基酸序列
(2)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val，及將第43號之Ala取代為Pro之胺基酸序列
(3)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第15號之Val取代為Thr，及將第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
(4)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第43號之Ala取代為Pro，及將第64號之Gly取代為Ser之胺基酸序列
作為導入有1個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第13號之Ala取代為Val之胺基酸序列
(2)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第43號之Ala取代為Pro之胺基酸序列
(3)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第73號之Leu取代為Phe之胺基酸序列
(4)將序列編號156所表示之胺基酸序列中之第85號之Thr取代為Asp之胺基酸序列
又，作為本發明之KM5321人類化抗體中所含之VH，較佳為以下之(1)~(8)之VH。
(1)序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val、第9號之Ser、第38號之Arg、第46號之Glu、第79號之Ser、第93號之Val、及第112號之Val被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(2)序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val、第38號之Arg、第46號之Glu、第79號之Ser、及第112號之Val被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(3)序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val、第9號之 Ser、第79號之Ser、及第112號之Val被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(4)序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser、第46號之Glu、及第93號之Val被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(5)序列編號186所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg、第46號之Glu、及第93號之Val被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(6)序列編號186所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg、及第46號之Glu被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(7)序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser、及第93號之Val被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(8)序列編號186所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu被取代為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
作為上述VH之胺基酸序列，例如可列舉導入有選自將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第79號之Ser取代為Ala，將第93號之Val取代為Thr，及將第112號之Val取代為Ile之改型中之至少1種改型之胺基酸序列。
作為導入有7個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第79號之Ser取代為Ala，將第93號之Val取代為Thr，及將第112號之Val取代為Ile之胺基酸序列。
作為導入有5個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號 之Glu取代為Lys，及將第112號之Val取代為Ile之胺基酸序列
(2)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第79號之Ser取代為Ala，及將第112號之Val取代為Ile之胺基酸序列
(3)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第79號之Ser取代為Ala，及將第93號之Val取代為Thr之胺基酸序列
(4)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第93號之Val取代為Thr，及將第112號之Val取代為Ile之胺基酸序列
作為導入有4個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第9號之Ser取代為Pro，將第79號之Ser取代為Ala，及將第112號之Val取代為Ile之胺基酸序列
(2)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，及將第79號之Ser取代為Ala之胺基酸序列
(3)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，及將第93號之Val取代為Thr之胺基酸序列
(4)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第46號之Glu取代為Lys，將第79號之Ser取代為Ala，及將第112號之Val取代為Ile之胺基酸序列
作為導入有3個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，將第46號之Glu取代為Lys，及將第93號之Val取代為Thr之胺基酸序列
(2)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第2號之Val取代為Ile，將第38號之Arg取代為Lys，及將第46號之Glu取代為Lys之胺基酸序列
(3)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，及將第79號之Ser取代為Ala之胺基酸序列
(4)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，及將第93號之Val取代為Thr之胺基酸序列
作為導入有2個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg取代為Lys，及將第46號之Glu取代為Lys之胺基酸序列
(2)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，及將第93號之Val取代為Thr之胺基酸序列
(3)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro，及將第38號之Arg取代為Lys之胺基酸序列
(4)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第79號之Ser取代為Ala，及將第93號之Val取代為Thr之胺基酸序列
作為導入有1個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser取代為Pro之胺基酸序列
(2)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg取代為Lys之胺基酸序列
(3)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu取代為Lys之胺基酸序列
(4)將序列編號186所表示之胺基酸序列中之第93號之Val取代為Thr之胺基酸序列
又，作為本發明之KM5321人類化抗體之具體例，可列舉以下之(1)~(6)之人類化抗體等。
(1)抗體之VH包含序列編號195所表示之胺基酸序列及/或抗體之VL包含序列編號174所表示之胺基酸序列的人類化抗體
(2)抗體之VH包含圖10所表示之任一種胺基酸序列及/或抗體之VL包含序列編號174所表示之胺基酸序列的人類化抗體
(3)抗體之VH包含序列編號195所表示之胺基酸序列及/或抗體之VL包含圖9所表示之任一種胺基酸序列的人類化抗體
(4)抗體之VH包含序列編號186所表示之胺基酸序列及/或抗體之VL包含序列編號180所表示之胺基酸序列的人類化抗體
(5)抗體之VH包含圖10所表示之任一種胺基酸序列及/或抗體之VL包含序列編號180所表示之胺基酸序列的人類化抗體
(6)抗體之VH包含序列編號186所表示之胺基酸序列及/或抗體之VL包含圖9所表示之任一種胺基酸序列的人類化抗體
人類抗體係指原本天然存在於人類體內之抗體，亦包括自藉由最近之基因工程、細胞工程、發育工程(developmental engineering)之技術進步所製作之人類抗體噬菌體基因庫及產生人類抗體之基因轉殖動物所獲得之抗體等。
人類抗體可藉由使保持人類免疫球蛋白基因之小鼠(Tomizuka K.et.al.,Proc Natl Acad Sci U S A.97,722-7,2000.)對所需之抗原免疫 而取得。又，藉由使用利用源自人類之B細胞使抗體基因擴增而成之噬菌體表現(phage display)基因庫，選擇具有所需之結合活性之人類抗體，藉此可於不進行免疫之情況下取得人類抗體(Winter G.et.al.,Annu Rev Immunol.12：433-55.1994)。進而，藉由使用EB(Epstein-Barr，艾司坦-巴爾)病毒使人類B細胞永生化，可製作生產具有所需之結合活性之人類抗體之細胞，而取得人類抗體(Rosen A.et.al.,Nature 267,52-54.1977)。
人類體內所存在之抗體例如可藉由使自人類末梢血液單離之淋巴球感染EB病毒等而使之永生化後進行選殖，藉此獲得產生該抗體之淋巴球，並可自培養該淋巴球所獲得之培養物中精製該抗體。
人類抗體噬菌體基因庫係藉由將由人類B細胞製備之抗體基因插入至噬菌體基因中，使Fab、scFv等抗體片段於表面進行表現而獲得之噬菌體之基因庫。自該基因庫可回收如下噬菌體，其以針對固定有抗原之受質之結合活性作為指標而表現具有所需之抗原結合活性之抗體片段。該抗體片段亦可進而藉由基因工程學方法，轉化為包含2條全長H鏈及2條全長L鏈之人類抗體分子。
產生人類抗體之基因轉殖動物係指將人類抗體基因組入至宿主動物之染色體內之動物。具體而言，向小鼠ES細胞中導入人類抗體基因，並將該ES細胞移植至另一小鼠之早期胚胎後，使之發育，藉此可製作產生人類抗體之基因轉殖動物。利用產生人類抗體之基因轉殖動物之人類抗體的製作方法可藉由通常之於人類以外之哺乳動物中實施之融合瘤製作方法而取得產生人類抗體之融合瘤，並進行培養，藉此於培養物中產生並蓄積人類抗體。
作為本發明之抗體之VH及VL之胺基酸序列，亦可為人類抗體之VH及VL之胺基酸序列、非人類動物抗體之VH及VL之胺基酸序列、或將非人類動物抗體之CDR移植至任意人類抗體之架構而成之人類化 抗體之VH及VL之胺基酸序列中之任一種。具體而言，可列舉：產生融合瘤之非人類動物抗體之VH及VL之胺基酸序列、人類化抗體之VH及VL之胺基酸序列、人類抗體之VH及VL之胺基酸序列等。
作為本發明之抗體中之CL之胺基酸序列，可為人類抗體之胺基酸序列或非人類動物抗體之胺基酸序列中之任一種，較佳為人類抗體之胺基酸序列之Cκ或Cλ。
作為本發明之抗體之CH，只要屬於免疫球蛋白，則為任意者均可，可較佳地使用屬於IgG型之亞型γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)中之任一種。
作為本發明之抗體，Fc與抗體片段結合而成之Fc融合蛋白、Fc與天然存在之配體或受體結合而成之Fc融合蛋白(亦稱為免疫黏附素(immunoadhesin))、使複數個Fc區融合而成之Fc融合蛋白等亦包含於本發明中。又，為了使抗體穩定化及為了控制血中半衰期，將胺基酸殘基改型之Fc區等亦可用於本發明之抗體。
本發明之抗體或該抗體片段亦包括包含經轉譯後修飾之任何胺基酸殘基的抗體。作為轉譯後修飾，例如可列舉：H鏈之C末端之離胺酸殘基之缺失[離胺酸剪切(lysine clipping)]、及多肽N末端之麩醯胺殘基向焦麩醯胺(pyroGlu)之轉化等[Beck et al,Analytical Chemistry,85,715-736(2013)]。
於本發明中，作為抗體片段，可列舉：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、雙功能抗體、dsFv、包含複數個CDR之肽等。
Fab係於利用蛋白分解酶木瓜酶對IgG抗體進行處理而獲得之片段中(於H鏈之第224號之胺基酸殘基處切斷)，H鏈之N末端側約一半與整個L鏈以雙硫鍵(S-S鍵)鍵結而成之分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
F(ab')2係於利用蛋白分解酶胃蛋白酶對IgG進行處理而獲得之片 段中(於H鏈之第234號之胺基酸殘基處切斷)，略大於Fab經由鉸鏈區之S-S鍵進行鍵結而成者之分子量約10萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
Fab'係切斷上述F(ab')2之鉸鏈區之S-S鍵而成之分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
scFv係使用將任意個數之包含4個Gly及1個Ser殘基之連結子(G4S)連結而成之連結子肽等適當之肽連結子(P)，將1條VH與1條VL連結而成之VH-P-VL或VL-P-VH多肽，且係具有抗原結合活性之抗體片段。
雙功能抗體係抗原結合特異性相同或不同之scFv形成二聚物而獲得之抗體片段，且係具有針對相同抗原之二價抗原結合活性或針對不同抗原之特異性抗原結合活性的抗體片段。
dsFv係指將VH及VL中之各1個胺基酸殘基被取代為半胱胺酸殘基之多肽經由該半胱胺酸殘基間之S-S鍵進行鍵結而成者。
包含CDR之肽係包含VH或VL之CDR之至少1個區域以上而構成。包含複數個CDR之肽可使CDR彼此直接進行結合或經由適當之肽連結子而進行結合。可構建編碼本發明之改型抗體之VH及VL之CDR之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中使之表現而製造。又，包含CDR之肽亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等化學合成法而製造。
本發明之單株抗體包括藉由化學或基因工程學方法於與本發明之人類Gas6結合之單株抗體或其抗體片段上結合放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質、或抗體藥物等而獲得之抗體之衍生物。
抗體之衍生物可藉由如下方法製造：藉由化學方法[抗體工程學 入門，地人書館，(1994)]，於與本發明之人類Gas6結合之單株抗體或其抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側、C末端側、抗體分子中之適當之取代基或側鏈、以及糖鏈等上結合放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、免疫活化劑、蛋白質、抗體藥物、或核酸藥物等。
又，可藉由如下基因工程學方法而製造：將編碼與本發明之人類Gas6結合之單株抗體或其抗體片段的DNA、與編碼欲結合之蛋白質或抗體藥物之DNA連結並插入至表現載體中，再將該表現載體導入至適當之宿主細胞中使之表現。
作為放射性同位素，可列舉：111In、131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性同位素可藉由氯胺T法等直接與抗體進行結合。又，亦可使螯合放射性同位素之物質與抗體進行結合。作為螯合劑，可列舉：1-異硫氰酸苄酯基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作為低分子之藥劑，可列舉：烷基化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗生素、植物鹼、拓撲異構酶抑制劑、激素治療劑、激素拮抗劑、芳香酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、M期抑制劑、或激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學，癌與化學療法出版社，(1996)]，或氫化可的松、強的松(Prednisone)等類固醇劑，阿司匹林、吲哚美辛等非類固醇劑，硫代蘋果酸金、青黴胺等免疫調節劑，環磷醯胺、硫唑嘌呤等免疫抑制劑，順丁烯二酸氯苯那敏、或氯馬斯汀之類的抗組胺劑等抗炎劑[炎症與抗炎症療法，醫齒藥出版股份有限公司，(1982)]等。
作為抗癌劑，可列舉：阿米福汀(胺磷汀)、順鉑、達卡巴
Figure 104134584-A0202-12-0042-452
(DTIC)、更生黴素(Dactinomycin)、二氯甲基二乙胺(氮芥)、鏈脲黴素、環磷醯胺、異環磷醯胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿德力黴素)、表柔比星、吉西他濱(健擇)、柔紅黴素、丙 卡巴肼、絲裂黴素、阿糖胞苷、依託泊苷、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春花鹼、長春新鹼、博萊黴素、道諾黴素(daunorubicin)、培洛黴素、雌莫司汀、紫杉醇(泰克索)、歐洲紫杉醇(多烯紫杉醇)、阿地白介素、天門冬醯胺酶、白消安、卡鉑、奧沙利鉑、奈達鉑、克拉屈濱、喜樹鹼、10-羥基-7-乙基-喜樹鹼(SN38)、氟尿苷、氟達拉濱、羥基脲、依達比星、美司鈉、伊立替康(CPT-11)、拓撲替康、米托蒽醌、拓朴替康、亮脯利特、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、羥基脲、光輝黴素、米托坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾內酯、硫鳥嘌呤、噻替派、尿嘧啶氮芥、長春瑞濱、苯丁酸氮芥、氫化可的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、雷替曲塞、阿紮胞苷、優福定(UFT)、奧沙利鉑、吉米沙星(Iressa)、伊馬替尼(STI571)、埃羅替尼、類FMS酪胺酸激酶3(Flt3，FMS-like tyrosine kinase 3)抑制劑、血管內皮生長因子受體(VEGFR，vascular endothelial growth facotr receptor)抑制劑、纖維母細胞生長因子受體(FGFR，fibroblast growth factor receptor)抑制劑、Iressa、Tarceva等表皮生長因子受體(EGFR，epidermal growth factor receptor)抑制劑、根赤殼菌素、17-烯丙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素、雷帕黴素、安吖啶、全反式視黃酸、沙利竇邁、來那度胺、阿那曲唑、法曲唑、來曲唑、依西美坦、硫代蘋果酸金、D-青黴胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立賓、環孢菌素、雷帕黴素、氫化可的松、貝瑟羅汀(貝沙羅汀)、他莫昔芬、地塞米松、助孕素類、雌激素類、阿那曲唑(瑞寧得)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞來昔布、青黴胺、硫代蘋果酸金、順丁烯二酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯馬斯汀、維生素A酸、貝瑟羅汀、砷、硼替佐米、別嘌呤醇、卡里奇黴素、替伊莫單抗、貝沙羅汀、奧唑米星、克拉黴素、甲醯四氫葉酸、酮康唑、胺魯 米特、蘇拉明、類美登素或其衍生物等。
作為使低分子藥劑與抗體結合之方法，可列舉：經由戊二醛使藥劑與抗體之胺基間結合之方法、或經由水溶性碳二醯亞胺使藥劑之胺基與抗體之羧基結合之方法等。
作為高分子藥劑，可列舉：聚乙二醇(以下表記為PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯順丁烯二酸共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、吡喃共聚物、或羥丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物與抗體或其抗體片段結合，期待產生如下等效果：(1)提高對於化學性、物理性或生物性之各種因素之穩定性；(2)顯著延長血中半衰期；(3)抑制免疫原性之消失或抗體產生[Bioconjugates醫藥品，廣川書店，(1993)]。例如，作為使PEG與抗體結合之方法，可列舉與PEG化修飾試劑反應之方法等[Bioconjugates醫藥品，廣川書店，(1993)]。作為PEG化修飾試劑，可列舉：對離胺酸之ε-胺基之修飾劑(日本專利特開昭61-178926)、對天冬胺酸及麩胺酸之羧基之修飾劑(日本專利特開昭56-23587)、或對精胺酸之胍基之修飾劑(日本專利特開平2-117920)等。
作為免疫活化劑，可為作為免疫佐劑而已知之天然物，作為具體例，使免疫亢進之藥劑可列舉：β(1→3)葡聚糖(香菇多糖、裂褶多糖)、或α半乳糖腦醯胺(KRN7000)等。
作為蛋白質，可列舉：使NK(Natural Killer，自然殺手)細胞、巨噬細胞、或嗜中性球等免疫活性細胞活化之細胞激素或增殖因子、或毒素蛋白等。
作為細胞激素或增殖因子，例如可列舉：干擾素(以下記載為IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、介白素(以下記載為IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒球菌落刺激因子(G-CSF)、顆粒球/巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)、或巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)等。作為 毒素蛋白，可列舉：蓖麻毒蛋白(Ricin)、白喉毒素、或ONTAK等，亦包含為了調節毒性而向蛋白質中導入變異而獲得之蛋白毒素。
作為抗體藥物，可列舉針對藉由抗體之結合而誘導凋亡之抗原、與腫瘤之病症形成相關之抗原或調節免疫功能之抗原、與病變部位之血管新生相關之抗原的抗體。
作為藉由抗體之結合而誘導凋亡之抗原，可列舉：白細胞分化抗原(cluster of differentiation)(以下記載為CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、II型人類白血球抗原(HLA，human leukocyte antigen)、或表皮生長因子受體(EGFR)等。
作為與腫瘤之病症形成相關之抗原或調節免疫功能之抗體之抗原，可列舉：CD4、CD40、CD40配體、B7家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、或B7-H4)、B7家族分子之配體(CD28、CTLA(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen，細胞毒性T淋巴細胞抗原)-4、ICOS(inducible costimulator，誘導性共刺激分子)、PD(programmed death，程式性死亡蛋白)-1、或BTLA(B And T Lymphocyte Attenuator，B、T淋巴細胞衰減因子))、OX-40、OX-40配體、CD137、腫瘤壞死因子(TNF，tumor necrosis factor)受體家族分子(DR(Dopamine receptor，多巴胺)4、DR5、TNFR(Tumor Necrosis Factor Receptor，腫瘤壞死因子受體)1、或TNFR2)、TNF相關之凋亡誘導配體受體(TRAIL，TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor)家族分子、TRAIL家族分子之受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、或TRAIL-R4)、核因子κB受體活化因子配體(RANK，receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)、RANK配 體、CD25、葉酸受體、細胞激素[IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉型生長因子(TGF，transforming growth factor)β、或TNFα等]、該等細胞激素之受體、趨化素(SLC(Secondary lymphoid-tissue chemokine，次級淋巴組織趨化因子)、ELC(EBI1 ligand chemokine，EBI1配體趨化因子)、I-309、TARC(Thymus And Activation Regulated Chemokine，胸腺活化調節趨化因子)、MDC(Macrophage Derived Chemokine，巨噬細胞源趨化因子)、或CTACK(Cutaneous T-cell Attracting Chemokine，皮膚T細胞吸引趨化因子)等)、或該等趨化素之受體。
作為抑制病變部位之血管新生的抗體之抗原，可列舉：血管內皮生長因子(VEGF，vascular endothelial growth facotr)、血管生成素(angiopoietin)、纖維母細胞生長因子(FGF，fibroblast growth factor)、EGF、肝細胞生長因子(HGF，hepatocyte growth factor)、血小板衍生生長因子(PDGF，platelet-derived growth factor)、似胰島素生長因子(IGF，insulin-like growth factor)、紅血球生成素(EPO，erythropoietin)、TGFβ、IL-8、肝配蛋白(ephrin)、SDF-1(Stromal cell-derived factor-1，基質細胞衍生因子-1)、或該等之受體等。
關於與蛋白質或抗體藥物之融合抗體，可使編碼單株抗體或抗體片段之cDNA與編碼蛋白質或抗體藥物中所含之抗體之cDNA連結，構建編碼融合抗體之DNA，將該DNA插入至原核生物或真核生物用表現載體，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物使之表現，而製造融合抗體。
作為核酸藥物，可列舉包含藉由控制基因之功能而作用於生物體之小干擾核糖核酸(siRNA，small interference ribonucleic acid)或微核糖核酸(microRNA，micro ribonucleic acid)等核酸之醫藥品。例如可考慮與抑制Th17細胞之主轉錄因子ROR(Retinoic acid-related orphan receptor，視黃酸相關孤兒受體)γt之核酸藥物之偶聯物。
於將本發明之抗體之衍生物用於檢測方法、測定方法或者診斷方法之情形時，或於使用本發明之抗體之衍生物作為檢測用試劑、測定用試劑或者診斷藥之情形時，作為與該抗體結合之藥劑，可列舉通常之免疫學檢測或測定法中所使用之標記物。作為標記物，可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶、或螢光素酶等酶，吖啶鎓酯、或咯吩等發光物質，或螢光素異硫氰酸酯(FITC)、或四甲基玫瑰紅異硫氰酸酯(RITC)等螢光物質等。
又，本發明係關於一種人類Gas6相關疾病之治療藥，其含有與人類Gas6結合之單株抗體或其抗體片段作為有效成分。又，本發明係關於一種人類Gas6相關疾病之治療方法，其包括投予與人類Gas6結合之單株抗體或其抗體片段之步驟。
作為人類Gas6相關疾病，只要為與人類Gas6或人類Gas6受體相關之疾病，則可為任何疾病，例如可列舉腎病或癌症。作為腎病，可列舉：絲球體腎炎、IgA腎病、糖尿病性腎病等。作為絲球體腎炎，可列舉：進行性絲球體腎炎、腎小球膜增殖性絲球體腎炎等。又，作為癌症，具體而言，可列舉：肺癌、乳癌、卵巢癌、攝護腺癌、胰臟癌、腎癌、神經膠母細胞瘤等。作為其他疾病，可列舉：血栓塞栓症、缺血性疾病、靜脈血栓塞栓症、動脈血栓症、靜脈血栓症、肺塞栓症、再狹窄、糖尿病性血管病或同種異體移植粉瘤性動脈硬化症等。
含有本發明之抗體或該抗體片段之治療劑可為僅包含作為有效成分之該抗體或該抗體片段者，通常較理想為以與藥理學上容許之1個以上之載體一併混合，並藉由製劑學之技術領域中公知之任意方法而製造之藥物製劑之形式提供。
投予途徑較理想為使用治療時最有效者，可列舉：經口投予、 或口腔內、氣管內、直腸內、皮下、肌內或靜脈內等非經口投予，可較佳地列舉靜脈內投予。作為投予形態，可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、或貼劑等。
投予量或投予次數根據目標治療效果、投予方法、治療時間、年齡、及體重等而有所不同，通常成人每天為10μg/kg~10mg/kg。
本發明係關於一種含有與人類Gas6結合之單株抗體或該抗體片段的Gas6之檢測或者測定用試劑、或使用與人類Gas6結合之單株抗體或該抗體片段的Gas6之檢測或者測定方法。於本發明中，作為檢測或測定人類Gas6之方法，可列舉任意之公知方法。例如可列舉免疫學檢測或測定方法等。
所謂免疫學檢測或測定方法，係使用實施過標記之抗原或抗體而檢測或測定抗體量或抗原量之方法。作為免疫學檢測或測定方法，可列舉：放射性物質標記免疫抗體法(RIA(Radio Immunity Assay，放射免疫分析法))、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(luminescent immunoassay)、西方墨點法或物理化學方法等。
本發明係關於一種Gas6相關疾病之診斷藥，其含有與人類Gas6結合之單株抗體或該抗體片段作為有效成分；或一種Gas6相關疾病之診斷方法，其包括如下步驟：使用與人類Gas6結合之單株抗體或該抗體片段進行Gas6之檢測或測定。藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段，依據上述方法檢測或測定表現人類Gas6之細胞，可診斷與人類Gas6相關之疾病。
於本發明中，作為成為檢測或測定人類Gas6之對象之活體試樣，若為組織、細胞、血液、血漿、血清、胰臟液、尿、糞便、組織液、或培養液等可能包含人類Gas6或表現人類Gas6之細胞者，則無特 別限定。
含有本發明之單株抗體或其抗體片段之診斷藥根據目標診斷法，可含有用於進行抗原抗體反應之試劑、該反應之檢測用試劑。作為用於進行抗原抗體反應之試劑，可列舉緩衝劑、鹽等。作為檢測用試劑，可列舉識別該單株抗體或其抗體片段之經標記之二次抗體、或與標記對應之受質等通常之免疫學檢測或測定法所使用之試劑。
又，本發明係關於一種抗人類Gas6單株抗體或該抗體片段之用途，其用以製造Gas6相關疾病之治療藥或者診斷藥。
以下，對本發明之抗體之製造方法、疾病之治療方法、及疾病之診斷方法進行具體說明。
1.抗體之製造方法
(1)抗原之製備
成為抗原之人類Gas6可藉由自將包含編碼人類Gas6全長或其部分長度之cDNA之表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等中而獲得之人類Gas6表現細胞進行精製而獲得。又，亦可藉由自大量表現人類Gas6之各種人類細胞株、人類細胞、人類組織等精製人類Gas6獲得。進而，亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等化學合成法製備具有人類Gas6之部分序列之合成肽而用作抗原。亦可於具有人類Gas6或人類Gas6之部分序列之合成肽中，於C末端或者N末端附加FLAG或者His等公知標籤。
本發明中所使用之人類Gas6可使用Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)等中所記載之方法等，例如藉由以下之方法，使編碼該人類Gas6之DNA於宿主細胞中進行表現而製造。
首先，藉由將包含編碼人類Gas6之部分之全長cDNA插入至適當 之表現載體之啟動子之下游，而製作重組載體。亦可使用基於全長cDNA所製備之包含編碼多肽之部分之適當長度之DNA片段代替上述全長cDNA。其次，藉由將所獲得之該重組載體導入至適合該表現載體之宿主細胞，可獲得生產多肽之轉形體。
作為表現載體，只要為可於所使用之宿主細胞中進行自主複製或組入至染色體中，且於可轉錄編碼多肽之DNA之位置含有適當之啟動子者，則均可使用。
作為宿主細胞，只要為大腸桿菌等屬於大腸菌屬等之微生物、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等可表現目標基因者，則均可使用。
於使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時，重組載體較佳為於原核生物中可進行自主複製並且包含啟動子、核糖體結合序列、包含編碼人類Gas6之部分之DNA、及轉錄終止序列之載體。又，該重組載體中，轉錄終止序列並非必須，但較佳為於結構基因之下游配置轉錄終止序列。該重組載體中亦可進而含有控制啟動子之基因。
作為該重組載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列之夏因-達爾瓦諾(Shine-Dalgarno)序列(亦稱為SD序列)與起始密碼子之間調節為適當距離(例如6~18個鹼基)所獲得之質體。
又，作為編碼該人類Gas6之DNA之鹼基序列，可以成為對於在宿主內之表現而言最佳之密碼子之方式取代鹼基，藉此可提高目標之人類Gas6之生產率。
作為表現載體，只要為可於所使用之宿主細胞中發揮功能者，則均可使用，例如可列舉：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上為Roche Diagnostics公司製造)、pKK233-2(Pharmacia公司製造)、pSE280(Invitrogen公司製造)、pGEMEX-1(Promega公司製造)、pQE-8(Qiagen公司製造)、pKYP10(日本專利特開昭58-110600)、 pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)製備]、pTrs32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)製備，日本專利特開昭60-221091]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)製備，日本專利特開昭60-221091]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司製造)、pET系統(Novagen公司製造)、或pME18SFL3等。
作為啟動子，只要為可於所使用之宿主細胞中發揮功能者，則可為任意者。例如可列舉：trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子、或T7啟動子等源自大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又，亦可使用使兩個Ptrp串聯而成之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子、或let I啟動子等經人工設計改型所獲得之啟動子等。
作為宿主細胞，例如可列舉：大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49或大腸桿菌DH5α等。
作為向宿主細胞中導入重組載體之方法，只要為向所使用之宿主細胞中導入DNA之方法，則均可使用，例如可列舉使用鈣離子之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)、Gene,17,107(1982)、Molecular & General Genetics,168,111(1979)]。
於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，只要為可於動物細胞中發揮功能者，則均可使用，例如可列舉：pcDNAI、 pCDM8(舟越公司製造)、pAGE107[日本專利特開平3-22979；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(WO97/10354)、N5KG1val(US6,001,358)、INPEP4(Biogen-IDEC公司製造)及轉位子載體(WO2010/143698)等。
作為啟動子，只要為可於動物細胞中發揮功能者，則均可使用，例如可列舉：巨細胞病毒(CMV)之立即早期(IE，immediate early)基因之啟動子、SV(simian virus，猿猴病毒)40之初期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα(soluble receptor α，可溶性受體α)啟動子、或莫洛尼(Moloney)小鼠白血病病毒之啟動子或促進子。又，亦可將人類CMV之IE基因之促進子與啟動子一併使用。
作為宿主細胞，可列舉：人類白血病細胞那馬瓦(Namalwa)細胞、猴細胞COS細胞、中國倉鼠卵巢細胞CHO(Chinese Hamster Ovary，中國倉鼠卵巢)細胞(Journal of Experimental Medicine,108,945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；Genetics,55,513(1968)；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in Cell Science,18,115(1996)；Radiation Research,148,260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.,60,1275(1968)；Cell,6,121(1975)；Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(pp.883-900)；)、二氫葉酸還原酶基因(以下表記為dhfr)缺損之CHO細胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980))、CHO-K1(ATCC(American Type Culture Collection，美國菌種保存中心)CCL-61)、DUkXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat # 11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NSO、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14、敍利亞倉鼠細胞BHK或HBT5637(日本專利特開昭63-000299)等。
作為向宿主細胞中導入重組載體之方法，只要為向動物細胞中導入DNA之方法，則均可使用，例如可列舉：電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075)、或脂質體轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
將藉由以上方式所獲得之保有組入有編碼人類Gas6之DNA之重組載體的源自微生物、或動物細胞等之轉形體於培養基中進行培養，於培養液中生成並蓄積該人類Gas6，並自該培養液進行採集，藉此可製造人類Gas6。該轉形體於培養基中進行培養之方法可依據培養宿主時使用之通常方法而進行。
於在源自真核生物之細胞中進行表現之情形時，可獲得附加有糖或糖鏈之人類Gas6。
又，為了製作γ-羧基麩胺酸殘基(Gla)於Gas6之Gla區進行結合而成之Gas6蛋白質，亦可使用作為參與麩胺酸殘基之γ-羧基化之酶的維生素K環氧化物還原酶(VKOR)或導入有γ-麩胺醯羧化酶(GGCX)之細胞。較佳為，為了促進還原型維生素K之誘導，較佳為使用導入有維生素K環氧化物還原酶複合次單元1(VKORC1)及GGCX之兩者的細胞。
又，作為VKOR、VKORC1及GGCX，只要可有效率地向Gas6導入Gla殘基，則可為任一酶，可使用人類、大鼠、小鼠等任一者之酶，可根據所使用之宿主細胞而選擇使用。較佳為可使用導入有人類或大鼠之VKORC1及GGCX之基因之細胞，而製作經Gla化之Gas6。
於對利用使用誘導性之啟動子之重組載體進行轉形後之微生物 進行培養時，亦可視需要將誘導物添加至培養基中。例如，於對利用使用lac啟動子之重組載體進行轉形後之微生物進行培養之情形時，可將異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷等添加至培養基中，於對利用使用trp啟動子之重組載體進行轉形後之微生物進行培養之情形時，可將吲哚丙烯酸等添加至培養基中。
作為對將動物細胞作為宿主而獲得之轉形體進行培養之培養基，可列舉：通常使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、伊戈爾(Eagle)之MEM培養基[Science,122,501(1952)]、杜貝可(Dulbecco)改良MEM培養基[Virology,8,396(1959)]、199培養基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]、伊思考夫改良之杜爾貝科培養基(IMDM，Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、或於該等培養基中添加有胎牛血清(FBS)等之培養基等。培養通常係於pH值6~8、30~40℃、5%CO2之存在下等條件下進行1~7天。又，培養中，亦可視需要將康黴素、青黴素等抗生素添加至培養基中。
作為編碼人類Gas6之基因之表現方法，除直接表現以外，亦可使用分泌生產或融合蛋白表現等方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。
作為人類Gas6之生產方法，存在如下方法：於宿主細胞內生產之方法、分泌至宿主細胞外之方法、或於宿主細胞外膜上生產之方法，可藉由改變所使用之宿主細胞、或所生產之人類Gas6之結構而選擇適當之方法。
於人類Gas6係於宿主細胞內或宿主細胞外膜上生產之情形時，可藉由使用鮑爾森等人之方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、羅等人之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本專利特開平05-336963、或 WO94/23021等中所記載之方法，使人類Gas6積極地分泌至宿主細胞外。
又，亦可利用使用二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系統(日本專利特開平2-227075)而提高人類Gas6之生產量。
所獲得之人類Gas6例如可藉由如下方式進行單離、精製。
於人類Gas6於細胞內於溶解狀態下進行表現之情形時，培養結束後藉由離心分離而回收細胞，懸浮於水系緩衝液中後，使用超音波粉碎機、法式壓碎器(French Press)、Manton-Gaulin均質機、或球磨機等將細胞粉碎，而獲得無細胞提取液。自藉由將該無細胞提取液離心分離而獲得之上清液，單獨使用或組合使用通常之蛋白質之單離精製法、即溶劑提取法、利用硫酸銨等之鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、二乙基胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠(sepharose)、使用DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司製造)等樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、聚焦層析法、或等電點電泳等電泳法等方法，可獲得精製樣本。
於人類Gas6於細胞內形成不溶體而進行表現之情形時，與上述相同地將細胞回收後進行粉碎，並進行離心分離，藉此以沈澱組分之形式回收該人類Gas6之不溶體。利用蛋白質改性劑使所回收之該人類Gas6之不溶體可溶化。藉由對該可溶化液進行稀釋或透析，使該人類Gas6恢復至正常之立體結構，然後藉由與上述相同之單離精製法，可獲得多肽之精製樣本。
於使人類Gas6或其糖修飾物等衍生物分泌至細胞外之情形時，可於培養上清液中回收該人類Gas6或其糖修飾物等衍生物。與上述相同地藉由離心分離等方法對該培養物進行處理，藉此取得可溶性組 分，藉由使用與上述相同之單離精製法，可自該可溶性組分獲得精製樣本。
又，本發明中可使用之人類Gas6亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等化學合成法而製造。又，亦可利用Advanced Chemtec公司製造、PerkinElmer公司製造、Pharmacia公司製造、Protein Technology Instrument公司製造、Synthecell-Vega公司製造、PerSepteive公司製造、或島津製作所公司製造等之肽合成機而進行化學合成。
(2)動物之免疫與融合用抗體產生細胞之製備
使3~20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠等動物對(1)中所獲得之抗原免疫，並採集該動物之脾臟、淋巴結、末梢血液中之抗體產生細胞。又，亦可使用小鼠Gas6剔除小鼠作為被免疫動物。
免疫係藉由將抗原與例如弗氏之完全佐劑、或氫氧化鋁凝膠與百日咳菌疫苗等適當之佐劑一併投予至動物之皮下或靜脈內或腹腔內而進行。於抗原為部分肽之情形時，製作與BSA(牛血清白蛋白)、或KLH(Keyhole Limpet hemocyanin，匙孔螺血氰蛋白)等載體蛋白之偶聯物，將其用作免疫原。
抗原之投予係於第1次之投予後，每隔1~2週進行5~10次。每次投予後第3~7天自眼底靜脈叢(venous plexus)採血，並使用酶免疫測定法[Antibodies- A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等對其血清之抗體效價進行測定。將其血清對免疫中所使用之抗原顯示出充分之抗體效價之動物作為融合用抗體產生細胞之供給源。
於抗原之最終投予後第3~7天，自免疫後之動物摘取脾臟等包含抗體產生細胞之組織，並採集抗體產生細胞。於使用脾臟細胞之情形時，於將脾臟細細切碎並攪散後，進行離心分離，進而將紅血球去除而取得融合用抗體產生細胞。
(3)骨髓瘤細胞之製備
使用自小鼠獲得之培養細胞株作為骨髓瘤細胞，例如可使用8-氮雜鳥嘌呤耐性小鼠(源自BALB/c)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。
該骨髓瘤細胞係於正常培養基[添加有麩醯胺、2-巰基乙醇、慶大黴素、FBS、及8-氮雜鳥嘌呤之RPMI1640培養基]中進行繼代，於細胞融合之3~4天前於正常培養基中進行繼代，而於融合當日確保2×107個以上之細胞數。
(4)細胞融合與產生單株抗體之融合瘤之製備
將(2)中所獲得之融合用抗體產生細胞與(3)中所獲得之骨髓瘤細胞利用最低必需介質(MEM，Minimum Essential Medium)培養基或PBS(磷酸氫鈉1.83g、磷酸二氫鉀0.21g、氯化鈉7.65g、蒸餾水1升，pH值7.2)充分洗淨，以使細胞數達到融合用抗體產生細胞：骨髓瘤細胞=5~10：1之方式進行混合，並進行離心分離後，去除上清液。將沈澱之細胞群充分攪散後，於37℃下一面攪拌一面添加聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培養基及二甲基亞碸之混合液。進而每1~2分鐘添加MEM培養基1~2mL數次後，添加MEM培養基以使總量達到50mL。離心分離後，將上清液去除。將沈澱之細胞群輕輕地攪散後，對於融合用抗體產生細胞，輕輕地使細胞懸浮於HAT(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine，次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷))培養基[添加有次黃嘌呤、胸苷、及胺喋呤之正常培養基]中。將該懸浮液於5%CO2培養箱中於37℃下培養7~14天。
培養後，取培養上清液之一部分，藉由下述結合分析等融合瘤之選擇方法，選擇與包含人類Gas6之抗原反應，且不與不含人類Gas6之抗原反應之細胞群。又，藉由下述競爭分析(competitive assay)等，選擇產生抑制人類Gas6與Axl等Gas6受體之結合之抗人類Gas6抗體之融合瘤細胞群。其次，藉由極限稀釋法進行選殖，選擇穩定地觀察到較強之抗體效價者作為產生單株抗體之融合瘤。
(5)精製單株抗體之製備
對經姥鮫烷處理[腹腔內投予2,6,10,14-四甲基十五烷(姥鮫烷(Pristane))0.5mL並飼養2週]之8~10週齡之小鼠或裸小鼠腹腔內注射(4)中所獲得之產生單株抗體之融合瘤。於10~21天內融合瘤產生癌性腹水。自該小鼠採集腹水，進行離心分離而將固形物成分去除後，利用40~50%硫酸銨進行鹽析，利用辛酸沈澱法、DEAE-瓊脂糖凝膠管柱、蛋白A管柱或凝膠過濾管柱進行精製，採集IgG或IgM組分，而製成精製單株抗體。
又，於添加有10%FBS之RPMI1640培養基等中對(4)中所獲得之產生單株抗體之融合瘤進行培養後，藉由離心分離將上清液去除，懸浮於融合瘤(Hybridoma)SFM(Serum free medium，無血清培養基)培養基中，並培養3~7天。亦可將所獲得之細胞懸浮液離心分離，利用所獲得之上清液利用蛋白A-管柱或蛋白G-管柱進行精製，採集IgG組分，而獲得精製單株抗體。再者，亦可於融合瘤SFM培養基中添加5%Daigo GF21。
抗體之亞型之確定係使用亞型分型套組藉由酶免疫測定法而進行。蛋白質量之定量係根據勞立法或280nm下之吸光度而算出。
(6)單株抗體之選擇
單株抗體之選擇係藉由如下所示之利用酶免疫測定法之結合分析或競爭分析等而進行。除該等方法以外，亦可藉由利用Biacore(註 冊商標)之動力學(Kinetics)分析等而選擇單株抗體。又，亦可藉由利用公知方法[The Prostate,67,1163(2007)]，鑑定抗體之標的抗原，而選擇單株抗體。
(6-a)結合分析
使用將包含編碼(1)中所獲得之人類Gas6之cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等中而獲得之重組蛋白質、或由人類組織獲得之精製多肽或部分肽等作為抗原。於抗原為重組蛋白質之情形時，亦可附加FLAG或His等標籤。於抗原為部分肽之情形時，製作與BSA或KLH等載體蛋白質之偶聯物，並使用該偶聯物。
將抗原分注至96孔培養盤等板中，並進行固相化後，分注作為第1抗體之血清、融合瘤之培養上清液或精製單株抗體等試驗物質，使之反應。利用PBS或PBS-Tween等充分洗淨後，分注作為第2抗體之利用生物素、酶、化學發光物質或放射線化合物等進行標記之抗免疫球蛋白抗體，使之反應。利用PBS-Tween充分洗淨後，進行與第2抗體之標記物質相應之反應，而選擇對免疫原特異性地反應之單株抗體。
又，與包含與本發明之人類Gas6結合之單株抗體所結合之抗原決定基之抗原決定基結合的抗體可藉由如下方法取得：藉由公知方法對上述結合分析系統中所取得之抗體之抗原決定基進行鑑定，製作包含所鑑定之抗原決定基之合成肽等，並進行免疫。
進而，結合於與本發明之與人類Gas6結合之單株抗體所結合之抗原決定基相同之抗原決定基的抗體可藉由如下方法取得：對上述結合分析系統中所取得之抗體之抗原決定基進行鑑定，製作使所鑑定之抗原決定基之部分性合成肽、或模擬抗原決定基之立體結構而成之合成肽等，並進行免疫。
(6-b)競爭分析
依據(1)中所記載之方法，製備人類Axl細胞外區與人類IgG1重鏈恆定區融合蛋白(hAxl-hFc)。hAxl-hFc於人類Axl細胞外區與IgG1重鏈恆定區之間可具有適當之限制酶識別序列。將所獲得之hAxl-hFc分注至96孔培養盤中進行固相化。其次，將融合瘤培養上清液或精製單株抗體等試驗物質及(1)中所獲得之附有標籤之hGas6之混合溶液分注至孔中，使之反應。利用PBS或PBS-Tween等充分洗淨後，分注利用生物素、酶、化學發光物質或放射線化合物等進行標記之針對上述標籤之抗體作為檢測用抗體，使之反應。利用PBS-Tween充分洗淨後，進行與檢測用抗體之標記物質相應之反應，而選擇抑制hGas6與hAxl-hFc之結合之單株抗體。
(6-c)利用Biacore(註冊商標)之動力學分析
使用Biacore(註冊商標)T100，對抗原與試驗物質間之結合時之動力學進行測定，並利用設備附屬之分析軟體對其結果進行分析。藉由胺偶合法將抗小鼠IgG抗體固定於感測片CM5，然後沖流以融合瘤培養上清液或精製單株抗體等試驗物質，使適當量結合，進而沖流以已知濃度之複數種濃度之抗原，並測定結合、解離。使用設備附屬之軟體，藉由1：1結合模型對所獲得之資料進行動力學分析，而取得各種參數。或者，例如藉由胺偶合法將人類Gas6、該部分肽、使該部分肽與載體蛋白偶聯而得者固定於感測片上，然後沖流以已知濃度之複數種濃度之精製單株抗體，並測定結合及解離。使用設備附屬之軟體，利用二價結合模型對所獲得之資料進行動力學分析，而取得各種參數。
2.基因重組抗體之製作
作為基因重組抗體之製作例，以下示出人類型嵌合抗體及人類化抗體之製作方法。
(1)基因重組抗體表現用載體之構建
基因重組抗體表現用載體係組入有編碼人類抗體之CH及CL之DNA的動物細胞用表現載體，可藉由分別將編碼人類抗體之CH及CL之DNA選殖至動物細胞用表現載體中而構建。
人類抗體之C區可使用任意之人類抗體之CH及CL。例如，使用人類抗體之γ1亞型之CH及κ型之CL等。編碼人類抗體之CH及CL之DNA係使用cDNA，但亦可使用包含外顯子與內含子之染色體DNA。動物細胞用表現載體只要為可組入並表現編碼人類抗體之C區之基因者，則亦可使用任意者。例如使用pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。動物細胞用表現載體中之啟動子與促進子係使用SV40之初期啟動子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR((Long Terminal Repeat，長末端重複序列)[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]、或免疫球蛋白H鏈之啟動子[Cell,41,479(1985)]與促進子[Cell,33,717(1983)]等。
就基因重組抗體表現載體之構建之容易性、導入至動物細胞中之容易性、動物細胞內之抗體H鏈及L鏈之表現量之平衡性均衡等觀點而言，基因重組抗體表現用載體係使用抗體H鏈及L鏈存在於同一載體上之類型(串聯型)之基因重組抗體表現用載體[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，但亦可使用抗體H鏈及L鏈存在於不同載體上之類型。串聯型之基因重組抗體表現用載體係使用pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。
(2)編碼源自人類以外之動物之抗體之V區的cDNA之取得及胺基 酸序列之分析
編碼非人類抗體之VH及VL的cDNA之取得及胺基酸序列之分析可藉由如下方式進行。
自產生非人類抗體之融合瘤細胞提取mRNA，並合成cDNA。將所合成之cDNA選殖至噬菌體或質體等載體中，而製作cDNA基因庫。使用編碼小鼠抗體之C區部分或V區部分的DNA作為探針，自該基因庫分別單離出具有編碼VH或VL之cDNA之重組噬菌體或重組質體。分別確定重組噬菌體或重組質體上之目標小鼠抗體之VH或VL之全長鹼基序列，並由鹼基序列分別推測VH或VL之全長胺基酸序列。
製作產生非人類抗體之融合瘤細胞的人類以外之動物係使用小鼠、大鼠、倉鼠、或兔等，但只要可製作融合瘤細胞，則亦可使用任何動物。
由融合瘤細胞製備總RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)時係使用硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]、或RNA easy套組(Qiagen公司製造)等套組等。
由總RNA製備mRNA時係使用寡聚(dT)固定化纖維素管柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]、或Oligo-dT30<Super>mRNA Purification(註冊商標)套組(TAKARA BIO公司製造)等套組等。又，亦可使用Fast Track mRNA Isolation(註冊商標)套組(Invitrogen公司製造)、或QuickPrep mRNA Purification(註冊商標)套組(Pharmacia公司製造)等套組，由融合瘤細胞製備mRNA。
cDNA之合成及cDNA基因庫之製作係使用公知方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987-1997)]、或SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen公司製造)、或ZAP-cDNA Synthesis(註冊商標)套組(Stratagene公司製造)等套組等。
於製作cDNA基因庫時，組入以自融合瘤細胞提取之mRNA作為模板而合成之cDNA的載體只要為可組入該cDNA之載體，則可使用任何者。例如使用ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning：A Practical Approach,I,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司製造)、λExCell、pT7T3-18U(Pharmacia公司製造)、pCD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]、或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
導入由噬菌體或質體載體所構建之cDNA基因庫的大腸桿菌只要為可導入、表現及維持該cDNA基因庫者，則可使用任何者。例如使用XL1-Blue MRF'[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]、或JM105[Gene,38,275(1985)]等。
於自cDNA基因庫選擇編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA選殖時，使用利用同位素或螢光進行標記之探針的菌落雜交法、或噬菌斑雜交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]等。
又，亦可藉由製備引子，以由mRNA合成之cDNA或cDNA基因庫作為模板，實施聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction)法[以下，表述為PCR法，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons (1987-1997)]，而製備編碼VH或VL之cDNA。
利用適當之限制酶等切斷所選擇之cDNA後，選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體中，藉由通常所使用之鹼基序列分析方法等確定該cDNA之鹼基序列。鹼基序列分析方法例如於進行雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等之反應後，使用ABI PRISM3700(PE Biosystems公司製造)或A.L.F.DNA核酸定序儀(Pharmacia公司製造)等鹼基序列自動分析裝置等。
由所確定之鹼基序列分別推測VH及VL之全長胺基酸序列，並與已知之抗體之VH及VL之全長胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較，藉此分別確認所取得之cDNA是否編碼包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL的完整胺基酸序列。關於包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列，可藉由與已知之抗體之VH及VL之全長胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較，而推測分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可知該等所屬之亞群。又，關於VH及VL之各CDR之胺基酸序列，亦可藉由與已知之抗體之VH及VL之胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較而找出。
又，使用所獲得之VH及VL之完整胺基酸序列，例如對SWISS-PROT或PIR-Protein等任意之資料庫進行BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等同源性檢索，可確認VH及VL之完整胺基酸序列是否為新穎者。
(3)人類型嵌合抗體表現載體之構建
藉由將分別編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA分別選殖至(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基 因之上游，可構建人類型嵌合抗體表現載體。
為了將編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA之3'末端側與人類抗體之CH或CL之5'末端側連結，製作以連結部分之鹼基序列編碼適當之胺基酸，且成為適當之限制酶識別序列之方式設計之VH及VL之cDNA。使所製作之VH及VL之cDNA分別選殖至(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游，以使該等以適當之形式進行表現，而構建人類型嵌合抗體表現載體。
又，亦可使用兩端具有適當之限制酶之識別序列之合成DNA，藉由PCR法分別擴增非人類抗體編碼VH或VL之cDNA，並將其選殖至(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體中。
(4)編碼人類化抗體之V區的cDNA之構建
編碼人類化抗體之VH或VL的cDNA可藉由如下方式構建。
分別選擇用以移植非人類抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序列的人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列。所選擇之FR之胺基酸序列只要為源自人類抗體者，則可使用任一者。例如使用蛋白質資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中所登記之人類抗體之FR之胺基酸序列、或人類抗體之FR之各亞群之共用胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]等。為了抑制抗體之結合活性之降低，選擇與原本之抗體之VH或VL之FR的胺基酸序列具有儘量高之同源性(至少60%以上)之FR之胺基酸序列。
其次，向所選擇之人類抗體之VH或VL之FR的胺基酸序列中分別移植原抗體之CDR之胺基酸序列，而分別設計人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列。考慮於抗體之基因之鹼基序列中出現之密碼子的使用頻度[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]而將所設計之胺基酸序列轉為DNA序列， 從而分別設計編碼人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序列。
基於所設計之DNA序列，合成數條包含100個鹼基左右之長度之合成DNA，並使用該等進行PCR反應。於該情形時，根據PCR反應中之反應效率及可合成之DNA之長度，較佳為分別對VH、VL設計各6條合成DNA。進而，藉由在位於兩端之合成DNA之5'或3'末端導入適當之限制酶之識別序列，可容易地將編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA選殖至(1)中。
PCR反應後，分別將擴增產物選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體上，藉由與(2)中所記載之方法同樣之方法確定鹼基序列，而取得具有編碼所需之人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列的DNA序列之質體。
或者，亦可使用基於所設計之DNA序列將VH全長及VL全長分別作為1條長鏈DNA而合成者代替上述PCR擴增產物。進而，藉由在合成長鏈DNA之兩端導入適當之限制酶之識別序列，可容易地將編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA選殖至(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體上。
(5)人類化抗體之V區之胺基酸序列之改型
關於人類化抗體，若僅將非人類抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL之FR，則其抗原結合活性與原非人類抗體相比降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。對於人類化抗體，鑑定人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列中參與和直接抗原之結合之胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維持抗體之立體結構並間接地參與和抗原之結合之胺基酸殘基，並將該等胺基酸殘基取代為原非人類抗體之胺基酸殘基，藉此可使已降低之抗原結合活性提高。
為了鑑定與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基，可藉由使用X 射線結晶分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或電腦模型化[Protein Engineering,7,1501(1994)]等，而進行抗體之立體結構之構建及分析。又，可藉由針對各抗體製作數種改型體，並反覆研究與各抗原結合活性之相關性而進行試誤，從而取得具有所需之抗原結合活性之人類化抗體。
人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用改型用合成DNA進行(4)中所記載之PCR反應而進行改型。針對PCR反應後之擴增產物，藉由(2)中所記載之方法確定鹼基序列，而確認已實施目標改型。
(6)人類化抗體表現載體之構建
可將所構建之編碼基因重組抗體之VH或VL之cDNA分別選殖至(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體的編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游，而構建人類化抗體表現載體。
例如，藉由在(4)及(5)中所獲得之構建人類化抗體之VH或VL時所使用之合成DNA中位於兩端之合成DNA之5'或3'末端導入適當之限制酶之識別序列，分別選殖至在(1)中所獲得之人類化抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游，以使該等以適當形式進行表現。
(7)基因重組抗體之短暫性表現(transient expression)
使用(3)及(6)中所獲得之基因重組抗體表現載體、或將該等改型而成之表現載體進行基因重組抗體之短暫性表現，可有效率地對所製作之多種人類型嵌合抗體、人類化抗體之抗原結合活性進行評價。
導入表現載體之宿主細胞只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則任何細胞均可使用，例如使用COS-7細胞[美國菌種保存中心(ATCC，American Type Culture Collection)編號：CRL1651][Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]。
向COS-7細胞中導入表現載體係使用DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press(1991)]、或脂質體轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
導入表現載體後，培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性係使用酶免疫抗體法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies- A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單純系抗體實驗手冊，Kodansha Scientific,(1987)]等而進行測定。
(8)穩定地表現基因重組抗體之轉形株之取得與基因重組抗體之製備
藉由將(3)及(6)中所獲得之基因重組抗體表現載體導入至適當之宿主細胞中，可獲得穩定地表現基因重組抗體之轉形株。
向宿主細胞導入表現載體係使用電穿孔法[日本專利特開平2-257891,Cytotechnology,3,133(1990)]等。
導入基因重組抗體表現載體之宿主細胞只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則任何細胞均可使用。例如，使用CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat # 11619)、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(ATCC編號：CRL1662，或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NS0、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14(ATCC編號：CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC編號：CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(Dihydroforate Reductase，以下，表述為dhfr)缺損之CHO細胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]等。
又，亦可使用參與細胞內糖核苷酸GDP(Guanosine diphosphate，鳥苷二磷酸)-岩藻糖之合成之酶等蛋白質、或參與於N-糖苷鍵複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡糖胺之6位上使岩藻糖之1位進行α鍵結之 糖鏈修飾的酶等蛋白質、或參與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖向高爾基體輸送的蛋白質等之活性降低或缺失之宿主細胞、例如α1,6-岩藻糖轉移酶基因缺損之CHO細胞(WO2005/035586、WO02/31140)、獲得了抗凝集素性之Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]等。
導入表現載體後，穩定地表現基因重組抗體之轉形株係藉由在包含G418硫酸鹽(以下表記為G418)等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養而選擇(日本專利特開平2-257891)。
動物細胞培養用培養基係使用RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)、融合瘤-SFM培養基(Invitrogen公司製造)、或於該等培養基中添加有FBS等各種添加物之培養基等。藉由將所獲得之轉形株於培養基中進行培養，而於培養上清液中表現並蓄積基因重組抗體。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等進行測定。又，可利用dhfr基因擴增系統(日本專利特開平2-257891)等，而提高轉形株所產生之基因重組抗體之表現量。
基因重組抗體係使用蛋白A-管柱自轉形株之培養上清液進行精製[Monoclonal Antibodies- Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies- A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。又，亦可將凝膠過濾、離子交換層析法及超濾等蛋白質之精製中所使用之方法加以組合。
精製後之基因重組抗體之H鏈、L鏈或整個抗體分子之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature,227,680(1970)]、或西方墨點法[Monoclonal Antibodies- Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies- A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等而進行測定。
3.精製單株抗體或其抗體片段之活性評價
經精製之本發明之單株抗體或其抗體片段之活性評價可藉由如下方式進行。
針對人類Gas6之結合活性係使用利用上述1-(6a)中所記載之結合分析及(6c)中所記載之Biacore(註冊商標)系統等之表面電漿子共振法而進行測定。又，可使用螢光抗體法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]等而進行測定。
人類Gas6與Gas6受體之結合抑制活性例如可使用上述1-(6b)中所記載之競爭分析而進行測定。
4.使用本發明之抗人類Gas6單株抗體或其抗體片段的疾病之治療方法
本發明之單株抗體或其抗體片段只要為人類Gas6依賴性細胞增殖、病變等與Gas6相關之疾病，則可用於任一人類Gas6相關疾病之治療。
含有本發明之單株抗體或其抗體片段之治療劑亦可為僅包含作為有效成分之該抗體或該抗體片段者，通常係以與藥理學上容許之1種以上之載體一併混合，並藉由製劑學之技術領域中公知之方法而製造之藥物製劑之形式提供。
投予途徑可列舉：經口投予、或口腔內、氣管內、直腸內、皮下、肌內或者靜脈內等非經口投予，作為投予形態，可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、或貼劑等。
適合經口投予之製劑為乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑、或顆粒劑等。
乳劑或糖漿劑之類的液體製備物係使用水，蔗糖、山梨糖醇或 果糖等糖類，聚乙二醇或丙二醇等二醇類，芝麻油、橄欖油或大豆油等油類，對羥基苯甲酸酯類等防腐劑，或草莓香料或胡椒薄荷等香料類等作為添加劑而製造。
膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等係使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等賦形劑，澱粉或海藻酸鈉等崩解劑，硬脂酸鎂或滑石等潤滑劑，聚乙烯醇、羥丙基纖維素或明膠等結合劑，脂肪酸酯等界面活性劑或甘油等塑化劑等作為添加劑而製造。
作為適合非經口投予之製劑，為注射劑、栓劑或噴霧劑等。
注射劑係使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或該兩者之混合物之載體等而製造。
栓劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體而製造。
噴霧劑係使用不會刺激接受者之口腔及氣管黏膜且使本發明之單株抗體或其抗體片段以微細粒子之形式分散而使吸收變得容易之載體等而製造。例如使用乳糖或甘油等作為載體。又，亦可以氣溶膠或乾粉之形式製造。
進而，於上述非經口劑中，亦可添加在適合經口投予之製劑中作為添加劑而例示之成分。
5.使用本發明之抗人類Gas6單株抗體或其抗體片段的疾病之診斷方法
藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段而檢測或測定人類Gas6或表現人類Gas6之細胞，可對人類Gas6相關疾病進行診斷。
作為人類Gas6相關疾病之腎或癌之疾病之診斷例如可藉由免疫學方法檢測或測定患者體內所存在之人類Gas6而進行。又，可藉由使用流式細胞儀等免疫學方法檢測於患者體內之細胞中進行表現之人類Gas6而進行診斷。
所謂免疫學方法，係使用實施過標記之抗原或抗體而檢測或測 定抗體量或抗原量的方法。例如使用放射性物質標記免疫抗體法、酶免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法、西方點墨法或物理化學方法等。
放射性物質標記免疫抗體法例如係使抗原或表現抗原之細胞等與本發明之抗體或該抗體片段反應，進而使實施過放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應，然後利用閃爍計數器等進行測定。
酶免疫測定法例如係使抗原或表現抗原之細胞等與本發明之抗體或該抗體片段反應，進而使之與實施過標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應，然後利用吸光光度計測定顯色色素。例如使用夾層ELISA法等。作為酶免疫測定法中所使用之標記物，可使用公知[酶免疫測定法，醫學書院(1987)]之酶標記。
例如使用鹼性磷酸酶標記、過氧化酶標記、螢光素酶標記、或生物素標記等。夾層ELISA法係如下方法：使抗體結合於固相上之後，使之捕獲作為檢測或測定對象之抗原，而使所捕獲之抗原與第2抗體反應。於該ELISA法中，準備如下兩種抗體，其係識別欲檢測或測定之抗原之抗體或抗體片段，且抗原識別部位不同；預先使其中之第1抗體或抗體片段吸附於培養盤(例如96孔培養盤)，其次利用FITC等螢光物質、過氧化酶等酶、或生物素等標記第2抗體或抗體片段。於吸附有上述抗體之板上，使自活體內分離出之細胞或其破碎液、組織或其破碎液、細胞培養上清液、血清、胸水、腹水或眼液等反應，然後使所標記之單株抗體或抗體片段反應，並進行與標記物質相應之檢測反應。由將已知濃度之抗原階段性地稀釋而製成之校準曲線，算出試驗樣品中之抗原濃度。作為夾層ELISA法中所使用之抗體，可使用多株抗體或單株抗體之任一種，亦可使用Fab、Fab'、或F(ab)2等抗體片段。作為夾層ELISA法中所使用之兩種抗體之組合，可為識別不同抗原決定基之單株抗體或抗體片段之組合，亦可為多株抗體與單株 抗體或抗體片段之組合。
螢光免疫測定法係藉由文獻[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單純系抗體實驗手冊、Kodansha Scientific、(1987)]等中所記載之方法而進行測定。作為螢光免疫測定法中所使用之標記物，可使用公知[螢光抗體法，soft science公司，(1983)]之螢光標記。例如使用FITC或RITC等。
發光免疫測定法係藉由文獻[生物發光與化學發光，臨床檢査42，廣川書店，(1998)]等中所記載之方法而進行測定。作為發光免疫測定法中所使用之標記物，可列舉公知之發光體標記，使用吖啶鎓酯、咯吩等。
西方點墨法係藉由如下方法進行測定：將抗原或表現抗原之細胞等利用SDS(十二烷基硫酸鈉)-PAGE(聚丙烯醯胺凝膠)[Antibodies- A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]進行區分後，將該凝膠印跡至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝基纖維素膜上，並於該膜上使識別抗原之抗體或抗體片段反應，進而使之與實施過FITC等螢光物質、過氧化酶等酶標記、或生物素標記等之抗小鼠IgG抗體或結合片段反應後，將該標記可見化。
將一例示於以下。將表現具有序列編號4之胺基酸序列之多肽的細胞或組織溶解，於還原條件下使每個泳道之蛋白量為0.1~30μg，藉由SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)法進行電泳。將電泳後之蛋白質轉印至PVDF膜上，使包含1~10%BSA之PBS(以下表記為BSA-PBS)於室溫下反應30分鐘而進行阻斷操作。此處使本發明之單株抗體反應，利用包含0.05~0.1%之Tween-20之PBS(以下表記為Tween-PBS)進行洗淨，使過氧化酶標記之山羊抗小鼠IgG於室溫下反應2小時。利用Tween-PBS進行洗淨，使用ECL(Electrochemical luminescence，電致化學發光)西方墨點檢測試劑(Western Blotting Detection Reagents)(Amersham公司製造)等對結合有單株抗體之條帶進行檢測，藉此檢測具有序列編號4之胺基酸序列之多肽。作為西方墨點法之檢測中所使用之抗體，可使用可與未保持天然型之立體結構之多肽結合的抗體。
物理化學方法例如係藉由如下方法進行：藉由使作為抗原之人類Gas6與本發明之單株抗體或其抗體片段結合而形成凝聚體，並對該凝聚體進行檢測。除此以外，作為物理化學方法，亦可使用毛細管法、一維免疫擴散法、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法[臨床檢査法提要，金原出版(1998)]等。關於乳膠免疫比濁法，若使用使抗體或抗原致敏之粒徑0.1~1μm左右之聚苯乙烯乳膠等載體，藉由對應之抗原或抗體引起抗原抗體反應，則反應液中之散射光增加，透過光減少。以吸光度或積分球濁度之形式檢測該變化，藉此測定試驗樣品中之抗原濃度等。
表現人類Gas6之細胞之檢測或測定可使用公知之免疫學檢測法，其中，較佳為使用免疫沈澱法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。
關於免疫沈澱法，使表現人類Gas6之細胞等與本發明之單株抗體或其抗體片段反應後，添加對蛋白G-瓊脂糖凝膠等免疫球蛋白具有特異性結合能力之載體，而使抗原抗體複合體沈澱。或者，亦可藉由如下所述之方法進行。使上述本發明之單株抗體或其抗體片段固相化於ELISA用96孔培養盤中，然後利用BSA-PBS進行阻斷。於抗體例如為融合瘤培養上清液等未精製之狀態之情形時，預先使抗小鼠免疫球蛋白、抗大鼠免疫球蛋白、蛋白-A或蛋白-G等固相化於ELISA用96孔培養盤中，並利用BSA-PBS進行阻斷，然後分注融合瘤培養上清液而使之結合。其次，棄去BSA-PBS並利用PBS充分洗淨後，使表現人類 Gas6之細胞或組織之溶解液反應。利用SDS-PAGE用樣品緩衝液自充分洗淨後之板提取免疫沈澱物，並藉由上述西方墨進行檢測。
免疫細胞染色法或免疫組織染色法為如下方法：將表現抗原之細胞或組織等視情形利用界面活性劑或甲醇等進行處理，以使抗體之通過性變得良好，然後與本發明之單株抗體反應，進而與實施過FITC等螢光標記、過氧化酶等酶標記或生物素標記等之抗免疫球蛋白抗體或其結合片段反應後，使該標記可見化，並利用顯微鏡進行顯微觀察。又，可使螢光標記之抗體與細胞反應，並藉由利用流式細胞儀進行分析之螢光抗體染色法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)，單純系抗體實驗手冊，Kodansha Scientific,(1987)]進行檢測。尤其對於與人類Gas6結合之本發明之單株抗體或其抗體片段，可藉由螢光抗體染色法檢測保持天然型之立體結構而表現之細胞。
又，螢光抗體染色法中，於使用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等之情形時，可於不將所形成之抗體-抗原複合體與未參與抗體-抗原複合體形成之游離之抗體或抗原分離之情況下測定抗原量或抗體量。
以下，藉由實施例具體地說明本發明，但本發明並不限定於下述實施例。
[實施例]
[實施例1]Gas6剔除(以下記載為KO)小鼠之取得
自Taconic公司購入Gas6異質KO小鼠之精子。所購入之Gas6異質KO小鼠之遺傳背景為129/SvEv-C57BL/6。於日本CLAIR公司，使該Gas6異質KO小鼠之精子與C57BL/6 NJcl小鼠之卵子進行體外受精後，將受精卵移植至受體小鼠中而獲得幼仔。對所獲得之幼仔，藉由公知之方法進行基因分型，並確認Gas6基因被剔除，而獲得Gas6同質 KO小鼠。
[實施例2]各種Gas6重組體之製作
為了用於免疫及篩選，藉由以下所記載之方法製作於C末端附加有FLAG-tag之人類、食蟹猴、大鼠及小鼠之Gas6重組蛋白質。以下，分別記載為hGas6-F、cGas6-F、rGas6-F、及mGas6-F。
(1)hGas6-F表現載體之構建
組入有hGas6-F基因序列之動物細胞表現載體係由組入有人類Gas6之基因序列(序列編號3，基因庫寄存編號：NM_000820)之質體(Invitrogen公司製造)以如下之方式製作。
包含hGas6-F基因之DNA片段係以上述質體作為模板，藉由使用引子1、2(序列編號1、2)之聚合酶連鎖反應(PCR)進行擴增。關於PCR，製備包含模板質體、各10pmol之上述兩種引子、及KOD FX(Toyobo公司製造)20μL的反應液，於94℃下保溫2分鐘後，將於94℃下15秒鐘、於58℃下30秒鐘、及於68℃下2.5分鐘設為1個循環而使之反應30個循環。將所獲得之PCR產物供於瓊脂糖凝膠電泳，使用QIA快速凝膠提取套組(quick Gel Extraction kit)(Qiagen公司製造)回收約2kbp之擴增DNA片段(包含hGas6-F基因之DNA片段)。將所獲得之擴增DNA片段使用ZERO BLUNT TOPO PCR選殖套組(Invitrogen公司製造)插入至pCR4-Blunt-TOPO載體中，而獲得包含質體pCR4-hGas6-F之反應液。使用該反應液，藉由通常方法使大腸桿菌DH5α株(TOYOBO公司製造)轉形，並自所獲得之轉形體提取質體pCR4-hGas6-F。針對所獲得之pCR4-hGas6-F，選擇具有無因PCR所引起之變異之插入基因序列的純系，用於以下之實驗。
其次，利用限制酶EcoRI及BamHI對pCR4-hGas6-F進行酶處理。將反應液供於瓊脂糖凝膠電泳後，使用QIA快速凝膠提取套組回收約2kbp之DNA片段(以下記載為hGas6-F- EcoRI-BamHI)。同樣地，利用 EcoRI及BamHI對動物細胞表現用載體pKANTEX93(WO97/10354)進行酶處理。將反應液供於瓊脂糖凝膠電泳後，使用QIA快速凝膠提取套組回收約9.3kbp之DNA片段(以下記載為pKANTEX93-EcoRI-BamHI)。使用Ligation High ver.2(Toyobo公司製造)使所獲得之兩種DNA片段連結，使用該反應液使大腸桿菌DH5α株(TOYOBO)轉形。由所獲得之轉形體獲得作為hGas6-F動物細胞表現載體之pKANTEX-hGas6-F。
(2)cGas6-F表現載體之構建
藉由以下之方法構建組入有cGas6-F基因之動物細胞表現載體。首先於最初進行食蟹猴Gas6基因之選殖。包含食蟹猴Gas6基因之DNA片段係藉由PCR進行擴增。關於PCR，製備包含作為模板之源自食蟹猴肺之cDNA(CytoMol公司製造)、各10pmol之引子3、4(序列編號5、6)、KOD-plus-(Toyobo公司製造)、及2%DMSO(Dimethylsulfoxide，二甲基亞碸)20μL的反應液，於94℃下保溫2分鐘後，將以於94℃下15秒鐘、於65℃下30秒鐘、及於68℃下2.5分鐘設為1個循環而進行35個循環。其後係藉由與(1)同樣之方法，獲得於pCR4-Blunt-TOPO載體中插入有擴增DNA片段(包含cGas6基因之DNA片段)之質體pCR4-cGas6。針對所獲得之質體，藉由通常方法進行序列分析，以序列編號7表示所獲得之食蟹猴Gas6之鹼基序列，以序列編號8表示由該鹼基序列推測出之食蟹猴Gas6之胺基酸序列。
繼而，藉由PCR法使包含cGas6-F基因之DNA片段擴增，並組入至動物細胞表現用載體pKANTEX93。關於PCR，製備包含作為模板之pCR4-Gas6、各10pmol之引子5、6(序列編號9、10)、及PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)20μL的反應液，於94℃下保溫5分鐘後，將於98℃下10秒鐘、於68℃下2分20秒鐘設為1個循環而進行35個循環。
自所獲得之PCR產物及pKANTEX93，回收藉由與(1)同樣之方法進行了限制酶消化之DNA片段(cGas6-F-EcoRI-BamHI及pKANTEX93-EcoRI-BamHI)。使用融合HD選殖套組(In-Fusion HD Cloning kit)(Clontech公司製造)使所獲得之兩種DNA片段連結，藉由與(1)同樣之方法取得cGas6-F動物細胞表現用載體pKANTEX-cGas6-F。針對所獲得之載體，選擇具有無因PCR所引起之變異之插入基因之純系，用於以下之實驗。
(3)rGas6-F表現載體之構建
藉由以下之方法製作組入有rGas6-F基因之動物細胞表現載體。
包含rGas6-F基因之DNA片段係藉由PCR法進行擴增。關於PCR，製備包含作為模板之源自大鼠心臟或肝臟之cDNA(TAKARA BIO公司製造)、各10pmol之引子7、8(序列編號11、12)、及KOD FX(Toyobo公司製造)20μL的反應液，於94℃下保溫2分鐘後，將於94℃下15秒鐘、於58℃下30秒鐘、及於68℃下2.5分鐘設為1個循環而進行30個循環。
藉由與(1)同樣之方法，於pCR4-Blunt-TOPO載體中插入有藉由PCR進行擴增之DNA片段(包含rGas6-F基因之DNA片段)，而獲得質體pCR4-rGas6-F。確認到所獲得之質體所具有之大鼠Gas6之鹼基序列係與基因庫寄存編號：NM_057100所表示之大鼠Gas6之鹼基序列(序列編號13)一致，且未產生因PCR所引起之基因變異。
基於所獲得之pCR4-rGas6-F，藉由與(1)同樣之方法，於pKANTEX93中插入rGas6-F基因，而獲得作為rGas6-F動物細胞表現載體之pKANTEX-rGas6-F。
(4)mGas6-F表現載體之構建
藉由以下所記載之方法製作組入有mGas6-F基因之動物細胞表現載體。
藉由PCR使包含mGas6-F基因之DNA片段擴增。關於PCR，製備包含作為模板之源自小鼠腎臟或肺之cDNA(ambion公司製造)、各10pmol之引子7、9(序列編號11及15)之引子、及KOD FX(Toyobo公司製造)20μL的反應液，於94℃下保溫2分鐘後，將於94℃下15秒鐘、於58℃下30秒鐘、及於68℃下2.5分鐘設為1個循環而進行30個循環。藉由與(1)同樣之方法，於pCR4-Blunt-TOPO載體中插入藉由PCR進行擴增之DNA片段(包含mGas6-F基因之DNA片段)，而獲得質體pCR4-mGas6-F。確認到所獲得之質體所具有之小鼠Gas6之鹼基序列係與基因庫寄存編號：NM_019521所表示之小鼠Gas6之鹼基序列(序列編號16)一致，且未產生因PCR所引起之基因變異。基於所獲得之pCR4-mGas6-F，藉由與(1)同樣之方法，於pKANTEX93中插入mGas6-F基因，而獲得作為mGas6-F動物細胞表現載體之pKANTEX-mGas6-F。
(5)hGas6-F穩定表現細胞株之建立
為了建立hGas6-F之穩定表現細胞株，將(1)中所製作之hGas6-F表現載體pKANTEX-hGas6-F使用電穿孔法[Sight Technology，3,133(199)]，以如下方式導入至dhfr缺損之CHO細胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]中。
關於細胞之培養，通常繼代係使用基礎培養基[包含10%透析FBS(GIBCO公司製造)、1×HT(Hypoxanthine Thymidine，次黃嘌呤-胸苷)溶液(Invitrogen公司製造)、50μg/mL之慶大黴素(Gentamicin)(Nacalai Tesque公司製造)之IMDM(Invitrogen公司製造)]。於基因導入後之細胞之篩選時，使用包含50nM、200nM或者500nM之甲胺喋呤水合物(methotrexate hydrate)(Sigma-Aldrich公司製造)(以下記載為MTX)之基礎培養基(MTX培養基)。任一細胞均於37℃、5%CO2條件下進行靜置培養。
將包含10μg之pKANTEX-hGas6-F之質體溶液[使(1)中所獲得之 pKANTEX-hGas6-F溶解於殺菌水中而成之溶液]添加至電穿孔法用比色管(Bio-Rad公司製造)中。於該比色管中添加藉由K-PBS[混合有137mmol/L之KCl、2.7mmol/L之NaCl、8.1mmol/L之Na2HPO4、1.5mmol/L之KH2PO4、4.0mmol/L之MgCl2之溶劑]所製備之8×106個/mL之細胞懸浮液，進行混合後，使用基因脈衝儀(Gene Pulser)(BIO-RAD)於脈衝電壓350V、電容250μF之條件下進行基因導入。
使基因導入後之細胞懸浮液懸浮於不含50mL之HT溶液之基礎培養基中，並以100μL/孔接種至5片96孔培養盤中。培養開始14天後將培養基更換為50nM之MTX培養基，於第22天更換為200nM之MTX培養基，而進行MTX耐性細胞株之篩選。於培養第35天，針對確認到菌落之細胞株，使用人類Gas6 ELISA套組(human Gas6 ELISA kit)(R&D公司製造)，對培養上清液中之hGas6-F之表現量進行測定。將hGas6-F之表現量較高之株擴大至24孔培養盤中，培養開始42天後將培養基更換為500nM之MTX培養基。針對500nM之MTX耐性細胞株，藉由與上述同樣之方法，對培養上清液之hGas6-F之表現量進行測定，並選擇hGas6-F之表現量最高之株作為hGas6-F穩定表現細胞株。
(6)cGas6-F、rGas6-F、及mGas6-F穩定表現細胞株之製作
藉由與(5)同樣之方法將(2)~(4)中所製作之pKANTEX-cGas6-F、pKANTEX-rGas6-F、及pKANTEX-mGas6導入至宿主細胞中，而建立cGas6-F、rGas6-F及mGas6-F穩定表現細胞株。
上述載體均使用藉由限制酶MulI進行酶處理而使之線狀化。藉由苯酚/氯仿提取及乙醇沈澱而精製該線狀化載體，使之溶解於殺菌水中並供於實驗。
培養上清液中之cGas6-F之表現量係使用人類Gas6 ELISA套組(R&D公司製造)進行測定。又，rGas6-F及mGas6-F之表現量係使用小 鼠Gas6 ELISA套組(mouse Gas6 ELISA kit)(R&D公司製造)進行測定。
(7)大鼠VKOR及人類GGCX表現串聯載體之構建
為了取得活性型Gas6蛋白質，Gas6之Gla區中所含之麩胺酸殘基之γ位之碳必須利用作為Gla化修飾相關酶之GGCX進行羧基化。又，GGCX之活化需要還原維生素K，還原維生素K係藉由VKOR(vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，維生素K環氧化物還原酶複合次單元1)將維生素K環氧化物還原而製成[Journal of Thrombosis and Haemostasis 3,1873-1878(2005)]。因此，為了獲得活性型Gas6，而製作人類GGCX(以下記載為hGGCX)及大鼠VKOR(以下記載為rVKOR)表現載體。
首先，藉由與(1)同樣之方法將rVKOR基因組入至pCR4-Blunt-TOPO載體，而取得質體pCR4-rVKOR。關於PCR，製備包含作為模板之源自大鼠肝臟之cDNA(TAKARA BIO公司製造)、各10pmol之引子10、11(序列編號18、19)之引子及KOD-plus-(Toyobo公司製造)之反應液並供於實驗。確認到所獲得之質體所具有之rVKOR基因序列係與基因庫寄存編號NM_203335所表示之大鼠VKOR之鹼基序列(序列編號20)一致，且未產生因PCR所引起之基因變異。
藉由與(1)同樣之方法，將利用限制酶HindIII及SmaI進行酶處理而獲得之pCR4-rVKOR插入至利用相同限制酶進行處理而獲得之pAGE249表現載體(J.Biol.Chem.,278,3466-3473,2003)，而獲得pAGE-rVKOR。利用限制酶ClaI對pAGE-rVKOR進行酶處理，使將5'末端磷酸化而成之二種合成寡聚DNA(引子18、19)(序列編號38、39)退火，而藉由與(1)同樣之方法獲得於pAGE-rVKOR中插入有XhoI酶位點之載體pAGE-rVKOR(XhoI)。
藉由與(1)同樣之方法，取得將hGGCX基因組入至pCR4-Blunt-TOPO載體之質體pCR4-hGGCX。PCR係以源自人類肝臟之 cDNA(ambion公司製造)作為模板，製備包含10pmol之引子12、13(序列編號22、23)之引子及KOD-plus-(Toyobo公司製造)之反應液並供於實驗。所獲得之質體所具有之hGGCX基因序列係基因庫寄存編號NM_000821所表示之hGGCX基因序列(序列編號24)之第145號之胞嘧啶被取代為丙胺酸之序列。但是，由於由該等鹼基序列編碼之hGGCX之胺基酸序列相同，故而將所取得之質體用於以下之實驗。
藉由與(1)同樣之方法將利用限制酶SalI及SmaI進行酶消化而獲得之pCR4-hGGCX插入至利用相同限制酶進行處理而獲得之pAGE249表現載體，而獲得pAGE-hGGCX。
分別利用XhoI對pAGE-rVKOR(XhoI)與pAGE-hGGCX進行酶處理，並藉由與(1)同樣之方法將包含源自pAGE249之啟動子區之hGGCX片段插入至pAGE-rVKOR(XhoI)，而獲得pAGE-VKOR-hGGCX。
(8)向各種Gas6-F穩定表現細胞株中導入pAGE-VKOR-hGGCX
為了製作活性型之各種Gas6-F之穩定表現株，藉由與(5)同樣之方法，向(5)及(6)中所製作之各種Gas6-F穩定表現細胞株中導入(7)中所製作之Gla化修飾相關酶表現載體pAGE-VKOR-hGGCX。
使基因導入後之細胞懸浮液懸浮於10mL之500nM之MTX培養基中，並接種至125cm2燒瓶中。次日，將培養基更換為MTX潮黴素培養基[包含500μg/mL之潮黴素(Wako公司製造)之500mM之MTX培養基]，培養開始約1個月後擴大培養至175cm2燒瓶中。將所獲得之細胞株記載為活性型之各種Gas6-F穩定表現細胞株。
(9)各種Gas6-F之精製
使(8)中所建立之活性型之各種Gas6-F穩定表現細胞株懸浮於MTX潮黴素培養基中，並於接著細胞用燒瓶中培養3天。其次，將培養基更換為無血清培養基[於EX-CELL302(Sigma-Aldrich公司製造)中 添加有6mM L-麩醯胺酸(Invitrogen公司製造)、100ng/mL維生素K3(Nacalai Tesque公司製造)、500nM之MTX、500μg/mL潮黴素、100nM之3,3',5-三碘-L-甲狀腺胺酸鈉鹽(3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)(Sigma-Aldrich公司製造)及50μg/mL慶大黴素之培養基]，培養5天後，回收培養基。將所回收之培養基離心分離，使用0.22μm過濾器(Thermo Scientific公司製造)對所獲得之培養上清液進行殺菌過濾。
使用所回收之培養上清液而精製各種Gas6-F。精製係使用填充有抗FLAG M2親和凝膠(ANTI-FLAG M2 Affunity Gel)(Sigma-Aldrich公司製造)之開口管柱。於管柱中添加培養上清液後，使用平衡緩衝液[50mM Tris(Nacalai Tesque公司製造)、150mM之NaCl(Nacalai Tesque公司製造)、0.5%聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(Nacalai Tesque公司製造)(pH值8.2)]洗淨管柱。繼而，使用不含聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯之平衡緩衝液洗淨管柱，然後使用溶出緩衝液[0.1M甘胺酸(Nacalai Tesque公司製造)(pH值3.5)或者3M氯化鎂(Nacalai Tesque公司製造)]使各種Gas6-F溶出。所獲得之各種Gas6-F溶液係使用NAP(Neutrophil Alkaline Phosphatase，嗜中性白血球鹼性磷酸酶)(GE Healthcare公司製造)，將緩衝液換為Gas6用緩衝液(20mM之Tris，150mM之NaCl，pH值8.2)，並使用0.22μm過濾器進行殺菌過濾後，用於試驗。
蛋白質之吸光係數係藉由將莫耳吸光係數除以分子量而算出(Protein Science,4,2411-2423(1995))。hGas6-F及cGas6-F之吸光係數為0.95。又，rGas6-F及mGas6-F之吸光係數為0.89。蛋白質溶液中之蛋白濃度係使用Nanodrop(Thermo Scientific公司製造)進行測定。
[實施例3]Axl細胞外區與IgG1重鏈恆定區之複合體之製作
(1)人類Axl細胞外區與人類IgG1重鏈恆定區之複合體(以下記載 為hAxl-hFc)表現載體之構建
藉由以下之方法製作組入有hAxl-hFc基因序列之動物細胞表現用載體。
進行包含hAxl-hFc之基因序列(序列編號28)之全合成，而獲得pMD19-hAxl-hFc(TAKARA BIO公司)。序列編號28所表示之鹼基序列自5'末端起包含BglII及MluI限制酶識別序列、編碼人類Axl之細胞外區之鹼基序列(序列編號26所表示之人類Axl全長的鹼基序列中之第1號~第1314號之鹼基序列)、BamHI、SalI及EcoRI限制酶識別序列以及編碼人類IgG1重鏈恆定區之鹼基序列。
利用限制酶BglII及BamHI對pMD19-hAxl-hFc及動物細胞表現載體pKTABEX-Tc26.2(WO2013/005649)進行酶處理，將反應液供於瓊脂糖凝膠電泳後，使用QIA快速凝膠提取套組而分別獲得約2kbp之DNA片段(以下記載為hAxl-hFc-BglII-BamHI)及約9.6kbp之DNA片段(以下記載為pKTABEX-BglII-BamHI)。
使用Ligation High ver.2(Toyobo公司製造)使上述兩種DNA片段結合，藉由與實施例2(1)同樣之方法而獲得hAxl-hFc重組體表現載體pKTABEX-hAxl-hFc。
(2)猴Axl細胞外區與人類IgG1重鏈恆定區之複合體(以下記載為cAxl-hFc)表現載體之構建
構建cAxl-hFc之製備所需之表現載體。首先，藉由與實施例2(1)同樣之方法，取得將食蟹猴Axl基因組入至pCR4-Blunt-TOPO載體而成之質體。關於PCR，製備包含作為模板之源自食蟹猴腎臟之cDNA(CytoMol公司製造)、各10pmol之引子14、15(序列編號30、31)、KOD-FX(Toyobo公司製造)、及2%DMSO之20μL之反應液，於94℃下保溫2分鐘後，將於94℃下15秒鐘、於60℃下30秒鐘、及於68℃下3.5分鐘設為1個循環而進行30個循環。以序列編號32表示所獲得 之質體所具有之食蟹猴Axl之鹼基序列。又，以序列編號33表示由該鹼基序列推測之食蟹猴Axl之胺基酸序列。
繼而，藉由以所獲得之質體作為模板進行PCR，而使包含編碼食蟹猴Axl細胞外區之鹼基序列之DNA片段擴增。關於PCR，製備包含模板質體、引子16、17(序列編號34、35)各10pmol及PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)20μL的反應液，於94℃下保溫5分鐘後，將於94℃下15秒鐘、於55℃下10秒鐘、於68℃下1分40秒鐘設為1個循環而進行30個循環。將PCR產物供於瓊脂糖凝膠電泳，使用QIA快速凝膠提取套組(Qiagen公司製造)而獲得約1.3kbp之DNA片段(以下記載為cAxl-BglII-EcoRI)。
又，利用限制酶BglII及EcoRI對(1)中所製作之pKTABEX-hAxl-hFc進行酶處理。將反應液供於瓊脂糖凝膠電泳後，使用QIA快速凝膠提取套組而獲得約9.6kbp之DNA片段(以下記載為pKTABEX-hFc-BglII-EcoRI)。
最後，使用融合HD選殖套組(Clontech公司製造)，於pKTABEX-hFc-BglII-EcoRI中插入cAxl-BglII-EcoRI，而獲得cAxl-hFc重組體表現載體pKTABEX-cAxl-hFc。以序列編號36表示pKTABEX-cAxl-hFc所具有之cAxl-hFc之鹼基序列，以序列編號37表示由該鹼基序列推測出之cAxl-hFc之胺基酸序列。
(3)大鼠Axl細胞外區與人類IgG1重鏈恆定區之複合體(以下記載為rAxl-hFc)表現載體之構建
藉由以下所記載之方法構建rAxl-hFc之製備所需之表現載體。於GenScript公司，全合成大鼠Axl之細胞外區之鹼基序列，並組入至pUC57質體而獲得pUC57-rAxl。大鼠Axl之細胞外區之鹼基序列係使用序列編號40所表示之大鼠Axl之鹼基序列(基因庫寄存編號NM_0317941)之第1號~第1329號之鹼基。
繼而，基於pUC57-rAxl，藉由與(2)同樣之方法，獲得rAxl-hFc重組體表現載體pKTABEX-rAxl-hFc。關於PCR，製備包含作為模板之pUC57-rAxl、各10pmol之引子20、21(序列編號42、43)、及PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)20μL的反應液，於94℃下保溫5分鐘後，將於94℃下15秒鐘、於55℃下10秒鐘、於68℃下1分40秒鐘設為1個循環而進行30個循環。以序列編號40表示rAxl-hFc之鹼基序列，以序列編號41表示由該鹼基序列推測出之rAxl-hFc之胺基酸序列。
(4)小鼠Axl細胞外區與小鼠IgG1重鏈恆定區之複合體(以下記載為mAxl-mFc)表現載體之構建
藉由以下所記載之方法構建mAxl-mFc之製備所需之表現載體。於TAKARA BIO公司，全合成包含序列編號48所表示之mAxl-mFc之鹼基序列，並組入至pMD19質體，而獲得pMD19-mAxl-mFc。mAxl-mFc自5'末端起包含BglII及MluI識別序列、編碼小鼠Axl之細胞外區之鹼基序列(序列編號46所表示之小鼠Axl之鹼基序列中之第1號~第1329號之鹼基序列)、BamHI、SalI及EcoRI識別序列以及編碼小鼠IgG1重鏈恆定區之鹼基序列。利用限制酶BglII及BamHI對pMD19-mAxl-mFc進行酶處理，並藉由與(1)同樣之方法插入至pKTABEX-Tc26.2中，而獲得mAxl-mFc重組體表現載體pKTABEX-mAxl-mFc。
(5)hAxl-hFc及mAxl-mFc穩定表現細胞株之製作
為了製作hAxl-hFc及mAxl-mFc之穩定表現株，向宿主細胞中導入表現載體。使用CHO-K1(理研)作為hAxl-hFc及mAxl-mFc表現用宿主細胞。關於細胞培養，通常繼代係使用包含4mM之L-麩醯胺酸(Invitrogen公司製造)及50μg/mL慶大黴素(Nacalai Tesque公司製造)之EX-CELL325 PF(Nichirei Bioscience公司製造)(基礎培養基)。又，於篩選基因導入株時，使用包含3μg/mL環己醯亞胺預製溶液 (Cycloheximide Ready Made Solution)(SIGMA公司製造)的基礎培養基(CHX培養基)。任一細胞均於37℃、5%CO2條件下進行振盪培養。
向細胞中導入基因係藉由與實施例2(5)同樣之方法進行。
將包含(1)中所取得之10μg之pKTABEX-hAxl-hFc、及20μg之轉座酶(transposase)表現載體(WO2010/143698)(以下記載為TPEX_pMug)之溶液添加至電穿孔法用比色管(基因脈衝儀比色管(Gene Pulser cuvette)，Bio-Rad公司製造)中。將利用PBS製備之4×106個/mL之CHO-K1細胞懸浮液400μL添加至該比色管中。於將比色管中之細胞懸浮液混合後，使用基因脈衝儀(BIO-RAD)，於脈衝電壓300V、電容500μF之條件下進行基因導入。
基因導入後，使比色管中之細胞懸浮於20mL之基礎培養基中，並以200μL/孔接種至1片96孔培養盤中。培養開始4天後將培養基更換為CHX培養基，並進行基因導入株之篩選。於培養第29天將培養基變黃之細胞株擴大至24孔，進而使用培養了3天之上清液，藉由以下所記載之方法對hAxl-hFc之表現量進行測定。
為了測定hAxl-hFc之表現量，而進行以下之ELISA。於96孔培養盤(Nunc公司製造)中，以50μL/孔分注利用PBS稀釋750倍而成之山羊抗人類IgG(Goat anti-human IgG)(H&L)(American Qualex公司製造)作為1次抗體，於4℃下靜置一晚而使之固相化。利用含0.05~0.1%之Tween-20之PBS(以下表記為Tween20-PBS)(Wako公司製造)將培養板洗淨5次，將含1%BSA之PBS(以下表記為1%BSA-PBS)(Nacalai Tesque公司製造)以100μL/孔分注至ELISA培養盤中，於室溫下靜置2小時，藉此進行阻斷。將培養盤利用Tween20-PBS(Wako公司製造)洗淨5次，以50μL/孔分注利用1%BSA-PBS稀釋而成之培養上清液作為樣品，並靜置1小時。標準品係使用公知之人類IgG1抗體。利用Tween20-PBS(Wako公司製造)洗淨5次後，以50μL/孔分注利用 1%BSA-PBS稀釋至2000倍之山羊抗人類IgG(H&L)-HRP(Horseradish peroxidase，辣根過氧化酶)(American Qualex公司製造)作為2次抗體，並靜置1小時。於利用Tween20-PBS進行洗淨後，以50μL/孔分注ABTS(2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid，2,2-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸)(Thermo Fisher公司製造)而使之顯色。以50μL/孔分注5%SDS溶液而停止顯色。使用讀板儀對樣品波長415nm、參考波長490nm下之吸光度(415nm-490nm)進行測定。
將hAxl-hFc表現量高之株自6孔培養盤依次擴大至125mL錐形燒瓶，並再次測定hAxl-hFc表現量。其結果為，選擇表現量最高之細胞株作為hAxl-hFc穩定表現細胞株。
同樣地，使用(4)中所取得之pKTABEX-mAxl-mFc，而獲得mAxl-mFc穩定表現細胞株。mAxl-mFc之表現量係與上述同樣地藉由ELISA法進行測定。使用利用PBS稀釋100倍而成之多株兔抗小鼠免疫球蛋白(Polyclonal Rabbit Anti-mouse Immunoglobulins)(Dako公司製造)作為1次抗體，並使用利用1%BSA-PBS稀釋400倍而成之多株兔抗小鼠免疫球蛋白HRP(Dako公司製造)作為2次抗體。標準品係使用公知之小鼠IgG1抗體。
(6)cAxl-hFc及rAxl-hFc短暫性表現細胞株之製作
為了製作cAxl-hFc及rAxl-hFc之短暫性表現株，而向宿主細胞中導入表現載體。
使用CHO-S(Life Tecnologies公司製造)作為cAxl-hFc及rAxl-hFc表現用宿主細胞。細胞之繼代係使用包含4mM之L-麩醯胺酸(Invitrogen公司製造)之Free Style CHO(Invitrogen公司製造)，於37℃、5%CO2條件下進行振盪培養。
分別使(2)中所製作之1.25mg之pKTABEX-cAxl-hFc溶解於20mL之Opti-Pro SFM(Invitrogen公司製造)中，又，使1.25mL之Free Style MAX Reagent(Invitrogen公司製造)溶解於20mL之Optipro SFM中，於室溫下放置5分鐘。將上述二液混合，並於室溫下放置15分鐘。將該混合溶液滴加至CHO-S培養液中，而獲得cAxl-hFc短暫性表現細胞株。以相同之方式使用(3)中所製作之pKTABEX-rAxl-hFc，而獲得rAxl-hFc短暫性表現細胞株。
(7)各種Axl-hFc及mAxl-mFc之精製
將(5)中所取得之hAxl-hFc及mAxl-mFc穩定表現細胞株懸浮於公知之蛋白質表現用之培養基中，於錐形燒瓶中培養7天後，將培養上清液回收。將所回收之培養上清液離心分離，對所獲得之培養上清液使用0.22μm過濾器進行過濾，藉此製備包含hAxl-hFc之培養上清液。藉由同樣之方法製備包含mAxl-mFc之培養上清液。
又，使(6)中所取得之cAxl-hFc及rAxl-hFc短暫性表現細胞株懸浮於添加有4mM之L-麩醯胺酸(Invitrogen公司製造)之Free Style CHO(Invitrogen公司製造)中，於錐形燒瓶中培養5天後，將培養上清液回收。將所回收之培養上清液離心分離，對所獲得之培養上清液使用0.22μm過濾器進行過濾，藉此製備包含cAxl-hFc之培養上清液。藉由同樣之方法製備包含rAxl-hFc之培養上清液。
自所製備之培養上清液，藉由通常方法精製各種Axl-Fc。樹脂係使用HiTrap MabSelect SuRe(GE Healthcare公司製造)。所獲得之精製蛋白質溶液係使用0.22μm過濾器進行殺菌過濾後用於試驗。使用實施例2(9)中所記載之方法，算出各蛋白質之吸光係數。hAxl-hFc、mAxl-mFc、cAxl-hFc及rAxl-hFc之吸光係數分別為1.38、1.54、1.42及1.8。
[實施例4]先前抗人類Gas6單株抗體之製作
(1)CNTO抗體表現載體之製作
基於US7547767專利說明書中所記載之抗Gas6單株抗體WG1之 VH及VL之鹼基序列(US7547767專利說明書之SEQ ID NO：25、27)，藉由以下所記載之方法製作該抗體(以下記載為CNTO抗體)之表現載體。於IDT公司，進行CNTO抗體之VH及VL之鹼基序列之全合成，並組入至適當質體。將CNTO抗體之VH及VL之鹼基序列分別記載為序列編號61、63。又，將CNTO抗體之VH及VL之胺基酸序列分別記載為序列編號62、64。於US7547767中序列編號25所表示之WG1之VH之鹼基序列之第305號記載為N，故而根據Kabat之人類抗體序列資訊(Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept Health and Human Services(1991))及與第305號之鹼基形成密碼子之第304號、第306號之鹼基序列，使用胸苷作為第305號之鹼基。於表現用載體pKANTEX93(WO97/10354)之適當位置藉由公知之方法插入CNTO抗體之基因序列，而構建作為CNTO抗體表現載體之pKANTEX-CNTO。
(2)CNTO抗體穩定表現細胞株之製作
藉由與實施例2(5)同樣之方法，於dhfr缺損之CHO細胞中，導入(1)中所製備之pKANTEX-CNTO，而製作CNTO抗體穩定表現細胞株。
(3)CNTO抗體之精製
使(2)中所取得之CNTO抗體穩定表現細胞株懸浮於500nM之MTX培養基中，並於接著細胞用燒瓶中培養3天。其次，將培養基更換為EX-CELL302(6mM L-麩醯胺酸，包含100nM之3,3',5-三碘-L-甲狀腺胺酸鈉鹽、及50μg/mL慶大黴素)，培養5天後，將培養上清液回收。將所回收之培養上清液離心分離，使用0.22μm過濾器對上清液進行過濾，藉此製備包含CNTO抗體之培養上清液。
自所製備之培養上清液，藉由通常方法精製CNTO抗體。樹脂係使用MabSelect SuRe(GE Healthcare公司製造)。所獲得之CNTO抗體係使用0.22μm過濾器進行殺菌過濾後用於試驗。CNTO抗體之吸光係數 為1.43。
[實施例5]抗人類Gas6單株抗體之製作
(1)對動物之免疫與抗體產生細胞之製備
使實施例1中所獲得之KO小鼠對實施例2(9)中所製作之hGas6-F或rGas6-F免疫。小鼠之免疫係使用作為佐劑之氫氧化鋁(Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,p99,1988)、及百日咳疫苗(Nacalai Tesque公司製造)。
具體而言，每1隻使用80μL之氫氧化鋁、及5μL之百日咳疫苗，而製備與hGas6-F或rGas6-F之懸浮液。以每1隻投予30μg之hGas6-F或rGas6-F之方式向KO小鼠之腹腔內投予該懸浮液。
僅初次之免疫使用佐劑，免疫包括最終增強免疫在內合計進行4次。分成僅將hGas6-F用於免疫之群與交替地投予rGas6-F與hGas6-F之群，並對各4隻進行免疫。於最終免疫之4天後摘取脾臟。將所摘取之脾臟於MEM培養基(Invitrogen公司製造)中細細切碎，然後藉由離心分離(1200rpm，5分鐘)回收脾細胞組分。由於所獲得之脾細胞組分包含紅血球，故而添加紅血球裂解液(RED Blood Cell Lysing Buffer)(Sigma公司製造)，於37℃下使之反應而將紅血球去除。所獲得之脾細胞係於MEM培養基中進行2次洗淨後，供於細胞融合。
(2)小鼠骨髓瘤細胞之製備
於包含10%FCS(Fetal Calf Serum，胎牛血清)(MOREGATE BIOTECH公司製造)之RPMI1640(Wako公司製造)中培養8-氮雜鳥嘌呤耐性小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag8U.1(購自P3-U1：ATCC)，用作細胞融合之母株。
(3)融合瘤之製作
將(1)中所獲得之小鼠脾細胞與(2)中所獲得之骨髓瘤細胞以8：1之比例進行混合，並進行離心分離(1200rpm，5分鐘)。對所獲得之沈 澱組分(細胞群)，一面平穩地搖晃，一面緩慢添加0.5mL之聚乙二醇-1000(Roche Diagnostics公司製造)。其次，於37℃之水浴中每隔1分鐘向該細胞液中添加1mL之MEM 5次，最後添加45mL之MEM。其後，進行離心分離(900rpm，5分鐘)。使所獲得之沈澱組分(細胞群)懸浮於HAT培養基(於添加有10%胎牛血清之RPMI1640培養基中，添加有HAT培養基添加劑(Media Supplement)(Invitrogen公司製造)之培養基)中，將脾細胞數製備為1.5×107個/plate。將該細胞懸浮液各200μL接種至96孔培養盤中，並於37℃、5%CO2之條件下進行培養。於孔內之細胞達到適合篩選之細胞數之前一天，使用HAT培養基更換培養基。
(4)融合瘤之篩選
對(3)中所製作之融合瘤，藉由以下所記載之競爭ELISA法選擇產生抑制人類及大鼠之Gas6與Axl之結合之抗體的融合瘤。
首先，於96孔之ELISA用培養盤(Nunc公司製造)中，以50μL/孔分注2μg/mL之hAxl-hFc溶液(對實施例3(7)中所取得之hAxl-hFc溶液利用PBS(Nacalai Tesque公司製造)進行稀釋而成之溶液)，並於4℃下靜置一晚而使之吸附。將該培養盤利用Tween20-PBS洗淨5次後，以300μL/孔添加1%BSA-PBS(Nacalai Tesque公司製造)，於室溫下靜置1小時而進行阻斷，並利用Tween20-PBS(Wako公司製造)洗淨5次。
其次，以50μL/孔將藉由以下之方法而製備之反應液分注至該培養盤中，於室溫下靜置1小時後，利用Tween20-PBS洗淨5次。反應液係藉由如下方法進行製備：將100ng/mL之hGas6-F溶液(將實施例2(9)中所獲得之hGas6-F溶液利用1%BSA-PBS進行稀釋而成之溶液)與融合瘤之培養上清液或融合瘤用培養基(陰性對照)等量地混合，並於4℃下靜置30分鐘。
其次，以50μL/孔分注作為檢測用抗體之利用1%BSA-PBS稀釋2000倍而成之於小鼠中產生之單株抗FLAG M2-過氧化酶(HRP)抗體 (Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP)antibody produced in mouse)(Sigma-Aldrich)，並於室溫下靜置1小時。將該板利用Tween20-PBS洗淨5次，以50μL/孔添加TMB(tetramethylbenzidine，四甲基聯苯胺)(Sigma-Aldrich公司製造)使之反應。於適當之時刻以50μL/孔添加1N鹽酸(Wako公司製造)而停止反應，對各孔之溶液，使用讀板儀對樣品波長450nm、參考波長570nm下之吸光度(450nm-570nm)進行測定。
於本測定系統中，於融合瘤培養上清液中含有抑制hGas6與hAxl之結合之抗體之情形時，添加有該培養上清液之孔之吸光度低於添加有陰性對照之孔之吸光度。因此，選擇吸光度低於添加有陰性對照之孔，並選擇與添加至該孔中之培養上清液對應之融合瘤。
藉由同樣之方法，選擇產生抑制rGas6與rAxl之結合之抗體之融合瘤。使用實施例2(9)、實施例3(7)中所獲得之rGas6-F、rAxl-hFc作為樣品。
(5)使用固相抗原之Gas6結合活性測定ELISA
藉由以下所記載之抗原結合ELISA法，確認到(4)中所選擇之融合瘤之培養上清液中之抗體與hGas6-F及rGas6-F結合，且未與和hGas6同源性較高之人類蛋白質S及FLAG-tag(BAP-F)結合。
使用實施例2(9)中所精製之hGas6-F、rGas6-F、與hGas6同源性較高之人類蛋白質S(源自人類血清，Enzyme Research Laboratories公司製造)或羧基末端FLAG-BAP融合蛋白(Carboxy-terminal FLAG-BAP Fusion Protein)(以下記載為BAP-F)(Sigma-Aldrich公司製造)作為吸附於ELISA用培養盤之抗原。
首先，於96孔之ELISA用培養盤(Nunc公司製造)中，以50μL/孔分注2μg/mL之上述抗原溶液(利用PBS(Nacalai Tesque公司製造)製備各抗原而成者)，於4℃下靜置一晚使之吸附。利用Tween20-PBS洗淨5 次後，以300μL/孔添加1%BSA-PBS(Nacalai Tesque公司製造)，於室溫下靜置1小時而進行阻斷，並利用Tween20-PBS(Wako公司製造)洗淨5次。其次，以50μL/孔分注作為試驗物質之融合瘤之培養上清液，於室溫下靜置1小時，然後利用Tween20-PBS洗淨5次。其次，以50μL/孔分注使用1%BSA-PBS稀釋至2000倍之多株羊抗小鼠免疫球蛋白(polyclonal goat anti-mouse immunoglobulins)/HRP(Dako,P0447)，並於室溫下靜置1小時。將板利用Tween20-PBS洗淨5次，TMB(Sigma-Aldrich公司製造)以50μL/孔添加而使之反應，於適當之時刻以50μL/孔添加1N鹽酸(Wako公司製造)而停止反應，使用讀板儀(Spectra Max,Molecular Devices公司製造)對樣品波長450nm、參考波長570nm下之吸光度(450nm-570nm)進行測定。
(6)融合瘤之純系化
(4)及(5)中所選擇之融合瘤選殖用培養基(10%胎牛血清，使用添加有1%次黃嘌呤添加劑(HT Supplement)(Invitrogen公司製造)、0.2%硫酸慶大黴素溶液(Nacalai Tesque公司製造)之AESCULON選殖培養基(Eidia公司製造))進行極限稀釋，並接種至96孔培養盤中而進行純系化。純系化僅進行1次。藉由以上之操作，與人類及大鼠Gas6進行結合，進而對產生具有抑制人類及大鼠Gas6與Axl之結合之活性的抗體之融合瘤進行二株單離。
(7)源自融合瘤之抗體之取得
將(6)中所單離之融合瘤以使細胞密度達到1×107個/100mL之方式接種至懸浮燒瓶中。培養基係使用包含5%之胎牛血清超低IgG(Fetal Bovine Serum-Ultra Low IgG)(Invitrogen公司製造)之融合瘤SFM培養基(Invitrogen公司製造)。於將細胞於37℃下靜置培養7天後，將包含細胞之培養基回收。將所回收之培養基離心分離，對所獲得之培養上清液使用0.22μm過濾器進行過濾。
使用通常方法，自利用過濾器進行過濾之培養上清液精製源自融合瘤之抗人類Gas6小鼠單株抗體KM5320抗體(以下亦記載為KM5320-mKG1抗體)、KM5321抗體(以下亦記載為KM5321-mKG1抗體)。樹脂係使用Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司製造)。所獲得之抗體溶液係使用0.22μm過濾器進行殺菌後用於實驗。若藉由實施例2(9)中所記載之方法算出吸光係數，則KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體之吸光係數分別為1.54與1.45。
[實施例6]使用懸浮抗原之Gas6結合活性評價
使用以下所記載之競爭ELISA法，確認取得抗體對於更接近天然之狀態之各種Gas6之結合性。
首先，於96孔之ELISA用培養盤(Nunc公司製造)中，以50μL/孔分注2μg/mL之抗FLAG抗體[將於小鼠中產生之單株抗FLAG M2抗體(Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse)(Sigma-Aldrich公司製造)利用PBS(Nacalai Tesque公司製造)進行稀釋而成者]，於4℃下靜置一晚使之吸附。於去除固相化液後，以300μL/孔添加1%BSA-PBS(Nacalai Tesque公司製造)，於室溫下靜置1小時而進行阻斷，並利用Tween20-PBS(Wako公司製造)洗淨5次。
其次，以50μL/孔分注1μg/mL之各種Gas6-F或BAP-F溶液[將實施例2(9)中所獲得之各種Gas6-F溶液或BAP-F(Sigma-Aldrich公司製造)利用1%BSA-PBS進行稀釋而成者]，於室溫下靜置1小時後，利用Tween20-PBS洗淨5次。繼而，利用生物素標記套組(Biotin Labeling Kit)-NH2(DOJINDO公司製造)對KM5320-mKG、KM5321-mKG及CNTO抗體進行生物素化，以50μL/孔分注利用1%BSA-PBS製備為適當之濃度者，並於室溫下靜置1小時。將該板利用Tween20-PBS洗淨5次後，以50μL/孔分注利用1%BSA-PBS稀釋200倍而成之抗生蛋白鏈菌素HRP偶聯物(Streptavidin HRP Conjugate)(R&D公司製造)，並於室 溫下靜置1小時。將該板利用Tween20-PBS洗淨5次，以50μL/孔添加TMB(Sigma-Aldrich公司製造)使之反應，於適當之時刻，以50μL/孔添加1N鹽酸(Wako公司製造)而停止反應，使用讀板儀對樣品波長450nm、參考波長570nm下之吸光度(450nm-570nm)進行測定。
又，取得抗體對人類蛋白S之結合活性係藉由與實施例5(5)同樣之方法進行測定。樣品係利用1%BSA-PBS將作為試驗物質之上述中所製備之生物素化KM5320-mKG、KM5321-mKG及CNTO抗體稀釋至適當濃度而使用。使用利用1%BSA-PBS稀釋200倍而成之抗生蛋白鏈菌素HRP偶聯物(R&D公司製造)作為二次檢測試劑。
將結果示於圖1。KM5320-mKG1抗體、及KM5321-mKG1抗體係與人類Gas6-F、猴Gas6-F、大鼠Gas6-F及小鼠Gas6-F結合，且未與人類蛋白S及BAP-F結合。根據該結果顯示，KM5320-mKG1抗體及KM5321-mKG1抗體係與人類Gas6、猴Gas6、大鼠Gas6、及小鼠Gas6特異性地結合之抗體。
又，KM5320-mKG1抗體及KM5321-mKG1抗體對於人類Gas6-F之結合活性係以抗體濃度0.0003μg/mL進行檢測，於0.04μg/mL下達到最大活性。另一方面，CNTO抗體對於人類Gas6-F之結合活性係以抗體濃度0.04μg/mL進行檢測，即便為5μg/mL亦僅顯示出KM5320-mKG1抗體及KM5321-mKG1之最大活性之一半以下之活性(圖1-A)。根據該結果顯示，KM5320-mKG1抗體及KM5321-mKG1抗體與CNTO抗體相比，強力地與各種Gas6結合。
[實施例7]抗Gas6單株抗體之Gas6與Axl之結合抑制活性評價
對KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體及CNTO抗體，藉由與實施例5(4)同樣之方法，對各種Gas6與Axl之結合抑制活性進行測定。反應液係使用將100ng/mL之各種Gas6-F溶液(利用1%BSA-PBSdui將實施例2(9)中所獲得之各種Gas6-F溶液進行稀釋而成之溶 液)、與最終濃度之2倍濃度之各抗體溶液(利用1%BSA-PBS對實施例4(3)及實施例5(7)中所獲得之抗體溶液進行稀釋而成者)等量地混合而成者。
將結果示於圖2。KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體抑制人類、猴、大鼠、及小鼠Gas6與源自各物種之Axl之結合。關於KM5320-mKG1抗體，於對50ng/mL之人類Gas6添加約200ng/mL之抗體時，大致完全抑制人類Gas6與人類Axl之結合。由於人類Gas6之分子量約為70kDa，抗體之分子量約為140~150kDa，因此該結果顯示，於抗體與Gas6為2：1之莫耳濃度比時，KM5320-mKG1抗體完全抑制人類Gas6與人類Axl之結合。同樣地，關於KM5321-mKG1抗體，於對50ng/mL之人類Gas6添加約60ng/mL之抗體時，大致完全抑制人類Gas6與人類Axl之結合。根據該結果顯示，於抗體與Gas6為1：2之莫耳濃度比時，KM5321-mKG1抗體完全抑制人類Gas6與人類Axl之結合。由於1分子之抗體與最大2分子之抗原進行結合，故而顯示KM5321-mKG1抗體具有非常強之結合活性。
另一方面，CNTO抗體於所研究之抗體濃度下，完全未抑制各種Gas6與Axl之結合。
根據以上顯示，KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體具有強於CNTO抗體之中和活性。
[實施例8]取得抗體對於Gas6依賴性細胞內訊號之作用
作為Gas6之受體，除Axl以外，已知有Sky及Mer。若Gas6與於細胞上所表現之該受體結合，則於細胞內經由該受體之訊號傳遞途徑被活化。為了確認取得抗體對於該細胞內訊號傳遞之作用，而實施使用Gas6受體之強制表現細胞株之報導基因分析。
於該Gas6受體之強制表現細胞株中，導入作為參與Gas6受體之下游訊號傳遞之轉錄因子之一之包含Egr1(Early Growth Responese 1，早期生長反應基因1)之識別序列的載體。又，於載體中之Egr1識別序列之下游，組入螢光素酶基因。於本測定系統中，若Gas6與上述細胞株上之Gas6受體結合，則細胞內訊號傳遞途徑被活化，Egr-1之表現增加。Egr1與Egr1識別序列結合，而使螢光素酶基因之表現增加。因此，藉由檢測經生物合成之螢光素酶之發光強度，可確認因添加Gas6所產生之細胞內訊號傳遞途徑之活化狀態。
(1)Gas6受體表現載體之構建
首先，構建人類Axl之表現載體。
該載體係藉由以下所記載之方法製作組入有序列編號26所表示之人類Axl之基因序列(GeneCopoeia公司製造)(基因庫寄存編號NM_021913)之質體作為模板。製備包含模板質體、各10pmol之引子22、23(序列編號50、51)及PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)20μL的反應液，於94℃下保溫5分鐘後，將於98℃下10秒鐘、於55℃下5秒鐘、於72℃下3分30秒鐘設為1個循環而進行30個循環之PCR。將所獲得之PCR產物供於瓊脂糖凝膠電泳，使用QIA快速凝膠提取套組(Qiagen公司製造)而回收約2.7kbp之擴增DNA片段(包含hAxl之鹼基序列之DNA片段)。又，利用EcoRI及BamHI對公知之適當動物細胞表現載體進行酶消化，供於瓊脂糖凝膠電泳後，使用QIA快速凝膠提取套組而回收目標DNA片段。使用融合HD選殖套組(Clontech公司製造)使所獲得之兩種DNA片段結合，而獲得hAxl重組體表現載體。對所獲得之表現載體中所含之人類Axl基因序列進行分析，結果序列編號26所表示之人類Axl基因之第1546號之胞嘧啶被取代為胸苷。但是，對於任一鹼基序列，所推測之胺基酸序列均相同(基因庫寄存編號NP_068713)，且存在相同鹼基序列之基因多型，因此將本序列用於以下之實驗。
藉由同樣之方法將人類Sky基因組入至適當之公知動物細胞表現 載體，而製備人類Sky重組體表現載體。使用組入有序列編號52所表示之人類Sky基因序列(基因庫寄存編號NM_006293))之質體(Invitrogen公司製造)作為PCR之模板。關於PCR，製備包含上述模板質體、各10pmol之引子24、25(序列編號54、55)及PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)20μL的反應液，於98℃下保溫10分鐘後，將於98℃下10秒鐘、於55℃下5秒鐘、於72℃下1分30秒鐘設為1個循環而進行30個循環之PCR。對所獲得之表現載體中所含之人類Sky之鹼基序列進行分析，結果序列編號52所表示之人類Sky之鹼基序列之第2168號之胸苷被取代為胞嘧啶。但是，對於任一鹼基序列，所推測之胺基酸序列均相同(基因庫寄存編號NP_06284)，且存在相同鹼基序列之基因多型，因此使用本序列。
藉由同樣之方法將人類Mer基因組入至適當之公知動物細胞表現載體，而製備人類Mer重組體表現載體。使用組入有序列編號56所表示之人類Mer基因序列(基因庫寄存編號NM_006343))之質體(GeneCopoeia公司製造)作為PCR之模板質體。關於PCR，製備包含上述模板質體、各10pmol之引子26、27(序列編號58、59)及PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)20μL的反應液，於98℃下保溫10分鐘後，將於98℃下10秒鐘、於55℃下5秒鐘、於72℃下5秒鐘設為1個循環而進行30個循環之PCR。
(2)向宿主細胞導入Gas6受體表現載體及螢光素酶報導載體
將上述(1)中所製作之3種Gas6受體表現載體及報導載體藉由以下所記載之方法導入至宿主細胞HEK293F細胞(Invitrogen公司)中。細胞培養之培養基係使用Free Style 293表現培養基(Expression Medium)(Invitrogen公司製造)，於37℃、5%CO2條件下進行振盪培養。報導載體係使用將小鼠之Egr1識別序列(序列編號60)插入至作為螢光素酶報導載體之pGL3載體(Promega公司製造)中而獲得之pGL3- mEgr1(Nature 444,770-774,2006、PNAS85(21),7857-61,1988)。
分別使各Gas6受體表現載體及pGL3-mEgr1溶解於Opti-Pro SFM(Invitrogen公司製造)中，又，使293fectin轉染試劑(Transfection Reagent)(Invitrogen公司製造)溶解於Optipro SFM中，於室溫下放置5分鐘。將上述二液混合，並於室溫下放置20分鐘後，滴加至HEK293F細胞培養液中，並進行5小時振盪培養。將如此獲得之細胞株分別記載為人類Axl-mEgr1轉錄因子啟動子之報導細胞株、人類Sky-mEgr1轉錄因子啟動子之報導細胞株、人類Mer-mEgr1轉錄因子啟動子之報導細胞株。
(3)報導基因分析
將(2)中所製作之3種Gas6受體(Axl、Sky或Mer)-mEgr1轉錄因子啟動子之報導細胞株各80μL以成為1.6×104個/孔之方式接種至96孔黑色培養盤中。其次，以10μL/孔添加包含80μg/mL(最終濃度之10倍濃度)之KM5320-mKG1或KM5321-mKG1之培養基[利用Free Style 293表現培養基(Invitrogen公司製造)對實施例5(7)中所獲得之抗體溶液進行稀釋而成者]，並靜置培養1小時。作為同型對照，以10μL/孔添加包含藉由與上述同樣之方法所製備之80μg/mL之IgG1同型對照(isotype control)(精製小鼠單株IgG1(purified mouse monoclonal IgG1)，R&D公司製造)的培養基。
繼而，以10μL/孔添加包含20μg/mL(最終濃度之10倍濃度)之hGas6-F之培養基[利用Free Style 293表現培養基對實施例2(9)中所製備之hGas6-F溶液進行稀釋而成者]，並進行靜置培養。又，作為陰性對照，亦準備僅添加有上述細胞株與培養基之孔。12~14小時後以100μL/孔添加化學發光試劑(Steady Glo螢光素酶分析系統(Steady Glo Luciferase assay system)，Promega公司製造)，使用照度計(Veritas公司製造)測定各孔之發光強度。
將結果示於圖3。於添加hGas6-F與同型對照(Isotype control)時，於任一Gas6受體強制表現細胞中，與僅添加有培養基之時相比發光強度均增加3倍左右。另一方面，於添加hGas6-F與KM5320-mKG1或KM5321-mKG1時，顯示出與僅添加有培養基時相同程度之發光強度。
如上所述，於本測定系統中對應於細胞內訊號傳遞途徑之活化，所檢測之螢光素酶之發光強度增加。因此，若將人類Gas6添加至各種Gas6受體強制表現細胞株中，則顯示出細部內訊號傳遞途徑被活化、及KM5320-mKG1、KM5321-mKG1均會抑制該活化之情況。
又，若藉由與實施例7同樣之方法進行計算，則KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體均以抗體與Gas6為2：1之莫耳濃度，完全抑制因Gas6引起之細胞內訊號傳遞途徑之活化。由此，顯示出KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體具有非常強之中和活性。
[實施例9]本案發明之抗人類Gas6單株抗體對於人類腎小球膜細胞中之磷酸化訊號之作用
於與實施例8相比更接近活體之條件下，確認到取得抗體針對藉由Gas6與Gas6受體之結合所產生之細胞內訊號之作用。已知，若藉由Gas6之結合，Gas6受體被活化，則於該受體表現細胞內Akt被磷酸化。因此，使用天然地表現各Gas6受體之人類腎小球膜細胞(Sciencell公司製造，以下，僅記載為人類腎小球膜細胞)，藉由以下所記載之方法檢測因添加Gas6引起之Akt之磷酸化水準。
於人類腎小球膜細胞中，Axl、Sky、Mer之各Gas6受體表現之情況係藉由利用公知方法進行FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting，螢光活化細胞分選)分析而確認。關於FACS分析，各Gas6受體之檢測係分別使用抗AXL抗體(Anti-Axl antibody)(abcam公司製造，MM0098-2 N33)、人類Dtk MAb(Monoclonal antibody，單株抗 體)(R&D公司製造，Clone 96201)、人類Mer單株抗體(R&D公司製造，Clone 125518)。二次抗體係使用Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG(H+L)抗體(Invitrogen公司製造)。
使人類腎小球膜細胞懸浮於在腎小球膜細胞培養基(Mesangial Cell Medium)(Sciencell公司製造，以下，記載為MCM)中添加有2%FBS及1%腎小球膜細胞生長因子營養補充劑(mesangial cell growth supplement)(隨附於MCM者)之培養基中，以成為0.5×104個/孔之方式接種至12孔培養盤上，並於37℃、5%CO2條件下進行靜置培養。2天後，將培養基更換為不含添加物之MCM而進行靜置培養。1天後，利用MCM將孔洗淨一次，並新添加400μL/孔之MCM。
其次，以50μL/孔添加在MCM中以成為最終濃度之10倍濃度之方式進行稀釋而成之實施例4(3)中所製備之抗體樣品、hAXL-hFc及同型對照抗體，並靜置培養1小時。同型對照抗體(陰性對照)係使用IgG1同型對照(精製小鼠單株IgG1，R&D公司製造)。繼而，以50μL/孔僅添加在MCM中以成為最終濃度(0.1μg/mL)之10倍濃度之方式進行稀釋而成之hGas6-F或者僅MCM，並進行10分鐘靜置培養。於冰上將培養基去除，利用包含蛋白酶抑制劑混合物(Protease inhibitor cocktail)(SigmaAldrich公司製造)之PBS進行洗淨後，以120μL/孔添加利用包含蛋白酶抑制劑混合物與2-巰基乙醇(Nacalai Tesque公司製造)之PBS稀釋5倍而成之非還原性泳道標記物上樣緩衝液(Lane Marker Non-Reducing Sample Buffer)(Thermo Fisher公司製造)。
將各孔中之樣品回收，於95℃下加熱10分鐘。將加熱後之樣品供於e-PAGEL(5~20%，ATTO公司製造)後，藉由SDS丙烯醯胺凝膠電泳法將蛋白質分離。分離後，將蛋白質藉由semi-drive lot法轉錄至PVDF膜上，並實施西方墨點法。一次抗體係使用將抗Akt抗體(Cell Signaling公司製造，#4691)稀釋1000倍、或者將抗Phospho- Akt(Ser273)抗體(Cell Signaling公司製造，#4060)稀釋2000倍而成者。二次抗體係使用抗兔IgG抗體-HRP(dako公司製造，P0448)。上述抗體之稀釋係使用包含5%之ECL阻斷劑(Blocking Agent)(GE Healthcare公司製造)之1×TBST(Tris Buffered Saline Tween，三羥甲基胺基甲烷緩衝鹽水吐溫)(Santa Cruz公司製造)。顯色受質係使用ECL選擇性西方墨點檢測試劑(Select Western Blotting Detection Reagent)(GE Healthcare公司製造)，並使用ImageQuant LAS500(GE Healthcare公司製造)檢測化學發光。
將結果示於圖4。若向腎小球膜細胞中添加hGas6，則Akt之磷酸化水準亢進。另一方面，hAXL-hFc、KM5320-mKG1抗體及KM5321-mKG1抗體均濃度依賴性地抑制因hGas6Akt引起之磷酸化水準之亢進。又，同型對照未抑制因hGas6Akt引起之Akt之磷酸化水準之亢進。
根據該結果顯示，KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體於原本表現Gas6受體之人類腎小球膜細胞中亦抑制因添加hGas6而產生之細胞內訊號傳遞途徑之活化。
[實施例10]本案發明之抗人類Gas6單株抗體與抗人類Gas6單株抗體CNTO抗體之競爭抑制實驗
使用競爭ELISA確認取得抗體與CNTO抗體是否進行競爭而與人類Gas6結合。
競爭ELISA係藉由以下所記載之方法而進行。於96孔之ELISA用培養盤(Nunc公司製造)中，以50μL/孔分注利用PBS(Nacalai Tesque公司製造)將小鼠體內所產生之單株抗FLAG M2抗體(Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse)(Sigma-Aldrich公司製造)製備為2μg/mL者，並於4℃下靜置一晚而使之吸附。於去除固相化液體後，以300μL/孔添加1%BSA-PBS(Nacalai Tesque公司製造)，於室溫下靜 置1小時而進行阻斷，並利用Tween20-PBS(Wako公司製造)洗淨5次。其次，以50μL/孔分注利用1%BSA-PBS將hGas6-F製備為1μg/mL之濃度者，並於室溫下靜置1小時。
其次，利用生物素標記套組-NH2(DOJINDO公司製造)對實施例4(3)中所製備之CNTO抗體進行生物素化，以成為最終濃度(2μg/mL)之2倍濃度之方式利用1%BSA-PBS進行稀釋，而製備生物素化CNTO抗體溶液。又，以成為最終濃度之2倍濃度之方式利用1%BSA-PBS稀釋作為試驗物質之實施例5(7)中所製備之未標記之KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體、及實施例4(3)中所製備之未標記之CNTO300，將各者與生物素化CNTO抗體溶液逐一等量地混合，並於室溫下靜置1小時。將培養盤利用Tween20-PBS洗淨5次後，以50μL/孔分注上述混合樣品，並於室溫下靜置1小時。
將上述培養盤利用Tween20-PBS洗淨5次後，以50μL/孔分注利用1%BSA-PBS稀釋200倍之抗生蛋白鏈菌素HRP偶聯物(R&D公司製造)，並於室溫下靜置1小時。將板利用Tween20-PBS洗淨5次，以50μL/孔添加TMB(Sigma-Aldrich公司製造)而使之顯色，於獲得適當之顯色之時刻，以50μL/孔添加1N鹽酸(Wako公司製造)，使用讀板儀對樣品波長450nm、參考波長570nm下之吸光度(450nm-570nm)進行測定。
將結果示於圖5。於將CNTO抗體設為試驗物質之情形時，吸光度低於陰性對照。另一方面，於將KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體設為試驗物質之情形時，為與陰性對照相同程度之吸光度。於作為試驗物質之上述未標記之Gas6單株抗體與生物素化CNTO抗體進行競爭而與人類Gas6結合時，所檢測出之吸光度低於陰性對照。因此顯示，KM5320-mKG1抗體及KM5321-mKG1抗體與CNTO抗體未進行競爭地與hGas6結合。
[實施例11]編碼抗人類Gas6單株抗體之VH及VL的基因序列之單離
(1)自產生抗人類Gas6之單株抗體製備融合瘤細胞之總RNA
由分別產生5×106個KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體之融合瘤，使用RNAeasy迷你套組(RNAeasy Mini kit)(QIAGEN公司製造)及QIA shredder(QIAGEN公司製造)，而製備總RNA。
(2)抗人類Gas6單株抗體之VH及VL之基因選殖
由(1)中所取得之1μg之總RNA，使用SMARTer RACE cDNA擴增套組(Clontech公司製造)，而製作cDNA。將所獲得之cDNA作為模板，製備包含套組所附帶之通用引子A混合物(含有前置引子)、編碼小鼠IgG1重鏈恆定區之反置引子(引子28(序列編號65))及PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)之25μL之反應液，而進行PCR。PCR係於98℃下保溫10秒鐘後，將於98℃下10秒鐘、於55℃下5秒鐘、及於72℃下5秒鐘設為1個循環而進行30個循環，將包含各抗體之VH之基因之DNA片段擴增。
又，使用通用引子A與小鼠Ig(κ)特異性引子(引子29(序列編號66))同樣地進行PCR，而將包含各抗體之VL之基因之DNA片段擴增。將PCR產物供於瓊脂糖凝膠電泳，使用QIA快速凝膠提取套組(Qiagen公司製造)回收擴增DNA片段。使用ZERO BLUNT TOPO PCR選殖套組(Invitrogen公司製造)將所獲得之擴增DNA片段插入至pCR4-Blunt-TOPO載體中，藉由與實施例2(1)同樣之方法而取得質體。對所獲得之質體之鹼基序列進行分析，確認到取得於cDNA之5'末端存在被推測為起始密碼子之ATG序列的全長VH cDNA、及VLcDNA。
(3)抗人類Gas6單株抗體V區之基因序列之分析
以序列編號67表示(2)中所獲得之KM5320-mKG1抗體之VH之全長鹼基序列，以序列編號68表示由該序列推測出之包含訊號序列之 VH之全長胺基酸序列，以序列編號69表示自序列編號68所表示之胺基酸序列去除訊號序列後之胺基酸序列。又，以序列編號70表示KM5320-mKG1抗體之VL之全長鹼基序列，以序列編號71表示由該序列推測出之包含訊號序列之VL之全長胺基酸序列，以序列編號72表示自序列編號71所表示之胺基酸序列去除訊號序列後之胺基酸序列。
以序列編號73表示KM5321-mKG1抗體之VH之全長鹼基序列，以序列編號74表示由該序列推測出之包含訊號序列之VH之全長胺基酸序列，以序列編號75表示自序列編號74所表示之胺基酸序列去除訊號序列後之胺基酸序列。又，以序列編號76表示KM5321-mKG1抗體之VL之全長鹼基序列，以序列編號77表示由該序列推測出之包含訊號序列之VL之全長胺基酸序列，以序列編號78表示自序列編號77所表示之胺基酸序列去除訊號序列後之序列。
根據與已知之小鼠抗體之序列資料[SEQUENCES of Proteins ofImmunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]之比較，確認到單離之各cDNA係編碼包含分泌訊號序列之KM5320-mKG1抗體、KM5321-mKG1抗體的全長cDNA。
藉由將各單株抗體之VH及VL之CDR與已知之抗體之胺基酸序列進行比較而進行鑑定。以序列編號79、80及81表示KM5320-mKG1抗體之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列，以序列編號82、83及84表示VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。以序列編號85、86及87表示KM5321-mKG1抗體之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列，以序列編號88、89及90表示VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。
[實施例12]抗人類Gas6小鼠-大鼠嵌合抗體之製備
藉由以下所記載之方法，由抗Gas6小鼠單株抗體KM5320-mKG1抗體及KM5321-mKG1抗體而製作小鼠-大鼠IgG1嵌合抗體(以下僅簡 稱為大鼠嵌合抗體)。以下，將各大鼠嵌合抗體記載為KM5320-rKG1抗體及KM5321-rKG1抗體。
(1)大鼠嵌合抗體表現載體之構建
於公知之適當動物細胞表現載體之適當位置，使用通常方法串聯地組入KM5320-rKG1抗體之重鏈全長之鹼基序列(序列編號91)及輕鏈全長之鹼基序列(序列編號93)。序列編號91所表示之KM5320-rKG1抗體之重鏈全長之鹼基序列包含含有KM5320抗體之VH之全長鹼基序列(序列編號67)及大鼠IgG1重鏈恆定區之基因序列。又，序列編號93所表示之KM5320-rKG1抗體之輕鏈全長之鹼基序列包含含有KM5320抗體之VL之全長鹼基序列(序列編號70)與大鼠Ig(κ)恆定區之基因序列。
以相同之方式，於公知之適當動物細胞表現載體之適當位置，使用通常方法串聯地組入KM5321-rKG1抗體之重鏈全長之鹼基序列(序列編號95)及輕鏈全長之鹼基序列(序列編號97)。序列編號95所表示之KM5321-rKG1抗體之重鏈全長之鹼基序列包含含有KM5321抗體之VH之全長鹼基序列(序列編號73)及大鼠IgG1重鏈恆定區之基因序列。又，序列編號97所表示之KM5321-rKG1抗體之輕鏈全長之鹼基序列包含含有KM5321抗體之VL之全長鹼基序列(序列編號76)及大鼠Ig(κ)恆定區之基因序列。
(2)大鼠嵌合抗體穩定表現細胞株之製作
依據實施例2(5)及通常方法，將(1)中所製作之表現載體導入至CHO-K1細胞(ECACC(European Collection of Cell Cultures，歐洲細胞培養收集中心))中，而製作大鼠嵌合抗體穩定表現細胞株。
(3)大鼠嵌合抗體之精製
將(2)中所製作之大鼠嵌合抗體穩定表現細胞於公知之蛋白質表現用之培養基中培養數日，並將培養上清液回收。依據實施例3(7)及公知之方法，自所回收之培養上清液精製KM5320-rKG1及KM5321- rKG1。依據實施例2(9)中所記載之方法測定抗體之吸光度，KM5320-rKG1抗體之吸光係數為1.54，KM5321-rKG1抗體之吸光係數為1.45。
針對所獲得之大鼠嵌合抗體，藉由與實施例6及實施例7同樣之方法，確認到針對hGas6之結合活性及抑制hGas6與hAxl-Fc之結合之活性等同於各自之親本抗體(parent antibody)。
[實施例13]抗人類Gas6單株抗體之抗原決定基分析
為了對取得抗體之抗原決定基進行分析，製備將人類Gas6區缺損體及該蛋白質之胺基酸之一部分取代為丙胺酸之變異蛋白質，並確認取得抗體之結合活性之變化。
(1)人類Gas6變異體(區缺損體)表現載體之製備
為了取得自hGas6去除Gla區，且於C末端附加有FLAG標籤及His標籤之Gas6變異體(以下記載為hGas6-FH)，藉由以下所記載之方法製作該蛋白質之表現載體。
於Genscrip公司，全合成序列編號99所表示之鹼基序列(hGas6-delta)，並組入至適當質體。序列編號99所表示之鹼基序列自5'末端起包含EcoRI識別序列、hGas6-FH之鹼基序列及BamHI識別序列。hGas6-FH之鹼基序列係將序列編號3所表示之hGas6之鹼基序列中之第91號至第273號之鹼基序列去除，且於3'末端結合有編碼公知之FLAG標籤及His標籤之鹼基序列的鹼基序列。
利用EcoRI及BamHI對所獲得之質體及動物細胞表現用載體INPEP4(Biogen-IDEC公司製造)進行酶處理，並藉由與實施例2(1)同樣之方法，獲得hGas6-FH表現載體之INPEP-hGas6-FH。
(2)人類Gas6變異體(丙胺酸取代體)表現載體之製備
製作將(1)中所記載之hGas6-FH之胺基酸序列中與序列編號4所表示之人類Gas6之全長胺基酸序列之第314號之白胺酸、第315號之麩醯胺、第316號之脯胺酸對應之胺基酸全部取代為丙胺酸之變異體(以下 記載為hGas6-FH-L314A、Q315A、P316A或僅記載為丙胺酸取代體)之表現載體。
表現上述丙胺酸變異體之載體係藉由對利用以下所記載之方法(1)所製作之INPEP-hGas6-FH導入部位特異突變而製作。製備包含作為模板之INPEP-hGas6-FH、各10pmol之引子30、31(序列編號101、102)及PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TAKARA BIO公司製造)之25μL之反應液，進行PCR。PCR係於98℃下保溫10秒鐘後，將於98℃下10秒鐘、於55℃下5秒鐘、及於72℃下5秒鐘設為1個循環而進行30個循環，並將包含各變異體之鹼基序列之DNA片段擴增。於PCR產物中添加DpnI，於37℃下進行1小時限制酶處理，藉此進行未插入變異之模板載體之消化。將DpnI消化後之PCR產物導入至大腸桿菌DH5α中，由所獲得之轉形體獲得具有插入有所需變異之基因的質體。
(3)人類Gas6變異體短暫性表現細胞株之製備
於人類Gas6變異體(hGas6-F及丙胺酸取代體)之表現細胞株之製備時使用Expi293細胞(Invitrogen公司製造)。細胞培養之培養基係使用Expi293TM表現培養基(Invitrogen公司製造)，並於37℃、5%CO2條件下進行振盪培養。於Expi293細胞中，導入(1)、(2)中所製作之各種人類Gas6變異體表現載體，而獲得各種人類Gas6變異體之短暫性表現細胞株。向細胞中導入表現載體係依據隨附文件而使用ExpiFectamine 293轉染套組(Invitrogen公司製造)。
(4)自包含各種人類Gas6變異體之培養上清液而精製人類Gas6變異體
依據ExpiFectamine 293轉染套組(Invitrogen公司製造)之隨附文件，將(3)中所取得之各種人類Gas6變異體短暫性表現細胞株培養4天，並將培養基回收。將所回收之培養基離心分離，對所獲得之培養上清液使用0.22μm過濾器進行過濾，藉此製備包含各種人類Gas6變 異體之培養上清液。
培養上清液係藉由與實施例2(9)同樣之方法使用抗FLAG M2親和凝膠(Sigma-Aldrich公司製造)進行精製。溶出緩衝液係使用3M氯化鎂(Nacalai Tesque公司製造)，所獲得之人類Gas6變異體溶液之緩衝液係換為PBS(Nacalai Tesque公司製造)，使用0.22μm過濾器進行殺菌過濾後，用於試驗。
(5)取得抗體針對各種人類Gas6變異體之結合活性評價
為了確定取得抗體所結合之Gas6之抗原決定基，依據實施例6中所記載之方法評價針對(4)中所精製之各種人類Gas6變異體之結合活性。實驗係以N=2進行，將所獲得之吸光度之平均值為0.1以下時判定為不結合，將2以上時判定為進行結合。
抗原樣品係使用實施例2(9)中所製備之hGas6-F及(3)中所製備之各種人類Gas6變異體。抗體樣品係利用生物素標記套組-NH2(DOJINDO公司製造)對實施例12(3)中所製備之KM5320-rKG1及KM5321-rKG1抗體進行生物素化，並對所得者利用1%BSA-PBS以成為1μg/mL之方式進行稀釋而使用。又，利用1%BSA-PBS，以成為0.2Ng/mL之方式對作為陽性對照之抗人類Gas6(R&D公司製造，DY885)進行稀釋而使用。
將結果示於表1。將抗體與各抗原結合時表示為○，將未結合時表示為×。
Figure 104134584-A0202-12-0110-1
KM5320-rKG1及KM5321-rKG1抗體係以相同程度之強度與hGas6-F及hGas6-FH結合。另一方面，該等抗體未與hGas6-FH-L314A、Q315A、P316A結合。根據以上顯示，KM5320-rKG1及KM5321-rKG1抗體與序列編號4所表示之人類Gas6之全長胺基酸序列中之第314號之白胺酸、第315號之麩醯胺、第316號之脯胺酸之至少任一者結合。
[實施例14]抗人類Gas6單株抗體之癌細胞株之增殖抑制活性評價
為了確認抗人類Gas6單株抗體針對Gas6依賴性癌細胞增殖之作用，使用3種人類癌細胞株進行細胞增殖分析。
使用胰臟癌細胞株Panc-1細胞(美國菌種保存中心)、惡性黑色素瘤細胞株A375細胞(大日本製藥)、胃癌細胞株MKN7細胞(Riken Cell Bank)進行增殖分析。各細胞中有無表現Gas6受體係使用流式細胞儀並藉由與實施例9同樣之方法進行測定，分別確認到Axl與Mer、Axl與Sky、Axl與Sky進行表現。
使Panc-1細胞、A375細胞懸浮於在DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium，杜爾貝科改良之伊戈爾培養基)(life technologies公司製造)中添加有10%FBS(life technologies公司製造)之培養基中，並使MKN7細胞懸浮於在RPMI 1640(life technologies公司製造)中添加有10%FBS之培養基中。將各細胞懸浮液分別以成為2.0×104、1.0×104、0.6×104個/孔之方式接種至96孔培養盤中，並於37℃、5%CO2條件下進行靜置培養。1天後，將培養基更換為未添加FBS者進行靜置培養。1天後棄去培養基，於未添加FBS之培養基中以200μl/孔添加調整為下述最終濃度之試驗體進行靜置培養。試驗體係使用最終濃度1μg/ml之hGas6-F以及最終濃度20μg/ml之hAxl-hFc、KM5320-rKG1抗體、KM5321-rKG1抗體、及藉由公知方法所製作之抗二硝基苯肼(DNP，dinitrophenylhydrazine)抗體(Motoki K et.al.,Clin.Cancer Res. 11,3126-3135,2005)。又，使用利用上述培養基稀釋20倍之PBS作為陰性對照。3天後棄去培養基，以50μl/孔添加溶解於CellTiter-Glo基質(Promega公司製造)所附屬之CellTiter-Glo緩衝液中之CellTiter-Glo試劑，利用振盪器攪拌1分鐘，並於室溫下靜置10分鐘後，檢測發光。
將針對Panc-1細胞而獲得之結果示於圖6。向Panc-1細胞中添加hGas6，與添加PBS時相比細胞數增加至約2倍。相對於此，KM5320-rKG1與KM5321-rKG1係將因hGas6Akt引起之細胞增殖之亢進抑制為與PBS相同程度。抗DNP抗體未對因hGas6Akt引起之細胞增殖之亢進產生影響。又，Panc-1細胞以外之其他2種細胞株亦為同樣之結果。根據該等結果顯示，KM5320-rKG1與KM5321-rKG1於表現Gas6受體之癌細胞株中亦抑制hGas6依賴性細胞增殖。
[實施例15]KM5320、KM5321人類化抗體之輕鏈及重鏈可變區之設計
(1)KM5320人類化抗體之VL及VH之胺基酸序列之設計
藉由以下所記載之方法，設計出KM5320人類化抗體之各種VL及VH之胺基酸序列。於以下之記述中，作為具有各種VL、VH之胺基酸序列之KM5320人類化抗體之總稱，記載為hzKM5320抗體。
首先，為了選擇適合KM5320抗體之CDR之胺基酸序列之移植的已知之人類抗體之FR之胺基酸，根據美國國家生物技術信息中心(The National Center for Biotechnology Information)所提供之BLASTP資料庫，針對VL及VH之各者，檢索與KM5320抗體之架構(以下記載為FR)之胺基酸序列同源性較高之已知之人類抗體之FR之胺基酸序列。
其結果為，基因庫寄存編號AAW69164.1(抗破傷風類毒素免疫球蛋白輕鏈可變區(anti-tetanus toxoid immunoglobulin light chain variable region))及DDBJ(DNA Data Bank of Japan，日本核酸資料庫) 寄存編號BAC01510.1(immunoglobulin heavy chain VHDJ region，免疫球蛋白重鏈VHDJ區)所表示之胺基酸序列(以下分別記載為AAW69164.1、BAC01510.1)之FR之胺基酸序列分別與KM5320抗體之VL及VH之FR之胺基酸序列同源性最高。
因此，分別將序列編號82、83、84所表示之KM5320之VL之CDR1~3之胺基酸序列移植至AAW69164.1之FR之胺基酸序列之適當位置，而設計出hzKM5320 LV0(序列編號105)。又，分別將序列編號79、80、81所表示之KM5320 VH之CDR1~3之胺基酸序列移植至BAC01510.1之FR之胺基酸序列之適當位置，而設計出hzKM5320 HV0(序列編號129)。
如上所述所設計之hzKM5320 LV0及hzKM5320 HV0係僅將源自作為小鼠單株抗體之KM5320的CDR之胺基酸序列移植至所選擇之人類抗體之FR之胺基酸序列而成之胺基酸序列。
但是，通常於製作人類化抗體之情形時，若僅將源自嚙齒類抗體之CDR之胺基酸序列移植至人類抗體之FR之胺基酸序列，則人類化抗體之結合活性降低之情況較多。為了避免此種結合活性之降低，於移植CDR之胺基酸序列之同時，對人類抗體與嚙齒類抗體中不同之FR之胺基酸殘基中認為會對抗體之結合活性產生影響之胺基酸殘基進行改型。
因此，於本實施例中亦藉由如下方式對認為會對抗體之結合活性產生影響之FR之胺基酸殘基進行鑑定並改型。
首先，對於上述所設計之hzKM5320 LV0及hzKM5320 HV0，分別將VL、VH中所具有之抗體記載為hzKM5320 LV0HV0抗體或僅記載為hzKM5320 LV0HV0。對於其他hzKM5320抗體，亦藉由同樣方法進行記載。使用電腦模型化之方法而構建hzKM5320 LV0HV0抗體之可變區之三維結構。三維結構座標製作及三維結構之表示係使用 Discovery Studio(Accelrys公司)。又，KM5320抗體之可變區之三維結構之電腦模型亦藉由相同方式進行構建。
進而，製作將於hzKM5320 LV0HV0抗體之VL及VH之FR之胺基酸序列中與KM5320抗體不同之胺基酸殘基取代為KM5320抗體之相同部位所存在之胺基酸殘基的胺基酸序列，同樣地構建三維結構模型。
將該等所製作之KM5320抗體、hzKM5320 LV0HV0抗體及改型體之可變區之三維結構加以比較，而鑑定預測會對抗體之結合活性產生影響之胺基酸殘基。
其結果為，於hzKM5320 LV0HV0抗體之可變區之FR之胺基酸殘基中，作為認為改變抗原結合部位之三維結構而對抗體之結合活性產生影響之胺基酸殘基，對於VL係選擇序列編號105所表示之胺基酸序列之第2號之Val、第15號之Leu、第46號之Leu、第73號之Leu、第78號之Leu、及第87號之Tyr，對於VH係選擇序列編號129所表示之胺基酸序列之第2號之Val、第9號之Ser、第20號之Val、第38號之Arg、第46號之Glu、第77號之Ser、第93號之Val、及第95號之Tyr。
將該等所選擇之胺基酸殘基中之至少1個以上之胺基酸殘基取代為KM5320抗體之相同部位所存在之胺基酸殘基，而設計出具有各種改型之人類化抗體之VL及VH。
具體而言，對於VL，導入將序列編號105所表示之胺基酸序列之第2號之Val取代為Ile，將第15號之Leu取代為Ala，將第46號之Leu取代為Val，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Val，及將第87號之Tyr取代為Phe之胺基酸改型中之至少1種改型。
藉此，作為hzKM5320抗體之VL，設計hzKM5320 LV0(序列編號105)、LV1a(序列編號108)、LV1b(序列編號111)、LV2a(序列編號114)、LV2b(序列編號117)、LV3(序列編號120)、LV5(序列編號123)及LV6(序列編號126)，將各胺基酸序列示於圖7。
又，對於VH，導入將序列編號129所表示之胺基酸序列之第2號之Val取代為Ile，將第9號之Ser取代為Pro，將第20號之Val取代為Ile，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第77號之Ser取代為Thr，將第93號之Val取代為Thr，及將第95號之Tyr取代為Phe之胺基酸改型中之至少1種改型。
藉此，作為hzKM5320抗體之VH，設計hzKM5320 HV0(序列編號129)、HV1(序列編號132)、HV2(序列編號135)、HV3a(序列編號138)、HV3b(序列編號141)、HV3c(序列編號144)、HV4(序列編號147)、HV6(序列編號150)及HV8(序列編號153)，將各胺基酸序列示於圖8。
(2)KM5321人類化抗體之VL及VH之胺基酸序列之設計
對於KM5321人類化抗體之各種VL及VH之胺基酸序列，亦藉由與實施例15(1)同樣之方法進行設計。於以下之記述中，作為具有各種VL、VH之胺基酸序列之KM5321人類化抗體之總稱，記載為hzKM5321抗體。
藉由將KM5321抗體之VL之CDR1~3之胺基酸序列(分別為序列編號88、89、90)移植至基因庫寄存編號AAW67414.1(rotavirus-specific intestinal-homing antibody light chain variable region，輪狀病毒特異性腸道歸巢抗體輕鏈可變區)所表示之人類抗體之VL之FR之胺基酸序列之適當位置，而設計出hzKM5321 LV0(序列編號156)。
又，藉由將KM5321抗體VH之CDR1~3之胺基酸序列(分別為序列編號85、86、87)移植至EMBL(European Molecular Biology Laboratory，歐洲分子生物學實驗室)寄存編號CAJ13496.1(免疫球蛋白重鏈可變區)所表示之人類抗體之FR之胺基酸序列之適當位置，而設計出hzKM5321 HV0(序列編號186)。
對於認為會對hzKM5321抗體之結合活性產生影響之FR之胺基酸 殘基，亦藉由與hzKM5320抗體之情形同樣之方法分別選擇VL、VH。將所選擇之胺基酸殘基中之至少1個以上之胺基酸序列取代為KM5321抗體之相同部位所存在之胺基酸殘基，而設計出具有各種改型之人類化抗體之VL及VH。
具體而言，對於VL，導入將序列編號156所表示之胺基酸序列之第4號之Leu取代為Val，將第13號之Ala取代為Val，將第15號之Val取代為Thr，將第43號之Ala取代為Pro，將第64號之Gly取代為Ser，將第73號之Leu取代為Phe，將第78號之Leu取代為Thr，將第85號之Thr取代為Asp，及將第104號之Val取代為Leu之胺基酸改型中之至少1種改型。
藉此，作為hzKM5321抗體之VL，設計出hzKM5321 LV0(序列編號156)、LV1a(序列編號159)、LV1b(序列編號162)、LV1c(序列編號165)、LV3(序列編號168)、LV4(序列編號171)、LV6(序列編號174)、LV7a(序列編號177)、LV7b(序列編號180)及LV9(序列編號183)，將各胺基酸序列示於圖9。
又，對於VH，導入將序列編號186所表示之胺基酸序列之第2號之Val取代為Ile，將第9號之Ser取代為Pro，將第38號之Arg取代為Lys，將第46號之Glu取代為Lys，將第79號之Ser取代為Ala，將第93號之Val取代為Thr，及將第112號之Val取代為Ile之胺基酸改型中之至少1種改型。
藉此，作為hzKM5321抗體之VH，設計出hzKM5321 HV0(序列編號186)、HV1(序列編號189)、HV2a(序列編號192)、HV2b(序列編號195)、HV3a(序列編號198)、HV3b(序列編號201)、HV4a(序列編號204)、HV4b(序列編號207)、HV5(序列編號210)及HV7(序列編號213)，將各胺基酸序列示於圖10。
於以下之記述中，對於hzKM5321 LV0及hzKM5321 HV0，分別 將VL、VH中所具有之抗體記載為hzKM5321 LV0HV0抗體或hzKM5321 LV0HV0。對於其他hzKM5321抗體，亦藉由同樣之方法進行記載。
(3)人類化抗體之可變區基因之設計
編碼人類化抗體(hzKM5320、hzKM5321抗體)之可變區之胺基酸序列的鹼基序列係使用於動物細胞中高頻度地使用之密碼子而設計。使用該等鹼基序列，構建人類化抗體之表現載體，而表現人類化抗體。
[實施例16]hzKM5320、hzKM5321抗體之表現載體之構建
藉由以下所記載之方法構建表2所示之hzKM5320、hzKM5321抗體之表現載體。
Figure 104134584-A0202-12-0118-2
首先，關於編碼包含表3中所記載之各人類化抗體之訊號序列的可變區胺基酸序列的鹼基序列，於Fasmac公司合成所需之基因片段。
Figure 104134584-A0202-12-0119-3
使用上述合成基因片段、以及導入有適當之抗體分泌訊號的人類κ鏈恆定區之表現載體(EcoNI/BsiWI處理)及人類重鏈恆定區之表現載體(FspAI/NheI處理)，利用In-Fuision HD選殖套組(Clontech公司)進行對載體之次選殖。將大腸桿菌DH5α勝任細胞(TAKARA BIO公司)進行轉形，並確認到所獲得之質體之序列。選拔產生插入有正確鹼基序列之質體的大腸桿菌之菌落，使用NucleoBond Xtra Midi EF套組(TAKARA BIO公司)製備質體。
為了使包含含有EU index S228P、L235E及R409K之胺基酸殘基取代之變異人類IgG4恆定區的抗人類Gas6人類化抗體表現，使用如下載體作為人類重鏈恆定區之表現載體，該載體係使用限制酶Bgl2及BamHI去除編碼N5KG1載體(美國專利第6,001,358號)中之輕鏈恆定區及重鏈恆定區之鹼基序列，並將該部分取代為編碼上述變異人類IgG4之恆定區之鹼基序列。
[實施例17]hzKM5320、hzKM5321抗體之短暫性表現及精製
使用Expi293F表現系統套組(Expi293F Expression System kit)(Life Technologies公司製造)使所製作之人類化抗體短暫性地進行表現。質體之導入方法係依據隨附文件。輕鏈之表現載體與重鏈之表現載體係以1：2之比率進行混合而導入。
將導入質體後之細胞於120mL之培養液中，於37℃、5%CO2、125rpm之條件下培養3天。其後，進行細胞培養液之離心分離，利用0.2μm過濾器(Thermo Scientific公司)而回收培養上清液。
藉由使用MabSelect SuRe(GE Healthcare公司製造)之親和精製，自培養上清液取得精製抗體。具體而言，利用PBS將管柱中所填充之樹脂平衡化後，向該管柱中添加培養上清液，並利用PBS洗淨2次，利用Wash緩衝液1(PBS及1M之NaCl)、Wash緩衝液2(20mM檸檬酸，50mM NaCl，pH值5.0)洗淨各1次後，使用溶出緩衝液(20mM檸檬 酸，50mM之NaCl，pH值3.4)使抗體溶出。向所獲得之抗體溶液中，以1/10量添加中和緩衝液(1M磷酸-NaOH，pH值7.0)而進行中和，並使用NAP25(GE Healthcare公司製造)將抗體溶液之溶劑更換為保存緩衝液(10mM檸檬酸，150mM之NaCl，pH值6.0)。針對更換緩衝液後之抗體溶液，使用Amicon Ultra-4離心過濾器單元(Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units)(Millipore公司製造)進行藉由超濾之濃縮，使用Nanodrop(Thermo Scientific公司)測定吸光度A280，而進行抗體溶液之濃度之測定與調整。
[實施例18]利用Biacore(註冊商標)所進行之hzKM5320、hzKM5321抗體對人類Gas6蛋白質之結合活性評價
依據實施例16中所記載之方法，製作使KM5320及KM5321之可變區胺基酸序列結合於包含EU index S228P、L235E、R409K之胺基酸殘基取代的變異人類IgG4恆定區而成之人類型嵌合抗體(以下分別記載為KM5320嵌合抗體、KM5321嵌合抗體)。為了對該等嵌合抗體與實施例17中所獲得之hzKM5320、hzKM5321抗體對人類Gas6之結合活性進行比較，使用實施例2中所製作之人類Gas6，實施藉由表面電漿子共振法(SPR法)之結合性試驗。測定設備係使用Biacore(註冊商標)T100(GE Healthcare公司製造)。
將抗人類IgG抗體(Anti-human IgG antibody)使用人類抗體捕捉套組(Human Antibody Capture kit)(GE Healthcare公司製造)，依據隨附文件固定於CM5感測片(GE Healthcare公司製造)。以10μL/min之流速向流槽中添加製備為1μg/mL之試驗抗體10秒鐘。繼而，以30μL/min之流速添加作為分析物之自10μg/mL起以5次階段性稀釋各稀釋3倍而成之人類Gas6蛋白質溶液(利用包含0.1%BSA之HBS-EP+進行稀釋)，對各抗體與分析物之結合反應進行2分鐘測定，對解離反應進行10分鐘測定。測定係藉由單循環動力學法而進行。所獲得之感測圖係使用 Bia評估軟體(Bia Evaluation Software)(GE Healthcare公司製造)進行分析，而算出各抗體之動力學常數。
本測定之預試驗表明，於歷經長時間測定大量抗體之結合活性之期間，即便為相同之抗體，於後半程中測得之ka值亦低於在前半程中測得之ka值。認為該現象係由於用作分析物之人類Gas6蛋白質於測定中緩慢吸附於小玻璃瓶上，導致實質性濃度降低而產生。為了排除分析物吸附於小玻璃瓶上對測定結果所產生之影響，於本測定中，向小玻璃瓶中添加人類Gas6蛋白質溶液後靜置充分時間，於人類Gas6蛋白質吸附於小玻璃瓶達到平穩時期之狀態下，開始對各抗體之結合活性之測定。
將所算出之KM5320嵌合抗體及hzKM5320抗體對人類Gas6之結合速度常數(ka)之最小值、解離速度常數(kd)及解離常數[kd/ka=KD]之最大值示於表4。對KM5321嵌合抗體及hzKM5321抗體亦藉由同樣之方法測定結合活性，將所獲得之結果記載於表6。
又，僅對KM5320嵌合抗體、hzKM5320 LV5HV2抗體及hzKM5320 LV1bHV0抗體，再次藉由SPR法進行結合性試驗，算出ka、kd及KD，將所獲得之結果示於表5。於再試驗中，減少所測定之抗體之數量與分析物之濃度之變化，於短時間(數小時以內)內進行測定，而非如上述試驗般將添加至小玻璃瓶中之分析物靜置充分時間。分析物係使用自10μg/mL起以3次之階段性稀釋各稀釋3倍而成之Gas6蛋白質溶液(利用包含0.1%BSA之HBS-EP+進行稀釋)。藉此，使分析物對小玻璃瓶之吸附成為最低限度，而可算出與上述試驗相比更準確之ka、KD之值。
對於KM5321嵌合抗體及hzKM5321 LV6HV2b抗體及hzKM5321 LV7bHV0抗體，亦藉由同樣之方法再次測定結合活性，並將所獲得之結果記載於表7。
根據表4，KM5320嵌合抗體與各種hzKM5320抗體之ka值均為相同程度。hzKM5320 LV0HV0抗體與KM5320嵌合抗體相比kd值約增加至6倍，伴隨於此，KD值亦增加10倍以上，關於其他hzKM5320抗體中之半數以上之抗體，KD值相對於KM5320嵌合抗體之增加被抑制為2倍左右。
又，根據表6，KM5321嵌合抗體與各種hzKM5321抗體之ka值均為相同程度。hzKM5321 LV0HV0抗體與KM5321嵌合抗體相比，kd值、KD值增加至約3倍，關於其他hzKM5321抗體中三分之一以上之抗體，KD值相對於KM5321嵌合抗體之增加被抑制為2倍左右。
據此表明，關於僅將KM5320、KM5321抗體之CDR移植至人類抗體之FR中之hzKM5320 LV0HV0抗體、hzKM5321 LV0HV0抗體，與KM5320、KM5321嵌合抗體相比，針對Gas6蛋白質之結合活性大幅度降低。但是，藉由將hzKM5320 LV0HV0、hzKM5321 LV0HV0抗體之FR之胺基酸殘基之一部分取代為KM5320抗體、KM5321抗體之FR之相同部位所存在之胺基酸殘基，上述抗體之結合活性之降低得到抑制，而製作出保持有KM5320、KM5321嵌合抗體之50%左右之結合活性的複數個人類化抗體。
又，根據表5，KM5320嵌合抗體之KD值為0.73nM，相對於此，hzKM5320 LV5HV2抗體之KD值為1.29nM，與表4之結果同樣地確認到hzKM5320 LV5HV2抗體保持有KM5320嵌合抗體之50%以上之結合活性。進而根據表7，KM5321嵌合抗體之KD值為0.2nM，相對於此，hzKM5321 LV6HV2b抗體之KD值為0.48nM，hzKM5321LV7bHV0抗體之KD值為0.40nM，再次確認到該等人類化抗體保持有KM5321嵌合抗體之50%左右之結合活性。
Figure 104134584-A0202-12-0124-4
Figure 104134584-A0202-12-0124-5
Figure 104134584-A0202-12-0125-6
Figure 104134584-A0202-12-0126-7
[實施例19]藉由ELISA所進行之hzKM5320、hzKM5321抗體對人類Gas6蛋白質之結合活性評價
依據實施例6中所記載之方法，藉由ELISA而測定hzKM5320抗體與hzKM5321抗體對人類Gas6蛋白質之結合活性。關於嵌合抗體及人類化抗體，由於恆定區係源自人類抗體，故而使用包含利用1%BSA-PBS稀釋3000倍之山羊抗人類IgG(H&L)Ads to Ms,Rb,Bv,Ho辣根過氧化物酶(American Qualex公司製造，A110PD)之溶液作為2次抗體。為了降低測定值之背景，2次抗體稀釋液係使用將與抗DNP小鼠IgG1抗體50μg/mL混合者於室溫下培養1小時而成者。將所獲得之結果示於圖11。針對圖11之圖表，由每種抗體於各濃度下之吸光值進行邏輯曲線(logistic curve)之曲線擬合(curve fitting)，並使用統計分析語言R(Ver.3.02)算出KM5320、KM5321嵌合抗體及hzKM5320、hzKM5321抗體之結合之EC50值及其SE值。將結果示於表8。hzKM5320 LV5HV2抗體顯示出與KM5320嵌合抗體相同程度之結合活性。又，hzKM5321 LV6HV2b、LV7bHV0抗體亦顯示出與KM5321嵌合抗體相同程度之結合活性。
Figure 104134584-A0305-02-0129-1
[實施例20]hzKM5320、hzKM5321抗體抑制人類Gas6蛋白質與Axl之結合之活性評價
藉由與實施例7同樣之方法，測定hzKM5320、hzKM5321抗體抑制人類Gas6蛋白質與Axl之結合之活性。將所獲得之結果示於圖12。針對圖12之圖表，由每種抗體於各濃度下之ELISA之吸光值進行邏輯曲線之曲線擬合，並使用統計分析語言R算出KM5320、KM5321嵌合抗體及hzKM5320、hzKM5321抗體之結合抑制之IC50值及其SE值。將結果示於表9。表明hzKM5320 LV5HV2抗體維持KM5320嵌合抗體之7成左右之結合抑制活性。又，表明hzKM5321 LV6HV2b抗體及hzKM5321 LV7bHV0抗體維持與KM5321嵌合抗體相同程度之結合抑制活性。
Figure 104134584-A0305-02-0129-2
[產業上之可利用性]
本發明之單株抗體對腎或癌之疾病等Gas6相關疾病之治療及診斷有用。
將本說明書中引用之所有出版物、專利及專利申請直接作為參考而併入本說明書中。
[序列表自由內容]
序列編號1-人工序列之說明：引子1
序列編號2-人工序列之說明：引子2
序列編號5-人工序列之說明：引子3
序列編號6-人工序列之說明：引子4
序列編號9-人工序列之說明：引子5
序列編號10-人工序列之說明：引子6
序列編號11-人工序列之說明：引子7
序列編號12-人工序列之說明：引子8
序列編號15-人工序列之說明：引子9
序列編號18-人工序列之說明：引子10
序列編號19-人工序列之說明：引子11
序列編號22-人工序列之說明：引子12
序列編號23-人工序列之說明：引子13
序列編號28-人工序列之說明：hAxl-hFc
序列編號29-合成構建物
序列編號30-人工序列之說明：引子14
序列編號31-人工序列之說明：引子15
序列編號34-人工序列之說明：引子16
序列編號35-人工序列之說明：引子17
序列編號36-人工序列之說明：cAxl-hFc
序列編號37-合成構建物
序列編號38-人工序列之說明：引子18
序列編號39-人工序列之說明：引子19
序列編號42-人工序列之說明：引子20
序列編號43-人工序列之說明：引子21
序列編號44-人工序列之說明：rAxl-hFc
序列編號45-合成構建物
序列編號48-人工序列之說明：mAxl-mFc
序列編號49-合成構建物
序列編號50-人工序列之說明：引子22
序列編號51-人工序列之說明：引子23
序列編號54-人工序列之說明：引子24
序列編號55-人工序列之說明：引子25
序列編號58-人工序列之說明：引子26
序列編號59-人工序列之說明：引子27
序列編號61-人工序列之說明：CNTO VH
序列編號62-合成構建物
序列編號63-人工序列之說明：CNTO VL
序列編號64-合成構建物
序列編號65-人工序列之說明：引子28
序列編號66-人工序列之說明：引子29
序列編號67-人工序列之說明：KM5320 VH
序列編號68-合成構建物
序列編號69-人工序列之說明：除訊號序列以外之KM5320 VH之胺基酸序列
序列編號70-人工序列之說明：KM5320 VL
序列編號71-合成構建物
序列編號72-人工序列之說明：除訊號序列以外之KM5320 VL之胺基酸序列
序列編號73-人工序列之說明：KM5321 VH
序列編號74-合成構建物
序列編號75-人工序列之說明：除訊號序列以外之KM5321 VH之胺基酸序列
序列編號76-人工序列之說明：KM5321 VL
序列編號77-合成構建物
序列編號78-人工序列之說明：除訊號序列以外之KM5321 VL之胺基酸序列
序列編號79-人工序列之說明：KM5320 VH CDR1之胺基酸序列
序列編號80-人工序列之說明：KM5320 VH CDR2之胺基酸序列
序列編號81-人工序列之說明：KM5320 VH CDR3之胺基酸序列
序列編號82-人工序列之說明：KM5320 VLCDR1之胺基酸序列
序列編號83-人工序列之說明：KM5320 VLCDR2之胺基酸序列
序列編號84-人工序列之說明：KM5320 VLCDR3之胺基酸序列
序列編號85-人工序列之說明：KM5321 VH CDR1之胺基酸序列
序列編號86-人工序列之說明：KM5321 VH CDR2之胺基酸序列
序列編號87-人工序列之說明：KM5321 VH CDR3之胺基酸序列
序列編號88-人工序列之說明：KM5321 VLCDR1之胺基酸序列
序列編號89-人工序列之說明：KM5321 VLCDR2之胺基酸序列
序列編號90-人工序列之說明：KM5321 VLCDR3之胺基酸序列
序列編號91-人工序列之說明：KM5320-rIgG1
序列編號92-合成構建物
序列編號93-人工序列之說明：KM5320-r_kappa
序列編號94-合成構建物
序列編號95-人工序列之說明：KM5321-rIgG1
序列編號96-合成構建物
序列編號97-人工序列之說明：KM5321-r_kappa
序列編號98-合成構建物
序列編號99-人工序列之說明：hGas6-delta
序列編號100-合成構建物
序列編號101-人工序列之說明：引子30
序列編號102-人工序列之說明：引子31
序列編號103-人工序列之說明：hzKM5320 LV0序列
序列編號104-合成構建物
序列編號105-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV0之胺基酸序列
序列編號106-人工序列之說明：hzKM5320 LV1a序列
序列編號107-合成構建物
序列編號108-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV1a之胺基酸序列
序列編號109-人工序列之說明：hzKM5320 LV1b序列
序列編號110-合成構建物
序列編號111-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV1b之胺基酸序列
序列編號112-人工序列之說明：hzKM5320 LV2a序列
序列編號113-合成構建物
序列編號114-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV2a之胺基酸序列
序列編號115-人工序列之說明：hzKM5320 LV2b序列
序列編號116-合成構建物
序列編號117-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV2b之胺基酸序列
序列編號118-人工序列之說明：hzKM5320 LV3序列
序列編號119-合成構建物
序列編號120-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV3之胺基酸序列
序列編號121-人工序列之說明：hzKM5320 LV5序列
序列編號122-合成構建物
序列編號123-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV5之胺基酸序列
序列編號124-人工序列之說明：hzKM5320 LV6序列
序列編號125-合成構建物
序列編號126-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV6之胺基酸序列
序列編號127-人工序列之說明：hzKM5320 HV0序列
序列編號128-合成構建物
序列編號129-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV0之胺基酸序列
序列編號130-人工序列之說明：hzKM5320 HV1序列
序列編號131-合成構建物
序列編號132-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV1之胺基酸序列
序列編號133-人工序列之說明：hzKM5320 HV2序列
序列編號134-合成構建物
序列編號135-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV2之胺基酸序列
序列編號136-人工序列之說明：hzKM5320 HV3a序列
序列編號137-合成構建物
序列編號138-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV3a之胺基酸序列
序列編號139-人工序列之說明：hzKM5320 HV3b序列
序列編號140-合成構建物
序列編號141-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV3b之胺基酸序列
序列編號142-人工序列之說明：hzKM5320 HV3c序列
序列編號143-合成構建物
序列編號144-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV3c之胺基酸序列
序列編號145-人工序列之說明：hzKM5320 HV4序列
序列編號146-合成構建物
序列編號147-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV4之胺基酸序列
序列編號148-人工序列之說明：hzKM5320 HV6序列
序列編號149-合成構建物
序列編號150-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV6之胺基酸序列
序列編號151-人工序列之說明：hzKM5320 HV8序列
序列編號152-合成構建物
序列編號153-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV8之胺基酸序列
序列編號154-人工序列之說明：hzKM5321 LV0序列
序列編號155-合成構建物
序列編號156-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV0之胺基酸序列
序列編號157-人工序列之說明：hzKM5321 LV1a序列
序列編號158-合成構建物
序列編號159-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV1a之胺基酸序列
序列編號160-人工序列之說明：hzKM5321 LV1b序列
序列編號161-合成構建物
序列編號162-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV1b之胺基酸序列
序列編號163-人工序列之說明：hzKM5321 LV1c序列
序列編號164-合成構建物
序列編號165-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV1c之胺基酸序列
序列編號166-人工序列之說明：hzKM5321 LV3序列
序列編號167-合成構建物
序列編號168-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV3之胺基酸序列
序列編號169-人工序列之說明：hzKM5321 LV4序列
序列編號170-合成構建物
序列編號171-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV4之胺基酸序列
序列編號172-人工序列之說明：hzKM5321 LV6序列
序列編號173-合成構建物
序列編號174-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV6之胺基酸序列
序列編號175-人工序列之說明：hzKM5321 LV7a序列
序列編號176-合成構建物
序列編號177-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV7a之胺基酸序列
序列編號178-人工序列之說明：hzKM5321 LV7b序列
序列編號179-合成構建物
序列編號180-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV7b之胺基酸序列
序列編號181-人工序列之說明：hzKM5321 LV9序列
序列編號182-合成構建物
序列編號183-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV9之胺基酸序列
序列編號184-人工序列之說明：hzKM5321 HV0序列
序列編號185-合成構建物
序列編號186-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV0之胺基酸序列
序列編號187-人工序列之說明：hzKM5321 HV1序列
序列編號188-合成構建物
序列編號189-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV1之胺基酸序列
序列編號190-人工序列之說明：hzKM5321 HV2a序列
序列編號191-合成構建物
序列編號192-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV2a之胺基酸序列
序列編號193-人工序列之說明：hzKM5321 HV2b序列
序列編號194-合成構建物
序列編號195-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV2b之胺基酸序列
序列編號196-人工序列之說明：hzKM5321 HV3a序列
序列編號197-合成構建物
序列編號198-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV3a之胺基酸序列
序列編號199-人工序列之說明：hzKM5321 HV3b序列
序列編號200-合成構建物
序列編號201-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV3b之胺基酸序列
序列編號202-人工序列之說明：hzKM5321 HV4a序列
序列編號203-合成構建物
序列編號204-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV4a之胺基酸序列
序列編號205-人工序列之說明：hzKM5321 HV4b序列
序列編號206-合成構建物
序列編號207-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV4b之胺基酸序列
序列編號208-人工序列之說明：hzKM5321 HV5序列
序列編號209-合成構建物
序列編號210-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV5之胺基酸序列
序列編號211-人工序列之說明：hzKM5321 HV7序列
序列編號212-合成構建物
序列編號213-人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV7之胺基酸序列
[序列表]PKH-5002TW Sequence Listing.txt
<110> 協和醱酵麒麟股份有限公司
<120> 抗人類Gas6單株抗體
<150> US62/066687
<151> 2014-10-21
<160> 213
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子1
<400> 1
Figure 104134584-A0305-02-0140-6
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子2
<400> 2
Figure 104134584-A0305-02-0140-5
<210> 3
<211> 2037
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2037)
<400> 3
Figure 104134584-A0305-02-0140-3
Figure 104134584-A0202-12-0139-11
Figure 104134584-A0202-12-0140-12
Figure 104134584-A0202-12-0141-13
<210> 4
<211> 678
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Figure 104134584-A0202-12-0142-14
Figure 104134584-A0202-12-0143-15
Figure 104134584-A0202-12-0144-16
Figure 104134584-A0202-12-0145-17
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子3
<400> 5
Figure 104134584-A0202-12-0145-451
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子4
<400> 6
Figure 104134584-A0202-12-0145-449
<210> 7
<211> 2040
<212> DNA
<213> 食蟹猴
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2040)
<400> 7
Figure 104134584-A0202-12-0145-18
Figure 104134584-A0202-12-0146-21
Figure 104134584-A0202-12-0147-22
Figure 104134584-A0202-12-0148-23
<210> 8
<211> 679
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 8
Figure 104134584-A0202-12-0149-24
Figure 104134584-A0202-12-0150-25
Figure 104134584-A0202-12-0151-26
Figure 104134584-A0202-12-0152-27
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子5
<400> 9
Figure 104134584-A0202-12-0152-29
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子6
<400> 10
Figure 104134584-A0202-12-0152-28
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子7
<400> 11
Figure 104134584-A0202-12-0152-30
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子8
<400> 12
Figure 104134584-A0202-12-0152-31
<210> 13
<211> 2025
<212> DNA
<213> 溝鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2025)
<400> 13
Figure 104134584-A0202-12-0153-33
Figure 104134584-A0202-12-0154-34
Figure 104134584-A0202-12-0155-35
Figure 104134584-A0202-12-0156-36
<210> 14
<211> 674
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 14
Figure 104134584-A0202-12-0156-37
Figure 104134584-A0202-12-0157-38
Figure 104134584-A0202-12-0158-39
Figure 104134584-A0202-12-0159-40
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子9
<400> 15
Figure 104134584-A0202-12-0159-42
<210> 16
<211> 2025
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2025)
<400> 16
Figure 104134584-A0202-12-0159-41
Figure 104134584-A0202-12-0160-43
Figure 104134584-A0202-12-0161-45
Figure 104134584-A0202-12-0162-46
<210> 17
<211> 674
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 17
Figure 104134584-A0202-12-0163-47
Figure 104134584-A0202-12-0164-48
Figure 104134584-A0202-12-0165-49
Figure 104134584-A0202-12-0166-50
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子10
<400> 18
Figure 104134584-A0202-12-0166-53
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子11
<400> 19
Figure 104134584-A0202-12-0166-52
<210> 20
<211> 486
<212> DNA
<213> 溝鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(486)
<400> 20
Figure 104134584-A0202-12-0166-51
Figure 104134584-A0202-12-0167-54
<210> 21
<211> 161
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 21
Figure 104134584-A0202-12-0167-55
Figure 104134584-A0202-12-0168-56
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子12
<400> 22
Figure 104134584-A0202-12-0168-57
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子13
<400> 23
Figure 104134584-A0202-12-0168-59
<210> 24
<211> 2277
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2277)
<400> 24
Figure 104134584-A0202-12-0169-60
Figure 104134584-A0202-12-0170-61
Figure 104134584-A0202-12-0171-62
Figure 104134584-A0202-12-0172-63
<210> 25
<211> 758
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Figure 104134584-A0202-12-0172-64
Figure 104134584-A0202-12-0173-65
Figure 104134584-A0202-12-0174-66
Figure 104134584-A0202-12-0175-67
Figure 104134584-A0202-12-0176-69
<210> 26
<211> 2685
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2685)
<400> 26
Figure 104134584-A0202-12-0176-68
Figure 104134584-A0202-12-0177-70
Figure 104134584-A0202-12-0178-71
Figure 104134584-A0202-12-0179-72
Figure 104134584-A0202-12-0180-73
<210> 27
<211> 894
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Figure 104134584-A0202-12-0180-74
Figure 104134584-A0202-12-0181-75
Figure 104134584-A0202-12-0182-76
Figure 104134584-A0202-12-0183-77
Figure 104134584-A0202-12-0184-78
<210> 28
<211> 2034
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：hAxl-hFc
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2034)
<400> 28
Figure 104134584-A0202-12-0184-80
Figure 104134584-A0202-12-0185-81
Figure 104134584-A0202-12-0186-82
Figure 104134584-A0202-12-0187-83
<210> 29
<211> 675
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 29
Figure 104134584-A0202-12-0187-84
Figure 104134584-A0202-12-0188-85
Figure 104134584-A0202-12-0189-86
Figure 104134584-A0202-12-0190-87
Figure 104134584-A0202-12-0191-89
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子14
<400> 30
Figure 104134584-A0202-12-0191-93
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子15
<400> 31
Figure 104134584-A0202-12-0191-92
<210> 32
<211> 2685
<212> DNA
<213> 食蟹猴
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2685)
<400> 32
Figure 104134584-A0202-12-0191-91
Figure 104134584-A0202-12-0192-94
Figure 104134584-A0202-12-0193-95
Figure 104134584-A0202-12-0194-96
Figure 104134584-A0202-12-0195-97
<210> 33
<211> 894
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 33
Figure 104134584-A0202-12-0195-98
Figure 104134584-A0202-12-0196-99
Figure 104134584-A0202-12-0197-100
Figure 104134584-A0202-12-0198-102
Figure 104134584-A0202-12-0199-103
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子16
<400> 34
Figure 104134584-A0202-12-0199-104
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子17
<400> 35
Figure 104134584-A0202-12-0200-106
<210> 36
<211> 2004
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：cAxl-hFc
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2004)
<400> 36
Figure 104134584-A0202-12-0200-105
Figure 104134584-A0202-12-0201-107
Figure 104134584-A0202-12-0202-108
Figure 104134584-A0202-12-0203-109
<210> 37
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 37
Figure 104134584-A0202-12-0203-110
Figure 104134584-A0202-12-0204-111
Figure 104134584-A0202-12-0205-112
Figure 104134584-A0202-12-0206-113
<210> 38
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子18
<400> 38
Figure 104134584-A0202-12-0206-115
<210> 39
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子19
<400> 39
Figure 104134584-A0202-12-0207-116
<210> 40
<211> 2667
<212> DNA
<213> 溝鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2667)
<400> 40
Figure 104134584-A0202-12-0207-117
Figure 104134584-A0202-12-0208-118
Figure 104134584-A0202-12-0209-119
Figure 104134584-A0202-12-0210-120
Figure 104134584-A0202-12-0211-121
<210> 41
<211> 888
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 41
Figure 104134584-A0202-12-0211-122
Figure 104134584-A0202-12-0212-123
Figure 104134584-A0202-12-0213-124
Figure 104134584-A0202-12-0214-125
Figure 104134584-A0202-12-0215-126
<210> 42
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子20
<400> 42
Figure 104134584-A0202-12-0215-127
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子21
<400> 43
Figure 104134584-A0202-12-0215-128
<210> 44
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：rAxl-hFc
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2019)
<400> 44
Figure 104134584-A0202-12-0216-129
Figure 104134584-A0202-12-0217-130
Figure 104134584-A0202-12-0218-131
Figure 104134584-A0202-12-0219-132
<210> 45
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 45
Figure 104134584-A0202-12-0219-133
Figure 104134584-A0202-12-0220-134
Figure 104134584-A0202-12-0221-135
Figure 104134584-A0202-12-0222-136
<210> 46
<211> 2667
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2667)
<400> 46
Figure 104134584-A0202-12-0222-139
Figure 104134584-A0202-12-0223-140
Figure 104134584-A0202-12-0224-141
Figure 104134584-A0202-12-0225-142
Figure 104134584-A0202-12-0226-144
<210> 47
<211> 888
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 47
Figure 104134584-A0202-12-0226-145
Figure 104134584-A0202-12-0227-146
Figure 104134584-A0202-12-0228-147
Figure 104134584-A0202-12-0229-148
Figure 104134584-A0202-12-0230-149
<210> 48
<211> 2034
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：mAxl-mFc
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2034)
<400> 48
Figure 104134584-A0202-12-0230-150
Figure 104134584-A0202-12-0231-151
Figure 104134584-A0202-12-0232-152
Figure 104134584-A0202-12-0233-153
Figure 104134584-A0202-12-0234-155
<210> 49
<211> 675
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 49
Figure 104134584-A0202-12-0234-154
Figure 104134584-A0202-12-0235-156
Figure 104134584-A0202-12-0236-157
Figure 104134584-A0202-12-0237-158
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子22
<400> 50
Figure 104134584-A0202-12-0237-159
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子23
<400> 51
Figure 104134584-A0202-12-0237-161
<210> 52
<211> 2673
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2673)
<400> 52
Figure 104134584-A0202-12-0237-162
Figure 104134584-A0202-12-0238-163
Figure 104134584-A0202-12-0239-164
Figure 104134584-A0202-12-0240-165
Figure 104134584-A0202-12-0241-166
<210> 53
<211> 890
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Figure 104134584-A0202-12-0242-167
Figure 104134584-A0202-12-0243-168
Figure 104134584-A0202-12-0244-169
Figure 104134584-A0202-12-0245-170
Figure 104134584-A0202-12-0246-171
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子24
<400> 54
Figure 104134584-A0202-12-0246-174
<210> 55
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子25
<400> 55
Figure 104134584-A0202-12-0246-173
<210> 56
<211> 3000
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3000)
<400> 56
Figure 104134584-A0202-12-0246-172
Figure 104134584-A0202-12-0247-175
Figure 104134584-A0202-12-0248-176
Figure 104134584-A0202-12-0249-177
Figure 104134584-A0202-12-0250-178
Figure 104134584-A0202-12-0251-179
<210> 57
<211> 999
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Figure 104134584-A0202-12-0251-180
Figure 104134584-A0202-12-0252-181
Figure 104134584-A0202-12-0253-182
Figure 104134584-A0202-12-0254-183
Figure 104134584-A0202-12-0255-184
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子26
<400> 58
Figure 104134584-A0202-12-0256-188
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子27
<400> 59
Figure 104134584-A0202-12-0256-187
<210> 60
<211> 1027
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<400> 60
Figure 104134584-A0202-12-0256-185
<210> 61
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：CNTO VH
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(438)
<400> 61
Figure 104134584-A0202-12-0257-189
<210> 62
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 62
Figure 104134584-A0202-12-0258-190
<210> 63
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：CNTO VL
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 63
Figure 104134584-A0202-12-0259-192
<210> 64
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 64
Figure 104134584-A0202-12-0259-191
Figure 104134584-A0202-12-0260-193
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子28
<400> 65
Figure 104134584-A0202-12-0260-194
<210> 66
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子29
<400> 66
Figure 104134584-A0202-12-0260-195
<210> 67
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320 VH
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 67
Figure 104134584-A0202-12-0261-196
<210> 68
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 68
Figure 104134584-A0202-12-0262-197
<210> 69
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之KM5320 VH之胺基酸序列
<400> 69
Figure 104134584-A0202-12-0262-198
Figure 104134584-A0202-12-0263-199
<210> 70
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320 VL
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 70
Figure 104134584-A0202-12-0263-200
Figure 104134584-A0202-12-0264-201
<210> 71
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 71
Figure 104134584-A0202-12-0264-202
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之KM5320 VL之胺基酸序列
<400> 72
Figure 104134584-A0202-12-0265-205
<210> 73
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321 VH
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 73
Figure 104134584-A0202-12-0265-204
Figure 104134584-A0202-12-0266-206
<210> 74
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 74
Figure 104134584-A0202-12-0266-207
Figure 104134584-A0202-12-0267-208
<210> 75
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之KM5321 VH之胺基酸序列
<400> 75
Figure 104134584-A0202-12-0267-209
Figure 104134584-A0202-12-0268-210
<210> 76
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321 VL
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 76
Figure 104134584-A0202-12-0268-211
Figure 104134584-A0202-12-0269-213
<210> 77
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 77
Figure 104134584-A0202-12-0269-212
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之KM5321 VL之胺基酸序列
<400> 78
Figure 104134584-A0202-12-0270-214
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320 VH CDR1之胺基酸序列
<400> 79
Figure 104134584-A0202-12-0270-216
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320 VH CDR2之胺基酸序列
<400> 80
Figure 104134584-A0202-12-0270-215
Gly
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320 VH CDR3之胺基酸序列
<400> 81
Figure 104134584-A0202-12-0271-219
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320 VL CDR1之胺基酸序列
<400> 82
Figure 104134584-A0202-12-0271-218
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320 VL CDR2之胺基酸序列
<400> 83
Figure 104134584-A0202-12-0271-217
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320 VL CDR3之胺基酸序列
<400> 84
Figure 104134584-A0202-12-0272-220
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321 VH CDR1之胺基酸序列
<400> 85
Figure 104134584-A0202-12-0272-221
<210> 86
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321 VH CDR2之胺基酸序列
<400> 86
Figure 104134584-A0202-12-0272-222
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321 VH CDR3之胺基酸序列
<400> 87
Figure 104134584-A0202-12-0272-223
Figure 104134584-A0202-12-0273-227
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321 VL CDR1之胺基酸序列
<400> 88
Figure 104134584-A0202-12-0273-226
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321 VL CDR2之胺基酸序列
<400> 89
Figure 104134584-A0202-12-0273-225
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321 VL CDR3之胺基酸序列
<400> 90
Figure 104134584-A0202-12-0273-224
<210> 91
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320-rIgG1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1395)
<400> 91
Figure 104134584-A0202-12-0274-228
Figure 104134584-A0202-12-0275-229
Figure 104134584-A0202-12-0276-230
<210> 92
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 92
Figure 104134584-A0202-12-0276-231
Figure 104134584-A0202-12-0277-232
Figure 104134584-A0202-12-0278-233
<210> 93
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5320-r_kappa
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(705)
<400> 93
Figure 104134584-A0202-12-0278-236
Figure 104134584-A0202-12-0279-237
<210> 94
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 94
Figure 104134584-A0202-12-0280-238
Figure 104134584-A0202-12-0281-239
<210> 95
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321-rIgG1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1386)
<400> 95
Figure 104134584-A0202-12-0281-240
Figure 104134584-A0202-12-0282-241
Figure 104134584-A0202-12-0283-242
<210> 96
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 96
Figure 104134584-A0202-12-0283-243
Figure 104134584-A0202-12-0284-244
Figure 104134584-A0202-12-0285-245
<210> 97
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：KM5321-1_kappa
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(705)
<400> 97
Figure 104134584-A0202-12-0285-246
Figure 104134584-A0202-12-0286-247
<210> 98
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 98
Figure 104134584-A0202-12-0287-249
Figure 104134584-A0202-12-0288-250
<210> 99
<211> 1896
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：hGas6-delta
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1896)
<400> 99
Figure 104134584-A0202-12-0288-251
Figure 104134584-A0202-12-0289-252
Figure 104134584-A0202-12-0290-253
Figure 104134584-A0202-12-0291-254
<210> 100
<211> 631
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建物
<400> 100
Figure 104134584-A0202-12-0291-255
Figure 104134584-A0202-12-0292-256
Figure 104134584-A0202-12-0293-257
Figure 104134584-A0202-12-0294-259
<210> 101
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子30
<400> 101
Figure 104134584-A0202-12-0294-260
<210> 102
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：引子31
<400> 102
Figure 104134584-A0202-12-0294-261
<210> 103
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 LV0序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 103
Figure 104134584-A0202-12-0295-263
<210> 104
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 104
Figure 104134584-A0202-12-0295-262
Figure 104134584-A0202-12-0296-264
<210> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV0之胺基酸序列
<400> 105
Figure 104134584-A0202-12-0296-265
Figure 104134584-A0202-12-0297-266
<210> 106
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 LV1a序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 106
Figure 104134584-A0202-12-0297-267
<210> 107
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 107
Figure 104134584-A0202-12-0298-269
<210> 108
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV1a之胺基酸序列
<400> 108
Figure 104134584-A0202-12-0298-268
Figure 104134584-A0202-12-0299-270
<210> 109
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 LV1b序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 109
Figure 104134584-A0202-12-0299-272
Figure 104134584-A0202-12-0300-273
<210> 110
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 110
Figure 104134584-A0202-12-0300-274
<210> 111
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV1b之胺基酸序列
<400> 111
Figure 104134584-A0202-12-0301-276
<210> 112
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 LV2a序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 112
Figure 104134584-A0202-12-0301-275
Figure 104134584-A0202-12-0302-277
<210> 113
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 113
Figure 104134584-A0202-12-0302-278
Figure 104134584-A0202-12-0303-279
<210> 114
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV2a之胺基酸序列
<400> 114
Figure 104134584-A0202-12-0303-280
<210> 115
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 LV2b序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 115
Figure 104134584-A0202-12-0304-281
<210> 116
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 116
Figure 104134584-A0202-12-0305-282
<210> 117
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV2b之胺基酸序列
<400> 117
Figure 104134584-A0202-12-0305-283
Figure 104134584-A0202-12-0306-285
<210> 118
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 LV3序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 118
Figure 104134584-A0202-12-0306-284
Figure 104134584-A0202-12-0307-286
<210> 119
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 119
Figure 104134584-A0202-12-0307-287
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV3之胺基酸序列
<400> 120
Figure 104134584-A0202-12-0308-289
<210> 121
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 LV5序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 121
Figure 104134584-A0202-12-0308-288
Figure 104134584-A0202-12-0309-290
<210> 122
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 122
Figure 104134584-A0202-12-0309-291
Figure 104134584-A0202-12-0310-294
<210> 123
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV5之胺基酸序列
<400> 123
Figure 104134584-A0202-12-0310-293
<210> 124
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 LV6序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 124
Figure 104134584-A0202-12-0311-295
<210> 125
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 125
Figure 104134584-A0202-12-0311-296
Figure 104134584-A0202-12-0312-297
<210> 126
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 LV6之胺基酸序列
<400> 126
Figure 104134584-A0202-12-0312-298
Figure 104134584-A0202-12-0313-300
<210> 127
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 HV0序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 127
Figure 104134584-A0202-12-0313-299
<210> 128
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 128
Figure 104134584-A0202-12-0314-301
<210> 129
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV0之胺基酸序列
<400> 129
Figure 104134584-A0202-12-0315-303
<210> 130
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 HV1序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 130
Figure 104134584-A0202-12-0315-302
Figure 104134584-A0202-12-0316-304
<210> 131
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 131
Figure 104134584-A0202-12-0316-305
Figure 104134584-A0202-12-0317-306
<210> 132
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV1之胺基酸序列
<400> 132
Figure 104134584-A0202-12-0317-307
Figure 104134584-A0202-12-0318-309
<210> 133
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 HV2序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 133
Figure 104134584-A0202-12-0318-308
<210> 134
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 134
Figure 104134584-A0202-12-0319-310
<210> 135
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV2之胺基酸序列
<400> 135
Figure 104134584-A0202-12-0320-312
<210> 136
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 HV3a序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 136
Figure 104134584-A0202-12-0320-311
Figure 104134584-A0202-12-0321-313
<210> 137
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 137
Figure 104134584-A0202-12-0321-314
Figure 104134584-A0202-12-0322-316
<210> 138
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV3a之胺基酸序列
<400> 138
Figure 104134584-A0202-12-0322-315
Figure 104134584-A0202-12-0323-317
<210> 139
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 HV3b序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 139
Figure 104134584-A0202-12-0323-318
<210> 140
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 140
Figure 104134584-A0202-12-0324-319
<210> 141
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV3b之胺基酸序列
<400> 141
Figure 104134584-A0202-12-0325-320
<210> 142
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 HV3c序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 142
Figure 104134584-A0202-12-0325-321
Figure 104134584-A0202-12-0326-322
<210> 143
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 143
Figure 104134584-A0202-12-0326-323
Figure 104134584-A0202-12-0327-325
<210> 144
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV3c之胺基酸序列
<400> 144
Figure 104134584-A0202-12-0327-324
Figure 104134584-A0202-12-0328-326
<210> 145
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 HV4序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 145
Figure 104134584-A0202-12-0328-327
<210> 146
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 146
Figure 104134584-A0202-12-0329-329
<210> 147
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV4之胺基酸序列
<400> 147
Figure 104134584-A0202-12-0330-330
<210> 148
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 HV6序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 148
Figure 104134584-A0202-12-0330-331
Figure 104134584-A0202-12-0331-333
<210> 149
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 149
Figure 104134584-A0202-12-0331-332
Figure 104134584-A0202-12-0332-334
<210> 150
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV6之胺基酸序列
<400> 150
Figure 104134584-A0202-12-0332-335
Figure 104134584-A0202-12-0333-337
<210> 151
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5320 HV8序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 151
Figure 104134584-A0202-12-0333-336
<210> 152
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 152
Figure 104134584-A0202-12-0334-338
<210> 153
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5320 HV8之胺基酸序列
<400> 153
Figure 104134584-A0202-12-0335-341
<210> 154
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV0序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 154
Figure 104134584-A0202-12-0335-340
Figure 104134584-A0202-12-0336-342
<210> 155
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 155
Figure 104134584-A0202-12-0336-343
Figure 104134584-A0202-12-0337-345
<210> 156
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV0之胺基酸序列
<400> 156
Figure 104134584-A0202-12-0337-344
<210> 157
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV1a序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 157
Figure 104134584-A0202-12-0338-346
<210> 158
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 158
Figure 104134584-A0202-12-0338-347
Figure 104134584-A0202-12-0339-349
<210> 159
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV1a之胺基酸序列
<400> 159
Figure 104134584-A0202-12-0339-348
Figure 104134584-A0202-12-0340-350
<210> 160
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV1b序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 160
Figure 104134584-A0202-12-0340-351
<210> 161
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 161
Figure 104134584-A0202-12-0341-353
<210> 162
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV1b之胺基酸序列
<400> 162
Figure 104134584-A0202-12-0341-352
Figure 104134584-A0202-12-0342-354
<210> 163
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV1c序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 163
Figure 104134584-A0202-12-0342-355
Figure 104134584-A0202-12-0343-357
<210> 164
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 164
Figure 104134584-A0202-12-0343-356
Figure 104134584-A0202-12-0344-358
<210> 165
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV1c之胺基酸序列
<400> 165
Figure 104134584-A0202-12-0344-359
<210> 166
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV3序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 166
Figure 104134584-A0202-12-0345-361
<210> 167
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 167
Figure 104134584-A0202-12-0345-360
Figure 104134584-A0202-12-0346-362
<210> 168
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV3之胺基酸序列
<400> 168
Figure 104134584-A0202-12-0346-363
Figure 104134584-A0202-12-0347-365
<210> 169
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV4序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 169
Figure 104134584-A0202-12-0347-364
<210> 170
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 170
Figure 104134584-A0202-12-0348-366
<210> 171
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV4之胺基酸序列
<400> 171
Figure 104134584-A0202-12-0348-367
Figure 104134584-A0202-12-0349-368
<210> 172
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV6序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 172
Figure 104134584-A0202-12-0349-369
Figure 104134584-A0202-12-0350-371
<210> 173
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 173
Figure 104134584-A0202-12-0350-370
<210> 174
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV6之胺基酸序列
<400> 174
Figure 104134584-A0202-12-0351-372
<210> 175
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV7a序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 175
Figure 104134584-A0202-12-0351-373
Figure 104134584-A0202-12-0352-374
<210> 176
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 176
Figure 104134584-A0202-12-0352-375
Figure 104134584-A0202-12-0353-377
<210> 177
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV7a之胺基酸序列
<400> 177
Figure 104134584-A0202-12-0353-376
<210> 178
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV7b序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 178
Figure 104134584-A0202-12-0354-378
<210> 179
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 179
Figure 104134584-A0202-12-0354-379
Figure 104134584-A0202-12-0355-381
<210> 180
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV7b之胺基酸序列
<400> 180
Figure 104134584-A0202-12-0355-380
Figure 104134584-A0202-12-0356-382
<210> 181
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 LV9序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 181
Figure 104134584-A0202-12-0356-383
<210> 182
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 182
Figure 104134584-A0202-12-0357-385
<210> 183
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 LV9之胺基酸序列
<400> 183
Figure 104134584-A0202-12-0357-384
Figure 104134584-A0202-12-0358-386
<210> 184
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV0序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 184
Figure 104134584-A0202-12-0358-387
Figure 104134584-A0202-12-0359-388
<210> 185
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 185
Figure 104134584-A0202-12-0359-389
Figure 104134584-A0202-12-0360-391
<210> 186
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV0之胺基酸序列
<400> 186
Figure 104134584-A0202-12-0360-390
<210> 187
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV1序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 187
Figure 104134584-A0202-12-0361-392
<210> 188
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 188
Figure 104134584-A0202-12-0362-394
<210> 189
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV1之胺基酸序列
<400> 189
Figure 104134584-A0202-12-0362-393
Figure 104134584-A0202-12-0363-395
<210> 190
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV2a序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 190
Figure 104134584-A0202-12-0363-396
Figure 104134584-A0202-12-0364-398
<210> 191
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 191
Figure 104134584-A0202-12-0364-397
Figure 104134584-A0202-12-0365-399
<210> 192
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV2a之胺基酸序列
<400> 192
Figure 104134584-A0202-12-0365-400
<210> 193
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV2b序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 193
Figure 104134584-A0202-12-0366-401
<210> 194
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 194
Figure 104134584-A0202-12-0367-402
<210> 195
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV2b之胺基酸序列
<400> 195
Figure 104134584-A0202-12-0367-403
Figure 104134584-A0202-12-0368-406
<210> 196
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV3a序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 196
Figure 104134584-A0202-12-0368-405
Figure 104134584-A0202-12-0369-407
<210> 197
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 197
Figure 104134584-A0202-12-0369-408
Figure 104134584-A0202-12-0370-410
<210> 198
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV3a之胺基酸序列
<400> 198
Figure 104134584-A0202-12-0370-409
<210> 199
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV3b序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 199
Figure 104134584-A0202-12-0371-412
<210> 200
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 200
Figure 104134584-A0202-12-0372-414
<210> 201
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV3b之胺基酸序列
<400> 201
Figure 104134584-A0202-12-0372-413
Figure 104134584-A0202-12-0373-415
<210> 202
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV4a序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 202
Figure 104134584-A0202-12-0373-416
Figure 104134584-A0202-12-0374-418
<210> 203
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 203
Figure 104134584-A0202-12-0374-417
Figure 104134584-A0202-12-0375-419
<210> 204
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV4a之胺基酸序列
<400> 204
Figure 104134584-A0202-12-0375-420
<210> 205
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV4b序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 205
Figure 104134584-A0202-12-0376-421
<210> 206
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 206
Figure 104134584-A0202-12-0377-423
<210> 207
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV4b之胺基酸序列
<400> 207
Figure 104134584-A0202-12-0377-424
Figure 104134584-A0202-12-0378-426
<210> 208
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV5序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 208
Figure 104134584-A0202-12-0378-425
Figure 104134584-A0202-12-0379-427
<210> 209
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 209
Figure 104134584-A0202-12-0379-428
Figure 104134584-A0202-12-0380-430
<210> 210
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV5之胺基酸序列
<400> 210
Figure 104134584-A0202-12-0380-429
<210> 211
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：hzKM5321 HV7序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 211
Figure 104134584-A0202-12-0381-431
<210> 212
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 212
Figure 104134584-A0202-12-0382-433
<210> 213
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：除訊號序列以外之hzKM5321 HV7之胺基酸序列
<400> 213
Figure 104134584-A0202-12-0382-432
Figure 104134584-A0202-12-0383-434

Claims (17)

  1. 一種單株抗體或該抗體片段，其中單株抗體為選自下述(a)或(b)之抗體：(a)抗體之重鏈(以下簡稱為H鏈)可變區(以下簡稱為VH)之互補決定區(CDR，complementarity determining region，以下簡稱為CDR)1~3之胺基酸序列分別為序列編號79、80及81所記載之胺基酸序列，且輕鏈(以下簡稱為L鏈)可變區(以下簡稱為VL)之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號82、83及84所記載之胺基酸序列之抗體；(b)抗體之VH之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號85、86及87所記載之胺基酸序列，且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別為序列編號88、89及90所記載之胺基酸序列之抗體。
  2. 如請求項1之單株抗體或該抗體片段，其與人類Gas6之胺基酸序列之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基結合。
  3. 如請求項1之單株抗體或該抗體片段，其中單株抗體係與人類Gas6之第314號、第315號及第316號胺基酸殘基結合之單株抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項之單株抗體或該抗體片段，其中單株抗體為選自下述(a)至(e)中之任一種抗體：(a)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號69所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號72所記載之胺基酸序列之抗體；(b)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號75所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號78所記載之胺基酸序列之抗 體；(c)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號135所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號123所記載之胺基酸序列之抗體；(d)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號195所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號174所記載之胺基酸序列之抗體；(e)抗體之VH之胺基酸序列為序列編號186所記載之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列為序列編號180所記載之胺基酸序列之抗體。
  5. 如請求項1至3中任一項之單株抗體或該抗體片段，其中單株抗體為基因重組抗體。
  6. 如請求項5之單株抗體或該抗體片段，其中基因重組抗體係選自人類型嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體中之基因重組抗體。
  7. 如請求項1至3中任一項之單株抗體或該抗體片段，其中抗體片段係選自Fab、Fab'、(Fab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚物化V區(diabody，雙功能抗體)、二硫鍵穩定化V區(dsFv)及包含CDR之肽中。
  8. 一種核酸，其具有編碼如請求項1至7中任一項之單株抗體或該抗體片段之鹼基序列。
  9. 一種轉形細胞，其包含含有如請求項8之核酸之載體。
  10. 一種如請求項1至7之單株抗體或該抗體片段之製造方法，其包括如下步驟：於培養基中培養如請求項9之細胞，並自培養液採集該單株抗體或該抗體片段。
  11. 一種Gas6之檢測或測定用試劑，其包含如請求項1至7之單株抗體或該抗體片段。
  12. 一種Gas6相關疾病之治療藥，其包含如請求項1至7之單株抗體或該抗體片段作為有效成分，其中Gas6相關疾病為腎或癌之疾病。
  13. 如請求項12之治療藥，其中腎之疾病為絲球體腎炎、糖尿病性腎病或IgA腎病。
  14. 如請求項12之治療藥，其中癌之疾病為肺癌、乳癌、卵巢癌、攝護腺癌、胰臟癌、腎癌或神經膠母細胞瘤。
  15. 一種Gas6相關疾病之診斷藥，其包含如請求項1至7之單株抗體或該抗體片段作為有效成分，其中Gas6相關疾病為腎或癌之疾病。
  16. 一種如請求項1至7中任一項之單株抗體或該抗體片段之用途，其用以製造Gas6相關疾病之治療藥，其中Gas6相關疾病為腎或癌之疾病。
  17. 一種如請求項1至7中任一項之單株抗體或該抗體片段之用途，其用以製造Gas6相關疾病之診斷藥，其中Gas6相關疾病為腎或癌之疾病。
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