KR20090029227A - 헤파린 결합 상피세포 증식 인자 유사 증식 인자에 결합하는 모노클로날 항체 - Google Patents

Abstract

HB-EGF가 항진하는 질환을 치료하기 위한 의약이 요구되고 있다. 본 발명에 따르면, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF에 결합하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편을 제공할 수 있다.

Description

헤파린 결합 상피세포 증식 인자 유사 증식 인자에 결합하는 모노클로날 항체{MONOCLONAL ANTIBODY CAPABLE OF BINDING TO HEPARIN-BINDING EPIDERMAL GROWTH FACTOR-LIKE GROWTH FACTOR}

본 발명은 세포막에 결합하고 있는 헤파린 결합 상피세포 증식 인자 유사 증식 인자(heparin binding epidermal growth factor-like growth factor, 이하 HB-EGF라 칭함), 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF에 결합하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편에 관한 것이다.

HB-EGF는 1992년에 도잔(東山) 등에 의해서, 대식세포로 분화된 인간 대식세포 유사 세포주 U-937의 배양 상청으로부터 정제, 단리되었다(비특허문헌 1). HB-EGF는 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor; EGF) 패밀리에 보존되어 있는 6개의 시스테인을 공유하고 있어, EGF 패밀리에 속하며, 또한 EGF 패밀리에 속하는 다른 단백질과 마찬가지로, I형 막단백질로서 합성된다(비특허문헌 1 및 2). 막형 HB-EGF는 열이나 침투압에 의한 스트레스, 증식 인자, 사이토카인 및 G 단백질 공역 수용체(GPCR) 작용물질인 리소포스파티드산(LPA) 등의 다양한 생리적 자극에 의해서 활성화된 메탈로프로테아제에 의해, 14∼22 킬로달톤(이하, kDa이라 기재함)의 분비형 HB-EGF로 변환된다(비특허문헌 1∼3). 분비형 HB-EGF는 EGF 수용 체(EGFR/ErbB1)(비특허문헌 1), ErbB4(비특허문헌 4) 및 N-알기닌 2염기 전환 효소(비특허문헌 5)에 결합하여, 선유아세포 또는 평활근세포(비특허문헌 1), 케라티노사이트(비특허문헌 6), 간세포(비특허문헌 7), 메산지움 세포(비특허문헌 8)에 대하여 증식 촉진 활성을 갖는다. 또한, 심장변 등의 기관 형성(비특허문헌 28, 29 및 31)이나 창상 치유(비특허문헌 9 및 10), 아테롬성 동맥경화증에서 생기는 평활근세포의 과형성(비특허문헌 11), 재협착(비특허문헌 12 및 13), 폐성 고혈압(비특허문헌 14), 간재생(비특허문헌 15), 뇌장해(비특허문헌 16)나 암(비특허문헌 28∼35)에 HB-EGF가 관여한다는 것 등도 알려져 있다.

한편, 세포 표면에는 상당량의 막형 HB-EGF가 분비형으로 절단되지 않는 채로 발현하고 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 17). 막형 HB-EGF는 세포 표면에서 CD9 등의 테트라스패닌이나 인테그린α3β1과 복합체를 형성하고 있음이 알려져 있으며, 근접분비(Juxtacrine) 증식 인자로서 근접하는 세포와 상호작용한다는 보고도 있다(비특허문헌 17∼22). 또한, Naglich 등은 막형 HB-EGF가 디프테리아 독소의 수용체로서 기능하여, 디프테리아 독소의 세포 내로의 진입에 관여하고 있음을 보고하고 있다(비특허문헌 23).

메카타(目加田) 등은 HB-EGF 녹아웃(KO) 마우스를 제작하여, HB-EGF의 생리적 기능을 해석한 결과, HB-EGF KO 마우스는 심실의 확장, 심기능의 저하 및 심장변 비대 증상을 보이고, 반수 이상이 생후 수일만에 사망하였다. 이것은 HB-EGF가 심장의 발달과 기능 유지에 필수적인 단백질임을 나타내고 있다(비특허문헌 24).

이어서 메카타 등은 프로테아제에 의한 절단 부위에 변이를 도입함으로써, 분비형으로 변환되지 않았던 HB-EGF(이하, HB^uc라 칭함) 및 막 관통 영역이 결손된 프로테아제 비의존적으로 분비되는 HB-EGF(이하, HB^△tm이라 부름)의, 2 종류의 유전자를 제작하였다. 각각의 HB-EGF 변이체를 발현하는 유전자 변형 마우스를 제작하여, 막형 및 분비형 HB-EGF의 생리적 기능을 해석하였다(비특허문헌 25). 그 결과, HB^uc 발현 마우스는 HB-EGF KO 마우스와 유사한 증상을 보였기 때문에, 분비형 HB-EGF가 활성형 단백질로서 기능하고 있다고 생각되었다. HB^△tm 발현 마우스는 신생아기 이전 또는 신생아기에 대부분이 사망하였다. 또한, 대립 유전자의 한쪽에만 변이를 도입한 HB^△tm/+ 마우스에서는 케라티노사이트의 과형성 및 신생아기부터 심실 비대가 인정되었다. 이들 증상은 HB-EGF KO 마우스나 HB^uc 발현 마우스와는 정반대의 표현형이었다. 디프테리아 독소의 변이체로서 알려져 있는 CRM197(비특허문헌 26)은 HB-EGF의 세포 증식 촉진 활성을 특이적으로 저해하고, 또 세포막을 투과하지 않는다. 이 CRM197이 HB^△tm 발현 마우스의 표현형인 과형성이나 심실 비대를 억제하므로, HB^△tm 발현 마우스에서 생성된 HB^△tm은 분비 전에 세포 내의 수용체에 결합하여 작용하는 것이 아니라, 세포 밖으로 분비된 후에 세포 표면의 수용체에 결합하여 작용하는 것이 추정되고 있다. 따라서, 생체 내의 막형 HB-EGF와 분비형 HB-EGF와의 양적 밸런스가 정상적인 생리 기능의 유지에 필수적이며, 또한 생체 내에서는 HB-EGF의 막형에서 분비형으로의 변환 프로세스가 제어되고 있다고 생각된 다.

도잔 등은 흉부 대동맥을 협착하여 심비대를 유발시킨 마우스에서, 심장 내의 분비형 HB-EGF 단백질이 증가함을 발견하고 있다. 이 마우스에게, 막형 HB-EGF를 분비형으로 변환하는 프로테아제를 저해하는 저분자 화합물을 투여하면, 심장에 있어서의 막형 HB-EGF의 분비형으로의 변환이 억제된 결과, 심비대가 억제됨을 보고하고 있다(비특허문헌 27).

지금까지, 유방암, 간암, 췌장암, 방광암 등 여러 가지 암에서, HB-EGF가 정상 조직과 비교하여 고발현하고 있음이 보고되고 있다(비특허문헌 28∼31). 또한, 최근 HB-EGF가 암의 증식에 중요한 인자임이 분명하게 되었다(비특허문헌 32 및 33). 메카타 등은 누드 마우스에게 인간 난소암 세포주를 이식하는 모델계에 있어서, HB-EGF의 소형 간섭 RNA(siRNA)를 암 세포주에 도입하는 것, 또는 암 세포주를 이식한 마우스에게 CRM197을 투여하는 것에 의해, 현저한 종양 증식 저해 효과가 인정된다는 것을 밝혔다. 또한, 도잔 등은 방광암의 세포주에 HB-EGF 유전자를 도입한 주에서, 시험관내(in vitro)에 있어서 세포 증식, 콜로니 형성능, 혈관 내피 증식 인자(VEGF) 발현 및 사이크린 D1 등의 발현이 증가한다는 것을 밝혔다. 또한, 생체내(in vivo)에 있어서도, 누드 마우스에 있어서의 조종양성(造腫瘍性)의 항진이나 종양 혈관 신생의 항진이 인정된다는 것을 보고하였다. 이러한 증식 촉진 작용은 막형 HB-EGF 또는 분비형 HB-EGF 유전자를 발현시킨 경우에만 인정되며, 프로테아제 저항성 막형 HB-EGF 유전자를 강제 발현시킨 경우에는 인정되지 않았다. 따라서, 분비형 HB-EGF는 난소암이나 방광암의 종양 증식에 관여하는 중요한 인자일 가능성이 시사되었다. 임상 환자의 HB-EGF 발현에 관해서는, 메카타 등이 난소암 환자의 종양 조직 중의 HB-EGF mRNA 발현량 및 복수 중의 분비형 HB-EGF 단백질 농도를 해석한 결과, EGF 패밀리 중에서 HB-EGF만이 발현 항진하고 있음을 보고하고 있다(비특허문헌 32). 또한 미야모토(宮本) 등은 종양의 HB-EGF mRNA가 고발현하고 있는 난소암 환자에게서는 저발현 환자와 비교하여 예후가 불량하다는 것을 보고하였다(비특허문헌 34). 이상의 결과는 적어도 난소암에 있어서, 암이 생산하는 분비형 HB-EGF가 자가분비 또는 측분비의 기서로, 암의 증식에 관여하고 있음을 보이고 있다(비특허문헌 35). 분비형 HB-EGF에 결합하여 활성을 저해하는 항체로서는 몇 개의 폴리클로날 항체와, 1종의 모노클로날 항체(모두 R&D사 제조)가 알려져 있다. 항HB-EGF 염소 폴리클로날 항체(R&D사 제조)는 COS-7 세포에서 발현시킨 세포 표면의 막형 HB-EGF에 결합하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 막형 단백질이 암 등의 세포 표면에 존재하는 경우, 그 단백질에 결합하는 모노클로날 항체가 그 세포의 증식을 저해하는 치료약으로 될 수 있음이 널리 알려져 있다(비특허문헌 36). 그러나, 분비형 HB-EGF, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF 및 막형 HB-EGF에 결합하는 모노클로날 항체에 관해서는 현재까지 보고가 없다.

비특허문헌 1: Science, Vol. 251, 936, 1991

비특허문헌 2: J. Biol. Chem. 267(1992) 6205-6212

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비특허문헌 9: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(1993) 3889-3893

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비특허문헌 13: J. Biol. Chem. 277(2002) 37487-37491

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비특허문헌 26: J. Biol. Chem., Vol. 270, 1015, 1995

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비특허문헌 33: Cancer Res., Vol. 64, 5283, 2004

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비특허문헌 36: Nat. Rev. Drug. Discov., Vol. 2, 52-62, 2003

[발명의 개시]

[발명이 해결하고자 하는 과제]

HB-EGF가 관여하는 질환을 치료하기 위한 의약이 요구되고 있다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명은 이하의 (1)∼(24)에 관한 것이다.

(1) 세포막에 결합하고 있는 헤파린 결합 상피세포 증식 인자 유사 증식 인자(heparin binding epidermal growth factor-like growth factor, 이하, HB-EGF라 칭함), 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(2) 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF의 상피증식 인자 유사 도메인(EGF 유사 도메인)에 결합하는 (1)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(3) 분비형 HB-EGF와 HB-EGF 수용체와의 결합을 저해하는 (1) 또는 (2)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(4) 분비형 HB-EGF에 대하여 중화 활성을 갖는 (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(5) 분비형 HB-EGF와, HB-EGF 수용체 또는 디프테리아 독소와의 결합 영역에 결합하는 (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(6) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 133번째, 135번째 및 147번째 중 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 (1)∼(5)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(7) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 133번째, 135번째 및 147번째의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 (6)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(8) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 141번째의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 (1)∼(5)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(9) 하이브리도마 KM3579(FERM BP-10491)가 생산하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 (1)∼(3), (5) 및 (8)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(10) 하이브리도마 KM3567(FERM BP-10573)이 생산하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 (1)∼(7) 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(11) 하이브리도마 KM3566(FERM BP-10490)이 생산하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 (1)∼(7) 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(12) 항체의 중쇄 가변 영역(이하, VH라 기재함)의 상보쇄 결정 영역(complementarity determining region, 이하 CDR이라 기재함)1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 12, 13 및 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 항체의 경쇄 가변 영역(이하, VL이라 기재함)의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 15, 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (1)∼(7) 및 (11) 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.

(13) 모노클로날 항체가 유전자 변형 항체인 (1)∼(12) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편.

(14) 유전자 변형 항체가 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 것인 (13)에 기재된 항체 또는 그 항체 단편.

(15) 인간형 키메라 항체의 VH가 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, VL이 (11)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 (14)에 기재된 인간형 키메라 항체 또는 그 항체 단편.

(16) 인간화 항체의 VH가, 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열의 9번째의 Ala을 Thr으로, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한,

인간화 항체의 VL이, 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열의 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 것인 (14)에 기재된 인간화 항체 또는 그 항체 단편.

(17) 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(diabody), 디설파이드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 (1)∼(16) 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편.

(18) (1)∼(17) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 코딩하는 DNA.

(19) (18)에 기재된 DNA를 함유하는 변형체 벡터.

(20) (19)에 기재된 변형체 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.

(21) (20)에 기재된 형질전환체를 배지에서 배양하고, 배양물 중에서 (1)∼(17) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 생성 축적시켜, 배양물로부터 그 항체 또는 그 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는 (1)∼(17) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편의 제조 방법.

(22) (1)∼(17) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 의약.

(23) (1)∼(17) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, HB-EGF가 관여하는 질환의 치료제.

(24) HB-EGF가 관여하는 질환이 암인 (23)에 기재된 치료제.

[발명의 효과]

본 발명에 따르면, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF에 결합하는 항체를 제공할 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

도 1a는 결합 ELISA에 있어서의 각종 항HB-EGF 모노클로날 항체의 반응성을 도시한다. 횡축에 각 항체의 농도를, 종축에 각 항체의 결합 활성을 나타낸다. ◇는 모노클로날 항체 KM511, ■는 모노클로날 항체 KM3566, △는 모노클로날 항체 KM3567, ▲은 모노클로날 항체 KM3579, ○는 모노클로날 항체 MAB259를 각각 나타낸다.

도 1b는 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3567, KM3579 및 MAB259의 HB-EGF-EGFR 결합 저해 활성을 나타낸다. 횡축에 각 항체의 농도를, 종축에 비오틴 표지 HB-EGF의 결합을 형광 강도로 나타낸다. 가로로 뻗은 실선은 비오틴 표지 HB-EGF 첨가, 항체 비첨가시의 형광 강도, 가로로 뻗은 점선은 비오틴 표지 HB-EGF 비첨가, 항체 비첨가시의 형광 강도를 나타낸다. △는 모노클로날 항체 KM3566, ×는 모노클로날 항체 KM3567, ●는 모노클로날 항체 KM3579, ■는 모노클로날 항체 MAB259를 각각 나타낸다.

도 2a는 각종 항HB-EGF 모노클로날 항체의 HB-EGF 중화 활성을 나타낸다. 횡축에 각 항체의 농도를, 종축에 증식 저해율(%)을 나타낸다. ◇는 모노클로날 항체 KM511, ■는 모노클로날 항체 KM3566, ▲는 모노클로날 항체 KM3579, ○는 모노클로날 항체 MAB259를 각각 나타낸다.

도 2b는 각종 항HB-EGF 모노클로날 항체의 HB-EGF 중화 활성을 나타낸다. 횡축에 각 항체의 농도를, 종축에 세포 증식을 나타낸다. HB-EGF(+)는 HB-EGF 첨가, 항체 비첨가시의 세포 증식, HB-EGF(-)는 HB-EGF 비첨가, 항체 비첨가시의 세포 증식을 나타낸다. □는 모노클로날 항체 MAB259, ■는 모노클로날 항체 KM3567, ▲는 모노클로날 항체 KM3566을 각각 나타낸다.

도 3은 FCM 해석에 있어서의 각종 항HB-EGF 모노클로날 항체의 반응성을 나타낸다. 횡축에 각 항체의 농도를, 종축에 평균 형광 강도 MFI 값을 나타낸다. ×는 모노클로날 항체 KM511, △는 모노클로날 항체 KM3566, □는 모노클로날 항체 KM3579, ○는 모노클로날 항체 MAB259를 각각 나타낸다.

도 4는 FCM 해석에 있어서의, MDA-MB-231 세포에 대한 각종 항HB-EGF 모노클로날 항체의 반응성을 나타낸다. 각 히스토그램의 실선은 음성 대조 항체 KM511, 파선은 각 항HB-EGF 항체를 나타낸다. (a) MAB529, (b) KM3566, (c) KM3567, (d) KM3579를 나타낸다.

도 5는 항HB-EGF 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX3566의 조성 공정을 도시한다.

도 6은 정제한 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 SDS-PAGE(5∼20% 구배 겔 사용)의 영동 패턴을 도시한다. 레인 1이 분자량 마커, 레인 2가 환원 조건하, 레인 3이 비환원 조건하에 있어서의 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966을 나타낸다.

도 7은 유세포 분석법에서의, 인간 고형암 세포주에 대한 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 반응성을 도시한다. 도면의 종축은 세포수를, 횡축은 형광 강도를 나타낸다.

도 8은 유세포 분석법에서의, 재조합 HB-EGF를 처리한 인간 고형암 세포주에 대한 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 반응성을 도시한다. 도면의 종축은 세포수를, 횡축은 형광 강도를 나타낸다.

도 9는 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 인간 HB-EGF에 대한 중화 활성을 도시한다. 도면의 종축은 생세포수를 나타내는 O.D 450 nm의 흡광도값을, 횡축은 항체 농도를 나타낸다. ■는 음성 대조 항체 인간 IgG, □는 KM3966을 나타낸다. HB-EGF(-)는 HB-EGF 비첨가, HB-EGF(+)는 HB-EGF 첨가를 나타낸다.

도 10은 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 인간 고형암 세포주에 대한 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)을 도시한다. 도면의 종축은 세포 상해 활성률(%)을, 횡축은 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 항체 농도를 나타낸다. 가로로 뻗은 직선은 항체 비첨가시의 세포 상해 활성을 나타낸다.

도 11은 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 초기암 모델에 있어서의 항종양 활성을 도시한다. 도면의 종축은 종양 체적을, 횡축은 암 세포 이식 후의 일수를 나타낸다. ●는 PBS 투여군, ○는 KM3966 10 mg/kg 투여군을 나타낸다. 바는 표준 편차를 나타낸다.

도 12는 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 진행암 모델에 있어서의 항종양 활성을 도시한다. 도면의 종축은 종양 체적을, 횡축은 암 세포 이식 후의 일수를 나타낸다. ●는 PBS 투여군, ○는 KM3966 10 mg/kg 투여군을 나타낸다. 바는 표준 편차를 나타낸다.

도 13은 유세포 분석법에서의 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566의 인간 혈액암 세포주에 대한 반응성을 도시한다. 도면의 종축은 세포수를, 횡축은 형광 강도를 나타낸다. A는 급성 골수성 백혈병 세포주, B는 T 세포성 백혈병 세포주를 나타낸다.

도 14는 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 인간 혈액암 세포주에 대한 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)을 도시한다. 도면의 종축은 세포 상해 활성률(%)을, 횡축은 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 항체 농도를 나타낸다. 가로로 뻗은 직선은 항체 비첨가시의 세포 상해 활성을 나타낸다.

도 15는 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3579 및 키메라 항체 KM3966의 변이 HB-EGF 발현 세포에 대한 반응성을 나타낸다. 도면의 종축은 각 항체의 반응성(%)을, 횡축은 변이 HB-EGF의 종류를 나타낸다.

[발명의 실시를 위한 최선의 형태]

본 발명에 있어서 막형 HB-EGF란, 세포막 관통 도메인을 가져서 세포막에 결합하고, 또한 신호 서열, 프로 영역, 헤파린 결합 도메인, EGF 유사 도메인, 막근접(juxtamembrane) 도메인, 세포질 도메인으로 구성되는 HB-EGF를 말한다. 구체적으로는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 또, 본 발명에 있어서 분비형 HB-EGF란, 막형 HB-EGF의 막 결합 부위가 프로테아제 등으로 절단된, EGF 유사 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 말한다. 구체적으로는 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF란, 분비형 HB-EGF가 그 헤파린 결합 활성 및 정전기적 결합 활성 등에 의해서 세포막 표면에 결합하고 있는 HB-EGF를 말한다.

세포막에 있어서, 분비형 HB-EGF가 결합하는 물질로서는, 세포막 상에 존재하고 분비형 HB-EGF가 결합하는 물질이라면 어떠한 것이라도 좋지만, 구체적으로는 다당류, 보다 바람직하게는 글리코사미노글리칸을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 헤파란황산 등을 들 수 있다.

HB-EGF는 디프테리아 독소, EGF 수용체 ErbB1 또는 ErbB4와 결합하는 활성을 갖는다.

막형 HB-EGF로서는 하기 (a), (b), (c)의 단백질 등을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;

(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 디프테리아 독소가 결합하는 활성을 갖는 단백질;

(c) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 디프테리아 독소가 결합하는 단백질;

또한, 분비형 HB-EGF로서는 하기 (a), (b), (c)의 단백질 등을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 3, 4 또는 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;

(b) 서열 번호 3, 4 또는 5로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, EGF 수용체 ErbB1 또는 ErbB4가 결합하는 활성을 갖는 단백질;

(c) 서열 번호 3, 4 또는 5로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, EGF 수용체 ErbB1 또는 ErbB4가 결합하는 단백질;

서열 번호 2, 3, 4 또는 5로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 디프테리아 독소 또는 EGF 수용체 ErbB1 또는 ErbB4가 결합하는 단백질이란, 문헌[Molecular Cloning 제2판, Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)], 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985)] 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여, 예컨대 서열 번호 2, 3, 4 또는 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA에, 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있는 단백질을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상이며 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지된 기술에 의해, 결실, 치환, 또는 부가할 수 있는 정도의 수이며, 예컨대, 1∼수십개, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개이다.

또한, 서열 번호 2, 3, 4 또는 5로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 지니고, 또한, 디프테리아 독소, EGF 수용체 ErbB1 또는 ErbB4가 결합하는 단백질이란, 서열 번호 2, 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 지니고, 또한, 디프테리아 독소, EGF 수용체 ErbB1 또는 ErbB4가 결합하는 활성을 갖는 단백질이다.

상동성 수치는 특별히 명시한 경우를 제외하고, 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 이용하여 산출되는 수치이며, 염기 서열에 관해서는 BLAST[Journal of Molecular Biology, 215, 403(1990)]에 있어서 디폴트 파라미터를 이용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다. 아미노산 서열에 대해서는, BLAST2[Nucleic Acid Res., 25, 3389(1997)]; 문헌[Genome Res., 7, 649(1997)]; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/infomation3.html에 있어서 디폴트 파라미터를 이용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다. 디폴트 파라미터로서는, G(Cost to open gap)가 염기 서열의 경우에는 5, 아미노산 서열의 경우에는 11, -E(Cost to extend gap)가 염기 서열의 경우에는 2, 아미노산 서열의 경우에는 1, -q(penalty for nucleotide mismatch)가 -3, -r(reward for nucleotide match)이 1, -e(expect value)가 10, -W(wordsize)가 염기 서열의 경우에는 11 잔기, 아미노산 잔기의 경우에는 3 잔기, -y(Dropoff(X) for blast extensions in bits)가 blastn의 경우에는 20, blastn 이외의 프로그램에서는 25이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastcgihelp.html). 또한, 아미노산 서열의 해석 소프트로서는 FASTA[Methods in Enzymology, 183, 63(1990)] 등도 들 수 있다.

본 발명의 항체는 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF에 결합하는 모노클로날 항체이며, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF의 상피 증식 인자 유사 도메인(EGF 유사 도메인)에 결합하는 모노클로날 항체를 포함한다.

EGF 유사 도메인이란, 구체적으로는 서열 번호 4 또는 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.

이 EGF 유사 도메인에 결합하는 모노클로날 항체란, 분비형 HB-EGF와 HB-EGF 수용체와의 결합을 저해하는 모노클로날 항체를 포함한다.

분비형 HB-EGF와 HB-EGF 수용체의 결합을 저해하는 항체로서는, 분비형 HB-EGF와, HB-EGF 수용체 또는 디프테리아 독소와의 결합 영역에 결합하는 모노클로날 항체 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체는 분비형 HB-EGF에 대하여 중화 활성을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명에 있어서 중화 활성으로는, 분비형 HB-EGF의 생물 활성을 억제하는 활성을 말하며, 예컨대, HB-EGF 수용체가 발현하고 있는 세포의 세포 증식을 억제하는 활성 등을 들 수 있다.

본 발명 항체의 구체적인 예로서는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산을 갖는 폴리펩티드의 115번째부터 147번째의 아미노산 중 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체, 바람직하게는 133번째부터 147번째 중 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체, 보다 바람직하게는 115번째, 122번째, 124번째, 125번째, 127번째, 129번째, 133번째, 135번째, 141번째 및 147번째의 아미노산 중 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체, 더욱 바람직하게는 133번째, 135번째 및 147번째의 아미노산 중 적어도 133번째 및 135번째의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체, 가장 바람직하게는 133번째, 135번째 및 147번째의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 등을 들 수 있다.

더욱 구체적으로는, 하이브리도마 KM3566(FERM BP-10490), 하이브리도마 KM3567(FERM BP-10573)이 생산하는 모노클로날 항체 및 하이브리도마 KM3579(FERM BP-10491)가 생산하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체가 본 발명의 항체로서 예시된다.

중화 활성을 갖는 항체의 구체적인 예로서는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산을 갖는 폴리펩티드의 133번째, 135번째 및 147번째의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마가 생산하는 항체, 유전자 변형 항체 등을 들 수 있다.

하이브리도마란, 인간 이외의 포유동물에 항원을 면역하여 취득된 B 세포와, 마이엘로마 세포를 세포 융합시켜 얻어지는 원하는 항원 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 세포를 말한다.

유전자 변형 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 이들의 항체 단편 등, 유전자 변형에 의하여 제조되는 항체를 포함한다. 유전자 변형 항체에 있어서, 모노클로날 항체의 특징을 지니고, 항원성이 낮으며, 혈중 반감기가 연장된 것은 치료약으로서 바람직하다.

본 발명의 유전자 변형 항체의 구체적인 예로서는, 항체의 VH의 CDR1, CDR2및 CDR3이 각각 서열 번호 12, 13 및 14로 각각 표시되는 아미노산 서열 및 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 15, 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 유전자 변형 항체를 들 수 있다.

본 발명의 유전자 변형 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 그 항체 단편 등, 유전자 변형에 의하여 제조되는 항체를 포함한다.

인간형 키메라 항체는 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL과 인간 항체의 중쇄 정상 영역(이하, CH라 표기함) 및 경쇄 정상 영역(이하, CL이라 표기함)으로 이루어지는 항체를 말한다.

본 발명의 인간형 키메라 항체는 다음과 같은 식으로 제작할 수 있다. 우선, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 분비형 HB-EGF 및 막형 HB-EGF에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터, VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득한다. 취득한 cDNA를, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입하여 발현시킴으로써, 인간형 키메라 항체를 제조할 수 있다.

인간형 키메라 항체의 CH로서는 인간 면역글로불린(이하, hIg라 표기함)에 속하면 어떠한 것이라도 좋지만, hIgG 클래스인 것이 적합하며, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4와 같은 서브클래스 중 어느 것이나 이용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋으며, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 이용할 수 있다.

본 발명의 인간형 키메라 항체로서는, 구체적으로는 항체의 VH가 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열 및 항체의 VL이 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체 등을 들 수 있다. 또한, 항체의 VH가 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열 및 항체의 VL이 서열 번호 10으로 표시되는 인간형 키메라 항체의 구체적인 예로서는 인간형 키메라 항체 KM3966 등을 들 수 있다.

인간화 항체는 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 말하며, CDR 이식 항체, 재구성 항체(reshaped-antibody) 등이라고도 말한다.

본 발명의 인간화 항체는 다음과 같은 식으로 제작할 수 있다. 우선, 하이브리도마가 생산하는, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 분비형 HB-EGF 및 막형 HB-EGF에 결합하는, 인간 이외 동물의 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을, 임의의 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임워크(이하, FR이라 기재함)에 이식한 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 제작한다. 제작한 cDNA를, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축한다. 이어서, 제작한 인간화 항체 발현 벡터를 동물 세포에 도입하여 인간화 항체를 발현시킴으로써, 인간화 항체를 제조할 수 있다.

인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열은 인간 항체 유래의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열이라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, Protein Data Bank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 또는 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)] 등에 기재된 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열 등이 이용된다.

인간화 항체의 CH로서는, hIg에 속하면 어떠한 것이라도 좋지만, hIgG 클래스인 것이 적합하며, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4와 같은 서브클래스 중 어느 것이나 이용할 수 있다. 또한, 인간화 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋으며, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 이용할 수 있다.

본 발명의 인간화 항체로서는, 구체적으로는 항체의 VH가 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala, 20번째의 Val, 30번째의 Thr, 38번째의 Arg, 41번째의 Pro, 48번째의 Met, 67번째의 Arg, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 95번째의 Tyr 및 118번째의 Val으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu, 19번째의 Ala, 21번째의 Ile, 49번째의 Pro 및 84번째의 Leu으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 각각 포함하는 인간화 항체 등을 들 수 있는데, 도입되는 개변의 수에 특별한 제한은 없다.

예컨대, 항체의 VH의 아미노산 서열에 관해서는, 항체의 VH가 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 20번째의 Val, 30번째의 Thr, 38번째의 Arg, 48번째의 Met, 67번째의 Arg, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 95번째의 Tyr 및 118번째의 Val이, 바람직하게는 항체의 VH가 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 20번째의 Val, 30번째의 Thr, 48번째의 Met, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 95번째의 Tyr 및 118번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체,

바람직하게는 30번째의 Thr, 48번째의 Met, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 95번째의 Tyr이, 바람직하게는 30번째의 Thr, 48번째의 Met, 68번째의 Val, 70번째의 Ile이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체,

바람직하게는 30번째의 Thr, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 95번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체,

바람직하게는 30번째의 Thr, 68번째의 Val, 70번째의 Ile이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체,

바람직하게는 30번째의 Thr, 70번째의 Ile이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체 등을 들 수 있다.

표시된 상기한 아미노산 개변의 결과 얻어지는 항체 VH의 아미노산 서열로서는, 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로, 20번째의 Val를 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.

11개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.

10개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

9개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 및 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

8개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열,

20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 및

20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

7개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 및 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

6개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 및 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

5개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 및 30번째의 Thr을 Arg으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

4개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 및 30번째의 Thr을 Arg으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Lue으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

3개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 30번째의 Thr을 Arg으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ala을 Thr으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 및 30번째의 Thr을 Arg으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

2개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 30번째의 Thr을 Arg으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ala을 Thr으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Leu으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 41번째의 Pro을 Thr으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 48번째의 Met을 Ile으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 67번째의 Arg을 Lys으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 70번째의 Ile을 Leu으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ala을 Thr으로, 30번째의 Thr을 Arg으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 41번째의 Pro을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로 48번째의 Met을 Ile으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로 67번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로 68번째의 Val을 Ala으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 및 30번째의 Thr을 Arg으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

1개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 9번째의 Ala을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Thr을 Arg으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 41번째의 Pro을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 48번째의 Met을 Ile으로 치환한 아미노산 서열, 67번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 68번째의 Val을 Ala으로 치환한 아미노산 서열, 70번째의 Ile을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열 및 118번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.

항체의 VL에 관해서는, 예컨대 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열중의 15번째의 Leu, 19번째의 Ala, 21번째의 Ile 및 84번째의 Leu이 치환된 아미노산 서열을 들 수 있다.

바람직하게는 19번째의 Ala, 21번째의 Ile 및 84번째의 Leu이 치환된 아미노산 서열을 들 수 있다.

상기한 아미노산 개변의 결과 얻어지는 VL의 아미노산 서열로서는, 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.

5개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

4개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 및 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

3개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 49번째의 Pro을 Ser으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로 치환한 아미노산 서열, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 19번째의 Ala을 Val으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 및 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

2개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 49번째의 Pro을 Ser으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Leu을 Val으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로 치환한 아미노산 서열, 19번째의 Ala을 Val으로, 49번째의 Pro을 Ser으로 치환한 아미노산 서열, 19번째의 Ala을 Val으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로 치환한 아미노산 서열, 21번째의 Ile을 Met으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 및 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

1개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 중의 15번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 19번째의 Ala을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 21번째의 Ile을 Met으로 치환한 아미노산 서열, 49번째의 Pro을 Ser으로 치환한 아미노산 서열, 및 84번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 인간화 항체의 구체적인 예로서는, 가변 영역이 서열 번호 22 및 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 등을 들 수 있다.

인간 항체란, 원래 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다. 인간 체내에 존재하는 항체는, 예컨대 인간 말초혈 림프구를 단리하여, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화(不死化)하고 클로닝함으로써, 그 항체를 생산하는 림프구를 단리하여 배양할 수 있고, 배양 상청 중에서 그 항체를 정제할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리는 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 이 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 표면에 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 상기 항체 단편은 또한 유전자 공학적 수법에 의해 2 가닥의 완전한 H쇄 및 2 가닥의 완전한 L쇄로 이루어지는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물은 인간 항체 유전자가 숙주 동물의 게놈 유전자에 삽입된 동물을 의미한다. 구체적으로는, 예컨대 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하여, 그 ES 세포를 마우스의 초기 배(胚)에 이식한 후 발생시킴으로써 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 제작할 수 있다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법은 통상의 인간 이외의 동물에서 이루어지고 있는 하이브리도마 제작 방법에 의해 인간 항체 생산 하이브리도마를 취득하고 배양함으로써, 배양 상청 중에 인간 항체를 생성 축적시킬 수 있다.

상술한 항체 또는 항체 단편을 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가, 치환 또는 삽입되고, 또한 상술한 항체 또는 그 항체 단편과 동일한 활성을 갖는 항체 또는 그 항체 단편도 본 발명의 항체 또는 그 항체 단편에 포함된다.

결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상이며 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 문헌[Molecular Cloning 제2판, Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)], 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982), USA, 79, 6409(1982)], 문헌[Gene, 34, 315(1985)], 문헌[Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)], 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488(1985)] 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지된 기술에 의해, 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이다. 예컨대, 1∼수십개, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개이다.

상기한 항체의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되었다는 것은 다음을 나타낸다. 동일 서열 중의 임의, 또 하나 또는 복수의 아미노산 서열 중에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있음을 의미한다. 또한, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 생기는 경우도 있으며, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형의 어느 경우나 있다. 천연형 아미노산 잔기로는 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소루신, L-루신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 및 L-시스테인 등을 들 수 있다.

이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 바람직한 예를 나타낸다. 동일 군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다.

A군: 루신, 이소루신, 노르루신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌

B군: 아스파라긴산, 글루탐산, 이소아스파라긴산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산

C군: 아스파라긴, 글루타민

D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산

E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린

F군: 세린, 트레오닌, 호모세린

G군: 페닐알라닌, 티로신

본 발명의 항체 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, 디아바디(diabody), dsFv 등을 들 수 있다.

Fab는 IgG형 항체 분자를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어진다. 이 단편 중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단됨), H쇄의 N 말단측 약 반과 L쇄 전체가 디설파이드 결합으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Fab는 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 그 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써, Fab를 발현시켜 제조할 수 있다.

F(ab')₂는 IgG형 항체 분자를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기로 절단됨), Fab가 힌지 영역의 디설파이드 결합을 통해 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 F(ab')₂는 항체를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻을 수 있다. 또는 하기 Fab'을 티오에테르 결합 또는 디설파이드 결합시켜 제작할 수 있다.

Fab'는 상기 F(ab')₂의 힌지 영역의 디설파이드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Fab'는 F(ab')₂를 환원제 디티오트레이톨 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 상기 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 Fab'을 발현시켜 제조할 수 있다.

scFv는 1 가닥의 VH와 1 가닥의 VL을 적당한 펩티드 링커(이하, P라 표기함)를 이용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 본 발명의 scFv는 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 그 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 scFv를 발현시켜 제조할 수 있다.

디아바디는 scFv가 이량체화한 항체 단편으로, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성은 동일하게 할 수도 있고, 한쪽을 다른 항원 결합 활성으로 할 수도 있다. 본 발명의 디아바디는 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, scFv를 코딩하는 DNA를 링커의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하고, 그 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 디아바디를 발현시켜 제조할 수 있다.

dsFv는 VH 및 VL 중 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 그 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는 Reiter 등에 의해 알려진 방법(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)에 따라서 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다. 본 발명의 dsFv는 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, dsFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 그 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 dsFv를 발현시켜 제조할 수 있다.

상술한 항체 또는 그 항체 단편에 방사성 동위원소, 단백질 또는 약제를 결합시킨 항체의 유도체도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 항체의 유도체는 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항체 단편의, H쇄 또는 L쇄의 N 말단측 또는 C 말단측, 항체 중의 적당한 치환기 또는 측쇄, 나아가서는 항체 중의 당쇄에 약제를 화학적 수법(항체공학입문, 가네미츠 오사무(金光修)저, (주)치진쇼칸, 1994)에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.

또는, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항체 단편을 코딩하는 DNA와, 결합시키고 싶은 단백질 등의 약제를 코딩하는 DNA를 연결시켜 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 숙주 세포에 도입한다고 하는 유전자 공학적 수법에 의해서도 제조할 수 있다.

약제로서는 화학요법제, 항체 의약, 사이토카인 등의 면역부활제, 방사성 동위원소, 면역보강제 등을 들 수 있다.

또한, 항체 또는 그 항체 단편에 결합시키는 약제는 프로드러그의 형태라도 좋다. 본 발명에 있어서의 프로드러그란, 종양 환경에 존재하는 효소 등에 의해서 화학적인 수식을 받아, 암 세포를 상해하는 작용을 갖는 물질로 변환되는 약제를 말한다.

화학요법제로는, 알킬화제, 니트로소우레아제, 대사길항제, 항암성 항생 물질, 식물 유래 알카로이드, 토포이소머라아제 저해제, 호르몬 요법제, 호르몬 길항제, 아로마타제 저해제, P당단백 저해제, 백금 착체 유도체, M기 저해제, 키나제 저해제 등의 어떠한 화학요법제도 포함된다. 화학요법제로는, 아미포스틴(에틸올), 시스플라틴, 다카르바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민(질소 머스터드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소루비신(아드리아마이신), 독소루비신 리포(독실), 에피루비신, 겜시타빈(겜자르), 다우노루비신, 다우노루비신 리포(다우노좀), 프로카르바진, 마이토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 다우노마이신, 페프로마이신, 에스트라무스틴, 파클리탁셀(택솔), 도세탁셀(택소티어), 알데스류킨, 아스파라기나제, 부설판, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, CPT-11, 10-히드록시-7-에틸-캄프토테신(SN38), 플록스우리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸, 노기테칸, 미토산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜파란, 머캅토퓨린, 히드록시카르바미드, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 스트렙토조신, 태목시펜, 고세렐린, 류프롤레닌, 플루타미드, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스터드, 비노렐빈, 클로람부실, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 빈데신, 니무스틴, 세무스틴, 캡사이타빈, 토무덱스, 아자시티딘, UFT, 옥살로플라틴, 게피티닙(이레사), 이마티닙(STI571), 엘로티닙, Flt3 저해제, 혈관 내피세포 성장 인자 수용체(vascular endothelial growth facotr receptor; VEGFR) 저해제, 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor; FGFR) 저해제, EGFR 저해제(이레사, 타르세바 등) 라디시콜, 17-알릴아미노-17-디메톡시겔다나마이신, 라파마이신, 암사크린, 올-트랜스레티노인산, 살리드마이드, 아나스트로졸, 파드로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 골드 티오말레이트, D-페니실라민, 부실라민, 아자티오푸린, 미조리빈, 시클로스포린, 라파마이신, 히드로콜티존, 벡사로텐(타그레틴), 태목시펜, 덱사메타존, 프로게스틴류, 에스트로겐류, 아나스트로졸(아리미덱스), 류프린, 아스피린, 인도메타신, 셀레콕시브, 아자티오푸린, 페니실라민, 골드 티오말레이트, 말레인산클로로페닐아민, 클로로페닐아민, 클레마시틴, 트레티노인, 벡사로텐, 비소, 보르테조밉, 알로프리놀, 겜투주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 131토시투테맙, 타그레틴, ONTAK, 오조가민, 클라리스로마이신, 류코보린, 이파스파미드, 케토코나졸, 아미노글루테티미드, 수라민 및 메토트렉세이트 등을 들 수 있다.

화학요법제와 항체를 결합시키는 방법으로서는, 글루타르알데히드를 통해 화학요법제와 항체의 아미노기 사이를 결합시키는 방법, 수용성 카르보디이미드를 통해 화학요법제의 아미노기와 항체의 카르복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.

항체 의약으로서는, 항체의 결합에 의해 아폽토시스가 유도되는 항원에 대한 항체, 또는 종양 세포의 증식이나 전이 등, 종양의 병태 형성에 관련한 항원에 대한 항체 이외에, 면역 기능을 조절하는 항체, 병변 부위의 혈관 신생을 저해하는 항체 등을 들 수 있다.

항체의 결합에 의해 아폽토시스가 유도되는 항원으로서는, 분화 클러스터(Cluster of differentiation; 이하, CD)19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86(B7.2), 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen; HLA)-클래스 II, EGFR 등을 들 수 있다.

면역 기능을 조절하는 항체의 항원으로서는, CD4, CD40, CD40 리간드, B7 패밀리 분자(CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, B7-H4), B7 패밀리 분자의 리간드(CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, BTLA), OX-40, OX-40 리간드, CD137, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor; TNF) 수용체 패밀리 분자(DR4, DR5, TNFR1, TNFR2), TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드 수용체(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor; TRAIL) 패밀리 분자, TRAIL 패밀리 분자의 수용체 패밀리(TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4), 핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 활성화제(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand; RANK)), RANK 리간드, CD25, 엽산 수용체 4, 사이토카인[인터루킨-1α(이하, 인터루킨이라 기재함), IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, 변형 성장 인자(transforming growth factor; TGF) β, TNFα 등], 이들 사이토카인의 수용체, 케모카인(SLC, ELC, I-309, TARC, MDC, CTACK 등), 이들 케모카인의 수용체가 바람직하다.

병변 부위의 혈관 신생을 저해하는 항체의 항원으로서는, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴(Angiopoietin), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor; FGF), EGF, 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor; PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor; IGF), 에리트로포이에틴(erythropoietin; EPO), TGFβ, IL-8, 에필린(Ephilin), SDF-1 등 및 이들의 수용체를 들 수 있다.

면역부활제로서는, NK세포, 대식세포, 호중구 등의 세포를 항진하는 사이토카인이라면 어떠한 것이라도 좋지만, 구체적인 예로는, 인터페론(이하, INF라고 기재함)-α, INF-β, INF-γ, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 과립구 자극 인자(G-CSF), 과립구·대식세포 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 자극 인자(M-CSF) 등을 들 수 있다. 또한, 면역부활제로서 알려져 있는 천연물이라도 좋으며, 구체적인 예로는 면역을 항진하는 약제가, β(1→3)글루칸(레티난, 시조피란), α 갈락토실세라미드(KRN7000), 균체 분말(피시바닐, BCG), 균체 추출물(크레스틴)을 들 수 있다. 방사성 동위원소로서는, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ⁶⁴Cu, ¹⁹⁹Tc, ⁷⁷Lu, ²¹¹At 등을 들 수 있다. 방사성 동위원소는 클로라민 T법 등에 의해서 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 방사성 동위원소를 킬레이트하는 물질을 항체에 결합시키더라도 좋다. 킬레이트제로서는, 메틸벤질디에틸렌-트리아민펜타아세트산(methylbenzyldiethylene-triaminepentaacetic acid; MX-DTPA) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서는, 본 발명의 항체와 하나 이상의 다른 약제를 조합하여 투여하거나 또는 방사선 조사를 조합시킬 수도 있다. 다른 약제로서는 상술한 화학요법제, 항체 의약, 사이토카인 등의 면역부활제 등이 포함된다.

항체 의약으로는 상기한 표적이 될 수 있는 항원에 대한 항체를 들 수 있으며, 예컨대 EGFR 항체(Cetuximab, Panitumumab, Matuzumab 등) 등도 들 수 있다.

방사선 조사로는 X선, γ선 등의 광자(전자파) 조사, 전자선, 양자선, 중입자선 등의 입자선 조사 등이 포함된다.

조합하여 투여하는 방법으로는, 본 발명의 항체와의 동시 투여라도 좋고, 또, 본 발명 항체의 투여와 전후하여 투여하더라도 상관없다.

이하에 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 유전자 변형 항체의 제조 방법

(1) 항원의 조제

분비형 HB-EGF 또는 분비형 HB-EGF의 부분 길이(이하, 이들을 단순히 분비형 HB-EGF라 부르는 경우도 있음)를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등에 도입하여 발현시킴으로써, 분비형 HB-EGF 또는 분비형 HB-EGF의 부분 단편을 얻을 수 있다. 또한, HB-EGF를 발현하고 있는 세포로부터, 프로테아제 처리함으로써 세포외 영역의 HB-EGF를 정제할 수 있다. 분비형 HB-EGF를 다량으로 발현하고 있는 각종 인간 종양 배양 세포, 인간 조직 등으로부터 분비형 HB-EGF를 정제할 수도 있다. 또한, 분비형 HB-EGF의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드를 조제하여 항원에 이용할 수도 있다.

구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 분비형 HB-EGF로서는, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 또는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)] 등에 기재된 방법 등을 이용하여, 예컨대 이하의 방법에 의해, 이것을 코딩하는 DNA를 숙주 세포 내에서 발현시켜 제조할 수 있다.

우선, 전체 길이 cDNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 변형 벡터를 제작한다. 이때 혹시 필요하면, 전체 길이 cDNA를 기초로 하여 HB-EGF를 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제하여, 상기 전체 길이 cDNA 대신에 상기 DNA 단편을 사용하더라도 좋다. 이어서, 상기 변형 벡터를 그 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, HB-EGF를 생산하는 형질전환체를 얻을 수 있다.

숙주 세포로서는, 대장균, 동물 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 어느 것이나 이용할 수도 있다.

발현 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포에 있어서 자율 복제가 가능하거나 또는 염색체 내에 삽입할 수 있고, 분비형 HB-EGF를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 적당한 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다.

대장균 등의 원핵생물을 숙주 세포로서 이용하는 경우에는, 본 발명에 있어서 이용되는 HB-EGF를 코딩하는 DNA를 함유하는 변형 벡터는 원핵생물 중에서 자율 복제가 가능한 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 본 발명에 있어서 이용되는 DNA 및 전사 종결 서열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 이 변형 벡터는 또한 프로모터를 제어하는 유전자를 포함하고 있더라도 좋다.

발현 벡터로서는, 예컨대 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(모두 Roche Diagnostics사 제조), pKK233-2(Pharmacia사 제조), pSE280(Invitrogen사 제조), pGEMEX-1(Promega사 제조), pQE-8(QIAGEN사 제조), pKYP10(일본 특허 공개 소58-110600), pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669(1984)], pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], pBluescript II SK(-)(Stratagene사 제조), pTrs30[대장균 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)로 조제], pTrs32[대장균 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로 조제], pGHA2[대장균 IGHA2(FERM BP-400)로 조제, 일본 특허 공개 소60-221091], pGKA2[대장균 IGKA2(FERM BP-6798)로 조제, 일본 특허 공개 소60-221091], pTerm2(US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392(1990)], pGEX(Pharmacia사 제조), pET 시스템(Novagen사 제조), pME18SFL3 등을 들 수 있다.

프로모터로서는, 사용하는 숙주 세포 내에서 기능을 발휘할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 좋다. 예컨대, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터, T7 프로모터 등의, 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터를 예로 들 수 있다. 또한, Ptrp를 2개 직렬시킨 탠덤 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터, let I 프로모터 등과 같이, 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 이용할 수 있다.

또한, 상기 변형 벡터로서는, 리보솜 결합 서열인 샤인·달가노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈과의 사이를 적당한 거리(예컨대 6∼18 염기)로 조절한 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 이용되는 분비형 HB-EGF를 코딩하는 DNA의 염기 서열에 있어서는, 숙주 내에서의 발현에 최적인 코돈이 되도록 염기를 치환할 수 있으며, 이로써, 목적으로 하는 분비형 HB-EGF의 생산율을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 변형 벡터에 있어서의 유전자의 발현에는 전사 종결 서열은 반드시 필요하지는 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.

숙주 세포로는, 에스케리치아속 등에 속하는 미생물, 예컨대 대장균 XL1-Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 DH5α, 대장균 BL21(DE3), 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No. 49, 대장균 W3110, 대장균 NY49 등을 들 수 있다.

변형 벡터의 도입 방법으로는, 상기 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 어느 것이나 이용할 수 있으며, 예컨대, 칼슘 이온을 이용하는 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)], 문헌[Gene, 17, 107(1982)] 또는 문헌[Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서 예컨대 pcDNAI, pcDM8(후나코시사에서 시판), pAGE107[일본 특허 공개 평3-22979; Cytotechnology, 3, 133,(1990)], pAS3-3(일본 특허 공개 평2-227075), pCDM8[Nature, 329, 840,(1987)], pcDNAI/Amp(Invitrogen사 제조), pREP4(Invitrogen사 제조), pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307(1987)], pAGE210, pME18SFL3 등을 들 수 있다.

프로모터로서는, 동물 세포 내에서 기능을 발휘할 수 있는 것이라면 어느 것이나 이용할 수 있으며, 예컨대, 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 열충격 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 이용하더라도 좋다.

숙주 세포로서는, 인간의 세포인 나말와(Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈 햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637(일본 특허 공개 소63-299) 등을 들 수 있다.

변형 벡터의 도입 방법으로는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 어느 것이나 이용할 수 있으며, 예컨대, 일렉트로포레이션법[Cytotechnology, 3, 133(1990)], 인산칼슘법(일본 특허 공개 평2-227075), 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.

유전자의 발현 방법으로는, 직접 발현 이외에, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다. 진핵생물 유래의 세포에서 발현시킨 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 분비형 HB-EGF를 얻을 수 있다.

이상과 같이 하여 얻어지는 형질전환체를 배지에서 배양하여, 배양물 중에서 그 HB-EGF를 생성 축적시켜, 상기 배양물로부터 채취함으로써, 분비형 HB-EGF를 제조할 수 있다. 상기 형질전환체를 배지에서 배양하는 방법은 숙주의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 이용한 변형 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라서 유도 물질을 배지에 첨가하더라도 좋다. 예컨대, lac 프로모터를 이용한 변형 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 이용한 변형 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가하더라도 좋다.

동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)], Eagle의 MEM 배지[Science, 122, 501(1952)], 둘베코 개변 MEM 배지[Virology, 8, 396(1959)], 199 배지[Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다. 배양은 통상 pH 6∼8, 30∼40℃, 5% CO₂ 존재하 등의 조건하에서 1∼7일간 행한다. 또한, 배양 중에 필요에 따라서, 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가하더라도 좋다.

상기한 대로, 본 발명에 있어서 이용되는 분비형 HB-EGF를 코딩하는 DNA를 삽입한 변형 벡터를 보유하는 미생물, 동물 세포 등에서 유래하는 형질전환체를, 통상의 배양 방법에 따라서 배양하여 상기 HB-EGF를 생성 축적시키고, 그 배양물로부터 채취함으로써, 본 발명에 있어서 이용되는 분비형 HB-EGF를 제조할 수 있다.

유전자의 발현 방법으로는, 직접 발현 이외에, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.

분비형 HB-EGF의 생산 방법으로는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 밖으로 분비시키는 방법 및 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있으며, 사용하는 숙주 세포 또는 생산시키는 분비형 HB-EGF의 구조를 바꿈으로써 적절한 방법을 선택할 수 있다.

분비형 HB-EGF가 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴손 등의 방법[J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)], 또는 일본 특허 공개 평05-336963, WO 94/23021 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 그 유전자 산물을 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

또한, 일본 특허 공개 평2-227075에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디히드로엽산 환원 효소 유전자 등을 이용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다. 분비형 HB-EGF는 예컨대 다음과 같은 식으로 단리·정제할 수 있다. 분비형 HB-EGF가 세포 내에 용해 상태로 발현된 경우에는, 배양 종료 후에 세포를 원심분리에 의해 회수하여, 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치프레스, 만톤가우린 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 이 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 효소의 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 유안 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미츠비시가가쿠사 제조) 등의 레진을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로스 FF(Pharmacia사 제조) 등의 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 레진을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독으로 또는 조합해서 이용하여 정제 표품을 얻을 수 있다.

또한, 분비형 HB-EGF가 세포 내에 불용체를 형성하여 발현한 경우에는, 마찬가지로 세포를 회수한 후 파쇄하고, 원심분리를 함으로써, 침전 분획으로서 상기 HB-EGF의 불용체를 회수한다. 회수한 상기 단백질의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 그 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 상기 단백질을 정상적인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 같은 단리 정제법에 의해 분비형 HB-EGF의 정제 표품을 얻을 수 있다.

분비형 HB-EGF 또는 그 당 수식체 등의 유도체가 세포 밖으로 분비된 경우에는, 배양 상청에 있어서 상기 HB-EGF 또는 그 당 수식체 등의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 상기 배양물을 상기와 같은 원심분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 가용성 분획을 취득하여, 그 가용성 분획으로부터 상기와 같은 단리 정제법을 이용함으로써, 정제 표품을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 이용되는 분비형 HB-EGF는 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, Advanced ChemTech사, 퍼킨·엘머사, Pharmacia사, Protein Technology Instrument사, Synthecell-Vega사, PerSeptive사, 시마즈세이사쿠쇼 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

(2) 동물의 면역과 항체 생산 세포의 조제

3∼20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터에 상기한 바와 같이 조제한 항원을 면역하여, 그 동물의 비장, 림프절, 말초혈 중의 항체 생산 세포를 채취한다. 또한, 면역원성이 낮고 상기한 동물로 충분한 항체가의 상승이 인정되지 않는 경우에는 HB-EGF 녹아웃 마우스를 피면역 동물로서 이용하는 방법도 있다.

면역은 동물의 피하 또는 정맥내 또는 복강내에, 적당한 어쥬번트[예컨대, 프로인트의 완전 어쥬번트(Complete Freund's Adjuvant)나 수산화알루미늄 겔과 백일해균 백신 등]와 함께 항원을 투여함으로써 행한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는, BSA(소 혈청 알부민) 또는 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌; Keyhole Limpet Hemocyanin) 등의 캐리어 단백질과 컨쥬게이트를 제작하여, 이것을 면역원으로서 이용한다.

항원의 투여는 1번째 투여 후 1∼2주간 간격으로 5∼10회 행한다. 각 투여 후 3∼7일째에 안저정맥총으로부터 채혈하여, 그 혈청이 항원과 반응하는 것을 효소면역측정법[Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 등으로 조사한다. 면역에 이용한 항원에 대하여, 그 혈청이 충분한 항체가를 보인 마우스, 래트 또는 햄스터를 비장 세포의 공급원으로서 제공한다.

비장 세포를 골수종 세포의 융합에 사용함에 있어서, 항원 물질의 최종 투여 후 3∼7일째에, 면역한 마우스, 래트 또는 햄스터로부터 비장을 적출하여, 비장 세포를 채취한다. 비장을 MEM 배지(닛수이세이야쿠사 제조) 중에서 세단하고, 핀셋으로 풀어, 원심분리(1200 rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고, 트리스-염화암모늄 완충액(pH 7.65)으로 1∼2분간 처리하여 적혈구를 제거하고, MEM 배지로 3회 세정하여 융합용 비장 세포로서 제공한다.

(3) 골수종 세포의 조제

골수종 세포로는, 마우스로부터 얻어진 주화 세포를 사용한다. 예컨대, 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18:1-7, 1978], P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6:511-519, 1976], SP2/O-Ag14(SP-2)[Nature, 276:269-270, 1978], P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology, 123:1548-1550, 1979], P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256: 495-497, 1975] 등이 이용된다. 이들 세포주는 8-아자구아닌 배지[RPMI-1640 배지에 글루타민(1.5 mM), 2-머캅토에탄올(5×10^-5 M), 젠타마이신(10 ㎍/mL) 및 소 태아 혈청(FCS)을 가한 배지(이하, 정상 배지라고 함)에, 8-아자구아닌(15 ㎍/mL)을 더 가한 배지]로 계대하는데, 세포 융합 3∼4일 전에 정상 배지로 계대하여, 융합 당일 2×10⁷개 이상의 세포수를 확보한다.

(4) 세포 융합

전술한 항체 생산 세포와 골수종 세포를 MEM 배지 또는 PBS(인산이나트륨 1.83 g, 인산일칼륨 0.21 g, 식염 7.65 g, 증류수 1 L, pH 7.2)로 잘 세정하여, 세포수가 항체 생산 세포 대 골수종 세포가 5∼10:1이 되도록 혼합하여, 원심분리(1,200 rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고, 침전된 세포군을 잘 푼 후, 교반하면서 37℃에서 폴리에틸렌글리콜-1,000(PEG-1,000) 2 g, MEM 2 mL 및 디메틸설폭시드 0.7 mL의 혼액을 항체 생산 세포수 10⁸당 0.2∼1 mL의 용량으로 가하여, 1∼2분마다 MEM 배지 1∼2 mL를 수회 가한 후, MEM 배지를 가하여 전량이 50 mL가 되게 한다. 원심분리(900 rpm, 5분 간) 후, 상청을 버리고, 천천히 세포를 푼 후, 메스피펫에 의한 흡입, 흡출로 천천히 세포를 HAT 배지[정상 배지에 히포크산틴(10^-4 M), 티미딘(1.5×10^-5 M) 및 아미노프테린(4×10^-7 M)을 가한 배지] 100 mL 중에 현탁한다. 이 현탁액을 96웰 배양용 플레이트에 100 ㎕/웰씩 분주하고, 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 37℃에서 7∼14일간 배양한다.

배양 후, 배양 상청의 일부를 취하여, 후술하는 결합 분석 등에 의해서, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 분비형 HB-EGF 및 막형 HB-EGF 중 어디에도 반응성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 정제 항체를 선택한다.

또, 이어서, 한계희석법에 의해 클로닝을 2회 반복[1번째는 HT 배지(HAT 배지에서 아미노프테린을 제외한 배지), 2번째는 정상 배지를 사용함]하여, 안정적이고 강한 항체가가 인정된 것을 모노클로날 항체 생산 하이브리도마주로서 선택한다.

(5) 모노클로날 항체의 조제

프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(Pristane) 0.5 mL를 복강내 투여하여, 2주간 사육함]한 8∼10주령의 마우스 또는 누드 마우스에, (4)에서 얻어진 항HB-EGF 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포 2×10⁶∼5×10⁷ 세포/마리를 복강내 주사한다. 10∼21일에 하이브리도마는 복수암(腹水癌)화한다. 이 마우스로부터 복수를 채취하여, 원심분리(3,000 rpm, 5분간)하여 고형분을 제거한 후, 40∼50% 황산암모늄으로 염석한 후, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로스 컬럼, 프로테인 A-컬럼 또는 겔 여과 컬럼에 의한 정제를 하여, IgG 또는 IgM 분획을 모아, 정제 모노클로날 항체로 한다.

항체의 서브클래스의 결정은 서브클래스 타이핑 키트를 이용하여 효소면역측정법에 의해 행한다. 단백량의 정량은 로리법 및 280 nm에서의 흡광도로부터 산출한다.

(6) 결합 분석

항원으로는, (1)에 기재된 방법에 의해, 본 발명에 있어서 이용되는 HB-EGF를 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등에 도입하여 얻은 유전자 도입 세포 또는 재조합 단백질 또는 인간 조직으로부터 얻은 정제 HB-EGF나 부분 펩티드를 이용한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는 BSA(소 혈청 알부민)나 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌) 등의 캐리어 단백질과 컨쥬게이트를 제작하여, 이것을 이용한다.

이들 항원 중, 분비형 HB-EGF 및 HB-EGF가 세포에 결합하고 있는 세포주를 96웰 플레이트에 분주하여 고층화(固層化)한 후, 제1 항체로서, 피면역 동물 혈청, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청 또는 정제 항체를 분주하여 반응시킨다. PBS 또는 PBS-0.05% Tween으로 잘 세정한 후, 제2 항체로서 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항면역글로불린 항체를 분주하여 반응시킨다. PBS-Tween으로 잘 세정한 후, 제2 항체의 표지 물질에 따른 반응을 행한다.

전술한 것과 같은 방법으로, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 분비형 HB-EGF 및 막형 HB-EGF 중 어디에도 반응성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 정제 항체를 선택할 수 있다.

얻어진 모노클로날 항체 중, 분비형 HB-EGF의 HB-EGF 수용체에의 결합 저해 활성을 갖는 항체로서는, 하이브리도마 세포주 KM3566이 생산하는 모노클로날 항체 KM3566, 하이브리도마 세포주 KM3567이 생산하는 모노클로날 항체 KM3567 및 하이브리도마 KM3579가 생산하는 모노클로날 항체를 들 수 있다. 하이브리도마 세포주 KM3579는 2006년 1월 24일부로 부다페스트 조약에 기초하여 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 이바라기켄 츠쿠바시 히가시 1-1-1 쥬오 다이6)에 FERM BP-10491로서 기탁되어 있다.

또한, 얻어진 모노클로날 항체가 분비형 HB-EGF에 대하여 중화 활성을 갖고 있는지의 여부는 HB-EGF 의존성 세포를 이용한 세포 증식 저해 분석을 함으로써 확인할 수 있다.

세포 증식 저해 분석에 이용하는 세포로서는, 분비형 HB-EGF가 결합할 수 있는 수용체를 갖는 세포라면 어떠한 세포라도 좋지만, 구체적으로는 EGF 수용체 유전자를 마우스 골수성 유래 세포주 32D 클론 3(ATCC No. CRL-11346)에 도입하여 얻어진 세포주 등을 들 수 있다.

얻어진 모노클로날 항체와 분비형 HB-EGF를 플레이트 상에서 반응시킨 후에 상술한 세포주를 가하여 배양을 한다. 대조로서, 분비형 HB-EGF를 첨가하고 모노클로날 항체를 첨가하지 않는 플레이트 및 모노클로날 항체와 분비형 HB-EGF 중 어느 것도 첨가하지 않는 플레이트에, 마찬가지로 상술한 세포주를 가하여 배양을 한다. 각 플레이트에서의 세포수를 계측함으로써, 세포 증식 저해율을 구할 수 있다. 세포 증식 저해율이 높은 모노클로날 항체는 중화 활성을 갖는 모노클로날 항체로서 선택할 수 있다.

본 발명의 중화 활성을 갖는 모노클로날 항체의 구체적인 예로서는, 하이브리도마 세포주 KM3566이 생산하는 모노클로날 항체 KM3566 및 하이브리도마 세포주 KM3567이 생산하는 모노클로날 항체 KM3567을 들 수 있다. 하이브리도마 세포주 KM3566 및 KM3567은 각각 2006년 1월 24일, 2006년 3월 23일부로 부다페스트 조약에 기초하여 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 이바라기켄 츠쿠바시 히가시 1-1-1 쥬오 다이6)에 FERM BP-10490 및 FERM BP-10573으로서 기탁되어 있다.

2. 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 제작

(1) 인간화 항체 발현용 벡터의 구축

인간화 항체 발현용 벡터로서는, 인간 항체의 CH 및/또는 CL을 코딩하는 유전자가 삽입된 동물 세포용 발현 벡터라면 어떠한 것이라도 좋다. 인간화 항체 발현용 벡터는 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.

인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL일 수 있으며, 예컨대 인간 항체의 H쇄의 IgG1 서브클래스의 C 영역(이하, hCγ1이라 표기함) 및 인간 항체의 L쇄의 κ 클래스의 C 영역(이하, hCκ라 표기함) 등을 들 수 있다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자로서는 엑손과 인트론으로 이루어지는 염색체 DNA를 이용할 수 있으며, 또한 cDNA를 이용할 수도 있다.

동물 세포용 발현 벡터로서는, 인간 항체의 C 영역을 코딩하는 유전자를 삽입하여 발현시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, pAGE107(Cytotechnology, 3, 133-140, 1990), pAGE103(Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987), pHSG274(Gene, 27, 223-232, 1984), pKCR(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 1527-1531, 1981), pSG1βd2-4(Cytotechnology, 4, 173-180, 1990) 등을 들 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 이용하는 프로모터와 인핸서로서는, SV40의 초기 프로모터와 인핸서(Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터와 인핸서(Biochemical & Biophysical Research Communications, 149, 960-968, 1987), 면역글로불린 H쇄의 프로모터(Cell, 41, 479-487, 1985)와 인핸서(Cell, 33, 717-728, 1983) 등을 들 수 있다.

인간형 키메라 항체 및 인간화 항체 발현용 벡터는, 항체 H쇄 및 L쇄가 별개의 벡터 상에 존재하는 타입, 또는 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(이하, 탠덤형이라 표기함) 중 어느 쪽이나 이용할 수 있지만, 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물 세포에의 도입의 용이함, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형을 이룬다는 등의 점에서, 탠덤형의 인간화 항체 발현용 벡터 쪽이 바람직하다(Journal of Immunological Methods, 167, 271-278, 1994). 탠덤형의 인간화 항체 발현용 벡터로는, pKANTEX93(WO 97/10354), pEE18(Hybridoma, 17, 559-567, 1998) 등을 들 수 있다.

(2) 인간 이외 동물의 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석

인간 이외 동물의 항체, 예컨대 마우스 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA는 다음과 같은 식으로 취득할 수 있다.

하이브리도마로부터 mRNA를 추출하여, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 이 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 프로브로서 이용하여, VH를 코딩하는 cDNA를 갖는 변형 파지 또는 변형 플라스미드 및 VL을 코딩하는 cDNA를 갖는 변형 파지 또는 변형 플라스미드를 각각 단리한다. 변형 파지 또는 변형 플라스미드 상의 목적으로 하는 마우스 항체의 VH 및 VL의 전체 염기 서열을 결정하여, 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 추정한다.

인간 이외의 동물로는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하다면, 어떠한 것도 이용할 수 있다.

하이브리도마로부터 전체 RNA를 조제하는 방법으로는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로초산세슘법(Methods in Enzymology, 154, 3-28, 1987), 또 전체 RNA로부터 mRNA를 조제하는 방법으로는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로스 컬럼법(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989) 등을 들 수 있다. 또한, 하이브리도마로부터 mRNA를 조제하는 키트로는, Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제조) 등을 들 수 있다.

cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로는, 통상의 방법(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34), 또는 시판되는 키트, 예컨대, Super Script^TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GIBCO BRL사 제조) 또는 ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene사 제조)를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제작할 때, 하이브리도마로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA를 삽입하는 벡터는 그 cDNA를 삽입할 수 있는 벡터라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, ZAP Express(Strategies, 5, 58-61, 1992), pBluescript II SK(+)(Nucleic Acids Research, 17, 9494, 1989), λZAP II(Stratagene사 제조), λgt10, λgt11(DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985), Lambda BlueMid(Clontech사 제조), λExCell, pT7T3 18U(Pharmacia사 제조), pcD2(Molecular & Cellular Biology, 3, 280-289, 1983) 및 pUC18(Gene, 33, 103-119, 1985) 등의 파지 또는 플라스미드 벡터가 이용된다.

파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로는 상기 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, XL1-Blue MRF'(Journal of Biotechnology, 23, 271-289, 1992), C600(Genetics, 59, 177-190, 1968), Y1088, Y1090(Science, 222, 778-782, 1983), NM522(Journal of Molecular Biology, 166, 1-19, 1983), K802(Journal of Molecular Biology, 16, 118-133, 1966) 및 JM105(Gene, 38, 275-276, 1985) 등이 이용된다.

cDNA 라이브러리로부터의 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA 클론의 선택법으로는, 방사성 동위원소 또는 형광 표지한 프로브를 이용한 콜로니·하이브리다이제이션법 또는 플라크·하이브리다이제이션법(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989)에 의해 선택할 수 있다. 또한, 프라이머를 조제하여, mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)(이하, PCR법이라 표기함; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34)에 의해 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 조제할 수도 있다.

상기 방법에 의해 선택된 cDNA를 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드 벡터에 클로닝하여, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 디데옥시법(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 5463-5467, 1977) 등의 반응을 행하여, 염기서열자동분석장치 ABI PRISM 377(ABI사 제조) 등을 이용하여 해석함으로써 그 cDNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.

결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 추정하고, 기지 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비를 위한 신호 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 코딩하고 있는지를 확인할 수 있다. 신호 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 관해서는, 기지 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)과 비교함으로써, 신호 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있으며, 나아가서는 이들이 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 관해서도, 기지 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)과 비교함으로써 알아낼 수 있다.

또한, VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 이용하여 임의의 데이터베이스, 예컨대, SWISS-PROT 또는 PIR-Protein 등에 대하여 BLAST법(Journal of Molecular Biology, 215, 403-410, 1990) 등의 서열 상동성 검색을 하여, 서열의 신규성을 검토할 수 있다.

(3) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축

상기 2(1)에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예컨대, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL의 3'말단 측의 염기 서열과 인간 항체의 CH 및 CL의 5' 말단 측의 염기 서열로 이루어지고, 또한 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA와 각각 연결하고, 각각을 상기 2(1)에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 또한, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하여, 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR법에 의해 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 증폭하고, 각각을 상기 2(1)에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.

(4) 인간화 항체(CDR 이식 항체)의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 구축

인간화 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA는 다음과 같은 식으로 구축할 수 있다. 우선, 목적의 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열을 선택한다. 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열로서는, 인간 항체 유래의 것이라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, Protein Data Bank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 충분한 활성을 갖는 인간화 항체를 제작하기 위해서는 목적의 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60% 이상)을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다. 이어서, 선택한 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열에, 목적의 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에서 보이는 코돈의 사용 빈도(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)를 고려하여 염기 서열로 변환하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 설계한다. 설계한 염기 서열에 기초하여, 150 염기 전후의 길이로 이루어지는 여러 가닥의 합성 DNA를 합성하고, 이들을 이용하여 PCR법을 실시한다. 이 경우, PCR에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터 보면, VH, VL 모두 4 가닥의 합성 DNA를 설계하는 것이 바람직하다.

또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 상기 2(1)에서 구축한 인간화 항체 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하여, 상기 2(2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하여, 원하는 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.

(5) 인간화 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변

인간화 항체는 목적의 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는 그 항원 결합 활성은 원래의 인간 이외 동물의 항체에 비해서 저하되어 버린다는 것이 알려져 있다(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991). 이 원인으로는, 원래의 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL에서는, CDR뿐만 아니라, FR의 몇 개의 아미노산 잔기가 직접적 또는 간접적으로 항원 결합 활성에 관여하고 있어, 이들 아미노산 잔기가 CDR의 이식에 따라, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 다른 아미노산 잔기로 변화되어 버리는 것을 생각할 수 있다. 이 문제를 해결하기 위해서, 인간화 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기나 CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하거나, 항체의 입체 구조를 유지하여, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하여, 이들을 원래의 인간 이외 동물의 항체에서 찾을 수 있는 아미노산 잔기로 개변하여, 저하된 항원 결합 활성을 상승시키는 것이 이루어지고 있다(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991). 인간화 항체의 제작에 있어서는, 이들 항원 결합 활성에 관련한 FR의 아미노산 잔기를 어떻게 효율적으로 동정하는지가 가장 중요한 점이며, 그 때문에 X선 결정 해석(Journal of Molecular Biology, 112, 535-542, 1977) 또는 컴퓨터 모델링(Protein Engineering, 7, 1501-1507, 1994) 등에 의한 항체의 입체 구조의 구축 및 해석이 이루어지고 있다. 이들 항체의 입체 구조의 정보는 인간화 항체의 제작에 많은 유익한 정보를 가져왔지만, 그 한편, 온갖 항체에 적응할 수 있는 인간형 CDR 이식 항체의 제작법은 아직 확립되어 있지 않아, 현재로는 각각의 항체에 대해서 여러 종류의 개변체를 제작하여, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 등의 여러 가지 시행착오가 필요하다.

인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기의 개변은 개변용 합성 DNA를 이용하여 상기 2(4)에 기재된 PCR법을 행함으로써 달성할 수 있다. PCR 후의 증폭 산물에 관해서 상기 2(2)에 기재된 방법에 의해서 염기 서열을 결정하여, 목적의 개변이 실시되었음을 확인한다.

(6) 인간화 항체 발현 벡터의 구축

상기 2(1)에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에, 상기 2(4) 및 (5)에서 구축한 인간화 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 클로닝하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예컨대, 상기 2(4) 및 (5)에서 인간화 항체의 VH 및 VL을 구축할 때에 이용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 상기 2(1)에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 클로닝할 수 있다.

(7) 인간화 항체의 일과성 발현

제작한 많은 종류의 인간화 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가하기 위해서, 상기 2(3) 및 (6)에 기재된 인간화 항체 발현 벡터 또는 이들을 개변한 발현 벡터를 이용하여 인간화 항체의 일과성 발현을 행할 수 있다. 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로서는 인간화 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포라면 어떠한 세포라도 이용할 수 있지만, 그 발현량이 높다는 점에서, COS-7 세포(ATCC CRL 1651)가 일반적으로 이용된다(Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991). COS-7 세포에의 발현 벡터의 도입법으로는 DEAE-덱스트란법(Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991), 리포펙션법(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 7413-7417, 1987) 등을 들 수 있다.

발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 인간화 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996) 등에 의해 측정할 수 있다.

(8) 인간화 항체의 안정 발현

상기 2(3) 및 (6)에 기재된 인간화 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 인간화 항체를 안정적으로 발현하는 형질전환 세포를 얻을 수 있다. 숙주 세포에의 발현 벡터의 도입법으로는 일렉트로포레이션법(Cytotechnology, 3, 133-140, 1990) 등을 들 수 있다. 인간화 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로는, 인간화 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포라면 어떠한 세포라도 이용할 수 있다. 예컨대, 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디히드로엽산 환원 효소 유전자(이하, dhfr이라 표기함)가 결손된 CHO 세포(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77, 4216-4220, 1980), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL1662, 이하, YB2/0 세포라 표기함) 등을 들 수 있다.

발현 벡터의 도입 후, 인간화 항체를 안정적으로 발현하는 형질전환체는 일본 특허 공개 평2-257891에 개시되어 있는 방법에 따라서, G418 설페이트(이하, G418이라 표기함) 등의 약제를 함유하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택할 수 있다. 동물 세포 배양용 배지로는 RPMI1640 배지(닛수이세이야쿠사 제조), GIT 배지(니혼세이야쿠사 제조), EX-CELL302 배지(JRH사 제조), IMDM(GIBCO BRL사 제조), Hybridoma-SFM(GIBCO BRL사 제조) 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다. 얻어진 형질전환 세포를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 인간화 항체를 발현 축적시킬 수 있다. 배양 상청 중의 인간화 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질전환 세포는 일본 특허 공개 평2-257891에 개시되어 있는 방법에 따라서, DHFR 증폭계 등을 이용하여 인간화 항체의 발현량을 상승시킬 수 있다.

인간화 항체는 형질전환 세포의 배양 상청으로부터 프로테인 A 컬럼을 이용하여 정제할 수 있다(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996). 또한, 그 밖에 통상 단백질의 정제에서 이용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합시켜 실시하여 정제할 수 있다. 정제한 인간화 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은 폴리아크릴아미드겔 전기영동(이하, PAGE라 표기함: Nature, 227, 680-685, 1970)이나 웨스턴 블로팅법(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996) 등으로 측정할 수 있다.

(9) 인간화 항체와 항원과의 결합 활성 평가

인간화 항체와 항원과의 결합 활성 평가는 상기에 기재된 ELISA를 이용하여 행할 수 있다.

3. 항체 단편의 제작

항체 단편은 상기 1 및 2에 기재된 항체를 기초로 유전자 공학적 수법 또는 단백질 화학적 수법에 의해서 제작할 수 있다.

유전자 공학적 수법으로는, 목적의 항체 단편을 코딩하는 유전자를 구축하고, 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 대장균 등의 적당한 숙주를 이용하여 발현, 정제를 하는 등의 방법을 들 수 있다.

단백질 화학적 수법으로는, 펩신, 파파인 등의 단백질 분해 효소를 이용한 부위 특이적 절단, 정제 등의 방법을 들 수 있다.

항체 단편으로서, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv, 디아바디, dsFv의 제조법에 관해서 이하에 구체적으로 설명한다.

(1) Fab의 제작

Fab는 단백질 화학적으로는 IgG를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리함으로써 제작할 수 있다. 파파인 처리 후에는 원래의 항체가 프로테인 A 결합성을 갖는 IgG 서브클래스라면, 프로테인 A 컬럼에 통과시킴으로써, IgG 분자나 Fc 단편과 분리하여, 균일한 Fab로서 회수할 수 있다(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995). 프로테인 A 결합성을 갖지 않는 IgG 서브클래스 항체의 경우에는, 이온 교환 크로마토그래피에 의해, Fab는 저염 농도로 용출되는 분획 중에 회수할 수 있다(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995). 또한, Fab는 유전자 공학적으로는, 대부분은 대장균을 이용하고, 또, 곤충 세포 또는 동물 세포 등을 이용하여 제작할 수 있다. 예컨대, 상기 2(2), 2(4) 및 2(5)에 기재된 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를 Fab 발현용 벡터에 클로닝하여, Fab 발현 벡터를 제작할 수 있다. Fab 발현용 벡터로서는, Fab용의 DNA를 삽입하여 발현시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것이나 이용할 수 있다. 예컨대, pIT106(Science, 240, 1041-1043, 1988) 등을 들 수 있다. Fab 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여, 봉입체 또는 주변세포질(periplasm)에 Fab를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 Fab로 할 수 있으며, 또한, 주변세포질에 발현시킨 경우에는 배양 상청 중에 활성을 지닌 Fab가 누출된다. 리폴딩 후 또는 배양 상청으로부터는, 항원을 결합시킨 컬럼을 이용함으로써, 균일한 Fab를 정제할 수 있다(Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992).

(2) F(ab')₂의 제작

F(ab')₂는 단백질 화학적으로는 IgG를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리함으로써 제작할 수 있다. 펩신의 처리 후에는 Fab와 같은 정제 조작에 의해서, 균일한 F(ab')₂로서 회수할 수 있다(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, Academic Press, 1995). 또한, 하기 3(3)에 기재된 Fab'을 o-PDM이나 비스말레이미드헥산 등과 같은 말레이미드로 처리하여, 티오에테르 결합시키는 방법이나, DTNB[5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)]로 처리하여, S-S 결합시키는 방법에 의해서도 제작할 수 있다(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).

(3) Fab'의 제작

Fab'은 상기 3(2)에 기재된 F(ab')₂를 디티오트레이톨 등의 환원제로 처리하여 얻을 수 있다. 또한, Fab'은 유전자 공학적으로는, 대부분은 대장균, 또 곤충 세포 또는 동물 세포 등을 이용하여 제작할 수 있다. 예컨대, 상기 2(2), 2(4) 및 2(5)에 기재된 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를 Fab' 발현용 벡터에 클로닝하여, Fab' 발현 벡터를 제작할 수 있다. Fab' 발현용 벡터로는, Fab'용의 DNA를 삽입하여 발현시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것이나 이용할 수 있다. 예컨대, pAK19(BIO/TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992) 등을 들 수 있다. Fab' 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여, 봉입체 또는 주변세포질에 Fab'을 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해서 활성이 있는 Fab'으로 할 수 있으며, 또한, 주변세포질에 발현시킨 경우에는 리소자임에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 초음파 처리 등의 처리에 의해 균을 파쇄하여, 균체 밖으로 회수시킬 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는 프로테인 G 컬럼 등을 이용함으로써 균일한 Fab'을 정제할 수 있다(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).

(4) scFv의 제작

scFv는 유전자 공학적으로는, 파지 또는 대장균, 또 곤충 세포 또는 동물 세포 등을 이용하여 제작할 수 있다. 예컨대, 상기 2(2), 2(4) 및 2(5)에 기재된 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를 scFv 발현용 벡터에 클로닝하여, scFv 발현 벡터를 제작할 수 있다. scFv 발현용 벡터로는, scFv의 DNA를 삽입하여 발현시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것이나 이용할 수 있다. 예컨대, pCANTAB5E(Pharmacia사 제조), pHFA(Human Antibodies & Hybridomas, 5, 48-56, 1994) 등을 들 수 있다. scFv 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여, 헬퍼 파지를 감염시킴으로써, 파지 표면에 scFv가 파지 표면 단백질과 융합한 형태로 발현되는 파지를 얻을 수 있다. 또한, scFv 발현 벡터를 도입한 대장균의 봉입체 또는 주변세포질에 scFv를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해서 활성이 있는 scFv로 할 수 있으며, 또한, 주변세포질에 발현시킨 경우에는 리소자임에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 초음파 처리 등의 처리에 의해 균을 파쇄하여, 균체 밖으로 회수할 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는 양이온 교환 크로마토그래피 등을 이용함으로써, 균일한 scFv를 정제할 수 있다(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).

(5) 디아바디의 제작

디아바디는 유전자 공학적으로는, 대부분은 대장균, 또 곤충 세포 또는 동물 세포 등을 이용하여 제작할 수 있다. 예컨대, 상기 2(2), 2(4) 및 2(5)에 기재된 항체의 VH와 VL을 링커가 코딩하는 아미노산 잔기가 8 잔기 이하가 되도록 연결한 DNA를 제작하고, 디아바디 발현용 벡터에 클로닝하여, 디아바디 발현 벡터를 제작할 수 있다. 디아바디 발현용 벡터로는, 디아바디의 DNA를 삽입하여 발현시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것도 이용할 수 있다. 예컨대, pCANTAB5E(Pharmacia사 제조), pHFA(Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994) 등을 들 수 있다. 디아바디 발현 벡터를 도입한 대장균의 봉입체 또는 주변세포질에 디아바디를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해서 활성이 있는 디아바디로 할 수 있으며, 또한, 주변세포질에 발현시킨 경우에는 리소자임에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 초음파 처리 등의 처리에 의해 균을 파쇄하여, 균체 밖으로 회수할 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는 양이온 교환 크로마토그래피 등을 이용함으로써, 균일한 디아바디를 정제할 수 있다(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).

(6) dsFv의 제작

dsFv는 유전자 공학적으로는, 대부분은 대장균, 또 곤충 세포 또는 동물 세포 등을 이용하여 제작할 수 있다. 우선, 상기 2(2), 2(4) 및 2(5)에 기재된 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 DNA의 적당한 위치에 변이를 도입하여, 코딩하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 DNA를 제작한다. 제작한 각 DNA를 dsFv 발현용 벡터에 클로닝하여, VH 및 VL의 발현 벡터를 제작할 수 있다. dsFv 발현용 벡터로는, dsFv용 DNA를 삽입하여 발현시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것이나 이용할 수 있다. 예컨대, pULI9(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994) 등을 들 수 있다. VH 및 VL의 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여, 봉입체 또는 주변세포질에 dsFv를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체 또는 주변세포질으로부터 VH 및 VL을 취득하여, 혼합한 후에, 통상 단백질에서 이용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 dsFv로 할 수 있다. 리폴딩 후에는 이온 교환 크로마토그래피 및 겔여과 등에 의해서 더 정제할 수 있다(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).

4. 본 발명의 의약 및 치료제

본 발명의 모노클로날 항체를 유효 성분으로서 함유하는 의약은 HB-EGF가 관여하는 각종 질환을 치료할 수 있다.

HB-EGF가 관여하는 질환으로는 암, 심질환, 동맥경화 등을 들 수 있다.

암으로는 유방암, 간암, 췌장암, 방광암, 난소암, 난소배세포종양 등의 고형암을 들 수 있다. 또, 어느 한 고형암에 따른 연속성, 혈행성 또는 림프성 전이, 복막 파종 등에 의한 전이암 등도 들 수 있다. 또한 백혈병(급성 골수성 백혈병, T 세포성 백혈병 등), 림프종, 골수종 등의 조혈 세포 유래의 암(혈액암, hematological cancer, blood cancer) 등의 암 종류를 들 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로 하는 의약은 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학 기술 분야에서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.

투여 경로는 치료함에 있어서 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하며, 경구 투여, 또는 구강내, 비강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내, 복강내 및 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 항체 또는 펩티드 제제의 경우, 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다. 투여 형태는 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.

경구 투여에 적당한 제제로는 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다. 유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은 물, 자당, 솔비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 오일류, p-히드록시안식향산에스테르류 등의 방부제, 딸기향, 페파민트 등의 향미류 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다. 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은 젖당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다.

비경구 투여에 적당한 제제로는 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다. 주사제는 염 용액, 포도당 용액 또는 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 이용하여 조제된다. 좌제는 카카오지, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 이용하여 조제된다. 또한, 분무제는 해당 항체 또는 펩티드 그 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또 해당 화합물을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 만드는 담체 등을 이용하여 조제된다. 담체로서 구체적으로는 젖당, 글리세린 등을 예로 들 수 있다. 해당 항체 및 이용하는 담체의 성질에 따라서, 에어로졸, 건조 분말 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에 있어서도 경구제로 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.

투여량 또는 투여 횟수는 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 통상 성인이 1일당 10 ㎍/kg∼8 mg/kg이다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 실시예는 본 발명의 예시이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1>

항HB-EGF 모노클로날 항체의 제작

(1) 면역원의 조제

R&D 시스템사 제조 재조합 분비형 인간 HB-EGF(카탈로그 번호 259-HE/CF) 동결 건조품을 둘베코 인산 완충액(Phosphate Buffered Saline: PBS)으로 용해하여, 면역원으로서 이용하였다.

(2) 동물의 면역과 항체 생산 세포의 조제

실시예 1의 (1)에서 조제한 재조합 분비형 인간 HB-EGF 25 ㎍을 수산화알루 미늄 어쥬번트[Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p 99, 1988]2 mg 및 백일해 백신(치바켄 혈청연구소 제조) 1×10⁹ 세포와 함께 HB-EGF 결손 마우스(오사카 대학 미생물병 연구소 세포 기능 분야 연구실로부터 공여, PNAS, VOL. 100, NO. 100, 3221-3226, 2003)에 투여하였다. 투여 2주간 후부터, 상기 HB-EGF 25 ㎍만을 일주일에 1회, 총 4회 투여하였다. 상기 마우스의 안저정맥으로부터 부분 채혈하고, 그 혈청 항체가를 이하에 나타내는 효소면역측정법으로 조사하여, 충분한 항체가를 보인 마우스로부터 최종 면역 3일 후에 비장을 적출하였다. 비장을 MEM(Minimum Essential Medium) 배지(닛수이세이야쿠사 제조) 중에서 세단하고, 핀셋으로 풀어, 원심분리(1200 rpm, 5분간)하였다. 얻어진 침전 분획에 트리스-염화암모늄 완충액(pH 7.6)을 첨가하여, 1∼2분간 처리함으로써 적혈구를 제거하였다. 얻어진 침전 분획(세포 분획)을 MEM 배지로 3회 세정하여, 세포 융합에 이용하였다.

(3) 효소면역측정법(결합 ELISA)

분석에는 실시예 1(1)의 재조합 인간 HB-EGF를 96웰의 ELISA용 플레이트(Greiner사)에 0.5 ㎍/mL, 50 ㎕/웰로 분주하여, 4℃에서 하룻밤 방치하여 흡착시킨 것을 이용하였다. 상기 플레이트를 세정한 후, 1% 소 혈청 알부민(BSA)-PBS를 50 ㎕/웰로 가하여, 실온에서 1시간 방치하고, 남아 있는 활성기를 블로킹하였다. 방치 후, 1% BSA-PBS를 버리고, 상기 플레이트에 일차 항체로서 피면역 마우스 항혈청, 하이브리도마 배양 상청을 50 ㎕/웰로 분주하여 2시간 방치하였다. 상기 플 레이트를 0.05% 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우레이트[(ICI사 상표 Tween 20 상당품: 와코쥰야쿠사 제조)]/PBS(이하 Tween-PBS라 표기)로 세정한 후, 2차 항체로서 퍼옥시다제 표지 토끼 항마우스 IgG 감마쇄(Kirkegaard & Perry Laboratories사)를 50 ㎕/웰로 가하여 실온에서 1시간 방치하였다. 상기 플레이트를 Tween-PBS로 세정한 후, ABTS[2.2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸-6-술폰산)암모늄] 기질액[1 mmoL/L ABTS/0.1 moL/L 시트르산 완충액(pH 4.2), 0.1% H₂O₂]을 첨가하고, 발색시켜 OD 415 nm의 흡광도를 플레이트 판독기(Emax; Molecular Devices사)를 이용하여 측정하였다.

(4) 마우스 골수종 세포의 조제

8-아자구아닌 내성 마우스 골수종 세포주 P3X63Ag8U.1(P3-U1: ATCC로부터 구입)을 10% 소 태아 혈청 첨가 RPMI1640(인비트로젠사)에서 배양하고, 세포 융합시에 2×1O⁷개 이상의 세포를 확보하여, 세포 융합에 친주로서 사용하게 하였다.

(5) 하이브리도마의 제작

실시예 1(2)에서 얻어진 마우스 비장 세포와 실시예 1(4)에서 얻어진 골수종 세포를 10:1이 되도록 혼합하여, 원심분리(1200 rpm, 5분간)하였다. 얻어진 침전 분획의 세포군을 잘 푼 후, 교반하면서, 37℃에서 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000) 1 g, MEM 배지 1 mL 및 디메틸설폭시드 0.35 mL의 혼액을 10⁸개의 마우스 비장 세포당 0.5 mL 가하고, 그 현탁액에 1∼2분마다 MEM 배지 1 mL를 수회 가한 후, MEM 배지를 가하여 전량이 50 mL가 되도록 하였다. 상기 현탁액을 원심분리(900 rpm, 5분간)하여, 얻어진 침전 분획의 세포를 천천히 푼 후, 그 세포를 메스피펫에 의해서 흡입/흡출하여 천천히 HAT 배지[10% 소 태아 혈청 첨가 RPMI1640 배지에 HAT Media Supplement(인비트로젠사 제조)를 가한 배지] 100 mL 중에 현탁하였다. 상기 현탁액을 96웰 배양용 플레이트에 200 ㎕/웰씩 분주하여, 5% CO₂ 인큐베이터 중에서, 37℃에서 10∼14일간 배양하였다. 배양 후, 배양 상청을 실시예 1(3)에 기재된 효소면역측정법으로 조사하여, 재조합 인간 HB-EGF에 반응하는 웰을 선택하고, 거기에 포함되는 세포로부터 한계희석법에 의한 클로닝을 2회 반복하여, 항HB-EGF 모노클로날 항체 생산 하이브리도마주 KM3566, KM3567 및 KM3579를 확립하였다.

(6) 모노클로날 항체의 정제

프리스탄 처리한 8주령 누드 암컷 마우스(BALB/c)에 실시예 1(5)에서 얻어진 하이브리도마주를 5∼20×10⁶ 세포/마리씩 각각 복강내 주사하였다. 10∼21일 후, 하이브리도마가 복수암화함으로써 복수가 고인 마우스로부터 복수를 채취(1∼8 mL/마리)하였다. 그 복수를 원심분리(3000 rpm, 5분간)하여 고형분을 제거하였다. 정제 IgG 모노클로날 항체는 카프릴산침전법[Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 의해 정제함으로써 취득하였다. 모노클로날 항체의 서브클래스는 서브클래스 타이핑 키트를 이용한 ELISA법에 의해 결정하였다. 모노클로날 항체 KM3566의 서브클래스는 IgG1, KM3567의 서브클래스는 IgG1, 모노클로날 항체 KM3579는 IgG2b였다.

<실시예 2>

HB-EGF에 대한 항HB-EGF 모노클로날 항체의 반응성

(1) 결합 ELISA에 있어서의 HB-EGF와의 반응성

실시예 1(3)에 나타낸 방법에 따라서 행하였다. 일차 항체에는 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3567, KM3579, 시판되는 항HB-EGF 모노클로날 항체 MAB259(R&D사 제조) 및 음성 대조 항체 KM511(항GCSF 유도체 모노클로날 항체)의 각 정제 항체를 10 ㎍/mL에서부터 5배 희석으로 단계적으로 희석한 것을 이용하였다. 결과를 도 1a에 도시하였다.

항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3567, KM3579 및 MAB259는 모두 재조합 인간 HB-EGF에 반응하고, BSA에는 전혀 반응하지 않았다.

(2) 웨스턴 블롯에 있어서의 HB-EGF와의 반응성

1 레인당, 20 ng의 재조합 인간 HB-EGF(R&D사 제조)를 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분획하고, 영동 후의 겔을 PVDF막에 전사하였다. 이 막을 10% BSA-PBS로 블로킹한 후, 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3567, KM3579, MAB259 및 음성 대조 항체 KM511의 정제 항체를 각각 10% BSA-PBS를 이용하여 1 ㎍/mL로 희석하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 상기 막을 Tween-PBS로 잘 세정한 후, 희석한 퍼옥시다제 표지 마우스 면역글로불린(자이메트사)을 실온에서 1시간 반응시켰다. 상기 막을 Tween-PBS로 잘 세정하여, ECL^TM western blotting detection reagents(Amersham Pharmacia사 제조)를 이용하여 밴드를 검출하였다.

항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3567, KM3579 및 MAB259는 모두 재조합 분비형 인간 HB-EGF의 분자량에 해당하는 15∼30 킬로달톤(이하, kDa이라 기재함) 부근의 밴드를 검출하였다.

(3) 항HB-EGF 모노클로날 항체의 HB-EGF-EGFR 결합 저해 활성의 평가

항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3567, KM3579 및 MAB259의 HB-EGF-EGFR 결합 저해 활성을 32D/EGFR 세포와 비오틴 표지 HB-EGF를 이용하여 검토하였다.

재조합 분비형 HB-EGF는 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin(피어스사 제조)을 이용하여 통상의 방법에 의해 비오틴 표지를 행하였다.

KM3566, KM3567, KM3579 및 MAB259를 10 ㎍/mL에서부터 5배 희석으로 단계적으로 희석하여, 50 ㎕/웰로 96웰 플레이트에 분주하였다. 그 후, 32D/EGFR 세포를 1×10⁴개/50 ㎕/웰로 분주하였다. 또한, 지적(至適) 농도로 희석한 비오틴 표지 HB-EGF와 알렉사 647 표지 스트렙타비딘을 각각 10 ㎕/웰, 50 ㎕/웰로 분주하여 혼합한 후, 실온 차광하에서 3시간 반응시켰다. 레이저광 633 nm He/Ne으로 여기되는 650 nm∼685 nm의 파장을 8200 Cellular Detection System(어플라이드바이오시스템사 제조)으로 측정하였다.

그 결과, 도 1b에 나타내는 바와 같이, KM3566, KM3567, KM3579 및 MAB259는 모두 항체 농도 의존적으로, 비오틴화 HB-EGF의 EGFR에의 결합을 저해하였다. 따라서, 모든 항HB-EGF 모노클로날 항체는 HB-EGF와 EGFR과의 결합을 저해하는 것이 분명해졌다.

<실시예 3>

HB-EGF에 대한 항HB-EGF 모노클로날 항체의 중화 활성의 검토

항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3567, KM3579 및 MAB259의 HB-EGF 중화 활성을 HB-EGF 의존성 세포를 이용한 세포 증식 저해 분석으로 조사하였다. HB-EGF 의존성 세포로서는, EGFR 유전자를 마우스 골수 유래 세포주 32D clone3(ATCC CRL-11346)에 도입하여 조성한 세포주(이하, 32D/EGFR이라 기재함)를 이용하였다. 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3567, KM3579, MAB259 및 음성 대조 항체 KM511의 정제 항체를 각각 20 ㎍/mL에서부터 3∼4배 희석으로 단계적으로 희석하여, 50 ㎕/웰로 96웰 플레이트에 분주하였다. 이어서, 0.1 ㎍/mL의 재조합 인간 HB-EGF(R&D사)를 10 ㎕/웰로 분주하고, 혼합한 후 빙상에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 32D/EGFR 세포를 1×10⁴개/40 ㎕/웰로 파종하여, 36시간 배양하였다. 생세포수 측정 시약 SF(나카라이테스크사)를 10 ㎕/웰로 첨가하여, 2시간 후에 OD 450 nm의 흡광도를 플레이트 판독기(Emax; Molecular Devices사)를 이용하여 측정하였다.

HB-EGF 첨가, 항체 비첨가 웰의 흡광도를 저해율 0%로 하고, HB-EGF 비첨가, 항체 비첨가 웰의 흡광도를 저해율 100%로 하여, 각 웰의 세포 증식 저해율을 산출한 결과를 도 2a에 도시하였다. 그 결과, KM3566은 세포주 32D/EGFR에 대하여 MAB259와 같은 정도의 HB-EGF 의존성 증식의 저해 활성을 보였다. 따라서, 2개의 항체는 같은 정도의 HB-EGF 중화 활성을 갖고 있음이 분명해졌다. 한편, KM3579는 세포주 32D/EGFR의 증식을 전혀 저해하지 않았으므로, HB-EGF 중화 활성을 갖지 않 음이 분명해졌다.

또한, 같은 식으로 하여 KM3567의 중화 활성을 검토한 결과를 도 2b에 도시하였다. 그 결과, KM3567은 KM3566과 비교하여 활성은 약하지만, HB-EGF 의존성 세포 증식의 저해 활성을 갖고 있었다.

<실시예 4>

막형 HB-EGF에 대한 항HB-EGF 모노클로날 항체의 반응성 검토

1∼5×10⁵ 세포의 인간　위암　세포주 MKN-28(HSRRB　JCRB0253),　인간　난소암 ES-2(ATCC　CRL-1978)　및 인간　유방암 세포주 MDA-MB-231(ATCC HTB-26)에, 0.1% BSA-PBS로 각 농도로 희석한 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566, KM3567, KM3579, MAB259 및 음성 대조 항체 KM511을 가하고 혼합하여 전량을 50 ㎕로 하였다. 이들 세포 현탁액을 빙상에서 40분간 반응시킨 후, 0.1% BSA-PBS로 3회 세정하였다. 그 세포에, 0.1% BSA-PBS로 희석 조제한 FITC 표지 염소 항마우스 IgG+IgM(H+L) 폴리클로날 항체(Kirkegaard & Perry Laboratories사)를 50 ㎕ 첨가하여, 빙냉하에서 40분간 반응시켰다. 0.1% BSA-PBS로 세정한 후, 0.1% BSA-PBS에 현탁하여 유세포 분석기(코울터사 제조)를 이용하여, 형광 강도를 측정하였다.

도 3에, MKN-28 및 ES-2에 상기 모노클로날 항체를 20 ㎍/mL에서부터 2배 희석으로 반응시킨 경우의 평균 형광 강도(MFI값)를 도시한다. 도 4에, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231에 상기 모노클로날 항체를 20 ㎍/mL로 반응시킨 경우의 히스토그램를 도시한다. 그 결과, MKN-28에 대해서는 KM3566, KM3579의 결합 활성이 인정 되고, 또한 ES-2에서는, KM3566>KM3579의 순으로 결합 활성이 인정되었다. 또한, MDA-MB-231에서는 KM3566>KM3567≒KM3579의 순으로 결합 활성이 인정되었다. 또한, 어느 세포에 대해서도 MAB259의 MFI값은 음성 대조 항체 KM511 및 항체 비첨가 음성 대조와 같은 정도이며, 세포에의 결합이 거의 인정되지 않았다. 이상으로부터, 모노클로날 항체 KM3566, KM3567 및 KM3579는 암 세포주의 막형 및 세포막에 결합한 HB-EGF에 결합하는 것이 분명하게 되었다.

<실시예 5>

항HB-EGF 모노클로날 항체의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 단리, 해석

(1) 항HB-EGF 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포로부터의 mRNA의 조제

실시예 1에 기재된 하이브리도마 KM3566으로부터, RNAeasy Maxi kit(QIAGEN사 제조) 및 OligotexTM-dT30<Super>mRNA Purfication Kit(Takara사 제조)를 이용하여, 첨부한 사용설명서에 따라서 하이브리도마 세포 5×10⁷ 세포로부터 약 4.8 ㎍의 mRNA를 조제하였다.

(2) 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566의 H쇄 및 L쇄 가변 영역의 유전자 클로닝

실시예 5(1)에서 취득한 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566의 mRNA의 1 ㎍에서부터, BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences사 제조)를 이용하여, 첨부된 사용설명서에 따라서 5' 측에 키트 첨부의 BD SMART IITM A Oligonucleotide 서열을 갖는 cDNA를 취득하였다. 그 cDNA를 주형으로 하여, 키트 첨부의 유니버셜 프라이머 Amix와, 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 갖는 마우스 Ig(γ) 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 행하여, VH의 cDNA 단편을 증폭하였다. 또한 Ig(γ) 특이적 프라이머 대신에 서열 번호 7로 표시되는 염기 서열을 갖는 마우스 Ig(κ) 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 행하여, VL의 cDNA 단편을 증폭하였다. PCR은 94℃에서 5분간 가열한 후, 94℃에서 30초간, 72℃에서 3분간으로 이루어지는 반응 사이클을 5회, 94℃에서 30초간, 70℃에서 30초간, 72℃에서 3분간으로 이루어지는 반응 사이클을 5회, 94℃에서 30초간, 68℃에서 30초간, 72℃에서 3분간으로 이루어지는 반응 사이클을 30회 각각 행한 후, 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR은 PTC-200 DNA Engine(BioRad사 제조)을 이용하여 행하였다.

얻어진 PCR 산물을 클로닝하여, 염기 서열을 결정하기 위해서, 아가로스 겔 전기영동으로 분리하여, H쇄, L쇄 각각 약 600 bp의 PCR 산물을 Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여 추출하였다. 얻어진 추출 단편을 SmaI으로 소화한 pBluescriptII SK(-) 벡터에, Ligation high(도요보세키사 제조)를 이용하여 연결한 후, 코엔 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)]에 의해 대장균 DH5α주를 형질전환하였다. 얻어진 형질전환체로부터 자동 플라스미드 추출기(크라보우사 제조)를 이용하여 플라스미드를 추출하고, BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE 바이오시스템즈사 제조)를 이용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 동사의 시퀀서 ABI PRISM3700에 의해 클로닝한 PCR 산물의 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, cDNA의 5' 말단에 개시 코돈으로 추정되는 ATG 서열이 존재하는, 완전 길이의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 KM3566VH10G2 및 L쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 KM3566VL10K2가 취득되었다.

(3) 항HB-EGF 모노클로날 항체 V 영역의 아미노산 서열의 해석

플라스미드 KM3566VH10G2에 포함되어 있었던 VH의 전체 염기 서열을 서열 번호 8에, 상기 서열로부터 추정된, 신호 서열을 포함한 VH의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 9에, 플라스미드 KM3566VL10K2에 포함되어 있었던 VL의 전체 염기 서열을 서열 번호 10에, 상기 서열로부터 추정된, 신호 서열을 포함한 VL의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 11에 각각 나타내었다. 기지의 마우스 항체의 서열 데이터[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]와의 비교 및 정제한 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566의 H쇄 및 L쇄의 N 말단 아미노산 서열을 단백질 시퀀서(시마즈세이사쿠쇼사 제조: PPSQ-10)를 이용하여 해석한 결과와의 비교로부터, 단리한 각각의 cDNA는 분비 신호 서열을 포함하는 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566을 코딩하는 완전 길이 cDNA이며, H쇄에 관해서는 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열의 1번 내지 19번째가, L쇄에 관해서는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열의 1번 내지 20번째가 분비 신호 서열임이 분명하게 되었다.

이어서, 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 신규성에 대해서 검토하였다. 서열 해석 시스템으로서 GCG Package(version 9.1, Genetics Computer Group사 제조)를 이용하고, 기존 단백질의 아미노산 서열 데이터베이스를 BLASTP법[Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997)]에 의해 검색하였다. 그 결과, VH, VL 모두 완전하게 일치하는 아미노산 서열은 인정되지 않고, 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566의 VH 및 VL은 신규의 아미노산 서열을 갖고 있음이 확인되었다.

또한, 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566의 VH 및 VL의 CDR을 기지 항체의 아미노산 서열과 비교함으로써 동정하였다. 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 12, 13 및 14에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 15, 16 및 17에 각각 나타내었다.

<실시예 6>

항HB-EGF 키메라 항체의 제작

(1) 항HB-EGF 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX3566의 구축

WO 97/10354에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93과, 실시예 5(2)에서 얻어진 플라스미드 KM3566VH10G2 및 KM3566VL10K2를 이용하여, 항HB-EGF 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX3566을 다음과 같은 식으로 구축하였다.

플라스미드 KM3566VH10G2를 주형으로서 100 ng 사용하고, 10×KOD 완충액 10 ㎕, 2 mmol/L dNTP 10 ㎕, 25 mmol/L의 염화마그네슘을 2 ㎕, 10 ㎛ol/L의 서열 번호 18 및 19에 기재된 염기 서열을 갖는 프라이머를 각각 1 ㎕, KOD 폴리머라제(도요보세키사 제조) 1 ㎕를 함유하는 총량 100 ㎕로 이루어지는 용액을 96℃에서 3분간 가열한 후, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 반응을 25 사이클, 72℃에서 8분간 반응시켰다. 이 반응에 의해서, pKANTEX93에 삽입하기 위한 제한 효소 인식 서열이 부가된 KM3566의 VH를 코딩하는 유전자 서열을 합성하였다. 마찬가지로, 플라스미드 KM3566VL10K2를 주형으로서 100 ng, 10×KOD 완충액 10 ㎕, 2 mmol/L의 dNTP를 10 ㎕, 25 mmol/L의 염화마그네슘을 2 ㎕, 10 ㎛ol/L의 서열 번호 20 및 21에 기재된 염기 서열을 갖는 프라이머를 각각 1 ㎕, KOD 폴리머라제(도요보세키사 제조) 1 ㎕를 함유하는 총량 100 ㎕로 이루어지는 용액을 96℃에서 3분간 가열한 후, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 반응을 25 사이클, 72℃에서 8분간 반응시켰다. 이 반응에 의해서, pKANTEX93에 삽입하기 위한 제한 효소 인식 서열이 부가된 KM3566의 VL을 코딩하는 유전자 서열을 합성하였다. 각각의 PCR 반응 산물을 에탄올 침전함으로써 정제, 농축하여, SmaI으로 소화한 pBluescriptII SK(-) 벡터에 클로닝함으로써, KM3566의 VH를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 pKM3566VH와, VL을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 pKM3566VL을 취득하였다. 이어서, 벡터 pKANTEX93과, 상기에서 얻어진 pKM3566VL에, 각각 제한 효소 BsiWI(New England Biolabs사 제조)를 가하여 55℃에서 1시간 반응시킨 후, 계속해서 제한 효소 EcoRI(TaKaRa사 제조)을 가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동한 후, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여, 약 12.8 kb의 pKANTEX93의 EcoRI-BsiWI 단편 및 약 0.43 kb의 VL의 EcoRI-BsiWI 단편을 각각 회수하였다. 얻어진 2 종류의 단편을 Ligation high(도요보세키사 제조)를 이용하여 첨부된 설명서에 따라서 연결하고, 얻어진 변형 플라스미드 DNA 용액을 이용하여 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하였다. 형질전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하여 제한 효소 처리에 의해 확인하여, 목적의 약 0.43 kb의 EcoRI-BsiWI 단편이 삽입된 플라스미드 pKANTEX3566VL을 취득하였다. 이어서, 상기에서 얻어진 pKANTEX3566VL과 pKM3566VH에, 각각 제한 효소 ApaI(TaKaRa사 제조)를 가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 제한 효소 NotI(New England Biolabs사 제조)를 더 가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동으로 분획하고, 약 13.2 kb의 pKANTEX3566VL 및 약 0.47 kb의 VH의 ApaI-NotI 단편을 각각 회수하였다. 얻어진 2 종류의 단편을 Ligation High(도요보세키사 제조)를 이용하여 첨부된 설명서에 따라서 연결하고, 얻어진 변형 플라스미드 DNA 용액을 이용하여 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하였다. 형질전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하여 제한 효소 처리에 의해 확인하여, 목적의 약 0.47 kb의 ApaI-NotI 단편이 삽입된 플라스미드 pKANTEX3566을 취득하였다. 상기 플라스미드에 대해서, BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE 바이오시스템즈사 제조)를 이용하여, 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 동사의 시퀀서 ABI PRISM3700에 의해 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, 목적의 KM3566의 VH를 코딩하는 cDNA 및 VL을 코딩하는 cDNA가 각각 클로닝된, 항HB-EGF 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX3566을 취득하였다. 벡터 구축의 개략도를 도 5에 도시하였다.

(2) 항HB-EGF 키메라 항체의 동물 세포에서의 발현

상기 (1)에서 얻어진 항HB-EGF 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX3566을 이용하여 항HB-EGF 키메라 항체의 동물 세포에서의 발현을 통상의 방법[Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company(1992)]에 의해 행하여, 항HB-EGF 키메라 항체를 생산하는 형질전환주 KM3966을 취득하였다.

(3) 정제 키메라 항체의 취득

상기 (2)에서 얻어진 형질전환주 KM3966을 통상의 배양법으로 배양한 후, 세포 현탁액을 회수하여, 3000 rpm, 4℃의 조건으로 10분간의 원심분리를 하여 배양 상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 공경 MillexGV 필터(밀리포어사 제조)를 통해서 여과 멸균하였다. 얻어진 배양 상청으로부터 Protein A High-capacity 레진(밀리포어사 제조) 컬럼을 이용하여, 첨부된 설명서에 따라서 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966을 정제하였다. 얻어진 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 정제 표품의 정제도 및 발현 분자 크기를 구배 겔(ATTO사 제조, E-T520L)을 이용하여, 첨부된 설명서에 따라서 SDS-PAGE에 의해 확인하였다.

결과를 도 6에 도시하였다. 정제한 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 비환원 조건하에서는 분자량 150∼200 kDa 부근에 1 라인의 밴드가, 환원 조건하에서는 약 50 kDa과 약 25 kDa의 2 라인의 밴드가 인정되었다. 이들 분자량은 IgG 클래스의 항체가, 비환원 조건하에서는 분자량은 약 150 kDa이며, 환원 조건하에서는 분자 내의 S-S 결합이 절단되어, 약 50 kDa 분자량의 H쇄와, 약 25 kDa 분자량의 L쇄로 분해된다고 하는 보고[Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14(1988), Monoclonal Antibodies - Principles and Practice, Academic Press Limited(1996)]와 일치하고 있다. 따라서, 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966이 올바른 구조의 항체 분자로서 발현되고 있음이 확인되었다.

<실시예 7>

항HB-EGF 키메라 항체의 활성 평가

(1) 인간 고형암 세포주에 대한 결합 활성

실시예 6에서 얻어진 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 인간 고형암 세포주에 대한 결합성을 평가하기 위해서, 형광항체법에 의해 다음과 같이 검토하였다.

인간 난소암 세포주의 MCAS(JCRB0240), RMG-I(JCRB IF050315), ES-2(CRL1978), 인간 유방암 세포주의 MDA-MB-231(ATCC HTB-26), T47D(HTB-133), SK-BR-3(ATCC HTB-30), ZR-75-1(ATCC CRL-1500), 인간 위암 세포주의 MKN-28(HSRRB JCRB0253)의 각종 세포주를 0.02%-EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리하여 PBS로 세정한 후, 96웰 U 바닥 플레이트(FALCON사 제조)에, 1∼2×10⁵개/50 ㎕/웰씩 분주하였다. 1% BSA-PBS로 20 ㎍/mL로 조제한 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966 용액을 50 ㎕/웰씩 분주하여 플레이트 믹서로 교반하고, 빙상에 30분간 정치하였다. PBS에 의해 2회 세정한 후, 100배 희석한 2차 항체 FITC 접합 AffiniPure F(ab')₂ 단편 토끼 항인간 IgG(H+L)(Jackson Laboratories사 제조)를 50 ㎕/웰씩 첨가하여, 플레이트 믹서로 교반하고, 차광하여 빙상에 30분간 정치하였다. PBS로 2회 세정한 후, 유세포 분석기 EPICS XL System II v3.0(BECKMAN COULTER사 제조)을 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 음성 대조 항체로서는 항FGF8 키메라 항체 KM3034(US2004-0253234)를 이용하였다.

결과를 도 7에 도시하였다. 어느 인간 고형암 세포주의 막형 및 세포막에 결합한 HB-EGF에 대하여도 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 결합하였다.

(2) 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 인간 HB-EGF에 대한 결합 활성 측정

마우스 항체 KM3566과 키메라 항체 KM3966의 인간 HB-EGF에 대한 결합 활성 을 반응속도론적으로 해석하기 위해서, 비아코어를 이용하여 결합 활성을 측정하였다. 이하의 조작은 전부 BiacoreT-100(비아코어사 제조)을 이용하여 행하였다. HBS-EP 완충액(비아코어사 제조)를 이용하여 5 ㎍/mL로 조제한 인간 HB-EGF(R&D사 제조)를 아민 커플링법에 의해 CM5 센서 칩(비아코어사 제조)에 80 RU(공명 단위)가 되도록 고층화(固層化)하였다. 그 후 9 nmol/L에서부터 5단계로 희석한 각종 항체를 10 ㎕/min의 속도로 칩 상에 흘려, 각 농도에 있어서의 센서그램을 해석하여, 각 항체의 인간 HB-EGF에 대한 결합 속도 상수 및 해리 속도 상수를 산출하였다.

그 결과, 양 항체 모두 본 항체 농도역에서는, 인간 HB-EGF와 결합 후, 거의 해리 반응이 인정되지 않음이 분명해지고, 해리 속도 상수에 대해서는 산출할 수 없었다. 한편 결합 속도 상수에 대해서는 산출이 가능하며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 본 결과로부터, 양 항체는 인간 HB-EGF에 대하여 거의 동등한 결합 활성을 가짐이 확인되었다.

[표 1]

항체 Ka(1/Ms)

KM3566 2.7×10⁵

KM3966 2.4×10⁵

(3) 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF에 대한 항HB-EGF 모노클로날 항체의 반응성

세포주를 0.02%-EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리하여 PBS로 세정 한 후, RPMI1640 배지(GIBCO-BRL사 제조)를 가하여, 300 G로 5분간 원심분리하여 상청을 제거하였다. 세포에, 0.1% BSA-PBS로 희석한 재조합 인간 HB-EGF(R&D사 제조)를 1 ㎍/mL로 첨가하여, 37℃에서 10분간 반응시켰다. 재조합 인간 HB-EGF를 첨가하지 않는 경우에는 0.1% BSA-PBS만을 첨가하고, 마찬가지로 37℃에서 10분간 반응시켰다. 1% BSA-PBS에 의해 2회 세정한 후, 1% BSA-PBS로 10 ㎍/mL로 조제한 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966 용액을 50 ㎕/웰로 분주하여 플레이트 믹서로 교반하고, 빙상에 30분간 정치하였다. PBS에 의해 2회 세정한 후, 100배 희석한 2차 항체 FITC 접합 AffiniPure F(ab')₂ 단편 토끼 항인간 IgG(H+L)(Jackson Laboratories사 제조)를 50 ㎕/웰씩 첨가하고, 플레이트 믹서로 교반하고 차광하여, 빙상에 30분간 정치하였다. PBS에 의해 2회 세정한 후, 유세포 분석기 EPICS XL System II v3.0(BECKMAN COULTER사 제조)으로 형광 강도를 측정하였다. 음성 대조 항체로서는 항FGF8 키메라 항체(US2004-0253234)를 이용하였다.

그 결과, 모든 세포주에 있어서, 재조합 HB-EGF를 처리한 세포는 처리하지 않은 세포에 비해서, 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 반응성이 증가하였다(도 8). 따라서, 본 발명의 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 막형 및 세포막에 결합한 HB-EGF의 양방에 결합하는 것이 분명하게 되었다.

(4) 인간 고형암 세포주에 대한 중화 활성

실시예 6에서 얻어진, 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 HB-EGF에 대한 중화 활성을 평가하기 위해서, HB-EGF 의존성 증식 저해 활성을 측정하였다. HB-EGF 의 존성 세포로서는, HB-EGF 양성 인간 난소암 세포주 RMG-I(JCRB IF050315) 및 인간 위암 세포주 MKN-28(HSRRB JCRB)을 이용하였다.

세포주를 0.02%-EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리하여 PBS로 세정한 후, RPMI1640 배지(GIBCO-BRL사 제조)(무혈청)를 가하고, 300 G로 5분간 원심분리하여 상청을 제거하였다. 같은 배지로 세포를 현탁한 후, RMG-I는 2.5×10³개/50 ㎕/웰, MKN-28은 1×10⁴개/50 ㎕/웰로 96웰 플레이트에 파종하였다. 0.1% BSA-PBS로 희석한 재조합 인간 HB-EGF(R&D사 제조)를, RMG-I의 경우에는 3 ng/mL 농도인 것을 50 ㎕/웰, MKN-28의 경우에는 30 ng/mL 농도인 것을 50 ㎕/웰로 첨가한 후, 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966을 30 ㎍/mL에서부터 10배로 4단계로 희석하여, 50 ㎕/웰로 첨가하여 혼합하였다. 음성 대조 항체로서 인간 IgG(미츠비시웰파마사 제조)를 이용하였다. 37℃에서 72시간 배양한 후, 생세포수 측정 시약 WST-1(나카라이테스크사 제조) 15 ㎕/웰을 첨가하여, 2시간 후에 OD 450 nm의 흡광도를 플레이트 판독기(Emax; Molecular Devices사 제조)를 이용하여 측정하였다.

결과를 도 9에 도시하였다. RMG-I, MKN-28 모두 HB-EGF 첨가에 의한 세포 증식이 인정되고, HB-EGF 의존성 증식을 보였다. 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 HB-EGF 의존성 세포 증식을 항체 농도 의존적으로 억제하여, 중화 활성을 보였다.

(5) 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)

실시예 6에서 얻어진 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 ADCC 활성을 이하에 나타내는 방법에 따라서 측정하였다.

(5)-1 표적 세포 용액의 조제

인간 난소암 세포주의 MCAS, RMG-I, ES-2, 인간 유방암 세포주의 MDA-MB-231, T47D, SK-BR-3, ZR-75-1, 인간 위암 세포주의 MKN-28의 각종 세포주를 0.02%-EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리하여, 1% FCS(JRH사 제조)를 함유하는 페놀 레드 불포함 RPMI1640 배지(Invitrogen사 제조)(이하, ADCC용 배지라 기재함)로 세정한 후, 같은 배지로 지적 농도로 조제하여 표적 세포 용액으로 하였다.

(5)-2 이펙터 세포 용액의 조제

말초혈 단핵구(Peripheral Blood Mononuclear Cell: PBMC)는 건강한 보통 사람의 말초혈로부터 이하에 나타낸 방법에 의해 분리하였다. 헤파린나트륨주(注)N「시미즈」(시미즈세이야쿠사 제조)를 소량 포함하게 한 시린지로 건강한 보통 사람 말초혈 50 mL를 채혈하였다. 채취한 말초혈에 동량의 생리 식염수(메이커명)를 가하여 희석하여, 잘 교반하였다. 15 mL 튜브(Greiner사 제조)에 약 6.5 mL씩 분주한 Polymorphprep(NYCOMED사 제조) 위에, 동량의 희석 말초혈을 조심스럽게 중층(重層)하고, 실온에서 800 G로 30분간 원심분리하여 단핵구층을 분리하였다. ADCC용 배지를 이용하여 2회 세정한 후, 같은 배지에 의해 지적 농도로 조제하여, 이펙터 세포 용액으로 하였다.

(5)-3 ADCC 활성의 측정

96웰 U 바닥 플레이트(FALCON사 제조)의 각 웰에, 항체 희석 용액을 50 ㎕ 분주해 두고, (4)-1에서 조제한 표적 세포 용액을 50 ㎕, (4)-2에서 조제한 이펙터 세포 용액을 50 ㎕ 첨가하여(이펙터 세포(E)와 표적 세포(T)의 비는 25로 함), 전 량을 150 ㎕로 하여, 37℃에서 4시간 반응시켰다. 표적 세포 자연 유리값은 표적 세포 용액 50 ㎕, 배지 100 ㎕를 가함으로써, 또한, 표적 세포 및 이펙터 세포 자연 유리값은 표적 세포 용액 50 ㎕, 이펙터 세포 50 ㎕, 배지 50 ㎕를 가함으로써 취득하였다. 표적 세포 전체 유리값은 표적 세포 용액 50 ㎕, 배지 80 ㎕를 가하여, 반응 종료 45분 전에 9% Triton X-100 용액을 20 ㎕ 첨가함으로써 취득하였다. 반응 후, 플레이트를 원심분리하고, 상청 중의 락트산 데히드로게나제(LDH) 활성을, LDH-Cytotoxic Test(Wako사 제조)를 이용하여, 첨부된 설명서에 따라서 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. ADCC 활성은 이하의 식에 의해 구하였다.

(식)

ADCC 활성(%)=([검체의 흡광도]-[표적 세포 및 이펙터 세포 자연 유리의 흡광도])/([표적 세포 전체 유리의 흡광도]-[표적 세포 자연 유리의 흡광도])×100

결과를 도 10에 도시하였다. 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 HB-EGF 양성 인간 고형암 세포주에 대하여 항체 농도 의존적으로 세포 상해 활성을 보였다.

(6) 마우스 이종이식을 이용한 항종양 활성 평가

실시예 6에서 얻어진 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 항종양 활성을 평가하기 위해서, 인간 난소암, 인간 유방암의 마우스 이종이식 초기암 및 진행암 모델을 이용하여 평가하였다.

(6)-1 초기암 모델에서의 평가

인간 난소암 세포주의 MCAS 및 ES-2를 0.02%-EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리하여 PBS로 세정한 후, RPMI1640 배지(GIBCO-BRL사 제조)를 가하고, 300 G로 5분간 원심분리하여 상청을 제거하였다. 같은 배지를 가하여 원심분리 조작에 의해 세정한 후, 지적 농도로 조제한 세포 현탁액을 SCID 마우스 암컷 6∼8주령(니혼구레아사 제조)의 우측 겨드랑이 아래에 각각 100 ㎕로 피하 이식하였다. 같은 날부터, 항체 투여군은 PBS로 희석한 항체 용액을, 대조군은 PBS만을 100 ㎕씩 꼬리 정맥 투여하였다(1군 5∼7마리). 투여는 일주일에 2회, 총 8회 행하고, 종양이 관찰된 시점에서부터 노기스(버니어 캘리퍼스)로 종양 직경을 측정하였다. 종양 체적은 이하의 식에 의해 산출하였다.

(식)

종양 체적(mm³)=장경×단경²×O.5

결과를 도 11에 도시하였다. 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 난소암 세포주 MCAS 및 ES-2의 종양 증식을 유의하게 저해하였다. 따라서, 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 이식 초기암 모델에 있어서, 항종양 효과를 지님이 분명하게 되었다.

(6)-2 진행암 모델에서의 평가

인간 난소암 세포주의 MCAS 및 ES-2, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231을 0.02%-EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리하여 PBS로 세정한 후, RPMI1640 배지(GIBCO-BRL사 제조)를 가하여, 300 G로 5분간 원심분리하여 상청을 제거하였다. 같은 배지를 가하여 원심분리 조작에 의해 세정한 후, 지적 농도로 조제한 세포 현탁액을 SCID 마우스 암컷 6∼8주령(니혼구레아사 제조)의 우측 겨드랑이 아래에 각각 100 ㎕로 피하 이식하였다. 경과를 관찰하여, 종양 체적이 100 mm³ 전후로 된 단계에서 마우스를 선발하여, 각 군의 평균 종양 체적이 동등하게 되도록 군을 나누었다. 같은 날부터, 항체 투여군은 PBS로 희석한 항체 용액을, 대조군은 PBS만을 100 ㎕씩 꼬리 정맥 투여하였다(1군 6-7마리). 투여는 일주일에 2회, 총 8회 행하고, 항체 투여 시점에서부터 노기스로 종양 직경을 측정하였다. 종양 체적은 이하의 식에 의해 산출하였다.

(식)

종양 체적(mm³)=장경×단경²×O.5

결과를 도 12에 도시하였다. 그 결과, 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 난소암 세포주 MCAS, ES-2 및 유방암 세포주 MDA-MB-231의 종양 증식을 유의하게 저해하였다. 따라서, 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 진행암 모델에 있어서, 항종양 활성을 지님이 분명해졌다.

<실시예 8>

항HB-EGF 항체의 인간 혈액암 세포주에 대한 반응성 및 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)의 평가

(1) 인간 혈액암 세포주에 있어서의 HB-EGF 발현 해석

인간 혈액암 세포주에 있어서의 HB-EGF 발현을 평가하기 위해서 형광항체법에 의해서 검토하였다. 인간 급성 골수성 백혈병 세포주의 ML-1(DSMZ ACC464), MOLM-13(DSMZ ACC554), MV-4-11(ATCC CRL9591), HL-60(ATCC CCL-240), NB-4(DSMZ ACC207), KG-1a(ATCC CCL-246.1) 및 인간 T 세포성 백혈병 세포주의 Karpas299(DSMZ ACC31), Jurkat(RCB RCB0806)를 PBS로 세정한 후, 지적 농도로 조제하여, 96웰 U 바닥 플레이트(FALCON사 제조)에 50 ㎕/웰(약 2×10⁵ 세포)로 분주하였다. 1% BSA-PBS로 20 ㎍/mL로 조제한 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566 용액을 50 ㎕/웰을 분주하여 플레이트 믹서로 교반하고, 빙상에 30분간 정치하였다. PBS에 의해 2회 세정한 후, 50배 희석한 2차 항체 항마우스 Ig/FITC 염소 F(ab')₂(DAKO사 제조)를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 플레이트　믹서로 교반하고 차광하여 빙상에 30분간 정치하였다. PBS로 2회 세정한 후, 유세포 분석기 EPICS XL System II v3.0(BECKMAN COULTER사 제조)을 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 음성 대조 항체로는 마우스 IgG1(DAKO사 제조)을 이용하였다.

결과를 도 13에 도시하였다. KM3566은 T 세포성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병 세포주에 특이적으로 결합하였다. 따라서, 인간 혈액암 세포주에 있어서, HB-EGF가 발현하고 있음이 확인되었다.

(2) 인간 혈액암 세포주에 대한 항HB-EGF 키메라 항체의 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)

HB-EGF 발현이 확인된 급성 골수성 백혈병 세포주에 대한, HB-EGF 키메라 항체 KM3966의 ADCC 활성을 이하에 나타내는 방법에 따라서 측정하였다.

(2)-1 표적 세포 용액의 조제

인간 급성 골수성 백혈병 세포주의 ML-1, MOLM-13, MV-4-11, HL-60, NB-4 및 KG-1a를 PBS로 세정한 후, ADCC용 배지로 세정한 후, 같은 배지로 지적 농도로 조 제하여 표적 세포 용액으로 하였다.

(2)-2 이펙터 세포 용액의 조제

말초혈 단핵구(Peripheral Blood Mononuclear Cell: PBMC)는 건강한 보통 사람 말초혈로부터 이하에 나타낸 방법에 의해 분리하였다. 헤파린나트륨주N「시미즈」(시미즈세이야쿠사 제조)를 소량 포함하게 한 시린지로 건강한 보통 사람 말초혈 50 mL를 채혈하였다. 채취한 말초혈에 동량의 생리식염수(오츠카세이야쿠사 제조)를 가해 희석하여 잘 교반하였다. 15 mL 튜브(Greiner사 제조)에 약 6.5 mL씩 분주한 Polymorphprep(NYCOMED사 제조) 위에, 동량의 희석 말초혈을 조심스럽게 중층하고, 실온에서 800 G로 30분간 원심분리하여 단핵구층을 분리하였다. ADCC용 배지를 이용하여 2회 세정한 후, 같은 배지에 의해 지적 농도로 조제하여, 이펙터 세포 용액으로 하였다.

(2)-3 ADCC 활성의 측정

96웰 U 바닥 플레이트(FALCON사 제조)의 각 웰에, 항체 희석 용액을 50 ㎕ 분주해 두고서, (2)-1에서 조제한 표적 세포 용액을 50 ㎕, (2)-2에서 조제한 이펙터 세포 용액을 50 ㎕ 첨가하여(이펙터 세포(E)와 표적 세포(T)의 비는 25로 함), 전량을 150 ㎕로 하고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. 표적 세포 자연 유리값은 표적 세포 용액 50 ㎕, 배지 100 ㎕를 가함으로써, 또, 표적 세포 및 이펙터 세포 자연 유리값은 표적 세포 용액 50 ㎕, 이펙터 세포 50 ㎕, 배지 50 ㎕를 가함으로써 취득하였다. 표적 세포 전체 유리값은 표적 세포 용액 50 ㎕, 배지 80 ㎕를 가하여, 반응 종료 45분 전에 9% Triton X-100 용액을 20 ㎕ 첨가함으로써 취득하였다. 반 응 후, 플레이트를 원심분리하여, 상청 중의 락트산 데히드로게나제(LDH) 활성을 LDH-Cytotoxic Test(Wako사 제조)를 이용하여 첨부된 설명서에 따라서 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. ADCC 활성은 이하의 식에 의해 구하였다.

(식)

ADCC 활성(%)=([검체의 흡광도]-[표적 세포 및 이펙터 세포 자연 유리의 흡광도])/([표적 세포 전체 유리의 흡광도]-[표적 세포 자연 유리의 흡광도])×100

결과를 도 14에 도시하였다. 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 HB-EGF 양성 인간 혈액암 세포주에 대하여, 항체 농도 의존적으로 세포 상해 활성을 보였다. 따라서, 본 발명의 항EB-EGF 모노클로날 항체 및 유전자 변형 항체가, HB-EGF를 발현하고 있는 난소암 등의 고형암뿐만 아니라, 급성 골수성 백혈병 및 T 세포성 백혈병 등의 혈액암에 대하여도 유효할 가능성이 시사되었다.

<실시예 9>

항HB-EGF 인간화 항체의 제작

(1) 항HB-EGF 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 설계

우선, 항HB-EGF 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열을 다음과 같은 식으로 설계하였다.

서열 번호 12∼14로 각각 나타내어지는 항체 VH의 CDR1∼3의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열을 선택하였다. Kabat 등은, 기지의 여러 가지 인간 항체의 VH를 그 아미노산 서열의 상동성으로부터 3 종류의 서브그룹(HSG I∼III)으로 분류하고, 또한, 이들 서브그룹마다 공통 서열을 보고하고 있다[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]. 이들 공통 서열은 인간에게 있어서 보다 면역원성이 저하될 가능성이 생각되므로, 이들 공통 서열을 기초로 항HB-EGF 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열을 설계하였다. 보다 결합 활성이 높은 항HB-EGF 인간화 항체를 제작하기 위해서, 설계에 있어서는 인간 항체의 VH의 3 종류의 서브그룹의 공통 서열의 FR의 아미노산 서열 중, 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566의 VH의 FR의 아미노산 서열과 가장 높은 상동성을 갖는 FR의 아미노산 서열을 선택하였다.

상동성을 검색한 결과, HSGI, HSGII 및 HSGIII의 상동성은 각각 73.6%, 50.6% 및 56.3%였다. 따라서, KM3566의 VH 영역의 FR의 아미노산 서열은 서브그룹 I과 가장 높은 상동성을 갖고 있었다.

이상의 결과로부터, 인간 항체의 VH의 서브그룹 I의 공통 서열의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566의 VH의 CDR의 아미노산 서열을 이식하였다. 그러나, 서열 번호 9에 기재된 KM3566의 VH의 아미노산 서열 중의 74번째의 Lys은 Kabat 등이 예로 든 인간 항체 FR의 아미노산 서열의 상당하는 부위에 있어서, 가장 사용되는 빈도가 높은 아미노산 잔기는 아니지만, 비교적 높은 빈도로 사용되는 아미노산 잔기이기 때문에, 상기한 KM3566의 아미노산 서열에서 인정되는 아미노산 잔기를 이용하기로 하였다. 이와 같이 하여, 서열 번호 22로 표시되는 항HB-EGF 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0을 설계하였다.

이어서, 항HB-EGF 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열을 다음과 같은 식으로 설계하였다.

서열 번호 15∼17로 각각 나타내어지는 항체 VL의 CDR1∼3의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열을 선택하였다. Kabat 등은 기지의 여러 가지 인간 항체의 VL을 그 아미노산 서열의 상동성으로부터 4 종류의 서브그룹(HSG I∼IV)으로 분류하고, 또한, 이들 서브그룹마다 공통 서열을 보고하고 있다[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]. 그래서 VH의 경우와 같은 식으로 하여, 인간 항체의 VL의 4 종류의 서브그룹의 공통 서열의 FR의 아미노산 서열 중, 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566의 VL의 FR의 아미노산 서열과 가장 높은 상동성을 갖는 FR의 아미노산 서열을 선택하였다.

상동성을 검색한 결과, HSGI, HSGII, HSGIII 및 HSGIV의 상동성은 각각 75.0%, 75.0%, 71.3% 및 81.3%였다. 따라서, KM3566의 VL의 FR의 아미노산 서열은 서브그룹 IV와 가장 높은 상동성을 갖고 있었다.

이상의 결과로부터, 인간 항체의 VL의 서브그룹 IV의 공통 서열의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566의 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하였다. 그러나, 서열 번호 11에 기재된 KM3566의 VL의 아미노산 서열 중의 110번째의 Leu은, 카배트 등이 예로 드는 인간 항체 FR의 아미노산 서열의 상당하는 부위에 있어서, 가장 사용되는 빈도가 높은 아미노산 잔기는 아니지만, 비교적 높은 빈도로 사용되는 아미노산 잔기이기 때문에, 상기한 KM3566의 아미노산 서열에서 인정되는 아미노산 잔기를 이용하기로 하였다. 이와 같이 하여, 서열 번호 23으로 표시되는 항HB-EGF 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열 LV0을 설계하였 다.

상기에서 설계한 항HB-EGF 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0 및 VL의 아미노산 서열 LV0은 선택한 인간 항체의 FR의 아미노산 서열에 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566의 CDR의 아미노산 서열만을 이식한 서열이다. 그러나, 일반적으로, 인간화 항체를 제작하는 경우에는 단순한 인간 항체의 FR로의 마우스 항체의 CDR의 아미노산 서열의 이식만으로는 결합 활성이 저하되어 버리는 경우가 많다. 이 때문에, 결합 활성의 저하를 피하기 위해서, 인간 항체와 마우스 항체에서 상이한 FR의 아미노산 잔기 중, 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 아미노산 잔기를 CDR의 아미노산 서열의 이식과 함께 개변하는 것이 이루어지고 있다. 그래서, 본 실시예에서도, 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 FR의 아미노산 잔기를 다음과 같은 식으로 동정하였다.

우선, 상기에서 설계한 항HB-EGF 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0 및 VL의 아미노산 서열 LV0으로 이루어지는 항체 V 영역(HV0LV0)의 삼차원 구조를 컴퓨터 모델링의 수법을 이용하여 구축하였다. 삼차원 구조 좌표 제작에 관해서는 소프트웨어 AbM(Oxford Molecular사 제조)를, 삼차원 구조의 표시에 관해서는 소프트웨어 Pro-Explore(Oxford Molecular사 제조), 또는 ViewerLite(Accelrys사 제조)를 이용하여 각각 첨부된 사용설명서에 따라서 행하였다. 또한, 항HB-EGF 마우스 모노클로날 항체 KM3566의 V 영역의 삼차원 구조의 컴퓨터 모델도 같은 식으로 하여 구축하였다. 또한, HV0LV0의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566과 상이한 아미노산 잔기를 선택하여, 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566 의 아미노산 잔기로 개변한 아미노산 서열을 제작하여, 마찬가지로 삼차원 구조 모델을 구축하였다. 이들 제작한 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566, HV0LV0 및 개변체의 V 영역의 삼차원 구조를 비교하여, 항체의 결합 활성에 영향을 준다고 예측되는 아미노산 잔기를 동정하였다.

그 결과, HV0LV0의 FR의 아미노산 잔기 중에서 항원 결합 부위의 삼차원 구조를 변화시켜, 항체의 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 아미노산 잔기로서, HV0에서는 9번째의 Ala, 20번째의 Val, 30번째의 Thr, 38번째의 Arg, 41번째의 Pro, 48번째의 Met, 67번째의 Arg, 68번째의 Val, 70번째의 Ile, 95번째의 Tyr 및 118번째의 Val을, LV0에서는 15번째의 Leu, 19번째의 Ala, 21번째의 Ile, 49번째의 Pro 및 84번째의 Leu을 각각 선택하였다. 이들 선택한 아미노산 잔기 중 적어도 하나 이상의 아미노산 서열을 마우스 항체 KM3566의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 개변하여, 여러 가지 개변을 갖는 인간화 항체의 VH 및 VL을 설계하였다. 구체적으로는, 항체 VH에 관해서는, 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열의 9번째의 Ala을 Thr으로, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환하는 아미노산 개변 중 적어도 하나의 개변을 도입하였다. 또한, VL에 관해서는, 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열의 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환하는 아미노산 개변 중 적어도 하나의 개변을 도입하였다.

(2) 항HB-EGF 인간화 항체의 VH를 코딩하는 cDNA의 구축

본 실시예 (1)에서 설계한 항HB-EGF 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0을 코딩하는 cDNA를, PCR을 이용하여 다음과 같은 식으로 구축하였다.

우선, 설계한 아미노산 서열과, 서열 번호 9의 1∼19번째에 나타내어지는 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566의 H쇄의 분비 신호 서열을 연결시켜 완전한 항체 아미노산 서열로 하였다. 이어서, 상기 아미노산 서열을 유전자 코돈으로 변환하였다. 하나의 아미노산 잔기에 대하여 복수의 유전자 코돈이 존재하는 경우에는, 항체의 유전자의 염기 서열에 보이는 사용 빈도[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]를 고려하여, 대응하는 유전자 코돈을 결정하였다. 결정한 유전자 코돈을 연결시켜, 완전한 항체 V 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA의 염기 서열을 설계하고, 또한 5' 말단과 3' 말단에 PCR 반응시의 증폭용 프라이머의 결합 염기 서열(인간화 항체 발현용 벡터에 클로닝하기 위한 제한 효소 인식 서열도 포함함)을 부가하였다. 설계한 염기 서열을 5' 말단 측에서부터 약 100 염기씩 총 4 가닥의 염기 서열로 나눠(인접하는 염기 서열은 그 말단에 약 20 염기의 중복 서열을 갖도록 함), 이들을 센스쇄, 안티센스쇄를 번갈아 가는 순서로, 합성 DNA(서열 번호 24∼27)를 합성하였다.

각 합성 DNA(서열 번호 24∼27)를 최종 농도가 0.1 ㎛ol/L가 되도록 50 ㎕의 반응액에 가하고, 0.5 ㎛ol/L T3 프라이머(Takara Shuzo사 제조), 0.5 ㎛ol/L T7 프라이머(Takara Shuzo사 제조) 및 1 단위의 KOD 폴리머라제(도요보세키사 제조)를 이용하여, KOD 폴리머라제에 첨부된 사용설명서에 따라서 PCR을 실시하였다. 이때의 반응 조건은 사용설명서에 기록된 조건(94℃ 30초간, 50℃ 30초간, 74℃ 60초간의 사이클을 30 사이클)에 따랐다. 상기 반응액을 에탄올 침전한 후, 멸균수에 용해하여, 적당한 제한 효소 처리를 한 후에, 플라스미드 pBluescript II SK(-)(Stratagene사 제조)에 연결하였다. 이와 같이 하여 얻어진 변형 플라스미드 DNA 용액을 이용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하고, 형질전환주로부터 플라스미드 DNA를 조제하여, BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Applied Biosystems사 제조)를 이용하여 염기 서열을 해석한 결과, 목적의 염기 서열을 갖는 플라스미드를 취득하였다.

이어서, 본 실시예 (1)에서 설계한 FR의 아미노산 잔기의 개변은, 변이를 갖는 합성 DNA를 제작하여, 상기한 PCR을 행하거나, 상기에서 제작한 HV0을 코딩하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 변이를 갖는 합성 DNA를 프라이머로서 PCR을 행하여, 증폭 유전자 단편을 단리함으로써 실시하였다. 개변 후의 아미노산 잔기의 유전자 코돈에 대해서는, 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566에 보이는 유전자 코돈이 되도록 행하였다. 또한, 이하에 특별히 기재가 없는 경우에는, 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 60초간의 사이클을 35 사이클의 PCR 반응으로 반응시켰다. PCR 반응은 KOD-플러스 폴리머라제(TOYOBO사 제조)를 사용하여 행하였다. 또한, 사용한 합성 DNA는 파스마크사 제조의 것이다.

(3) 항HB-EGF 인간화 항체의 VL을 코딩하는 cDNA의 구축

본 실시예 (1)에서 설계한 항HB-EGF 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열을 코 딩하는 cDNA를, PCR을 이용하여 다음과 같은 식으로 구축하였다.

우선, 설계한 아미노산 서열과, 서열 번호 11의 1∼20번째에 나타내어지는 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566의 L쇄의 분비 신호 서열을 연결시켜 완전한 항체 아미노산 서열로 하였다. 이어서, 상기 아미노산 서열을 유전자 코돈으로 변환하였다. 하나의 아미노산 잔기에 대하여 복수의 유전자 코돈이 존재하는 경우에는, 항체의 유전자의 염기 서열에 보이는 사용 빈도[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]를 고려하여, 대응하는 유전자 코돈을 결정하였다. 결정한 유전자 코돈을 연결시켜, 완전한 항체 V 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA의 염기 서열을 설계하고, 또한 5' 말단과 3' 말단에 PCR 반응시의 증폭용 프라이머의 결합 염기 서열(인간화 항체 발현용 벡터에 클로닝하기 위한 제한 효소 인식 서열도 포함함)을 부가하였다. 설계한 염기 서열을 5' 말단 측에서 약 100 염기씩 총 4 가닥의 염기 서열로 나눠(인접하는 염기 서열은 그 말단에 약 20 염기의 중복 서열을 갖도록 함), 이들을 센스쇄, 안티센스쇄를 번갈아 가는 순서로, 합성 DNA(서열 번호 28∼31)를 합성하였다.

각 합성 DNA(서열 번호 28∼31)를 최종 농도가 0.1 ㎛ol/L가 되도록 50 ㎕의 반응액에 가하고, 0.5 ㎛ol/L T3 프라이머(Takara Shuzo사 제조), 0.5 ㎛ol/L T7 프라이머(Takara Shuzo사 제조) 및 1 단위의 KOD 폴리머라제(도요보세키사 제조)를 이용하여, KOD 폴리머라제에 첨부된 사용설명서에 따라서 상기 (2)와 마찬가지로 PCR을 행하였다. 반응액을 에탄올 침전한 후, 멸균수에 용해하여, 적당한 제한 효소 처리를 한 후에, 플라스미드 pBluescript II SK(-)(Stratagene사 제조)에 연결 하였다. 이와 같이 하여 얻어진 변형 플라스미드 DNA 용액을 이용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하고, 형질전환주로부터 플라스미드 DNA를 조제하여, BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Applied Biosystems사 제조)를 이용하여 염기 서열을 해석한 결과, 목적의 염기 서열을 갖는 플라스미드 pBS/LV0을 취득하였다.

이어서, 본 실시예 (1)에서 설계한 FR의 아미노산 잔기의 개변은, 변이를 갖는 합성 DNA를 제작하여, 상기한 PCR을 행하거나, 상기에서 제작한 LV0을 코딩하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 변이를 갖는 합성 DNA를 프라이머로서 PCR을 행하여, 증폭 유전자 단편을 단리함으로써 실시하였다. 개변 후의 아미노산 잔기의 유전자 코돈에 관해서는, 항HB-EGF 마우스 항체 KM3566에서 보이는 유전자 코돈이 되도록 행하였다.

이하에, 특별히 기재가 없는 경우에는, PCR 반응은 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 60초간의 사이클을 35 사이클로, KOD-플러스 폴리머라제(TOYOBO사 제조)를 사용하여 행하였다. 또한, 사용한 합성 DNA는 파스마크사 제조의 것을 사용하였다.

(4) 항HB-EGF 인간화 항체 발현 벡터의 구축

WO 97/10354에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93의 적당한 위치에 본 실시예 (2) 및 (3)에서 얻어진 HV0 및 LV0을 코딩하는 각각의 cDNA 또는 이들의 개변체를 코딩하는 cDNA를 삽입하여, 각종 항HB-EGF 인간화 항체 발현 벡터를 구축하였다.

(5) 항HB-EGF 인간화 항체의 동물 세포를 이용한 안정 발현 및 정제 항체의 취득

항HB-EGF 인간화 항체의 동물 세포를 이용한 안정 발현 및 배양 상청으로부터의 항체의 정제는 실시예 6(2) 및 (3)에 기재된 방법과 같은 식으로 행하였다.

<실시예 10>

항HB-EGF 항체의 결합 에피토프에 관한 해석

인간 HB-EGF에 대한 항HB-EGF 항체 KM3566, KM3579 및 KM3966의 결합 에피토프에 관해서 하기의 해석을 실시하였다.

(1) 변이형 인간 HB-EGF 전체 길이 유전자 도입 세포의 조성

항HB-EGF 항체 KM3566, KM3579 및 KM3966은 모두 인간 HB-EGF에 반응하고, 마우스 HB-EGF에는 교차 반응성을 보이지 않는다. 그래서, 인간 HB-EGF의 EGF 유사 도메인의 아미노산 서열 중에서, 마우스 HB-EGF와 다른 10개의 아미노산을 각각 1개씩 마우스 유래의 아미노산으로 치환한 10 종류의 변이형 인간 HB-EGF 전체 길이 단백질(이하, 변이 HB-EGF라고 기재함)을 발현하는 유전자 도입 세포를 조성하고, 이들에 대한 항HB-EGF 항체의 결합 활성을 측정함으로써, 결합 에피토프의 해석을 행하였다. 제작한 10 종류의 변이 HB-EGF를 이하에 나타낸다.

(1) N 말단으로부터 115번째의 페닐알라닌을 티로신으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, F115Y로 표기)

(2) N 말단으로부터 122번째의 리신을 아르기닌으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, K122R로 표기)

(3) N 말단으로부터 124번째의 발린을 루신으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, V124L로 표기)

(4) N 말단으로부터 125번째의 리신을 글루타민으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, K125Q로 표기)

(5) N 말단으로부터 127번째의 루신을 페닐알라닌으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, L127F로 표기)

(6) N 말단으로부터 129번째의 알라닌을 트레오닌으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, A129T로 표기)

(7) N 말단으로부터 133번째의 이소루신을 리신으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, I133K로 표기)

(8) N 말단으로부터 135번째의 히스티딘을 루신으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, H135L로 표기)

(9) N 말단으로부터 141번째의 글루탐산을 히스티딘으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, E141H로 표기)

(10) N 말단으로부터 147번째의 세린을 트레오닌으로 치환한 변이 HB-EGF(이하, S147T로 표기).

또한 양성 대조로서 이하의 인간/마우스 키메라형 HB-EGF 전체 길이 유전자 도입 세포를 조성하였다.

(11) N 말단으로부터 1번째에서 49번째까지의 서열이 마우스 HB-EGF 유래 서열, N 말단으로부터 50번째에서 208번째까지의 서열이 인간 HB-EGF 유래 서열로 이 루어지는 인간/마우스 키메라형 HB-EGF(이하, pRTHGC-6이라 기재함)를 제작하였다. EGF 유사 도메인은 전부 인간 HB-EGF 유래 서열이기 때문에, 양성 대조로서 이용하였다.

상기한 변이 HB-EGF 및 인간/마우스 키메라형 HB-EGF의 일과성 발현용 플라스미드는 메카타 등의 방법(J. Bio. Chem., Vol. 272, 27084-27090, 1997)을 이용하여 제작하였다. 마우스 LMTK-세포(ATCC CCL-1.3)는 100 단위/mL 페니실린 G, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 상기한 각 발현 플라스미드를 인산칼슘법에 의해 마우스 LMTK-세포에 도입한 후, 48시간 배양한 것을 이후의 실험에 이용하였다.

음성 대조에는 벡터만을 마우스 LMTK-세포에 도입한 세포(이하, mock이라 표기)를 이용하였다.

(2) 변이 HB-EGF 유전자 도입 세포를 이용한 항HB-EGF 항체의 결합 활성 해석

우선, 1×10⁵개의 변이 HB-EGF 유전자 도입 세포, 인간/마우스 키메라형 HB-EGF 유전자 도입 세포 및 mock에, 결합 완충액(Ham's F12에 비필수 아미노산, 20 mM Hepes-NaOH(pH 7.2), 10% 소 태아 혈청을 첨가한 것)으로 2 ㎍/mL로 희석한 비오틴 표지 항HB-EGF 항체(KM3566, KM3579, KM3966)를 4℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 빙냉한 세정 완충액(PBS에 0.5 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂, 0.1% 소 태아 혈청을 첨가한 것)으로 2회 세정하고, 이어서 1회 PBS(+)(PBS에 0.5 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂를 첨가한 것)로 세정하였다. 세정한 세포에, PBS(+)로 1.8%로 희석한 포름알데히드　용액을 가하여, 4℃에서 20분간 세포를 고정하였다. 이어서, PBS(+)로 1회 세정한 후, 글리신 용액(0.2 M-글리신, 100 mM-Tris, pH 8.1)으로 4℃에서 20분간 처리하고, 이어서 세정 완충액으로 4℃에서 20분간 인큐베이트하였다. 이어서, 결합 완충액으로 0.1 ㎍/mL로 희석한 HRP 결합 스트렙타비딘을 4℃에서 1시간 반응시켜, 세정 완충액으로 2회 세정, PBS(+)로 2회 세정하였다. 퍼옥시다제 검출용 키트(나카라이테스크사 제조, ELISA POD 기질 OPD 키트)를 이용하여 발색을 행하고, 492 nm에 있어서의 흡광도를 측정하여, 세포에 결합한 HRP 활성을 측정하였다.

항HB-EGF 항체의 각종 변이 HB-EGF 유전자 도입 세포 및 인간/마우스 키메라형 HB-EGF 유전자 도입 세포에 대한 흡광도로부터 mock에 대한 흡광도를 뺀 값을 A 값으로 하였다.

다음에, 마우스 LMTK-세포의 세포막 상에 발현한 변이 HB-EGF 단백의 발현량을 해석하기 위해서, 모든 변이 HB-EGF와 같게 결합하는 항HB-EGF 토끼 폴리클로날 항체(항체 명칭; H-6, 인간 HB-EGF의 N 말단으로부터 54번째∼73번째까지의 합성 펩티드를 세파로스 CL-6B에 가교한 것을 토끼에게 면역 감작함으로써 제작된 항체, EMBO J., 13, 2322-2330, 1994)의 변이 HB-EGF 유전자 도입 세포, 인간/마우스 키메라형 HB-EGF 유전자 도입 세포 및 mock에 대한 흡광도를 상기와 같은 방법에 의해 측정하였다. 다만 비오틴 표지 H-6 항체는 항체 농도 10 ㎍/mL로 사용하였다. H-6 항체의 각 변이 HB-EGF 유전자 도입 세포 및 인간/마우스 키메라형 HB-EGF 유 전자 도입 세포에 대한 흡광도로부터 mock에 대한 흡광도를 뺀 값을 B 값으로 하였다.

유전자 도입 세포의 발현량의 차를 보정하기 위해서, A 값을 B 값으로 나눔으로써 A/B 값을 구하였다. 항HB-EGF 항체의 양성 대조 pRTHGC-6에 대한 A/B 값을 100%로 했을 때의, 각종 변이형 HB-EGF에 대한 A/B 값의 비율을 산출하여, 이것을 각종 변이 HB-EGF에 대한 상대적 결합 활성으로 하였다.

결과를 도 15에 나타내었다. 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566은 pRTHGC-6과 비교하여, I133K, H135L 및 S147T에 거의 결합하지 않았다. 따라서, 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566은 133번째의 I, 135번째의 H 및 147번째의 S의 아미노산을 포함하는 에피토프를 인식하고 있음이 분명해졌다. 또한, 동일한 항체 가변 영역을 갖는 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966도, 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566과 마찬가지로, pRTHGC-6과 비교하여, I133K 및 H135L에는 거의 결합하지 않고, S147T에서는 약 1/3로 결합 활성이 저하되었다. 따라서, 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966은 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566과 마찬가지로, 133번째의 I, 135번째의 H 및 147번째의 S의 아미노산을 포함하는 에피토프를 인식하고 있음이 분명해졌다.

항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3579는 pRTHGC-6과 비교하여, E141H에만 결합하지 않고, 다른 변이 HB-EGF에는 전부 pRTHGC-6과 동등한 결합 활성을 보였다. 따라서, 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3579는 141번째의 E의 아미노산을 포함하는 에피토프를 인식하고 있음이 분명해졌다.

이상의 결과로부터, 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3566 및 항HB-EGF 키메라 항체 KM3966과, 항HB-EGF 모노클로날 항체 KM3579는 HB-EGF의 상이한 에피토프를 인식하고 있음이 분명하게 되었다.

본 발명에 의하면, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF에 결합하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편이 제공된다.

서열표 프리텍스트

서열 번호 18 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 19 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 20 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 21 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 22 - 인공 서열의 설명: 인간화 항체의 아미노산 서열

서열 번호 23 - 인공 서열의 설명: 인간화 항체의 아미노산 서열

서열 번호 24 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 25 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 26 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 27 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 28 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 29 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 30 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

서열 번호 31 - 인공 서열의 설명: 합성 DNA

SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. Osaka University Fukuoka University <120> Monoclonal antibody which binds to Heparin binding-EGF <130> 1870 <150> JP2006-157279 <151> 2006-06-06 <160> 31 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gctacgcggg ccacgctgct ggctggcctg acctaggcgc gcggggtcgg gcggccgcgc 60 gggcgggctg agtgagcaag acaagacact caagaagagc gagctgcgcc tgggtcccgg 120 ccaggcttgc acgcagaggc gggcggcaga cggtgcccgg cggaatctcc tgagctccgc 180 cgcccagctc tggtgccagc gcccagtggc cgccgcttcg aaagtgactg gtgcctcgcc 240 gcctcctctc ggtgcgggac catgaagctg ctgccgtcgg tggtgctgaa gctctttctg 300 gctgcagttc tctcggcact ggtgactggc gagagcctgg agcggcttcg gagagggcta 360 gctgctggaa ccagcaaccc ggaccctccc actgtatcca cggaccagct gctaccccta 420 ggaggcggcc gggaccggaa agtccgtgac ttgcaagagg cagatctgga ccttttgaga 480 gtcactttat cctccaagcc acaagcactg gccacaccaa acaaggagga gcacgggaaa 540 agaaagaaga aaggcaaggg gctagggaag aagagggacc catgtcttcg gaaatacaag 600 gacttctgca tccatggaga atgcaaatat gtgaaggagc tccgggctcc ctcctgcatc 660 tgccacccgg gttaccatgg agagaggtgt catgggctga gcctcccagt ggaaaatcgc 720 ttatatacct atgaccacac aaccatcctg gccgtggtgg ctgtggtgct gtcatctgtc 780 tgtctgctgg tcatcgtggg gcttctcatg tttaggtacc ataggagagg aggttatgat 840 gtggaaaatg aagagaaagt gaagttgggc atgactaatt cccactgaga gagacttgtg 900 ctcaaggaat cggctgggga ctgctacctc tgagaagaca caaggtgatt tcagactgca 960 gaggggaaag acttccatct agtcacaaag actccttcgt ccccagttgc cgtctaggat 1020 tgggcctccc ataattgctt tgccaaaata ccagagcctt caagtgccaa acagagtatg 1080 tccgatggta tctgggtaag aagaaagcaa aagcaaggga ccttcatgcc cttctgattc 1140 ccctccacca aaccccactt cccctcataa gtttgtttaa acacttatct tctggattag 1200 aatgccggtt aaattccata tgctccagga tctttgactg aaaaaaaaaa agaagaagaa 1260 gaaggagagc aagaaggaaa gatttgtgaa ctggaagaaa gcaacaaaga ttgagaagcc 1320 atgtactcaa gtaccaccaa gggatctgcc attgggaccc tccagtgctg gatttgatga 1380 gttaactgtg aaataccaca agcctgagaa ctgaattttg ggacttctac ccagatggaa 1440 aaataacaac tatttttgtt gttgttgttt gtaaatgcct cttaaattat atatttattt 1500 tattctatgt atgttaattt atttagtttt taacaatcta acaataatat ttcaagtgcc 1560 tagactgtta ctttggcaat ttcctggccc tccactcctc atccccacaa tctggcttag 1620 tgccacccac ctttgccaca aagctaggat ggttctgtga cccatctgta gtaatttatt 1680 gtctgtctac atttctgcag atcttccgtg gtcagagtgc cactgcggga gctctgtatg 1740 gtcaggatgt aggggttaac ttggtcagag ccactctatg agttggactt cagtcttgcc 1800 taggcgattt tgtctaccat ttgtgttttg aaagcccaag gtgctgatgt caaagtgtaa 1860 cagatatcag tgtctccccg tgtcctctcc ctgccaagtc tcagaagagg ttgggcttcc 1920 atgcctgtag ctttcctggt ccctcacccc catggcccca ggccacagcg tgggaactca 1980 ctttcccttg tgtcaagaca tttctctaac tcctgccatt cttctggtgc tactccatgc 2040 aggggtcagt gcagcagagg acagtctgga gaaggtatta gcaaagcaaa aggctgagaa 2100 ggaacaggga acattggagc tgactgttct tggtaactga ttacctgcca attgctaccg 2160 agaaggttgg aggtggggaa ggctttgtat aatcccaccc acctcaccaa aacgatgaag 2220 gtatgctgtc atggtccttt ctggaagttt ctggtgccat ttctgaactg ttacaacttg 2280 tatttccaaa cctggttcat atttatactt tgcaatccaa ataaagataa cccttattcc 2340 ataaaaaaaa aaaaaaaaaa 2360 <210> 2 <211> 208 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Lys Leu Leu Pro Ser Val Val Leu Lys Leu Phe Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Leu Ser Ala Leu Val Thr Gly Glu Ser Leu Glu Arg Leu Arg Arg Gly 20 25 30 Leu Ala Ala Gly Thr Ser Asn Pro Asp Pro Pro Thr Val Ser Thr Asp 35 40 45 Gln Leu Leu Pro Leu Gly Gly Gly Arg Asp Arg Lys Val Arg Asp Leu 50 55 60 Gln Glu Ala Asp Leu Asp Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys 85 90 95 Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr 100 105 110 Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg 115 120 125 Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His 130 135 140 Gly Leu Ser Leu Pro Val Glu Asn Arg Leu Tyr Thr Tyr Asp His Thr 145 150 155 160 Thr Ile Leu Ala Val Val Ala Val Val Leu Ser Ser Val Cys Leu Leu 165 170 175 Val Ile Val Gly Leu Leu Met Phe Arg Tyr His Arg Arg Gly Gly Tyr 180 185 190 Asp Val Glu Asn Glu Glu Lys Val Lys Leu Gly Met Thr Asn Ser His 195 200 205 <210> 3 <211> 86 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 3 Asp Leu Gln Glu Ala Asp Leu Asp Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser 1 5 10 15 Lys Pro Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg 20 25 30 Lys Lys Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg 35 40 45 Lys Tyr Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu 50 55 60 Leu Arg Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg 65 70 75 80 Cys His Gly Leu Ser Leu 85 <210> 4 <211> 76 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 4 Arg Val Thr Leu Ser Ser Lys Pro Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys 1 5 10 15 Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys 20 25 30 Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu 35 40 45 Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro 50 55 60 Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His Gly Leu Ser Leu 65 70 75 <210> 5 <211> 75 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 5 Val Thr Leu 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Leu Ala Arg 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 aga acc tat ggt ata acc tgg gtg aag cag aga act gga cag ggc ctt 192 Arg Thr Tyr Gly Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gag att ttt cct gga agt ggt aat act tac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag ggc aag gcc tca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc 288 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat ttc tgt gca agg gag agc ttc tct gat ggt tac tac ggc tac ttt 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Ser Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 423 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 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<211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Leu Lys 130 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Thr Tyr Gly Ile Thr 1 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Glu Ser Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Ser Leu 1 5 10 15 Ala <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial sequence: Synthetic DNA <400> 18 aaggaaaaaa gcggccgctg aacacactga ctctaaccat ggaatgga 48 <210> 19 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial sequence: Synthetic DNA <400> 19 cgatgggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtgc 44 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial sequence: Synthetic DNA <400> 20 ccggaattca gacaggcagg ggaagcaaga tgga 34 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial sequence: Synthetic DNA <400> 21 agccaccgta cgtttcagct ccagcttggt cccagcaccg 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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 24 <211> 160 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial sequence: Synthetic DNA <400> 24 aattaaccct cactaaaggg atccgcggcc gcgacccctc accatgaacc tcgggctcag 60 tttgattttc cttgccctca ttttaaaagg tgtccagtgt caggtgcagc tggtgcagtc 120 tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 160 <210> 25 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial sequence: Synthetic DNA <400> 25 ggtgttgccg gagccaggaa aaatctcccc catccactca agcccttgtc caggggcctg 60 tcgcacccag gtaatgccgt aggtggtaaa ggtgtaacca gaagccttgc aggagacctt 120 cactgaggcc ccaggcttct tcacctcagc ccc 153 <210> 26 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial sequence: Synthetic DNA <400> 26 gagtggatgg gggagatttt tcctggctcc 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Claims (24)

1. 세포막에 결합하고 있는 헤파린 결합 상피세포 증식 인자 유사 증식 인자(heparin binding epidermal growth factor-like growth factor, 이하, HB-EGF라 칭함), 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
2. 제1항에 있어서, 세포막에 결합하고 있는 HB-EGF, 막형 HB-EGF 및 분비형 HB-EGF의 상피 증식 인자 유사 도메인(EGF 유사 도메인)에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분비형 HB-EGF와 HB-EGF 수용체와의 결합을 저해하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분비형 HB-EGF에 대하여 중화 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분비형 HB-EGF와, HB-EGF 수용체 또는 디프테리아 독소와의 결합 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 133번째, 135번째 및 147번째 중 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
7. 제6항에 있어서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 133번째, 135번째 및 147번째의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 141번째의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
9. 제1항 내지 제3항, 제5항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리도마 KM3579(FERM BP-10491)가 생산하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리도마 KM3567(FERM BP-10573)이 생산하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리도마 KM3566(FERM BP-10490)이 생산하는 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
12. 제1항 내지 제7항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역(이하, VH라 기재함)의 상보쇄 결정 영역(complementarity determining region, 이하 CDR이라 기재함)1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 12, 13 및 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 항체의 경쇄 가변 영역(이하, VL이라 기재함)의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 15, 16 및 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 유전자 변형 항체인 항체 또는 그 항체 단편.
14. 제13항에 있어서, 유전자 변형 항체가 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 것인 항체 또는 그 항체 단편.
15. 제14항에 있어서, 인간형 키메라 항체의 VH가 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, VL이 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함 하는 것인 인간형 키메라 항체 또는 그 항체 단편.
16. 제14항에 있어서, 인간화 항체의 VH가, 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열의 9번째의 Ala을 Thr으로, 20번째의 Val을 Leu으로, 30번째의 Thr을 Arg으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 41번째의 Pro을 Thr으로, 48번째의 Met을 Ile으로, 67번째의 Arg을 Lys으로, 68번째의 Val을 Ala으로, 70번째의 Ile을 Leu으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 118번째의 Val을 Leu으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 또한,

    인간화 항체의 VL이, 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열의 15번째의 Leu을 Val으로, 19번째의 Ala을 Val으로, 21번째의 Ile을 Met으로, 49번째의 Pro을 Ser으로, 84번째의 Leu을 Val으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 하나의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간화 항체 또는 그 항체 단편.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(diabody), 디설파이드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 항체 단편.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 코딩하는 DNA.
19. 제18항에 기재된 DNA를 함유하는 변형체 벡터.
20. 제19항에 기재된 변형체 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.
21. 제20항에 기재된 형질전환체를 배지에서 배양하여, 배양물 중에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 생성 축적시켜, 배양물로부터 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편의 제조 방법.
22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
23. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, HB-EGF가 관여하는 질환의 치료제.
24. 제23항에 있어서, HB-EGF가 관여하는 질환이 암인 치료제.

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