WO2018123979A1 - ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に結合する抗体 - Google Patents

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に結合する抗体 Download PDF

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了輔 中野
さやか 前田
祐二 伊東
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Definitions

  • the present invention includes an antibody that binds to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) or an antibody fragment thereof, a hybridoma that produces the antibody or the antibody fragment, a base sequence encoding the antibody or the antibody fragment A nucleic acid, a transformed cell containing a vector containing the nucleic acid, a method for producing the antibody or the antibody fragment, a composition containing the antibody or the antibody fragment, and an antigen present in the brain using the antibody or the antibody fragment
  • the present invention relates to a method of detecting or measuring, a method of diagnosing or treating a brain disease, a method of improving the brain retention of antibodies, and a method of increasing the amount of antibodies in the brain.
  • CDR complementarity determining region
  • FR human antibody framework region
  • Non-patent Document 1 the phage display technology using a human antibody sequence library has come to be used, and the fully human anti-TNF ⁇ antibody adalimamba was approved in 2002 as the first antibody obtained by the phage display technology. More than 60 antibody drugs with CD20, CD52, TNF ⁇ , HER2, EGFR, etc. as target antigens have already been approved (Non-patent Document 1).
  • antibodies are a widely recognized pharmaceutical format. Most of the antibody drugs approved so far are for cancer and immune diseases, accounting for about 75% or more of the total.
  • Non-patent Document 2 a factor (BDNF), a glial-derived neurotrophic factor (GDNF) exhibits a neuroprotective action in a central nervous disease.
  • BDNF a factor
  • GDNF glial-derived neurotrophic factor
  • Non-Patent Document 3-5 the ratio of cerebrospinal fluid (CSF) concentration to serum concentration
  • the reason why the drug delivery amount decreases in the central nervous system including the brain and spinal cord is a mechanism called blood brain barrier (BBB) that restricts the transport of substances between the tissue fluid between blood and brain.
  • BBB blood brain barrier
  • the blood-brain barrier has a physical and non-specific control mechanism by intercellular junctions of vascular endothelial cells and a substrate-specific discharge mechanism by an exhaust transporter to protect the central nervous system from foreign substances or drugs. Plays an important role in maintaining homeostasis.
  • Non-patent Documents 6-9 ⁇ -L-iduronidase for Hurler's syndrome
  • iduronic acid 2-sulfatase for hunter syndrome iduronic acid 2-sulfatase for hunter syndrome
  • Non-patent Document 11 a method of administering iduronic acid 2-sulfatase into a patient's brain has been reported in order to prevent progression of brain damage in a patient with Hunter syndrome (mucopolysaccharidosis type II) (Patent Document 1).
  • Patent Document 11 direct administration into the medullary cavity or brain is highly invasive (Non-patent Document 11).
  • RMT receptor-mediated transcytosis
  • LDLRf low density lipoprotein receptor family
  • a blood-brain barrier passing technique via transferrin receptor has been reported by producing a fusion protein of an anti-transferrin receptor antibody and nerve growth factor.
  • bispecific antibodies Patent Documents 2 and 3, and Non-Patent Documents 12 and 13
  • BACE1 anti-beta secretase
  • BACE1 anti-beta secretase
  • a fusion antibody Patent Document 4, Non-Patent Document 14
  • a monovalent antibody of an anti-transferrin receptor is fused to the carboxyl terminal side of the antibody has been reported.
  • Non-Patent Document 13 The brain delivery of anti-transferrin receptor antibody and anti-BACE1 antibody by bispecific antibody reported that when the antibody was administered at 20 mg / kg body weight in the mouse, the amount of antibody uptake in the brain increased to about 4 times that of the control.
  • Non-patent Document 9 a technique for passing a drug through the blood-brain barrier by encapsulating the drug in a liposome having an anti-transferrin receptor antibody on its surface has been reported. It has been reported that anti-rat transferrin receptor antibody and immunomicelle fusion increase the uptake amount in rat brain by about 2 to 5 times (Non-patent Document 9).
  • Non-Patent Document 17 In rhesus monkeys, it has been reported that the amount taken up in the brain 2 hours after administration of the fusion antibody of labeled anti-human insulin receptor antibody and GDNF is about 15 times that of GDNF (Non-Patent Document). 17).
  • Non-Patent Document 20 since transferrin receptor and insulin receptor are expressed not only in cerebral vascular endothelial cells but also in the whole body such as the liver, these technologies increase the amount of drug delivered to the central nervous system and deliver drugs to the liver as well. It occurs (Non-Patent Document 20). Furthermore, since the antigen is expressed throughout the body, the blood half-life of the antibody is short (Non-patent Document 12).
  • Fc5 is a heavy chain variable region of a llama-derived single domain heavy chain antibody (Variable domain of Heavy chain of Heavy chain antibody, hereinafter referred to as VHH), and Fc5 and human Fc fusion deliver brain delivery compared to control IgG Increasing is shown in the in vitro BBB model and the rat in vivo model.
  • a fusion of an Fc5-derived single chain antibody (single chain antibody; scFv) and a metabotropic glutamate receptor type 1 (metatropic glutamate receptor type I, hereinafter referred to as mGluRI) antibody is a fusion of a control single chain antibody and an mGluRI antibody.
  • scFv single chain antibody
  • mGluRI metabotropic glutamate receptor type 1
  • CSF exposure in a rat model has been reported to increase, but the increase is about 5 times (Non-patent Document 23).
  • Non-patent Documents 24 and 25 fetal Fc receptor (neonal Fc receptor; FcRn)
  • FcRn spinal Fc receptor
  • the intracerebral half-life after intracerebral administration is as short as 48 minutes (Non-patent Document 24).
  • MOG is a protein belonging to the immunoglobulin superfamily and constitutes myelin.
  • the full length of human MOG consists of 218 amino acids and is expressed in the outermost layer of myelin in the central nervous system and plays a role in cell adhesion and cell surface interactions (Non-patent Documents 26-28).
  • Non-patent Documents 29 and 30 In inflammatory diseases in which central nerve glial cells such as multiple sclerosis (MS) are attacked by autoimmunity, MOG is considered to be a self-antigen candidate (Non-patent Documents 29 and 30). . In MS patients, the concentration of anti-MOG antibody in serum is low, but it has been reported that anti-MOG antibody is also detected in the central nerve (Non-patent Document 29).
  • Non-patent Documents 30, 32, and 33 The reason for this is that during the pathology such as MS, the leakage of humoral factors and the invasion of inflammatory cells causes the blood-brain barrier to break down, making it easier for antibodies to migrate to the central nervous system.
  • Patent Documents 30 and 31 Furthermore, it has been reported that autoantibodies are produced locally in the central nervous system by B cells and plasma cells that have infiltrated the central nervous system.
  • EAE Experimental autoimmune encephalomyelitis
  • Non-patent documents 29 and 35 exacerbate the EAE score by administering an anti-MOG antibody to an EAE-induced animal, but 1-2 days after the antibody administration (non-patent document 29) or 4 A day later (Non-patent Document 35) shows a peak of the EAE score, which is transient.
  • Non-patent Documents 36 and 37 it has been reported that EAE does not develop even when only an anti-MOG antibody is administered to a normal animal.
  • Boado RJ. Methods in Enzymology, 503, 269-292, 2012 Boado RJ., Et al., Drug Metab. Dispos., 37 (12), 2299-2304, 2009 Boado RJ., Et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 333 (3), 961-969, 2010 Boado RJ., Et al., Bioconjugate Chem., 1, 97-104, 2012 Yun Zhang.et al., J. Pharmacol. Exp.
  • Non-patent documents 29 and 35 describe that when an anti-MOG antibody is administered to an EAE model, the antibody is detected in the brain. However, when an anti-MOG antibody is administered to the periphery of a normal animal, There are no reports of anti-MOG antibodies that can detect their presence in the body.
  • the present invention relates to a MOG-binding molecule that binds to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and a method using the molecule.
  • MOG myelin oligodendrocyte glycoprotein
  • the present invention provides a MOG-binding molecule that binds to MOG and a method using the molecule, specifically, an antibody or an antibody fragment thereof.
  • the present invention relates to the following (1) to (22).
  • An antibody or antibody fragment that binds to myelin oligodendrocyte glycoprotein hereinafter referred to as MOG.
  • MOG myelin oligodendrocyte glycoprotein
  • the amino acid sequences of the complementarity determining regions (hereinafter referred to as CDRs) 1 to 3 of the heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) comprise the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively;
  • An antibody wherein the amino acid sequences of CDRs 1-3 of the light chain variable region (VL) comprise the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 11, and 12, respectively;
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 16, 17 and 18, respectively, and the amino acid sequences of CDR1 to 3 of VL are respectively represented by SEQ ID NOs: 22, 23 and 24.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 28, 29, and 30, respectively, and the amino acid sequences of CDR1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 34, 35, and 36, respectively.
  • an antibody comprising the amino acid sequence described, (D) an antibody fragment in which the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the heavy chain variable region (hereinafter referred to as VHH) of the heavy chain antibody comprise the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 40, 41 and 42, (E)
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 153, 154 and 155, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 158, 159 and 160, respectively.
  • An antibody comprising the amino acid sequence described (F)
  • the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VH include the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 163, 164, and 165, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 168, 169, and 170, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 173, 174 and 175, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 178, 179 and 180, respectively.
  • the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 183, 184, and 185, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 188, 189, and 190, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 193, 194 and 195, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 198, 199 and 200, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 203, 204 and 205, respectively, and the amino acid sequences of CDR1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 208, 209 and 210, respectively.
  • the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 213, 214, and 215, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 218, 219, and 220, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 223, 224 and 225, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 228, 229 and 230, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 233, 234 and 235, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 238, 239 and 240, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 243, 244 and 245, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 248, 249 and 250, respectively.
  • An antibody comprising the amino acid sequence described, (O) an antibody that competes with at least one antibody described in (a) to (n) for binding to MOG; (P) an antibody that binds to an epitope including an epitope to which any one of the antibodies described in (a) to (n) binds, and (q) any one of the above described (a) to (n) An antibody that binds to the same epitope to which the antibody binds. (R) An antibody comprising an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence of any one of the antibodies (a) to (n).
  • An antibody comprising the amino acid sequence set forth in 336 and the amino acid sequence of VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 338.
  • An antibody comprising an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence of any one of the antibodies (a) to (n) and ( Bernard1) to ( 7222).
  • the antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (4), wherein the antibody or the antibody fragment is a bispecific antibody.
  • Antibody fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single chain antibody (scFv), dimerized V region (diabody), disulfide stabilized V region (dsFv), VHH and CDR
  • the antibody is one selected from the group consisting of a mouse antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, an alpaca antibody, a camel antibody, a llama antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody, (1) to (9) The antibody and the antibody fragment thereof according to any one of the above.
  • At least one selected from the group consisting of the following (a) to (c) is bound to the antibody or antibody fragment that binds to MOG according to any one of (1) to (10) Fusion antibody or fusion antibody fragment.
  • A hydrophilic polymer,
  • B amphiphilic polymers, and (c) functional molecules.
  • a nucleic acid comprising a base sequence encoding the antibody according to any one of (1) to (11).
  • a transformed cell comprising a vector comprising the nucleic acid according to (13).
  • the hybridoma according to (12) or the transformed cell according to (14) is cultured, and the antibody or antibody fragment thereof according to any one of (1) to (11) is collected from the culture solution A method for producing the antibody or antibody fragment thereof according to any one of (1) to (11).
  • (19) A method for detecting or measuring an antigen present in the brain using the antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (11), or the composition according to (16).
  • (20) A method for diagnosing or treating a brain disease using the antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (11), or the composition according to (16).
  • (21) Using the antibody according to any one of (1) to (11) or the antibody fragment or fusion antibody or fusion antibody fragment, or the composition according to (16), the antibody or the antibody fragment or A method for improving brain retention of a fusion antibody or fusion antibody fragment.
  • the MOG binding molecule of the present invention not only increases the brain retention of the binding molecule itself by binding specifically to MOG, but also transports and stays in the brain by modifying other molecules to MOG binding molecules. Can be applied to the treatment of brain diseases.
  • Specific MOG binding molecules of the present invention include antibodies.
  • the antibody or the antibody fragment of the present invention is an antibody having brain retention by binding to MOG in the brain. Therefore, the antibody or the antibody fragment of the present invention comprises a composition for detection or measurement of an antigen (MOG or MOG and other antigens present in the brain) present in the brain, a composition for diagnosing a brain disease, And can be used as a pharmaceutical composition for treating brain diseases.
  • FIG. 1 shows the results of analyzing the binding of scFv-displaying phage clones that bind to MOG to rMOG-FLAG_Fc by ELISA.
  • the vertical axis represents the absorbance with respect to rMOG-FLAG_Fc, and the horizontal axis represents the name of the scFv antibody displayed by each phage clone.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing the binding of each anti-MOG antibody to HEK cells, rat MOG / HEK cells, mouse MOG / HEK cells, cynomolgus monkey MOG / HEK cells or human MOG / HEK cells using a flow cytometer.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • the dotted line histogram shows the binding property of the anti-AVM antibody used as a negative control, and the solid line histogram shows the binding property of each MOG antibody.
  • 3 (A) and 3 (B) are the results of the rat brain migration evaluation of anti-MOG antibody.
  • FIG. 3 (A) shows the antibody concentration in serum 4 days after administration of the antibody to the rat.
  • the vertical axis represents antibody concentration (ng / mL), and the horizontal axis represents the administered antibody.
  • FIG. 3 (B) shows the antibody concentration in the brain tissue 4 days after administration of the antibody to the rat.
  • the vertical axis represents the amount of antibody per brain weight (ng / g brain), and the horizontal axis represents the administered antibody.
  • the white bar graph represents the anti-AVM antibody used as a negative control
  • the black bar graph represents the anti-MOG antibody.
  • 4 (A) and 4 (B) are the results of rat brain migration evaluation of anti-MOG antibody.
  • FIG. 4 (A) shows the antibody concentration in serum 4 days and 10 days after administration of the antibody to rats.
  • the vertical axis represents antibody concentration (ng / mL), and the horizontal axis represents the number of days (days) after antibody administration.
  • FIG. 4 (B) shows the antibody concentration in the brain tissue 4 days and 10 days after administration of the antibody to the rat.
  • the vertical axis indicates the amount of antibody per brain weight (ng / g brain), and the horizontal axis indicates the number of days (days) after antibody administration.
  • white diamonds indicate anti-AVM antibody used as a negative control
  • white squares indicate anti-transferrin receptor antibody OX26 antibody
  • black triangles indicate anti-MOG antibody MOG01 antibody.
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the binding properties of various bispecific antibodies to HEK293F cells, rat MOG / HEK293F cells, or human MOG / HEK293F cells using a flow cytometer.
  • the vertical axis represents the number of cells
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • FIG. 6 shows the results of analyzing the binding properties of various bispecific antibodies to the human breast cancer cell line SK-BR-3 using a flow cytometer.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • the dotted line histogram shows the binding property of the anti-AVM antibody used as a negative control, and the solid line histogram shows the binding property of each bispecific antibody.
  • FIGS. 7 (A) and (B) are the results of the rat brain migration evaluation of bispecific antibodies that bind to MOG.
  • FIG. 7 (A) shows the antibody concentration in the serum 10 days after administration of the antibody to the rat.
  • the vertical axis represents the antibody concentration (ng / mL), and the horizontal axis represents the bispecific antibody used.
  • FIG. 7 (B) shows the antibody concentration in the brain tissue 10 days after administration of the antibody to the rat.
  • the vertical axis represents the amount of antibody per brain weight (ng / g brain), and the horizontal axis represents the bispecific antibody used.
  • FIGS. 8A and 8B show the results of evaluation of anti-MOG01 antibody migration to the mouse brain.
  • FIG. 8 (A) shows the antibody concentration in the serum 3, 6, 10, 14, 21, and 28 days after the antibody was administered to the mouse.
  • FIG. 8 (B) shows the antibody concentration in the brain tissue 3, 6, 10, 14, 21, and 28 days after the antibody was administered to the mouse.
  • the vertical axis represents antibody concentration (ng / g brain), and the horizontal axis represents time (days).
  • the white circles indicate anti-AVM antibodies used as negative controls, and the black squares indicate MOG01 scFv-hG4PE.
  • FIGS. 9A to 9C show the results of the mouse brain migration imaging evaluation of the anti-MOG01 antibody.
  • FIG. 9 (A) shows brain fluorescence intensity measurement data 6 days after administration of Alexa FluorR 488-labeled anti-AVM antibody and Alexa FluorR 488-labeled anti-MOG01 antibody as negative controls, and FIG. 9 (B) shows 14 days later. It is the fluorescence intensity measurement data of the brain.
  • FIG. 9C shows values obtained by correcting the brain fluorescence after 6 days and 14 days with the fluorescence intensity of the administered antibody.
  • the vertical axis represents the amount of fluorescence in the brain / the amount of fluorescence of the administered antibody (%), and the horizontal axis represents the administered antibody.
  • FIGS. 10A to 10C show the structures of various bispecific antibodies that bind to AVM and MOG.
  • FIG. 10A shows the structure of the AVM-MOG01 IgG4PE (R409K) antibody
  • FIG. 10B shows the structure of the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 Fab antibody
  • FIG. 10C shows the structure of the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01sscFv antibody.
  • FIGS. 11A and 11B show the structures of various bispecific antibodies that bind to AVM and MOG.
  • FIG. 11 shows AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv antibody, AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv2 antibody and AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv4 antibody, and FIG. Antibody to AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscF11 antibody structure.
  • 12A to 12C show the results of analyzing the binding properties of various bispecific antibodies to human MOG / L929 cells using a flow cytometer. The vertical axis represents average fluorescence intensity, and the horizontal axis represents antibody concentration. In FIG.
  • FIGS. 12 A
  • white circles indicate AVM IgG4PE (R409K) antibody (negative control)
  • black squares indicate AVM-MOG01 IgG4PE (R409K) antibody.
  • white circles indicate AVM IgG4PE (R409K) _AVMsscFv antibody (negative control)
  • black squares indicate AVM IgG4PE (R409K) _MOG01sscFv antibody.
  • FIG. 12 (C) white circles indicate AVM IgG4PE (R409K) _AVM Fab antibody (negative control)
  • black squares indicate AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 Fab antibody.
  • FIG. 13A and 13B show the results of analyzing the binding properties of various bispecific antibodies to human MOG / L929 cells using a flow cytometer.
  • the vertical axis represents average fluorescence intensity, and the horizontal axis represents antibody concentration.
  • white squares indicate AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv antibody
  • white circles indicate AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv2 antibody
  • white triangles indicate AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv4 antibody.
  • the white diamond is AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv3 antibody
  • the black diamond is AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv5 antibody
  • the white circle is AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv6 antibody
  • the black circle is MOVM01dscFv6
  • Triangles are AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv8 antibody
  • black triangles are AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv9 antibody
  • white squares are AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv10 antibody
  • black squares are AVM IgG4PE (R409dFG11FMO11) FIGS.
  • FIGS. 14A and 14B show the results of evaluation of various bispecific antibodies in the mouse brain.
  • the vertical axis represents the antibody concentration, and the horizontal axis represents the bispecific antibody used.
  • FIGS. 14A and 14B show the antibody concentrations in serum and brain tissue 10 days after administration of AVM IgG4PE (R409K) antibody (negative control) and AVM-MOG01 IgG4PE (R409K) antibody, respectively.
  • FIGS. 15A and 15B show the results of evaluation of various bispecific antibodies in the mouse brain.
  • the vertical axis represents the antibody concentration, and the horizontal axis represents the bispecific antibody used.
  • FIGS. 16A and 16B show antibody concentrations in serum and brain tissue 10 days after administration of AVM IgG4PE (R409K) _AVMsscFv antibody (negative control) and AVM IgG4PE (R409K) _MOG01sscFv antibody, respectively.
  • FIGS. 16A and 16B show the results of evaluation of various bispecific antibodies in the mouse brain. The vertical axis represents the antibody concentration, and the horizontal axis represents the bispecific antibody used.
  • FIGS. 16A and 16B show antibody concentrations in serum and brain tissue 10 days after administration of AVM IgG4PE (R409K) _AVM Fab antibody (negative control) and AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 Fab antibody, respectively.
  • FIGS. 17A to 17D show the results of evaluation of various bispecific antibodies in the mouse brain.
  • the vertical axis represents the antibody concentration, and the horizontal axis represents the bispecific antibody used.
  • Negative control corresponding to AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv antibody is AVM IgG4PE (R409K) _AVMdscFv antibody
  • negative control corresponding to AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv3 antibody is AVM IgG4PE (R409K) _AVMdSMG40FV4FMO4A4
  • the corresponding negative control is AVM IgG4PE (R409K) _AVMdscFv5 antibody.
  • FIG. 17 (A) shows the antibody concentration in serum 10 days after antibody administration.
  • FIG. 17B shows the antibody concentration in the brain tissue 10 days after antibody administration.
  • FIG. 17C shows the antibody concentration in the serum 28 days after antibody administration.
  • FIG. 17D shows the antibody concentration in the brain tissue 28 days after antibody administration.
  • FIG. 18 is an amino acid sequence of scFv of a similar clone of MOG antibody, and shows a similar clone of MOG301 antibody.
  • FIG. 19 shows the scFv amino acid sequence of a similar clone of the MOG antibody, and shows a similar clone of the MOG303 antibody.
  • FIG. 20 is a scFv amino acid sequence of a similar clone of the MOG antibody and shows a similar clone of the MOG307 antibody.
  • FIG. 21 is an amino acid sequence of scFv of a similar clone of MOG antibody, and shows a similar clone of MOG310 antibody.
  • 22A and 22B are the amino acid sequences of scFv of similar clones of MOG antibodies.
  • FIG. 22 (A) shows a similar clone of MOG329 antibody
  • FIG. 22 (B) shows a similar clone of MOG456 antibody.
  • FIG. 23 shows the results of analyzing the binding properties of anti-MOG antibodies to Expi293F cells using a flow cytometer.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • the dotted line histogram shows the binding property of the anti-AVM antibody used as a negative control, and the solid line histogram shows the binding property of each MOG antibody.
  • FIG. 24 shows the results of analyzing the binding properties of anti-MOG antibodies to mouse MOG / Expi293F cells using a flow cytometer.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • the dotted line histogram shows the binding property of the anti-AVM antibody used as a negative control, and the solid line histogram shows the binding property of each MOG antibody.
  • FIG. 25 shows the results of analyzing the binding properties of anti-MOG antibodies to human MOG / Expi293F cells using a flow cytometer.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • the dotted line histogram shows the binding property of the anti-AVM antibody used as a negative control, and the solid line histogram shows the binding property of each MOG antibody.
  • FIG. 26 shows the results of analyzing the binding of the enzyme fusion antibody MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM to human MOG / L929 cells using a flow cytometer.
  • the vertical axis represents average fluorescence intensity, and the horizontal axis represents antibody concentration.
  • FIG. 27 shows the results of analyzing the binding of anti-ASM antibody (manufactured by LSBio) to MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM and AVM IgG4PE (R409K) -ASM by ELISA.
  • the vertical axis represents the absorbance, and the horizontal axis represents the name of the antibody immobilized on the solid phase.
  • MOG01 IgG4PE and AVM IgG4PE were used as negative controls.
  • the thin diagonal bar graph shows the data of anti-ASM antibody 5 ⁇ g / mL
  • the thick diagonal bar graph shows the data of anti-ASM antibody 1 ⁇ g / mL
  • the white bar graph shows the data of anti-ASM antibody 0.2 ⁇ g / mL.
  • 28 (A) and (B) are the results of evaluation of the enzyme fusion antibodies MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM and AVM IgG4PE (R409K) -ASM in mouse brain migration.
  • the vertical axis represents antibody concentration
  • the horizontal axis represents the enzyme fusion antibody used.
  • FIG. 28 (A) shows the antibody concentration in serum 10 days after antibody administration.
  • FIG. 28 (B) shows the antibody concentration in brain tissue 10 days after antibody administration.
  • the present invention relates to an antigen-binding molecule that binds to myelin-oligodendrocyte glycoprotein (hereinafter referred to as MOG). More specifically, the present invention relates to an antibody or antibody fragment that binds to MOG.
  • MOG myelin-oligodendrocyte glycoprotein
  • the MOG-binding molecule of the present invention may be in any molecular form as long as it is a molecule that specifically binds to MOG and stays in the brain.
  • the MOG binding molecule is preferably a molecule that binds to the extracellular region of MOG.
  • MOG is a protein belonging to the immunoglobulin superfamily and constitutes myelin.
  • the full length of human MOG consists of 218 amino acids and is expressed in the outermost layer of myelin in the central nervous system and plays a role in cell adhesion and cell surface interactions.
  • Examples of the animal species of MOG to which the MOG-binding molecule of the present invention binds include mouse, rat, cynomolgus monkey and / or human, but are not particularly limited to these species, and are appropriate depending on the use of the antibody. Different animal species can be selected.
  • the antibody of the present invention is used for human pharmaceutical use, the antibody is preferably an antibody that binds to at least human MOG.
  • human MOG is a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78 or the amino acid sequence of NCBI accession number AAB08088, one amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78, or the amino acid sequence of NCBI accession number AAB08088.
  • a polypeptide having an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 78 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by NCBI accession number AAB08088 can be obtained by site-directed mutagenesis [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic acids Research, 10, 6487 (tl), Proc. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)]
  • site-specific mutation into DNA encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. It is.
  • Examples of the gene encoding human MOG include the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 77 and the nucleotide sequence of NCBI accession number U64564.
  • a DNA encoding a polypeptide consisting of a base sequence of SEQ ID NO: 77 or a base sequence of NCBI accession number U64564 with one or more bases deleted, substituted or added, and having a MOG function A nucleotide sequence having at least 60% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 77 or the nucleotide sequence of NCBI Accession No.
  • U64564 preferably having a homology of 80% or more, more preferably 95 A DNA comprising a base sequence having a homology of at least% and encoding a polypeptide having a function of MOG, a base sequence described in SEQ ID NO: 77, or a DNA comprising the base sequence of NCBI accession number U64564 Hybrid under stringent conditions It consists size to DNA, and such a gene encoding a polypeptide having the function of MOG also included in the gene encoding MOG in the present invention.
  • a colony hybridization method or a plaque hybridization method using a DNA containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 77 or the nucleotide sequence of NCBI accession number U64564 as a probe It means a hybridizable DNA obtained by Southern blot hybridization method or DNA microarray method.
  • 0.7 to 1.0 mol / L of sodium chloride is present using a DNA or DNA derived from a hybridized colony or plaque, or a filter or slide glass on which a PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • DNA capable of hybridizing DNA having at least 60% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 77, or nucleotide sequence of NCBI Accession No. U64564, preferably DNA having homology of 80% or more, Preferably, DNA having 95% or more homology can be mentioned.
  • MOG The functions of MOG include involvement in cell adhesion and cell surface interaction on myelin.
  • the gene used in the present invention includes a gene in which a small-scale mutation has occurred in the nucleotide sequence due to such a polymorphism, and is included in the gene encoding MOG in the present invention.
  • the numerical value of homology in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, but for the base sequence, BLAST [J. Mol. Biol ., 215, 403 (1990)] for amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997), Genome Res., 7, 649 (1997) ), Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL], numerical values calculated using default parameters.
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 if it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • 11 residues when -W (wordsize) is a base sequence
  • -y [Dropoff (X) for blast extensions in bits] is 20 when blastn, 7 for programs other than blastn
  • -X X dropoff value for If the grouped alignment in bits is 15 and -Z (final X dropoff value for grouped alignment in bits) is blastn, it is 50, and 25 for programs other than blastn (http: //www.ncbi.nlmnih.vlm.nlmnih.
  • Polypeptides containing partial sequences of the amino acid sequences of the above-mentioned various MOGs can be prepared by methods known to those skilled in the art. Specifically, it can be produced by culturing a transformant into which a part of DNA encoding the amino acid sequences of the above-mentioned various MOGs is deleted and an expression vector containing the DNA is introduced. In addition, a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequences of various MOGs can be obtained by the same method as described above.
  • a polypeptide having an amino acid sequence of various MOGs or a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequences of various MOGs is obtained by the fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) method. , T-butyloxycarbonyl (tBoc) method and other chemical synthesis methods.
  • the extracellular region of human MOG refers to the amino acid sequence from the 30th to the 154th or from the 232nd to the 247th amino acid sequence in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 78 or NCBI accession number AAB08088, and the 30th to 154th positions.
  • the amino acid sequence is preferably
  • the extracellular region of mouse MOG is the amino acid sequence from the 30th to the 157th or from the 232nd to the 247th amino acid sequence in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 74 or NCBI accession number NP_034494, and the 30th to 157th amino acid sequence.
  • the extracellular region of rat MOG refers to the amino acid sequence from 28th to 155th or 230th to 245 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 68 or NCBI accession number AAA41628, and is the 28th to 155th amino acid sequence. It is preferable.
  • the extracellular region of cynomolgus monkey MOG is the amino acid sequence from the 30th to the 154th or from the 232nd to the 247th amino acid sequence in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 76 or NCBI accession number NP_001271785, and the amino acid sequence from the 30th to the 154th amino acid sequence. Preferably there is.
  • the binding of the antibody of the present invention to the extracellular region of MOG measures the binding of the antibody of the present invention to an MOG-expressing cell or a recombinant MOG protein using ELISA, flow cytometry, surface plasmon resonance, etc. This can be confirmed. Also known immunological detection methods [Monoclonal-Antibodies-Principles-and-practice, Third-edition, Academic-Press- (1996), Antibodies-A-Laboratory-Manual, Cold-Spring-Harbor-Laboratory- (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)] etc. can also be confirmed.
  • the MOG-binding molecule of the present invention is a molecule having brain retention by specifically binding to MOG in the brain.
  • an antibody is an antibody having brain retention by binding to MOG in the brain.
  • the antibody of the present invention when administered to the periphery of an animal, passes through the blood-brain barrier of the brain from the periphery, migrates into the brain, and binds to the MOG in the brain, thereby having a brain retention property It is.
  • the antibody of the present invention is preferably an antibody with excellent brain retention or an antibody with improved brain retention.
  • brain retention refers to the property that a subject remains in the brain when the subject is administered to a test animal. That is, at least selected from an increase in the transition into the brain, an increase in the accumulation in the brain, a decrease in the transition from the brain to the outside of the brain, a decrease in the discharge from the brain to the outside of the brain, and a decrease in the decomposition in the brain It means that the concentration in the brain (or the amount in the brain) of the object is increased by any one, or a certain concentration exists so as to be detectable.
  • the brain retention is excellent, the brain retention is high, or the brain retention is improved, when the subject is administered to the test animal, compared to the control, after the same day from the administration.
  • these phenomena are an increase in the transfer of the object into the brain, an increase in accumulation in the brain, a decrease in the transfer from the brain to the outside of the brain, and the excretion of the object from the brain to the outside of the brain. It is caused by at least one of a decrease and a decrease in brain degradation.
  • brain retention is excellent, brain retention is high, or brain retention is improved, for example, when the subject is administered to a test animal after administration, compared to control.
  • From 10 to 10 days preferably from 2 to 10 days after administration, from 3 to 10 days, more preferably from 4 to 10 days.
  • the peak in the brain is after 4 days after administration, preferably after 5 days after administration, after 6 days, after 7 days, after 8 days, after 9 days, more preferably after 10 days. And so on.
  • An antibody with excellent brain retention, an antibody with high brain retention, or an antibody with improved brain retention has an antibody concentration (antibody amount) in the brain that is higher than that of the control antibody, or is long in the brain. Any antibody may be used as long as it has the characteristics that can be present.
  • features that are highly transferable and / or accumulating in the brain transferability from the brain to the outside of the brain, features that are less expelling and / or degradable in the brain, and brain
  • examples thereof include antibodies having characteristics such as transferability into the brain and / or accumulation property in the brain as compared with transferability from the inside to the brain, excretion, and / or degradability in the brain.
  • the antibody or the antibody fragment of the present invention when the antibody or the antibody fragment is administered to an animal, the antibody concentration (or antibody amount) in the brain is higher after administration on the same day than the control antibody.
  • the antibody fragment, an antibody that can exist in the brain for a long time, the antibody fragment, or the like can be mentioned.
  • any change in the antibody concentration (or antibody amount) in the brain may be used.
  • the antibody concentration in the brain once reaches a peak during the measurement period examples include a case where the antibody concentration continues to be maintained after the antibody concentration reaches a peak, or a case where the antibody concentration continues to increase in the brain after antibody administration.
  • Examples of the antibody or antibody fragment of the present invention include antibodies having a higher antibody concentration or antibody amount in the brain than the control antibody on the 4th or 10th day after administration to the rat, and the 4th day after administration to the rat.
  • Antibody that maintains or increases the antibody concentration or antibody amount in the brain between day 10 and day 10, or that can be clearly confirmed in the brain after day 10 after administration to the rat is not limited to these.
  • the control antibody may be any antibody as long as it is of the same species or subclass as the test antibody.
  • an anti-avermectin (AVM) antibody can be used.
  • examples of the brain include, but are not limited to, the brain parenchyma, the ventricle, and cerebrospinal fluid.
  • examples of the method for administering an antibody to an animal include intravenous administration or intraventricular administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, nasal administration, intrathecal administration, and the like. The method is not limited.
  • the antibody is administered to an animal, brain tissue is collected after several days, homogenized, and the antibody concentration in the supernatant after centrifugation is measured.
  • a method for calculating the amount of antibody per unit brain weight a method for detecting the presence of an antibody using a known immunological technique using the collected brain tissue, or a labeled antibody administered to an animal, Examples include a method of detecting the presence of the antibody over time with a vivo imaging system.
  • the antibody of the present invention includes one antibody selected from the group consisting of the following (a) to (q).
  • (A) The amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VH are the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are SEQ ID NOs: 10, 11, and 12, respectively.
  • An antibody comprising the amino acid sequence described in (B) The amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VH are the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 16, 17 and 18, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are SEQ ID NOs: 22, 23 and 24, respectively.
  • An antibody comprising the amino acid sequence described in (C)
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH are the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 28, 29, and 30, respectively, and the amino acid sequences of CDR1 to 3 of VL are SEQ ID NOs: 34, 35, and 36, respectively.
  • An antibody comprising the amino acid sequence described in (D) an antibody fragment in which the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VHH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 40, 41 and 42, respectively
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 153, 154 and 155, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 158, 159 and 160, respectively.
  • An antibody comprising the amino acid sequence described (F)
  • the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VH include the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 163, 164, and 165, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 168, 169, and 170, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 173, 174 and 175, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 178, 179 and 180, respectively.
  • the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 183, 184, and 185, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 188, 189, and 190, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 193, 194 and 195, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 198, 199 and 200, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 203, 204 and 205, respectively, and the amino acid sequences of CDR1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 208, 209 and 210, respectively.
  • the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 213, 214, and 215, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 218, 219, and 220, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 223, 224 and 225, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 228, 229 and 230, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 233, 234 and 235, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 238, 239 and 240, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1 to V3 of VH include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 243, 244 and 245, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of VL are represented by SEQ ID NOs: 248, 249 and 250, respectively.
  • An antibody comprising the amino acid sequence described, (O) an antibody that competes with at least one antibody described in (a) to (n) for binding to MOG; (P) an antibody that binds to an epitope including an epitope to which any one of the antibodies described in (a) to (n) binds, and (q) any one of the above described (a) to (n) An antibody that binds to the same epitope to which the antibody binds.
  • the amino acid sequences of VH CDR1 to 3 and VL CDR1 to 3 of any one of the antibodies described in (a) to (n) above are each 85% or more, preferably 90%
  • An antibody having the amino acid sequences of VH CDR1 to 3 and VL CDR1 to 3 of an antibody exhibiting the above homology is included. More preferably, the homology of 90% or more includes 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% homology.
  • one embodiment of the antibodies described in the above (a) to (n) includes human anti-MOG monoclonal antibody MOG01 antibody, MOG09 antibody, MOG14 antibody and alpaca anti-MOG monoclonal VHH antibody iMOG-3Rim1-S32 antibody, respectively. Is mentioned. Other examples include a human chimeric antibody of iMOG-3Rim1-S32 and a humanized antibody of iMOG-3Rim1-S32.
  • the antibody (o) above refers to a second antibody that inhibits the binding between the first antibody and MOG when the antibodies described in (a) to (n) above are used as the first antibody.
  • the antibody of (p) above refers to the case where the antibody described in (a) to (n) above is the first antibody, and the epitope to which the first antibody binds is the first epitope.
  • the antibody (q) of the present invention refers to the antibody described in (a) to (n) above when the first antibody is used, and the epitope to which the first antibody binds is the first epitope.
  • the antibody of the present invention also specifically includes one antibody selected from the group consisting of the following (a) to (n) and (o1) to (o22).
  • C an antibody in which the amino acid sequence of VH is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and the amino acid sequence of VL includes the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 33;
  • the VH and VL amino acid sequences of any one of the antibodies described in (a) to (n) and (o1) to (o22) above are each 85% or more, preferably 90%
  • Antibodies having the VH and VL amino acid sequences of antibodies exhibiting the above homology are included. More preferably, the homology of 90% or more includes 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% homology.
  • one embodiment of the antibodies described in the above (a) to (n) and (o1) to (o22) includes human anti-MOG monoclonal antibody MOG01 antibody, MOG09 antibody, MOG14 antibody and alpaca anti-MOG monoclonal, respectively.
  • Examples include the VHH antibody iMOG-3Rim1-S32 antibody.
  • Other examples include iMOG-3Rim1-S32 human chimeric antibody and iMOG-3Rim1-S32 humanized antibody.
  • the EU index refers to the position of an amino acid residue as shown in Sequence of Proteins of Immunological Interest 5th Edition (1991).
  • the amino acid residue positions shown below are all amino acid residue positions described in the EU index unless otherwise specified.
  • An antibody molecule is also called an immunoglobulin (hereinafter referred to as Ig), and its basic structure is referred to as a heavy chain (hereinafter referred to as H chain) and a light chain (hereinafter referred to as L chain).
  • Ig immunoglobulin
  • H chain heavy chain
  • L chain light chain
  • H chain is an H chain variable region (also expressed as VH), an H chain constant region (also expressed as CH) from the N terminal side, and an L chain is also expressed as an L chain variable region (VL) from the N terminal side. ), Each region of the L chain constant region (also expressed as CL).
  • CH has known ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains for each subclass.
  • the CH is further composed of domains of a CH1 domain, a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain from the N-terminal side.
  • a domain refers to a functional structural unit constituting each polypeptide of an antibody molecule.
  • the CH2 domain and the CH3 domain are collectively referred to as an Fc (Fragment, crystallizable) region or simply Fc.
  • Fc Fraction, crystallizable region
  • CL C ⁇ chain and C ⁇ chain are known.
  • the antibody subclasses in which CH is an ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ chain are referred to as IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, respectively.
  • Some antibody subclasses have isotypes depending on the animal. In humans, IgA has IgA1 and IgA2, and IgG has IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 isotypes.
  • the CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, CH3 domain, and Fc region in the present invention can be specified by the number of amino acid residues from the N-terminus by the EU index.
  • CH1 is an amino acid sequence of EU indexes 118 to 215
  • hinge is an amino acid sequence of EU indexes 216 to 230
  • CH2 is an amino acid sequence of EU indexes 231 to 340
  • CH3 is an EU index 341 to 447.
  • the amino acid sequence and the Fc region are specified as the amino acid sequences of EU indexes 231 to 447, respectively.
  • the antibody of the present invention includes any of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and oligoclonal antibodies.
  • Polyclonal antibody refers to a population of antibody molecules secreted by antibody-producing cells of different clones.
  • a monoclonal antibody is an antibody that is secreted by an antibody-producing cell of a single clone, recognizes only one epitope (also called an antigenic determinant), and has a uniform amino acid sequence (primary sequence) that constitutes a monoclonal antibody.
  • An oligoclonal antibody refers to a population of antibody molecules in which a plurality of different monoclonal antibodies are mixed.
  • Examples of the monoclonal antibody in the present invention include an antibody produced by a hybridoma or a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
  • Epitopes include a single amino acid sequence that is recognized and bound by a monoclonal antibody, a three-dimensional structure composed of amino acid sequences, a three-dimensional structure composed of post-translationally modified amino acid sequences and a post-translationally modified amino acid sequence, and the like.
  • the post-translationally modified amino acid sequence includes an O-linked sugar chain bonded to Tyr and Ser having an OH substituent, an N-linked sugar chain bonded to Gln and Asn having an NH 2 substituent, and a sulfate molecule. Is a tyrosine sulfated amino acid sequence which binds to Tyr having an OH substituent.
  • the epitope of MOG to which the antibody of the present invention binds is determined by using a deletion in which a partial domain of MOG is deleted, a mutant in which a domain derived from another protein is substituted, a partial peptide fragment of MOG, etc. It can be determined by performing a binding experiment. Antibody binding experiments can also be performed using cells expressing the above-mentioned mutants or mutants.
  • the epitope of MOG to which the antibody of the present invention binds can also be determined by adding the antibody of the present invention to a peptide fragment of MOG digested with proteolytic enzyme and performing epitope mapping using a known mass spectrometry method. can do.
  • antibodies of the present invention include mouse antibodies, rat antibodies, hamster antibodies, rabbit antibodies, llama antibodies, camel antibodies, alpaca antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies ("Complementary Determining Region (CDR) grafted antibodies"). And also recombinant antibodies such as human antibodies.
  • CDR Complementary Determining Region
  • chimeric antibody refers to an antibody derived from animal species in which VH and VL are different from CH and CL.
  • An antibody consisting of VH and VL of an antibody other than a human (non-human animal) and CH and CL of a human antibody is a human chimeric antibody, VH and VL of an antibody other than a mouse, CH of a mouse antibody, and CH
  • An antibody composed of CL is referred to as a mouse-type chimeric antibody, and other chimeric antibodies are named in the same manner.
  • any mouse, rat, hamster, rabbit, llama, camel, alpaca, etc. can be used as long as it can produce a hybridoma or can produce an antibody phage library.
  • a hybridoma is a cell that produces a monoclonal antibody having a desired antigen specificity obtained by fusing a B cell obtained by immunizing a non-human animal with a myeloma cell derived from a mouse or the like. Say.
  • Antibody phage library refers to a library prepared by cloning an immunoglobulin variable region gene into a phage and expressing an antigen-binding molecule on the surface thereof.
  • Examples of the phage to be used include M13 phage, but are not particularly limited.
  • the antigen-binding molecule displayed on the phage may be in any form, but is preferably an antibody fragment such as scFv, Fab or VHH.
  • the antibody phage library may be any library of an immune library, a naive library, and a synthetic library.
  • An immune library refers to an antibody phage library constructed based on antibody genes derived from animals immunized with antigens or patient lymphocytes.
  • the naive library refers to an antibody phage library constructed based on antibody genes derived from normal animal or healthy human lymphocytes.
  • a synthetic library refers to a library in which CDRs of V genes in genomic DNA or reconstructed functional V genes are replaced with oligonucleotides encoding random amino acid sequences of appropriate length.
  • a method for producing a chimeric antibody As a method for producing a chimeric antibody, a method for producing a human chimeric antibody is described below. Other chimeric antibodies can be prepared in the same manner.
  • Human chimeric antibodies are obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from non-human animal cell-derived hybridomas producing monoclonal antibodies, and expressing them as expression vectors for animal cells having DNAs encoding human antibodies CH and CL, respectively.
  • a human chimeric antibody expression vector is constructed by insertion and can be expressed and produced by introducing it into animal cells.
  • genes encoding VH and VL are cloned from non-human animal-derived antibody phage libraries and inserted into animal cell expression vectors having DNA encoding human antibodies CH and CL, respectively, and human chimeric antibody expression vectors And can be expressed and produced by introducing it into animal cells.
  • a humanized antibody refers to an antibody obtained by grafting the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of a non-human animal antibody into CDRs corresponding to VH and VL of a human antibody.
  • An area other than the CDRs of VH and VL is referred to as a framework area (hereinafter referred to as FR).
  • the humanized antibody is composed of a cDNA encoding a VH amino acid sequence consisting of a VH CDR amino acid sequence of a non-human animal antibody and a VH FR amino acid sequence of any human antibody, and a VL CDR amino acid of a non-human animal antibody.
  • a cDNA encoding the amino acid sequence of VL consisting of the sequence and the amino acid sequence of FR of VL of any human antibody is constructed, and inserted into an expression vector for animal cells having DNA encoding CH and CL of human antibody, respectively.
  • An antibody expression vector can be constructed and introduced into animal cells for expression and production.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but includes human antibody phage libraries and antibodies obtained from human antibody-producing transgenic animals.
  • Human antibodies can be obtained by immunizing mice carrying human immunoglobulin genes (Tomizuka K. et al.,. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 722-7, 2000.) Can do. Further, by selecting a human antibody having a desired binding activity using a phage display library obtained by amplifying an antibody gene from a human-derived B cell, a human antibody can be obtained without performing immunization (Winter G. et al., Annu Rev Immunol. 12: 433-55. 1994).
  • the human antibody phage library is a library of phages in which antibody fragments such as Fab, scFv, and VHH are expressed on the surface by inserting antibody genes prepared from human (healthy or patient) lymphocytes into the phage genes. . From the library, phages expressing antibody fragments having a desired antigen-binding activity can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal is an animal in which a human antibody gene is integrated into the chromosome of a host animal.
  • a human antibody-producing transgenic animal can be produced by introducing a human antibody gene into mouse ES cells, and then transplanting the ES cells into early embryos of other mice and then generating them.
  • Human antibodies are produced from human antibody-producing transgenic animals by culturing human antibody-producing hybridomas obtained by the conventional method of producing hybridomas in mammals other than humans, and producing and accumulating human antibodies in the culture.
  • the antibody can be purified from the culture.
  • the antibody of the present invention includes a heavy chain antibody composed only of a heavy chain.
  • the heavy chain antibody refers to an antibody obtained from a camelid animal such as llama, camel, alpaca, and a gene recombinant antibody prepared based on the antibody.
  • an antibody fragment refers to an antibody fragment that has antigen-binding activity.
  • examples include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single chain Fv (scFv), diabody, dsFv, a peptide containing a plurality of CDRs, and VHH.
  • the antibody fragment of the present invention includes a partial antibody fragment such as an antibody fragment obtained by fusing the antibody constant region or the full length or a part of Fc to the antibody fragment, an antibody fragment containing the constant region or Fc, and MOG. Any antibody fragment having a binding activity is included.
  • Fab is a fragment obtained by treating an IgG antibody with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the amino acid residue at position 224 of the H chain), and about half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain are disulfide bonded. It is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 50,000, bound by (SS bond).
  • F (ab ′) 2 is a fragment obtained by treating IgG with proteolytic enzyme pepsin (which is cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain), and Fab is linked via an SS bond in the hinge region.
  • Antibody fragment having an antigen-binding activity with a molecular weight of about 100,000, which is slightly larger than those bound together.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight obtained by cleaving the SS bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • scFv uses an appropriate peptide linker (P) such as a linker peptide in which one VH and one VL are connected to an arbitrary number of linkers (G4S) consisting of four Gly and one Ser residue.
  • P peptide linker
  • G4S linkers
  • VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide which is an antibody fragment having antigen-binding activity.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv having the same or different antigen binding specificity forms a dimer, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity for the same antigen or a specific antigen-binding activity for different antigens.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue, which are bound via an SS bond between the cysteine residues.
  • the peptide containing CDR is configured to contain at least one region of CDR of VH or VL.
  • a peptide containing a plurality of CDRs can be linked to each other directly or via an appropriate peptide linker.
  • a DNA encoding the CDR of the antibody VH and VL of the present invention is constructed, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism It can be made to express and manufacture.
  • the peptide containing CDR can also be manufactured by chemical synthesis methods, such as Fmoc method or tBoc method.
  • VHH is a variable region of a heavy chain antibody and is also referred to as nanobody.
  • the antibody fragment of the present invention includes any of the above-described antibody fragments or partial fragments thereof, as long as the antibody fragment has MOG binding activity.
  • an antibody having one antigen-binding site or the antibody fragment is referred to as a monovalent antibody.
  • the monovalent antibody format include antigen binding sites described in International Publication No. 2014/054804, International Publication No. 2011/090754, International Publication No. 2007/048037, International Publication No. 2012/116927, and the like. Examples include a single antibody or a format of the antibody fragment.
  • one molecule of an antibody or antibody fragment that binds to three or more different antigens or epitopes is referred to as a multispecific antibody.
  • one molecule of an antibody or an antibody fragment that binds to two different antigens or epitopes is referred to as a bispecific antibody.
  • bispecific antibody examples include the bispecific antibodies described below.
  • the bispecific antibody described in (1) is a bispecific antibody in which an antigen binding site containing VH of heavy chain A binds to MOG, and an antigen binding site containing VH of heavy chain B binds to an antigen present in the brain.
  • MOG metal-oxide-semiconductor
  • antigen binding site containing VH of heavy chain B binds to an antigen present in the brain.
  • the opposite may be possible.
  • bispecific antibody in which an antibody fragment is bound to one C-terminal of two heavy chains constituting the antibody, and an antibody fragment is bound to both of the two heavy chains.
  • Bispecific antibody any bispecific antibody may be used.
  • An appropriate linker may be present between the C-terminus of the antibody heavy chain and the antibody fragment.
  • the antibody fragment possessed by the bispecific antibody described in (2) above is preferably scFv, Fab, VHH and the like, but is not particularly limited thereto.
  • the bispecific antibody described in (2) above may be a bispecific antibody in which the N-terminal antigen-binding site binds to MOG and the C-terminal antigen-binding site binds to an antigen present in the brain, or vice versa. .
  • the bispecific antibody described in (3) above refers to a bispecific antibody in which an antibody fragment is bound to at least one N-terminal of two heavy chains or light chains constituting the antibody. Further, an appropriate linker may be present between the N-terminus of the antibody heavy chain and / or light chain and the antibody fragment.
  • the antibody fragment possessed by the bispecific antibody described in (3) above is preferably scFv, Fab, VHH and the like, but is not particularly limited thereto.
  • the bispecific antibody described in (3) above includes a bispecific antibody having a structure of VH 1 -CH1-VH 2 -CH1-hinge-CH2-CH3 from the N-terminus of the heavy chain, and the heavy chain structure described above. And bispecific antibody in which VH 1 and VH 2 form an antigen-binding site with VL, respectively.
  • the VL in which VH 1 and VH 2 form an antigen binding site may be the same amino acid sequence or may be different amino acid sequences.
  • the multispecific antibody or bispecific antibody may be any antibody as long as it is a multispecific antibody and a bispecific antibody that bind to MOG.
  • a multispecific antibody or a bispecific antibody that binds to MOG and an antigen present in the brain is preferred, and a multispecific antibody comprising an antigen binding site that binds to MOG and an antigen binding site that binds to an antigen present in the brain or Bispecific antibodies are more preferred.
  • the antigen present in the brain includes proteins, sugar chains, lipids and the like, and among them, proteins are preferable.
  • proteins present in the brain include MOG, Prion, 5T4, AFP, ADAM-10, ADAM-12, ADAM17, AFP, AXL, BSG, C5, C5R, CA9, CA72-4, CCL11, CCL2, CCR1, CCR4, CCR5, CCR6, CD2, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD18, CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD29, CD30, CD32B, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40LG, CD44, CD47, CD52, CD55SC1, CD56, CD66E, CD71, CD72, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD86, CD95, CD98, CD137, CD147, CD138, CD168, CD 00, CD248, CD254, CD257, CDH3, CEA, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM8, Claudin3, Claudin4, c-Met, CS-1, CSF2RA,
  • sugar chains present in the brain include Lewis-x, Lewis-y, and CD15, but are not limited to these sugar chains.
  • lipids present in the brain include GD1a, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, and phosphatidylserine, but are not limited to these lipids.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment includes an antibody containing any amino acid modified after translation.
  • Post-translational modifications include, for example, deletion of a lysine residue at the C-terminus of the H chain [lysine clipping] and conversion of a glutamine residue at the N-terminus of the polypeptide to pyroglutin (puroGlu), etc. [Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736 (2013)].
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment may be modified with amino acids in the Fc region.
  • the amino acid modification of the Fc region include amino acid modification for stabilizing an antibody or controlling blood half-life.
  • Specific examples of the amino acid modification of the Fc region include International Publication No. 2006/033386, International Publication No. 2006/0775668, International Publication No. 2011/122011, and International Publication No. 2009/125825. .
  • the antibody or the antibody fragment of the present invention includes an antibody or a fusion antibody obtained by modifying the antibody fragment or the fusion antibody fragment.
  • the method for modifying the antibody is not particularly limited, and any method can be used as long as it can modify a desired amino acid residue and sugar chain.
  • examples of the molecule that modifies the antibody or the antibody fragment include a hydrophilic polymer, an amphiphilic polymer, and a functional molecule.
  • examples of the hydrophilic polymer and amphiphilic polymer include molecules containing polyoxyalkylene, polyol or polysaccharide.
  • polyoxyalkylene examples include linear or branched polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), polypropylene glycol, and polypropylene ethylene glycol.
  • Examples of the molecule containing polyol or polysaccharide include homo- or hetero-polysaccharides such as amylose, dextran, pullulan, glycogen and the like made of linear or branched polyglycerol.
  • the molecular weight of the molecule containing a hydrophilic polymer or amphiphilic polymer is not particularly limited, but is preferably 100 Da or more, for example, 100 Da to 100 kDa.
  • Examples of functional molecules include antigen-binding molecules and fragments thereof, drugs, bioactive peptides, bioactive proteins, nucleic acids, radiolabeled compounds, sugar chains, lipids, and fluorescent compounds.
  • the bispecific molecule is a bispecific antibody.
  • antigen-binding molecules examples include antibodies, receptors, and ligands.
  • the antigen-binding molecule fragment may be any antigen-binding molecule fragment as long as it has antigen-binding activity.
  • Examples of the drug include alkylating agents, nitrosourea agents, antimetabolites, antiviral agents, antibiotics, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, tubulin polymerization inhibitors, hormone therapeutic agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, P-glycoprotein inhibitors, platinum complex derivatives, anti-cancer agents such as M-phase inhibitors or kinase inhibitors [Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy (1996)], steroids such as hydrocortisone and prednisone, aspirin, indomethacin, etc.
  • Non-steroidal agents such as gold thiomalate, penicillamine, immunosuppressants such as cyclophosphamide, azathioprine, or anti-inflammatory agents such as antihistamines such as chlorpheniramine maleate or clemacytin [inflammatory and anti-inflammatory therapy, Ishiyaku Publishing Co., Ltd. (19 2)] and the like.
  • Anticancer agents include, for example, meltansine, emtansine, amifostine (ethiol), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, mechlorethamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine ( CCNU), doxorubicin (adriamycin), epirubicin, gemcitabine (gemzar), daunorubicin, procarbazine, mitomycin, cytarabine, etoposide, 5-fluorouracil, fluorouracil, vinblastine, vincristine, bleomycin, daunomycin, pepromycin, estramuxel Docetaxel (Taxotea), Aldesroykin, Asparagi Ase, busulfan, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, cladribine, camp
  • the drug and antibody or antibody fragment may be bound by a method of binding between the drug and the amino group of the antibody via glutaraldehyde, or the amino group of the drug via water-soluble carbodiimide. And a method of binding the carboxyl group of the antibody.
  • physiologically active peptide or physiologically active protein examples include interferon (hereinafter referred to as IFN) - ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , interleukin (hereinafter referred to as IL) -2, IL-12, and IL-15.
  • IFN interferon
  • IL interleukin
  • NK Cytokines or growth factors that activate immunocompetent cells such as cells, macrophages, or neutrophils
  • proteolytic enzymes such as hydrase, lyase and isomerase, enzymes such as acid sphingomyelinase, lysine, diphtheria toxin, or ONTAK Toxins
  • bacterial toxins and plant toxins cell membrane damage Antimicrobial peptides having sex, peptides having cell membrane bound or cell membrane permeability, and derivatives thereof.
  • the nucleic acid may be any molecule as long as it is a molecule obtained by polymerizing nucleotides or molecules having functions equivalent to the nucleotides, and examples thereof include siRNA, microRNA, antisense RNA, and DNA aptamer.
  • the radiolabeled compound may be any nuclide that is used for diagnostic or therapeutic purposes.
  • the radiolabeled compound can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like. Further, a substance that chelates the radiolabeled compound may be bound to the antibody. Examples of the chelating agent include DOTA, PA-DOTA, TRITA, and DTPA. An antibody modified with a chelating agent, and a modified antibody labeled with a radiolabeled compound via a chelating agent are also included in the antibody of the present invention. included.
  • sugar chains include fucose, mannose, glucose, allose, altose, gurose, idose, galactose, talose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, erythose, erythrose, threose, cellobiose, maltose, isomaltose, lactose, lipoarabi.
  • sugar chains include fucose, mannose, glucose, allose, altose, gurose, idose, galactose, talose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, erythose, erythrose, threose, cellobiose, maltose, isomaltose, lactose, lipoarabi.
  • monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and the like including nomannan, Lewis X type trisaccharide,
  • it may be a natural product containing a sugar chain known as an immunoadjuvant, such as ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (lentinan, schizophyllan), ⁇ galactosylceramide (KRN7000), and the like.
  • an immunoadjuvant such as ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (lentinan, schizophyllan), ⁇ galactosylceramide (KRN7000), and the like.
  • lipids examples include esters of fatty acids and various alcohols and simple lipids (neutral lipids) that are analogs thereof.
  • fats and oils for example, triacylglycerol
  • waxes for example, fatty acid esters of higher alcohols
  • sterol esters for example, cholesterol esters, vitamin fatty acid esters, etc.
  • lipids with groups such as phospholipids (eg glycerophospholipids and sphingophospholipids) and glycolipids (eg glyceroglycolipids and glycosphingolipids), simple lipids and compounds produced by hydrolysis of complex lipids
  • phospholipids eg glycerophospholipids and sphingophospholipids
  • glycolipids eg glyceroglycolipids and glycosphingolipids
  • simple lipids and compounds produced by hydrolysis of complex lipids Among these, derived lipids that indicate fat-soluble substances, for example, fatty acids, higher alcohols, fat-soluble vitamins, steroids, hydrocarbons and the like.
  • fluorescent compound examples include fluorescent dyes such as fluorescein series such as fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine series, Cy3, Cy5, eosin series, Alexafluoro series and NBD series, acridinium esters, and lophine. And fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP).
  • fluorescent dyes such as fluorescein series such as fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine series, Cy3, Cy5, eosin series, Alexafluoro series and NBD series, acridinium esters, and lophine.
  • fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP).
  • hydrophilic polymer or amphiphilic polymer and the functional molecule of the antibody or the antibody fragment of the present invention can be bound directly or via an appropriate linker.
  • linker include esters, disulfides, hydrazones and dipeptides.
  • the cDNA encoding the protein is linked to the cDNA encoding the antibody, and the fusion antibody or fusion Constructing a DNA encoding an antibody fragment, inserting the DNA into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism to express a fusion antibody or fusion antibody fragment
  • a fusion antibody or a fusion antibody fragment can be prepared.
  • composition of the present invention may be any composition as long as it contains the antibody of the present invention or the antibody fragment.
  • a composition may contain additives such as a suitable carrier and a stabilizer in addition to the antibody or the antibody fragment.
  • composition of the present invention examples include a composition for detection or measurement containing the antibody of the present invention or the antibody fragment.
  • the composition of the present invention includes, for example, a pharmaceutical composition (therapeutic agent) containing the antibody of the present invention or the antibody fragment as an active ingredient, and the desired dosage form together with a pharmacologically acceptable carrier. Formulated.
  • the composition for detection or measurement includes the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, and can detect or measure the antigen specifically bound by the antibody of the present invention or the antibody fragment. Any composition can be used.
  • the antigen to which the antibody of the present invention or the antibody fragment specifically binds include MOG or an antigen present in MOG and brain.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention has the property of binding to MOG in the brain and retaining in the brain when administered to animals. Therefore, by using the composition for detection or measurement containing the antibody or the antibody fragment, the antibody can be maintained in the brain or the antibody concentration in the brain can be increased, and MOG or MOG over a long period of time. It is also possible to detect or measure antigens present in the brain and / or to detect or measure MOG or antigens present in MOG and brain with high sensitivity.
  • the composition for detection or measurement is a composition containing a bispecific antibody that binds to an antigen present in MOG and the brain
  • the MOG to which the bispecific antibody binds and the antigen present in the brain are detected for a long period of time.
  • measurement and / or antigen present in MOG and brain can be detected or measured with high sensitivity.
  • the detection or measurement composition is a composition containing a fusion antibody or fusion antibody fragment that binds to a radiolabeled compound or a fluorescent dye-labeled MOG
  • MOG is detected or measured for a long period of time.
  • / or MOG can be detected or measured with high sensitivity.
  • the pharmaceutical composition (therapeutic agent) containing the antibody of the present invention may be a therapeutic agent for any disease as long as the antibody of the present invention or an antigen to which the antibody fragment specifically binds is expressed.
  • a therapeutic agent for brain disease is preferred.
  • brain diseases include Alzheimer's disease, progenitor Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, brain tumor, multiple sclerosis, muscular dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, multiple system atrophy, progressive supranuclear palsy, Substantia nigra degeneration, Olive bridge cerebellar atrophy, bulbar spinal muscular atrophy, spinocerebellar degeneration, cerebrovascular disorder, epilepsy, migraine, hyperactivity disorder, Creutzfeldt-Jakob disease, cortical basal ganglia degeneration Disease, lysosomal disease, depression, and dystonia.
  • the antibody of the present invention has the property of binding to MOG in the brain and retaining in the brain when administered to animals. Therefore, by using the therapeutic agent containing the antibody or the antibody fragment, it becomes possible to maintain the antibody or the antibody fragment in the brain for a long period of time and to improve the antibody concentration in the brain. Can show a therapeutic effect.
  • the therapeutic agent when the therapeutic agent is a therapeutic agent containing a bispecific antibody that binds to MOG and an antigen present in the brain, it has a therapeutic effect on a brain disease related to the antigen present in the brain to which the bispecific antibody binds. Can show.
  • the therapeutic agent when the therapeutic agent is a fusion antibody or a fusion antibody fragment that binds to MOG modified with a low molecular drug, the therapeutic effect can be shown for brain diseases targeted by the low molecular drug. At this time, it is preferable that the therapeutic effect is higher when the therapeutic agent of the present invention is used than when the low molecular drug is used alone.
  • the therapeutic agent containing the antibody or the antibody fragment of the present invention may contain only the antibody or the antibody fragment as an active ingredient, but usually one or more pharmacologically acceptable carriers and Desirably, they are mixed together and provided as a pharmaceutical formulation produced by any method known in the pharmaceutical arts.
  • the administration route that is most effective for treatment for example, oral administration, or intraoral, intratracheal, rectal, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intraventricular, intraspinal, intranasal.
  • Parenteral administration such as intraperitoneal or intravenous, and particularly preferably intravenous or intracerebroventricular administration.
  • the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, weight, etc., but is usually 10 ⁇ g / kg to 20 mg / kg per day for an adult.
  • the present invention also provides a method of retaining an antibody in the brain using the antibody of the present invention or the antibody fragment, a method of improving the brain retention of the antibody, and a method of increasing the antibody concentration (or antibody amount) in the brain. Is also included.
  • the present invention also provides a peptide that binds to MOG, a nucleic acid containing a base sequence encoding the peptide, a transformed cell containing a vector containing the nucleic acid, culturing the transformed cell, and collecting the peptide from the culture solution.
  • a method for producing the peptide, a composition containing the peptide, or a method for detecting or measuring an antigen present in the brain using the peptide or the composition, a method for diagnosing or treating a brain disease, and a peptide The present invention relates to a method for improving the retention of brain in the brain, or a method for increasing the amount of peptide in the brain.
  • the peptide of the present invention includes a fusion peptide in which the peptide is modified.
  • Antibody production method Preparation of antigen MOG or MOG-expressing cells to be antigens are introduced by introducing an expression vector containing cDNA encoding the full-length MOG or a partial length thereof into Escherichia coli, yeast, insect cells or animal cells. Can be obtained at MOG can also be obtained by purifying MOG from various animal cell lines, animal cells and animal tissues that express MOG in large amounts.
  • these animal cell lines, animal cells and animal tissues can be used as antigens as they are.
  • a synthetic peptide having a partial sequence of MOG can be prepared by a chemical synthesis method such as Fmoc method or tBoc method, and used as an antigen.
  • a known peptide such as FLAG or His may be added to the C-terminal or N-terminal of the synthetic peptide having MOG or a partial sequence of MOG.
  • MOG used in the present invention is a method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), etc.
  • DNA encoding MOG can be expressed in a host cell and produced by the following method.
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a portion encoding MOG downstream of a promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • a transformant producing the polypeptide can be obtained by introducing the obtained recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Any expression vector can be used as long as it can autonomously replicate in the host cell to be used or can be integrated into the chromosome, and contains an appropriate promoter at a position where DNA encoding the polypeptide can be transcribed. Can do.
  • any microorganisms belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cells or animal cells can be used so long as they can express the target gene.
  • the expression vector is capable of autonomous replication in a prokaryote, and at the same time contains a promoter, a ribosome binding sequence, DNA containing a portion encoding human MOG, and a transcription termination sequence. It is preferably a vector containing.
  • the expression vector does not necessarily require a transcription termination sequence, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls the promoter.
  • the expression vector it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence (also referred to as SD sequence), which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • SD sequence also referred to as SD sequence
  • start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • bases can be substituted so as to be optimal codons for expression in the host, thereby improving the production rate of the target MOG.
  • Any expression vector can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 hereinafter, Roche Diagnostics
  • pKK233-2 Pharmacia
  • pSE280 manufactured by Invitrogen
  • pGEMEX-1 manufactured by Promega
  • pQE-8 manufactured by Qiagen
  • pKYP10 Japanese Patent Laid-Open Publication No. 58-110600
  • pKYP200 Agricultural Biobiological Chemistry, 48, 669 (1984)]
  • pLSA1 Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)
  • pGEL1 Proc.
  • any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter or T7 promoter.
  • Terp trp promoter
  • lac promoter lac promoter
  • PL promoter PL promoter
  • PR promoter PR promoter
  • T7 promoter trp promoter
  • artificially designed and modified promoters such as a tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter or let I promoter in which two Ptrps are connected in series can be mentioned.
  • Examples of host cells include E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49 or E. coli DH5 ⁇ .
  • any method for introducing DNA into a host cell to be used can be used.
  • a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci. USA] 69, 2110 (1972), Gene 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)].
  • any expression vector can be used as long as it can function in animal cells.
  • pcDNAI, pCDM8 (manufactured by Funakoshi), pAGE107 Japanese Unexamined Patent Publication No. 3]. No. 22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen) , PcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 [J.
  • Any promoter can be used as long as it can function in animal cells.
  • a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter. , Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter or Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early
  • IE SV40 early promoter
  • a retroviral promoter e.g., a promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter.
  • Metallothionein promoter e.g., Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter or Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer.
  • host cells examples include human leukemia cells Namalwa cells, monkey cells COS cells, Chinese hamster ovary cells CHO cells [Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, sAppendix I, II (pp.
  • CHO cells lacking the dihydrofolate reductase gene (hereinafter referred to as dhfr) (CHO / DG44 cells) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)], CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUkXB11 (ATCC CCL-9096), Pro-5 (ATCC) CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, Cat # 11619), Pro-3, rat myeloma cells YB2 / 3HL. P2. G11.16 Ag.
  • dhfr dihydrofolate reductase gene
  • mouse myeloma cell NS0 mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14
  • Syrian hamster cell BHK or HBT5637 Japanese Patent Laid-Open No. 63-000299.
  • any method for introducing an expression vector into a host cell any method can be used as long as it introduces DNA into animal cells.
  • electroporation [Cytotechnology, to3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method JP-A-2-227075
  • lipofection method Proc. [Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a transformant derived from a microorganism or animal cell having an expression vector incorporating a DNA encoding MOG obtained as described above is cultured in a medium, and the MOG is produced and accumulated in a culture solution. By collecting from the culture solution, MOG can be produced.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be carried out according to a usual method used for culturing a host.
  • MOG When expressed in cells derived from eukaryotes, MOG to which sugars or sugar chains have been added can be obtained.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter culturing a microorganism transformed with an expression vector using isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside, etc. Indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host for example, a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science , 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or Iscove's Modified Examples include a Dulbecco's Medium (IMDM) medium or a medium obtained by adding fetal bovine serum (FBS) or the like to these mediums.
  • IMDM Dulbecco's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and 5% CO 2 .
  • Examples of the expression method of the gene encoding MOG include, in addition to direct expression, methods such as secretory production or fusion protein expression [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. .
  • Examples of the method for producing MOG include a method for production in a host cell, a method for secretion outside the host cell, and a method for production on the outer membrane of the host cell.
  • the host cell to be used or the structure of the MOG to be produced is used. By changing, an appropriate method can be selected.
  • the obtained MOG can be isolated and purified as follows, for example.
  • MOG When MOG is expressed in a dissolved state in cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then used with an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, or dynomill. The cells are disrupted to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) , Methods such as hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, or electrophoresis such as isoelectric focusing To obtain purified preparations It is possible.
  • MOG When MOG is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, the cell is collected and crushed in the same manner as described above, and centrifuged to collect the insoluble substance of MOG as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble matter of MOG is solubilized with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the solubilized solution, the MOG is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified product of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the MOG or its derivative such as a sugar-modified product can be recovered in the culture supernatant.
  • a soluble fraction can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified preparation can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. it can.
  • the MOG used in the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, Perceptive or Shimadzu You can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, Perceptive or Shimadzu You can also
  • Immunization is performed by administering the antigen subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to the animal together with an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (Keyhole limpet hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH Keyhole limpet hemocyanin
  • the antigen When immunizing mice and rats, the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. An animal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of antibody producing cells for fusion.
  • tissues containing antibody-producing cells such as the spleen are removed from the immunized animal, and antibody-producing cells are collected.
  • the spleen is shredded and loosened, and then centrifuged, and the erythrocytes are removed to obtain antibody producing cells for fusion.
  • immunized animals can also be immunized by the same method to obtain antibody-producing cells. Appropriate conditions can be selected for the immunization interval and the period from the last immunization to the tissue extraction in accordance with the animal species of the immunized animal.
  • a cell line obtained from a mouse is used.
  • the myeloma cells are passaged in normal medium [RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS, and 8-azaguanine] and passaged to normal medium 3-4 days prior to cell fusion. On the day of fusion, secure a cell count of 2 ⁇ 10 7 or more.
  • HAT medium normal medium supplemented with hypoxanthine, thymidine, and aminopterin. This suspension is cultured for 7-14 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • a part of the culture supernatant is extracted, and a cell group that reacts with MOG and does not react with an antigen other than MOG is selected by a hybridoma selection method such as a binding assay described later.
  • cloning is performed by a limiting dilution method, and a stable and strong antibody titer recognized is selected as a monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • the supernatant is removed by centrifugation, suspended in a Hybridoma SFM medium, and cultured for 3 to 7 days.
  • the obtained cell suspension is centrifuged, and purified using a protein A-column or protein G-column from the obtained supernatant, and the IgG fraction is collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • 5% Digo GF21 can also be added to the Hybridoma SFM medium.
  • the antibody subclass is determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit.
  • the amount of protein is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm.
  • the antibody is selected by measuring the binding of the antibody to the MOG-expressing cells using flow cytometry.
  • the MOG-expressing cell may be any cell as long as MOG is expressed on the cell surface, and examples thereof include animal cells, animal cell lines, and MOG forced expression cell lines obtained in (1).
  • a test substance such as serum, hybridoma culture supernatant or purified antibody is dispensed and reacted as the first antibody.
  • the cells after the reaction are thoroughly washed with PBS containing 1 to 10% bovine serum albumin (BSA) (hereinafter referred to as BSA-PBS), and then anti-immunoglobulin antibody labeled with a fluorescent reagent or the like as a second antibody. Dispense and react. After thoroughly washing with BSA-PBS or the like, an antibody that specifically reacts with MOG-expressing cells is selected by measuring the amount of fluorescence of the labeled antibody using a flow cytometer.
  • BSA-PBS bovine serum albumin
  • the antibody can also be selected by measuring the binding ability of the monoclonal antibody to MOG-expressing cells or MOG protein using ELISA or surface plasmon resonance described below.
  • the MOG protein may be a protein composed of a partial domain of MOG or a protein to which a tag such as GST is added.
  • ELISA dispenses MOG-expressing cells or MOG protein into a plate such as a 96-well plate, then blocks with BSA-PBS, and dispenses a test substance such as serum, hybridoma culture supernatant or purified antibody as the first antibody. And react. Next, after thoroughly washing with PBS or the like, an anti-immunoglobulin antibody labeled with a fluorescent reagent or the like is dispensed and reacted as a second antibody.
  • Surface plasmon resonance can measure the affinity of an antibody that binds to MOG by immobilizing the antibody on an appropriate sensor chip and using MOG protein as an analyte, using a known protocol.
  • an antibody having a desired affinity for the MOG protein can be selected.
  • the affinity of an antibody that binds to MOG can be measured by immobilizing MOG protein on a sensor chip and using the antibody as an analyte.
  • an antibody that competes with the antibody of the present invention and binds to MOG can be obtained by adding the test antibody to the above-described measurement system using flow cytometry or ELISA and allowing it to react. That is, an antibody that competes with the antibody of the present invention for binding to the amino acid sequence of MOG or its three-dimensional structure by screening an antibody that inhibits the binding of the antibody of the present invention to MOG when a test antibody is added Can be obtained.
  • an antibody that binds to an epitope containing an epitope to which the antibody of the present invention binds is identified by a known method for the epitope of the antibody obtained by the screening method described above, and a synthetic peptide containing the identified epitope or a three-dimensional epitope. Synthetic peptides and the like mimicking the structure can be prepared and obtained by immunization.
  • the epitope to which the antibody of the present invention binds and the antibody that binds to the same epitope are identified by identifying the epitope of the antibody obtained by the screening method described above, and a partial synthetic peptide of the identified epitope, or the three-dimensional structure of the epitope It can be obtained by preparing and immunizing a synthetic peptide or the like that is mimicked.
  • an antibody phage library can be an immune library, a naive library, or a synthetic library. The method for preparing each library is described below.
  • Immunity library is immunized animal or patient-derived lymphocytes by the same method as in (1) above, naive library is normal animal or healthy person-derived lymphocytes, RNA is extracted and reverse transcription reaction CDNA is synthesized by the reaction.
  • the antibody gene fragment amplified by PCR using this cDNA as a template is inserted into a phagemid vector, and Escherichia coli is transformed with the phagemid vector.
  • Escherichia coli is transformed with the phagemid vector.
  • an antibody phage library in which antibody genes are libraryized can be obtained.
  • the synthetic library is a phagemid vector in which the V gene in the genomic DNA or the CDR of the reconstructed functional V gene is replaced with an oligonucleotide encoding a random amino acid sequence of an appropriate length, and the V gene is inserted.
  • an antibody phage library can be obtained.
  • lymphocyte-derived cDNA and antibody phage libraries can also be used.
  • the phagemid vectors are pCANTAB 5E (Amersham Pharmacia), pUC118 / pUC119 vector (TaKaRa), pBlueScript II Phagemid Vector (Agilent Technologies, et al., JM. be able to.
  • Helper phages include M13KO7 helper phage (Invitrogen), VCSM13 Interference Resistant Helper Page (Agilent Technologies), and R408 Interferent Resistant Helper (AgileTelge).
  • Phage vectors can also be used for phage display.
  • peptide phage libraries such as New England Biolabs
  • Methods that use g7p, g8p, and g9p as display molecules.
  • a display system for T7 phage includes T7Select vector (Novagen).
  • Antibody phage clones can be selected from the antibody phage library prepared in (7-1) using the ELISA method shown below.
  • Recombinant Antibody As a production example of a recombinant antibody, a method for producing a human chimeric antibody and a humanized antibody is shown below. Recombinant mouse antibodies, rat antibodies, rabbit antibodies, hamster antibodies, camel antibodies, llama antibodies, alpaca antibodies, human antibodies, various chimeric antibodies, heavy chain antibodies, and the like can be prepared in the same manner.
  • a recombinant antibody expression vector is an animal cell expression vector in which DNAs encoding human antibodies CH and CL are incorporated, and the animal cell expression vector is human. It can be constructed by cloning DNAs encoding antibody CH and CL, respectively.
  • Any human antibody CH and CL can be used for the C region of a human antibody.
  • ⁇ 1 subclass CH and ⁇ class CL of human antibodies are used.
  • cDNA is used for DNA encoding CH and CL of human antibodies, chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]
  • pSG1bd2-4 [Cytotechnol., 4, 173 (1990)]
  • pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79 (1993)].
  • promoters and enhancers include SV40 early promoter [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], Moloney murine leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 ( 1987)] or an immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and an enhancer [Cell, 33, 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors balance the ease of construction of recombinant antibody expression vectors, the ease of introduction into animal cells, and the balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells.
  • a vector for expressing a recombinant antibody of a type (tandem type) in which the antibody H chain and L chain are present on the same vector [J. Immunol. [Methods, 167, 271 (1994)]
  • pKANTEX93 International Publication No. 97/10354
  • pEE18 Hybridoma, 17, 559 (1998)
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having cDNA encoding VH or VL is isolated from the library.
  • the entire base sequence of VH or VL of the target non-human antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, respectively, and the entire amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence, respectively.
  • Mouse, rat, hamster, rabbit, llama, camel, or alpaca is used as a non-human animal for producing a hybridoma cell that produces a non-human antibody. Any hybridoma cell can be produced. Animals can also be used.
  • RNA easy kit for preparation of total RNA from hybridoma cells.
  • oligo (dT) immobilized cellulose column method [MolecularMCloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]
  • Oligo-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification
  • a kit such as a registered trademark Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) is used.
  • mRNA can also be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation (registered trademark) Kit (manufactured by Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification (registered trademark) Kit (manufactured by Pharmacia).
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized using mRNA extracted from a hybridoma cell as a template is incorporated.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ ZAPIII (manufactured by Stratagene)
  • Lambda BlueMid manufactured by Clontech
  • pT7T3-18U manufactured by Pharmacia
  • pCD2 Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)
  • pUC18 Gene , 33, 103 (1985)
  • Any Escherichia coli into which a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector is introduced can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XL1-Blue MRF ′ [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)] or JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] or the like is used.
  • Selection of cDNA clones encoding non-human antibody VH or VL from a cDNA library includes colony hybridization using an isotope or fluorescently labeled probe, or plaque hybridization [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
  • PCR method Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Laboratory Press (1989) , Current Protocols, Molecular Molecular Biology, Supplement, 1, John Wiley, and Sons (1987-1997)
  • PCR method Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Laboratory Press (1989) , Current Protocols, Molecular Molecular Biology, Supplement, 1, John Wiley, and Sons (1987-1997)
  • a cDNA encoding VH or VL can also be prepared.
  • the selected cDNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and the nucleotide sequence of the cDNA is determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method.
  • the base sequence analysis method includes, for example, a dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], ABI PRISM 3700 (PE Biosystems) or A.I. L. F. An automatic base sequence analyzer such as a DNA sequencer (Pharmacia) is used.
  • amino acid sequences of CDRs of VH and VL are also found by comparing with the VH and VL amino acid sequences of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Can do.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid, and VH and VL cDNAs designed to be appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are respectively expressed so that they are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL of the recombinant antibody expression vector obtained in (1). Cloning to construct a human chimeric antibody expression vector.
  • a cDNA encoding the non-human antibody VH or VL is amplified by a PCR method using a synthetic DNA having a recognition sequence of an appropriate restriction enzyme at both ends, and the recombinant antibody expression vector obtained in (1) Can also be cloned.
  • the amino acid sequence of the VH or VL of the human antibody for grafting the amino acid sequence of the CDR of the VH or VL of the non-human antibody is selected. Any amino acid sequence can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • human antibody FR amino acid sequences registered in databases such as Protein Data Bank, or common amino acid sequences of each subgroup of human antibody FRs [Sequencesenceof Proteins of Immunological Interest, estUS Dept.eptHealth and Human Services ( 1991)].
  • an FR amino acid sequence having the highest homology (at least 60% or more) with the FR amino acid sequence of the VH or VL of the original antibody is selected.
  • the amino acid sequence of CDR of the original antibody is transplanted to the amino acid sequence of FR of VH or VL of the selected human antibody, respectively, and the amino acid sequence of VH or VL of the humanized antibody is designed respectively.
  • the designed amino acid sequence is converted into a DNA sequence in consideration of the frequency of codon usage [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
  • a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL is designed.
  • a cDNA encoding the humanized antibody VH or VL can be obtained in the gene set obtained in (1). It can be easily cloned into a vector for expression of the replacement antibody.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), the base sequence is determined by the same method as described in (2), and the desired humanized antibody is obtained.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL is obtained.
  • a product obtained by synthesizing the full length VH and the full length VL as one long chain DNA based on the designed DNA sequence can be used in place of the PCR amplification product.
  • the cDNA encoding the humanized antibody VH or VL can be easily converted into the recombinant antibody expression vector obtained in (1). Can be cloned into.
  • a humanized antibody can only have its antigen-binding activity by transplanting only the VH and VL CDRs of a non-human antibody into the VH and VL FRs of a human antibody. [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
  • the amino acid residues of human antibody VH and VL FRs can be modified by performing the PCR reaction described in (4) using the synthetic DNA for modification.
  • the base sequence is determined by the method described in (2) and it is confirmed that the target modification has been performed.
  • the gene is cloned so that it is expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody of the recombinant antibody expression vector obtained in (1).
  • any cell can be used as long as it can express the recombinant antibody.
  • COS-7 cells American Type Culture Collection (ATCC) number: CRL1651] [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)].
  • the expression vector is introduced into COS-7 cells by DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press (1991)] or lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 ( 1987)].
  • the expression amount and antigen binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant are determined by enzyme immunoassay [MonoclonallonAntibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)], etc.
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as a host cell into which the recombinant antibody expression vector is introduced.
  • CHO-K1 ATCC CCL-61
  • DUKXB11 ATCC CCL-9096
  • Pro-5 ATCC CCL-1781
  • CHO-S Life Technologies, Cat # 11619
  • mice 20 (ATCC number: also referred to as CRL1662 or YB2 / 0), mouse myeloma cell NS0, mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14 (ATCC number: CRL1581), mouse P3X63-Ag8.653 cells (ATCC number: CRL1580), dihydro CHO cells (CHO / DG44 cells) lacking a folate reductase gene (Dihydroformate Reductase, hereinafter referred to as dhfr) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)] are used.
  • dhfr dihydroformate Reductase
  • a protein such as an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex sugar chain
  • a transformant that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 sulfate (hereinafter referred to as G418) (Japan).
  • G418 sulfate hereinafter referred to as G418, (Japan).
  • RPMI1640 medium manufactured by Invitrogen
  • GIT medium manufactured by Nippon Pharmaceutical
  • EX-CELL301 medium manufactured by JRH
  • IMDM medium manufactured by Invitrogen
  • Hybridoma-SFM medium manufactured by Invitrogen or Hybridoma-SFM medium or a medium obtained by adding various additives such as FBS to these mediums.
  • the obtained transformant is cultured in a medium to express and accumulate the recombinant antibody in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA method or the like.
  • the expression level of the recombinant antibody produced by the transformed strain can be improved using a dhfr gene amplification system (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891).
  • the recombinant antibody is purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column (Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. Also, methods used in protein purification such as gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration can be combined.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain or whole antibody molecule is determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, “Academic” Press (1996), Antibodies—A Laboratory, Manual, Cold Spring, Laboratory (1988)].
  • the antibody fragment of the present invention can be produced according to a known method.
  • the antibody fragment of the present invention may be prepared by cleaving an antibody prepared according to the method described in (1) to (8) above with an enzyme or the like, or a nucleotide sequence encoding a desired antibody fragment It may be prepared and produced by a genetic engineering technique.
  • the monovalent antibody is expressed in International Publication No. 2014/054804, International Publication No. 2011/090754, International Publication No. 2007/048037, and International Publication No. 2012/116927. It can produce by the method etc. which are described in these.
  • the bispecific antibody or multispecific antibody of the present invention can be produced according to the above-described antibody production method.
  • a bispecific antibody expression vector in which scFv that binds to MOG is fused to the C-terminus of IgG antibody that binds to an antigen present in the brain can be prepared by the method described below.
  • the bispecific antibody can be prepared according to the method and the antibody purification method.
  • a bispecific antibody in which an antibody fragment is fused to the C-terminus of the antibody can be prepared in the same manner.
  • the gene fragment of the CH1-Hinge-CH2-CH3-linker region is amplified by PCR using the synthetic gene of the heavy chain constant region of IgG antibody that binds to the antigen present in the brain as a template.
  • the base sequence of the antibody that binds to MOG is prepared using PCR or the like.
  • the above two regions are combined by PCR or the like, and the obtained gene fragment is inserted into an appropriate vector such as a pCI vector.
  • the above-mentioned vector is obtained by amplifying the light chain region (VL and CL) gene fragment of an IgG antibody that binds to an antigen present in the brain and the VH gene fragment of the antibody by a PCR method using an appropriate template. Insert it at the appropriate position.
  • VL and CL light chain region
  • the bispecific antibody of the present invention can also be prepared by binding an antigen binding site containing an antibody fragment to an IgG antibody by a chemical method.
  • the activity of an antibody or antibody fragment can be evaluated as follows.
  • Binding activity to MOG The binding activity to the MOG of the antibody or the antibody fragment of the present invention is measured using the flow cytometry, ELISA, surface plasmon resonance detection and the like described in 1- (6) above. Moreover, it can also measure using the fluorescent antibody method [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].
  • the binding activity of the monovalent antibody to MOG can be measured by the same method.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment is a bispecific antibody or multispecific antibody that binds to MOG and an antigen present in the brain, the bispecific antibody or multispecific antibody is present in the MOG or brain in the same manner. The binding activity to the antigen to be measured can be measured.
  • the brain tissue is collected after several days after the antibody or the antibody fragment is administered to the animal, and the concentration of the antibody or the antibody fragment in the supernatant after homogenization and centrifugation is measured. Examples include a method for calculating the amount of the antibody fragment or a method for detecting the presence of the antibody or the antibody fragment by a known immunological technique using the collected brain tissue. In addition, there may be mentioned a method of administering an antibody or an antibody fragment labeled with a pharmacologically acceptable label to an animal and detecting the presence of the antibody or the antibody fragment over time with an in vivo imaging system.
  • an appropriate animal can be selected according to the use of the antibody of the present invention or the antibody fragment.
  • Method for controlling effector activity of antibody or antibody fragment As a method for controlling the effector activity of the antibody of the present invention or the antibody fragment, it binds to the 297th asparagine (Asn) of the Fc region of the antibody fragment containing the antibody or Fc.
  • fucose also referred to as core fucose
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • Effector activity refers to antibody-dependent activity caused through the Fc region of an antibody or the antibody fragment, and is antibody-dependent phagocytosis by phagocytes such as ADCC, CDC, or macrophages or dendritic cells.
  • phagocytes such as ADCC, CDC, or macrophages or dendritic cells.
  • ADP Dependent phagocytosis
  • effector activity for example, target cells, human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) as effectors, and target cell-specific antibodies or antibody fragments thereof are mixed and incubated for about 4 hours, and then an indication of cytotoxicity Lactate dehydrogenase (LDH) released as can be measured.
  • LDH cytotoxicity Lactate dehydrogenase
  • the effector activity can be measured by a free 51 Cr method or a flow cytometry method.
  • the effector activity of the antibody or antibody fragment containing Fc can be increased or decreased.
  • CHO cells lacking the ⁇ 1,6-fucose transferase gene may be used to prepare the antibody or the By expressing the antibody fragment, an antibody to which fucose is not bound or the antibody fragment can be obtained.
  • An antibody to which fucose is not bound or the antibody fragment has a high ADCC.
  • an antibody using a host cell into which an ⁇ 1,6-fucose transferase gene has been introduced is used as a method for increasing the content of fucose that binds to an N-linked complex type sugar chain that is bound to Fc of an antibody or the antibody fragment.
  • an antibody to which fucose is bound or the antibody fragment can be obtained by expressing the antibody fragment.
  • the antibody or antibody fragment to which fucose is bound has a lower ADCC than the antibody or antibody fragment to which fucose is not bound.
  • ADCC or CDC can be increased or decreased by modifying amino acid residues in the Fc region of the antibody or antibody fragment. For example, by using the amino acid sequence of the Fc region described in US Patent Application Publication No. 2007/0148165, the CDC of the antibody or the antibody fragment can be increased.
  • ADCC or CDC can be increased or decreased.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof may be modified according to amino acid modification or sugar chain modification in the constant region contained in the antibody or the antibody fragment described above, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-165716 or Japanese Patent Also included are antibodies or antibody fragments in which the half-life in blood is controlled by controlling the reactivity to Fc receptors by carrying out amino acid modifications as described in Kai 2012-021004.
  • an antibody or the antibody fragment with controlled effector activity or blood half-life can be obtained.
  • the antibody or the antibody fragment of the present invention can be used for treatment of a brain disease in an animal in which MOG is expressed in the brain.
  • brain diseases include Alzheimer's disease, progenitor Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, brain tumor, multiple sclerosis, muscular dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, multiple system atrophy, progressive supranuclear palsy, Substantia nigra degeneration, Olive bridge cerebellar atrophy, bulbar spinal muscular atrophy, spinocerebellar degeneration, cerebrovascular disorder, epilepsy, migraine, hyperactivity disorder, Creutzfeldt-Jakob disease, cortical basal ganglia degeneration Disease, lysosomal disease, depression, dystonia and the like.
  • the brain diseases that can be treated by the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof include an antigen to which the antibody of the present invention or the antibody fragment binds and a molecule that modifies the antibody or the antibody fragment with the fusion antibody or fusion antibody fragment of the present invention. It depends on the type.
  • the therapeutic agent containing the antibody or the antibody fragment of the present invention may contain only the antibody or the antibody fragment as an active ingredient, but usually one or more pharmacologically acceptable carriers and They are mixed together and provided as pharmaceutical preparations produced by methods known in the pharmaceutical arts.
  • Examples of the administration route include oral administration, non-oral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular, intracerebroventricular, intraperitoneal, intradermal, nasal, intrathecal, or intravenous. Oral administration is mentioned.
  • Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments or tapes.
  • Preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders or granules.
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Manufactured using preservatives such as esters or flavors such as strawberry flavor or peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders or granules include excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin is used as an additive.
  • Suitable formulations for parenteral administration include injections, suppositories or sprays.
  • An injection is produced using a carrier comprising a salt solution or a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are produced using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the propellant is produced using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, disperses the antibody of the present invention or the antibody fragment as fine particles, and facilitates absorption.
  • a carrier for example, lactose or glycerin is used. It can also be produced as an aerosol or dry powder.
  • the components exemplified as additives in preparations suitable for oral administration can also be added.
  • Method for detecting or measuring antigen present in brain using antibody or antibody fragment of the present invention, or method for diagnosing disease Using antibody or antibody fragment of the present invention, MOG or MOG and antigen present in brain Can be detected or measured. Further, by detecting or measuring MOG or MOG and an antigen present in the brain, it is possible to diagnose a brain disease in an animal in which MOG is expressed in the brain.
  • brain diseases include Alzheimer's disease, progenitor Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, brain tumor, multiple sclerosis, muscular dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, multiple system atrophy, progressive supranuclear palsy, Substantia nigra degeneration, Olive bridge cerebellar atrophy, bulbar spinal muscular atrophy, spinocerebellar degeneration, cerebrovascular disorder, epilepsy, migraine, hyperactivity disorder, Creutzfeldt-Jakob disease, cortical basal ganglia degeneration Cerebral diseases that can be diagnosed with the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, and the antigen to which the antibody of the present invention or the antibody fragment binds, and the fusion antibody of the present invention or the lysosome disease, depression, dystonia, etc. It differs depending on the antibody or the type of molecule that modifies the antibody fragment in the fusion antibody fragment.
  • Diagnosis of a brain disease in an animal in which MOG is expressed in the brain can be performed, for example, by detecting or measuring MOG present in the brain of the patient or patient animal by an immunological technique. Diagnosis can be made by detecting MOG expressed or present in cells in the brain of a patient or patient animal using an immunological technique such as flow cytometry.
  • MOG in the brain can be measured by the same method as described above.
  • the bispecific antibody or the multispecific antibody that binds to MOG and an antigen present in the brain is used as the antibody or the antibody fragment of the present invention, the MOG in the brain or the antigen present in the brain is detected or measured by the same method as described above. can do.
  • the immunological technique is a method for detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • a radioactive substance-labeled immunoantibody method an enzyme immunoassay method, a fluorescence immunoassay method, a luminescence immunoassay method, a Western blot method or a physicochemical method is used.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof is reacted with an antigen or an antigen-expressing cell, and the anti-immunoglobulin antibody or the antibody fragment with a radiolabel is further reacted. Then, measure with a scintillation counter.
  • an antigen or a cell expressing the antigen is reacted with the antibody of the present invention or the antibody fragment, and further reacted with an anti-immunoglobulin antibody or the antibody fragment labeled with an enzyme or the like. Thereafter, the substrate is added and the absorbance of the reaction solution is measured with an absorptiometer. For example, a sandwich ELISA method is used.
  • an enzyme label known in the art [Enzyme immunoassay, Medical School (1987)] can be used.
  • the sandwich ELISA method is a method of binding an antibody to a solid phase, trapping an antigen to be detected or measured, and reacting a second antibody with the trapped antigen.
  • the ELISA method two types of antibodies that recognize an antigen to be detected or measured and that have different antigen recognition sites are prepared, and the first antibody is adsorbed to a plate (for example, a 96-well plate) in advance.
  • the second antibody is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin.
  • the antigen concentration in the test sample is calculated from a calibration curve prepared by diluting antigens with known concentrations stepwise.
  • an antibody used in the sandwich ELISA method either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used. Further, instead of antibodies, antibody fragments such as Fab, Fab ′ or F (ab) 2 may be used.
  • the combination of two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a monoclonal antibody that recognizes different epitopes or a combination of the antibody fragments, or a combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof.
  • the fluorescence immunoassay is measured by the method described in the literature [Monoclonal-Antibodies-Principles and practices, A Third edition, Academic Press (1996), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)].
  • a label used in the fluorescence immunoassay a known fluorescent label [fluorescent antibody method, Soft Science (1983)] can be used.
  • FITC or RITC is used.
  • Luminescent immunoassay is performed by the method described in the literature [Bioluminescence and chemiluminescence, clinical examination 42, Yodogawa Shoten (1998)].
  • Examples of the label used in the luminescence immunoassay include known phosphor labels, and acridinium ester or lophine is used.
  • Western blotting involves fractionating the antigen or antigen-expressing cells with SDS (sodium dodecyl sulfate) -PAGE (polyacrylamide gel) [Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)], Blotting was performed on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane or a nitrocellulose membrane, and the antibody or antibody fragment that recognizes the antigen was reacted with the membrane, and further, a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, or a biotin label was applied. After reacting with the anti-mouse IgG antibody or binding fragment, the label is measured by visualization. An example is shown below.
  • BSA-PBS PBS containing 1 to 10% BSA
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment is reacted, washed with PBS containing 0.05 to 0.1% Tween-20 (hereinafter referred to as Tween-PBS), and peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG. For 2 hours at room temperature.
  • Tween-PBS PBS containing 0.05 to 0.1% Tween-20
  • IgG peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG
  • a polypeptide having the amino acid sequence of MOG is detected by washing with Tween-PBS and detecting a band to which the antibody of the present invention or the antibody fragment is bound using ECL Western Blotting Detection Reagents (manufactured by Amersham) or the like. .
  • an antibody or the antibody fragment used for detection by Western blotting an antibody or the antibody fragment that can bind to a polypeptide that does not have a natural three-dimensional structure is used.
  • the physicochemical method is performed by, for example, forming an aggregate by binding the antigen MOG and the antibody of the present invention or the antibody fragment, and detecting the aggregate.
  • a physicochemical method a capillary method, a one-dimensional immunodiffusion method, an immunoturbidimetric method, or a latex immunoturbidimetric method [Presentation of clinical test method, Kanbara Publishing (1998)] can be used.
  • Latex immunoturbidimetry is a method in which an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m is used to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antigen or antibody. Scattered light increases and transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrating sphere turbidity, the antigen concentration or the like in the test sample is measured.
  • an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m
  • Known immunological detection methods can be used for detection or measurement of cells expressing MOG. Among them, immunoprecipitation, immunocytostaining, immunohistochemical staining, fluorescent antibody staining, etc. are used. It is preferable.
  • a cell expressing MOG or the like is reacted with the antibody of the present invention or the antibody fragment, and then a carrier having a specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to the antigen-antibody complex. To settle.
  • a carrier having a specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to the antigen-antibody complex.
  • the following method can be used.
  • the above-described antibody of the present invention or the antibody fragment is immobilized on a 96-well plate for ELISA, and then blocked with BSA-PBS.
  • the antibody is in an unpurified state, such as a hybridoma culture supernatant, anti-mouse immunoglobulin, anti-rat immunoglobulin, protein-A or protein-G is preliminarily immobilized on a 96-well plate for ELISA. After blocking with BSA-PBS, the hybridoma culture supernatant is dispensed and bound.
  • cells or tissues expressing the antigen are treated with a surfactant or methanol to improve the passage of the antibody in some cases, and then reacted with the antibody of the present invention. Furthermore, after reacting with an anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment thereof to which a fluorescent label such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, or a biotin label is applied, the label is visualized and microscopically observed.
  • a fluorescent label such as FITC
  • an enzyme label such as peroxidase, or a biotin label
  • fluorescent antibody staining (Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific) Fick (1987)] can be used for detection.
  • the antibody or the antibody fragment of the present invention can detect cells expressing and retaining a natural three-dimensional structure by fluorescent antibody staining.
  • the formed antibody-antigen complex and the free that is not involved in the formation of the antibody-antigen complex can be measured without separating the antibody or antigen.
  • Example 1 Acquisition of anti-MOG antibody (1) Acquisition of antibody using human antibody phage library VH gene fragment and VL gene fragment were amplified from cDNA derived from human PBMC by PCR. The VH gene fragment and the VL gene fragment were inserted into the phagemid vector pCANTAB 5E (Amersham Pharmacia), respectively, and E. coli TG1 (Lucigen) was transformed to obtain a plasmid.
  • the obtained plasmid was infected with M13KO7 Helper Page (manufactured by Invitrogen) to obtain a human antibody M13 phage library in which the VH gene and VL gene were made into a library.
  • an anti-rat MOG (rMOG) monoclonal antibody was obtained using the following phage display method.
  • the rMOG-FLAG_Fc of Example 4 to be described later was immobilized on MAXISORP STARTUBE (manufactured by NUNC), and the site where rMOG-FLAG_Fc was not bound was blocked using SuperBlock Blockig Buffer (manufactured by Thermo).
  • the tube was reacted with the human antibody M13 phage library at room temperature for 1 hour, washed with PBS or PBS containing 0.1% Tween 20 (hereinafter referred to as PBS-T), and then 0.1 M Gly-HCl (pH 2.2).
  • PBS-T PBS or PBS containing 0.1% Tween 20
  • the phage was eluted with The eluate was neutralized by adding Tris-HCl (pH 8.5).
  • the eluted phage was infected with TG1 competent cells to amplify the phage.
  • washing and elution were performed by reacting again with rMOG-FLAG_Fc immobilized on MAXISORP STARTUBE. This operation was repeated to concentrate phages that displayed scFv that specifically bind to rMOG-FLAG_Fc.
  • the enriched phage was single-cloned and three clones having binding ability to rMOG-FLAG_Fc were selected by ELISA.
  • rMOG-FLAG_Fc was solid-phased on MAXISORP (manufactured by NUNC), and a site where rMOG-FLAG_Fc was not bound was blocked using SuperBlock Blockig Buffer (manufactured by Thermo).
  • a negative control a plate on which FLAG_Fc was immobilized was also prepared.
  • Each phage clone was added to each well and reacted at room temperature for 30 minutes, and then each well was washed with PBS-T. Next, a solution prepared by diluting anti-M13 antibody (GE Healthcare) labeled with horseradish peroxidase with PBS-T containing 10% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to each well, and the solution was added at room temperature. Incubated for minutes.
  • the microplate was washed 3 times with PBS-T, TMB coloring substrate solution (manufactured by DAKO) was added, and the mixture was incubated at room temperature. 0.5 M sulfuric acid was added to each well to stop the color reaction, and the absorbance at a wavelength of 450 nm (reference wavelength 570 nm) was measured with a microplate reader (Molecular Device). The obtained results are shown in FIG.
  • the clones bound to rMOG-FLAG_Fc were subjected to sequence analysis to obtain anti-MOG antibody phagemid vectors pCANTAB_MOG01, pCANTAB_MOG09 and pCANTAB_MOG14.
  • the names of the anti-MOG scFv antibodies presented by the phages expressed using pCANTAB_MOG01, pCANTAB_MOG09 and pCANTAB_MOG14 are referred to as MOG01 antibody, MOG09 antibody and MOG14 antibody, respectively.
  • Table 1 shows the base sequences encoding VH or VL of various anti-MOG scFv antibodies and the amino acid sequences deduced from the base sequences.
  • Lymphocytes (2 ⁇ 10 7 cells) were collected from the immunized alpaca blood (50 mL), and RNA was extracted from the obtained cells using RNA IsoPlus (manufactured by TAKARA). Furthermore, after synthesizing cDNA by reverse transcription using SuperScript (registered trademark) III First-Strand Synthesis System for RT-PC (manufactured by Invitrogen), Alpaca IgG2 (Short hinge-heavy3 IgG) (Short hinge-heavy3 IgG) The VHH gene was amplified using primers specific for heavy chain antibody.
  • VHH gene fragment was inserted into a phagemid vector pKSTV-02 (described in Miyazaki et al, J. Biochem. 2015; 1), and Escherichia coli TG1 was transformed by electroporation using a MicroPulser electroporator (manufactured by BioRad).
  • the transformant titer was 2.6 ⁇ 10 7 for IgG2 and 3.2 ⁇ 10 7 for IgG3).
  • the obtained transformant was infected with M13KO7 Helper Page (manufactured by Invitrogen) to obtain an alpaca antibody M13 phage library in which the VHH gene was libraryed.
  • an anti-MOG antibody was obtained using the following biopanning technique.
  • RMOG-GST (4 ⁇ g / 2 mL) was immobilized on an immunotube, and the site where rMOG-GST was not bound was blocked with 0.5% BSA.
  • the alpaca antibody M13 phage library was reacted in the tube at room temperature for 1 hour. After washing with PBS-T, the phage was eluted with 0.1 M Gly-HCl (pH 2.7). The eluate was neutralized by adding Tris-HCl (pH 9.1). The eluted phage was amplified after infection with E. coli TG1. Thereafter, it was again reacted with rMOG-GST immobilized on an immunotube to perform washing and elution.
  • This operation was repeated 3 times for IgG2 and 2 times for IgG3 to concentrate phages displaying VHH specifically binding to rMOG-GST.
  • 96 phage clones each displaying IgG2 and IgG3 VHH were cloned from the enriched phage, and clones having binding ability to rMOG-GST were selected by ELISA.
  • rMOG-GST was immobilized on MAXISORP (manufactured by NUNC) (50 ng / 50 ⁇ L), and a site where rMOG-GST was not bound was blocked using 0.5% BSA. Each phage clone was added to each well and reacted at room temperature for 1 hour, and then each well was washed 5 times with PBS-T.
  • TMB chromogenic substrate solution (CALBIOCHEM) was added to each well and incubated at room temperature. The color development reaction was stopped by adding 1 M hydrochloric acid to each well, and the absorbance at a wavelength of 450 nm (reference wavelength 570 nm) was measured with a microplate reader (Model 680XR, manufactured by BioRad).
  • Table 2 shows the nucleotide sequence encoding VHH of the iMOG-3Rim1-S32 antibody and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence.
  • Example 2 Construction of antibody expression vector (1) Construction of anti-MOG antibody expression vector To produce a human IgG type anti-MOG antibody, the human antibody phage library-derived anti-MOG scFv antibody obtained in Example 1 was used. Expression vectors for various anti-MOG antibodies in which the DNA sequence encoding the amino acid sequence of each variable region was incorporated into the amino acid sequence encoding the amino acid sequence of the human IgG antibody constant region were prepared by the methods described below.
  • a base sequence encoding the lambda chain constant region of human IgG was synthesized and inserted into the BglII-EcoRI site of an N5KG4PE vector (described in International Publication No. 2002/088186) to prepare an N5LG4PE vector.
  • N5LG4PE_MOG01 and N5LG4PE_MOG09 The expression vectors in which the nucleotide sequences encoding the VH and VL amino acid sequences of the MOG01 antibody and the MOG09 antibody were inserted into N5LG4PE were named N5LG4PE_MOG01 and N5LG4PE_MOG09, respectively. Further, an expression vector in which the nucleotide sequence encoding the VH and VL amino acid sequences of the MOG14 antibody was inserted into the N5KG4PE vector was named N5KG4PE_MOG14.
  • MOG01 antibody expression vector N5LG4PE_MOG01 Using the phagemid vector pCANTAB_MOG01 as a template, the gene fragment of the VL region was amplified by PCR using primer 1 (SEQ ID NO: 43) and primer 2 (SEQ ID NO: 44), and KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo). In PCR, 30 cycles of a reaction consisting of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 45 seconds were performed. PCR described in Example 2 was performed under the above conditions unless otherwise specified.
  • primer 3 SEQ ID NO: 45
  • primer 2 SEQ ID NO: 44
  • KOD plus DNA Polymerase manufactured by Toyobo
  • the obtained gene fragment was inserted into the BglII-BlpI site of the N5LG4PE vector to obtain N5LG4PE_MOG01VL.
  • the gene fragment of the VH region was amplified by PCR using pCANTAB_MOG01 as a template, primer 4 (SEQ ID NO: 46) and primer 5 (SEQ ID NO: 47), and KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo).
  • a signal sequence was added to the gene fragment of the VH region by PCR using primer 6 (SEQ ID NO: 48), primer 5 (SEQ ID NO: 47), and KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo).
  • the obtained gene fragment was inserted into the SalI-NheI site of the N5LG4PE_MOG01VL vector to obtain N5LG4PE_MOG01.
  • MOG09 antibody expression vector N5LG4PE_MOG09 N5LG4PE_MOG09 was produced by the same method as in (1-1) above.
  • primer 7 SEQ ID NO: 49
  • primer 8 SEQ ID NO: 50
  • primer 3 sequence No.
  • primer 8 SEQ ID NO: 50
  • primer 9 SEQ ID NO: 51
  • primer 10 SEQ ID NO: 52
  • VH region gene fragment Primer 6 SEQ ID NO: 48
  • Primer 10 SEQ ID NO: 52
  • MOG14 antibody expression vector N5KG4PE_MOG14 N5KG4PE_MOG14 was produced by the same method as in (1-1) above.
  • primer 11 SEQ ID NO: 53
  • primer 12 SEQ ID NO: 54
  • primer 3 sequence No. 45
  • primer 12 SEQ ID NO: 54
  • primer 13 SEQ ID NO: 55
  • primer 14 SEQ ID NO: 56
  • primer 6 SEQ ID NO: 48
  • primer 14 SEQ ID NO: 56
  • the obtained VH region gene fragment to which the signal sequence was added was inserted into the SalI-NheI site of N5KG4PE_MOG14VL to obtain N5KG4PE_MOG14.
  • iMOG-3Rim1-S32 antibody expression vector N5G4PEFc_iMOG-3Rim1-S32 A sequence obtained by adding a signal sequence to a gene encoding the Fc region of human IgG4PE was synthesized, and using primer 25 (SEQ ID NO: 79) and primer 26 (SEQ ID NO: 80), and KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo) The gene fragment of the human Fc region was amplified by PCR.
  • the obtained Fc gene fragment was inserted into the BglII-BamHI site of the N5KG4PE vector to prepare an N5G4PEFc vector.
  • N5G4PEFc_iMOG-3Rim1-S32 An expression vector in which a base sequence encoding the amino acid sequence of iMOG-3Rim1-S32 VHH was inserted into N5G4PEFc was named N5G4PEFc_iMOG-3Rim1-S32.
  • a VHH-Fc expression vector was prepared by the method described below.
  • VHH base sequence of iMOG-3Rim1-S32 was synthesized, and the VHH region gene was obtained by PCR using primer 15 (SEQ ID NO: 57) and primer 16 (SEQ ID NO: 58), and KOD plus DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.). The fragment was amplified. In PCR, 30 cycles of a reaction consisting of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 60 seconds were performed. The obtained VHH gene fragment was inserted into the EcoRI-BglII site of the N5G4PEFc vector to obtain N5G4PEFc_iMOG-3Rim1-S32.
  • N5LG4PE_AVM of anti-Avermectin antibody As a negative control antibody, a chimeric anti-Avermectin (AVM) antibody was prepared by the same method as in (1-1) above.
  • the expression vector in which the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL of the AVM antibody was inserted into N5LG4PE was named N5LG4PE_AVM.
  • SD rats were immunized with AVM and anti-AVM antibody-producing hybridomas were established by a conventional method.
  • a signal sequence was added to the primer fragment 29 (SEQ ID NO: 83) and primer 30 (SEQ ID NO: 84) and the gene fragment of the VL region for amplification of the gene fragment of the VL region.
  • primer 3 SEQ ID NO: 45
  • primer 30 SEQ ID NO: 84
  • primer 31 SEQ ID NO: 85
  • primer 32 SEQ ID NO: 86
  • primer 6 SEQ ID NO: 48
  • primer 32 SEQ ID NO: 86
  • Expression vector N5KG4PE (R409K) _OX26 of anti-rat transferrin receptor antibody OX26 antibody The anti-rat transferrin receptor antibody OX26 antibody described in [Protein Engineering, 12, 787-796, 1999] was produced as a positive control antibody for the anti-rat transferrin receptor antibody.
  • a gene encoding the VL amino acid sequence of the OX26 antibody is synthesized and used as a template.
  • primer 40 SEQ ID NO: 94
  • primer 41 SEQ ID NO: 95
  • gene fragment of the VH region Primer 42 and primer 43 (SEQ ID NO: 97) were used for amplification of.
  • bispecific antibody expression vector (1) Preparation of bispecific antibody expression vector that binds to Her2 and MOG Bispecific antibody expression vector pCI-Transtumumab-hKG4PE (R409K) that binds to HER2 and MOG _MOG01scFv was produced by the following method.
  • the bispecific antibody is obtained by fusing the scFv of the anti-MOG antibody to the C-terminus of the two heavy chains of IgG of the anti-HER2 antibody.
  • MOG01scFv gene fragment of the scFv region (hereinafter referred to as MOG01scFv) by PCR using primer 19 (SEQ ID NO: 61) and primer 20 (SEQ ID NO: 62), and KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo) was amplified.
  • PCR performed 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 90 seconds.
  • primer 17 SEQ ID NO: 59
  • primer 20 SEQ ID NO: 62
  • KOD plus DNA Polymerase manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • PCR performed 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 2 minutes.
  • the obtained gene fragment was inserted into a pCI vector (manufactured by Promega) to prepare a pCI-hG4PE (R409K) _MOG01scFv vector.
  • a gene encoding the amino acid sequence of the VL of an anti-HER2 antibody (Trastuzumab) (described in WO 1999/57134) was synthesized and used as a template, primer 21 (SEQ ID NO: 63) and primer 22 (SEQ ID NO: 64), and The gene fragment of the VL region was amplified by PCR using KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • PCR 30 cycles of a reaction consisting of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 45 seconds were performed.
  • N5KG4PE vector described in WO 2002/088186
  • primer 27 SEQ ID NO: 81
  • primer 28 SEQ ID NO: 82
  • KOD plus DNA Polymerase manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • PCR 30 cycles of a reaction consisting of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 45 seconds were performed.
  • the gene fragment was amplified by PCR using primer 21 (SEQ ID NO: 63), primer 28 (SEQ ID NO: 82), and KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • PCR performed 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 90 seconds.
  • the obtained gene fragment was inserted into pCI-hG4PE (R409K) _MOG01scFv to obtain pCI-TransuzumabVL-hKG4PE (R409K) _MOG01scFv.
  • a gene encoding the VH amino acid sequence of trastuzumab was synthesized and used as a template, PCR using primer 23 (SEQ ID NO: 65) and primer 24 (SEQ ID NO: 66), and KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). To amplify the VH region gene fragment. In PCR, 30 cycles of a reaction consisting of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 45 seconds were performed.
  • the obtained gene fragment was inserted into pCI-TransuzumabVL-hKG4PE (R409K) _MOG01scFv to obtain pCI-Transuzumab-hKG4PE (R409K) _MOG01scFv.
  • bispecific antibody that binds to AVM and MOG
  • an expression vector of bispecific antibody that binds to AVM and MOG was prepared by the method described below for pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _MOG01scFv .
  • the bispecific antibody is obtained by fusing the scFv of the anti-MOG antibody to the IgG C-terminus of the anti-AVM antibody.
  • the gene fragment of the AVM light chain region was amplified by PCR using N5LG4PE_AVM as a template, primer 33 (SEQ ID NO: 87) and primer 34 (SEQ ID NO: 88), and KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo). In PCR, 30 cycles of a reaction consisting of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 60 seconds were performed.
  • the gene fragment of the AVM VH region was amplified by PCR using N5LG4PE_AVM as a template, primer 35 (SEQ ID NO: 89), primer 32 (SEQ ID NO: 86), and KOD plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo).
  • PCR performed 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 2 minutes.
  • primer 38 SEQ ID NO: 92
  • primer 39 SEQ ID NO: 93
  • KOD plus DNA Polymerase manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • PCR performed 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 90 seconds.
  • primer 36 SEQ ID NO: 90
  • primer 39 SEQ ID NO: 93
  • KOD plus DNA Polymerase manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the obtained gene fragment was inserted into the NheI-BamHI site of the above-mentioned pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _MOG01scFv to obtain pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _AVM scFv.
  • Example 4 Production of soluble MOG antigen and soluble HER2 antigen (1) Production of extracellular domain protein of rat MOG conjugated with FLAG-Fc An extracellular domain protein was prepared by the method described below.
  • the nucleotide sequence encoding rMOG is shown in SEQ ID NO: 67, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 68.
  • the gene sequence of the extracellular domain of MOG was synthesized and inserted into the BglII-XbaI site of the IMPEP4 (made by IDEC) vector into which FLAG-Fc was inserted, whereby FLAG-Fc was added to the C-terminal side of MOG.
  • a plasmid vector INPEP4_rMOG-FLAG-Fc expressing the extracellular domain was prepared.
  • the nucleotide sequence of rMOG-FLAG-Fc is shown in SEQ ID NO: 69, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 70.
  • IMPEP4_rMOG-FLAG-Fc was introduced into buoyant 293 cells using Expi293 (trademark) Expression System (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and the protein was expressed in a transient expression system.
  • Expi293 trademark
  • the culture supernatant was collected and filtered through a membrane filter (manufactured by MILLIPORE) having a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • the MOG-FLAG-Fc protein in the culture supernatant was affinity purified using Protein A resin (MabSelect SuRe, manufactured by GE Healthcare Biosciences). A phosphate buffer was used as a washing solution.
  • the protein adsorbed on protein A was eluted with 20 mM sodium citrate, 50 mM NaCl buffer (pH 3.4), and collected in a tube containing 1 M Tris-HCl Buffer Solution (pH 8.0).
  • N5_rMOG-GST An expression plasmid vector N5_rMOG-GST was prepared.
  • the nucleotide sequence of rMOG-GST is shown in SEQ ID NO: 71, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 72.
  • an extracellular domain protein of HER2 with GST added to the C-terminus was prepared by the method described below.
  • the extracellular domain of HER2 with GST added to the C-terminal side was synthesized.
  • An expression plasmid vector N5_hHER2-GST was prepared.
  • the nucleotide sequence of hHER2-GST is shown in SEQ ID NO: 71, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 72.
  • N5_rMOG-GST and N5_hHER2-GST were introduced and cultured in suspension 293 cells using Expi293 (trademark) Expression System (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and proteins were expressed in a transient expression system.
  • Expi293 trademark
  • MILLIPORE membrane filter
  • the protein in the culture supernatant was affinity purified using Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare Bioscience). A phosphate buffer was used as a washing solution. The protein adsorbed on Glutathione Sepharose 4B was eluted with 50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutation (pH 8.0).
  • Example 5 Preparation of membrane-type MOG antigen expression vector
  • rMOG rat MOG
  • mMOG mouse MOG
  • cMOG monkey MOG
  • hMOG human MOG
  • Plasmid vectors pEF6_rMOG, pEF6_mMOG, pEF6_cMOG, and pEF6_hMOG for various MOG membranes were prepared by inserting into the BamHI-NotI site of the / V5-His (Thermo Fisher Scientific) vector.
  • the base sequence encoding mMOG is shown in SEQ ID NO: 73, and the amino acid sequence deduced from the base sequence is shown in SEQ ID NO: 74.
  • the base sequence encoding cMOG is shown in SEQ ID NO: 75, and the amino acid sequence deduced from the base sequence is shown in SEQ ID NO: 76.
  • the base sequence encoding hMOG is shown in SEQ ID NO: 77, and the amino acid sequence deduced from the base sequence is shown in SEQ ID NO: 78.
  • Example 6 Preparation of various antibodies
  • the antibody expression plasmid vector prepared in Example 2 and Example 3 was introduced into buoyant 293 cells using Expi293 TM Expression System (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and cultured. Antibodies were expressed in a transient expression system.
  • the culture supernatant was collected and filtered through a membrane filter (MILLIPORE) having a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • the protein in the culture supernatant was affinity purified using Protein A resin (MabSelect SuRe, manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • a phosphate buffer was used as a washing solution.
  • the antibody adsorbed to protein A was eluted with 20 mM sodium citrate and 50 mM NaCl buffer (pH 3.4) and collected in a tube containing 1 M Tris-HCl Buffer Solution (pH 8.0).
  • Anti-MOG antibody expression vectors N5LG4PE_MOG01, N5LG4PE_MOG09, N5KG4PE_MOG14 and N5G4PEFc_iMOG-3Rim1-S32 expressed in Example 2 were expressed as MOG01 antibody, MOG09 antibody, and MOG14 antibody, respectively. It describes.
  • the various bispecific antibody expression vectors pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _AVM scFv, pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _MOG01scFv, and pCI-Transuzumab-hKG4PE (R409K) _MOG01v obtained by expressing the various bispecific antibody expression vectors prepared in Example 3
  • AVM IgG4PE (R409K) _AVM dscFv antibody AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody
  • Trastuzumab IgG4PE (R409K) _MOG01scFv antibody Trastuzumab IgG4PE (R409K) _MOG01scFv antibody, respectively.
  • Example 7 Evaluation of binding ability of anti-MOG antibody to MOG by flow cytometer The binding of anti-MOG antibody MOG01 antibody, MOG09 antibody, MOG14 antibody and iMOG-3Rim1-S32 antibody obtained in Example 6 to MOG was as follows. According to the procedure of Fluorescence activation cell sorting (FACS) method, it evaluated.
  • FACS Fluorescence activation cell sorting
  • Example 5 Various membrane-type MOG antigen expression vectors prepared in Example 5 were introduced into and cultured in free-floating 293 cells using FreeStyle (trademark) 293, Expression System (Thermo Fisher Scientific), and membrane-type in a transient expression system. The antigen was expressed. Using the above cells, the reactivity of the anti-MOG antibody was analyzed by the method described below.
  • rMOG / HEK293F, mMOG / HEK293F, cMOG / HEK293, and hMOG / HEK293 cells were suspended in a staining buffer (SB) in PBS containing 0.1% NaN 3 and 1% FBS at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / mL, respectively. , And dispensed into a 96-well round bottom plate (Becton Dickinson).
  • SB staining buffer
  • Example 6 After centrifugation (2000 rpm, 4 ° C., 2 minutes), the supernatant is removed, 10 ⁇ g / mL of each antibody obtained in Example 6 is added to the pellet and suspended, and then allowed to stand at ice temperature for 30 minutes. did. Further, the supernatant was removed by centrifugation (2000 rpm, 4 ° C., 2 minutes), the pellet was washed with SB, 1 ⁇ g / mL RPE fluorescent-labeled goat anti-human antibody (manufactured by Southern Bioblot) was added, and the temperature was lowered. Incubated for 30 minutes.
  • anti-MOG antibodies MOG01 antibody, MOG09 antibody, MOG14 antibody and iMOG-3Rim1-S32 antibody all showed binding activity against rMOG / HEK293F cells and mMOG / HEK293F cells. It was. Both MOG01 antibody and MOG14 antibody also showed binding activity to cMOG / HEK293 cells and hMOG / HEK293 cells.
  • the anti-MOG human IgG antibodies MOG01 and MOG14 recognize and bind not only rat and mouse MOG but also cynomolgus monkey and human MOG.
  • Example 8 Evaluation of binding of anti-MOG antibody to MOG by surface plasmon resonance detection Affinity of anti-MOG antibody MOG01 antibody, MOG09 antibody, MOG14 antibody and iMOG-3Rim1-S32 antibody obtained in Example 6 to rat MOG was measured using Biacore T-100 (GE Healthcare).
  • the dissociation constant (KD value) of each anti-MOG antibody is 2.1 ⁇ 10 ⁇ 11 (M) to 4.0 ⁇ 10 ⁇ 8 (M), and all antibodies have good affinity. It became clear to show.
  • the dissociation rate constant kd is outside the instrument measurement range, and the KD value cannot be uniquely determined.
  • Example 9 Evaluation of transferability of anti-MOG antibody to rat brain After tail vein (iv) administration of antibody to rats, blood was collected from the tail vein. On the same day as the blood collection, brain tissue was collected after whole body perfusion under pentobarbital anesthesia, and its weight was measured. Further, a buffer solution was added to the collected brain tissue for homogenization, and after centrifugation, the antibody solution eluted in the supernatant was collected. The volume was measured and the antibody concentration was measured by AlphaLISA (manufactured by PerkinElmer) to calculate the amount of antibody per unit brain weight.
  • AlphaLISA manufactured by PerkinElmer
  • MOG01 antibody MOG14 antibody, and iMOG-3Rim1-S32 antibody, and negative control anti-AVM antibody
  • MOG01 antibody and MOG14 antibody were 1 mg / kg body weight
  • iMOG-3Rim1-S32 antibody was 5 mg / kg body weight.
  • 3A and 3B show the antibody concentration in serum and the amount of antibody per unit brain weight in brain tissue 4 days after administration of the antibody.
  • the antibody concentration in the serum did not change for any of the anti-MOG antibodies compared to the negative control (AVM), but the antibodies in the brain The amount was shown to increase 5-10 times.
  • anti-MOG01 antibody anti-transferrin receptor antibody OX26 antibody, and negative control anti-AVM antibody
  • the antibody concentration in the serum and brain tissue 4 days and 10 days after the administration of the antibody at an amount of 5 mg / kg body weight The amount of antibody per unit brain weight is shown in FIGS. 4 (A) and (B).
  • the antibody concentration in the serum after 4 days was the lowest among the antibodies evaluated, and the blood kinetics of the antibody was poor, such as being below the detection sensitivity after 10 days.
  • the MOG01 antibody which is an anti-MOG antibody
  • the antibody concentration was comparable to that of the negative control. From this, it can be said that the blood half-life of the MOG01 antibody is the negative control and the degree of identification.
  • the negative control had the lowest antibody amount among the antibodies evaluated at 4 days after administration, but was slight after 10 days. Furthermore, the amount of antibody decreased.
  • the antibody amount of OX26 antibody rapidly decreases between 4 days and 10 days after administration, and the amount of antibody after 10 days of administration is below the negative control, whereas MOG01 antibody is between 4 days and 10 days after administration.
  • the amount of antibody increased, the amount of antibody 4 days after administration was about 2.5 times that of the negative control, and the amount of antibody 10 days after administration was about 10 times that of the negative control.
  • the anti-MOG antibody MOG01 antibody showed an antibody concentration at the same level as that of the negative control in serum, but the dose of the antibody in the brain was about 2.5 times that of the negative control 10 days after administration. After days, it was shown to be about 10 times higher than the negative control and OX26 antibody.
  • Example 10 Evaluation of binding property of MOG bispecific antibody to MOG or HER2 by flow cytometer Bispecific antibody Trastuzumab IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody, MOG and AVM binding to MOG and Her2 obtained in Example 6
  • the membrane-type MOG antigen expression vector prepared in Example 5 was introduced and cultured in free-floating 293 cells using FreeStyle (trademark) 293 Expression System (Thermo Fisher Scientific), and the membrane-type antigen was transferred using a transient expression system. Expressed.
  • HEK293F cells, rMOG / HEK293F cells, hMOG / HEK293F cells, and human breast cancer cell line SK-BR-3 cells were stained with PBS containing 0.1% NaN 3 and 1% FBS at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / mL, respectively.
  • the suspension was suspended in Buffer (SB) and dispensed into a 96-well round bottom plate (Becton Dickinson).
  • Example 6 After centrifugation (2000 rpm, 4 ° C., 2 minutes), the supernatant is removed, 10 ⁇ g / mL of each antibody obtained in Example 6 is added to the pellet and suspended, and then allowed to stand at ice temperature for 30 minutes. did. Further, the supernatant was removed by centrifugation (2000 rpm, 4 ° C., 2 minutes), the pellet was washed with SB, 1 ⁇ g / mL RPE fluorescent-labeled goat anti-human antibody (manufactured by Southern Bioblot) was added, and the temperature was lowered. Incubated for 30 minutes.
  • FIG. 5 shows the results of binding analysis on HEK293F cells, rMOG / HEK293F cells, and hMOG / HEK293 cells.
  • FIG. 6 shows the results of binding analysis for the human breast cancer cell line SK-BR-3 cells. It is known that HER2 is expressed in the cells.
  • FIG. 6 shows that the Trastuzumab IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody retains binding to HER2 even in the form of a bispecific antibody.
  • the dissociation constant (KD value) of each bispecific antibody is expressed as AVM.
  • IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody is 2.0 ⁇ 10 ⁇ 7 (M)
  • Trastuzumab IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 (M)
  • any MOG bispecific antibody is used. It was found to show good affinity.
  • the dissociation constant (KD value) of Trastuzumab IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody for HER2 is 3.7 ⁇ 10 ⁇ 9 (M), and it is clear that the antibody exhibits good affinity. Became.
  • Example 13 Evaluation of MOG bispecific antibody to rat brain migration
  • AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody The brain migration was evaluated in the same manner as in Example 9.
  • 7A and 7B show the antibody concentration in the serum 10 days after administration of the antibody at an amount of 5 mg / kg body weight and the antibody amount per unit brain weight in the brain tissue.
  • the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody As shown in FIG. 7 (A), the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody, the Trastuzumab IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody, compared to the AVM IgG4PE (R409K) _AVM dscFv antibody, which is a negative control of the bispecific antibody, There was no difference in serum antibody concentrations.
  • the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody the Trastuzumab IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv antibody, compared to the AVM IgG4PE (R409K) _AVM dscFv antibody, which is a negative control of the bispecific antibody, It was shown that the amount of antibody in the brain increased about 10 times.
  • bispecific antibodies that bind to MOG can increase the amount of antibody in the brain by about 10 times compared to bispecific antibodies that do not bind to MOG, while there is no change in blood half-life. It was done.
  • Example 14 Evaluation of transferability of anti-MOG01 antibody to mouse brain (1) Measurement of antibody amount Tail vein blood was collected several days after the antibody was administered to mice at 35 nmol / kg via the tail vein (iv). On the same day as the blood collection, brain tissue was collected after whole body perfusion under pentobarbital anesthesia, and its weight was measured. Further, a buffer solution was added to the collected brain tissue for homogenization, and after centrifugation, the antibody solution eluted in the supernatant was collected. The volume was measured and the antibody concentration was measured by AlphaLISA (manufactured by PerkinElmer) to calculate the amount of antibody per unit brain weight.
  • AlphaLISA manufactured by PerkinElmer
  • anti-MOG01 human IgG antibody and negative control anti-AVM human IgG antibody antibody concentration in serum and antibody per unit brain weight in brain tissue 3, 6, 10, 14, 21, and 28 days after antibody administration The amounts are shown in FIGS. 8 (A) and (B), respectively.
  • the anti-MOG01 human IgG antibody showed no difference in the antibody concentration in serum compared to the negative control.
  • FIG. 8B it was shown that the amount of antibody in the brain can be increased several tens of times over 28 days.
  • the anti-MOG01 human IgG antibody and the negative control anti-AVM human IgG antibody were labeled with Alexa FluorR 488 Protein Labeling Kit (Molecular Probes).
  • the labeled antibodies are AF488-MOG01 IgG4PE antibody and AF488-AVM IgG4PE antibody.
  • FIG. 9 A brain imaging image after 6 days is shown in FIG. 9 (A), and a brain imaging image after 14 days is shown in FIG. 9 (B).
  • FIG. 9C shows the amount of fluorescence in the brain after correction with the fluorescence intensity of the administered antibody.
  • the anti-MOG01 antibody can increase the amount of the antibody several tens of times over the entire brain as compared with the negative control.
  • Bispecific antibody expression vectors that bind to AVM and MOG having the structures described in FIGS. 10 (A) to (C) and FIGS. 11 (A) and (B) It was produced by the following method.
  • the name of the bispecific antibody and the name of the antibody expression vector are shown in Table 6, and the name of the antibody expression vector, the base sequence of the antibody, and the amino acid sequence deduced from the base sequence are shown in Table 7.
  • the obtained gene fragment was inserted into a pCI vector (manufactured by Promega) to prepare a pCI-MOG01-hLG4PE (R409K / Y349C / T366S / L368A / Y407V) -His tag vector.
  • linker-MOG01scFv-FLAG tag region was amplified by PCR using the above PCR product as a template.
  • the gene fragment of CH1-Hinge-CH2-CH3 (R409K / S354C / T366W) -linker region and linker-MOG01scFv-FLAG tag region is inserted into the NheI-BamHI site of pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _AVM scFv, AVM-hLG4PE (R409K / S354C / T366W) -linker-MOG01scFv-FLAG tag vector was prepared.
  • the gene fragment of the CH1-Hinge-CH2-CH3-linker region and the VH and VL regions of MOG01 were inserted into the NheI-BamHI site of pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _AVMscFv and pCI-AVM-hLG4PE (R409K ) _MOG01scFv2 vector was prepared.
  • the gene fragment of CH1-Hinge-CH2-CH3 (R409K / S354C / T366W) -linker region and linker-AVMscFv-FLAG tag region is inserted into the NheI-BamHI site of pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _AVM scFv, pC AVM-hLG4PE (R409K / S354C / T366W) -linker-AVMscFv-FLAG tag vector was prepared.
  • the gene fragment of the CH1-Hinge-CH2-CH3-linker region and the gene fragment of the AVM VH region and VL region were inserted into the NheI-BamHI site of pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _AVMscFv, and pCI-AVM-hLG4PE (R409K) ) _AVMscFv3 vector and pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _AVMscFv5 vector were prepared.
  • AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 Fab antibody AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv2 antibody, AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv3 antibody, AVM IgG4PE (RVM40PE) by the method described in Example 6 _MOG01dscFv4 antibody, AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv5 antibody, AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv6 antibody, AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv7 antibody, AVM IgG4PE (R409K) _MOG01PE OG01dscFv10 antibodies were AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv11 antibody,
  • AVM-MOG01 IgG4PE (R409K) antibody, AVM IgG4PE (R409K) _MOG01sscFv antibody and AVM IgG4PE (R409K) _AVMsscFv antibody were prepared by the methods described below.
  • the antibody expression plasmid vector was introduced into buoyant 293 cells using Expi293 (trademark) Expression System (Thermo Fisher Scientific) and cultured, and the antibody was expressed in a transient expression system.
  • the culture supernatant was collected and filtered through a membrane filter (MILLIPORE) having a pore size of 0.22 ⁇ m. Proteins in the culture supernatant were affinity purified by His tag using Ni Sepharose resin (GE Healthcare Bioscience). A 20 mM imidazole-phosphate buffer was used as a washing solution.
  • MILLIPORE membrane filter having a pore size of 0.22 ⁇ m. Proteins in the culture supernatant were affinity purified by His tag using Ni Sepharose resin (GE Healthcare Bioscience). A 20 mM imidazole-phosphate buffer was used as a washing solution.
  • the antibody adsorbed on the Ni Sepharose resin was eluted with 500 mM imidazole-phosphate buffer. Next, the solvent of the eluate was replaced with PBS by ultrafiltration using VIVASPIN (manufactured by Sartrius stealin) and NAP column (manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • the His tag-purified protein was affinity purified using a FLAG antibody affinity gel (Sigma-Aldrich). A phosphate buffer was used as a washing solution. The antibody adsorbed on the FLAG antibody affinity gel was eluted with 20 mM sodium citrate, 50 mM NaCl buffer (pH 3.4), and collected in a tube containing 1 M Tris-HCl Buffer Solution (pH 8.0).
  • Example 17 Evaluation of binding properties of various bispecific antibodies to MOG using a flow cytometer The binding of various bispecific antibodies and negative control antibodies obtained in Examples 6 and 16 to MOG was performed according to the following procedure. It was evaluated by sorting (FACS) method.
  • PEF6_hMOG obtained in Example 5 was introduced into mouse connective tissue-derived fibroblast L929 [American Type Culture Collection (ATCC) number: CCL-1] using HilyMax (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.). After selecting the cells after gene introduction with the antibiotic Blasticidin (manufactured by Invitrogen), cloning was performed by limiting dilution, and using L929 cells expressing hMOG on the cell surface (hereinafter abbreviated as hMOG / L929), The reactivity of various bispecific antibodies was analyzed by the method described below.
  • hMOG / L929 was suspended in 0.1% NaN 3 , 1% FBS-containing PBS Staining Buffer (SB), and dispensed into a 96-well round bottom plate (Becton Dickinson). After centrifugation (2000 rpm, 4 ° C., 2 minutes), the supernatant was removed, and various MOG01 bispecific antibodies obtained in Example 6 and Example 16 were added to the pellets to suspend them, followed by 30 minutes under ice temperature. Let stand for a minute.
  • SB FBS-containing PBS Staining Buffer
  • each of the various bispecific antibodies has a binding property to MOG.
  • AVM IgG4PE (R409K) _MOG01Fab antibody [FIG. 10 (B), FIG.
  • Example 18 Evaluation of binding properties of various bispecific antibodies to MOG by surface plasmon resonance detection Binding of various bispecific antibodies obtained in Examples 6 and 16 to MOG was carried out in the same manner as in Example 8. evaluated. The obtained results are shown in Table 10 and Table 11.
  • the dissociation constant (KD value) of the bispecific antibody of each MOG is 1.2 ⁇ 10 ⁇ 8 (M) to 2.0 ⁇ 10 ⁇ 7 (M). It was revealed that the antibody also showed good affinity.
  • AVM-MOG01 IgG4PE (R409K) antibody [FIG. 10 (A)]
  • AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 Fab antibody [FIG. 10 (B)]
  • AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv3 antibody AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 dscFv5 antibody [FIG. (B)] proved to have high binding properties.
  • Example 19 Evaluation of various bispecific antibodies to mouse brain transfer The mouse brain transferability of various bispecific antibodies and negative control antibodies obtained in Example 6 and Example 16 was evaluated by the method of Example 14.
  • AVM-MOG01 IgG4PE (R409K) antibody For AVM-MOG01 IgG4PE (R409K) antibody, AVM IgG4PE (R409K) _MOG01sscFv antibody and AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 Fab antibody, the antibody was administered at 5 mg / kg, and the antibody concentration in serum and the unit in brain tissue after 10 days The amount of antibody per brain weight is shown in FIGS. 14 (A) to 16 (B).
  • FIG. 14 (A), FIG. 15 (A) and FIG. 16 (A) there was no difference in the antibody concentration in serum with any MOG01 modified antibody compared to the negative control.
  • the AVM-MOG01 IgG4PE (R409K) antibody is about 8 times the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01sscFv as compared to the negative control. It was shown that the amount of antibody in the brain increased about 12 times for the antibody and about 30 times for the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01 Fab antibody.
  • AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv antibody For AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv antibody, AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv3 antibody and AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv5 antibody, the antibody was administered at 5 mg / kg, and the serum antibody concentration and brain tissue after 10 and 28 days The amount of antibody per unit brain weight is shown in FIGS. 17 (A) to (D).
  • FIGS. 17 (A) and (C) there was no difference in the antibody concentration in serum with any bispecific antibody compared to the negative control.
  • the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv antibody, the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv3 antibody, and the AVM IgG4PE (R409K) _MOG01dscFv5 antibody showed the antibody amount in the brain over 28 days. It has been shown that it can be increased several tens of times.
  • bispecific antibodies with high amounts of antibodies in the brain after 28 days have high binding properties to MOG (Table 11), and the MOG binding activity correlates with the amount of antibodies in the brain. It became clear.
  • Example 20 Acquisition of a novel MOG antibody exhibiting stronger binding to MOG than anti-MOG01 antibody (1)
  • the extracellular domain proteins of soluble human MOG antigen and soluble mouse MOG antigen bound to FLAG-Fc Production of plasmid vectors IMPEP4_hMOG-FLAG-Fc and IMPEP4_mMOG-FLAG-Fc expressing the extracellular domain protein of MOG with FLAG-Fc added to the C-terminus as soluble antigens of human MOG and mouse MOG are described in Example 4. It was produced by the method.
  • the base sequence of hMOG-FLAG-Fc is shown in SEQ ID NO: 100
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence is shown in SEQ ID NO: 101
  • the base sequence of mMOG-FLAG-Fc is shown in SEQ ID NO: 102
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 103.
  • the extracellular domain protein of MOG bound to FLAG-Fc was obtained by transient expression and purification by the method described in Example 4.
  • immunization was performed three times with hMOG-GST and mMOG-GST.
  • the spleen was dissected from the individual that had been administered intraperitoneally, and erythrocytes were removed using an erythrocyte removal reagent (manufactured by SIGMA), followed by CELLBANKER 1 (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) Frozen. From the individuals that received intradermal administration, the armpit lymph nodes were collected by dissection, the red blood cells were removed with a red blood cell removal reagent, and then frozen with CELLBANKER 1.
  • RNA was extracted from the obtained spleen cells and cells of the subarachnoid lymph node using RNeasy Plus Mini kit (manufactured by QIAGEN), and cDNA was synthesized using SMARTER RACE cDNA amplification kit (manufactured by Clontech). Using the synthesized cDNA, a phage library derived from a human antibody-producing mouse was prepared by the method described in Example 1.
  • an anti-human MOG monoclonal antibody was obtained by the phage display method.
  • the phage display method and cloning ELISA were performed by the method described in Example 1 using hMOG-FLAG_Fc and mMOG-FLAG_Fc.
  • hMOG-FLAG_Fc subjected to sequence analysis of the clones bound to mMOG-FLAG_Fc and hMOG / Expi293F cells, anti-MOG antibody phagemid vector pCANTAB_MOG301, pCANTAB_MOG303, pCANTAB_MOG307, pCANTAB_MOG310, pCANTAB_MOG312, pCANTAB_MOG326, pCANTAB_MOG329, pCANTAB_MOG446, were obtained pCANTAB_MOG456 and PCANTAB_MOG473.
  • pCANTAB_MOG301 pCANTAB_MOG303, pCANTAB_MOG307, pCANTAB_MOG310, pCANTAB_MOG303, pCANTAB_MOG303, pCANTAB_MOG303, pCANTAB_MOG303, pCANTAB_MOG303, pCANTAB_MOG303, pCANTAB_MOG303, pCANTAB_MOG303
  • antibodies MOG310 antibodies, MOG312 antibodies, MOG326 antibodies, MOG329 antibodies, MOG446 antibodies, MOG456 antibodies, and MOG473 antibodies.
  • Table 12 shows nucleotide sequences encoding VH or VL of various anti-MOG antibodies and amino acid sequences deduced from the nucleotide sequences.
  • the MOG307 antibody has a homologous sequence clone of 97-99% homology (MOG323, MOG341, MOG354, MOG355), and the MOG310 antibody has a homologous sequence clone of 85-98% homology (MOG308, MOG316, MOG319, MOG320, MOG338, MOG352, MOG359, MOG478), MOG329 antibody with 85% homologous sequence clone (MOG470), and MOG456 antibody with 84% homologous sequence clone (MOG 18) was Tokura by phage display method using the index MOG binding.
  • Table 13 shows the base sequence encoding the VH or VL of a similar clone and the amino acid sequence deduced from the base sequence, and FIG. 18 to FIG.
  • Example 21 Preparation of anti-MOG scFv-Fc antibody A gene fragment in the scFv region was amplified by PCR using the phagemid vector pCANTAB_MOG01 as a template. The gene fragment of the Hinge-CH2-CH3 region was amplified by PCR using the synthetic gene of the heavy chain constant region as a template. The obtained gene fragment was inserted into an N5KG4PE vector (described in International Publication No. WO 2002/088186) to prepare an N5-MOG01 scFv-hG4PE vector.
  • N5KG4PE vector described in International Publication No. WO 2002/088186
  • the gene fragment of the scFv region was amplified by PCR using the phagemid vector pCANTAB_MOG301 as a template.
  • the gene fragment of the Hinge-CH2-CH3 region was amplified by PCR using the synthetic gene of the heavy chain constant region as a template.
  • the obtained gene fragment was inserted into a pCI vector (manufactured by Promega) to prepare a pCI-MOG301 scFv-hG4PE (R409K) vector.
  • antibody expression vectors in which the gene fragments of the scFv regions of various anti-MOG antibodies shown in Table 12 were inserted were prepared, pCI-MOG303 scFv-hG4PE (R409K), pCI-MOG307 scFv-hG4PE (R409K), respectively.
  • the prepared anti-MOG antibody expression vector was prepared by the method described in Example 6. Expression vectors of anti-MOG antibodies pCI-MOG301 scFv-hG4PE (R409K), pCI-MOG303 scFv-hG4PE (R409K), pCI-MOG307 scFv-hG4PE (R409K), pCI-MOG310 scFv-hG4PEGp3F4012 -HG4PE (R409K), pCI-MOG326, scFv-hG4PE (R409K), pCI-MOG329, scFv-hG4PE (R409K), pCI-MOG446, scFv-hG4PE (R409K), pCI-MOG456CFR40G -MOG301 scFv-hG4PE (R409K) by expressing hG4PE (R409K) Antibody,
  • Example 22 Evaluation of binding of anti-MOG antibody to MOG by flow cytometer The binding of anti-MOG antibody obtained in Example 21 to MOG was evaluated in the same manner as in Example 7. The results are shown in FIGS.
  • Example 23 Evaluation of anti-MOG antibody binding to MOG by surface plasmon resonance detection MOG01 scFv-hG4PE, MOG301 scFv-hG4PE (R409K), MOG303 scFv-hG4PE (R409K), MOG307 scFv- obtained in Example 21 hG4PE (R409K), MOG329 scFv-hG4PE (R409K), MOG446 scFv-hG4PE (R409K), MOG456 scFv-hG4PE (R409K) and MOG473 scFv-hG4PE (R409K) to human MOG and Example 8 Evaluation was made in the same manner. For the analyte, hMOG-GST and mMOG-GST were used. Table 14 shows the results of the evaluation of binding to human MOG, and Table 15 shows the results of the evaluation of binding to mouse MOG.
  • each anti-MOG antibody has a dissociation constant (KD value) for human MOG of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 10 (M) to 3.6 ⁇ 10 ⁇ 9 (M), and for mouse MOG.
  • the dissociation constant (KD value) was 1.9 ⁇ 10 ⁇ 10 (M) to 6.9 ⁇ 10 ⁇ 9 (M), and it was revealed that all antibodies showed good affinity.
  • the binding rate constant ka is outside the instrument measurement range, and the KD value cannot be uniquely determined.
  • the gene fragment of the linker-ASM region was amplified by PCR. Further, a gene fragment of the CH1-Hinge-CH2-CH3 (R409K) region was synthesized by PCR using the synthetic gene as a template.
  • N5LG4PE_MOG01 as a template, the gene fragment of the MOG01 light chain region and the gene fragment of the MOG01 VH region were amplified by PCR.
  • the obtained gene fragment was inserted into a pCI vector (manufactured by Promega) to prepare a pCI-MOG01-hLG4PE (R409K) _ASM vector.
  • a pCI-MOG01-hLG4PE (R409K) _ASM vector Using the synthetic gene as a template, the gene fragment in the CH2-CH3 region was amplified by PCR. The gene fragments of the CH2-CH3 region and the linker-ASM region were inserted into the PmlI-BamHI site of the pCI-AVM-hLG4PE (R409K) vector to prepare pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _ASM.
  • PCI-MOG01-hLG4PE (R409K) _ASM and pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _ASM were expressed and purified by the method shown in Example 6.
  • the antibody obtained by expressing pCI-MOG01-hLG4PE (R409K) _ASM is MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM
  • the antibody obtained by expressing pCI-AVM-hLG4PE (R409K) _ASM is AVM IgG4PE (R409K) -ASM Named.
  • FIG. 26 shows the results of confirming the binding of MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM to MOG-expressing cells in the same manner as in Example 23. Further, the binding property to the MOG soluble antigen was confirmed by the same method as in Example 8. As a result, the dissociation constant (KD value) of MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM was 2.9 ⁇ 10 ⁇ 9 (M), It showed good affinity.
  • anti-ASM antibody manufactured by LSBio was bound to the prepared MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM and AVM IgG4PE (R409K) -ASM.
  • MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM and AVM IgG4PE (R409K) -ASM are solid-phased (100 ng / 50 ⁇ L) on MAXISORP (manufactured by NUNC) and PE4 is used with SuperBlock Blockig Buffer (manufactured by Thermo) 4 R409K) -ASM and AVM IgG4PE (R409K) -ASM were not blocked.
  • a negative control a plate on which anti-MOG01 IgG antibody and anti-AVM IgG antibody were immobilized (50 ng / 50 ⁇ L) was also prepared.
  • the produced ASM fusion antibody was recognized and bound by the anti-ASM antibody. Further, the sphingomyelinase activity of the prepared MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM and AVM IgG4PE (R409K) -ASM was measured using a sphingomyelinase activity measurement kit (manufactured by Echelon Biosciences), and as a result, the prepared ASM fusion antibody was obtained. It was confirmed to have enzyme activity. From the above results, it was confirmed that the enzyme fusion antibody obtained by fusing the enzyme with the MOG antibody retains both the antigen binding activity and the enzyme activity.
  • Example 26 Evaluation of enzyme fusion antibody to mouse brain transfer The mouse fusion ability of the ASM fusion antibody obtained in Example 24 was evaluated in the same manner as in Example 14. The ASM fusion antibody was administered at 5 mg / kg, and the serum antibody concentration after 10 days and the amount of antibody per unit brain weight in the brain tissue are shown in FIG.
  • MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM had no difference in serum antibody concentration compared to AVM IgG4PE (R409K) -ASM.
  • MOG01 IgG4PE (R409K) -ASM showed that the amount of antibodies in the brain increased about 58 times compared to AVM IgG4PE (R409K) -ASM.
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  • SEQ ID NO: 12 Description of artificial sequence: amino acid sequence of LCDR3 of MOG01
  • 15 Description of artificial sequence: amino acid sequence of VH of MOG09 without signal sequence
  • SEQ ID NO: 16 Description of artificial sequence: amino acid sequence of HCDR1 of MOG09 S
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Abstract

本発明は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＯＧ）に結合する抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸、当該核酸を含むベクターを含む形質転換細胞、該抗体または該抗体断片の製造方法、該抗体または該抗体断片を含む組成物、ならびに該抗体または該抗体断片を用いた脳に存在する抗原を検出または測定する方法、脳疾患を診断または治療する方法、抗体の脳滞留性を向上させる方法、および脳内の抗体量を増加させる方法に関する。

Description

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に結合する抗体
　本発明は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＯＧ）に結合する抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸、当該核酸を含むベクターを含む形質転換細胞、該抗体または該抗体断片の製造方法、該抗体または該抗体断片を含む組成物、ならびに該抗体または該抗体断片を用いた脳に存在する抗原を検出または測定する方法、脳疾患を診断または治療する方法、抗体の脳滞留性を向上させる方法、および脳内の抗体量を増加させる方法に関する。
　１９８６年にマウス抗ＣＤ３抗体、ｍｕｒｏｍｏｎａｂ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）が最初の抗体医薬品としてＦＤＡから承認を受けて以来、数多くの抗体医薬品が開発されている。１９９４年には、マウス抗体のもつ抗原性を低減するために、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を連結したキメラ抗体ａｂｃｉｘｉｍａｂが承認を受けている。
　さらに抗原性を低減するために、マウス抗体の可変領域の抗原結合に重要な働きをもつ相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲ）をヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅ　ｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ、以下ＦＲ）に移植するヒト化抗体技術が開発され、１９９７年にヒト化抗ＣＤ２０抗体ｄａｃｉｚｕｍａｂが承認を受けている。
　また、ヒトの抗体配列ライブラリを用いたファージディスプレイ技術が用いられるようになり、ファージディスプレイ技術で取得した最初の抗体として、完全ヒト抗ＴＮＦα抗体ａｄａｌｉｍｕｍａｂが２００２年に承認されている。ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＴＮＦα、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ等を標的抗原とした抗体医薬品が、既に６０品目以上が承認されている（非特許文献１）。
　このように、抗体は幅広く認知された医薬品フォーマットとなっている。これまでに承認された抗体医薬品のうち大部分はがんや免疫疾患を対象とするものであり、全体の約７５％以上を占めている。
　中枢神経疾患の治療においても、抗体などのバイオロジクスの重要性が高まっており、アミロイドβに対するモノクローナル抗体がアルツハイマー病において研究されていることや、神経保護作用を有する各種神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｏｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ、ｇｌｉａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｏｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；ＧＤＮＦ）が中枢神経疾患において神経保護作用を示すことが動物モデルで報告されている（非特許文献２）。
　しかしながら、中枢神経系では、抗体を末梢に投与した場合に他の臓器と比べて送達量が低く、抗体移行率（脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ　ｆｌｕｉｄ；ＣＳＦ）中濃度と血清濃度の比）は０．１－０．３％と報告されている（非特許文献３－５）。
　脳及び脊髄を含む中枢神経系において薬剤送達量が低下する理由として、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ　Ｂｒａｉｎ　Ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）と呼ばれる血液と脳との組織液間での物質輸送を制限する機構が挙げられる。血液脳関門は、血管内皮細胞の細胞間接合による物理的・非特異的な制御機構と、排出トランスポーターによる基質特異的な排出機構を有しており、異物若しくは薬物から中枢神経系を保護し、恒常性の維持に重要な役割を果たしている。
　しかしながら、血液脳関門の存在により、中枢神経系では薬剤投与時の有効濃度が得られにくく、薬剤開発が困難になっている。例えば、ハーラー症候群（ムコ多糖症Ｉ型）に対するα－Ｌ－イズロニダーゼや、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）に対するイズロン酸２－スルファターゼの静脈内投与による酵素補充療法が行われているが、酵素の分子量が大きく血液脳関門を通過しないため、中枢神経症状に対する有効性は認められていない（非特許文献６－９）。また、一定量の組換え酵素を定期的に継続投与するため、中和抗体の産生等の副作用が現れることが報告されている（非特許文献１０）。
　また、脳内濃度を高めるために、バイオロジクスを髄腔内または脳内に直接投与する試みも行われている。例えば、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）の患者の脳障害の進行を防止するために、イズロン酸２－スルファターゼを患者の脳内に投与する方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、髄腔内または脳内への直接投与は侵襲性が高い（非特許文献１１）。
　そのため、バイオロジクスのような高分子物質の脳内濃度を高めるために、様々な送達技術が研究されている。例えば、脳血管内皮細胞に発現している膜蛋白質に結合し、高分子物質と膜蛋白質の複合体を形成させてエンドサイトーシスにより血液脳関門を通過させる方法が複数報告されている。
　報告されている技術のほとんどは、受容体介在性トランスサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ、以下ＲＭＴ）を利用したものであり、標的となる脳血管内皮発現受容体としては、例えばトランスフェリン受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、及び低比重リポ蛋白質受容体ファミリー（ＬＤＬＲｆ）がある。
　抗トランスフェリン受容体抗体と神経成長因子との融合蛋白質を作製することにより、トランスフェリン受容体を介した血液脳関門通過技術が報告されている。抗トランスフェリン受容体抗体を用いた技術としては、抗トランスフェリン受容体抗体と抗ベーターセクレターゼ（ＢＡＣＥ１）抗体とのバイスペシフィック抗体（特許文献２および３、並びに非特許文献１２および１３）や、抗アミロイドβ抗体のカルボキシル末端側に抗トランスフェリン受容体の一価抗体を融合させた融合抗体（特許文献４、非特許文献１４）が報告されている。
　抗トランスフェリン受容体抗体と抗ＢＡＣＥ１抗体とのバイスペシフィック抗体による脳送達は、マウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇ体重で抗体を投与した際に脳での抗体取り込み量がコントロールの約４倍に増加することが報告されている（非特許文献１３）。
　また、抗トランスフェリン受容体抗体を表面に有するリポソームに薬剤を内包させることで、薬剤を血液脳関門において通過させる技術が報告されている。抗ラットトランスフェリン受容体抗体とイムノミセル融合体により、ラット脳での取り込み量が約２～５倍に増加することが報告されている（非特許文献９）。
　また、抗インスリン受容体抗体のカルボキシル末端側に神経栄養因子や酵素または抗アミロイド抗体を融合した融合蛋白質を作製することにより、インスリン受容体を介した血液脳関門通過技術が報告されている（非特許文献１６－１９）。
　アカゲザルにおいて、標識抗ヒトインスリン受容体抗体とＧＤＮＦとの融合抗体を投与した２時間後の脳での取り込み量が、ＧＤＮＦと比較して約１５倍となることが報告されている（非特許文献１７）。
　しかしながら、トランスフェリン受容体やインスリン受容体は脳血管内皮細胞だけでなく、肝臓など全身で発現しているため、これらの技術では中枢神経系への薬剤送達量の増大とともに肝臓などにも薬剤送達が起こる（非特許文献２０）。さらに、全身で抗原が発現しているため、抗体の血中半減期が短い（非特許文献１２）。
　また、脳血管内皮膜発現抗原であるＴＭＥＭ３０Ａに対する抗体（Ｆｃ５）が、ＲＭＴ様の活性を示すことが報告されている（特許文献５、並びに非特許文献２１および２２）。Ｆｃ５はラマ由来のシングルドメインの重鎖抗体の重鎖可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　Ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ｏｆ　Ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、以下ＶＨＨ）抗体であり、Ｆｃ５とヒトＦｃ融合体がコントロールＩｇＧと比較して脳送達が増加することが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＢＢＢモデルおよびラットｉｎ　ｖｉｖｏモデルにおいて示されている。
　Ｆｃ５由来の単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｓｃＦｖ）と代謝型グルタミン酸受容体１型（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ　Ｉ、以下ｍＧｌｕＲＩ）抗体との融合体が、コントロール単鎖抗体とｍＧｌｕＲＩ抗体との融合体と比較して、ラットモデルでのＣＳＦ曝露が高まることが報告されているが、増加量としては５倍程度である（非特許文献２３）。　
　また、ＩｇＧ抗体は胎児性Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦｃＲｎ）によって脳内から循環血液方向へ速やかに排出されることが報告されており（非特許文献２４および２５）、例えばラットにおけるＩｇＧの脳内投与後の脳内半減期は４８分間と短い（非特許文献２４）。
　ＭＯＧは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する蛋白質であり、ミエリンを構成している。ヒトＭＯＧの全長は２１８アミノ酸からなり、中枢神経系においてミエリンの最外層で発現しており、細胞接着及び細胞表面相互作用において役割を果たしている（非特許文献２６－２８）。
　多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＭＳ）のような中枢神経のグリア細胞が自己免疫により攻撃される炎症性疾患において、ＭＯＧは自己抗原候補であると考えられている（非特許文献２９および３０）。ＭＳ患者において、血清中の抗ＭＯＧ抗体の濃度は低いが、中枢神経内でも抗ＭＯＧ抗体が検出されることが報告されている（非特許文献２９）。
　この理由として、ＭＳのような病態時には液性因子の漏出と炎症性細胞の侵入により血液脳関門の破綻が起こり、抗体が中枢神経系に移行しやすくなっていることが報告されている（非特許文献３０および３１）。さらに、中枢神経系に浸潤したＢ細胞や形質細胞により自己抗体が中枢神経系内局所で産生されていることが報告されている（非特許文献３０、３２および３３）。
　実験的自己免疫性脳脊髄炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；ＥＡＥ）は、ＭＳと多くの病態を共有することから、ＭＳの病態研究において使用されているモデルである。ＭＯＧタンパク質またはペプチドを動物に免疫することにより、ＥＡＥが誘導できることが報告されている（非特許文献３４）。
　また、ＥＡＥを誘導した動物に抗ＭＯＧ抗体を投与することでＥＡＥスコアが増悪するという報告（非特許文献２９および３５）があるが、抗体投与後１－２日後（非特許文献２９）または４日後（非特許文献３５）がＥＡＥスコアのピークを示しており、一過的である。一方で、正常な動物に抗ＭＯＧ抗体のみを投与してもＥＡＥは発症しないことが報告されている（非特許文献３６および３７）。
国際公開第２０１２／０２３６２３号 国際公開第２０１６／０８１６４０号 国際公開第２０１６／０８１６４３号 国際公開第２０１４／０３３０７４号 カナダ国特許第２６２３８４１号明細書
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　非特許文献２９、３５はＥＡＥモデルに抗ＭＯＧ抗体を投与すると、当該抗体が脳内で検出されることが記載されているが、正常な動物の末梢に抗ＭＯＧ抗体を投与したときに、脳内での存在を検出できる抗ＭＯＧ抗体の報告はない。
　本発明は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＯＧ）に結合するＭＯＧ結合分子及び該分子を用いた方法に関する。具体的には、ＭＯＧに結合する抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸、当該核酸を含むベクターを含む形質転換細胞、該抗体または該抗体断片の製造方法、該抗体または該抗体断片を含む組成物、ならびに該抗体または該抗体断片を用いた脳に存在する抗原を検出または測定する方法、脳疾患を診断または治療する方法、抗体の脳滞留性を向上させる方法、および脳内の抗体量を増加させる方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するための手段として、本発明はＭＯＧに結合するＭＯＧ結合分子及び該分子を用いた方法、具体的には抗体または該抗体断片を提供する。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（２２）に関する。
（１）ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（以下ＭＯＧと記載）に結合する抗体または該抗体断片。
（２）抗体が脳滞留性を有する（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（３）抗体が下記（ａ）～（ｒ）からなる群より選ばれる１である、（１）または（２）に記載の抗体または該抗体断片。
（ａ）重鎖可変領域（以下ＶＨと記載する）の相補性決定領域（以下、ＣＤＲ）１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４、５および６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６、１７および１８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２２、２３および２４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｃ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２８、２９および３０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３４、３５および３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｄ）重鎖抗体の重鎖可変領域（以下ＶＨＨと記載する）のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４０、４１および４２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｅ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５３、１５４および１５５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５８、１５９および１６０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｆ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６３、１６４および１６５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６８、１６９および１７０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｇ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７３、１７４および１７５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７８、１７９および１８０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｈ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１８３、１８４および１８５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１８８、１８９および１９０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｉ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１９３、１９４および１９５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１９８、１９９および２００に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｊ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２０３、２０４および２０５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２０８、２０９および２１０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｋ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２１３、２１４および２１５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２１８、２１９および２２０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｌ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２２３、２２４および２２５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２２８、２２９および２３０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｍ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３３、２３４および２３５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３８、２３９および２４０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｎ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２４３、２４４および２４５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２４８、２４９および２５０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ）前記（ａ）～（ｎ）に記載の少なくとも１つの抗体と、ＭＯＧへの結合について競合する抗体、
（ｐ）前記（ａ）～（ｎ）に記載のいずれか１つの抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体、および
（ｑ）前記（ａ）～（ｎ）に記載のいずれか１つの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
（ｒ）前記（ａ）～（ｎ）に記載のいずれか１つの抗体のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体。
（４）抗体が下記（ａ）～（ｎ）、（ｏ１）～（ｏ２２）および（ｐ）からなる群より選ばれる１である、（１）～（３）のいずれか１つに記載の抗体または該抗体断片。
（ａ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５に記載されるアミノ酸配列含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｃ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｄ）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｅ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１５７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｆ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１６２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｇ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１７２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１７７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｈ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１８２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１８７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｉ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１９２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１９７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｊ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２０７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｋ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２１２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２１７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｌ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２２２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２２７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｍ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２３２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２３７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｎ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２４２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２４７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２５２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２５４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２５６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２５８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ３）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２６０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ４）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２６４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ５）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２６８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ６）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２７２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２７６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２８０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２８２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２８４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２８６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２８８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２９２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２９６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１３）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３００に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３０２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１４）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３０４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３０６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１５）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３０８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１６）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３１２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３１４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３１６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３１８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３２２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３２６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ２０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ２１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３３２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、および
（ｏ２２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３３６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
（ｐ）前記（ａ）～（ｎ）及び（о１）～（о２２）に記載のいずれか１つの抗体のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体。
（５）抗体または該抗体断片がバイスペシフィック抗体である、（１）～（４）のいずれか１つに記載の抗体または該抗体断片。
（６）バイスペシフィック抗体がＭＯＧと脳に存在する抗原に結合する、（５）に記載のバイスペシフィック抗体。
（７）バイスペシフィック抗体がＭＯＧに結合する抗原結合部位と、脳に存在する抗原に結合する抗原結合部位とを含む、（５）または（６）に記載のバイスペシフィック抗体。
（８）抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、ＶＨＨおよびＣＤＲを含むペプチドからなる群より選ばれる１である、（１）～（７）のいずれか１つに記載の抗体断片。
（９）抗体が遺伝子組換え抗体である、（１）～（８）のいずれか１つに記載の抗体および該抗体断片。
（１０）抗体がマウス抗体、ラット抗体、ラビット抗体、アルパカ抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群より選ばれる１である、（１）～（９）のいずれか１つに記載の抗体および該抗体断片。
（１１）（１）～（１０）のいずれか１つに記載のＭＯＧに結合する抗体または該抗体断片に、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つを結合させた融合抗体または融合抗体断片。
（ａ）親水性高分子、
（ｂ）両親媒性高分子、および
（ｃ）機能性分子。
（１２）（１）～（１１）のいずれか１つに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（１３）（１）～（１１）のいずれか１つに記載の抗体をコードする塩基配列を含む核酸。
（１４）（１３）に記載の核酸を含むベクターを含む形質転換細胞。
（１５）（１２）に記載のハイブリドーマまたは（１４）に記載の形質転換細胞を培養し、培養液から（１）～（１１）のいずれか１つに記載の抗体または該抗体断片を採取することを含む、（１）～（１１）のいずれか１つに記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
（１６）（１）～（１１）のいずれか１つに記載の抗体または該抗体断片を含む、組成物。
（１７）脳に存在する抗原の検出または測定用の組成物である、（１６）に記載の組成物。
（１８）脳疾患の診断または治療をするための組成物である、（１６）に記載の組成物。
（１９）（１）～（１１）のいずれか１つに記載の抗体若しくは該抗体断片、または（１６）に記載の組成物を用いて、脳に存在する抗原を検出または測定する方法。
（２０）（１）～（１１）のいずれか１つに記載の抗体若しくは該抗体断片、または（１６）に記載の組成物を用いて、脳疾患を診断または治療する方法。
（２１）（１）～（１１）のいずれか１つに記載の抗体または該抗体断片若しくは融合抗体または融合抗体断片、または（１６）に記載の組成物を用いて、抗体または該抗体断片若しくは融合抗体または融合抗体断片の脳滞留性を向上させる方法。
（２２）（１）～（１１）のいずれか１つに記載の抗体または該抗体断片若しくは融合抗体または融合抗体断片、または（１６）に記載の組成物を用いて、脳内の抗体量または該抗体断片量若しくは融合抗体量または融合抗体断片量を増加させる方法。
　本発明のＭＯＧ結合分子は、ＭＯＧに特異的に結合することで結合分子自体の脳滞留性を増加させるだけでなく、その他の分子をＭＯＧ結合分子に修飾することで脳内への輸送、滞留させることで、脳疾患の治療に応用することができる。本発明の具体的なＭＯＧ結合分子としては、抗体が挙げられる。本発明の抗体または該抗体断片は、脳内のＭＯＧに結合することにより、脳滞留性を有する抗体である。それゆえ、本発明の抗体または該抗体断片は、脳に存在する抗原（ＭＯＧ、またはＭＯＧと脳に存在するその他の抗原）の検出または測定用の組成物、脳疾患の診断用の組成物、および脳疾患を治療するための医薬組成物として用いることができる。
図１は、ＭＯＧに結合するｓｃＦｖ提示ファージクローンのｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃに対する結合性をＥＬＩＳＡにより解析した結果である。縦軸にｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃに対する吸光度、横軸に各ファージクローンが提示するｓｃＦｖ抗体の名称を表す。 図２は、各抗ＭＯＧ抗体のＨＥＫ細胞、ラットＭＯＧ／ＨＥＫ細胞、マウスＭＯＧ／ＨＥＫ細胞、カニクイザルＭＯＧ／ＨＥＫ細胞またはヒトＭＯＧ／ＨＥＫ細胞に対する結合性を、フローサイトメーターにより解析した結果である。縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を表す。点線のヒストグラムはネガティブコントロールとして用いた抗ＡＶＭ抗体の結合性を、実線のヒストグラムは各ＭＯＧ抗体の結合性を示す。 図３（Ａ）および（Ｂ）は、抗ＭＯＧ抗体のラット脳移行性評価の結果である。図３（Ａ）は、ラットに抗体を投与して４日後の、血清中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は投与した抗体を示す。図３（Ｂ）は、ラットに抗体を投与して４日後の、脳組織中の抗体濃度を示す。縦軸は脳重量あたりの抗体量（ｎｇ／ｇ　脳）、横軸は投与した抗体を示す。いずれの図においても、白い棒グラフがネガティブコントロールとして用いた抗ＡＶＭ抗体を、黒い棒グラフが抗ＭＯＧ抗体を表す。 図４（Ａ）および（Ｂ）は、抗ＭＯＧ抗体のラット脳移行性評価の結果である。図４（Ａ）は、ラットに抗体を投与して４日後及び１０日後の、血清中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は抗体を投与してからの日数（日）を示す。図４（Ｂ）は、ラットに抗体を投与して４日後及び１０日後の、脳組織中の抗体濃度を示す。縦軸は脳重量あたりの抗体量（ｎｇ／ｇ　脳）、横軸は抗体を投与してからの日数（日）を示す。いずれの図においても、白ひし形はネガティブコントロールとして用いた抗ＡＶＭ抗体を、白四角は抗トランスフェリン受容体抗体ＯＸ２６抗体を、黒三角は抗ＭＯＧ抗体ＭＯＧ０１抗体を示す。 図５は、各種バイスペシフィック抗体のＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ラットＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ細胞またはヒトＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する結合性を、フローサイトメーターにより解析した結果である。縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を表す。点線のヒストグラムはネガティブコントロールとして用いた抗ＡＶＭ抗体の結合性を、実線のヒストグラムは各バイスペシフィック抗体の結合性を示す。 図６は、各種バイスペシフィック抗体のヒト乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３に対する結合性を、フローサイトメーターにより解析した結果である。縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を表す。点線のヒストグラムはネガティブコントロールとして用いた抗ＡＶＭ抗体の結合性を、実線のヒストグラムは各バイスペシフィック抗体の結合性を示す。 図７（Ａ）および（Ｂ）は、ＭＯＧに結合するバイスペシフィック抗体のラット脳移行性評価の結果である。図７（Ａ）は、ラットに抗体を投与して１０日後の、血清中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は使用したバイスペシフィック抗体を示す。図７（Ｂ）は、ラットに抗体を投与して１０日後の、脳組織中の抗体濃度を示す。縦軸は脳重量あたりの抗体量（ｎｇ／ｇ　脳）、横軸は使用したバイスペシフィック抗体を示す。 図８（Ａ）および（Ｂ）は、抗ＭＯＧ０１抗体のマウス脳移行性評価の結果である。図８（Ａ）は、マウスに抗体を投与して３、６、１０、１４、２１、２８日後の、血清中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は時間（日）を示す。図８（Ｂ）は、マウスに抗体を投与して３、６、１０、１４、２１、２８日後の、脳組織中の抗体濃度を示す。縦軸は抗体濃度（ｎｇ／ｇ　脳）、横軸は時間（日）を示す。いずれの図においても、白丸はネガティブコントロールとして用いた抗ＡＶＭ抗体を、黒四角はＭＯＧ０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥを示す。 図９（Ａ）～（Ｃ）は、抗ＭＯＧ０１抗体のマウス脳移行性イメージング評価の結果である。図９（Ａ）は、マウスにネガティブコントロールであるＡｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒＲ　４８８標識抗ＡＶＭ抗体とＡｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒＲ　４８８標識抗ＭＯＧ０１抗体を投与して６日後の脳の蛍光強度測定データ、図９（Ｂ）は１４日後の脳の蛍光強度測定データである。図９（Ｃ）は６日後および１４日後の脳中蛍光量を投与抗体の蛍光強度で補正した値である。縦軸は脳中蛍光量／投与抗体の蛍光量（％）、横軸は投与した抗体を示す。 図１０（Ａ）～（Ｃ）は、ＡＶＭとＭＯＧに結合する各種バイスペシフィック抗体の構造を示す。図１０（Ａ）はＡＶＭ－ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、図１０（Ｂ）はＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　Ｆａｂ抗体、図１０（Ｃ）はＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｓｃＦｖ抗体の構造を示す。 図１１（Ａ）および（Ｂ）は、ＡＶＭとＭＯＧに結合する各種バイスペシフィック抗体の構造を示す。図１１（Ａ）はＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ２抗体およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ４抗体、図１１（Ｂ）はＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ３抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ５抗体～ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦ１１抗体の構造を示す。 図１２（Ａ）～（Ｃ）は、各種バイスペシフィック抗体のヒトＭＯＧ／Ｌ９２９細胞に対する結合性を、フローサイトメーターにより解析した結果である。縦軸に平均蛍光強度を、横軸に抗体濃度を表す。図１２（Ａ）では、白丸がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体（ネガティブコントロール）、黒四角がＡＶＭ－ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体を示す。図１２（Ｂ）では、白丸がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｓｃＦｖ抗体（ネガティブコントロール）、黒四角がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｓｃＦｖ抗体を示す。図１２（Ｃ）では、白丸がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　Ｆａｂ抗体（ネガティブコントロール）、黒四角がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　Ｆａｂ抗体を示す。 図１３（Ａ）および（Ｂ）は、各種バイスペシフィック抗体のヒトＭＯＧ／Ｌ９２９細胞に対する結合性を、フローサイトメーターにより解析した結果である。縦軸に平均蛍光強度を、横軸に抗体濃度を表す。図１３（Ａ）では、白四角がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ抗体、白丸がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ２抗体、白三角がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ４抗体を示す。図１３（Ｂ）では、白ひし形がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ３抗体、黒ひし形がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ５抗体、白丸がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ６抗体、黒丸がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ７抗体、白三角がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ８抗体、黒三角がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ９抗体、白四角がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ１０抗体、黒四角がＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ１１抗体を示す。 図１４（Ａ）および（Ｂ）は、各種バイスペシフィック抗体のマウス脳移行性評価の結果である。縦軸は抗体濃度、横軸は使用したバイスペシフィック抗体を示す。図１４（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体（ネガティブコントロール）とＡＶＭ－ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体を投与１０日後の血清中および脳組織中の抗体濃度を示す。 図１５（Ａ）および（Ｂ）は、各種バイスペシフィック抗体のマウス脳移行性評価の結果である。縦軸は抗体濃度、横軸は使用したバイスペシフィック抗体を示す。図１５（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｓｃＦｖ抗体（ネガティブコントロール）およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｓｃＦｖ抗体を投与１０日後の血清中および脳組織中の抗体濃度を示す。 図１６（Ａ）および（Ｂ）は、各種バイスペシフィック抗体のマウス脳移行性評価の結果である。縦軸は抗体濃度、横軸は使用したバイスペシフィック抗体を示す。図１６（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　Ｆａｂ抗体（ネガティブコントロール）およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　Ｆａｂ抗体を投与１０日後の血清中および脳組織中の抗体濃度を示す。 図１７（Ａ）～（Ｄ）は、各種バイスペシフィック抗体のマウス脳移行性評価の結果である。縦軸は抗体濃度、横軸は使用したバイスペシフィック抗体を示す。ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ抗体に対応するネガティブコントロールはＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｄｓｃＦｖ抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ３抗体に対応するネガティブコントロールはＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｄｓｃＦｖ３抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ５抗体に対応するネガティブコントロールはＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｄｓｃＦｖ５抗体である。図１７（Ａ）は抗体投与１０日後の血清中の抗体濃度を示す。図１７（Ｂ）は抗体投与１０日後の脳組織中の抗体濃度を示す。図１７（Ｃ）は抗体投与２８日後の血清中の抗体濃度を示す。図１７（Ｄ）は抗体投与２８日後の脳組織中の抗体濃度を示す。 図１８は、ＭＯＧ抗体の類似クローンのｓｃＦｖのアミノ酸配列であり、ＭＯＧ３０１抗体の類似クローンを示す。 図１９は、ＭＯＧ抗体の類似クローンのｓｃＦｖのアミノ酸配列であり、ＭＯＧ３０３抗体の類似クローンを示す。 図２０は、ＭＯＧ抗体の類似クローンのｓｃＦｖのアミノ酸配列であり、ＭＯＧ３０７抗体の類似クローンを示す。 図２１は、ＭＯＧ抗体の類似クローンのｓｃＦｖのアミノ酸配列であり、ＭＯＧ３１０抗体の類似クローンを示す。 図２２（Ａ）および（Ｂ）は、ＭＯＧ抗体の類似クローンのｓｃＦｖのアミノ酸配列である。図２２（Ａ）はＭＯＧ３２９抗体の類似クローンを、図２２（Ｂ）はＭＯＧ４５６抗体の類似クローンを示す。 図２３は、抗ＭＯＧ抗体のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対する結合性を、フローサイトメーターにより解析した結果である。縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を表す。点線のヒストグラムはネガティブコントロールとして用いた抗ＡＶＭ抗体の結合性を、実線のヒストグラムは各ＭＯＧ抗体の結合性を示す。 図２４は、抗ＭＯＧ抗体のマウスＭＯＧ／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対する結合性を、フローサイトメーターにより解析した結果である。縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を表す。点線のヒストグラムはネガティブコントロールとして用いた抗ＡＶＭ抗体の結合性を、実線のヒストグラムは各ＭＯＧ抗体の結合性を示す。 図２５は、抗ＭＯＧ抗体のヒトＭＯＧ／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対する結合性を、フローサイトメーターにより解析した結果である。縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を表す。点線のヒストグラムはネガティブコントロールとして用いた抗ＡＶＭ抗体の結合性を、実線のヒストグラムは各ＭＯＧ抗体の結合性を示す。 図２６は、酵素融合抗体ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭのヒトＭＯＧ／Ｌ９２９細胞に対する結合性を、フローサイトメーターにより解析した結果である。縦軸に平均蛍光強度を、横軸に抗体濃度を表す。 図２７は、抗ＡＳＭ抗体（ＬＳＢｉｏ社製）のＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭおよびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭに対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法により解析した結果である。縦軸は吸光度、横軸は固相した抗体名を示す。ネガティブコントロールとして、ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ　およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥを用いた。細い斜線の棒グラフが抗ＡＳＭ抗体５μｇ／ｍＬのデータ、太い斜線の棒グラフが抗ＡＳＭ抗体１μｇ／ｍＬのデータ、白色の棒グラフが抗ＡＳＭ抗体０．２μｇ／ｍＬのデータを示す。 図２８（Ａ）および（Ｂ）は、酵素融合抗体ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭおよびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭのマウス脳移行性評価の結果である。縦軸は抗体濃度、横軸は使用した酵素融合抗体を示す。図２８（Ａ）は抗体投与１０日後の血清中の抗体濃度を示す。図２８（Ｂ）は抗体投与１０日後の脳組織中の抗体濃度を示す。
　本発明は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（Ｍｙｅｌｉｎ－ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、以下ＭＯＧと記載）に結合する抗原結合分子に関する。より具体的には、本発明はＭＯＧに結合する抗体または該抗体断片に関するものである。
　本発明のＭＯＧ結合分子としては、ＭＯＧに特異的に結合し当該分子が脳内に滞留する分子であればいずれの分子形態でもよく、タンパク質、核酸、有機合成された低分子化合物／高分子化合物などいずれの分子であってもよい。具体的には組換えタンパク質や抗体、アプタマー、低分子スクリーニングで得られる低分子化合物などいずれのものでもよいが、好ましくは抗体及び該抗体断片が挙げられる。ＭＯＧ結合分子は、ＭＯＧの細胞外領域に結合する分子であることが好ましい。
　ＭＯＧは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質であり、ミエリンを構成している。例えば、ヒトＭＯＧの全長は２１８アミノ酸からなり、中枢神経系においてミエリンの最外層で発現しており、細胞接着及び細胞表面相互作用において役割を果たしている。
　本発明のＭＯＧ結合分子が結合するＭＯＧの動物種は、マウス、ラット、カニクイザルおよび／またはヒトなどが挙げられるが、特にこれらの種に限定されるものではなく、抗体の用途に応じて、適切な動物種を選択することができる。例えば、本発明の抗体をヒトの医薬用途で用いる場合、該抗体は少なくともヒトのＭＯＧに結合する抗体であることが好ましい。
　本発明において、ヒトＭＯＧとしては配列番号７８に記載のアミノ酸配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＢ０８０８８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７８に記載のアミノ酸配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＢ０８０８８のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトＭＯＧの機能を有するポリペプチド、あるいは配列番号７８に記載のアミノ酸配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＢ０８０８８のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつヒトＭＯＧの機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。
　配列番号７８に記載のアミノ酸配列またはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＢ０８０８８で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などを用いて、例えば配列番号７８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
　欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　マウスＭＯＧのアミノ酸配列［配列番号７４、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４９４４］、ラットＭＯＧのアミノ酸配列［配列番号６８、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＡ４１６２８］、およびカニクイザルＭＯＧのアミノ酸配列［配列番号７６、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２７１７８５］についても同様のことがいえる。
　ヒトＭＯＧをコードする遺伝子としては、配列番号７７に記載の塩基配列、およびＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ６４５６４の塩基配列が挙げられる。配列番号７７に記載の塩基配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号　Ｕ６４５６４の塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列から成り、かつＭＯＧの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号７７に記載の塩基配列若しくはＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ６４５６４の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列から成り、かつＭＯＧの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子または配列番号７７に記載の塩基配列、若しくはＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ６４５６４の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡから成り、かつＭＯＧの機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子なども本発明においてＭＯＧをコードする遺伝子に含まれる。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号７７に記載の塩基配列またはＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ６４５６４の塩基配列を含むＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡのことをいう。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターあるいはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドガラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
　ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては配列番号７７に記載の塩基配列、またはＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ６４５６４の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　マウスＭＯＧの塩基酸配列［配列番号７３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１０８１４］、ラットＭＯＧの塩基配列［配列番号６７、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｍ９９４８５］、およびカニクイザルＭＯＧの塩基配列［配列番号７５、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２８４８５６］についても同様のことがいえる。
　ＭＯＧの機能としては、ミエリン上での細胞接着及び細胞表面相互作用等への関与が挙げられる。
　真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も本発明におけるＭＯＧをコードする遺伝子に包含される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Res.,25, 3389 (1997)、Genome Res., 7, 649 (1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL/blastcgihelp.htmL)。
　上記の各種ＭＯＧのアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができる。具体的には、上記の各種ＭＯＧのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、上記と同様の方法により、各種ＭＯＧのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
　さらに、各種ＭＯＧのアミノ酸配列からなるポリペプチド、または各種ＭＯＧのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明において、ヒトＭＯＧの細胞外領域は、配列番号７８またはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＢ０８０８８に記載のアミノ酸配列において、３０番目から１５４番目または２３２番目から２４７番目のアミノ酸配列をいい、３０番目から１５４番目のアミノ酸配列であることが好ましい。
　マウスＭＯＧの細胞外領域は、配列番号７４またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４９４４に記載のアミノ酸配列において、３０番目から１５７番目または２３２番目から２４７番目のアミノ酸配列をいい、３０番目から１５７番目のアミノ酸配列であることが好ましい。ラットＭＯＧの細胞外領域は、配列番号６８またはＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＡ４１６２８に記載のアミノ酸配列において、２８番目から１５５番目または２３０番目から２４５のアミノ酸配列をいい、２８番目から１５５番目のアミノ酸配列であることが好ましい。
　カニクイザルＭＯＧの細胞外領域は、配列番号７６またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２７１７８５に記載のアミノ酸配列において、３０番目から１５４番目または２３２番目から２４７番目のアミノ酸配列をいい、３０番目から１５４番目のアミノ酸配列であることが好ましい。
　本発明の抗体がＭＯＧの細胞外領域に結合することは、ＭＯＧ発現細胞または組換えＭＯＧタンパク質に対する本発明の抗体の結合性を、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよび表面プラズモン共鳴法などを用いて測定することにより確認することができる。また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などを組み合わせて確認することもできる。
　本発明のＭＯＧ結合分子は脳内のＭＯＧに特異的に結合することで脳滞留性を有する分子であり、例えば抗体は、脳内のＭＯＧに結合することにより、脳滞留性を有する抗体である。また、本発明の抗体は、動物の末梢に投与したときに、末梢から脳の血液脳関門を透過して脳内に移行し、脳内のＭＯＧに結合することにより、脳滞留性を有する抗体である。本発明の抗体は、脳滞留性に優れた抗体、または脳滞留性が向上した抗体であることが好ましい。
　本発明において、脳滞留性とは、被験動物に対象物を投与したときに、該対象物が脳内に留まる性質をいう。即ち、脳内への移行の増加、脳内への蓄積の増加、脳内から脳外への移行の低下、脳内から脳外への排出の低下、および脳内分解の低下から選らばれる少なくともいずれか１つによって該対象物の脳内濃度（又は脳内量）が増加すること、または検出可能な程度に一定濃度存在することを意味する。
　本発明において、脳滞留性が優れる、脳滞留性が高い、又は脳滞留性が向上していることとは、対象物を被験動物に投与した際に、コントロールと比べて、投与から同日経過後の該対象物の脳内濃度（又は脳内量）が増加すること、または、当該対象物が脳内で長期間検出可能な程度に一定濃度（量）存在することを意味する。
　これらの現象は、コントロールと比べて、該対象物の脳内への移行の増加、脳内への蓄積の増加、脳内から脳外への移行の低下、脳内から脳外への排出の低下、および脳内分解の低下のうち、少なくともいずれか１つによって生じる。
　本発明において、脳滞留性が優れる、脳滞留性が高い、又は脳滞留性が向上していることとは、例えば、被験動物に該対象物を投与したときに、コントロールと比べて投与後１～１０日、好ましくは投与後２～１０日、３～１０日、より好ましくは４～１０日の該対象物の脳内濃度（量）が高いこと、または当該対象物の脳内濃度（又は脳内量）のピークが投与後４日目以降、好ましくは投与後５日目以降、６日目以降、７日目以降、８日目以降、９日目以降、より好ましくは１０日目以降であることなどが挙げられる。
　脳滞留性に優れた抗体、脳滞留性が高い抗体または脳滞留性が向上した抗体は、コントロール抗体と比べて、脳内での抗体濃度（抗体量）が高い抗体、または脳内に長期間存在し得る特徴を備えた抗体であればいずれの抗体であってもよい。
　例えば、コントロール抗体と比べて、脳内への移行性及び／又は脳内蓄積性が高い特徴、脳内から脳外への移行性、排出性及び／又は脳内分解性が低い特徴、並びに脳内から脳外への移行性、排出性及び／又は脳内分解性に比べて、脳内への移行性及び／又は脳内蓄積性が高い特徴などを備えた抗体が挙げられる。
　したがって、本発明の抗体または該抗体断片としては、抗体または該抗体断片を動物に投与した場合、コントロール抗体と比べて、投与から同日経過後の脳内の抗体濃度（又は抗体量）が高い抗体若しくは該抗体断片、または、脳内に長期間存在することができる抗体若しくは該抗体断片などが挙げられる。
　脳内での抗体濃度（又は抗体量）の変化はいかなるものでもよく、例えば、測定期間中に脳内の抗体濃度が一度ピークに達した後、徐々に抗体濃度が低下する場合、脳内の抗体濃度がピークに達した後、その抗体濃度を維持し続けている場合、または抗体投与後に脳内での抗体濃度が増加し続けている場合などが挙げられる。
　本発明の抗体または該抗体断片としては、例えば、ラットへの投与後４日目若しくは１０日目にコントロール抗体よりも脳内の抗体濃度または抗体量が高い抗体、ラットへの投与後４日目から１０日目の間に、脳内の抗体濃度若しくは抗体量が維持されている、若しくは増加する抗体、またはラットへの投与後１０日目以降にも脳内での存在が明確に確認できる抗体などをいうが、これらに限定されない。
　コントロール抗体としては、被験抗体と同じ種又はサブクラスの抗体であればいずれの抗体でもよいが、例えば、抗アベルメクチン（ＡＶＭ）抗体などを用いることができる。
　本発明において、脳内としては、例えば、脳実質、脳室内、脳脊髄液中などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において、動物に抗体を投与する方法としては、例えば、静脈投与または脳室内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、経鼻投与、脊髄腔内投与などが挙げられるが、これらの方法に限定されない。
　本発明において抗体の脳滞留性を測定する方法としては、例えば、動物に抗体を投与して数日経過後に脳組織を回収し、ホモジナイズして遠心分離後の上清中の抗体濃度を測定し、単位脳重量あたりの抗体量を算出する方法、回収した脳組織を用いて公知の免疫学的手法を用いて抗体の存在を検出する方法、または標識を施した抗体を動物に投与し、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングシステムで経時的に当該抗体の存在を検出する方法などが挙げられる。
　本発明の抗体としては、下記（ａ）～（ｑ）からなる群より選ばれる１の抗体が挙げられる。
（ａ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４、５および６に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６、１７および１８に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２２、２３および２４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｃ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２８、２９および３０に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３４、３５および３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｄ）ＶＨＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４０、４１および４２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
（ｅ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５３、１５４および１５５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５８、１５９および１６０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｆ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６３、１６４および１６５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６８、１６９および１７０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｇ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７３、１７４および１７５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７８、１７９および１８０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｈ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１８３、１８４および１８５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１８８、１８９および１９０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｉ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１９３、１９４および１９５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１９８、１９９および２００に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｊ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２０３、２０４および２０５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２０８、２０９および２１０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｋ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２１３、２１４および２１５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２１８、２１９および２２０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｌ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２２３、２２４および２２５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２２８、２２９および２３０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｍ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３３、２３４および２３５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３８、２３９および２４０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｎ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２４３、２４４および２４５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２４８、２４９および２５０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ）前記（ａ）～（ｎ）に記載の少なくとも１つの抗体と、ＭＯＧへの結合について競合する抗体、
（ｐ）前記（ａ）～（ｎ）に記載のいずれか１つの抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体、および
（ｑ）前記（ａ）～（ｎ）に記載のいずれか１つの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
　本発明の抗体としては、上記（ａ）～（ｎ）に記載されるいずれか１つの抗体のＶＨのＣＤＲ１～３およびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列と、それぞれ８５％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示す抗体のＶＨのＣＤＲ１～３およびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を有する抗体を含む。９０％以上の相同性としてより好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の相同性などが挙げられる。
　本発明において、上記（ａ）～（ｎ）に記載される抗体の一態様としては、それぞれヒト抗ＭＯＧモノクローナル抗体ＭＯＧ０１抗体、ＭＯＧ０９抗体、ＭＯＧ１４抗体およびアルパカ抗ＭＯＧモノクローナルＶＨＨ抗体ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体が挙げられる。他には、ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２のヒト型キメラ抗体、およびｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２のヒト化抗体なども挙げられる。
　本発明において上記（ｏ）の抗体とは、上記（ａ）～（ｎ）に記載の抗体を第１抗体とした時に、該第１抗体とＭＯＧとの結合を阻害する第２抗体をいう。
　本発明において上記（ｐ）の抗体とは、上記（ａ）～（ｎ）に記載の抗体を第１抗体、および第１抗体が結合するエピトープを第１エピトープとした場合、当該第１エピトープを含む、第２エピトープに結合する第２抗体をいう。
　また、本発明の上記（ｑ）の抗体とは、上記（ａ）～（ｎ）に記載の抗体を第１抗体、および第１抗体が結合するエピトープを第１エピトープとした場合に、当該第１エピトープに結合する第２抗体をいう。
　また、本発明の抗体として、具体的には、下記（ａ）～（ｎ）、（ｏ１）～（ｏ２２）からなる群より選ばれる１の抗体も挙げられる。
（ａ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｃ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２７に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｄ）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｅ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１５７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｆ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１６２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｇ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１７２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１７７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｈ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１８２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１８７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｉ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１９２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１９７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｊ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２０７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｋ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２１２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２１７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｌ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２２２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２２７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｍ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２３２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２３７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｎ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２４２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２４７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２５２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２５４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２５６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２５８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ３）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２６０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ４）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２６４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ５）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２６８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ６）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２７２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２７６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２８０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２８２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２８４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２８６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２８８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２９２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２９６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１３）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３００に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３０２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１４）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３０４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３０６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１５）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３０８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１６）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３１２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３１４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３１６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３１８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３２２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ１９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３２６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ２０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｏ２１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３３２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、および
（ｏ２２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３３６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
　本発明の抗体としては、上記（ａ）～（ｎ）、（ｏ１）～（ｏ２２）に記載されるいずれか１つの抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列と、それぞれ８５％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示す抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を有する抗体を含む。９０％以上の相同性としてより好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の相同性などが挙げられる。
　本発明において、上記（ａ）～（ｎ）、（ｏ１）～（ｏ２２）に記載される抗体の一態様としては、それぞれヒト抗ＭＯＧモノクローナル抗体ＭＯＧ０１抗体、ＭＯＧ０９抗体、ＭＯＧ１４抗体およびアルパカ抗ＭＯＧモノクローナルＶＨＨ抗体ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体が挙げられる。他には、ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２ヒト型キメラ抗体、およびｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２ヒト化抗体なども挙げられる。
　本発明においてＥＵインデックスとは、シーケンス・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト第５版（１９９１）に示されるアミノ酸残基の位置をいう。以下に示すアミノ酸残基の位置は、特に記載の無い場合は全てＥＵインデックスに記載されるアミノ酸残基の位置を示す。
　抗体分子はイムノグロブリン（以下、Ｉｇと記載する）とも称され、その基本的な構造は重鎖（Ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）および軽鎖（Ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドをそれぞれ二つずつ有する四量体である。
　また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＨ鎖可変領域（ＶＨとも表記される）、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＬ鎖可変領域（ＶＬとも表記される）、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。
　ＣＨは各サブクラスごとに、α、δ、ε、γおよびμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。
　ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを併せてＦｃ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域または単にＦｃという。ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖が知られている。
　ＣＨがα、δ、ε、γおよびμ鎖である抗体のサブクラスは、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭという。各抗体のサブクラスには動物によってアイソタイプが存在するものがあり、ヒトではＩｇＡにはＩｇＡ１およびＩｇＡ２、ＩｇＧにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアイソタイプが存在する。
　本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＦｃ領域は、ＥＵインデックスにより、Ｎ末端からのアミノ酸残基の番号で特定することができる。
　具体的には、ＣＨ１はＥＵインデックス１１８～２１５番のアミノ酸配列、ヒンジはＥＵインデックス２１６～２３０番のアミノ酸配列、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１～３４０番のアミノ酸配列、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１～４４７番のアミノ酸配列、およびＦｃ領域はＥＵインデックス２３１～４４７番のアミノ酸配列とそれぞれ特定される。
　本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびオリゴクローナル抗体のいずれの抗体をも包含する。ポリクローナル抗体とは、異なるクローンの抗体産生細胞が分泌する抗体分子の集団をいう。モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（一次配列）が均一である抗体をいう。オリゴクローナル抗体とは、複数の異なるモノクローナル抗体を混合した抗体分子の集団をいう。
　本発明におけるモノクロ－ナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体を挙げられる。
　エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、翻訳後修飾されたアミノ酸配列および翻訳後修飾されたアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
　翻訳後修飾されたアミノ酸配列としては、糖鎖がＯＨ置換基を有するＴｙｒおよびＳｅｒに結合したＯ結合型糖鎖、ＮＨ２置換基を有するＧｌｎおよびＡｓｎに結合したＮ結合型糖鎖ならびに硫酸分子がＯＨ置換基を有するＴｙｒに結合し、チロシン硫酸化されたアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明の抗体が結合するＭＯＧのエピトープは、ＭＯＧの一部のドメインを欠失させた欠損体、他のタンパク質由来のドメインと置換させた変異体およびＭＯＧの部分ペプチド断片等を用いて抗体の結合実験を行うことにより決定することができる。また、上記欠損体または変異体の発現細胞を用いて抗体の結合実験を行うこともできる。
　または、本発明の抗体が結合するＭＯＧのエピトープは、タンパク質分解酵素にて消化したＭＯＧのペプチド断片に本発明の抗体を添加し、既知の質量分析法を用いてエピトープマッピングを行うことによっても決定することができる。
　本発明の抗体としては、マウス抗体、ラット抗体、ハムスター抗体、ラビット抗体、ラマ抗体、ラクダ抗体、アルパカ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）移植抗体」ともいう）およびヒト抗体などの遺伝子組換え抗体も含まれる。
　本発明において、キメラ抗体とは、ＶＨおよびＶＬと、ＣＨおよびＣＬとが異なる動物種に由来する抗体をいう。ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体は、ヒト型キメラ抗体、マウス以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬと、マウス抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体は、マウス型キメラ抗体といい、その他のキメラ抗体も同様の方法で命名される。
　非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ラマ、ラクダ、アルパカ等、ハイブリドーマを作製する、または抗体ファージライブラリを作製することが可能な動物であれば、いかなるものも用いることができる。
　ハイブリドーマとは、非ヒト動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウスなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。
　抗体ファージライブラリは免疫グロブリン可変領域の遺伝子をファージにクローニングして、その表面に抗原結合分子を発現させて作製したライブラリをいう。使用されるファージはＭ１３ファージなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。
　ファージに提示される抗原結合分子は、いかなる形態でもよいが、ｓｃＦｖ、ＦａｂやＶＨＨなどの抗体断片であることが好ましい。
　本発明において、抗体ファージライブラリは、免疫ライブラリ、ナイーブライブラリおよび合成ライブラリのうちいずれのライブラリでもよい。
　免疫ライブラリは抗原で免疫された動物や、患者のリンパ球由来の抗体遺伝子をもとに構築された抗体ファージライブラリをいう。ナイーブライブラリは、正常の動物または健常人のリンパ球由来の抗体遺伝子をもとに構築された抗体ファージライブラリをいう。合成ライブラリは、ゲノムＤＮＡにおけるＶ遺伝子や再構築された機能的なＶ遺伝子のＣＤＲを、適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドで置換したライブラリをいう。
　キメラ抗体の作製方法として、以下にヒト型キメラ抗体の作製方法を記載する。その他のキメラ抗体についても同様の方法で作製することができる。
　ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物細胞由来のハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　また、非ヒト動物由来の抗体ファージライブラリよりＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子をクローニングし、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することもできる。
　ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体をいう。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。
　ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、ヒト抗体ファージライブラリおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
　ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保持するマウス（Tomizuka K. et al., Proc Natl Acad Sci U S A.  97, 722-7, 2000.)に所望の抗原を免疫することにより、取得することができる。また、ヒト由来のＢ細胞から抗体遺伝子を増幅したファージディスプレイライブラリを用いて所望の結合活性を有するヒト抗体を選択することにより、免疫を行わずにヒト抗体を取得することができる（Winter G. et al., Annu Rev Immunol.12:433-55. 1994）。
　さらに、ＥＢウイルスを用いてヒトＢ細胞を不死化することにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を生産する細胞を作製し、ヒト抗体を取得することができる（Rosen A. et al., Nature 267, 52-54.1977）。
　ヒト抗体ファージライブラリは、ヒト（健常人または患者）のリンパ球から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ、およびＶＨＨ等の抗体断片を表面に発現させたファージのライブラリである。該ライブラリより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物の染色体内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法により得たヒト抗体産生ハイブリドーマを培養して培養物中にヒト抗体を産生蓄積させ、該培養物から抗体を精製することにより行うことができる。
　本発明の抗体は、重鎖のみで構成される重鎖抗体を包含する。重鎖抗体は、ラマ、ラクダ、アルパカなどのラクダ科の動物から取得される抗体、および当該抗体をもとに作製した遺伝子組換え抗体をいう。
　本発明において抗体断片は、抗体の断片であって、かつ抗原結合活性を有するものをいう。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ　（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、複数のＣＤＲを含むペプチド、およびＶＨＨなどが挙げられる。また、本発明の抗体断片には、該抗体断片に抗体の定常領域又はＦｃの全長又は一部を融合させた抗体断片、定常領域又はＦｃを含む抗体断片など、抗体の部分断片を含みかつＭＯＧ結合活性を有するものであればいずれの抗体断片も含まれる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを４個のＧｌｙおよび１個のＳｅｒ残基からなるリンカー（Ｇ４Ｓ）を任意の個数つなげたリンカーペプチドなどの適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ－Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
　本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
　ＶＨＨは、重鎖抗体の可変領域であり、ｎａｎｏｂｏｄｙともいう。
　本発明の抗体断片は、上述したいずれの抗体断片又は該部分断片を含みかつＭＯＧ結合活性を有する抗体断片であればいずれのものも含む。
　本発明において、一つの抗原結合部位を有する抗体または該抗体断片を一価抗体という。一価抗体のフォーマットとしては、国際公開第２０１４／０５４８０４号、国際公開第２０１１／０９０７５４号、国際公開第２００７／０４８０３７号、および国際公開第２０１２／１１６９２７号などに記載される、抗原結合部位を一つ有する抗体または該抗体断片のフォーマットなどが挙げられる。
　本発明において、３つ以上の異なる抗原またはエピトープに結合する１分子の抗体または該抗体断片をマルチスペシフィック抗体という。また、本発明において、２つの異なる抗原またはエピトープに結合する１分子の抗体または該抗体断片をバイスペシフィック抗体という。
　マルチスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体のフォーマットとしては、国際公開第２００９／１３１２３９号、国際公開第２０１４／０５４８０４号、国際公開第０１／０７７３４２号、米国特許出願公開２００７／００７１６７５号明細書、国際公開２００７／０２４７１５号、Wu et al.,［Nature Biotechnology，2007，25(11)，p.1290-1297］、Labrijn et al., ［PNAS 2013, vol.110, no.13, p5145-5150］、Jong et al., ［http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002344］、Kontermann et al., ［mAbs 2012, vol.4, issue2, p182-197］、Spiess et al., ［Molecular Immunology 67 (2015) 95-106］、   Ridgway et al., ［Protein engineering, 1996 vol.9 no.7 pp617-621、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１０／１５１７９２号および国際公開第２０１４／０３３０７４号などに記載されるフォーマットなどが挙げられる。
　バイスペシフィック抗体として具体的には、以下に記載するバイスペシフィック抗体などが挙げられる。
（１）抗体の二つの重鎖のうち、一方の重鎖（重鎖Ａ）のＣＨ３にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、もう一方の重鎖（重鎖Ｂ）のＣＨ３にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖのアミノ酸改変を加えたバイスペシフィック抗体。
（２）抗体のＣ末端に抗体断片を融合させたバイスペシフィック抗体。
（３）抗体のＮ末端に抗体断片を融合させたバイスペシフィック抗体。
　上記（１）に記載するバイスペシフィック抗体は、重鎖ＡのＶＨを含む抗原結合部位がＭＯＧに結合し、重鎖ＢのＶＨを含む抗原結合部位が脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体でもよいし、その逆でもよい。
　上記（２）に記載するバイスペシフィック抗体は、抗体を構成する二つの重鎖の一方のＣ末端に抗体断片が結合しているバイスペシフィック抗体と、二つの重鎖の両方に抗体断片が結合しているバイスペシフィック抗体、いずれのバイスペシフィック抗体であってもよい。また、抗体の重鎖のＣ末端と抗体断片との間に適当なリンカーが存在していてもよい。
　上記（２）に記載するバイスペシフィック抗体が有する抗体断片は、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＶＨＨなどが好ましいが、特にこれらに限定されない。
　上記（２）に記載するバイスペシフィック抗体は、Ｎ末端の抗原結合部位がＭＯＧに結合し、Ｃ末端の抗原結合部位が脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体でもよいし、その逆でもよい。
　上記（３）に記載するバイスペシフィック抗体は、抗体を構成する二つの重鎖または軽鎖の少なくともいずれか１つのＮ末端に抗体断片が結合しているバイスペシフィック抗体をいう。また、抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ末端と抗体断片との間に適当なリンカーが存在していてもよい。上記（３）に記載するバイスペシフィック抗体が有する抗体断片は、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＶＨＨなどが好ましいが、特にこれらに限定されない。
　また、上記（３）に記載するバイスペシフィック抗体としては、重鎖のＮ末端からＶＨ１－ＣＨ１－ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３という構造を有するバイスペシフィック抗体、および上記重鎖構造を有し、かつＶＨ１とＶＨ２がそれぞれＶＬと抗原結合部位を形成しているバイスペシフィック抗体などが挙げられる。ＶＨ１およびＶＨ２が抗原結合部位を形成するＶＬは、同じアミノ酸配列であってもよいし、異なるアミノ酸配列であってもよい。
　本発明において、マルチスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体は、ＭＯＧに結合するマルチスペシフィック抗体およびバイスペシフィック抗体であればいかなる抗体でもよい。なかでも、ＭＯＧと脳に存在する抗原に結合するマルチスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体が好ましく、ＭＯＧに結合する抗原結合部位と、脳に存在する抗原に結合する抗原結合部位とを含むマルチスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体がより好ましい。
　本発明において、脳に存在する抗原とは、タンパク質、糖鎖、および脂質などが挙げられ、なかでもタンパク質であることが好ましい。
　脳に存在するタンパク質としては、例えば、ＭＯＧ、Ｐｒｉｏｎ、５Ｔ４、ＡＦＰ、ＡＤＡＭ－１０、ＡＤＡＭ－１２、ＡＤＡＭ１７、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＢＳＧ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ、ＣＡ９、ＣＡ７２－４、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＤ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５ＳＣ１、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｅ、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１３７、ＣＤ１４７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６８、ＣＤ２００、ＣＤ２４８、ＣＤ２５４、ＣＤ２５７、ＣＤＨ３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、Ｃｌａｕｄｉｎ３、Ｃｌａｕｄｉｎ４、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＳ－１、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＰＧ－４、ＣＴＬＡ４、ＣＲＦ－１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＤＬＬ４、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＤ－Ｂ、ＥＦＮＡ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＴＢＲ、ＥＮＰＰ３、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＡＰα、ＦＡＳ、ＦｃγＲＩ、ＦＣＥＲ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＯＬＨ１、ＦＯＬＲ１、ＧＤＦ２、ＧＦＲ、ＧＬＰ１Ｒ、ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＰＮＭＢ、ＧＲＰ７８、ＨＢ－ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＨＬＡ－ＤＲβ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ１、ＩｇＥ、ＩｇＥ－Ｆｃ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ９、ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＮＳＲ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ２、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ２、ＫＤＲ、Ｌ１ＣＡＭ、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＳＴ１Ｒ、ＭＳＴＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ５ＡＣ、ｍｙｏｓｔａｔｉｎ、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＧＦ、ＮＯＴＣＨ、ＮＲＧ１、ＮＲＰ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＳＣＡ、ＳＬＡＭ７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＴＡＧ－７２、ＴＣＲ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ、ＴＮＦ、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ７、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＬＡ－４、ＣＧＲＰ、ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＴＤＰ－４３、Ｔａｕ、ＦＵＳ、Ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ（Ａβ）、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ、ＬＩＮＧＯ－１、Ｎｏｇｏ、ｐｏｌｙＱ、ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、ａｔａｘｉｎ　１、ａｔａｘｉｎ　２、ＲＧＭＡ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔａｕ、またはＰｈｏｓｐｈｏ－ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎなどが挙げられるが、これらのタンパク質に限定されるものではない。
　脳に存在する糖鎖としては、例えば、Ｌｅｗｉｓ－ｘ、Ｌｅｗｉｓ－ｙ、またはＣＤ１５などが挙げられるが、これらの糖鎖に限定されるものではない。
　脳に存在する脂質としては、例えば、ＧＤ１ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３またはＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅなどが挙げられるが、これらの脂質に限定されるものではない。
　本発明の抗体または該抗体断片は、翻訳後修飾されたいかなるアミノ酸を含む抗体をも包含する。翻訳後修飾としては、例えば、Ｈ鎖のＣ末端におけるリジン残基の欠失［リジン・クリッピング（ｌｙｓｉｎｅ　ｃｌｉｐｐｉｎｇ）］、およびポリペプチドのＮ末端におけるグルタミン残基のピログルタミン（ｐｕｒｏＧｌｕ）への変換などが挙げられる［Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736(2013)］。
　本発明の抗体または該抗体断片は、Ｆｃ領域のアミノ酸改変を行っていてもよい。Ｆｃ領域のアミノ酸改変としては、例えば、抗体を安定化させるため、または血中半減期を制御するためのアミノ酸改変などが挙げられる。Ｆｃ領域のアミノ酸改変としては、具体的には例えば、国際公開第２００６／０３３３８６号、国際公開第２００６／０７５６６８号、国際公開第２０１１／１２２０１１号、および国際公開第２００９／１２５８２５号などが挙げられる。
　本発明の抗体または該抗体断片は、抗体または該抗体断片が修飾された融合抗体または該融合抗体断片も包含する。抗体を修飾する方法は特に限定されず、所望のアミノ酸残基および糖鎖を修飾できるものであればいずれの方法も用いることができる。
　例えば、化学反応を利用した化学修飾［抗体工学入門、地人書館（１９９４）；Kolb et al., Angew Chem Int Ed Engl. 40. 2004-21, 2001］や、遺伝子組換え技術を利用し、組換えタンパク質発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入して発現させる遺伝子工学的手法での修飾などが挙げられる。
　本発明において、抗体または該抗体断片を修飾する分子としては、例えば、親水性高分子、両親媒性高分子、および機能性分子などが挙げられる。前記親水性高分子、両親媒性高分子としては、例えば、ポリオキシアルキレン、ポリオールまたは多糖を含む分子などが挙げられる。
　ポリオキシアルキレンとしては、例えば、直鎖または分岐鎖からなるポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧと記載する）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンエチレングリコールなどが挙げられる。
　ポリオールまたは多糖を含む分子としては、例えば、直鎖または分岐鎖からなるポリグリセロールからなるアミロース、デキストラン、プルランまたはグリコーゲン等のホモまたはヘテロ多糖類等が挙げられる。
　親水性高分子または両親媒性高分子を含む分子の分子量は特に限定されないが、１００Ｄａ以上であることが好ましく、例えば、１００Ｄａ～１００ｋＤａであることが好ましい。
　機能性分子としては、例えば、抗原結合分子およびその断片、薬物、生理活性ペプチド、生理活性タンパク質、核酸、放射性標識化合物、糖鎖、脂質または蛍光化合物などが挙げられる。抗原結合分子などの機能性分子で修飾された結果、二重特異性を有する分子は、バイスペシフィック抗体である。
　抗原結合分子としては、例えば、抗体、受容体、およびリガンドなどが挙げられる。
　抗原結合分子の断片としては、前記抗原結合分子の断片であって、抗原結合活性を有するものであれば、いかなるものでもよい。
　薬物としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗ウイルス剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン重合阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学、癌と化学療法社（１９９６）］、ハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、またはマレイン酸クロルフェニラミン若しくはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
　抗癌剤としては、例えば、メルタンシン、エムタンシン、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ－ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、メイタンシノイドまたはその誘導体などが挙げられる。
　薬物と抗体または該抗体断片とを結合させる方法としては、上述の方法の他、グルタールアルデヒドを介して薬物と抗体のアミノ基間を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬物のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
　生理活性ペプチドまたは生理活性タンパク質としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）など、ＮＫ細胞、マクロファージ、または好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子、ヒドラーゼ、リアーゼおよびイソメラーゼ等のタンパク質分解酵素、酸性スフィンゴミエリナーゼ等の酵素、リシン、ジフテリアトキシン、またはＯＮＴＡＫなどの細菌毒素および植物毒素等の毒素、細胞膜傷害活性を有する抗菌ペプチド、細胞膜結合性または細胞膜透過性を有するペプチド、およびそれらの誘導体等が挙げられる。
　核酸としては、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡアプタマーなどが挙げられる。
　放射性標識化合物としては、診断用または治療用用途に使用される核種であればよく、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７ＣＯ、１８Ｆ、１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ、６４Ｃｕ、６８Ｇｅ、１６６Ｈｏ、１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ、１４０Ｌａ、１７７Ｌｕ、５４Ｍｎ、９９Ｍｏ、１０３Ｐｄ、１４２Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、１５３Ｓｍ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ、８５Ｓｒ、９９Ｔｃ、２０１Ｔｉ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、１３３Ｘｅ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、９０Ｙおよび６５Ｚｎ等、または上述の核種を含む化合物が挙げられる。
　放射性標識化合物は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性標識化合物をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、ＤＯＴＡ、ＰＡ－ＤＯＴＡ、ＴＲＩＴＡおよびＤＴＰＡ等が挙げられ、キレート剤によって修飾された抗体、キレート剤を介して放射性標識化合物が標識された修飾化抗体も本発明の抗体に含まれる。
　糖鎖としては、例えば、フコース、マンノース、グルコース、アロース、アルトース、ギュロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、エリトース、エリトロース、トレオース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、リポアラビノマンナン、ルイスＸ型三糖およびシアリルルイスＸ型四糖等を含む、単糖、二糖類またはオリゴ糖等が挙げられる。また、イムノアジュバントとして知られる糖鎖を含む天然物でもよく、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、またはαガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。
　脂質としては、例えば、脂肪酸と各種アルコールとのエステルおよびその類似体である単純脂質（中性脂質）が挙げられる。例えば、油脂（例えば、トリアシルグリセロール）、ろう（例えば、高級アルコールの脂肪酸エステル）、ステロールエステル、コレステロールエステル、ビタミンの脂肪酸エステル等、脂肪酸とアルコールのほかにリン酸、糖、硫酸、アミンなど極性基をもつ複合脂質、例えば、リン脂質（例えば、グリセロリン脂質およびスフィンゴリン脂質等）および糖脂質（例えば、グリセロ糖脂質およびスフィンゴ糖脂質等）、単純脂質および複合脂質の加水分解によって生成する化合物のうち脂溶性のものをさす誘導脂質、例えば、脂肪酸、高級アルコール、脂溶性ビタミン、ステロイド、炭化水素等が挙げられる。
　蛍光化合物としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などのフルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、アレクサフルオロ系列およびＮＢＤ系列等の蛍光色素、アクリジニウムエステル、またはロフィンなどの発光物質ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性タンパク質等が挙げられる。
　本発明の抗体または該抗体断片は、上述の親水性高分子または両親媒性高分子、および機能性分子は直接または適当なリンカーを介して結合させることができる。リンカーとしては、例えば、エステル、ジスルフィド、ヒドラゾンおよびジペプチド等が挙げられる。
　本発明の抗体または該抗体断片を遺伝子工学的な手法によって修飾し、融合抗体または融合抗体断片を作製する場合には、抗体をコードするｃＤＮＡにタンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体または融合抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して融合抗体または融合抗体断片を発現させることにより、融合抗体または融合抗体断片を作製することができる。
　本発明の組成物は、本発明の抗体または該抗体断片を含有する組成物であればいかなるものでもよい。かかる組成物は、抗体または該抗体断片の他に、適当なキャリア、安定化剤などの添加剤を含んでいてもよい。
　本発明の組成物としては、例えば、本発明の抗体または該抗体断片を含む検出用または測定用の組成物などが挙げられる。本発明の組成物としては、例えば、本発明の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬組成物（治療剤）などが挙げられ、薬理学的に許容しうる担体とともに所望の剤型に製剤化される。
　本発明において、検出用または測定用の組成物とは、本発明の抗体または該抗体断片を含んでおり、本発明の抗体または該抗体断片が特異的に結合する抗原を検出または測定できるものであればいかなる組成物でもよい。本発明の抗体または該抗体断片が特異的に結合する抗原としては、ＭＯＧまたは、ＭＯＧおよび脳に存在する抗原などが挙げられる。
　本発明の抗体または該抗体断片は動物に投与すると脳内のＭＯＧに結合し、脳に滞留する性質を有する。したがって、当該抗体または該抗体断片を含む検出用または測定用の組成物を用いることにより、当該抗体の脳内における維持、または脳内における抗体濃度の向上が可能となり、長期間にわたってＭＯＧ、またはＭＯＧおよび脳に存在する抗原を検出または測定すること、および／またはＭＯＧまたは、ＭＯＧおよび脳に存在する抗原を高感度に検出または測定することもできる。
　例えば、検出用または測定用の組成物がＭＯＧと脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体を含む組成物であるときには、当該バイスペシフィック抗体が結合するＭＯＧおよび脳に存在する抗原を長期間検出または測定すること、並びに／またはＭＯＧおよび脳に存在する抗原を高感度に検出または測定することができる。
　また、例えば、検出用または測定用の組成物が、放射性標識化合物または蛍光色素で標識されたＭＯＧに結合する融合抗体または融合抗体断片を含む組成物であるときには、ＭＯＧを長期間検出または測定すること、および／またはＭＯＧを高感度に検出または測定することができる。
　本発明の抗体を含有する医薬組成物（治療剤）は、本発明の抗体または該抗体断片が特異的に結合する抗原が発現している疾患であればいずれの疾患の治療剤でもよいが、脳疾患の治療剤が好ましい。
　脳疾患としては、例えば、アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳変性症、脳血管障害、てんかん、片頭痛、多動性障害、クロイツフェルトヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、ライソゾーム病、うつ病、およびジストニアなどが挙げられる。
　本発明の抗体は、動物に投与すると脳内のＭＯＧに結合し、脳に滞留する性質を有する。したがって、当該抗体または該抗体断片を含有する治療剤を用いることで、脳内における該抗体または該抗体断片の長期間にわたる維持、脳内における抗体濃度の向上が可能となり、上記の疾患に対して治療効果を示すことができる。
　例えば、治療剤がＭＯＧと脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体を含む治療剤であるときには、当該バイスペシフィック抗体が結合する、脳に存在する抗原に関連する脳疾患に対して治療効果を示すことができる。
　また、例えば、治療剤が低分子薬剤で修飾されたＭＯＧに結合する融合抗体または融合抗体断片であるときには、当該低分子薬剤が標的とする脳疾患に対して治療効果を示すことができる。このとき、該低分子薬剤を単体で用いるときよりも、本発明の治療剤を用いたときのほうが、治療効果が高いことが好ましい。
　本発明の抗体または該抗体断片を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体または該抗体断片のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、皮内、筋肉内、脳室内、脊髄腔内、鼻腔内、腹腔内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、特に好ましくは静脈内または脳室内投与などが挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、またはテープ剤などが挙げられる。
　投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇである。
　また、本発明は、本発明の抗体または該抗体断片を用いて抗体を脳内に滞留させる方法、抗体の脳滞留性を向上させる方法、および脳内の抗体濃度（又は抗体量）を高める方法をも包含する。
　また、本発明は、ＭＯＧに結合するペプチド、該ペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、該核酸を含むベクターを含む形質転換細胞、該形質転換細胞を培養し、培養液から前記ペプチドを採取することを含む、前記ペプチドの製造方法、前記ペプチドを含む組成物、または前記ペプチドまたは前記組成物を用いて、脳に存在する抗原を検出または測定する方法、脳疾患を診断若しくは治療する方法、ペプチドの脳滞留性を向上させる方法、または脳内のペプチド量を増加させる方法に関する。
　本発明のペプチドは、ペプチドが修飾された融合ペプチドを含む。
　ＭＯＧに結合するペプチドに関する各種用語の定義等は、特に記載がない限り、上述したＭＯＧに結合する抗体について記載した用語の定義等と同じものを用いる。
　以下に、本発明の抗体または該抗体断片の製造方法、疾患の治療方法、および疾患の診断方法などについて、具体的に説明する。
１．抗体の製造方法
（１）抗原の調製
　抗原となるＭＯＧまたはＭＯＧ発現細胞は、ＭＯＧ全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞または動物細胞などに導入することで得ることができる。また、ＭＯＧは、ＭＯＧを多量に発現している各種動物細胞株、動物細胞および動物組織などからＭＯＧを精製することによっても得ることができる。
　また、これら動物細胞株、動物細胞および動物組織などをそのまま抗原として使用することもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＭＯＧの部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
　ＭＯＧまたはＭＯＧの部分配列を有する合成ペプチドには、Ｃ末端またはＮ末端にＦＬＡＧまたはＨｉｓなどの公知のタグが付加されていてもよい。
　本発明で用いられるＭＯＧは、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)やCurrent Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載された方法などを用い、例えば、以下の方法により、ＭＯＧをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
　まず、ＭＯＧをコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ヒトＭＯＧをコードする部分を含むＤＮＡ、および転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該発現ベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　該発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、ＭＯＧをコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＭＯＧの生産率を向上させることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３―２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)］、pLSA1［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４，６８６，１９１号明細書、米国特許第４，９３９，０９４号明細書、米国特許第１６０，７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）またはｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターまたはＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターまたはｌｅｔ　Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなどが挙げられる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９または大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)、Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)］が挙げられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature, 329, 840 (1987)］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社製）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）およびトランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターまたはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900)］；ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)］、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫまたはＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などが挙げられる。
　以上のようにして得られるＭＯＧをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを保有する微生物または動物細胞などの由来の形質転換体を培地中で培養し、培養液中に該ＭＯＧを生成蓄積させ、該培養液から採取することにより、ＭＯＧを製造することができる。該形質転換体を培地中で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＭＯＧを得ることができる。
　誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science, 122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology, 8, 396 (1959)］、１９９培地［Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)］若しくはＩｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中に必要に応じて、カナマイシンまたはペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
　ＭＯＧをコードする遺伝子の発現方法としては、例えば、直接発現以外に、分泌生産または融合タンパク質発現などの方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］が挙げられる。
　ＭＯＧの生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法が挙げられ、使用する宿主細胞または生産させるＭＯＧの構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　ＭＯＧが宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＭＯＧを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してＭＯＧの生産量を上昇させることもできる。
　得られたＭＯＧは、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。ＭＯＧが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザーまたはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
　ＭＯＧが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＭＯＧの不溶体を回収する。回収した該ＭＯＧの不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ＭＯＧを正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　ＭＯＧまたはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＭＯＧまたはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　また、本発明において用いられるＭＯＧは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
　３～２０週令のマウス、ラット、ラビットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また被免疫動物としてラマ、アルパカ、ラクダなどの動物を用いることもできる。
　免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
　マウスやラットに免疫する際、抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
　その他の被免疫動物についても同様の方法で免疫を行い、抗体産生細胞を取得することができる。免疫間隔や最後の免疫から組織の摘出までの期間は、被免疫動物の動物種に合わせて適切な条件を選択することができる。
（３）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J. Immunology, 6, 511 (1976)］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Nature, 276, 269 (1978)］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548 (1979)］またはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495 (1975)］などが用いられる。
　該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、および８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
　沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。
　遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、ＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７～１４日間培養する。
　培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＭＯＧに反応し、ＭＯＧではない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを行い、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
（５）精製モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。
　このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。
　得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ－カラムまたはプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。タンパク質量の定量は、ローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）抗体の選択
　抗体の選択は以下に示すように、フローサイトメトリーを用いて、ＭＯＧ発現細胞への抗体の結合性を測定することなどにより行う。ＭＯＧ発現細胞は、細胞表面上にＭＯＧが発現していればいずれの細胞でもよく、例えば、動物細胞、動物細胞株および（１）で得られるＭＯＧ強制発現細胞株などが挙げられる。
　ＭＯＧ発現細胞を９６ウェルプレートなどのプレートに分注した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清または精製抗体などの被験物質を分注し、反応させる。反応後の細胞を１～１０％ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと記す）などで、よく洗浄した後、第２抗体として蛍光試薬などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＢＳＡ－ＰＢＳなどでよく洗浄した後、フローサイトメーターを用いて標識化抗体の蛍光量を測定することにより、ＭＯＧ発現細胞に対して特異的に反応する抗体を選択する。
　また、抗体の選択は、以下に記載するＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴を用いて、モノクローナル抗体のＭＯＧ発現細胞またはＭＯＧタンパク質などへの結合性を測定することにより行うこともできる。ＭＯＧタンパク質は、ＭＯＧの一部のドメインからなるタンパク質であっても、ＧＳＴなどのタグが付加しているタンパク質であってもよい。
　ＥＬＩＳＡは、ＭＯＧ発現細胞またはＭＯＧタンパク質を９６ウェルプレートなどのプレートに分注した後、ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングし、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清または精製抗体などの被験物質を分注し、反応させる。次に、ＰＢＳなどでよく洗浄した後、第２抗体として蛍光試薬などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。
　その後ＰＢＳなどでよく洗浄した後、発色試薬を添加する。最後に反応停止液で発色反応を止めて、マイクロプレートリーダーで各ウェルにおける吸光度を測定することにより、ＭＯＧ発現細胞またはＭＯＧタンパク質に対して特異的に反応する抗体を選択する。
　表面プラズモン共鳴は、公知のプロトコールを用いて、適切なセンサーチップに抗体を固相化し、ＭＯＧタンパク質をアナライトとすることでＭＯＧに結合する抗体のアフィニティーを測定することができる。
　得られた抗体のアフィニティーより、ＭＯＧタンパク質に対して所望のアフィニティーを有する抗体を選択することができる。また、センサーチップにＭＯＧタンパク質を固相化し、抗体をアナライトとして、ＭＯＧに結合する抗体のアフィニティーを測定することもできる。
　また、本発明の抗体と競合してＭＯＧに結合する抗体は、上述のフローサイトメトリーやＥＬＩＳＡを用いた測定系に、被験抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被験抗体を加えた時に本発明の抗体とＭＯＧとの結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＭＯＧのアミノ酸配列、またはその立体構造への結合について、本発明の抗体と競合する抗体を取得することができる。　
　また、本発明の抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体は、上述のスクリーニング方法で取得された抗体のエピトープを公知の方法で同定し、同定したエピトープを含む合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで取得することができる。
　更に、本発明の抗体が結合するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のスクリーニング方法で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの部分的な合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
（７）ファージディスプレイ法による抗体の取得
（７－１）抗体ファージライブラリの作製方法
　本発明において、抗体ファージライブラリは免疫ライブラリ、ナイーブライブラリおよび合成ライブラリを用いることができる。各ライブラリの作製方法を以下に記載する。
　免疫ライブラリは、上記（１）と同様の方法で免疫した動物、または患者由来のリンパ球を、ナイーブライブラリは正常な動物または健常人由来のリンパ球を採取し、ＲＮＡを抽出して逆転写反応反応によりｃＤＮＡを合成する。
　このｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲで増幅した抗体遺伝子断片をファージミドベクターに挿入し、該ファージミドベクターで大腸菌を形質転換する。得られた形質転換体にヘルパーファージを感染させると、抗体遺伝子がライブラリ化された抗体ファージライブラリを得ることができる。
　また、合成ライブラリはゲノムＤＮＡにおけるＶ遺伝子や再構築された機能的なＶ遺伝子のＣＤＲを、適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドで置換し、当該Ｖ遺伝子を挿入したファージミドベクターで大腸菌を形質転換する。得られた形質転換体にヘルパーファージを感染させると、抗体ファージライブラリを得ることができる。
　リンパ球由来のｃＤＮＡ、抗体ファージライブラリは市販のものを用いることもできる。
　ファージミドベクターはｐＣＡＮＴＡＢ　５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＵＣ１１８／ｐＵＣ１１９ベクター（ＴａＫａＲａ社）、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｐｈａｇｅｍｉｄ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびｐＫＳＴＶ－０２（Miyazaki et al, J. Biochem. 2015;1）などを用いることができる。
　ヘルパーファージはＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＶＣＳＭ１３　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｐｈａｇｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｒ４０８　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｐｈａｇｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などを用いることができる。
　ファージディスプレイには、ファージベクターも用いることができる。繊維状ファージのｇ３ｐを提示分子とするペプチドファージライブラリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製など）およびｇ７ｐ、ｇ８ｐ、ｇ９ｐを提示分子とする方法などがある。
　また、Ｔ７ファージを用いたファージディスプレイ用をいることもできる。Ｔ７ファージへのディスプレイシステムにはＴ７Ｓｅｌｅｃｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などがある。
（７－２）抗体ファージクローンの選択
　（７－１）で作製した抗体ファージライブラリからの抗体ファージクローンの選択は、以下に示すＥＬＩＳＡ法を用いて行うことができる。
　イムノチューブにＭＯＧを固相化し、ブロッキングバッファーでチューブをブロッキングする。チューブの各ウェルに上記（７－１）で作製した抗体ファージライブラリを加えて反応させる。次に、ウェルを洗浄し、蛍光標識された抗ファージ抗体を加えて反応させた後、再びウェルを洗浄して発色液を添加する。その後反応停止液で発色反応を止めて、マイクロプレートリーダーで各ウェルにおける吸光度を測定する。これにより、ＭＯＧに結合する抗体ファージクローンを選択する。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製方法を示す。遺伝子組換えのマウス抗体、ラット抗体、ラビット抗体、ハムスター抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、アルパカ抗体、およびヒト抗体、各種キメラ抗体、ならびに重鎖抗体なども同様の方法で作製することができる。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
　動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol., 3, 133 (1990)］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223 (1984)］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Cytotechnol., 4, 173 (1990)］またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Cytotechnol., 13, 79 (1993)］などを用いる。
　動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)］または免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Cell, 41, 479 (1985)］とエンハンサー［Cell, 33, 717 (1983)］などが挙げられる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［J．Immunol． Methods， 167， 271（1994）］を用いるが、抗体H鎖およびL鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559 (1998)］などを用いる。
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
（２－１）ハイブリドーマ法で抗体を取得した場合
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリを作製する。
　前記ライブラリより、非ヒト抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ若しくはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とする非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ラマ、ラクダ、またはアルパカなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
　ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)］、またはＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］、またはＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
　ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリの作製には、公知の方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)］、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）若しくはＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（登録商標）Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ［Strategies, 5, 58 (1992)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49 (1985)］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐＣＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)］またはｐＵＣ１８［Gene, 33, 103 (1985)］などを用いる。
　ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’［Strategies, 5, 81 (1992)］、Ｃ６００［Genetics, 39, 440 (1954)］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Science, 222, 778 (1983)］、NM522［J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)］、Ｋ８０２［J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)］またはＪＭ１０５［Gene, 38, 275 (1985)］などを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ若しくは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］などを用いる。
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)］を行うことよりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)］などの反応を行った後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）またはＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
（２－２）ファージディスプレイ法により抗体を取得した場合
　選択したファージクローンのプラスミドベクターから、ベクター部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定することができる。
　ハイブリドーマ法またはファージディスプレイ法のいずれの手法においても、決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
　分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。
　また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することによって見出すことができる。
　また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴまたはＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］などの相同性検索を行い、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。
　作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
　また、非ヒト抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
　ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するための、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
　例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
　次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＶＨ、ＶＬ各々について各６本の合成ＤＮＡを設計する。
　さらに、両端に位置する合成ＤＮＡの５’または３’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
　ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
　または、設計したＤＮＡ配列に基づき、ＶＨ全長およびＶＬ全長を各々１本の長鎖ＤＮＡとして合成したものを、上記ＰＣＲ増幅産物に代えて用いることもできる。さらに、合成長鎖ＤＮＡの両端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)］。
　ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)］またはコンピューターモデリング［Protein Engineering, 7, 1501 (1994）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有するヒト化抗体を取得できる。
　ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、（４）および（５）で得られるヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’または３’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　（３）および（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
　発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えば、ＣＯＳ－７細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１］を用いる［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)］。
　ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press (1991)］、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などを用いる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などを用いて測定する。
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）および（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Cytotechnology, 3, 133 (1990)］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Life Technologies、Cat#11619）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２、またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)］などを用いる。
　また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などのタンパク質、Ｎ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などのタンパク質若しくは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与するタンパク質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、例えば、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)］などを用いることもできる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）若しくはＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。
　得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株の産生する遺伝子組換え抗体の発現量を向上させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などのタンパク質の精製で用いられる方法を組み合わせることもできる。
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature, 227, 680 (1970)］、またはウェスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)］など用いて測定することができる。
（９）抗体断片の作製方法
　本発明の抗体断片は、公知の方法に従い作製することができる。本発明の抗体断片は、上記（１）～（８）にて記載した方法に従い作製した抗体を、酵素などで切断することにより作製してもよいし、所望の抗体断片をコードする塩基配列を調製し、遺伝子工学的な手法で作製してもよい。
（１０）一価抗体の作製方法
　本発明において、一価抗体は、国際公開第２０１４／０５４８０４号、国際公開第２０１１／０９０７５４号、国際公開第２００７／０４８０３７号、および国際公開第２０１２／１１６９２７号などに記載する方法などで作製することができる。
（１１）バイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体の製造方法
　本発明のバイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体は、上述した抗体の製造方法に準じて作製することができる。例えば、国際公開第２００９／１３１２３９号、国際公開第２０１４／０５４８０４号、国際公開第０１／０７７３４２号、米国特許出願公開第２００７／００７１６７５号明細書、国際公開第２００７／０２４７１５、Wu et al.,[Nature Biotechnology，2007，25(11)，p.1290-1297］、Labrijn et al.,［PNAS 2013, vol.110, no.13, p5145-5150］、Jong et al., ［http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002344］、Kontermann et al., ［mAbs 2012, vol.4, issue2, p182-197］、Spiess et al., ［Molecular Immunology 67 (2015) 95-106］、Ridgway et al., ［Protein engineering, 1996 vol.9 no.7 pp617-621、国際公開第２００９／０８０２５１、国際公開第２０１０／１５１７９２および国際公開第２０１４／０３３０７４などに記載される方法を用いて作製することができる。
　例えば脳に存在する抗原に結合するＩｇＧ抗体のＣ末端に、ＭＯＧに結合するｓｃＦｖを融合させたバイスペシフィック抗体の発現ベクターは、以下に記載する方法で作製することができ、上述した抗体の発現方法および抗体の精製方法に準じて当該バイスペシフィック抗体を作製することができる。また、その他には、抗体のＣ末端に抗体断片を融合させたバイスペシフィック抗体も同様の方法で作製することができる。
　脳に存在する抗原に結合するＩｇＧ抗体の重鎖定常領域の合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ法によりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片を増幅する。次に、ＭＯＧに結合する抗体の塩基配列を鋳型として、当該抗体のＶＨおよびＶＬ適切なリンカーで結合させたｓｃＦｖ領域の塩基配列を、ＰＣＲ法などを用いて調製する。上記二つの領域をＰＣＲ法などで結合させ、得られた遺伝子断片をｐＣＩベクターなどの適切なベクターに挿入する。
　また、脳に存在する抗原に結合するＩｇＧ抗体の軽鎖領域（ＶＬおよびＣＬ）の遺伝子断片、および当該抗体のＶＨの遺伝子断片を、それぞれ適切な鋳型を用いたＰＣＲ法により増幅し、上記ベクターの適切な位置に挿入する。
　また、本発明のバイスペシフィック抗体は、化学的手法により、ＩｇＧ抗体に抗体断片を含む抗原結合部位を結合させて作製することもできる。
３．抗体または該抗体断片の活性評価
　本発明において、抗体または該抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
（１）ＭＯＧに対する結合活性
　本発明の抗体または該抗体断片のＭＯＧに対する結合活性は、前述の１－（６）に記載のフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、および表面プラズモン共鳴検出などを用いて測定する。また、蛍光抗体法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)］を用いて測定することもできる。
　本発明の抗体または該抗体断片がＭＯＧに結合する一価抗体である場合にも、同様の方法で当該一価抗体のＭＯＧへの結合活性を測定することができる。本発明の抗体または該抗体断片がＭＯＧと脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体である場合にも、同様の方法で当該バイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体のＭＯＧまたは脳に存在する抗原への結合活性を測定することができる。
（２）脳滞留性の測定方法
　本発明の抗体または該抗体断片の脳滞留性は以下に記載する方法で測定することができる。
　動物に抗体または該抗体断片を投与して数日経過後に脳組織を回収し、ホモジナイズして遠心分離後の上清中の抗体または該抗体断片の濃度を測定し、単位脳重量あたりの抗体または該抗体断片の量を算出する方法、または回収した脳組織を用いて公知の免疫学的手法により抗体または該抗体断片の存在を検出する方法などが挙げられる。また、薬理学的に許容される標識を施した抗体または該抗体断片を動物に投与し、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングシステムで経時的に当該抗体または該抗体断片の存在を検出する方法などが挙げられる。
　用いる動物は、本発明の抗体または該抗体断片の用途に応じた適切な動物を選択することができる。
（３）ＡＤＣＣ、ＣＤＣの測定方法
　ヒトＭＯＧ発現細胞またはＭＯＧと脳に存在する抗原が発現している細胞に対する本発明の抗体または該抗体断片のＣＤＣ、またはＡＤＣＣは公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993); Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons,Inc.,(1993)］により測定することができる。
４．抗体また抗体断片のエフェクター活性を制御する方法
　本発明の抗体または該抗体断片のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体またはＦｃを含む該抗体断片のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、または抗体若しくは該抗体断片のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明の抗体または該抗体断片にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。　
　エフェクター活性とは、抗体または該抗体断片のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＰ）などが知られている。　
　エフェクター活性の測定法として、例えば、標的細胞、エフェクターとしてヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、そして標的細胞特異的な抗体または該抗体断片を混合し、４時間程度インキュベーションした後、細胞傷害の指標として遊離してきた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することができる。他には、遊離５１Ｃｒ法またはフローサイトメトリー法などによってエフェクター活性を測定することもできる。
　抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体またはＦｃを含む抗体断片のエフェクター活性を増加または低下させることができる。抗体または該抗体断片のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体または該抗体断片を発現することで、フコースが結合していない抗体または該抗体断片を取得することができる。フコースが結合していない抗体または該抗体断片は高いＡＤＣＣを有する。　
　一方、抗体または該抗体断片のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体または該抗体断片を発現させることで、フコースが結合している抗体または該抗体断片を取得できる。フコースが結合している抗体または該抗体断片は、フコースが結合していない抗体または該抗体断片よりも低いＡＤＣＣを有する。　
　また、抗体または該抗体断片のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣまたはＣＤＣを増加または低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体または該抗体断片のＣＤＣを増加させることができる。　
　また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書または米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを、増加させることも低下させることもできる。
　また本発明の抗体または該抗体断片には、上述の抗体または該抗体断片が含む定常領域におけるアミノ酸改変または糖鎖改変に合わせて、例えば、日本国特開第２０１３－１６５７１６号公報または日本国特開第２０１２－０２１００４号公報などに記載のアミノ酸改変を行うことにより、Ｆｃ受容体への反応性を制御することで血中半減期を制御した抗体または該抗体断片も含まれる。
　さらに、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体または該抗体断片に使用することにより、エフェクター活性や血中半減期が制御された抗体または該抗体断片を取得することができる。
５．本発明の抗体または該抗体断片を用いた疾患の治療方法
　本発明の抗体または該抗体断片は、脳内にＭＯＧが発現している動物の脳疾患の治療に用いることができる。
　脳疾患としては、例えば、アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳変性症、脳血管障害、てんかん、片頭痛、多動性障害、クロイツフェルトヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、ライソゾーム病、うつ病、ジストニアなどが挙げられる。
　本発明の抗体または該抗体断片が治療できる脳疾患は、本発明の抗体または該抗体断片が結合する抗原、および本発明の融合抗体または融合抗体断片にて抗体または該抗体断片を修飾する分子の種類などによって異なる。
　本発明の抗体または該抗体断片を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体または該抗体断片のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
　投与経路としては、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、脳室内、腹腔内投与、皮内投与、経鼻投与、脊髄腔内投与若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。
　経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などが挙げられる。
　乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤またはストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
　カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
　非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤または噴霧剤などである。注射剤は、塩溶液若しくはブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造する。
　噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明の抗体または該抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖またはグリセリンなどを用いる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
６．本発明の抗体または該抗体断片を用いた脳に存在する抗原の検出若しくは測定方法、または疾患の診断方法
　本発明の抗体または該抗体断片を用いて、ＭＯＧ、またはＭＯＧと脳に存在する抗原とを検出または測定することができる。また、ＭＯＧ、またはＭＯＧと脳に存在する抗原とを検出または測定することにより、脳内にＭＯＧが発現している動物の脳疾患を診断することができる。
　脳疾患としては、例えば、アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳変性症、脳血管障害、てんかん、片頭痛、多動性障害、クロイツフェルトヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、ライソゾーム病、うつ病、ジストニアなどが挙げられるが、本発明の抗体または該抗体断片が診断できる脳疾患は、本発明の抗体または該抗体断片が結合する抗原、および本発明の融合抗体または融合抗体断片にて抗体または該抗体断片を修飾する分子の種類などによって異なる。
　脳内にＭＯＧが発現している動物の脳疾患の診断は、例えば、患者または患者動物の脳内に存在するＭＯＧを免疫学的手法により検出または測定して行うことができる。また、患者または患者動物の脳内の細胞に発現または存在しているＭＯＧをフローサイトメトリーなどの免疫学的手法を用いて検出することにより診断を行うことができる。
　本発明の抗体または該抗体断片として、ＭＯＧに結合する一価抗体を用いるときには、上記と同様の方法で脳内のＭＯＧを測定することができる。本発明の抗体または該抗体断片としてＭＯＧと脳に存在する抗原に結合するバイスペシフィック抗体またはマルチスペシフィック抗体を用いるときには、上記と同様の方法で脳内のＭＯＧまたは脳に存在する抗原を検出または測定することができる。
　免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体などを用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法または物理化学的手法などを用いる。
　放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または該抗体断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
　酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに酵素などで標識を施した抗イムノグロブリン抗体または該抗体断片を反応させた後、基質を添加して反応液の吸光度を吸光光度計で測定する。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。
　例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識またはビオチン標識などを用いる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。
　前記ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素またはビオチンなどで標識しておく。
　上記の第１の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水または眼液などを反応させた後、第２の抗体を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作成した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよい。また、抗体の代わりにＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）２などの抗体断片を用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または該抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片との組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法は、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック (1987)］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（1983）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどを用いる。
　発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光　臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステルまたはロフィンなどを用いる。
　ウエスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル）［Antibodies - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または該抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
　ＭＯＧのアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１～１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
　ここで本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。
　Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いて本発明の抗体または該抗体断片が結合したバンドを検出することにより、ＭＯＧのアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。
　ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体または該抗体断片としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体または該抗体断片が用いられる。
　物理化学的手法は、例えば、抗原であるＭＯＧと本発明の抗体または該抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などを用いることもできる。
　ラテックス免疫比濁法は、抗体または抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
　ＭＯＧが発現している細胞の検出または測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、中でも、免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いることが好ましい。
　免疫沈降法は、ＭＯＧを発現した細胞などを本発明の抗体または該抗体断片と反応させた後、プロテインＧ－セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。または以下のような方法によっても行うことができる。
　ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明の抗体または該抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ－ＰＢＳによりブロッキングする。抗体が、例えば、ハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン－Ａまたはプロテイン－ＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。
　次に、ＢＳＡ－ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ヒトＭＯＧを発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
　免疫細胞染色法または免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明の抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。
　また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ－サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック (1987)］により検出を行うことができる。特に、本発明の抗体または該抗体断片は、蛍光抗体染色法により天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出ができる。
　また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］抗ＭＯＧ抗体の取得
（１）ヒト抗体ファージライブラリでの抗体の取得
　ヒトＰＢＭＣ由来のｃＤＮＡから、ＰＣＲにてＶＨ遺伝子断片、ＶＬ遺伝子断片を増幅させた。ＶＨ遺伝子断片とＶＬ遺伝子断片をファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ　５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にそれぞれ挿入し、大腸菌ＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）を形質転換してプラスミドを得た。
　得られたプラスミドをＭ１３ＫＯ７　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｐｈａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に感染させることで、ＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子がライブラリ化されたヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリを得た。
　このヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリを用いて、下記のファージディスプレイ法を用いて、抗ラットＭＯＧ（ｒＭＯＧ）モノクローナル抗体を取得した。ＭＡＸＩＳＯＲＰ　ＳＴＡＲＴＵＢＥ（ＮＵＮＣ社製）に、後述する実施例４のｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃを固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ　Ｂｌｏｃｋｉｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いてｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃが結合していない部位をブロックした。
　該チューブにヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリを室温下で１時間反応させ、ＰＢＳまたは０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳ－Ｔと記載する）で洗浄後に０．１ＭのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）でファージを溶出した。溶出液はＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を加えて中和した。溶出したファージは、ＴＧ１コンピテントセルに感染させ、ファージを増幅した。
　その後、再度ＭＡＸＩＳＯＲＰ　ＳＴＡＲＴＵＢＥに固相化したｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃと反応させて、洗浄および溶出を実施した。この操作を繰り返し、ｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃに特異的に結合するｓｃＦｖを提示したファージを濃縮した。濃縮されたファージを単クローン化し、ＥＬＩＳＡにてｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃへの結合性を有する３つのクローンを選択した。
　ＥＬＩＳＡには、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＮＵＮＣ社製）にｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃを固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ　Ｂｌｏｃｋｉｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いてｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃが結合していない部位をブロックした。ネガティブコントロールとして、ＦＬＡＧ＿Ｆｃを固相化したプレートも用意した。
　各ウェルに各々のファージクローンを加え、室温下で３０分間反応させた後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗Ｍ１３抗体（ＧＥヘルスケア社製）を１０％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有ＰＢＳ－Ｔで希釈した溶液を、各ウェルに加え、室温下３０分間インキュベートした。
　マイクロプレートを、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、ＴＭＢ発色基質液（ＤＡＫＯ社製）を加え、室温下でインキュベートした。各ウェルに０．５Ｍ硫酸を加えて発色反応を止め、波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）で測定した。得られた結果を図１に示す。
　図１に示すように、３種のファージクローンは、いずれもｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ　Ｆｃに結合することが確認できた。一方、いずれのファージクローンもＦＬＡＧ　Ｆｃには結合しなかった（データ非表示）。
　ｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃに結合したクローンについて配列解析を行い、抗ＭＯＧ抗体ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ０１、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ０９およびｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ１４を取得した。
　以降の文章において、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ０１、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ０９およびｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ１４を用いて発現させたファージが提示する抗ＭＯＧ　ｓｃＦｖ抗体の名称を、それぞれＭＯＧ０１抗体、ＭＯＧ０９抗体およびＭＯＧ１４抗体と記載する。各種抗ＭＯＧ　ｓｃＦｖ抗体のＶＨまたはＶＬをコードする塩基配列、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）アルパカ抗体ライブラリでの抗体の取得
　免疫原としてｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃと初回はコンプリートアジュバント、２および３回目はインコンプリートアジュバントとのエマルジョンを作製し、アルパカに免疫した。
　免疫されたアルパカの血液（５０ｍＬ）からリンパ球（２×１０７細胞）を採取し、得られた細胞からＲＮＡ　ＩｓｏＰｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてＲＮＡを抽出した。さらに、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使った逆転写反応によりｃＤＮＡを合成後、アルパカＩｇＧ２（Ｓｈｏｒｔ　ｈｉｎｇｅ－ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＩｇＧ３（Ｌｏｎｇ　ｈｉｎｇｅ－ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）に特異的なプライマーを使用して、ＶＨＨ遺伝子の増幅を行った。
　ＶＨＨ遺伝子断片をファージミドベクターｐＫＳＴＶ－０２（Miyazaki et al, J. Biochem. 2015;1に記載）に挿入し、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ　エレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ社製）を使ったエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＧ１を形質転換した（形質転換体のタイターはＩｇＧ２が２．６×１０７、ＩｇＧ３が３．２×１０７であった）。
　得られた形質転換体にＭ１３ＫＯ７　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｐｈａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を感染させることで、ＶＨＨ遺伝子がライブラリ化されたアルパカ抗体Ｍ１３ファージライブラリを得た。
　このアルパカ抗体Ｍ１３ファージライブラリを用いて、下記のバイオパニングの手法を用いて、抗ＭＯＧ抗体を取得した。イムノチューブにｒＭＯＧ－ＧＳＴ（４μｇ／２ｍＬ）を固相化し、０．５％ＢＳＡを用いてｒＭＯＧ－ＧＳＴが結合していない部位をブロックした。
　該チューブにアルパカ抗体Ｍ１３ファージライブラリを室温下で１時間反応させ、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後に０．１ＭのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）でファージを溶出した。溶出液はＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和した。溶出したファージは、大腸菌ＴＧ１に感染後、ファージを増幅した。その後、再度イムノチューブに固相化したｒＭＯＧ－ＧＳＴと反応させて、洗浄および溶出を実施した。
　この操作をＩｇＧ２では３回、ＩｇＧ３では２回繰り返し、ｒＭＯＧ－ＧＳＴに特異的に結合するＶＨＨを提示したファージを濃縮した。濃縮されたファージからＩｇＧ２およびＩｇＧ３のＶＨＨを提示しているファージクローンをそれぞれ９６個単クローン化し、ＥＬＩＳＡにてｒＭＯＧ－ＧＳＴへの結合性を有するクローンを選択した。
　ＥＬＩＳＡでは、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＮＵＮＣ社製）にｒＭＯＧ－ＧＳＴを固相化（５０ｎｇ／５０μＬ）し、０．５％ＢＳＡを用いてｒＭＯＧ－ＧＳＴが結合していない部位をブロックした。各ウェルに各々のファージクローンを加え、室温下で１時間反応させた後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。
　次いで、ビオチン化抗Ｍ１３ファージ抗体（Ａｂｃａｍ社製）と西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を各ウェルに５０μＬ加え、室温下１時間インキュベートした。
　マイクロプレートを、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＴＭＢ発色基質液（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を各ウェルに加え、室温下でインキュベートした。各ウェルに１Ｍの塩酸を加えて発色反応を止め、波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ　６８０ＸＲ、ＢｉｏＲａｄ社製）で測定した。
　ｒＭＯＧ－ＧＳＴに結合したクローンについて配列解析を行い、抗ＭＯＧ　ＶＨＨ抗体ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体を取得した。ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体のＶＨＨをコードする塩基配列、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例２］抗体発現ベクターの構築
（１）抗ＭＯＧ抗体の発現ベクターの構築
　ヒトＩｇＧ型の抗ＭＯＧ抗体を作製するために、実施例１で取得したヒト抗体ファージライブラリ由来抗ＭＯＧ　ｓｃＦｖ抗体の各可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ抗体定常領域のアミノ酸配列をコードするアミノ酸配列に組みこんだ各種抗ＭＯＧ抗体の発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
　ヒトＩｇＧのラムダ鎖定常領域をコードする塩基配列を合成し、Ｎ５ＫＧ４ＰＥベクター（国際公開第２００２／０８８１８６号に記載）のＢｇｌＩＩ－ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、Ｎ５ＬＧ４ＰＥベクターを作製した。
　ＭＯＧ０１抗体およびＭＯＧ０９抗体の各ＶＨ、ＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列をＮ５ＬＧ４ＰＥに挿入した発現ベクターを、それぞれＮ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０１、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０９と命名した。また、ＭＯＧ１４抗体のＶＨ、ＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列をＮ５ＫＧ４ＰＥベクターに挿入した発現ベクターをＮ５ＫＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ１４と命名した。
（１－１）ＭＯＧ０１抗体発現ベクターＮ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０１
　ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ０１を鋳型として、プライマー１（配列番号４３）およびプライマー２（配列番号４４）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＶＬ領域の遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で４５秒間からなる反応を３０サイクル実施した。実施例２に記載するＰＣＲは、特に記載がない限り、上記の条件で行った。
　ＰＣＲ産物を鋳型としてプライマー３（配列番号４５）およびプライマー２（配列番号４４）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＶＬ領域の遺伝子断片にシグナル配列を付加した。
　得られた遺伝子断片をＮ５ＬＧ４ＰＥベクターのＢｇｌＩＩ－ＢｌｐＩサイトに挿入し、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０１ＶＬを得た。次にｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ０１を鋳型として、プライマー４（配列番号４６）およびプライマー５（配列番号４７）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＶＨ領域の遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲ産物を鋳型としてプライマー６（配列番号４８）およびプライマー５（配列番号４７）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＶＨ領域の遺伝子断片にシグナル配列を付加した。得られた遺伝子断片をＮ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０１ＶＬベクターのＳａｌＩ－ＮｈｅＩサイトに挿入し、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０１を得た。
（１－２）ＭＯＧ０９抗体発現ベクターＮ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０９
　上記（１－１）と同様の方法でＮ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０９を作製した。ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ０９を鋳型として、ＶＬ領域の遺伝子断片の増幅には、プライマー７（配列番号４９）およびプライマー８（配列番号５０）、ＶＬ領域の遺伝子断片にシグナル配列を付加するときには、プライマー３（配列番号４５）およびプライマー８（配列番号５０）、ＶＨ領域の遺伝子断片を増幅には、プライマー９（配列番号５１）およびプライマー１０（配列番号５２）、ＶＨ領域の遺伝子断片にシグナル配列を付加するときには、プライマー６（配列番号４８）およびプライマー１０（配列番号５２）を用いた。
（１－３）ＭＯＧ１４抗体発現ベクターＮ５ＫＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ１４
　上記（１－１）と同様の方法でＮ５ＫＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ１４を作製した。ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ１４を鋳型として、ＶＬ領域の遺伝子断片の増幅には、プライマー１１（配列番号５３）およびプライマー１２（配列番号５４）、ＶＬ領域の遺伝子断片にシグナル配列を付加するときには、プライマー３（配列番号４５）およびプライマー１２（配列番号５４）を使用した。得られたシグナル配列が付加されたＶＬ領域の遺伝子断片をＮ５ＫＧ４ＰＥベクターのＢｇｌＩＩ－ＢｓｉＷＩサイトに挿入し、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ１４ＶＬを得た。
　次にｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ１４を鋳型として、ＶＨ領域の遺伝子断片の増幅には、プライマー１３（配列番号５５）およびプライマー１４（配列番号５６）、ＶＨ領域の遺伝子断片を増幅するときには、プライマー６（配列番号４８）およびプライマー１４（配列番号５６）を使用した。得られたシグナル配列が付加されたＶＨ領域の遺伝子断片をＮ５ＫＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ１４ＶＬのＳａｌＩ－ＮｈｅＩサイトに挿入し、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ１４を得た。
（１－４）ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体発現ベクターＮ５Ｇ４ＰＥＦｃ＿ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２
　ヒトＩｇＧ４ＰＥのＦｃ領域をコードする遺伝子にシグナル配列を付加した配列を合成し、プライマー２５（配列番号７９）およびプライマー２６（配列番号８０）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりヒトＦｃ領域の遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で６０秒間からなる反応を３０サイクル実施した。得られたＦｃ遺伝子断片をＮ５ＫＧ４ＰＥベクターのＢｇｌＩＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、Ｎ５Ｇ４ＰＥＦｃベクターを作製した。
　ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２のＶＨＨのアミノ酸配列をコードする塩基配列をＮ５Ｇ４ＰＥＦｃに挿入した発現ベクターを、Ｎ５Ｇ４ＰＥＦｃ＿ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２と命名した。ＶＨＨ－Ｆｃ発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
　ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２のＶＨＨの塩基配列を合成し、プライマー１５（配列番号５７）およびプライマー１６（配列番号５８）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＶＨＨ領域の遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で６０秒間からなる反応を３０サイクル実施した。得られたＶＨＨ遺伝子断片をＮ５Ｇ４ＰＥＦｃベクターのＥｃｏＲＩ－ＢｇｌＩＩサイトに挿入し、Ｎ５Ｇ４ＰＥＦｃ＿ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２を得た。
（２）抗Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ抗体の発現ベクターＮ５ＬＧ４ＰＥ＿ＡＶＭ
　ネガティブコントロール抗体として、キメラ抗Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ（ＡＶＭ）抗体を上記（１－１）と同様の方法で作製した。ＡＶＭ抗体のＶＨ、ＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列をＮ５ＬＧ４ＰＥに挿入した発現ベクターを、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＡＶＭと命名した。
　ＳＤラットにＡＶＭを免疫し、通常の方法で抗ＡＶＭ抗体産生ハイブリドーマを樹立した。該ハイブリドーマ由来の抗ＡＶＭ抗体の可変領域を鋳型として、ＶＬ領域の遺伝子断片の増幅には、プライマー２９（配列番号８３）およびプライマー３０（配列番号８４）、ＶＬ領域の遺伝子断片にシグナル配列を付加するときには、プライマー３（配列番号４５）およびプライマー３０（配列番号８４）を使用した。
　ＶＨ領域の遺伝子断片の増幅には、プライマー３１（配列番号８５）およびプライマー３２（配列番号８６）、ならびにＶＨ領域の遺伝子断片にシグナル配列を付加するときには、プライマー６（配列番号４８）およびプライマー３２（配列番号８６）を使用した。
（３）抗ラットトランスフェリン受容体抗体ＯＸ２６抗体の発現ベクターＮ５ＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＯＸ２６
　抗ラットトランスフェリン受容体抗体のポジティブコントロール抗体として［Protein Engineering, 12, 787-796, 1999］に記載された抗ラットトランスフェリン受容体抗体ＯＸ２６抗体を作製した。ＯＸ２６抗体のＶＨ、ＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列をＮ５ＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（国際公開第２００２／０８８１８６号に記載）に挿入した発現ベクターを、上記（１－１）と同様の方法で作製し、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＯＸ２６と命名した。
　ＯＸ２６抗体のＶＬのアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成して鋳型とし、ＶＬ領域の遺伝子断片の増幅には、プライマー４０（配列番号９４）およびプライマー４１（配列番号９５）、ならびにＶＨ領域の遺伝子断片の増幅にはプライマー４２（配列番号９６）およびプライマー４３（配列番号９７）を使用した。
［実施例３］バイスペシフィック抗体の発現ベクターの構築
（１）Ｈｅｒ２とＭＯＧに結合するバイスペシフィック抗体の発現ベクターの作製
　ＨＥＲ２とＭＯＧに結合するバイスペシフィック抗体の発現ベクターｐＣＩ－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖを以下の方法で作製した。当該バイスペシフィック抗体は、抗ＨＥＲ２抗体のＩｇＧの２本のＨ鎖のＣ末端に抗ＭＯＧ抗体のｓｃＦｖが融合したものである。
　重鎖定常領域の合成遺伝子を鋳型として、プライマー１７（配列番号５９）およびプライマー１８（配列番号６０）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で２分間からなる反応を３０サイクル実施した。ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ０１を鋳型として、プライマー１９（配列番号６１）およびプライマー２０（配列番号６２）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりｓｃＦｖ領域（以下ＭＯＧ０１ｓｃＦｖと記載）の遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で９０秒間からなる反応を３０サイクル実施した。次に、上記のＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３領域およびＭＯＧ０１ｓｃＦｖ領域を鋳型とし、プライマー１７（配列番号５９）およびプライマー２０（配列番号６２）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＭＯＧ０１ｓｃＦｖを増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で２分間からなる反応を３０サイクル実施した。得られた遺伝子断片をｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖベクターを作製した。
　抗ＨＥＲ２抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（国際公開第１９９９／５７１３４号に記載）のＶＬのアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成して鋳型とし、プライマー２１（配列番号６３）およびプライマー２２（配列番号６４）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＶＬ領域の遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で４５秒間からなる反応を３０サイクル実施した。Ｎ５ＫＧ４ＰＥベクター（国際公開第２００２／０８８１８６号に記載）を鋳型とし、プライマー２７（配列番号８１）およびプライマー２８（配列番号８２）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＣＬ領域の遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で４５秒間からなる反応を３０サイクル実施した。得られた遺伝子断片ＶＬ及びＣＬを鋳型としプライマー２１（配列番号６３）およびプライマー２８（配列番号８２）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲにより遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で９０秒間からなる反応を３０サイクル実施した。得られた遺伝子断片をｐＣＩ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖに挿入し、ｐＣＩ－ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂＶＬ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖを得た。
　次にＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂのＶＨのアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成して鋳型とし、プライマー２３（配列番号６５）およびプライマー２４（配列番号６６）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＶＨ領域の遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で４５秒間からなる反応を３０サイクル実施した。
　得られた遺伝子断片をｐＣＩ－ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂＶＬ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖに挿入し、ｐＣＩ－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖを得た。
（２）ＡＶＭとＭＯＧに結合するバイスペシフィック抗体の発現ベクターの作製
　また、ＡＶＭとＭＯＧに結合するバイスペシフィック抗体の発現ベクターをｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖを以下に記載する方法で作製した。当該バイスペシフィック抗体は、抗ＡＶＭ抗体のＩｇＧのＣ末端に抗ＭＯＧ抗体のｓｃＦｖが融合したものである。
　Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＡＶＭを鋳型として、プライマー３３（配列番号８７）およびプライマー３４（配列番号８８）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＡＶＭ軽鎖領域の遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で６０秒間からなる反応を３０サイクル実施した。
　Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＡＶＭを鋳型として、プライマー３５（配列番号８９）およびプライマー３２（配列番号８６）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＡＶＭ　ＶＨ領域の遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で４５秒間からなる反応を３０サイクル実施した。得られた遺伝子断片を上記で作製したｐＣＩ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖを得た。
（３）抗ＡＶＭ抗体のＩｇＧのＣ末端に抗ＡＶＭ抗体のｓｃＦｖが融合した抗体の発現ベクターの作製
　ネガティブコントロール抗体として、抗ＡＶＭ抗体のＩｇＧのＣ末端に抗ＡＶＭ抗体のｓｃＦｖが融合した抗体の発現ベクターをｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｓｃＦｖと命名した。
　重鎖定常領域の合成遺伝子を鋳型として、プライマー３６（配列番号９０）およびプライマー３７（配列番号９１）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で２分間からなる反応を３０サイクル実施した。ＡＶＭ　ｓｃＦｖの合成遺伝子を鋳型として、プライマー３８（配列番号９２）およびプライマー３９（配列番号９３）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲによりｓｃＦｖ領域の遺伝子断片を増幅した。
　ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で９０秒間からなる反応を３０サイクル実施した。次に、上記のＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３領域およびＡＶＭ　ｓｃＦｖ領域を鋳型とし、プライマー３６（配列番号９０）およびプライマー３９（配列番号９３）、ならびにＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＡＶＭ　ｓｃＦｖを増幅した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で２分間からなる反応を３０サイクル実施した。
　得られた遺伝子断片を上記ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｓｃＦｖを得た。
［実施例４］
可溶型ＭＯＧ抗原、可溶型ＨＥＲ２抗原の作製
（１）ＦＬＡＧ－Ｆｃが結合したラットＭＯＧの細胞外ドメインタンパク質の作製
　ラットＭＯＧの可溶性抗原として、Ｃ末端にＦＬＡＧ－Ｆｃが付加されたＭＯＧの細胞外ドメインタンパク質を以下に記載する方法で作製した。ｒＭＯＧをコードする塩基配列を配列番号６７に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号６８に示す。
　ＭＯＧの細胞外ドメインの遺伝子配列を合成し、ＦＬＡＧ－Ｆｃが挿入されたＩＮＰＥＰ４（ＩＤＥＣ社製）ベクターのＢｇｌＩＩ－ＸｂａＩサイトに挿入することにより、Ｃ末側にＦＬＡＧ－Ｆｃが付加されたＭＯＧの細胞外ドメインを発現するプラスミドベクターＩＮＰＥＰ４＿ｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃを作製した。ｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃの塩基配列を配列番号６９に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号７０に示す。
　ＩＮＰＥＰ４＿ｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ－ＦｃをＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて浮遊性２９３細胞に導入して培養し、一過性発現系でタンパク質を発現させた。ベクター導入４日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で濾過した。
　この培養上清中のＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてアフィニティー精製した。洗浄液としてリン酸緩衝液を用いた。
　プロテインＡに吸着させたタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３．４）により溶出し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ８．０）を含むチューブに回収した。
　次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ　ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いた限外ろ過とＮＡＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により溶出液の溶媒をＰＢＳに置換後、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌を行った。溶液中の精製した各ＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃタンパク質の濃度は２８０ｎｍの吸光度により測定した。
（２）ＧＳＴが結合したＭＯＧの細胞外ドメインタンパク質の作製
　ラットＭＯＧの可溶性抗原として、Ｃ末端にＧＳＴが付加されたＭＯＧの細胞外ドメインタンパク質を以下に記載する方法で作製した。
　ＭＯＧの細胞外ドメインの遺伝子配列を合成し、ＧＳＴが挿入されたＮ５ベクター（ＩＤＥＣ社製）のＢｇｌＩＩ－ＫｐｎＩサイトに挿入することにより、Ｃ末側にＧＳＴが付加されたＭＯＧの細胞外ドメインを発現するプラスミドベクターＮ５＿ｒＭＯＧ－ＧＳＴを作製した。ｒＭＯＧ－ＧＳＴの塩基配列を配列番号７１に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号７２に示す。
　ヒトＨＥＲ２の可溶性抗原として、Ｃ末端にＧＳＴが付加されたＨＥＲ２の細胞外ドメインタンパク質を以下に記載する方法で作製した。ＨＥＲ２の細胞外ドメインの遺伝子配列を合成し、ＧＳＴが挿入されたＮ５ベクター（ＩＤＥＣ社製）のＢｇｌＩＩ－ＫｐｎＩサイトに挿入することにより、Ｃ末側にＧＳＴが付加されたＨＥＲ２の細胞外ドメインを発現するプラスミドベクターＮ５＿ｈＨＥＲ２－ＧＳＴを作製した。ｈＨＥＲ２－ＧＳＴの塩基配列を配列番号７１に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号７２に示す。
　Ｎ５＿ｒＭＯＧ－ＧＳＴ、Ｎ５＿ｈＨＥＲ２－ＧＳＴをＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて浮遊性２９３細胞に導入して培養し、一過性発現系でタンパク質を発現させた。ベクター導入４日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で濾過した。
　この培養上清中のタンパク質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてアフィニティー精製した。洗浄液としてリン酸緩衝液を用いた。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂに吸着させたタンパク質を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｇｌｕｔａｔｉｏｎｅ　（ｐＨ８．０）により溶出した。
　次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ　ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いた限外ろ過とＮＡＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により溶液中の溶媒をＰＢＳに置換後、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌を行った。溶液中の精製したｒＭＯＧ－ＧＳＴタンパク質、ｈＨＥＲ２－ＧＳＴタンパク質の濃度は２８０ｎｍの吸光度により測定した。
［実施例５］膜型ＭＯＧ抗原発現ベクターの作製
　ラットＭＯＧ（ｒＭＯＧ）、マウスＭＯＧ（ｍＭＯＧ）、サルＭＯＧ（ｃＭＯＧ）およびヒトＭＯＧ（ｈＭＯＧ）の全長遺伝子配列を合成し、それぞれの遺伝子配列をｐＥＦ６／Ｖ５－Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）ベクターのＢａｍＨＩ－ＮｏｔＩサイトに挿入することにより、各種ＭＯＧの膜発現用プラスミドベクターｐＥＦ６＿ｒＭＯＧ、ｐＥＦ６＿ｍＭＯＧ、ｐＥＦ６＿ｃＭＯＧおよびｐＥＦ６＿ｈＭＯＧを作製した。
　ｍＭＯＧをコードする塩基配列を配列番号７３に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号７４に示す。ｃＭＯＧをコードする塩基配列を配列番号７５に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号７６に示す。ｈＭＯＧをコードする塩基配列を配列番号７７に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号７８に示す。
［実施例６］各種抗体の調製
　実施例２および実施例３で作製した抗体発現プラスミドベクターをＥｘｐｉ２９３TM　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて浮遊性２９３細胞に導入して培養し、一過性発現系で抗体を発現させた。
　ベクター導入４日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で濾過した。この培養上清中のタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてアフィニティー精製した。洗浄液としてリン酸緩衝液を用いた。プロテインＡに吸着させた抗体を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３．４）により溶出し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ８．０）を含むチューブに回収した。
　次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ　ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いた限外ろ過とＮＡＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により溶出液の溶媒をＰＢＳに置換後、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌を行った。抗体溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、濃度１ｍｇ／ｍＬを１．４０Ｏｐｔｉｍａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙと換算することで、精製抗体の濃度を算出した。
　実施例２に記載の抗ＭＯＧ抗体の発現ベクターＮ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０１、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０９、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ１４およびＮ５Ｇ４ＰＥＦｃ＿ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２を用いて発現した抗ＭＯＧヒトＩｇＧ抗体をそれぞれＭＯＧ０１抗体、ＭＯＧ０９抗体、ＭＯＧ１４抗体およびｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体と記載する。
　実施例３で作製した各種バイスペシフィック抗体発現ベクターｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｓｃＦｖ、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ、およびｐＣＩ－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ｈＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖを発現させて得た抗体をそれぞれＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｄｓｃＦｖ抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ抗体、およびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ抗体と命名した。
［実施例７］フローサイトメーターによる抗ＭＯＧ抗体のＭＯＧに対する結合性の評価
　実施例６で得た抗ＭＯＧ抗体ＭＯＧ０１抗体、ＭＯＧ０９抗体、ＭＯＧ１４抗体およびｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体のＭＯＧへの結合を以下の手順に従いｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ　（ＦＡＣＳ）法により評価した。
　実施例５で作製した各種膜型ＭＯＧ抗原発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて浮遊性２９３細胞に導入して培養し、一過性発現系で膜型抗原を発現させた。上記の細胞を用いて、以下に記載する方法で抗ＭＯＧ抗体の反応性を解析した。
　ｒＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ、ｍＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ、ｃＭＯＧ／ＨＥＫ２９３およびｈＭＯＧ／ＨＥＫ２９３細胞をそれぞれ、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で０．１％ＮａＮ３、１％ＦＢＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に懸濁し、９６穴丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。
　遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットへ実施例６で得た１０μｇ／ｍＬの各抗体を加えて懸濁した後、氷温下で３０分間静置した。さらに遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）して上清を除去し、ペレットをＳＢで洗浄後に、１μｇ／ｍＬのＲＰＥ蛍光標識ヤギ抗ヒト抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｂｌｏｔ社製）を加え、氷温下３０分間インキュベートした。
　ＳＢで洗浄後、ＳＢに懸濁し、フローサイトメーターＦＡＣＳ　ＣＡＮＴＯ　ＩＩ、（ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。得られた結果を図２に示す。なお、ネガティブコントロールとして、抗ＡＶＭ抗体を用いた。
　図２に記載されるように、ｒＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ細胞及びｍＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対して、抗ＭＯＧ抗体であるＭＯＧ０１抗体、ＭＯＧ０９抗体、ＭＯＧ１４抗体およびｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体は、いずれも結合活性を示した。また、ＭＯＧ０１抗体およびＭＯＧ１４抗体は、いずれもｃＭＯＧ／ＨＥＫ２９３細胞及びｈＭＯＧ／ＨＥＫ２９３細胞にも結合活性を示した。
　よって、抗ＭＯＧヒトＩｇＧ抗体ＭＯＧ０１およびＭＯＧ１４は、ラット、マウスＭＯＧだけでなく、カニクイザルおよびヒトＭＯＧの全てを認識して、結合することが明らかになった。
［実施例８］表面プラズモン共鳴検出による抗ＭＯＧ抗体のＭＯＧに対する結合性の評価
　実施例６で得た抗ＭＯＧ抗体ＭＯＧ０１抗体、ＭＯＧ０９抗体、ＭＯＧ１４抗体およびｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体のラットＭＯＧへのアフィニティーをＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ－１００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。
　ＣＭ５センサーチップ上にＨｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅキットを用いて各抗体を固定化し、実施例４で作製したｒＭＯＧ－ＧＳＴをアナライトとして結合能を評価した。得られたセンサグラムについてＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅにより解析を行うことで解離定数（ＫＤ値）を算出した。得られた結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、各抗ＭＯＧ抗体の解離定数（ＫＤ値）は２．１×１０－１１（Ｍ）～４．０×１０－８（Ｍ）であり、いずれの抗体も良好なアフィニティーを示すことが明らかになった。ＭＯＧ０９抗体では、解離速度定数ｋｄが機器測定範囲外となり、ＫＤ値が一意に決定できていない。
［実施例９］抗ＭＯＧ抗体のラット脳移行性評価
　ラットに抗体を尾静脈（ｉ．ｖ．）投与後、尾静脈採血を行った。採血と同じ日に、ペントバルビタール麻酔下にて全身灌流後、脳組織を回収し、その重さを測定した。また、回収した脳組織にバッファー溶液を加えホモジナイズし、遠心分離後、上清に溶出された抗体溶液を回収した。その容量を測定するとともに抗体濃度をＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により測定し、単位脳重量あたりの抗体量を算出した。
　抗ＭＯＧ抗体ＭＯＧ０１抗体、ＭＯＧ１４抗体、およびｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体、ならびにネガティブコントロールの抗ＡＶＭ抗体について、ＭＯＧ０１抗体およびＭＯＧ１４抗体は１ｍｇ／ｋｇ体重、ｉＭＯＧ－３Ｒｉｍ１－Ｓ３２抗体は５ｍｇ／ｋｇ体重の量で抗体を投与して４日後の血清中の抗体濃度および脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量を図３（Ａ）および（Ｂ）に示す。
　図３（Ａ）および（Ｂ）に示すように、抗ＭＯＧ抗体のいずれの抗体についても、ネガティブコントロール（ＡＶＭ）と比較して、血清中の抗体濃度は変化しなかったが、脳内の抗体量が５－１０倍に増加することが示された。
　抗ＭＯＧ抗体ＭＯＧ０１抗体、抗トランスフェリン受容体抗体ＯＸ２６抗体、およびネガティブコントロールの抗ＡＶＭ抗体について、５ｍｇ／ｋｇ体重の量で抗体を投与して４日後及び１０日後の血清中の抗体濃度および脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量を図４（Ａ）および（Ｂ）に示す。
　図４（Ａ）に示すように、ＯＸ２６抗体では、４日後の血清中の抗体濃度が評価した抗体の中で最も低く、１０日後には検出感度以下になるなど抗体の血中動態が悪かった。抗ＭＯＧ抗体であるＭＯＧ０１抗体では、投与４日後、１０日後の血清中の抗体濃度に大きな変化はなく、ネガティブコントロールと同程度の抗体濃度であった。これより、ＭＯＧ０１抗体の血中半減期はネガティブコントロールと同定度であるといえる。
　また、図４（Ｂ）に示すように、脳内の抗体量については、ネガティブコントロールは投与から４日後の時点で評価した抗体の中で最も抗体量が低く、１０日後にはわずかではあるが、さらに抗体量が減少した。
　ＯＸ２６抗体は、投与４日後から１０日後の間に急速に抗体量が減少し、投与１０日後の抗体量はネガティブコントロール以下になるのに対し、ＭＯＧ０１抗体では、投与４日後から１０日後の間に抗体量が増加し、投与４日後の抗体量はネガティブコントロールの約２．５倍、投与１０日後の抗体量はネガティブコントロールの約１０倍となった。
　以上により、抗ＭＯＧ抗体ＭＯＧ０１抗体は、血清中ではネガティブコントロールと同定度の抗体濃度を示しながらも、脳内の抗体量を投与４日後には、ネガティブコントロールの約２．５倍に、投与１０日後には、ネガティブコントロールおよびＯＸ２６抗体の約１０倍に高められることが示された。
［実施例１０］フローサイトメーターによるＭＯＧのバイスペシフィック抗体のＭＯＧまたはＨＥＲ２に対する結合性の評価
　実施例６で得たＭＯＧとＨｅｒ２に結合するバイスペシフィック抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体、ＭＯＧとＡＶＭに結合するバイスペシフィック抗体ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体、およびＡＶＭに結合する抗体ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｄｓｃＦｖ抗体のＭＯＧまたはＨＥＲ２への結合を以下の手順に従いｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法により評価した。
　実施例５で作製した膜型ＭＯＧ抗原発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて浮遊性２９３細胞に導入して培養し、一過性発現系で膜型抗原を発現させた。
　ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ｒＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ｈＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ細胞およびヒト乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、それぞれ５×１０５細胞／ｍＬの濃度で０．１％ＮａＮ３、１％　ＦＢＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に懸濁し、９６穴丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。
　遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットへ実施例６で得た１０μｇ／ｍＬの各抗体を加えて懸濁した後、氷温下で３０分間静置した。さらに遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）して上清を除去し、ペレットをＳＢで洗浄後に、１μｇ／ｍＬのＲＰＥ蛍光標識ヤギ抗ヒト抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｂｌｏｔ社製）を加え、氷温下３０分間インキュベートした。
　ＳＢで洗浄後、ＳＢに懸濁し、フローサイトメーターＦＡＣＳ　ＣＡＮＴＯ　ＩＩ（ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。なお、ネガティブコントロールとして、１０μｇ／ｍＬの抗ＡＶＭ抗体を用いた。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ｒＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、およびｈＭＯＧ／ＨＥＫ２９３細胞に対する結合性解析の結果を図５に示す。
　図５より、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体では、ｒＭＯＧ／ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ｈＭＯＧ／ＨＥＫ２９３細胞への結合がみられることから、バイスペシフィック抗体の形状であっても、ラットＭＯＧおよびヒトＭＯＧへの結合性を保持していることが示された。
　ヒト乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する結合性解析の結果を図６に示す。当該細胞には、ＨＥＲ２が発現していることが知られている。
　図６より、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体はバイスペシフィック抗体の形状であっても、ＨＥＲ２への結合性を保持していることが示された。
［実施例１１］表面プラズモン共鳴検出によるＭＯＧのバイスペシフィック抗体のＭＯＧに対する結合性の評価
　ＭＯＧのバイスペシフィック抗体のＭＯＧへのアフィニティーを実施例８と同様の方法で測定し、結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、各バイスペシフィック抗体の解離定数（ＫＤ値）は、ＡＶＭ
　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体で２．０×１０－７（Ｍ）、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体で１．０×１０－７（Ｍ）であり、いずれのＭＯＧのバイスペシフィック抗体についても良好なアフィニティーを示すことが明らかになった。
　Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体では、結合速度定数ｋａ、および解離速度定数ｋｄが機器測定範囲外となり、ＫＤ値が一意に決定できていない。
［実施例１２］表面プラズモン共鳴検出によるＭＯＧのバイスペシフィック抗体のＨＥＲ２に対する結合性の評価
　ＭＯＧとＨＥＲ２に結合するバイスペシフィック抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体のＨＥＲ２へのアフィニティーをＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ－１００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。
　ＣＭ５センサーチップ上にＨｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅキットを用いて各抗体を固定化し、実施例４で作製したＨＥＲ２－ＧＳＴをアナライトとして、ＭＯＧ－Ｈｅｒ２バイスペシフィック抗体の結合能を評価した。得られたセンサグラムについてＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅにより解析を行うことで解離定数（ＫＤ値）を算出した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体のＨＥＲ２に対する解離定数（ＫＤ値）は、３．７×１０－９（Ｍ）であり、良好なアフィニティーを示す抗体であることが明らかになった。
［実施例１３］ＭＯＧのバイスペシフィック抗体のラット脳移行性評価
　各バイスペシフィック抗体ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ　抗体、およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｄｓｃＦｖ抗体のラットでの脳移行性評価を実施例９と同様の方法で測定した。５ｍｇ／ｋｇ体重の量で抗体を投与して１０日後の血清中の抗体濃度および脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量を図７（Ａ）および（Ｂ）に示す。
　図７（Ａ）に示すように、バイスペシフィック抗体のネガティブコントロールであるＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｄｓｃＦｖ抗体と比較して、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体では、血清中の抗体濃度に差はなかった。
　一方、図７（Ｂ）に示すように、バイスペシフィック抗体のネガティブコントロールであるＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｄｓｃＦｖ抗体と比較して、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　ｄｓｃＦｖ抗体では、脳内の抗体量が約１０倍に高まることが示された。
　以上より、ＭＯＧに結合するバイスペシフィック抗体は、ＭＯＧに結合しないバイスペシフィック抗体よりも、脳内の抗体量を約１０倍高めることができる一方で、血中半減期には変化がないことが示された。
［実施例１４］抗ＭＯＧ０１抗体のマウス脳移行性評価
（１）抗体量測定
　マウスに抗体を３５ｎｍｏｌ／ｋｇで尾静脈（ｉ．ｖ．）投与して数日後、尾静脈採血を行った。採血と同じ日に、ペントバルビタール麻酔下にて全身灌流後、脳組織を回収し、その重さを測定した。また、回収した脳組織にバッファー溶液を加えホモジナイズし、遠心分離後、上清に溶出された抗体溶液を回収した。その容量を測定するとともに抗体濃度をＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により測定し、単位脳重量あたりの抗体量を算出した。
　抗ＭＯＧ０１ヒトＩｇＧ抗体ならびにネガティブコントロールの抗ＡＶＭヒトＩｇＧ抗体について、抗体を投与して３、６、１０、１４、２１、２８日後の血清中の抗体濃度および脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量をそれぞれ図８（Ａ）および（Ｂ）に示す。
　図８（Ａ）に示すように、抗ＭＯＧ０１ヒトＩｇＧ抗体は、ネガティブコントロールと比較して、血清中の抗体濃度に差はなかった。一方で、図８（Ｂ）に示すように、２８日間にわたり脳内の抗体量を数十倍に高められることが示された。
（２）イメージング解析
　抗ＭＯＧ０１ヒトＩｇＧ抗体ならびにネガティブコントロールの抗ＡＶＭヒトＩｇＧ抗体について、Ａｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒＲ　４８８　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）にて標識を行った。標識後の抗体を、ＡＦ４８８－ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ抗体、ＡＦ４８８－ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ抗体とする。
　標識後の抗体を１０ｍｇ／ｋｇでマウスに尾静脈（ｉ．ｖ．）投与数日後、トマトレクチン投与を行い、頬採血を行った。採血後、ペントバルビタール麻酔下にて全身灌流後、脳組織を回収し、ＩＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（パーキンエルマー社製）にて蛍光強度を測定した。６日後の脳イメージング像を図９（Ａ）、１４日後の脳イメージング像を図９（Ｂ）に示す。投与抗体の蛍光強度で補正後の脳中蛍光量を図９（Ｃ）に示す。
　図９（Ａ）～（Ｃ）に示すように、抗ＭＯＧ０１抗体は、ネガティブコントロールと比較して、脳内全域に渡って抗体量を数十倍に高められることが示された。
［実施例１５］各種バイスペシフィック抗体発現ベクターの構築
　図１０（Ａ）～（Ｃ）並びに図１１（Ａ）および（Ｂ）に記載する構造を有するＡＶＭとＭＯＧに結合するバイスペシフィック抗体発現ベクターを以下の方法で作製した。当該バイスペシフィック抗体の名称および抗体発現ベクターの名称を表６に、抗体発現ベクターの名称と抗体の塩基配列、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（１）図１０（Ａ）の構造に関するバイスペシフィック抗体発現ベクターの構築
（１－１）ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ＦＬＡＧ　ｔａｇベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）領域の遺伝子断片を増幅し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ＦＬＡＧ　ｔａｇベクターを作製した。
（１－２）ｐＣＩ－ＭＯＧ０１－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇ領域の遺伝子断片を増幅した。また、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０１を鋳型として、ＭＯＧ０１軽鎖領域の遺伝子断片とＭＯＧ０１　ＶＨ領域の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅した。得られた遺伝子断片をｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ－ＭＯＧ０１－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇベクターを作製した。
（２）図１０（Ｂ）の構造に関するバイスペシフィック抗体発現ベクターの構築
（２－１）ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ＶＬ－ＣＬベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ＶＬ－ＣＬ領域の遺伝子断片を増幅し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ＶＬ－ＣＬベクターを作製した。
（２－２）ｐＣＩ－ＭＯＧ０１ＶＨ－ＣＨベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＭＯＧ０１ＶＨ－ＣＨ領域の遺伝子断片を増幅し、ｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ－ＭＯＧ０１ＶＨ－ＣＨベクターを作製した。
（３）図１０（Ｃ）の構造に関するバイスペシフィック抗体発現ベクターの構築
（３－１）ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片を増幅した。また、ＭＯＧ０１ｓｃＦｖを鋳型として、ＰＣＲによりｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ領域の遺伝子断片を増幅した。さらに上記のＰＣＲ産物を鋳型として、ＰＣＲによりｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇ領域の遺伝子断片を増幅した。ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ領域とｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇ領域の遺伝子断片をｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｓｃＦｖのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇベクターを作製した。
（３－２）ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇ領域の遺伝子断片を増幅し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇベクターを作製した。
（４）図１１（Ａ）および（Ｂ）の構造を有するバイスペシフィック抗体発現ベクターの構築
（４－１）ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片を増幅した。また、ＭＯＧ０１ｓｃＦｖを鋳型として、ＰＣＲによりＭＯＧ０１のＶＨ領域、ＶＬ領域の遺伝子断片を増幅した。ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片とＭＯＧ０１のＶＨ領域、ＶＬ領域の遺伝子断片をｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ２ベクターを作製した。
　同様に、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ３ベクター、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ４ベクター、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ５ベクター、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ６ベクター、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ７ベクター、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ８ベクター、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ９ベクター、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ１０ベクターと、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ１１ベクターを作製した。
（５）ネガティブコントロールとなる抗体の発現ベクターの構築
　ネガティブコントロールとなる抗体を以下の方法で作製した。当該抗体の名称および抗体発現ベクターの名称を表８に、抗体発現ベクターの名称と抗体の塩基配列、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　
（２－１）ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターの作製
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＡＶＭのＶＨ領域、ＶＬ領域ならびに抗体定常領域の遺伝子断片を増幅し、ｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターを作製した。
（２－２）ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭＶＬ－ＣＬベクターの作製
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭＶＬ－ＣＬ領域の遺伝子断片を増幅し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｓｃＦｖのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭＶＬ－ＣＬベクターを作製した。
（２－３）ｐＣＩ－ＡＶＭＶＨ－ＣＨベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＡＶＭＶＨ－ＣＨ領域の遺伝子断片を増幅し、ｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭＶＨ－ＣＨベクターを作製した。
（２－４）ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片を増幅した。また、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＡＶＭを鋳型として、ＰＣＲによりｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇ領域の遺伝子断片を増幅した。ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ領域とｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇ領域の遺伝子断片をｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　ｓｃＦｖのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇベクターを作製した。
（２－５）ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖベクターの構築
　合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片を増幅した。また、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＡＶＭを鋳型として、ＰＣＲによりＡＶＭのＶＨ領域、ＶＬ領域の遺伝子断片を増幅した。ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｌｉｎｋｅｒ領域の遺伝子断片とＡＶＭのＶＨ領域、ＶＬ領域の遺伝子断片をｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖ３ベクターとｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖ５ベクターを作製した。
［実施例１６］各種バイスペシフィック抗体の調製
　実施例６に記載した方法で、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　Ｆａｂ抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ２抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ３抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ４抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ５抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ６抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ７抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ８抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ９抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ１０抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ１１抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭ　Ｆａｂ抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｄｓｃＦｖ３抗体およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｄｓｃＦｖ５抗体を調製した。
　ＡＶＭ－ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｓｃＦｖ抗体およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｓｃＦｖ抗体は、下記に記載する方法で調製した。抗体発現プラスミドベクターをＥｘｐｉ２９３（商標）　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて浮遊性２９３細胞に導入して培養し、一過性発現系で抗体を発現させた。
　ベクター導入４日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で濾過した。この培養上清中のタンパク質をＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてＨｉｓ　ｔａｇによるアフィニティー精製した。洗浄液として２０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－リン酸緩衝液を用いた。
　Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂に吸着させた抗体を、５００ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－リン酸緩衝液により溶出した。次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ　ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いた限外ろ過とＮＡＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により溶出液の溶媒をＰＢＳに置換した。
　このＨｉｓ　ｔａｇ精製後のタンパク質をＦＬＡＧ抗体アフィニティゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いてアフィニティー精製した。洗浄液としてリン酸緩衝液を用いた。ＦＬＡＧ抗体アフィニティゲルに吸着させた抗体を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３．４）により溶出し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ８．０）を含むチューブに回収した。
　次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ　ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いた限外ろ過とＮＡＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により溶出液の溶媒をＰＢＳに置換後、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌を行った。抗体溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、精製抗体の濃度を算出した。
［実施例１７］フローサイトメーターによる各種バイスペシフィック抗体のＭＯＧに対する結合性の評価
　実施例６および実施例１６で得た各種バイスペシフィック抗体およびネガティブコントロール抗体のＭＯＧに対する結合を以下の手順に従いｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法により評価した。
　実施例５で得たｐＥＦ６＿ｈＭＯＧを、ＨｉｌｙＭａｘ（同仁化学社製）を用いてマウス結合組織由来線維芽細胞Ｌ９２９［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＣＬ－１］に導入した。遺伝子導入後の細胞を抗生物質Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により選抜した後、限界希釈法によるクローニングを行い、ｈＭＯＧを細胞表面に発現したＬ９２９細胞（以下、ｈＭＯＧ／Ｌ９２９と略記する）を用いて、以下に記載する方法で各種バイスペシフィック抗体の反応性を解析した。
　ｈＭＯＧ／Ｌ９２９を０．１％　ＮａＮ３、１％　ＦＢＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に懸濁し、９６穴丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットへ実施例６および実施例１６で得た各種ＭＯＧ０１バイスペシフィック抗体を加えて懸濁した後、氷温下で３０分間静置した。さらに遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）して上清を除去し、ペレットをＳＢで洗浄後に、１μｇ／ｍＬのＲＰＥ蛍光標識ヤギ抗ヒト抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで洗浄後、ＳＢに懸濁し、フローサイトメーターＦＡＣＳ　ＣＡＮＴＯ　ＩＩ、（ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。結果を図１２（Ａ）～（Ｃ）並びに図１３（Ａ）および（Ｂ）に示す。
　図１２（Ａ）～（Ｃ）並びに図１３（Ａ）および（Ｂ）に示すように、各種バイスペシフィック抗体はいずれもＭＯＧへの結合性を有していることを確認した。特にＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１Ｆａｂ抗体［図１０（Ｂ）、図１２（Ｃ）］、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ３抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ５抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ６抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ７抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ８抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ９抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ１０抗体、およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ１１抗体［図１１（Ｂ）、図１３（Ｂ）］で結合性が高いことが明らかとなった。
［実施例１８］表面プラズモン共鳴検出による各種バイスペシフィック抗体のＭＯＧに対する結合性の評価
　実施例６および実施例１６で得られた各種バイスペシフィック抗体のＭＯＧへの結合を実施例８と同様の方法で評価した。得られた結果を表１０および表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１０および表１１に示すように、各ＭＯＧのバイスペシフィック抗体の解離定数（ＫＤ値）は１．２×１０－８（Ｍ）～２．０×１０－７（Ｍ）であり、いずれの抗体も良好なアフィニティーを示すことが明らかになった。
　特にＡＶＭ－ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体［図１０（Ａ）］、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１Ｆａｂ抗体［図１０（Ｂ）］、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ３抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ５抗体［図１１（Ｂ）］では結合性が高いことが明らかとなった。
［実施例１９］各種バイスペシフィック抗体のマウス脳移行性評価
　実施例６および実施例１６で得た各種バイスペシフィック抗体およびネガティブコントロール抗体のマウス脳移行性を実施例１４の方法で評価した。
　ＡＶＭ－ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｓｃＦｖ抗体およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　Ｆａｂ抗体について、抗体を５ｍｇ／ｋｇで投与し、１０日後での血清中抗体濃度および脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量を図１４（Ａ）～図１６（Ｂ）に示す。
　図１４（Ａ）、図１５（Ａ）および図１６（Ａ）に示すように、いずれのＭＯＧ０１改変抗体でも、ネガティブコントロールと比較して血清中の抗体濃度に差はなかった。一方、図１４（Ｂ）、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）に示すように、ネガティブコントロールと比較して、ＡＶＭ－ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体では約８倍、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｓｃＦｖ抗体では約１２倍、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１　Ｆａｂ抗体では約３０倍に脳内の抗体量が高まることが示された。
　以上より、ＭＯＧに結合する各種バイスペシフィック抗体は、ＭＯＧに結合しないネガティブコントロール抗体よりも、脳内の抗体量を高めることができる一方で、血中半減期には変化がないことが示された。
　ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ３抗体およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ５抗体について、抗体を５ｍｇ／ｋｇで投与し、１０日後および２８日後での血清中抗体濃度および脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量を図１７（Ａ）～（Ｄ）に示す。
　図１７（Ａ）および（Ｃ）に示すように、いずれのバイスペシフィック抗体でも、ネガティブコントロールと比較して血清中の抗体濃度に差はなかった。一方、図１７（Ｂ）および（Ｄ）に示すように、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ抗体、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ３抗体およびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｄｓｃＦｖ５抗体では、２８日間にわたり脳内の抗体量を数十倍に高められることが示された。また、図１７（Ｄ）に示すように、２８日後の脳内の抗体量が高いバイスペシフィック抗体は、ＭＯＧへの結合性も高く（表１１）、ＭＯＧ結合活性と脳内抗体量が相関することが明らかになった。
［実施例２０］抗ＭＯＧ０１抗体より強いＭＯＧへの結合性を示す新規ＭＯＧ抗体の取得
（１）ＦＬＡＧ－Ｆｃが結合した可溶型ヒトＭＯＧ抗原および可溶型マウスＭＯＧ抗原の細胞外ドメインタンパク質の作製
　ヒトＭＯＧとマウスＭＯＧの可溶性抗原として、Ｃ末端にＦＬＡＧ－Ｆｃが付加されたＭＯＧの細胞外ドメインタンパク質を発現するプラスミドベクターＩＮＰＥＰ４＿ｈＭＯＧ－ＦＬＡＧ－ＦｃとＩＮＰＥＰ４＿ｍＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃを実施例４に記載する方法で作製した。ｈＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃの塩基配列を配列番号１００に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１０１に示し、ｍＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃの塩基配列を配列番号１０２に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１０３に示した。ＦＬＡＧ－Ｆｃが結合したＭＯＧの細胞外ドメインタンパク質は、実施例４に記載する方法で一過性発現させ、精製して取得した。
（２）ＧＳＴが結合したＭＯＧの細胞外ドメインタンパク質の作製
　ヒトＭＯＧとマウスＭＯＧの可溶性抗原として、Ｃ末端にＧＳＴが付加されたＭＯＧの細胞外ドメインタンパク質を発現するプラスミドベクターＮ５＿ｈＭＯＧ－ＧＳＴとＮ５＿ｍＭＯＧ－ＧＳＴを実施例４に記載する方法で作製した。ｈＭＯＧ－ＧＳＴの塩基配列を配列番号１０４に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１０５に示し、ｍＭＯＧ－ＧＳＴの塩基配列を配列番号１０６に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１０７に示した。ＧＳＴが結合したＭＯＧの細胞外ドメインタンパク質は、実施例４に記載する方法で一過性発現させ、精製して取得した。
（３）ヒト抗体産生マウスからの抗ＭＯＧ抗体の取得
　ヒト抗体産生マウス（Ishida& Lonberg, IBC’s 11th Antibody Engineering, Abstract 2000; Ishida, I. et al., Cloning & Stem Cells 4, 85-96 (2002)および石田 功 (2002) 実験医学 20, 6, 846-851）に、ｈＭＯＧ－ＧＳＴとｍＭＯＧ－ＧＳＴを百日咳ワクチンとアラムゲルと混合して、腹腔内または皮内に投与した。
　初回免疫以降、ｈＭＯＧ－ＧＳＴとｍＭＯＧ－ＧＳＴを３回免疫した。最終免疫から４日後に、腹腔内投与を行った個体から解剖して脾臓を採材し、赤血球除去試薬（ＳＩＧＭＡ社製）にて赤血球を除去後、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　１（日本全薬工業株式会社製）にて凍結した。皮内投与を行った個体からは、解剖により腋下リンパ節を採材し、赤血球除去試薬にて赤血球を除去後、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　１にて凍結した。得られた脾臓細胞と腋下リンパ節の細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを用いて実施例１に記載の方法でヒト抗体産生マウス由来ファージライブラリを作製した。
　このヒト抗体産生マウス由来ファージライブラリを用いて、ファージディスプレイ法により抗ヒトＭＯＧモノクローナル抗体を取得した。ファージディスプレイ法及びクローニングＥＬＩＳＡは、ｈＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿ＦｃとｍＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃを用いて、実施例１に記載した方法で行った。
　ｈＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ、ｍＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿ＦｃおよびｈＭＯＧ／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に結合したクローンについて配列解析を行い、抗ＭＯＧ抗体ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３０１、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３０３、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３０７、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３１０、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３１２、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３２６、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３２９、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ４４６、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ４５６およびｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ４７３を取得した。
　以降の文章において、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３０１、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３０３、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３０７、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３１０、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３１２、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３２６、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３２９、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ４４６、ｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ４５６およびｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ４７３を用いて発現させたファージが提示する抗ＭＯＧ　ｓｃＦｖ抗体の名称を、それぞれＭＯＧ３０１抗体、ＭＯＧ３０３抗体、ＭＯＧ３０７抗体、ＭＯＧ３１０抗体、ＭＯＧ３１２抗体、ＭＯＧ３２６抗体、ＭＯＧ３２９抗体、ＭＯＧ４４６抗体、ＭＯＧ４５６抗体およびＭＯＧ４７３抗体と記載する。
　各種抗ＭＯＧ抗体のＶＨまたはＶＬをコードする塩基配列、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　また、それぞれＭＯＧ３０１抗体には相同性９１～９３％の類似配列クローン（ＭＯＧ４２６、ＭＯＧ４２８）、ＭＯＧ０３抗体には相同性８５～９５％の類似配列クローン（ＭＯＧ３１３、ＭＯＧ３１４、ＭＯＧ３１５、ＭＯＧ３３１、ＭＯＧ３５７、ＭＯＧ４７６）、ＭＯＧ３０７抗体には相同性９７～９９％の類似配列クローン（ＭＯＧ３２３、ＭＯＧ３４１、ＭＯＧ３５４、ＭＯＧ３５５）、ＭＯＧ３１０抗体には相同性８５～９８％の類似配列クローン（ＭＯＧ３０８、ＭＯＧ３１６、ＭＯＧ３１９、ＭＯＧ３２０、ＭＯＧ３３８、ＭＯＧ３５２、ＭＯＧ３５９、ＭＯＧ４７８）、ＭＯＧ３２９抗体には相同性８５％の類似配列クローン（ＭＯＧ４７０）、およびＭＯＧ４５６抗体には相同性８４％の類似配列クローン（ＭＯＧ４１８）がＭＯＧ結合性を指標にしたファージディスプレイ法により得らた。これらの類似クローンはｈＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿Ｆｃ、ｍＭＯＧ－ＦＬＡＧ＿ＦｃおよびｈＭＯＧ／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に結合することが確認されたことから、各抗体クローンのアミノ酸配列と相同性の高い抗体クローンも同様にＭＯＧ結合活性を有する抗体であることが明らかになった。
　類似クローンのＶＨまたはＶＬをコードする塩基配列、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を表１３に、類似クローンのアミノ酸配列の比較を図１８～図２２（Ｂ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
［実施例２１］抗ＭＯＧ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体の作製
　ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ０１を鋳型として、ＰＣＲによりｓｃＦｖ領域の遺伝子断片を増幅した。重鎖定常領域の合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＨｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３領域の遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をＮ５ＫＧ４ＰＥベクター（国際公開第２００２／０８８１８６号に記載）に挿入し、Ｎ５－ＭＯＧ０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥベクターを作製した。
　ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ＿ＭＯＧ３０１を鋳型として、ＰＣＲによりｓｃＦｖ領域の遺伝子断片を増幅した。重鎖定常領域の合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＨｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３領域の遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ－ＭＯＧ３０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターを作製した。
　同様の方法で、表１２に示す各種抗ＭＯＧ抗体のｓｃＦｖ領域の遺伝子断片を挿入した抗体発現ベクターを作製し、それぞれｐＣＩ－ＭＯＧ３０３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３０７　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３１０　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３１２　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３２６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３２９　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ４４６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ４５６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）およびｐＣＩ－ＭＯＧ４７３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）と命名した。
　作製した抗ＭＯＧ抗体の発現ベクターを、実施例６に記載した方法で調製した。抗ＭＯＧ抗体の発現ベクターｐＣＩ－ＭＯＧ３０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３０３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３０７　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３１０　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３１２　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３２６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ３２９　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ４４６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ｐＣＩ－ＭＯＧ４５６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）およびｐＣＩ－ＭＯＧ４７３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）を発現させてＭＯＧ３０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＭＯＧ３０３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＭＯＧ３０７　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＭＯＧ３１０　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＭＯＧ３１２　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＭＯＧ３２６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＭＯＧ３２９　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＭＯＧ４４６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体、ＭＯＧ４５６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体およびＭＯＧ４７３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）抗体をそれぞれ取得した。
［実施例２２］フローサイトメーターによる抗ＭＯＧ抗体のＭＯＧに対する結合性の評価
　実施例２１で得た抗ＭＯＧ抗体のＭＯＧへの結合を実施例７と同様の方法で評価した。結果を図２３～２５に示す。
　図２３～２５に示すように、ＭＯＧ０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ、ＭＯＧ３０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ３０３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ３０７　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ３１０　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ３１２　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ３２６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ３２９　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ４４６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ４５６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）およびＭＯＧ４７３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）はいずれも、ｈＭＯＧ／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞およびｍＭＯＧ／Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に結合活性を示した。
［実施例２３］表面プラズモン共鳴検出による抗ＭＯＧ抗体のＭＯＧに対する結合性の評価
　実施例２１で得たＭＯＧ０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ、ＭＯＧ３０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ３０３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ３０７　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ３２９　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ４４６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、ＭＯＧ４５６　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）およびＭＯＧ４７３　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）のヒトＭＯＧおよびマウスＭＯＧへの結合を実施例８と同様の方法で評価した。アナライトには、ｈＭＯＧ－ＧＳＴとｍＭＯＧ－ＧＳＴを用いた。ヒトＭＯＧへの結合性評価の結果を表１４に、マウスＭＯＧへの結合性評価の結果を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表１４および表１５に示すように、各抗ＭＯＧ抗体のヒトＭＯＧに対する解離定数（ＫＤ値）は１．０×１０－１０（Ｍ）～３．６×１０－９（Ｍ）、マウスＭＯＧに対する解離定数（ＫＤ値）は１．９×１０－１０（Ｍ）～６．９×１０－９（Ｍ）であり、いずれの抗体も良好なアフィニティーを示すことが明らかになった。ＭＯＧ０１　ｓｃＦｖ－ｈＧ４ＰＥでは、結合速度定数ｋａが機器測定範囲外となり、ＫＤ値が一意に決定できていない。
［実施例２４］酵素融合抗体の作製
　抗ＭＯＧ０１ＩｇＧ抗体および抗ＡＶＭＩｇＧ抗体のＣ末端に酸性スフィンゴミエリナーゼ（Ａｃｉｄ　Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ；ＡＳＭ）が融合した酵素融合抗体を以下に記載する方法で作製した。抗ＭＯＧ０１ＩｇＧ抗体のＣ末端にＡＳＭが融合した抗体の発現ベクターをｐＣＩ－ＭＯＧ０１－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＳＭ、抗ＡＶＭＩｇＧ抗体のＣ末端にＡＳＭが融合した抗体の発現ベクターをｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＳＭと命名した。
　配列番号１５０に示すＡＳＭの合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりｌｉｎｋｅｒ－ＡＳＭ領域の遺伝子断片を増幅した。また、合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｒ４０９Ｋ）領域の遺伝子断片を合成した。Ｎ５ＬＧ４ＰＥ＿ＭＯＧ０１を鋳型として、ＭＯＧ０１軽鎖領域の遺伝子断片とＭＯＧ０１　ＶＨ領域の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅した。
　得られた遺伝子断片をｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ｐＣＩ－ＭＯＧ０１－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＳＭベクターを作製した。合成遺伝子を鋳型として、ＰＣＲによりＣＨ２－ＣＨ３領域の遺伝子断片を増幅した。ＣＨ２－ＣＨ３領域とｌｉｎｋｅｒ－ＡＳＭ領域の遺伝子断片をｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターのＰｍｌＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＳＭを作製した。
　ｐＣＩ－ＭＯＧ０１－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＳＭとｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＳＭを実施例６に示す方法で発現、精製した。ｐＣＩ－ＭＯＧ０１－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＳＭを発現させて得た抗体をＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭ、ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＳＭを発現させて得た抗体をＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭと命名した。
［実施例２５］酵素融合抗体の活性評価
　ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭのＭＯＧ発現細胞への結合性を実施例２３と同様の方法により確認した結果を図２６に示す。また、ＭＯＧ可溶性抗原への結合性を実施例８と同様の方法により確認した結果、ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭの解離定数（ＫＤ値）は２．９×１０－９（Ｍ）であり、良好なアフィニティーを示した。
　作製したＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭおよびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭへ、抗ＡＳＭ抗体（ＬＳＢｉｏ社製）が結合することを以下に示すＥＬＩＳＡ法で確認した。
　ＥＬＩＳＡでは、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＮＵＮＣ社製）にＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭおよびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭを固相化（１００ｎｇ／５０μＬ）し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ　Ｂｌｏｃｋｉｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いてＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭおよびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭが結合していない部位をブロックした。ネガティブコントロールとして、抗ＭＯＧ０１ＩｇＧ抗体および抗ＡＶＭＩｇＧ抗体を固相化（５０ｎｇ／５０μＬ）したプレートも用意した。各ウェルに０．２、１、５μｇ／ｍＬの濃度にＰＢＳ－Ｔで希釈した抗ＡＳＭ抗体を加え、室温下で１時間反応させた後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄した。
　次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗Ｍｏｕｓｅ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ抗体（Ｄａｋｏ社製）をＰＢＳ－Ｔで希釈した溶液を各ウェルに加え、室温下１時間反応させた。ＴＭＢ発色基質液（ＤＡＫＯ社製）を加え、室温下でインキュベートした。各ウェルに２Ｍ塩酸を加えて発色反応を止め、波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度を測定した。得られた結果を図２７に示す。
　図２７に示すように、作製したＡＳＭ融合抗体は、抗ＡＳＭ抗体によって認識され、結合されることが示された。また、作製したＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭおよびＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭのスフィンゴミエリナーゼ活性をスフィンゴミエリナーゼ活性測定キット（Ｅｃｈｅｌｏｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて測定した結果、作製したＡＳＭ融合抗体が酵素活性を有していることが確認された。
　以上の結果から、ＭＯＧ抗体に酵素を融合させた酵素融合抗体は抗原結合活性、酵素活性いずれも保持されていることが確認された。
［実施例２６］酵素融合抗体のマウス脳移行性評価
　実施例２４で得たＡＳＭ融合抗体のマウス脳移行性を実施例１４と同様の方法で評価した。ＡＳＭ融合抗体を５ｍｇ／ｋｇで投与し、１０日後での血清中抗体濃度および脳組織中の単位脳重量あたりの抗体量を図２８に示す。
　図２８に示すように、ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭは、ＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭと比較して血清中の抗体濃度に差はなかった。一方で、ＭＯＧ０１　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭではＡＶＭ　ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ＡＳＭと比較して約５８倍に脳内の抗体量が高まることが示された。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年１２月２６日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６－２５１１０６号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号３－人工配列の説明：シグナル配列を除いたＭＯＧ０１のＶＨのアミノ酸配列
配列番号４－人工配列の説明：ＭＯＧ０１のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５－人工配列の説明：ＭＯＧ０１のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６－人工配列の説明：ＭＯＧ０１のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号９－人工配列の説明：シグナル配列を除いたＭＯＧ０１のＶＬのアミノ酸配列
配列番号１０－人工配列の説明：ＭＯＧ０１のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１１－人工配列の説明：ＭＯＧ０１のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１２－人工配列の説明：ＭＯＧ０１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１５－人工配列の説明：シグナル配列を除いたＭＯＧ０９のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１６－人工配列の説明：ＭＯＧ０９のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１７－人工配列の説明：ＭＯＧ０９のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１８－人工配列の説明：ＭＯＧ０９のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２１－人工配列の説明：シグナル配列を除いたＭＯＧ０９のＶＬのアミノ酸配列
配列番号２２－人工配列の説明：ＭＯＧ０９のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２３－人工配列の説明：ＭＯＧ０９のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２４－人工配列の説明：ＭＯＧ０９のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２７－人工配列の説明：シグナル配列を除いたＭＯＧ１４のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２８－人工配列の説明：ＭＯＧ１４のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２９－人工配列の説明：ＭＯＧ１４のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３０－人工配列の説明：ＭＯＧ１４のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３３－人工配列の説明：シグナル配列を除いたＭＯＧ１４のＶＬのアミノ酸配列
配列番号３４－人工配列の説明：ＭＯＧ１４のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３５－人工配列の説明：ＭＯＧ１４のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３６－人工配列の説明：ＭＯＧ１４のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３７－人工配列の説明：シグナル配列を含むｉＭＯＧ＿３Ｒｉｍ１＿Ｓ３２のＶＨＨの塩基配列
配列番号３８－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３９－人工配列の説明：シグナル配列を除いたｉＭＯＧ＿３Ｒｉｍ１＿Ｓ３２のＶＨＨのアミノ酸配列
配列番号４０－人工配列の説明：ｉＭＯＧ＿３Ｒｉｍ１＿Ｓ３２のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４１－人工配列の説明：ｉＭＯＧ＿３Ｒｉｍ１＿Ｓ３２のＣＤＲ２のアミノ酸配列配
列番号４２－人工配列の説明：ｉＭＯＧ＿３Ｒｉｍ１＿Ｓ３２のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４３－人工配列の説明：プライマー１の塩基配列
配列番号４４－人工配列の説明：プライマー２の塩基配列
配列番号４５－人工配列の説明：プライマー３の塩基配列
配列番号４６－人工配列の説明：プライマー４の塩基配列
配列番号４７－人工配列の説明：プライマー５の塩基配列
配列番号４８－人工配列の説明：プライマー６の塩基配列
配列番号４９－人工配列の説明：プライマー７の塩基配列
配列番号５０－人工配列の説明：プライマー８の塩基配列
配列番号５１－人工配列の説明：プライマー９の塩基配列
配列番号５２－人工配列の説明：プライマー１０の塩基配列
配列番号５３－人工配列の説明：プライマー１１の塩基配列
配列番号５４－人工配列の説明：プライマー１２の塩基配列
配列番号５５－人工配列の説明：プライマー１３の塩基配列
配列番号５６－人工配列の説明：プライマー１４の塩基配列
配列番号５７－人工配列の説明：プライマー１５の塩基配列
配列番号５８－人工配列の説明：プライマー１６の塩基配列
配列番号５９－人工配列の説明：プライマー１７の塩基配列
配列番号６０－人工配列の説明：プライマー１８の塩基配列
配列番号６１－人工配列の説明：プライマー１９の塩基配列
配列番号６２－人工配列の説明：プライマー２０の塩基配列
配列番号６３－人工配列の説明：プライマー２１の塩基配列
配列番号６４－人工配列の説明：プライマー２２の塩基配列
配列番号６５－人工配列の説明：プライマー２３の塩基配列
配列番号６６－人工配列の説明：プライマー２４の塩基配列
配列番号６９－人工配列の説明：ｒＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃの塩基配列
配列番号７０－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号７１－人工配列の説明：ｒＭＯＧ－ＧＳＴの塩基配列
配列番号７２－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号７９－人工配列の説明：プライマー２５の塩基配列
配列番号８０－人工配列の説明：プライマー２６の塩基配列
配列番号８１－人工配列の説明：プライマー２７の塩基配列
配列番号８２－人工配列の説明：プライマー２８の塩基配列
配列番号８３－人工配列の説明：プライマー２９の塩基配列
配列番号８４－人工配列の説明：プライマー３０の塩基配列
配列番号８５－人工配列の説明：プライマー３１の塩基配列
配列番号８６－人工配列の説明：プライマー３２の塩基配列
配列番号８７－人工配列の説明：プライマー３３の塩基配列
配列番号８８－人工配列の説明：プライマー３４の塩基配列
配列番号８９－人工配列の説明：プライマー３５の塩基配列
配列番号９０－人工配列の説明：プライマー３６の塩基配列
配列番号９１－人工配列の説明：プライマー３７の塩基配列
配列番号９２－人工配列の説明：プライマー３８の塩基配列
配列番号９３－人工配列の説明：プライマー３９の塩基配列
配列番号９４－人工配列の説明：プライマー４０の塩基配列
配列番号９５－人工配列の説明：プライマー４１の塩基配列
配列番号９６－人工配列の説明：プライマー４２の塩基配列
配列番号９７－人工配列の説明：プライマー４３の塩基配列
配列番号９８－人工配列の説明：ｈＨＥＲ２－ＧＳＴの塩基配列
配列番号９９－人工配列の説明：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号１００－人工配列の説明：ｈＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃの塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号１０１－人工配列の説明：ｈＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃのアミノ酸配列（シグナル配列含む）
配列番号１０２－人工配列の説明：ｍＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃの塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号１０３－人工配列の説明：ｍＭＯＧ－ＦＬＡＧ－Ｆｃのアミノ酸配列（シグナル配列含む）
配列番号１０４－人工配列の説明：ｈＭＯＧ－ＧＳＴの塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号１０５－人工配列の説明：ｈＭＯＧ－ＧＳＴのアミノ酸配列（シグナル配列含む）
配列番号１０６－人工配列の説明：ｍＭＯＧ－ＧＳＴの塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号１０７－人工配列の説明：ｍＭＯＧ－ＧＳＴのアミノ酸配列（シグナル配列含む）
配列番号１０８－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ＦＬＡＧ　ｔａｇの抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１０９－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ＦＬＡＧ　ｔａｇの抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１１０－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＭＯＧ０１－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇの抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１１１－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＭＯＧ０１－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇの抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１１２－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ＶＬ－ＣＬの抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１１３－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ＶＬ－ＣＬの抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１１４－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＭＯＧ０１ＶＨ－ＣＨの抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１１５－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＭＯＧ０１ＶＨ－ＣＨの抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１１６－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇの抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１１７－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇの抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１１８－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇの抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１１９－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）－Ｈｉｓ　ｔａｇの抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１２０－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ２の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１２１－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ２の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１２２－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ３の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１２３－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ３の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１２４－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ４の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１２５－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ４の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１２６－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ５の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１２７－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ５の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１２８－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ６の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１２９－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ６の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１３０－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ７の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１３１－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ７の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１３２－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ８の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１３３－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ８の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１３４－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ９の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１３５－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ９の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１３６－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ１０の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１３７－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ１０の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１３８－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ１１の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１３９－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＭＯＧ０１ｓｃＦｖ１１の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１４０－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭＶＬ－ＣＬの抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１４１－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭＶＬ－ＣＬの抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１４２－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭＶＨ－ＣＨの抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１４３－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭＶＨ－ＣＨの抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１４４－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇの抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１４５－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ）－ｌｉｎｋｅｒ－ＡＶＭｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ　ｔａｇの抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１４６－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖ３の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１４７－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖ３の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１４８－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖ５の抗体配列の塩基配列（シグナル配列除く）
配列番号１４９－人工配列の説明：ｐＣＩ－ＡＶＭ－ｈＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ＡＶＭｓｃＦｖ５の抗体配列のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１５０－人工配列の説明：Ａｃｉｄ　Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ（ＡＳＭ）の塩基配列
配列番号１５１－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１５２－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１５３－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１５４－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１５５－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１５６－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１５７－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１５８－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１５９－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１６０－人工配列の説明：ＭＯＧ３０１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１６１－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１６２－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１６３－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１６４－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１６５－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１６６－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１６７－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１６８－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１６９－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１７０－人工配列の説明：ＭＯＧ３０３のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１７１－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１７２－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１７３－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１７４－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１７５－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１７６－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１７７－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１７８－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１７９－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１８０－人工配列の説明：ＭＯＧ３０７のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１８１－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１８２－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１８３－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１８４－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１８５－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１８６－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１８７－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１８８－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１８９－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１９０－人工配列の説明：ＭＯＧ３１０のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１９１－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１９２－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１９３－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１９４－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１９５－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１９６－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号１９７－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号１９８－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１９９－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２００－人工配列の説明：ＭＯＧ３１２のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２０１－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２０２－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２０３－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２０４－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２０５－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２０６－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２０７－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２０８－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２０９－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２１０－人工配列の説明：ＭＯＧ３２６のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２１１－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２１２－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２１３－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２１４－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２１５－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２１６－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２１７－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２１８－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２１９－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２２０－人工配列の説明：ＭＯＧ３２９のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２２１－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２２２－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２２３－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２２４－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２２５－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２２６－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２２７－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２２８－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２２９－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２３０－人工配列の説明：ＭＯＧ４４６のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２３１－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２３２－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２３３－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２３４－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２３５－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２３６－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２３７－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２３８－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２３９－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２４０－人工配列の説明：ＭＯＧ４５６のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２４１－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２４２－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２４３－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２４４－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２４５－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２４６－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２４７－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２４８－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２４９－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２５０－人工配列の説明：ＭＯＧ４７３のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２５１－人工配列の説明：ＭＯＧ４２６のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２５２－人工配列の説明：ＭＯＧ４２６のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２５３－人工配列の説明：ＭＯＧ４２６のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２５４－人工配列の説明：ＭＯＧ４２６のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２５５－人工配列の説明：ＭＯＧ４２８のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２５６－人工配列の説明：ＭＯＧ４２８のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２５７－人工配列の説明：ＭＯＧ４２８のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２５８－人工配列の説明：ＭＯＧ４２８のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２５９－人工配列の説明：ＭＯＧ３１３のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２６０－人工配列の説明：ＭＯＧ３１３のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２６１－人工配列の説明：ＭＯＧ３１３のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２６２－人工配列の説明：ＭＯＧ３１３のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２６３－人工配列の説明：ＭＯＧ３１４のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２６４－人工配列の説明：ＭＯＧ３１４のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２６５－人工配列の説明：ＭＯＧ３１４のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２６６－人工配列の説明：ＭＯＧ３１４のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２６７－人工配列の説明：ＭＯＧ３１５のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２６８－人工配列の説明：ＭＯＧ３１５のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２６９－人工配列の説明：ＭＯＧ３１５のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２７０－人工配列の説明：ＭＯＧ３１５のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２７１－人工配列の説明：ＭＯＧ３３１のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２７２－人工配列の説明：ＭＯＧ３３１のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２７３－人工配列の説明：ＭＯＧ３３１のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２７４－人工配列の説明：ＭＯＧ３３１のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２７５－人工配列の説明：ＭＯＧ３５７のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２７６－人工配列の説明：ＭＯＧ３５７のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２７７－人工配列の説明：ＭＯＧ３５７のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２７８－人工配列の説明：ＭＯＧ３５７のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２７９－人工配列の説明：ＭＯＧ４７６のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２８０－人工配列の説明：ＭＯＧ４７６のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２８１－人工配列の説明：ＭＯＧ４７６のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２８２－人工配列の説明：ＭＯＧ４７６のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２８３－人工配列の説明：ＭＯＧ３２３のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２８４－人工配列の説明：ＭＯＧ３２３のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２８５－人工配列の説明：ＭＯＧ３２３のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２８６－人工配列の説明：ＭＯＧ３２３のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２８７－人工配列の説明：ＭＯＧ３４１のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２８８－人工配列の説明：ＭＯＧ３４１のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２８９－人工配列の説明：ＭＯＧ３４１のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２９０－人工配列の説明：ＭＯＧ３４１のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２９１－人工配列の説明：ＭＯＧ３５４のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２９２－人工配列の説明：ＭＯＧ３５４のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２９３－人工配列の説明：ＭＯＧ３５４のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２９４－人工配列の説明：ＭＯＧ３５４のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２９５－人工配列の説明：ＭＯＧ３５５のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２９６－人工配列の説明：ＭＯＧ３５５のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２９７－人工配列の説明：ＭＯＧ３５５のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号２９８－人工配列の説明：ＭＯＧ３５５のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号２９９－人工配列の説明：ＭＯＧ３０８のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３００－人工配列の説明：ＭＯＧ３０８のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３０１－人工配列の説明：ＭＯＧ３０８のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３０２－人工配列の説明：ＭＯＧ３０８のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３０３－人工配列の説明：ＭＯＧ３１６のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３０４－人工配列の説明：ＭＯＧ３１６のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３０５－人工配列の説明：ＭＯＧ３１６のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３０６－人工配列の説明：ＭＯＧ３１６のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３０７－人工配列の説明：ＭＯＧ３１９のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３０８－人工配列の説明：ＭＯＧ３１９のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３０９－人工配列の説明：ＭＯＧ３１９のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３１０－人工配列の説明：ＭＯＧ３１９のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３１１－人工配列の説明：ＭＯＧ３２０のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３１２－人工配列の説明：ＭＯＧ３２０のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３１３－人工配列の説明：ＭＯＧ３２０のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３１４－人工配列の説明：ＭＯＧ３２０のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３１５－人工配列の説明：ＭＯＧ３３８のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３１６－人工配列の説明：ＭＯＧ３３８のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３１７－人工配列の説明：ＭＯＧ３３８のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３１８－人工配列の説明：ＭＯＧ３３８のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３１９－人工配列の説明：ＭＯＧ３５２のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３２０－人工配列の説明：ＭＯＧ３５２のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３２１－人工配列の説明：ＭＯＧ３５２のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３２２－人工配列の説明：ＭＯＧ３５２のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３２３－人工配列の説明：ＭＯＧ３５９のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３２４－人工配列の説明：ＭＯＧ３５９のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３２５－人工配列の説明：ＭＯＧ３５９のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３２６－人工配列の説明：ＭＯＧ３５９のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３２７－人工配列の説明：ＭＯＧ４７８のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３２８－人工配列の説明：ＭＯＧ４７８のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３２９－人工配列の説明：ＭＯＧ４７８のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３３０－人工配列の説明：ＭＯＧ４７８のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３３１－人工配列の説明：ＭＯＧ４７０のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３３２－人工配列の説明：ＭＯＧ４７０のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３３３－人工配列の説明：ＭＯＧ４７０のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３３４－人工配列の説明：ＭＯＧ４７０のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３３５－人工配列の説明：ＭＯＧ４１８のＶＨ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３３６－人工配列の説明：ＭＯＧ４１８のＶＨ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列
配列番号３３７－人工配列の説明：ＭＯＧ４１８のＶＬ（シグナル配列を除く）をコードする塩基配列
配列番号３３８－人工配列の説明：ＭＯＧ４１８のＶＬ（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列

Claims (22)

  1. 　ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（以下ＭＯＧと記載）に結合する抗体または該抗体断片。
  2. 　抗体が脳滞留性を有する請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
  3. 　抗体が下記（ａ）～（ｒ）からなる群より選ばれる１である、請求項１または２に記載の抗体または該抗体断片。
    （ａ）重鎖可変領域（以下ＶＨと記載する）の相補性決定領域（以下、ＣＤＲ）１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４、５および６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｂ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６、１７および１８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２２、２３および２４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｃ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２８、２９および３０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３４、３５および３６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｄ）重鎖抗体の重鎖可変領域（以下ＶＨＨと記載する）のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４０、４１および４２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
    （ｅ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５３、１５４および１５５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５８、１５９および１６０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｆ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６３、１６４および１６５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１６８、１６９および１７０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｇ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７３、１７４および１７５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７８、１７９および１８０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｈ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１８３、１８４および１８５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１８８、１８９および１９０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｉ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１９３、１９４および１９５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１９８、１９９および２００に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｊ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２０３、２０４および２０５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２０８、２０９および２１０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｋ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２１３、２１４および２１５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２１８、２１９および２２０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｌ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２２３、２２４および２２５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２２８、２２９および２３０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｍ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３３、２３４および２３５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３８、２３９および２４０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｎ）ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２４３、２４４および２４５に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２４８、２４９および２５０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ）前記（ａ）～（ｎ）に記載の少なくとも１つの抗体と、ＭＯＧへの結合について競合する抗体、
    （ｐ）前記（ａ）～（ｎ）に記載のいずれか１つの抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体、および
    （ｑ）前記（ａ）～（ｎ）に記載のいずれか１つの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
    （ｒ）前記（ａ）～（ｎ）に記載のいずれか１つの抗体のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体。
  4. 　抗体が下記（ａ）～（ｎ）、（ｏ１）～（ｏ２２）および（ｐ）からなる群より選ばれる１である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
    （ａ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｂ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５に記載されるアミノ酸配列含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｃ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｄ）ＶＨＨのアミノ酸配列が配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体断片、
    （ｅ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１５２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１５７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｆ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１６２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１６７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｇ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１７２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１７７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｈ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１８２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１８７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｉ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１９２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号１９７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｊ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２０７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｋ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２１２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２１７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｌ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２２２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２２７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｍ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２３２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２３７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｎ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２４２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２４７に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２５２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２５４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２５６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２５８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ３）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２６０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ４）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２６４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ５）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２６８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ６）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２７２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２７６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２７８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２８０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２８２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２８４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２８６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２８８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２９２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２９６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２９８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１３）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３００に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３０２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１４）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３０４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３０６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１５）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３０８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１６）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３１２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３１４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１７）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３１６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３１８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１８）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３２２に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ１９）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２４に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３２６に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ２０）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３２８に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３０に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｏ２１）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３３２に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３４に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、および
    （ｏ２２）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号３３６に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号３３８に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
    （ｐ）前記（ａ）～（ｎ）及び（о１）～（о２２）に記載のいずれか１つの抗体のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体。
  5. 　抗体または該抗体断片がバイスペシフィック抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
  6. 　バイスペシフィック抗体がＭＯＧと脳に存在する抗原に結合する、請求項５に記載のバイスペシフィック抗体。
  7. 　バイスペシフィック抗体がＭＯＧに結合する抗原結合部位と、脳に存在する抗原に結合する抗原結合部位とを含む、請求項５または６に記載のバイスペシフィック抗体。
  8. 　抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、ＶＨＨおよびＣＤＲを含むペプチドからなる群より選ばれる１である、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体断片。
  9. 　抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片。
  10. 　抗体がマウス抗体、ラット抗体、ラビット抗体、アルパカ抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群より選ばれる１である、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のＭＯＧに結合する抗体または該抗体断片に、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つを結合させた融合抗体または融合抗体断片。
    （ａ）親水性高分子、
    （ｂ）両親媒性高分子、および
    （ｃ）機能性分子。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
  13. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体をコードする塩基配列を含む核酸。
  14. 　請求項１３に記載の核酸を含むベクターを含む形質転換細胞。
  15. 　請求項１２に記載のハイブリドーマまたは請求項１４に記載の形質転換細胞を培養し、培養液から請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を採取することを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
  16. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を含む、組成物。
  17. 　脳に存在する抗原の検出または測定用の組成物である、請求項１６に記載の組成物。
  18. 　脳疾患の診断または治療するための組成物である、請求項１６に記載の組成物。
  19. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体若しくは該抗体断片、または請求項１６に記載の組成物を用いて、脳に存在する抗原を検出または測定する方法。
  20. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体若しくは該抗体断片、または請求項１６に記載の組成物を用いて、脳疾患を診断または治療する方法。
  21. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片若しくは融合抗体または融合抗体断片、または請求項１６に記載の組成物を用いて、抗体または該抗体断片若しくは融合抗体または融合抗体断片の脳滞留性を向上させる方法。
  22. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片若しくは融合抗体または融合抗体断片、または請求項１６に記載の組成物を用いて、脳内の抗体量または該抗体断片量若しくは融合抗体量または融合抗体断片量を増加させる方法。
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