CN112457415A - 靶向MOG的嵌合抗原受体、编码基因、CAR-Tregs细胞及其制备方法、用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种靶向MOG的嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体、CAR‑Tregs细胞及制备方法、用途，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号传导域；所述抗原结合结构域结合MOG，本发明CAR‑Tregs细胞为靶向MOG的嵌合抗原受体修饰的Treg细胞，可抑制特异性免疫反应，可用于预防和/或治疗多发性硬化症。

Description

靶向MOG的嵌合抗原受体、编码基因、CAR-Tregs细胞及其制备 方法、用途
技术领域
本发明涉及分子基因技术领域，具体涉及一种靶向MOG的嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体、CAR-Tregs细胞及制备方法、用途。
背景技术
多发性硬化(MS)是影响中枢神经系统的慢性退行性疾病，特征在于神经轴突的脱髓鞘。MS会造成众多生理和精神症状，并且通常发展为生理缺陷和认知功能障碍。疾病通常在年轻人(20至40岁)中发病，在女性中更常见，并且在世界范围内影响超过一百万人。
MS的病程各不相同，并且会潜伏或随时间稳步发展。已根据进展模式描述了MS的几种亚型。患有MS的人会患有几乎任何神经症状或迹象，包括知觉变化，如丧失敏感度或发麻、刺痛或麻痹(感觉迟钝和感觉异常)、肌肉虚弱、阵挛、肌肉痉挛或移动困难；协调和平衡困难(共济失调)；语言问题(构音障碍)或吞咽问题(吞咽困难)问题、视觉问题(眼球震颤、视神经炎(包括光幻视)或复视)、疲劳、急性或慢性疼痛以及膀胱和肠困难。
目前MS被认为是免疫介导性病症，其中人体自身的免疫系统攻击并损伤了髓鞘质。现有疗法在疾病侵袭(复发)后的功能恢复中、在防止或降低新的疾病侵袭(复发)的程度或频率中、或者在预防或降低残疾程度中是有效的。然而，很多现有MS疗法有副作用或耐受不良。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种靶向MOG的嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体、CAR-Tregs细胞及制备方法、用途，本发明CAR-Tregs细胞为靶向MOG的嵌合抗原受体修饰的Treg细胞，可抑制特异性免疫反应，可用于预防和/或治疗多发性硬化症。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号传导域；所述抗原结合结构域结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)。
优选的，所述抗原结合结构域为靶向MOG的单链抗体其包括串联的MOG单链抗体重链VH、MOG单链抗体轻链VL；MOG单链抗体重链VH位于所述靶向MOG的单链抗体的N端，MOG单链抗体轻链VL位于靶向所述MOG的单链抗体的C端；MOG单链抗体重链VH编码基因如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，MOG单链抗体轻链VL编码基因如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
MOG单链抗体重链VH和MOG单链抗体轻链VL通过连接肽连接。
优选的，所述连接肽为本领域常用的连接肽。
优选的，所述连接肽编码基因如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
优选的，所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽中的任意一种；所述铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和4-1BB铰链区中的一种或多种；所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区、DAP10跨膜区和4-1BB跨膜区中的一种或多种；所述共刺激因子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40和ICOS中的一种或多种；所述胞内信号传导域为CD28信号传导域或CD3ζ信号传导域。
优选的，所述信号肽为CD8信号肽，所述铰链区为CD8α铰链区和4-1BB铰链区，所述跨膜区为CD8跨膜区和4-1BB跨膜区，所述共刺激因子为4-1BB胞内信号域，所述胞内信号传导域为CD3ζ胞内信号域。
优选的，从N端到C端，所述嵌合抗原受体依次包括CD8信号肽、抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB铰链区、4-1BB跨膜区、4-1BB胞内信号域和CD3ζ信号传导域。
优选的，CD8信号肽编码基因如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
CD8α铰链区如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
CD8跨膜区如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
4-1BB铰链区如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
4-1BB跨膜区如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
4-1BB胞内信号域如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
CD3ζ信号传导域如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。
一种编码基因，其编码权利要求1～3中任意一项所述的嵌合抗原受体。
优选的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，包括上述的编码基因。
优选的，所述重组表达载体为慢病毒表达质粒。
本发明还提供了一种CAR-Tregs细胞，所述的CAR-Tregs细胞是上述的嵌合抗原受体修饰的Treg细胞。
本发明还提供了一种上述CAR-Tregs细胞的制备方法，包括：所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到Treg细胞中表达。
优选的，所述制备方法具体包括：
(1)靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建；
(2)靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒的制备；
(3)用步骤(2)制备好的靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒转染Treg细胞。
本发明提供了上述CAR-Tregs细胞在用于制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的用途。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
Treg细胞可抑制人体内T细胞的活化与增殖，是维持人体免疫耐受的重要因素。经嵌合抗原受体修饰后可抑制体内特定抗原引起的免疫反应，例如T细胞针对MOG抗原的活化和反应是引起多发性硬化症的重要原因，通过基因工程的手段使得Treg细胞特异性表达MOG抗原受体后，即靶向MOG的CAR-Treg细胞，回输人体后可特异性抑制人体内MOG抗原引起的免疫反应，达到治疗多发性硬化症的效果。
本发明提供了一种嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体、CAR-Tregs细胞及制备方法、用途，本发明CAR-Tregs细胞为靶向MOG的嵌合抗原受体修饰的Treg细胞，Treg细胞是一类控制体内免疫反应性的T细胞亚群，其通过主动调节的方式抑制存在于正常机体内潜在的反应性T细胞的活化与增殖，本发明通过基因工程的方法，将普通Treg细胞改造成CAR-Tregs细胞，使其具有抑制体内特异性免疫反应的功能。抗体序列设计的差异直接影响CAR-Tregs的结合效果，进一步影响其治疗相关病症的效果，本发明针对MOG抗原设计的单链抗体序列，得到的CAR-Tregs的结合效果好。
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)是免疫球蛋白超家族的一员，由218个氨基酸组成，是中枢神经系统髓鞘的组成部分。MOG在神经系统的发育中表达相对较晚，这提示其可能是少突胶质细胞成熟的重要表面标志，在维持髓鞘的完整性、促进细胞间信息交流中发挥重要作用。同时，多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是一种自身免疫介导的以中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为主要特点的疾病，脱髓鞘病变可累及白质、皮质、深层灰质，适应性免疫在该病的发病机理上有着关键的作用，且主要由T细胞介导。其发布机理涉及自身反应性T细胞识别髓鞘表位。活化的T细胞侵入中枢神经系统，招募外周单核吞噬细胞，并在大脑和脊髓组织中脱髓鞘，最终导致神经传递受损。
本发明CAR-Tregs可以特异性激活Treg细胞，通过Treg细胞对T细胞的抑制作用，明显特异性抑制T细胞针对MOG抗原刺激引起的活化和增殖反应，因此，MS患者可以中获益。本发明CAR-Tregs可用于制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的用途。
附图说明
图1为本发明嵌合抗原受体CAR-MOG示意图；
图2本发明慢病毒表达质粒pLenti6/V5-CAR-MOG示意图；
图3为实施例2细胞体外实验结果图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供了一种靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyteglycoprotein，MOG)的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号传导域；所述抗原结合结构域结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)。
优选的，所述抗原结合结构域为靶向MOG的单链抗体其包括串联的MOG单链抗体重链VH、MOG单链抗体轻链VL；MOG单链抗体重链VH位于所述靶向MOG的单链抗体的N端，MOG单链抗体轻链VL位于靶向所述MOG的单链抗体的C端；MOG单链抗体重链VH编码基因如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，MOG单链抗体轻链VL编码基因如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
MOG单链抗体重链VH和MOG单链抗体轻链VL通过连接肽连接。
优选的，所述连接肽为本领域常用的连接肽。
优选的，所述连接肽编码基因如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
优选的，所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽中的任意一种；所述铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和4-1BB铰链区中的一种或多种；所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区、DAP10跨膜区和4-1BB跨膜区中的一种或多种；所述共刺激因子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40和ICOS中的一种或多种；所述胞内信号传导域为CD28信号传导域或CD3ζ信号传导域。
优选的，所述信号肽为CD8信号肽，所述铰链区为CD8α铰链区和4-1BB铰链区，所述跨膜区为CD8跨膜区和4-1BB跨膜区，所述共刺激因子为4-1BB胞内信号域，所述胞内信号传导域为CD3ζ胞内信号域。
优选的，从N端到C端，所述嵌合抗原受体依次包括CD8信号肽、抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB铰链区、4-1BB跨膜区、4-1BB胞内信号域和CD3ζ信号传导域。
优选的，CD8信号肽编码基因如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
CD8α铰链区如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
CD8跨膜区如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
4-1BB铰链区如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
4-1BB跨膜区如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
4-1BB胞内信号域如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
CD3ζ信号传导域如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。
一种编码基因，其编码权利要求1～3中任意一项所述的嵌合抗原受体。
优选的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，包括上述的编码基因。
优选的，所述重组表达载体为慢病毒表达质粒。
本发明还提供了一种CAR-Tregs细胞，所述的CAR-Tregs细胞是上述的嵌合抗原受体修饰的Treg细胞。
本发明还提供了一种上述CAR-Tregs细胞的制备方法，包括：所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到Treg细胞中表达。
优选的，所述制备方法具体包括：
(1)靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建；
(2)靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒的制备；
(3)用步骤(2)制备好的靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒转染Treg细胞。
本发明提供了上述CAR-Tregs细胞在用于制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的用途。
实施例1
一、慢病毒表达质粒的构建
1、制备嵌合抗原受体的编码基因序列
制备CD8信号肽、靶向MOG的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB铰链区、4-1BB跨膜区、4-1BB胞内信号域和CD3ζ信号传导域的编码基因；
靶向MOG为靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyteglycoprotein，MOG)；
靶向MOG的单链抗体包括串联的MOG单链抗体重链VH、连接肽、MOG单链抗体轻链VL；MOG单链抗体重链VH位于所述靶向MOG单链抗体的N端，MOG单链抗体轻链VL位于靶向所述MOG的单链抗体的C端；MOG单链抗体重链VH编码基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，MOG单链抗体轻链VL编码基因如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述连接肽编码基因如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述CD8信号肽编码基因如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述CD8α铰链区编码基因如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；所述CD8跨膜区编码基因如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；所述4-1BB铰链区编码基因如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；所述4-1BB跨膜区编码基因如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；所述4-1BB胞内信号域编码基因如SEQ IDNO.9所示的核苷酸序列；所述CD3ζ信号传导域编码基因如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。
通过PCR的方法将Kozak序列、上述CD8信号肽、靶向HLA-A11的单链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB铰链区、4-1BB跨膜区、4-1BB胞内信号域和CD3ζ信号传导域序列的编码基因序列依次从N端到C端连接到一起，得到靶向MOG的嵌合抗原受体CAR-MOG的编码基因序列，所述CAR-MOG的编码基因包括如SEQIDNO：11所示的核苷酸序列。
Kozak序列如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。
图1为嵌合抗原受体CAR-MOG示意图。
2、构建入门克隆pENTR-CAR-MOG
EcoRI和BamHI双酶切CAR-MOG的编码基因序列(BamHⅠ酶切位点---Kozak序列---CD8αsp----MOG VL----Linker----MOG VH---CD8αHinge---CD8αTM---4-1BB Hinge---4-1BB TM---4-1BB胞内信号域---CD3ζ---EcoRⅠ酶切位点)，经T4DNA连接酶连接插入入门载体pENTR载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间(pENTR载体为骨架，利用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化去除其上的GUS基因)，入门克隆pENTR-CAR-MOG。
将入门克隆转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选转化后的阳性单菌落进行PCR鉴定，然后提取质粒，对入门克隆pENTR-CAR-MOG进行EcoRI和BamHI酶切鉴定及序列测定，测序反应鉴定序列正确无误，成功构建入门克隆pENTR-CAR-MOG。
3、利用LR重组反应构建慢病毒表达质粒pLenti6/V5-CAR-MOG
3.1、LR反应
(1)入门克隆pENTR-CAR-MOG与目的载体pLenti6.3/V5-DEST载体(带GFP荧光蛋白marker)在
Figure BDA0002834931260000091
LRQonaseTMU Plus酶混合物作用下进行体外重组反应
LR重组体系如表1所示，在10～30℃下将表1成分添加到15mL微量离心管中。且设一个单独的反应，但不使用
Figure BDA0002834931260000092
LR ClonaseTM II Plus酶混合物。
表1
Component Sample
Entry clone(50-150ng/reaction) 1-7μL
Destination vector(150ng/μL) IμL
TE Buffer,pH 8.0 to 8μL
Entry clone为入门克隆pENTR-CAR-MOG，Destination vector为目的载体pLenti6.3/V5-DEST载体,TEBuffer为缓冲液.
(2)在-20℃以下的温度下取出
Figure BDA0002834931260000093
LR ClonaseTM II Plus酶混合物，在冰上融化(约2分钟)。
(3)将
Figure BDA0002834931260000094
LR ClonaseTM II Plus酶混合物短暂涡旋两次，每次两次(每次2秒)。
(4)在上述样品中，添加
Figure BDA0002834931260000095
LR ClonaseTM II Plus酶混合物。通过上下移液均匀混合。注意：
Figure BDA0002834931260000096
LR ClonaseTM U Plus酶在使用后立即恢复至-20℃。
(5)将反应液在25℃孵育1小时。注意：将孵育时间延长至18小时通常会产生更多的菌落。
(6)在加入1μL蛋白酶K溶液至上述反应体系,37℃下孵育10分钟。
3.1、LR反应产物的转化步骤
(1)在冰上将一管E.coli感受态细胞(Invitrogen,Cat.No.C7373-03)解冻；
(2)加入2-3μl LR反应产物至感受态细胞悬液中，轻柔混匀(切勿用移液枪吹打)。冰上孵育30min，42℃水浴中热击处理30s，将反应管转移至冰上继续孵育2min；
(3)加入225μl室温下预温的S.O.C.培养基；
(4)将反应管盖紧后置于37℃水平摇床中225rpm转速下孵育1h；
(5)取出100μl转化产物均匀涂布到预热的LB平板(含氨苄青霉素)上，37℃培养箱中孵育过夜。
3.2、阳性克隆的筛选得到表达质粒pLenti6/V5-CAR-MOG
(1)用枪头蘸取1个菌落后，将枪头置于10μl无菌水中，反复吹打；重复上述步骤，挑取5-10个菌落进行后续PCR验证
(2)吸取1μl菌液用于PCR，扩增片段为CAR-MOG的编码基因序列长度
(3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在1.6kb(CAR-MOG的编码基因序列长度)处得到清晰的单一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养；
(4)用质粒DNA纯化试剂盒(Promega，Cat.No.A7500)从上述过夜培养的菌液中分离纯化质粒DNA即为慢病毒表达质粒pLenti6/V5-CAR-MOG，质粒结构图如图2所示，同时保存菌种。
二、靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒(pLenti6/V5-CAR-MOG慢病毒)的制备
1.1、试剂盒：
市售试剂盒：Thermo fisher公司的LV-MAXTM Lentiviral Production System
1.2制备方法：
以慢病毒表达质粒pLenti6/V5-CAR-MOG作为慢病毒表达载体，使用市售试剂盒，按照其说明书操作获得pLenti6/V5-CAR-MOG慢病毒。
三、Treg细胞分离
1、分选PBMC：
将50ml外周血分成5份，每份10ml，小心加入到等体积的淋巴细胞分离液的液面上，注意加血液过程中不要冲破液面，然后用离心机慢升慢降(速率调为1)，2000rpm离心20分钟。
吸取PBMC(中间白膜层)到新离心管中，用PBS洗涤2次即可
2、从PBMC中分选Treg细胞
2.1试剂盒：
市售试剂盒：美天旎公司的CD4+CD25+CD45RA+Regulatory T cell isolationkit；
2.2分选方法：
PBMC细胞采用美天旎公司的磁珠分选Treg细胞，按照人CD4+CD25+CD45RA+调节性T细胞分离试剂盒(美天旎公司的CD4+CD25+CD45RA+Regulatory T cell isolation ki)说明书内容分选Treg细胞。
四、靶向MOG的嵌合抗原受体慢病毒(pLenti6.3-CAR-MOG慢病毒)转染Treg细胞
1、采用pLenti6/V5-CAR-MOG慢病毒转染分离得到的Treg细胞得到MOG-CAR-Tregs。
(1)按照MOI＝10计算所需要的病毒量，加入到分离得到的Treg细胞中；
(2)培养24h后，更换不含病毒的新的细胞培养液，继续培养；
(3)在第5-6天，通过荧光显微镜观察(病毒质粒上带有GFP荧光蛋白)来评估感染效率-，感染效率>80％视为合格。
以未感染的Treg细胞作为阴性对照。
实施例2
效果验证
1.收集人外周血50ml，分离成熟DC细胞和T细胞。
2、采用市售MOG抗原，加入到DC细胞培养瓶中，让DC细胞摄食抗原。
3、进行淋巴细胞混合培养(MLR)实验，分成四组：第一组为T细胞，第二组为T细胞+摄食抗原后的DC细胞，第三组为T细胞+摄食抗原后的DC细胞+未转染的正常Treg细胞，第四组为T细胞+摄食抗原后的DC细胞+慢病毒转染后的Treg细胞(实施例1得到的MOG-CAR-Tregs细胞)
4、使用CCK8方法(试剂盒)检测T细胞增殖情况。
5、试验结果见图3，图3横坐标为培养时间，纵坐标为T细胞相对增殖率。其中，第一组和第四组的T细胞没有明显细胞增殖，而第二组的T细胞明显增殖，第三组的T细胞增殖受到一定抑制，培养72h后，第一组、第二组，第三组和第四组的相对平均增殖率为140％，238％，170％，130％，证实慢病毒转染后的Treg细胞可以明显特异性抑制T细胞针对MOG抗原刺激引起的活化和增殖反应，说明了本发明CAR-Tregs细胞发挥了很好的T细胞活性抑制功能，具有排斥反应的抑制能力。
本发明实施例中编码基因的核苷酸序列：
表2
Figure BDA0002834931260000121
Figure BDA0002834931260000131
Figure BDA0002834931260000141
Figure BDA0002834931260000151
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 成都仕康美生物科技有限公司
<120> 靶向MOG的嵌合抗原受体、编码基因、CAR-Tregs细胞及其制备方法、用途
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtgcagcct caggattcac tttcagtaac tatgccatgg cttgggtccg ccgggctcca 60
acgaagggtc tggagtgggt cgcatccatt agtaatggtg gtggtaacac ttactatcgc 120
gactccgtga agggccgatt cactatctcc agagatgatg caaaaaacac cctatacctg 180
caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaag acacgggaat 240
tatatatatt atgggtcctt ctttgattac tggggccaag gagtcatg 288
<210> 2
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag 60
acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 120
tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc ccagcacctg agttcgaggg gggaccatca 180
gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 240
acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 300
gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggag 345
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgt 57
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 5
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60
actctttact gt 72
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcaattgaag ttatgtatcc tcctccttac ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt 60
atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc 120
<210> 8
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
<210> 10
<211> 346
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctatcgctcc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca 60
gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa 120
gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg 180
cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa 240
aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac 300
caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 346
<210> 11
<211> 1643
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccatggtggc tgtgcagcct caggattcac tttcagtaac tatgccatgg cttgggtccg 60
ccgggctcca acgaagggtc tggagtgggt cgcatccatt agtaatggtg gtggtaacac 120
ttactatcgc gactccgtga agggccgatt cactatctcc agagatgatg caaaaaacac 180
cctatacctg caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaag 240
acacgggaat tatatatatt atgggtcctt ctttgattac tggggccaag gagtcatgat 300
ggagtttggg ctgagctggg ttttcctcgt tgctcttttt agaggtgtcc agtgttcagg 360
actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cgaagaccta 420
cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagtccaa 480
atatggtccc ccatgcccac catgcccagc acctgagttc gaggggggac catcagtctt 540
cctgttcccc ccaaaaccca aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg 600
cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg 660
cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag atggccttac cagtgaccgc 720
cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg ccgaccacga cgccagcgcc 780
gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc 840
gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat 900
ctacatttgg gcccctctgg ctggtacttg cggggtcctg ctgctttcac tcgtgatcac 960
tctttactgt gcaattgaag ttatgtatcc tcctccttac ctagacaatg agaagagcaa 1020
tggaaccatt atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca agtcccctat ttcccggacc 1080
ttctaagccc ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct 1140
agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaagcgcggt cggaagaagc tgctgtacat 1200
ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa gaggaggacg gctgttcatg 1260
ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcta tcgctccaga gtgaagttca 1320
gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca 1380
atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga 1440
tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag 1500
ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg 1560
ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc 1620
acatgcaggc cctgccccct cgc 1643
<210> 12
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccatggtggc 10

Claims (10)

1.一种靶向MOG的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号传导域；所述抗原结合结构域结合MOG。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域为靶向MOG的单链抗体其包括串联的MOG单链抗体重链VH、MOG单链抗体轻链VL；MOG单链抗体重链VH位于所述靶向MOG的单链抗体的N端，MOG单链抗体轻链VL位于靶向所述MOG的单链抗体的C端；MOG单链抗体重链VH编码基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，MOG单链抗体轻链VL编码基因如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
MOG单链抗体重链VH和MOG单链抗体轻链VL通过连接肽连接。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽中的任意一种；所述铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1FcCH2CH3铰链区、IgG4FcCH2CH3铰链区和4-1BB铰链区中的一种或多种；所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区、DAP10跨膜区和4-1BB跨膜区中的一种或多种；所述共刺激因子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40和ICOS中的一种或多种；所述胞内信号传导域为CD28信号传导域或CD3ζ信号传导域。
4.一种编码基因，其编码权利要求1～3中任意一项所述的嵌合抗原受体。
5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。
6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求4所述的编码基因。
7.一种CAR-Tregs细胞，其特征在于，所述的CAR-Tregs细胞是所述权利要求1～3任意一项所述的嵌合抗原受体修饰的Treg细胞。
8.一种权利要求7所述CAR-Tregs细胞的制备方法，其特征在于，包括：所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到Treg细胞中表达。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体包括：
(1)靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建；
(2)靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒的制备；
(3)用步骤(2)制备好的靶向HLA-A的嵌合抗原受体慢病毒转染Treg细胞。
10.权利要求7所述的CAR-Tregs细胞在用于制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的用途。
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