KR102609667B1 - 비통합성 바이러스 전달 시스템 및 이와 관련된 방법 - Google Patents

비통합성 바이러스 전달 시스템 및 이와 관련된 방법 Download PDF

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Abstract

비통합성 바이러스 전달 시스템이 개시된다. 시스템은 바이러스 운반체를 포함하고, 여기서 바이러스 운반체는 결함성 인테그라제 유전자, 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원; 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열로서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성인 서열; 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 함유한다.

Description

비통합성 바이러스 전달 시스템 및 이와 관련된 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 그 개시내용이 참조로 본 명세서에 편입되는 "비통합성 바이러스 전달 시스템 및 이의 사용 방법"이라는 발명의 명칭으로 2016년 6월 8일 출원된 미국 가출원 제62/347,552호, "비통합성 바이러스 전달 시스템 및 이와 관련된 방법"이라는 발명의 명칭으로 2016년 12월 8일 출원된 미국 가출원 제62/431,760호, 및 "비통합성 바이러스 전달 시스템 및 이와 관련된 방법"이라는 발명의 명칭으로 2016년 12월 12일 출원된 국제 특허 출원 PCT/US16/66185에 대해 우선권을 청구한다.
분야
본 개시내용은 대체로 유전자의 전달 및 다른 치료, 진단 또는 연구 용도를 위한 바이러스 벡터 및 시스템의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용의 구체예는 유전자의 전달 및 다른 치료, 진단 또는 연구 용도를 위한 비통합성 바이러스 벡터 및 시스템에 관한 것이다.
바이러스 벡터는 그들의 특이적 바이러스 엔벨로프-숙주 세포 수용체 상호작용 및 유전자 발현을 위한 바이러스 기전때문에 표적 세포로 유전자 및 다른 치료적 핵산 구성체를 형질도입시키는데 사용되어 왔다. 그 결과로서, 바이러스 벡터는 제한없이, 단리된 조직 샘플, 제자리 조직 표적 및 배양된 세포주를 포함하는 많은 상이한 세포 유형으로 유전자의 전달을 위한 비히클로서 사용되고 있다. 세포로 외래 유전자를 도입시켜 발현시키는 능력은 유전자 발현 및 세포 계통 및 경로의 해명을 비롯하여 치료적 중재술 예컨대 유전자 요법 및 다양한 유형의 면역요법에 대한 잠재성을 제공하는 연구에서 유용하다.
렌티바이러스, 쥣과동물 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연합 바이러스를 포함한 몇몇 바이러스 시스템은 잠재적인 치료적 유전자 전달 벡터로서 제안되었다. 그러나, 많은 장애가 승인된 치료제로서 이들의 활발한 이용을 방해하였다. 연구 및 개발 장애는 제한없이, 발현의 안정성 및 제어, 게놈 패키징 능력, 및 구성체-의존적 벡터 안정성을 포함한다. 또한, 바이러스 벡터의 생체내 적용은 유해한 항-벡터 면역학적 효과를 초래할 수 있는, 바이러스 구조 단백질 및/또는 형질도입 유전자 산물에 대한 숙주 면역 반응에 의해 제한될 수 있다.
연구자들은 이들 장애의 일부를 극복하려는 방식으로 안정한 발현 시스템을 찾고자 시도하고 있다. 한 접근법은 이러한 발현 시스템으로, 소형 RNA를 포함하여, 재조합 폴리펩티드 또는 유전자 조절 분자를 이용한다. 이들 시스템은 숙주 세포의 게놈으로 형질도입된 레트로바이러스 게놈 또는 적어도 이의 일부분의 염색체 통합을 채택한다. 이들 접근법의 중요한 한계는 유전자 통합 부위가 일반적으로 무작위적이고 임의의 특정한 부위에서 통합되는 유전자의 수 및 비율이 종종 예측불가능하다는 것이다. 따라서, 염색체 통합에 의존하는 벡터는 치료 간격을 초과할 수 있는 재조합 유전자의 영구적인 유지를 초래하고, 플라스미드 또는 다른 비복제성 DNA가 불충분하게 제어되고 바람직한 치료 간격을 완료하기 전에 붕괴될 수 있다.
다른 접근법은 일시적 발현 시스템의 사용이다. 일시적 발현 시스템 하에서, 관심 유전자의 발현은 비통합성 플라스미드를 기반으로 하며, 그런 이유로 발현은 전형적으로 세포가 후속 분열을 겪으면서 상실되거나 또는 플라스미드 벡터가 내생성 뉴클레아제에 의해 파괴된다. 따라서, 일시적 유전자 발현 시스템은 전형적으로 시간 경과에 따라 충분한 발현을 야기하지 않고 전형적으로 반복된 치료를 요구하며, 이것은 일반적으로 바람직하지 않은 특성으로 이해된다.
안정한 바이러스 전달 시스템 및 방법이 제공된다. 다양한 양상에서, 전달 시스템은 일시적 발현 시스템을 포함한다. 일 양상에 따라서, 전달 시스템은 비통합성이다. 다른 양상에서 전달 시스템은 비통합적이고 일시적이다.
다양한 양상 및 구체예에서, 시스템은 다양하게 바이러스 운반체 중 하나 또는 전부를 포함하고, 여기서 바이러스 운반체는 결함성 인테그라제 유전자; 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원; 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열로서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성인 서열; 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 함유한다. 바이러스 운반체는 렌티바이러스일 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 파필로마바이러스 유래일 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 인간 파필로마바이러스 또는 소 파필로마바이러스 유래일 수 있다.
이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 제16형 인간 파필로마바이러스 (HPV16) 유래일 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 긴 제어 영역 (LCR) 유래일 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 서열번호 1을 포함할 수 있다. 임의로, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 서열번호 1의 5' 절단형을 포함할 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 서열번호 1의 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 700개 뉴클레오티드의 5' 절단형을 포함할 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 LCR의 Frag 1 (서열번호 2) (본 명세서에서 단편 1이라고도 함), 또는 Frag 2 (서열번호 3) (본 명세서에서 단편 2라고도 함), 또는 Frag 3 (서열번호 4) (본 명세서에서 단편 3이라고도 함), 또는 Frag 4 (서열번호 5) (본 명세서에서 단편 4라고도 함)와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 포함할 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 LCR의 Frag 1 (서열번호 2), 또는 Frag 2 (서열번호 3), 또는 Frag 3 (서열번호 4), 또는 Frag 4 (서열번호 5)를 포함할 수 있다.
이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E1 또는 이의 작동성 단편을 포함할 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E2 또는 이의 작동성 단편을 포함할 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질은 EBNA-1 또는 이의 작동성 단편을 포함할 수 있다. 임의로, 시스템은 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질을 포함할 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질은 단독으로 또는 조합하여 E1 또는 E2, 또는 이의 작동성 단편을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열은 단일 개별 플라스미드 또는 비통합성 바이러스 벡터 상에 존재할 수 있다. 임의로, 시스템은 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 적어도 2종의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열은 단일 개별 플라스미드 또는 비통합성 바이러스 벡터 상에 존재할 수 있다. 임의로, 시스템은 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 제1 개시인자 단백질에 대한 서열 및 제2 개시인자 단백질에 대한 서열은 별개 플라스미드 또는 비통합성 바이러스 벡터 상에 존재할 수 있다.
개시된 비통합성 바이러스 전달 시스템과 관련하여, 적어도 하나의 유전자 산물은 항체, 항체 단편, 또는 성장 인자를 포함할 수 있다. 항체는 항-HER2 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. miRNA는 CCR5 miRNA를 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 약학 조성물이 개시된다. 약학 조성물은 본 명세서에 개시된 비통합성 바이러스 전달 시스템 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
다른 양상에서, 세포에서 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 발현하는 방법이 제공된다. 방법은 세포를 비통합성 바이러스 전달 시스템의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 시스템은 바이러스 운반체를 포함하고, 바이러스 운반체는 결함성 인테그라제 유전자; 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원; 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열로서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성인 서열; 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA 중 하나 또는 전부를 함유한다.
다른 양상에서, 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 이의 발현을 필요로 하는 대상체에서 발현하는 방법이 제공된다. 방법은 비통합성 바이러스 전달 시스템의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 시스템은 바이러스 운반체를 포함하고, 바이러스 운반체는 결함성 인테그라제 유전자; 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원; 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열로서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성인 서열; 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA 중 하나 또는 전부를 함유한다. 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열은 단일 개별 플라스미드 상에 존재할 수 있고, 적어도 하나의 개시인자 단백질은 단독으로 또는 조합하여 E1 또는 E2, 또는 이의 작동성 단편을 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 발현의 제1 수준을 개시시키기 위해 단일 개별 플라스미드의 제1 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 발현의 제2 수준을 개시하기 위해서 단일 개별 플라스미드의 제2 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 양이 제1 양보다 적은 상황에서, 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 발현의 수준은 감소될 수 있다. 제2 양이 제1 양보다 높은 경우에, 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 발현의 수준은 증가될 수 있다.
다른 양상에서, 본 명세서에서 개시하는 비통합성 바이러스 전달 시스템은 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 낮은 수준의 기초 발현을 생산하도록 최적화된다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 LCR의 서열번호 1 또는 Frag 1 (서열번호 2)와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98%의 서열 동일성을 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 비통합성 바이러스 전달 시스템은 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 낮은 수준의 기초 발현을 생산하도록 최적화되고, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 LCR의 서열번호 1 또는 Frag 1 (서열번호 2)을 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 비통합성 바이러스 전달 시스템은 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 중간 수준의 기초 발현을 생산하도록 최적화되고, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 LCR의 Frag 2 (서열번호 3), Frag 3 (서열번호 4), 또는 Frag 4 (서열번호 5)와 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 시스템은 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 중간 수준의 기초 발현을 생산하도록 최적화될 수 있고, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 LCR의 Frag 2 (서열번호 3), Frag 3 (서열번호 4), 또는 Frag 4 (서열번호 5)를 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 최적화된 비통합성 바이러스 전달 시스템을 선택하는 방법이 개시된다. 방법은 기초 발현의 수준을 선택하는 단계를 포함한다. 그 이후에, 수준 X가 선택되면, 상응하는 Y가 선택되고, 여기서 Y는 비통합성 바이러스 전달 시스템에 도입하기 위해 선택되는 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 해당되며, 그에 따라서 X = 카고의 기초 수준의 제1 확정 수준일 때; Y는 LCR (서열번호 1) 또는 Frag 1 (서열번호 2)을 포함하고; X = 카고의 기초 수준의 제2 확정 수준일 때; Y는 HPV16의 LCR의 Frag 2 (서열번호 3), Frag 3 (서열번호 4), 또는 Frag 4 (서열번호 5)를 포함한다. 구체예에서, 제1 확정 수준은 세포 당 0.020 미만의 카고의 에피솜 카피를 포함한다. 구체예에서, 제2 확정 수준은 세포 당 0.020 또는 그를 초과하는 카고의 에피솜 카피를 포함한다.
추가 양상은 예를 들어 감염성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 추가 양상은 감염성 질환을 예방하는 방법을 포함한다. 다른 양상에서, 상처 치유를 증강시키는 방법이 개시된다. 다른 양상에서, 뼈 손상을 치료하는 방법이 개시된다. 추가 양상은 본 명세서에 상술된 시스템을 사용하여 유전성 질환을 치료하는 방법을 포함한다.
상기의 일반 설명 및 하기의 구체적인 설명은 예시적이고 설명적인 것이며 청구된 본 발명의 추가 설명을 제공하고자 한다. 다른 목적, 장점 및 새로운 특성은 하기 도면의 간단한 설명 및 발명의 구체적인 설명을 통해서 당업자에게 쉽게 분명해질 것이다.
도 1은 예시적인 벡터-인-벡터 (VIV) 구체예를 도시한다. 도 1(A)는 벡터의 선형 형태를 도시하고 도 1(B)는 벡터의 원형 형태를 도시한다.
도 2는 E1 개시인자 단백질를 함유하는 예시적인 벡터-인-벡터 (VIV) 구체예 (본 명세서에서 벡터 1이라고도 함)를 도시한다.
도 3은 벡터 1을 사용한 3회의 별개 실험에 따른 293T 세포에서의 형질도입 결과를 도시한다.
도 4는 E1 및 E2 개시인자 단백질 둘 모두를 함유하는 예시적인 벡터-인-벡터 (VIV) 구체예 (본 명세서에서 벡터 19라고도 함)를 도시한다.
도 5는 개별적으로, (A) mCherry 및 (B) VEGF를 발현하는 예시적인 벡터-인-벡터 (VIV) 구체예를 도시한다.
도 6은 E1 및 E2가 개별적으로 플라스미드 (A) 또는 렌티바이러스 (B)에 의해 제공될 때 다양하게 기술된 구성체에 대한 mCherry-양성 세포의 발현을 도시한다.
도 7은 본 명세서에서 상술하는 실시예와 함께 사용되는 예시적인 벡터-인-벡터 (VIV) 구체예를 도시한다.
도 8은 HPV16 긴 제어 영역 (LCR)의 단편 1을 함유하는 다양하게 기술된 구성체에 대한 VEGF의 발현 수준을 도시한다.
도 9는 본 명세서에서 상술하는 실시예와 함께 사용되는 예시적인 벡터-인-벡터 (VIV) 구체예를 도시한다.
도 10은 비통합성 렌티바이러스 벡터의 에피솜 형태의 예시적인 다이아그램을 도시한다.
도 11은 HPV16의 LCR의 Frag 1, Frag 2, Frag 3, 및 Frag 4 간 게놈 관련성을 도시한다.
도 12는 본 명세서에 기술된 바와 같은 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터에서 HPV16 ori의 에피솜 카피수의 분석을 도시한다.
도 13은 (A) HPV LCR 및 3' 단편을 함유하는 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터로부터 mCherry 발현; 및 (B) 단일 벡터로부터 HPV16 E1-T2A-E2를 발현하거나 또는 발현하지 않는 인테그라제-결핍 벡터로부터 mCherry 발현의 분석을 도시한다.
도 14는 E1, E1-C, 및 E2-11의 첨가 이후에 HPV LCR을 함유하는 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터로부터 mCherry 발현의 분석을 도시한다.
도 15는 (A) 면역블롯; 및 (B) IgG 농도에 의해 결정되는, HPV LCR을 함유하는 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터를 사용한 항-HER2 항체의 발현을 도시한다.
도 16은 HPV ori 서열을 함유하는 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터를 사용한 항-EGFR 항체의 발현을 도시한다.
도 17은 HPV16의 전체 길이 LCR을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 CCR5 발현의 넉다운을 도시한다.
도 18은 HPV16의 LCR의 Frag 2를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용한 CCR5 발현의 넉다운을 도시한다.
도 19는 엡스타인-바 바이러스 (EBV) oriP 서열을 사용하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 세포에서 GFP의 발현을 도시한다.
도 20은 HVP16의 Frag 1, Frag 2, Frag 3, Frag 4, 및 전체 길이 LCR에 대한 기초 및 E1-E2-유도된 에피솜 카피수를 입증하는 개략도를 도시한다.
도 21은 본 명세서에서 상술되는 실시예에서 더욱 설명하는 바와 같이 상대적 구조-기능 활성에 관한 발견을 기반으로 LCR 단편 선택의 선택에 대한 구체예를 도시한다.
본 명세서는 안정한 바이러스 전달 시스템 및 방법을 개시한다. 다양한 양상에서, 전달 시스템은 일시적 발현 시스템을 포함한다. 일 양상에 따라서, 전달 시스템은 비통합적이다. 다른 양상에서 전달 시스템은 비통합적이고 일시적이다.
추가 양상에서, 비통합적인, 에피솜 복제성 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터) 및 이의 사용 방법이 제공된다. 본 개시내용의 에피솜 복제성 벡터는 파포바바이러스과 (예를 들어, 소 파필로마바이러스 또는 BPV) 또는 헤르페스바이러스과 (예를 들어, 엡스타인 바 바이러스 또는 EBV) 또는 헤파드나바이러스과 (예를 들어, B형 간염 바이러스 또는 HBV)와 같은 바이러스 유래의 바이러스 성분을 함유할 수 있다. 이들 바이러스로부터 유래된 에피솜 복제성 벡터는 복제 기원 및 적어도 하나의 바이러스 트랜스-작용성 인자, 예를 들어 개시인자 단백질, 예컨대 BPV의 경우 E1 및 EBV의 경우 EBNA-1 또는 HBV 폴리머라제 또는 아데노바이러스의 말단 결합 단백질을 함유할 수 있다. 에피솜 복제 과정은 전형적으로 숙주 세포 복제 기구 및 바이러스 트랜스-작용성 인자 둘 모두를 포함한다.
이종성 바이러스의 복제 기원을 사용함으로써, 신규 벡터는 복제 기원을 인식하는데 요구되는 바이러스 단백질의 발현을 위한 스위치를 "오프 (off)"하도록 조작될 수 있다. DNA 복제 스위치의 오프는 시간 경과에 따라 치료적 DNA 수준을 극적으로 강하시키게 될 것이다. 임의의 특정 이론에 한정하려는 것은 아니지만, 비복제성 DNA는 간단히 예를 들어 뉴클레아제 활성에 의해서 그리고 숙주 세포가 시간 경과에 따라 자연 아폽토시스 (세포 사멸) 사건을 겪게되면서 분해된다고 여겨진다. 결국 이러한 비복제성 DNA는 검출불가할 수 있고 시간 경과에 따라서 환자로부터 완전하게 또는 거의 청소될 수 있다.
개시된 시스템 및 방법은 형질도입된 유전자의 과발현 또는 장기간 발현에 의한 독성 및 독성 효과의 감소 또는 예방을 포함한다. DNA 복제가 중단되면 유전자의 제거는 향후 숙주 유전자 발현의 넉다운 또는 원치않는 유전자 발현을 방지한다. 유사하게, 이종성 바이러스 시스템으로 에피솜 복제의 이득의 조합은 다양한 세포 유형으로 관심 유전자를 안전하고 효율적으로 형질도입시킬 수 있는 플랫폼을 제공한다.
파필로마바이러스
파필로마바이러스는 포유동물 세포에서 주로 에피솜으로서 복제된다. DNA 복제의 바이러스 기원 (ori) 상에서 DNA 헬리카제로서 기능하는 바이러스 E1 단백질의 작용은 감염된 내피 세포의 분화 상태에 의존적으로 세포 당 수백 내지 수천의 DNA 카피의 생산을 구동시킨다. "셔틀 플라스미드"라고 알려지게 된 것을 사용하여 파필로마바이러스-기반 유전자 전달 시스템을 개발하려는 시도가 있어왔다. 포유동물 세포에서 에피솜 복제가 가능하도록 파필로마바이러스 ori 및 이. 콜라이 (E.coli)에서 DNA 생산을 가능케 하는 DNA 복제의 박테리아 기원에 의해서, 수많은 연구가 수행되어 유전자 발현의 안정성 및 내구성이 입증되었다. 대부분의 경우에서 ori는 소 파필로마바이러스로부터 비롯되었다.
파필로마바이러스는 상피 및 내피 세포를 감염하도록 진화되어 왔다. 감염된 세포가 기저로부터 내강 표면으로 분화되면서, 파필로마바이러스는 DNA 복제를 증가시키고 카피수는 엄청난 용량의 바이러스가 내강 표면에서 방출될 때까지 매우 높아진다. 이것은 인간 파필로마바이러스에서 분명하듯이 파필로마바이러스를 고도로 전염성으로 만든다. 카피수의 급증은 주로 숙주 인자에 기인한다. 그러나, 파필로마바이러스의 이러한 특성은 상피 및 내피 표면으로 일시적 유전자 요법을 표적화시키는데 이용될 수 있다.
파필로마바이러스의 일정한 특성은 특별한 세포 유형에 대해 벡터의 발현을 표적화시키는 것을 비롯하여, 에피솜 벡터의 복제 및 발현을 구동하기 위해 본 개시내용의 다양한 양상 및 구체예에 따라서 사용된다.
엡스타인 바 바이러스 (EBV)
엡스타인-바 바이러스 (EBV)는 인간 헤르페스바이러스 4라고도 알려져 있고, 헤르페스 바이러스 패밀리의 구성원이다. 가장 흔한 인간 바이러스 중 하나이고, 대부분의 사람은 그들 삶의 일부 시기에 EBV에 감염된다.
EBV는 대략 85개 유전자를 함유하는 이중 가닥 DNA 바이러스이고; EBV는 B 세포 및 상피 세포를 감염시키는 것으로 알려져 있다. EBV는 용해기 및 잠복기 복제 둘 모두를 할 수 있는데, 후자의 경우 EBV 게놈의 원형 형태는 숙주 세포 핵으로 전좌되어 거기서 숙주 세포 DNA 폴리머라제에 의해 복제될 수 있다.
EBV는 적어도 3개의 개별 경로를 통해 잠복기 복제를 겪을 수 있지만, 각각은 에피솜 복제 기원에 결합하여 숙주 세포의 분열 동안 에피솜의 분할을 매개하는 단백질인, 엡스타인-바 바이러스 핵 항원 1 (EBNA-1)의 발현이 관여된다. EBNA-1은 EBV 유전자 조절, 복제, 및 에피솜 유지에서 중추적인 역할을 한다.
EBV의 일정 특성은 본 개시내용의 다양한 양상 및 구체예에 따라서 사용된다.
B형 간염 바이러스 (HBV)
B형 간염 바이러스 (HBV)는 헤파드나바이러스 패밀리의 구성원이다. 진행성 간 섬유증, 간염 및 간세포 암종과 연관된 일반적인 인간 바이러스이다.
HBV는 RNA 중간체를 통해서 복제되고 바이러스 폴리머라제에 의존하는 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 간 세포에서 HBV의 안정한 유지는 근절하기가 어려운 공유적으로-폐쇄된 바이러스 DNA 원형 형태의 존재에 기인한다.
따라서, HBV의 일정한 특성은 본 개시내용의 다양한 양상 및 구체예에 따라서 사용된다.
레트로바이러스
레트로바이러스는 RNA 주형으로부터 DNA 카피를 생성시킬 수 있는 역전사효소의 코딩 및 숙주 세포 염색체로 프로바이러스의 통합을 특징으로 하는 바이러스 패밀리이다. 렌티바이러스는 숙주 세포로 바이러스 핵산의 상당량을 전달할 수 있는 레트로바이러스 속이다. 렌티바이러스는 비분열 세포를 감염/형질도입시키는 고유한 능력을 갖는 것을 특징으로 하고, 형질도입 이후에, 렌티바이러스는 숙주 세포의 염색체로 그들 핵산을 통합시킨다.
감염성 렌티바이러스는 독성 단백질을 코딩하는 3개의 주요 유전자, gag, pol, 및 env, 및 tat 및 rev를 포함하는 2개의 조절성 유전자를 갖는다. 특별한 혈청형 및 바이러스에 의존적으로, 바이러스 핵산의 조절, 합성 및/또는 프로세싱, 및 렌티바이러스 감염에 대항하는 대응성 선천적 세포 방어를 포함한 복제 기능에 관여하는 단백질을 코딩하는 추가적인 부속 유전자가 존재할 수 있다.
렌티바이러스는 대략 600 nt 길이일 수 있는 긴 말단 반복부 (LTR) 영역을 함유한다. LTR은 U3, R, 및 U5 영역으로 절편화될 수 있다. LTR은 인테그라제의 작용을 통해서 숙주 염색체로 레트로바이러스 DNA의 통합을 매개할 수 있다. 대안적으로, 인테그라제의 기능없이, LTR은 바이러스 핵산을 원형화시키는데 사용될 수 있다.
렌티바이러스 복제의 초기 단계에 관여되는 바이러스 단백질은 역전사효소 및 인테그라제를 포함한다. 역전사효소는 바이러스에 의해 코딩되는, RNA-의존적 DNA 폴리머라제이다. 이 효소는 상보적 DNA 카피의 합성을 위한 주형으로서 바이러스 RNA 게놈을 사용한다. 역전사효소는 또한 통합을 위해 준비되는 이중 가닥 DNA의 생산을 완료하기 위해 DNA 2차 가닥 합성에 필요한 RNA-주형의 파괴를 위한 RNaseH 활성을 갖는다. 인테그라제는 역전사효소에 의해 생성되는 바이러스 cDNA 및 숙주 DNA 둘 모두에 결합한다. 인테그라제는 숙주 DNA로 바이러스 게놈의 삽입 전에 LTR을 프로세싱한다. Tat는 바이러스 DNA로부터 만들어지는 RNA 카피의 개시 및 연장을 증강시키기 위해 전사 동안 트랜스-활성인자로서 작용된다. rev 반응성 엘리먼트는 전사후에 작용하여, mRNA 스플라이싱을 조절하고 세포질로 수송된다.
렌티바이러스를 포함하여, 레트로바이러스의 일정 특성은 본 개시내용의 다양한 양상 및 구체예에 따라서 사용된다.
벡터-인-벡터 시스템
신규한 벡터-인-벡터 (VIV) 시스템은 다양한 바이러스종으로부터의 바람직한 특성을 조합하여 유전자의 전달 및 발현을 정밀하게 조절할 수 있다. 렌티바이러스 (LV) 플랫폼을 포함하는 많은 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 대부분의 다른 안정한 형질도입 형태와 비슷하게, 렌티바이러스 형질도입은 그 결과로 LV 페이로드 (예를 들어, 관심 유전자)의 염색체 통합이 일어난다. 다양한 양상에 따라서, 염색체 통합은 바이러스 인테그라제 유전자를 불활성화시키는 선택적 돌연변이를 통해서 폐지된다. E1 단백질이 더해진 파필로마바이러스 ori, 또는 EBNA-1이 더해진 EBV ori 또는 바이러스 폴리머라제가 더해진 헤파드나바이러스 말단이 일상적으로는 에피솜으로 유지될 수 없는 이종성 바이러스의 유전자 카고의 일부로서 본 명세서에서 사용된다. 렌티바이러스 벡터로 이러한 이종성 바이러스 복제 기구의 통합은 관심 치료적 유전자를 수용하기 위해 이용가능한 대략 5 kb의 추가적인 카고 공간을 남겨둔다.
다른 양상에서, 다른 제어 엘리먼트가 개시된 VIV 시스템에 도입될 수 있다. 비제한적인 예로서, E1 또는 E2 또는 EBNA-1 또는 HBV 폴리머라제의 발현은 유도성 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 더 나아가, 비제한적인 예로서, E1 및/또는 E2, 또는 이의 변이체는 플라스미드 또는 비통합 바이러스 벡터를 사용하여 발현될 수 있다. 수많은 유형의 유도성 프로모터가 당분야에 공지되어 있고, 본 개시내용의 목적을 위해서, 유도성 프로모터는 제한없이 항생제 (즉, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 페니실린, 세팔로스포린, 폴리믹신 등), 또는 다른 약물, 구리 및 다른 금속, 알콜, 스테로이드, 빛, 산소, 열, 저온 또는 다른 물리적 또는 화학적 자극에 반응하는 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 바이러스 시스템을 사용하는 방법은 카고 유전자의 발현을 위해 약물의 일정한 공급에 의존하는 테트라사이클린-유도성 유전자 발현의 적용을 포함한다. 유도성 프로모터를 유도시키는데 사용되는 화합물은 바람직한 카고 전달의 시기 및 에피솜 복제의 지속기간에 의존적으로 1회 또는 반복적으로 첨가될 수 있다. 에피솜의 유지 및 DNA 복제는 다양하게 E1, E2 및/또는 EBNA-1 유도에 의존적이고, 이것은 차례로 유전자 발현의 유도인자 (즉, 테트라사이클린)에 의존적이다.
예시적인 VIV 시스템은 도 1에 도시되어 있다. 개시된 VIV는 적어도 하나의 관심 유전자 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 도 1A에 도시된 바와 같은 카고)을 포함한다. VIV에 도입되는 유전자 또는 서열은 VIV의 목적에 따라 좌우될 것이다. 대체로 도 1을 참조하면, 렌티바이러스는 인테그라제-결함성 시스템에 의해 패키징되거나 또는 형질도입은 인테그라제 활성을 차단하는데 사용되는 임상적 약물 (예를 들어, 돌루테그라비어 또는 랄테그라비어)의 존재 하에서 수행된다. 통합에 실패하면, 선형 이중 가닥 벡터 DNA는 일반적으로 숙주 효소 기구를 사용하여 원형화될 것이다 (예를 들어, 도 1B). 임의로, 약물-유도성 프로모터는 바람직하다면 E1 및/또는 E2 단백질을 발현하도록 활성화될 수 있고, 결국에 DNA 복제를 구동하게 될 것이다. 치료적 카고는 통합된 카세트(들)로부터 발현될 것이다. 다양한 구체예에서, 유도성 프로모터를 유도시키는 화합물 (본 명세서에서 또한 "유도인자"라고도 함)은 사용이 중단되거나 또는 종료된다. 유도인자의 종료는 E1 및/또는 E2 합성을 하향 조절하게 된다. 추가 구체예에서, E1 및/또는 E2 생산은 효율적으로 종료된다. 각 사건에서, 이것은 에피솜 DNA 수준의 감쇠를 야기하게 되고 최종적으로는 벡터 구성체를 제거시키게 된다.
VIV 시스템에 관한 추가의 예시적인 다이아그램은 도 2에 도시되어 있다. E1 개시인자 단백질이 존재하고 카고는 EF1-HTLV 프로모터 하의 GFP이다. 도 1 및 2는 E1을 함유하는 VIV 시스템을 도시하고 있지만, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 도 4는 단일 바이러스 벡터 상에 E1 및 E2 둘 모두를 함유하는 VIV 시스템을 도시한다. 추가의 구체예에서, 동일한 mRNA로부터 E1 및 E2 둘 모두를 발현시키기 위해서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)가 단백질 번역의 재개시를 허용하도록 첨가된다. 개시인자 단백질 예컨대 E1 및 E2는 또한 개별 플라스미드 또는 비통합성 렌티바이러스 벡터 상에서 발현될 수 있다.
VIV 시스템의 추가의 예시적인 다이아그램은 도 4에 도시되어 있다. 유전자 카고는 CMV/GFP 카세트로 표시된다. 카고 유전자 서열은 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)에 의해 증폭될 수 있다. 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 예컨대 카고 유전자의 5' 말단과 동일하고/하거나 카고 유전자의 3' 말단에 상보적인 프라이머를 사용할 수 있다. 5' 프라이머는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 갖는 5' 말단으로부터 연장될 수 있다. 3' 프라이머는 또한 엔도뉴클레아제 인식에 상보적인 이의 3' 말단으로부터 연장될 수 있다. 최종적으로 증폭된 카고 유전자 서열은 적합한 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터에 어닐링될 수 있다. 유전자 카고의 비제한적인 예는 CMV/VEGF, CMV/항-상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 항-HER2 항체, 또는 miRNA 억제성 C-C 케모카인 수용체 제5형 (CCR5)을 포함한다.
카고의 적합한 발현은 적절한 어세이에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, DNA 카피수는 정량적 PCR에 의해 측정될 수 있다. 비제한적인 예 예컨대 벡터 1 또는 벡터 19 (본 명세서에 기재된 바와 같음)로부터 번역되는 단백질 산물은 예를 들어 분석적 유세포측정법으로 측정될 수 있다. ELISA 어세이는 일정 카고의 존재, 예컨대 분비된 단백질, 예컨대 VEGF를 검출하는데 사용될 수 있다. 웨스턴 블롯 기술은 또한 일정 카고 예컨대 항체, 예컨대 항-EGFR을 검출하는데 사용될 수 있다. 더 나아가서, 카고 단백질, 예컨대 케모카인 수용체 예컨대 CCR5의 세포 표면 발현의 감소의 모니터링이 또한 적용될 수 있다.
카고와 관련하여, 비제한적인 예로서 제공되는, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF)를 코딩하는 유전자가 shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 유전자-침묵화 RNA와 함께 관심 유전자로서 VIV에 통합되어 상처 치유를 촉진시킬 수 있다. 개시된 VIV 시스템은 발현될 수 있는 특정 유형의 유전자 또는 서열에 제한적이지 않다.
개시된 VIV는 예를 들어, 감염성 질환 또는 암과 연관된 항원 (복제되는 병원체 상의 항원 및 외생성 독소인 항원 및 종양 세포 상의 항원 포함)에 대한 항체를 코딩하는 서열, 혈소판 유래 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 뇌 유래 성장 인자, 신경 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 융모성 고나도트로핀, 낭성 섬유증 경막 전도도 조절인자 (CFTR), 디스트로핀 또는 디스트로핀-연관 복합체, 페닐알라닌 히드록실라제, 지단백질 리파제, α-탈라세미아 및/또는 β-탈라세미아, 인자 VIII, 뼈 형태형성성 단백질 1-4, 사이클로옥시게나제 2, 혈관 내피 성장 인자, 케모카인 수용체 CCR5, 케모카인 수용체 CXCR4, 케모카인 수용체 CXCR5, 결장염, 염증성 장질환 또는 크론병에 관여하는 자가면역 항원에 대한 안티센스 DNA 또는 RNA, 아편류 또는 알콜에 대한 신경 약독화를 조절하는 miRNA를 포함하는 중독에 관여되는 소형 간섭 RNA, 종양 억제인자 유전자, 프로아폽토시스 또는 항아폽토시스 유전자 및 프로오토파지 또는 항오토파지 유전자를 포함하는 세포 생존을 조절하는 유전자, 방사선 내성 인자를 코딩하는 유전자, 종양 세포 전이의 추적 또는 다른 세포 수송 현상에 사용되는 발광성 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 신체를 방사선, 수술 또는 화학요법제의 최대 효과에 대해 조건화하거나 또는 조직을 방사선, 수술 또는 또는 화학요법제에 대해 보호하거나, 장기 이식을 개선시키도록 숙주 또는 이식 조직을 변형시키거나 또는 특히 기도에서 과반응성을 억제하는데 사용될 수 있는 다양한 다른 치료적으로 유용한 서열을 포함하는, 수많은 치료적 또는 예방적 유전자 또는 서열을 편입시킬 수 있다.
임의의 전술한 내용에 제한되지 않고, 카고는 진단적 단백질 예컨대 GFP 및 mCherry를 비롯하여, cDNA, 마이크로RNA, shRNA 및 항체를 포함할 수 있다. 더 나아가서, 카고는 본 명세서에 기술된 바와 같이 특별한 카고 예컨대 VEGF 및 BMP를 포함할 수 있다.
추가 양상에서, "안전성 스위치"로서 VIV 시스템 중 에피솜 형태로 유전자를 유지시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 특정 유전자 산물이 유독한 경우에, 유도인자 분자의 회수는 DNA 복제를 감소시키게 되거나 또는 종료시키게 된다. 에피솜 수는 이후에 하락하게 되며, 유전자 및 벡터는 결국에 소멸될 것이다. 전통적으로 조절되는 유전자 발현과 달리, 개시된 발현 구성체는 효율적으로 소멸될 때까지 내생성 뉴클레아제에 의해 분해되고, 세포 분열에 의해 희석되어서, 임의의 단기간 또는 장기간 급등 발현이 예방된다.
추가 양상에 따라서, 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 관심 유전자-침묵화 RNA를 에피솜 형태로 유지시키는 것은 또한 넓은 범위로 카피수를 조절하는 것을 가능하게 하고 그보다 훨씬 높은 수준은 전통적인 렌티바이러스 형질도입에 의해 획득된다.
개시된 VIV 시스템은 수많은 이득이 존재한다. 예를 들어, 에피솜 DNA는 전통적인 형질도입 벡터의 유전자 침묵화를 초래할 수 있는, 염색체 변형에 덜 감수성이다. 유사하게, VIV 에피솜 DNA는 적어도 약 1 내지 약 4개월, 및 가능하게는 그보다 긴 단기-범위 내지 중기-범위의 시간 간격 동안 활성 유전자 전달을 지원한다. 다른 구체예에서, 에피솜 DNA 벡터는 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 또는 약 12주 또는 그 이상의 기간 동안 활성 유전자 전달을 지원한다. 다른 구체예에서, 에피솜 DNA 벡터는 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 또는 그 이상의 기간 동안 활성 유전자 전달을 지원한다. 이들 시간 기간의 임의 조합, 예를 들어 1개월 및 1주, 또는 3개월 및 2주가 본 명세서에 개시된 방법에서 또한 사용될 수 있다.
개시된 VIV 시스템의 도입을 위해 렌티바이러스 운반체의 사용과 연관된 이득이 특별히 존재하지만, 개시된 시스템은 단일 유형의 바이러스 벡터에 제한되지 않는다. 제한없이 렌티바이러스, 아데노-연합 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 백시니아, 헤르페스 바이러스, 홍역 바이러스, 헤파드나바이러스, 파보바이러스 및 쥣과동물 바이러스를 포함하여, 임의의 DNA 바이러스 또는 DNA 중간체를 사용하는 바이러스가 본 명세서의 VIV 시스템은 도입시키기 위한 운반체로서 사용될 수 있다.
임의의 전술한 내용에 제한되지 않고, 본 개시내용의 양상에서, 비통합성 바이러스 전달 시스템이 개시된다. 시스템은 바이러스 운반체로서, 하나 이상의 결함성 인테그라제 유전자를 함유하는 것인 바이러스 운반체; 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원; 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열로서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성인 서열; 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 포함한다. 바이러스 운반체는 렌티바이러스일 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 파필로마바이러스 유래일 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 인간 파필로마바이러스 또는 소 파필로마바이러스 유래일 수 있다.
이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 제16형 인간 파필로마바이러스 (HPV16) 유래일 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 긴 제어 영역 (LCR) 유래일 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 서열번호 1을 포함할 수 있다. 임의로, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 서열번호 1의 5' 절단형을 포함할 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 서열번호 1의 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 700개 뉴클레오티드의 5' 절단형을 포함할 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 LCR의 Frag 1 (서열번호 2), 또는 Frag 2 (서열번호 3), 또는 Frag 3 (서열번호 4), 또는 Frag 4 (서열번호 5)와 적어도 약 80%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 85%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 90%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 95%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 98%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원은 HPV16의 LCR의 Frag 1 (서열번호 2), 또는 Frag 2 (서열번호 3), 또는 Frag 3 (서열번호 4), 또는 Frag 4 (서열번호 5)를 포함할 수 있다. 임의의 전술한 내용 또는 본 명세서에 기술된 실시예에 제한없이, LCR의 게놈 구성은 도 11에 도시되어 있다. 본 명세서에서 상술되는 단편이외에도, 추가적인 단편은 LCR의 5' 및 3' 영역 결실에 의해 생성될 수 있다. 더 나아가서, 돌연변이, 치환, 첨가 및/또는 결실이 전체 길이 LCR 또는 연관된 단편에 만들어질 수 있다. 더 나아가서 전술한 내용 또는 본 명세서에서 상술하는 실시예에 제한되지 않고, 본 명세서에서 상술되는 벡터의 성분은 신규 및/또는 변형 벡터를 개발하는데 상호교환적으로 사용될 수 있다는 것은 본 개시내용의 구체예의 범주 내에서 이해된다.
벡터-인-벡터 시스템의 조율성
본 개시내용의 일 양상에서, 바이러스 벡터 시스템은 바이러스 운반체; 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원; 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열로서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현이 조절되는 것인 서열; 또는 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA 중 하나 이상을 변형시킴으로써 조율가능하거나 또는 최적화된다. 적어도 하나의 유전자 산물의 최대 용량을 제어하기 위해서, 표적 세포 또는 조직에서 발현의 내구성에 영향을 미치기 위해서, 그리고 일시적으로 필요한 생물학적 분자로 질환 또는 손상을 치료하기 위해 그 동일한 생물학적 분자가 오용량으로 전달되어 이러한 생물학적 분자가 더 이상 필요하지 않거나 또는 유독할 수 있는 이후에도 발현이 계속될 때의 독성 또는 부작용을 방지하기 위해, 변형이 가해진다.
구체예에서, 개시된 시스템에서 변형은 생물학적 분자에 대한 발현의 수준을 조율하고, 유전자 요법 실험에서 위약 대조군에 요구될 수 있는 것과 같은 검출불가하거나 또는 거의 검출불가한 카고 발현을 획득하도록 발현의 지속기간을 제어하는 것을 가능하게 한다. 구체예에서, 이것은 검출불가와는 통계적으로 상이하지만, 결함 유전자의 제거 또는 교정을 위한 노력으로 짧은 간격 동안 낮은 수준으로 제공될 때 더 안전한 유전자 편집 단백질 및 RNA의 전달에 필요할 수 있는 것과 같은 유도되거나 또는 높은 수준 발현에 대한 기준은 충족하지 못하는 낮은 수준 발현을 야기한다. 구체예에서, 검출가능과 비교하여 대략 5배 더 높은 피크 발현 수준을 포함하는 높거나 또는 유도된 카고의 발현 수준이지만, 동일 카고의 낮은 기초 수준이 생성된다. 구체예에서, 이것은 종양 부위에서 또는 그 근처에서 생산시 더 유효한 종양 표적화 생물학적 약물을 포함하는 치료적 항체의 발현이 높은 수준으로 존재하고, 정상 조직 상에서의 부위외 효과를 피하거나 또는 자가면역의 개시를 예방하기 위해 혈액으로부터 제거되어야만 할 때 최적일 수 있다.
구체예에서, 개시된 시스템은 암을 치료하기 위해서 조율가능하다. 개시된 시스템은 종양의 부위에서 또는 그 근처에서 종양-표적화 항체 예컨대 세툭시맙, 리툭시맙 또는 트라스투주맙의 발현을 허용하고, 표적 세포에서 유전자 용량을 증가시키기 위해 에피솜 DNA를 복제시킴으로써 유효한 종양 표적화를 위한 충분한 수준으로 항체를 생산하고, 그 이후에 이들 및 유사한 생물학적 약물의 안전성 및 효능을 개선시키는 것으로 알려진 치료적 항체에 대한 예상 붕괴 그래프와 일치되는 항체 발현의 하락과 함께 에피솜 이식유전자 분자의 붕괴가 야기되게 E1/E2 단백질이 생산을 중단할 때 에피솜 DNA 복제를 종료하도록 조율가능하다.
구체예에서, 개시된 시스템은 감염성 질환을 치료하거나 또는 예방하도록 조율가능하다. 개시된 시스템은 병원체 복제를 파괴하거나 또는 중화시킬 수 있는 치료적 항체를 발현하고, 감염 부위에서 또는 그 근처에서 항체의 국소 생산을 유도시키거나 또는 혈액 또는 림프 순환계로 항체를 방출시키고, 표적 세포에서 유전자 용량을 증가시키기 위해 에피솜 DNA를 복제시킴으로써 유효한 병원체 예방 또는 근절을 위한 충분한 수준으로 항체를 생산하고, 이후에 이들 및 유사한 생물학적 약물의 안전성 및 효능을 개선하는 것으로 알려진 치료적 항체에 대해 예상되는 붕괴 그래프와 일치되는 항체 발현의 하락과 함께 에피솜 유전자이식 분자의 붕괴가 야기되게 E1/E2 단백질이 생산을 중단할 때 에피솜 DNA 복제를 종료하도록 조율가능하다.
구체예에서, 개시된 시스템은 외상성 손상 또는 재생성 질환을 치료하도록 조율가능하다. 구체예에서, 개시된 시스템은 치료적 잠재성이 있는 생물학적 활성 분자를 발현시키고, 손상 또는 질환 부위에서 또는 그 근처에서 항체의 국소 생산을 유도하며, 표적 세포에서 유전자 용량이 증가되도록 에피솜 DNA를 복제시켜 유효한 요법에 충분한 수준으로 항체를 생산시키며, 짧은 치료창 동안 요구되는 생물학적 치료제의 영구적 또는 매우 장기간의 발현으로 인한 부작용 또는 독성은 피하지만 피크 이식유전자 용량에서 고수준 용량을 획득하는 생물학적 치료제의 발현의 하락과 함께 에피솜 이식유전자 분자의 붕괴가 야기되게 E1/E2 단백질이 생산을 중단할 때 에피솜 DNA 복제를 종료하도록 조율가능하다.
구체예에서, LCR 단편은 치료의 바람직한 과정 또는 결과에 의존적으로 선택되어 사용될 수 있다. 도 20-21, 표 1 및 실시예 16-20에 제공되는 비제한적인 예에 표시된 바와 같이, 치료의 바람직한 과정 또는 결과에 의존적으로, 바이러스 전달 시스템을 조율가능하거나 또는 최적화한다.
표 1 - 질환 표적의 요약 및 관련 설명
Figure 112019001120424-pct00001
본 개시내용의 양상에서, 바람직한 치료 과정 또는 결과를 기반으로, 바이러스 전달 시스템은 1사분면, 2사분면, 3사분면, 또는 4사분면 인자에 따라서 조율가능하거나 또는 최적화된다.
구체예에서, 1사분면 인자는 LCR이 전체 길이 Frag 2, Frag 3, Frag 4, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 바이러스 전달 시스템을 포함한다. 1사분면 인자는 기술된 벡터 시스템을 사용하여 유전자 카고의 일시적 기초 발현을 제공한다. 대부분의 경우에서, DNA 카피수는 이 시스템으로 획득될 수 있는 최고 수준보다 대략 20배 이하일 것이다. 카고의 발현을 구동하는 프로모터의 신중한 선택은 이 시스템의 탄력성 및 조직 특이성을 더 증가시킬 것이다.
구체예에서, 2사분면 인자는 LCR이 Frag 2, Frag 3, Frag 4, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 바이러스 전달 시스템을 포함한다. 2사분면 인자는 또한 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질을 포함한다. 구체예에서, E1 및/또는 E2 개시인자 단백질은 플라스미드를 통해서 제공된다. 구체예에서, E1 및/또는 E2 개시인자 단백질은 렌티바이러스 벡터를 통해 제공된다. 2사분면 인자는 역시 프로모터 선택에 의존적으로, 잠재적으로 매우 높은 유전자 발현 수준과 함께 높은 에피솜 DNA 카피수를 제공한다. 더 나아가서, 짧은 LCR 단편의 사용은 카고로서 도입될 수 있는 DNA 삽입물의 크기를 증가시킨다.
구체예에서, 3사분면 인자는 LCR이 LCR, Frag 1, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 바이러스 전달 시스템을 포함한다. 3사분면 인자는 또한 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질을 포함한다. 구체예에서, E1 및/또는 E2 개시인자 단백질은 플라스미드를 통해 제공된다. 구체예에서, E1 및/또는 E2 개시인자 단백질은 렌티바이러스 벡터를 통해 제공된다. 3사분면 인자는 2사분면에서 수득할 수 있는 것보다 약간 적지만 높은 에피솜 카피수를 제공한다. 3사분면의 장점은 E1/E2 단백질의 도입 여부에 의해 시스템을 고도로 제어가능하게 만드는 에피솜 DNA가 초저 기초 수준으로 존재한다는 것이다.
구체예에서, 4사분면 인자는 LCR이 전체 길이 LCR, Frag 1, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 바이러스 전달 시스템을 포함한다. 4사분면 인자의 선택은 바람직한 지표를 위한 최대 내성 또는 최적 수준을 확립하기 위해 용량 상승 임상 실험 또는 용량 검사의 개시 용량 또는 위약 대조군에 대해 요구될 수 있는 것과 같은 초저 발현을 야기한다.
본 개시내용의 양상에서, 매우 낮은 기초 수준의 카고 발현이 바람직할 때, 4사분면 인자가 바이러스 전달 시스템에 도입된다. 구체예에서, 4사분면 인자는 Frag 1 또는 전체 길이 LCR 또는 이의 변이체를 포함한다. 구체예에서, 약간 더 높은 기초 수준의 카고 발현이 바람직할 때, 1사분면 인자가 바이러스 전달 시스템에 도입된다. 구체예에서, 1사분면 인자는 Frag 2, Frag 3, Frag 4 또는 이의 변이체를 포함한다.
구체예에서, 높은 유도성 수준의 카고 발현이 바람직할 때, 2사분면 인자 또는 3사분면 인자가 바이러스 전달 시스템에 도입된다. 구체예에서, 2사분면 인자는 Frag 2, Frag 3, Frag 4, 또는 이의 변이체를 포함한다. 구체예에서, 2사분면 인자는 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질을 포함한다. 구체예에서, 3사분면 인자는 LCR, Frag 1, 또는 이의 변이체를 포함한다. 구체예에서, 3사분면 인자는 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질을 포함한다. 구체예에서, 높은 유도성 수준의 카고 발현이 바람직하고, 더 큰 카고 크기가 고려될 때, 2사분면 인자가 바이러스 전달 시스템에 도입된다. 구체예에서, 높은 유도성 수준의 카고 발현이 바람직하고, 더 작은 카고 크기가 고려될 때, 3사분면 인자가 바이러스 전달 시스템에 도입된다. 따라서, 현 시스템의 조율가능성 또는 최적화는 카고 크기를 기반으로 조율가능성 또는 최적화를 가능하게 한다.
구체예에서, 카고 발현의 기초 수준 및 유도성 수준 간에 큰 배수-변화 증가가 바람직할 때, 3사분면 인자가 바이러스 전달 시스템에 도입된다. 구체예에서, 3사분면 인자는 LCR, Frag 1, 또는 이의 변이체를 포함한다. 구체예에서, 3사분면 인자는 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질을 포함한다.
구체예에서, 더 적은 배수-변화 증가가 카고 발현의 기초 수준 및 유도성 수준 간에 바람직할 때, 2사분면 인자가 바이러스 전달 시스템에 도입된다. 추가 구체예로서, 도 12 및 20에 도시된 3사분면 프로파일과 비교하여 카고 발현의 기초 수준 및 유도성 수준 간에 더 적은 배수-변화 증가가 바람직할 때, 2사분면 인자가 바이러스 전달 시스템에 도입된다. 구체예에서, 2사분면 인자는 Frag 2, Frag 3, Frag 4, 또는 이의 변이체를 포함한다. 구체예에서, 2사분면 인자는 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질을 포함한다.
다른 양상에서, 대상체를 1사분면의 치료 과정으로 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 피험체에게 1사분면 인자를 포함하는 바이러스 전달 시스템을 투여하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 1사분면 인자는 LCR이 전체 길이 Frag 2, Frag 3, Frag 4, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 바이러스 전달 시스템을 포함한다.
다른 양상에서, 대상체를 2사분면의 치료 과정으로 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 2사분면 인자를 포함하는 바이러스 전달 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 2사분면 인자는 Frag 2, Frag 3, Frag 4, 또는 이의 변이체를 포함한다. 구체예에서, 2사분면 인자는 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질을 포함한다.
다른 양상에서, 대상체를 3사분면의 치료 과정으로 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 3사분면 인자를 포함하는 바이러스 전달 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 3사분면 인자는 LCR, Frag 1, 또는 이의 변이체를 포함한다. 구체예에서, 3사분면 인자는 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질을 포함한다.
다른 양상에서, 대상체를 4사분면의 치료 과정으로 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 4사분면 인자를 포함하는 바이러스 전달 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 4사분면 인자는 LCR, Frag 1, 또는 이의 변이체를 포함한다.
다른 양상에서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질이 바이러스 시스템에 존재한다. 구체예에서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E1 또는 이의 작동성 단편을 포함한다. 구체예에서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E2 또는 이의 작동성 단편을 포함한다. 구체예에서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질은 EBNA-1 또는 이의 작동성 단편을 포함한다. 구체예에서, 시스템은 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질을 포함한다. 구체예에서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질은 E1 및 E2 또는 이의 작동성 단편이다. 구체예에서, 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열은 단일 개별 플라스미드 상에 존재한다. 구체예에서, 시스템은 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 2종의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열은 단일 개별 플라스미드 상에 존재할 수 있다. 구체예에서, 시스템은 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질을 포함하고, 제1 개시인자 단백질에 대한 서열 및 제2 개시인자 단백질에 대한 서열은 별개 플라스미드 상에 존재할 수 있다.
본 개시내용의 양상에서, 적어도 하나의 유전자 산물이 존재한다. 구체예에서, 적어도 하나의 유전자 산물은 항체, 항체 단편, 성장 인자, 또는 소형 RNA를 포함한다. 구체예에서, 항체는 항-HER2 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 구체예에서, 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 또는 이의 변이체를 포함한다. 구체예에서, 소형 RNA는 shRNA, siRNA, 또는 miRNA를 포함한다. 구체예에서, miRNA는 CCR5 miRNA를 포함한다.
방법
본 개시내용의 양상은 VIV 시스템을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법을 포함하고, 여기서 VIV 시스템은 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 또는 적어도 다섯의 관심 유전자를 코딩한다. 다재다능성 및 치료적 잠재성 및 개시된 VIV 시스템을 고려하면, 개시내용의 양상에 따른 VIV 시스템은 감염성 질환과 연관된 항원 또는 감염성 병원체에 의해 생산되는 독소에 대한 항체, 혈소판 유래 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 뇌 유래 성장 인자, 신경 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 융모성 고나도트로핀, 낭성 섬유증 경막 전도도 조절인자 (CFTR), 디스트로핀 또는 디스트로핀-연관 복합체, 지단백질 리파제, α-탈라세미아 및/또는 β-탈라세미아, 인자 VIII, 뼈 형태형성성 단백질 1-4, 사이클로옥시게나제 2, 혈관 내피 성장 인자, 케모카인 수용체 CCR5, 케모카인 수용체 CXCR4, 케모카인 수용체 CXCR5, 결장염, 염증성 장질환 또는 크론병에 관여되는 자가면역 항원에 대한 안티센스 DNA 또는 RNA, 아편류 또는 알콜에 대한 신경 약독화를 조절하는 miRNA를 포함하는 중독에 관여하는 소형 간섭 RNA, 종양 억제인자 유전자, 프로아폽토시스 또는 항아폽토시스 유전자 및 프로오토파지 또는 항오토파지 유전자를 포함하는 세포 생존을 조절하는 유전자, 방사선 내성 인자를 코딩하는 유전자, 종양 세포 전이를 추적하거나 또는 다른 세포 수송 현상에 사용되는 발광성 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 신체를 방사선, 수술 또는 화학요법제의 최대 효과를 위해 조건화하거나 또는 방사선, 수술 또는 화학요법제로부터 조직을 보호하거나, 숙주 또는 이식 조직을 변형시켜 장기 이식을 개선시키거나 또는 특히 기도에서 과반응성을 억제하는데 사용할 수 있는 다양한 다른 치료적으로 유용한 서열을 포함하는 유전자 또는 핵산 서열을 코딩할 수 있다.
더 나아가서, 임의의 전술한 내용에 제한없이, 다른 양상에서, 세포에서 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 발현하는 방법이 제공된다. 방법은 세포를 비통합성 바이러스 전달 시스템의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 시스템은 바이러스 운반체로서, 결함성 인테그라제 유전자를 함유하는 것인 바이러스 운반체; 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원; 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열로서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성인 서열; 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 포함한다.
다른 양상에서, 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 이를 필요로 하는 대상체에서 발현하는 방법이 제공된다. 방법은 비통합성 바이러스 전달 시스템의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 시스템은 바이러스 운반체로서, 결함성 인테그라제 유전자를 함유하는 것인 바이러스 운반체; 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원; 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열로서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성인 서열; 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 포함한다. 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열은 단일 개별 플라스미드 상에 존재할 수 있고, 적어도 하나의 개시인자 단백질은 단독으로 또는 조합하여, E1 또는 E2, 또는 이의 단편일 수 있다. 방법은 임의로 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 발현의 제1 수준을 개시하도록 단일 개별 플라스미드의 제1 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 방법은 임의로 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 발현의 제2 수준을 개시하도록 단일 개별 플라스미드의 제2 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 제2 양이 제1 양 미만인 상황에서, 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 발현 수준은 감소될 수 있다. 제2 양이 제1 양을 초과하는 상황에서, 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA의 발현 수준은 증가될 수 있다.
감염성 질환
감염성 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법이 제공된다. 고위험성 개체, 예컨대 건강 상태 또는 지리적 위치에 기인하여, 감염성 질환에 걸릴 고위험성의 개체에게 단일클론 항체의 예방적 전달이 현재 실행되고 있다. 예방적 전달은 예컨대 풍토성 지역을 통해 이동하는 개체 (예를 들어, 에볼라-감염 지역에 들어가는 군대 및 국제 구호원)를 보호하기 위해서, 치명적 바이러스 작용제에 대한 보호성 항체 전달을 포함한다. 백신은 대체로 에볼라 또는 라싸열 바이러스 또는 뎅기열 또는 치쿤군야 바이러스 또는 말라리아를 일으키는 플라스모듐 종과 같은 질환에 대해 검사되지 않으며, 통합 벡터의 사용에 의한 예방적 항체 유전자의 만성적 발현은 알려지지 않은 건강상 위험성을 보유한다. 따라서, 높지만 일시적이어야하는 유효한 항체 발현에 대한 상당한 의료적 요구가 존재한다.
높은 카피수의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 관심 유전자-침묵화 RNA를 제한된 기간 동안 전달하는 개시된 방법 및 VIV 시스템은 이러한 의학적 요구를 충족한다. 감염성 질환을 치료하기 위해 전달될 수 있는 유전자 산물의 비제한적인 예는 대상 감염성 질환에 특이적인 항체이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 감염성 질환과 연관된 병태, 증상, 또는 부작용을 치료하거나, 예방하거나, 또는 최소화하는 방법에 관한 것이다. 일정 구체예에서, 감염성 질환은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 에볼라 바이러스, 라싸열 바이러스, 뎅기열, 지카 바이러스, 말라리아, 결핵, 광견병, 백시니아 바이러스 또는 다른 감염성 질환일 수 있다. 일부 구체예에서, VIV 시스템은 예방적으로 또는 감염성 질환으로 감염 이후에 투여될 수 있다.
다른 양상에서, VIV 시스템은 감염성 질환을 예방하는데 사용될 수 있다. 특정한 감염 질환에 걸릴 높은 위험성을 가질 것으로 의심되는 대상체는 대상 감염성 질환을 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV의 예방적 유효량의 투여를 수용할 수 있다.
일정 구체예에서, 감염성 질환은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 에볼라 바이러스, 라싸열 바이러스, 뎅기열, 지카 바이러스, 말라리아, 결핵, 광견병, 백시니아 바이러스 또는 다른 감염성 질환일 수 있다. 일정 구체예에서, VIV 벡터는 예방적으로 또는 감염성 질환으로 감염 이후에 투여될 수 있다.
상처 치유
다른 구체예에서, 본 개시내용은 상처 치유와 연관된 병태, 증상 또는 부작용을 치료하거나, 예방하거나, 또는 최소화하는 방법에 관한 것이다. 개시된 조성물은 사고, 손상, 또는 수술 이후에 상처에 직접적으로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 수술의 경우에, VIV 시스템은 치유를 진척시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다. 사고, 손상, 또는 수술에 의한 상처의 경우에서, VIV 시스템은 상처의 형성 이후 언젠가 투여될 수 있다. 예를 들어, VIV 시스템은 상처 형성의 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 약 96시간, 약 108시간, 약 120시간, 또는 약 168시간 이내에 투여될 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물의 다른 적용은 상처 치유를 가속화하도록 혈소판 성장 인자를 발현할 수 있는 VIV 구성체의 일시적 전달이다. 고 용량의 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 관련 성장 인자, 이의 단편, 및 이와 관련된 뉴클레오티드 돌연변이체는 매우 신속하지만 일시적으로 요구된다. 개시된 시스템 및 방법은 이러한 유형의 적용에 이상적이다.
추가적인 단기간 적용은 피부 병태에 대한 국소 도포, 척수 재생을 위한 신경 성장 인자 및 알콜 남용의 간헐적 치료를 위한 뇌-유래 성장 인자의 발현을 포함한다.
뼈 질환 또는 손상
일 구체예에서, 개시내용은 뼈 손상을 갖는 대상체를 식별하는 단계 및 대상체에게 본 명세서에 개시된 바이러스 전달 시스템의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 뼈 치유를 증강시키는 방법에 관한 것이다. 바이러스 전달 시스템은 바이러스 운반체, 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원, 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 개시인자 단백질을 코딩하는 서열, 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 관심 유전자-침묵화 RNA를 포함하고, 여기서 바이러스 운반체는 결함성 인테그라제 유전자를 가지며, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 뼈 손상은 예를 들어, 사고, 손상, 또는 수술로 인한 것일 수 있고, 뼈 불유합, 또는 급성 골절일 수 있거나, 또는 척추 융합술을 요구할 수 있다. 일부 구체예에서, 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 관심 유전자-침묵화 RNA는 뼈 형태형성성 단백질 1-4 또는 사이클로옥시게나제-2 또는 혈관 내피 성장 인자, 또는 이의 단편을 코딩한다. 더 나아가서, 일정 구체예에서, 전술한 것의 돌연변이체가 바람직하고 뼈 손상 또는 관련 질환을 치료하기 위해 본 개시내용의 범주 내에 속한다.
구체예에서, 본 개시내용은 뼈 질환을 갖는 대상체를 식별하는 단계 및 대상체에게 본 개시내용에 따른 바이러스 전달 시스템의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 뼈 치유를 증강시키는 방법에 관한 것이다. 바이러스 전달 시스템은 바이러스 운반체, 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원, 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 개시인자 단백질을 코딩하는 서열, 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 관심 유전자-침묵화 RNA를 포함하고, 여기서 바이러스 운반체는 결함성 인테그라제 유전자를 가지고, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 존재한다. 뼈 질환은 예를 들어, 사고, 손상, 또는 수술로 인한 것일 수 있고, 뼈 불유합, 또는 급성 골절일 수 있거나, 또는 척추 융합술을 요구할 수 있다. 추가적으로, 뼈 질환은 낮은 골밀도, 뼈로의 저혈류량, 노화, 유전성 병태 등에 의한 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 관심 유전자-침묵화 RNA는 뼈 형태형성성 단백질 1-4 또는 사이클로옥시게나제-2 또는 혈관 내피 성장 인자를 코딩한다.
유전성 유전자 질환
구체예에서, 본 개시내용은 유전성 유전자 질환과 연관된 병태, 증상 또는 부작용을 치료하거나, 예방하거나, 또는 최소화하는 방법에 관한 것이다. 이러한 유전성 유전자 질환의 몇몇 예를 하기의 명명법을 사용하여 관여되는 돌연변이 및 염색체의 인과 유형과 함께 본 명세서의 표 2에 개시한다:
P - 전체적으로 한 유전자 내의 점 돌연변이, 또는 임의의 삽입/결실
D - 유전자 또는 유전자들의 결실
C - 전체 염색체 과잉, 누락, 또는 둘 모두 (염색체 이상 참조)
T - 트리뉴클레오티드 반복 장애: 유전자가 길이가 연장됨
현행 유전자 요법은 유전자 결실, 치환, 또는 재-시퀀싱을 통해서 게놈 DNA를 편집하려는 노력을 포함한다. Talen, CRISPR-Cas9, 징크 핑거 엔도뉴클레아제, TALEN 및 기타를 포함하여, 당분야에 공지된 다양한 유전자 요법 시스템은 렌티바이러스 형질도입에 의한 유전 물질의 전달에 의존한다. 그러나, 본 개시내용과 달리, 이들 시스템은 활성 염색체 변형 시스템이 예상치않은 부위를 변경시켜서, 암을 포함하는 새로운 유전자 질환을 초래할 수 있기 때문에 장기간 동안 세포에서 활성인 채로 남아있으면 예상치 않은 결과를 가질 수 있다. 숙주 DNA의 변형을 위해 실제로 실용적인 시스템은 본 명세서에 개시된 방법과 같은 방법을 통해서, 일시적으로, 철저히-조절되는 발현을 요구한다.
구체예에서, 본 개시내용은 유전성 유전자 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 유전성 유전자 질환을 갖는 대상체를 식별하는 단계 및 대상체에게 본 개시내용에 따른 바이러스 전달 시스템의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 바이러스 전달 시스템은 바이러스 운반체, 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원, 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 개시인자 단백질을 코딩하는 서열, 및 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 관심 유전자-침묵화 RNA 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 바이러스 운반체는 결함성 인테그라제 유전자를 갖고, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 존재한다. 유전성 유전자 질환은 예를 들어, 표 2에 열거된 질환일 수 있고, 일부 구체예에서, 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 관심 유전자-침묵화 RNA는 표 2에 열거된 유전자의 비돌연변이된 형태를 코딩한다. 전술한 내용을 제한하지 않고, 특별한 유전성 유전자 질환은 CF일 수 있고 치료는 본 명세서에서 상술하는 바와 같이 CFTR의 비돌연변이된 형태를 발현시켜서 수행될 수 있다.
다른 구체예에서, 가이드 RNA 표적 서열은 개시된 VIV 시스템으로 도입된다. 가이드 RNA 서열은 돌연변이되거나 또는 그렇지 않으면 교정을 요구하는 숙주 게놈 내의 특별한 부위로 유전자 편집 기구를 표적화시키는데 사용되는 서열이다. VIV 시스템의 카고 내에 가이드 RNA의 내포는 교정을 요구하는 염색체 구획의 변형을 가능하게 하고, 동일한 변형이 VIV 내에서 발생되어 숙주에 의한 분해 및/또는 희석이 가속화될 것이다. 구체예에서, 개시된 바이러스 전달 시스템은 바이러스 운반체, 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원, 이종성 바이러스 에피솜의 복제 기원에 특이적인 개시인자 단백질을 코딩하는 서열, 적어도 하나의 유전자, shRNA, siRNA, miRNA, 및/또는 다른 관심 유전자-침묵화 RNA, 및 적어도 하나의 가이드 RNA 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 바이러스 운반체는 결함성 인테그라제 유전자를 가지고, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 개시인자 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 존재한다.
세포 또는 조직의 생체외 변형
다른 양상에서, VIV 시스템은 질환 요법을 위해 사용되는 세포 또는 조직을 변형시키는데 사용될 수 있다. 세포는 제한없이, 초대 세포 예컨대 림프구, 줄기 세포, 상피 세포, 신경 세포 및 기타를 포함할 수 있다. 예를 들어, VIV 시스템은 암, 감염성 질환 또는 자가면역을 포함한 특별한 질환에 대해 재지정되는 림프구를 변형시키는데 사용될 수 있고, 여기서는 유전자 변형 세포의 장기간 존재가 건강 위험을 제기한다. 예를 들어, VIV 시스템은 또한 정해진 간격 동안 전사 인자의 높은 수준을 요구하고, 통합된 바이러스 벡터의 장기간 존재가 바람직하지 않을 수 있는 다능성 줄기 세포를 프로그래밍하는데 사용될 수 있다. 적합한 상피 세포는 합성 피부 또는 다른 적용에 사용되는 것들을 포함한다. 이들은 치료 이후에 정상 조직의 기능에 유해할 수 있는 초기 치료 동안 영양 또는 성장 인자의 발현을 요구할 수 있고 본 명세서에 개시된 VIV 시스템에 의해 최고로 전달된다.
용량 및 제형
개시된 VIV 시스템은 개시된 벡터의 에피솜 유지 및 관심 유전자 또는 서열의 단기간, 중간 기간, 또는 장기간 발현을 가능하게 한다. 따라서, 용량 용법은 치료되는 병태 및 투여 방법을 기반으로 다양할 수 있다.
구체예에서, VIV는 다양한 용량으로 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 특히, 대상체는 ≥ 106 감염 용량 (여기서 1 용량이 1 표적 세포를 형질도입시키는데 평균적으로 필요함)이 투여될 수 있다. 보다 특히, 대상체는 ≥ 107, ≥ 108, ≥ 109, 또는 ≥ 1010 감염 용량이 투여될 수 있다. VIV 용량의 상한치는 각 질환 징후에 대해 결정될 것이고 각 개별 제품 또는 제품 로트에 대한 독성/안전성 프로파일에 따라 좌우될 것이다.
추가적으로, VIV는 1일 1회 또는 2회 투여될 수 있다. 대안적으로, VIV는 필요로 하는 대상체에게 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 1개월에 1회, 2개월 마다, 3개월 마다, 6개월 마다, 9개월 마다, 1년에 1회, 18개월 마다, 2년 마다, 36개월 마다, 또는 3년 마다 또는 그 이상으로 투여될 수 있다.
다양한 양상 및 구체예에서, VIV는 약학 조성물로서 투여된다. 구체예에서, VIV를 포함하는 약학 조성물은 임상 적용을 위해 광범위하게 다양한 코, 폐, 경구, 국소, 또는 비경구 제형으로 제제화될 수 있다. 각각의 제형은 다양한 붕해제, 계면활성제, 충전제, 증점제, 결합제, 희석제 예컨대 습윤제 또는 다른 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. VIV를 포함하는 약학 조성물은 또한 주사용으로 제제화될 수도 있다.
VIV 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 방법을 사용하여, 예컨대 비내, 구강, 설하, 경구, 직장, 안구, 비경구 (정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 수조내, 복강내), 폐, 질내, 국부 투여, 국소 투여, 난절 이후 국소 투여, 점막 투여, 에어로졸, 구강 또는 코 스프레이 제제를 통해서 투여될 수 있다.
더 나아가서, VIV 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 제형, 예컨대 고체 제형, 정제, 알약, 로젠지, 캡슐, 액체 분산액, 겔, 에어로졸, 폐 에어로졸, 코 에어로졸, 연고, 크림, 반고체 제형, 및 현탁액으로 제제화될 수 있다. 또한, 조성물은 제어 방출 제제, 지속 방출 제제, 즉시 방출 제제 또는 이의 임의 조합일 수 있다. 또한, 조성물은 경피 전달 시스템일 수 있다.
다른 구체예에서, VIV를 포함하는 약학 조성물은 경구 투여용 고체 제형으로 제제화될 수 있고, 고체 제형은 분말, 과립, 캡슐, 정제 또는 알약일 수 있다. 다른 구체예에서, 고체 제형은 하나 이상의 부형제 예컨대 칼슘 카보네이트, 전분, 수크로스, 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 젤라틴을 포함할 수 있다. 또한, 고체 제형은 부형제이외에도, 윤활제 예컨대 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 구체예에서, 경구 제형은 즉시 방출 또는 변형 방출 형태일 수 있다. 변형 방출 제형은 제어 또는 장기간 방출, 장 방출 등을 포함한다. 변형 방출 제형에 사용되는 부형제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
구체예에서, VIV를 포함하는 약학 조성물은 설하 또는 구강 제형으로서 제제화될 수 있다. 이러한 제형은 혀 아래에 투여되는 설하 정제 또는 용액 조성물 및 뺨과 잇몸 사이에 놓여지는 구강 정제를 포함한다.
다른 구체예에서, VIV를 포함하는 약학 조성물은 코 제형으로서 제제화될 수 있다. 본 개시내용의 이러한 제형은, 코 전달을 위한 용액, 현탁액 및 겔 조성물을 포함한다.
구체예에서, 약학 조성물은 경구 투여용 액상 제형, 예컨대 현탁액, 에멀션 또는 시럽으로 제제화될 수 있다. 구체예에서, 액상 제형은 통용되는 단순한 희석제 예컨대 물 및 액체 파라핀이외에도, 다양한 부형제 예컨대 보습제, 감미제, 방향제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 구체예에서, VIV 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 소아과 환자에게 투여하기 적합하도록 제제화될 수 있다.
구체예에서, 약학 조성물은 비경구 투여용 제형, 예컨대 멸균 수성 용액, 현택액, 에멀션, 비수성 용액 또는 좌제로 제제화될 수 있다. 구체예에서, 비수성 용액 또는 현탁액은 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일 또는 주사용 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트를 포함할 수 있다. 좌제용 베이스로서, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오 오일, 라우린 오일 또는 글리세린화된 젤라틴이 사용될 수 있다.
약학 조성물의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 투여 시기 및 방식, 배설률, 및 질환의 중증도에 따라서 다양할 수 있다.
정의
본 명세서에서 특별하게 정의되지 않은 단어는 당업자가 이해하는 바와 일관된 의미를 갖는 것으로 이해하게 될 것이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "약"은 당업자가 이해하게 될 것이며 사용되는 문맥에 따라서 어느 정도 다양할 수 있다. 사용된 문맥을 고려했을 때 당업자에게 분명하지 않은 용어의 사용이 존재하면, "약"은 특정한 용어의 10%를 최대로 더하거나 뺀 것을 의미하게 된다.
용어 활성제를 "투여하는" 또는 활성제의 "투여"는 개체의 신체에 치료적으로 유용한 형태 및 치료적 유효량으로 유입될 수 있는 형태로 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 활성제를 제공하는 것을 의미한다.
용어 "기초 수준"은 적어도 하나의 개시인자 단백질이 첨가되지 않았을 때 카고의 발현을 의미한다.
용어 "BMP"는 뼈 형태형성성 단백질을 의미한다.
용어 "카고"는 본 명세서에 개시된 바이러스 전달 시스템(들)을 사용하여 발현되는 유전자 또는 유전자 산물을 의미한다.
용어 "CF"는 낭성 섬유증을 의미하고, 용어 "CFTR"은 낭성 섬유증 경막 전도도 조절인자 단백질을 의미한다.
용어 "발현", "발현되는" 또는 "코딩하는"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 이후에 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 발현은 진핵생물 세포에서 mRNA의 스플라이싱 또는 전사후 변형 또는 번역후 변형의 다른 형태를 포함할 수 있다.
용어 "단편 1"은 "F1" 및 "Frag 1"과 동의어이고 본 명세서에서 상술되는 LCR의 단편 1 절단형을 의미한다. 용어 "단편 2"는 "F2" 및 "Frag 2"와 동의어이고 본 명세서에서 상술되는 LCR의 단편 2 절단형을 의미한다. 용어 "단편 3"은 "F3" 및 "Frag 3"과 동의어이고 본 명세서에서 상술되는 LCR의 단편 3 절단형을 의미한다. 용어 "단편 4"는 "F4" 및 "Frag 4"와 동의어이고 본 명세서에서 상술되는 LCR의 단편 1 구성체를 의미한다.
용어 "개체", "숙주", "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "유도성 수준"은 적어도 하나의 개시인자 단백질의 첨가 이후 카고의 발현을 의미한다.
용어 "LCR"은 예를 들어 HVP16의 긴 제어 영역을 의미한다.
용어 "PDGF"는 혈소판-유래 성장 인자를 의미한다.
용어 "1사분면의 치료 과정"은 도 21의 1사분면에 포함된 치료 과정의 참조를 포함한다. 비제한적인 예로서, 1사분면의 치료 과정은 유전자 편집, 안전성 연구, 및 실시예 17에 요약된 목적을 포함한다. 용어 "2사분면의 치료 과정"은 도 21의 2사분면에 포함된 치료 과정의 참조를 포함한다. 비제한적인 예로서, 2사분면의 치료 과정은 세포 리프로그래밍, 체크포인트 억제, 및 실시예 18에 요약된 목적을 포함한다. 용어 "3사분면의 치료 과정"은 도 21의 3사분면에 포함된 치료 과정의 참조를 포함한다. 비제한적인 예로서, 3사분면의 치료 과정은 수동 면역, 면역 자극, 및 실시예 19에 요약된 목적을 포함한다. 용어 "4사분면의 치료 과정"은 도 21의 4사분면에 포함된 치료 과정의 참조를 포함한다. 비제한적인 예로서, 4사분면의 치료 과정은 위약 대조군, 및 실시예 20에 요약된 목적을 포함한다.
용어 "1사분면 인자"는 도 20의 1사분면에 도시된 기초 에피솜 카피수 프로파일을 촉진하는 임의의 생물학적 인자를 의미한다. 비제한적인 예로서, 1사분면 인자는 Frag 2, Frag 3, 및 Frag 4 서열을 포함한다. 용어 "2사분면 인자"는 도 20의 2사분면에 도시된 유도성 에피솜 카피수 프로파일을 촉진하는 임의의 생물학적 인자를 의미한다. 비제한적인 예로서, 2사분면 인자는 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질과 조합하여 Frag 2, Frag 3, 및 Frag 4 서열을 포함한다. 용어 "3사분면 인자"는 도 20의 3사분면에 도시된 유도성 에피솜 카피수 프로파일을 촉진하는 임의의 생물학적 인자를 의미한다. 비제한적인 예로서, 3사분면 인자는 E1 및/또는 E2 개시인자 단백질과 조합하여 LCR 및 Frag 1 서열을 포함한다. 용어 "4사분면 인자"는 도 20의 4사분면에 도시된 기초 에피솜 카피수 프로파일을 촉진하는 임의의 생물학적 인자를 의미한다. 비제한적인 예로서, 4사분면 인자는 LCR 및 Frag 1 서열을 포함한다.
용어 "shRNA"는 짧은 헤어핀 RNA를 의미하고; 용어 "siRNA"는 소형 (또는 단형) 간섭 RNA를 의미하며; 용어 "miRNA"는 마이크로RNA를 의미한다.
용어 "치료적 유효량"은 소정 질병, 손상, 질환 또는 병태를 앓고 있는 환자에서 보이는 합병증의 증상, 진행 또는 개시를 치료하거나 또는 예방하기 위한, 적합한 제형, 및 적합한 조성물 중 본 개시내용의 활성제의 충분한 분량을 의미한다. 치료적 유효량은 환자의 병태의 상태 또는 이의 중증도, 및 치료하려는 대상체의 연령, 체중 등에 따라서 다양할 것이다. 치료적 유효량은 예를 들어 투여 경로, 대상체의 병태를 비롯하여 당업자가 이해하는 다른 인자들을 포함하는, 임의의 많은 인자들에 따라서 다양할 수 있다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 일반적으로 치료되는 대상체의 자연적 과정을 변경시키려고 시도하는 중재술을 의미하며, 예방법으로 또는 임상 병리학 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 효과는 제한없이, 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 저해, 감소 또는 억제, 질환 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 차도의 야기 또는 개선된 예후를 포함한다.
기초 발현 수준의 내용에서 사용될 때 용어 "초저"는 에피솜 카피수 (적절하면) 및/또는 발현의 초저 수준을 의미하고 검출불가능한 에피솜 카피수 및/또는 발현을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 초저 수준의 발현은 세포 당 0.020 미만의 에피솜 카피를 포함한다. 기초 발현 수준의 내용에서 사용될 때 용어 "초저"는 또한 본 명세서에서 "제1 확정 수준"을 의미할 수 있다. 기초 발현 수준의 내용에서 사용될 때 용어 "약간 더 높은"은 "초저" 표준과 비교하여 약간 더 높은 에피솜 카피수 및/또는 발현의 낮은 수준을 의미한다. 비제한적인 예로서, 발현의 약간 더 높은 수준은 세포 당 0.020 에피솜 카피 또는 이의 초과이지만 세포 당 0.2 카피 미만인 세포 당 에피솜 카피 값을 포함한다. 기초 발현 수준의 내용에서 사용될 때 용어 "약간 더 높은"은 또한 본 명세서에서 "제2 확정 수준"을 의미할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "VIV"는 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 관심 RNA를 발현시키기 위한 벡터-인-벡터 시스템을 의미한다. 용어 "VIV"는 본 명세서에서 사용될 때, 바이러스 전달 시스템 및 일시적 벡터와 동의어로 사용된다.
하기의 실시예는 본 발명의 양상들을 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명을 이들 실시예에서 기술하는 특정한 상태 또는 구체적인 내용으로 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 참조하는 모든 인쇄된 공개물은 특별히 참조로 편입된다.
실시예
실시예 1 - 감염성 질환을 치료하기 위한 VIV
이 실시예는 감염성 질환을 치료하기 위한 예시적인 VIV 구성체를 입증한다.
이 실시예에서, 도 1A는 에볼라 바이러스, 감염성 질환을 치료하기 위한 예시적인 선형 VIV 구성체를 나타낸다. 본 명세서에서, 도 1A에 도시된 "카고" 부분의 적어도 하나는 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩한다. 예시적인 VIV 구성체의 긴 말단 반복부 (LTR) 부분은 도 1B에 도시된 바와 같이 바이러스 핵산을 원형화시키는데 사용될 수 있다.
에볼라 바이러스를 갖는 것으로 의심되거나 또는 진단된 대상체는 에볼라의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 또는 단독으로, 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV의 치료적 유효량의 투여를 수용할 수 있다. 추가적인 작용제 및/또는 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV는 당분야에 공지되거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 경구로, 비내로, 척추강내로, 안구내로, 피부내로, 경점막으로, 이온영동으로, 국소로, 전신으로, 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 근육내로 투여된다. 다음으로 대상체는 제한없이, 예를 들어, 발열, 피로, 권태, 나약, 충혈, 관절 및 근육 통증, 두통, 구역, 구토, 출혈, 및 사망을 포함하는, 에볼라 바이러스와 연관된 징후 및 증상의 존재 및/또는 중증도에 대해 날마다 평가된다. 치료는 에볼라 바이러스 감염의 하나 이상의 징후 또는 증상이 경감되거나 또는 제거되는 시기까지 유지된다.
에볼라 바이러스가 감염된 것으로 의심되거나 또는 에볼라 바이러스 감염으로 진단되어 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV의 치료적 유효량을 수용한 대상체가 에볼라 바이러스 감염과 연관된 하나 이상의 증상의 제거 또는 감소된 중증도를 나타낼 것이라는 것이 합리적으로 예측된다. 더 나아가서 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV의 투여가 상승적 효과를 가질 것이라는 것이 합리적으로 예측된다.
이들 결과는 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV가 에볼라 바이러스의 치료에 유용하다는 것을 보여줄 것이다.
실시예 2 - 감염성 질환을 예방하기 위한 VIV
이 실시예는 감염성 질환을 예방하기 위한 예시적인 VIV 구성체를 입증한다. 이 실시예에서, 도 1A는 에볼라 바이러스에 의한 감염, 감염성 질환을 예방하기 위한 예시적인 선형 VIV 구성체를 나타낸다. 여기서, 도 1A에 도시된 "카고" 부분의 적어도 하나는 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩한다. 예시적인 VIV 구성체의 긴 말단 반복부 (LTR) 부분은 도 1B에 도시된 바와 같은 바이러스 핵산을 원형화하는데 사용될 수 있다.
에볼라 바이러스에 걸릴 높은 위험성을 갖는 것으로 의심되는 대상체는 에볼라에 걸릴 위험성이 높은 지역으로 들어가기 전에 에볼라의 치료 또는 예방을 위해 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 또는 단독으로, 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV의 예방적 유효량의 투여를 수용할 수 있다. 추가적인 작용제 및/또는 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV는 당분야에 공지되거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 경구로, 비내로, 척추강내로, 안구내로, 피부내로, 경점막으로, 이온영동으로, 국소로, 전신으로, 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 근육내로 투여된다. 다음으로 대상체는 제한없이, 예를 들어, 발열, 피로, 권태, 나약, 충혈, 관절 및 근육 통증, 두통, 구역, 구토, 출혈, 및 사망을 포함한, 에볼라 바이러스와 연관된 징후 및 증상의 존재 및/또는 중증도에 대해 날마다 평가된다. 치료는 에볼라 바이러스 감염의 하나 이상의 징후 또는 증상이 예방되는 시기까지 유지된다.
에볼라 바이러스에 노출된 것으로 의심되거나 또는 노출된 것으로 진단되어 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV의 예방적 유효량을 수용한 대상체는 에볼라에 걸릴 감소된 위험성을 가질 것이라는 것이 합리적으로 예측된다. 또한 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV의 투여가 상승적 효과를 가질 것이라는 것이 합리적으로 예측된다. 이들 결과는 에볼라 바이러스를 특이적으로 표적화하는 항체를 코딩하는 VIV가 에볼라 바이러스의 예방에 유용하다는 것을 보여줄 것이다.
실시예 3 - 상처 치유의 증강을 위한 VIV
이 실시예는 상처 치유를 증강시키기 위한 예시적인 VIV 구성체를 입증한다. 이 실시예에서, 도 1A는 상처 치유를 증강시키기 위한 예시적인 선형 VIV 구성체를 나타낸다. 여기서, 도 1A에 도시된 "카고" 부분의 적어도 하나는 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) (서열번호 17)를 코딩한다. 예시적인 VIV 구성체의 긴 말단 반복부 (LTR) 부분은 도 1B에 도시된 바와 같이, 바이러스 핵산을 원형화시키는데 사용될 수 있다.
상처 (예를 들어, 사고, 손상, 또는 수술에 의함)를 갖는 대상체는 상처를 치료하거나 또는 멸균하기 위해 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하거나 또는 단독으로, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF)를 코딩하는 VIV의 치료적 유효량의 투여를 수용할 수 있다. VIV PDGF 및/또는 추가적인 작용제는 당 분야에 공지되거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 경구로, 비내로, 척추강내로, 안구내로, 피부내로, 경점막으로, 이온영동으로, 국소로, 전신으로, 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 근육내로 투여된다. 다음으로, 대상체는 상처의 상태를 결정하기 위해 날마다 평가된다. 치료는 상처가 치유되어 반흔이 최소화되는 시기까지 유지된다.
상처를 가져서 VIV PDGF의 치료적 유효량을 수용한 대상체가 증강된 상처 치유를 나타내게 될 것이라는 것이 합리적으로 예측된다. 또한 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 PDGF를 코딩하는 VIV의 투여가 상승적 효과를 가지게 될 것이라는 것이 합리적으로 예측된다. 이들 결과는 PDGF를 코딩하는 VIV가 상처 치유를 증강시키는데 유용하다는 것을 보여줄 것이다.
실시예 4 - 뼈 손상의 치료를 위한 VIV
이 실시예는 뼈 손상을 치료하기 위한 예시적인 VIV 구성체를 입증한다. 이 실시예에서, 도 1A는 뼈 손상을 치료하기 위한 예시적인 선형 VIV 구성체를 나타낸다. 여기서, 도 1A에 도시된 "카고" 부분의 적어도 하나는 뼈 형태형성성 단백질 (BMP) (서열번호 18)을 코딩한다. 예시적인 VIV 구성체의 긴 말단 반복부 (LTR) 부분은 도 1B에 도시된 바와 같이, 바이러스 핵산을 원형화시키는데 사용될 수 있다.
뼈 손상을 갖는 것으로 의심되거나 또는 뼈 손상을 갖는 것으로 진단된 대상체는 뼈 손상의 치료를 위해서 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 또는 단독으로, 뼈 형태형성성 단백질 (BMP)을 코딩하는 VIV의 치료적 유효량의 투여를 수용할 수 있다. 추가적인 작용제 및/또는 BMP를 코딩하는 VIV는 당분야에 공지되거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 경구로, 비내로, 척추강내로, 안구내로, 피부내로, 경점막으로, 이온영동으로, 국소로, 전신으로, 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 근육내로 투여된다. 다음으로 대상체는 치유 속도 및 강도를 결정하기 위해서 뼈 손상과 연관된 징후 및 증상의 존재 및/또는 중증도에 대해서 매주 평가된다. 치료는 뼈가 치유되는 시기까지 유지된다.
뼈 손상을 갖는 것으로 의심되거나 또는 뼈 손상을 갖는 것으로 진단되어 BMP를 코딩하는 VIV의 치료적 유효량을 수용한 대상체는 손상의 감소된 중증도 및 증강된 치유를 나타낼 것이라는 것이 합리적으로 예측된다. 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 BMP를 코딩하는 VIV의 투여가 상승적 효과를 가질 것이라는 것이 또한 합리적으로 예측된다. 이들 결과는 BMP를 코딩하는 VIV가 뼈 손상 또는 질환의 치료에서 유용하다는 것을 보여줄 것이다.
실시예 5 - 유전성 질환의 치료를 위한 VIV
이 실시예는 낭성 섬유증 (CF)을 치료하기 위한 예시적인 VIV 구성체를 입증한다. 이러한 실시예에서, 도 1A는 유전성 질환인 CF를 치료하기 위한 예시적인 선형 VIV 구성체를 나타낸다. 여기서, 도 1A에 도시된 "카고" 부분의 적어도 하나는 낭성 섬유증 경막 전도도 조절인자 (CFTR) (NM_000492)를 코딩한다. 예시적인 VIV 구성체의 긴 말단 반복부 (LTR) 부분은 도 1B에 도시된 바와 같이, 바이러스 핵산을 원형화시키는데 사용될 수 있다.
(CF)를 갖는 것으로 의심되거나 또는 (CF)를 갖는 것으로 진단된 대상체는 CF의 치료를 위해서 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 또는 단독으로 낭성 섬유증 경막 전도도 조절인자 (CFTR)를 코딩하는 VIV의 치료적 유효량의 투여를 수용할 수 있다. 추가적인 작용제 및/또는 CFTR을 코딩하는 VIV는 당분야에 공지되거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 경구로, 비내로, 척추강내로, 안구내로, 피부내로, 경점막으로, 이온영동으로, 국소로, 전신으로, 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 근육내로 투여된다. 다음으로 대상체는 제한없이, 예를 들어, 저조한 성장, 지속적인 기침, 진한 객담 및 점액, 천명, 호흡곤란, 운동 능력 감소, 반복된 폐감염, 염증이 생긴 비도, 기름성 대변, 장폐색, 및 저조한 체중 증량을 포함하는 CF와 연관된 징후 및 증상의 존재 및/또는 중증도에 대해서 매주 평가된다. 치료는 CF의 하나 이상의 징후 또는 증상이 경감되거나 또는 제거되는 시기까지 유지된다.
CF를 갖는 것으로 의심되거나 또는 CF를 갖는 것으로 진단되어 CFTR을 코딩하는 VIV의 치료적 유효량을 수용한 대상체는 CF와 연관된 하나 이상의 증상의 제거 또는 감소된 중증도를 나타낼 것이라는 것이 합리적으로 예측된다. 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 CFTR을 코딩하는 VIV의 투여가 상승적 효과를 가지게 될 것이 또한 합리적으로 예측된다. 이들 결과는 CFTR을 코딩하는 VIV가 CF의 치료에서 유용하다는 것을 보여줄 것이다.
실시예 6 - 카고를 발현하기 위해 E1을 함유하는 VIV
도 2에 따른 벡터는 카고로서 녹색 형광발광 단백질 유전자 (GFP)를 함유하는 것을 제조하였다. 제16형 인간 파필로마바이러스 유래의 완전한 유전자좌 제어 영역 (Locus Control Region) 및 E1 단백질을 함유하는 DNA (NCBI 수탁 번호 U89348;서열번호 19)를 화학적으로 합성하였다. 개별 절편 및/또는 코딩 서열을 초기에 합성하였다. 이들을 녹색 형광발광성 단백질 유전자의 5' 말단과 동일하고 녹색 형광발광 단백질의 3' 말단에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)에 의해 증폭시켰다. 5' 프라이머 (서열번호 20)는 BamHI 또는 EcoRI 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 갖는 이의 5' 말단으로부터 연장되었다. 3' 프라이머 (서열번호 21)는 BamHI, 또는 EcoRI 엔도뉴클레아제 인식 부위의 상보체인 이의 3' 말단으로부터 연장되었다. 다음으로 최종적으로 증폭된 녹색 형광발광 단백질 유전자 서열을 BamHI 및 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 분해시켰다.
렌티바이러스 벡터는 System Biosciences, Inc로부터 입수하였다. 플라스미드를 BamHI 및 EcoRI 효소로 절단하였고, 1:3 비율의 삽입물 대 벡터 비율로 과량의 증폭된 녹색 형광발광 단백질 유전자 서열과 혼합하였다.
이어서 효소 활성을 20분간 70℃에서 가열 불활성화에 의해 중단시켰다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각시켜 어닐링되도록 하였다.
어닐링 반응은 실온에서 30분간 박테리오파지 T4 DNA 리가제에 의해 수행되었다. 2.5 마이크로리터의 최종 결찰 믹스를 25 마이크로리터의 STBL3 컴피턴트 박테리아 세포에 첨가하였다.
이어서 42℃에서 짧은 (1분) 열-충격을 통해 형질감염을 수행하였다.
박테리아 배양물을 수득하기 위해서 암피실린을 함유하는 한천 플레이트 상에 박테리아 세포를 스트리킹하였다. 이들 배양물을 루리아 액체 배지에서 확장시켰다.
렌티바이러스 벡터 패키징 플라스미드로 증폭된 녹색 형광발광 단백질 유전자 서열의 삽입을 검토하기 위해서, DNA를 상기 박테리아 배양물로부터 추출하였고 표준 방법으로 정제하였다. 정제된 DNA를 구성체를 만들기 위해 사용된 동일한 엔도뉴클레아제로 분해하였다. 단편 길이를 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하였고, 증폭된 녹색 형광발광 단백질 유전자 서열은 Eurofins MWG Operon LLC에서 수득된 특이적 프라이머를 사용한 DNA 시퀀싱을 통해 검증하였다.
렌티바이러스 벡터 스톡을 다음과 같이 제조하였다. 카고 플라스미드가 더해진 적어도 2종의 렌티바이러스 패키징 플라스미드를 HEK 세포에 형질감염시켰고 여기서 바이러스 유전자 및 게놈 RNA가 발현되어, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 입자로 조립되고 배양 배지로 방출되었다. 세포-무함유 상청액을 제조하고 형질감염 이후 3 내지 10일의 간격 동안 수집하였다. 렌티바이러스 입자를 원심분리, 부정류 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 크기 배제 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 방법의 조합을 포함하는 표준 절차에 의해 정제하였다. 각 스톡에 대한 농도 및 생물학적 활성 (mL 당 형질도입 단위)을 결정하였다.
293T 세포를 포함하는 포유동물 세포를 사용하여 렌티바이러스-유래된 에피솜 형성, 카피수 및 발현에 대해 검사하였다. 293T 세포는 폴리브렌의 존재 하에서 1 내지 10 범위의 감염 다중도로 인테그라제 결핍성 렌티바이러스 입자를 형질도입시켰다. 비흡착 바이러스는 적용 이후 3시간에 세포를 세척하여 제거하였고, 세포를 3일 동안 배양하였다. 세포를 형광 현미경에서 관찰하였고 GFP를 발현하는 세포를 계측하였다. 비형질도입된 293T 세포는 음성 대조군으로서 사용되었다. 데이타는 배양 중 100개 생존 세포 당 GFP-양성 세포로서 기록하였다. 최소 300개 세포가 현미경 필드 당 계측되었고 5 내지 10개 필드를 각 반복 실험에서 계측하였다. 하나의 음성 대조군 (가장 왼쪽 데이타 컬럼) 및 3회의 반복 실험 (즉, 실험 1, 실험 2 및 실험 3으로 표시된 데이타 컬럼)을 포함하는 4회의 독립적인 형질도입 실험을 수행하여 형질도입된 세포의 빈도를 결정하였다. 데이타는 도 3에 도시하였고, 3회의 반복 실험으로 GFP의 발현을 확인하였다.
실시예 7 - 카고를 발현시키기 위한 E1 및 E2를 함유하는 VIV
도 4를 참조하면, 벡터 19는 E1 (서열번호 6) 및 E2 (서열번호 7) 개시인자 단백질 둘 모두를 함유하도록 구축되었다. 여기서, 유전자 카고는 유도성 프로모터 제어 하의 CMV/GFP 발현 카세트이다.
293T 세포는 세포 당 1 내지 20 형질도입 단위의 범위인 감염 다중도로 벡터 19에 의해 형질도입될 수 있다. 3시간 후에, 세포를 배지로 세척하여 비흡착된 비리온을 제거하여 배지로 귀환시켰다. 형질도입 이후 12 내지 24시간에, 세포를 유도성 프로모터를 유도시킬 수 있는 화합물의 적어도 한 용량으로 처리한다. 유도성 프로모터를 유도시킬 수 있는 화합물의 첨가 시에, E1 및 E2 mRNA는 에피솜으로부터 전사되어 유전자좌 제어 영역 단편 2 (LCR/F2) (서열번호 3) 상에서 조합 및 조립되어 DNA 복제를 촉발시킨다. 렌티바이러스-유래 에피솜은 프로모터 유도의 중단 이후 대략 24시간 내지 36시간에 붕괴가 시작된다. 벡터 19의 카고 유래 단백질 산물은 분석적 유세포측정법으로 측정된다.
실시예 8 - 카고 발현을 위한 E1 및 E2의 도입
카고를 발현시키는데서 E1 및 E2의 효과를 결정하기 위해서, 본 명세서에서 단편 1 (서열번호 2), 단편 2 (서열번호 3), 단편 3 (서열번호 4), 및 단편 4 (서열번호 5)에 대해 설명한 바와 같이, 293T 세포를 mCherry 및 전체 길이 HPV16 (서열번호 1) 긴 제어 영역 (LCR) 또는 3' 단편을 발현하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터 (즉, 도 5A의 벡터)로 형질도입시켰다.
특히, 도 5A를 참조하면, 전체 길이 LCR 또는 3' 단편은 도 5A에 도시된 LCR 영역에서 이용되었다. 보다 특히, 디자인된 구성체의 묘사는 본 명세서의 도 7의 벡터 9-13으로서 설명된다. 도 7에 도시된 추가적인 엘리먼트는 psi 패키징 엘리먼트 (서열번호 22); rev 엘리먼트 (서열번호 23); cPPT (central polypurine tract) 엘리먼트 (서열번호 24); 및 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (서열번호 25)를 의미한다.
24시간 후에, 세포는 리포펙타민 2000을 사용하여 HPV16 E1 (서열번호 6) 및 E2 (서열번호 7)를 함유하는 플라스미드로 형질감염되었다. 2일 이후에, mCherry 발현을 FACS로 분석하였다. 이들 실험의 결과는 본 명세서의 도 6A에 도시되어 있다.
E1 및 E2가 플라스미드를 통해서 도입된 상기 실험들과 대조적으로, 두번째 세트의 실험은 하기에 기술된 대로 수행되었다. 간략하게, 293T 세포는 본 명세서에서 도 5A에 도시된 일반화된 벡터를 기반으로 mCherry 및 전체 길이 HPV16 긴 제어 영역 (LCR) (서열번호 1) 또는 보다 짧은 단편 1 (서열번호 2)을 발현하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 동시에, 세포는 HPV16 E1 (서열번호 6) 및 E2 (서열번호 7)를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되었다. 2일 이후에, mCherry 발현은 본 명세서의 도 6B에 도시된 바와 같이 FACS로 분석하였다. 본 명세서의 도 6B에 도시된 바와 같이, mCherry 세포의 상당한 백분율이 mCherry 및 전체 길이 LCR (서열번호 1) 또는 보다 짧은 단편 1 (또한 본 명세서에서 단편 1이라고도 하며, 역시 본 명세서에서 서열번호 2라고도 함)을 발현하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터가 도입되었을 때 획득되었다.
이 실시예에서 상술된 데이타는 E1 및 E2가 렌티바이러스-매개 발현을 통해 발현될 때, HPV ori (LCR) 전체 길이 및 단편의 더 강력한 발현과 그에 따라 더 활성화되었다는 것을 입증하였다.　
두번째로, 이 실시예의 데이타는 LCR 영역의 크기에 따라서 HPV ori 활성화에 차이가 존재한다는 것을 입증하였다. 예를 들어, 도 6을 참조하면, 단편 2 (서열번호 3), 3 (서열번호 4), 및 4 (서열번호 5)와 비교하여, 전체 길이 LCR (서열번호 1) 및 단편 1 (서열번호 2)을 사용했을 때 mCherry의 발현에 보다 유의한 변화가 존재하였다.
실시예 9 - VEGF의 발현
본 명세서에서 언급한 바와 같이, VEGF는 다른 것들 중에서도, 뼈 손상을 치료하기 위한 "카고" 영역으로서 선택될 수 있다. VEGF 발현 수준을 더 분석하기 위해서, 293T 세포는 HPV16 긴 제어 영역 (LCR)의 단편 1 (서열번호 2) 및 VEGF (서열번호 26)에 대한 인간 cDNA를 함유하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터가 형질도입되었다 (VEGF-함유 벡터의 일반 설명은 도 5B를 참조함). 동시에, 세포는 HPV16 E1 (서열번호 6) 및 E2 (서열번호 7)를 함유하는 렌티바이러스 벡터가 형질도입되었다. 2일 후에, 세포 배양 배지를 수집하였고 VEGF에 대한 E1ISA 키트 (Thermo Scientific)로 분석하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, VEGF 발현 벡터에 의해 VEGF 수준 (3,594 pg/mL)이 증가되었고, 이것은 E1 및 E2에 의해 더 증가되었다 (11,856 pg/mL).
상기 실시예 8에서 mCherry 결과와 유사한 방식으로, 그 결과는 LCR 영역의 길이에 따라서 HPV ori 활성화에 차이가 존재한다는 것을 입증하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, E1/E2를 첨가한 후에 VEGF 수준은 대략 3배 변화되었다. 그러므로, 전체 길이 LCR (서열번호 1) 또는 단편 1 (서열번호 2)은 낮은 수준으로 관심 유전자 (즉, VEGF)를 발현하지만, E1/E2가 도입되면, 발현의 강력한 유도가 존재하였다. 대조적으로, 검사된 다른 단편들은 더 높은 개시 수준으로 발현되었고 그리하여 E1/E2 도입 시에 감소된 차이가 존재하였다.
실시예 10 - E1 및 E2-함유 벡터의 개발
표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, Sambrook; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed.)을 비롯하여 본 명세서에 기술된 기술을 사용하여, HPV LCR 및 E1 및 E2를 함유하는 일련의 렌티바이러스 벡터를 하기에 더욱 상세하게 기술하는 바와 같이 개발하였다. 이들 벡터를 또한 본 명세서의 도 9에 도시하였다.
도 9를 참조하면, 벡터 20을 개발하였고 cDNA, 마이크로RNA, 또는 shRNA의 발현을 위한 일반적인 렌티바이러스 벡터이다. 벡터 20을 참조하면, 좌측에서 우측으로, 개발된 벡터의 핵심 성분은 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 27); psi 패키징 엘리먼트 (서열번호 22); rev 반응 엘리먼트 (RRE) (서열번호 23); 프로모터; cDNA, 마이크로RNA, shRNA 또는 다른 카고 엘리먼트; 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (서열번호 25), LCR 부분으로서, 본 명세서에서 상술한 바와 같은 LCR의 단편을 함유할 수 있는 LCR 부분; 및 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 28)이다.
도 9를 참조하면, 벡터 21을 개발하였고, E1의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터이다. 벡터 21을 참조하면, 좌측에서 우측으로, 개발된 벡터의 핵심 성분은 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 27); psi 패키징 엘리먼트 (서열번호 22); rev 반응 엘리먼트 (RRE) (서열번호 23); CMV 프로모터 (서열번호 29); E1 (서열번호 6); 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (서열번호 25); 및 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 28)이다
도 9를 참조하면, 벡터 22를 개발하였고 E1-C (카복시 말단) (서열번호 8)의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터이다. 벡터 22를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 개발된 벡터의 핵심 성분은 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 27); psi 패키징 엘리먼트 (서열번호 22); rev 반응 엘리먼트 (RRE) (서열번호 23); CMV 프로모터 (서열번호 29); E1-C (서열번호 8); 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (서열번호 25); 및 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 28)이다.
도 9를 참조하면, 벡터 23을 개발하였고 E2 (HPV 16) (서열번호 7)를 발현하기 위한 렌티바이러스 벡터이다. 벡터 23을 참조하면, 좌측에서 우측으로, 개발된 벡터의 핵심 성분은 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 27); psi 패키징 엘리먼트 (서열번호 22); rev 반응 엘리먼트 (RRE) (서열번호 23); UbiC 프로모터 (서열번호 30); E2 (HPV16) (서열번호 7); 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (서열번호 25); 및 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 28)이다.
도 9를 참조하면, 벡터 24를 개발하였고 E2-11 (HPV11) (서열번호 9)의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터이다. 벡터 24를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 개발된 벡터의 핵심 성분은 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 27); psi 패키징 엘리먼트 (서열번호 22); rev 반응 엘리먼트 (RRE) (서열번호 23); UbiC 프로모터 (서열번호 30); E2-11 (HPV11) (서열번호 9); 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (서열번호 25); 및 긴 말단 반복부 엘리먼트 (서열번호 28)이다.
도 9를 참조하면, 벡터 25를 개발하였고 E1-T2A-E2 (서열번호 10)의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터이다. 벡터 25를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 개발된 벡터의 핵심 성분은 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 27); psi 패키징 엘리먼트 (서열번호 22); rev 반응 엘리먼트 (RRE) (서열번호 23); CMV 프로모터 (서열번호 29); E1-T2A-E2 (서열번호 10); 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (서열번호 25); 및 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 28)이다.
도 9를 참조하면, 벡터 26을 개발하였고 E1-T2A-E2 (서열번호 10) 및 전체 길이 LCR (서열번호 1) 또는 이의 단편 (예를 들어, 서열번호 2-5)의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터이다. 벡터 26을 참조하면, 좌측에서 우측으로, 개발된 벡터의 핵심 성분은 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 27); psi 패키징 엘리먼트 (서열번호 22); rev 반응 엘리먼트 (RRE) (서열번호 23); CMV 프로모터 (서열번호 29); E1-T2A-E2 (서열번호 10); 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (서열번호 25); LCR 부분, 및 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 28)이다.
역시 도 9를 참조하면, 벡터 27는 예를 들어, cDNA, 항체, 마이크로RNA, 또는 shRNA를 발현하기 위한 일반 렌티바이러스 벡터를 도시한다. 벡터 27을 참조하면, 좌측에서 우측으로, 개발된 벡터의 핵심 성분은 긴 말단 반복부 부분 (서열번호 27); psi 패키징 엘리먼트 (서열번호 22); rev 반응 엘리먼트 (RRE) (서열번호 23); 프로모터; cDNA. 마이크로RNA, shRNA 또는 다른 카고 엘리먼트; 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (서열번호 25); EBV ori (서열번호 31); 및 긴 말단 반복부 엘리먼트 (서열번호 28)이다.
본 명세서에 상술된 선형 벡터는 벡터 20의 원형화를 도시한, 예를 들어 도 10에 도시된 바와 같이, 세포 내에서 원형화된다 (도 9에 도시된 바와 같음). 본 명세서에 상술된 실험의 목적을 위해서, 도 10은 3' 및 5' 긴 말단 반복부 (LTR) 상에 위치된 화살표와 같은 프라이머 세트를 상술한다. 이 프라이머 세트는 렌티바이러스 벡터의 에피솜 형태를 증폭하기 위해 디자인되었고, 벡터의 통합된 형태를 증폭하지 않는다. 렌티바이러스 에피솜의 검출을 위해 적절한 프라이머는 하기 서열을 함유한다:
3'LTR Fwd CTAATTCACTCCCAACGAAG (서열번호 11); 및
5'LTR Rev GCCGAGTCCTGCGTCGAGAG (서열번호 12).
본 명세서에서 상술하는 실험에서, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터 카피수는 벡터 21 또는 벡터 22 또는 벡터 23 또는 벡터 24와 조합하여 이용되는 벡터 20의 조합에 의해 조절되었다. 대안적으로, 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터 카피수는 벡터 25 또는 벡터 26과 조합하여 이용되는 벡터 20의 조합에 의해 조절되었다.
실시예 11 - LCR 단편 및 관련 벡터의 개발
본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 본 명세서에서 상술하는 벡터의 LCR 부분은 단편 예컨대 단편 1 (서열번호 2), 단편 2 (서열번호 3), 단편 3 (서열번호 4); 및 단편 4 (서열번호 5)의 사용을 통해서 변형될 수 있고 변형되었다.
본 명세서에 기술된 LCR 및 단편의 게놈 구성은 도 11에 도시되어 있다. 거기서, 전체 길이 LCR (상부)은 일련의 AP1, YY1, E1, 및 E2 결합 부위를 함유한다. 예를 들어, 도 11에 도시된 바와 같이, 단편 1 (서열번호 2), 단편 2 (서열번호 3), 단편 3 (서열번호 4), 및 단편 4 (서열번호 5)는 일련의 AP1, YY1, 및 E2 결합 부위가 감소되는 증가된 5' 절단에 따른 증가된 LCR을 나타낸다. LCR 단편을 사용하는 렌티바이러스 벡터가 본 명세서에 상술되어 있다 (예를 들어, 도 7 및 본 명세서의 관련 실시예).
실시예 12 - LCR 단편 및 E1/E2 변이체를 함유하는 벡터의 검사
본 명세서에 상술된 다양한 LCR 단편을 함유하는 벡터를 검사하기 위해서, 293T 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같이 전체 길이 HPV16 긴 제어 영역 (LCR) 또는 단편 1 (서열번호 2), 단편 2 (서열번호 3), 단편 3 (서열번호 4), 및 단편 4 (서열번호 5)를 함유하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다 (예를 들어, 도 7 및 본 명세서의 관련 실시예 참조).
24시간 후에, 세포는 리포펙타민 2000을 사용하여 HPV16 E1 (서열번호 6) 및 E2 (서열번호 7)를 함유하는 플라스미드로 형질감염되었다. 2일 후에, DNA는 qPCR에 의한 분석을 위해 추출되었다. 렌티바이러스 벡터의 에피솜 형태에 특이적인 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머를 사용하여 에피솜 카피수를 결정하였다. 특히, 이 프라이머 세트는 오직 1-LCR 및 2-LCR 에피솜만을 증폭시켰다. 이 실시예에 대한 데이타는 도 12에 도시되어 있다. 거기서, LCR 및 이의 단편과 연관된 수는 E1 및 E2의 첨가 이후에 각 조건에 대한 배수-변화 증가를 반영한다.
도 12에 도시된 바와 같이, 전체 길이 LCR 및 Frag 1에 대한 기초 에피솜 카피수는 초저였다. 예를 들어, 이들 2가지 조건 (즉, 전체 길이 LCR 및 Frag 1)의 경우, 기초 에피솜 카피수는 세포 당 0.020 미만의 에피솜 카피였다. Frag 2, Frag 3, 및 Frag 4 구성체에 대한 기초 에피솜 카피수는 약간 더 높았다. 예를 들어, 이들 3가지 조건 (즉, Frag 2, Frag 3, 및 Frag 4)의 경우에, 기초 에피솜 카피수는 세포 당 0.020 또는 그를 초과하는 에피솜 카피였다. 기초 에피솜 카피수 데이타는 검사된 조건 각각에 대해 상대적 배수-변화에 영향을 미쳤다. 도 12에 도시된 바와 같이, E1/E2가 시스템에 도입되었을 때, 전체 길이 LCR 구성체는 에피솜 카피수에서 267배 변화의 증가를 야기시켰다. E1/E2가 시스템에 도입되었을 때, Frag 1 구성체는 에피솜 카피수에서 362배 변화의 증가를 야기시켰다. E1/E2가 시스템에 도입되었을 때, Frag 2 구성체는 에피솜 카피수에서 6배 변화의 증가를 야기시켰다. E1/E2가 시스템에 도입되었을 때, Frag 3 구성체는 에피솜 카피수에서 61배 변화의 증가를 야기시켰다. E1/E2가 시스템에 도입되었을 때, Frag 4 구성체는 에피솜 카피수에서 7배 변화의 증가를 야기시켰다. 도 12에 상술된 데이타는 본 명세서의 도 20에서 개별 형식으로 또한 재계측되었다.
관련 실험의 별개 세트에서, 분석은 HPV LCR 및 이의 3' 단편을 함유하는 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터로부터 mCherry 발현에 대해 수행되었다. 간략하게, 293T 세포는 mCherry 및 전체 길이 HPV16 긴 제어 영역 (LCR) 또는 단편 1 (서열번호 2), 단편 2 (서열번호 3), 단편 3 (서열번호 4), 및 단편 4 (서열번호 5)를 발현하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터가 형질도입되었다. 동시에, 세포는 HPV16 E1 (서열번호 6) 및 E2 (서열번호 7)를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되었다. 2일 후에, mCherry 발현을 FACS로 분석하였다.
도 13A에 도시된 바와 같이, mCherry 세포의 백분율은 검사된 조건 각각에 대해 확인된다. LCR 및 이의 단편과 연관된 수는 E1 및 E2의 첨가 이후에 각 조건에 대한 배수-변화 증가를 반영한다.
관련 실험의 별개 세트에서, 293T 세포는 mCherry 및 이전에 서열번호 1로서 식별된 전체 길이 HPV16 긴 제어 영역을 발현하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터가 형질도입되었다. 동시에, 세포는 단일 벡터 (도 9의 벡터 25 참조)로부터 HPV16 E1-T2A-E2 (서열번호 10)를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되었다. 2일 후에, mCherry 발현을 FACS를 통해 분석하였고 데이타는 도 13B에 도시하였다. 이에 도시된 바와 같이, HPV16 E1-T2A-E2 (서열번호 10)의 형질도입은 양성 mCherry 세포에서 상당한 증가를 야기하였다.
관련 실험의 별개 세트에서, 분석은 E1, E1-C, 및 E2-11의 첨가 이후에 HPV LCR을 함유하는 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터를 사용하여 mCherry 발현에 대해 수행되었다. 간략하게, 293T 세포는 mCherry 및 HPV16 LCR (서열번호 1) 또는 단편 1 (서열번호 2)을 발현하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터가 형질도입되었다. 동시에, 세포는 HPV16 E1 (즉, 도 9의 벡터 21; 및 서열번호 6) 또는 E1 카복시 (C)-말단 단편 (즉, 도 9의 벡터 22; 및 서열번호 8) 및 HPV16 E2 (즉, 도 9의 벡터 23; 및 서열번호 7) 또는 HPV11 E2 (즉, 도 9의 벡터 24; 및 서열번호 9)가 형질도입되었다. 2일 후에, mCherry 발현을 FACS를 통해 분석하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, mCherry 세포의 백분율은 검사된 조건 각각에 대해 확인되었다. 검사된 조건과 연관된 수는 E1 및 E2의 첨가 이후에 각각의 조건에 대한 배수-변화 증가를 반영한다.
실시예 13 - 항체 발현
본 명세서에 언급된 바와 같이, 개시된 시스템의 특성들 중 하나는 항체를 발현하는 개시된 시스템의 유용성이다. 본 명세서에 상술된 일련의 대표적인 실험에서, 항-HER2 항체를 렌티바이러스 벡터 시스템을 사용하여 발현시켰다. 간략하게, 293T 세포는 HER2 (서열번호 13)에 대한 항체 서열 및 HPV LCR (서열번호 1) 서열을 함유하는 D64 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터 (즉, 벡터 20)로 감염시켰다.
동시에, 세포는 E1 (서열번호 6) 및 E2 (서열번호 7)를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. 3일 후에, 세포 배양 배지를 회수하였다. 항체는 단백질 A/G 아가로스 비드를 사용하여 배지로부터 정제하였다. 면역블롯은 양 항-인간 항체 (Thermo Scientific)를 사용하여 수행하였다. 항체 생산은 도 15A에 도시된 바와 같이 E1 및 E2의 첨가에 따라서 증가되었다. 더 나아가서, 도 15B에 도시된 바와 같이, 항-HER2 IgG 농도는 EasyTiter IgG 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 결정되었다.
더 나아가서, 본 명세서의 도 16에 도시된 바와 같이, 추가적인 항체는 또한 본 명세서에 개시된 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. 도 16에, 항-EGFR 항체 (서열번호 14)의 발현을 입증하는 면역블롯이 도시되어 있다. 간략하게, 293T 세포는 EGFR (하기 서열번호 14 참조)에 대한 항체 서열 및 HPV 단편 2 (서열번호 3)를 함유하는 D64 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터로 감염되었다.
24시간 후에, 세포는 E1 (서열번호 6) 및 E2 (서열번호 7)를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 감염되었다. 3일 후에, 세포 용해물 및 세포 배양 배지를 수집하였다. 항체는 단백질 A/G 아가로스 비드를 사용하여 배지로부터 정제하였고 세포 용해를 통해 세포로부터 추출되었다. 면역블롯은 세포 용해물에 대한 단백질 로딩 대조군으로서 항-액틴 (Sigma) 항체 및 양 항-인간 항체 (Thermo Scientific)를 사용하여 수행하였다. 항체 생산은 도 16에 도시된 바와 같이, E1 및 E2의 첨가에 따라서 세포 용해물과 배지 둘 모두에서 증가되었다.
실시예 14 - 마이크로RNA 발현 및 넉다운
본 명세서에 언급된 바와 같이, 개시된 시스템의 특성들 중 하나는 마이크로RNA를 발현하는 개시된 시스템의 유용성이다. 비제한적인 예로서, 서열번호 15를 기반으로 CCR5에 대한 마이크로RNA를 발현하도록 구성체를 디자인하였다.
간략하게, CCR5를 발현하는 HeLa 세포는 CCR5 (서열번호 15)에 대한 마이크로RNA 서열 및 전체 길이 HPV LCR (서열번호 1) 서열을 함유하는 D64 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터 (즉, 벡터 20)로 감염시켰다. 동시에, 세포는 E1 및 E2를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 감염되었다. 3일 후에, 세포를 수집하였고 CCR5 발현에 대해서 항-CCR5 APC-접합된 항체를 사용한 FACS 분석에 의해 분석하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, CCR5 양성 세포의 백분율은 LV-LCR miR-CCR5의 경우에 92.6%에서 70.9%로 감소되었고 E1 및 E2를 더한 LV-LCR miR-CCR5의 경우에는 44%까지 감소되었다.
관련 실험에서, CCR5에 대한 마이크로RNA 서열 및 단편 2 (서열번호 3) LCR 서열을 함유하는 D64 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터가 이용되었다. 도 18에 도시된 바와 같이, miR-CCR5 첨가 이후에 CCR 발현에서 유사한 감소가 존재하였고 E1 및 E2가 첨가되었을 때는 훨씬 더 그러하였다.
도 18을 보다 상세하게 참조하면, 상층 패널은 mCherry의 발현 수준을 기반으로, 각각 단일 도트로 표시된, 세포의 분포를 도시한다. 아래 패널은 CCR5에 대한 miRNA의 생산 및 DNA 복제의 수준과 관련된 CCR5 발현에서의 상응하는 변화를 보여준다. CCR5는 세포 표면을 염색하는데 사용되는 형광발광성 단일클론 항체에 의해 검출된다. 임의의 LV 벡터 (좌측 패널)없이, mCherry (모든 세포는 섹터 1에 있음)의 발현이 존재하지 않았고 CCR5 발현은 대략 200 형광발광 강도 유닛에서 균일하게 높다. miRCCR5를 함유하는 LV-LCR (단편 2; 서열번호 3)을 첨가하여, 우리는 mCherry의 기초 발현의 세포 (이제 섹터 2에서 발견된 세포의 55%) 및 대략 30 강도 유닛에 집중된 형광발광 강도를 갖는 새로운 개체군을 야기시키는 CCR5 발현의 일부 감소가 있는 세포를 발견하였다 (아래, 중심 패턴 상의 점선). LV-LCR miRCCR5 및 E1 및 E2 복제 단백질을 발현하는 비통합성 렌티바이러스 벡터 둘 모두를 첨가함으로써, 우리는 mCherry가 최고로 발현되는 18.8%의 세포 (섹터 3)를 확인하였고 20 미만의 형광발광 강도 유닛의 보다 더 낮은 CCR5 발현의 새로운 개체군 (그래프 3, 회색 및 점선)을 확인하였다. 이들 데이타는 CCR5 단백질의 세포 표면 발현을 감소시키는데서 생물학적으로 활성인 miRCCR5의 기초 수준을 발현하는 LCR 단편 2 (서열번호 3)를 함유하는 VIV의 능력을 입증한다. 더 나아가서, 결과는 벡터 카피수 (mCherry의 발현과 관련) 및 세포 표면 CCR5 발현의 추가 감소를 야기하는 증가된 miRCCR5 발현에 대한 E1/E2 DNA 복제 단백질 첨가의 영향을 보여준다.
실시예 15 - EBV-기반 개시인자 단백질
본 명세서에 언급된 바와 같이, 개시인자 단백질 예컨대 E1 (서열번호 6) 및 E2 (서열번호 7)는 본 명세서에 기술된 시스템의 유효성을 증가시키는데 사용된다. 현재 시스템에서 사용되는 교대된 개시인자 단백질은 EBNA-1 (서열번호 32)이다. 따라서, 일련의 실험에서, 293T 세포는 GFP 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV) OriP 서열 (서열번호 31)을 발현하는 D64V 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터 (즉, 벡터 27)가 형질도입되었다.
24시간 후에, 세포는 리포펙타민 2000을 사용해 EBV EBNA-1 (서열번호 32)을 함유하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 2일 후에, GFP 발현을 FACS를 통해 분석하였다. 도 19의 대표적인 데이타로 도시된 바와 같이, EBNA가 더해진 EBV는 증강된 GFP 발현을 야기하였다. 따라서, 이러한 데이타는 개시인자 단백질/ori 상호작용이 E1/E2 상호작용에 제한되는 것이 아니라 또한 엡스타인-바 바이러스 성분도 포함한다는 것을 입증한다.
실시예 16 - 최적화된 바이러스 전달 시스템을 구성하기 위한 LCR 단편 선택
LCR 단편 길이는 세포에서 바람직한 수준의 발현에 따라서 선택되었다. 도 20은 본 명세서의 도 12에서 생성된 에피솜 카피수 데이타를 도시한다. 보다 특히, 도 20은 본 발명의 양상에 따른 선택 규정을 예시한다. 세포 당 에피솜 카피 (Y-축)은 LCR 단편 길이 (X-축)에 따라 기록되었다. 도 20에 도시된 바와 같이, 세포 당 에피솜 카피로 결정되는 다양한 발현 수준은 본 명세서에서 검사된 다양한 LCR 단편에 기인하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, 우측에서 좌측으로 이동하여, 전체 길이 LCR (서열번호 1), 단편 1 (서열번호 2), 단편 2 (서열번호 3), 단편 3 (서열번호 4) 및 단편 4 (서열번호 5)에 대한 데이타는 E1/E2가 있는 경우 (검은색 도트 데이타 점) 및 없는 경우 (연회색 도트 데이타 점)로 도시된다. 도 12에 도시된 바와 같이, 세포 당 에피솜 카피로 결정되는, 기초 발현은 LCR 및 Frag 1 구성체의 경우 최저였다. 예를 들어, 이들 2가지 조건 (즉, 전체 길이 LCR 및 Frag 1)의 경우, 기초 에피솜 카피수는 세포 당 0.020 미만의 에피솜 카피였다. 기초 발현은 Frag 2, Frag 3, 및 Frag 4 조건의 경우 약간 더 높았다. 예를 들어, 이들 3가지 조건 (즉, Frag 2, Frag 3, 및 Frag 4)의 경우, 기초 에피솜 카피수는 세포 당 0.020 이상의 에피솜 카피였다.
도 11과 도 20을 참조하면, LCR의 5' 말단으로부터 증가된 결실은 핵심 기능성 엘리먼트를 제거하였다. 기초 발현은 E1/E2 단백질 첨가없이, LCR 또는 LCR의 단편이 렌티바이러스-유래된 에피솜 벡터에 존재할 때 정량적 PCR 어세이를 통해 측정된 에피솜 DNA 카피의 수로 정의되었다 (예를 들어, 연회색 도트 데이타 점). 유도성 활성은 E1 및 E2를 함유하는 발현 플라스미드를 형질감염 (예를 들어, 검은색 도트 데이터 점)시키고 나서, 정량적 PCR 어세이에서 세포 당 에피솜 DNA 카피수를 측정하기 전에 렌티바이러스-유도된 에피솜 벡터를 도입시켜서 측정되었다. E1/E2 단백질 발현 구성체가 비통합성 렌티바이러스 벡터로서 전달되었을 때 유사한 결과가 수득되었다. 본 명세서에서 상술되는 바와 같이, 기초 발현은 LCR의 단편 2, 3, 및 4에 대해 최고인 것으로 결정되었다. 이것은 도 11에 도시된 바와 같이, 기초 발현이 LCR 및 단편 1에는 존재하지만 단편 2-4에는 존재하지 않는 YY1 전사 인자 결합 부위의 존재에 의해 억제되었다는 것을 의미한다. 단편 2-4 내에서, 단편 2는 최고의 기초 발현을 가졌으며 양쪽 AP1 전사 인자 결합 부위를 포함하는 유일한 단편이었다. 따라서, YY1 부위가 제거되고 양쪽 AP1 부위는 보존되었을 때 기초 전사는 증가되었다. 본 명세서에 상술되는 바와 같이, 유도성 활성은 단편 1 및 3의 경우가 최고였고, 단편 2 및 4의 경우는 더 낮고, 온전한 LCR의 경우가 최저인 것으로 결정되었다. 단편 1에 존재하지 않지만 유도성 DNA 복제를 억제하도록 작용하는 LCR 내 미동정된 엘리먼트가 존재하였다. YY1 및 AP1 부위가 존재할 때 (단편 1), YY1 및 모든 AP1 부위를 제거한 것 (단편 3)과 비교하여 에피솜 DNA 수준은 더 낮았다. YY1 없이 AP1 부위가 존재한 경우 (단편 2) 또는 YY1, AP1 및 4개 E2 결합 부위 중 2개가 제거된 경우 (단편 4) 유도성 에피솜 DNA 형성은 중간 정도였고 LCR과 유사하였다.
도 20에 요약된 바와 같이, 본 명세서에서 상술되는 데이타는 발현의 기초 수준의 한정할 수 있는 차이 및 이러한 발현을 유도하는 능력을 입증한다. 이 데이타를 기반으로 적어도 4개 사분면의 활성이 도 20에 도시된 바와 같이 정의되었다.
도 21을 참조하면, 4개 사분면은 LCR 및 그들 관련 단편에 기인하는 다양한 정도의 활성을 나타낸다. 도 21에 도시된 바와 같이, 1사분면은 보다 작은 LCR 단편에 의한 낮은 활성이지만 4사분면보다 3-4배 더 높은 활성을 반영한다. 2사분면은 역시 보다 작은 LCR 단편에 의한 높은 활성을 반영한다. 3사분면은 이 때에는 비교적 긴 LCR 단편에 의한 더 높은 활성을 반영한다. 마지막으로, 4사분면은 비교적 긴 LCR 단편에 의한 초저 활성을 반영한다.
도 21에 상술된 바와 같이, 각각의 사분면은 특정한 바람직한 치료 과정 또는 결과와 타당하게 연관된다. 대표적인 예로서, 바람직한 치료 과정 또는 결과가 유전자 편집을 포함할 때, 1사분면에서 선택된 LCR이 선택된다. 대표적인 예로서, 바람직한 치료 과정 또는 결과가 세포 리프로그래밍을 포함할 때, 2사분면의 LCR이 선택된다. 대표적인 예로서, 바람직한 치료 과정 또는 결과가 면역 자극일 때, 3사분면의 LCR이 선택된다. 대표적인 예로서, 바람직한 치료 과정 또는 결과가 위약 효과일 때, 4사분면의 LCR이 선택될 수 있다. 따라서, 바람직한 치료 과정 또는 결과를 기반으로 다양한 LCR 단편이 현 시스템을 사용하여 적용된다.
실시예 17 - 1사분면 하에서 개체의 치료
겸상 적혈구 빈혈을 위한 치료가 디자인된다. 이 접근법에서, CD34+ 골수-유래 조혈 전구체 줄기 세포 (HPSC)를 제거하여, 생체외에서 유전자 변형으로 처리되고 자기유래 세포 요법으로서 이식된다. 전략은 태아 글로빈 발현의 강력한 억제인자인, Bcl11A 단백질의 발현을 감소시키는 억제성 miRNA의 발현에 의해 좌우된다 (Akinsheye, et al., Blood 118:19, 2011). Bcl11A 수준이 감소되는 경우, 태아 글로빈 발현이 증가되어 정상 세포 기능의 관점에서 성체 글로빈을 대체한다.
안전성 연구 우려는, 결국에, 형질도입된 CD34+ HPSC의 생존능을 감소시키게 되고, 치료 효율을 감소시키고 요법 비용을 상승시키게 되는 바이러스 벡터 용량의 극적인 증가없이, 억제성 miRNA의 충분한 수준을 발현하는 능력에 대해서 제기되었다. 렌티바이러스 벡터의 양을 증가시키지 않고 발현을 증가시키는 문제를 극복하기 위해서, 유전자 용량을 증가시킬 수 있는 비통합성 벡터가 최선의 선택권이라고 결정되었다. 먼저, Bcl11A miRNA를 발현하는 염색체외 DNA의 저용량이 Bcl11A 발현을 억제하고 태아 글로빈 발현을 상승시키는데 충분할 것인지 여부를 검사하는 것이 필수적이다.
렌티바이러스 벡터 (LVmiRBcl11A)는 적합한 프로모터 제어 하의 Bcl11A mRNA 내에서 발견되는 서열과 일치되는 가이드 서열을 갖는 합성 miRNA 구성체; 길이가 200개 뉴클레오티드인 LCR 단편을 함유하지만; E1 및/또는 E2 복제 단백질의 부수적 발현은 없는 표준적이고 일반적으로 허용되는 임상 등급 벡터 골격 및 패키징 시스템 (인테그라제 기능은 돌연변이에 의해 불활성화됨)을 사용해 구축된다.
LVmiRBcl11A는 5의 감염 다중도에서, 형질도입되는 세포의 빈도를 최대화하고 HPSC 세포 사멸은 최소로 하는 조건에서 HPSC를 형질도입시키는데 사용된다. 형질도입된 세포는 적절한 세포수감소 조건화 이후에 본래 도너의 골수로 이식된다. 시험 참가자는 형질도입된 세포의 빈도, 세포 당 염색체외 DNA의 카피 및 태아 글로빈 발현 수준을 결정하기 위해 모니터링된다. 이러한 1사분면 접근법은 세포 당 염색체외 DNA의 낮은 카피수를 생산하고 LVmiRBcl11A의 낮은 치료적 용량을 구성한다고 타당하게 예측된다.
실시예 18 - 2사분면 하에서 개체의 치료
치료는 겸상 적혈구 빈혈과 관련된 세포 리프로그래밍에 대해 디자인된다. 이러한 접근법에서, CD34+ 골수-유래 조혈 전구체 줄기 세포 (HPSC)를 제거하고, 생체외에서 유전자 변형으로 처리하며 자기유래 세포 요법으로서 이식된다. 전략은 태아 글로빈 발현의 강력한 억제인자인, Bcl11A 단백질의 발현을 감소시키는 억제성 mRNA의 발현에 의해 좌우된다. Bcl11A 수준이 감소될 때, 태아 글로빈 발현이 증가되어 정상 세포 기능의 관점에서 성체 글로빈을 대체한다.
결국에, 형질도입된 CD34+ HPSC의 생존능을 감소시키게 되고, 치료의 효율을 감소시키고, 요법 비용을 상승시키게 되는 바이러스 벡터 용량의 극적인 증가없이 억제성 miRNA의 충분한 수준을 발현시키는 능력에 대한 우려가 제기되었다.
렌티바이러스 벡터의 양을 증가시키지 않고 발현을 증가시키는 문제를 극복하기 위해서, 유전자 용량을 다양화할 수 있는 비통합성 벡터가 최선의 선택안이라고 결정된다. 1사분면 조건 (E1 및/또는 E2 복제 단백질의 부수적 발현없이 짧은 LCR 단편) (즉, 실시예 17)을 사용한 초기 검사 이후에, Bcl11A miRNA를 발현하는 염색체외 DNA의 고용량이 Bcl11A 발현을 억제하고 태아 글로빈 발현을 상승시키는데 충분할지 여부를 검사하는 것이 필수적이다. 짧은 LCR을 사용하는 유전자 용량의 유도성 성질 및 E1 및/또는 E2 복제 단백질의 부수적 발현에 기인하여, CD34+ HPSC 생존능을 감소시키는 렌티바이러스 벡터 용량을 상승시키지 않고 5배를 초과하게 유전자 용량을 증가시키기 위해서, E1 및/또는 E2 단백질의 일시적 발현을 위한 비통합성 렌티바이러스 벡터와 함께, 동일한 용량의 LVmiRBcl11A를 전달할 수 있다.
렌티바이러스 벡터 (LVmiRBcl11A)는 적합한 프로모터 제어 하에 Bcl11A mRNA 내에서 발견되는 서열과 일치되는 가이드 서열을 갖는 합성 miRNA 구성체; 길이가 200개 뉴클레오티드인 LCR 단편을 함유하는 표준의 일반적으로 허용되는 임상 등급의 벡터 골격 및 패키징 시스템 (인테그라제 기능은 돌연변이에 의해 불활성화됨)을 사용하여 구축되며; E1 및/또는 E2 복제 단백질은 DNA 복제를 제어하기 위해 LCR을 함유하지 않는 비통합성 렌티바이러스 벡터 상에서 발현된다.
LVmiRBcl11A를 사용하여 5의 감염 다중도에서, 형질도입된 세포의 빈도를 최대화하고 HPSC 세포 사멸은 최소로 하는 조건에서 HPSC를 형질도입시킨다. 형질도입된 세포는 적절한 세포수감소 조건화 이후에 본래 도너의 골수에 이식된다. 시험 참여자는 형질도입된 세포의 빈도, 세포 당 염색체외 DNA의 카피 및 태아 글로빈 발현의 수준을 결정하기 위해 모니터링된다. 이러한 2사분면 접근법은 세포 당 염색체외 DNA의 높은 카피수를 생산하고 LVmiRBcl11A의 높은 치료적 용량을 구성한다고 합리적으로 예측된다.
실시예 17 및 18에 표시된 연구들은 치료의 효율 및 역가를 최대화하기 위해 LVmiRBcl11A로 CD34+ HPSC를 형질도입시키기 위한 최적 조건을 결정하도록 비교된다.
실시예 19 - 3사분면 하에서 개체의 치료
HIV 질환에 대해 제안된 수동 면역 치료는 감수성 T 세포에 대한 바이러스의 부착 및 침투를 촉진하는 세포 표면 인테그린 수용체 알파4베타7을 결실시키기 위한 CRISP-Cas9 유전자 편집의 사용을 포함한다. 치료 전략은 말초 혈액으로부터 T 세포의 단리와 이후에 알파4베타7 유전자 서열에 특이적인 가이드 RNA를 포함하는 항-알파4베타7 CRISPR-Cas9 구성체를 운반하는 렌티바이러스에 의한 형질도입을 포함한다. 단리된 T 세포는 알파4베타7 수용체를 결실시키기 위해 치료적 렌티바이러스가 형질도입된다. 다음으로 세포를 주입을 통해 신체로 복귀된다. 순환계로 되돌아가면, 이들 HIV-내성 세포는 그 수가 증가될 수 있고 HIV 복제에 저항하는 능력을 포함한 정상 면역 기능을 제공하기 시작할 것이다. 고 용량의 CRISPR-Cas9 렌티바이러스 벡터가 알파4베타7 유전자의 균일한 결실을 획득하는데 요구될 것으로 예상된다. 제안된 임상 시험 (즉, 실시예 20)의 한 부문은 CRISPR-Cas9알파4베타7을 발현하지만 거의 검출불가한 수준 이상으로 카피수를 증가시키는데 필요한 E1 및/또는 E2 복제 단백질은 포함하지 않는 긴 형태의 LCR을 갖는 비통합성 렌티바이러스 벡터를 이용한다.
임상 시험의 이러한 치료 부문에서, 동일한 LVCRISPR-Cas9알파4베타7이 전달되고, LCR을 함유하지 않고 DNA 복제를 할 수 없는 구성체에서 E1 및/또는 E2 복제 단백질을 발현하는 비통합성 렌티바이러스의 부수적 전달이 존재한다. 이것은 T 세포를 효율적으로 형질도입시키는데 필요한 LV-CRISPR-Cas9알파4베타7의 양을 변경시키지 않고 유전자 용량을 증가시키게 될 것이며, 시험의 고용량 치료 부문으로 간주된다.
렌티바이러스 벡터가 구축되어 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터 골격 내에 다음의 엘리먼트들이 함유된다: E1 및/또는 E2 복제 단백질이 제공될 때 유도될 수 있는 720개 뉴클레오티드 길이의 LCR; CRISPR-Cas9 단백질 및 알파4베타7-상보성 가이드 RNA의 유전자 전사에 적합한 프로모터를 함유하는 발현 카세트. 벡터는 정상 바이러스 DNA 통합을 차단하도록 인테그라제 유전자에 돌연변이를 가지고 패키징된다. 제2 비통합성 렌티바이러스가 사용되어 LCR을 함유하지 않고 DNA 복제를 할 수 없는 구성체로 E1 및/또는 E2 DNA 복제 단백질의 일시적 발현을 제공한다.
T 세포는 유전자 용량이 E1 및/또는 E2 단백질의 첨가에 의해 증가되었기 때문에 높은 CRISPR-Cas9 및 가이드 RNA 발현을 갖는 비통합성 렌티바이러스 벡터에 의해 생체외에서 변형된다. 세포는 실험의 치료 부문에서 임상 시험 대상체에게 복귀된다. 임상 결과는 HIV의 존재 하에서 알파4베타7 유전자 결실을 보유한 T 세포 비율의 증가, 항레트로바이러스 약물의 부재 하에서 HIV 복제의 자연 제어 및 T 세포 기능의 개선을 기반으로 평가된다. 이러한 3사분면 접근법은 HIV의 존재 하에서 알파4베타7 유전자 결실을 보유하는 T 세포 비율의 증가, 항레트로바이러스 약물의 부재 하에서 HIV 복제의 자연 제어 및 T 세포 기능의 개선을 야기한다고 합리적으로 예측된다.
실시예 20 - 4사분면 하에서 개체의 치료
HIV 질환에 대해 제안된 치료는 감수성 T 세포에 대한 바이러스의 부착 및 침투를 촉진하는 세포 표면 인테그린 수용체 알파4베타7을 결실시키기 위해 CRISPR-Cas9 유전자 편집의 사용을 포함한다. 치료 전략은 말초 혈액으로부터 T 세포의 단리이후에 알파4베타7 유전자 서열에 특이적인 가이드 RNA를 포함하는 항-알파4베타7 CRISPR-Cas9 구성체를 운반하는 렌티바이러스에 의한 형질도입을 포함한다. 단리된 T 세포는 알파4베타7 수용체를 결실시키기 위해 치료적 렌티바이러스가 형질도입되며, 이후에 세포를 주입을 통해 신체로 복귀시킨다. 순환계로 복귀되면, 이들 HIV-내성 세포는 그 수가 증가될 수 있고 HIV 복제에 저항하는 능력을 포함하여 정상 면역 기능을 제공하기 시작할 것이다.
이 치료의 임상 연구를 개시하기 이전에, 벡터 안전성 및 특이성을 확증하는 것이 중요하다. 핵심적인 우려는 알파4베타7-특이적 가이드 RNA를 포함하는 치료적 유전자 카세트가 통합되어서 유전독성을 초래할 수 있는지 여부이다. 그러한 우려는 가이드 RNA가 인간 게놈에 직접적인 상동성을 가지며 장기간 CRISPR-Cas9 발현이 가능한 구성체를 통합시키는 효과가 세포 형질전환 및 암을 포함한 예상치 않은 결과를 가질 수 있기 때문에 존재한다.
알파4베타7 유전자로 벡터 통합이 높은 확률 사건이 아니라는 것을 입증하기 위해서, 비통합성 일시적 벡터를 사용하여 주입 이전에 T 세포를 변형시키는 한 부문을 포함한 임상 대조군 시험이 디자인된다. 시험관내 연구는 생체내에서 분석되는 사건의 수가 시험관내 또는 생체외 연구에 의해 모의될 수 있는 것보다 훨씬 많기 때문에 위험성을 평가하는데 충분하지 않다.
일반적으로 사용되는 바이러스 벡터 골격 내에 다음의 엘리먼트들을 함유하는 렌티바이러스 벡터가 구축된다: E1 및 E2 단백질의 부수적 발현이 없는 720개 뉴클레오티드 길이의 LCR; CRISPR-Cas9 단백질 및 알파4베타7-상보적 가이드 RNA의 유전자 전사에 적합한 프로모터를 함유하는 발현 카세트. 벡터는 정상 바이러스 DNA 통합을 차단하기 위해 인테그라제 유전자에 돌연변이를 갖게 패키징된다.
T 세포는 유전자 용량이 E1 및/또는 E2 단백질 없이 증가되지 않기 때문에 최소의 CRISPR-Cas9 또는 가이드 RNA 발현을 갖는 비통합성 렌티바이러스 벡터로 생체외에서 변형된다. 세포는 연구의 대조군 부문의 임상 시험 대상체에게 복귀시키고 바이러스 DNA 통합의 패턴은 염색체 DNA를 추출하고 염색체 DNA와 재조합된 바이러스 DNA를 동정하기 위해 적절한 PCR-기반 연구를 수행하여 측정된다. 임의의 통합된 DNA의 재조합 부위는 고속-대량 DNA 시퀀싱에 의해 결정되어 부작용에 대한 잠재성을 의미하는 잠재적인 유전독성 사건으로서 기록된다. 이러한 4사분면 접근법이 재조합 사건을 모니터링하기 위한 효과 대조군으로 제공된다는 것은 합리적으로 예측된다.
서열
하기 서열을 본 명세서에서 참조한다:
본 발명의 바람직한 일정 구체예를 본 명세서에 기술하고 특별히 예시하였지만, 이러한 구체예에 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다양한 변형이 본 발명의 범주 및 정신을 벗어나지 않고 이에 가해질 수 있다.
<110> AMERICAN GENE TECHNOLOGIES <120> NON-INTEGRATING VIRAL DELIVERY SYSTEM AND METHODS RELATED THERETO <130> 70612.01693 <140> WO PCT/US2017/036433 <141> 2016-07-07 <150> WO PCT/US2016/66185 <151> 2016-12-12 <150> US 62/347,552 <151> 2016-06-08 <150> US 62/431,760 <151> 2016-12-08 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 946 <212> DNA <213> human papillomavirus type 16 <400> 1 aaggccaaac caaaatttac attaggaaaa cgaaaagcta cacccaccac ctcatctacc 60 tctacaactg ctaaacgcaa aaaacgtaag ctgtaagtat tgtatgtatg ttgaattagt 120 gttgtttgtt gtgtatatgt ttgtatgtgc ttgtatgtgc ttgtaaatat taagttgtat 180 gtgtgtttgt atgtatggta taataaacac gtgtgtatgt gtttttaaat gcttgtgtaa 240 ctattgtgtc atgcaacata aataaactta ttgtttcaac acctactaat tgtgttgtgg 300 ttattcattg tatataaact atatttgcta catcctgttt ttgttttata tatactatat 360 tttgtagcgc caggcccatt ttgtagcttc aaccgaattc ggttgcatgc tttttggcac 420 aaaatgtgtt tttttaaata gttctatgtc agcaactatg gtttaaactt gtacgtttcc 480 tgcttgccat gcgtgccaaa tccctgtttt cctgacctgc 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gacgattccg aaatagcgta taagtacgcc 1140 cagctcgcag ataccaattc caatgccagc gcatttctga agtccaattc acaggcaaag 1200 atagtaaagg attgcgctac aatgtgccgc cattataaaa gagcggagaa aaagcagatg 1260 tcaatgtccc aatggatcaa gtataggtgt gatcgcgttg atgatggcgg tgattggaag 1320 cagatcgtga tgttcctccg ctatcaaggc gtagaattca tgtcattcct gaccgccctg 1380 aaacgcttcc tgcagggcat tcctaaaaaa aattgcatcc tgctgtatgg cgcggctaac 1440 actggaaaga gtctgttcgg catgagcctt atgaagttcc tccagggatc cgtgatatgc 1500 tttgtgaaca gcaaatcaca cttttggctt cagccattgg cagatgcaaa gatcggcatg 1560 ctggacgacg ccacagtccc atgctggaac tacatagacg ataatctccg aaacgcattg 1620 gacggcaatc tggtgagcat ggacgtcaag cacaggcctc tggtgcaact gaagtgtccc 1680 cctctcctca ttacgtcaaa catcaacgcc ggaacagata gtcggtggcc gtacctgcac 1740 aatagacttg tggtgtttac atttcctaat gaattcccat ttgacgaaaa cggcaatcca 1800 gtatacgagc tgaatgacaa gaactggaag agttttttct ctaggacatg gtccaggttg 1860 agtctccacg aagacgagga taaagagaat gacggagact ctttgcccac ttttaagtgc 1920 gtgtctggac aaaataccaa taccctgtga 1950 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caccaacatc tgtaccttcc atccccccag 4620 atgtatcagg atttagtatt actacttcaa ctgataccac acctgctata ttagatatta 4680 ataatactgt tactactgtt actacacata ataatcccac tttcactgac ccatctgtat 4740 tgcagcctcc aacacctgca gaaactggag ggcattttac actttcatca tccactatta 4800 gtacacataa ttatgaagaa attcctatgg atacatttat tgttagcaca aaccctaaca 4860 cagtaactag tagcacaccc ataccagggt ctcgcccagt ggcacgccta ggattatata 4920 gtcgcacaac acaacaagtt aaagttgtag accctgcttt tgtaaccact cccactaaac 4980 ttattacata tgataatcct gcatatgaag gtatagatgt ggataataca ttatattttc 5040 ctagtaatga taatagtatt aatatagctc cagatcctga ctttttggat atagttgctt 5100 tacataggcc agcattaacc tctaggcgta ctggcattag gtacagtaga attggtaata 5160 aacaaacact acgtactcgt agtggaaaat ctataggtgc taaggtacat tattattatg 5220 atttgagtac tattgatcct gcagaagaaa tagaattaca aactataaca ccttctacat 5280 atactaccac ttcacatgca gcctcaccta cttctattaa taatggctta tatgatattt 5340 atgcagatga ctttattaca gatacttcta caaccccggt accatctgta ccctctacat 5400 ctttatcagg ttatattcct gcaaatacaa 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acattacagg ctaacaaaag tgaagttcca 6300 ctggatattt gtacatctat ttgcaaatat ccagattata ttaaaatggt gtcagaacca 6360 tatggcgaca gcttattttt ttatttacga agggaacaaa tgtttgttag acatttattt 6420 aatagggctg gtgctgttgg tgaaaatgta ccagacgatt tatacattaa aggctctggg 6480 tctactgcaa atttagccag ttcaaattat tttcctacac ctagtggttc tatggttacc 6540 tctgatgccc aaatattcaa taaaccttat tggttacaac gagcacaggg ccacaataat 6600 ggcatttgtt ggggtaacca actatttgtt actgttgttg atactacacg cagtacaaat 6660 atgtcattat gtgctgccat atctacttca gaaactacat ataaaaatac taactttaag 6720 gagtacctac gacatgggga ggaatatgat ttacagttta tttttcaact gtgcaaaata 6780 accttaactg cagacgttat gacatacata cattctatga attccactat tttggaggac 6840 tggaattttg gtctacaacc ccccccagga ggcacactag aagatactta taggtttgta 6900 acatcccagg caattgcttg tcaaaaacat acacctccag cacctaaaga agatcccctt 6960 aaaaaataca ctttttggga agtaaattta aaggaaaagt tttctgcaga cctagatcag 7020 tttcctttag gacgcaaatt tttactacaa gcaggattga aggccaaacc aaaatttaca 7080 ttaggaaaac gaaaagctac acccaccacc tcatctacct ctacaactgc taaacgcaaa 7140 aaacgtaagc tgtaagtatt gtatgtatgt tgaattagtg ttgtttgttg tttatatgtt 7200 tgtatgtgct tgtatgtgct tgtaaatatt aagttgtatg tgtgtttgta tgtatggtat 7260 aataaacacg tgtgtatgtg tttttaaatg cttgtgtaac tattgtgtga tgcaacataa 7320 ataaacttat tgtttcaaca cctactaatt gtgttgtggt tattcattgt atataaacta 7380 tatttgctac aatctgtttt tgttttatat atactatatt ttgtagcgcc agcggccatt 7440 ttgtagcttc aaccgaattc ggttgcatgc tttttggcac aaaatgtgtt tttttaaata 7500 gttctatgtc agcaactata gtttaaactt gtacgtttcc tgcttgccat gcgtgccaaa 7560 tccctgtttt cctgacctgc actgcttgcc aaccattcca ttgtttttta cactgcacta 7620 tgtgcaacta ctgaatcact atgtacattg tgtcatataa aataaatcac tatgcgccaa 7680 cgccttacat accgctgtta ggcacatatt tttggcttgt tttaactaac ctaattgcat 7740 atttggcata aggtttaaac ttctaaggcc aactaaatgt caccctagtt catacatgaa 7800 ctgtgtaaag gttagtcata cattgttcat ttgtaaaact gcacatgggt gtgtgcaaac 7860 cgttttgggt tacacattta caagcaactt atataataat actaa 7905 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ggatccgcca ccatggagag cgacgagagc ggc 33 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gaattcttag cgagatccgg tggagcc 27 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> human immunodeficiency virus <400> 22 tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga g 41 <210> 23 <211> 233 <212> DNA <213> human immunodeficiency virus <400> 23 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat 60 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcc 233 <210> 24 <211> 118 <212> DNA <213> human immunodeficiency virus <400> 24 ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60 agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaattca aaatttta 118 <210> 25 <211> 590 <212> DNA <213> woodchuck hepatitis virus <400> 25 aatcaacctc tgattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct 590 <210> 26 <211> 1239 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 atgacggaca gacagacaga caccgccccc agccccagct accacctcct ccccggccgg 60 cggcggacag tggacgcggc ggcgagccgc gggcaggggc cggagcccgc gcccggaggc 120 ggggtggagg gggtcggggc tcgcggcgtc gcactgaaac ttttcgtcca acttctgggc 180 tgttctcgct tcggaggagc cgtggtccgc gcgggggaag ccgagccgag cggagccgcg 240 agaagtgcta gctcgggccg ggaggagccg cagccggagg agggggagga ggaagaagag 300 aaggaagagg agagggggcc gcagtggcga ctcggcgctc ggaagccggg ctcatggacg 360 ggtgaggcgg cggtgtgcgc agacagtgct ccagccgcgc gcgctcccca ggccctggcc 420 cgggcctcgg gccggggagg aagagtagct cgccgaggcg ccgaggagag cgggccgccc 480 cacagcccga gccggagagg gagcgcgagc cgcgccggcc ccggtcgggc ctccgaaacc 540 atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 600 gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 660 gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 720 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 780 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 840 aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 900 agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 960 aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 1020 aagtcctgga gcgtgtacgt tggtgcccgc tgctgtctaa tgccctggag cctccctggc 1080 ccccatccct gtgggccttg ctcagagcgg agaaagcatt tgtttgtaca agatccgcag 1140 acgtgtaaat gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca aggcgaggca gcttgagtta 1200 aacgaacgta cttgcagatg tgacaagccg aggcggtga 1239 <210> 27 <211> 180 <212> DNA <213> human papillomavirus type 16 <400> 27 ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60 tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120 gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180 180 <210> 28 <211> 250 <212> DNA <213> human papillomavirus type 16 <400> 28 tggaagggct aattcactcc caacgaagat aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta 240 gttcatgtca 250 <210> 29 <211> 350 <212> DNA <213> cytomegalovirus <400> 29 actagtatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 60 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 120 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 180 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 240 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tttatataag cagagctcgt ttagtgaacc 300 gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga 350 <210> 30 <211> 1162 <212> DNA <213> human papillomavirus type 16 <400> 30 gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60 agacgaaggg cgcaggagcg ttcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120 ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180 cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240 gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300 taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360 cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagttgc gggctgctgg gctggccggg 420 gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 480 tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcacaaaa 540 tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtaa ggcgggctgt gaggtcgttg 600 aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg 660 cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa 720 gtttgtcact gactggagaa ctcgggtttg tcgtctggtt gcgggggcgg cagttatgcg 780 gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg cctcgtcgtg tcgtgacgtc 840 acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc 900 ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga atcgacaggc 960 gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg 1020 tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag 1080 tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa 1140 ttttcagtgt tagactagta aa 1162 <210> 31 <211> 1687 <212> DNA <213> Epstein-Barr Virus <400> 31 atgaggatag catatgctac ccggatacag attaggatag catatactac ccagatatag 60 attaggatag catatgctac ccagatatag attaggatag cctatgctac ccagatataa 120 attaggatag catatactac ccagatatag attaggatag catatgctac ccagatatag 180 attaggatag cctatgctac ccagatatag attaggatag catatgctac ccagatatag 240 attaggatag catatgctat ccagatattt gggtagtata tgctacccag atataaatta 300 ggatagcata tactacccta atctctatta ggatagcata tgctacccgg atacagatta 360 ggatagcata tactacccag atatagatta ggatagcata tgctacccag atatagatta 420 ggatagccta tgctacccag atataaatta ggatagcata tactacccag atatagatta 480 ggatagcata tgctacccag atatagatta ggatagccta tgctacccag atatagatta 540 ggatagcata tgctatccag atatttgggt agtatatgct acccatggca acattagccc 600 accgtgctct cagcgacctc gtgaatatga ggaccaacaa ccctgtgctt ggcgctcagg 660 cgcaagtgtg tgtaatttgt cctccagatc gcagcaatcg cgcccctatc ttggcccgcc 720 cacctactta tgcaggtatt ccccggggtg ccattagtgg ttttgtgggc aagtggtttg 780 accgcagtgg ttagcggggt tacaatcagc caagttatta cacccttatt ttacagtcca 840 aaaccgcagg gcggcgtgtg ggggctgacg cgtgccccca ctccacaatt tcaaaaaaaa 900 gagtggccac ttgtctttgt ttatgggccc cattggcgtg gagccccgtt taattttcgg 960 gggtgttaga gacaaccagt ggagtccgct gctgtcggcg tccactctct ttccccttgt 1020 tacaaataga gtgtaacaac atggttcacc tgtcttggtc cctgcctggg acacatctta 1080 ataaccccag tatcatattg cactaggatt atgtgttgcc catagccata aattcgtgtg 1140 agatggacat ccagtcttta cggcttgtcc ccaccccatg gatttctatt gttaaagata 1200 ttcagaatgt ttcattccta cactagtatt tattgcccaa ggggtttgtg agggttatat 1260 tggtgtcata gcacaatgcc accactgaac cccccgtcca aattttattc tgggggcgtc 1320 acctgaaacc ttgttttcga gcacctcaca tacaccttac tgttcacaac tcagcagtta 1380 ttctattagc taaacgaagg agaatgaaga agcaggcgaa gattcaggag agttcactgc 1440 ccgctccttg atcttcagcc actgcccttg tgactaaaat ggttcactac cctcgtggaa 1500 tcctgacccc atgtaaataa aaccgtgaca gctcatgggg tgggagatat cgctgttcct 1560 taggaccctt ttactaaccc taattcgata gcatatgctt cccgttgggt aacatatgct 1620 attgaattag ggttagtctg gatagtatat actactaccc gggaagcata tgctacccgt 1680 ttagggt 1687 <210> 32 <211> 1926 <212> DNA <213> Epstein-Barr Virus <400> 32 atgtctgacg aggggccagg tacaggacct ggaaatggcc taggagagaa gggagacaca 60 tctggaccag aaggctccgg cggcagtgga cctcaaagaa gagggggtga taaccatgga 120 cgaggacggg gaagaggacg aggacgagga ggcggaagac caggagcccc gggcggctca 180 ggatcagggc caagacatag agatggtgtc cggagacccc aaaaacgtcc aagttgcatt 240 ggctgcaaag ggacccacgg tggaacagga gcaggagcag gagcgggagg ggcaggagca 300 ggaggggcag gagcaggagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggaggg 360 gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga 420 ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca ggaggagggg caggaggggc aggagcagga 480 ggaggggcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagc aggaggaggg 540 gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggaggggcag gaggggcagg agcaggagga 600 ggggcaggag caggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca 660 ggaggagggg caggaggggc aggaggggca ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca 720 ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg 780 gcaggagcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggagca 840 ggaggagggg caggaggggc aggagcagga ggggcaggag gggcaggagc aggaggggca 900 ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggagcagga 960 ggggcaggag caggaggtgg aggccggggt cgaggaggca gtggaggccg gggtcgagga 1020 ggtagtggag gccggggtcg aggaggtagt ggaggccgcc ggggtagagg acgtgaaaga 1080 gccagggggg gaagtcgtga aagagccagg gggagaggtc gtggacgtgg agaaaagagg 1140 cccaggagtc ccagtagtca gtcatcatca tccgggtctc caccgcgcag gccccctcca 1200 ggtagaaggc catttttcca ccctgtaggg gaagccgatt attttgaata ccaccaagaa 1260 ggtggcccag atggtgagcc tgacgtgccc ccgggagcga tagagcaggg ccccgcagat 1320 gacccaggag aaggcccaag cactggaccc cggggtcagg gtgatggagg caggcgcaaa 1380 aaaggagggt ggtttggaaa gcatcgtggt caaggaggtt ccaacccgaa atttgagaac 1440 attgcagaag gtttaagagc tctcctggct aggagtcacg tagaaaggac taccgacgaa 1500 ggaacttggg tcgccggtgt gttcgtatat ggaggtagta agacctccct ttacaaccta 1560 aggcgaggaa ctgcccttgc tattccacaa tgtcgtctta caccattgag tcgtctcccc 1620 tttggaatgg cccctggacc cggcccacaa cctggcccgc taagggagtc cattgtctgt 1680 tatttcatgg tctttttaca aactcatata tttgctgagg ttttgaagga tgcgattaag 1740 gaccttgtta tgacaaagcc cgctcctacc tgcaatatca gggtgactgt gtgcagcttt 1800 gacgatggag tagatttgcc tccctggttt ccacctatgg tggaaggggc tgccgcggag 1860 ggtgatgacg gagatgacgg agatgaagga ggtgatggag atgagggtga ggaagggcag 1920 gagtga 1926

Claims (51)

  1. 비통합성 바이러스 전달 시스템으로서, 시스템은
    바이러스 운반체로서, 결함성 인테그라제 유전자를 함유하는 것인 바이러스 운반체;
    5' 절단된 제16형 인간 파필로마바이러스 (HPV16) 긴 제어 영역 (LCR)을 포함하는 이종성 인간 파필로마바이러스 (HPV) 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원;
    이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 제1 서열로서, 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E1, E1-C, E2, E2-11, E1-T2A-E2 및 EBNA-1 에서 선택되고, 제1 서열의 발현은 유도성인 서열; 및
    적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA를 코딩하는 제2 서열
    을 포함하며,
    적어도 하나의 개시인자 단백질은 발현되었을 때 제2 서열의 발현을 조절하는 기능을 하고,
    5' 절단된 HPV16 LCR 은 하기에서 선택되는 서열을 포함하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템:
    a) 3 개의 AP1 결합 부위, 1 개의 E1 결합 부위, 4 개의 E2 결합 부위 및 1 개의 YY1 결합 부위를 포함하는 서열,
    b) 2 개의 AP1 결합 부위, 1 개의 E1 결합 부위 및 3 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열,
    c) 1 개의 E1 결합 부위 및 3 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열, 및
    d) 1 개의 E1 결합 부위 및 2 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열;
    여기서, 결합 부위는 이의 임의의 기능성 엘리먼트를 포함함.
  2. 제1항에 있어서, 바이러스 운반체는 렌티바이러스인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  3. 삭제
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  9. 제1항에 있어서, 5' 절단된 HPV16 LCR은 서열번호 1의 적어도 약 200개 뉴클레오티드의 5' 절단형, 서열번호 1의 적어도 약 300개 뉴클레오티드의 5' 절단형, 서열번호 1의 적어도 약 400개 뉴클레오티드의 5' 절단형, 서열번호 1의 적어도 약 500개 뉴클레오티드의 5' 절단형, 서열번호 1의 적어도 약 600개 뉴클레오티드의 5' 절단형, 또는 서열번호 1의 적어도 약 700개 뉴클레오티드의 5' 절단형 중 적어도 하나를 포함하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 5' 절단된 HPV16 LCR은 Frag 1 (서열번호 2), Frag 2 (서열번호 3), Frag 3 (서열번호 4), 또는 Frag 4 (서열번호 5)를 포함하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E1을 포함하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  13. 제1항에 있어서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E2를 포함하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  14. 제1항에 있어서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질은 EBNA-1을 포함하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  15. 제1항에 있어서, 시스템은 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질을 포함하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질은 E1 및 E2인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  17. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열은 단일 개별 플라스미드 또는 비통합 바이러스 벡터 상에 존재하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  18. 제1항에 있어서, 시스템은 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질을 포함하고, 적어도 2종의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열은 단일 개별 플라스미드 또는 비통합 바이러스 벡터 상에 존재하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  19. 제1항에 있어서, 시스템은 이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 2종의 개시인자 단백질을 포함하고, 제1 개시인자 단백질에 대한 서열 및 제2 개시인자 단백질에 대한 서열은 개별 플라스미드 또는 비통합 바이러스 벡터 상에 존재하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  20. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 유전자 산물은 항체, 항체 단편, 또는 성장 인자를 포함하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  21. 제1항에 있어서, miRNA는 CCR5 miRNA를 포함하는 것인 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  22. 제1항의 비통합성 바이러스 전달 시스템 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  23. 세포에서 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA를 발현하는 방법에 사용하기 위한 비통합성 바이러스 전달 시스템으로서, 방법은
    세포를 비통합성 바이러스 전달 시스템의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 시스템은
    바이러스 운반체로서, 결함성 인테그라제 유전자를 함유하는 것인 바이러스 운반체;
    5' 절단된 제16형 인간 파필로마바이러스 (HPV16) 긴 제어 영역 (LCR)을 포함하는 이종성 인간 파필로마바이러스 (HPV) 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원;
    이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 제1 서열로서, 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E1, E1-C, E2, E2-11, E1-T2A-E2 및 EBNA-1 에서 선택되고, 제1 서열의 발현은 유도성인 서열; 및
    적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA 를 코딩하는 제2 서열
    을 포함하며,
    적어도 하나의 개시인자 단백질은 발현되었을 때 제2 서열의 발현을 조절하는 기능을 하고,
    5' 절단된 HPV16 LCR 은 하기에서 선택되는 서열을 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템:
    a) 3 개의 AP1 결합 부위, 1 개의 E1 결합 부위, 4 개의 E2 결합 부위 및 1 개의 YY1 결합 부위를 포함하는 서열,
    b) 2 개의 AP1 결합 부위, 1 개의 E1 결합 부위 및 3 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열,
    c) 1 개의 E1 결합 부위 및 3 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열, 및
    d) 1 개의 E1 결합 부위 및 2 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열;
    여기서, 결합 부위는 이의 임의의 기능성 엘리먼트를 포함함.
  24. 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA를 이의 발현을 필요로 하는 대상체에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한 비통합성 바이러스 전달 시스템으로서, 방법은
    비통합성 바이러스 전달 시스템의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 시스템은
    바이러스 운반체로서, 결함성 인테그라제 유전자를 함유하는 것인 바이러스 운반체;
    5' 절단된 제16형 인간 파필로마바이러스 (HPV16) 긴 제어 영역 (LCR)을 포함하는 이종성 인간 파필로마바이러스 (HPV) 바이러스 에피솜의 복제 기원;
    이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 제1 서열로서, 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E1, E1-C, E2, E2-11, E1-T2A-E2 및 EBNA-1 에서 선택되고, 제1 서열의 발현은 유도성인 서열; 및
    적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA 를 코딩하는 제2 서열
    을 포함하며,
    적어도 하나의 개시인자 단백질은 발현되었을 때 제2 서열의 발현을 조절하는 기능을 하고,
    5' 절단된 HPV16 LCR 은 하기에서 선택되는 서열을 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템:
    a) 3 개의 AP1 결합 부위, 1 개의 E1 결합 부위, 4 개의 E2 결합 부위 및 1 개의 YY1 결합 부위를 포함하는 서열,
    b) 2 개의 AP1 결합 부위, 1 개의 E1 결합 부위 및 3 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열,
    c) 1 개의 E1 결합 부위 및 3 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열, 및
    d) 1 개의 E1 결합 부위 및 2 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열;
    여기서, 결합 부위는 이의 임의의 기능성 엘리먼트를 포함함.
  25. 제24항에 있어서, 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 서열은 단일 개별 플라스미드 상에 존재하고, 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E1 또는 E2인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  26. 제25항에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA의 제1 발현 수준을 개시하기 위해 단일 개별 플라스미드의 제1 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA의 제2 발현 수준을 개시하기 위해 단일 개별 플라스미드의 제2 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  28. 제27항에 있어서, 제2 양은 제1 양 미만이고, 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA의 발현 수준은 감소되는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  29. 제27항에 있어서, 제2 양은 제1 양을 초과하고, 적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA의 발현 수준은 증가되는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  30. 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA의 발현을 유도하는 방법에 사용하기 위한 비통합성 바이러스 전달 시스템으로서,
    바이러스 운반체로서, 결함성 인테그라제 유전자를 함유하는 것인 바이러스 운반체;
    1사분면 인자, 2사분면 인자, 3사분면 인자, 및 4사분면 인자 중 적어도 하나;
    이종성 바이러스 에피솜의 DNA 복제 기원에 특이적인 적어도 하나의 개시인자 단백질을 코딩하는 제1 서열로서, 적어도 하나의 개시인자 단백질은 E1, E1-C, E2, E2-11, E1-T2A-E2 및 EBNA-1 에서 선택되고, 제1 서열의 발현은 유도성인 서열; 및
    적어도 하나의 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA를 코딩하는 제2 서열
    을 포함하고,
    1사분면 인자는 제1 5' 절단된 제16형 인간 파필로마바이러스 (HPV16) 긴 제어 영역 (LCR)을 포함하고,
    2사분면 인자는 적어도 하나의 개시인자 단백질 및 제2 5' 절단된 HPV16 LCR을 포함하고,
    3사분면 인자는 적어도 하나의 개시인자 단백질, 및 제3 5' 절단된 HPV16 LCR을 포함하고,
    4사분면 인자는 제4 5' 절단된 HPV16 LCR 을 포함하고,
    적어도 하나의 개시인자 단백질은 발현되었을 때 제2 서열의 발현을 조절하는 기능을 하고,
    제1 또는 제2 5' 절단된 HPV16 LCR 은 하기에서 선택되는 서열을 포함하고:
    a) 2 개의 AP1 결합 부위, 1 개의 E1 결합 부위 및 3 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열,
    b) 1 개의 E1 결합 부위 및 3 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열, 및
    c) 1 개의 E1 결합 부위 및 2 개의 E2 결합 부위를 포함하는 서열; 및
    제3 또는 제4 5' 절단된 HPV16 LCR 은, 3 개의 AP1 결합 부위, 1 개의 E1 결합 부위, 4 개의 E2 결합 부위 및 1 개의 YY1 결합 부위를 코딩하는 서열을 포함하고,
    여기서, 결합 부위는 이의 임의의 기능성 엘리먼트를 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  31. 제30항에 있어서, 제1 5' 절단된 HPV16 LCR 및 제2 5' 절단된 HPV16 LCR 중 적어도 하나는 API 전사 인자 결합 부위 또는 이의 임의의 일부분을 결여하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  32. 제30항에 있어서, 제1 5' 절단된 HPV16 LCR 및 제2 5' 절단된 HPV16 LCR 중 적어도 하나는 하나 이하의 API 전사 인자 결합 부위 또는 이의 일부분을 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  33. 제30항에 있어서, 제1 5' 절단된 HPV16 LCR 및 제2 5' 절단된 HPV16 LCR 중 적어도 하나는 둘 이하의 API 전사 인자 결합 부위 또는 이의 일부분을 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  34. 삭제
  35. 제30항에 있어서, 제1 5' 절단된 HPV16 LCR 및 제2 5' 절단된 HPV16 LCR 중 적어도 하나는 약 200 염기쌍 미만의 길이를 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  36. 제30항에 있어서, 제1 5' 절단된 HPV16 LCR 및 제2 5' 절단된 HPV16 LCR 중 적어도 하나는 약 200 염기쌍 내지 약 300 염기쌍의 길이를 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  37. 제30항에 있어서, 제1 5' 절단된 HPV16 LCR 및 제2 5' 절단된 HPV16 LCR 중 적어도 하나는 약 300 염기쌍 내지 약 550 염기쌍의 길이를 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  38. 제30항에 있어서, 제3 5' 절단된 HPV16 LCR 및 제4 5' 절단된 HPV16 LCR 중 적어도 하나는 약 550 염기쌍 내지 약 750 염기쌍의 길이를 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  39. 삭제
  40. 제30항에 있어서, 제1 5' 절단된 HPV16 LCR 및 제2 5' 절단된 HPV16 LCR 중 적어도 하나는 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  41. 삭제
  42. 제30항에 있어서, 제3 5' 절단된 HPV16 LCR, 또는 제4 5' 절단된 HPV16 LCR 중 적어도 하나는 서열번호 2를 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  43. 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 비통합성 바이러스 전달 시스템으로서,
    상기 방법은, 제30항 내지 제33항, 제35항 내지 제38항, 제40항 및 제42항 중 어느 한 항의 비통합성 바이러스 전달 시스템의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  44. 제43항에 있어서, 1사분면 인자 또는 2사분면 인자를 포함하는 바이러스 전달 시스템은 제1 유전자 카고를 더 포함하고, 3사분면 인자 또는 4사분면 인자를 포함하는 바이러스 전달 시스템은 제2 유전자 카고를 더 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 상기 방법은 세포를 1사분면 인자를 포함하는 바이러스 전달 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하여, 세포 당 약 0.02 초과의 제1 유전자 카고의 기초 에피솜 카피수를 초래하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  46. 제44항에 있어서, 상기 방법은 세포를 4사분면 인자를 포함하는 바이러스 전달 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하여, 세포 당 약 0.02 미만의 제2 유전자 카고의 기초 에피솜 카피수를 초래하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  47. 제30항에 있어서, 유전자, 유전자 산물, shRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 대상 RNA의 발현의 유도는 치료 과정 또는 생리학적 결과 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  48. 제30항에 있어서, 1사분면 인자는 유전자 편집 또는 안전성 연구 중 적어도 하나에 사용되는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  49. 제30항에 있어서, 2사분면 인자는 세포 리프로그래밍, 장시간 작용성 성장 인자, 또는 체크포인트 억제 중 적어도 하나에 사용되는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  50. 제30항에 있어서, 3사분면 인자는 수동 면역, 면역 자극, 또는 전사/분화 인자 중 적어도 하나를 초래하는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
  51. 제30항에 있어서, 4사분면 인자는 위약 대조군 또는 용량 상승 중 적어도 하나에 사용되는 것인, 비통합성 바이러스 전달 시스템.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010045659A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 American Gene Technologies International Inc. Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
JP6890831B2 (ja) 2015-07-08 2021-06-18 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
CN108883100B (zh) 2016-01-15 2022-11-25 美国基因技术国际有限公司 用于活化γ-δT细胞的方法和组合物
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
WO2017139065A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 American Gene Technologies International Inc. Hiv vaccination and immunotherapy
US10767183B2 (en) 2016-03-09 2020-09-08 American Gene Technologies International Inc. Combination vectors and methods for treating cancer
WO2017213697A1 (en) * 2016-06-08 2017-12-14 American Gene Technologies International Inc. Non-integrating viral delivery system and methods related thereto
IL300730A (en) 2016-07-08 2023-04-01 American Gene Tech Int Inc Pre-HIV vaccine and immunotherapy
US11583562B2 (en) 2016-07-21 2023-02-21 American Gene Technologies International Inc. Viral vectors for treating Parkinson's disease
EP3607072A4 (en) 2017-04-03 2021-01-06 American Gene Technologies International Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF PHENYLCETONURISM
CA3170630A1 (en) * 2020-03-03 2021-09-10 American Gene Technologies International Inc. On demand expression of exogenous factors in lymphocytes to treat hiv
CN112029803A (zh) * 2020-09-21 2020-12-04 西人马联合测控（泉州）科技有限公司 一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途
CN113046330B (zh) * 2021-03-23 2023-03-21 中吉智药(南京)生物技术有限公司 携带红系基因编辑系统的慢病毒及药物
CN114395586A (zh) * 2022-01-12 2022-04-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 非整合慢病毒载体系统在基因编辑器递送中的应用
CN114317610A (zh) * 2022-01-27 2022-04-12 上海本导基因技术有限公司 一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040214158A1 (en) 2000-05-12 2004-10-28 Neerja Sethi Treatment of human papillomavirus (hpv)-infected cells
US20070026521A1 (en) 2000-04-28 2007-02-01 Genzyme Corporation Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
US20140336245A1 (en) 2011-11-22 2014-11-13 The Children Hospital Of Philadelphia Virus vectors for highly efficient transgene delivery

Family Cites Families (136)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5668255A (en) 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
PL179877B1 (pl) 1993-07-13 2000-11-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Zdefektowany replikacyjnie adenowirus, linia komórkowa do infekowania zdefektowanym adenowirusem oraz srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL
AU8828598A (en) * 1997-08-15 1999-03-08 Rubicon Laboratory, Inc. Retrovirus and viral vectors
US6399383B1 (en) * 1997-10-28 2002-06-04 Maxygen, Inc. Human papilloma virus vectors
CA2324225A1 (en) 1998-03-20 1999-09-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
EP1115290B1 (en) 1998-10-01 2009-03-04 University of Southern California Retroviral gene delivery system and methods of use
US6156514A (en) 1998-12-03 2000-12-05 Sunol Molecular Corporation Methods for making recombinant cells
US6410013B1 (en) 1999-01-25 2002-06-25 Musc Foundation For Research Development Viral vectors for use in monitoring HIV drug resistance
WO2000072886A1 (en) 1999-05-26 2000-12-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Episomally replicating lentiviral vectors
AU2001265187A1 (en) 2000-05-30 2001-12-11 Baylor College Of Medicine Chimeric viral vectors for gene therapy
NO314588B1 (no) 2000-09-04 2003-04-14 Bionor Immuno As HIV-peptider, antigener, vaksinesammensetning, immunoassay- testsett og en fremgangsmåte for å påvise antistoffer indusert av HIV
US7122181B2 (en) 2000-12-19 2006-10-17 Research Development Foundation Lentiviral vector-mediated gene transfer and uses thereof
US20030138444A1 (en) 2001-08-18 2003-07-24 Myriad Genetics, Incorporated Composition and method for treating HIV infection
US20030119770A1 (en) 2001-08-02 2003-06-26 Zhennan Lai Intercellular delivery of a herpes simplex virus VP22 fusion protein from cells infected with lentiviral vectors
US7737124B2 (en) 2001-09-13 2010-06-15 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell
US20070203333A1 (en) 2001-11-30 2007-08-30 Mcswiggen James RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2005521393A (ja) 2002-03-20 2005-07-21 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｈｉｖ治療
US20040142416A1 (en) 2002-04-30 2004-07-22 Laipis Philip J. Treatment for phenylketonuria
US20040161412A1 (en) 2002-08-22 2004-08-19 The Cleveland Clinic Foundation Cell-based VEGF delivery
WO2004021995A2 (en) 2002-09-06 2004-03-18 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Departement Of Health And Human Services Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy
CA2504915A1 (en) 2002-11-04 2004-05-21 University Of Massachusetts Allele-specific rna interference
AU2003283174A1 (en) 2002-12-11 2004-06-30 Cytos Biotechnology Ag Method for protein production
EP1631669A2 (en) 2003-04-09 2006-03-08 Biodelivery Sciences International, Inc. Cochleate compositions directed against expression of proteins
US20060246520A1 (en) 2003-05-23 2006-11-02 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Gamma delta t cell-mediated therapy
EP1644508A1 (en) 2003-07-11 2006-04-12 Cytos Biotechnology AG Gene expression system
US20050019927A1 (en) 2003-07-13 2005-01-27 Markus Hildinger DECREASING GENE EXPRESSION IN A MAMMALIAN SUBJECT IN VIVO VIA AAV-MEDIATED RNAi EXPRESSION CASSETTE TRANSFER
US20050138677A1 (en) 2003-09-16 2005-06-23 Pfister Herbert J. Transgenic animal model for the treatment of skin tumors
EP1678292A4 (en) 2003-09-18 2008-05-07 Univ Emory IMPROVED MVA VACCINES
WO2005033282A2 (en) * 2003-10-01 2005-04-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc Polyamide compositions and therapeutic methods for treatment of human papilloma virus
US20080039413A1 (en) 2003-10-21 2008-02-14 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
WO2005081911A2 (en) 2004-02-25 2005-09-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF HIV INFECTION USING TRIM5α
US20060058255A1 (en) 2004-03-01 2006-03-16 Jianzhu Chen RNAi-based therapeutics for allergic rhinitis and asthma
TWI439284B (zh) 2004-04-09 2014-06-01 Abbvie Biotechnology Ltd 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
US20080227736A1 (en) 2004-06-03 2008-09-18 Regents Of The University Of California, Targeting Pseudotyped Retroviral Vectors
US20080131940A1 (en) 2004-06-25 2008-06-05 Robert Chiu Target Cell-Specific Short Interfering Rna and Methods of Use Thereof
CA2576925C (en) 2004-08-16 2013-12-10 The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. Method of delivering rna interference and uses thereof
WO2006039721A2 (en) 2004-10-08 2006-04-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Bisphosphonate compounds and methods for bone resorption diseases, cancer, bone pain, immune disorders, and infectious diseases
EP1647595A1 (en) 2004-10-15 2006-04-19 Academisch Medisch Centrum bij de Universiteit van Amsterdam Nucleic acids against viruses, in particular HIV
JP2008518591A (ja) 2004-11-02 2008-06-05 イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー 複製欠損アデノウイルスベクターの製造のためのアデノウイルスアンプリコンおよびプロデューサー細胞、その製造方法および用途
US7790446B2 (en) 2005-02-11 2010-09-07 Kosagen Cell Factory Oü Vectors, cell lines and their use in obtaining extended episomal maintenance replication of hybrid plasmids and expression of gene products
EP1858332A4 (en) 2005-02-16 2011-06-22 Lentigen Corp LENTIVIRUS VECTORS AND ITS USE
EP3002330A1 (en) 2005-05-27 2016-04-06 Ospedale San Raffaele S.r.l. Gene vector
WO2007015122A1 (en) 2005-08-02 2007-02-08 Genexel, Inc. Therapy for alzheimer’s disease
US20070032443A1 (en) 2005-08-02 2007-02-08 Jaeseob Kim Therapy for Alzheimer's disease
WO2007056388A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 The General Hospital Corporation Compositions and methods for modulating poly (adp-ribose) polymerase activity
GB0526211D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vectors
WO2007133674A2 (en) 2006-05-12 2007-11-22 Lentigen Corporation Lentiviral vector compositions, methods and applications
WO2007149476A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Assays for non-apoptotic cell death and uses thereof
US20080003225A1 (en) 2006-06-29 2008-01-03 Henri Vie Method for enhancing the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and uses of T cells expressing CD16 receptors
US8124752B2 (en) 2006-07-10 2012-02-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the MYC gene
EP1878440A1 (en) 2006-07-13 2008-01-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for increasing the efficiency of therapeutic antibodies using gamma delta cell activator compounds
WO2008014311A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Novartis Ag Inhibitors of undecaprenyl pyrophosphate synthase
US20080199961A1 (en) 2006-08-25 2008-08-21 Avi Biopharma, Inc. ANTISENSE COMPOSITION AND METHOD FOR INHIBITION OF miRNA BIOGENESIS
EP2415783B1 (en) 2006-10-16 2016-12-14 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
EP2126137B1 (en) 2007-01-23 2017-06-07 Janssen Pharmaceutica NV Method for designing a drug regime for hiv-infected patients
CN101679466A (zh) 2007-04-12 2010-03-24 伊利诺伊大学评议会 对包括fpps、ggpps和dpps在内的多靶点效力提高的二膦酸盐化合物及方法
US20080293142A1 (en) 2007-04-19 2008-11-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Multiple shRNA Expression Vectors and Methods of Construction
EP2008656A1 (en) 2007-06-28 2008-12-31 Bergen Teknologioverforing AS Compositions for the treatment of hyperphenylalaninemia
WO2009026328A2 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Immune Disease Institute, Inc. Methods of delivery of agents to leukocytes and endothelial cells
EP2090659A1 (en) 2008-02-14 2009-08-19 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Infectious particle, process for its preparation and use thereof
US8288094B2 (en) * 2008-04-09 2012-10-16 Institut Pasteur APOBEC3 mediated DNA editing
GB0810209D0 (en) 2008-06-04 2008-07-09 Cambridge Entpr Ltd Pluripotency associated epigenetic factor
US8629334B2 (en) * 2008-07-16 2014-01-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Viral-based transient-expression vector system for trees
WO2010022195A2 (en) 2008-08-20 2010-02-25 Virxsys Corporation Non-integrating lenti/adeno-associated virus hybrid vector system
EP2342321B1 (en) 2008-09-17 2018-04-11 Isogenis, Inc. Construction of fully-deleted adenovirus-based gene delivery vectors and uses thereof
WO2010045659A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 American Gene Technologies International Inc. Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
WO2010051502A2 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof
WO2010051521A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Lentigen Corporation Cell therapy product for the treatment of hiv infection
CN102369288A (zh) 2008-11-14 2012-03-07 生命技术公司 用于工程化细胞的组合物和方法
EP2191834A1 (en) 2008-11-26 2010-06-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Compositions and methods for treating retrovirus infections
CN102438631A (zh) 2009-04-09 2012-05-02 史坦赛特股份有限公司 抗hiv干细胞及其用途
BRPI1013771A2 (pt) 2009-04-13 2016-04-05 Apceth Gmbh & Co Kg "células-tronco mesenquimais projetadas e método de uso das mesmas para tratar tumores."
US8728458B2 (en) 2009-04-30 2014-05-20 The Regents Of The University Of California Combination anti-HIV vectors, targeting vectors, and methods of use
WO2011008348A2 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Calimmune Inc. Dual vector for inhibition of human immunodeficiency virus
US20120027725A1 (en) 2009-11-30 2012-02-02 Galvin Jeffrey A Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules to treat liver cancer
CN101805750B (zh) 2009-12-29 2011-11-30 浙江大学 法呢基焦磷酸合成酶rna干扰重组慢病毒载体构建及用途
AU2011217955A1 (en) 2010-02-18 2012-08-16 Emory University Vectors expressing HIV antigens and GM-CSF and related methods for generating an immune response
WO2011119942A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Vistagen Therapeutics, Inc. Induction of ips cells using transient episomal vectors
WO2011133687A2 (en) 2010-04-20 2011-10-27 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for inhibition of beta2-adrenergic receptor degradation
SI2561078T1 (sl) 2010-04-23 2019-01-31 Cold Spring Harbor Laboratory Nove strukturno oblikovane shRNA
JP5965392B2 (ja) 2010-05-28 2016-08-03 オックスフォード バイオメディカ （ユーケー） リミテッド 脳へのレンチウイルスベクターの送達
JP5805089B2 (ja) 2010-08-10 2015-11-04 タカラバイオ株式会社 細胞集団の製造方法
EP2625294A4 (en) 2010-10-07 2014-03-26 Univ Columbia METHOD OF TREATING CANCER WITH P53 MUTATION
WO2012061075A2 (en) 2010-10-25 2012-05-10 The Regents Of The University Of California Hiv resistant and functional hematopoietic stem/progenitor cells and macrophages from induced pluripotent stem cells
BR112013021494B1 (pt) 2011-02-22 2021-09-08 California Institute Of Technology Vetor viral, polinucleotídeo isolado, uso de um vírus adeno-associado (aav) recombinante e método para produzir o mesmo
EP3318634A1 (en) 2011-04-21 2018-05-09 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating diseases involving dominant-negative or gain of function mutations
US9745631B2 (en) 2011-12-20 2017-08-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for diagnosing and treating oncogenic kras-associated cancer
KR102063195B1 (ko) 2012-02-07 2020-01-07 글로벌 바이오 테라퓨틱스, 인크. 핵산 전달의 구획화된 방법 및 이의 조성물 및 용도
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP3967323A3 (en) 2012-06-06 2022-05-04 Bionor Immuno AS Hiv vaccine
CA2879514C (en) 2012-07-17 2020-04-14 Universite De Geneve Nucleic acids for down-regulation of gene expression
US10233495B2 (en) 2012-09-27 2019-03-19 The Hospital For Sick Children Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
EP3415627A1 (en) 2012-11-13 2018-12-19 Codiak BioSciences, Inc. Delivery of therapeutic agent
WO2014089212A1 (en) 2012-12-05 2014-06-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
US9642921B2 (en) 2012-12-20 2017-05-09 Tocagen Inc. Cancer combination therapy and recombinant vectors
WO2014117050A2 (en) 2013-01-26 2014-07-31 Mirimus, Inc. Modified mirna as a scaffold for shrna
CN103184224A (zh) 2013-04-03 2013-07-03 衡阳师范学院 一种抗艾滋病病毒感染的三联miRNA及构建方法
US10501803B2 (en) 2013-05-21 2019-12-10 Max-Planck Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Isoforms of GATA6 and NKX2-1 as markers for diagnosis and therapy of cancer and as targets for anti-cancer therapy
CA2954168C (en) 2013-08-02 2023-09-19 The Regents Of The University Of California Engineering antiviral t cell immunity through stem cells and chimeric antigen receptors
WO2015042308A2 (en) 2013-09-18 2015-03-26 City Of Hope Rna-based hiv inhibitors
WO2015061491A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
PT3066201T (pt) 2013-11-07 2018-06-04 Massachusetts Inst Technology Métodos e composições relacionadas com crispr com arng reguladores
EP2878674A1 (en) 2013-11-28 2015-06-03 Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) Stable episomes based on non-integrative lentiviral vectors
GB201322091D0 (en) 2013-12-13 2014-01-29 Cambridge Entpr Ltd Modified serpins for the treatment of bleeding disorders
IL292038A (en) 2014-04-23 2022-06-01 Juno Therapeutics Inc Methods for enriching and producing immune cell populations for stress treatment
CN106536549B (zh) 2014-04-25 2020-01-17 蓝鸟生物公司 Mnd启动子嵌合抗原受体
EP3851537B1 (en) 2014-04-25 2023-12-27 Genethon Treatment of hyperbilirubinemia
EP3186365A4 (en) 2014-08-29 2018-04-25 Immunomedics, Inc. Identification of cancer genes by in-vivo fusion of human cancer cells and animal cells
ES2896401T3 (es) 2014-09-22 2022-02-24 Tanea Medical Ab Proteínas recombinantes exentas de Phe para su uso en el tratamiento de la fenilcetonuria
AU2015329696A1 (en) 2014-10-10 2017-04-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods to eliminate cancer stem cells by targeting CD47
WO2016061232A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Texas Tech University System Multiplexed shrnas and uses thereof
WO2016069716A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The Scripps Research Institute Compositions and methods comprising tyrosyl-trna synthetases and resveratrol compounds
GB201509202D0 (en) 2015-05-28 2015-07-15 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Semi-static cell culture
JP6924487B2 (ja) 2015-06-10 2021-08-25 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド 非組み込みウイルス送達システムおよびその使用の方法
JP6890831B2 (ja) 2015-07-08 2021-06-18 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
WO2017025061A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Peking University Induced extended pluripotent stem cells, methods of making and using
CN105112370B (zh) 2015-08-25 2019-02-05 杭州优善生物科技有限公司 一种体外刺激外周血γδT细胞高效增殖的方法及其应用
WO2017068077A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and products for genetic engineering
WO2017100551A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. HETEROLOGOUS UTR SEQUENCES FOR ENHANCED mRNA EXPRESSION
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
CN108883100B (zh) 2016-01-15 2022-11-25 美国基因技术国际有限公司 用于活化γ-δT细胞的方法和组合物
WO2017139065A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 American Gene Technologies International Inc. Hiv vaccination and immunotherapy
US10767183B2 (en) 2016-03-09 2020-09-08 American Gene Technologies International Inc. Combination vectors and methods for treating cancer
US20190117799A1 (en) 2016-04-01 2019-04-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
WO2017213697A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 American Gene Technologies International Inc. Non-integrating viral delivery system and methods related thereto
IL300730A (en) 2016-07-08 2023-04-01 American Gene Tech Int Inc Pre-HIV vaccine and immunotherapy
US11583562B2 (en) 2016-07-21 2023-02-21 American Gene Technologies International Inc. Viral vectors for treating Parkinson's disease
US11382941B2 (en) 2016-12-30 2022-07-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating Phenylketonuria
EP3565564A4 (en) 2017-01-09 2020-09-23 American Gene Technologies International Inc. HIV IMMUNOTHERAPY WITHOUT PRE-IMMUNIZATION STEP
EP3579847A4 (en) 2017-02-08 2020-12-09 Dana Farber Cancer Institute, Inc. MODULAR DEGRADATION OF ENDOGENOUS PROTEIN WITH HETEROBIFUNCTIONAL COMPOUNDS
EP3607072A4 (en) 2017-04-03 2021-01-06 American Gene Technologies International Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF PHENYLCETONURISM
KR20200018586A (ko) 2017-06-16 2020-02-19 아메리칸 진 테크놀로지스 인터내셔널 인코포레이티드 인간 감마-델타 t-세포를 통한 종양 세포독성의 활성화를 위한 방법 및 조성물
KR20200057766A (ko) 2017-10-02 2020-05-26 아메리칸 진 테크놀로지스 인터내셔널 인코포레이티드 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 프로모터 및 인핸서 조합을 포함하는 벡터
US11352646B2 (en) 2018-11-05 2022-06-07 American Gene Technologies International Inc. Vector system for expressing regulatory RNA
CA3137698A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Tyler LAHUSEN Optimized phenylalanine hydroxylase expression

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070026521A1 (en) 2000-04-28 2007-02-01 Genzyme Corporation Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
US20040214158A1 (en) 2000-05-12 2004-10-28 Neerja Sethi Treatment of human papillomavirus (hpv)-infected cells
US20140336245A1 (en) 2011-11-22 2014-11-13 The Children Hospital Of Philadelphia Virus vectors for highly efficient transgene delivery

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190023065A (ko) 2019-03-07
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JP2019523767A (ja) 2019-08-29
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EP3468618A2 (en) 2019-04-17
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AU2017279542A1 (en) 2018-12-06

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