KR20220150320A - Hiv 치료를 위한 림프구에서 외생성 인자의 주문형 발현 - Google Patents

Hiv 치료를 위한 림프구에서 외생성 인자의 주문형 발현 Download PDF

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Abstract

본 개시는 일반적으로 HIV의 치료 또는 억제를 위한 면역화 및 면역요법에 관한 것이다. 구현예에서, HIV 감염을 억제할 수 있는 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 T 세포-반응성 프로모터를 포함하는 치료제 카고 부분을 포함하는 바이러스 벡터를 개시한다.

Description

HIV 치료를 위한 림프구에서 외생성 인자의 주문형 발현
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 "HIV 치료를 위한 림프구에서 외생성 인자의 주문형 발현"의 명칭으로, 2020년 3월 3일 출원된 미국 가출원 제62/984,716호에 대한 우선권을 청구하고, 이의 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다.
분야
본 개시는 일반적으로 HIV의 치료 및 억제를 위한 면역요법 분야에 관한 것이다. 특히, 개시된 치료 및 억제 방법은 유전자 생산물의 전달을 위한 바이러스 벡터 및 시스템의 투여 및 HIV의 치료 및 억제를 위한 유전자 카고에 관한 것이다.
병용 항레트로바이러스 요법 (cART) (고활성 항레트로바이러스 요법 또는 HAART로서도 알려짐)은 HIV-1 복제를 제한하고 질환 진행을 지체시키지만, 약물 독성 및 약물-내성 바이러스의 출현은 HIV-감염된 사람에서 장기간 제어에 도전이 된다. 추가로, 전통적인 항-레트로바이러스 요법이, AIDS의 개시 또는 사망의 지연에는 성공적이지만, 아직 기능적 치유를 제공하지는 못한다. 대안적인 치료 전략이 필요하다.
HIV 감염에 대한 면역요법에 대한 강렬한 관심은 일반적으로 불충분하지만, 면역계가 HIV 복제의 제한에서 주요한 역할을 한다는 것을 의미하는 최근에 생긴 데이터에 의해서 촉발되었다. 세포용해성 T 세포 (CTL) 기능의 유지에 결정적인, 바이러스-특이적 T-헬퍼 세포가 아마도 역할을 하는 듯 하다. 바이러스혈증은 또한 중화 항체에 의해 영향을 받지만, 그들은 일반적으로 HIV 감염에서 규모가 낮고 생체내에서 바이러스 변이체의 진화를 따라가지 못한다.
이들 데이터와 함께 HIV-특이적 세포 면역 반응의 강도 및 폭이 소위 HIV 면역요법을 통해서 임상적 이득을 가질 수 있음을 시사한다. 일부 연구들이 HIV에 대한 백신을 검사하였지만, 지금까지 성공은 제한적이었다. 추가적으로, 유전자 요법 기술을 이용하여 HIV 면역요법을 증대시키려는데 관심이 있었지만, 다른 면역요법 접근법과 마찬가지로, 성공이 제한적이었다. 따라서, 여전히 HIV의 개선된 치료에 대한 요구가 남아있다.
일 양태에서, 치료제 카고 부분을 포함하는 바이러스 벡터가 제공되고, 치료제 카고 부분은 HIV 감염을 억제할 수 있는 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 T 세포-반응성 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 가용성 외생성 인자는 항-HIV 항체를 포함한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 VRC01 항체 또는 3BNC117 항체이다.
구현예에서, 적어도 하나의 가용성 외생성 인자는 가용성 CD4 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 구현예에서, 가용성 CD4 또는 이의 단편은 이량체 가용성 CD4를 포함한다. 구현예에서, 이량체 가용성 CD4는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 76, 또는 SEQ ID NO: 77과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 CMV 프로모터, IFN-α 프로모터, IFN-β 프로모터, IFN-γ 프로모터, EF-1α 프로모터, IL-2 프로모터, CD69 프로모터, 또는 이의 단편을 포함한다. 구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 IL-2 프로모터를 포함한다.
구현예에서, 치료제 카고 부분은 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 분비 신호를 더 포함한다. 구현예에서, 분비 신호는 항체 분비 신호 또는 IL-2 분비 신호를 포함한다.
구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, 또는 SEQ ID NO: 87과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, 또는 SEQ ID NO: 87을 포함한다.
구현예에서, 치료제 카고 부분은 Vif, Tat, 및 CCR5 중 어느 하나 이상을 표적으로 하는 적어도 하나의 소형 RNA를 더 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, 또는 SEQ ID NO: 64와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, 또는 SEQ ID NO: 64를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 Vif, Tat, 및 CCR5 중 어느 2개를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 Vif, Tat, 및 CCR5를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 Vif, Tat, 및 CCR5를 포함하는 마이크로RNA 클러스터를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 가용성 외생성 인자는 가용성 CD4 또는 이의 단편을 포함한다. 구현예에서, 가용성 CD4 또는 이의 단편은 이량체 가용성 CD4를 포함한다. 구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 CMV 프로모터, IFN-α 프로모터, IFN-β 프로모터, IFN-γ 프로모터, EF-1α 프로모터, IL-2 프로모터, CD69 프로모터, 또는 이의 단편을 포함한다. 구현예에서, 치료제 카고 부분은 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 분비 신호를 더 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 SEQ ID NO: 65와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 SEQ ID NO: 65를 포함한다.
일 양태에서, 패키징 세포에 의해 생산되고 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자가 제공되고, 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질; 및 본 명세서에 기술된 임의의 바이러스 벡터를 포함한다.
일 양태에서, 렌티바이러스 입자로 감염된 림프구를 포함하는 변형된 세포가 제공되고, 렌티바이러스 입자는 림프구를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질; 및 본 명세서에 기술된 임의의 바이러스 벡터를 포함한다. 구현예에서, 림프구는 T 세포, B 세포, NKT 세포, 또는 NK 세포를 포함한다. 구현예에서, 림프구는 T 세포이고, T 세포는 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 또는 γδ T 세포를 포함한다. 구현예에서, 림프구는 T 세포이고, T 세포는 CD4 T 세포를 포함한다.
일 양태에서, Gag, Pol, 및 Rev 유전자의 각각으로부터 유래되는 기능성 단백질을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드; 표적 세포를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질을 발현하기 위한 DNA 서열을 포함하는 엔벨로프 플라스미드; 및 본 명세서에 기술된 임의의 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 전달 시스템을 제공한다. 구현예에서, 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드는 제1 및 제2 헬퍼 플라스미드를 포함하고, 제1 헬퍼 플라스미드는 Gag 및 Pol 유전자로부터 유래되는 기능성 단백질을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 코딩하고, 제2 헬퍼 플라스미드는 Rev 유전자로부터 유래되는 단백질을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 코딩한다.
일 양태에서, HIV를 치료하는 방법이 제공되고, 방법은 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 자극제의 치료적 유효량과 접촉시키는 단계로서, 접촉은 생체외에서 수행되는 것인 단계; PBMC를 생체외에서 렌티바이러스 입자로 형질도입시키는 단계로서, 렌티바이러스 입자는 PBMC를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질; 및 본 명세서에 기술된 임의의 바이러스 벡터를 포함하는 것인 단계; 및 적어도 1일 동안 형질도입된 PBMC를 배양하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 방법은 형질도입된 PBMC를 대상체에게 주입시키는 단계를 더 포함한다. 구현예에서, 자극제는 Gag 펩티드 또는 HIV 백신을 포함한다.
본 개시에서,
도 1 은 예시적인 3-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 2 는 예시적인 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 3A-3C 는 원형 버전과 상이한 가용성 외생성 인자를 코딩하는 벡터를 도시한다. 도 3A 는 외생성 인자 VRC01을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 도시한다. 도 3B 는 외생성 인자 sCD4를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 도시한다. 도 3C 는 외생성 인자 sCD4-IgG1 Fc를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 도시한다.
도 4 는 선형 버전으로 다양한 가용성 외생성 인자를 코딩하는 벡터를 도시한다.
도 5 는 CD4 T 세포에서 VRC01 항체를 외생적으로 발현시킨 다음에 CD4 T 세포를 HIV로 챌린지시키기 위한 프로토콜의 개략도를 도시한다.
도 6 은 시험관내에서 HIV 감염에 대한 T 세포 생산된 3BNC117 항체의 효과를 보여주는 유세포측정 데이터를 도시한다.
도 7 은 CD4 T 세포에서 sCD4를 외생적으로 발현시킨 다음 CD4 T 세포를 HIV로 챌린지시키기 위한 프로토콜의 개략도를 도시한다.
도 8A 및 8B 는 sCD4를 발현하는 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 CD4 T 세포에 의한 HIV 억제의 효과를 보여주는 유세포측정 데이터를 도시한다.
도 9 는 CD4 T 세포에서 HIV 항체를 외생적으로 발현시키기 위한 프로토콜의 개략도를 도시한다.
도 10 은 HIV 항체 VRC01 (AGT111) 및 3BNC117 (AGT112)을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입 후 CD4 T 세포의 펩티드 자극의 효과를 보여주는 유세포측정 데이터를 도시한다.
도 11 은 CD4 T 세포를 자극하고 난 후 HIV 항체를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입시키기 위한 프로토콜의 개략도를 도시한다.
도 12 는 세포를 자극시킨 후에 VRC01 (AGT111) 및 3BNC117 (AGT112) 항체를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입시켰을 때 CD4 T 세포 중 세포내 항체 축적을 보여주는 유세포측정 데이터를 도시한다.
도 13A 는 시험관내에서 HIV 감염에 대한 T 세포 생산된 VRC01 항체의 효과를 보여주는 유세포측정 데이터를 도시한다.
도 13B 는 T 세포에서 VRC01 항체 발현 및 HIV 복제에 대한 VRC01 항체 발현의 효과를 보여주는 그래프 데이터를 도시한다.
도 14 는 VRC01을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입시킨 세포에서 C8166 T 세포주 중 VRC01의 발현을 도시한다.
도 15 는 HIV 항체를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 C8166 세포주에 형질도입시킨 후에 세포를 HIV로 챌린지하기 위한 프로토콜의 개략도를 도시한다.
도 16 은 VRC01 항체 (AGT111)를 코딩하는 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 C8166 세포에서 HIV의 감염율을 보여주는 유세포측정 데이터를 도시한다.
도 17 은 C8166 세포에 VRC01 항체 (AGT113)를 코딩하는 렌티바이러스를 형질도입시킨 후 배양 중 항체 발현을 도시한다.
도 18 은 VRC01 항체가 C8166 T 세포주에서 발현될 때 HIV 감염에 대한 효과를 보여주는 유세포측정 데이터를 도시한다.
도 19 는 sCD4가 C8166 T 세포주에서 발현될 때 HIV 감염에 대한 효과를 보여주는 유세포측정 데이터를 도시한다.
도 20 은 미토겐 자극된 CD4 T 세포에 VRC01 항체 (AGT113)를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입시킨 후 CD4 T 세포에서 VRC01 발현을 도시한다.
도 21 은 VRC01 (AGT113)을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입시킨 후 CD4 T 세포의 펩티드 자극의 효과를 보여주는 유세포측정 데이터를 도시한다.
도 22 는 CD4 T 세포를 자극시키고, 그들을 HIV 항체 VRC01 및 3BNC117을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨 후에, 세포를 HIV로 챌린지시키기 위한 프로토콜의 개략도를 도시한다.
도 23 은 VRC01 (AGT113)을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입시키고 HIV를 처리한 CD4 T 세포의 감염율을 보여주는 유세포측정을 도시한다.
도 24 는 (i) 가용성 CD4 (AGT116) 및 (ii) 가용성 CD4 및 IgG1 Fc (AGT117)를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입시킨 CD4 T 세포의 HIV 감염율을 비교한 유세포측정을 도시한다.
도 25 는 (i) Vif, Tat, 및 CCR5를 표적화하는 마이크로RNA를 코딩하는 마이크로RNA 클러스터 (AGT103) 및 (ii) Vif, Tat, 및 CCR5, 및 가용성 CD4를 표적화하는 마이크로RNA를 코딩하는 마이크로RNA 클러스터 (AGT118)를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입시킨 CD4 T 세포의 감염율을 비교하는 유세포측정을 도시한다.
도 26 은 EF-1α, IFNγ, 및 IL-2 프로모터를 코딩하는 벡터를 사용한 CD4 T 세포 중 sCD4의 발현 수준을 보여주는 유세포측정을 도시한다.
도 27 은 렌티바이러스 벡터 AGT117 (SEQ ID NO: 10), AGT124 (SEQ ID NO: 88), 및 AGT125 (SEQ ID NO: 89)가 형질도입된 CD4 T 세포의 HIV 감염율을 비교하는 유세포측정을 도시한다.
도 28A 및 28B 는 sCD4를 사용한 T 세포의 HIV 감염을 억제하는 예상 기전을 보여주는 개략도를 도시한다.
도 29 는 가용성 CD4, 및 인간 IgG1 유래 Fc 영역의 상이한 버전: 버전 1; (SEQ ID NO: 9 (sCD4(D1+D2)-IgG1 Fc); 버전 2 (SEQ ID NO: 76 (sCD4-IgG1 Fc (항체 분비 신호 존재) 버전 2); 및 버전 3 (SEQ ID NO: 77 (sCD4-IgG Fc (항체 분비 신호 존재) 버전 3)을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 렌티바이러스의 C8166 T 세포에서 상대 발현 수준을 도시한다.
도 30 은 Fc 수용체 감마 II를 발현하는 CD4-음성 단핵구양 세포 (THP-1)에 대한 CD4-IgG 버전 2 (SEQ ID NO: 76) (sCD4-IgGv2) 및 버전 3 (SEQ ID NO: 77) (sCD4-IgGv3)의 세포-무함유 (상청액)의 결합을 도시한다.
도 31A-31G 는 C8166 세포 단독 또는 CD4-IgG 버전 1 (SEQ ID NO: 9) (sCD4-IgGv1) 또는 버전 2 (SEQ ID NO: 76) (sCD4-IgGv2) 렌티바이러스 벡터의 형질도입 후 HIV 감염의 유세포측정 분석을 도시한다. 2종의 상이한 바이러스 균주를 비교하였는데, 양쪽 버전은 세포를 감염에서 보호하였고 버전 2가 세포에 대해 더 높은 보호성을 부여하였다. 도 31A 는 바이러스가 도입되지 않은 C8166 세포에서 GFP 발현을 도시한다. 도 31B 는 HXB2-GFP 바이러스가 도입된 C8166 세포에서 GFP 발현을 도시한다. 도 31C 는 HXB2-GFP 바이러스가 버전 1 CD4-IgG (SEQ ID NO: 9)와 함께 도입된 C8166 세포에서 GFP 발현을 도시한다. 도 31D 는 HXB2-GFP 바이러스가 버전 2 CD4-IgG (SEQ ID NO: 76)와 함께 도입된 C8166 세포에서 GFP 발현을 도시한다. 도 31E 는 NL4-GFP 벡터가 도입된 C8166 세포에서 GFP 발현을 도시한다. 도 31F 는 NL4-GFP 벡터가 버전 1 CD4-IgG (SEQ ID NO: 9)와 함께 도입된 C8166 세포에서 GFP 발현을 도시한다. 도 31G 는 NL4-GFP 벡터가 버전 2 CD4-IgG (SEQ ID NO: 76)와 함께 도입된 C8166 세포에서 GFP 발현을 도시한다.
개요
본 명세서는 기능적 치유를 획득하기 위해서 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 질환을 치료하고/하거나 억제하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 방법 및 조성물은 하기 기술되는 바와 같은, 렌티바이러스 벡터 및 관련 바이러스 벡터를 포함한다.
정의 및 해석
본 명세서에서 달리 정의하지 않으면, 본 개시와 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 문맥에서 달리 요구하지 않으면, 단수 형태는 복수형을 포함하고 복수 형태는 단수형을 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화의 기술 및 이와 관련되어 사용되는 명명법은 당분야에 충분히 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 개시의 방법 및 기술은 일반적으로 당분야에 충분히 공지되고, 달리 표시하지 않으면 본 명세서 전반에서 인용되고 논의되는 다양한 일반 및 보다 특수한 참조에 기술된 바와 같은 통상의 방법에 따라서 수행된다. 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). 임의의 효소 반응 또는 정제 기술은 본 명세서에 기술되거나 또는 당분야에서 통상적으로 수반되는, 제조사의 명세서에 따라서 수행된다. 본 명세서에 기술되는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약학 화학의 실험실 절차 및 기술, 및 이와 관련하여 사용되는 명명법은 당분야에 충분히 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 당업자가 이해하게 될 것이고 이것이 사용되는 문맥에 따라서 어느 정도 가변적일 것이다. 이것이 사용되는 문맥을 고려하여 당업자에게 명확하지 않은 이 용어의 사용이 존재하면, "약"은 특정 용어의 최대 10%를 더하거나 또는 뺀것을 의미할 것이다.
본 명세서에서 사용되는, "AGT 103", "AGT111", "AGT112", "AGT113," "AGT114", "AGT115", "AGT116", "AGT117", "AGT118", "AGT119", "AGT120," "AGT121", "AGT122", "AGT123", "AGT124", 및 "AGT125" 중 어느 하나에 대한 언급은 표 1에 개시된 벡터를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 활성제"의 투여" 또는 활성제를 "투여하는"은 치료적으로 유용한 형태 및 치료적으로 유효한 양으로 개체의 신체에 도입될 수 있는 형태로 치료가 필요한 대상체에게 활성제를 제공하는 것을 의미한다.
본 명세서 및 청구항 전반에서, 용어 "포함하다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"같은 별형은 명시된 정수 또는 정수 그룹의 포함을 암시하지만 임의의 다른 정수 또는 정수 그룹의 배제를 암시하는 것이 아님을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "포괄한다"는 제한없음을 포괄한다는 것을 의미한다. 용어 "발현", "발현되는" 또는 "코딩한다"는 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 이후 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 발현은 진핵생물 세포에서 mRNA의 스플라이싱 또는 전사후 변형 또는 번역후 변형의 다른 형태를 포괄할 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 용어 "기능적 치유"는 이전에 진행 중인 HIV 요법 예컨대 cART 또는 HAART를 요구한 HIV+ 개체가 이러한 HIV 용량의 저용량, 간헐적 용량, 또는 중단된 용량을 사용하여 낮거나 또는 검출불가능한 바이러스 복제로 생존될 수 있는 것인 상황 또는 상태를 의미한다. 개체는 낮은 수준으로 바이러스 복제를 유지시키고 질환 진행을 둔화시키거나 또는 제거하기 위해 보조 요법을 여전히 요구하는 동안 "기능적으로 치유되었다"라고 할 수 있다. 기능적 치유의 가능한 결과는 명시된 시간 기간, 예를 들어, 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 3년, 및 5년, 및 한정할 수 있는 모든 다른 시간 기간 내에 재발이 검출되지 않도록 모든 또는 실질적으로 모든 HIV의 궁극적인 근절이다.
용어 "생체내"는 살아있는 유기체에서 발생되는 과정을 의미한다. 용어 "생체외"는 살아있는 유기체의 외부에서 발생되는 과정을 의미한다. 예를 들어, 생체내 치료는 환자의 체내에서 발생되는 치료를 의미하는 한편, 생체외 치료는 환자의 신체 외부에서 발생되는 것이지만, 여전히 그 환자 유래의 조직을 사용 또는 이용하거나 또는 그와 상호작용한다. 이후에, 생체외 치료 단계는 후속 생체내 치료 단계를 포괄할 수 있다.
용어 "miRNA"는 마이크로RNA라고 하고, 또한 본 명세서에서 "miR"이라고 할 수 있다. 용어 "마이크로RNA 클러스터"는 서로 밀접하게 근접하여 벡터 상에 위치되고 공-발현되는 적어도 2개의 마이크로RNA를 의미한다.
용어 "패키징 세포주"는 렌티바이러스 입자를 발현시키는데 사용될 수 있는 임의의 세포주를 의미한다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 상황에서 용어 "퍼센트 동일성"은 하기 기술된 서열 비교 알고리즘 중 하나 (예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자에게 이용가능한 다른 알고리즘) 또는 육안 검사를 사용해 측정시, 최대 상응도에 대해 비교 및 정렬했을 때, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 용도에 따라서, "퍼센트 동일성"은 예를 들어, 기능성 도메인 상에서 비교되는 서열의 영역에 존재할 수 있거나, 또는 대안적으로 비교하려는 2개 서열의 전체 길이 상에 존재할 수 있다. 서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 하위서열 좌표를 필요하면 지정하고, 서열 정렬 프로그램 매개변수를 지정한다. 다음으로 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로, 기준 서열에 대해서 시험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현 (Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 육안 검사 (일반적으로, [Ausubel et al., infra] 참조)를 통해서 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 일례는 BLAST 알고리즘으로서, [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국립 생물공학 정보 센터 웹사이트를 통해서 공공으로 입수가능하다.
2개 뉴클레오티드 서열 간 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 입수가능)을 사용해 결정할 수 있다. 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 도입된, E. Meyers 및 W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개 아미노산 서열 간 퍼센트 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 입수가능)에 도입된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) 알고리즘을 사용해 결정할 수 있다.
본 개시의 핵산 및 단백질 서열은 또한 예를 들어, 관련 서열을 확인하기 위해서, 공공 데이터베이스에 대해 검색을 수행하도록 "문의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용해 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12를 사용해 수행할 수 있어서 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3을 사용해 수행하여 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위해 갭포함 정렬을 수득하기 위해서, Gapped BLAST는 [Altschul et al., (1997) Nucleic acids Res. 25(17):3389-3402]에 기술된 대로 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 개별 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO"는 용어 "Sequence ID No."와 동의어이다.
본 명세서에서 사용되는 "소형 RNA"는 일반적으로 약 200 뉴클레오티드 이하 미만의 길이이고 침묵화 또는 간섭 기능을 보유하는 RNA를 의미한다. 다른 구현예에서, 소형 RNA는 약 175 뉴클레오티드 이하, 약 150 뉴클레오티드 이하, 약 125 뉴클레오티드 이하, 약 100 뉴클레오티드 이하, 또는 약 75 뉴클레오티드 이하의 길이이다. 이러한 RNA는 마이크로RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 포함한다. 본 개시의 "소형 RNA"는 예를 들어, 표적 유전자 mRNA의 파괴를 일으키는 경로를 통해서, 표적 유전자의 유전자 발현을 억제할 수 있어야 하거나 또는 녹-다운할 수 있어야 한다.
본 명세서에서 사용되는, 어구 "외생성 인자"는 숙주 세포에서 발현될 수 있고 숙주 세포 이외의 공급원으로부터 유래하는 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 의미한다. 구현예에서, 아미노산 서열은 단백질로서 발현될 수 있다. 구현예에서, 단백질은 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "자극제"는 면역 반응을 자극할 수 있는 임의의 외생성 자극제를 의미하고, 제한없이, HIV 백신, 및 HIV 또는 HIV-관련 핵산 및 펩티드를 포함하는, 백신 (예를 들어, 핵산 백신, 탄수화물 백신, 및 펩티드 백신을 포함한다. 자극제는 바람직하게 T 세포 반응을 자극할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 HIV 감염을 갖는 대상체 또는 HIV에 감염되지 않았지만 잠재적인 향후 HIV 감염으로부터 보호를 추구하는 대상체를 의미한다. 대상체는 인간 환자뿐만 아니라 또는 다른 포유동물을 포함할 수 있다. 용어 "대상체", "개체", "숙주", 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "T 세포-반응성 프로모터"는 T 세포 수용체 신호전달 및 이의 동족 세포내 신호전달 경로를 통해서 조절될 수 있는 임의의 프로모터이다.
용어 "치료적 유효량"은 소정 질병, 상처, 질환, 또는 병태를 앓는 환자에서 확인된 합병증의 증상, 진행, 또는 개시를 치료하거나 또는 억제하기에 적합한 조성물, 및 적합한 제형 중, 활성제의 충분한 분량을 의미한다. 치료적 유효량은 환자의 병태 또는 이의 중증도의 상황, 및 치료하려는 대상체의 연령, 체중 등에 의존하여 가변적일 것이다. 치료적 유효량은 예를 들어, 투여 경로, 대상체의 병태를 포함한, 임의의 다수 인자를 비롯하여, 당업자가 이해하는 다른 인자에 의존하여, 가변적일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 벡터"는 렌티바이러스 벡터와 동의어이다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 일반적으로 치료되는 대상체의 자연적인 과정을 변경시키고자 시도하는 중재술을 의미하고, 예방을 위해서 또는 임상적 병상 과정 동안에 수행될 수 있다. 바람직한 효과는 질환 발생 또는 재발의 억제, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 저해, 감소 또는 억제, 질환 상태의 완화 또는 일시적 완화, 및 관해 또는 개선된 예후의 야기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "VRC01"은 HIV 엔벨로프 gp120 상의 CD4 결합 부위를 표적화하는, 인간 IgG1 단일클론 항체를 의미한다. 어구 "VRC01 항체"는 용어 "VRC01"과 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "3BNC117"은 HIV 엔벨로프 gp160 상의 CD4 결합 부위를 표적화하는, 인간 IgG1 단일클론 항체를 의미한다. 용어 "3BNC" 및 어구 "3BNC117 항체"는 용어 "3BNC117"과 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단편"은 유전자로부터 분리된 뉴클레오티드 서열의 일부분 또는 단백질로부터 분리된 아미노산 서열의 일부분을 의미한다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 일부분은 (예를 들어, 실험실 상황에서) 합성 수단을 사용하여, 각각 유전자 또는 단백질로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 일부분은 천연 발생 자발적 과정을 통해서, 개별적으로, 유전자 또는 단백질로부터 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인핸서"는 단백질이 결합할 수 있고, 단백질이 결합했을 때, 특정 유전자가 전사하게 되는 기회를 증가시키는 DNA 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "가용성 외생성 인자"는 세포로부터 분비될 수 있고 세포외 공간에서 기능할 수 있는 "외생성 인자"를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "분비 신호"는 세포로부터 이출이 예정된 단백질에 작동적으로 연결된 펩티드를 의미한다. "분비 신호"는 이출 기구로 단백질을 지정하여 단백질의 분비를 일으키도록 기능한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 결합할 수 있고, 결합했을 때, 전사의 개시를 일으킬 수 있는 DNA 서열이다.
본 개시의 양태 및 구현예의 설명
일 양태에서, 치료제 카고 부분을 포함하는 바이러스 벡터가 제공되고, 치료제 카고 부분은 HIV 감염을 억제할 수 있는 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 T 세포-반응성 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의 플라스미드 DNA를 포함한다.
일 양태에서, 치료제 카고 부분을 포함하는 바이러스 벡터가 제공되고, 치료제 카고 부분은 (i) 적어도 하나의 외생성 인자를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 적어도 하나의 HIV 유전자를 표적화하는 적어도 하나의 소형 RNA를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 T 세포-반응성 프로모터를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 가용성 외생성 인자는 항-HIV 항체를 포함한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 VRC01 항체 또는 3BNC117 항체 중 적어도 하나를 포함한다. 추가 구현예에서, 항-HIV 항체는 PG9 항체, PG16 항체, PG141-145 항체, CH01-04 항체, PGDM1400 항체, CAP256-VRC26.25 항체, VRC38 항체, PCT64 항체, PGT121 항체, PGT128 항체, PGT135 항체, 10-1074 항체, PCDN-33A 항체, PGDM12 항체, PGDM21 항체, VRC29.03 항체, BF520.1 항체, VRC41.01 항체, BG18 항체, DH270.1 항체, DH270.6 항체, 10E8VLS 항체, PGV04 항체, 8ANC131 항체, CH103 항체, CH235 항체, N6 항체, IOMA 항체, N49-P7 항체, VRC07-523LS 항체, N6LS 항체, PGT151-158 항체, BANC195 항체, 35022 항체, N123-VRC34.01 항체, ACS202 항체, VRC-PG05 항체, SF12 항체, 10E8 항체, 또는 Dh511 항체 중 적어도 하나를 포함한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 당분야에서 이해되는 임의의 존재하거나 또는 미래의 항-HIV 항체이다.
구현예에서, 항-HIV 항체는 HIV 엔벨로프의 표면 상의 엔벨로프 당단백질 GP120 (gp120)에 결합한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 HIV 엔벨로프의 표면 상의 엔벨로프 당단백질 GP160 (gp160)에 결합한다.
구현예에서, 항-HIV 항체는 HIV 엔벨로프 당단백질 상의 V1V2 루프에 결합한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 HIV 엔벨로프 당단백질 상의 V3 루프에 결합한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 HIV 엔벨로프 당단백질 상의 CD4 결합 부위에 결합한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 HIV 엔벨로프 당단백질 상의 Gp120/gp41 계면에 결합한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 HIV 엔벨로프 당단백질 상의 침묵면 gp120에 결합한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 HIV 엔벨로프 당단백질 상의 MPER 에피토프에 결합한다.
구현예에서, 항-HIV 항체는 SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, 또는 SEQ ID NO: 86과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, 또는 SEQ ID NO: 86을 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 외생성 인자는 가용성 CD4 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 구현예에서, 가용성 CD4는 단량체 가용성 CD4를 포함한다. 구현예에서, 가용성 CD4는 이량체 가용성 CD4를 포함한다. 구현예에서, 이량체 가용성 CD4는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 76, 또는 SEQ ID NO: 77과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 이량체 가용성 CD4는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 76, 또는 SEQ ID NO: 77을 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 가용성 외생성 인자는 HIV의 엔벨로프에 결합할 수 있어서 그 결과로 림프구의 표면에 대한 HIV의 결합 억제가 일어난다. 구현예에서, 림프구는 T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포를 포함한다. 구현예에서, 림프구는 T 세포이고, T 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, 또는 γδ T 세포를 포함한다. 구현예에서, 가용성 인자는 HIV 엔벨로프의 표면 상의 엔벨로프 당단백질에 결합한다. 구현예에서, 엔벨로프 당단백질은 GP120이다. 구현예에서, 엔벨로프 당단백질은 GP160이다. 구현예에서, 엔벨로프 당단백질은 당분야에 공지된 HIV의 표면 상의 임의의 엔벨로프 당단백질이다.
구현예에서, 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, 또는 SEQ ID NO: 87과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, 또는 SEQ ID NO: 87을 포함한다.
구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, IFN-γ 프로모터, IL-2 프로모터, CD69 프로모터, 또는 이의 단편을 포함한다.
구현예에서, CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 13과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 구현예에서, CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 13을 포함한다.
구현예에서, EF-1α 프로모터는 SEQ ID NO: 14와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 구현예에서, EF-1α 프로모터는 SEQ ID NO: 14를 포함한다.
구현예에서, IFN-γ 프로모터는 SEQ ID NO: 15와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84% 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 구현예에서, IFN-γ 프로모터는 SEQ ID NO: 15를 포함한다.
구현예에서, IL-2 프로모터는 SEQ ID NO: 66과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 구현예에서, IL-2 프로모터는 SEQ ID NO: 66을 포함한다.
구현예에서, CD69 프로모터는 SEQ ID NO: 67 (CD69 프로모터 (1050) + CNS2) 인핸서) 또는 SEQ ID NO: 68 (CD69 프로모터 (625) + CNS2 인핸서)과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 구현예에서, CD69 프로모터는 SEQ ID NO: 67 또는 SEQ ID NO: 68을 포함한다.
구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 항상성 프로모터를 포함한다. 구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 조직-특이적 프로모터를 포함한다. 구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 유도성 프로모터를 포함한다.
구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 IFN-α 프로모터, IFN-β 프로모터, SV40 프로모터, PGK1 프로모터, CAG 프로모터, Ubc 프로모터, H1 프로모터, 또는 U6 프로모터 중 적어도 하나를 포함한다.
추가 구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 FOXP3 프로모터, IL2RA 프로모터, CTLA4 프로모터, IKZF2 프로모터, CD40LG 프로모터, THEMIS 프로모터, SATB1 프로모터, LAIR2 프로모터, METTL7A 프로모터, RTKN2 프로모터, TCF7 프로모터, ANK3 프로모터, NELL2 프로모터, ANXA1 프로모터, TGFB1 프로모터, TIGIT 프로모터, TNFRSF10B 프로모터, LAG3 프로모터, GZMA 프로모터, IL10 프로모터, FGL2 프로모터, ENTPD1 프로모터, CCR6 프로모터, CCR9 프로모터, CCR10 프로모터, MAF 프로모터, TBX21 프로모터, RORC 프로모터, AHR 프로모터, PRDM1 프로모터, GATA3 프로모터, IFNG 프로모터, TNFA 프로모터, GZMB 프로모터, FURIN 프로모터, IL12A 프로모터, ICOS 프로모터, LGALS1 프로모터, CCR7 프로모터, CCL5 프로모터, CCL3 프로모터, CCL4 프로모터, CCR1 프로모터, ICAM1 프로모터, CCR3 프로모터, CCR8 프로모터, CCR2 프로모터, CCR5 프로모터, CXCR6 프로모터, CXCR3 프로모터, CXCR4 프로모터, CXCR5 프로모터, CCR9 프로모터, CCR10 프로모터, FER 프로모터, PECAM1 프로모터, CCR4 프로모터, ITGA4 프로모터, SELPLG 프로모터, RUNX1 프로모터, STAT5 프로모터, FOXP3 프로모터, H3K27ac 프로모터, hPGK 프로모터, 또는 RPBSA 프로모터 중 적어도 하나를 포함한다.
구현예에서, T 세포-반응성 프로모터는 HIV, HIV 유전자, 또는 다른 HIV 구조적 특성에 의해서 유도성인 당분야에서 이해되는 임의의 존재하거나 또는 미래의 T 세포-반응성 프로모터이다. 구현예에서, HIV 유전자, 단백질, 또는 구조적 특성은 Gag, Pol, Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu, Tev, LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, 및 INS 중 적어도 하나를 포함한다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 T 세포-반응성 프로모터에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 인핸서를 더 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 인핸서는 1개 인핸서, 2개 인핸서, 3개 인핸서, 4개 인핸서, 5개 인핸서, 또는 임의의 보다 큰 개수를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 인핸서는 5개 초과의 인핸서를 포함한다.
구현예에서, 인핸서가 프로모터/인핸서 조합에 제공된다. 구현예에서, 프로모터/인핸서 조합은 SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84% 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 구현예에서, 프로모터/인핸서 조합은 SEQ ID NO: 16을 포함한다.
구현예에서, 치료제 카고 부분은 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 분비 신호를 더 포함한다. 구현예에서, 분비 신호는 IL-2 분비 신호이다. 구현예에서, IL-2 분비 신호를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 11과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89% 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 구현예에서, IL-2 분비 신호를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 11을 포함한다.
구현예에서, 분비 신호는 항체 분비 신호이다. 구현예에서, 항체 분비 신호를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 12와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 구현예에서, 항체 분비 신호를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 12를 포함한다.
구현예에서, 분비 신호는 APO 분비 신호, ARSF 분비 신호, ART4 분비 신호, ARTN 분비 신호, AZGP1 분비 신호, BSGAT1 분비 신호, BDNF 분비 신호, BMP 분비 신호, BTN 분비 신호, C1Q 분비 신호, C1R 분비 신호, C3 분비 신호, CA10 분비 신호, CALCA 분비 신호, CALCB 분비 신호, CCK 분비 신호, CCL 분비 신호, CD14 분비 신호, CD163 분비 신호, CD6 분비 신호, CEACAM16 분비 신호, CEL 분비 신호, CGA 분비 신호, CGB 분비 신호, CKLFCLEC 분비 신호, COL 분비 신호, CPA 분비 신호, CPB 분비 신호, CSF 분비 신호, CSHCSN 분비 신호, CTRB2 분비 신호, CXCL 분비 신호, DEF 분비 신호, DPP4 분비 신호, F10 분비 신호, F11 분비 신호, F12 분비 신호, F13 분비 신호, F2 분비 신호, F3 분비 신호, F5 분비 신호, F7 분비 신호, F8 분비 신호, F9 분비 신호, FGF 분비 신호, FGFBP 분비 신호, FSHB 분비 신호, GCG 분비 신호, GZM 분비 신호, HSPG2 분비 신호, IFNA 분비 신호, IFNB 분비 신호, IFNE 분비 신호, IFNG 분비 신호, IFNK 분비 신호, IFNL 분비 신호, IFNW1 분비 신호, IGF 분비 신호, IL 분비 신호, INS 분비 신호, INSL 분비 신호, KLK 분비 신호, LALB 분비 신호, LBP 분비 신호, LIF 분비 신호, LTF 분비 신호, LYGMBL2 분비 신호, MMP 분비 신호, MUC 분비 신호, NDNF 분비 신호, NGFN 분비 신호, NPPA 분비 신호, NRP1 분비 신호, NRP2 분비 신호, PLAG2G 분비 신호, PLAC1 분비 신호, PLAT 분비 신호, PLAU 분비 신호, PPIA 분비 신호, PRL 분비 신호, PROC 분비 신호, PRSS 분비 신호, PTH 분비 신호, RNAS 분비 신호, SDC4 분비 신호, SERPINA 분비 신호, SFTPA 분비 신호, TNFRS 분비 신호, TSLP 분비 신호, TRH 분비 신호, TTR 분비 신호, UTS 분비 신호, VIP 분비 신호, VTN 분비 신호, VWA 분비 신호, 또는 WIF 분비 신호를 포함한다. 구현예에서, 분비 신호는 당분야에서 이해되는 바와 같은 임의의 공지되거나 또는 미래의 분비 신호를 포함한다.
구현예에서, 분비 신호는 HIV를 표적화할 수 있는 외생성 인자의 분비를 촉진할 수 있는 임의의 분비 신호를 포함한다. 구현예에서, 외생성 인자는 임의의 HIV 유전자, 단백질, 또는 구조적 특성을 표적화할 수 있다. 구현예에서, HIV 유전자, 단백질, 또는 구조적 특성은 하기 중 어느 하나를 포함할 수 있다: Gag, Pol, Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu, Tev, LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, 및 INS.
구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 Vif이다. 구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 Tat이다. 구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 Vif 및 Tat이다. 구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 당분야에 공지된 임의의 하나 이상의 HIV 유전자를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 Gag, Pol, Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu, 및 Tev 중 적어도 하나를 포함한다.
구현예에서, 치료제 카고 부분은 CCR5를 표적화하는 적어도 하나의 소형 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 구현예에서, 치료제 카고 부분은 CCR5 및 적어도 하나의 HIV 유전자를 표적화하는 적어도 하나의 소형 RNA를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 Vif이다. 구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 Tat이다. 구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 Vif 및 Tat이다. 구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 당분야에 공지된 어느 하나 이상의 HIV 유전자를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 HIV 유전자는 Gag, Pol, Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu, 및 Tev 중 적어도 하나를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 적어도 하나의 마이크로RNA, 적어도 하나의 shRNA, 또는 적어도 하나의 siRNA이다. 구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 당분야에서 이해하는 임의의 공지되거나 또는 미래의 소형 RNA이다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 CCR5를 표적화하는 마이크로RNA를 포함한다. 구현예에서, CCR5를 표적화하는 마이크로RNA는 SEQ ID NO: 62와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, CCR5를 표적화하는 마이크로RNA는 SEQ ID NO: 62를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 CCR5를 표적화하는 소형 RNA를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 Vif를 표적화하는 마이크로RNA를 포함한다. 구현예에서, Vif를 표적화하는 마이크로RNA는 SEQ ID NO: 63과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, Vif를 표적화하는 마이크로RNA는 SEQ ID NO: 63을 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 Vif를 표적화하는 소형 RNA를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 Tat를 표적화하는 마이크로RNA를 포함한다. 구현예에서, Tat를 표적화하는 마이크로RNA는 SEQ ID NO: 64와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, Tat를 표적화하는 마이크로RNA는 SEQ ID NO: 64를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 Tat를 표적화하는 소형 RNA를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 Vif, Tat, 및 CCR5를 표적화하는 소형 RNA를 포함한다. 구현예에서, 소형 RNA는 SEQ ID NO: 65와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 마이크로RNA 클러스터는 SEQ ID NO: 65를 포함한다.
구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 Vif를 표적화하는 소형 RNA, Tat를 표적화하는 소형 RNA, 및 CCR5를 표적화하는 소형 RNA를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 소형 RNA는 마이크로RNA 클러스터이다.
일 양태에서, 렌티바이러스 입자가 제공된다. 렌티바이러스 입자는 다양하게 표적 세포를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질; 및 본 명세서에 기술된 임의의 바이러스 벡터를 포함한다. 구현예에서, 렌티바이러스 입자는 패키징 세포에 의해 생산되고 표적 세포를 감염시킬 있다.
구현예에서, 표적 세포는 림프구이다. 구현예에서, 림프구는 T 세포, B 세포, NKT 세포, 또는 NK 세포이다. 구현예에서, T 세포는 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 또는 γδ T 세포이다.
일 양태에서, 렌티바이러스 입자가 감엽된 림프구를 포함하는 변형된 세포가 제공된다. 구현예에서, 렌티바이러스 입자는 다양하게 림프구를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질; 및 본 명세서에 기술된 임의의 바이러스 벡터를 포함한다. 구현예에서, 림프구는 T 세포, B 세포, NKT 세포, 또는 NK 세포이다. 구현예에서, 림프구는 T 세포이고, T 세포는 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 또는 γδ T 세포이다.
일 양태에서, 바이러스 전달 시스템이 제공된다. 구현예에서, 바이러스 전달 시스템은 다양하게 Gag, Pol, 및 Rev 유전자의 각각으로부터 유래된 기능성 단백질을 발현시키기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드; 표적 세포를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질을 발현시키기 위한 DNA 서열을 포함하는 엔벨로프 플라스미드; 및 본 명세서에 기술된 임의의 바이러스 벡터를 포함한다. 구현예에서, 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드는 제1 및 제2 헬퍼 플라스미드를 포함하고, 제1 헬퍼 플라스미드는 Gag 및 Pol 유전자로부터 유래된 기능성 단백질을 발현시키기 위한 뉴클레오티드 서열을 코딩하고, 제2 헬퍼 플라스미드는 Rev 유전자로부터 유래된 단백질을 발현시키기 위한 뉴클레오티드 서열을 코딩한다.
일 양태에서, HIV를 치료하는 방법이 제공된다. 구현예에서, 방법은 다양하게 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 자극제의 치료적 유효량과 접촉시키는 단계로서, 접촉은 생체외에서 수행되는 것인 단계; PBMC를 생체외에서 렌티바이러스 입자; 및 본 명세서에 기술된 임의의 바이러스 벡터로 형질도입시키는 단계로서, 렌티바이러스 입자는 PBMC를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질을 포함하는 것인 단계; 및 형질도입된 PBMC를 적어도 1일 동안 배양하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 방법은 형질도입된 PBMC를 대상체에게 주입하는 단계를 더 포함한다.
구현예에서, 자극제는 HIV로부터 유래된다. 구현예에서, 자극제는 HIV로부터 유래된 펩티드이다. 추가 구현예에서, 펩티드는 Gag 펩티드를 포함한다. 구현예에서, 자극제는 Env 펩티드를 포함한다.
다른 양태에서, 방법은 2개 자극제로서, 제1 자극제 및 제2 자극제를 투여하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 제1 자극제 및 제2 자극제는 동일한 자극제이다. 구현예에서, 제1 자극제 및 제2 자극제는 각각이 Gag 펩티드이다. 구현예에서, 제1 자극제 및 제2 자극제는 각각 Env 펩티드이다. 구현예에서, 제1 자극제 및 제2 자극제는 상이한 자극제이다. 구현예에서, 제1 자극제는 생체외에서 투여된다. 구현예에서, 제2 자극제는 생체내에서 투여된다. 구현예에서, 방법은 제1 자극제를 투여하는 단계, 세포를 본 명세서에 기술된 임의의 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키는 단계, 및 제2 자극제를 투여하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 펩티드는 적어도 하나의 림프구를 활성화시킨다. 구현예에서 적어도 한 유형의 림프구는 T 세포, B 세포, NKT 세포, 또는 NK 세포이다. 구현예에서, 림프구는 T 세포이다. 구현예에서, T 세포는 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 또는 γδ T 세포이다. 구현예에서, 활성화된 림프구는 MHC 클래스 I 제한된 림프구이다. 구현예에서, 활성화된 림프구는 MHC 클래스 II 제한된 림프구이다.
구현예에서, 형질도입된 PBMC는 1일 초과 동안 배양될 수 있다. 구현예에서, 형질도입된 PBMC는 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일 32일, 33일, 34일, 35일, 또는 그 이상 동안 배양된다. 구현예에서, 형질도입된 PBMC는 35일 초과 동인 배양된다.
양태에서, CD4 T 세포의 HIV 감염을 억제하는 기전이 제공된다. 구현예에서, HIV 감염을 억제하는 기전은 도 28A 및 28B에 제공된다. 구현예에서, 도 28A에 도시된 바와 같이, HIV는 CD4 T 세포의 표면 (140) 상의 CD4 수용체 (100)에 결합한다. 구현예에서, 가용성 CD4 (본 명세서에서 sCD4라고도 함) (110)가 세포외 공간에 존재할 때, HIV의 표면 (130) 상의 엔벨로프 단백질 (예를 들어, gp120) (120)에 결합한다 (도 28B). 이것은 CD4 T 세포 (140)의 표면 상의 CD4 수용체 (100)에 대한 HIV의 결합을 억제한다 (도 28B). 구현예에서, sCD4는 항-HIV 항체에 의해 대체될 수 있다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 본 명세서에 개시된 임의의 항-HIV 항체 또는 이의 임의의 변이체를 포함한다. 구현예에서, 항-HIV 항체는 당분야에서 이해되는 임의의 항-HIV 항체 또는 이의 임의의 변이체를 포함한다. 구현예에서, sCD4 또는 항-HIV 항체가 제공되어서 HIV의 표면 상의 임의의 당단백질에 결합되어서 HIV가 세포로 들어가는 것을 억제하게 된다.
일 양태에서, HIV를 치료하는 방법이 제공된다. 구현예에서, 방법은 다양하게, 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계를 포함한다. 구현예에서, PBMC는 임의의 적합한 기술을 사용해 단리된다. 구현예에서, PBMC는 자극제의 치료적 유효량과 접촉된다. 구현예에서, PBMC를 자극제와 접촉시키는 단계는 생체외에서 일어난다. 구현예에서, 자극제는 HIV 백신을 포함한다. 구현예에서, 자극제는 Gag 펩티드를 포함한다. 구현예에서, 자극제는 Env 펩티드를 포함한다. 구현예에서, 자극제는 PBMC가 형질도입에 더 감수성이게 한다. 구현예에서, 자극제의 치료적 유효량과 접촉시키는 단계는 생체외에서 발생된다. 구현예에서, 자극제와 접촉시키는 단계는 렌티바이러스 입자로의 형질도입이 후속된다. 구현예에서, 렌티바이러스 입자는 PBMC를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질을 포함한다. 구현예에서, 렌티바이러스 입자는 본 명세서에 개시된 임의의 렌티바이러스 입자이다. 구현예에서, 형질도입 이후에, PBMC는 PBMC의 적합한 확장을 허용하기에 충분한 시간 기간 동안 배양된다. 구현예에서, 시간 기간은 적어도 1일이다. 구현예에서, PBMC는 환자에게 투여된다.
인간 면역결핍 바이러스 (HIV)
"HIV"라고도 통상 지칭되는 인간 면역결핍 바이러스는 인간에서 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)을 야기하는 레트로바이러스이다. 치료없이, HIV 감염 이후 평균 생존 시간은 HIV 아형에 따라서, 9년 내지 11년으로 추산된다. HIV 감염은 제한없이, 혈액, 정액, 질액, 쿠퍼액, 타액, 눈물, 림프액 또는 뇌척수액, 또는 모유를 포함하여, 체액의 전달을 통해서 일어난다. HIV는 유리 바이러스 입자로서 감염된 개체에 및 감염된 면역 세포 내에 존재할 수 있다.
HIV는 인간 면역계의 중추 세포 예컨대 헬퍼 T 세포를 감염시키지만, 향성은 HIV 아형 중에서 다양할 수 있다. HIV 감염에 특이적으로 감수성일 수 있는 면역 세포는 CD4+ T 세포, 마크로파지, 및 수지상 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. HIV 감염은 미감염된 방관자 세포의 아폽토시스, 감염된 세포의 직접 바이러스 사멸, 및 감염된 세포를 인식하는 CD8 세포독성 림프구에 의한 감염된 CD4+ T 세포의 사멸을 포함하는, 다수의 기전을 통해서 낮은 수준의 CD4+ T 세포를 초래한다. CD4+ T 세포 수가 임계 수준 미만으로 하락될 때, 세포-매개 면역력을 상실한다.
구조적으로, HIV는 많은 다른 레트로바이러스와 구별된다. RNA 게놈은 적어도 7개 구조적 랜드마크 (LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, 및 INS), 및 적어도 9개 유전자 (Gag, Pol, Env, Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu, 및 때때로 Tat, Env, 및 Rev의 융합체인, 10번째 Tev)로 이루어지고, 19개 단백질을 코딩한다. 이들 유전자 중 3개, Gag, Pol, 및 Env 는 새로운 바이러스 입자를 위해 구조적 단백질을 만드는데 필요한 정보를 함유한다.
HIV는 주로 CD4 T 세포에서 복제되고, 숙주 면역력을 감소시키도록 세포 파괴 또는 이상조절을 초래한다. HIV는 통합된 프로바이러스로서 감염을 확립하고 특정 세포에서 바이러스 발현이 세포에 영향을 미치는 세포병리학 또는 숙주 면역계에 의한 검출에 대한 수준 미만으로 감소하는 잠복기 상태로 들어갈 수 있으므로, HIV를 치료하는 것이 어렵고 고도의 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)의 장기간 간격 이후라도 제거되지 않았다. 대부분의 사례에서, HIV 감염은 치명적인 질환을 초래하지만 생존은 HAART를 통해서 연장될 수 있다.
HIV 퇴치의 주요 목표는 질환의 치유를 위한 전략을 개발하는 것이다. 장기간 HAART는 이러한 목표를 달성하지 못하여서, 연구자들은 대체 절차로 눈을 돌렸다. 치료적 면역화 (감염 발생 후 백신 사용)에 의해 숙주 면역력을 개선시키기 위한 초기 노력은 미미하거나 또는 전혀 영향이 없었다. 유사하게, 치료 강화는 중간 정도 영향을 갖거나 또는 전형 영향이 없었다.
유전자 요법을 사용하여 일부 진전이 있었지만, 긍정적인 결과는 산발적이고 CCR5 (케모카인 수용체)를 코딩하는 유전자의 대립유전자 중 하나 또는 둘 모두에서 결함을 보유하는 드문 인간 중에서만 발견된다. 그러나, 많은 연구자들은 유전자 요법이 궁극적으로 HIV 치유를 달성하기 위해 최선의 가능성을 보유한다고 낙관하고 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 방법 및 조성물은 기능적 치유를 달성할 수 있다. 기능적 치유를 달성하는데 주요한 장애물은 HIV 그 자체의 기본 생물학에 있다. 바이러스 감염은 거의 모든 면역 기능에 핵심적인 CD4 T 세포를 결실시킨다. 가장 중요하게, HIV 감염 및 CD4 T 세포의 고갈은 개별 세포의 활성화를 요구한다. 활성화는 재배열된 T 세포 수용체를 사용하여, 병원체 또는 다른 분자를 인식하는 개별 CD4 T 세포 클론에 특이적인 기전이다.
HIV의 경우에, 감염은 감염되는 HIV-특이적 T 세포의 개체군을 활성화시켜서 결과적으로 바이러스에 덜 특이적인 다른 T 세포에 앞서 고갈되어서, 바이러스에 대한 면역계 방어를 효과적으로 무력화시킨다. IV-특이적 T 세포 반응에 대한 능력은 장기간 HAART 동안 재건되지만, HAART가 중단될 때 반등된 바이러스 감염이 과정을 반복하여서 다시 바이러스-특이적 세포를 결실시켜, 질환 진행이 촉진된다.
기능적 치유는 충분한 HIV-특이적 CD4 T 세포가 보호되어서 HAART가 중단되면 숙주 천연 면역력이 HIV를 직면하여 제어할 수 있는 경우에만 오직 가능할 것이다.
다양한 양태에서, HIV 질환의 기능적 치유를 제공하도록 유전자 요법의 유효성을 개선시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 구현예에서, 기능적 치유를 제공하도록 HIV에 대한 숙주 면역력을 증강시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 추가 구현예에서, 기능적 치유를 획득하도록 환자에서 HIV-특이적 CD4 T 세포를 농축하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
유전자 요법
HIV를 치료하거나 또는 억제하는 목적을 위해서 숙주 세포에 유전자 구성체를 전달하기 위한 바이러스 벡터가 본 명세서에서 제공된다.
이들 유전자 구성체는 질환 상태를 변경시키도록, 존재하는 결합을 교정하거나 또는 보완하기 위한 기능적 유전자 또는 유전자의 일부분, 조절 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 안티센스, 짧은 상동성 RNA, 긴 비-코딩 RNA, 소형 간섭 RNA 등을 포함한, 조절 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열, 및 핵심 세포 인자에 대해 경쟁하도록 디자인된 RNA 또는 단백질을 코딩하는 디코이 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 유전자 요법은 HIV-관련 질환의 치료 또는 완화를 제공하도록 표적 세포에 이들 치료적 유전자 구성체를 전달하는 것을 포함한다.
본 명세서에 제공되는 바와 같은 유전자 요법은 친화성-증강된 T 세포 수용체, CD4 T 세포 (또는 대안적으로 CD8 T 세포 또는 γδ T 세포) 상의 키메라 항원 수용체, 바이러스 단백질에 의한 초래된 세포 사멸을 피하기 위한 신호 전달 경로의 변형, TREX, SAMHD1, MxA 또는 MxB 단백질, APOBEC 복합체, TRIM5-알파 복합체, 테테린 (BST2), 및 포유동물 세포에서 HIV 복제를 할 수 있는 것으로 확인된 유사한 단백질을 포함한 HIV 제한 구성요소의 증가된 발현을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
면역요법
역사적으로, 백신은 천연두, 소아마비, 홍역, 및 황열을 포함한, 치명적인 감염성 질환에 대한 필수 무기였다. 불행하게도, HIV에 대해 현재 승인된 백신은 존재하지 않는다. HIV 바이러스는 면역계를 회피하는 고유한 방식을 갖고, 인간 신체는 이에 대한 효과적인 면역 반응을 일으킬 수 없는 것으로 보인다. 결과적으로, 과학자들은 HIV에 대한 보호성을 제공하는데 필요한 것에 대한 명확한 그림을 가지고 있지 않다. 그러나, 면역요법은 통상적인 백신 접근법을 통해서 이전에 해결되지 못한 해법을 제공할 수 있다.
다양한 양태 및 구현예에서, 면역치료 접근법은 숙주의 항-HIV 면역력 증가의 목적을 위해서 HIV-특이적 CD4 T 세포의 개체군을 농축시킨다. 구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 통합 또는 비-통합은 숙주의 항-HIV 면역력 증가 목적을 위해 숙주의 면역 세포를 형질도입시키는데 사용된다. 추가 구현예에서, 제한없이, 숙주의 면역 반응을 증가시키기 위한 생물학적 또는 화학적 보강제 및/또는 적합한 비히클과 조합된 사멸 입자, 바이러스-유사 입자, HIV 펩티드 또는 펩티드 단편, 재조합 바이러스 벡터, 재조합 박테리아 벡터, 정제된 서브유닛 또는 플라스미드 DNA를 포함하는, HIV 단백질을 포함하는 백신이 제공된다. 이러한 백신은 바이러스-특이적 T 세포 또는 항체의 개체군을 농축시키는데 사용될 수 있다. 렌티바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용하여 HIV-표적화된 유전자 요법의 사용을 통해 더 증강시키기 위한 다양한 방법이 제공된다.
방법
다양한 양태에서, HIV 질환에 대한 기능적 치유를 획득하기 위해 바이러스 벡터를 사용하기 위한 방법이 제공된다. 방법은 다양하게 HIV-특이적 CD4 T 세포의 비율을 농축시키기 위한 면역요법, 및 HIV를 억제할 수 있는 외생성 인자의 전달을 가능하게 하기 위한 렌티바이러스 형질도입을 포함한다.
구현예에서, 방법은 HIV-특이적 CD4 T 세포의 비율을 농축하기 위해 제1 자극 사건을 포함한다. 제1 자극은 제한없이 백신을 포함하는 환자의 HIV-특이적 CD4+ T 세포를 농축시키는데 적합한 하나 이상의 임의의 작용제의 투여를 포함할 수 있다.
치료 백신은 치료가 일어나는 지리적 영역의 우세한 바이러스 유형을 나타내는 단백질 서열을 갖는 하나 이상의 HIV 단백질을 포함할 수 있다. 치료 백신은 정제된 단백질, 불활성화된 바이러스, 바이러스 벡터화된 단백질, 박테리아 벡터화된 단백질, 펩티드 또는 펩티드 단편, 바이러스-유사 입자 (VLP), 사이토카인 및/또는 케모카인을 포함하는 생물학적 또는 화학적 보강제, 비히클, 및 면역화 방법을 포함한다. 면역화는 당분야에 공지된 표준 방법에 따라서 투여될 수 있고 HIV 환자는 면역화 간격 동안 항레트로바이러스 요법 및 렌티바이러스 형질도입을 포함한 후속 생체외 림프구 배양을 계속할 수 있다.
구현예에서, 방법은 정제된 단백질, 불활성화된 바이러스, 바이러스 벡터화 단백질, 박테리아 벡터화 단백질, 사이토카인 및/또는 케모카인을 포함한 생물학적 또는 화학적 보강제, 비히클, 및 자극화를 위한 방법을 사용하여, 치료 백신접종을 통해서 이전에 면역화된 사람 또는 환자로부터의 CD4 T 세포의 생체외 자극을 포함한다. 생체외 자극은 면역화를 위해 사용된 것과 동일한 백신 또는 면역 자극 화합물을 사용해 수행될 수 있거나, 또는 면역화를 위해 사용된 것과 상이한 백신 또는 면역 자극 화합물을 사용해 수행될 수 있다.
구현예에서, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 백혈구성분 채집술을 포함한, 표준 기술을 통해서 수득될 수 있다. 구현예에서, PBMC는 생체외에서 처리된다. 추가 구현예에서, 치료는 CD4 T 세포의 확장을 산출한다. 구현예에서, 약 0.1%, 약 1%, 약 5% 또는 약 10% 또는 약 30%가 항원 반응의 관점에서 HIV-특이적이고, 개시된 렌티바이러스 벡터에 의해 전달되는 치료적 이식유전자를 보유한 덕분에 HIV-내성일 수 있는 1x1010 CD4 T 세포의 수율이 수득된다. 대안적으로, 약 1x107, 약 1x108, 약 1x109, 약 1x1010, 약 1x1011, 또는 약 1x1012 CD4 T 세포는 생체외 자극을 위해 단리될 수 있다. 임의의 적합한 양의 CD4 T 세포가 생체외 자극을 위해 단리된다.
단리된 CD4 T 세포는 사전 치료적 백신접종에서 존재하는 항원을 포함할 수 있는, HIV 백신 항원으로 자극을 통해서 적절한 배지에서 배양될 수 있다. 역전사효소, 프로테아제 또는 인테그라제의 억제제를 포함하는 항레트로바이러스 치료적 약물을 첨가하여 장기간 생체외 배양 동안 바이러스-재출현을 억제할 수 있다. CD4 T 세포 생체외 자극은 배양되는 HIV-특이적 CD4 T 세포의 비율을 농축하는데 사용된다. 동일한 절차가 또한 분석 목적을 위해 사용될 수 있는데, 정제를 통해서 수득된 말초 혈액 단핵 세포가 존재하는 보다 작은 혈액 부피를 사용하여 HIV-특이적 T 세포를 확인하고, 이러한 하위-개체군의 빈도를 측정한다.
PBMC 분획은 이전에 생체내 면역화에 사용된 백신의 성분과 일치하거나 또는 그에 상보적인 HIV 단백질과 세포를 접촉시켜서 HIV-특이적 CD4 T 세포에 대해 농축될 수 있다. 생체외 자극은 약 5배, 약 10배, 약 25배, 약 50배, 약 75배, 약 100배, 약 125배, 약 150배, 약 175배, 또는 약 200배 까지 HIV-특이적 CD4 T 세포의 상대적 빈도를 증가시킬 수 있다.
다양한 방법은 추가적으로 생체내 치료적 면역화 및 CD4 T 세포의 생체외 자극을 생체외 렌티바이러스 형질도입과 조합시키는 단계 및 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, HIV-특이적 CD4 T 세포에 대해 농축된 생체외 자극된 PBMC 분획은 HIV를 억제할 수 있는 외생성 인자를 코딩하는 치료적 렌티바이러스 또는 다른 벡터로 형질도입될 수 있고 이러한 형질도입을 위해 충분한 시간 기간 동안, 예를 들어, 최대 약 35일, 또는 35일 초과를 포함하여, 약 1일 내지 약 21일 동안 배양으로 유지될 수 있다. 추가 구현예에서, 세포는 약 1일 내지 약 18일, 약 1일 내지 약 15일, 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 9일, 또는 약 3일 내지 약 7일 동안 배양될 수 있다. 형질도입된 세포는 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 약 25일, 약 26일, 약 27일, 약 28일, 약 29일, 약 30일, 약 31일, 약 32일, 약 33일, 약 34일, 약 35일, 또는 35일 초과 동안 배양될 수 있다.
추가 구현예에서, 형질도입된 CD4 T 세포는 환자, 예컨대 CD4 T 세포가 수득된 본래 환자에게 다시 주입된다. 주입은 임의의 적합한 장치 및 방법을 사용해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 주입은 생착의 효율을 증가시키기 위해서 사이클로포스파미드 또는 유사한 화합물의 사전-치료가 수반될 수 있다.
다양한 구현예에서, 항레트로바이러스 요법 예컨대 cART 또는 HAART를 포함한, 계속 바이러스 저해가 제공된다. 다른 구현예에서, 항레트로바이러스 요법은 사전-주입 용량 및/또는 수준으로부터 감소된다. 일부 구현예에서, 약 26주 동안 감소되거나 또는 보조 요법이 없는 것을 HIV에 대한 기능적 치유로 간주될 수 있다. 기능적 치유의 다른 정의가 본 명세서에 기술된다.
본 명세서의 바이러스 벡터는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개 관심 유전자, 또는 적어도 6개 관심 유전자, 또는 적어도 7개 관심 유전자, 또는 적어도 8개 관심 유전자, 또는 적어도 9개 관심 유전자, 또는 적어도 10개 관심 유전자, 또는 적어도 11개 관심 유전자, 또는 적어도 12개, 또는 그 이상의 관심 유전자를 코딩할 수 있다. 본 명세서의 바이러스 벡터는 제한없이 (i) HIV 질환과 연관된 HIV 항원 또는 HIV에 의해 생산되는 독소에 대한 항체, (ii) 면역 세포 성장 또는 기능에 필요하고 HIV에서 접하게 되는 면역 이상조절에 대한 치료제일 수 있는 인터루킨을 포함한 사이토카인, (iii) CD8 저해제 인자를 포함하여 생체내에서 HIV의 성장을 저해하는 인자, (iv) 케모카인 수용체 CCR5의 돌연변이 또는 결실, 케모카인 수용체 CXCR4의 돌연변이 또는 결실, 또는 케모카인 수용체 CXCR5의 돌연변이 또는 결실, (v) HIV와 연관된 특이적 수용체 또는 펩티드 또는 HIV와 연관된 숙주 단백질에 대한 안티센스 DNA 또는 RNA, (vi) HIV와 연관된 특이적 수용체 또는 펩티드 또는 HIV와 연관된 숙주 단백질에 대한 소형 간섭 RNA, (vii) 외생성 인자 예컨대, 예를 들어, 세포로 HIV의 억제를 일으키는 세포외 공간에서 HIV에 결합하는 CD4 (예를 들어, sCD4), 또는 (viii) HIV 또는 AIDS를 치료하는데 사용될 수 있는 다양한 다른 치료적으로 유용한 서열을 포함하는 유전자 또는 핵산 서열을 코딩할 수 있다.
개시된 방법에서 사용을 위한 HIV-표적화된 유전자 요법의 추가적인 예는 제한없이, 친화성-증강된 T 세포 수용체, CD4 T 세포 (또는 대안적으로 CD8 T 세포 또는 γδ T 세포) 상의 키메라 항원 수용체, 바이러스 단백질에 의해 초래되는 세포 사멸을 피하기 위한 신호 전달 경로의 변형, TREX, SAMHD1, MxA 또는 MxB 단백질, APOBEC 복합체, TRIM5-알파 복합체, 테테린 (BST2), 및 포유동물 세포에서 HIV 복제를 감소시킬 수 있는 것으로 확인된 유사한 단백질을 포함한 HIV 제한 구성요소의 증가된 발현을 포함한다.
구현예에서, 환자는 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 치료하면서 동시발생적으로 cART 또는 HAART를 겪을 수 있다. 다른 구현예에서, 환자는 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 치료되기 이전 또는 이후에 cART 또는 HAART를 겪을 수 있다. 다른 구현예에서, cART 또는 HAART는 치료 전반에서 유지되고 환자는 혈액 중 HIV 바이러스 부담량 및 혈액 중 렌티바이러스-형질도입된 CD4 T 세포의 빈도에 대해 모니터링될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따라서 치료되기 이전에 cART 또는 HAART를 받은 환자는 치료 이후에 cART 또는 HAART를 중단 또는 감소시킬 수 있다.
유전자 치료 요법에 대한 신고 대리 마커인, 형질도입된, HIV-특이적 CD4 T 세포의 빈도는 본 명세서에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 결정될 수 있다.
조성물
도 1-4에 도시된 바와 같이, 예시적인 구성체는 수많은 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 예시적인 LV 구성체는 하기 분비물 또는 성분을 포함할 수 있다:
RSV - 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부;
. 5'LTR - 염색체 통합 이후에 벡터의 복제를 억제하도록 절두될 수 있는 HIV 긴 말단 반복부의 일부분;
. Psi - 패키징 동안 바이러스 입자로 벡터 RNA 게놈의 통합을 허용하는 패키징 신호;
. RRE - Rev 반응성 구성요소는 핵밖으로 세포의 세포질로 RNA 이동을 통해서 이식유전자로부터 발현을 개선시키도록 첨가될 수 있다;
. cPPT - 숙주 세포 염색체로 이식유전자의 통합 이전에 제2 가닥 DNA 합성을 촉진하는 폴리 푸린 트랙;
. 프로모터 - 프로모터는 외생성 인자, 소형 RNA, 마이크로-RNA 클러스터, 또는 구성체의 다른 유전자 구성요소를 발현하도록 통합된 이식유전자로부터 RNA 전사를 개시시키고, 일부 구현예에서, 벡터는 EF-1 프로모터를 사용할 수 있다;
. 항-VRC01 항체 및 항-3BNC117를 비롯하여 다른 HIV 항체는 CD4 수용체와 HIV의 상호작용을 차단하여 CD4 T 세포로 HIV의 진입을 억제한다;
. sCD4는 T 세포 표면 상의 CD4 수용체와 HIV의 상호작용을 차단하여서, CD4 T 세포로 HIV의 진입을 억제한다;
. 항-CCR5 - 세포 표면 상에서 이의 발현을 감소시키도록 숙주 세포 인자 CCR5에 대한 메신저 RNA를 표적화하는 마이크로 RNA;
. 항-Rev/Tat - HIV Rev 및 Tat 코딩 영역 사이의 접합부에서 메신저 RNA 또는 HIV 게놈을 표적화하는 마이크로 RNA로서, 때때로 miRNA Tat로 명명되거나 또는 본 출원에서 유사한 설명으로 제공된다;
. 항-Vif - Vif 코딩 영역 내 메신저 RNA 또는 HIV 게놈을 표적화하는 마이크로 RNA;
. WPRE - 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 구성요소는 핵 밖으로 RNA 수송을 촉진하는데 사용될 수 있는 추가의 벡터 성분이다; 그리고
. 델타U3 3'LTR - 벡터의 안전성을 개선시키기 위해 U3 영역의 일부분이 결실된 HIV 3' 긴 말단 반복부가 변형된 버전.
렌티바이러스 벡터 시스템
렌티바이러스 비리온 (입자)이 제공된다. 다양한 양태 및 구현예에 따라서, 비리온 (바이러스 입자)을 생산하기 위해 필요한 바이러스 단백질을 코딩하는 벡터 시스템에 의해 발현될 수 있다. 다양한 구현예에서, 렌티바이러스 Pol 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 하나의 벡터 플라스미드가 프로모터에 작동적으로 연결되어, 역전사 및 통합을 위해 제공된다. 다른 구현예에서, Pol 단백질은 다수의 벡터 플라스미드에 의해 발현된다. 다른 구현예에서, 프로모터에 작동적으로 연결된, 바이러스 캡시드 형성을 위한 렌티바이러스 Gag 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터 플라스미드가 제공된다. 구현예에서, 이러한 Gag 핵산 서열은 Pol 핵산 서열의 적어도 일부와 별개 벡터 상에 존재한다. 다른 구현예에서, Gag 핵산은 Pol 단백질을 코딩하는 모든 Pol 핵산 서열과 별개 벡터 상에 존재한다.
본 명세서에 기술된 벡터에 많은 변형이 만들어질 수 있다. 다양한 구현예에서, 이러한 변형은 야생형 복귀 돌연변이체를 수득할 기회를 더 최소화하기 위해서 입자를 생성시키는데 사용될 수 있다. 이들은 LTR의 U3 영역의 결실, tat 결실 및 매트릭스 (MA) 결실을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, Gag, Pol 및 Env 벡터(들)은 렌티바이러스 패키징 서열이라고 지칭되는, 렌티바이러스 RNA를 패키징하는 렌티바이러스 게놈 유래 뉴클레오티드를 함유하지 않는다.
입자를 형성하는 벡터 플라스미드는 바람직하게 엔벨로프 단백질을 발현하는 렌티바이러스 게놈 유래 핵산 서열을 함유하지 않는다. 바람직하게, 프로모터에 작동적으로 연결된 엔벨로프 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 별개 벡터 플라스미드가 사용된다. 이러한 env 벡터는 또한 렌티바이러스 패키징 서열을 함유하지 않는다. 일 구현예에서, env 핵산 서열은 렌티바이러스 엔벨로프 단백질을 코딩한다.
다른 구현예에서, 엔벨로프 단백질은 렌티바이러스가 아닌, 상이한 바이러스로부터 유래된다. 최종 입자는 위형 입자라고 지칭할 수 있다. 엔벨로프의 적절한 선택을 통해서, 실제로 임의 세포를 "감염"시킬 수 있다. 예를 들어, 세포내이입 구획을 표적화하는 엔벨로프 단백질을 코딩하는 env 유전자를 사용할 수 있다. 이러한 env 융전자 및 엔벨로프 단백질이 유래될 수 있는 바이러스의 예는 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 인플루엔자 D 바이러스, 이사바이러스, 콰란자바이러스, 및 토고토바이러스), 베시쿨로바이러스 (예를 들어, 인디아나 베시쿨로바이러스), 알파 바이러스 (예를 들어, 특히 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스, 오로라 바이러스, 바마 포레스트 바이러스, 베바루 바이러스, 카바쏘우 바이러스, 게타 바이러스, 하이랜드 제이 바이러스, 트로카라 바이러스, 우나 바이러스, 은두무 바이러스, 및 미들부르그 바이러스), 아레나바이러스 (예를 들어, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 마추포 바이러스, 후닌 바이러스 및 라싸열 바이러스), 플라비바이러스 (예를 들어, 특히, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, C형 간염 바이러스, GB 바이러스, 아포이 바이러스, 바가자 바이러스, 에지힐 바이러스, 주그라 바이러스, 카담 바이러스, 다카르 박쥐 바이러스, 모독 바이러스, 포와싼 바이러스, 우수투 바이러스, 및 살 비에자 바이러스), 라브도바이러스 (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 공수병 바이러스), 파라믹소바이러스 (예를 들어, 볼거리 또는 홍역) 및 오르쏘믹소바이러스 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스) 및 인간 코로나바이러스 (SARS, MERS, SARS-CoV-2)를 포함한다.
바람직하게 사용할 수 있는 다른 엔벨로프 단백질은 내생성 레트로바이러스 (예를 들어, 고양이 내생성 레트로바이러스 및 개코원숭이 내생성 레트로바이러스) 및 밀접하게 관련된 감마레트로바이러스 (예를 들어, 특히, 몰로니 백혈병 바이러스, MLV-E, MLV-A, 기본 원숭이 백혈병 바이러스, GALV, 고양이 백혈병 바이러스, 코알라 레트로바이러스, 트라거 오리 비장 괴사 바이러스, 바이퍼 레트로바이러스, 병아리 세포융합 바이러스, 가드너-아른슈타인 고양이 육종 바이러스, 및 돼지 C형 온코바이러스)로부터 유래된 것을 포함한다. 이들 감마레트로바이러스는 초대 세포를 표적화하기 위한 env 유전자 및 엔벨로프 단백질의 공급원으로서 사용될 수 있다. 감마레트로바이러스는 숙주 세포가 초대 세포인 경우에 특히 바람직하다.
엔벨로프 단백질은 특별한 바람직한 숙주 세포를 표적화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 도파민 수용체같은 특이적 수용체의 표적화가 뇌 전달에 사용될 수 있다. 다른 표적은 혈관 내피일 수 있다. 이들 세포는 필로비리다에 과 (예를 들어, 쿠에바바이러스, 디안로바이러스, 에볼라바이러스, 및 마르부르그바이러스) 또는 인간 코로나비아러스 과의 임의 바이러스로부터 유래되는 엔벨로프 단백질을 사용하여 표적화될 수 있다. 에볼라바이러스의 종은 타이 포레스트 에볼라바이러스, 자이르 에볼라바이러스, 수단 에볼라바이러스, 분디분교 에볼라바이러스, 및 레스톤 에볼라바이러스를 포함한다.
또한, 구현예에서, 당단백질은 전사후 변형을 겪을 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 에볼라의 GP는 변역 후에 변형되어서 cGP1 및 GP2 당단백질이 될 수 있다. 다른 구현예에서, 위형 엔벨로프를 갖는 상이한 렌티바이러스 캡시드를 사용할 수 있다 (예를 들어, FIV 또는 SHIV [미국 특허 제5,654,195호]). SHIV 위형 벡터는 원숭이같은 동물 모델에서 쉽게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 렌티바이러스 벡터 시스템은 Gag, Pol, 또는 Rev 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함할 수 있다. Gag, Pol, 및 Rev 유전자의 각각은 개별 플라스미드에 제공될 수 있거나, 또는 하나 이상의 유전자가 함께 동일한 플라스미드에 제공될 수 있다. 일 구현예에서, Gag, Pol, 및 Rev 유전자는 동일한 플라스미드에 제공된다 (예를 들어, 도 1). 다른 구현예에서, Gag 및 Pol 유전자는 제1 플라스미드에 제공되고, rev 유전자는 제2 플라스미드에 제공된다 (예를 들어, 도 2). 3-벡터 및 4-벡터 시스템 둘 모두는 본 명세서에 기술된 바와 같은 렌티바이러스를 비롯하여, 다른 적합한 벡터 시스템을 생산하는데 사용될 수 있다. 구현예에서, 치료적 벡터, 적어도 하나의 엔벨로프 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드는 패키징 세포, 예를 들어, 패키징 세포주에 형질감염된다. 패키징 세포주의 비제한적인 예는 293T/17 HEK 세포주이다. 치료적 벡터, 엔벨로프 플라스미드, 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포주에 형질감염될 때, 렌티바이러스 입자가 생산될 수 있다.
다른 양태에서, 렌티바이러스 입자를 발현하기 위한 렌티바이러스 벡터 시스템이 제공된다. 시스템은 다양하게 본 명세서에 기술된 바와 같은 렌티바이러스 벡터; 세포를 감염시키는데 최적화된 엔벨로프 단백질을 발현하기 위한 엔벨로프 플라스미드; 및 Gag, Pol, 및 Rev 유전자를 발현하기 위한 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함하고, 렌티바이러스 벡터, 엔벨로프 플라스미드, 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포주에 형질감염될 때, 렌티바이러스 입자는 패키징 세포주에 의해 생산되고, 렌티바이러스 입자는 HIV의 생산을 억제할 수 있고/있거나 HIV에 의한 세포 감염을 억제할 수 있다.
다른 양태에서, 렌티바이러스 벡터는 다양하게 임의의 하기 구성요소를 포함한다: 하이브리드 5' 긴 말단 반복부 (라우스 육종 (RSV) 프로모터 (SEQ ID NO: 17)/5' LTR (SEQ ID NO: 18)), Psi 서열 (PSI 패키징 신호) (SEQ ID NO: 19), RRE (Rev 반응 구성요소 (RRE)) (SEQ ID NO: 20), cPPT (중심 폴리푸린 트랙 (cPPT)) (SEQ ID NO: 21), CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13), 인간 EF-1α (SEQ ID NO: 14), 인터페론 감마 (IFNγ) 프로모터 (SEQ ID NO: 15), 또는 프로트롬빈 인간 알파-1 항 트립신 인핸서/프로모터 (SEQ ID NO: 16)), 우드척 전사후 조절 구성요소 (WPRE) (SEQ ID NO: 22 (긴 WPRE 서열) 또는 SEQ ID NO: 23 (짧은 WPRE 서열)), 및 3' 델타 LTR (SEQ ID NO: 24). 다른 양태에서, 치환, 결실, 첨가, 또는 돌연변이에 의한, 서열 변이를 사용하여 본 명세서에서 참조하는 서열을 변형시킬 수 있다.
추가 양태에서, 헬퍼 플라스미드는 임의의 하기 구성요소를 포함한다: CAG 프로모터 (헬퍼/Rev; 닭 베타 액틴 (CAG) 프로모터; 전사) (SEQ ID NO: 25); HIV 성분 Gag (헬퍼/Rev; HIV Gag; 바이러스 캡시드) (SEQ ID NO: 26); HIV 성분 Pol (헬퍼/Rev; HIV Pol; 프로테아제 및 역전사효소) (SEQ ID NO: 27); HIV Int (헬퍼 Rev: HIV 인테그라제; 바이러스 RNA의 통합) (SEQ ID NO: 28); HIV RRE (헬퍼/Rev; HIV RRE; Rev 구성요소에 결합) (SEQ ID NO: 29); 및 HIV Rev (헬퍼/Rev; HIV Rev; 핵 이출 및 바이러스 mRNA 안정화) (SEQ ID NO: 30). 추가 양태에서, 헬퍼 플라스미드는 Gag 및 Pol 유전자의 발현을 위한 제1 헬퍼 플라스미드, 및 Rev 유전자의 발현을 위한 제2 플라스미드를 포함하도록 변형될 수 있다. 추가 양태에서, 치환, 결실, 첨가, 또는 돌연변이에 의한 서열 변이가 본 명세서에서 참조되는 서열을 변형시키는데 사용될 수 있다.
추가 양태에서, 엔벨로프 플라스미드는 하기 구성요소를 포함한다: RNA 중합효소 II 프로모터 (엔벨로프; CMV 프로모터) (SEQ ID NO: 31) 및 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질 (VSV-G) (엔벨로프; VSV-G; 당단백질 엔벨로프-세포 진입) (SEQ ID NO: 32). 다른 양태에서, 치환, 결실, 첨가, 또는 돌연변이에 의한, 서열 변이가 본 명세서에서 참조되는 서열을 변형시키는데 사용될 수 있다.
추가 양태에서, 헬퍼 플라스미드는 임의의 하기 구성요소를 포함한다: CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 토끼 베타 글로빈 인트론, HIV 성분 Gag; HIV 성분 Pol; HIV Int; HIV RRE; HIV Rev, 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A.
양태에서, 헬퍼 플라스미드는 Gag 및 Pol 유전자의 발현을 위한 제1 헬퍼 플라스미드, 및 rev 유전자의 발현을 위한 제2의 별개 플라스미드를 포함하도록 변형된다. 추가 양태에서, 치환, 결실, 첨가, 또는 돌연변이에 의한, 서열 변이는 본 명세서에서 참조되는 서열을 변형시키는데 사용될 수 있다.
추가 양태에서, 렌티바이러스 패키지에 사용되는 플라스미드는 유사한 구성요소로 변형되고; 인트론 서열은 벡터 기능 상실없이 제거될 수 있다. 예를 들어, 하기 구성요소는 패키징 시스템을 포함하는 플라스미드 내 유사한 구성요소를 대체할 수 있다: 연장 인자-1 (EF-1), 포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 및 유비퀴틴 C (UbC) 프로모터는 CMV 또는 CAG 프로모터를 대체할 수 있다. SV40 폴리 A 및 bGH 폴리 A는 토끼 베타 글로빈 폴리 A를 대체할 수 있다. 헬퍼 플라스미드의 HIV 서열은 상이한 HIV 균주 또는 분기군으로부터 구축될 수 있다. VSV-G 당단백질은 HERV-W, 개코원숭이 내생성 레트로바이러스 BaEV, 고양이 내생성 바이러스 (RD114), 기본 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV), 공수병 (FUG), 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 인플루엔자 A 조류 흑사병 바이러스 (FPV), 로스 리버 알파바이러스 (RRV), 쥐 백혈병 바이러스 10A1 (MLV), 또는 에볼라 바이러스 (EboV)를 포함하는 인간 내생성 레트로바이러스 유래의 막 당단백질로 대체될 수 있다.
특히, 레트로바이러스 패키징 시스템은 상업적으로 획득할 수 있고 (예를 들어, Lenti-vpak 패키징 시스템, OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD), 표준 기술을 사용해 합성할 수 있다. 게다가, 렌티바이러스 입자의 생산 효율을 포함하여, 임의의 다수의 관련 인자를 개선시키기 위해서 렌티바이러스 패키징 시스템의 양태를 대체하거나 또는 변형시키는 것은 당분야의 당업자의 기술 내에 있다.
실시예
실시예 1: 렌티바이러스 벡터 시스템의 개발
렌티바이러스 벡터 시스템은 도 1-3 (원형 형태) 및 도 4 (선형 형태)에 요약된 바와 같이 개발되었다. 먼저 도 4를 참조하면, 대표적인 치료적 벡터은 좌측에서 우측으로 하기 구성요소를 갖게 디자인되고 생산되었다: 하이브리드 5' 긴 말단 반복부 (RSV/5' LTR) SEQ ID NO: 17 (라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터) 및 SEQ ID NO: 18 (5' 긴 말단 반복부 (LTR)), Psi 서열 (RNA 패키징 부위) (SEQ ID NO: 19), RRE (Rev-반응 구성요소) (SEQ ID NO: 20), cPPT (폴리푸린 트랙) (SEQ ID NO: 21), 프로모터/프로모터 인핸서 조합 (CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)), EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14), IFNγ 프로모터 (SEQ ID NO: 15), IL-2 프로모터 (SEQ ID NO: 66), CD69 프로모터 (SEQ ID NO: 67 및 68), 또는 프로트롬빈 인간 알파-1 항-트립신 (hAAT) 인핸서/프로모터 (SEQ ID NO: 16)), 외생성 인자 (예를 들어, VRC01 항체 (도 3A), 3BNC117 항체, sCD4 (도 3B), 및 sCD4-IgG1 Fc (도 3C)), 우드척 전사후 조절 구성요소 (WPRE) (SEQ ID NO: 22 또는 23), 및 ΔU3 3' LTR (SEQ ID NO: 24).
헬퍼 플라스미드는 하기 구성요소를 갖게 디자인되고 생산되었다: CAG 프로모터 (SEQ ID NO: 25); HIV 성분 Gag (SEQ ID NO: 26); HIV 성분 Pol (SEQ ID NO: 27); HIV Int (SEQ ID NO: 28); HIV RRE (SEQ ID NO: 29); 및 HIV Rev (헬퍼/Rev; HIV Rev; 핵 이출 및 바이러스 mRNA 안정화) (SEQ ID NO: 30).
엔벨로프 플라스미드는 하기 구성요소를 갖게 디자인되고 생산되었다: RNA 중합효소 II 프로모터 (사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터) (SEQ ID NO: 13) 및 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질 (VSV-G) (SEQ ID NO: 32).
렌티바이러스 입자는 치료적 벡터, 엔벨로프 플라스미드, 및 헬퍼 플라스미드로 형질감염 이후에 293T/17 HEK 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA에서 구매)에서 생산하였다. 기능성 바이러스 입자를 생산한, 293T/17 HEK 세포의 형질감염은 플라스미드 DNA 흡수의 효율을 증가시키기 위해서 시약 폴리(에틸렌이민) (PEI)을 적용하였다. 플라스미드 및 DNA는 초기에 3:1의 비율 (PEI 대 DNA의 질량비)로 혈청없는 배양 배지에서 개별적으로 첨가되었다. 2일 내지 3일 후에, 세포 배지를 수집하였고, 렌티바이러스 입자는 고속 원심분리 및/또는 여과에 이어서 음이온-교환 크로마토그래피를 통해서 정제하였다. 렌티바이러스 입자의 농도는 형질도입 단위/mL (TU/mL)로 표시될 수 있다. TU의 결정은 배양액 중에서 HIV p24 수준 (p24 단백질은 렌티바이러스 입자에 도입됨)을 측정하고, 정량적 PCR을 통해서 세포 당 바이러스 DNA 카피수를 측정하거나, 또는 세포를 감염시키고 빛 (벡터가 루시퍼라제 또는 형광 단백질 마커를 코딩하는 경우)을 사용하여 수행될 수 있다.
3-벡터 시스템 (즉, 2-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템)이 렌티바이러스 입자의 생산을 위해 디자인되었다. 3-벡터 시스템의 개략도는 도 1에 도시된다. 간략하게, 도 1을 참조하여, 상단 벡터는 헬퍼 플라스미드를 도시하는데, 이 경우에 Rev를 포함한다. 중간 벡터는 엔벨로프 플라스미드이다. 하단 벡터는 치료적 벡터이다.
도 1의 상단 벡터를 보다 특별히 참조하면, 헬퍼 플러스 Rev 플라스미드는 CAG 인핸서 (헬퍼/Rev; CMV 초기 (CAG) 인핸서; 전사 증강) (SEQ ID NO: 33); CAG 프로모터 (SEQ ID NO: 25); 닭 베타 액틴 인트론 (헬퍼/Rev; 닭 베타 액틴 인트론; 유전자 발현 증강) (SEQ ID NO: 34); HIV Gag (SEQ ID NO: 26); HIV Pol (SEQ ID NO: 27); HIV Int (SEQ ID NO: 28); HIV RRE (SEQ ID NO: 29); HIV Rev (헬퍼/Rev; HIV Rev; 핵 이출 및 바이러스 mRNA 안정화) (SEQ ID NO: 30); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (헬퍼/Rev; 토끼 베타 글로빈 폴리 A; RNA 안정성) (SEQ ID NO: 35)를 포함한다.
엔벨로프 플라스미드 (도 1의 중간 벡터)는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13); 베타 글로빈 인트론 (엔벨로프; 베타 글로빈 인트론; 유전자 발현 증강) (SEQ ID NO: 36); VSV-G (SEQ ID NO: 32); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (엔벨로프; 토끼 베타 글로빈 폴리 A; RNA 안정성) (SEQ ID NO: 37)를 포함한다.
헬퍼 (Rev가 더해짐) 및 엔벨로프 플라스미드를 포함하는 2-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템의 합성.
재료 및 방법:
헬퍼 플라스미드의 구축: 헬퍼 플라스미드는 Gag, Pol, 및 인테그라제 유전자를 함유하는 pNL4-3 HIV 플라스미드 (NIH Aids Reagent Program)로부터 DNA 단편의 초기 PCR 증폭을 통해서 구축되었다. 플라스미드는 pCDNA3 플라스미드 (Invitrogen)의 동일한 부위에 삽입을 위해 사용될 수 있는 EcoRI 및 NotI 제한효소 부위를 갖는 단편을 증폭하도록 디자인되었다. 전방향 프라이머는 SEQ ID NO: 38이었고 역방향 플라스미드는 SEQ ID NO: 39였다. Gag, Pol, 인테그라제 단편에 대한 서열은 SEQ ID NO: 40 (Gag, Pol, 인테그라제 단편)이었다.
XbaI 및 XmaI 측접 제한효소 부위를 갖는 Rev, RRE, 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A 서열을 함유하는 DNA 단편은 MWG Operon을 통해서 합성하였다. 다음으로, DNA 단편은 XbaI 및 XmaI 제한효소 부위 (SEQ ID NO: 41) (Rev, RRE 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A를 함유하는 DNA 단편)에서 플라스미드에 삽입되었다.
pCDNA3.1의 CMV 프로모터는 닭 베타 액틴 인트론 서열이 더해진 CAG 인핸서/프로모터로 대체되었다. MluI 및 EcoRI 측접된 제한효소 부위를 갖는 CAG 인핸서/프로모터/인트론 서열을 함유하는 DNA 단편은 MWG Operon을 통해서 합성하였다. 다음으로 DNA 단편은 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위 (SEQ ID NO: 42)에서 플라스미드에 삽입되었다 (CAG 인핸서/프로모터/인트론 서열을 함유하는 DNA 단편).
VSV-G 엔벨로프 플라스미드의 구축:
수포성 구내염 인디아나 바이러스 당단백질 (VSV-G) 서열은 측접하는 EcoRI 제한효소 부위를 갖게 MWG 오페론을 통해서 합성하였다. 다음으로 DNA 단편은 EcoRI 제한효소 부위에서 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen)에 삽입되었고 올바른 배향은 CMV 특이적 프라이머 (SEQ ID NO: 43) (VSV-G를 함유하는 DNA 단편)를 사용한 시퀀싱을 통해서 결정하였다.
4-벡터 시스템 (즉, 3-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템)은 또한 본 명세서에 기술된 방법 및 재료를 사용해 디자인되고 생산되었다. 4-벡터 시스템의 개략도는 도 2에 도시된다. 간략하게, 도 2를 참조하여, 도 2의 상단 벡터는 헬퍼 플라스미드로서, 이 경우에, Rev를 포함하지 않는다. 상단로부터 2번째 벡터는 별개 Rev 플라스미드이다. 아래로부터 2번째 벡터는 엔벨로프 플라스미드이다. 하단 벡터는 치료적 벡터이다.
부분적으로, 도 2에서 상단 벡터를 참조하면, 헬퍼 플라스미드는 CAG 인핸서 (헬퍼/Rev CMV 초기 (CAG) 인핸서; 전사 증강) (SEQ ID NO: 33); CAG 프로모터 (헬퍼/Rev 닭 베타 액틴 (CAG) 프로모터) (SEQ ID NO: 25); 닭 베타 액틴 인트론 (헬퍼/Rev; 닭 베타 액틴 인트론; 유전자 발현 증강) (SEQ ID NO: 34); HIV Gag (헬퍼/Rev; HIV Gag; 바이러스 캡시드) (SEQ ID NO: 26); HIV Pol (헬퍼/Rev; HIV Pol; 프로테아제 및 역전사효소) (SEQ ID NO: 27); HIV Int (헬퍼 Rev; HIV 인테그라제; 바이러스 RNA의 통합) (SEQ ID NO: 28); HIV RRE (헬퍼/Rev; HIV RRE; Rev 구성요소에 결합) (SEQ ID NO: 29); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (헬퍼/Rev; 토끼 베타 글로빈 폴리 A; RNA 안정성) (SEQ ID NO: 35)를 포함한다.
도 2의 상단로부터 2번째 벡터에 도시된 Rev 플라스미드는 RSV 프로모터 및 HIV Rev (SEQ ID NO: 45); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (엔벨로프 토끼 베타 글로빈 폴리 A; RNA 안정성) (SEQ ID NO: 37)를 포함한다.
도 2의 하단로부터 2번째에 도시된 엔벨로프 플라스미드는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13); 베타 글로빈 인트론 (SEQ ID NO: 36); VSV-G (SEQ ID NO: 32); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 37)를 포함한다.
헬퍼, Rev, 및 엔벨로프 플라스미드를 포함하는 3-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템의 합성.
재료 및 방법:
Rev 없는 헬퍼 플라스미드의 구축:
Rev 없는 헬퍼 플라스미드는 RRE 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A 서열을 함유하는 DNA 단편을 삽입시켜서 구축하였다. 이러한 서열은 측접하는 XbaI 및 XmaI 제한효소 부위를 갖게 MWG Operon을 통해서 합성하였다. 다음으로 RRE/토끼 폴리 A 베타 글로빈 서열은 XbaI 및 XmaI 제한효소 부위 (SEQ ID NO: 44)에서 헬퍼 플라스미드 (RRE 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A를 함유하는 헬퍼 플라스미드)에 삽입되었다.
Rev 플라스미드의 구축:
RSV 프로모터 및 HIV Rev 서열은 측접하는 MfeI 및 XbaI 제한효소 부위를 갖게 MWG Operon을 통해서 단일 DNA 단편으로서 합성하였다. 다음으로 DNA 단편은 MfeI 및 XbaI 제한효소 부위에서 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen)에 삽입되었고, 여기서 CMV 프로모터는 RSV 프로모터 (SEQ ID NO: 45)로 대체된다 (RSV 프로모터 및 HIV Rev).
2-벡터 및 3-벡터 패키징 시스템을 위한 플라스미드는 유사한 구성요소로 변형될 수 있고 인트론 서열은 잠재적으로 벡터 기능 상실없이 제거될 수 있었다. 예를 들어, 하기 구성요소는 2-벡터 및 3-벡터 패키징 시스템에서 유사한 구성요소를 대체할 수 있다:
프로모터: 연장 인자-1 (인간 연장 인자 1 알파 (EF-1α) 프로모터) (SEQ ID NO: 14), 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) (프로모터; PGK) (SEQ ID NO: 46), 및 유비퀴틴 C (UbC) (프로모터; UbC) (SEQ ID NO: 47)는 CMV (SEQ ID NO: 13) 또는 CAG 프로모터 (SEQ ID NO: 48)를 대체할 수 있다. 이들 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이를 통해서 더욱 가변화될 수 있다.
폴리 A 서열: SV40 폴리 A (폴리 A; SV40) (SEQ ID NO: 49) 및 bGH 폴리 A (폴리 A; bGH) (SEQ ID NO: 50)는 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 35)를 대체할 수 있다. 이들 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이를 통해서 더욱 가변화될 수 있다.
HIV Gag, Pol, 및 인테그라제 서열: 헬퍼 플라스미드의 HIV 서열은 상이한 HIV 균주 또는 분기군으로부터 구축될 수 있다. 예를 들어, Bal 균주 유래의 HIV Gag (HIV Gag; Bal) (SEQ ID NO: 51); HIV Pol (HIV Pol; Bal) (SEQ ID NO: 52); 및 HIV Int (HIV 인테그라제; Bal) (SEQ ID NO: 53)는 본 명세서에 요약된 바와 같은 헬퍼/헬퍼 플러스 Rev 플라스미드에 함유된 Gag, Pol, 및 Int 서열과 상호교환될 수 있다. 이들 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이를 통해서 더욱 가변화될 수 있다.
엔벨로프: VSV-G 당단백질은 고양이 내생성 바이러스 (RD114) (엔벨로프; RD114) (SEQ ID NO: 54), 기본 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV) (엔벨로프; GALV) (SEQ ID NO: 55), 공수병 (FUG) (엔벨로프 FUG) (SEQ ID NO: 56), 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV) (엔벨로프 LCMV) (SEQ ID NO: 57), 인플루엔자 A 조류 흑사병 바이러스 (FPV) (엔벨로프; FPV) (SEQ ID NO: 58), 로스 리버 알파바이러스 (RRV) (엔벨로프; RRV) (SEQ ID NO: 59), 쥐 백혈병 바이러스 10A1 (MLV) (엔벨로프; MLV 10A1) (SEQ ID NO: 60), 또는 에볼라 바이러스 (EboV) (엔벨로프; 에볼라) (SEQ ID NO: 61) 유래의 막 당단백질로 대체될 수 있다. 이들 엔벨로프에 대한 서열은 본 명세서의 서열 부분에서 확인된다. 또한, 이들 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이를 통해서 더욱 가변화될 수 있다.
요약하면, 3-벡터 대 4-벡터 시스템은 하기와 같이, 부분적으로, 비교 및 대조할 수 있다. 3-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 1. 헬퍼 플라스미드: HIV Gag, Pol, 인테그라제, 및 Rev/Tat; 2. 엔벨로프 플라스미드: VSV-G/FUG 엔벨로프; 및 3. 치료적 벡터: RSV 5'LTR, Psi 패키징 신호, Gag 단편, RRE, Env 단편, cPPT, WPRE, 및 3' 델타 LTR을 함유한다. 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 1. 헬퍼 플라스미드: HIV Gag, Pol, 및 인테그라제; 2. Rev 플라스미드: Rev; 3. 엔벨로프 플라스미드: VSV-G/FUG 엔벨로프; 및 4. 치료적 벡터: RSV 5'LTR, Psi 패키징 신호, Gag 단편, RRE, Env 단편, cPPT, WPRE, 및 3' 델타 LTR을 함유한다. 상기 구성요소에 상응하는 서열은 본 명세서의 서열 목록 부분에서 확인된다.
실시예 2: VRC01 서열, 3BNC117 서열, sCD4 서열, 또는 sCD4-IgG1 Fc 서열을 함유하는 렌티바이러스의 구축
항-HIV 중화 항체의 중쇄 (HV) 중쇄 및 경쇄 (LV) 가변 영역을 합성하였고 (Integrated DNA Technologies-IDT), 인간 IgG1 중쇄 (SEQ ID NO: 70) (IgG1 중쇄 불변 사슬) (CH) (Gen Bank: AY623427.1) 및 경쇄 (SEQ ID NO: 73) (IgG1 경쇄 불변 사슬) (CL) (Gen Bank: JQ837832.1)의 불변 영역을 함유하는 렌티바이러스 플라스미드에 삽입시켰다. IgG1 항체 불변 영역 및 VRC01 (Gen Bank: GU980702.1) 및 3BN117 (Gen Bank: HE584537.1) 중쇄 가변 영역의 유전자 단편을 함유하는 렌티바이러스 플라스미드는 제한 효소 XhoI 및 AgeI (NEB)로 분해하였고, 플라스미드는 1% 아가로스 겔 (ThermoFisher)에서 분리하고 추출하고 나서, 플라스미드 및 단편을 T4 DNA 리가제 (NEB)를 사용해 결찰시켰다. IgG1 항체 불변 영역 및 VRC01 (Gen Bank: GU980703.1) 및 3BN117 (Gen Bank: HE584538.1) 경쇄 가변 영역의 유전자 단편을 함유하는 렌티바이러스 플라스미드는 제한효소 BamHI 및 NotI (NEB)으로 분해하였다. DNA 단편은 1% 아가로스 겔 (ThermoFisher)에서 분리하고 추출하였고, 그 다음에 플라스미드 및 단편을 T4 DNA 리가제 (NEB)를 사용해 결찰하였다. sCD4 및 sCD4-IgG1 Fc의 유전자 단편을 합성하였고 (IDT) 렌티바이러스 플라스미드에 삽입하였다. sCD4는 항체 분비 서열을 갖는 CD4의 도메인 1 및 2 (Gen Bank: NM_000616.5)로 이루어지고 sCD4-IgG1 Fc는 IgG1 Fc 영역 (Gen Bank: AF237583.1)에 융합된 CD4의 도메인 1 및 2 및 항체 분비 서열로 이루어진다. 렌티바이러스 플라스미드 및 sCD4 및 sCD4-IgG1 Fc의 유전자 단편은 BsrGI 및 NotI (NEB)로 분해하였고, 플라스미드는 1% 아가로스 겔에서 분리 및 추출하고 나서, 플라스미드 및 단편은 T4 DNA 리가제 (NEB)를 사용해 결찰하였다. 항-HIV 중화 항체 및 sCD4의 발현을 조절하기 위한 프로모터 및 분비 서열의 변이를 함유하는 렌티바이러스 벡터의 선형 맵은 도 4에 도시된다. 표 1은 항-HIV 항체 또는 sCD4를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 예시한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 3: 3BNC117을 발현하는 CD4 T 세포를 감염시키는 HIV 능력의 손상
HIV 항체 3BNC117을 CD4 T 세포에서 발현시킨 다음 HIV로 세포를 챌린지하였다. 세포는 HIV-감염된 세포의 빈도를 결정하기 위해 분석되었다.
방법: 0일에, PBMC는 CD8+ T 세포를 고갈시킨 다음 TransAct (CD3/CD28 비드) (MiltenyiBiotec)로 자극되었다. 1일에, PBMC는 HIV에 대한 광범위 중화 항체 (bNAb)를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (SEQ ID NO:4; AGT112)를 형질도입시켰다. 벡터의 성분은 표 2에 기술된다. AGT112 벡터 (SEQ ID NO: 4)는 IL-2 분비 서열 (SEQ ID NO: 74 (3BNC117 중쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 서열 존재)) 및 SEQ ID NO: 75 (3BNC117 경쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 서열 존재))을 함유하는 3BNC117 항체 서열의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. IL-2 분비 서열은 SEQ ID NO: 11이다.
2일에, PBMC는 HIV NL43-GFP로 감염되었다. 3일에, 세포를 3회 세척하였다. 6일에, HIV-감염된 GFP 양성 세포를 측정하였다. 이 프로토콜은 도 5에 도시되지만 여기서 LV-3BNC117은 LV-VRC01로 대체되었다.
도 6은 유세포측정 데이터를 도시하고, 시험관내에서 HIV 감염에 대한 T 세포 생산된 3BNC117 항체의 효과를 밝혀준다. 도 6의 상단 및 하단 패널은 상이한 도너 (NY025 도너 및 NY026 도너)로부터 시험된 PBMC를 나타낸다. 양쪽 도너에서 확인된 바와 같이, 대조군 처리된 세포 (3BNC117을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 처리되지 않은 세포) (NL43-GFP로 표지된 컬럼 참조) (NY025 도너 경우 3.96%의 GFP 양성 세포 및 NY026 도너 경우 0.57%의 GFP 양성 세포)와 비교하여 3BNC117를 코딩하는 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 세포에서 GFP 발현의 감소가 존재하였다 (NL43+3BNC117로 표지된 컬럼 참조) (NY025 도너 경우 1.79%의 GFP 양성 세포 및 NY026 도너 경우 0.30%의 GFP 양성 세포). 사퀴나비르 처리된 세포는 NY025 및 NY026 도너에 대해서 각각 0.025% 및 2.43E-3% GFP 양성 세포가 확인되었다.
실시예 4: 가용성 CD4를 발현하는 CD4 T 세포를 감염시키는 HIV 능력의 손상
가용성 CD4 (sCD4)는 CD4 T 세포에서 발현시켰다. 다음으로 CD4 T 세포를 HIV로 감염시켰다. 세포는 HIV 감염된 세포의 빈도를 결정하기 위해 분석되었다.
방법: 0일에, PBMC는 CD8+ T 세포를 고갈시킨 다음에 TransAct (CD3/CD28 비드) (MiltenyiBiotec)로 자극되었다. 1일에, PBMC는 sCD4 (SEQ ID NO: 8 (AGT116) 및 SEQ ID NO: 10 (AGT117))를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 벡터의 성분은 표 2에 기술된다. AGT116 벡터 (SEQ ID NO: 8)는 sCD4 서열 (SEQ ID NO: 7) 및 sCD3 서열 상류의 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다. AGT117 벡터 (SEQ ID NO: 10)는 sCD4-IgG1 Fc 서열 (SEQ ID NO: 9) 및 sCD4-IgG1 Fc 서열 상류의 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다.
2일에, PBMC는 HIV NL43-GFP로 감염시켰다. 3일에, 세포를 3회 세척하였다. 다음으로 세포를 4일 동안 배양하였다. 6일에, HIV-감염된 GFP 양성 세포를 측정하였다. 이 프로토콜의 개략도는 도 7에 도시된다.
도 8A 및 8B는 시험관내에서 HIV 감염에 대한 T 세포 생산된 sCD4의 효과를 밝혀주는 유세포측정 데이터를 도시한다. 도 8A 및 8B 둘 모두의 상단 행에 도시된 바와 같이, sCD4의 형질도입 효율은 낮았다. 도 8A (상단 행)에서, AGT116 (SEQ ID NO: 8)의 형질도입 효율 (NL43-sCD4로 표지된 컬럼 참조)은 12.7%였고, AGT117 (SEQ ID NO: 10)의 형질도입 효율 (NL43-sCD4-Ig 및 NL43+sCD4-Ig-R5로 표지된 컬럼 참조)은 6.39% 및 2.36%였다. 도 8B (상단 행)에서, AGT116 (SEQ ID NO: 8)의 형질도입 효율 (NL43-sCD4로 표지된 컬럼 참조)은 22.7%였고 AGT117 (SEQ ID NO: 10)의 형질도입 효율 (NL43-sCD4-Ig 및 NL43+sCD4-Ig-R5로 표지된 컬럼 참조)은 12.1% 및 4.37%였다.
sCD4를 발현하는 CD4 T 세포는 부분적으로 HIV 감염을 차단하였다 (도 8A 및 8B의 하단 행 참조). 도 8A (하단 행)에서, 대조군 처리된 세포 (NL43으로 표지된 컬럼 참조)에서, GFP 양성 세포의 비율은 0.46%였다. 그러나, 세포가 AGT116 (SEQ ID NO: 8)로 처리되었을 때 (NL43+sCD4로 표지된 컬럼 참조), GFP 양성 세포의 비율은 0.30%였고, 세포가 (AGT117) (SEQ ID NO: 10)로 처리되었을 때 (NL43-sCD4-Ig 및 NL43+sCD4-Ig-R5로 표지된 컬럼 참조), GFP 양성 세포의 비율은 0.26% 및 0.25%였다. 이것은 0.017%의 사퀴나비르 처리된 세포 (NL43-사퀴나비르로 표지된 컬럼 참조)에서의 GFP 양성 세포의 비율과 비교될 수 있다. 도 8B (하단 행)에서, 대조군 처리된 세포 (NL43으로 표지된 컬럼 참조)에서, GFP 양성 세포의 비율은 7.75%였다. 그러나, 세포를 AGT116 (SEQ ID NO: 8)으로 처리했을 때 (NL43+sCD4로 표지된 컬럼 참조), GFP 양성 세포의 퍼센트는 3.67%였고, 세포가 (AGT117) (SEQ ID NO: 10)로 처리되었을 때 (NL43-sCD4-Ig 및 NL43+sCD4-Ig-R5로 표지된 컬럼 참조), GFP 양성 세포의 비율은 2.98% 및 5.40%였다. 이것은 0.026%의 사퀴나비르 처리된 세포 (NL43-사퀴나비르로 표지된 컬럼 참조)에서 GFP 양성 세포의 비율과 비교할 수 있다.
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실시예 5: HIV Gag-특이적 CD4 T 세포에 의한 항체 발현
HIV 항체 VRC01 또는 3BNC117을 CD4 T 세포에서 발현시켰다. Gag 로 CD4 T 세포의 자극은 항체 발현의 증가를 야기시켰다.
방법: HIV Gag-특이적 CD4 T 세포에 의한 항체 발현을 측정하기 위해서, HIV 양성 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Cat: 17-1440-02)를 사용해 분리하였다. 분리된 PBMC (1x107)는 18시간 동안 24-웰 플레이트 중 1 mL 배지에서 PepMix™ HIV (GAG) Ultra (Cat: PM-HIV-GAG, JPT 펩티드 Technologies)로 자극되었다. CD8 T, γδ, NK, 및 B 세포는 PE 표지된 특이적 항체 및 항-PE 마이크로비드를 사용해 고갈되었다. 음성적으로 선택된 세포는 IL7 (170-076-111, Miltenyi Biotec), IL15 (170-076-114, Miltenyi Biotec) 및 사퀴나비르 (Cat: 4658, NIH AIDS Reagent Program)를 함유하는 TexMACS GMP 배지 (Cat: 170-076-309, Miltenyi Biotec) 중에서 2x106/mL로 배양되었다. 항-HIV 항체 VRC01을 코딩하는 렌티바이러스 벡터 AGT111 (SEQ ID NO: 2) 또는 항-HIV 항체 3BNC117을 코딩하는 AGT112 (SEQ ID NO: 4)는 24시간 후에 5의 감염 다중도 (MOI)로 첨가되었다.
AGT111 벡터 (SEQ ID NO: 2)는 IL-2 분비 서열을 함유하는 VRC01 항체 서열 (SEQ ID NO: 69 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재)) 및 SEQ ID NO: 72 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재))의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13) 를 함유한다. IL-2 분비 서열은 SEQ ID NO: 11이다.
AGT112 벡터 (SEQ ID NO: 4)는 IL-2 분비 신호를 함유하는 3BNC117 항체 서열 (SEQ ID NO: 74 (3BNC117 중쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재)) 및 SEQ ID NO: 75 (3BNC117 경쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재))의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. IL-2 분비 신호는 SEQ ID NO: 11이다.
IL7, IL15, 및 사퀴나비르를 함유하는 신선한 배지는 세포 확장 동안 2일 내지 3일 마다 첨가되었다. IL7 및 IL15의 출발 농도는 10 ng/mL이었다. 12일 내지 16일에, 2-3x106 세포는 펩티드 자극을 위해 수집되었다. IFNγ 및 IgG Fc의 세포내 발현은 PE 항-IFNγ 항체 및 APC 항-IgG1 Fc 항체 (Biolegend)를 사용해 검출되었다. 이 프로토콜의 개략도는 도 9에 도시되어 있다.
도 10에 도시된 바와 같이, 항원-특이적 CD4 T 세포는 IFNγ 및 항-HIV 항체 VRC01 또는 3BNC117을 발현하였다. 이것은 Gag-특이적 CD4 T 세포에서 유도성 항체 발현 (펩티드에 의해 유도)을 입증하였다 (도 10). 또한, 23일에 Gag PepMix (JPT Peptide Technologies)에 의한 자극 (Gag PepMix로 표지된 하단 행 참조, VRC01이 형질도입된 세포의 1.66% 및 3BNC117이 형질도입된 세포의 1.58%가 IgG Fc에 양성임을 보여줌)은 그 결과로 DMSO로 처리된 세포 (DMSO로 표지된 상단 행을 참조하고 VRC01이 형질도입된 세포의 0.18% 및 3BNC117가 형질도입된 세포의 0.13%가 IgG Fc에 양성임을 보여줌)에 비해서 IgG의 형광 강도의 대략 10배 증가를 야기시켰다 (도 10).
실시예 6: CD3/CD28 비드-자극된 CD4 T 세포에 의한 항체 발현
3BNC117 HIV 항체를 코딩하는 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 미토겐-자극된 CD4 T 세포는 세포내 항체 축적을 일으켰다.
방법: 초대 CD4 T 세포에서 항체 발현을 측정하기 위해서, PBMC는 전체 혈액으로부터 정제하였고 CD4+ T 세포 서브세트는 자성 비드를 사용한 음성 선택을 통해 농축되었다. 1Х106 CD4 T 세포는 10% FBS (Gemini Bio) 및 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 2 mL의 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 5% CO2 의 37℃ 인큐베이터에서 재조합 인간 IL-2 (30 U/mL) (Thermo Fisher Scientific) 및 TransAct (CD3/CD28 마이크로비드) (Miltenyi Biotec)를 보충하여 배양하였다. 세포는 항-HIV 항체 VRC01을 코딩하는 렌티바이러스 벡터 AGT111 (SEQ ID NO: 2) 또는 항-HIV 항체 3BNC117을 코딩하는 AGT112 (SEQ ID NO: 4)를 5의 MOI로 첨가하기 전에 1일 동안 배양되었다.
AGT111 벡터 (SEQ ID NO: 2)는 IL-2 분비 신호 (SEQ ID NO: 69 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재)) 및 SEQ ID NO: 72 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재))를 함유하는 VRC01 항체 서열의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. IL-2 분비 신호는 SEQ ID NO: 11이다.
AGT112 벡터 (SEQ ID NO: 4)는 IL-2 분비 신호 (SEQ ID NO: 74 (3BNC117 중쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재)) 및 SEQ ID NO: 75 (3BNC117 경쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 서열 존재))를 함유하는 3BNC117 항체 서열의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. IL-2 분비 신호는 SEQ ID NO: 11이다.
형질도입 후 1일에, 배지를 제거하였고 IL-2가 더해진 신선한 배지로 대체하였다. 세포는 추가 3일 동안 배양하였고, CD4 T 세포를 세척하고 수집하여 형질도입의 효율을 측정하였다. 형질도입된 세포는 헬퍼 T 세포의 특징은 CD3 및 CD4 당단백질의 세포 표면 염색을 통해서 확인하였고 VRC01 발현에 대해 세포내 IgG Fc를 측정하여 시험하였다. 이러한 프로토콜의 개략도는 도 11에 도시된다.
도 12에 도시된 바와 같이, CD4 T 세포는 PE-표지된 항-CD4 항체로 염색하였고 형질도입된 세포는 인간 IgG Fc (Biolegend)에 대한 APC-표지된 항체로 확인하였다. AGT111 (SEQ ID NO: 2) 형질도입된 세포 (AGT111로 표지된 컬럼 참조)에서, 배양되는 전체 세포의 41.6%는 CD4 및 IgG Fc 둘 모두에 양성이었다. AGT112 (SEQ ID NO: 4)에서, 배양되는 전체 세포의 17.9%가 CD4 및 IgG Fc 둘 모두에 양성이었다. 대조군 처리된 세포 (대조군 표지된 컬럼 참조)에서, 세포의 오직 0.13%만이 CD4 및 IgG 둘 모두에 양성이었다. 이들 데이터는 항체가 자극된 초대 CD4 T 세포에 의해 발현될 수 있다는 것을 입증하였다.
실시예 7: 항-HIV 항체 생산은 HIV 감염으로부터 CD4 T 세포를 보호한다
항-HIV 항체 VRC01의 발현은 HIV 감염으로부터 CD4 T 세포를 보호한다.
방법: CD4 T 세포는 음성 선택을 통해서 분리되었고 1일 동안 IL-2 (30 U/mL) (Thermo Fisher Scientific)를 더한 TransAct (CD3/CD28 비드) (Miltenyi Biotec)로 자극되었고 그 다음에 다양한 MOI의 렌티바이러스 벡터 AGT111 (SEQ ID NO: 2)로 형질도입되었다.
AGT111 벡터 (SEQ ID NO: 2)는 IL-2 분비 신호를 함유하는 VRC01 항체 서열 (SEQ ID NO: 69 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재))및 SEQ ID NO: 72 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재))의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. IL-2 분비 신호는 SEQ ID NO: 11이다.
1일 후에, 세포는 GFP를 발현하는 HIV 재조합 균주 NL43의 1 MOI로 감염되었다. 24시간 후에, CD3/CD28 비드, 렌티바이러스 및 HIV는 3회 PBS로 세척하여 제거되었고 10% FBS (Gemini Bio) 및 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)과 IL-2 (30 U/mL)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 5% CO2 의 37℃ 인큐베이터에서 7일 동안 배양되었고 필요에 따라 배지를 보충하였다. 대조군으로서 HIV 감염된 세포는 200 nM 사퀴나비르가 처리되었다. 배양 종료 시에, 세포를 수집하였고 GFP 발현에 대해서 APC 항-CD4 항체를 사용하여 유세포측정을 통해 분석되었다. CD4 세포가 GFP를 발현하면, HIV 감염되었다.
도 13A에 도시된 바와 같이, 더 높은 비율의 GFP+ 세포는 더 많은 HIV가 초대 CD4 T 세포에서 생산되었다는 것을 의미한다. 초대 T 세포 배양에서 생산된 더 많은 수준의 HIV는 AGT111에 의해 제공되는 적은 보호성과 연관된다. 임의의 벡터없이 NL43-GFP로 처리된 세포에서, GFP 양성 세포의 백분율은 각각 5일, 7일, 및 9일에 0.71%, 2.18%, 및 1.95%였다. 8 MOI의 AGT111 (SEQ ID NO: 2) 처리된 세포에서, GFP 양성 세포의 백분율은 5일, 7일, 및 9일에 각각 0.25%, 0.36%, 및 0.59%였다. 4 MOI의 AGT111 (SEQ ID NO: 2) 처리된 세포에서, GFP 양성 세포의 백분율은 5일, 7일, 및 9일에 각각 0.32%, 0.94%, 및 1.83%였다. 2 MOI의 AGT111 (SEQ ID NO: 2) 처리된 세포에서, GFP 양성 세포의 백분율은 5일, 7일, 및 9일에 각각 0.38%, 1.37%, 및 1.85%였다. 이것은 GFP 양성 세포의 백분율이 5일, 7일, 및 9일에 각각 0.19%, 0.22%, 및 0.24% 였던 사퀴나비르 처리된 세포와 비교할 수 있다.
도 13B은 상이한 날에, 상이한 MOI로 AGT 111 (SEQ ID NO:2)이 처리된 세포의 억제율을 도시한다. 5일에, 8, 4, 및 2의 MOI에서, AGT111는 세포의 각각 88%, 75%, 및 63%를 보호하였다. 7일에, 8, 4, 및 2의 MOI에서, AGT111는 세포의 각각 93%, 63%, 및 41%를 보호하였다. 9일에, 8, 4, 및 2의 MOI에서, AGT111은 세포의 각각 80%, 7%, 및 6%를 보호하였다.
실시예 8: 고도의 HIV 허용 T 세포 백혈병 세포주에 의한 항체 발현
C8166은 HIV 감염을 고도로 허용하는 T 세포 백혈병 세포주이다. HIV 항체를 코딩하는 렌티바이러스로 C8166 T 세포 백혈병 세포주의 형질도입은 HIV의 생산을 일으킨다.
방법: C8166 세포는10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific)에서 배양된 다음에 5의 MOI로 렌티바이러스 벡터 AGT111 (SEQ ID NO: 2)로 형질도입되었다. AGT111 벡터 (SEQ ID NO: 2)는 IL-2 분비 신호를 함유하는 VRC01 항체 서열 (SEQ ID NO: 69 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재)) 및 SEQ ID NO: 72 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재))의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. IL-2 분비 서열은 SEQ ID NO: 11이다.
72시간 후에, 세포는 12x75 mm FACs 튜브에 회수하였고 1000 rpm을 3분 동안 원심분리하였다. 세포를 PBS로 세척하였고 1000 rpm으로 3분 동안 원심분리하였다. BD 고정/투과 키트로부터의 0.2 mL의 고정 용액을 튜브에 첨가하였고 세포를 4℃에서 15분 동안 유지시켰다. 세포는 BD Perm/Wash 완충액으로 2회 세척하였고, 0.1 mL은 2.5 ㎕의 PE 항-인간 IgG1 Fc 항체 (Biolegend)와 함께 각 튜브에 첨가되었다. 튜브를 4℃에서 20분 동안 유지시킨 다음에 2회 PBS로 세척하였다. 세포는 0.7 mL의 PBS에 재현탁하였고 FACS Calibur 유세포측정계에서 검출하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, 항체 발현은 AGT111-형질도입된 C8166 세포에서 검출되었다.
실시예 9: 항-HIV 항체 생산은 고도로 허용되는 세포를 HIV 감염으로부터 보호한다.
C8166 T 세포주에서 VRC01 항체를 코딩하는 렌티바이러스의 형질도입은 HIV NL43 감염의 억제를 일으켰다.
방법: C8166 세포는 10% FBS (Gemini Bio)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였고 그 다음에 0일에 5의 MOI로 렌티바이러스 벡터 AGT111 (SEQ ID NO: 2)로 형질도입시키거나 또는 하지 않았다. AGT111 벡터 (SEQ ID NO: 2)는 IL-2 분비 신호를 함유하는 VRC01 항체 서열 (SEQ ID NO: 69 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재)) 및 1SEQ ID NO: 72 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (IL-2 분비 신호 존재))의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. IL-2 분비 신호는 SEQ ID NO: 11이다.
3일에, 세포는 GFP를 발현하는 HIV 재조합 균주 NL43의 1 MOI로 감염되었다. 7일에, 세포는 유세포측정을 통해서 GFP 양성 HIV 감염된 세포를 측정하기 위해 수집되었다. C8166 세포가 GFP를 발현하면, 그것은 HIV에 의해 감염되었다. 더 높은 비율의 GFP+ C8166 세포는 더 많은 HIV가 생산되었다는 것을 의미한다. 이 프로토콜의 개략도는 도 15에 도시된다.
도 16에 도시된 바와 같이, AGT111은 HIV 감염에 대해 C8166 세포를 보호하였다. AGT111 (SEQ ID NO: 2) 형질도입된 세포 (AGT111+NL43-GFP로 표지된 컬럼 참조)에서, C8166 세포의 13.5%가 HIV 양성이었다. 렌티바이러스 벡터가 형질도입되지 않은 세포 (NL43-GFP로 표지된 컬럼 참조)에서, C8166 세포의 54.8%가 HIV 양성이었다. 그러므로, AGT111에 의한 HIV 감염의 75.4% 감소가 존재하였다.
실시예 10: 고도로 HIV 허용되는 T 세포 백혈병 세포주로부터 항체 분비
VRC01 항체를 코딩하는 렌티바이러스로 C8166 세포의 형질도입은 항체의 항체 분비를 일으킨다.
방법: 2Х105 세포/mL의 C8166 세포를 10% FBS (Gemini Bio)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific)의 24웰 플레이트에 파종하였고 항-HIV VRC01 항체를 코딩하는 렌티바이러스 AGT113 (SEQ ID NO: 6)을 5의 MOI로 형질감염시키거나 또는 없이 형질감염시켰다. AGT113 벡터 (SEQ ID NO: 6)는 항체 분비 신호를 함유하는 VRC01 항체 서열 (SEQ ID NO: 86 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재)) 및 SEQ ID NO: 71 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재))의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. 항체 분비 신호는 SEQ ID NO: 12이다.
4일에, 세포는 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 배지를 제거하였다. 항체 발현은 제조사 설명서에 따라서 EasyTiter IgG Fc 항체 검출 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용해 결정되었다.
도 17에 도시된 바와 같이, VRC01 (SEQ ID NO: 6)을 코딩하는 렌티바이러스로 C8166 세포의 형질도입 (도 17에서 LV-AGT113으로 표지된 막대 참조)은 대략 1,500 ng/mL의 세포 배양 배지 중 항체의 농도를 야기시켰다. 이것은 대조군 처리된 세포 (LV 없음 표지된 막대 참조)를 함유하는 배양 배지 중 항체의 무시할만한 양과 비교된다.
실시예 11: 항-HIV 항체 생산은 HIV 감염으로부터 고도로 허용되는 세포주를 보호하였다.
VRC01 항체를 코딩하는 렌티바이러스로 C8166 세포주의 형질도입은 HIV 감염으로부터 세포주의 보호를 일으켰다.
방법: C8166 세포는 10% FBS (Gemini Bio)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였고 0일에 5의 MOI로 렌티바이러스 AGT113 (SEQ ID NO: 6)으로 형질도입되거나 또는 하지 않았다. AGT113 벡터 (SEQ ID NO: 6)는 항체 분비 신호 (SEQ ID NO: 86 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재) SEQ ID NO: 71 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재))를 함유하는 VRC01 항체 서열의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. IL-2 항체 분비 신호는 SEQ ID NO: 12이다.
3일에, 세포는 그 자체로 GFP를 발현하는 HIV 재조합 균주 NL43의 1 MOI로 감염되었다. 7일에, 세포는 유세포측정을 통해서 GFP 양성 HIV 감염된 세포를 측정하기 위해 수집되었다. C8166 세포가 GFP를 발현하면, 그것은 HIV에 감염되었다. 더 높은 비율의 GFP+ C8166 세포는 더 많은 HIV가 생산되었다는 것을 의미한다.
도 18에 도시된 바와 같이, AGT113 (SEQ ID NO: 6)은 C8166 세포를 HIV 감염에 대해 보호하였다. AGT113 (SEQ ID NO: 6) 감염된 세포 (C8166+AGT113+NL43-GFP로 표지된 컬럼 참조)에서, C8166 세포의 1.06%가 HIV 양성이었다. 렌티바이러스가 형질도입되지 않은 세포 (C8166+NL43-GFP로 표지된 컬럼 참조)에서, 31.8%가 HIV였다. 그러므로, AGT113에 의해서 HIV 감염의 96.7% 감소가 존재하였다.
실시예 12: 가용성 CD4 생산은 HIV 감염으로부터 고도로 허용되는 세포주를 보호하였다
가용성 CD4를 코딩하는 렌티바이러스로 C8166 T 세포의 형질도입은 HIV 감염으로부터 보호를 일으켰다.
방법: C8166 세포는 MOI 5로 sCD4-IgG1 Fc를 코딩하는 렌티바이러스 AGT117 (SEQ ID NO: 10)로 형질도입되거나 또는 하지 않았다. AGT117 벡터 (SEQ ID NO: 10)는 sCD4-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 9)의 발현을 구동하는 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다 (sCD4(D1+D2)-IgG1 Fc). 5일에, 세포는 GFP를 보유하는 HIV NL43으로 감염되었다. 7일에, 세포는 GFP 양성 HIV 감염 세포를 측정하기 위해 수집되었다.
도 19에서, GFP 형광 강도는 NL43-GFP로만 처리된 세포에서 GFP 형광 강도 (32.2% GFP 양성 세포를 보이는 C8166+NL43-GFP 표지된 컬럼 참조)와 비교하여 CD4를 코딩하는 렌티바이러스가 형질도입되고 NL43 GFP처리된 세포 (AGT117 (SEQ ID NO: 10)) (0.41% GFP 양성 세포를 보이는 C8166+sCD4+NL43-GFP로 표지된 컬럼 참조)에서 유의하게 감소되었다. 이것은 sCD4 생산이 HIV 감염으로부터 고도로 허용되는 세포주를 보호하였다는 것을 의미한다.
실시예 13: CD3/CD28 비드-자극된 CD4 T 세포 내에서 항체 발현
VRC01 HIV 항체를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 미토겐-자극된 CD4 T 세포는 세포내 항체 축적을 일으켰다.
방법: 초대 CD4 T 세포에서 항체 발현을 측정하기 위해서, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 전체 혈액으로부터 정제하였고 CD4+ T 세포 서브세트는 자성 비드를 사용해 음성 선택을 통해 농축되었다. 1Х106 CD4 T 세포는 10% FBS (Gemini Bio) 및 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)를 함유하는 2 mL의 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에서 5% C02의 37℃ 인큐베이터에서 배양되었고 재조합 인간 IL-2 (30 U/ml) (Thermo Fisher Scientific) 및 TransAct (CD3/CD28 마이크로비드) (Miltenyi Bio)가 보충되었다. 세포는 5의 MOI로 렌티바이러스 AGT113 (SEQ ID NO: 6)를 첨가하기 전 1일 동안 배양되었다.
AGT113 벡터 (SEQ ID NO: 6)는 항체 분비 신호를 함유하는 VRC01 항체 서열 (SEQ ID NO: 86 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재) 및 SEQ ID NO: 71 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재))의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. 항체 분비 신호는 SEQ ID NO: 12이다.
형질도입 후 1일에, 배지를 제거하였고, IL-2가 더해진 신선한 배지로 대체되었다. 세포를 추가 3일 동안 배양하였고, CD4 T 세포를 세척하고 형질도입의 효율을 측정하기 위해 수집되었다. 형질도입된 세포는 PE 항-인간 IgG Fc 항체 (Biolegend)로 VRC01에 대한 세포내 IgG Fc를 측정하기 위해 시험되었다.
도 20에 도시된 바와 같이, IFNγ 양성, 항원-특이적 CD4 T 세포는 VRC01 항체를 발현하였다.
실시예 14: HIV Gag-특이적 CD4 T 세포 내 항체 발현
HIV Gag-특이적 CD4 T 세포에서 항체 발현을 측정하기 위해서, HIV 양성 인간 PBMC는 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Cat: 17-1440-02)에서 분리하였다.
방법: PBMC (1x107)는 18시간 동안 24웰 플레이트 중 1 mL 배지에서 PepMix™ HIV (GAG) Ultra (Cat: PM-HIV-GAG, JPT Peptide Technologies)로 자극시켰다. CD8 T γδ, NK 및 B 세포는 PE 표지된 특이적 항체 및 항-PE 마이크로비드를 사용해 고갈되었다. 음성적으로 선택된 세포는 IL7 (170-076-111, Miltenyi Biotec), IL15 (170-076-114, Miltenyi Biotec) 및 사퀴나비르 (Cat: 4658, NIH AIDS Reagent Program)를 함유하는 TexMACS GMP 배지 (Cat: 170-076-309, Miltenyi Biotec) 중에서 2x106/mL로 배양되었다. 렌티바이러스 AGT113 (SEQ ID NO: 6)는 24시간 이후에 5의 MOI로 첨가되었다. AGT113 벡터 (SEQ ID NO: 6)는 항체 분비 신호를 함유하는 VRC01 항체 서열 (SEQ ID NO: 86 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재) 및 SEQ ID NO: 71 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재))의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. 항체 분비 신호는 SEQ ID NO: 12이다.
IL7, IL15, 및 사퀴나비르를 함유하는 신선한 배지가 세포 확장 동안 2일 내지 3일 마다 첨가되었다. IL7 및 IL15의 출발 농도는 10 ng/mL이었다. 12일 내지 16일에, 2-3x106 세포가 펩티드 자극을 위해 수집되었다. IFNγ 및 VRC01 항체의 세포내 발현은 PE 항-IFNγ 항체 및 PC 항-IgG1 Fc 항체 (Biolegend)를 사용해 검출되었다.
도 21에 도시된 바와 같이, IFNγ 양성, 항원-특이적 CD4 T 세포는 대조군 처리된 세포 (대조군 표지된 컬럼 참조-상단행 (0.24% 양성 세포) 및 하단 행 (0.24% 양성 세포) 둘 모두의 상단 우측 사분면 참조)에 비해서, 함유된 VRC01 항체를 발현하였다 (AGT113 표지된 컬럼 참조-상단 행 (6.37% 양성 세포) 및 하단 행 (5.23% 양성 세포) 둘 모두의 상단 우측 사분면).
실시예 15: 항-HIV 항체 생산은 HIV 감염에 대해 CD4 T 세포를 보호한다.
초대 CD4 T 세포에서 VRC01 항체를 코딩하는 렌티바이러스의 형질도입은 HIV NL43-GFP 감염을 억제한다.
방법: CD4 T 세포를 음성 선택으로 분리하였고 1일 동안 IL-2 (30 U/mL) (Thermo Fisher Scientific)가 더해진 TransAct (CD3/CD28 비드) (Miltenyi Biotec)로 자극시킨 다음에 5의 MOI로 렌티바이러스 AGT113 (SEQ ID NO: 6)로 형질도입시켰다. AGT113 벡터 (SEQ ID NO: 6)는 항체 분비 신호를 함유하는 VRC01 항체 서열 (SEQ ID NO: 86 (VRC01 중쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재) 및 SEQ ID NO: 71 (VRC01 경쇄 가변 사슬 (항체 분비 신호 존재))의 발현을 구동하는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 함유한다. 항체 분비 신호는 SEQ ID NO: 12이다.
1일 이후에, 세포는 GFP를 발현하는 HIV 재조합 균주 NL43의 1 MOI로 감염시켰다. 24시간 후에, CD3/CD28 비드, 렌티바이러스 및 HIV는 3회 PBS로 세척하여 제거하였고, 10% FBS (Gemini Bio) 및 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)과 IL-2 (30 U/mL)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 5% C02의 37℃ 인큐베이터에서 7일 동안 배양하였고 필요에 따라 배지 보충하였다. 배양 종료 시에, 세포를 수집하였고 유세포측정으로 분석하였다. CD4 세포가 GFP를 발현하면, 그것은 HIV에 의해 감염되었다. 이 프로토콜의 개략도는 도 22에 도시된다.
도 23에 도시된 바와 같이, AGT113은 HIV 감염으로부터 초대 CD4 T 세포를 보호하였다. AGT113 형질도입된 세포 (SEQ ID NO: 6) (NL43-GFP-AGT113으로 표지된 컬럼 참조)에서, 세포의 0.36%는 HIV 양성이었다. 비형질도입된 세포 (NL43-GFP로 표지된 컬럼 참조)에서, 세포의 1.28%가 HIV 양성이었다.
실시예 16: 가용성 CD4-IgG Fc 융합 단백질의 생산은 HIV 감염으로부터 CD4 T 세포를 보호한다.
가용성 CD4-IgG Fc 융합 단백질은 HIV 감염으로부터 CD4 T 세포를 보호한다.
방법 (I): CD4 T 세포는 음성 선택을 통해 분리하였고 1일 동안 TransAct (CD3/CD28 비드) (Miltenyi Biotec)와 IL-2 (30 U/mL) (Thermo Fisher Scientific)로 자극한 다음 5의 MOI로 렌티바이러스 AGT116 (SEQ ID NO: 8) 또는 AGT117 (SEQ ID NO: 10)로 형질도입되었다. AGT116 벡터 (SEQ ID NO: 8)는 sCD4 (SEQ ID NO: 7)의 발현을 구동하는 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다 (sCD4(D1+D2). AGT117 벡터 (SEQ ID NO: 10)는 sCD4-IgG1 FC (SEQ ID NO: 9)의 발현을 구동하는 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다 (sCD4(D1+D2)-IgG1 Fc).
1일 후에, 세포는 GFP를 발현하는 HIV 재조합 균주 NL43의 1 MOI로 감염되었다. 24시간 후에, CD3/CD28 비드, 렌티바이러스 및 HIV는 3회 PBS로 세척하여 제거되었고 10% FBS (Gemini Bio) 및 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)와 IL-2 (30 U/mL)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 5% C02의 37℃ 인큐베이터에서 7일 동안 배양되었고 필요하면 배지 보충하였다. 배양 종료 시에, 세포는 수집되었고 유세포측정을 통해 분석되었다. CD4 T 세포가 GFP를 발현하면, 그것은 재조합 HIV로 감염되었다.
도 24에 도시된 바와 같이, 가용성 CD4-IgG Fc 융합 단백질을 코딩하는 AGT117 (SEQ ID NO: 10)은 HIV 감염으로부터 초대 CD4 T 세포를 보호하였다. 특히, AGT117이 처리된 세포 (NL43-GFP+AGT117로 표지된 컬럼 참조)에서, 세포의 0.65%는 HIV 양성이었다. 이것은 2.83%가 HIV 양성인 대조군 처리된 세포 (NL43-GFP로 표지된 컬럼 참조)와 비교될 수 있다. 따라서, AGT117로 HIV 감염에서 77% 감소가 존재하였다. 그러나, 가용성 CD4를 코딩하는 렌티바이러스 AGT116 (SEQ ID NO: 8)은 낮은 수준의 HIV 억제를 입증하였다 (세포의 2.65%가 HIV 양성임을 보여주는 NL43-GFP+AGT116 표지된 컬럼 참조).
방법 (II): CD4 T 세포는 음성 선택을 통해 분리되었고 1일 동안 TransAct (CD3/CD28 비드) (Miltenyi Biotec)와 IL-2 (30 U/mL) (Thermo Fisher Scientific)로 자극된 다음에 5의 MOI로 렌티바이러스 AGT117 (SEQ ID NO:10) 또는 AGT124 (SEQ ID NO: 88) 또는 AGT125 (SEQ ID NO:89)로 형질감염되었다. AGT117 벡터 (SEQ ID NO: 10)는 Fc 영역이 절두된 CD4-IgG (SEQ ID NO: 7)의 발현을 구동하는 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다. AGT124 벡터 (SEQ ID NO: 88)는 Fc 영역이 온전하고 야생형 서열 (SEQ ID NO: 76)을 사용하는 sCD4-IgG1의 발현을 구동하는 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다. AGT125 벡터 (SEQ ID NO: 89)는 Fc 감마 수용체 II (SEQ ID NO: 77)에 대한 결합 부위를 제거하도록 돌연변이된 sCD4-IgG1의 발현을 구동하는 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다.
1일 후에, 세포는 GFP를 발현하는 1 MOI의 HIV 재조합 균주 NL43으로 감염되었다. 24시간 후에, CD3/CD28 비드, 렌티바이러스 및 HIV는 3회 PBS로 세척하여 제거되었고 10% FBS (Gemini Bio) 및 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)과 IL-2 (30 U/mL)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 5% C02의 37℃ 인큐베이터에서 7일 동안 배양되었고 필요에 따라 배지 보충하였다. 배양 종료 시에, 세포를 수집하였고 유세포측정을 통해 분석하였다. CD4 T 세포가 GFP를 발현하면, 그것은 재조합 HIV에 의해 감염되었다.
도 27에 도시된 바와 같이, 렌티바이러스 벡터 첨가없이 NL43-GFP 바이러스 감염은 2종의 상이한 혈액 도너 (NY035 및 NY036)로부터의 데이터를 사용하여, 평균 2% 감염된 세포를 생산하였다. AGT117로 T 세포의 형질도입은 HIV 감염에 대해 보호되었고 0.024%까지 감염된 세포의 비율을 감소시켰다. AGT124로 형질도입은 감염으로부터 CD4 T 세포를 보호하였고 대조군 수준의 0.003% 까지 감염된 세포의 수를 감소시켰고 AGT125로 형질도입은 CD4 T 세포의 감염을 대조군 수준의 0.004% 까지 감소시켰다. AGT117, AGT124, 및 AGT125 벡터가 모두 HIV 감염에 대해 CD4 T 세포에 대한 보호를 제공하였지만, AGT124 및 AGT125는 AGT117과 비교해 가장 강력하였다.
실시예 17: 가용성 CD4-IgG Fc 융합 단백질 및 CCR5 및 HIV Vif 및 Tat에 대한 억제성 RNA를 코딩하는 렌티바이러스 벡터는 HIV 감염으로부터 CD4 T 세포를 보호한다
가용성 sCD4-IgG Fc 및 CCR, Vif 및 Tat에 대한 억제성 RNA 둘 모두의 발현은 가용성 sCD4-IgG Fc 단독 발현보다 HIV에 대해 더 나은 보호성을 부여한다.
방법: CD4 T 세포는 음성 선택하였고 1일 동안 TransAct (CD3/CD28 비드) (Miltenyi Biotec)와 IL-2 (30 U/mL) (Thermo Fisher Scientific)로 자극시킨 다음 5의 MOI로 렌티바이러스 AGT103 (SEQ ID NO: 78) 또는 AGT118 (SEQ ID NO: 80)로 형질도입시켰다. AGT103 벡터 (SEQ ID NO: 78)는 miR30-CCR5/miR21-Vif/mir185-Tat 마이크로RNA 클러스터 서열 (SEQ ID NO: 65)의 발현을 구동하는 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다 (miR30-CCR5/miR21-Vif/miR185-Tat 마이크로RNA 클러스터 서열). miR30-CCR5 서열은 SEQ ID NO: 62이다. miR21-Vif 서열은 SEQ ID NO: 63이다. miR185-Tat 서열은 SEQ ID NO: 64이다. AGT118 벡터 (SEQ ID NO: 80)는 sCD4(D1+D2)-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 9) 및 miR30-CCR5/miR21-Vif/miR185-Tat 마이크로RNA 클러스터 서열 (SEQ ID NO: 65)의 발현을 구동하는 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다.
1일 후에, 세포는 GFP를 발현하는 HIV 재조합 균주 NL43의 1 MOI로 감염되었다. 24시간 후에, CD3/CD28 비드, 렌티바이러스 및 HIV는 3회 PBS 세척으로 제거되었고 10% FBS (Gemini Bio) 및 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)과 IL-2 (30 U/mL)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 5% C02의 37℃ 인큐베이터에서 7일 동안 배양되었고, 필요하면 배지 보충하였다. 배양 종료시에, 세포를 수집하고 유세포측정을 통해 분석하였다. CD4 세포가 GFP를 발현하면, 그것은 HIV에 의해 감염되었다.
도 25에 도시된 바와 같이, AGT118 (SEQ ID NO: 80)은 CCR5 및 HIV Vif 및 Tat에 대한 억제성 RNA를 코딩하는 AGT103의 보호 효과를 더 개선시켰다. AGT118-형질도입된 세포 (NL43-GFP+AGT118로 표지된 컬럼 참조)에서, 세포의 0.21%가 HIV 양성이었다. AGT103 형질도입된 세포 (NL43-GFP+AGT103으로 표지된 컬럼 참조)에서, 세포의 0.86%가 HIV 양성이었다. 대조군 처리된 세포 (NL43-GFP로 표지된 컬럼)에서, 세포의 2.35%가 HIV 양성이었다. 그러므로, AGT118에 의해서 HIV 감염의 91.1% 감소 및 AGT103에 의해 75.6% 감소가 존재하였다.
실시예 18: EF-1α, IL-2, 및 IFNγ 프로모터는 PHA/아이오노마이신 자극된 CD4 T 세포에 의해 CD4-IgG1 Fc 융합 단백질 발현을 조절하였다
T 세포 활성화는 IL-2 프로모터를 사용하여 CD4-IgG1 Fc의 발현을 유도할 수 있다.
방법: 초대 CD4 T 세포에서 CD4-IgG1 Fc 융합 단백질 발현을 측정하기 위해서, PBMC는 전체 세포로부터 정제하였고 CD4+ T 세포 서브세트는 자성 비드를 사용해 음성 선택으로 농축하였다. 1Х106 CD4 T 세포는 10% FBS (Gemini Bio) 및 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 2 mL의 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에 5% CO2 의 37℃ 인큐베이터에서 배양되었고 재조합 인간 IL-2 (30 U/mL) (Thermo Fisher Scientific) 및 TransAct (CD3/CD28 마이크로비드) (Miltenyi Biotec)가 보충되었다.
세포는 5 MOI의 렌티바이러스 벡터 AGT117 (SEQ ID NO: 10), AGT120 (SEQ ID NO: 82), 및 AGT121 (SEQ ID NO: 83)의 첨가 전에 1일 동안 배양되었다. AGT117 벡터, AGT120 벡터, 및 AGT121 벡터의 각각은 sCD4-IgG1 Fc 서열 (SEQ ID NO: 9) (sCD4(D1+D2)-IgG1 Fc)을 코딩한다. AGT117 벡터는 sCD4 (D1+D2)-IgG1 서열의 상류에 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 14)를 함유한다. AGT120 벡터는 sCD4 (D1+D2)-IgG1 서열 상류에 IL-2 프로모터 (SEQ ID NO: 66)를 함유한다. AGT121 벡터는 sCD4 (D1+D2)-IgG1 서열 상류에 IFNγ 프로모터 (SEQ ID NO: 15)를 함유한다.
형질도입 후 1일에, 배지를 제거하였고 IL-2가 더해진 신선한 배지로 대체되었다. 세포는 추가 6일 동안 배양되었고 배지는 16시간 동안 IL-2 없이 대체되었다. 다음으로, 세포는 PMA (20 ng/mL) (Millipore Sigma) 및 아이오노마이신 (1 ㎍/mL) (Millipore Sigma)으로 24시간 동안 자극되었다. 세포를 세척하였고 PE 항-인간 IgG1 Fc 항체 (Cat. No. 12-4998-82, Thermo Fisher Scientific)로 CD4-IgG Fc 융합 단백질의 세포내 발현을 측정하기 위해 수집되었다.
도 26에 도시된 바와 같이, CD4-IgG1 Fc를 발현하는 CD4 T 세포는 인간 IgF Fc에 대해 PE-표지된 항체로 검출되었다. PMA/아이오노마이신은 PKC 경로에 의해 T 세포 활성을 자극한다. AGT117 (SEQ ID NO: 10) 형질도입된 세포에서, EF-1α 프로모터가 발현을 조절하고, 세포의 56%는 CD4-IgG1 Fc를 발현하였다 (LV-AGT117로 표지된 컬럼 참조, 상단 패널). CD4-IgG1 Fc의 발현율은 PBM/아이오노마이신 처리에 따라 60.3% 까지 증가되었다 (LV-AGT117 표지된 컬럼 참조, 하단 패널). AGT121 (SEQ ID NO: 83) 형질도입된 세포에서, IFNγ 프로모터가 발현을 조절하고, 세포의 3.83%가 CD4-IgG1 Fc를 발현하였다 (LV-AGT121 표지된 컬럼 참조, 상단 패널). CD4-IgG1 Fc의 발현율은 PMA/아이오노마이신 처리에 따라 4.92% 까지 증가되었다 (LV-AGT121 표지된 컬럼 참조, 하단 패널). AGT120 (SEQ ID NO: 82) 형질도입된 세포에서, IL-2 프로모터가 발현을 제어하고, 세포의 8.75%가 CD4-IgG1 Fc를 발현하였다 (LV-AGT120 표지된 컬럼 참조, 상단 패널). CD4-IgG1 Fc의 발현율은 PMA/아이오노마이신 치료에 따라 31.8% 까지 증가되었다 (LV-AGT120 표지된 컬럼 참조, 하단 패널). 이들 데이터는 CD4-IgG1 Fc가 IL-2 프로모터 활성을 증가시키기 위해 T 세포 활성화 화합물 PMA/아이오노마이신을 통해서 CD4 T 세포에서 유도될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 19: 본 명세서에 기술된 실시예에서 이용되는 재료 및 방법
렌티바이러스 플라스미드의 프로모터의 클로닝:
측접된 ClaI 및 EcoRI 제한 효소 부위를 갖는 EF-1α (Gen Bank: J04617.1), IL-2 (Gen Bank: M13879.1), IFNγ (Gen Bank: AF330164.1), 또는 CD69 프로모터 (Gen Bank: Z38109.1)의 DNA 단편은 Integrated DNA Technologies을 통해서 합성되었다. 프로모터 단편 및 렌티바이러스 플라스미드는 ClaI/EcoRI 제한 효소 (New England Biolabs)로 분해되었다. 분해된 렌티바이러스 플라스미드는 1% 아가로스 겔 (Thermo Fisher Scientific)에서 전기영동하였고, 자르고, PureLink DNA 겔 추출 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용해 겔에서 추출하였다. DNA 농도를 결정한 다음에 3:1 삽입 비율로 벡터를 사용해 분해된 DNA 단편과 혼합하였다. 혼합물은 16시간 동안 실온에서 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 사용해 결찰시킨 다음에 3 ㎕의 결찰 혼합물을 23 ㎕의 STBL3 컴피턴트 박테리아 세포 (Thermo Fisher Scientific)에 첨가하였다. 형질전환은 42℃에서 열-충격을 통해 수행되었다. 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 한천 플레이트 상에 세포를 스트리킹한 다음에 콜로니는 LB 액체 배지 (VWR)에서 확장시켰다. DNA 단편의 삽입을 확인하기 위해서, 플라스미드 DNA는 PureLink DNA 플라스미드 mini prep 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용해 수확된 박테리아 배양물로부터 추출하였다. 삽입된 DNA 단편은 DNA 시퀀싱 (Eurofins Genomics)을 통해서 검증하였다. 검증된 프로모터 서열을 함유하는 렌티바이러스 플라스미드가 항-HIV 항체 서열 또는 CD4-IgG1 Fc를 삽입하는데 사용되었다.
렌티바이러스 플라스미드에서 항-HIV 항체의 클로닝:
측접된 XhoI 및 NheIVRC01 제한 효소 부위를 갖는 항-HIV 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (Gen Bank: GU980702.1) 또는 3BNC117 (Gen Bank: HE584537.1) 및 측접된 EcoRI 및 NotI 제한 효소 부위를 갖는 VRC01 (Gen Bank: GU980703.1) 또는 3BNC117 (Gen Bank: HE584538.1)의 경쇄 가변 영역은 Integrated DNA Technologies를 통해서 합성하였다. VRC01 또는 3BNC117 중쇄 가변 단편은 XhoI/NheI 제한 효소 (New England Biolabs)로 분해하였고 경쇄 가변 단편을 삽입하기 전에 렌티바이러스 플라스미드에 삽입하였다. 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 함유하는 렌티바이러스 플라스미드는 XhoI/NheI 또는 EcoRI/NotI제한 효소로 분해되었다. 분해된 생산물은 1% 아가로스 겔 (Thermo Fisher Scientific) 상에서 전기영동하고, 자르고, PureLink DNA 겔 추출 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용해 겔에서 추출하였다. DNA 농도를 결정한 다음에 3:1 삽입 비율로 벡터를 사용해 분해된 DNA 단편과 혼합하였다. 혼합물을 16시간 동안 실온에서 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)로 결찰시킨 다음에 3 ㎕의 결찰 혼합물을 23 ㎕의 STBL3 컴피턴트 박테리아 세포 (Thermo Fisher Scientific)에 첨가하였다. 형질전환은 42℃에서 열-충격으로 수행하였다. 세포는 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 한천 플레이트 상에 스크리닝하였고 콜로니는 LB 액체 배지 (VWR)에서 확장시켰다. DNA 단편의 삽입을 확인하기 위해서, 플라스미드 DNA는 PureLink DNA 플라스미드 mini prep 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용해 수확된 박테리아 배양물로부터 추출되었다. 삽입된 DNA 단편은 DNA 시퀀싱 (Eurofins Genomics)으로 검증하였다. 검증된 서열을 함유하는 렌티바이러스 플라스미드는 유세포측정계 상에서 APC-표지된 항-IgG1 또는 항-IgG Fc 항체 (Biolegend)를 사용해 검출을 통해서 VRC01 또는 3BNC117 항체를 발현하는 그들 능력에 대해 시험하기 위해 293T 세포에서 렌티바이러스 입자를 패키징하는데 사용되었다.
렌티바이러스 플라스미드에서 CD4-IgG1 Fc의 클로닝:
힌지 및 Fc 영역을 함유하는 인간 면역글로불린 중쇄와 융합된 CD4의 DNA 단편은 BsrGI 및 NotI 제한 효소 부위를 측접시켜서 Integrated DNA Technologies를 통해서 합성되었다. CD4-IgG1 Fc 단편 및 렌티바이러스 플라스미드는 BsrGI/NotI 제한 효소 (New England Biolabs)로 분해되었다. 분해된 플라스미드는 1% 아가로스 겔 (Thermo Fisher Scientific) 상에서 전기영동하고, 자르고, PureLink DNA 겔 추출 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용해 겔에서 추출하였다. DNA 농도를 결정한 다음 3:1의 삽입 비율로 벡터를 사용하여 분해 DNA 단편과 혼합하였다. 혼합물은 16시간 동안 실온에서 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)로 결찰시킨 다음 3 ㎕의 결찰 혼합물을 23 ㎕의 STBL3 컴피턴트 박테리아 세포 (Thermo Fisher Scientific)에 첨가하였다. 형질전환은 42℃에서 열충격으로 수행되었다. 세포를 100 ㎍/mL의 암피실린을 함유하는 한천 플레이트 상에 스트리킹한 다음 콜로니는 LB 액체 배지 (VWR)에서 확장시켰다. DNA 단편의 삽입을 확인하기 위해서, 플라스미드 DNA는 PureLink DNA 플라스미드 mini prep 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용해 수확된 박테리아 배양물로부터 추출하였다. 삽입된 DNA 단편은 DNA 시퀀싱 (Eurofins Genomics)을 통해 검증하였다. 검증된 서열을 함유하는 렌티바이러스 플라스미드는 유세포측정계 상에서 PE-표지된 항-IgG Fc 항체 (Cat. No. 12-4998-82, Thermo Fisher Scientific)를 사용한 검출에 의해서 CD4-IgG1 Fc를 발현하는 그들 능력에 대해 시험하기 위해 293T 세포에서 렌티바이러스 입자를 패키징하는데 사용되었다.
실시예 20: 백혈병 T 세포주에서 가용성 CD4-IgG Fc 발현
C8166은 렌티바이러스 벡터 변형에 허용되는 T 세포 백혈병 세포주이다. 가용성 CD4 및 인간 IgG1 유래 Fc 영역으로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 렌티바이러스로 C8166 T 세포 백혈병 세포주의 형질도입. Fc 영역의 3개의 별개 버전이 시험되었다. 버전 1 (SEQ ID: 9)은 힌지 영역까지 아미노 말단 서열이 계속되는 절두된 Fc 서열이다. 버전 2 (SEQ ID: 76)는 허용되는 야생형 서열을 갖는 완전한 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 버전 3 (SEQ ID: 77)은 세포 표면 Fc 감마 수용체 II형에 대한 결합 및 보체 결합을 불능화시키기 위한 돌연변이를 갖는 완전한 IgG1 Fc 영역을 함유한다. Fc 감마 수용체에 대한 결합은 가용성 CD4-IgG1 Fc 분자가 최고 발현을 가질 것으로 기대하는 경우에 림프절에서 항체 생산에 대해 억제성 효과를 가질 수 있다. 버전 3은 HIV를 억제하는 기능은 보존되지만 Fc 감마 수용체 II에 대한 결합은 감소된다. 도 29는 버전 1 (SEQ ID NO: 9) 및 이의 상응하는 렌티바이러스 벡터 (SEQ ID NO: 10; AGT117), 버전 2 (SEQ ID NO: 76) 및 이의 상응하는 렌티바이러스 벡터 (SEQ ID NO: 88; AGT124), 또는 버전 3 (SEQ ID NO: 77) 및 이의 상응하는 렌티바이러스 벡터 (SEQ ID NO: 89; ATG125)에 대한, C8166 세포에서의 상대 발현도를 도시한다. 도 30은 CD4-음성, Fc 감마 수용체 III-발현 THP-1 세포, 단핵구양 세포주에 대한 분비된 버전 1, 2, 또는 3 단백질의 상대 결합을 도시한다. 도 31A-31G는 표적으로서 HIV-1 및 C8166 세포의 NL4 및 HXB2 균주를 사용하여 HIV 감염을 억제하기 위한 버전 1 또는 2의 역가를 도시한다.
방법: C8166 세포는 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific)에서 배양시킨 다음에 CD4-IgG1 Fc 버전 1 (AGT117), 2 (AGT 124), 또는 3 (AGT125)을 코딩하는 렌티바이러스 벡터의 5 MOI로 형질도입시켰다.
72시간 후에, 세포는 12x75 mm FACs 튜브에 수집하였고 1000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 세포를 PBS로 세척하고 1000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. BD 고정/투과 키트로부터 0.2 mL의 고정 용액을 각 튜브에 첨가하였고 세포를 4℃에서 15분 동안 유지시켰다. 세포를 2회 BD Perm/Wash 완충액으로 세척하였고, 0.1 mL을 2.5 ㎕의 PE 항-인간 IgG1 Fc 항체 (Biolegend)의 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 4℃에서 20분 동안 유지시킨 다음에 2회 PBS로 세척하였다. 세포를 0.7 mL의 PBS에 재현탁하였고 FACS Calibur 유세포측정계에서 검출하였다.
도 29에 도시된 바와 같이, CD4-IgG1 Fc 발현은 AGT117-형질도입된 C8166 세포에서 검출되었다. 단백질 발현 수준은 염색 후에 평균 형광 강도 (MFI)에 비례한다. 버전 3의 발현이 최고로서 88.2 MFI였고 48.4 MFI (로그 규모)의 버전 2와 유사하였다. 버전 1 발현은 13.4 MFI로 더 낮았고 비-형질도입된 세포 (배경)는 2.79 MFI였다. 따라서, 버전 2 및 버전 3 발현 수준은 높았고 대체로 유사하였다.
다음으로, 세포-무함유 배양 상청액을 AGT124 또는 AGT125 벡터가 형질도입된 세포로부터 수집하였다. 상청액을 30분 동안 THP-1 세포위에 오버레이한 다음에 세포 표면 결합을 위해 시험하므로 투과 단계가 없는 것을 제외하고 상기 기술된 대로 세포를 고정 및 염색하였다. THP-1 세포주는 Fc 감마 수용체 III을 발현하고 인간 IgG1의 천연 Fc 서열을 함유하는 항체에 결합하게 되므로 사용하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, Fc 영역의 천연 또는 야생형 버전인 AGT124는 비처리된 대조군 THP-1 세포의 배경 (MFI 5.87)에 가깝게 MFI 16.5의 AGT125와 비교하여 MFI 460으로 THP-1 세포에 결합하는 최고 수준을 입증하였다. 결과는 AGT125의 Fc 영역의 부위 지정 돌연변이유발법이 Fc 감마 수용체 III에 대한 결합 부위를 제거하였음을 확인해 준다.
도 31A-31G에 도시된 바와 같이, CD4-IgG1 Fc 벡터의 AGT117 및 AGT124 버전 둘 모두가 HIV-1 감염의 강력한 억제제였다. C8166 세포는 3일 동안 AGT117 또는 AGT124 벡터로 형질도입시킨 다음에 녹색 형광 단백질을 발현하도록 또한 조작된 HXB2 균주 또는 GFP를 역시 발현하는 NL4 바이러스 균주를 사용해 HIV로 챌린지하였다. 감염성 HIV는 1일 동안 형질도입된 세포 상에 오버레이하였고, 세척으로 제거하였으며, 세포를 고정시키고 감염 효율의 측정으로서 GFP 발현 수준을 검출하기 위해 유세포측정으로 조사하였다.
도 31A는 2개 복제물에서, 바이러스가 C8166 세포에 도입되지 않았을 때, GFP 양성 세포의 백분율이 0.21% 및 0.33% (평균 0.27% GFP 양성 세포)였다는 것을 보여준다. 도 31B는 2개 복제물에서, HXB2-GFP 바이러스가 C8166 세포에 도입되었을 때, GFP 양성 세포의 백분율이 13.1% 및 11.4% (평균 12.25% GFP 양성 세포)였다는 것을 보여준다. 도 31C는 2개 복제물에서, HXBc2-GFP 바이러스가 CD4-IgG의 버전 1 (SEQ ID NO: 9)과 함께 C8166 세포에 도입되었을 때, GFP 양성 세포의 백분율이 1.05% 및 1.22% (평균 1.14% GFP 양성 세포)였음을 보여준다. 도 31D는 2개 복제물에서, HXB2-GFP 바이러스가 CD4-IgG의 버전 2 (SEQ ID NO: 76)와 함께 C8166 세포에 도입되었을 때, GFP 양성 세포의 백분율이 1.76% 및 1.20% (평균 1.48% GFP 양성 세포)였음을 보여준다.
도 31E는 NL4-GFP 바이러스가 C8166 세포에 도입되었을 때, GFP 양성 세포의 백분율이 18.2%였음을 보여준다. 도 31F는 2개 복제물에서, NL4-GFP 바이러스가 C8166 세포에 CD4-IgG의 버전 1 (SEQ ID NO: 9)과 함께 도입되었을 때, GFP 양성 세포의 백분율이 9.44% 및 7.49% (평균8.47% GFP 양성 세포)였음을 보여준다. 도 31G는 2개 복제물에서, NL4-GFP 바이러스가 C8166 세포에 CD4-IgG의 버전 2 (SEQ ID NO: 76)와 함께 도입되었을 때, GFP 양성 세포의 백분율이 5.14% 및 4.77% (평균 4.96% GFP 양성 세포)였음을 보여준다.
HXB2-GFP 바이러스 챌린지를 사용하여, AGT117 (바이러스 감염의 91% 억제) 및 AGT124 (바이러스 감염의 88% 억제)가 강력한 항바이러스제임을 입증하였다. NL4-GFP 바이러스 챌린지 사용은 AGT117 (53% 바이러스 억제)과 비교하여 GT124 (73% 바이러스 억제)의 장점을 입증하였다.
실시예 21: Gag-특이적 CD4+ T 세포에서 CD4-IgG1 Fc를 발현시키기 위한 CD69 프로모터 1050 대 CD69 프로모터 625를 사용한 유도성 발현의 비교
CD69 유전자 프로모터의 2개 버전을 시험하여 초대, 항원 특이적 CD4 T 세포에서 유전자 발현 및 유도성의 강도를 측정하였다. AGT122 (SEQ ID NO: 84)는 CD69 1050 프로모터 (SEQ ID: 67) (CD69 프로모터 ((1050) + CNS2 인핸서)를 사용하여 CD4-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 9)를 발현하였고 AGT123 (SEQ ID NO: 85)은 CD69 625 프로모터 (SEQ ID: 68) (CD69 프로모터 (625) + CNS2 인핸서)를 사용하여 CD4-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 9)를 발현하였다. 발현 수준은 IL-2 프로모터 (SEQ ID NO: 66)를 사용하여 CD4-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 9)를 발현하는 AGT120 (SEQ ID NO: 82)과 비교된다.
방법: HIV+ 도너로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 정제하였고 HIV-1 Gag 폴리단백질 서열을 나타내는 152개 중복 펩티드로 밤새 자극하였다. 다음 날에 CD8, CD56 또는 CD19를 발현하는 세포를 자성 비드 고갈을 통해 제거하고 CD4+ T 세포에 대해 고도로 농축시킨, 나머지 세포들은 MOI 10의 AGT122 (SEQ ID NO: 84), AGT123 (SEQ ID NO: 85), 또는 대조군 AGT120 (SEQ ID NO: 82)으로 형질도입된다. 형질도입된 세포는 정적 상태 하에서 8일 동안 배양된 다음에 수확하고, 세척 및 저온저장하였다.
저온저장된 세포를 해동하고, 배지에 현탁시키고 3회 세척하여 DMSO를 제거한 다음에, 10% 태아 소 혈청이 존재하는 RPMI 완전 배지에서 배양하였다. 1일 후에, 세포는 펩티드는 없지만 부형제를 함유하는 모의 용액으로 처리하거나 또는 이전에 사용된 동일 펩티드로 재자극시킨다. 펩티드 자극 후 6시간에, 세포-무함유 액체 및 세포를 수확한다.
세포 무함유 유체는 CD4-IgG1 Fc의 존재에 대해 ELISA를 통해서 시험된다. 세포를 12x75 mm FACs 튜브에 수집하였고 1000 rpm으로 3분 동안 원심분리한다. 세포를 PBS로 세척하고 1000 rpm에서 3분 동안 원심분리한다. BD 고정/투과 키트로부터의 0.2 mL의 고정 용액을 각 튜브에 첨가하고 세포를 4℃에서 15분 동안 유지시킨다. 세포를 2회 BD Perm/Wash 완충액으로 세척하고, 0.1 mL을 2.5 ㎕의 PE 항-인간 IgG1 Fc 항체 (Biolegend)와 함께 각 튜브에 첨가한다. 튜브를 4℃에서 20분 동안 유지시킨 다음에 2회 PBS로 세척한다. 세포를 0.7 mL의 PBS에 재현탁하고 FACS Calibur 유세포측정계에서 검출한다.
실시예 22: 가용성 외생성 인자를 발현시키기 위해 상이한 프로모터를 사용한 유도성 발현의 비교
프로모터는 실시예 19에 기술된 바와 같은 렌티바이러스 플라스미드에 클로닝하였다. 가용성 CD4-IgG1 Fc는 실시예 19에 기술된 바와 같이 렌티바이러스 플라스미드에 클로닝하였다. 이 방법을 사용하여, 다수의 렌티바이러스 플라스미드는 상이한 프로모터를 사용하여 가용성 CD4-IgG1 Fc를 발현하는 것을 합성하였다.
방법: HIV+ 도너로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 정제하였고 HIV-1 Gag 폴리단백질 서열을 나타내는 152개 중복 펩티드로 밤새 자극하였다. 다음 날에 CD8, CD56 또는 CD19를 발현하는 세포를 자성 비드 고갈을 통해 제거하고, CD4+ T 세포에 대해 고도로 농축된, 나머지 세포를 이전에 합성된 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨다. 형질도입된 세포는 정적 상태 하에서 8일 동안 배양한 다음에, 수확, 세척 및 저온저장된다.
저온저장된 세포를 해동하고, 배지에 현탁시키고 3회 세척하여 DMSO를 제거한 다음에, 10% 태아 소 혈청이 존재하는 RMPI 완전 배지에 배양한다. 1일 후에, 세포를 이전에 사용된 동일 펩티드로 재자극하거나 펩티드없이 부형제를 함유하는 모의 용액으로 처리한다. 펩티드 자극 후 6시간에, 세포-무함유 액체 및 세포를 수확한다.
세포 무함유 유체는 CD4-IgG1 Fc의 존재에 대해서 ELISA를 통해 시험된다. 세포는 12x75 mm FACs 튜브에 수확하고 1000 rpm으로 3분 동안 원심분리한다. 세포를 PBS로 세척하고 1000 rpm에서 3분 동안 원심분리한다. BD 고정/투과 키트로부터의 0.2 mL의 고정 용액을 각 튜브에 첨가하고 세포를 4℃에서 15분 동안 유지시킨다. 세포를 2회 BD Perm/Wash 완충액으로 세척하고, 0.1 mL을 2.5 ㎕의 PE 항-인간 IgG1 Fc 항체 (Biolegend)와 함께 각 튜브에 첨가한다. 튜브를 4℃에서 20분 동안 유지시킨 다음 2회 PBS로 세척한다. 세포를 0.7 mL의 PBS에 재현탁하고 FACS Calibur 유세포측정계에서 검출한다.
서열
하기 서열을 본 명세서에서 참조한다:
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
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Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
특정의 바람직한 구현예가 상기에 기술되고 특별히 예시되었지만, 본 개시는 이러한 바람직한 구현예에 제한하려는 의도가 아니다. 다양한 변형은 본 명세서에 기술된 본 구현예의 범주 및 정신을 벗어나지 않고 이에 만들어질 수 있다.
<110> American Gene Technologies International Inc. <120> ON DEMAND EXPRESSION OF EXOGENOUS FACTORS IN LYMPHOCYTES TO TREAT HIV <130> 70612.03716 <140> WO PCT/US2021/20721 <141> 2021-03-03 <150> US 62/984,716 <151> 2020-03-03 <160> 89 <170> Notepad <210> 1 <211> 2181 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VRC01 (IL-2 secretory sequence)-HV-CH-T2A-LV-CL <400> 1 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgcaggtg 60 cagctggtgc agtctggggg tcagatgaag aagcctggcg agtcgatgag aatttcttgt 120 cgggcttctg gatatgaatt tattgattgt acgctaaatt ggattcgtct ggcccccgga 180 aaaaggcctg agtggatggg atggctgaag cctcgggggg gggccgtcaa ctacgcacgt 240 ccacttcagg gcagagtgac catgacacga gacgtttatt ccgacacagc ctttttggag 300 ctgcgctcgt tgacagtaga cgacacggcc gtctactttt gtactagggg aaaaaactgt 360 gattacaatt gggacttcga acactggggc cggggcaccc cggtcatcgt ctcatcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 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<220> <223> CMV- VRC01 (IL-2 secretory sequence)-HV-CH-T2A-LV-CL (AGT111) <400> 2 actagtatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 60 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 120 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 180 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 240 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tttatataag cagagctcgt ttagtgaacc 300 gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga ttctagatct 360 cgaggccacc atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt 420 cacgcaggtg cagctggtgc agtctggggg tcagatgaag aagcctggcg agtcgatgag 480 aatttcttgt cgggcttctg gatatgaatt tattgattgt acgctaaatt ggattcgtct 540 ggcccccgga aaaaggcctg agtggatggg atggctgaag cctcgggggg gggccgtcaa 600 ctacgcacgt ccacttcagg gcagagtgac catgacacga gacgtttatt ccgacacagc 660 ctttttggag ctgcgctcgt tgacagtaga cgacacggcc gtctactttt gtactagggg 720 aaaaaactgt gattacaatt gggacttcga acactggggc cggggcaccc cggtcatcgt 780 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agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt 1080 tttcttccat ttcaggtgtc gtgatgtaca gccaccatgg gatggtcatg tatcatcctt 1140 tttctagtag caactgcaac tggtgttcat tccaagaaag tggtgctggg caaaaaaggg 1200 gatacagtgg aactgacctg cacagcttcc cagaagaaga gcatacaatt ccactggaaa 1260 aactccaacc agataaagat tctgggaaat cagggctcct tcttaactaa aggtccatcc 1320 aagctgaatg atcgcgctga ctcaagaaga agcctttggg accaaggaaa ctttcccctg 1380 atcatcaaga atcttaagat agaagactca gatacttaca tctgtgaagt ggaggaccag 1440 aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga ttgactgcca actctgacac ccacctgctt 1500 caggggcaga gcctgaccct gaccttggag agcccccctg gtagtagccc ctcagtgcaa 1560 tgtaggagtc caaggggtaa aaacatacag ggggggaaga ccctctccgt gtctcagctg 1620 gagctccagg atagtggcac ctggacatgc actgtcttgc agaaccagaa gaaggtggag 1680 ttcaaaatag acatcgtggt gctagcttga 1710 <210> 9 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sCD4(D1+D2)-IgG1 Fc <400> 9 atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caactggtgt acattccaag 60 aaagtggtgc tgggcaaaaa aggggataca gtggaactga cctgcacagc ttcccagaag 120 aagagcatac aattccactg gaaaaactcc aaccagataa agattctggg aaatcagggc 180 tccttcttaa ctaaaggtcc atccaagctg aatgatcgcg ctgactcaag aagaagcctt 240 tgggaccaag gaaactttcc cctgatcatc aagaatctta agatagaaga ctcagatact 300 tacatctgtg aagtggagga ccagaaggag gaggtgcaat tgctagtgtt cggattgact 360 gccaactctg acacccacct gcttcagggg cagagcctga ccctgacctt ggagagcccc 420 cctggtagta gcccctcagt gcaatgtagg agtccaaggg gtaaaaacat acaaggtggt 480 aagaccctct ccgtgtctca gctggagctc caggatagtg gcacctggac atgcactgtc 540 ttgcagaacc agaagaaggt ggagttcaaa atagacatcg tggtgctagc tgctgcagat 600 ccggagccca agagctgcga caagacccac acctgtccac catgccccgc ccacctgaac 660 tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct 720 cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 780 agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 840 agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 900 tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 960 aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat ggacagaggc 1020 cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt ctacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtccc cgggtaaatg a 1401 <210> 10 <211> 2517 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF-1alpha promoter- sCD4(D1+D2)-IgG1 Fc fusion protein (truncated SEQ ID NO: 9), antibody secretion signal(AGT117) <400> 10 ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 60 gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 120 tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc 180 ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacg cccctggctg 240 cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct 300 tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc 360 cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta 420 gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta 480 aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg 540 gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga 600 atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg 660 tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa 720 agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga 780 gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct 840 tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt 900 tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact 960 gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt 1020 gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt 1080 tttcttccat ttcaggtgtc gtgatgtaca gccaccatgg gatggtcatg tatcatcctt 1140 tttctagtag caactgcaac tggtgtacat tccaagaaag tggtgctggg caaaaaaggg 1200 gatacagtgg aactgacctg cacagcttcc cagaagaaga gcatacaatt ccactggaaa 1260 aactccaacc agataaagat tctgggaaat cagggctcct tcttaactaa aggtccatcc 1320 aagctgaatg atcgcgctga ctcaagaaga agcctttggg accaaggaaa ctttcccctg 1380 atcatcaaga atcttaagat agaagactca gatacttaca tctgtgaagt ggaggaccag 1440 aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga ttgactgcca actctgacac ccacctgctt 1500 caggggcaga gcctgaccct gaccttggag agcccccctg gtagtagccc ctcagtgcaa 1560 tgtaggagtc caaggggtaa aaacatacaa ggtggtaaga ccctctccgt gtctcagctg 1620 gagctccagg atagtggcac ctggacatgc actgtcttgc agaaccagaa gaaggtggag 1680 ttcaaaatag acatcgtggt gctagctgct gcagatccgg agcccaagag ctgcgacaag 1740 acccacacct gtccaccatg ccccgcccac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc 1800 tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg 1860 tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg 1920 tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg 1980 tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca 2040 aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaaggtg 2100 ggacccgtgg ggtgcgaggg ccacatggac agaggccggc tcggcccacc ctctgccctg 2160 agagtgaccg ctgtaccaac ctctgtccct acagggcagc cccgagaacc acaggtctac 2220 accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 2280 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2340 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag 2400 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2460 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtccccggg taaatga 2517 <210> 11 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 secretory signal <400> 11 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacg 54 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody secretory signal <400> 12 atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caactggtgt acattcc 57 <210> 13 <211> 350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytomegalovirus (CMV) promoter <400> 13 actagtatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 60 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 120 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 180 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 240 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tttatataag cagagctcgt ttagtgaacc 300 gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga 350 <210> 14 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human elongation factor 1 alpha (EF-1alpha) promoter <400> 14 ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 60 gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 120 tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc 180 ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacg cccctggctg 240 cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct 300 tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc 360 cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta 420 gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta 480 aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg 540 gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga 600 atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg 660 tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa 720 agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga 780 gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct 840 tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt 900 tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact 960 gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt 1020 gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt 1080 tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1104 <210> 15 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interferon gamma (IFNgamma) promoter <400> 15 tgtatttcta ctgggcagtg ctgatctaga gcaatttgaa acttgtggta gatattttac 60 taaccaactc tgatgaagga cttcctcacc aaattgttct tttaaccgca ttctttcctt 120 gctttctggt catttgcaag aaaaatttta aaaggctgcc cctttgtaaa ggtttgagag 180 gccctagaat ttcgtttttc acttgttccc aaccacaagc aaatgatcaa tgtgctttgt 240 gaatgaagag tcaacatttt accagggcga agtggggagg tacaaaaaaa tttccagtcc 300 ttgaatggtg tgaagtaaaa gtgccttcaa agaatcccac cagaatggca caggtgggca 360 taatgggtct gtctcatcgt caaaggaccc aaggagtcta aaggaaactc taactacaac 420 acccaaatgc cacaaaacct tagttattaa tacaaactat catccctgcc tatctgtcac 480 catctcatct taaaaaactt gtgaaaatac gtaatcctca ggagacttca attaggtata 540 aataccagca gccagaggag gtgcagcaca ttgttctgat catctgaaga tcagctatta 600 gaagagaaag atcag 615 <210> 16 <211> 523 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prothrombin/Human alpha-1-anti trypsin (hAAT) enhancer/promoter <400> 16 gcgagaactt gtgcctcccc gtgttcctgc tctttgtccc tctgtcctac ttagactaat 60 atttgccttg ggtactgcaa acaggaaatg ggggagggac aggagtaggg cggagggtag 120 cccggggatc ttgctaccag tggaacagcc actaaggatt ctgcagtgag agcagagggc 180 cagctaagtg gtactctccc agagactgtc tgactcacgc caccccctcc accttggaca 240 caggacgctg tggtttctga gccaggtaca atgactcctt tcggtaagtg cagtggaagc 300 tgtacactgc ccaggcaaag cgtccgggca gcgtaggcgg gcgactcaga tcccagccag 360 tggacttagc ccctgtttgc tcctccgata actggggtga ccttggttaa tattcaccag 420 cagcctcccc cgttgcccct ctggatccac tgcttaaata cggacgagga cagggccctg 480 tctcctcagc ttcaggcacc accactgacc tgggacagtg aat 523 <210> 17 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rous Sarcoma virus (RSV) promoter <400> 17 gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 60 cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 120 tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 180 gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacg 228 <210> 18 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Long terminal repeat (LTR) <400> 18 ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60 tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120 gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180 180 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psi Packaging signal <400> 19 tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga g 41 <210> 20 <211> 233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rev response element (RRE) <400> 20 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat 60 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcc 233 <210> 21 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Central polypurine tract (cPPT) <400> 21 ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60 agcaacagac 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ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc 120 gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 180 ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 240 cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 290 <210> 26 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev - HIV Gag - Viral capsid <400> 26 atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60 ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120 ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180 ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240 acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300 ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360 gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420 caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480 gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540 ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600 ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660 gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720 agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780 atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840 agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900 tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960 ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagga 1020 gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080 agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaatccag ctaccataat gatacagaaa 1140 ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200 atagccaaaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260 caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320 cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380 gagagcttca ggtttgggga agagacaaca actccctctc agaagcagga gccgatagac 1440 aaggaactgt atcctttagc ttccctcaga tcactctttg gcagcgaccc ctcgtcacaa 1500 taa 1503 <210> 27 <211> 1872 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev - HIV Pol - Protease and reverse transcriptase <400> 27 atgaatttgc caggaagatg gaaaccaaaa atgatagggg gaattggagg ttttatcaaa 60 gtaggacagt atgatcagat actcatagaa atctgcggac ataaagctat aggtacagta 120 ttagtaggac ctacacctgt caacataatt ggaagaaatc tgttgactca gattggctgc 180 actttaaatt ttcccattag tcctattgag actgtaccag taaaattaaa gccaggaatg 240 gatggcccaa aagttaaaca atggccattg acagaagaaa aaataaaagc attagtagaa 300 atttgtacag aaatggaaaa ggaaggaaaa atttcaaaaa ttgggcctga aaatccatac 360 aatactccag tatttgccat aaagaaaaaa gacagtacta aatggagaaa attagtagat 420 ttcagagaac ttaataagag aactcaagat ttctgggaag ttcaattagg aataccacat 480 cctgcagggt taaaacagaa aaaatcagta acagtactgg atgtgggcga tgcatatttt 540 tcagttccct tagataaaga cttcaggaag tatactgcat ttaccatacc tagtataaac 600 aatgagacac cagggattag atatcagtac aatgtgcttc cacagggatg gaaaggatca 660 ccagcaatat tccagtgtag catgacaaaa atcttagagc cttttagaaa acaaaatcca 720 gacatagtca tctatcaata catggatgat ttgtatgtag gatctgactt agaaataggg 780 cagcatagaa caaaaataga ggaactgaga caacatctgt tgaggtgggg atttaccaca 840 ccagacaaaa aacatcagaa agaacctcca ttcctttgga tgggttatga actccatcct 900 gataaatgga cagtacagcc tatagtgctg ccagaaaagg acagctggac tgtcaatgac 960 atacagaaat tagtgggaaa attgaattgg gcaagtcaga tttatgcagg gattaaagta 1020 aggcaattat gtaaacttct taggggaacc aaagcactaa cagaagtagt accactaaca 1080 gaagaagcag agctagaact ggcagaaaac agggagattc taaaagaacc ggtacatgga 1140 gtgtattatg acccatcaaa agacttaata gcagaaatac agaagcaggg gcaaggccaa 1200 tggacatatc aaatttatca agagccattt aaaaatctga aaacaggaaa atatgcaaga 1260 atgaagggtg cccacactaa tgatgtgaaa caattaacag aggcagtaca aaaaatagcc 1320 acagaaagca tagtaatatg gggaaagact cctaaattta aattacccat acaaaaggaa 1380 acatgggaag catggtggac agagtattgg caagccacct ggattcctga gtgggagttt 1440 gtcaataccc ctcccttagt gaagttatgg taccagttag agaaagaacc cataatagga 1500 gcagaaactt tctatgtaga tggggcagcc aatagggaaa ctaaattagg aaaagcagga 1560 tatgtaactg acagaggaag acaaaaagtt gtccccctaa cggacacaac aaatcagaag 1620 actgagttac aagcaattca tctagctttg caggattcgg gattagaagt aaacatagtg 1680 acagactcac aatatgcatt gggaatcatt caagcacaac cagataagag tgaatcagag 1740 ttagtcagtc aaataataga gcagttaata aaaaaggaaa aagtctacct ggcatgggta 1800 ccagcacaca aaggaattgg aggaaatgaa caagtagatg ggttggtcag tgctggaatc 1860 aggaaagtac ta 1872 <210> 28 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper Rev - HIV Integrase - Integration of viral RNA <400> 28 tttttagatg gaatagataa ggcccaagaa gaacatgaga aatatcacag taattggaga 60 gcaatggcta gtgattttaa cctaccacct gtagtagcaa aagaaatagt agccagctgt 120 gataaatgtc agctaaaagg ggaagccatg catggacaag tagactgtag cccaggaata 180 tggcagctag attgtacaca tttagaagga aaagttatct tggtagcagt tcatgtagcc 240 agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag ggcaagaaac agcatacttc 300 ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac atacagacaa tggcagcaat 360 ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg ggatcaagca ggaatttggc 420 attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta tgaataaaga attaaagaaa 480 attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga cagcagtaca aatggcagta 540 ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 600 gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 660 caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 720 ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 780 ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 840 gtggcaagta gacaggatga ggattaa 867 <210> 29 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev - HIV RRE - Binds Rev element <400> 29 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234 <210> 30 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev - HIV Rev - Nuclear export and stabilize viral mRNA <400> 30 atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gaactcctca aggcagtcag actcatcaag 60 tttctctatc aaagcaaccc acctcccaat cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 120 agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatcctt 180 agcacttatc tgggacgatc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccacc gcttgagaga 240 cttactcttg attgtaacga ggattgtgga acttctggga cgcagggggt gggaagccct 300 caaatattgg tggaatctcc tacaatattg gagtcaggag ctaaagaata g 351 <210> 31 <211> 577 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Envelope - CMV promoter <400> 31 acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60 atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120 cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 180 tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240 agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300 gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360 agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 420 gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480 gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 540 gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagc 577 <210> 32 <211> 1519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Envelope - VSV-G - Glycoprotein envelope-cell entry <400> 32 atgaagtgcc ttttgtactt agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata 60 gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc 120 ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa 180 atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240 gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc 300 ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360 ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca 420 gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt 480 gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct 540 acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg 600 gacatcacct tcttctcaga ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg 660 ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc 720 aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780 tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840 acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900 caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960 cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020 tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080 ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140 gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200 tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260 ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320 tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380 tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440 gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500 tatacagaca tagagatga 1519 <210> 33 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev - CMV early (CAG) enhancer - Enhance Transcription <400> 33 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tc 352 <210> 34 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev - Chicken beta actin intron - Enhance gene expression <400> 34 ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60 cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 120 ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 180 cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 240 gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 300 gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 360 gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt 420 gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc 480 ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg gggcgtggcg 540 cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 600 cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg ccggcggctg 660 tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg 720 acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct 780 agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc 840 gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc cgcaggggga 900 cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg 960 960 <210> 35 <211> 448 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev - Rabbit beta globin poly A - RNA stability <400> 35 agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 60 ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 120 ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt 180 ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg ctataaagag 240 gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 300 cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 360 aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 420 tagctgtccc tcttctctta tgaagatc 448 <210> 36 <211> 573 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Envelope - Beta globin intron - Enhance gene expression <400> 36 gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60 ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120 ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 180 cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 240 atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 300 tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 360 ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 420 cttattggta gaaacaacta caccctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 480 tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 540 aaccatgttc atgccttctt ctctttccta cag 573 <210> 37 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Envelope - Rabbit beta globin poly A - RNA stability <400> 37 agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 60 ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 120 ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt 180 ttagagtttg gcaacatatg cccatatgct ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag 240 aggtcatcag tatatgaaac agccccctgc tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt 300 gacttgaggt tagatttttt ttatattttg ttttgtgtta tttttttctt taacatccct 360 aaaattttcc ttacatgttt tactagccag atttttcctc ctctcctgac tactcccagt 420 catagctgtc cctcttctct tatggagatc 450 <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 38 taagcagaat tcatgaattt gccaggaaga t 31 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 39 ccatacaatg aatggacact aggcggccgc acgaat 36 <210> 40 <211> 2745 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gag, Pol, Integrase fragment <400> 40 gaattcatga atttgccagg aagatggaaa ccaaaaatga tagggggaat tggaggtttt 60 atcaaagtaa gacagtatga tcagatactc atagaaatct gcggacataa agctataggt 120 acagtattag taggacctac acctgtcaac ataattggaa gaaatctgtt gactcagatt 180 ggctgcactt taaattttcc cattagtcct attgagactg taccagtaaa attaaagcca 240 ggaatggatg gcccaaaagt taaacaatgg ccattgacag aagaaaaaat aaaagcatta 300 gtagaaattt gtacagaaat ggaaaaggaa ggaaaaattt caaaaattgg gcctgaaaat 360 ccatacaata ctccagtatt tgccataaag aaaaaagaca gtactaaatg gagaaaatta 420 gtagatttca gagaacttaa taagagaact caagatttct gggaagttca attaggaata 480 ccacatcctg cagggttaaa acagaaaaaa tcagtaacag tactggatgt gggcgatgca 540 tatttttcag ttcccttaga taaagacttc aggaagtata ctgcatttac catacctagt 600 ataaacaatg agacaccagg gattagatat cagtacaatg tgcttccaca gggatggaaa 660 ggatcaccag caatattcca gtgtagcatg acaaaaatct tagagccttt tagaaaacaa 720 aatccagaca tagtcatcta tcaatacatg gatgatttgt atgtaggatc tgacttagaa 780 atagggcagc atagaacaaa aatagaggaa ctgagacaac atctgttgag gtggggattt 840 accacaccag acaaaaaaca tcagaaagaa cctccattcc tttggatggg ttatgaactc 900 catcctgata aatggacagt acagcctata gtgctgccag aaaaggacag ctggactgtc 960 aatgacatac agaaattagt gggaaaattg aattgggcaa gtcagattta tgcagggatt 1020 aaagtaaggc aattatgtaa acttcttagg ggaaccaaag cactaacaga agtagtacca 1080 ctaacagaag aagcagagct agaactggca gaaaacaggg agattctaaa agaaccggta 1140 catggagtgt attatgaccc atcaaaagac ttaatagcag aaatacagaa gcaggggcaa 1200 ggccaatgga 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caggaatatg gcagctagat tgtacacatt tagaaggaaa agttatcttg 2100 gtagcagttc atgtagccag tggatatata gaagcagaag taattccagc agagacaggg 2160 caagaaacag catacttcct cttaaaatta gcaggaagat ggccagtaaa aacagtacat 2220 acagacaatg gcagcaattt caccagtact acagttaagg ccgcctgttg gtgggcgggg 2280 atcaagcagg aatttggcat tccctacaat ccccaaagtc aaggagtaat agaatctatg 2340 aataaagaat taaagaaaat tataggacag gtaagagatc aggctgaaca tcttaagaca 2400 gcagtacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac 2460 agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa 2520 aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag agatccagtt 2580 tggaaaggac cagcaaagct cctctggaaa ggtgaagggg cagtagtaat acaagataat 2640 agtgacataa aagtagtgcc aagaagaaaa gcaaagatca tcagggatta tggaaaacag 2700 atggcaggtg atgattgtgt ggcaagtaga caggatgagg attaa 2745 <210> 41 <211> 1586 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment containing Rev, RRE and rabbit beta globin poly A <400> 41 tctagaatgg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc 60 atcaagcttc tctatcaaag caacccacct cccaatcccg aggggacccg acaggcccga 120 aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg 180 atccttggca cttatctggg acgatctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accaccgctt 240 gagagactta ctcttgattg taacgaggat tgtggaactt ctgggacgca gggggtggga 300 agccctcaaa tattggtgga atctcctaca atattggagt caggagctaa agaatagagg 360 agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 420 gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 480 gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 540 ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tagatctttt 600 tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta 660 ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg 720 aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt 780 ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg gctataaaga ggtcatcagt 840 atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg 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gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg 660 cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa 720 gtttgtcact gactggagaa ctcgggtttg tcgtctggtt gcgggggcgg cagttatgcg 780 gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg cctcgtcgtg tcgtgacgtc 840 acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc 900 ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga atcgacaggc 960 gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg 1020 tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag 1080 tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa 1140 ttttcagtgt tagactagta aa 1162 <210> 48 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAG promoter <400> 48 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catgggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420 ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480 ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga 540 ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg 600 cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cg 642 <210> 49 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Poly A - SV40 <400> 49 gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 60 agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 120 120 <210> 50 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Poly A - bGH <400> 50 gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 60 cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 120 tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 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catagcgtgg tcccctcccc tatggcaggc agaagcggca 1440 ccttccctcc caatgaccgc gtcttcgtcg cggccgcgcc accatgggat ggtcatgtat 1500 catccttttt ctagtagcaa ctgcaactgg tgtacattcc aagaaagtgg tgctgggcaa 1560 aaaaggggat acagtggaac tgacctgcac agcttcccag aagaagagca tacaattcca 1620 ctggaaaaac tccaaccaga taaagattct gggaaatcag ggctccttct taactaaagg 1680 tccatccaag ctgaatgatc gcgctgactc aagaagaagc ctttgggacc aaggaaactt 1740 tcccctgatc atcaagaatc ttaagataga agactcagat acttacatct gtgaagtgga 1800 ggaccagaag gaggaggtgc aattgctagt gttcggattg actgccaact ctgacaccca 1860 cctgcttcag gggcagagcc tgaccctgac cttggagagc ccccctggta gtagcccctc 1920 agtgcaatgt aggagtccaa ggggtaaaaa catacaaggt ggtaagaccc tctccgtgtc 1980 tcagctggag ctccaggata gtggcacctg gacatgcact gtcttgcaga accagaagaa 2040 ggtggagttc aaaatagaca tcgtggtgct agctgctgca gatccggagc ccaagagctg 2100 cgacaagacc cacacctgtc caccatgccc cgcccacctg aactcctggg gggaccgtca 2160 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 2220 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 2280 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 2340 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 2400 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 2460 aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg gcccaccctc 2520 tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca gggcagcccc gagaaccaca 2580 ggtctacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 2640 cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 2700 ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta 2760 tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt 2820 gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ccccgggtaa 2880 atga 2884 <210> 82 <211> 1937 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2 promoter, CD4/IgG1 fusion protein, antibody secretion signal (AGT120) <400> 82 atctatctta ttgtatgcaa ttagctcatt gtgtggataa aaaggtaaaa ccattctgaa 60 acaggaaacc aatacacttc ctgtttaatc aacaaatcta aacatttatt cttttcatct 120 gtttactctt gctcttgtcc accacaatat gctattcaca tgttcagtgt agttttatga 180 caaagaaaat tttctgagtt acttttgtat ccccaccccc ttaaagaaag gaggaaaaac 240 tgtttcatac agaaggcgtt aattgcatga attagagcta tcacctaagt gtgggctaat 300 gtaacaaaga gggatttcac ctacatccat tcagtcagtc tttgggggtt taaagaaatt 360 ccaaagagtc atcagaagag gaaaaatgaa ggtaatgttt tttcagactg gtaaagtctt 420 tgaaaatatg tgtaatatgt aaaacatttt gacaccccca taatattttt ccagaattaa 480 cagtataaat tgcatctctt gttcaagagt tccctatcac tcttgaattc gccaccatgg 540 gatggtcatg tatcatcctt tttctagtag caactgcaac tggtgtacat tccaagaaag 600 tggtgctggg caaaaaaggg gatacagtgg aactgacctg cacagcttcc cagaagaaga 660 gcatacaatt ccactggaaa aactccaacc agataaagat tctgggaaat cagggctcct 720 tcttaactaa aggtccatcc aagctgaatg atcgcgctga ctcaagaaga agcctttggg 780 accaaggaaa ctttcccctg atcatcaaga atcttaagat agaagactca gatacttaca 840 tctgtgaagt ggaggaccag aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga ttgactgcca 900 actctgacac ccacctgctt 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aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 1800 ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct 1860 tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc 1920 tgtccccggg taaatga 1937 <210> 83 <211> 2028 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNgamma promoter, CD4/IgG1 fusion protein, antibody secretion signal (AGT121) <400> 83 tgtatttcta ctgggcagtg ctgatctaga gcaatttgaa acttgtggta gatattttac 60 taaccaactc tgatgaagga cttcctcacc aaattgttct tttaaccgca ttctttcctt 120 gctttctggt catttgcaag aaaaatttta aaaggctgcc cctttgtaaa ggtttgagag 180 gccctagaat ttcgtttttc acttgttccc aaccacaagc aaatgatcaa tgtgctttgt 240 gaatgaagag tcaacatttt accagggcga agtggggagg tacaaaaaaa tttccagtcc 300 ttgaatggtg tgaagtaaaa gtgccttcaa agaatcccac cagaatggca caggtgggca 360 taatgggtct gtctcatcgt caaaggaccc aaggagtcta aaggaaactc taactacaac 420 acccaaatgc cacaaaacct tagttattaa tacaaactat catccctgcc tatctgtcac 480 catctcatct taaaaaactt gtgaaaatac gtaatcctca ggagacttca attaggtata 540 aataccagca gccagaggag gtgcagcaca ttgttctgat catctgaaga tcagctatta 600 gaagagaaag atcaggaatt cgccaccatg ggatggtcat gtatcatcct ttttctagta 660 gcaactgcaa ctggtgtaca ttccaagaaa gtggtgctgg gcaaaaaagg ggatacagtg 720 gaactgacct gcacagcttc ccagaagaag agcatacaat tccactggaa aaactccaac 780 cagataaaga ttctgggaaa tcagggctcc ttcttaacta aaggtccatc caagctgaat 840 gatcgcgctg actcaagaag aagcctttgg gaccaaggaa actttcccct gatcatcaag 900 aatcttaaga tagaagactc agatacttac atctgtgaag tggaggacca gaaggaggag 960 gtgcaattgc tagtgttcgg attgactgcc aactctgaca cccacctgct tcaggggcag 1020 agcctgaccc tgaccttgga gagcccccct ggtagtagcc cctcagtgca atgtaggagt 1080 ccaaggggta aaaacataca aggtggtaag accctctccg tgtctcagct ggagctccag 1140 gatagtggca cctggacatg cactgtcttg cagaaccaga agaaggtgga gttcaaaata 1200 gacatcgtgg tgctagctgc tgcagatccg gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc 1260 tgtccaccat gccccgccca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc 1320 caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1380 acgtgagcca 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cagtgtcagg tgcatagggg gtgttcagta aatatcagtt 960 aaatgtatgc ataaatcgat aaacgggatt cctggaaaat actacactct ccttctccaa 1020 attatcttca tctcaaagac aggaacctct aacttttaat tctttactta gattatgctg 1080 tctcctaaac tgtttatgtt ttctagaaat ttaaggcagg atgtctcaga gtctgggaaa 1140 atcccacttt cctcctgcta caccttacag ttgtgagaaa gcacatttca gacaacaggg 1200 aaaacccata cttcaccaca acaacacact atacattgtc tggtccactg gagcataaat 1260 taaagagaaa caatgtagtc aagcaagtag gcggcaagag gaagggggcg gagacatcat 1320 cagggagtat aaactctgag atgcctcaga gcctcacgaa ttcgccacca tgggatggtc 1380 atgtatcatc ctttttctag tagcaactgc aactggtgta cattccaaga aagtggtgct 1440 gggcaaaaaa ggggatacag tggaactgac ctgcacagct tcccagaaga agagcataca 1500 attccactgg aaaaactcca accagataaa gattctggga aatcagggct ccttcttaac 1560 taaaggtcca tccaagctga atgatcgcgc tgactcaaga agaagccttt gggaccaagg 1620 aaactttccc ctgatcatca agaatcttaa gatagaagac tcagatactt acatctgtga 1680 agtggaggac cagaaggagg aggtgcaatt gctagtgttc ggattgactg ccaactctga 1740 cacccacctg cttcaggggc agagcctgac cctgaccttg gagagccccc ctggtagtag 1800 cccctcagtg caatgtagga gtccaagggg taaaaacata caaggtggta agaccctctc 1860 cgtgtctcag ctggagctcc aggatagtgg cacctggaca tgcactgtct tgcagaacca 1920 gaagaaggtg gagttcaaaa tagacatcgt ggtgctagct gagcccaaga gctgcgacaa 1980 gacccacacc tgtccaccat gccccgcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct 2040 cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt 2100 ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt 2160 ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt 2220 ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa 2280 ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca 2340 gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca 2400 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga 2460 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 2520 ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt 2580 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc 2640 cctgtctccg ggtaaatga 2659 <210> 85 <211> 2234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD69 (625) promoter, CD4/IgG1 fusion protein, antibody secretion signal (AGT123) <400> 85 cagacactga ggcttgggtt gggcgaggcc attcagacac taaaacccag tgcagttctc 60 cctcaagtgt gaccttatat gaagaatccg gagggaggtt tctgaaagga aatgatgtaa 120 tgtgaggcag atgcaaagtg cggcaggaag gcagggtgta cagtccttat cacggcagct 180 gccttagtgg tatgtgttca aaggaaccac aaacttccga cctgaggcag tttccggtga 240 caacctgctc atcatatttc aaaatgattt ttttctttca gtgagtgaat gaggtactgg 300 aatgtccaag ctttctgttt cctgcattct tacttcttac tacgtgatac atctagtcac 360 cagggaagaa gcgaatgaca cacttccaaa aaccaattcg tagctttcta aataaaaccc 420 tttctagctg gagagagatc catgagcata gagatcttaa aattcatgtt cagcaataaa 480 tcctggggcc ccagacagtg tcaggtgcat agggggtgtt cagtaaatat cagttaaatg 540 tatgcataaa tcgataaacg ggattcctgg aaaatactac actctccttc tccaaattat 600 cttcatctca aagacaggaa cctctaactt ttaattcttt acttagatta tgctgtctcc 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cacgagacgt ttattccgac acagcctttt 1200 tggagctgcg ctcgttgaca gtagacgaca cggccgtcta cttttgtact aggggaaaaa 1260 actgtgatta caattgggac ttcgaacact ggggccgggg caccccggtc atcgtctcat 1320 cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg 1380 ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt 1440 cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct 1500 caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga 1560 cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc 1620 ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg 1680 gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 1740 ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact 1800 ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca 1860 acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca 1920 aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct 1980 ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 2040 agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 2100 tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg 2160 tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt 2220 ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca 2280 cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aacgtagacg aaagcgcgga agcggagagg 2340 gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg tcgaggagaa tcctggacct ggatccatgg 2400 gatggtcatg tatcatcctt tttctagtag caactgcaac tggtgtacat tccgaaattg 2460 tgttgacaca gtctccaggc accctgtctt tgtctccagg ggaaacagcc atcatctctt 2520 gtcggaccag tcagtatggt tccttagcct ggtatcaaca gaggcccggc caggccccca 2580 ggctcgtcat ctattcgggc tctactcggg ccgctggcat cccagacagg ttcagcggca 2640 gtcggtgggg gccagactac aatctcacca tcagcaacct ggagtcggga gattttggtg 2700 tttattattg ccagcagtat gaattttttg gccaggggac caaggtccag gtcgacatta 2760 agcgagaatt cgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga 2820 aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag 2880 tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc 2940 aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact 3000 acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca 3060 caaagagctt caacagggga gagtgttag 3089 <210> 88 <211> 2508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF-1alpha promoter, CD4/IgG1 fusion protein version 2, antibody secretion signal (AGT124) <400> 88 ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 60 gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agccggtgcc tagagaaggt 120 ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg 180 ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg 240 ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt 300 atggcccttg cgtgccttga attacttcca cgcccctggc tgcagtacgt gattcttgat 360 cccgagcttc gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct 420 tcgcctcgtg cttgagttga ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt 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tgcacagctt cccagaagaa gagcatacaa ttccactgga aaaactccaa ccagataaag 1380 attctgggaa atcagggctc cttcttaact aaaggtccat ccaagctgaa tgatcgcgct 1440 gactcaagaa gaagcctttg ggaccaagga aactttcccc tgatcatcaa gaatcttaag 1500 atagaagact cagatactta catctgtgaa gtggaggacc agaaggagga ggtgcaattg 1560 ctagtgttcg gattgactgc caactctgac acccacctgc ttcaggggca gagcctgacc 1620 ctgaccttgg agagcccccc tggtagtagc ccctcagtgc aatgtaggag tccaaggggt 1680 aaaaacatac aaggtggtaa gaccctctcc gtgtctcagc tggagctcca ggatagtggc 1740 acctggacat gcactgtctt gcagaaccag aagaaggtgg agttcaaaat agacatcgtg 1800 gtgctagctg agcccaagag ctgcgacaag acccacacct gtccaccatg ccccgcacct 1860 gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 1920 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 1980 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 2040 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 2100 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 2160 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 2220 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 2280 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 2340 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 2400 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 2460 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 2508 <210> 89 <211> 2406 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF-1alpha promoter, CD4/IgG1 fusion protein version 3, antibody secretion signal (AGT125) <400> 89 ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 60 gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 120 tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc 180 ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacg cccctggctg 240 cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct 300 tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc 360 cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta 420 gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta 480 aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg 540 gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga 600 atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg 660 tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa 720 agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga 780 gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct 840 tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt 900 tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact 960 gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt 1020 gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt 1080 tttcttccat ttcaggtgtc gtgatgtaca gccaccatgg gatggtcatg tatcatcctt 1140 tttctagtag caactgcaac tggtgtacat tccaagaaag tggtgctggg caaaaaaggg 1200 gatacagtgg aactgacctg cacagcttcc cagaagaaga gcatacaatt ccactggaaa 1260 aactccaacc agataaagat tctgggaaat cagggctcct tcttaactaa aggtccatcc 1320 aagctgaatg atcgcgctga ctcaagaaga agcctttggg accaaggaaa ctttcccctg 1380 atcatcaaga atcttaagat agaagactca gatacttaca tctgtgaagt ggaggaccag 1440 aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga ttgactgcca actctgacac ccacctgctt 1500 caggggcaga gcctgaccct gaccttggag agcccccctg gtagtagccc ctcagtgcaa 1560 tgtaggagtc caaggggtaa aaacatacaa ggtggtaaga ccctctccgt gtctcagctg 1620 gagctccagg atagtggcac ctggacatgc actgtcttgc agaaccagaa gaaggtggag 1680 ttcaaaatag acatcgtggt gctagctgag cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt 1740 ccaccatgcc ccgcacctga agctgcaggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1800 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1860 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1920 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1980 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcgctgt ctccaacaaa 2040 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 2100 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 2160 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 2220 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 2280 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 2340 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 2400 aaatga 2406

Claims (32)

  1. 치료제 카고 부분를 포함하는 바이러스 벡터로서, 치료제 카고 부분은 HIV 감염을 억제할 수 있는 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 T 세포-반응성 프로모터를 포함하는 것인, 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 가용성 외생성 인자는 항-HIV 항체를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 항-HIV 항체는 VRC01 항체 또는 3BNC117 항체인 바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 가용성 외생성 인자는 가용성 CD4 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 가용성 CD4 또는 이의 단편은 이량체 가용성 CD4를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 이량체 가용성 CD4는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 76, 또는 SEQ ID NO: 77과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 이량체 가용성 CD4는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 76, 또는 SEQ ID NO: 77을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  8. 제1항에 있어서, T 세포-반응성 프로모터는 CMV 프로모터, IFN-α 프로모터, IFN-β 프로모터, IFN-γ 프로모터, EF-1α 프로모터, IL-2 프로모터, CD69 프로모터, 또는 이의 단편을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  9. 제8항에 있어서, T 세포-반응성 프로모터는 IL-2 프로모터를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 치료제 카고 부분은 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 분비 신호를 더 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 분비 신호는 항체 분비 신호 또는 IL-2 분비 신호를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, 또는 SEQ ID NO: 87과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  13. 제1항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, 또는 SEQ ID NO: 87을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  14. 제1항에 있어서, 치료제 카고 부분은 Vif, Tat, 및 CCR5 중 어느 하나 이상을 표적화하는 적어도 하나의 소형 RNA를 더 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 소형 RNA는 SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, 또는 SEQ ID NO: 64와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 적어도 하나의 소형 RNA는 SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, 또는 SEQ ID NO: 64를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  17. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 가용성 외생성 인자는 가용성 CD4 또는 이의 단편을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 가용성 CD4 또는 이의 단편은 이량체 가용성 CD4를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  19. 제14항에 있어서, T 세포-반응성 프로모터는 CMV 프로모터, IFN-α 프로모터, IFN-β 프로모터, IFN-γ 프로모터, EF-1α 프로모터, IL-2 프로모터, CD69 프로모터, 또는 이의 단편을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  20. 제14항에 있어서, 치료제 카고 부분은 적어도 하나의 가용성 외생성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 분비 신호를 더 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  21. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 소형 RNA는 SEQ ID NO: 65와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  22. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 소형 RNA는 SEQ ID NO: 65를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  23. 패키징 세포에 의해 생산되고 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자로서,
    표적 세포를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질; 및
    제1항의 바이러스 벡터
    를 포함하는 것인 렌티바이러스 입자.
  24. 렌티바이러스 입자로 감염된 림프구를 포함하는 변형된 세포로서, 렌티바이러스 입자는
    림프구를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질; 및
    제1항의 바이러스 벡터
    를 포함하는 것인 변형된 세포.
  25. 제24항에 있어서, 림프구는 T 세포, B 세포, NKT 세포, 또는 NK 세포를 포함하는 것인 변형된 세포.
  26. 제25항에 있어서, 림프구는 T 세포이고, T 세포는 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 또는 γδ T 세포를 포함하는 것인 변형된 세포.
  27. 제26항에 있어서, T 세포는 CD4 T 세포인 변형된 세포.
  28. Gag, Pol, 및 Rev 유전자의 각각으로부터 유래된 기능성 단백질을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드;
    표적 세포를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질을 발현하기 위한 DNA 서열을 포함하는 엔벨로프 플라스미드; 및
    제1항의 바이러스 벡터
    를 포함하는 바이러스 전달 시스템.
  29. 제28항에 있어서, 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드는 제1 및 제2 헬퍼 플라스미드를 포함하고, 제1 헬퍼 플라스미드는 Gag 및 Pol 유전자로부터 유래되는 기능성 단백질을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 코딩하고, 제2 헬퍼 플라스미드는 rev 유전자로부터 유래되는 단백질을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 것인 바이러스 전달 시스템.
  30. HIV를 치료하는 방법으로서, 방법은
    대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 자극제의 치료적 유효량과 접촉시키는 단계로서, 접촉은 생체외에서 수행되는 것인 단계;
    PBMC를 생체외에서 렌티바이러스 입자로 형질도입시키는 단계로서, 렌티바이러스 입자는
    PBMC를 감염시킬 수 있는 엔벨로프 단백질; 및
    제1항의 바이러스 벡터를 포함하는 것인 단계; 및
    적어도 1일 동안 형질도입된 PBMC를 배양하는 단계
    를 포함하는 것인 치료 방법.
  31. 제30항에 있어서, 형질도입된 PBMC를 대상체에게 주입하는 단계를 더 포함하는 것인 치료 방법.
  32. 제30항에 있어서, 자극제는 Gag 펩티드 또는 HIV 백신을 포함하는 것인 치료 방법.
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