CN110317275B

CN110317275B - 一种重组抗体样t细胞抗原受体、t细胞抗原受体偶联药物、双特异性分子及应用

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Publication number: CN110317275B
Application number: CN201910446589.0A
Authority: CN
Inventors: 赵文彬; 刘文慧; 沈莹; 周展; 潘利强; 陈枢青
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: CN110317275A

Abstract

本发明公开了一种重组抗体样T细胞抗原受体、T细胞抗原受体偶联药物、双特异性分子及应用。本发明通过设计多种IgG1恒定区与1G4113的融合表达形式，筛选获得了可在哺乳动物细胞中可溶性表达的融合蛋白形式，仅需要一步纯化便能够获得纯度较高的重组抗体样T细胞抗原受体。将重组抗体样T细胞抗原受体与MMAE小分子偶联制成T细胞抗原受体偶联药物可以用于制成抗肿瘤药物。将重组抗体样T细胞抗原受体与荧光染料分子Cy5偶联可以用于药物的体内定位或肿瘤成像。将重组抗体样T细胞抗原受体与抗CD3抗体偶联制成可溶性表达的双特异性分子，可以用于制成抗肿瘤药物。

Description

一种重组抗体样T细胞抗原受体、T细胞抗原受体偶联药物、双特异性分子及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种重组抗体样T细胞抗原受体、T细胞抗原受体偶联药物、双特异性分子及应用。

背景技术

癌症已经成为危害人类健康的重要疾病。近年来，以肿瘤免疫检查点抑制剂、过继性免疫细胞治疗和个体化肿瘤疫苗为代表的肿瘤免疫疗法表现出前所未有的抗肿瘤治疗效果，成为癌症研究和临床治疗的热点。肿瘤抗原靶点的选择是肿瘤免疫治疗能否成功的关键因素，肿瘤新抗原由于其肿瘤特异性引起了研究者的广泛关注，成为肿瘤免疫治疗的潜在理想靶点。

体细胞突变是肿瘤发生发展的重要驱动因素，在肿瘤细胞中存在大量的点突变、小片段的插入缺失以及基因融合等形成的突变蛋白，其展示到细胞表面可以形成肿瘤特异性抗原(Tumor-Specific Antigen，TSA)。与肿瘤细胞高表达的肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen，TAA)不同，TSA仅存在于肿瘤细胞中，可有效区分肿瘤细胞与正常细胞，是理想的药物作用靶点。细胞中的大部分蛋白质位于细胞内，突变的胞内蛋白可经胞内途径处理后成为抗原肽，通过主要组织相容性复合体(Major HistocompatibilityComplex，MHC)I类分子提呈到细胞表面形成MHC-多肽复合物(pMHC)，成为肿瘤特异的新抗原(Tumor-Specific Neoantigen)，被TCR(T细胞受体，T cell receptor)识别从而介导T细胞免疫应答。目前已有研究发现能够被特异性T细胞所识别的肿瘤特异性新抗原，如非小细胞细胞肺癌中经典的耐药突变EGFR ^T790M与HLA-A*0201，KRAS中致癌突变G12D与HLA-C*0802，慢性髓性白血病中费城染色体融合基因BCR-ABL新生多肽与HLA-A*0301等突变多肽与MHC I类分子形成的pMHC。

抗体药物在抗肿瘤领域发挥着举足轻重的作用。近年来，针对pMHC的抗体(TCR-mimic or TCR-like Antibody，TCRm)筛选得到研究者的青睐。虽然筛选获得的抗体亲和力(一般在10～100nM)已经处于比较高的水平，但是仍难以达到抗体药物的水平(一般<10nM)，需要进一步改造成熟。在已发表的超过50种的TCRm中，靶向肿瘤新抗原的抗体仅有2例，分别靶向KRAS的G12V突变与HLA-A*0201、EGFR的L858R突变与HLA-A*0301形成的pMHC，且后者特异性并不理想。突变蛋白与正常蛋白形成的pMHC中仅有少量氨基酸残基的改变，抗原肽的氨基酸残基容易被MHC包埋，使得靶向肿瘤新抗原的TCRm抗体筛选的难度和工作量极大，还存在特异性差等缺点。TCR对pMHC的识别具有高度特异性，能够识别肿瘤新抗原的特异性TCR有望成为靶向肿瘤细胞的肿瘤特异性TCR，但TCR在亲和力方面不尽人意(一般在1～100μM)，也是限制TCR作为药物广泛应用的瓶颈。

另一方面，TCR是膜蛋白，难以可溶性表达，也限制了TCR作为蛋白类药物的应用并增加了TCR体外活性评价的难度。Jonathan(BOULTER J M,GLICK M,TODOROV P T,etal.Stable,soluble T-cell receptor molecules for crystallization andtherapeutics[J].Protein Eng,2003,16(9):707-711.)等对TRAC的T48C以及TRBC的S57C进行突变改造，在大肠杆菌中表达，并通过复性形式成功获得多种可溶性TCR，该方法虽然适用于多种可溶性TCR的制备，但是存在以下问题：1、复性效率低(≈40％)；2、大肠杆菌存在内毒素等毒性物质难以去除干净，且对人体有危害；3、该方法包括大肠杆菌包涵体表达、纯化，复性以及复性后再由离子交换柱和分子筛纯化，过程非常繁琐，技术要求高；4、获得产品的纯度约95％，仍需进一步提高才能满足后续成药等。因此，目前TCR作为药物分子的应用受到限制。探索安全有效的、适用于不同TCR的可溶性表达方法是TCR走向蛋白药物的前提。

发明内容

本发明提供了一种使用哺乳动物细胞表达且为可溶性表达的重组抗体样T细胞抗原受体。

一种重组抗体样T细胞抗原受体，为异源二聚体，第一亚基包括依次连接的ECDα-铰链区-CH2-CH3，第二亚基包括依次连接的ECDβ-铰链区-CH2-CH3，其中，ECDα和ECDβ分别为T细胞抗原受体1G4113的α链和β链的胞外结构域，铰链区、CH2、CH3均为IgG1的结构，并且第一亚基和第二亚基的两个CH3之间分别使用knob-into-hole技术设计成knob结构和hole结构。

优选的，所述第一亚基和/或第二亚基的C末端还连接有连接臂LPETG。

sortase A是从金黄色葡萄球菌中分离的催化转肽反应的酶，其184位的半胱氨酸亲核攻击LPXTG(X表示天然氨基酸中任意一种)标签中苏氨酸(T)和甘氨酸(G)之间的肽键，形成共价硫代中间体，同时释放出甘氨酸及其羧基末端肽段。该中间体通过捕获溶剂中的甘氨酸底物从而在苏氨酸和捕获的甘氨酸底物之间形成新的肽键，释放出sortase A酶进行下一步催化。由于该反应特异性高、操作简单、反应条件温和，sortase A已被广泛用于蛋白质工程和蛋白质定点修饰。

更优选的，所述第一亚基的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；所述第二亚基的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

最优选的，所述第一亚基的编码基因序列如SEQ ID No.8所示；所述第二亚基的编码基因序列如SEQ ID No.9所示。

本发明重组抗体样T细胞抗原受体的制备方法包括以下步骤：

(1)将第一亚基的编码基因和第二亚基的编码基因分别克隆到表达载体中获得两个表达质粒；

(2)将两个表达质粒共同转染哺乳动物细胞中进行表达；

(3)使用Protein A填料进行柱层析纯化获得所述重组抗体样T细胞抗原受体。

其中，使用的表达载体为pMH3质粒，表达用的哺乳动物细胞为293F细胞。

本发明又提供了所述重组抗体样T细胞抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明又提供了一种T细胞抗原受体偶联药物，在所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端通过sortase A酶催化转肽反应偶联上vcMMAE，其中vc为缬氨酸-瓜氨酸二肽接头，MMAE为海兔毒素。缬氨酸-瓜氨酸二肽接头可在溶酶体酶cathepsin B作用下断开。

本发明又提供了所述的T细胞抗原受体偶联药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明又提供了一种T细胞抗原受体偶联药物，在所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端偶联上荧光分子Cy5，

所述T细胞抗原受体偶联药物的制备方法包括以下步骤：

(1)提供第一亚基和/或第二亚基C末端连接有连接臂LPETG的重组抗体样T细胞抗原受体，通过sortase A酶催化转肽反应与GGG-(PEG)₃-N₃偶联获得C末端连接有N₃接头的重组抗体样T细胞抗原受体；

(2)提供Cy5-DBCO，将步骤(1)C末端连接有N₃接头的重组抗体样T细胞抗原受体与Cy5-DBCO通过N₃接头与DBCO接头发生环加成反应，制得所述T细胞抗原受体偶联药物。

由于在所述重组抗体样T细胞抗原受体上偶联了荧光分子Cy5，所以该T细胞抗原受体偶联药物可以被用于制备肿瘤成像药物。

本发明还提供了一种双特异性分子，在所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端偶联上抗CD3ε抗体，

所述双特异性分子的制备方法包括以下步骤：

(2)提供重链的C末端连接有连接臂LPETG的抗CD3ε抗体，通过sortase A酶催化转肽反应与GGG-(PEG)₄-DBCO偶联获得重链的C末端连接有DBCO接头的抗CD3ε抗体；

(3)将步骤(1)C末端连接有N₃接头的重组抗体样T细胞抗原受体与步骤(2)重链的C末端连接有DBCO接头的抗CD3ε抗体通过N₃接头与DBCO接头发生环加成反应，制得重组抗体样T细胞抗原受体-抗CD3ε抗体双特异性分子。

本发明还提供了所述的双特异性分子在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明通过设计多种IgG1恒定区与1G4113的融合表达形式，筛选获得了可在哺乳动物细胞中可溶性表达的融合蛋白形式，仅需要一步纯化便能够获得纯度较高的重组抗体样T细胞抗原受体。将重组抗体样T细胞抗原受体与MMAE小分子偶联制成T细胞抗原受体偶联药物可以用于制成抗肿瘤药物。将重组抗体样T细胞抗原受体与荧光染料分子Cy5偶联可以用于药物的体内定位或肿瘤成像。将重组抗体样T细胞抗原受体与抗CD3抗体偶联制成可溶性表达的双特异性分子，可以用于制成抗肿瘤药物。

附图说明

图1为不同形式1G4113-IgG融合蛋白示意图，其中图a～e分别为5中不同形式的融合蛋白，分别命名为1G4113-1、1G4113-2、1G4113-3、1G4113-4、1G4113-5。

图2为亲和性和特异性分析结果图，其中，图a和b是T2细胞分析结果，箭头标记峰：NY-ESO-1_157-165，两个重叠的峰分别是空白对照与不相关多肽对照(RMFPNAPYL)。

图3为HPLC分析结果图，其中图a和b分别为TOSOH Butyl-NPR HPLC分析未还原的1G4113及1G4113-vcMMAE；图c和d分别为RP-HPLC分析未还原的1G4113及1G4113-vcMMAE，DAR＝0：1G4113，DAR＝1∶1个1G4113分子偶联1个MMAE，DAR＝2：1个1G4113分子偶联2个MMAE。

图4为1G4113和1G4113-vcMMAE的亲和性及内吞分析结果图，其中(a)1G4113和1G4113-vcMMAE对A375-NY-ESO-1_157-165细胞的亲和性分析；(b)荧光共聚焦显微镜分析1G4113和1G4113-vcMMAE的内吞；(c)流式细胞技术分析1G4113和1G4113-vcMMAE的内吞效率，内吞效率(％)＝(MFI of 4℃-MFI of 37℃)/MFI of 4℃×100％。

图5为1G4113-vcMMAE对HLA-A2/NY-ESO-1_157-165表达量不同的肿瘤细胞的体外抑制活性检测结果图，其中，图a和c分别为2种1G4113-vcMMAE对A375和A375-NY-ESO-1_157-165细胞的抑制活性；图b和d分别为2种1G4113-vcMMAE对3种K562来源肿瘤细胞的抑制活性。

图6为1G4113-5的体内分布分析结果图。

图7为1G4113-5-CD3双特异性分子示意图，其中，(a)1G4113-5和抗CD3ε抗体示意图，1G4113-5和图1相同，抗CD3ε是Fab形式的小鼠OKT3；(b)1G4113-5-CD3示意图，1个1G4113-5可以偶联1个抗CD3ε抗体(1G4113-5-1CD3)或2个抗CD3ε抗体(1G4113-5-2CD3)。

图8为1G4113-5-CD3的制备和分析结果图，其中，(a)分子筛分析并纯化1G4113-5-CD3；(b)非还原SDS-PAGE分析1G4113-5-CD3，泳道1：纯化的1G4113-5-CD3，泳道2：纯化的1G4113-5-N₃，泳道3：纯化的anti-CD3ε-DBCO，泳道4：未纯化的1G4113-5-N₃和anti-CD3ε-DBCO反应液，箭头从上往下依次为：1G4113-5-2CD3，1G4113-5-1CD3，1G4113-5-N₃，anti-CD3ε-DBCO；(c)流式细胞技术分析1G4113-5-CD3的亲和性，左边峰：对照，右边峰：1G4113-5-CD3。

图9为1G4113-5-CD3介导T细胞的激活检测结果图，其中图a为CD69，图b为CD25，相对阳性比例(％)＝实验组阳性比例-对照组阳性比例。

图10为1G4113-5-CD3刺激PBMC的增殖检测结果图，相对T细胞增殖比例(％)＝实验组T细胞增殖比例-对照组T细胞增殖比例。

图11为1G4113-5-CD3体外介导PBMC发挥抗肿瘤活性检测结果图，其中，(a)1G4113-5-CD3介导PBMC杀伤K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞；(b)1G4113-5-CD3介导PBMC杀伤A375-NY-ESO-1_157-165细胞。相对凋亡比例(％)＝实验组的凋亡比例-对照组的凋亡比例。

图12为1G4113-5-CD3体外介导ATC发挥抗肿瘤活性检测结果图，其中，(a)1G4113-5-CD3介导ATC诱导K562-A2-NY-ESO-1_157-165凋亡；(b)1G4113-5-CD3介导ATC诱导A375-NY-ESO-1_157-165凋亡，肿瘤相对凋亡比例(％)＝1G4113-5-CD3处理组的肿瘤凋亡比例-对照组的肿瘤凋亡比例。

图13为1G4113-5-CD3介导ATC特异性杀伤肿瘤检测结果图，其中，(a)可溶性NY-ESO-1-A2-pMHC-Fc中和1G4113-5-CD3的活性。肿瘤相对凋亡比例(％)＝NY-ESO-1-A2-pMHC-Fc和1G4113-5-CD3共同处理的肿瘤细胞凋亡比例-对照组肿瘤细胞的凋亡比例；(b)1G4113-5-CD3介导ATC杀伤肿瘤释放LDH，ΔOD490＝1G4113-5-CD3处理组的OD490-对照组的OD490。

具体实施方式

本申请相关动物实验经浙江大学实验动物福利伦理审查委员会审批通过，申请编号12435。本申请中涉及人的相关实验经浙江大学药学院医学伦理委员会审批通过，审批件编号为：(2018)伦研批第003号。

实施例1

1G4113哺乳动物细胞表达质粒构建。

TCR选择1G4113(靶向SLLMWITQC多肽与HLA-A*0201复合物的TCR(名字为1G4)的亲和力成熟克隆)，来自专利：US20110014169A1。共设计5种不同截短和组合的1G4113与IgG1抗体恒定区(重链恒定区及knob-into-hole突变的基因序列如SEQ ID No.14所示，轻链恒定区的基因序列如SEQ ID No.15所示)融合表达形式(图1)，并在IgG1抗体恒定区羧基末端引入GGGGSLPETGG多肽序列(G₄S-LPETGG)用以后续sortase A的催化偶联，构建人肾上皮细胞(293F)表达质粒9个。

1G4113-1：Vα-(G₄S)₃-ECDβ(含C末端的半胱氨酸)-IgG1HC-G₄S-LPETGG(基因序列如SEQ ID No.1所示)，融合蛋白形成同源二聚体。

1G4113-2：Vα-GS-LC(基因序列如SEQ ID No.2所示)，Vβ-GS-IgG1HC-G₄S-LPETGG(基因序列如SEQ ID No.3所示)，融合蛋白形成类似抗体“Y”型的四聚体。

1G4113-3：ECDα(含C末端的半胱氨酸)-GS-LC(基因序列如SEQ ID No.4所示)，ECDβ(含C末端的半胱氨酸)-GS-IgG1HC-G₄S-LPETGG(基因序列如SEQ ID No.5所示)，融合蛋白形成类似抗体“Y”型的四聚体。

1G4113-4：ECDα(不含C末端的半胱氨酸)-GS-LC(基因序列如SEQ ID No.6所示)，ECDβ(不含C末端的半胱氨酸)-GS-IgG1HC-G₄S-LPETGG(基因序列如SEQ ID No.7所示)，融合蛋白形成类似抗体“Y”型的四聚体。

1G4113-5：ECDα(含C末端的半胱氨酸)-GS-铰链区-CH2-CH3(hole)-G₄S-LPETGG(基因序列如SEQ ID No.8所示)，ECDβ(含C末端的半胱氨酸)-GS-铰链区-CH2-CH3(knob)-G₄S-LPETGG(基因序列如SEQ ID No.9所示)，融合蛋白形成异源二聚体。

其中，ECDα表示1G4113-α胞外区，Vα表示1G4113-α可变区，Cα表示1G4113-α的胞外恒定区，ECDβ表示1G4113-β胞外区，Vβ表示1G4113-β可变区，Cβ表示1G4113-β的胞外恒定区，IgG1HC表示IgG1的H恒定区，LC表示L恒定区。

通过重叠PCR，将各段基因按照图1所示组合在一起，并在重组基因的上游引入EcoR I酶切位点(GAATTC)、kozaka序列(ACCACC)及信号肽，在下游引入终止密码子(TGA)及Not I酶切位点(GCGGCCGC)，Fc的羧基末端引入G₄S-LPETGG多肽序列。PCR产物经EcoR I和Not I双酶切后，由T4连接酶连接到pMH3质粒(质粒也经EcoR I和Not I双酶切)。引物信息如下表1所示。

表1各引物的核苷酸序列。

连接产物直接用于转化DH5α感受态，涂布于含Amp⁺LB平板。待菌落清晰可见后，挑取单克隆于Amp⁺LB液体培养基中培养8-10h，取一部分加入15％无菌甘油，冻存于-20℃，其余送上海生工生物技术有限公司测序。含测序正确重组质粒的DH5α大肠杆菌，经由无内毒素质粒大提试剂盒提取无内毒素质粒，冻存于-20℃备用。

实施例2

1G4113的表达、纯化。

将上述5种包含不同形式1G4113的质粒(其中1G4113-1为一个质粒，而1G4113-2～5均包括分别用于表达两部分亚基的两个质粒)分别转染293F细胞4天后，4000g、15min离心，取上清，经0.45μm滤膜过滤后，使用

纯化仪以及HiTrap Protein A HP预装柱(购自GE公司，货号：17-0403-01)纯化。纯化步骤：HiTrap Protein A HP预装柱用100％Protein A上样缓冲液(50mM Tris-NaCl，150mM NaCl，pH＝7.4，0.45μm滤膜过滤)平衡后开始进样。进样完毕后，用100％Protein A上样缓冲液冲洗预装柱至不结合的杂蛋白去除干净；最后用100％Protein A洗脱缓冲液(50mM柠檬酸，pH＝3.2，0.45μm滤膜过滤)洗脱收集目标蛋白。不同形式的1G4113分别用30kDa孔径大小的超滤膜超滤(购自Millipore公司，货号：UF503096)，将溶剂置换成Tris-NaCl缓冲液后，用Nanodrop ND-1000测定蛋白浓度，分装冻存于-80℃备用。

在293F细胞中表达并纯化到1G4113-4(表达量约6mg/L，两个亚基的氨基酸序列分别为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11)，1G4113-5(表达量约20mg/L，两个亚基的氨基酸序列分别为SEQ ID No.12和SEQ ID No.13)，而另外3种1G4113未能在293F中表达。1G4113-4和1G4113-5的Fc羧基末端引入了G₄S-LPETGG序列，用于后续sortase A(srt A)的催化偶联；1G4113-5的Fc上引入突变，利用knob-into-hole技术有利于异二聚体的形成。

实施例3

T2细胞验证1G4113的特异性和亲和性。

T2细胞(购自ATCC，培养于含20％血清的IMDM培养基中)是TAP缺陷的细胞系，其细胞表面仅存在空的HLA-A*0201分子孵育β2m以及多肽后，可在T2细胞表面形成特定的pMHC复合物，用于后续检测。

收集处于对数生长期的T2细胞，1000rpm，5min离心，弃上清。用无血清的RPMI-1640培养基清洗2次。重悬于无血清的IMDM培养基中，按照5×10⁵个/孔铺于12孔板，1mL/孔。加入多肽(由合肥国肽生物技术有限公司合成，纯度>95％)至终浓度为25μg/mL，β2m(购自Sigma，货号：M4890)至终浓度为5μg/mL。混合均匀后，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的恒温孵箱孵育6h。

孵育结束后，500g，5min离心收集细胞，用stain buffer(含0.5％BSA，2mmol/L的EDTA的PBS溶液)清洗一次。加入200μL stain buffer 4℃封闭30min后，离心弃stainbuffer。加入200μL 1G4113抗体(5μg/mL溶于stain buffer)，4℃孵育30min。用stainbuffer清洗三次，加入200μL FITC标记的山羊抗人IgG抗体(购自碧云天生物技术有限公司，货号：A0556，1∶200稀释于stain buffer中)，4℃孵育30min。用stain buffer清洗三次，加入400μL stain buffer重悬细胞，用ACEA NovoCyte^TM流式细胞仪检测FITC强度。

将T2细胞与β2m以及多肽(NY-ESO-1_157-165多肽为实验组，来源于WT1蛋白的不相关多肽RMFPNAPYL为阴性对照，不孵育多肽为空白对照)共孵育后，通过流式细胞技术验证发现，T2细胞孵育NY-ESO-1_157-165多肽并用1G4113-4或1G4113-5检测，FITC平均荧光强度相对于空白对照发生显著偏移；T2细胞孵育WT1多肽并用1G4113-4或1G4113-5检测，FITC平均荧光强度相对于空白对照未见偏移(图2)，表明1G4113-4或1G4113-5对靶标HLA-A2/NY-ESO-1_157-165保持了一定的亲和性，对HLA-A2/WT1复合物无亲和性，2种1G4113可特异性识别靶标HLA-A2/NY-ESO-1_157-165。

实施例4

HLA-A2/NY-ESO-1_157-165阳性细胞系的鉴定及构建。

1)K562，A375细胞NY-ESO-1以及HLA-A*02表达鉴定

提取K562以及A375细胞的mRNA，逆转录成cDNA。设计引物，对两种细胞是否表达NY-ESO-1进行验证。引物(5’至3’)：NY-ESO-1-up：GCTTGAGTTCTACCTCGCCA，NY-ESO-1-down：AGCCAAAAACACGGGCAGAA。PCR产物经凝胶回收后，送生工生物技术有限公司测序，进一步验证是否为NY-ESO-1片段。

收集处于对数生长期的A375细胞，用靶向HLA-A*02的抗体(BB7.2，购自ThermoFisher，货号：MA1-10344)在流式细胞仪上检测A375是否表达HLA-A*02。BB7.2孵育浓度参照说明书，选用FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(购自碧云天生物技术有限公司，货号：A0568)为检测抗体。

收集处于对数生长期的A375和K562-A2细胞，用1G4113-5在流式细胞仪上检测两种细胞是否表达HLA-A2/NY-ESO-1_157-165。选用PE标记的山羊抗人IgG抗体(购自，货号：12-4998-82)为检测抗体。

在RNA水平验证了K562细胞不表达NY-ESO-1，A375表达NY-ESO-1；利用特异性靶向HLA-A*02的BB7.2抗体，确定A375细胞为HLA-A*02阳性的细胞系。在K562细胞中稳定转染HLA-A*0201，构建了HLA-A*02阳性的K562-A2细胞系，因此已获得NY-ESO-1和HLA-A*02双阳性的A375细胞，NY-ESO-1和HLA-A*02双阴性的K562细胞，NY-ESO-1阴性和HLA-A*02阳性的K562-A2细胞(表2)。用1G4113-5验证上述3种细胞表面HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物的表达情况，发现K562和K562-A2为HLA-A2/NY-ESO-1_157-165阴性，与理论一致；但是A375也未检测到HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物(表2)。

2)HLA-A2/NY-ESO-1_157-165阳性细胞系构建

泛素(ubiquitin，Ub)和多肽的融合表达被用于构建递呈抗原高表达的细胞系。EcoR I-EGFP-Ub-NY-ESO-1_157-165-Not I基因由生工生物技术有限公司合成。基因和pMHC载体经EcoR I和Not I双酶切后，由T4连接酶连接并转染DH5α感受态，挑取单克隆菌落进行测序验证，测序正确的克隆提取无内毒素质粒。质粒转染A375细胞和K562-A2细胞。转染次日，弃旧培养基，加入含800μg/mL G418硫酸盐的新鲜培养基。待G418耐药细胞长满培养器皿后，取约100个细胞，均匀铺于96孔细胞培养板，挑选单克隆细胞，以EGFP的绿色荧光信号和1G4113-5用流式细胞技术筛选稳定表达EGFP-Ub-peptide的细胞株备用(细胞株命名为A375-NY-ESO-1_157-165以及K562-A2-NY-ESO-1_157-165)。

EcoR V-信号肽-NY-ESO-1_157-165-(G₄S)₃-β2m-(G₄S)₄-(HLA-A*0201)-Xho I基因生工生物技术有限公司合成并插入到pCDNA3.1-hygro(+)质粒中。提取无内毒素质粒，转染K562细胞。转染次日，弃旧培养基，加入含250μg/mL潮霉素B的新鲜培养基。待潮霉素B耐药细胞长满培养器皿后，取约100个细胞，均匀铺于96孔细胞培养板，挑选单克隆细胞，以1G4113-5用流式细胞技术筛选稳定表达NY-ESO-1_157-165-(G₄S)₃-β2m-(G₄S)₄-(HLA-A*0201)的细胞株(细胞株命名为K562-NY-ESO-1_157-165pMHC)。K562-NY-ESO-1_157-165pMHC的HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物表达量比K562-A2-NY-ESO-1_157-165提高了约12.8倍(表2)。

表2不同细胞系的NY-ESO-1_157-165，HLA-A*02的表达及1G4113-5亲和分析。

细胞系	NY-ESO-1<sub>157-165</sub>	HLA-A*02	1G4113-5亲和强度
				K562	阴性	阴性	阴性
K562-A2	阴性	阳性	阴性
				K562-A2-NY-ESO-1<sub>157-165</sub>	阳性	阳性	4.67
K562-NY-ESO-1<sub>157-165</sub>pMHC	阳性	阳性	59.70
				A375	阳性	阳性	未检测到
A375-NY-ESO-1<sub>157-165</sub>	阳性	阳性	10.17

实施例5

1G4113-vcMMAE的制备。

GGG-vcMMAE(由联宁(苏州)生物制药有限公司合成)通过srt A催化偶联到1G4113的羧基末端。偶联方法同1G4113-biotin的制备。37℃偶联12h后，取100μL，经0.22μm滤膜过滤后进行RP-HPLC分析。纯化后的1G4113-vcMMAE用PBS将浓度调整为1mg/mL。取100μL，经0.22μm滤膜过滤后进行RP-HPLC及HIC-HPLC分析。

RP-HPLC分析方法如下：色谱柱：PLRP-S(

8μm，2.1×150mm)。流速：0.6mL/min。柱温：50℃。进样量：30μL。

HIC-HPLC分析方法如下：色谱柱：TSKgel Butyl-NPR。流速：0.8mL/min。柱温：25℃。进样量：10μL。A液：25mM磷酸钠，2M硫酸铵，pH＝7.0，B液：25mM磷酸钠，pH＝7.0。

通过HiTrap Protein A HP预装柱纯化去除未偶联的游离小分子、srt A等，分离得到1G4113-vcMMAE偶联产物，并利用TOSOH Butyl-NPR HPLC以及RP-HPLC进一步分析确定了DAR。1G4113-4-vcMMAE包含两种组分，分别为DAR＝1和DAR＝2，平均DAR≈1.6；1G4113-5-vcMMAE除了DAR＝1和DAR＝2两种组分外，还存在微量的DAR＝0的组分，平均DAR≈1.4(图3)。从TOSOH Butyl-NPR HPLC的分析结果看，发现1G4113-5-vcMMAE的DAR＝1组分含有两个峰。此外，1G4113-4，1G4113-5在TOSOH Butyl-NPR HPLC和RP-HPLC的分析中均仅有一个峰，也表明表达纯化的可溶性1G4113纯度较高。

实施例6

1G4113-vcMMAE的亲和性验证。

ADC对肿瘤细胞表面抗原亲和并内吞是发挥活性的关键步骤，因此有必要对1G4113-vcMMAE的亲和性和内吞效率进行验证。

首先，用流式细胞技术在A375-NY-ESO-1_157-165细胞上验证了1G4113以及1G4113-vcMMAE的亲和性，以PE标记的山羊抗人IgG抗体为检测抗体。发现，在检测的浓度范围内1G4113以及1G4113-vcMMAE对A375-NY-ESO-1_157-165细胞的亲和性呈浓度依赖，浓度越高，结合在细胞表面的分子越多(图4)。当1G4113偶联MMAE小分子后，亲和性均显著下降，大约为未偶联时的1/2(图4)。

用荧光共聚焦的方法定性检测1G4113以及1G4113-vcMMAE的内吞。K562-NY-ESO-1_157-165pMHC按1×10⁴个/孔铺于含洁净的6×6mm圆形盖玻片的24孔细胞培养板中。次日，分别加入2种1G4113以及其偶联物至终浓度为5μg/mL，37℃，5％CO₂培养4h。弃上清，轻轻加入PBS清洗2次，用4％多聚甲醛固定细胞并用0.1％Triton X-100进行打孔。2％BSA封闭后，兔抗LAMP1抗体(购自abcam，货号：EPR4204)1∶1000稀释于含1％BSA的PBS缓冲液，200μL室温孵育30min。PBS清洗3次，Cy3标记的山羊抗兔IgG(购自碧云天生物技术有限公司，货号：A0516)和FITC标记的山羊抗人IgG抗体1∶200共同稀释于含1％BSA的PBS缓冲液，200μL室温避光孵育30min。PBS清洗3次后，进行DAPI染色以及封片。荧光染色后的细胞在DU-897D-CS0转盘式共聚焦显微镜下观察并成像记录。结果发现，1G4113和1G4113-vcMMAE均能在细胞内观察到明显的FITC荧光，表明其均可被K562-NY-ESO-1_157-165pMHC细胞内吞。部分FITC荧光和Cy3荧光重叠，表明内吞进细胞的1G4113和1G4113-vcMMAE能被运输到溶酶体进行降解释放MMAE小分子(图4)。

为了进一步确定1G4113和1G4113-vcMMAE的内吞效率，使用流式细胞方法定量检测1G4113-vcMMAE的内吞。取5×10⁵K562-NY-ESO-1_157-165pMHC细胞，500g离心5min收集细胞，PBS清洗2次。分别4℃孵育5μg/mL的2种1G4113及其偶联物30min(每组2份，每份3个重复)，PBS清洗3次后，其中一份37℃水浴2h，另一份冰浴(4℃)2h。FITC标记山羊抗人IgG 1∶200稀释于PBS中，200μL，4℃孵育30min。PBS清洗3次后，细胞重悬于400μL PBS中，用ACEANovoCyte^TM流式细胞仪检测MFI值。内吞效率(％)＝(4℃MFI平均值-37℃MFI平均值)/4℃MFI平均值×100％。结果发现，1G4113的内吞效率在40％左右。偶联MMAE后，1G4113的亲和性虽然降低了，但是内吞效率反而有所增加，表明以srt A催化方式在1G4113羧基末端偶联MMAE可有效的增加内吞效率(图4)。

实施例7

1G4113-vcMMAE的体外抗肿瘤活性。

肿瘤细胞按照3000-5000个/孔铺于96孔细胞培养板中，并孵育不同浓度的药物(每个浓度3个重复，0ng/mL为对照组)。37℃，5％CO₂培养96h后，加入CCK-8至终浓度为10％，37℃，5％CO₂孵育0.5-2h，利用BioRad Model 680Microplate Reader检测OD₄₅₀值。按照公式：不同浓度孔OD₄₅₀值/对照组OD₄₅₀平均值×100％，计算每孔细胞的存活率，并根据存活率，利用GraphPad Prim 6.01软件计算IC₅₀(IC₅₀表示细胞存活率为50％时的药物浓度)。

结果发现，虽然2种1G4113-vcMMAE对A375-NY-ESO-1_157-165细胞的杀伤活性优于对A375细胞的杀伤活性，但是活性均不佳(IC₅₀>20μg/mL，图5)。A375细胞表面未检测到HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物的表达，但由于其NY-ESO-1和HLA-A*02双阳性，因此猜测A375表面微量表达HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物，表达水平在流式细胞技术检测限以下。1G4113-vcMMAE体外对A375细胞的微弱毒性可能由其细胞表面微量表达的靶标介导。由于A375-NY-ESO-1_157-165细胞的HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物表达量远高于A375细胞，猜测1G4113-vcMMAE对A375-NY-ESO-1_157-165细胞与A375细胞的活性差异由HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物表达差异引起。

为了进一步验证抗原表达量对1G4113-vcMMAE体外抗肿瘤活性的影响，将K562-A2细胞，K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞以及K562-NY-ESO-1_157-165pMHC细胞均匀的铺于96孔细胞培养板中，并加入一系列浓度的1G4113-vcMMAE。药物处理4天后，用CCK-8检测各孔细胞的活性，计算给药组细胞的相对存活率。由于该部分实验选用的3种细胞均是源于K562细胞的稳转细胞系，除了HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物表达量上的差异之外，细胞背景相同，更利于1G4113-vcMMAE体外活性比较。结果发现，1G4113-vcMMAE对HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物阴性的K562-A2细胞和HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物低表达的K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞无显著活性(IC₅₀>10μg/mL)，对HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物表达较高的K562-NY-ESO-1_157-165pMHC细胞有显著的活性(图5)。1G4113-vcMMAE对3种K562来源的稳转细胞系的活性差异表明了其对抗原阳性的细胞有特异的杀伤活性且与活性抗原表达水平呈正相关。

实施例8

1G4113-5的体内分布分析。

1)1G4113-N₃-Cy5的制备

GGG-(PEG)₃-N₃(由联宁(苏州)生物制药有限公司合成)通过Srt A催化偶联到1G4113-5羧基末端。Srt A催化反应在Tris-NaCl缓冲液中进行。反应体系中含有：5mmol/LCaCl₂，2μmol/L 1G4113-5，200μmol/L GGG-(PEG)₃-N₃，50μmol/L srt A。反应体系在37℃孵育12h后，使用

纯化仪以及HiTrap Protein A HP预装柱纯化以去除srt A、游离小分子等成分，纯化步骤同1G4113的纯化。1G4113-N₃用30kDa孔径大小的超滤膜超滤，将溶剂置换成Tris-NaCl缓冲液并调整浓度为2mg/mL后，加入Cy5-DBCO(购自Lumiprobe，货号：A30F0)至终浓度为40μg/mL，室温避光反应12h。反应液用PBS以及30kDa孔径大小的超滤膜超滤清洗，去除未反应的Cy5-DBCO，分装避光保存于-80℃。

2)1G4113-5的体内分布分析

雌性BALB/c Nude小鼠6至8周龄，腋下皮下接种约3×10⁶个处于对数生长期的A375-NY-ESO-1_157-165细胞。当肿瘤体积长至500mm³(肿瘤体积＝长×宽²/2)，小鼠尾静脉注射5mg/kg的1G4113-N₃-Cy5。用Maestro in-vivo imaging system记录给药4、12、36h后小鼠体内Cy5荧光分布。

雌性BALB/c Nude小鼠6至8周龄，腋下皮下接种约6×10⁶个处于对数生长期的K562-NY-ESO-1_157-165pMHC细胞或K562-A2细胞。当肿瘤体积长至1000mm³(肿瘤体积＝长×宽²/2)，小鼠尾静脉注射5mg/kg的1G4113-N₃-Cy5。用Maestro in-vivo imaging system记录给药36h后小鼠体内Cy5荧光分布。

在A375-NY-ESO-1_157-165小鼠移植瘤模型中观察1G4113-5的分布情况。在尾静脉注射5mg/kg的1G4113-N₃-Cy5 4h后，肿瘤部位的颜色相比于小鼠其他部位深，表明1G4113-N₃-Cy5开始在肿瘤部位聚集；当药物处理12h后，肿瘤部位颜色很深，表明聚集大量的1G4113-5-Cy5；直至给药后36h，肿瘤部位颜色未见消退，表明1G4113-N₃-Cy5仍有效的聚集在肿瘤中(图6)。

小鼠的MHC I分子与人MHC I分子有所差别，为了进一步说明1G4113-5-Cy5可特异性的聚集在HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物阳性的肿瘤组织中，分别在HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物阳性的K562-NY-ESO-1_157-165pMHC移植瘤以及HLA-A2/NY-ESO-1_157-165复合物阴性的K562-A2移植瘤中观察1G4113-5的分布情况。在尾静脉注射5mg/kg的1G4113-N₃-Cy536h后，发现K562-NY-ESO-1_157-165pMHC肿瘤组织颜色很深，聚集大量的1G4113-N₃-Cy5；而K562-A2肿瘤组织颜色与小鼠其他部位无显著差别，未见1G4113-N₃-Cy5的聚集，说明了1G4113-N₃-Cy5在肿瘤部位的聚集依赖HLA-A2/NY-ESO-1_157-165抗原(图6)。

实施例9

1G4113-5-CD3的制备。

1)1G4113-5-N₃制备同实施例9。

2)anti-CD3ε-DBCO制备

GGG-(PEG)₄-DBCO(由联宁(苏州)生物制药有限公司合成)通过srt A催化偶联到抗CD3ε抗体(轻链可变区核苷酸序列来自NCBI，序列号：A22259.1，与IgG1 LC融合表达。重链可变区核苷酸序列来自NCBI，序列号：D82081.1，与IgG1 CH1融合表达，羧基末端引入(G₄S)₃-LPETG)的重链羧基末端。Srt A催化反应在Tris-NaCl缓冲液中进行。反应体系中含有：5mmol/L CaCl₂，6μmol/L抗CD3ε抗体，150μmol/L GGG-(PEG)₄-DBCO，50μmol/L srt A。反应体系在37℃孵育12h后，使用

纯化仪以及HiTrap Ni-NTA预装柱(购自GE，货号：17-5248-02)纯化以去除srt A以及未反应的抗CD3ε抗体。纯化步骤：HiTrap Ni-NTA预装柱用100％Ni-NTA上样缓冲液平衡后开始进样，收集流出液。流出液用10kDa孔径大小的超滤膜超滤，去除未反应的GGG-(PEG)₄-DBCO小分子，并将溶剂置换成Tris-NaCl缓冲液后，用Nanodrop ND-1000测定蛋白浓度。

3)1G4113-5-CD3制备

用Tris-NaCl缓冲液将1G4113-5-N₃调整至4mg/mL，将anti-CD3ε-DBCO浓度调整为2mg/mL，并将调整浓度后的1G4113-5-N₃和anti-CD3ε-DBCO按照体积1∶1混匀，室温旋转反应4h，再4℃旋转过夜反应。反应体系使用

纯化仪以及Superdex^TM200Increase 10/300GL分子筛(购自GE，货号：28-9909-44)纯化获得1G4113-5-CD3。纯化步骤：Superdex^TM200Increase 10/300GL分子筛用1×PBS平衡，进样后用1×PBS，并以0.3ml/min的流速冲洗柱子。收集前两个紫外吸收峰对应的蛋白，用30kDa孔径大小的超滤膜超滤浓缩，以Nanodrop ND-1000测定蛋白浓度，分装冻存于-80℃。取约10μg纯化的1G4113-5-CD3，1G4113-5-N₃，anti-CD3ε-DBCO以及3μL未纯化的1G4113-5-N₃和anti-CD3ε-DBCO反应液进行SDS-PAGE电泳验证。

1G4113-5有两个偶联位点，抗CD3抗体有一个偶联位点，理论上1个1G4113-5分子可偶联1个或2个抗CD3抗体(图7)。因此，1G4113-5-N₃与anti-CD3ε-DBCO的反应体系中可能存在1G4113-5偶联两个抗CD3抗体(1G4113-5-2CD3)，1G4113-5偶联一个抗CD3抗体(1G4113-5-1CD3)，未偶联的1G4113-5-N₃以及anti-CD3ε-DBCO四种组分。分子量越大越早从分子筛中流出，因此认为分子筛分析纯化的第一个峰对应1G4113-5-2CD3，第二个峰对应1G4113-5-1CD3，第三个峰对应1G4113-5-N₃，最后的峰对应anti-CD3ε-DBCO(图8)。收集第一个峰和第二个峰对应的蛋白。

利用非变性的SDS-PAGE方法对分子筛纯化收集的蛋白，1G4113-5-N₃与anti-CD3ε-DBCO的反应体系进行分析，并以1G4113-5-N₃和anti-CD3ε-DBCO为对照(图8)。发现1G4113-5-N₃与anti-CD3ε-DBCO的反应体系含有如上描述的四种组分，其中1G4113-5-2CD3含量较少，反应体系中存在大量未偶联的1G4113-5-N₃和anti-CD3ε-DBCO，表明偶联效率不高。分子筛纯化收集的蛋白仅含有1G4113-5-1CD3和1G4113-5-2CD3两种组分，1G4113-5-2CD3含量较低。

紧接着，利用流式细胞技术分析了制备的1G4113-5-CD3对HLA-A2/NY-ESO-1_157-165阳性肿瘤细胞以及T细胞的亲和性。分别取1×10⁶K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞和ATC细胞(同实施案例12)，孵育5μg/mL 1G4113-5-CD3后，再用PE标记的山羊抗人IgG抗体检测，以孵育0μg/mL 1G4113-5-CD3作为对照。与不孵育1G4113-5-CD3的对照组相比，孵育1G4113-5-CD3后的K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞和ATC细胞的荧光均发生显著偏移(图8)，表明1G4113-5-CD3保留了两种抗体的亲和性。

实施例10

1G4113-5-CD3刺激T细胞的激活增殖。

1)人外周血单核细胞(PBMC)的提取和培养

由浙江大学校医院采取无菌、肝素抗凝的人外周血。血液1000rpm离心10min，小心吸弃上清，加入与上清等量的37℃预热1×PBS混匀。人淋巴细胞分离液(购自达科为生物工程有限公司，货号：7111011)置于15mL离心管中后再沿管壁轻轻加入PBS稀释的外周血，用平转头600g离心20min，离心机升降速度调至最慢。离心完毕后，溶液中间白色层为PBMC，轻轻吸取PBMC于新离心管中，加入2倍体积的37℃预热1×PBS混匀，1000rpm离心10min。弃上清，加入37℃预热1×PBS清洗细胞一次后，重悬于RPMI-1640完全培养基，置于细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养2-4h。其中，DC细胞等在培养过程中会紧紧贴于培养皿底部，吸取未贴壁的细胞为所需的PBMC。

2)1G4113-5-CD3刺激T细胞的激活

1000rpm，5min离心收集处于对数生长期的K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞，重悬于新鲜RPMI-1640完全培养基中。1×10⁵个细胞/管分装于无菌1.5mL离心管中，加入不同浓度的1G4113-5-CD3(7200、1200、240、48、9.6、0ng/mL，0ng/mL为对照组)至终体积为500μL，4℃孵育30min。1000rpm，10min离心收集PBMC，重悬于新鲜RPMI-1640完全培养基中，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，取500μL分别与不同药物浓度处理的K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞混匀，铺于12孔细胞培养板中，置于细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养。

培养64h后，600g，5min离心收集细胞，用1×PBS清洗2次后重悬于1×PBS，均分为两份，每份200μL。一份加入5μL APC标记的小鼠抗人CD3抗体(购自ThermoFisher，货号：17-0036-41)和15μL PE标记的小鼠抗人CD69抗体(购自ThermoFisher，货号：12-0691-83)；另一份加入5μL PE标记的小鼠抗人CD3抗体(购自ThermoFisher，货号：12-0036-41)和15μLAPC标记的小鼠抗人CD25抗体(购自ThermoFisher，货号：17-0251-82)，4℃避光孵育30min。1×PBS清洗3次后，重悬于500μL的1×PBS中，用Cytomic FC 500MCL流式细胞仪检测CD69和CD25阳性细胞的比例。

CD69是T细胞激活早期的标志之一，CD25是T细胞激活晚期的标志之一，选择CD69和CD25作为T细胞激活的检测标志。发现，单独的肿瘤细胞不能显著刺激T细胞上调CD69的表达(对照组)；在1G4113-5-CD3和肿瘤细胞的共同刺激下，CD69阳性的细胞比例显著增加，并与药物呈浓度依赖，表明1G4113-5-CD3可有效的激活T细胞(图9)。另外，与单独肿瘤细胞刺激相比(对照组)，在1G4113-5-CD3和肿瘤细胞的共同刺激下，虽然CD25阳性的细胞比例有所增加，但是不显著。猜测PBMC在药物和肿瘤细胞共同刺激64h后，T细胞大部分处于早期激活状态，少部分进入晚期激活的状态(图9)。

3)1G4113-5-CD3刺激PBMC的增殖

按照1G4113-5-CD3刺激T细胞的激活实验操作收集K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞并孵育不同浓度的1G4113-5-CD3。1000rpm，10min离心收集PBMC，用室温预热的1×PBS清洗2次后，重悬于1×PBS中，调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。加入CFSE(购自ThermoFisher，货号：65-0850-84)至终浓度为2.5μmol/L，混匀，37℃避光孵育15min。1000rpm，10min离心收集PBMC收集CFES处理的PBMC，用室温预热的1×PBS清洗2次后，重悬于新鲜RPMI-1640完全培养基中，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，取500μL分别与不同药物浓度处理的K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞混匀，铺于12孔细胞培养板中，置于细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养。

培养90h后，600g，5min离心收集细胞，用1×PBS清洗2次后重悬于100μL 1×PBS中，加入5μL PI(购自Sigma，货号：81845)母液，室温避光孵育15min后，补加300μL 1×PBS，用ACEA NovoCyte^TM流式细胞仪根据细胞形态选取PBMC检测其增殖情况。

CFSE可非特异性的结合细胞内的蛋白，产生绿色荧光，并随着细胞分裂平均分配到两个子代细胞中，绿色荧光随着分裂次数增加逐级递减。检测PBMC绿色荧光的强弱来判定PBMC的增殖情况，同时用PI标记去除凋亡或坏死细胞对检测结果的干扰。发现，单独的肿瘤细胞不能显著的促进PBMC增殖(对照组)，在肿瘤细胞和较低浓度的1G4113-5-CD3(<120ng/mL)共同刺激下，PBMC开始分裂增殖，增殖的比例随着浓度增高而增加，当1G4113-5-CD3浓度>120ng/mL时，PBMC的增殖比例与药物的浓度依赖关系显著(图10)。

4)1G4113-5-CD3介导PBMC杀伤肿瘤细胞

A375-NY-ESO-1_157-165细胞，K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞与1G4113-5-CD3和PBMC细胞共孵育同1G4113-5-CD3刺激PBMC的激活实验操作。

培养48h后，600g，5min离心收集细胞，用1×PBS清洗2次后重悬于100μL 1×AnnexinV结合缓冲液中，并分别加入5μL的Annexin V-633和PI溶液(凋亡检测试剂盒购自同仁化学，货号：AD11)。混合均匀后，室温避光孵育15min，补加300μL 1×PBS，用CytomicFC 500MCL流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡情况。发现，在没有孵育1G4113-5-CD3的情况下，PBMC对两种肿瘤细胞有微弱的杀伤作用(对照组)。当与1G4113-5-CD3共孵育后，PBMC对两种肿瘤细胞杀伤活性增强，且与药物的浓度呈依赖性，表明1G4113-5-CD3可介导PBMC杀伤HLA-A2/NY-ESO-1_157-165阳性的肿瘤细胞(图11)。

实施例11

1)非特异性活化T细胞(ATC)的制备和培养

约5×10⁶PBMC重悬于10mL新鲜RPMI-1640完全培养基中，人T-activator CD3/CD28磁珠(购自ThermoFisher，货号：11161D)用1mL磁珠洗涤液清洗2次后重悬于新鲜RPMI-1640完全培养基中，按照细胞数∶磁珠数＝1∶1量将洗涤后的磁珠与PBMC混匀，并加入重组人IL-2(购自R&D systems，货号：202-IL-010)至终浓度为30U/mL，置于细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养。

2)1G4113-5-CD3介导ATC杀伤肿瘤细胞。

A375-NY-ESO-1_157-165细胞，K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞与1G4113-5-CD3于4℃预孵育同实施案例11中1G4113-5-CD3刺激PBMC的激活实验操作。1000rpm，10min离心收集ATC，重悬于1mL新鲜RPMI-1640完全培养基中，用磁力架吸附去除磁珠后调整细胞浓度为4×10⁵个/mL，取500μL分别与不同药物浓度处理的肿瘤细胞混匀，铺于12孔细胞培养板中，置于细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养。培养48h后对肿瘤细胞进行凋亡检测。细胞凋亡检测方法同实施案例11中1G4113-5-CD3介导PBMC杀伤肿瘤细胞。发现，在没有孵育1G4113-5-CD3的情况下，ATC对两种肿瘤细胞有微弱的杀伤作用(对照组)。当与1G4113-5-CD3共孵育后，ATC对两种肿瘤细胞杀伤活性显著增强，且与药物的浓度呈依赖性，表明1G4113-5-CD3可有效的介导ATC杀伤HLA-A2/NY-ESO-1_157-165阳性的肿瘤细胞(图12)。

实施例12

1G4113-5-CD3介导ATC细胞杀伤肿瘤细胞的特异性验证。

1)可溶性NY-ESO-1-A2-pMHC-Fc抑制1G4113-5-CD3的活性

1000rpm，5min离心收集处于对数生长期的A375-NY-ESO-1_157-165细胞，重悬于新鲜RPMI-1640完全培养基中。1×10⁵个细胞/管分装于无菌1.5mL离心管中，加入50ng/mL的1G4113-5-CD3以及不同浓度的NY-ESO-1-A2-pMHC-Fc(2000、400、80、16、3.2ng/mL)至终体积为500μL，4℃孵育30min(对照组不加1G4113-5-CD3和NY-ESO-1-A2-pMHC-Fc，用RPMI-1640完全培养基补充体积至500μL)。

再收集ATC细胞，按照2∶1与药物处理的肿瘤细胞共孵育。培养48h后用ACEANovoCyte^TM流式细胞仪对肿瘤细胞进行凋亡检测，细胞凋亡检测方法同实施案例11中1G4113-5-CD3介导PBMC杀伤肿瘤细胞。发现，随着NY-ESO-1-A2-pMHC-Fc孵育浓度的增加，肿瘤细胞凋亡的比例在逐渐下降；当NY-ESO-1-A2-pMHC-Fc孵育终浓度为1000ng/mL时，细胞凋亡的比例接近对照组，1G4113-5-CD3的活性基本被抑制，表明1G4113-5-CD3介导ATC细胞杀伤肿瘤细胞依赖于1G4113-5-CD3与肿瘤表面HLA-A2/NY-ESO-1_157-165抗原的识别(图13)。

2)1G4113-5-CD3介导ATC细胞杀伤肿瘤细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)

1000rpm，5min离心收集处于对数生长期的A375细胞，A375-NY-ESO-1_157-165细胞，K562-A2细胞以及K562-A2-NY-ESO-1_157-165细胞重悬于含1％FBS的无酚红RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL。1G4113-5-CD3梯度稀释于含1％FBS的无酚红RPMI-1640培养基中(14400、4800、2400、400、80、40、0ng/mL，0ng/mL为对照组)，取300μL肿瘤细胞与150μL不同浓度的1G4113-5-CD3混匀，4℃孵育30min。收集ATC细胞，重悬于含1％FBS的无酚红RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。不同药物浓度处理的肿瘤细胞均匀分成3份与50μL ATC细胞共同铺于96孔板中。置于细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养。

培养48h后，1000rpm，10min离心，各孔取120μL细胞培养上清液，用乳酸脱氢酶试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司，货号：C0016)检测LDH的释放水平。

LDH存在于细胞浆中，当细胞在凋亡、坏死等情况下，细胞膜损伤释放LDH，细胞培养上清中LDH的含量与细胞的死亡率呈正比。ΔOD₄₉₀越高表明上清中LDH含量越高，即1G4113-5-CD3介导ATC细胞杀伤肿瘤细胞的活性越强。发现，1G4113-5-CD3可介导ATC细胞有效的杀伤HLA-A2/NY-ESO-1_157-165抗原阳性的肿瘤细胞，且与药物的浓度呈依赖性；在5-3600ng/mL的给药范围内，1G4113-5-CD3不能增强ATC细胞对HLA-A2/NY-ESO-1_157-165抗原阴性的K562-A2细胞的杀伤，表明1G4113-5-CD3活性的发挥依赖于HLA-A2/NY-ESO-1_157-165抗原，具备特异性。此外，发现肿瘤细胞表面HLA-A2/NY-ESO-1_157-165抗原表达越高，1G4113-5-CD3介导ATC细胞对肿瘤细胞的杀伤活性也越强，表明抗原的表达水平影响了1G4113-5-CD3活性的发挥。1G4113-5-CD3介导ATC细胞杀伤A375细胞，也表明1G4113-5-CD3能在肿瘤细胞抗原表达水平极低的情况下发挥活性(图13)。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种重组抗体样T细胞抗原受体、T细胞抗原受体偶联药物、双特异性分子及应用

<160> 46

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2199

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggccgccg ccaccggcgc ccactccatg 60

caggaggtga cccagatccc cgccgccctg agcgtgcccg agggcgagaa cctggtgctg 120

aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttccgcca ggaccccggc 180

aagggactga cctccctgct gctgatcacc ccctggcaga gggagcagac cagcggcaga 240

ctgaacgcca gcctggacaa gagcagcggc agaagcaccc tgtacatcgc cgccagccag 300

cccggcgaca gcgccaccta cctgtgcgcc gtgcggcccc tgctcgacgg cacctacatc 360

cccaccttcg ggcgcggcac cagcttgatc gtgcacccct acggtggtgg tggtagcggc 420

ggcggcggct ctggtggtgg tggatccatg ggcgtgacac agacacctaa atttcaggtg 480

ctgaagacag gccagagtat gacactgcag tgtgcccagg atatgaatca tgagtacatg 540

tcttggtata gacaggaccc cggcatgggc ctgagactga tccactacag cgtggccatc 600

cagaccaccg acagaggcga ggtgcccaac ggctacaacg tgagcagatc caccatcgag 660

gacttccccc tgcggctgct gagcgccgcc cccagccaga ccagcgtgta cttctgcgcc 720

agcagctacc tgggcaacac cggcgagctg ttcttcggcg agggcagcag actgaccgtg 780

ctggaggacc tgaagaacgt gttccccccc gaggtggccg tgttcgagcc cagcgaggcc 840

gagatcagcc acacccagaa ggccaccctg gtgtgcctgg ccaccggctt ctaccccgac 900

cacgtggagc tgagctggtg ggtgaacggc aaggaggtgc acagcggcgt gagcaccgac 960

ccccagcccc tgaaggagca gcccgccctg aacgacagca ggtacgccct gagcagccgc 1020

ctgagagtgt ccgccacctt ctggcaggac cccaggaacc acttcagatg ccaggtgcag 1080

ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg acccaggaca gggccaagcc cgtgacccag 1140

atcgtgagcg ccgaggcctg gggcagagcc gacgctagca ccaagggccc atcggtcttc 1200

cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 1260

aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 1320

gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 1380

accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 1440

agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 1500

ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1560

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1620

agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1680

gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1740

accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1800

gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1860

caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1920

tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1980

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 2040

tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 2100

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 2160

aaaggcggtg gaggctctct gccggagact ggtggttaa 2199

<210> 2

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggccgccg ccaccggcgc ccactccatg 60

caggaggtga cccagatccc cgccgccctg agcgtgcccg agggcgagaa cctggtgctg 120

aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttccgcca ggaccccggc 180

aagggactga cctccctgct gctgatcacc ccctggcaga gggagcagac cagcggcaga 240

ctgaacgcca gcctggacaa gagcagcggc agaagcaccc tgtacatcgc cgccagccag 300

cccggcgaca gcgccaccta cctgtgcgcc gtgcggcccc tgctcgacgg cacctacatc 360

cccaccttcg ggcgcggcac cagcttgatc gtgcacccct acggttctcg tacggtggct 420

gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 480

gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 540

aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 600

acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 660

tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 720

ggagagtgtt aa 732

<210> 3

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggccgccg ccaccggcgc ccactccatg 60

ggcgtgacac agacacctaa atttcaggtg ctgaagacag gccagagtat gacactgcag 120

tgtgcccagg atatgaatca tgagtacatg tcttggtata gacaggaccc cggcatgggc 180

ctgagactga tccactacag cgtggccatc cagaccaccg acagaggcga ggtgcccaac 240

ggctacaacg tgagcagatc caccatcgag gacttccccc tgcggctgct gagcgccgcc 300

cccagccaga ccagcgtgta cttctgcgcc agcagctacc tgggcaacac cggcgagctg 360

ttcttcggcg agggcagcag actgaccgtg ctgggttctg ctagcaccaa gggcccatcg 420

gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480

ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540

agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600

gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660

aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720

acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380

ccgggtaaag gcggtggagg ctctctgccg gagactggtg gttaa 1425

<210> 4

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggccgccg ccaccggcgc ccactccatg 60

caggaggtga cccagatccc cgccgccctg agcgtgcccg agggcgagaa cctggtgctg 120

aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttccgcca ggaccccggc 180

aagggactga cctccctgct gctgatcacc ccctggcaga gggagcagac cagcggcaga 240

ctgaacgcca gcctggacaa gagcagcggc agaagcaccc tgtacatcgc cgccagccag 300

cccggcgaca gcgccaccta cctgtgcgcc gtgcggcccc tgctcgacgg cacctacatc 360

cccaccttcg ggcgcggcac cagcttgatc gtgcacccct acatccagaa ccccgacccc 420

gccgtgtacc agctgcggga tagcaagagc agcgataagt ccgtgtgcct gttcaccgac 480

ttcgacagcc agaccaacgt gagccagagc aaggacagcg acgtgtacat caccgacaag 540

accgtgctgg acatgagatc catggacttc aagtccaaca gcgccgtggc ctggagcaac 600

aagagcgact tcgcctgcgc caatgccttt aacaatagca ttatccctga ggatacattt 660

ttccctagcc ctgaatctag ctgtggttct cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 720

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 780

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 840

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 900

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 960

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaa 1014

<210> 5

<211> 1818

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggccgccg ccaccggcgc ccactccatg 60

ggcgtgacac agacacctaa atttcaggtg ctgaagacag gccagagtat gacactgcag 120

tgtgcccagg atatgaatca tgagtacatg tcttggtata gacaggaccc cggcatgggc 180

ctgagactga tccactacag cgtggccatc cagaccaccg acagaggcga ggtgcccaac 240

ggctacaacg tgagcagatc caccatcgag gacttccccc tgcggctgct gagcgccgcc 300

cccagccaga ccagcgtgta cttctgcgcc agcagctacc tgggcaacac cggcgagctg 360

ttcttcggcg agggcagcag actgaccgtg ctggaggacc tgaagaacgt gttccccccc 420

gaggtggccg tgttcgagcc cagcgaggcc gagatcagcc acacccagaa ggccaccctg 480

gtgtgcctgg ccaccggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaacggc 540

aaggaggtgc acagcggcgt gagcaccgac ccccagcccc tgaaggagca gcccgccctg 600

aacgacagca ggtacgccct gagcagccgc ctgagagtgt ccgccacctt ctggcaggac 660

cccaggaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg 720

acccaggaca gggccaagcc cgtgacccag atcgtgagcg ccgaggcctg gggcagagcc 780

gactgtggtt ctgctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 840

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 900

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 960

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 1020

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1080

aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 1140

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 1200

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1260

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1320

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1380

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1440

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1500

tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1560

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1620

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1680

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1740

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aaggcggtgg aggctctctg 1800

ccggagactg gtggttaa 1818

<210> 6

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggccgccg ccaccggcgc ccactccatg 60

caggaggtga cccagatccc cgccgccctg agcgtgcccg agggcgagaa cctggtgctg 120

aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttccgcca ggaccccggc 180

aagggactga cctccctgct gctgatcacc ccctggcaga gggagcagac cagcggcaga 240

ctgaacgcca gcctggacaa gagcagcggc agaagcaccc tgtacatcgc cgccagccag 300

cccggcgaca gcgccaccta cctgtgcgcc gtgcggcccc tgctcgacgg cacctacatc 360

cccaccttcg ggcgcggcac cagcttgatc gtgcacccct acatccagaa ccccgacccc 420

gccgtgtacc agctgcggga tagcaagagc agcgataagt ccgtgtgcct gttcaccgac 480

ttcgacagcc agaccaacgt gagccagagc aaggacagcg acgtgtacat caccgacaag 540

accgtgctgg acatgagatc catggacttc aagtccaaca gcgccgtggc ctggagcaac 600

aagagcgact tcgcctgcgc caatgccttt aacaatagca ttatccctga ggatacattt 660

ttccctagcc ctgaatctag cggttctcgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 720

ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 780

ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 840

tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 900

ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 960

cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta a 1011

<210> 7

<211> 1815

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggccgccg ccaccggcgc ccactccatg 60

ggcgtgacac agacacctaa atttcaggtg ctgaagacag gccagagtat gacactgcag 120

tgtgcccagg atatgaatca tgagtacatg tcttggtata gacaggaccc cggcatgggc 180

ctgagactga tccactacag cgtggccatc cagaccaccg acagaggcga ggtgcccaac 240

ggctacaacg tgagcagatc caccatcgag gacttccccc tgcggctgct gagcgccgcc 300

cccagccaga ccagcgtgta cttctgcgcc agcagctacc tgggcaacac cggcgagctg 360

ttcttcggcg agggcagcag actgaccgtg ctggaggacc tgaagaacgt gttccccccc 420

gaggtggccg tgttcgagcc cagcgaggcc gagatcagcc acacccagaa ggccaccctg 480

gtgtgcctgg ccaccggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaacggc 540

aaggaggtgc acagcggcgt gagcaccgac ccccagcccc tgaaggagca gcccgccctg 600

aacgacagca ggtacgccct gagcagccgc ctgagagtgt ccgccacctt ctggcaggac 660

cccaggaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg 720

acccaggaca gggccaagcc cgtgacccag atcgtgagcg ccgaggcctg gggcagagcc 780

gacggttctg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 840

acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 900

acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 960

cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 1020

acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 1080

gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 1140

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1200

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1260

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1320

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1380

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1440

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1500

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1560

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1620

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1680

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1740

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag gcggtggagg ctctctgccg 1800

gagactggtg gttaa 1815

<210> 8

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggccgccg ccaccggcgc ccactccatg 60

caggaggtga cccagatccc cgccgccctg agcgtgcccg agggcgagaa cctggtgctg 120

aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttccgcca ggaccccggc 180

aagggactga cctccctgct gctgatcacc ccctggcaga gggagcagac cagcggcaga 240

ctgaacgcca gcctggacaa gagcagcggc agaagcaccc tgtacatcgc cgccagccag 300

cccggcgaca gcgccaccta cctgtgcgcc gtgcggcccc tgctcgacgg cacctacatc 360

cccaccttcg ggcgcggcac cagcttgatc gtgcacccct acatccagaa ccccgacccc 420

gccgtgtacc agctgcggga tagcaagagc agcgataagt ccgtgtgcct gttcaccgac 480

ttcgacagcc agaccaacgt gagccagagc aaggacagcg acgtgtacat caccgacaag 540

accgtgctgg acatgagatc catggacttc aagtccaaca gcgccgtggc ctggagcaac 600

aagagcgact tcgcctgcgc caatgccttt aacaatagca ttatccctga ggatacattt 660

ttccctagcc ctgaatctag ctgtggttct cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 720

ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840

agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900

gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960

accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020

gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080

caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgtcc 1140

tgcgcggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260

gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380

aaaggcggtg gaggctctct gccggagact ggtggttaa 1419

<210> 9

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggccgccg ccaccggcgc ccactccatg 60

ggcgtgacac agacacctaa atttcaggtg ctgaagacag gccagagtat gacactgcag 120

tgtgcccagg atatgaatca tgagtacatg tcttggtata gacaggaccc cggcatgggc 180

ctgagactga tccactacag cgtggccatc cagaccaccg acagaggcga ggtgcccaac 240

ggctacaacg tgagcagatc caccatcgag gacttccccc tgcggctgct gagcgccgcc 300

cccagccaga ccagcgtgta cttctgcgcc agcagctacc tgggcaacac cggcgagctg 360

ttcttcggcg agggcagcag actgaccgtg ctggaggacc tgaagaacgt gttccccccc 420

gaggtggccg tgttcgagcc cagcgaggcc gagatcagcc acacccagaa ggccaccctg 480

gtgtgcctgg ccaccggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaacggc 540

aaggaggtgc acagcggcgt gagcaccgac ccccagcccc tgaaggagca gcccgccctg 600

aacgacagca ggtacgccct gagcagccgc ctgagagtgt ccgccacctt ctggcaggac 660

cccaggaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg 720

acccaggaca gggccaagcc cgtgacccag atcgtgagcg ccgaggcctg gggcagagcc 780

gactgtggtt ctcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 840

gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 900

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 960

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1020

gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1080

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1140

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1200

ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc 1260

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1320

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1380

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1440

cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaaggcgg tggaggctct 1500

ctgccggaga ctggtggtta a 1521

<210> 10

<211> 317

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly

1 5 10 15

Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn

20 25 30

Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu

35 40 45

Leu Ile Thr Pro Trp Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala

50 55 60

Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser

65 70 75 80

Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Leu Leu

85 90 95

Asp Gly Thr Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val

100 105 110

His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp

115 120 125

Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser

130 135 140

Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp

145 150 155 160

Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala

165 170 175

Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn

180 185 190

Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser

195 200 205

Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

210 215 220

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

225 230 235 240

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

245 250 255

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

260 265 270

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

275 280 285

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

290 295 300

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

305 310 315

<210> 11

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr Gly Gln

1 5 10 15

Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met Ser

20 25 30

Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser

35 40 45

Val Ala Ile Gln Thr Thr Asp Arg Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn

50 55 60

Val Ser Arg Ser Thr Ile Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser Ala

65 70 75 80

Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Leu Gly

85 90 95

Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

115 120 125

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

130 135 140

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

145 150 155 160

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu

180 185 190

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

195 200 205

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

210 215 220

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

225 230 235 240

Ala Asp Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

245 250 255

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

260 265 270

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

290 295 300

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

305 310 315 320

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

325 330 335

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

340 345 350

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

370 375 380

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

385 390 395 400

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

405 410 415

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

420 425 430

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

435 440 445

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

450 455 460

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

465 470 475 480

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

485 490 495

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

500 505 510

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

515 520 525

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

530 535 540

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

545 550 555 560

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly

565 570 575

Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly

580 585

<210> 12

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly

1 5 10 15

Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn

20 25 30

Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu

35 40 45

Leu Ile Thr Pro Trp Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala

50 55 60

Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser

65 70 75 80

Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Leu Leu

85 90 95

Asp Gly Thr Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val

100 105 110

His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp

115 120 125

Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser

130 135 140

Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp

145 150 155 160

Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala

165 170 175

Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn

180 185 190

Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser

195 200 205

Cys Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

340 345 350

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu

435 440 445

Pro Glu Thr Gly Gly

450

<210> 13

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr Gly Gln

1 5 10 15

Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met Ser

20 25 30

Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser

35 40 45

Val Ala Ile Gln Thr Thr Asp Arg Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn

50 55 60

Val Ser Arg Ser Thr Ile Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser Ala

65 70 75 80

Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Leu Gly

85 90 95

Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

115 120 125

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

130 135 140

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

145 150 155 160

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu

180 185 190

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

195 200 205

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

210 215 220

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

225 230 235 240

Ala Asp Cys Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

260 265 270

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

275 280 285

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

290 295 300

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

305 310 315 320

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

325 330 335

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

355 360 365

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

370 375 380

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

385 390 395 400

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

420 425 430

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

435 440 445

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

450 455 460

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly

465 470 475 480

Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly

485

<210> 14

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 15

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly

1 5 10

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaattcacca ccatggactg gacctggcgg atcctgttcc tggtggccgc 50

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atcctgttcc tggtggccgc cgccaccggc gcccactcca tgcaggaggt gacccagat 59

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

accagagccg ccgccgccgc taccaccacc accgtagggg tgcacgatca agc 53

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agcggcggcg gcggctctgg tggtggtgga tccatgggcg tgacacagac acc 53

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gatgggccct tggtgctagc gtcggctctg ccccaggcct 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aggcctgggg cagagccgac gctagcacca agggcccatc 40

<210> 24

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcggccgctt aaccaccagt ctccggcaga gagcctccac cgcctttacc cggagaca 58

<210> 25

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gatggtgcag ccaccgtacg agaaccgtag gggtgcacga tcaagc 46

<210> 26

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcttgatcgt gcacccctac ggttctcgta cggtggctgc accatc 46

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcggccgctt aacactctcc cctgttgaag c 31

<210> 28

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atcctgttcc tggtggccgc cgccaccggc gcccactcca tgggcgtgac acagacacc 59

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gatgggccct tggtgctagc agaacccagc acggtcagtc tgctgc 46

<210> 30

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcagcagact gaccgtgctg ggttctgcta gcaccaaggg cccatc 46

<210> 31

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gatggtgcag ccaccgtacg agaaccacag ctagattcag ggctaggga 49

<210> 32

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tccctagccc tgaatctagc tgtggttctc gtacggtggc tgcaccatc 49

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gatgggccct tggtgctagc agaaccacag tcggctctgc cccaggcct 49

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

aggcctgggg cagagccgac tgtggttctg ctagcaccaa gggcccatc 49

<210> 35

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gatggtgcag ccaccgtacg agaaccgcta gattcagggc taggga 46

<210> 36

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tccctagccc tgaatctagc ggttctcgta cggtggctgc accatc 46

<210> 37

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gatgggccct tggtgctagc agaaccgtcg gctctgcccc aggcct 46

<210> 38

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aggcctgggg cagagccgac ggttctgcta gcaccaaggg cccatc 46

<210> 39

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gttttgtcac aagatttggg agaaccacag ctagattcag ggctaggga 49

<210> 40

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tccctagccc tgaatctagc tgtggttctc ccaaatcttg tgacaaaac 49

<210> 41

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gttttgtcac aagatttggg agaaccacag tcggctctgc cccaggcct 49

<210> 42

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

aggcctgggg cagagccgac tgtggttctc ccaaatcttg tgacaaaac 49

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu

1 5

<210> 44

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Gly Gly Gly Lys

1

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gcttgagttc tacctcgcca 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

agccaaaaac acgggcagaa 20

Claims

1.一种重组抗体样T细胞抗原受体，其特征在于，为异源二聚体，第一亚基包括依次连接的ECDα-铰链区-CH2-CH3，第二亚基包括依次连接的ECDβ-铰链区-CH2-CH3，其中，ECDα和ECDβ分别为T细胞抗原受体1G4113的α链和β链的胞外结构域，铰链区、CH2、CH3均为IgG1的结构，并且第一亚基和第二亚基的两个CH3之间分别使用knob-into-hole技术设计成knob结构和hole结构。

2.如权利要求1所述的重组抗体样T细胞抗原受体，其特征在于，所述第一亚基的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；所述第二亚基的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

3.如权利要求2所述的重组抗体样T细胞抗原受体，其特征在于，所述第一亚基的编码基因序列如SEQ ID No.8所示；所述第二亚基的编码基因序列如SEQ ID No.9所示。

4.如权利要求1～3任一所述重组抗体样T细胞抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.一种T细胞抗原受体偶联药物，其特征在于，在如权利要求1～3任一所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端通过sortase A酶催化转肽反应偶联上vcMMAE，其中vc为缬氨酸-瓜氨酸二肽接头，MMAE为海兔毒素。

6.如权利要求5所述的T细胞抗原受体偶联药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.一种T细胞抗原受体偶联药物，其特征在于，在如权利要求1～3任一所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端偶联上荧光分子Cy5，

所述T细胞抗原受体偶联药物的制备方法包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的T细胞抗原受体偶联药物在制备肿瘤成像药物中的应用。

9.一种双特异性分子，其特征在于，在如权利要求1～3任一所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端偶联上抗CD3ε抗体，

所述双特异性分子的制备方法包括以下步骤：

10.如权利要求9所述的双特异性分子在制备抗肿瘤药物中的应用。