KR20230059789A - 항-가변 muc1* 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 이의 단편을 개시하는 것으로, 이때 상기 항체는 PSMGFR 펩티드(서열번호 2) 또는 이 펩티드의 단편에 특이적으로 결합한다.

Description

항-가변 MUC1* 항체 및 이의 용도

본원은 인간 항-MUC1* 항체, 인간화된 항-MUC1* 항체 및 비-인간 항-MUC1* 항체, 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본원은 또한 절단 효소로 형질감염되었거나 형질도입된 면역 세포를 암의 치료에 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CAR 및 또 다른 단백질로 형질감염되었거나 형질도입된 면역 세포를 암의 치료에 사용하는 것에 관한 것이다.

본 발명자들은 MUC1(서열번호 1) 막횡단 단백질의 절단된 형태가 모든 인간 암의 75% 이상의 성장을 유도하는 성장 인자 수용체임을 이전에 발견하였다. 본 발명자들이 MUC1*(muk 1 스타라고 발음함)라고 명명한 MUC1의 절단된 형태는 강력한 성장 인자 수용체이다. MUC1의 세포외 도메인의 대부분의 절단 및 방출은 리간드 이량체 NME1, NME6, NME7, NME7_AB, NME7-X1 또는 NME8을 활성화시키기 위한 결합 부위를 노출시킨다. 이것은 모든 암의 75% 이상에서 비정상적으로 발현되고 훨씬 더 높은 퍼센트의 전이성 암에서 과다발현될 가능성이 있기 때문에 암 약물을 위한 이상적인 표적이다(Mahanta et al. (2008) A Minimal Fragment of MUC1 Mediates Growth of Cancer Cells. PLoS ONE 3(4): e2054. doi:10.1371/ journal.pone.0002054; Fessler et al. (2009), “MUC1* is a determinant of trastuzumab (Herceptin) resistance in breast cancer cells,” Breast Cancer Res Treat. 118(1):113-124). MUC1 절단 후 그의 세포외 도메인의 대부분은 세포 표면으로부터 떨어져 나간다. 남은 부분은 PSMGFR(서열번호 2)로서 지칭된 일차 성장 인자 수용체 서열의 대부분 또는 전부를 포함하는 절두된 세포외 도메인을 가진다.

항체는 인간 질환을 치료하는 데 점점 더 많이 사용되고 있다. 비-인간 종에서 생성된 항체, 예컨대, 말 항체는 역사적으로 인간에서 치료제로서 사용되어 왔다. 보다 최근에는, 외래 항체의 일반화된 거부를 피하기 위해 대부분 또는 모든 인간 서열을 함유하도록 항체를 조작하거나 선택한다. 비-인간 항체의 인식 단편을 인간 항체로 조작하는 과정은 일반적으로 '인간화'로서 지칭된다. 인간 항체 서열을 대체하는 데 사용되는 비-인간 서열의 양은 이 항체가 키메라 항체로서 지칭될 지, 인간화된 항체로서 지칭될 지, 아니면 완전 인간 항체로서 지칭될 지를 결정한다.

인간화된 항체 또는 완전 인간 항체의 생성을 가능하게 하는 대안적 기술이 존재한다. 이 전략은 항원으로 동물을 면역화하는 단계보다는 인간 항체 또는 항체 단편의 라이브러리를 스크리닝하는 단계 및 표적 항원에 결합하는 인간 항체 또는 항체 단편을 식별하는 단계를 포함한다. 또 다른 접근법은 항체의 가변 영역(들)을 항체 유사 분자로 조작하는 것이다. 또 다른 접근법은 인간화된 동물을 면역화하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명자들이 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하는 것으로 확인한 항체의 인식 단편과 함께 사용하기 위해 이 접근법들도 포괄하고자 한다.

환자를 항체로 치료하는 것 외에도, 암 면역요법은 최근에 혈액암의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. CAR T(키메라 항원 수용체 T 세포) 요법으로서 지칭되는 한 가지 암 면역요법은 종양 항원을 인식하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 T 세포 신호전달 및 보조자극 성분을 포함하는 세포질 꼬리를 가진 키메라 수용체를 발현하도록 T 세포를 조작한다(Dai H, Wang Y, Lu X, Han W. (2016) Chimeric Antigen Receptors Modified T cells for Cancer Therapy. J Natl Cancer Inst. 108(7): djv439). 이러한 수용체는 T 세포 막횡단, 신호전달 도메인 및 보조자극 도메인 또는 도메인들에 연결된, 종양 항원을 인식하는 단일 쇄 항체 단편(scFv)으로 구성된다. 상기 수용체와 암 관련 항원의 결합 시, 신호가 전달되어, T 세포 활성화, 증식 및 암 세포의 표적화된 사멸을 야기한다. 실제로, T 세포는 환자 또는 기증자로부터 단리되고 CAR로 형질도입되고, 증폭된 후 환자 내로 다시 주입된다. 기증자로부터 단리되는 경우, 면역 세포는 수용자에서 이식편 대 숙주 질환을 유도하지 않도록 돌연변이될 수 있나 조작될 수 있다. CAR T 세포가 암 세포의 항원에 결합할 때, CAR T 세포는 암 세포를 공격한 다음 그 T 세포 집단을 증폭한다.

지금까지, CAR T 요법은 혈액암의 치료에 매우 성공적이었지만 인간의 고형 종양에 대한 효능을 아직 보여주지 못하였다. 대부분의 혈액암은 B 세포 악성종양이기 때문에, CAR T 세포는 환자에게 심각한 피해를 야기하지 않으면서 환자의 B 세포를 모두 제거할 수 있을 뿐이다. 고형 종양에는 B 세포 등가물이 없다. 대부분의 종양 관련 항원들은 정상 조직에서도 발현되고; 이들은 암 조직에서 더 높은 수준으로 발현될 뿐이다. 따라서, 과제는 정상 조직에 비해 종양의 환경에서 다소 상이한 종양 관련 항원의 에피토프를 인식하는 항체를 개발하는 것이다. 정상 조직의 오프(off)-종양/온(on)-표적 사멸의 위험을 더 최소화하기 위해, 항체는 정상 조직보다 적어도 2배 더 많이 암 조직을 인식하고 결합해야 한다. 이 정도로 암 선택적이지 않은 항체는 종양 부위에서 유도적으로 발현되는 경우 치료적으로 사용될 수 있다.

암 선택적 항체를 포함하는 또 다른 암 요법은 BiTE로서도 지칭되는 이중특이적 T 세포 인게이저(Bispecific T cell Engager)이다. BiTE 접근법은 오프-종양/온-표적 효과의 CAR T 관련 위험을 제거하고자 한다. CAR T와 달리, BiTE는 일반 항체 기반 요법보다 더 큰 임의의 위험을 초래해서는 안 되는 이중특이적 항체이다. 그러나, 암 항원에 결합하여 이를 차단하는 전형적인 항암 항체와 달리, BiTE는 종양 세포의 항원에 결합함과 동시에 T 세포와 같은 면역 세포의 항원에 결합하도록 설계된다. 이 방식으로, BiTE는 T 세포를 종양 쪽으로 이동시킨다. BiTE는 암 관련 항원 및 T 세포 표면 단백질, 예컨대, CD3-엡실론에 동시에 결합하는 조작된 단백질이다. BiTE는 항-CD3-엡실론처럼 T 세포 항원에 결합하는 항체의 scFv를 암 항원에 결합하는 치료 단일클론 항체의 scFv에 유전적으로 연결함으로써 만들어진 항체이다(Patrick A. Baeuerle, and Carsten Reinhardt (2009) Bispecific T cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res. 69(12):4941-4944). BiTE 기술의 단점은 이 항체가 CAR T 세포와 달리 환자에서 증폭되지 않으므로, 제한된 지속성을 가진다는 점이다.

암 선택적 항체를 포함하는 또 다른 암 요법은 ADC로서도 지칭되는 항체 약물 접합체 기술이다. 이 경우, 독소 또는 독소의 전구체는 암 선택적 항체에 연결된다. CD8 양성 T 세포의 천연 살해를 이용하여 암 세포를 사멸시키는 CAR T 세포와 달리, ADC는 독성 페이로드를 종양에게 전달한다. ADC의 단점은 독성 페이로드를 정상 세포에게 전달할 수 있는 가능성이 있다는 점, 및 대부분의 ADC가 결합 후 내재화되는 세포 표면 분자와의 결합을 요구하고, 이때 약 10,000개의 표면 분자가 결과적인 세포 사멸에 필요하다는 점을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 탠덤 반복부 도메인을 결여하는 MUC1 동형체(isoform) 또는 절단 생성물의 세포외 도메인의 영역에 결합하는 비-인간, 인간 또는 인간화된 항-MUC1* 항체 또는 항체 단편 또는 항체 유사 단백질에 관한 것이다. 비-인간, 인간 또는 인간화된 항-MUC1* 항체 또는 항체 단편 또는 항체 유사 단백질은

(i) MUC1의 PSMGFR 영역;

(ii) PSMGFR 펩티드;

(iii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)(서열번호 3)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(iv) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)(서열번호 4)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(v) NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)(서열번호 5)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vi) ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)(서열번호 6)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vii) SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)(서열번호 7)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(viii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)(서열번호 8)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(ix) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)(서열번호 9)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(x) FPFSAQSGA(서열번호 10)의 아미노산 서열을 가진 펩티드

에 특이적으로 결합할 수 있다.

비-인간, 인간 또는 인간화된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM일 수 있다. 인간 또는 인간화된 항체 단편 또는 항체 유사 단백질은 scFv 또는 scFv-Fc일 수 있다.

전술된 바와 같이 뮤린, 낙타, 인간 또는 인간화된 항체, 항체 단편 또는 항체 유사 단백질은 마우스 단일클론 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11 항체로부터 유래하고 마우스 단일클론 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11 항체에 대한 적어도 80%, 90% 또는 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. CDR1 및 CDR2의 중쇄 가변 영역은 서열목록에서 본원에 기재된 구체적으로 표시된 항체 중쇄 가변 영역 서열에 대한 적어도 90% 또는 95% 또는 98% 서열 동일성을 가질 수 있고, CDR1 및 CDR2의 경쇄 가변 영역은 서열목록 단락에서 본원에 기재된 구체적으로 표시된 항체 중쇄 가변 영역 서열에 대한 적어도 90% 또는 95% 또는 98% 서열 동일성을 가질 수 있다. CDR3의 중쇄 가변 영역은 서열목록에서 본원에 기재된 구체적으로 표시된 항체 중쇄 가변 영역 서열에 대한 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 서열 동일성을 가질 수 있고, CDR3의 경쇄 가변 영역은 서열목록 단락에서 본원에 기재된 구체적으로 표시된 항체 중쇄 가변 영역 서열에 대한 적어도 80% 또는 85% 또는 90% 서열 동일성을 가질 수 있다.

전술된 바에 따른 뮤린, 낙타, 인간 또는 인간화된 항체, 항체 단편 또는 항체 유사 단백질은 서열목록 단락에서 본원에 기재된 구체적으로 표시된 항체 중쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역 및 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역 서열에 대한 적어도 90% 또는 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 상보성 결정 영역(CDR)을 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항-MUC1* 세포외 도메인 항체 또는 항-N-10 항체에 관한 것으로, 이 항체는 인간화된 카파 경쇄 또는 인간화된 람다 경쇄와 쌍을 이루는 인간화된 IgG2 중쇄 또는 인간화된 IgG1 중쇄로 표시되는 서열로 구성된, 앞서 기재된 항체들 중 임의의 항체일 수 있다. 인간화된 IgG2 중쇄는 서열번호 55, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열일 수 있고, 인간화된 IgG1 중쇄는 서열번호 58, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열일 수 있고, 인간화된 카파 경쇄는 서열번호 110, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열일 수 있고, 인간화된 람다 경쇄는 서열번호 114, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항-MUC1* 세포외 도메인 항체 또는 항-N-10 항체에 관한 것으로, 이 항체는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄와 쌍을 이루는 인간 IgG2 중쇄 또는 인간 IgG1 중쇄로 표시되는 서열로 구성된, 앞서 기재된 항체들 중 임의의 항체일 수 있다. 인간 IgG2 중쇄는 서열번호 55, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열일 수 있고, 인간 IgG1 중쇄는 서열번호 58, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열일 수 있고, 인간 카파 경쇄는 서열번호 110, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열일 수 있고, 인간 람다 경쇄는 서열번호 114, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간화된 람다 경쇄 및 인간화된 카파 경쇄와 쌍을 이루는 인간화된 IgG1 중쇄 및 인간화된 IgG2 중쇄로 표시되는 인간화된 MNC2의 서열로 구성된 항-MUC1* 세포외 도메인 항체 또는 항-N-10 항체에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간화된 람다 경쇄 또는 인간화된 카파 경쇄와 쌍을 이루는 인간화된 IgG1 중쇄 또는 인간화된 IgG2 중쇄로 표시되는 인간화된 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 서열로 구성된 항-MUC1* 세포외 도메인 항체 또는 항-N-10 항체에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 PSMGFR 펩티드로부터 유래한 펩티드의 서브세트와의 동일하거나 매우 유사한 결합 패턴을 갖거나, 또한 선형 에피토프를 인식하지 않거나, NME1 또는 NME7_AB와 MUC1*의 결합을 경쟁적으로 억제하거나, MMP9에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1 막횡단 절단 생성물을 인식하거나, MNE6, MNC2, MN18G12, MN20A10, MN25E6, MN28F9, MN5C6F3, MN3C2B1 및 MN1E4 CDR 컨센서스 서열과 적어도 80% 상동한 CDR 서열을 함유한다는 점에서 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11과 "유사"한 항체에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 절단 생성물일 수 있는, 탠덤 반복부 도메인을 결여하는 MUC1의 세포외 도메인에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 항체는 QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)의 서열을 가진 펩티드에 결합한다. 본 발명의 한 측면에서, 항체는 ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)의 서열을 가진 펩티드에 결합한다. 본 발명의 한 측면에서, 항체는 SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)의 서열을 가진 펩티드에 결합한다. 본 발명의 한 측면에서, 항체는 FPFSAQSGA(N-36)의 서열을 가진 펩티드에 결합한다. 이러한 항체의 예는 단일클론 항체 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 이 항체들에 대한 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 서열은 서열목록 단락에서 본원에 기재되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, 이 항체들 중 하나 이상은 암으로 진단받거나 암을 발생시킬 위험이 있는 환자에게 투여된다. 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 항체는 뮤린 또는 낙타 항체일 수 있다. 항체는 2가 또는 1가 항체일 수 있다. 항체는 항체들 중 한 항체의 단일 쇄 단편인 scFv를 비롯한 단편일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 환자에게 직접 투여될 수 있거나 다중특이적 항체 유사 분자, 이중특이적 항체, 이중특이적 T 세포 인게이저인 BiTE, 또는 항체 약물 접합체인 ADC 내로 통합될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 T 세포 수용체인 TCR 내로 통합될 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 서열은 키메라 항원 수용체인 "CAR" 또는 다른 유사한 물질 내로 통합된 후, 생체외에서 면역 세포 내로 도입된 다음, 암으로 진단받거나 암을 발생시킬 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다. T 세포 또는 천연 킬러 세포일 수 있는 면역 세포는 기증자 또는 환자로부터 유래할 수 있다. 한 측면에서, 면역 세포는 시험관내에서 그 면역 세포 유형으로 분화하도록 유도된 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 면역 세포는 시험관내에서 그 면역 세포 유형으로 분화하도록 유도된 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 항체의 서열을 함유하는 CAR은 줄기 세포에서 발현되고, 이어서 이 줄기 세포는 면역 세포로 분화될 수 있다. 한 경우, 면역 세포는 T 세포이다. 또 다른 경우, 면역 세포는 NK 세포이다. 한 측면에서, 항체, 또는 항체의 서열을 함유하는 CAR은 유도성 프로모터로부터 발현될 수 있다. 한 경우, 항체 또는 CAR은 T 세포 또는 다른 면역 세포의 활성화 시 발현된다. 한 예에서, 본 발명의 항체 또는 CAR은 NFAT 반응 요소로부터 발현된다. 또 다른 예에서, 표적 종양 세포의 CAR 인식은 면역 세포를 활성화시켜, IL-12 또는 IL-18과 같은 사이토카인의 NFAT 유도성 발현, 또는 PD1 억제제 또는 PDL-1 억제제와 같은 체크포인트 억제제의 발현을 유발한다. 또 다른 측면에서, 표적 종양 세포의 CAR 인식은 면역 세포를 활성화시켜, 제2 항체의 서열을 함유하는 제2 CAR의 NFAT 유도성 발현을 유발한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 전술된 바에 따라 NME 단백질과 MUC1*의 결합을 억제하는 N-10 펩티드에 결합하는 뮤린, 낙타, 인간, 인간화된 항-MUC1* 항체 또는 항체 단편 또는 항체 유사 단백질에 관한 것이다. NME는 NME1, NME6, NME7_AB, NME7-X1, NME7 또는 NME8일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 링커를 통해 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고 MUC1* 세포외 도메인에 결합하는 항체의 CDR을 추가로 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)에 관한 것이다. CDR은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11로부터 유래할 수 있다. scFv는 서열번호 233, 235 또는 237(MNE6); 서열번호 238 내지 243, 654 및 655 또는 5017 내지 5020(MNC2); 서열번호 1574 내지 1581 또는 5001 내지 5012(20A10); 서열번호 1573 또는 1813(3C2B1); 서열번호 1385 또는 1815(5C6F3); 서열번호 1599 또는 1601(25E6)을 가진 scFv일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 탠덤 반복부를 결여하는 MUC1의 세포외 도메인에 결합하는 scFv 또는 인간화된 가변 영역, 링커 분자, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. 단일 쇄 항체 단편은

(i) MUC1의 PSMGFR 영역;

(ii) PSMGFR 펩티드;

(iii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)(서열번호 3)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(iv) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)(서열번호 4)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(v) NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)(서열번호 5)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vi) ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)(서열번호 6)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vii) SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)(서열번호 7)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(viii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)(서열번호 8)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(ix) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)(서열번호 9)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(x) FPFSAQSGA(N-36)(서열번호 10)의 아미노산 서열을 가진 펩티드

에 결합할 수 있다.

전술된 바와 같은 CAR에서, 상기 제시되고 기재된 가변 영역들 중 임의의 가변 영역의 일부, 또는 이들의 조합은 CAR의 세포외 도메인에 사용될 수 있다. CAR은 막횡단 영역, 및 면역 시스템 활성화 신호를 보내는 서열 모티프를 포함하는 세포질 꼬리도 포함한다. 세포외 도메인은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11의 뮤린, 낙타, 인간, 비-인간 또는 인간화된 단일 쇄 항체 단편으로 구성될 수 있다. 단일 쇄 항체 단편을 만드는 데 사용될 수 있는 추가 항체는 PSMGFR 펩티드로부터 유래한 펩티드의 서브세트와의 동일하거나 매우 유사한 결합의 패턴을 갖거나, 선형 에피토프를 인식할 수 없거나 NME1 또는 NME7_AB와 MUC1*의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있거나, MMP9에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1 막횡단 절단 생성물을 인식하거나, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11 CDR 컨센서스 서열과 적어도 80% 상동한 CDR 서열을 함유한다는 점에서 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11과 유사한 단일클론 항체들을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.

전술된 바와 같은 CAR에서, 세포외 도메인은 서열번호 233, 235 또는 237로서 기재된 MNE6 scFv, MNC2 scFv(서열번호 239, 241, 243, 655 또는 5017 내지 5020), 서열번호 1575, 1577, 1579, 1581 또는 5001 내지 5012로서 기재된 20A10 scFv, 서열번호 1573 또는 1813으로서 기재된 3C2B1 scFv, 서열번호 1385 또는 1815로서 기재된 5C6F3 scFv, 또는 서열번호 1599 또는 1601로서 기재된 25E6 scFv의 뮤린, 낙타, 인간, 비-인간 또는 인간화된 단일 쇄 항체 단편을 포함할 수 있다.

항체를 인간화하는 과정에서, 다양한 기능적 영역, 예컨대, 상보성 결정 영역(CDR), 프레임워크 영역 및 불변 영역을 식별하기 위해 서열에 주석을 달아야 한다. 특정 서열을 CDR, 프레임워크 영역 및 불변 영역으로 배정하는 다양한 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 한 영역이 끝나고 다음 영역이 시작되는 정확한 위치는 이용된 프로그램에 따라 몇몇 아미노산에 의해 상이할 수 있다. 전형적으로, 인간화된 단일 쇄 구축물인 scFv는 개재 프레임워크 영역에 의해 지지되는 중쇄 및 경쇄 CDR을 함유하며, 이때 중쇄와 경쇄는 유연한 링커를 통해 연결된다. 프레임워크 영역 IV로 배정된 서열은 이용된 주석달기 프로그램에 따라 불변 영역 내로 확장될 수 있다. 일부 경우, 프레임워크 영역 IV의 확장은 더 많은 안정성을 scFv에게 제공할 수 있다. 여기서, 본 발명자들은 본 발명의 인간화된 scFv에 대한 서열을 제공하고, 이때 경쇄의 프레임워크 영역 IV의 길이는 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우, 프레임워크 영역 IV의 C-말단은 아미노산 R, T로 끝난다. 다른 경우, 이 말단은 R만으로 끝난다. 다른 경우, 말단 R 및 T 둘 다가 누락된다. 본원에 기재된 CAR에서, 세포외 도메인은 MNE6 scFv(서열번호 5014 또는 5016), MNC2 scFv(서열번호 5018 또는 5020), 또는 20A10 scFv(서열번호 5002, 5004, 5006, 5008, 5010 또는 5012) 또는 25E6 scFv(서열번호 5030 또는 5032)로서 기재된, 가변 길이를 가진 프레임워크 영역 IV를 가진 뮤린, 낙타, 인간, 비-인간 또는 인간화된 단일 쇄 항체 단편을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 CAR들 중 임의의 CAR에서, 세포질 꼬리는 CD3-제타, CD3-제타-1XX CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICAm-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD5 또는 CD7을 포함하나 이들로 제한되지 않는 신호전달 서열 모티프 및 보조자극 도메인들 중 하나 이상으로 구성될 수 있다. 추가로, 세포내 신호전달 도메인의 서열은 지속성을 개선하거나 항원 저밀도 종양 세포의 사멸을 개선하기 위해 신호를 약화시키는 돌연변이를 함유할 수 있다. 세포질 꼬리는 신호전달 서열 모티프 및 보조자극 서열 모티프 CD3-제타, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICAm-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD5 또는 CD7 중 하나 이상으로 구성될 수 있다. CAR의 막횡단 및 세포외 힌지 영역은 인접 보조자극 도메인의 서열로부터 유래할 수 있거나 유래하지 않을 수 있다. 예를 들어, 4-1BB 보조자극 도메인을 포함하는 CAR은 CD8 또는 CD28로부터 유래한 막횡단 및 힌지 영역을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, CD28 보조자극 도메인을 포함하는 CAR은 CD28로부터 유래한 막횡단 및 힌지 영역을 가질 수 있다. 앞서 기재된 CAR들 중 임의의 CAR에서, 세포질 꼬리는 신호전달을 약화시키는 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있다. ITAM으로서도 알려진 3개의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프들 중 하나 이상에서 이러한 결실 또는 돌연변이는 CAR 보유 세포의 지속성을 증가시키고 CD62L+ CD45RA- 집단의 증가에 의해 측정된 이들의 분화를 감소시킨다. 이러한 돌연변이는 인산화 및 신호전달을 억제하도록 돌연변이된 티로신을 포함하나 이로 제한되지 않는다(Salter et al, 2018). 또 다른 측면에서, 1개 또는 2개의 ITAM만을 남기면서 1개 또는 2개의 ITAM이 결실된다(Feucht et al 2019). 또 다른 측면에서, 포함된 ITAM 또는 ITAM들의 위치는 보조자극 도메인에 인접한 위치로 이동된다. CAR의 증가된 지속성에 적합한 ITAM 구성은 1XX, X2X, XX3, 12X 및 23X를 포함하나 이들로 제한되지 않고, 이때 숫자 1, 2 또는 3은 ITAM1, ITAM2 또는 ITAM3을 지칭하고 X는 그 ITAM의 결실을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, ITAM1은 1XX로서도 알려진, CAR 구축물에 포함된 유일한 기능적 ITAM이다. 전술된 CAR들 중 임의의 CAR에서, CD3-제타의 ITAM은 신호전달을 억제하거나 약화시키도록 결실될 수 있거나 돌연변이될 수 있다. 전술된 CAR들 중 임의의 CAR에서, 세포질 꼬리의 CD3은 1XX로서 지칭되는 ITAM을 포함하는 ITAM의 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있다(Feucht et al 2019; 서열번호 1796 및 1797). 전술된 CAR들 중 임의의 CAR에서, T 세포는 T 세포 고갈을 억제하는 방법으로서 c-Jun을 과다발현하도록 조작될 수 있다(Lynn et al 2019). 상기 CAR 구축물은 자가 또는 동종이계 세포일 수 있는 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 또는 다른 면역 세포에서 발현될 수 있다. 동종이계 세포는 인간 줄기 세포로부터 유래할 수 있다.

전술된 CAR들 중 임의의 CAR에서, CAR은 서열번호 12, 13, 65, 66, 56, 57, 107, 108, 341, 342, 및 391 내지 394를 포함하나 이들로 제한되지 않는 항체 MNE6, 서열번호 118, 119, 168, 169, 144, 145, 194, 195, 654, 655, 1788 및 1789를 포함하나 이들로 제한되지 않는 항체 MNC2, 서열번호 988, 989, 1004, 1005, 1574 내지 1581, 5001 내지 5012, 1677 및 1687을 포함하나 이들로 제한되지 않는 항체 20A10, 서열번호 1820 내지 1823, 1572, 1573, 1812 및 1813을 포함하나 이들로 제한되지 않는 항체 3C2B1, 서열번호 1816 내지 1819, 1384, 1385, 1814 및 1815를 포함하나 이들로 제한되지 않는 항체 5C6F3, 또는 서열번호 1020, 1021, 1036, 1037, 및 1598 내지 1601을 포함하나 이들로 제한되지 않는 항체 25E6으로부터 유래한 서열을 포함하는 단일 쇄 항체 단편인 scFv를 포함할 수 있고, 이때 CAR 힌지 및 막횡단 서열은 41BB(서열번호 659) 또는 CD28(서열번호 378)일 수 있는 보조자극 도메인을 추가로 포함하는 CD8(서열번호 346 및 서열번호 364) 또는 CD28(서열번호 350 및 서열번호 368)로부터 유래할 수 있고 CD3-제타 신호전달 도메인은 서열번호 661로부터 유래할 수 있거나, 1XX로서 지칭되는 돌연변이를 비롯한 돌연변이를 함유할 수 있다(서열번호 1796 및 1797).

전술된 CAR들 중 임의의 CAR에서, 서열은 CAR MNE6 CD28/CD3z(서열번호 298); CAR MNE6 4-1BB/CD3z(서열번호 301); CAR MNE6 OX40/CD3z(서열번호 617); CAR MNE6 CD28/4-1BB/CD3z(서열번호 304); CAR MNE6 CD28/OX40/CD3z(서열번호 619); CAR MNC2 CD3z(서열번호 607); CAR MNC2 CD8 힌지/막횡단 CD28/CD3z(서열번호 609); CAR MNC2 CD8 힌지/막횡단 4-1BB/CD3z(서열번호 611 및 서열번호 719); CAR MNC2 CD8 힌지/막횡단 4-1BB/1XX(서열번호 1619 및 서열번호 1621); CAR MNC2 CD8 힌지/막횡단 CD28/1XX(서열번호 1623 및 서열번호 1625); CAR MNC2 CD28 힌지/막횡단 CD28/1XX(서열번호 5042 및 서열번호 5044); CAR MNC2 OX40/CD3z(서열번호 613); CAR MNC2 CD28/4-1BB/CD3z(서열번호 307); CAR MNC2 CD28/OX40/CD3z(서열번호 615); CAR 20A10 CD8 힌지/막횡단 4-1BB/CD3z(서열번호 1583 및 서열번호 1585); CAR 20A10 CD8 힌지/막횡단 CD28/CD3z(서열번호 1587 및 서열번호 1589); CAR 20A10 CD8 힌지/막횡단 4-1BB/1XX(서열번호 1591 및 서열번호 1593); CAR 20A10 CD8 힌지/막횡단 CD28/1XX(서열번호 1595 및 서열번호 1597); CAR 20A10 CD28 힌지/막횡단 CD28/CD3z(서열번호 5022 및 서열번호 5024); CAR 20A10 CD28 힌지/막횡단 CD28/1XX(서열번호 5026 및 서열번호 5028); 또는 CAR MNC3 4-1BB/CD3z(서열번호 601)일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 환자로부터 유래할 수 있는 면역 세포일 수 있는 동일한 세포 내로 형질감염된 상이한 세포외 도메인 유닛을 가진 적어도 2개의 CAR을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 제2 CAR의 발현은 유도될 수 있고 제1 CAR에 의한 표적의 인식에 의해 유도될 수 있다. 제2 CAR을 코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 연결될 수 있다. 제2 CAR의 발현은 특히 면역 세포가 표적 종양 세포에 대한 면역 반응을 일으킬 때 발생하는 사건에 의해 유도될 수 있다. CAR들 중 하나 또는 둘 다의 항체 단편은 세포를 MUC1* 양성 종양으로 향하게 할 수 있다. 제1 CAR 및 제2 CAR의 항체 단편은 MUC1이 2개의 상이한 절단 효소에 의해 절단될 때 생성되는 MUC1*에 결합할 수 있다. 유도성 프로모터에 의한 제2 CAR의 발현은 제1 CAR의 항체 단편이 종양의 MUC1 또는 MUC1*와 맞물리거나 결합할 때 유도될 수 있다. 이를 수행하는 한 가지 방법은 NFAT 단백질이 발현되거나 핵으로 전위될 때 또는 NFAT 단백질이 발현되거나 핵으로 전위된 직후 제2 CAR의 발현을 유도하는 것이다. 예를 들어, NFAT 프로모터 영역으로부터 유래한 서열은 제2 CAR에 대한 유전자의 업스트림에 놓인다. 이 방식으로, NFAT 단백질의 프로모터에 결합하는 전사 인자가 NFAT 단백질에 결합하여 이의 전사를 유도하기에 충분한 농도로 존재할 때, 이들은 제2 CAR의 전사를 위해 서열 앞에 조작된 그 동일한 프로모터에도 결합할 것이다. NFAT 단백질은 NFATc2로서도 알려진 NFAT1, NFATc 또는 NFATc1로서도 알려진 NFAT2, NFATc4로서도 알려진 NFAT3, NFATc3으로서도 알려진 NFAT4, 또는 NFAT5일 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, NFAT는 NFATc1, NFATc3 또는 NFATc2이다. 본 발명의 한 측면에서, NFAT는 NFATc1로서도 알려진 NFAT2이다. 서열번호 646은 NFAT2에 대한 업스트림 전사 조절 영역의 핵산 서열을 보여준다. 제2 CAR의 인식 유닛은 항체 단편 또는 펩티드일 수 있으며, 이때 상기 인식 유닛은 NME7, PD-1, PDL-1 또는 체크포인트 억제제에 결합할 수 있다.

적어도 2개의 CAR은 종양 항원 표적화 인식 유닛을 갖지 않는 하나의 CAR을 가질 수 있고 다른 CAR은 종양 항원 표적화 인식 유닛을 가진다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 세포외 도메인 인식 유닛 중 하나는 MUC1* 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 세포외 도메인 인식 유닛 중 하나는 항체 단편일 수 있고 다른 하나는 막횡단 및 신호전달 모티프를 결여할 수 있는 펩티드이고; 이 펩티드는 단일 쇄 항체 단편 또는 항체일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 인식 유닛 중 하나는 PD-1 또는 PDL-1에 결합할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 하나의 세포외 도메인 인식 유닛은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11로 구성된 군으로부터 선택된 항-MUC1* 항체, 항체 단편 또는 scFv이다. 다른 인식 유닛은 CAR일 수 있거나 항-NME7 항체일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 탠덤 반복부를 결여하는 MUC1 분자의 세포외 도메인에 결합하는 세포외 도메인을 가진 CAR을 포함하는 세포에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 MUC1*로 형질감염되었거나 형질도입된 세포에 결합하는 세포외 도메인을 가진 CAR을 포함하는 세포에 관한 것이다. CAR을 포함하는 세포는 면역 시스템 세포, 바람직하게는 T 세포, 천연 킬러 세포(NK), 수지상 세포 또는 비만 세포일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 조작된 항체 유사 단백질에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 임의의 청구항에 따른 항체를, 질환을 앓고 있는 사람에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이때 상기 대상체는 MUC1을 비정상적으로 발현한다. 질환은 암, 예컨대, 유방암, 난소암, 췌장암, 폐암, 결장암, 위암 또는 식도암일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 탠덤 반복부 도메인을 결여하는 MUC1 동형체 또는 절단 생성물의 세포외 도메인에 결합하는 항체로부터 유래한 가변 도메인 단편을 포함하는 항체, 항체 단편 또는 scFv에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합하지만, C-10 펩티드(서열번호 825)에는 결합하지 않는다. 가변 도메인 단편은 마우스 단일클론 항체 MNE6(서열번호 13 및 66) 또는 인간화된 MNE6(서열번호 39 및 94) 또는 MNE6 scFv(서열번호 233, 235 및 237)로부터 유래할 수 있다. 또는, 가변 도메인 단편은 마우스 단일클론 항체 MNC2(서열번호 119 및 169) 또는 인간화된 MNC2(서열번호 145 및 195) 또는 MNC2 scFv(서열번호 239, 241 및 243)로부터 유래할 수 있다. 또는, 가변 도메인은 단일클론 항체 MN18G12, MN20A10, MN25E6, MN28F9, MN5C6F3, MN3C2B1 또는 MN1E4로부터 유래할 수 있다. 이 항체들에 대한 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 서열도 본원의 서열목록에 기재되어 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 전술된 항체, 항체 단편 또는 scFv를 사람에게 투여하는 단계를 포함하는, MUC1 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 사람을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이때 종은 뮤린, 낙타, 인간 또는 인간화된 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 2개의 상이한 scFv 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로, 이때 scFv 서열 중 하나는 탠덤 반복부 도메인을 결여하는 MUC1 동형체 또는 절단 생성물의 세포외 도메인에 결합하는 서열이다. 상기 폴리펩티드는

(i) MUC1의 PSMGFR 영역;

(ii) PSMGFR 펩티드;

(iii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)(서열번호 3)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(iv) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)(서열번호 4)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(v) NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)(서열번호 5)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vi) ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)(서열번호 6)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vii) SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)(서열번호 7)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(viii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)(서열번호 8)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(ix) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)(서열번호 9)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(x) FPFSAQSGA(N-36)(서열번호 10)의 아미노산 서열을 가진 펩티드

에 결합할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 또는 조직의 샘플을 전술된 항체, 항체 단편 또는 scFv-Fc와 접촉시키는 단계 및 상기 항체, 항체 단편 또는 scFv-Fc와 세포의 결합의 존재에 대해 검출하는 단계를 포함하는, MUC1*를 비정상적으로 발현하는 세포의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 세포는 암 세포일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 뮤린, 낙타, 인간 또는 인간화된 항체일 수 있는 본 발명의 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 가변 영역의 일부를 포함하는 조성물을 사용한 치료의 적합성에 대해 대상체의 암을 시험하는 방법으로서, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 환자로부터의 신체 표본을 항체와 접촉시키는 단계, 환자가 정상 조직 또는 표본에 비해 비정상적인 MUC1* 발현을 나타내는지를 확인하는 단계, 및 환자의 암이 상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 작용제를 사용한 치료에 유리하게 반응할 것이라는 결론을 내리는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 이 진단에 사용되는 항체는 조영제에 접합될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체 또는 기증자로부터의 T 세포 또는 NK 세포일 수 있는 면역 세포를 MUC1* 펩티드에 노출시키는 단계, 적응된 T 세포 또는 NK 세포를 생성하는 단계, 및 적응된 세포를 증폭시키고 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 기증자 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이때 T 세포 또는 NK 세포는 다양한 성숙 라운드를 통해 MUC1* 특이적 수용체를 발생시킨다. MUC1* 펩티드는 하기 군으로부터 선택된다:

(i) MUC1의 PSMGFR 영역;

(ii) PSMGFR 펩티드;

(iii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(iv) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(v) NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vi) ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vii) SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(viii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(ix) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(x) FPFSAQSGA(N-36)의 아미노산 서열을 가진 펩티드.

본 발명의 한 측면에서, MUC1 또는 MUC1* 양성 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여되는 항체는 PSMGFR의 N-10 펩티드에 결합하는 그의 능력으로 인해 선택된다. 항체는 1가 항체로서 또는 scFv로서 단독으로 투여될 수 있거나, 항체의 단편은 CAR, BiTE 또는 ADC 내로 통합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, MUC1 또는 MUC1* 양성 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여되는 항체는 QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10) 펩티드에 결합하는 그의 능력으로 인해 선택되고, 이때 FPFSAQSGA(N-36) 서열의 존재는 결합을 위해 요구된다. 항체는 1가 항체로서 또는 scFv로서 단독으로 투여될 수 있거나, 항체의 단편은 CAR, BiTE 또는 ADC 내로 통합될 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, MUC1 또는 MUC1* 양성 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여되는 항체는 MUC1 또는 MUC1*의 선형 에피토프를 인식할 수 없기 때문에 선택된다. 항체는 1가 항체로서 또는 scFv로서 단독으로 투여될 수 있거나, 항체의 단편은 CAR, BiTE 또는 ADC 내로 통합될 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, MUC1 또는 MUC1* 양성 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여되는 항체는 MMP9에 의해 절단된 후 MUC1 막횡단 절단 생성물을 인식하는 그의 능력으로 인해 선택된다. 항체는 항체, 1가 항체, scFv, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체로서 단독으로 투여될 수 있거나, 항체의 단편은 면역 세포에서 발현될 수 있는 BiTE, ADC 또는 CAR 내로 통합될 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, MUC1 또는 MUC1* 양성 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여되는 항체는 NME7_AB 또는 NME7-X1과, 탠덤 반복부를 결여하는 MUC1의 세포외 도메인의 결합을 경쟁적으로 억제하는 그의 능력으로 인해 선택된다. 항체는 항체, 1가 항체, scFv, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체로서 단독으로 투여될 수 있거나, 항체의 단편은 면역 세포에서 발현될 수 있는 BiTE, ADC 또는 CAR 내로 통합될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 체크포인트 억제제와 함께, 전술된 임의의 면역 세포에서 발현된 항체, 항체 단편, BiTE, ADC 또는 CAR을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서, 하기 제시된 항체들 또는 이들의 가변 영역들 중 임의의 항체 또는 이의 가변 영역이 사용될 수 있다: MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11.

상기 방법에서, 하기 설명에 기재된 가변 영역들 중 임의의 가변 영역이 사용될 수 있다:

(i) 인간화된 카파 경쇄 또는 인간화된 람다 경쇄와 쌍을 이루는 인간화된 IgG2 중쇄 또는 인간화된 IgG1 중쇄로 표시되는 인간화된 MN-E6의 서열로 구성된 항-MUC1* 세포외 도메인 항체 또는 항-N-10 항체;

(ii) 인간화된 IgG2 중쇄가 서열번호 53, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열이고, 인간화된 IgG1 중쇄가 서열번호 57, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열이고, 인간화된 카파 경쇄가 서열번호 108, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열이고, 인간화된 람다 경쇄가 서열번호 112, 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열인 (i)의 항체;

(iii) 인간화된 람다 경쇄 및 인간화된 카파 경쇄와 쌍을 이루는 인간화된 IgG1 중쇄 및 인간화 IgG2 중쇄로 표시되는 인간화된 MN-C2의 서열로 구성된 항-MUC1* 세포외 도메인 항체 또는 항-N-10 항체;

(iv) 인간화된 IgG1 중쇄 MN-C2(서열번호 159) 또는 IgG2 중쇄(서열번호 164)가 람다 경쇄(서열번호 219) 또는 카파 경쇄(서열번호 213), 또는 이에 대한 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가진 서열과 쌍을 이루는 것인 (iii)의 항체.

상기 방법에서, CAR에서 세포외 도메인은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 인간화된 단일 쇄 항체 단편으로 구성될 수 있다. 세포외 도메인은 서열번호 233, 235, 또는 237로서 기재된 MN-E6 scFv, 또는 MN-C2 scFv(서열번호 239, 241, 또는 243)의 인간화된 단일 쇄 항체 단편으로 구성될 수 있다. CAR에서, 세포질 꼬리는 CD3-제타-1XX, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICAm-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD5 또는 CD7 및 CD3-제타 또는 변이체 1XX, X2X, XX3, 12X 또는 23X를 포함하나 이들로 제한되지 않는 신호전달 서열 모티프 및 보조자극 도메인 중 하나 이상으로 구성될 수 있다. 추가로, 세포내 신호전달 도메인의 서열은 지속성 또는 표적 세포 사멸을 개선하기 위해 신호를 약화시키는 돌연변이를 함유할 수 있다.

상기 방법은 동일한 세포 내로 형질감염된 상이한 세포외 도메인 유닛을 가진 2개의 CAR을 포함할 수 있다. 세포외 도메인 인식 유닛 중 하나는 MUC1* 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 세포외 도메인 인식 유닛 중 하나는 PD-1에 결합할 수 있다. 세포외 도메인 인식 유닛 중 하나는 항체 단편일 수 있고 다른 하나는 펩티드 또는 항-MUC1* 항체 단편일 수 있다.

방법은 CAR을 코딩하는 플라스미드 및 유도성 프로모터로부터 발현되는 비-CAR 종을 코딩하는 플라스미드로 형질감염되었거나 형질도입된 면역 세포를 포함할 수 있다. 비-CAR 종은 활성화된 면역 세포의 요소에 의해 활성화되는 유도성 프로모터로부터 발현될 수 있다. 비-CAR 종은 NFAT 유도성 프로모터로부터 발현될 수 있다. NFAT는 NFATc1, NFATc3 또는 NFATc2일 수 있다. 절단 효소는 MMP2, MMP3, MMP9, MMP13, MMP14, MMP16, ADAM10, ADAM17 또는 ADAM28, 또는 이의 촉매 활성 단편일 수 있다. 비-CAR 종은 사이토카인일 수 있다. 사이토카인은 IL-7, IL-12, IL-15 또는 IL-18일 수 있다.

본 발명은 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 이의 단편에 관한 것으로, 이때 이 항체는 PSMGFR 펩티드(서열번호 2) 또는 이 펩티드의 단편에 특이적으로 결합한다.

항체는 N-10 펩티드(서열번호 3), N-19 펩티드(서열번호 4), N-23 펩티드(서열번호 5), N-26 펩티드(서열번호 6), N-30 펩티드(서열번호 7), N-10/C-5 펩티드(서열번호 8), N-19/C-5 펩티드(서열번호 9), 또는 C-5 펩티드(서열번호 825)에 결합한다.

항체는 N-26 서열 ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6) 내의 입체구조적 에피토프 SVSDV(서열번호 1751) 및 FPFSA(서열번호 1747)를 포함하는 펩티드와 상호작용하고, 이때 FPFS(서열번호 1747)의 돌연변이 또는 결실은 항체 또는 이의 단편과 N-26 펩티드의 결합을 파괴한다.

항체는 N-19 서열 ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 4) 내의 입체구조적 에피토프 ASRYNLT(서열번호 1745), SVSDV(서열번호 1751) 및 FPFSA(서열번호 1747)를 포함하는 펩티드와 상호작용하고, 이때 ASRYNLT(서열번호 1745)의 돌연변이 또는 결실은 항체 또는 이의 단편과 N-26 펩티드의 결합을 파괴한다.

항체는 C-10 펩티드(서열번호 825)에 결합하지 않는다.

항체는 N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합하나, C-10 펩티드(서열번호 825)에는 결합하지 않는다.

항체는 NME7_AB와 MUC1* 사이의 상호작용을 억제한다.

항체는 NME7_AB와 PSMGFR 펩티드(서열번호 2) 사이의 상호작용을 억제한다.

항체는 NME7_AB와 N-10 펩티드(서열번호 3), N-19 펩티드(서열번호 4), N-23 펩티드(서열번호 5), N-26 펩티드(서열번호 6), N-30 펩티드(서열번호 7), N-10/C-5 펩티드(서열번호 8), N-19/C-5 펩티드(서열번호 9) 또는 C-5 펩티드(서열번호 825) 사이의 상호작용을 억제한다.

항체는 MUC1 막횡단 효소 절단 생성물을 인식한다.

상기 설명에서, 절단 효소는 MMP14 또는 MMP9, 또는 이 효소의 촉매 활성 단편이다.

항체는 PSMGFR(서열번호 2) 또는 이의 단편에 결합하고, 이때 PSMGFR(서열번호 2) 내의 아미노산 서열의 존재는 항체와 PSMGFR의 결합을 유도한다.

결합 입체구조적 유도 펩티드의 아미노산 서열은 N-10 펩티드(서열번호 3)에 존재한다.

항체는 결합 입체구조적 유도 펩티드 서열의 선형 형태에 결합하지 않고, 이때 상기 펩티드의 선형 형태는 변성된 형태이다.

결합 입체구조적 유도 펩티드 서열은 N-26 펩티드 서열 ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6) 내에 있고, 이때 FPFS(서열번호 1747)의 돌연변이 또는 결실은 항체 또는 이의 단편과 N-26 펩티드의 결합을 파괴한다.

결합 입체구조적 유도 펩티드 서열은 N-19 서열 ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 4) 내에 위치하고, 이때 ASRYNLT(서열번호 1745)의 돌연변이 또는 결실은 항체 또는 이의 단편과 N-19 펩티드의 결합을 파괴한다.

결합 유도 펩티드 서열은 N-26 서열 ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6) 내에 위치할 수 있고, 이때 FPFS(서열번호 1747) 내의 돌연변이 또는 결실은 항체 또는 이의 단편과 PSMGFR의 결합을 파괴한다.

항체는 컨센서스 서열을 가질 수 있다.

중쇄 CDR1은 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 F 또는 I, 위치 2에서 T, 위치 3에서 F, 위치 4에서 S, 위치 5에서 T, G 또는 R, 위치 6에서 Y, 위치 7에서 A, G 또는 T, 위치 8에서 M, 및 위치 9에서 S;

중쇄 CDR2는 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 T, 위치 2에서 I 또는 S, 위치 3에서 I 또는 S, 위치 5에서 G 또는 R, 위치 6에서 G 또는 A, 위치 9에서 T 또는 I, 위치 10에서 Y, 위치 11에서 Y, 위치 12에서 P 또는 S, 및 위치 13 내지 17에서 DSVKG;

중쇄 CDR3은 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 2에서 G, L 또는 N, 위치 4에서 G 또는 T, 위치 7에서 Y, 위치 12에서 D 또는 E, 위치 14에서 A, 및 위치 15에서 Y;

경쇄 CDR1은 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 K 또는 R, 위치 2에서 A 또는 S, 위치 3에서 S, 위치 4에서 K 또는 Q, 위치 5에서 S, 위치 6에서 L 또는 V, 위치 7에서 L, 위치 10에서 T 또는 S, 위치 15에서 Y, 및 위치 16에서 I, L 또는 M;

경쇄 CDR2는 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 L 또는 W, 또는 S, 위치 2에서 A 또는 T, 위치 3에서 S, 위치 4에서 N 또는 T, 위치 5에서 L 또는 R, 위치 6에서 E 또는 A, 및 위치 7에서 S;

경쇄 CDR3은 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함한다: 위치 1에서 Q, 위치 2에서 H 또는 Q, 위치 3에서 S, Q 또는 R, 위치 4에서 R, S 또는 Y, 위치 5에서 E, L 또는 S, 위치 6에서 L 또는 S, 위치 7에서 P 또는 S, 위치 8에서 F 또는 L, 및 위치 9에서 T.

N-26 서열 ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6)를 가진 펩티드 내의 입체구조적 에피토프에 결합하는 항체에서, FPFS(서열번호 1747), SVSDV(서열번호 1751) 또는 ASRYNLT(서열번호 1745) 내의 돌연변이 또는 결실은 항체 또는 이의 단편과 PSMGFR의 결합을 파괴한다.

항체는 추가 컨센서스 서열을 가질 수 있고, 이때

중쇄 CDR1은 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 F 또는 I, 위치 2에서 T 또는 A, 위치 3에서 F, 위치 4에서 S, 위치 5에서 T, G 또는 R, 위치 6에서 Y 또는 F, 위치 7에서 A, G 또는 T, 위치 8에서 M, 및 위치 9에서 S;

중쇄 CDR2는 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 T 또는 A, 위치 2에서 I 또는 S, 위치 3에서 I 또는 S, 위치 4에서 N, S, T 또는 G, 위치 5에서 G 또는 R, 위치 6에서 G 또는 A, 위치 7에서 G, T 또는 D, 위치 8에서 Y, K, H 또는 S, 위치 9에서 T 또는 I, 위치 10에서 Y 또는 F, 위치 11에서 Y, 위치 12에서 P 또는 S, 및 위치 13에서 D, 위치 14에서 S 또는 T, 위치 15에서 V 또는 L, 및 위치 16 및 17에서 KG;

중쇄 CDR3은 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 2에서 G, L 또는 N, 위치 3에서 G, T 또는 Y, 위치 4에서 G 또는 T, 위치 7에서 Y, 위치 10에서 Y, A 또는 G, 위치 11에서 M, D 또는 F, 위치 12에서 D 또는 E, 및 위치 14 및 15에서 AY;

경쇄 CDR1은 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 K 또는 R, 위치 2에서 A 또는 S, 위치 3에서 S 또는 R, 위치 8에서 S, Y, I 또는 V, 위치 10에서 T 또는 S, 위치 12에서 G, S, D 또는 Q, 위치 13에서 V, Y, K 또는 N, 위치 14에서 N, S 또는 T, 위치 15에서 Y 또는 F, 및 위치 16에서 I, L 또는 M;

경쇄 CDR2는 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 2에서 A, T 또는 V, 위치 3에서 S, 위치 4에서 N, T 또는 K, 위치 5에서 L 또는 R, 위치 6에서 E, A, F 또는 D, 및 위치 7에서 S;

경쇄 CDR3은 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함한다: 위치 1에서 Q, F 또는 W, 위치 2에서 H 또는 Q, 위치 4에서 R, S, T, Y 또는 N, 위치 5에서 E, L, S 또는 H, 위치 6에서 L, S, V, D 또는 Y, 위치 7에서 P 또는 S, 및 위치 9에서 T.

상기 항체는

컨센서스 서열 FTFSGYAMS를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 TISSGGTYIYYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 -LGGDNYYEYFDV--를 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 RASKS--VSTSGYSYMH를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 LASNLES를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 QHSRELPFT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 MNC2;

컨센서스 서열 FTFSRYGMS를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 TISGGGTYIYYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 DNYGRNYDYGMDY--를 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 -------SATSSVSYIH를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 STSNLAS를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 QQRSSSPFT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 MNE6;

컨센서스 서열 FAFSTFAMS를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 AISNGGGYTYYPDTLKG를 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 ----RYYDLYFDL--을 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 RSSQNIV-HSNGNTYLE를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 KVSNRFS를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 FQDSHVPLT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 B2;

컨센서스 서열 FTFSRYGMS를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 TISSGGTYIYYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 DNYGSSYDYAMDY--를 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 RSSQTIV-HSNGNTYLE를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 KVSNRFS를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 FQDSHVPLT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 B7;

컨센서스 서열 FTFSRYGMS를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 TISSGGTYIYYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 DNYGSSYDYAMDY--를 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 -------SASSSVSYMH를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 TTSNLAS를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 QQRSSYPF-를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 B9;

컨센서스 서열 FTFSTYAMS를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 AISNGGGYTYYPDSLKG를 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 ----RYYDHYFDY--를 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 --RASESVATYGNNFMQ를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 LASTLDS를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 QQNNEDPPT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 8C7F3;

컨센서스 서열 FAFSTFAMS를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 AISNGGGYTYYPDTLKG를 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 ----RYYDLYFDL--을 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 RSSQNIV-HSNGNTYLE를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 KVSNRFS를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 FQDSHVPLT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 H11;

컨센서스 서열 SYGVH를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 VIWPGGSTNYNSTLMSRM을 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 DRTPRVGAWFAY를 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 RASESVATYGNNFMQ를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 LASTLDS를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 QQNNEDPPT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 B12;

컨센서스 서열 FTFSTYAMS를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 -SIGRAGSTYYSDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 ---GPIYNDYDEFAY를 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 KSSQSVLYSSNQKNYLA를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 WASTRES를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 HQYLSSLT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 20A10; 또는

컨센서스 서열 ITFSTYTMS를 포함하는 중쇄 CDR1,

컨센서스 서열 TISTGGDKTYYSDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2,

컨센서스 서열 -GTTAMYYYAMDY를 포함하는 중쇄 CDR3,

컨센서스 서열 RASKS---ISTSDYNYIH를 포함하는 경쇄 CDR1,

컨센서스 서열 LASNLES를 포함하는 경쇄 CDR2, 및

컨센서스 서열 QHSRELPLT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 3C2B1

일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 PSMGFR(서열번호 2)의 항체 결합 입체구조적 유도 펩티드 ASRYNLT(서열번호 1745)의 존재를 필요로 하는, 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 상기 항체는

컨센서스 서열 FTFSSYGMS를 포함하는 중쇄 CDR1;

컨센서스 서열 TISNGGRHTFYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2;

컨센서스 서열 QTGTEGWFAY를 포함하는 중쇄 CDR3;

컨센서스 서열 KSSQSLLDSDGKTYLN을 포함하는 경쇄 CDR1;

컨센서스 서열 LVSKLDS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및

컨센서스 서열 WQGTHFPQT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 25E6일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 PSMGFR(서열번호 2)의 항체 결합 입체구조적 유도 펩티드 SVSDV(서열번호 1761)의 존재를 필요로 하는, 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 상기 항체는

컨센서스 서열 FTFSTYAMS를 포함하는 중쇄 CDR1;

컨센서스 서열 AISNGGGYTYYPDSLKG를 포함하는 중쇄 CDR2;

컨센서스 서열 RYYDHYFDY를 포함하는 중쇄 CDR3;

컨센서스 서열 RSSQTIVHSNGNTYLE를 포함하는 경쇄 CDR1;

컨센서스 서열 KVSNRFS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및

컨센서스 서열 FQDSHVPLT를 포함하는 경쇄 CDR3

을 가진 5C6F3일 수 있다.

모든 상기 설명에 따른 항체 또는 이의 단편은 뮤린, 낙타, 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 항체 단편은 scFv 또는 scFv-Fc일 수 있으며, 이의 가변 영역은 뮤린, 낙타, 인간 또는 인간화된 가변 영역일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항체 단편을 포함하고 보조자극 도메인 내의 돌연변이, 또는 CD3-제타 신호전달 도메인의 ITAM 중 1개 또는 2개의 ITAM의 돌연변이 또는 결실을 추가로 포함할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. 티로신은 CD28 또는 4-1BB에서 돌연변이될 수 있다. CD3-제타는 단일 ITAM, 예컨대, 1XX로서도 알려진 ITAM1, X2X로서도 알려진 ITAM2, 또는 XX3으로서도 알려진 ITAM3만을 함유할 수 있다. 또 다른 측면에서, CD3-제타는 2개의 ITAM을 함유할 수 있고, 이때 ITAM의 위치는 보다 가까운 위치, 예컨대, 12X 또는 23X로 이동될 수 있다(Feucht et al 2019). 또 다른 측면에서, 1개 또는 2개의 ITAM의 티로신은 신호전달을 약화시키도록 돌연변이될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, CD3-제타 도메인은 1XX이다. 1XX 돌연변이의 예는 서열번호 1796 및 1797로 예시된 돌연변이를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 CAR을 포함하는 면역 세포에 관한 것이다. 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 또는 비만 세포일 수 있다. 한 측면에서, 면역 세포는 시험관내에서 그 면역 세포 유형으로 분화하도록 유도된 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 항체의 서열을 함유하는 CAR은 나중에 면역 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포에서 발현된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 CAR, 및 CAR의 특이성과 상이한 특이성을 가진 생물학적 인식 유닛을 가진 제2 물질을 포함하는, 세포에서 발현된 세포 조성물에 관한 것이다. 제2 물질은 PD-1, PDL-1 또는 다른 체크포인트 억제제, 또는 NME7, 또는 사이토카인, 예컨대, IL-12 또는 IL-18, 또는 c-Jun에 결합할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 CAR을 코딩하는 핵산 및 상기 청구항들 중 어느 한 항의 제2 물질을 코딩하는 핵산을 발현하도록 조작된 면역 세포에 관한 것으로, 이때 제2 물질은 유도성 프로모터로부터 발현된다. 제2 물질은 활성화된 면역 세포의 요소에 의해 활성화되는 유도성 프로모터로부터 발현될 수 있다. 제2 물질은 NFAT 유도성 프로모터로부터 발현될 수 있다. NFAT는 NFATc1, NFATc3 또는 NFATc2일 수 있다. 제2 물질은 IL-7, IL-15 또는 IL-18과 같은 사이토카인일 수 있다. 제2 물질을 코딩하는 핵산은 Foxp3 프로모터 또는 인핸서 영역에 삽입될 수 있으며, 이때 사이토카인은 IL-18이다. 사이토카인은 NFAT 유도성 프로모터로부터 발현될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항체 단편을 포함하는 BiTE 구축물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)에 관한 것이다.

본 발명은 특이적으로

(i) PSMGFR(서열번호 2) 및 N-10(서열번호 3)에 결합하고, 전체 길이 MUC1에 결합하지 않거나;

(ii) C-10(서열번호 825)에 결합하지 않거나;

(iii) NME1 또는 NME7_AB와 MUC1* 세포외 도메인 또는 PSMGFR 펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하거나;

(iv) 절단 효소에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1*를 인식하거나;

(v) 입체구조적 에피토프를 인식하고 선형 에피토프를 인식하지 않거나;

(vi) 조직에 대한 면역조직화학에 의해 암 선택적인

항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.

기준 (i) 내지 (vi) 중 4개가 충족될 수 있다. 기준 (i) 내지 (vi) 중 5개가 충족될 수 있다. 기준 (i) 내지 (vi) 중 6개가 충족될 수 있다. 적어도 기준 (vi)이 충족될 수 있다. 절단 효소는 MMP-9일 수 있다.

상기 설명 모두에서, 암은 유방암, 췌장암, 난소암, 폐암, 결장암, 위암 또는 식도암일 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 항체 및 단편을, MUC1을 비정상적으로 발현하고 절두된 MUC1, 예컨대, MUC1*를 발현하는 것으로서 확인된, 암의 진단, 치료 또는 예방을 필요로 하는 암 환자에게 투여함으로써 암을 진단하거나, 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 이 목적 및 다른 목적은 본 발명의 하기 설명, 본 명세서에 첨부된 참조 도면 및 본 명세서에 첨부된 청구범위로부터 더 완전히 이해될 것이다.

특허 또는 출원 파일은 유색으로 제작된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 유색 도면을 가진 이 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 특허청에 의해 제공될 것이다.
본 발명은 단지 예시로서 제공되므로 본 발명을 제한하지 않는, 아래에 제공된 상세한 설명 및 첨부 도면으로부터 더 완전히 이해될 것이다.
도 1a 내지 1d는 2가 'bv' 항-MUC1* 항체, 1가 'mv' 또는 Fab, NM23-H1 이량체 또는 NME7-AB로 처리된 MUC1* 양성 세포의 세포 생장 어세이 그래프를 보여준다. 2가 항-MUC1* 항체는 암 세포의 생장을 자극하는 반면, 1가 Fab는 생장을 억제한다(도 1a 및 1b). 고전적인 종 모양의 곡선은 리간드에 의해 유도된 이량체화가 생장을 자극함을 표시한다. NME1로서도 알려진 이량체 NM23-H1은 MUC1* 양성 암 세포의 생장을 자극하지만, MUC1 발현을 억제하는 siRNA는 그의 효과를 제거한다(도 1c). NME7-AB도 MUC1* 양성 세포의 생장을 자극한다(도 1d).
도 2a 내지 2i는 ELISA 어세이의 결과를 보여준다. MUC1* 펩티드 PSMGFR, N-말단으로부터 10개의 아미노산이 제거된 PSMGFR(N-10으로서도 알려짐), 또는 C-말단으로부터 10개의 아미노산이 제거된 PSMGFR(C-10으로서도 알려짐)을 플레이트에 고정하고 결합에 대해 NME7-AB(도 2a), MNC2 단일클론 항체(도 2b), MNE6 단일클론 항체(도 2c) 또는 이량체 NME1(도 2d)을 어세이한다. 이 어세이는 NME1, NME7-AB 및 단일클론 항체 MNC2 및 MNE6 모두가 결합하기 위해 MUC1* 세포외 도메인의 첫 번째 막 근위 10개 아미노산을 필요로 함을 보여준다. N-말단으로부터 10개의 아미노산이 제거된 MUC1* 펩티드 PSMGFR(N-10으로서도 알려짐), 또는 C-말단으로부터 10개의 아미노산이 제거된 PSMGFR(C-10으로서도 알려짐)을 플레이트에 고정하고, MNC3(도 2e) 및 MNC8(도 2f)을 결합에 대해 어세이한다. 도 2g는 PSMGFR 펩티드의 아미노산 서열을 보여준다. 도 2h는 N-10 펩티드의 아미노산 서열을 보여준다. 도 2i는 C-10 펩티드의 아미노산 서열을 보여준다.
도 3a 내지 3c는 경쟁 ELISA 어세이의 결과를 보여준다. PSMGFR MUC1* 펩티드를 플레이트에 고정하고 이량체 NM23-H1(NME1로서도 알려짐)을 단독으로 첨가하거나, MNE6 항체가 첨가된 후에 첨가한다(도 3a). 동일한 실험을 수행하였는데, 이때 NM23-H7, 즉 NME7-AB를 단독으로 첨가하거나, MNE6 항체가 첨가된 후에 첨가한다(도 3b). 결과는 MNE6이 MUC1* 활성화 리간드 NME1 및 NME7의 결합을 경쟁적으로 억제함을 보여준다. 유사한 실험(도 3c)에서, PSMGFR 또는 N-말단으로부터 10개의 아미노산이 제거된 PSMGFR(N-10으로서도 알려짐)을 플레이트에 고정한다. 그 다음, 이량체 NM23-H1을 첨가한다. 이어서, 항-MUC1* 항체 MNE6, MNC2, MNC3 또는 MNC8을 NM23-H1과 경쟁하는 그들의 능력에 대해 시험한다. 결과는 3개의 항체 모두가 PSMGFR 펩티드에 결합하지만, MNE6 및 MNC2가 MUC1* 활성화 리간드의 결합을 경쟁적으로 억제함을 보여준다.
도 4a 내지 4f는 MUC1* 양성 암 세포 및 MUC1* 형질감염된 세포에 특이적으로 결합하지만 MUC1* 또는 MUC1 음성 세포에는 결합하지 않는 항-MUC1* 항체 huMNC2 scFv의 FACS 스캔을 보여준다. ZR-75-1(1500으로서도 알려짐) MUC1* 양성 유방암 세포를 1.5 ㎍/㎖ 인간화된 MNC2의 1:2 또는 1:10 희석물로 염색하였다. 2회 세척 후, 세포를 1:200(도 4a), 1:50(도 4b) 또는 1:10(도 4c)의 알렉사(Alexa) 488(Qiagen) 희석물에 접합된 이차 항체인 항-펜타-His 항체로 염색하여, huMNC2 scFv에서 6x His 태그를 검출하였다. 도 4a는 이차 항체가 1:200 희석비로 첨가된 경우 huMNC2와 ZR-75-1 유방암 세포의 결합을 보여준다. 도 4b는 이차 항체가 1:50 희석비로 첨가된 경우 huMNC2와 ZR-75-1 유방암 세포의 결합을 보여준다. 도 4c는 이차 항체가 1:10 희석비로 첨가된 경우 huMNC2와 ZR-75-1 유방암 세포의 결합을 보여준다. 유세포분석은 MNC2 scFv의 부재 하에 관찰되지 않는, 특이적 결합을 표시하는, 세포의 서브세트의 농도 의존적 이동을 보여주었다(도 4a 내지 4c). 도 4d는 빈 벡터로 형질감염된 MUC1 음성 HCT-116 결장암 세포인 단일 세포 클론 #8의 항-MUC1* 항체 MNE6 염색을 보여준다. 도 4e는 MUC1*로 형질감염된 HCT-116 결장암 세포인 단일 세포 클론 #10의 항-MUC1* 항체 MNE6 염색을 보여준다. 도 4f는 ZR-75-1(1500으로서도 알려짐) MUC1* 양성 유방암 세포의 항-MUC1* 항체 MNE6 염색을 보여준다. FACS 스캔이 보여주는 바와 같이, MNC2 및 MNE6 둘 다가 MUC1* 양성 세포만을 염색하고 MUC1 또는 MUC1* 음성 세포를 염색하지 않는다.
도 5는 표면이 MUC1* PSMGFR 펩티드 또는 대조군 펩티드로 코팅된 ELISA의 그래프를 보여준다. 그 다음, 인간화된 MNC2 scFv를 표준 방법에 따라 표면과 함께 인큐베이션하고 세척하고 검출한다. ELISA는 huMNC2 scFv가 약 333 nM의 EC-50으로 MUC1* 펩티드에 결합함을 보여준다.
도 6a 및 6b는 MUC1* 항체 가변 영역 단편 인간화된 MNC2 scFv에 의한 암 세포 생장 억제의 그래프를 보여준다. hMNC2 scFv는 시험관내 ELISA와 거의 동일한 EC-50으로 ZR-75-1(1500으로서도 알려짐) MUC1* 양성 유방암 세포(도 6a) 및 T47D MUC1* 양성 유방암 세포(도 6b)의 생장을 강하게 억제하였다.
도 7a 및 7b는 인간 종양이 이식된 후 항-MUC1* 항체 MNE6 Fab 또는 모의 치료로 치료받은 면역손상된 마우스에서의 종양 성장의 그래프를 보여준다. 매트리겔(Matrigel)과 50/50으로 혼합된 6백만 개의 T47D 인간 유방암 세포를, 90일 에스트로겐 펠릿이 이식된 암컷 nu/nu 마우스에 이식하였다. 적어도 150 mm³이고 종양 부피가 3회 연속적으로 증가된 종양을 보유하는 마우스를 치료를 위해 선택하였다. 80 mg/kg MNE6 Fab를 동물에게 주당 2회 피하 주사하였고, 비히클만을 동일한 선택 기준에 맞는 동등한 수의 마우스에 주사하였다(도 7a). 매트리겔과 50/50으로 혼합된 6백만 개의 DU-145 인간 전립선암 세포를 수컷 NOD/SCID 마우스에 이식하였다. 적어도 150 mm³이고 종양 부피가 3회 연속적으로 증가된 종양을 가진 마우스를 치료를 위해 선택하였다. 160 mg/kg MNE6 Fab를 동물에게 48시간마다 피하 주사하였고, 비히클만을 동일한 선택 기준에 맞는 동등한 수의 마우스에 주사하였다(도 7b). 2명의 연구원들이 독립적으로 종양을 주당 2회 측정하고 기록하였다. 독립적인 통계학자가 블라인드 방식으로 통계자료를 계산하여, 각각에 대해 0.0001의 P 값을 제공하였다. 항-MUC1* Fab는 유방암 성장 및 전립선암 성장을 억제하였다. 치료는 체중, 골수 세포 유형 또는 수에 영향을 미치지 않았다.
도 8은 표면이 PSMGFR 펩티드, 또는 N-말단으로부터 10개의 아미노산이 제거되었거나 C-말단으로부터 10개의 아미노산이 제거된 PSMGFR로 고정된 ELISA의 그래프를 보여준다. huMNE6 scFv-Fc는 PSMGFR 펩티드 및 PSMGFR N-10 펩티드에 결합하였으나, PSMGFR C-10 펩티드에는 결합하지 않았다. 모 MNE6 항체 및 인간화된 MNE6은 결합을 위해 PSMGFR의 C-말단 10개 아미노산을 필요로 한다.
도 9a 및 9b는 어세이 플레이트 표면이 PSMGFR 펩티드, 또는 N-말단으로부터 10개의 아미노산이 제거되었거나 C-말단으로부터 10개의 아미노산이 제거된 PSMGFR로 고정된 ELISA의 그래프를 보여준다. 이어서, MNC3 항체 변이체를 다양한 MUC1* 펩티드와의 결합에 대해 어세이하였다. 도 9a는 정제된 마우스 단일클론 MNC3 항체를 보여주고; 도 9b는 인간화된 MNC3 scFv-Fc를 보여준다. ELISA는 PSMGFR 펩티드뿐만 아니라 특정 결실 펩티드에도 결합함을 보여준다.
도 10a 내지 10j. 도 10a 및 10b는 유방암 조직 어레이의 사진이다. 도 10a는 MUC1-FL(전체 길이)을 인식하는 VU4H5로 염색되었고; 도 10b는 암성 MUC1*를 인식하는 마우스 단일클론 항체 MNC2로 염색되었다. 자동 염색(Clarient Diagnostics) 후, 강도 점수와 분포 점수를 합하는 Allred 점수화 방법을 이용하여 조직 염색을 점수화하였다. 도 10c 내지 10f는 각각의 환자의 조직에 대한 MUC1 전체 길이 염색에 대해 계산된 점수를 보여주는 색상 코딩된 그래프이다. 도 10g 내지 10j는 각각의 환자의 조직에 대한 MUC1* 염색에 대해 계산된 점수를 보여주는 색상 코딩된 그래프이다.
도 11a 내지 11j. 도 11a 및 11b는 유방암 조직 어레이의 사진이다. 도 11a는 MUC1-FL(전체 길이)을 인식하는 VU4H5로 염색되었고; 도 11b는 암성 MUC1*를 인식하는 마우스 단일클론 항체 MNC2로 염색되었다. 자동 염색(Clarient Diagnostics) 후, 강도 점수와 분포 점수를 합하는 Allred 점수화 방법을 이용하여 조직 염색을 점수화하였다. 도 11c 내지 11f는 각각의 환자의 조직에 대한 MUC1 전체 길이 염색에 대해 계산된 점수를 보여주는 색상 코딩된 그래프이다. 도 11g 내지 11j는 각각의 환자의 조직에 대한 MUC1* 염색에 대해 계산된 점수를 보여주는 색상 코딩된 그래프이다.
도 12a 내지 12h는 2.5 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 바이오티닐화된 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 스트렙타비딘 HRP 항체로 염색된 정상 유방 및 유방암 조직의 사진을 보여준다. 도 12a는 정상 유방 조직이다. 도 12b 내지 12d는 도면에 표시된 환자의 유방암 조직이다. 도 12e 내지 12h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 13a 내지 13f는 2.5 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 바이오티닐화된 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 스트렙타비딘 HRP 항체로 염색된 정상 유방 및 유방암 조직의 사진을 보여준다. 도 13a는 정상 유방 조직이다. 도 13b 및 13c는 도면에 표시된 환자의 유방암 조직이다. 도 13d 내지 13f는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 14a 내지 14h는 10 ㎍/㎖의 MNE6 항-MUC1* 항체로 염색된 후 토끼 항-마우스 이차 HRP 항체로 염색된 유방암 조직의 사진을 보여준다. 도 14a 내지 14d는 환자 #300의 유방암 조직이다. 도 14e 내지 14h는 전이성 환자 #291의 유방암 조직이다.
도 15a 내지 15f는 2.5 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 바이오티닐화된 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 스트렙타비딘 HRP 항체로 염색된 정상 폐 및 폐암 조직의 사진을 보여준다. 도 15a는 정상 폐 조직이다. 도 15b 및 15c는 도면에 표시된 환자의 폐암 조직이다. 도 15d 내지 15f는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 16a 내지 16f는 2.5 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 바이오티닐화된 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 스트렙타비딘 HRP 항체로 염색된 정상 폐 및 폐암 조직의 사진을 보여준다. 도 16a는 정상 폐 조직이다. 도 16b 및 16c는 도면에 표시된 환자의 폐암 조직이다. 도 16d 내지 16f는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 17a 내지 17f는 25 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 바이오티닐화된 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 스트렙타비딘 HRP 항체로 염색된 정상 폐 및 폐암 조직의 사진을 보여준다. 도 17a는 정상 폐 조직이다. 도 17b 및 17c는 도면에 표시된 환자의 폐암 조직이다. 도 17d 내지 17f는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 18a 내지 18f는 25 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 바이오티닐화된 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 스트렙타비딘 HRP 항체로 염색된 정상 폐 및 폐암 조직의 사진을 보여준다. 도 18a는 정상 폐 조직이다. 도 18b 및 18c는 도면에 표시된 환자의 폐암 조직이다. 도 18d 내지 18f는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 19a 내지 19d는 5 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 바이오티닐화된 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 스트렙타비딘 HRP 항체로 염색된 정상 소장 및 암 소장 조직의 사진을 보여준다. 도 19a는 정상 소장 조직이다. 도 19b는 도면에 표시된 환자의 소장암이다. 도 19c 및 19d는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 20a 내지 20h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 정상 소장 조직의 사진을 보여준다. 도 20a 내지 20d는 정상 소장 조직이다. 도 20e 내지 20h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 21a 내지 21h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 암성 소장 조직의 사진을 보여준다. 도 21a 내지 21d는 도면에 표시된 환자의 암성 소장 조직이다. 도 21e 내지 21h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 22a 내지 22h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 암성 소장 조직의 사진을 보여준다. 도 22a 내지 22d는 도면에 표시된 환자의 암성 소장 조직이다. 도 22e 내지 22h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 23a 내지 23h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 정상 결장 조직의 사진을 보여준다. 도 23a 내지 23d는 정상 결장이다. 도 23e 내지 23h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 24a 내지 24h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 결장암 조직의 사진을 보여준다. 도 24a 내지 24d는 도면에 표시된 전이성 환자의 결장암 조직이다. 도 24e 내지 24h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 25a 내지 25h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 결장암 조직의 사진을 보여준다. 도 25a 내지 25d는 도면에 표시된 등급 2 환자의 결장암 조직이다. 도 25e 내지 25h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 26a 내지 26h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 결장암 조직의 사진을 보여준다. 도 26a 내지 26d는 도면에 표시된 전이성 환자의 결장암 조직이다. 도 26e 내지 26h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 27a 내지 27h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 전립선암 조직의 사진을 보여준다. 도 27a 내지 27d는 도면에 표시된 환자의 전립선암 조직이다. 도 27e 내지 27h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 28a 내지 28h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 전립선암 조직의 사진을 보여준다. 도 28a 내지 28d는 도면에 표시된 환자의 전립선암 조직이다. 도 28e 내지 28h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 29a 내지 29h는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 다음, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 전립선암 조직의 사진을 보여준다. 도 29a 내지 29d는 도면에 표시된 환자의 전립선암 조직이다. 도 29e 내지 29h는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.
도 30a 내지 30f는 항-MUC1* 항체 huMNC2scFv로 염색된 삼중 음성 유방암 어레이의 사진을 보여준다. 표시된 첫 번째 점수는 Allred 점수이고 두 번째는 종양 등급이다. 0, 약함, 중간 또는 강함으로 점수화된 어레이의 퍼센트는 파이(pie) 차트로서 그래프로 작성되어 있다. 도 30a는 항-MUC1* 항체 염색 점수의 파이 차트를 보여준다. 도 30b는 항체로 염색된 어레이의 사진을 보여준다. 도 30c 및 30d는 어레이로부터의 유방암 표본들 중 2개의 유방암 표본의 확대된 사진을 보여준다. 도 30e 및 30f는 상자로 표시된 표본의 일부의 더 확대된 사진을 보여준다.
도 31a 내지 31f는 항-MUC1* 항체 huMNC2scFv로 염색된 난소암 어레이의 사진을 보여준다. 표시된 첫 번째 점수는 Allred 점수이고 두 번째는 종양 등급이다. 0, 약함, 중간 또는 강함으로 점수화된 어레이의 퍼센트는 파이 차트로서 그래프로 작성되어 있다. 도 31a는 항-MUC1* 항체 염색 점수의 파이 차트를 보여준다. 도 31b는 항체로 염색된 어레이의 사진을 보여준다. 도 31c 및 31d는 어레이로부터의 유방암 표본들 중 2개의 유방암 표본의 확대된 사진을 보여준다. 도 31e 및 31f는 상자로 표시된 표본의 일부의 더 확대된 사진을 보여준다.
도 32a 내지 32f는 항-MUC1* 항체 huMNC2scFv로 염색된 췌장암 어레이의 사진을 보여준다. 표시된 첫 번째 점수는 Allred 점수이고 두 번째는 종양 등급이다. 0, 약함, 중간 또는 강함으로 점수화된 어레이의 퍼센트는 파이 차트로서 그래프로 작성되어 있다. 도 32a는 항-MUC1* 항체 염색 점수의 파이 차트를 보여준다. 도 32b는 항체로 염색된 어레이의 사진을 보여준다. 도 32c 및 32d는 어레이로부터의 유방암 표본들 중 2개의 유방암 표본의 확대된 사진을 보여준다. 도 32e 및 32f는 상자로 표시된 표본의 일부의 더 확대된 사진을 보여준다.
도 33a 내지 33f는 항-MUC1* 항체 huMNC2scFv로 염색된 폐암 어레이의 사진을 보여준다. 표시된 첫 번째 점수는 Allred 점수이고 두 번째는 종양 등급이다. 0, 약함, 중간 또는 강함으로 점수화된 어레이의 퍼센트는 파이 차트로서 그래프로 작성되어 있다. 도 33a는 항-MUC1* 항체 염색 점수의 파이 차트를 보여준다. 도 33b는 항체로 염색된 어레이의 사진을 보여준다. 도 33c 및 33d는 어레이로부터의 유방암 표본들 중 2개의 유방암 표본의 확대된 사진을 보여준다. 도 33e 및 33f는 상자로 표시된 표본의 일부의 더 확대된 사진을 보여준다.
도 34a 내지 34i는 항-MUC1* 항체 huMNC2scFv로 염색된 정상 조직의 사진을 보여준다.
도 35a 내지 35d는 MUC1, MUC1* 또는 전체 길이 MUC1을 발현하지 않는 세포의 FACS 스캔을 보여주는 것으로, 이때 이 세포는 MNC2 또는 VU4H5로 프로빙되었다. 도 35a는 항체 MNC2로 프로빙된 MUC1 음성 HCT-116 결장암 세포를 보여준다. 도 35b는 MUC1*로 형질감염된 HCT 세포를 보여주는 것으로, 이때 세포외 도메인은 단지 PSMGFR 펩티드의 서열이고, 상기 세포는 항체 MNC2로 프로빙된다. 도 35c는 본원에서 HCT-MUC1-41TR로서도 지칭되는, 전체 길이 MUC1로 형질감염된 HCT 세포의 절단 내성 단일 세포 클론인 HCT-MUC1-18 세포를 보여주고, 세포는 항체 MNC2로 프로빙되었다. 도 35d는 전체 길이 MUC1에서 수백 개의 탠덤 반복부 에피토프를 인식하는 항체인 항체 VU4H5로 프로빙된 HCT-MUC1-18 세포를 보여준다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, MNC2는 전체 길이 MUC1에서 접근될 수 없는 이소성 에피토프를 인식한다.
도 36a 내지 36d는 MUC1* 또는 전체 길이 MUC1로 안정적으로 형질감염된, MUC1 음성 결장암 세포주인 HCT-116 세포의 웨스턴 블롯 및 상응하는 FACS 분석을 보여준다. 표시되어 있는 단일 세포 클론은 HCT-MUC1-41TR 및 HCT-MUC1*이다. 도 36a는 모 세포주 HCT-116, HCT-MUC1-41TR 및 HCT-MUC1*의 웨스턴 블롯을 보여주는 것으로, 이때 겔은 절단된 MUC1만을 인식하는 토끼 다중클론 항체인 SDIX로 프로빙되었다. 25 내지 35 kDa의 가시적 밴드는 HCT-MUC1*가 로딩된 레인 6에서 쉽게 관찰될 수 있는 반면, 레인 4 및 5에서는 희미한 밴드만이 있고, 이것은 소량의 MUC1만이 HCT-MUC1-41Tr 세포에서 절단됨을 보여준다. 레인 2 및 3에 로딩된 모 세포주 HCT-116에는 절단된 MUC1이 존재하지 않는다. 도 36b는 전체 길이 MUC1의 탠덤 반복부를 인식하는 마우스 단일클론 항체 VU4H5로 프로빙된 웨스턴 블롯이다. 볼 수 있는 바와 같이, HCT-MUC1-41TR만이 전체 길이 MUC1을 함유한다. 도 36c는 HCT-MUC1*가 MUC1*에만 결합하고 본질적으로 전체 길이 MUC1에는 전혀 결합하지 않는 SDIX에 대해 95.7% 양성임을 보여주는 FACS 스캔을 보여준다. 도 36d는 HCT-MUC1-41TR 세포가 전체 길이 MUC1에 대해 95% 양성이고 절단된 형태인 MUC1*에 대해 단지 약 11% 양성임을 보여주는 FACS 스캔을 보여준다.
도 37a 내지 37c는 MMP9에 의해 절단된 후 전체 길이 MUC1을 인식하는 MNC2의 능력을 평가하는 웨스턴 블롯 및 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 37a는 절단 효소 MMP9가 첨가된, 절단 내성 세포주인 HCT-MUC1-18 세포의 웨스턴 블롯을 보여준다. 세포 용해물 분획을 겔에서 런닝시키고 다중클론 항-PSMGFR 항체로 프로빙하였다. 사진은 MMP9가 용량 의존적 방식으로 MUC1을 약 25 kDa 종인 MUC1*로 절단하였음을 보여준다. 도 37b는 동일한 실험으로부터 컨디셔닝 배지의 웨스턴 블롯을 보여준다. 사진은 절단 효소 MMP9의 첨가가 용량 의존적 방식으로 컨디셔닝 배지로의 탠덤 반복부 도메인의 방출을 증가시켰음을 보여준다. 도 37c는 실험의 FACS 분석을 보여준다. 그래프는 MMP9의 첨가가 용량 의존적 방식으로 항-MUC1* 항체 MNC2에 의한 절단 생성물의 인식을 증가시켰고 탠덤 반복부 도메인을 함유하는 전체 길이 MUC1의 인식을 감소시켰음을 보여준다.
도 38은 전체 길이 MUC1로 형질감염된 HCT 세포의 절단 내성 단일 세포 클론인, 본원에서 HCT-18로서 표지된 HCT-MUC1-18 세포를 다양한 양의 촉매 활성 ADAM17 또는 MMP14로 처리한 웨스턴 블롯의 사진을 보여준다. 전체 길이 MUC1의 떨어져 나간 MUC1 탠덤 반복부 도메인을 컨디셔닝 배지로부터 면역침전시키고 겔에서 런닝시킨 후, 이 겔을 탠덤 반복부 에피토프에 결합하는 VU4H5로 프로빙한다. 볼 수 있는 바와 같이, MMP14도 전체 길이 MUC1을 효율적으로 절단하고 탠덤 반복부 함유 세포외 도메인을 컨디셔닝 배지 내로 떨어뜨린다. 절단 효소 ADAM17은 MUC1을 절단하지 않았다.
도 39a 및 39b는 항-MUC1* 단일클론 항체 MNC3, MNC2, MNE6 또는 이소타입 대조군 항체로 염색된 인간 골수의 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 측정을 보여준다. FACS 어세이의 히스토그램 및 데이터를 보여주는 막대 그래프는 골수의 MUC1* 양성 세포가 하나의 항-MUC1* 항체인 MNC3에 의해 인식되지만, MNE6 또는 MNC2에 의해서는 인식되지 않음을 보여준다. 세 항체 모두가 PSMGFR 펩티드에 결합한다. 이 항체들의 특이성의 큰 차이는 MNC3이 MUC1이 MMP9와 상이한 효소에 의해 절단될 때 생성된 MUC1* 유사 형태를 인식함을 암시한다.
도 40a 내지 40g는 MNC3 또는 MNE6으로 프로빙된 조혈 줄기 세포의 FACS 분석의 세부사항을 보여준다. 도 40a는 총 골수 세포의 FACS 산점도를 보여준다. 도 40b는 CD34+ 세포의 FACS 산점도를 보여준다. 도 40c는 CD34+ 세포의 FACS 히스토그램을 보여준다. 도 40d는 MNC3 또는 MNE6으로 염색된, CD34+/CD38-인 초기 조혈 줄기 세포의 FACS 산점도를 보여준다. 도 40e는 실험의 히스토그램을 보여준다. 도 40f는 MNE6에 비해 MNC3과 CD34+/CD38- 세포의 결합의 히스토그램 중첩을 보여준다. 도 40g는 그 FACS 실험의 막대 그래프를 보여준다.
도 41a 내지 42h는 다중클론 항-PSMGFR 항체 SDIX, MNE6 또는 MNC2로 프로빙된 CD34+/CD38^-/lo 조혈 줄기 세포의 FACS 분석의 세부사항을 보여준다. 도 41a는 CD34+/CD38^-/lo 세포 집단의 FACS 산점도를 보여준다. 도 41e는 상세한 분석의 표를 보여준다. 도 41b는 항-PSMGFR 다중클론 항체 SDIX로 프로빙된 CD34+/CD38^-/lo 세포 집단의 FACS 산점도를 보여준다. 도 41f는 상세한 분석의 표를 보여준다. 도 41c는 MNE6으로 프로빙된 CD34+/CD38^-/lo 세포 집단의 FACS 산점도를 보여준다. 도 41g는 상세한 분석의 표를 보여준다. 도 41d는 MNC2로 프로빙된 CD34+/CD38^-/lo 세포 집단의 FACS 산점도를 보여준다. 도 41h는 상세한 분석의 표를 보여준다.
도 42a 내지 42h는 항-MUC1* 항체 MNC2, MNE6, MNC3 또는 MNC8의 Fab로 처리된 DU145 전립선암 세포 또는 T47D 유방암 세포의 사진을 보여준다. 이미지는 암 특이적 항체 MNC2 및 MNE6이 전립선암 및 유방암 세포를 효과적으로 사멸시키는 반면, 단일클론 항체 MNC3 및 MNC8은 그렇지 않음을 보여준다.
도 43은 상이한 세포주에서 발현된 광범위한 절단 효소의 발현을 비교하는 PCR 실험의 그래프를 보여주는 것으로, 이때 값은 유방암 세포주 T47D에서 발현된 값으로 정규화되었다. 비교되는 세포주는 전립선암 세포주 DU145, 세포외 도메인이 41개의 탠덤 반복부 유닛 뒤에서 절두되어 있고 MUC1* 형태로 절단되지 않은 MUC1로 형질감염된 MUC1 음성 결장암 세포주인 HCT-MUC1-41TR, T47D 유방암 세포주 및 CD34+ 골수 세포이다.
도 43은 DU145 전립선암 세포, 전체 길이 MUC1을 발현하는 세포주인 HCT-MUC1-18로서도 알려진 HCT116+MUC1FL, T47D 유방암 세포, 및 골수의 CD34+ 조혈 줄기 세포에서 다양한 절단 효소들의 발현 수준을 측정하는 PCR 실험의 그래프를 보여준다. 배수 발현은 1로서 설정된, T47D 유방암 세포에서의 각각의 절단 효소의 발현에 비해 상대적인 값이다.
도 44는 Y축 최대값이 5로 설정된 것을 제외하고 도 43의 PCR 실험의 그래프를 보여준다.
도 45a 내지 45p는 CAR의 표적화 항체 단편이 huMNC2scFv인 CAR T 공-배양 어세이의 사진을 보여주는 것으로, 이때 CAR44는 CD8 막횡단 도메인에 이어서 41BB-3제타를 갖고, CAR50은 CD4 막횡단 도메인에 이어서 41BB-3제타를 가진다. 표적 암 세포는 MUC1*₄₅로 형질감염된 HCT-116 세포인 HCT-FLR, 및 41개의 탠덤 반복부 뒤에서 절두된 세포외 도메인을 갖고 자체적으로 MUC1* 형태로 절단되지 않는 MUC1을 발현하는 안정한 단일 세포 클론 HCT-116 세포주인 HCT-MUC1-41TR이다. HCT-MUC1-41TR 암 세포를 또한 MMP9 또는 ADAM17로 형질감염된 세포로부터의 컨디셔닝 배지와 함께 인큐베이션한 후, CAR T 세포와 공-배양하였다. MMP9 또는 ADAM17 발현 세포의 컨디셔닝 배지를 또한 이러한 절단 효소의 활성제인 APMA와 함께 인큐베이션하였다. 제시된 이미지는 4X 명시야 이미지와, 적색 CMTMR 친유성 염료로 염색된 암 세포를 보여주는 동일한 시야의 형광 이미지의 중첩이다. 도 45a, 45e, 45i, 45m은 형질도입되지 않은 인간 T 세포와 공-배양된 세포의 사진을 보여준다. 도 45b, 45f, 45j, 45n은 10의 MOI에서 항-MUC1* CAR44로 형질도입된 인간 T 세포와 공-배양된 세포의 사진을 보여준다. 도 45c, 45g, 45k, 45o는 10의 MOI에서 항-MUC1* CAR50으로 형질도입된 인간 T 세포와 공-배양된 세포의 사진을 보여준다. 도 45d, 45h, 45l, 45p는 형질도입 효율을 증가시키는, 50의 MOI에서 항-MUC1* CAR44로 형질도입된 인간 T 세포와 공-배양된 세포의 사진을 보여준다. 도 45b, 45c, 45d는 CAR44가 형질도입된 T 세포 및 CAR50이 형질도입된 T 세포 둘 다가 이 암 세포들에서 발현된 MUC1*를 인식하였고 이들에 결합하였고, 클러스터링을 유도하였고 많은 암 세포들을 사멸시켰음을 보여준다. 도 45f, 45g, 45h는 CAR44가 형질도입된 T 세포 및 CAR50이 형질도입된 T 세포 둘 다가 HCT-MUC1-41TR 암 세포에서 발현된 전체 길이 MUC1을 인식하지 않음을 보여준다. T 세포 유도 클러스터링은 없으며 암 세포의 수는 감소하지 않았다. 도 45j, 45k, 45l은 활성화된 MMP9가 전체 길이 MUC1을, CAR44이 형질도입된 T 세포 및 CAR50이 형질도입된 T 세포 둘 다에 의해 인식되는 MUC1* 형태로 절단하였음을 보여준다. 명확하게 가시적인 CAR T 세포 유도 클러스터링이 있고 암 세포가 사멸됨에 따라 암 세포 수의 감소가 있다. 도 45n, 45o, 45p는 활성화된 ADAM17이 MUC1을 절단하지 않았거나 MNC2에 의해 인식되지 않는 위치에서 MUC1을 절단하였음을 보여준다. huMNC2-CAR44가 형질도입된 T 세포 및 huMNC2-CAR50이 형질도입된 T 세포 둘 다가 이 암 세포들을 인식하지 않았다.
도 46a 내지 46t는 CAR의 표적화 항체 단편이 MNC2 scFv인 CAR T 공-배양 어세이의 사진을 보여주는 것으로, 이때 CAR44는 CD8 막횡단 도메인에 이어서 41BB-3제타를 갖고, CAR50은 CD4 막횡단 도메인에 이어서 41BB-3제타를 가진다. 표적 암 세포는 MMP2, MMP9 또는 ADAM17로 형질감염된 세포로부터의 컨디셔닝 배지와 함께 인큐베이션된 후 MNC2-CAR T 세포와 함께 공-배양된 유방암 T47D 세포이다. 일부 경우, MMP2 및 MMP9 발현 세포의 컨디셔닝 배지도 이 절단 효소들의 활성제인 APMA와 함께 인큐베이션하였다. 제시된 이미지는 4X 명시야 이미지와, 적색 CMTMR 친유성 염료로 염색된 암 세포를 보여주는 동일한 시야의 형광 이미지의 중첩이다. 볼 수 있는 바와 같이, MNC2-CAR T 세포는 절단된 형태인 MUC1*를 발현하는 표적 암 세포에만 결합하고 이를 공격한다.
도 47a 내지 47i는 항-MUC1* CAR T 세포와 공-배양된 암 세포의 사진을 보여주는 것으로, 이때 암 세포의 일부를 활성화된 MMP9와 사전인큐베이션한 후 CAR T 세포와 공-배양하였다. 도 47a 내지 47c에 나타낸 암 세포는 MUC1*를 발현하도록 안정적으로 형질감염된 MUC1 음성 결장암 세포주 HCT-116이다. 도 47d 내지 47f에 나타낸 암 세포는 전체 길이 MUC1 및 MUC1* 둘 다를 높은 수준으로 발현하는 MUC1 양성 유방암 세포주 T47D이다. 도 47g 내지 47i에 나타낸 암 세포는 활성화된 MMP9와 사전인큐베이션된 MUC1 양성 유방암 세포주 T47D이다. 도 47a, 47d 및 47g에 나타낸 세포는 형질도입되지 않은 인간 T 세포와 공-배양되었고 대조군이다. 도 47b, 47e 및 47h에 나타낸 세포는 10의 MOI에서 huMNC2-CAR44로 형질도입된 인간 T 세포와 공-배양되었으며, 이때 MOI는 감염 다중도를 의미하고 MOI가 높을수록 더 많은 CAR이 T 세포에서 발현된다. 도 47c, 47f 및 47i에 나타낸 세포는 50의 MOI에서 huMNC2-CAR44로 형질도입된 인간 T 세포와 공-배양되었다. 사진에서 볼 수 있는 바와 같이, CAR44 T 세포는 표적 MUC1* 양성 암 세포에 결합하여 주변을 둘러싸고 이 암 세포를 사멸시킨다. 도 47i의 사진을 다른 사진들과 비교하면, MMP9와 사전인큐베이션된 세포는 CAR의 항체 표적화 헤드가 MUC1*를 인식할 때 CAR T 사멸에 훨씬 더 민감해지는 것을 알 수 있다. 이것은 MMP9에 의해 절단된 MUC1이 huMNC2scFv에 의해 인식된다는 것도 입증한다.
도 48은 45시간 동안 대조군인 형질도입되지 않은 T 세포 또는 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 T47D 유방암 세포의 xCelligence 그래프를 보여준다. 18시간의 암 세포 생장 후, 촉매 서브유닛 MMP9를 일부 세포에 첨가하였다. 25시간에서, T 세포를 첨가하였다. 확인할 수 있는 바와 같이, huMNC2-CAR44 T 세포 사멸은 T47D 세포가 절단 효소 MMP9와 함께 사전인큐베이션될 때 크게 개선된다. xCelligence 시스템에서, 부착성을 띠는 표적 암 세포를 전극 어레이 플레이트에 플레이팅한다. 부착성 세포는 전극을 절연하고 임피던스를 증가시킨다. 부착성 암 세포의 수는 임피던스에 정비례한다. T 세포는 부착성을 띠지 않으며 임피던스에 기여하지 않는다. 따라서, 임피던스의 증가는 암 세포의 생장을 반영하고 임피던스의 감소는 암 세포의 사멸을 반영한다.
도 49는 45시간 동안 대조군인 형질도입되지 않은 T 세포 또는 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 DU145 전립선암 세포의 xCelligence 그래프를 보여준다. 18시간의 암 세포 생장 후, 촉매 서브유닛 MMP9를 일부 세포에 첨가하였다. 25시간에서, T 세포를 첨가하였다. 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CAR44 T 세포 사멸은 절단 효소 MMP9와의 사전인큐베이션에 의해 영향을 받지 않는다. DU145 암 세포는 MUC1*뿐만 아니라 전체 길이 형태도 포함하는 훨씬 더 적은 양의 MUC1을 발현한다. 전체 길이 MUC1의 낮은 밀도는 T 세포가 막 근위 MUC1*에 접근하는 것을 입체적으로 방해하지 않는다.
도 50은 정상 세포 및 암 세포로 구성된, 세포주 및 일차 세포의 패널에 의해 발현된 MUC1의 양을 측정하는 PCR 실험의 막대 그래프를 보여준다.
도 51a 및 51b는 72시간 동안 정상 세포 또는 HCT-MUC1* 암 세포와 공-배양한 후 huMNC2-CAR44 인간 T 세포에 의해 분비된 인터페론 감마인 IFN-g의 양을 측정하는 ELISA 어세이의 막대 그래프를 보여준다. 도 51a는 CAR44 T 세포 대 표적 세포 비가 1:1인 실험의 결과를 보여준다. 도 51b는 CAR44 T 세포 대 표적 세포 비가 0.5:1인 실험의 결과를 보여준다.
도 52a 및 52b는 72시간 동안 정상 세포 또는 HCT-MUC1* 암 세포와 공-배양한 후 huMNC2-CAR44 인간 T 세포에 의해 분비된 인터류킨-2인 IL-2의 양을 측정하는 ELISA 어세이의 막대 그래프를 보여준다. 도 52a는 CAR44 T 세포 대 표적 세포 비가 1:1인 실험의 결과를 보여준다. 도 52b는 CAR44 T 세포 대 표적 세포 비가 0.5:1인 실험의 결과를 보여준다.
도 53a 내지 53j는 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 생존 마커 대 사멸 마커의 FACS 분석의 막대 그래프 및 정상 세포 대 암 세포의 사진을 보여준다. 도 53a.1은 HCT-MUC1* 암 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53a.2 및 53a.3은 도 53a.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다. 도 53b.1은 MCF-12A 정상 유방 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53b.2 및 도 53b.3은 도 53b.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다. 도 53c.1은 THLE-3 정상 간 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53c.2 및 53c.3은 도 53c.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다. 도 53d.1은 T/G HA-HSMC 정상 심장 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53d.2 및 도 53d.3은 도 53d.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다. 도 53e.1은 Hs1.Tes 정상 고환 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53e.2 및 도 53e.3은 도 53E.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다. 도 53f.1은 HEK-293 MUC1 음성 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53f.2 및 도 53f.3은 도 53f.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다. 도 53g.1은 HRCE 정상 신장 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53g.2 및 도 53g.3은 도 53g.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다. 도 53h.1은 CCD-18Lu 정상 폐 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53h.2 및 도 53h.3은 도 53h.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다. 도 53i.1은 HBEC-5i 정상 뇌 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53i.2 및 도 53i.3은 도 53i.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다. 도 53j.1은 Hs.738.St/Int 정상 위 및 장 세포를 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양한 후 살아있는 세포 대 사멸된 세포의 FACS 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 53j.2 및 도 53j.3은 도 53j.1에 기재된 실험의 사진을 보여준다.
도 54는 각각의 환자에 대해 원발성 종양으로부터의 표본과 그 환자의 전이로부터의 표본이 있는 유방암 조직 어레이의 사진을 보여준다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 대부분 전이는 원발성 종양보다 더 많은 MUC1*를 발현한다.
도 55a 내지 55h는 다양한 어세이에 의해 측정되었을 때 MUC1* 양성 DU145 전립선암 세포에 대한 huMNC2-CAR44 T 세포의 세포독성 효과를 보여준다. 도 55a는 전립선암 세포와 공-배양된 형질도입되지 않은 T 세포의 형광 사진이며, 이때 그랜자임 B는 적색 형광단으로 염색된다. 도 55b는 DAPI와 그랜자임 B의 병합을 보여준다. 도 55c는 전립선암 세포와 공-배양된 huMNC2-CAR44 T 세포의 형광 사진이고, 이때 그랜자임 B는 적색 형광단으로 염색된다. 도 55d는 DAPI와 그랜자임 B의 병합을 보여준다. 도 55e는 암 세포와 함께 인큐베이션된 형질도입되지 않은 T 세포에 대한 형광 표지된 그랜자임 B에 대한 FACS 스캔이다. 도 55f는 암 세포와 함께 인큐베이션된 huMNC2-CAR44 T 세포에 대한 형광 표지된 그랜자임 B의 양성 증가를 보여주는 FACS 스캔이다. 도 55g는 평균 형광 강도의 그래프이다. 도 55h는 huMNC2-CAR44 T 세포(청색 추적선)에 의한 DU145 암 세포의 실시간 사멸을 추적하는 xCELLigence 스캔이고, 형질도입되지 않은 T 세포(녹색)에 의한 실시간 사멸은 없다.
도 56a 내지 56h는 다양한 어세이에 의해 측정되었을 때 MUC1* 양성 CAPAN-2 췌장암 세포에 대한 huMNC2-CAR44 T 세포의 세포독성 효과를 보여준다. 도 56a는 췌장암 세포와 공-배양된 형질도입되지 않은 T 세포의 형광 사진이며, 이때 그랜자임 B는 적색 형광단으로 염색된다. 도 56b는 DAPI와 그랜자임 B의 병합을 보여준다. 도 56c는 췌장암 세포와 공-배양된 huMNC2-CAR44 T 세포의 형광 사진이고, 이때 그랜자임 B는 적색 형광단으로 염색된다. 도 56d는 DAPI와 그랜자임 B의 병합을 보여준다. 도 56e는 암 세포와 함께 인큐베이션된 형질도입되지 않은 T 세포에 대한 형광 표지된 그랜자임 B에 대한 FACS 스캔이다. 도 56f는 암 세포와 함께 인큐베이션된 huMNC2-CAR44 T 세포에 대한 형광 표지된 그랜자임 B의 양성 증가를 보여주는 FACS 스캔이다. 도 56g는 평균 형광 강도의 그래프이다. 도 56h는 huMNC2-CAR44 T 세포(청색 추적선)에 의한 CAPAN-2 암 세포의 실시간 사멸을 추적하는 xCELLigence 스캔이고, 형질도입되지 않은 T 세포(녹색)에 의한 실시간 사멸은 없다.
도 57a 내지 57c는 huMNC2-CAR44 T 세포에 의한 MUC1* 양성 암 세포의 실시간 사멸을 추적하는 xCELLigence 스캔을 보여주는 것으로, MUC1* 음성 세포는 실시간 사멸되지 않는다. 도 57a는 huMNC2-CAR44 T 세포가 MUC1*로 안정적으로 형질감염된 HCT 결장암 세포를 효과적으로 사멸시킴을 보여준다. 도 57b는 huMNC2-CAR44 T 세포가 전체 길이 MUC1로 안정적으로 형질감염된 MUC1 음성 암 세포인 HCT-MUC1-41TR에 거의 영향을 미치지 않음을 보여준다. 이 세포주에서 세포의 약 10%만이 MUC1*로 절단된 MUC1을 가진다. 도 57c는 huMNC2-CAR44 T 세포가 MUC1 음성 결장암 세포주인 HCT-116 세포에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
도 58a 내지 58f는 마우스를 치료하지 않거나, PBS, 형질도입되지 않은 인간 T 세포 또는 huMNC2-CAR44 T 세포로 치료한 후 종양 세포로부터의 광자 방출을 측정하는 IVIS 기기에서 NOD/SCID/GAMMA 마우스의 사진을 보여준다. 루시퍼라제 양성을 띠게 만들어진 HCT-MUC1* 종양 세포를 마우스에게 피하 주사하였다. IVIS 사진을 촬영하기 십(10)분 전, 루시퍼라제 기질인 루시페린을 마우스의 복강내(ip) 공간에 주사하였다. 도 58a는 인산염 완충 식염수인 PBS로만 치료받은 종양 보유 마우스를 보여준다. 도 58b는 형질도입되지 않은 T 세포로만 치료받은 종양 보유 마우스를 보여준다. 도 58c는 단일 용량의 huMNC2-CAR44 T 세포로 치료받은 종양 보유 마우스를 보여준다. 도 58d는 이미지의 색상 스케일을 보여준다. 도 58e는 실험의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 보여준다. 도 58f는 희생 후 마우스 혈액으로부터 단리된 인간 T 세포의 분자 구성을 상세히 보여주는 표를 보여준다.
도 59a 내지 59c는 마우스를 치료하지 않거나, PBS 또는 huMNC2-CAR44 T 세포로 치료한 후 종양 세포로부터의 광자 방출을 측정하는 IVIS 기기에서 NOD/SCID/GAMMA 마우스의 사진을 보여준다. T47D-wt 유방암 세포, 또는 세포의 95%가 훨씬 더 많은 MUC1*로 안정적으로 형질감염된 T47D 세포인 혼합된 세포 집단인 T47D+more MUC1*를 마우스에게 피하 주사하였다. T47D-wt 및 T47D+more MUC1* 세포 둘 다가 루시퍼라제 양성을 띠게 만들어졌다. IVIS 사진을 촬영하기 십(10)분 전, 루시퍼라제 기질인 루시페린을 마우스의 복강내(ip) 공간에 주사하였다. 도 59a는 인산염 완충 식염수인 PBS로만 치료받은 종양 보유 마우스를 보여준다. 도 59b는 이(2)회 용량의 huMNC2-CAR44 T 세포로 치료받은 T47D-wt 종양 보유 마우스를 보여준다. 도 T90.1c는 이(2)회 용량의 huMNC2-CAR44 T 세포로 치료받은 T47D-MUC1* 종양 보유 마우스를 보여준다.
도 60a 내지 60c는 마우스를 치료하지 않았거나 PBS, 형질도입되지 않은 T 세포 또는 huMNC2-CAR44 T 세포로 치료한 후 종양 세포로부터의 광자 방출을 측정하는 IVIS 기기에서 NOD/SCID/GAMMA 마우스의 사진을 보여준다. 70% T47D-wt 유방암 세포와, 훨씬 더 많은 MUC1*로 형질감염된 30% T47D 세포의 혼합된 집단을 마우스에게 피하 주사하였다. 두 세포 유형 모두가 루시퍼라제 양성을 띠게 만들어졌다. IVIS 사진을 촬영하기 십(10)분 전, 루시퍼라제 기질인 루시페린을 마우스의 복강내(ip) 공간에 주사하였다. 도 60a는 인산염 완충 식염수인 PBS로만 치료받은 종양 보유 마우스를 보여준다. 도 60b는 형질도입되지 않은 T 세포로만 치료받은 종양 보유 마우스를 보여준다. 도 60c는 이(2)회 용량의 huMNC2-CAR44 T 세포로 치료받은 종양 보유 마우스를 보여준다.
도 61a 내지 61j는 IVIS 기기에서 촬영된 마우스의 형광 사진을 보여준다. 0일째 날 MUC1* 양성 삼중 음성 유방암 세포주인 500K 인간 BT-20 세포를 NSG(NOD/SCID/GAMMA) 면역손상된 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 암 세포는 루시퍼라제로 안정적으로 형질감염되었다. 종양은 생착할 수 있게 되었다. IVIS 측정 후 6일째 날, huMNC2-scFv-CAR44로 형질도입된 1,000만 개의 인간 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포를 동물에게 1회 주사로 제공하였다. 500만 개의 T 세포를 종양 내로 주사하였고 500만 개의 T 세포를 꼬리 정맥에 주사하였다. IVIS 사진을 촬영하기 10분 전, 루시퍼라제에 의한 절단 후 형광을 생성함으로써, 종양 세포가 형광을 띠게 만드는 루시페린을 마우스에게 IP 주사하였다. 도 61a, 61d, 61g는 투여 24시간 전에 합성 MUC1*인 PSMGFR 펩티드가 부착되어 있는 4 ㎛ 비드와 함께 24시간 동안 공-배양함으로써 사전자극된 huMNC2-scFv-CAR44 T 세포로 치료받은 마우스의 사진을 보여준다: 프로토콜 1. 도 61b, 61e, 61h는 투여 24시간 전에 MUC1* 양성 암 세포와 함께 24시간 동안 2회 공-배양함으로써 사전자극된 huMNC2-scFv-CAR44 T 세포로 치료받은 마우스의 사진을 보여준다: 프로토콜 2. 도 61c, 61f, 61i는 형질도입되지 않은 인간 T 세포로 치료받은 마우스의 사진을 보여준다. 도 61j는 광자/초 단위의 형광을 색상과 관련시키는 색상 스케일이다.
도 62a 내지 62m은 IVIS 기기에서 촬영된 마우스의 형광 사진을 보여준다. 0일째 날 MUC1* 양성 난소암 세포주인 500K 인간 SKOV-3 세포를 NSG(NOD/SCID/GAMMA) 면역손상된 마우스의 복강내(IP)에 주사하였다. 암 세포는 루시퍼라제로 안정적으로 형질감염되었다. 종양은 생착할 수 있게 되었다. 4일째 날, huMNC2-scFv-CAR44로 형질도입된 10 M 인간 T 세포, 형질도입되지 않은 T 세포 또는 PBS를 동물의 복강내 공간에 주사하였다. 11일째 날, 세포의 절반을 꼬리 정맥에 주사하고 나머지 절반을 IP 주사한 점을 제외하고 동물에게 다시 주사하였다. 3일째 날, 7일째 날, 10일째 날 및 15일째 날 IVIS로 동물을 이미지화하였다. IVIS 사진촬영 10분 전, 루시퍼라제에 의한 절단 후 형광을 생성함으로써, 종양 세포가 형광을 띠게 만드는 루시페린을 마우스에게 IP 주사하였다. 도 62a, 62d, 62g 및 62j는 투여 24시간 전에 합성 MUC1*인 PSMGFR 펩티드가 부착되어 있는 1 ㎛ 비드와 함께 24시간 동안 공-배양함으로써 사전자극된 huMNC2-scFv-CAR44 T 세포로 치료받은 마우스의 사진을 보여준다. 도 62b, 62e, 62h 및 62k는 형질도입되지 않은 인간 T 세포로 치료받은 마우스의 사진을 보여준다. 도 62c, 62f, 62i 및 62l은 PBS로 치료받은 마우스의 사진을 보여준다. 도 62a, 62b 및 62c는 CAR T, T 세포 또는 PBS 투여 전 3일째 날에 촬영된 IVIS 이미지이다. 도 62d, 62e 및 62f는 치료 사(4)일 후인 7일째 날 동물의 IVIS 이미지를 보여준다. 도 62g, 62h 및 62i는 10일째 날 동물의 IVIS 이미지를 보여준다. 도 62j, 62k 및 62l은 15일째 날 동물의 IVIS 이미지를 보여준다. 도 62m은 광자/초 단위의 형광을 색상과 관련시키는 IVIS 색상 스케일이다.
도 63은 PSMGFR 펩티드, N-10, C-10, N+20/C-27 또는 N+9/C-9 펩티드에 결합하는 다양한 단일클론 항체의 능력을 시험하는 ELISA 결합 어세이의 그래프를 보여주는 것으로, 이때 항체의 농도는 10 ㎍/㎖ 또는 1 ㎍/㎖이었다. 암 특이적인 것으로 입증된 항-MUC1* 단일클론 항체 C2 및 E6은 PSMGFR 펩티드에 결합하고 10개의 N-말단 아미노산이 누락된 경우에도 여전히 결합하지만, 10개 또는 9개의 C-말단 아미노산이 누락된 경우에는 결합하지 않음을 주목한다.
도 64a 및 64b는 ELISA 결합 어세이의 그래프를 보여준다. 시험되는 항체는 PSMGFR 펩티드로 면역화한 동물로부터 유래하였다. 첫 번째 선택 기준은 항체가 면역화 PSMGFR 펩티드에 결합하는지를 확인하는 것이었다. 도 64a는 PSMGFR 펩티드, N-10, C-10, N+20/C-27 또는 N+9/C-9 펩티드에 결합하는 능력을 측정하기 위해 추가로 시험된 선택된 항체의 ELISA 그래프를 보여준다. 18B4를 제외한 모든 항체들이 N-10 펩티드에 결합할 수 있었다. 18B4는 N+20/C-27을 인식하였으나 N-10 펩티드를 인식하지 않았고, 이것은 그의 동족 에피토프가 GTINVHDVET 서열 내에 있음을 암시한다. 20A10 및 C2를 제외한 모두가 C-10 및 N+9/C-9 펩티드와의 일부 결합을 보여줌으로써, 20A10 및 C2 둘 다가 결합을 위해 10개의 막 근위 아미노산을 필요로 한다는 것을 보여준다. 결합을 위해 10개의 막 근위 아미노산을 필요로 하는 C2는 암 특이적인 것으로 입증되었다. 도 64b는 다양한 펩티드의 서열을 보여준다. ELISA 그래프에서 각각의 항체에 대한 막대의 색상은 그 항체의 연역적 동족 서열 또는 이의 일부와 일치하도록 색상 코딩된다.
도 65a 및 65b는 PSMGFR 펩티드, N-10, C-10, N+20/C-27, 또는 N+9/C-9 펩티드에 결합하는 다양한 단일클론 항체들의 능력을 시험하는 ELISA 결합 어세이의 그래프를 보여준다. 시험되는 항체는 N+20/C-27 펩티드로 면역화한 동물로부터 유래하였다. 첫 번째 선택 기준은 항체가 면역화 N+20/C-27 펩티드에 결합하는지를 확인하는 것이었다. 도 65a는 다양한 펩티드에 결합하는 각각의 항체의 능력을 시험하는 ELISA 결합 어세이의 그래프를 보여준다. 이 항체들이 N+20/C-27 펩티드에 대해 생성되었지만, 45C11 하나를 제외한 모두가 여전히 PSMGFR 펩티드에 결합한다. 45C11의 결합은 약하지만, 연역적 추론은 동족 에피토프가 SNIKFRPGSVV 서열 내에 있어야 함을 보여준다. 1E4는 N+20/C-27 펩티드, PSMGFR 및 N-10 펩티드에 결합할 수 있었으며, 이것은 그의 에피토프가 QFNQYKTE 서열 내에 있어야 한다는 생각과 일치한다. 도 65b는 다양한 펩티드들의 서열을 보여준다. ELISA 그래프에서 각각의 항체에 대한 막대의 색상은 그 항체의 연역적 동족 서열 또는 이의 일부와 일치하도록 색상 코딩된다.
도 66a 및 66b는 PSMGFR 펩티드, N-10, C-10, N+20/C-27 또는 N+9/C-9 펩티드에 결합하는 다양한 단일클론 항체들의 능력을 시험하는 ELISA 결합 어세이의 그래프를 보여준다. 시험되는 항체는 N+9/C-9 펩티드로 면역화한 동물로부터 유래하였다. 첫 번째 선택 기준은 항체가 면역화 N+9/C-9 펩티드에 결합하는지를 확인하는 것이었다. 도 66a는 ELISA 어세이의 그래프를 보여준다. 39H5 하나를 제외한 모두가 면역화 펩티드인 N+9/C-9에만 결합할 수 있었다. 39H5는 PSMGFR 및 N-10 펩티드와의 매우 약한 결합을 보였고, 이것은 그의 동족 에피토프의 적어도 일부가 QFNQYKTE 서열 내에 있어야 한다는 생각과 일치한다. 도 66b는 다양한 펩티드들의 서열을 보여준다. ELISA 그래프에서 각각의 항체에 대한 막대의 색상은 그 항체의 연역적 동족 서열 또는 이의 일부와 일치하도록 색상 코딩된다.
도 67a 내지 67d는 MUC1 또는 MUC1* 세포외 도메인 내의 항체 에피토프를 추가로 정의하기 위한 ELISA 어세이의 결과를 보여준다. 이 도면에 표시된 항체는 모두 PSMGFR 펩티드로 동물을 면역화함으로써 생성되었다. 결합 어세이는 펩티드 N-19, N-26, N-30, N-10/C-5, N-19/C-5, PSMGFR, N-10 및 C-10에 결합하는 능력에 대해 항체를 시험하였는데, 이 펩티드들 모두가 PSMGFR 펩티드의 서브세트이고 넘버링은 PSMGFR 펩티드를 다시 참고한다. 도 67a는 다양한 항체들과 다양한 펩티드들의 결합을 보여준다. 도 67b는 N-말단에서 20개 아미노산이 연장되어 있는 PSMGFR 펩티드의 서열을 보여준다. 도 67c는 PSMGFR 유래 서브세트 펩티드의 서열을 보여준다. 도 67d는 항체 인식에 필수적인 에피토프의 전부 또는 일부를 포함하는 서열을 보여준다.
도 68a 내지 68d는 MUC1 또는 MUC1* 세포외 도메인 내의 항체 에피토프를 추가로 정의하기 위한 ELISA 어세이의 결과를 보여준다. 이 도면에 표시된 항체들은 모두 N+20/C-27 펩티드로 동물을 면역화함으로써 생성되었다. 결합 어세이는 펩티드 N-19, N-26, N-30, N-10/C-5, N-19/C-5, PSMGFR, N-10 및 C-10에 결합하는 능력에 대해 항체를 시험하였는데, 이 펩티드들은 모두 PSMGFR 펩티드의 서브세트이고, 넘버링은 PSMGFR 펩티드를 다시 참고한다. 도 68a는 다양한 항체들과 다양한 펩티드들의 결합을 보여준다. 도 68b는 N-말단에서 20개 아미노산이 연장되어 있는 PSMGFR 펩티드의 서열을 보여준다. 도 68c는 PSMGFR 유래 서브세트 펩티드의 서열을 보여준다. 도 68d는 항체 인식에 필수적인 에피토프의 전부 또는 일부를 포함하는 서열을 보여준다.
도 69a 내지 69d는 MUC1 또는 MUC1* 세포외 도메인 내의 항체 에피토프를 추가로 정의하기 위한 ELISA 어세이의 결과를 보여준다. 이 도면에 표시된 항체들은 모두 N+9/C-9 펩티드로 동물을 면역화함으로써 생성되었다. 결합 어세이는 펩티드 N-19, N-26, N-30, N-10/C-5, N-19/C-5, PSMGFR, N-10 및 C-10에 결합하는 능력에 대해 항체를 시험하였는데, 이 펩티드들은 모두 PSMGFR 펩티드의 서브세트이고, 넘버링은 PSMGFR 펩티드를 다시 참고한다. 도 69a는 다양한 항체들과 다양한 펩티드들의 결합을 보여준다. 도 69b는 N-말단에서 20개 아미노산이 연장되어 있는 PSMGFR 펩티드의 서열을 보여준다. 도 69c는 PSMGFR 유래 서브세트 펩티드의 서열을 보여준다. 도 69d는 항체 인식에 필수적인 에피토프의 전부 또는 일부를 포함하는 서열을 보여준다.
도 70a 및 70b는 ELISA 이탈 어세이의 그래프를 보여준다. 이 실험에서, 멀티웰 플레이트를 PSMGFR 펩티드로 코팅하였다. 도 70a에서, 재조합 NME7_AB를 표면 고정된 PSMGFR 펩티드에 결합시켰다. 다양한 항체들을 첨가한 후, 세척 단계를 수행하였다. 항체 경쟁 후 PSMGFR 코팅된 플레이트에 부착된 상태로 남아있는 NME7_AB의 양을, NME7_AB의 태그를 검출함으로써 측정하였다. 대조군으로서, PSMGFR로부터 NME7_AB를 이탈시키는 능력에 대해 항-NME7_AB 항체도 시험하였다. 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 항체 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 및 5C6F3은 NME7_AB가 PSMGFR 펩티드에 결합하는 것을 방해하였는데, 이것은 항체가 암 특이적임을 표시한다. 도 70b는 이 항체들이 결합하는 MUC1* 세포외 도메인 내의 에피토프가 서열 SVSDVPFPFSAQSGA임을 보여주는 것으로, 이때 아미노산 FPFS가 존재하지 않거나 돌연변이된 경우 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1에 대한 결합이 파괴되고, 아미노산 SVSDV가 존재하지 않거나 돌연변이된 경우 5C6F3에 대한 결합이 파괴된다.
도 71a 내지 71h는 전체 길이 MUC1 또는 MUC1*의 선형 에피토프에 결합하는 항체의 능력을 시험하는 웨스턴 블롯의 사진을 보여준다. 도 71a 내지 71d는 MUC1 음성 세포주인 HCT-116, 또는 전체 길이 MUC1을 발현하는 절단 내성 클론인 조작된 세포주 HCT-MUC1-18, 또는 세포외 도메인에서 PSMGFR 서열만을 발현하도록 조작된 HCT-MUC1*에 결합하는 능력에 대한 항체의 시험을 보여준다. 도 71e 내지 71h는 유방암 세포주 T47D 또는 1500(ZR-75-1로서도 알려짐)에 결합하는 능력에 대한 항체의 시험을 보여준다. 도 71a 및 도 71e는 PSMGFR 펩티드의 N-10 변이체에는 결합하지만 C-10 변이체에는 결합하지 않는, PSMGFR 펩티드에 대해 생성된 단일클론 항체인 MNC2를 보여준다. 도 71b 및 도 71f는 PSMGFR 펩티드의 N-10 변이체에는 결합하지만 C-10 변이체에는 결합하지 않는, PSMGFR 펩티드에 대해 생성된 단일클론 항체인 MNE6을 보여준다. 도 71c 및 도 71g는 PSMGFR 펩티드에 대해 생성되고 PSMGFR 펩티드에 결합하는 다중클론 항체인 SDIX를 보여준다. 도 71d 및 도 71h는 전체 길이 MUC1의 탠덤 반복부에 결합하는 시판되는 단일클론 항체인 VU4H5를 보여준다. 확인될 수 있는 바와 같이, MNC2 및 MNE6 둘 다가 MUC1 종의 선형 에피토프에 결합하지 않는다.
도 72a 내지 72p는 전체 길이 MUC1 또는 MUC1*의 선형 에피토프에 결합하는 항체의 능력을 시험하는 웨스턴 블롯의 사진을 보여준다. 이 항체들 모두가 PSMGFR 펩티드에 대해 생성되었으며 PSMGFR 펩티드에 결합한다. 도 72a 내지 72h는 MUC1 음성 세포주인 HCT-116, 또는 전체 길이 MUC1을 발현하는 절단 내성 클론인 조작된 세포주 HCT-MUC1-18, 또는 세포외 도메인에서 PSMGFR 서열만을 발현하도록 조작된 HCT-MUC1*에 결합하는 능력에 대한 항체의 시험을 보여준다. 도 72i 내지 72p는 유방암 세포주 T47D 또는 1500(ZR-75-1로서도 알려짐)에 결합하는 능력에 대한 항체의 시험을 보여준다. 도 72a 및 도 72i는 20A10을 보여준다. 도 72b 및 도 72j는 25E6을 보여준다. 도 72c 및 도 72k는 18B4를 보여준다. 도 72d 및 도 72l은 18G12를 보여준다. 도 72e 및 도 72m은 28F9를 보여준다. 도 72f 및 도 72n은 3C2B1을 보여준다. 도 72g 및 도 72o는 5C6F3을 보여준다. 도 72h 및 도 72p는 5C6F3을 보여주는 것으로, 이때 블롯은 MUC1* 특이적 밴드를 더 잘 보이게 만들기 위해 더 긴 시간 동안 노출되었다. 볼 수 있는 바와 같이, 항체 25E6, 18B4 및 어느 정도까지 5C6F3은 선형 에피토프를 인식하나, 20A10, 3C2B1, 18G12 및 28F9는 인식하지 않는다.
도 73a 내지 73j는 전체 길이 MUC1 또는 MUC1*의 선형 에피토프에 결합하는 항체의 능력을 시험하는 웨스턴 블롯의 사진을 보여준다. 이 항체들 모두가 PSMGFR 펩티드의 N+20/C-27 변이체에 대해 생성되었고 N+20/C-27 펩티드에 결합한다. 도 73a 내지 73e는 MUC1 음성 세포주인 HCT-116, 또는 전체 길이 MUC1을 발현하는 절단 내성 클론인 조작된 세포주 HCT-MUC1-18, 또는 세포외 도메인에서 PSMGFR 서열만을 발현하도록 조작된 HCT-MUC1*에 결합하는 능력에 대한 항체의 시험을 보여준다. 도 73f 내지 73j는 유방암 세포주 T47D 또는 1500(ZR-75-1로서도 알려짐)에 결합하는 능력에 대한 항체의 시험을 보여준다. 도 73a 및 도 73f는 1E4를 보여준다. 도 73b 및 도 73g는 45C11을 보여준다. 도 73c 및 도 73h는 31A1을 보여준다. 도 73d 및 도 73i는 32C1을 보여준다. 도 73e 및 도 73j는 29H1을 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 항체 31A1 및 32C1은 선형 에피토프를 인식한다.
도 74a 내지 74h는 전체 길이 MUC1 또는 MUC1*의 선형 에피토프에 결합하는 항체의 능력을 시험하는 웨스턴 블롯의 사진을 보여준다. 이 항체들 모두가 PSMGFR 펩티드의 N+9/C-9 변이체에 대해 생성되었고 N+9/C-9 펩티드에 결합한다. 도 74a 내지 74d는 MUC1 음성 세포주인 HCT-116, 또는 전체 길이 MUC1을 발현하는 절단 내성 클론인 조작된 세포주 HCT-MUC1-18, 또는 세포외 도메인에서 PSMGFR 서열만을 발현하도록 조작된 HCT-MUC1*에 결합하는 능력에 대한 항체의 시험을 보여준다. 도 74e 내지 74h는 유방암 세포주 T47D 또는 1500(ZR-75-1로서도 알려짐)에 결합하는 능력에 대한 항체의 시험을 보여준다. 도 74a 및 도 74e는 8A9를 보여준다. 도 74b 및 도 74f는 17H6을 보여준다. 도 74c 및 도 74g는 3C5를 보여준다. 도 74d 및 도 74h는 39H5를 보여준다.
도 75a 내지 75p는 FACS 분석의 그래프를 보여준다. 전체 길이 MUC1을 발현하는 HCT-MUC1-18 세포를 촉매 활성 MMP9 또는 MMP2와 함께 24시간 동안 인큐베이션하고, 본 발명의 항체와 함께 인큐베이션한 다음 FACS로 분석하여, 항체가 MMP9 또는 MMP2에 의해 절단된 형태의 MUC1에 결합하는지를 확인하였다. 각각의 그래프의 첫 번째 막대는 절단의 부재 하에 어느 항체도 전체 길이 MUC1에 결합하지 않음을 보여준다. 각각의 막대 그래프는 그 어세이에 사용된 항체의 명칭 및 그의 동족 에피토프 둘 다로 표지되어 있다. 오른쪽에서 왼쪽으로 그래프의 순서는 항체의 동족 에피토프의 세포 표면으로부터의 거리에 상응한다. 도 75a는 항체 1E4를 보여준다. 도 75b는 항체 28F9를 보여준다. 도 75c는 항체 18G12를 보여준다. 도 75d는 항체 25E6을 보여준다. 도 75e는 항체 20A10을 보여준다. 도 75f는 항체 3C5를 보여준다. 도 75g는 항체 29H1을 보여준다. 도 75h는 항체 32C1을 보여준다. 도 75i는 항체 31A1을 보여준다. 도 75j는 항체 18B4를 보여준다. 도 75k는 항체 45C11을 보여준다. 도 75l은 항체 8A9를 보여준다. 도 75m은 항체 17H6을 보여준다. 도 75n은 항체 39H5를 보여준다. 도 75o는 항체 3C2B1을 보여준다. 도 75p는 항체 5C6F3을 보여준다.
도 76a 내지 76j는 MUC1 음성 세포주 HCT-116, MUC1*로 형질감염된 HCT인 "HCT-MUC1*", 또는 전체 길이 MUC1로 형질감염된 HCT의 절단 내성 단일 세포 클론인 "HCT-MUC1-18"에 결합하는 기준 항체 MNC2인 "C2" 및 VU4H5, 및 유방암 세포주 T47D 또는 ZR-75-1로서도 알려진 유방암 세포주 1500에 결합하는 MNC2의 FACS 분석의 그래프를 보여준다. MNC2는 PSMGFR 서열의 막 근위 부분 내에서 MUC1*의 세포외 도메인의 이소성 결합 부위에 결합한다. MNC2 결합 부위는 탠덤 반복부 도메인을 포함하는 세포외 도메인의 대부분이 절단되고 방출된 후에만 이용 가능하다. VU4H5는 탠덤 반복부 도메인에서 수백 개의 반복 에피토프에 결합한다. 도 76a 내지 76e는 퍼센트 결합을 보여주고 도 76f 내지 76j는 평균 형광 강도 또는 MFI를 보여준다.
도 77a 내지 77n은 종종 음성 대조군으로서 사용될 정도로 낮은 수준으로 MUC1 및 MUC1*를 발현하는 MDA-MB-231을 제외하고 MUC1* 양성을 나타내는 암 세포주의 패널에 결합하는 기준 항체 MNC2인 "C2"의 FACS 분석의 그래프를 보여준다. MNC2는 PSMGFR 서열의 막 근위 부분 내에서 MUC1*의 세포외 도메인의 이소성 결합 부위에 결합한다. MNC2 결합 부위는 탠덤 반복부 도메인을 포함하는 세포외 도메인의 대부분이 절단되고 방출된 후에만 이용 가능하다. 도 77a 내지 77g는 퍼센트 결합을 보여주고, 도 77h 내지 77n은 평균 형광 강도 또는 MFI를 보여준다. 도 77a 및 77h는 폐암 세포주 NCI-H292에 결합하는 항체를 보여준다. 도 77b 및 77i는 폐암 세포주 NCI-H1975에 결합하는 항체를 보여준다. 도 77c 및 77j는 난소암 세포주 SKOV-3에 결합하는 항체를 보여준다. 도 77d 및 77k는 췌장암 세포주 HPAF-II에 결합하는 항체를 보여준다. 도 77e 및 77l은 췌장암 세포주 Capan-1에 결합하는 항체를 보여준다. 도 77f 및 77m은 전립선암 세포주 DU145에 결합하는 항체를 보여준다. 도 77g 및 77n은 거의 MUC1 및 MUC1* 음성을 나타내는 유방암 세포주 MDA-MB-231에 결합하는 항체를 보여준다.
도 78a 내지 78c는 N-말단 및 C-말단 둘 다에서 연장되거나 결실된 기본 PSMGFR 서열의 색상 코딩된 개략도를 보여준다. 각각의 항체가 결합하는 에피토프 또는 각각의 항체가 결합하는 에피토프 내의 중요한 아미노산을 더 세밀히 구별하기 위해 이 펩티드 서브세트에 대해 본 발명의 항체를 시험하였다. 도 78a는 다양한 펩티드 서브세트의 정렬된 개략도이다. 도 78b는 각각의 색상 코딩된 서열에 결합하는 항체를 나열한다. 도 78c는 각각의 항체가 인식하는 암 세포주를 나열한다.
도 79a 내지 79i는 T47D 유방암 세포에 결합하는 각각의 항체 및 N-말단 연장된 PSMGFR 서열 내의 이들 각각의 동족 서열의 FACS 분석으로부터 생성된 색상 코딩된 그래프를 보여준다. 도 79a 내지 79d는 각각의 항체에 의해 인식된 퍼센트 세포를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 79e 내지 79h는 각각의 항체의 평균 형광 강도인 MFI를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 79a 및 도 79e는 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 79b 및 도 79f는 N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 79c 및 도 79g는 N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 79d 및 도 79h도 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 79i는 N-말단에서 20개 아미노산만큼 연장된 PSMGFR 서열을 보여준다. 도 79a 및 도 79e는 20A10이 T47D 유방암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다. 도 79d 및 도 79h는 3C2B1이 T47D 유방암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다. 도 79d 및 도 79h는 5C6F3이 T47D 유방암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다.
도 80a 내지 80i는 ZR-75-1로서도 알려진 1500 유방암 세포에 결합하는 각각의 항체 및 N-말단 연장된 PSMGFR 서열 내의 이들 각각의 동족 서열의 FACS 분석으로부터 생성된 색상 코딩된 그래프를 보여준다. 도 80a 내지 80c는 각각의 항체에 의해 인식된 퍼센트 세포를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 80d 내지 80f는 각각의 항체의 평균 형광 강도인 MFI를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 80a, 도 80e, 도 80d 및 도 80h는 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 80b 및 도 80f는 N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 80c 및 도 80g는 N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 80i는 N-말단에서 20개 아미노산만큼 연장된 PSMGFR 서열을 보여준다. 도 80a 및 도 80e는 항체 20A10이 1500(ZR-75-1로서도 알려짐) 유방암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다. 도 80d 및 도 80h는 항체 3C2B1이 1500(ZR-75-1로서도 알려짐) 유방암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다. 도 80d 및 도 80h는 항체 5C6F3이 1500(ZR-75-1로서도 알려짐) 유방암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다.
도 81a 내지 81g는 NCI-H292 폐암 세포에 결합하는 각각의 항체 및 N-말단 연장된 PSMGFR 서열 내의 이들 각각의 동족 서열의 FACS 분석으로부터 생성된 색상 코딩된 그래프를 보여준다. 도 81a 내지 81c는 각각의 항체에 의해 인식된 퍼센트 세포를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 81d 내지 81f는 각각의 항체의 평균 형광 강도인 MFI를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 81a 및 도 81d는 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 81b 및 도 81e는 N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 81c 및 도 81f는 N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 81g는 N-말단에서 20개 아미노산만큼 연장된 PSMGFR 서열을 보여준다. 도 81a 및 도 81d는 항체 20A10이 H292 폐암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다.
도 82a 내지 82g는 NCI-H1975 폐암 세포에 결합하는 각각의 항체 및 N-말단 연장된 PSMGFR 서열 내의 이들 각각의 동족 서열의 FACS 분석으로부터 생성된 색상 코딩된 그래프를 보여준다. 도 82a 내지 82c는 각각의 항체에 의해 인식된 퍼센트 세포를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 82d 내지 82f는 각각의 항체의 평균 형광 강도인 MFI를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 82a 및 도 82d는 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 82b 및 도 82e는 N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 82c 및 도 82f는 N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 82g는 N-말단에서 20개 아미노산만큼 연장된 PSMGFR 서열을 보여준다. 도 82a 및 도 82d는 항체 20A10이 H1975 폐암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다.
도 83a 내지 83g는 SKOV-3 난소암 세포에 결합하는 각각의 항체 및 N-말단 연장된 PSMGFR 서열 내의 이들 각각의 동족 서열의 FACS 분석으로부터 생성된 색상 코딩된 그래프를 보여준다. 도 83a 내지 83c는 각각의 항체에 의해 인식된 퍼센트 세포를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 83d 내지 83f는 각각의 항체의 평균 형광 강도인 MFI를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 83a 및 도 83d는 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 83b 및 도 83e는 N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 83c 및 도 83f는 N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 83g는 N-말단에서 20개 아미노산만큼 연장된 PSMGFR 서열을 보여준다. 도 83a 및 도 83d는 항체 20A10이 SKOV-3 난소암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다.
도 84a 내지 84g는 DU145 전립선암 세포에 결합하는 각각의 항체 및 N-말단 연장된 PSMGFR 서열 내의 이들 각각의 동족 서열의 FACS 분석으로부터 생성된 색상 코딩된 그래프를 보여준다. 도 84a 내지 84c는 각각의 항체에 의해 인식된 퍼센트 세포를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 84d 내지 84f는 각각의 항체의 평균 형광 강도인 MFI를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 84a 및 도 84d는 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 84b 및 도 84e는 N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 84c 및 도 84f는 N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 84g는 N-말단에서 20개 아미노산만큼 연장된 PSMGFR 서열을 보여준다. 도 84a 및 도 84e는 항체 20A10이 DU145 전립선암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다. 도 84d 및 도 84h는 항체 3C2B1이 DU145 전립선암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다. 도 84d 및 도 84h는 항체 5C6F3이 DU145 전립선암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다.
도 85a 내지 85g는 HPAF-II 췌장암 세포에 결합하는 각각의 항체 및 N-말단 연장된 PSMGFR 서열 내의 이들 각각의 동족 서열의 FACS 분석으로부터 생성된 색상 코딩된 그래프를 보여준다. 도 85a 내지 85c는 각각의 항체에 의해 인식된 퍼센트 세포를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 85d 내지 85f는 각각의 항체의 평균 형광 강도인 MFI를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 85a 및 도 85d는 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 85b 및 도 85e는 N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 85c 및 도 85f는 N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 85g는 N-말단에서 20개 아미노산만큼 연장된 PSMGFR 서열을 보여준다. 도 85a 및 도 85d는 항체 20A10이 HPAF II 췌장암 세포에 존재하는 MUC1*를 인식함을 보여준다.
도 86a 내지 86g는 Capan-1 췌장암 세포에 결합하는 각각의 항체 및 N-말단 연장된 PSMGFR 서열 내의 이들 각각의 동족 서열의 FACS 분석으로부터 생성된 색상 코딩된 그래프를 보여준다. 도 86a 내지 86c는 각각의 항체에 의해 인식된 퍼센트 세포를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 86d 내지 86f는 각각의 항체의 평균 형광 강도인 MFI를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 86a 및 도 86d는 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 86b 및 도 86e는 N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 86c 및 도 86f는 N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 86g는 N-말단에서 20개 아미노산만큼 연장된 PSMGFR 서열을 보여준다.
도 87a 내지 87g는 거의 MUC1 음성을 나타내는 MDA-MB-231 유방암 세포에 결합하는 각각의 항체 및 N-말단 연장된 PSMGFR 서열 내의 이들 각각의 동족 서열의 FACS 분석으로부터 생성된 색상 코딩된 그래프를 보여준다. 도 87a 내지 87c는 각각의 항체에 의해 인식된 퍼센트 세포를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 87d 내지 87f는 각각의 항체의 평균 형광 강도인 MFI를 보여주는 FACS 그래프이다. 도 87a 및 도 87d는 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 87b 및 도 87e는 N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 87c 및 도 87f는 N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체의 FACS 그래프를 보여준다. 도 87g는 N-말단에서 20개 아미노산만큼 연장된 PSMGFR 서열을 보여준다.
도 88a 내지 88l은 동일한 기증으로부터 각각 유래하였으나 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 간 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 88a 내지 88f는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 88g 내지 88l은 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 조직은 오른쪽에서 PSMGFR 펩티드의 가장 막 근위 부분, 즉 가장 C-말단 부분에 결합하는 항체, 및 왼쪽에서 MUC1 세포외 도메인의 가장 N-말단 부분, 심지어 PSMGFR 영역을 넘어서는 부분에 결합하는 항체와 함께 오른쪽에서 왼쪽으로 정렬되어 있다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 가장 암 특이적인 항체는 PSMGFR 서열의 더 많은 막 근위 부분에 결합하는 항체이고, 가장 멀리 떨어진 N-말단 부분에 결합하는 항체는 암 특이성을 상실하고, 이때 PSMGFR 외부의 에피토프에 결합하는 항체는 모든 암 특이성을 상실한다. 볼 수 있는 바와 같이, 도 88f 및 88l은 서열 FPFS 또는 PFPFSAQSGA의 전부 또는 일부를 포함하는 MUC1* 세포외 도메인의 일부에 결합하는 항체 3C2B1이 정상 간에 결합하지 않음을 보여준다.
도 89a 내지 89h는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 심장 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 89a 내지 89d는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 89e 내지 89h는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 89a 및 도 89e는 MNC2-scFv를 사용한 염색을 보여준다. 도 89b 및 도 89f는 MNE6을 사용한 염색을 보여준다. 도 89c 및 도 89g는 20A10을 사용한 염색을 보여준다. 도 89d 및 도 89h는 3C2B1을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 서열 FPFS 또는 PFPFSAQSGA의 전체 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들 모두가 PSMGFR 펩티드에 결합할 수 있고, N-10 펩티드에 결합할 수 있으나 C-10 펩티드에는 결합하지 않는다. 또한, 이 항체들은 PSMGFR 펩티드로 예시되는 MUC1* 세포외 도메인과 NME7_AB의 결합을 파괴한다. 또한, 이 항체들은 절단 효소가 MMP9일 때 MUC1 절단 생성물을 인식한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 정상 심장 조직과의 결합을 보이지 않는다. 도 89a 및 도 89e는 기준 항체 MNC2가 정상 심장 조직에 결합하지 않음을 보여준다. 도 89b 및 도 89f는 기준 항체 MNE6이 정상 심장 조직에 결합하지 않음을 보여준다. 도 89c 및 도 89g는 항체 20A10이 정상 심장 조직에 결합하지 않음을 보여준다. 도 89d 및 도 89h는 항체 3C2B1이 정상 심장 조직에 결합하지 않음을 보여준다.
도 90a 내지 90d는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 심장 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 90a 및 90b는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 90c 및 90d는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 90a 및 도 90c는 MNC3을 사용한 염색을 보여준다. 도 90b 및 도 90d는 25E6을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 서열 ASRYNLT의 전체 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들은 모두 PSMGFR 펩티드에 결합할 수 있고, N-10 펩티드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 C-10 펩티드에도 결합할 수 있다. 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 암 특이적이지 않고 정상 심장 조직과의 일부 결합을 보여준다.
도 91a 및 91b는 본 발명의 항체 1E4로 염색된 정상 심장 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 91a는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 91b는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 항체 1E4는 서열 QFNQYKTEA의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 항체 1E4는 N-10 펩티드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 C-10 펩티드에도 결합한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 1E4는 정상 심장 조직에 결합한다. 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 암 특이적이지 않고 정상 심장 조직과의 일부 결합을 보여준다.
도 92a 내지 92h는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 심장 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 92a 내지 92d는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 92e 내지 92h는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 92a 및 도 92e는 18B4를 사용한 염색을 보여준다. 도 92b 및 도 92f는 31A1을 사용한 염색을 보여준다. 도 92c 및 도 92g는 32C1을 사용한 염색을 보여준다. 도 92d 및 도 92h는 29H1을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 PSMGFR 펩티드의 가장 N-말단 부분인 서열 GTINVHDVET의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들 중 어느 항체도 N-10 펩티드에 결합할 수 없다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 18B4를 제외한 이 항체들 모두가 정상 심장 조직과의 결합을 보여준다.
도 93a 내지 93d는 본 발명의 항체로 염색된 정상 심장 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 93a 및 93b는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 93c 및 93d는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 93a 및 도 93c는 항체 8A9를 사용한 염색을 보여준다. 도 93b 및 도 93d는 항체 17H6을 사용한 염색을 보여준다. 두 항체는 PSMGFR 영역의 외부에 있고 서열 VQLTLAFRE의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 두 항체는 정상 심장 조직과의 강한 결합을 보여준다.
도 94a 및 94b는 본 발명의 항체 45C11로 염색된 정상 심장 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 94a는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 94b는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 항체 45C11은 PSMGFR 영역의 외부에 있고 SNIKFRPGSVV 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 항체 45C11은 N-10 펩티드에 결합할 수 없다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 45C11은 정상 심장 조직에 강하게 결합한다.
도 95a 내지 95h는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 간 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 95a 내지 95d는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 95e 내지 95h는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 95a 및 도 95e는 기준 항체 MNC2-scFv를 사용한 염색을 보여준다. 도 95b 및 도 95f는 기준 항체 MNE6을 사용한 염색을 보여준다. 도 95c 및 도 95g는 20A10을 사용한 염색을 보여준다. 도 95d 및 도 95h는 3C2B1을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 서열 FPFS 또는 PFPFSAQSGA의 전체 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들은 모두 PSMGFR 펩티드에 결합할 수 있고, N-10 펩티드에 결합할 수 있으나 C-10 펩티드에는 결합하지 않는다. 추가로, 이 항체들은 PSMGFR 펩티드로 예시되는 MUC1* 세포외 도메인과 NME7_AB의 결합을 파괴한다. 또한, 이 항체들은 절단 효소가 MMP9일 때 MUC1 절단 생성물을 인식한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 정상 간 조직과의 결합을 보여주지 않는다.
도 96a 내지 96d는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 간 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 96a 및 96b는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 96c 및 96d는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 96a 및 도 96c는 MNC3을 사용한 염색을 보여준다. 도 96b 및 도 96d는 25E6을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 서열 ASRYNLT의 전체 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들은 모두 PSMGFR 펩티드에 결합할 수 있고, N-10 펩티드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 C-10 펩티드에도 결합할 수 있다. 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 암 특이적이지 않고 정상 간 조직과의 일부 결합을 보여준다.
도 97a 및 97b는 본 발명의 항체 1E4로 염색된 정상 간 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 97a는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 97b는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 항체 1E4는 서열 QFNQYKTEA의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 항체 1E4는 N-10 펩티드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 C-10 펩티드에도 결합한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 1E4는 정상 간 조직에 결합한다.
도 98a 내지 98h는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 간 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 98a 내지 98d는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 98e 내지 98h는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 98a 및 도 98e는 18B4를 사용한 염색을 보여준다. 도 98b 및 도 98f는 31A1을 사용한 염색을 보여준다. 도 98c 및 도 98g는 32C1을 사용한 염색을 보여준다. 도 98d 및 도 98h는 29H1을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 PSMGFR 펩티드의 가장 N-말단 부분인 서열 GTINVHDVET의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들 중 어느 항체도 N-10 펩티드에 결합할 수 없다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 32C1은 정상 간과의 일부 결합을 보여주고 29H1은 정상 간 조직과의 매우 강한 결합을 보여준다.
도 99a 내지 99d는 본 발명의 항체로 염색된 정상 간 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 99a 및 99b는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 99c 및 99d는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 99a 및 도 99c는 항체 8A9를 사용한 염색을 보여준다. 도 99b 및 도 99d는 항체 17H6을 사용한 염색을 보여준다. 두 항체는 PSMGFR 영역의 외부에 있고 서열 VQLTLAFRE의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 8A9는 정상 간 조직과의 강한 결합을 보여준다. 17H6은 약한 항체이고 이 연구에서 충분히 높은 농도로 사용되지 않았을 가능성이 있다.
도 100a 및 100b는 본 발명의 항체 45C11로 염색된 정상 간 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 100a는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 100b는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 항체 45C11은 PSMGFR 영역의 외부에 있고 서열 SNIKFRPGSVV의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 항체 45C11은 N-10 펩티드에 결합할 수 없다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 45C11은 정상 간 조직에 강하게 결합한다.
도 101a 내지 101h는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 폐 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 101a 내지 101d는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 101e 내지 101h는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 101a 및 도 101e는 MNC2-scFv를 사용한 염색을 보여준다. 도 101b 및 도 101f는 MNE6을 사용한 염색을 보여준다. 도 101c 및 도 101g는 20A10을 사용한 염색을 보여준다. 도 101d 및 도 101h는 3C2B1을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 서열 FPFS 또는 PFPFSAQSGA의 전체 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들은 모두 PSMGFR 펩티드에 결합할 수 있고, N-10 펩티드에 결합할 수 있으나 C-10 펩티드에는 결합하지 않는다. 또한, 이 항체들은 PSMGFR 펩티드로 예시되는 MUC1* 세포외 도메인과 NME7_AB의 결합을 파괴한다. 추가로, 이 항체들은 절단 효소가 MMP9일 때 MUC1 절단 생성물을 인식한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 정상 폐 조직과의 결합을 보여주지 않는다.
도 102a 내지 102d는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 폐 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 102a 및 102b는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 102c 및 102d는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 102a 및 도 102c는 MNC3을 사용한 염색을 보여준다. 도 102b 및 도 102d는 25E6을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 서열 ASRYNLT의 전체 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들은 모두 PSMGFR 펩티드에 결합할 수 있고, N-10 펩티드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 C-10 펩티드에도 결합할 수 있다. 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 암 특이적이지 않고 정상 폐 조직과의 일부 결합을 보여준다.
도 103a 및 103b는 본 발명의 항체 1E4로 염색된 정상 폐 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 103a는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 103b는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 항체 1E4는 서열 QFNQYKTEA의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 항체 1E4는 N-10 펩티드에 결합할 수 있을뿐만 아니라 C-10 펩티드에도 결합한다.
도 104a 내지 104h는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 폐 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 104a 내지 104d는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 104e 내지 104h는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 104a 및 도 104e는 18B4를 사용한 염색을 보여준다. 도 104b 및 도 104f는 31A1을 사용한 염색을 보여준다. 도 104c 및 도 104g는 32C1을 사용한 염색을 보여준다. 도 104d 및 도 104h는 29H1을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 PSMGFR 펩티드의 가장 N-말단 부분인 서열 GTINVHDVET의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들 중 어느 항체도 N-10 펩티드에 결합할 수 없다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 모두 정상 폐 조직과의 강한 결합을 보여준다.
도 105a 내지 105d는 본 발명의 항체로 염색된 정상 폐 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 105a 및 105b는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 105c 및 105d는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 105a 및 도 105c는 항체 8A9를 사용한 염색을 보여준다. 도 105b 및 도 105d는 항체 17H6을 사용한 염색을 보여준다. 두 항체는 PSMGFR 영역의 외부에 있고 서열 VQLTLAFRE의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 8A9는 정상 폐 조직과의 강한 결합을 보여준다. 17H6은 약한 항체이고 이 연구에서 충분히 높은 농도로 사용되지 않았을 가능성이 있다.
도 106a 및 106b는 본 발명의 항체 45C11로 염색된 정상 폐 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 106a는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 106b는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 항체 45C11은 PSMGFR 영역의 외부에 있고 서열 SNIKFRPGSVV의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 항체 45C11은 N-10 펩티드에 결합할 수 없다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 45C11은 정상 폐 조직에 결합한다.
도 107a 내지 107h는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 골수 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 107a 내지 107d는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 107e 내지 107h는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 107a 및 도 107e는 MNC2-scFv를 사용한 염색을 보여준다. 도 107b 및 도 107f는 MNE6을 사용한 염색을 보여준다. 도 107c 및 도 107g는 20A10을 사용한 염색을 보여준다. 도 107d 및 도 107h는 3C2B1을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 서열 FPFS 또는 PFPFSAQSGA의 전체 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들은 모두 PSMGFR 펩티드에 결합할 수 있고, N-10 펩티드에 결합할 수 있으나 C-10 펩티드에는 결합하지 않는다. 또한, 이 항체들은 PSMGFR 펩티드로 예시되는 MUC1* 세포외 도메인과 NME7_AB의 결합을 파괴한다. 또한, 이 항체들은 절단 효소가 MMP9일 때 MUC1 절단 생성물을 인식한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 정상 골수 조직과의 결합을 보여주지 않는다.
도 108a 내지 108d는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 골수 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 108a 및 108b는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 108c 및 108d는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 108a 및 도 108c는 MNC3을 사용한 염색을 보여준다. 도 108b 및 도 108d는 25E6을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 서열 ASRYNLT의 전체 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들은 모두 PSMGFR 펩티드에 결합할 수 있고, N-10 펩티드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 C-10 펩티드에도 결합할 수 있다.
도 109a 및 109b는 본 발명의 항체 1E4로 염색된 정상 골수 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 109a는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 109b는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 항체 1E4는 서열 QFNQYKTEA의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 항체 1E4는 N-10 펩티드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 C-10 펩티드에도 결합한다. 1E4는 정상 골수에 결합한다.
도 110a 내지 110h는 본 발명의 상이한 항체로 염색된 정상 골수 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 110a 내지 110d는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 110e 내지 110h는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 110a 및 도 110e는 18B4를 사용한 염색을 보여준다. 도 110b 및 도 110f는 31A1을 사용한 염색을 보여준다. 도 110c 및 도 110g는 32C1을 사용한 염색을 보여준다. 도 110d 및 도 110h는 29H1을 사용한 염색을 보여준다. 이 항체들은 PSMGFR 펩티드의 가장 N-말단 부분인 서열 GTINVHDVET의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 항체들 중 어느 항체도 N-10 펩티드에 결합할 수 없다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들은 모두 정상 골수 조직과의 강한 결합을 보여준다.
도 111a 내지 111d는 본 발명의 항체로 염색된 정상 골수 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 111a 및 111b는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 111c 및 111d는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 도 111a 및 도 111c는 항체 8A9를 사용한 염색을 보여준다. 도 111b 및 도 111d는 항체 17H6을 사용한 염색을 보여준다. 두 항체는 PSMGFR 영역의 외부에 있고 서열 VQLTLAFRE의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 8A9는 정상 골수 조직과의 강한 결합을 보여준다. 17H6은 약한 항체이고 이 연구에서 충분히 높은 농도로 사용되지 않았을 가능성이 있다.
도 112a 및 112b는 본 발명의 항체 45C11로 염색된 정상 골수 조직 표본의 사진을 보여준다. 도 112a는 전체 조직 코어를 보여준다. 도 112b는 조직의 특정 영역의 40배 확대를 보여준다. 항체 45C11은 PSMGFR 영역의 외부에 있고 서열 SNIKFRPGSVV의 전부 또는 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 항체 45C11은 N-10 펩티드에 결합할 수 없다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 45C11은 정상 골수 조직에 결합한다.
도 113a 내지 113c는 0.25 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 20A10으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 113a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 113b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 113c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 114a 내지 114x는 6배 및 20배로 확대된, 0.25 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 20A10으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 114a 및 도 114e는 부신이다. 도 114b 및 도 114f는 유방이다. 도 114c 및 도 114g는 나팔관이다. 도 114d 및 도 114h는 신장이다. 도 114i 및 도 114m은 심장근이다. 도 114j 및 도 114n은 간이다. 도 114k 및 도 114o는 폐이다. 도 114l 및 도 114p는 요관이다. 도 114q 및 도 114u는 눈이다. 도 114r 및 도 114v는 대뇌 피질이다. 도 114s 및 도 114w는 골수이다. 도 114t 및 도 114x는 골격근이다.
도 115a 내지 115c는 0.25 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 20A10으로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 115a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 115b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 115c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 116a 내지 116f는 6배 및 20배로 확대된, 0.25 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 20A10으로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 116a 및 도 116d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 116b 및 도 116e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 116c 및 도 116f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 117a 내지 117c는 0.25 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 20A10으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA805c의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 117a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 117b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 117c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 118a 내지 118f는 6배 및 20배로 확대된, 0.25 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 20A10으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA805c로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 118a 및 도 118d는 등급 2 유두 선암종의 사진이다. 도 118b 및 도 118e는 등급 2 내지 3 관 암종의 사진이다. 도 118c 및 도 118f는 등급 3 침습성 선암종의 사진이다.
도 119a 내지 119c는 0.25 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 20A10으로 염색된 식도암 조직 어레이 BC001113의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 119a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 119b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 119c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 120a 내지 120f는 6배 및 20배로 확대된, 0.25 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 20A10으로 염색된 식도암 조직 어레이 BC001113으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 120a 및 도 120d는 위치 A1에서의 표본의 사진이다. 도 120b 및 도 120e는 위치 A7에서의 표본의 사진이다. 도 120c 및 도 120f는 위치 A8에서의 표본의 사진이다.
도 121a 내지 121c는 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 121a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 121b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 121c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 122a 내지 122x는 6배 및 20배로 확대된, 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 122a 및 도 122e는 부신이다. 도 122b 및 도 122f는 유방이다. 도 122c 및 도 122g는 나팔관이다. 도 122d 및 도 122h는 신장이다. 도 122i 및 도 122m은 심장근이다. 도 122j 및 도 122n은 간이다. 도 122k 및 도 122o는 폐이다. 도 122l 및 도 122p는 요관이다. 도 122q 및 도 122u는 눈이다. 도 122r 및 도 122v는 대뇌 피질이다. 도 122s 및 도 122w는 골수이다. 도 122t 및 도 122x는 골격근이다.
도 123a 내지 123c는 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 123a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 123b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 123c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 124a 내지 124f는 6배 및 20배로 확대된, 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 124a 및 도 124d는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 124b 및 도 124e는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 124c 및 도 124f는 등급 2 선암종의 사진이다.
도 125a 내지 125c는 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 125a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 125b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 125c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 126a 내지 126f는 6배 및 20배로 확대된, 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 126a 및 도 126d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 126b 및 도 126e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 126c 및 도 126f는 등급 2 침습성 암종의 사진이다.
도 127a 내지 127c는 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 127a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 127b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 127c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 128a 내지 128x는 6배 및 20배로 확대된, 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 128a 및 도 128e는 부신이다. 도 128b 및 도 128f는 유방이다. 도 128c 및 도 128g는 나팔관이다. 도 128d 및 도 128h는 신장이다. 도 128i 및 도 128m은 심장근이다. 도 128j 및 도 128n은 간이다. 도 128k 및 도 128o는 폐이다. 도 128l 및 도 128p는 요관이다. 도 128q 및 도 128u는 눈이다. 도 128r 및 도 128v는 대뇌 피질이다. 도 128s 및 도 128w는 골수이다. 도 128t 및 도 128x는 골격근이다.
도 129a 내지 129c는 1 내지 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 129a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 129b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 129c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 130a 내지 130f는 6배 및 20배로 확대된, 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 130a 및 도 130d는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 130b 및 도 130e는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 130c 및 도 130f는 등급 2 선암종의 사진이다.
도 131a 내지 131c는 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 131a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 131b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 131c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 132a 내지 132f는 6배 및 20배로 확대된, 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 132a 및 도 132d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 132b 및 도 132e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 132c 및 도 132f는 등급 2 침습성 암종의 사진이다.
도 133a 내지 133c는 10 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18B4로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 133a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 133b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 133c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 134a 내지 134x는 6배 및 20배로 확대된, 10 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18B4로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 134a 및 도 134e는 부신이다. 도 134b 및 도 134f는 유방이다. 도 134c 및 도 134g는 나팔관이다. 도 134d 및 도 134h는 신장이다. 도 134i 및 도 134m은 심장근이다. 도 134j 및 도 134n은 간이다. 도 134k 및 도 134o는 폐이다. 도 134l 및 도 134p는 요관이다. 도 134q 및 도 134u는 눈이다. 도 134r 및 도 134v는 대뇌 피질이다. 도 134s 및 도 134w는 골수이다. 도 134t 및 도 134x는 골격근이다.
도 135a 내지 135c는 10 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18B4로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 135a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 135b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 135c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 136a 내지 136f는 6배 및 20배로 확대된, 10 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18B4로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 136a 및 도 136d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 136b 및 도 136e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 136c 및 도 136f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 137a 내지 137c는 10 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18B4로 염색된 식도암 조직 어레이 BC001113의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 137a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 137b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 137c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 138a 내지 138f는 6배 및 20배로 확대된, 10 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18B4로 염색된 식도암 조직 어레이 BC001113으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 138a 및 도 138d는 위치 A1에서의 표본의 사진이다. 도 138b 및 도 138e는 위치 A7에서의 표본의 사진이다. 도 138c 및 도 138f는 위치 A8에서의 표본의 사진이다.
도 139a 내지 139c는 10 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18G12로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 139a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 139b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 139c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 140a 내지 140x는 6배 및 20배로 확대된, 10 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18G12로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 140a 및 도 140e는 부신이다. 도 140b 및 도 140f는 유방이다. 도 140c 및 도 140g는 나팔관이다. 도 140d 및 도 140h는 신장이다. 도 140i 및 도 140m은 심장근이다. 도 140j 및 도 140n은 간이다. 도 140k 및 도 140o는 폐이다. 도 140l 및 도 140p는 요관이다. 도 140q 및 도 140u는 눈이다. 도 140r 및 도 140v는 대뇌 피질이다. 도 140s 및 도 140w는 골수이다. 도 140t 및 도 140x는 골격근이다.
도 141a 내지 141c는 15 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18G12로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 141a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 141b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 141c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 142a 내지 142f는 6배 및 20배로 확대된, 15 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18G12로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 142a 및 도 142d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 142b 및 도 142e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 142c 및 도 142f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 143a 내지 143c는 15 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18G12로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 143a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 143b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 143c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 144a 내지 144f는 6배 및 20배로 확대된, 15 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18G12로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 144a 및 도 144d는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 144b 및 도 144e는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 144c 및 도 144f는 림프절 침습이 있는 등급 2 내지 3 선암종의 사진이다.
도 145a 내지 145c는 30 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18G12로 염색된 식도암 조직 어레이 BC001113의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 145a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 145b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 145c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 146a 내지 146f는 6배 및 20배로 확대된, 30 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 18G12로 염색된 식도암 조직 어레이 BC001113으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 146a 및 도 146d는 위치 A1에서의 표본의 사진이다. 도 146b 및 도 146e는 위치 A7에서의 표본의 사진이다. 도 146c 및 도 146f는 위치 A8에서의 표본의 사진이다.
도 147a 내지 147c는 5.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 25E6으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 147a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 147b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 147c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 148a 내지 148x는 6배 및 20배로 확대된, 5.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 25E6으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 148a 및 도 148e는 부신이다. 도 148b 및 도 148f는 유방이다. 도 148c 및 도 148g는 나팔관이다. 도 148d 및 도 148h는 신장이다. 도 148i 및 도 148m은 심장근이다. 도 148j 및 도 148n은 간이다. 도 148k 및 도 148o는 폐이다. 도 148l 및 도 148p는 요관이다. 도 148q 및 도 148u는 눈이다. 도 148r 및 도 148v는 대뇌 피질이다. 도 148s 및 도 148w는 골수이다. 도 148t 및 도 148x는 골격근이다.
도 149a 내지 149c는 5.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 25E6으로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 149a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 149b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 149c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 150a 내지 150f는 6배 및 20배로 확대된, 5.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 25E6으로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 150a 및 도 150d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 150b 및 도 150e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 150c 및 도 150f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 151a 내지 151c는 5.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 25E6으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 151a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 151b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 151c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 152a 내지 152f는 6배 및 20배로 확대된, 5.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 25E6으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 152a 및 도 152d는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 152b 및 도 152e는 등급 1 선암종의 사진이다. 도 152c 및 도 152f는 등급 1 선암종의 사진이다.
도 153a 내지 153c는 15.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 28F9로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 153a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 153b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 153c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 154a 내지 154x는 6배 및 20배로 확대된, 15.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 28F9로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 154a 및 도 154e는 부신이다. 도 154b 및 도 154f는 유방이다. 도 154c 및 도 154g는 나팔관이다. 도 154d 및 도 154h는 신장이다. 도 154i 및 도 154m은 심장근이다. 도 154j 및 도 154n은 간이다. 도 154k 및 도 154o는 폐이다. 도 154l 및 도 154p는 요관이다. 도 154q 및 도 154u는 눈이다. 도 154r 및 도 154v는 대뇌 피질이다. 도 154s 및 도 154w는 골수이다. 도 154t 및 도 154x는 골격근이다.
도 155a 내지 155c는 15.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 28F9로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 155a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 155b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 155c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 156a 내지 156f는 6배 및 20배로 확대된, 15.0 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 28F9로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 156a 및 도 156d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 156b 및 도 156e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 156c 및 도 156f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 157a 내지 157c는 7.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 1E4로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 157a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 157b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 157c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 158a 내지 158x는 6배 및 20배로 확대된, 7.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 1E4로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 158a 및 도 158e는 부신이다. 도 158b 및 도 158f는 유방이다. 도 158c 및 도 158g는 나팔관이다. 도 158d 및 도 158h는 신장이다. 도 158i 및 도 158m은 심장근이다. 도 158j 및 도 158n은 간이다. 도 158k 및 도 158o는 폐이다. 도 158l 및 도 158p는 요관이다. 도 158q 및 도 158u는 눈이다. 도 158r 및 도 158v는 대뇌 피질이다. 도 158s 및 도 158w는 골수이다. 도 158t 및 도 158x는 골격근이다.
도 159a 내지 159c는 10.0 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 1E4로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1007의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 159a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 159b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 159c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 160a 내지 160f는 6배 및 20배로 확대된, 10.0 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 1E4로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1007로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 160a 및 도 160d는 양성 림프절을 가진 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 160b 및 도 160e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 160c 및 도 160f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 161a 내지 161c는 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 29H1로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 161a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 161b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 161c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 162a 내지 162x는 6배 및 20배로 확대된, 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 29H1로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 162a 및 도 162e는 부신이다. 도 162b 및 도 162f는 유방이다. 도 162c 및 도 162g는 나팔관이다. 도 162d 및 도 162h는 신장이다. 도 162i 및 도 162m은 심장근이다. 도 162j 및 도 162n은 간이다. 도 162k 및 도 162o는 폐이다. 도 162l 및 도 162p는 요관이다. 도 162q 및 도 162u는 눈이다. 도 162r 및 도 162v는 대뇌 피질이다. 도 162s 및 도 162w는 골수이다. 도 162t 및 도 162x는 골격근이다.
도 163a 내지 163c는 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 29H1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 163a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 163b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 163c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 164a 내지 164f는 6배 및 20배로 확대된, 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 29H1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 164a 및 도 164d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 164b 및 도 164e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 164c 및 도 164f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 165a 내지 165c는 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 29H1로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 165a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 165b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 165c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 166a 내지 166f는 6배 및 20배로 확대된, 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 29H1로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 166a 및 도 166d는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 166b 및 도 166e는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 166c 및 도 166f는 등급 3 선암종의 사진이다.
도 167a 내지 167c는 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 31A1로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 167a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 167b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 167c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 168a 내지 168x는 6배 및 20배로 확대된, 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 31A1로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 168a 및 도 168e는 부신이다. 도 168b 및 도 168f는 유방이다. 도 168c 및 도 168g는 나팔관이다. 도 168d 및 도 168h는 신장이다. 도 168i 및 도 168m은 심장근이다. 도 168j 및 도 168n은 간이다. 도 168k 및 도 168o는 폐이다. 도 168l 및 도 168p는 요관이다. 도 168q 및 도 168u는 눈이다. 도 168r 및 도 168v는 대뇌 피질이다. 도 168s 및 도 168w는 골수이다. 도 168t 및 도 168x는 골격근이다.
도 169a 내지 169c는 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 31A1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 169a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 169b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 169c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 170a 내지 170f는 6배 및 20배로 확대된, 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 31A1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 170a 및 도 170d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 170b 및 도 170e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 170c 및 도 170f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 171a 내지 171c는 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 31A1로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 171a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 171b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 171c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 172a 내지 172f는 6배 및 20배로 확대된, 0.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 31A1로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 172a 및 도 172d는 등급 1 선암종의 사진이다. 도 172b 및 도 172e는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 172c 및 도 172f는 등급 3 선암종의 사진이다.
도 173a 내지 173c는 0.25 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 32C1로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 173a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 173b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 173c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 174a 내지 174x는 6배 및 20배로 확대된, 0.25 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 32C1로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 174a 및 도 174e는 부신이다. 도 174b 및 도 174f는 유방이다. 도 174c 및 도 174g는 나팔관이다. 도 174d 및 도 174h는 신장이다. 도 174i 및 도 174m은 심장근이다. 도 174j 및 도 174n은 간이다. 도 174k 및 도 174o는 폐이다. 도 174l 및 도 174p는 요관이다. 도 174q 및 도 174u는 눈이다. 도 174r 및 도 174v는 대뇌 피질이다. 도 174s 및 도 174w는 골수이다. 도 174t 및 도 174x는 골격근이다.
도 175a 내지 175c는 5.0 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 32C1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 175a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 175b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 175c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 176a 내지 176f는 6배 및 20배로 확대된, 5.0 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 32C1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 176a 및 도 176d는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 176b 및 도 176e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 176c 및 도 176f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 177a 내지 177c는 1.0 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 32C1로 염색된 식도암 조직 어레이 ES1001의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 177a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 177b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 177c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 178a 내지 178f는 6배 및 20배로 확대된, 1.0 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 32C1로 염색된 식도암 조직 어레이 BC001113으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 178a 및 도 178d는 편평 세포 암종의 사진이다. 도 178b 및 도 178e는 선암종의 사진이다. 도 178c 및 도 178f는 편평 세포 암종의 사진이다.
도 179a 내지 179c는 12.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 45C11로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 179a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 179b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 179c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 180a 내지 180x는 6배 및 20배로 확대된, 12.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 45C11로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 180a 및 도 180e는 부신이다. 도 180b 및 도 180f는 유방이다. 도 180c 및 도 180g는 나팔관이다. 도 180d 및 도 180h는 신장이다. 도 180i 및 도 180m은 심장근이다. 도 180j 및 도 180n은 간이다. 도 180k 및 도 180o는 폐이다. 도 180l 및 도 180p는 요관이다. 도 180q 및 도 180u는 눈이다. 도 180r 및 도 180v는 대뇌 피질이다. 도 180s 및 도 180w는 골수이다. 도 180t 및 도 180x는 골격근이다.
도 181a 내지 181c는 10.0 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 45C11로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1007의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 181a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 181b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 181c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 182a 내지 182f는 6배 및 20배로 확대된, 10.0 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 45C11로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1007로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 182a 및 도 182d는 양성 림프절을 가진 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 182b 및 도 182e는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다. 도 182c 및 도 182f는 등급 2 침습성 관 암종의 사진이다.
도 183a 내지 183c는 12.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 45C11로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA805c의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 183a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 183b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 183c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 184a 내지 184f는 6배 및 20배로 확대된, 12.5 ㎍/㎖의 N+20/C-27 항체 45C11로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA805c로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 184a 및 도 184d는 등급 2 유두 선암종의 사진이다. 도 184b 및 도 184e는 등급 2 내지 3 관 암종의 사진이다. 도 184c 및 도 184f는 등급 3 침습성 선암종의 사진이다.
도 185a 내지 185c는 10.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 3C5로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 185a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 185b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 185c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 186a 내지 186x는 6배 및 20배로 확대된, 10.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 3C5로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 186a 및 도 186e는 부신이다. 도 186b 및 도 186f는 유방이다. 도 186c 및 도 186g는 나팔관이다. 도 186d 및 도 186h는 신장이다. 도 186i 및 도 186m은 심장근이다. 도 186j 및 도 186n은 간이다. 도 186k 및 도 186o는 폐이다. 도 186l 및 도 186p는 요관이다. 도 186q 및 도 186u는 눈이다. 도 186r 및 도 186v는 대뇌 피질이다. 도 186s 및 도 186w는 골수이다. 도 186t 및 도 186x는 골격근이다.
도 187a 내지 187c는 10.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 3C5로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 187a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 187b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 187c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 188a 내지 188f는 6배 및 20배로 확대된, 10.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 3C5로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 188a 및 도 188d는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 188b 및 도 188e는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 188c 및 도 188f는 림프절 침습이 있는 등급 2 내지 3 선암종의 사진이다.
도 189a 내지 189c는 15.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 8A9로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 189a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 189b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 189c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 190a 내지 190x는 6배 및 20배로 확대된, 15.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 8A9로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 190a 및 도 190e는 부신이다. 도 190b 및 도 190f는 유방이다. 도 190c 및 도 190g는 나팔관이다. 도 190d 및 도 190h는 신장이다. 도 190i 및 도 190m은 심장근이다. 도 190j 및 도 190n은 간이다. 도 190k 및 도 190o는 폐이다. 도 190l 및 도 190p는 요관이다. 도 190q 및 도 190u는 눈이다. 도 190r 및 도 190v는 대뇌 피질이다. 도 190s 및 도 190w는 골수이다. 도 190t 및 도 190x는 골격근이다.
도 191a 내지 191c는 15.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 8A9로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 191a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 191b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 191c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 192a 내지 192f는 6배 및 20배로 확대된, 15.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 8A9로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 192a 및 도 192d는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 192b 및 도 192e는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 192c 및 도 192f는 등급 2 선암종의 사진이다.
도 193a 내지 193c는 30.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 17H6으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 193a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 193b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 193c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 194a 내지 194x는 6배 및 20배로 확대된, 30.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 17H6으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 194a 및 도 194e는 부신이다. 도 194b 및 도 194f는 유방이다. 도 194c 및 도 194g는 나팔관이다. 도 194d 및 도 194h는 신장이다. 도 194i 및 도 194m은 심장근이다. 도 194j 및 도 194n은 간이다. 도 194k 및 도 194o는 폐이다. 도 194l 및 도 194p는 요관이다. 도 194q 및 도 194u는 눈이다. 도 194r 및 도 194v는 대뇌 피질이다. 도 194s 및 도 194w는 골수이다. 도 194t 및 도 194x는 골격근이다.
도 195a 내지 195c는 30.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 17H6으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA805c의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 195a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 195b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 195c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 196a 내지 196f는 6배 및 20배로 확대된, 30.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 17H6으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA805c로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 196a 및 도 196d는 등급 2 유두 선암종의 사진이다. 도 196b 및 도 196e는 림프절 침습이 있는 등급 2 내지 3 관 암종의 사진이다. 도 196c 및 도 196f는 등급 3 침습성 선암종의 사진이다.
도 197a 내지 197c는 5.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 39H5로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 197a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 197b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 197c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 198a 내지 198x는 6배 및 20배로 확대된, 5.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 39H5로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 198a 및 도 198e는 부신이다. 도 198b 및 도 198f는 유방이다. 도 198c 및 도 198g는 나팔관이다. 도 198d 및 도 198h는 신장이다. 도 198i 및 도 198m은 심장근이다. 도 198j 및 도 198n은 간이다. 도 198k 및 도 198o는 폐이다. 도 198l 및 도 198p는 요관이다. 도 198q 및 도 198u는 눈이다. 도 198r 및 도 198v는 대뇌 피질이다. 도 198s 및 도 198w는 골수이다. 도 198t 및 도 198x는 골격근이다.
도 199a 내지 199c는 5.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 39H5로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진, 어레이 맵 및 설명을 보여준다. 도 199a는 조직 마이크로어레이의 사진을 보여준다. 도 199b는 축약된 조직 기술어와 함께 어레이의 맵을 보여준다. 도 199c는 비-식별 기증자 데이터와 함께 조직 마이크로어레이의 상세한 설명을 보여준다.
도 200a 내지 200f는 6배 및 20배로 확대된, 5.0 ㎍/㎖의 N+9/C-9 항체 39H5로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 200a 및 도 200d는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 200b 및 도 200e는 등급 2 선암종의 사진이다. 도 200c 및 도 200f는 등급 2 선암종의 사진이다.
도 201a 내지 201c는 동물을 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 또 다른 항체 세트의 결합을 확인하기 위한 ELISA 어세이의 그래프를 보여준다. 도 201a는 PSMGFR 펩티드와의 결합을 보여준다. 도 201b는 N-10 펩티드와의 결합을 보여준다. 도 201c는 C-10 펩티드와의 결합을 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 항체들 중 어느 항체도 C-10 펩티드에 결합하지 않았다. F3, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11은 모두 PSMGFR 펩티드 및 N-10 펩티드에 결합하였다.
도 202a 내지 202c는 단일클론 항체 1E4, 단일클론 항체 18B4 또는 다중클론 항-PSMGFR 항체 SDIX로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진을 보여준다. 18B4는 PSMGFR 펩티드의 가장 N-말단 부분에서 GTINVHDVET 에피토프에 결합하는 반면, 1E4 항체는 18B4 에피토프에 바로 인접하고 C-말단에 있는 QFNQYKTEA 에피토프에 결합한다.
도 203a 내지 203f는 췌장암 어레이 PA1003의 위치 A2에서 조직 표본의 확대된 이미지를 보여준다. 도 203a 및 도 203b는 항체 1E4로 염색된 표본을 보여준다. 도 203c 및 도 203d는 항체 18B4로 염색된 표본을 보여준다. 도 203e 및 도 203f는 다중클론 항체 SDIX로 염색된 표본을 보여준다.
도 204a 내지 204d는 췌장 어레이 PA1003의 위치 D4에서 조직 표본의 확대된 이미지를 보여준다. 도 204a 및 도 204b는 항체 18B4로 염색된 표본을 보여준다. 도 204c 및 도 204d는 다중클론 항체 SDIX로 염색된 표본을 보여준다.
도 205a 내지 205d는 췌장암 어레이 PA1003의 위치 E1에서 조직 표본의 확대된 이미지를 보여준다. 도 205a 및 도 205b는 항체 18B4로 염색된 표본을 보여준다. 도 205c 및 도 205d는 다중클론 항체 SDIX로 염색된 표본을 보여준다.
도 206a 내지 206d는 췌장암 어레이 PA1003의 위치 C3에서 조직 표본의 확대된 이미지를 보여준다. 도 206a 및 도 206b는 항체 1E4로 염색된 표본을 보여준다. 도 206c 및 도 206d는 다중클론 항체 SDIX로 염색된 표본을 보여준다.
도 207a 내지 207d는 췌장암 어레이 PA1003의 위치 D1에서 조직 표본의 확대된 이미지를 보여준다. 도 207a 및 도 207b는 항체 1E4로 염색된 표본을 보여준다. 도 207c 및 도 207d는 다중클론 항체 SDIX로 염색된 표본을 보여준다.
도 208a 내지 208c는 췌장암 어레이 PA1003의 사진을 보여준다. 도 208a는 다중클론 항체 SDIX로 염색된 표본을 보여준다. 도 208b는 항체 20A10으로 염색된 표본을 보여준다. 도 208c는 항체 29H1로 염색된 표본을 보여준다.
도 209a 내지 209d는 다양한 항체로 염색된 식도암 어레이 ES1001의 사진을 보여준다. 도 209a는 다중클론 항체 SDIX로 염색된 어레이를 보여준다. 도 209b는 항체 20A10으로 염색된 어레이를 보여준다. 도 209c는 항체 29H1로 염색된 어레이를 보여준다. 도 209d는 항체 31A1로 염색된 어레이를 보여준다.
도 210a 내지 210c는 다양한 항체로 염색된 췌장암 어레이 PA1003의 사진을 보여준다. 도 210a는 다중클론 항체 SDIX로 염색된 어레이를 보여준다. 도 210b는 항체 20A10으로 염색된 어레이를 보여준다. 도 210c는 항체 29H1로 염색된 어레이를 보여준다.
도 211a 내지 211c는 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 MUC1* 양성 암 세포의 컨디셔닝 배지 내로 분비된 IL-18의 양을 측정하는 ELISA 실험의 그래프를 보여주는 것으로, 이때 세포는 NFAT 유도성 IL-18도 보유한다. 도 211a는 형질도입되지 않은 인간 T 세포와 공-배양된 T47D 유방암 세포의 상청액 내로 분비된 IL-18의 그래프를 보여준다. 도 211b는 Foxp3 인핸서의 일부에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자도 보유하는 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 T47D 유방암 세포의 상청액 내로 분비된 IL-18의 그래프를 보여준다. 도 211c는 IL-2 인핸서의 일부에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자도 보유하는 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 T47D 유방암 세포의 상청액 내로 분비된 IL-18의 그래프를 보여준다.
도 212a 내지 212x는 더 많은 MUC1*를 발현하도록 조작된 다양한 퍼센트의 T47D 세포(녹색)로 도핑된 T47D 유방암 세포(적색)의 사진을 보여준다. 표적 암 세포를, NFAT 유도성 IL-18을 가진 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양하였는데, 이때 IL-18 유전자는 Foxp3 인핸서/프로모터 또는 IL-2 인핸서/프로모터에 삽입되어 있다. 도 212a 내지 212c, 212i 내지 212k 및 212q 내지 212s는 형질도입되지 않은 T 세포와 공-배양된 암 세포를 보여준다. 도 212d 내지 212f, 212l 내지 212n 및 212t 내지 212v는 Foxp3 인핸서/프로모터에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자를 가진 hiMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 암 세포를 보여준다. 도 212g, 212h, 212o, 212p, 212w 및 212x는 IL-2 인핸서/프로모터에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자를 가진 hiMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 암 세포를 보여준다.
도 213a 및 213b는 MUC1* 양성 암 세포 또는 MUC1 음성 비-암성 세포와 공배양된, Foxp3 인핸서 또는 프로모터에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자를 가진 huMNC1-CAR44 T 세포에 대해 컨디셔닝 배지 내로 분비된 IL-18의 수준을 측정하는 ELISA 실험의 그래프를 보여준다. 도 213a는 집단이 훨씬 더 많은 MUC1*로 형질감염된 5%, 10% 또는 30% T47D 세포로 도핑된 경우 T47D 유방암 세포와 공-배양된, NFAT 유도성 IL-18을 가진 huMNC2-CAR44 T 세포로부터의 IL-18 분비를 보여준다. 도 213b는 세포 집단이 훨씬 더 많은 MUC1*로 형질감염된 5%, 10% 또는 30% T47D 세포로 도핑된 경우 비-암성 MUC1 음성 HEK293 세포와 공-배양된, NFAT 유도성 IL-18을 가진 huMNC2-CAR44 T 세포로부터의 IL-18 분비를 보여준다.
도 214a 내지 214x는 T47D 유방암 세포(적색) 또는 비-암성 HEK293 세포(마찬가지로 적색)의 사진을 보여주는 것으로, 이때 두 세포 유형은 더 많은 MUC1*를 발현하도록 조작된 다양한 퍼센트의 T47D 세포(녹색)로 도핑되어 있다. 이 표적 암 세포들을, NFAT 유도성 IL-18을 가진 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양하였는데, 이때 IL-18 유전자는 Foxp3 인핸서/프로모터에 삽입되어 있다. 도 214a 내지 214f는 높은 MUC1* 밀도를 발현하도록 조작된 T47D 세포로 도핑되지 않은 T47D 세포 또는 HEK293 세포를 보여준다. 도 214g 내지 214l은 높은 MUC1* 밀도를 발현하도록 조작된 5% T47D 세포로 도핑된 T47D 세포 또는 HEK293 세포를 보여준다. 도 214m 내지 214r은 높은 MUC1* 밀도를 발현하도록 조작된 10% T47D 세포로 도핑된 T47D 세포 또는 HEK293 세포를 보여준다. 도 214s 내지 214x는 높은 MUC1* 밀도를 발현하도록 조작된 30% T47D 세포로 도핑된 T47D 세포 또는 HEK293 세포를 보여준다. 도 214a, 214b, 214g, 214h, 214m, 214n, 214s 및 214t는 T47D 유방암 세포를 보여준다. 도 214c 내지 214f, 214i 내지 214l, 214o 내지 214r 및 214u 내지 214x는 HEK293 세포를 보여준다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, IL-18의 유도된 분비는 MUC1* 밀도가 낮은 T47D 세포가 사멸되게 하였으나, MUC1* 음성 HEK293 세포의 비특이적 사멸을 유도하지 않았다.
도 215a 내지 215c는 중쇄 CDR의 컨센서스 서열을 보여주는 것으로, 이때 컨센서스 서열은 PSMGFR 및 N-말단 확장된 PSMGFR 펩티드에서 동일한 에피토프에 결합된 항체의 각각의 군에 대해 생성되었다. 도 215a는 중쇄 CDR1에 대한 컨센서스 서열을 보여준다. 도 215b는 중쇄 CDR2에 대한 컨센서스 서열을 보여준다. 도 215c는 중쇄 CDR3에 대한 컨센서스 서열을 보여준다.
도 216a 내지 216c는 경쇄 CDR의 컨센서스 서열을 보여주는 것으로, 이때 컨센서스 서열은 PSMGFR 및 N-말단 확장된 PSMGFR 펩티드에서 동일한 에피토프에 결합된 항체의 각각의 군에 대해 생성되었다. 도 216a는 경쇄 CDR1에 대한 컨센서스 서열을 보여준다. 도 216b는 경쇄 CDR2에 대한 컨센서스 서열을 보여준다. 도 216c는 경쇄 CDR3에 대한 컨센서스 서열을 보여준다.
도 217은 5개 주요 부류인 BsIgG, 부가된 IgG, BsAb 단편, 이중특이적 융합 단백질 및 BsAb 접합체로 세분된 이중특이적 항체 및 다른 이중특이적 면역치료제에 대한 대안적 포맷을 보여준다. 중쇄는 짙은 청색, 짙은 분홍색 및 짙은 녹색으로 표시되어 있으며, 상응하는 경쇄는 동일한 색상의 더 밝은 색조로 표시되어 있다. 연결 펩티드 링커는 얇은 흑색 선으로 표시되어 있고 조작된 디설파이드 결합은 얇은 녹색 선으로 표시되어 있다. 면역글로불린 도메인당 약 12.5 kDa을 가정하여 대략적인 분자량이 표시되어 있다. 임상 시험으로 진행된 BsAb 포맷은 강조되어 있다(*). 이 도면 설명에서 색상의 언급의 해석을 위해, 독자는 문헌[Spiess et al. Molecular Immunology 67, 95-106 (2015)]의 웹 버전을 참조한다(이 문헌의 내용은 그의 전체, 특히 문헌[Spiess et al.]의 도 1의 설명뿐만 아니라 이중특이적 항체 단편의 다양한 제조 및 사용 방법들의 다른 설명도 참고로 포함됨).
도 218은 IVIS 기기에 의해 측정된 종양 부피의 그래프를 보여주는 것으로, 이때 종양 세포는 루시퍼라제를 발현하도록 유전적으로 변형되어 있다. 진정된 동물에서 광 방출을 측정하기 10분 전에 기질 루시페린을 주사하였다. 실험 1일째 날, 250,000개의 인간 유방 종양 세포를 동물에게 피하 주사하였다. 종양은 불균질해져, 2개의 상이한 종양 세포 유형으로 구성되었다. 제1 종양 세포 집단은 전체 길이 MUC1 및 성장 인자 수용체 형태 MUC1* 둘 다를 발현하는 유방암 세포주인 T47D-wt이었고, 본 발명자들은 mCherry 형광을 발현하도록 이 세포주를 조작하였다. 제2 종양 세포 집단은 훨씬 더 많은 MUC1* 및 GFP 형광을 발현하도록 안정적으로 형질도입되었다는 점을 제외하고 동일한 T47D 유방암 세포(본원에서 T47D-MUC1*로서 지칭됨)이었다. 이 실험에서 T47D-wt와 T47D-MUC1*를 동물에 이식하였는데, 이때 T47D-MUC1*의 집단은 종양 집단의 30%, 15% 또는 7.5%를 구성하였다. 이어서, PBS, huMNC2-41BB-3z CAR T 세포(4-1BB), huMNC2-CD28-3z CAR T 세포(CD28) 또는 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포(CD28-1XX 또는 1XX)의 1회 주사를 동물에게 투여하였다. CAR T 세포를 10:1, 5:1 또는 1:1의 이펙터 대 표적 비(E:T)로 꼬리 정맥에 주사하였다.
도 219a 및 219b는 IVIS 사진 및 IVIS 종양 부피 측정의 그래프를 보여준다. 도 219a는 암 세포 집단의 30%가 본원에서 고항원 발현 세포로서 지칭되는 T47D-MUC1*인 종양을 이식받은 마우스의 사진을 보여준다. 다양한 CAR T 세포를 10:1의 CAR T 대 종양 세포 비로 투여하였는데, 이때 250,000개의 종양 세포를 이식하였고 5일 후 2,500,000개의 CAR T 세포를 동물에 주사하였다. 도 219b는 일별 IVIS 측정에 의한 종양 부피의 그래프를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CD28-1XX를 주사한 동물은 CD3-제타 도메인에서 1XX 돌연변이를 갖지 않는다는 점을 제외하고 동일한 CAR T인 huMNC2-4-1BB-3z 또는 huMNC2-CD28-3z로 치료받은 동물보다 훨씬 더 작은 종양을 가졌다.
도 220a 내지 220t는 10:1의 CAR T 대 종양 비로 치료받은 30% 종양에 대한 IVIS 그래프를 보여준다. 여기서, 그래프는 치료군의 평균보다는 각각의 개별 동물에 대해 표시되어 있다.
도 221a 및 221b는 IVIS 사진 및 IVIS 종양 부피 측정의 그래프를 보여준다. 도 221a는 암 세포 집단의 30%가 본원에서 고항원 발현 세포로서 지칭되는 T47D-MUC1*인 종양을 이식받은 마우스의 사진을 보여준다. 다양한 CAR T 세포를 1:1의 CAR T 대 종양 세포 비로 투여하였는데, 이때 250,000개의 종양 세포를 이식하였고 5일 후 250,000개의 CAR T 세포를 동물에 주사하였다. 도 221b는 일별 IVIS 측정에 의한 종양 부피의 그래프를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CD28-1XX를 주사한 동물은 CD3-제타 도메인에서 1XX 돌연변이를 갖지 않는다는 점을 제외하고 동일한 CAR T인 huMNC2-4-1BB-3z 또는 huMNC2-CD28-3z로 치료받은 동물보다 훨씬 더 작은 종양을 가졌다. 그러나, 더 낮은 용량의 CAR T 세포의 사용 시, huMNC2-CD28-1XX 치료군에서도 종양이 다시 성장하기 시작한다.
도 222a 내지 222t는 1:1의 CAR T 대 종양 비로 치료받은 30% 종양에 대한 IVIS 그래프를 보여준다. 여기서, 그래프는 치료군의 평균보다는 각각의 개별 동물에 대해 표시되어 있다.
도 223a 및 223b는 IVIS 사진 및 IVIS 종양 부피 측정의 그래프를 보여준다. 도 223a는 암 세포 집단의 7.5%가 본원에서 고항원 발현 세포로서 지칭되는 T47D-MUC1*인 종양을 이식받은 마우스의 사진을 보여준다. 다양한 CAR T 세포를 10:1의 CAR T 대 종양 세포 비로 투여하였는데, 이때 250,000개의 종양 세포를 이식하였고 5일 후 2,500,000개의 CAR T 세포를 동물에 주사하였다. 도 223b는 일별 IVIS 측정에 의한 종양 부피의 그래프를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CD28-1XX를 주사한 동물은 CD3-제타 도메인에서 1XX 돌연변이를 갖지 않는다는 점을 제외하고 동일한 CAR T인 huMNC2-4-1BB-3z 또는 huMNC2-CD28-3z로 치료받은 동물보다 훨씬 더 작은 종양을 가졌다. 그러나, huMNC2-CD28-1XX 치료군에서도 종양이 다시 성장하기 시작하는데, 이것은 작은 퍼센트의 고항원 발현 종양 세포가 나머지 종양의 사멸을 방해한다는 생각과 일치한다.
도 224a 내지 224t는 10:1의 CAR T 대 종양 비로 치료받은 7.5% 종양에 대한 IVIS 그래프를 보여준다. 여기서, 그래프는 치료군의 평균보다는 각각의 개별 동물에 대해 표시되어 있다.
도 225a 및 225b는 IVIS 사진 및 IVIS 종양 부피 측정의 그래프를 보여준다. 도 225a는 암 세포 집단의 7.5%가 본원에서 고항원 발현 세포로서 지칭되는 T47D-MUC1*인 종양을 이식받은 마우스의 사진을 보여준다. 다양한 CAR T 세포를 1:1의 CAR T 대 종양 세포 비로 투여하였는데, 이때 250,000개의 종양 세포를 이식하였고 5일 후 250,000개의 CAR T 세포를 동물에 주사하였다. 도 225b는 일별 IVIS 측정에 의한 종양 부피의 그래프를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CD28-1XX를 주사한 동물은 CD3-제타 도메인에서 1XX 돌연변이를 갖지 않는다는 점을 제외하고 동일한 CAR T인 huMNC2-4-1BB-3z 또는 huMNC2-CD28-3z로 치료받은 동물보다 더 작은 종양을 가졌다. 그러나, 매우 낮은 용량의 CAR T 세포와 조합된 낮은 항원 밀도에서, huMNC2-CD28-1XX 치료군에서도 종양이 다시 성장하기 시작한다.
도 226a 내지 226t는 1:1의 CAR T 대 종양 비로 치료받은 7.5% 종양에 대한 IVIS 그래프를 보여준다. 여기서, 그래프는 치료군의 평균보다는 각각의 개별 동물에 대해 표시되어 있다.
도 227은 희생 후 시험 동물의 비장으로부터 채취된 CD3 양성 인간 T 세포의 표를 보여준다. 이 표에서, 세포는 30% T47D-MUC1*로 구성된 종양을 이식받고 10:1 비로 CAR T 세포로 치료받은 마우스로부터 단리되었다. 볼 수 있는 바와 같이, 더 작은 종양을 가진 huMNC2-CD28-1XX 치료 마우스는 더 많은 수의 CAR T 세포 및 CD8 양성 킬러 T 세포를 가진다. TIM3, LAG3 및 PD-1은 T 세포 고갈의 분자 마커이다. 표는 동물로부터 채취된 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포가 더 낮은 수준의 고갈 마커를 발현함을 보여주는데, 이것은 CD3-제타의 1XX 돌연변이가 생체내에서 CAR T 세포 지속성을 증가시킨다는 생각과 일치한다.
도 228은 희생 후 시험 동물의 비장으로부터 채취된 CD3 양성 인간 T 세포의 표를 보여준다. 이 표에서, 세포는 30% T47D-MUC1*로 구성된 종양을 이식받고 1:1 비로 CAR T 세포로 치료받은 마우스로부터 단리되었다. 볼 수 있는 바와 같이, 더 작은 종양을 가진 huMNC2-CD28-1XX 치료 마우스는 더 많은 수의 CAR T 세포 및 CD8 양성 킬러 T 세포를 가진다. TIM3, LAG3 및 PD-1은 T 세포 고갈의 분자 마커이다. 표는 동물로부터 채취된 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포가 더 낮은 수준의 고갈 마커를 발현함을 보여주는데, 이것은 CD3-제타의 1XX 돌연변이가 생체내에서 CAR T 세포 지속성을 증가시킨다는 생각과 일치한다.
도 229는 희생 후 시험 동물의 혈액으로부터 채취된 CD3 양성 인간 T 세포의 표를 보여준다. 이 표에서, 세포는 30% T47D-MUC1*로 구성된 종양을 이식받고 1:1 비로 CAR T 세포로 치료받은 마우스로부터 단리되었다. 볼 수 있는 바와 같이, 더 작은 종양을 가진 huMNC2-CD28-1XX 치료 마우스는 더 많은 수의 CAR T 세포 및 CD8 양성 킬러 T 세포를 갖고 더 낮은 수준의 T 세포 고갈 마커를 가진다.
도 230은 희생 후 시험 동물의 비장으로부터 채취된 CD3 양성 인간 T 세포의 표를 보여준다. 이 표에서, 세포는 7.5% T47D-MUC1*로 구성된 종양을 이식받고 10:1 비로 CAR T 세포로 치료받은 마우스로부터 단리되었다. 볼 수 있는 바와 같이, 더 작은 종양을 가진 huMNC2-CD28-1XX 치료 마우스는 더 많은 수의 CAR T 세포 및 CD8 양성 킬러 T 세포를 가진다. TIM3, LAG3 및 PD-1은 T 세포 고갈의 분자 마커이다. 표는 동물로부터 채취된 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포가 더 낮은 수준의 고갈 마커를 발현함을 보여주는데, 이것은 CD3-제타의 1XX 돌연변이가 생체내에서 CAR T 세포 지속성을 증가시킨다는 생각과 일치한다.
도 231은 희생 후 시험 동물의 혈액으로부터 채취된 CD3 양성 인간 T 세포의 표를 보여준다. 이 표에서, 세포는 7.5% T47D-MUC1*로 구성된 종양을 이식받고 10:1 비로 CAR T 세포로 치료받은 마우스로부터 단리되었다. 볼 수 있는 바와 같이, 더 작은 종양을 가진 huMNC2-CD28-1XX 치료 마우스는 더 많은 수의 CAR T 세포 및 CD8 양성 킬러 T 세포를 가진다. TIM3, LAG3 및 PD-1은 T 세포 고갈의 분자 마커이다. 표는 동물로부터 채취된 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포가 더 낮은 수준의 고갈 마커를 발현함을 보여주는데, 이것은 CD3-제타의 1XX 돌연변이가 생체내에서 CAR T 세포 지속성을 증가시킨다는 생각과 일치한다.
도 232는 희생 후 시험 동물의 비장으로부터 채취된 CD3 양성 인간 T 세포의 표를 보여준다. 이 표에서, 세포는 7.5% T47D-MUC1*로 구성된 종양을 이식받고 1:1 비로 CAR T 세포로 치료받은 마우스로부터 단리되었다. 볼 수 있는 바와 같이, 더 작은 종양을 가진 huMNC2-CD28-1XX 치료 마우스는 더 많은 수의 CAR T 세포 및 CD8 양성 킬러 T 세포를 가진다. TIM3, LAG3 및 PD-1은 T 세포 고갈의 분자 마커이다. 표는 동물로부터 채취된 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포가 더 낮은 수준의 고갈 마커를 발현함을 보여주는데, 이것은 CD3-제타의 1XX 돌연변이가 생체내에서 CAR T 세포 지속성을 증가시킨다는 생각과 일치한다.
도 233은 희생 후 시험 동물의 혈액으로부터 채취된 CD3 양성 인간 T 세포의 표를 보여준다. 이 표에서, 세포는 7.5% T47D-MUC1*로 구성된 종양을 이식받고 1:1 비로 CAR T 세포로 치료받은 마우스로부터 단리되었다. 볼 수 있는 바와 같이, 더 작은 종양을 가진 huMNC2-CD28-1XX 치료 마우스는 더 많은 수의 CAR T 세포 및 CD8 양성 킬러 T 세포를 가진다. TIM3, LAG3 및 PD-1은 T 세포 고갈의 분자 마커이다. 표는 동물로부터 채취된 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포가 더 낮은 수준의 고갈 마커를 발현함을 보여주는데, 이것은 CD3-제타의 1XX 돌연변이가 생체내에서 CAR T 세포 지속성을 증가시킨다는 생각과 일치한다.
도 234a 내지 234u는 시험 동물로부터 절제된 종양의 사진을 보여주고 그의 중량을 그램으로 보여준다. 종양은 30% T47D-MUC1* 항원 고밀도 세포 및 70% T47D-wt 항원 저밀도 세포로 구성된 종양을 이식받은 동물로부터 절제되었다. 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다.
도 235a 내지 235n2는 30% T47D-MUC1* 항원 고밀도 세포 및 70% T47D-wt 항원 저밀도 세포로 구성된 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 해리된 종양의 확대된 사진을 보여준다. 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다. 명시야 이미지와 형광 이미지의 중첩이 제시되어 있고, 이때 적색 형광인 mCherry는 항원 저밀도 세포를 보여주고 녹색 형광인 GFP는 항원 저밀도 세포를 보여준다. 도 235a 내지 235j는 PBS로만 치료받은 대조군 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 235k 내지 235t는 huMNC2-41BB-3z CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 235u 내지 235d2는 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 235e2 내지 235n2는 huMNC2-CD28-3z CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다.
도 236a 내지 236u는 시험 동물로부터 절제된 종양의 사진을 보여주고 그의 중량을 그램으로 보여준다. 종양은 30% T47D-MUC1* 항원 고밀도 세포 및 70% T47D-wt 항원 저밀도 세포로 구성된 종양을 이식받은 동물로부터 절제되었다. 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다. 도 236a 내지 236e는 PBS로 치료받은 모의 동물로부터 절제된 종양을 보여준다. 도 236f 내지 236j는 huMNC2-41BB-3z로 치료받은 동물로부터 절제된 종양을 보여준다. 도 236k 내지 236o는 huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 동물로부터 절제된 종양을 보여준다. 도 236p 내지 236t는 huMNC2-CD28-3z로 치료받은 동물로부터 절제된 종양을 보여준다. 도 236u는 시험 동물로부터 절제된 종양의 중량의 막대 그래프를 보여준다.
도 237a 내지 237d2는 30% T47D-MUC1* 항원 고밀도 세포 및 70% T47D-wt 항원 저밀도 세포로 구성된 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 해리된 종양의 확대된 사진을 보여준다. 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다. 명시야 이미지와 형광 이미지의 중첩이 제시되어 있고, 이때 적색 형광인 mCherry는 항원 저밀도 세포를 보여주고 녹색 형광인 GFP는 항원 저밀도 세포를 보여준다. 도 237a 내지 237j는 PBS로만 치료받은 대조군 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 237k 내지 237t는 huMNC2-41BB-3z CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 237u 내지 237d2는 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 237e2 내지 237n2는 huMNC2-CD28-3z CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다.
도 238a 내지 238t는 시험 동물로부터 절제된 종양의 사진을 보여주고 그의 중량을 그램으로 보여준다. 종양은 7.5% T47D-MUC1* 항원 고밀도 세포 및 92.5% T47D-wt 항원 저밀도 세포로 구성된 종양을 이식받은 동물로부터 절제되었다. 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다.
도 239a 내지 239m2는 7.5% T47D-MUC1* 항원 고밀도 세포 및 92.5% T47D-wt 항원 저밀도 세포로 구성된 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 해리된 종양의 확대된 사진을 보여준다. 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다. 명시야 이미지와 형광 이미지의 중첩이 제시되어 있고, 이때 적색 형광인 mCherry는 항원 저밀도 세포를 보여주고 녹색 형광인 GFP는 항원 저밀도 세포를 보여준다. 도 239a 내지 239j는 PBS로 치료받은 모의 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 239k 내지 239t는 huMNC2-41BB-3z CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 239u 내지 239c2는 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 239d2 내지 239m2는 huMNC2-CD28-3z CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다.
도 240a 내지 240o는 시험 동물로부터 절제된 종양의 사진을 보여주고 그의 중량을 그램으로 보여준다. 종양은 7.5% T47D-MUC1* 항원 고밀도 세포 및 92.5% T47D-wt 항원 저밀도 세포로 구성된 종양을 이식받은 동물로부터 절제되었다. 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다.
도 241a 내지 241d2는 7.5% T47D-MUC1* 항원 고밀도 세포 및 92.5% T47D-wt 항원 저밀도 세포로 구성된 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 해리된 종양의 확대된 사진을 보여준다. 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다. 명시야 이미지와 형광 이미지의 중첩이 제시되어 있고, 이때 적색 형광인 mCherry는 항원 저밀도 세포를 보여주고 녹색 형광인 GFP는 항원 저밀도 세포를 보여준다. 도 241a 내지 241j는 PBS로만 치료받은 대조군 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 241k 내지 241t는 huMNC2-41BB-3z CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 241u 내지 241d2는 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 241e2 내지 241n2는 huMNC2-CD28-3z CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다.
도 242a 내지 242r은 살아있는 동물의 사진을 보여주는 것으로, 이때 IVIS는 종양 부피를 측정하고, mCherry는 종양 내의 저항원 세포를 검출하고 GFP는 종양 내의 고항원 세포를 검출한다. 절제된 종양의 희생 후 사진 및 종양 중량의 그래프가 표시되어 있다. GFP 양성 고항원 종양 세포의 그래프도 표시되어 있다. 살아있는 GFP 사진 및 고항원 세포의 FACS 측정의 그래프 둘 다는 huMNC2-CD28-1XX가 종양 내의 가장 낮은 수준의 고항원 세포 및 매우 낮은 용량의 CAR T 세포를 사용한 경우조차도 모든 고항원 세포 및 대부분의 저항원 세포를 사멸시켰음을 보여준다.
도 243a 내지 243f는 두 상이한 시점에서 촬영된 사진을 보여준다. 여기서, IVIS 사진은 종양 부피를 측정하고 mCherry 형광 사진은 저항원 세포를 측정하고 GFP 형광 사진은 고항원 세포를 측정한다. 이 경우, 동물은 30% 항원 고밀도 세포(GFP+) 및 70% 항원 저밀도 세포(mCherry+)로 구성된 종양을 이식받았다. 동물은 10:1 또는 1:1의 CAR T 대 종양 세포 비로 단일 용량의 CAR T 세포를 제공받았다.
도 244는 시간 경과에 따른 IVIS 종양 부피 측정의 그래프를 보여준다. 화살표는 살아있는 동물의 형광 사진, mCherry 및 GFP가 촬영된 시점을 표시한다. 이 경우, 동물은 30% 항원 고밀도 세포(GFP+)와 70% 항원 저밀도 세포(mCherry+)로 구성된 종양을 이식받았다. 동물은 10:1 또는 1:1의 CAR T 대 종양 세포 비로 단일 용량의 CAR T 세포를 제공받았다.
도 245는 두 시점 사이에 종양 부피의 IVIS 측정, 저항원 세포의 생장 속도의 mCherry 측정 및 고항원 세포의 생장 속도의 GFP 측정의 그래프를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 높은 CAR T 용량에서, huMNC2-41BB-3z 또는 huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 마우스에서 시간 경과에 따라 항원 고밀도 세포(GFP)의 수는 증가하지 않는다. 그러나, 낮은 CAR T 용량에서, huMNC2-41BB-3z로 치료받은 일부 마우스는 항원 고밀도 세포의 생장 증가를 보이는 반면, huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 마우스는 그렇지 않다. 더 중요하게는, 높은 또는 낮은 CAR T 용량에서, huMNC2-41BB-3z로 치료받은 마우스는 항원 저밀도 세포의 생장 증가를 보이는 반면, huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 마우스에서는 항원 저밀도 세포의 생장이 더 제어된다.
도 246a 및 246b는 IVIS 사진 및 IVIS 종양 부피 측정의 그래프를 보여준다. 도 246a는 암 세포 집단의 15%가 본원에서 고항원 발현 세포로서 지칭되는 T47D-MUC1*인 종양을 이식받은 마우스의 사진을 보여준다. 다양한 CAR T 세포를 10:1의 CAR T 대 종양 세포 비로 투여하였는데, 이때 250,000개의 종양 세포를 이식하였고 5일 후 2,500,000개의 CAR T 세포를 동물에 주사하였다. 도 246b는 일별 IVIS 측정에 의한 종양 부피의 그래프를 보여준다. 이 실험에서, 52일째 날, 적색 윤곽선으로 표시된 동물은 250,000개 이상의 100% 항원 고밀도 종양 세포를 이식받았다. 녹색 윤곽선으로 표시된 동물은 추가 용량인 2,500,000개의 CAR T 세포를 제공받았다.
도 247a 내지 247t는 각각의 개별 동물에서 종양의 성장을 측정한 IVIS의 그래프를 보여준다. 적색 화살표는 더 많은 종양 세포의 주사를 표시하고 녹색 화살표는 2,500,000개의 추가 CAR T 세포의 주사를 표시한다. 볼 수 있는 바와 같이, 추가 종양 세포의 주사는 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포로 치료받은 동물에서 종양 성장을 증가시키지 않는다. 그러나, 추가 종양 세포의 주사는 huMNC2-CD28-3z 또는 huMNC2-41BB-3z CAR T 세포로 치료받은 동물에서 종양 성장을 증가시킨다. 이 결과는 CD3z에서 1XX 돌연변이를 가진 CAR T 세포가 생체내에서 CAR T 세포 지속성을 연장한다는 것과 일치한다. 추가 CAR T 세포의 주사가 모든 군에서 일부 동물의 종양 세포를 억제하였다는 것도 알 수 있다. 이것은 신선한 CAR T 세포가 여전히 종양 세포를 인식하고 이를 사멸시키기 때문에 종양 재발이 종양 탈출에 기인하지 않았다는 생각과 일치한다.
도 248a 내지 247d는 2개의 상이한 형광 표지를 가진 2개의 세포 유형으로 구성된 불균질한 종양을 동물에 이식한 실험 전략의 밑그림을 보여준다. mCherry를 갖고 적색 형광을 나타내는 T47D 유방암 세포를 동물에 이식하였고, 훨씬 더 많은 MUC1*를 발현하도록 조작되었고 녹색 형광을 띠게 만드는 GFP를 가진 T47D 세포도 동물에 이식하였다. 도 248a는 종양의 30%가 높은 수준의 MUC1*를 발현하고 이 종양 세포가 녹색 형광을 나타내는 종양을 이식받은 동물의 밑그림을 보여준다. 도 248b는 종양의 15%가 높은 수준의 MUC1*를 발현하고 이 종양 세포가 녹색 형광을 나타내는 종양을 이식받은 동물의 밑그림을 보여준다. 도 248c는 종양의 7.5%가 높은 수준의 MUC1*를 발현하고 이 종양 세포가 녹색 형광을 나타내는 종양을 이식받은 동물의 밑그림을 보여준다. 도 248d는 이 실험에 사용된 변수를 나열한다.
도 249a 내지 247f는 실험 전략의 밑그림 및 데이터를 보여준다. 도 249a는 정상 상피 세포에서 보이는 전체 길이 MUC1의 밑그림을 보여준다. 도 249b는 huMNC2-scFv-Fc로 염색된 4개의 조직 표본을 보여준다. 도 249c는 높은(30% 왼쪽) 또는 낮은(7.5% 오른쪽) 퍼센트의 높은 MUC1* 발현 종양 세포를 발현하는 불균질한 종양을 묘사하는 밑그림을 보여준다. 도 249d는 이식 전 불균질한 종양의 퍼센트를 검증하는 유세포분석을 보여준다. 도 249e는 30% 높은 MUC1* 세포를 이식받고 10:1(상단) 또는 1:1(하단)의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물에 대해 IVIS 기기에서 측정된 생체발광의 막대 그래프를 보여준다. 도 249f는 7.5% 높은 MUC1* 세포를 이식받고 10:1(상단) 또는 1:1(하단)의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물에 대해 IVIS 기기에서 측정된 생체발광의 막대 그래프를 보여준다.
도 250a 내지 250f는 30% 높은 MUC1* 세포 또는 7.5% 높은 MUC1* 종양을 이식받고 다양한 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물에 대해 IVIS 기기에서 측정된 종양의 생체발광의 막대 그래프를 보여준다. 도 250a는 30%가 높은 수준의 MUC1*를 발현하는 종양을 이식받은 동물의 IVIS 그래프를 보여주는 것으로, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다. 도 250b는 이펙터 대 표적 비가 5:1인 경우 IVIS 그래프를 보여준다. 도 250c는 이펙터 대 표적 비가 1:1인 경우 IVIS 그래프를 보여준다. 도 250d는 7.5%가 높은 수준의 MUC1*를 발현하는 종양을 이식받은 동물의 IVIS 그래프를 보여주는 것으로, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다. 도 250e는 이펙터 대 표적 비가 5:1인 경우 IVIS 그래프를 보여준다. 도 250f는 이펙터 대 표적 비가 1:1인 경우 IVIS 그래프를 보여준다.
도 251a 내지 251d는 30% 높은 MUC1* 세포 또는 7.5% 높은 MUC1* 종양을 이식받고 10:1 또는 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물에 대해 IVIS 기기에서 측정된 종양의 생체발광의 사진을 보여준다. 도 251a는 30%가 높은 수준의 MUC1*를 발현하는 종양을 이식받은 동물에 대한 IVIS 사진을 보여주는 것으로, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다. 도 250b는 이펙터 대 표적 비가 1:1인 경우 IVIS 사진을 보여준다. 도 251c는 7.5%가 높은 수준의 MUC1*를 발현하는 종양을 이식받은 동물에 대한 IVIS 사진을 보여주는 것으로, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 CAR T 세포로 치료받았다. 도 250d는 이펙터 대 표적 비가 1:1인 경우 IVIS 사진을 보여준다.
도 252a 내지 252d는 30% 또는 7.5% T47D-MUC1* 항원 고밀도 세포로 구성되고 나머지가 항원 저밀도 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 해리된 종양의 확대된 형광 사진을 보여준다. 동물은 10:1 또는 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 명시야 이미지와 형광 이미지의 중첩이 표시되어 있고, 이때 적색 형광인 mCherry는 항원 저밀도 세포를 보여주고 녹색 형광인 GFP는 항원 저밀도 세포를 보여준다. 도 252a는 30% 항원 고밀도 종양을 이식받고 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 252b는 30% 항원 고밀도 종양을 이식받고 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 252c는 7.5% 항원 고밀도 종양을 이식받고 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다. 도 252d는 7.5% 항원 고밀도 종양을 이식받고 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 종양 세포를 보여준다.
도 253a 내지 253h는 실험 전략의 밑그림 및 데이터를 보여준다. 도 253a는 정상 상피 세포에서 보이는 전체 길이 MUC1의 밑그림을 보여준다. 도 253b는 huMNC2-scFv-Fc로 염색된 4개의 조직 표본을 보여준다. 도 253c는 높은 또는 낮은 퍼센트의 높은 MUC1* 발현 종양 세포를 발현하는 불균질한 종양을 묘사하는 밑그림을 보여준다. 도 253d는 종양 세포의 15%가 이식 전에 높은 수준의 MUC1*를 발현하였음을 입증하는 유세포분석을 보여준다. 도 253e는 15% 높은 MUC1* 세포를 이식받고 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물에 대해 IVIS 기기에서 측정된 생체발광의 막대 그래프를 보여준다. 도 253f는 15% 항원 고밀도 종양을 이식받고 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T로 치료받은 동물에 대한 절제된 종양의 면역형광 사진을 보여준다. 도 253g는 15% 높은 MUC1* 세포를 이식받고 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물에 대해 IVIS 기기에서 측정된 생체발광의 막대 그래프를 보여준다. 도 253h는 15% 항원 고밀도 종양을 이식받고 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T로 치료받은 동물에 대한 절제된 종양의 면역형광 사진을 보여준다.
도 254a 및 254b는 15% 높은 MUC1* 세포를 이식받고 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물에 대해 IVIS 기기에서 측정된 생체발광의 막대 그래프를 보여준다. 도 254a는 10:1의 이펙터 대 표적 비로 치료받은 동물의 그래프를 보여준다. 도 254b는 1:1의 이펙터 대 표적 비로 치료받은 동물의 그래프를 보여준다.
도 255a 및 255b는 15% 높은 MUC1* 세포를 이식받고 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받은 동물에 대해 IVIS 기기에서 측정된 종양의 생체발광의 사진을 보여준다. 도 255a는 10:1의 이펙터 대 표적 비로 치료받은 동물의 사진을 보여준다. 도 255b는 1:1의 이펙터 대 표적 비로 치료받은 동물의 사진을 보여준다.
도 256a 및 256b는 mCherry 양성 항원 저밀도 세포를 적색으로 보여주고 GFP 양성 항원 고밀도 세포를 녹색으로 보여주는, 절제된 종양의 형광 사진을 보여준다. 이식 전 15% 높은 MUC1* 발현 세포인 종양 세포의 혼합물을 모든 동물들에 이식하였다. 도 256a는 10:1의 이펙터 대 표적 비로 치료받은 동물의 사진을 보여준다. 도 256b는 1:1의 이펙터 대 표적 비로 치료받은 동물의 사진을 보여준다.
도 257은 절제된 종양의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 30% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 258은 절제된 종양의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 15% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 259는 절제된 종양의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 260은 절제된 종양의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 30% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 5:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 261은 절제된 종양의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 5:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 262는 절제된 종양의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 30% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 263은 절제된 종양의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 15% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 264는 절제된 종양의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 265는 치료받은 동물의 절제된 비장의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 30% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 266은 치료받은 동물의 절제된 비장의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 15% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 267은 치료받은 동물의 절제된 비장의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 268은 치료받은 동물의 절제된 비장의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 30% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 5:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 269는 치료받은 동물의 절제된 비장의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 15% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 5:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 270은 치료받은 동물의 절제된 비장의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 5:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 271은 치료받은 동물의 절제된 비장의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 30% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 272는 치료받은 동물의 절제된 비장의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 15% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 273은 치료받은 동물의 절제된 비장의 세포를 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 274는 치료받은 동물의 혈액을 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 30% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 275는 치료받은 동물의 혈액을 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 15% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 276은 치료받은 동물의 혈액을 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 10:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 277은 치료받은 동물의 혈액을 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 30% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 5:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 278은 치료받은 동물의 혈액을 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 15% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 5:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 279는 치료받은 동물의 혈액을 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 5:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 280은 치료받은 동물의 혈액을 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 30% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 281은 치료받은 동물의 혈액을 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 15% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 282는 치료받은 동물의 혈액을 인간 T 세포 및 CAR T 세포의 존재에 대해 어세이한 후, 계수하고 T 세포 고갈의 마커의 존재에 대해 분석한 유세포분석의 결과의 표를 보여준다. 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 동물로부터 절제된 종양의 분석이 여기에 제시되어 있고, 이때 동물은 1:1의 이펙터 대 표적 비로 다양한 CAR T 세포로 치료받았다. 검출된 CAR T 세포의 수가 25 미만이었을 때, 그 숫자는 적색으로 표시되어 있고 이러한 소수의 세포의 추가 분석에 의문이 제기된다.
도 283a 내지 283l은 다양한 농도의 이중특이적 항체 20A10-OKT3-BiTE가 첨가된 인간 T 세포와 함께 배양된 MUC1* 양성 유방암 세포인 T47D의 사진을 보여준다. 20A10은 인간화된 항-MUC1* 항체이고 OKT3은 인간 T 세포에 존재하는 CD3에 결합하는 항체이다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 이중특이적 항체의 첨가는 여기서 세포 클러스터링으로서 관찰되는, T 세포와 암 세포의 연결을 매개한다. 도 283a에서, 이중특이적 항체의 농도는 1,000 ng/㎖이다. 도 283b에서, 농도는 333 ng/㎖이다. 도 283c에서, 농도는 111 ng/㎖이다. 도 283d에서, 농도는 37 ng/㎖이다. 도 283e에서, 농도는 12.3 ng/㎖이다. 도 283f에서, 농도는 4.1 ng/㎖이다. 도 283g에서, 농도는 1.3 ng/㎖이다. 도 283h에서, 농도는 0.4 ng/㎖이다. 도 283i에서, 농도는 0.15 ng/㎖이다. 도 283j에서, 농도는 0.05 ng/㎖이다. 도 283k는 T 세포와 암 세포 둘 다가 존재하지만 이중특이적 항체가 첨가되지 않은 대조군 웰이다. 도 283l은 이중특이적 항체가 암 세포에 첨가되었지만 T 세포가 존재하지 않는 대조군 웰이다.
도 284a 내지 284l은 다양한 농도의 이중특이적 항체 20A10-12F6-BiTE가 첨가된 인간 T 세포와 함께 배양된 MUC1* 양성 유방암 세포인 T47D의 사진을 보여준다. 20A10은 인간화된 항-MUC1* 항체이고 12F6은 인간 T 세포에 존재하는 CD3에 결합하는 항체이다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 이중특이적 항체의 첨가는 여기서 세포 클러스터링으로서 관찰되는, T 세포와 암 세포의 연결을 매개한다. 도 284a에서, 이중특이적 항체의 농도는 1,000 ng/㎖이다. 도 284b에서, 농도는 333 ng/㎖이다. 도 284c에서, 농도는 111 ng/㎖이다. 도 284d에서, 농도는 37 ng/㎖이다. 도 284e에서, 농도는 12.3 ng/㎖이다. 도 284f에서, 농도는 4.1 ng/㎖이다. 도 284g에서, 농도는 1.3 ng/㎖이다. 도 284h에서, 농도는 0.4 ng/㎖이다. 도 284i에서, 농도는 0.15 ng/㎖이다. 도 284j에서, 농도는 0.05 ng/㎖이다. 도 284k는 T 세포와 암 세포 둘 다가 존재하지만 이중특이적 항체가 첨가되지 않은 대조군 웰이다. 도 284l은 이중특이적 항체가 암 세포에 첨가되었지만 T 세포가 존재하지 않는 대조군 웰이다.
도 285a 내지 285l은 다양한 농도의 이중특이적 항체 20A10-OKT3-BiTE가 첨가된 인간 T 세포와 함께 배양된 HCT-MUC1* 형질도입된 암 세포의 사진을 보여준다. 20A10은 인간화된 항-MUC1* 항체이고 OKT3은 인간 T 세포에 존재하는 CD3에 결합하는 항체이다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 이중특이적 항체의 첨가는 여기서 세포 클러스터링으로서 관찰되는, T 세포와 암 세포의 연결을 매개한다. 도 285a에서, 이중특이적 항체의 농도는 1,000 ng/㎖이다. 도 285b에서, 농도는 333 ng/㎖이다. 도 285c에서, 농도는 111 ng/㎖이다. 도 285d에서, 농도는 37 ng/㎖이다. 도 285e에서, 농도는 12.3 ng/㎖이다. 도 285f에서, 농도는 4.1 ng/㎖이다. 도 285g에서, 농도는 1.3 ng/㎖이다. 도 285h에서, 농도는 0.4 ng/㎖이다. 도 285i에서, 농도는 0.15 ng/㎖이다. 도 285j에서, 농도는 0.05 ng/㎖이다. 도 285k는 T 세포와 암 세포 둘 다가 존재하지만 이중특이적 항체가 첨가되지 않은 대조군 웰이다. 도 285l은 이중특이적 항체가 암 세포에 첨가되었지만 T 세포가 존재하지 않는 대조군 웰이다.
도 286a 내지 286l은 다양한 농도의 이중특이적 항체 20A10-12F6-BiTE가 첨가된 인간 T 세포와 함께 배양된 HCT-MUC1* 형질도입된 암 세포의 사진을 보여준다. 20A10은 인간화된 항-MUC1* 항체이고 12F6은 인간 T 세포에 존재하는 CD3에 결합하는 항체이다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 이중특이적 항체의 첨가는 여기서 세포 클러스터링으로서 관찰되는, T 세포와 암 세포의 연결을 매개한다. 도 286a에서, 이중특이적 항체의 농도는 1,000 ng/㎖이다. 도 286b에서, 농도는 333 ng/㎖이다. 도 286c에서, 농도는 111 ng/㎖이다. 도 286d에서, 농도는 37 ng/㎖이다. 도 286e에서, 농도는 12.3 ng/㎖이다. 도 286f에서, 농도는 4.1 ng/㎖이다. 도 286g에서, 농도는 1.3 ng/㎖이다. 도 286h에서, 농도는 0.4 ng/㎖이다. 도 286i에서, 농도는 0.15 ng/㎖이다. 도 286j에서, 농도는 0.05 ng/㎖이다. 도 286k는 T 세포와 암 세포 둘 다가 존재하지만 이중특이적 항체가 첨가되지 않은 대조군 웰이다. 도 286l은 이중특이적 항체가 암 세포에 첨가되었지만 T 세포가 존재하지 않는 대조군 웰이다.

본원에서, 단수형 용어는 단일 객체 및 복수의 객체 둘 다를 지칭하기 위해 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 때때로, 간단히 말해서, 폴리펩티드는 세포 내로 "형질도입되거나 형질감염"되는 것으로서 표시된다. 이 경우, 폴리펩티드가 세포 내로 형질도입되거나 형질감염될 수 없기 때문에, 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산이 세포 내로 형질도입되거나 형질감염되는 것으로 이해된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 때때로 동물에 주사된 세포의 수를 언급할 때 또는 달리 문맥상 세포의 수가 언급될 때, "M"은 백만을 의미하고 "K"는 천을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 다양한 단일클론 항체에 대한 교환 가능한 표기, 예컨대, "C2", "Min-C2" 및 "MNC2"와 교환 가능한 "MNC2"; "E6", "Min-E6" 및 "MNE6"과 교환 가능한 "MNE6"; "C3", "Min-C3" 및 "MNC3"과 교환 가능한 "MNC3"; 및 "C8", "Min-C8" 및 "MNC8"과 교환 가능한 "MNC8"이 사용된다. 본원에서 제공된 단일클론 항체는 동일한 규정을 따른다.

본원에서 사용된 바와 같이, 항체 구축물 앞에 기재된 "h" 또는 "hu"는 인간화에 대한 약칭이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 유사"는 항체의 일부를 함유하도록 조작될 수 있으나 자연에서 천연적으로 생성되는 항체가 아닌 분자를 의미한다. 예는 CAR(키메라 항원 수용체) T 세포 기술 및 Ylanthia^® 기술을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. CAR 기술은 신체의 면역 시스템이 특정 표적 단백질 또는 세포를 공격하라는 지시를 받도록 T 세포의 일부에 융합된 항체 에피토프를 사용한다. Ylanthia^® 기술은 표적 단백질로부터의 펩티드 에피토프와의 결합에 대해 스크리닝되는 합성 인간 Fab의 집합체인 "항체 유사" 라이브러리로 구성된다. 그 다음, 선택된 Fab 영역은 항체와 유사하도록 스캐폴드 또는 프레임워크 내로 조작될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "PSMGFR"은 서열번호 2로 식별되는 MUC1 성장 인자 수용체의 일차 서열에 대한 약어이므로, 6 아미노산 서열과 혼동되어서는 안 된다. "PSMGFR 펩티드" 또는 "PSMGFR 영역"은 MUC1 성장 인자 수용체의 일차 서열(서열번호 2)을 포함하는 펩티드 또는 영역을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1*" 세포외 도메인은 일차적으로 PSMGFR 서열(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 2))로 정의된다. MUC1 절단의 정확한 위치는 이를 절단하는 효소에 의해 좌우되고 절단 효소는 세포 유형, 조직 유형 또는 세포의 진화 시간에 따라 달라지기 때문에, MUC1* 세포외 도메인의 정확한 서열은 N-말단에서 달라질 수 있다.

다른 절단된 아미노산 서열은 SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(서열번호 620); 또는 SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(서열번호 621)를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PSMGFR"은 GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 2)로서 기재된 MUC1 성장 인자 수용체의 일차 서열에 대한 두문자어이다. 이와 관련하여, "N-10 PSMGFR" 또는 간단히 "N-10", "N-15 PSMGFR" 또는 간단히 "N-15", 또는 "N-20 PSMGFR" 또는 단순히 "N-20"에서 "N-숫자"는 PSMGFR의 N-말단에서 결실된 아미노산 잔기의 수를 지칭한다. 마찬가지로, "C-10 PSMGFR" 또는 간단히 "C-10", "C-15 PSMGFR" 또는 간단히 "C-15", 또는 "C-20 PSMGFR" 또는 간단히 "C-20"에서 "C-숫자"는 PSMGFR의 C-말단에서 결실된 아미노산 잔기의 수를 지칭한다. 결실과 추가의 혼합도 가능하다. 예를 들어, N+20/C-27은 20개의 아미노산이 N-말단에서 PSMGFR에 추가되어 있고 27개의 아미노산이 C-말단으로부터 결실되어 있는, 야생형 MUC1의 펩티드 단편을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1*의 세포외 도메인"은 탠덤 반복부 도메인을 결여하는 MUC1 단백질의 세포외 부분을 지칭한다. 대부분의 경우, MUC1*는 절단 생성물이고, 이때 MUC1* 부분은 탠덤 반복부를 결여하는 짧은 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리로 구성된다. MUC1이 절단되는 정확한 위치는 아마도 하나 초과의 효소에 의해 절단될 수 있는 것으로 보이기 때문에 알려져 있지 않았다. MUC1*의 세포외 도메인은 대부분의 PSMGFR 서열을 포함할 것이나, 추가 10개 내지 20개의 N-말단 아미노산을 가질 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "서열 동일성"은 상동 펩티드의 기능이 기준 펩티드 또는 핵산과 동일하도록 기준 핵산 또는 아미노산 서열에 대한 특정 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 상동성을 의미한다. 이러한 상동성은 때때로 두 서열이 90%, 95% 또는 98% 동일할 수 있지만 결합 또는 다른 생물학적 활성에서 동일한 기능을 가질 수 있을 정도로 기준 펩티드와 유사할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1 양성" 세포는 MUC1, MUC1-Y 또는 MUC1-Z, 또는 다른 MUC1 변이체에 대한 유전자를 발현하는 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1 음성" 세포는 MUC1에 대한 유전자를 발현하지 않는 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1* 양성" 세포는 MUC1에 대한 유전자를 발현하는 세포를 지칭하는 것으로, 이때 그 유전자의 발현된 단백질은 번역 후 변형, 절단, 대안적 스플라이싱, 또는 탠덤 반복부를 결여하는 MUC1 단백질을 사용한 세포의 형질감염 또는 형질도입의 결과일 수 있는, 탠덤 반복부를 결여하는 막횡단 단백질이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1* 음성" 세포는 MUC1에 대한 유전자를 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있으나 탠덤 반복부를 결여하는 MUC1 막횡단 단백질을 발현하지 않는 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1 양성" 암 세포는 MUC1에 대한 유전자를 과다발현하고/하거나, 비정상적인 패턴으로 MUC1을 발현하고/하거나 탠덤 반복부를 결여하는 MUC1을 발현하는 암 세포를 지칭하는 것으로, 이때 그의 발현은 정점(apical) 경계로 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1 음성" 암 세포는 MUC1에 대한 유전자를 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있으나 MUC1을 과다발현하지 않거나 탠덤 반복부를 결여하는 MUC1 막횡단 단백질을 과다발현하지 않는 암 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1* 양성" 암 세포는 탠덤 반복부를 결여하는 MUC1 막횡단 단백질을 과다발현하는 암 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MUC1* 음성" 암 세포는 MUC1에 대한 유전자를 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있으나 탠덤 반복부를 결여하는 MUC1 막횡단 단백질을 과다발현하지 않는 암 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "입체구조적 에피토프"는 항체가 결합하기 위해 특정 3차원 구조 또는 입체구조로 존재하는 데 필요한 펩티드 서열을 지칭한다. 그러나, 항체는 펩티드 서열이 3차원 구조 또는 입체구조로 존재할 때 결합하고 선형일 때에는 결합하지 않는다. 항체가 선형 스트레치에 결합하는지 아니면 입체구조적 에피토프에 결합하는지를 확인하는 통상의 기법은 항체를 사용하여 변성 웨스턴 블롯을 프로빙하는 것이다. 변성 겔을 통한 이동은 단백질 및 펩티드를 선형화한다. 변성 웨스턴에서 작동하지 않지만, 예를 들어, 온전한 세포에서 발현된 천연 표적을 인식하는 항체는 입체구조적 에피토프를 인식하는 것으로 확인된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항체는 "입체구조적 에피토프"에 실제로 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으나, "입체구조적 에피토프" 서열의 존재는 암 세포의 MUC1* 영역이 암 치료에 특이적인 항체에 의해 결합될 수 있도록 3차원 구조를 만드는 데 필요하다. 따라서, 입체구조적 에피토프는 항체와 암 세포의 MUC1* 영역의 결합을 유도하는 아미노산 서열이다. 따라서, 펩티드 서열이 더 큰 펩티드 내부에 결합 부위로서 존재하는 것이 아니라 3차원 구조를 야기하여 항체와 더 큰 펩티드의 결합을 용이하게 하는 구조를 형성함으로써 항체와 더 큰 펩티드의 결합을 유도함을 표시하는 용어 "입체구조적 유도 펩티드 서열"이 사용될 수 있다.

암의 치료 또는 예방을 위한 MUC1* 항체(항-PSMGFR)

본 발명자들은 MUC1(서열번호 1) 막횡단 단백질의 절단된 형태가 모든 인간 고형 종양 암의 75% 이상의 성장을 유도하는 성장 인자 수용체임을 발견하였다. 본 발명자들이 MUC1*(muk 1 스타로서 발음됨)라고 명명한 MUC1의 절단된 형태는 강력한 성장 인자 수용체이다. 효소 절단은 MUC1 세포외 도메인의 대부분을 방출한다. 이것은 절두된 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리를 포함하는, MUC1*로서 지칭되는 남은 부분이다. MUC1의 세포외 도메인의 대부분의 절단 및 방출은 리간드 이량체 NME1, NME6, NME8, NME7_AB, NME7-X1 또는 NME7을 활성화시키기 위한 결합 부위를 노출시킨다. 세포 생장 어세이는 생장을 촉진하는 것이 MUC1* 세포외 도메인의 리간드 유도 이량체화임을 보여준다(도 1a 내지 1d). 2가 'bv' 항-MUC1* 항체, 1가 'mv' 또는 Fab, NM23-H1 이량체 또는 NME7-AB로 처리된 MUC1* 양성 세포. 2가 항-MUC1* 항체는 암 세포의 생장을 자극하는 반면, 1가 Fab는 생장을 억제한다. 고전적인 종 모양의 곡선은 리간드 유도 이량체화가 생장을 자극함을 표시한다. NME1로서도 알려진 이량체 NM23-H1은 MUC1* 양성 암 세포의 생장을 자극하나, MUC1 발현을 억제하는 siRNA는 그의 효과를 제거한다(도 1c). NME7-AB도 MUC1* 양성 세포의 생장을 자극한다(도 1d).

MUC1*는 모든 암의 75% 이상에서 비정상적으로 발현되고 훨씬 더 높은 퍼센트의 전이성 암에서 과다발현될 가능성이 있기 때문에 암 약물을 위한 훌륭한 표적이다. MUC1 절단 후, 그의 세포외 도메인의 대부분은 세포 표면으로부터 떨어져 나간다. 남은 부분은 적어도 일차 성장 인자 수용체 서열인 PSMGFR(서열번호 2)을 포함하는 절두된 세포외 도메인을 가진다. PSMGFR 서열에 결합하는 항체, 특히 NME1, NME6, NME8, NME7_AB, NME7-X1 및 NME7을 비롯한 NME 단백질과 같은 활성화 리간드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체는 이상적인 치료제이고, 면역 세포 내로 형질감염되거나 형질도입된 후 환자에게 투여되는, 다중특이적 항체 유사 분자, 이중특이적 항체, 항체-약물 접합체 또는 CAR로서도 지칭되는 키메라 항원 수용체 내로 통합된 독립형 항체, 항체 단편 또는 이의 가변 영역 단편으로서 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 치료 항-MUC1* 항체는 단일클론, 다중클론, 항체 모방체, 조작된 항체 유사 분자, 전체 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, scFv 및 scFv-Fc를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 인간 또는 인간화된 항체는 암의 치료 또는 예방에 사용하기에 바람직하다. 이러한 항체 유사 분자들 중 임의의 항체 유사 분자에서, 이량체 형성을 방지하거나 최소화하기 위해 돌연변이를 도입할 수 있다. 1가 또는 이중특이적 항체인 항-MUC1* 항체는 MUC1* 기능이 리간드 유도 이량체화에 의해 활성화되기 때문에 바람직하다. 전형적인 결합 어세이는 NME1 및 NME7_AB가 MUC1*의 PSMGFR 펩티드 부분에 결합함을 보여준다(도 2a 및 2d). 또한, 이 어세이는 10개의 C-말단 아미노산이 누락된 경우 이 활성화 성장 인자들이 PSMGFR 펩티드에 결합하지 않기 때문에, 이들이 MUC1*의 막 근위 부분에 결합함을 보여준다. 유사하게, 항-MUC1* 항체 MNC2 및 MNE6은 10개의 C-말단 아미노산이 존재하는 경우에만 PSMGFR 펩티드에 결합한다(도 2b 및 2c). 항체 MNC3 및 MNC8은 PSMGFR 펩티드의 10개 C-말단 아미노산의 존재에 의존하지 않기 때문에 MNC2 및 MNE6과 상이한 에피토프에 결합한다(도 2e 및 2f). 항체 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11 항체 및 본 발명의 다른 항체 또는 이들로부터 유래한 단편은 독립형 항체로서, 또는 BiTE, ADC, 다중특이적 항체 유사 분자, FC 영역 또는 Fc 영역의 일부를 갖거나 갖지 않는 이중특이적 항체, bi-scFv, di-scFv, 탠덤 di-scFv, 디아바디, 트리아바디, 트리바디, 테트라바디, 및 다가 및 다중특이적인 다른 항체 유사 분자 내로 통합된 상태로 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 뮤린, 인간, 인간화된, 낙타, 토끼 또는 다른 비-인간 종일 수 있다.

BiTE, 또는 CAR로서도 지칭되는 키메라 항원 수용체는 면역 세포 내로 형질도입된다. MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11 항체, 및 NME1 및 NME7_AB의 결합을 경쟁적으로 억제하는 다른 항-MUC1* 항체가 바람직하다. 항체 또는 항체 단편은 뮤린, 인간, 인간화된, 낙타, 토끼 또는 다른 비-인간 종일 수 있다.

독립형 항체 치료제로서 사용하거나 BiTE, CAR, ADC 또는 임의의 다중특이적 항체 유사 분자 내로 통합하기 위한 치료 항-MUC1* 항체는 구체적인 기준에 따라 선택될 수 있다. 모 항체는 동물에서 단일클론 항체를 생성하는 전형적인 방법을 이용함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, 이들은 항체 스크리닝 방법의 설명에 대해 본원에 참고로 포함되는 벡만(Beckman) 미국 특허 제9,944,719B2호에 기재된 전략을 포함하나 이들로 제한되지 않는 항체 또는 항체 단편 라이브러리의 스크리닝에 의해 선택될 수 있다. 치료 용도에 적합한 항체는 하기 펩티드일 수 있는 MUC1* 펩티드에 결합하는 그의 능력을 기반으로 선택된다:

(i) MUC1의 PSMGFR 영역;

(ii) PSMGFR 펩티드;

(iii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(iv) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(v) NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vi) ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(vii) SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(viii) QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)의 아미노산 서열을 가진 펩티드;

(ix) ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)의 아미노산 서열을 가진 펩티드; 또는

(x) FPFSAQSGA(N-36)의 아미노산 서열을 가진 펩티드.

그 다음, 이러한 방식으로 생성되거나 선택된 결과적인 항체 또는 항체 단편은 추가 스크린을 통과함으로써 더 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편은 MUC1* 양성 암 세포 또는 조직에 결합할 수 있으나 MUC1 음성 암 세포 또는 정상 조직에는 결합하지 않는 능력을 기반으로 더 선호되게 된다. 또한, 항-MUC1* 항체 또는 항체 단편은 줄기 또는 전구체 세포에 결합하는 경우 항암 치료제로서 선택취소될 수 있다. 항-MUC1* 항체 또는 항체 단편은 NME7_AB 또는 NME7-X1과 같은 활성화 리간드와 MUC1*의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 가진 경우 더 선호되게 된다. 도 3a 내지 3c는 MNE6 및 MNC2가 활성화 리간드 NME1 및 NME7과 MUC1*의 결합을 경쟁적으로 억제함을 보여준다.

MUC1 양성 암으로 진단받거나, MUC1 양성 암을 발생시킬 위험이 있거나 MUC1 양성 암을 가진 것으로 의심되는 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 항-MUC1* 항체를 선택하는 과정은 1) PSMGFR 펩티드에 결합하고; 2) N-10 PSMGFR 펩티드에 결합하고; 3) 암 세포에 선택적으로 결합하고; 4) C-10 PSMGFR 펩티드에 결합하지 않고; 5) 이량체 NME1 또는 NME7-AB와 PSMGFR 펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하하는 항체 또는 항체 단편을 선택하는 하기 단계들 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 예를 들어, 도 3a 내지 3c는 단일클론 MNE6 및 MNC2가 5가지 기준 모두를 충족시키는 반면, 단일클론 MNC3 및 MNC8이 활성화 리간드 NME1 및 NME7의 결합을 경쟁적으로 억제하지 않음을 보여준다(도 3c). MUC1* 성장 인자 수용체는 그의 세포외 도메인의 리간드 유도 이량체화에 의해 활성화된다는 점을 상기한다. 따라서, 이상적인 항체 치료제는 있는 그대로 독립형 항체 치료제로서 사용되는 경우 MUC1* 세포외 도메인을 이량체화하지 않아야 한다. 이 치료 포맷의 경우, Fc 부분이 동종이량체화하지 않도록 구축되는 한, 이와 관련하여 적합한 항체는 1가 항체, 예컨대, 라마 및 낙타에서 생성된 항체, Fab, scFv, 단일 도메인 항체(sdAb), scFv-Fc를 포함한다.

FACS 스캔은 항-MUC1* 항체 MNC2 및 MNE6이 MUC1* 양성 고형 종양 암 세포 및 MUC1* 형질감염된 세포에 특이적으로 결합하지만 MUC1* 음성 또는 MUC1 음성 세포에는 결합하지 않음을 보여준다. 한 예에서, 인간화된 MNC2 scFv는 ZR-75-1(1500으로서도 알려짐) MUC1* 양성 유방암 세포에 결합하는 것으로 확인된다(도 4a 내지 4c). MNE6은 세포가 MUC1*로 형질감염된 경우에만 MUC1 음성 HCT-116 결장암 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다. MNE6은 MUC1* 양성 암 세포, 예컨대, ZR-75-1(1500으로서도 알려짐) MUC1* 양성 유방암 세포에도 결합하였다(도 4d 내지 4f). ELISA, 면역형광 등과 같은 결합 어세이는 모두 MNC2 및 MNE6이 PSMGFR 펩티드에 결합하고 살아있는 MUC1 양성 암 세포에 결합한다는 것을 확인시켜준다. 인간화된 항-MUC1* 항체는 PSMGFR 펩티드 또는 MUC1 양성 암 세포에도 결합하는 그의 능력을 기반으로 선택된다. 도 5는 인간화된 MNC2 scFv가 약 333 nM의 EC-50으로 MUC1* 펩티드 PSMGFR에 높은 친화도로 결합함을 보여준다. 도 6a 및 6b에서 한 예로 표시된 바와 같이, 인간화된 MNC2 scFv는 Fab와 마찬가지로 MUC1* 양성 암 세포의 생장을 강하게 억제한다. 모 항체와 마찬가지로, 인간화된 scFv는 동일한 결합 패턴을 보여준다. huMNE6-scFv는 PSMGFR 펩티드에 결합하고, N-10 펩티드에 결합하지만, C-10 펩티드(서열번호 825)에는 결합하지 않는다(도 8). 그러나, 암의 치료에 덜 적합한 뮤린 또는 인간화된 MNC3-scFv는 PSMGFR 펩티드에 결합하고 N-10 펩티드에 결합하고, 본 발명자들이 아는 한 활성화 리간드 NME7_AB가 결합하는 에피토프인 C-10 펩티드에도 결합한다(도 9).

MNE6 및 MNC2의 Fab 또는 이들로부터 유래한 필적할만한 단일 쇄 가변 영역은 시험관내 및 생체내에서 MUC1* 양성 암의 성장을 강하게 억제한다. 여러 예에서, 항-MUC1* 항체의 Fab는 생체내에서 인간 MUC1* 양성 암의 성장을 억제하였다. 한 경우, 면역손상된 마우스는 인간 유방 종양을 이식받은 다음, 종양 생착 후 MNE6 Fab로 치료받았다. 도 7a는 MNE6 Fab가 MUC1* 양성 유방암의 성장을 강하게 억제하였음을 보여준다. 90일 에스트로겐 펠릿을 이식받은 암컷 nu/nu 마우스는 매트리겔과 50/50으로 혼합된 6백만 개의 T47D 인간 유방암 세포를 이식받았다. 적어도 150 mm³이고 종양 부피의 3회 연속 증가를 가진 종양을 보유한 마우스를 치료를 위해 선택하였다. 80 mg/kg MNE6 Fab를 동물에게 주당 2회 피하 주사하였고, 비히클만을 동일한 선택 기준에 맞는 동등한 수의 마우스에 주사하였다(도 7a).

또 다른 측면에서, MNE6은 전립선암의 성장을 중단시키는 것으로 확인되었다. 도 7b는 MNE6 Fab가 MUC1* 양성 전립선암의 성장을 강하게 억제하였음을 보여준다. 수컷 NOD/SCID 마우스는 매트리겔과 50/50으로 혼합된 6백만 개의 DU-145 인간 전립선암 세포를 이식받았다. 적어도 150 mm^3이고 종양 부피의 3회 연속 증가를 가진 종양을 보유한 마우스를 치료를 위해 선택하였다. 160 mg/kg MNE6 Fab를 동물에게 48시간마다 피하 주사하였고 비히클만을 동일한 선택 기준에 맞는 동등한 수의 마우스에 주사하였다(도 7b). 2명의 연구원이 종양을 주당 2회 독립적으로 측정하고 기록하였다. 독립적인 통계학자가 블라인드 방식으로 통계자료를 계산하여, 각각에 대해 0.0001의 P 값을 제공하였다. 항-MUC1* Fab는 유방암 성장 및 전립선암 성장을 억제하였다. 치료는 체중, 골수 세포 유형 또는 수에 영향을 미치지 않았다. MNE6 Fab는 종양의 성장을 효과적으로 억제한 반면, 대조군의 종양은 희생될 때까지 계속 성장하였다. 치료의 부작용은 관찰되지 않았거나 검출되지 않았다.

Fab처럼 단량체인 MNE6 및 MNC2의 재조합 형태를 구축하였다. 이 경우, MNE6을 인간화하였고 MNC2를 인간화하였다. 당분야에서 숙련된 자에게 알려진 다수의 항체 인간화 방법들이 존재한다. 인간화 이외에, 인간 항체 또는 항체 단편의 라이브러리를 스크리닝하여 PSMGFR에 결합하는 다른 완전 인간 항체를 식별할 수 있다.

scFv로서도 지칭되는, 인간화된 MNE6 가변 영역의 단일 쇄는 항체의 Fc 부분(서열번호 256 및 257)에 연결되도록 유전적으로 조작되었다. Fc 영역은 특정 이점을 치료제로서 사용될 항체 단편에 부여한다. 항체의 Fc 부분은 보체를 동원하는데, 이것은 일반적으로 이 Fc 부분이 면역 시스템의 다른 측면을 동원함으로써, 표적을 억제하는 것을 넘어 항-종양 반응을 증폭시킬 수 있음을 의미한다. Fc 부분의 추가는 항체 단편의 반감기도 증가시킨다(Czajkowsky DM, Hu J, Shao Z and Pleass RJ. (2012) Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4(10):1015-1028). 그러나, 항체의 Fc 부분은 동종이량체화하는데, 이것은 항-MUC1* 항체 기반 치료제의 경우 MUC1* 수용체의 리간드 유도 이량체화가 성장을 자극하기 때문에 최적이 아니다. 따라서, 이량체 형성에 대한 내성을 갖게 만드는 Fc 영역의 돌연변이가 항-MUC1* 항암 치료제를 위해 바람직하다. 힌지 영역의 결실, 및 Fc 돌연변이체가 이량체화에 대한 내성을 갖게 만드는 Fc 영역의 다른 돌연변이를 만들었고 치료제로서 사용할 수 있었다.

인간 또는 인간화된 MNE6 항체 또는 항체 단편, Fab, MNE6 scFv 또는 huMNE6 scFv-Fc_mut는 MUC1 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, MUC1 또는 MUC1* 양성 암을 가진 것으로 의심되거나 MUC1 또는 MUC1* 양성 암을 발생시킬 위험이 있는 사람에게 투여될 수 있는 효과적인 항암제이다.

인간화

-MUC1*의 세포외 도메인에 결합하는 인간화된 항체 또는 항체 단편 또는 완전 인간 항체는 치료 용도에 바람직하다. 본원에 기재된, 항체를 인간화하는 기법은 당분야에서 숙련된 자에게 알려진 다양한 방법들 중 일부에 불과하다. 본 발명은 항체를 인간화하는 데 이용되는 기법에 의해 제한되지 않는다.

인간화는 치료 항체(통상적으로 마우스 단일클론 항체)의 비-인간 영역을, 그의 결합 특이성 및 친화성을 변경하지 않으면서 인간 영역으로 대체하는 과정이다. 인간화의 주요 목표는 인간에게 투여될 때 치료 단일클론 항체의 면역원성을 감소시키는 것이다. 세 가지 상이한 유형의 인간화가 가능하다. 첫째, 키메라 항체는 항체의 비-인간 불변 영역을 인간 불변 영역으로 대체함으로써 만들어진다. 이러한 항체는 마우스 Fab 영역을 함유할 것이고 인간 서열의 약 80% 내지 90%를 함유할 것이다. 둘째, 인간화된 항체는 마우스 CDR 영역(결합 특이성을 담당함)을 인간 항체의 가변 영역에 이식하여 인간 CDR을 대체함으로써(CDR 이식 방법) 만들어진다. 이러한 항체는 인간 서열의 약 90% 내지 95%를 함유할 것이다. 세 번째이자 마지막으로, 완전 인간 항체(100% 인간 서열)는 항원 특이적 인간 항체를 선택하기 위해 인간 항체, 항체 유사 분자 또는 항체 단편의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이에 의해 생성될 수 있거나, 인간 항체를 발현하는 형질전환 마우스를 면역화함으로써 생성될 수 있다.

항체를 인간화하는 일반적인 기법은 대략 다음과 같이 실시된다. 숙주 동물, 전형적으로 마우스에서 단일클론 항체를 생성한다. 그 다음, 표적에 대한 결합의 친화성 및 특이성에 대해 단일클론 항체를 스크리닝한다. 일단 원하는 효과 및 원하는 특성을 가진 단일클론 항체가 식별되면, 이를 시퀀싱한다. 이어서, 동물 항체에 대한 가장 높은 상동성을 가진 서열을 가진 인간 항체를 찾기 위해 동물에서 생성된 항체의 서열을 많은 인간 항체의 서열과 정렬한다. 생화학 기법을 이용하여 인간 항체 서열과 동물 항체 서열을 함께 붙여 넣는다. 전형적으로, 비-인간 CDR을, 비-인간 항체에 대한 가장 높은 상동성을 가진 인간 항체 내로 이식한다. 이 과정은 어느 항체 또는 항체들이 원하는 친화성 및 특이성을 갖는지를 식별하기 위해 시험될 필요가 있는 많은 후보 인간화된 항체를 생성할 수 있다.

일단 인간 항체 또는 인간화된 항체가 생성되면, 이 항체는 Fab 단편, 전체 항체 또는 항체 유사 물질, 예컨대, 가변 영역을 함유하는 단일 쇄 분자, 예컨대, scFv 또는 scFv-Fc로서 사용되도록 더 변형될 수 있다. 일부 경우, 이량체화하지 않도록 돌연변이된 항체 또는 항체 유사 분자의 Fc 영역을 갖는 것이 바람직하다.

인간 서열을 비-인간 종에서 생성된 항체 내로 도입하는 방법 이외에, 항원의 펩티드 단편으로 인간 항체 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함하는, 당분야에서 숙련된 자에게 알려진 다양한 방법으로 완전 인간 항체를 수득할 수 있다. MNE6 또는 MNC2, 20A10 또는 본 발명의 다른 항체처럼 작용하는 완전 인간 항체는 PSMGFR N-10 펩티드의 서열을 가진 펩티드로 인간 항체 라이브러리 또는 항체 단편 라이브러리를 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 또 다른 방법에서, 인간 항체는 유전적으로 변형된 마우스에서 생성된다. 인간화된 항-MUC1* 항체 또는 항체 단편은 마우스 단일클론 항체 MNE6, MNC2, 20A10, 3C2B1, 5C6F3 및 25E6의 서열을 기반으로 생성되었다. 본 발명의 한 측면에서, MUC1* 양성 암으로 진단받은 환자는 MNC2(서열번호 118 및 119, 및 168 및 169), MNE6(서열번호 12 및 13, 및 65 및 66), 20A10(서열번호 988 및 989, 및 1004 및 1005), 3C2B1(서열번호 1820 및 1821, 및 1822 및 1823), 5C6F3(서열번호 1816 및 1817, 및 1818 및 1819), 25E6(서열번호 1020 및 1021, 및 1036 및 1037), 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11로부터의 서열을 포함하는 유효량의 뮤린 또는 낙타 항체 또는 항체 단편으로 치료받는다. 본 발명의 또 다른 측면에서, MUC1* 양성 암으로 진단받은 환자는 MNE6(서열번호 56 및 57, 및 107 및 108, 또는 서열번호 341 및 342, 또는 서열번호 391 및 392, 또는 서열번호 393 및 394) 또는 MNC2(서열번호 144 및 145, 및 194 및 195, 또는 서열번호 654 및 655, 또는 서열번호 239 내지 249, 또는 서열번호 5017 내지 5020), 20A10(서열번호 1576 내지 1581, 또는 서열번호 5001 내지 5012), 3C2B1(서열번호 1820 내지 1823, 또는 서열번호 1812 및 1813), 5C6F3(서열번호 1816 내지 1819, 또는 서열번호 1814 및 1815), 25E6(서열번호 1020 및 1021, 및 1036 및 1037, 또는 서열번호 1600 및 1601), 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11로부터의 서열을 포함하는 유효량의 인간 또는 인간화된 항체 또는 항체 단편으로 치료받는다. 바람직한 실시양태에서, MUC1* 양성 암으로 진단받은 환자는 MNC2(서열번호 654 및 655), MNE6(서열번호 341 및 342), 20A10(서열번호 1580 및 1581), 3C2B1(서열번호 1812 및 1813), 5C6F3(서열번호 1814 및 1815), 25E6(서열번호 1600 및 1601)의 서열을 포함하는 유효량의 인간화된 항체 또는 항체 단편으로 치료받는다. 본 발명의 또 다른 측면에서, MUC1* 양성 암으로 진단받은 환자는 유효량의 인간화된 1가 형태의 항체, 예컨대, MNC2(서열번호 239, 241, 243, 396 또는 5018 내지 5020), MNE6(서열번호), 20A10(서열번호 1574 내지 1581 또는 서열번호 5001 내지 5012), 3C2B1(서열번호 1813), 5C6F3(서열번호 1815), 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3, 또는 H11로 치료받고, 이때 1가는 상응하는 Fab 단편, 상응하는 scFv 또는 상응하는 scFv-Fc 융합체를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, MUC1* 양성 암으로 진단받은 환자는 유효량의 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 인간화된 scFv 또는 단량체 인간화된 scFv-Fc로 치료받는다. MUC1* 성장 인자 수용체는 그의 세포외 도메인의 리간드 유도 이량체화에 의해 활성화되고 항체의 Fc 부분이 동종이량체화하기 때문에, Fc 부분을 포함하는 구축물이 이량체화를 방지하거나 최소화하는 돌연변이된 Fc 영역을 사용하는 것이 바람직하다.

MUC1* 수용체의 세포외 도메인의 PSMGFR(서열번호 2) 펩티드, 보다 구체적으로는 N-10 펩티드에 결합하는 항체는 MUC1* 양성 암의 치료 또는 예방에 효과적인 강력한 항암 치료제이다. 이 항체는 활성화 리간드 이량체 NME1(서열번호 1781) 및 NME7_AB(서열번호 827)와 MUC1*의 세포외 도메인의 결합을 억제하는 것으로 확인되었다. PSMGFR 서열에 결합하는 항-MUC1* 항체는 특히 리간드 유도 수용체 이량체화를 억제하는 경우 MUC1* 양성 암 세포의 생장을 억제한다. 항-MUC1* 항체의 Fab는 동물에서 종양 성장을 차단하는 것으로 입증되었다. 따라서, MUC1*의 세포외 도메인에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 암 조직이 MUC1*를 발현하는 암의 치료에 유리할 것이다.

MUC1*의 PSMGFR 영역에 결합하거나 합성 PSMGFR 펩티드에 결합하는 항체가 바람직하다. N-10 펩티드에는 결합하나 C-10 펩티드에는 결합하지 않는 항체가 특히 바람직하다. N-26 펩티드에 결합하는 항체가 훨씬 더 바람직하고, 이때 PFPFS 서열(서열번호 1747)의 돌연변이 또는 결실은 항체 또는 이의 단편과 N-26 펩티드의 결합을 파괴한다. 본 발명자들은 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하는 여러 단일클론 항체를 확인하였다. 마우스 단일클론 항체 MNC2(서열번호 118 내지 131, 144 내지 158, 163 및 164, 168 내지 181, 194 내지 209), MNE6(서열번호 12 내지 25, 39 내지 59, 65 내지 78, 93 내지 114), 20A10(서열번호 988 내지 1019, 1574 내지 1597, 1659 내지 1666); 3C2B1(서열번호 1386 내지 1413, 1572 및 1573), 5C6F3(서열번호 1356 내지 1385), 25E6(서열번호 1020 내지 1051, 1598 내지 1617, 1667 내지 1674), 18G12(서열번호 956 내지 987), 28F9(서열번호 1052 내지 1083), 1E4(서열번호 1116 내지 1227), B12(서열번호 1414 내지 1431, 1733 내지 1742), B2(서열번호 1432 내지 1459), B7(서열번호 1460 내지 1487), B9(서열번호 1544 내지 1571), 8C7F3(서열번호 1488 내지 1515) 또는 H11(서열번호 1516 내지 1543)이 이 군에 속하고, 이 항체들의 가변 영역은 시퀀싱되었고 MNE6의 경우 서열번호 12, 13, 65 및 66으로서 제공되고 MNC2의 경우 서열번호 118, 119, 168 및 169로서 제공된다. 이 항체들의 CDR은 항체의 인식 유닛을 구성하며 인간 항체에 이식할 때 유지되어야 하는 마우스 항체의 가장 중요한 부분이다. 각각의 마우스 단일클론에 대한 CDR의 서열은 다음과 같고, 중쇄 서열 다음에 경쇄가 뒤따른다: MNE6 CDR1(서열번호 16 및 17, 및 69 및 70) CDR2(서열번호 20 및 21, 및 73 및 74) CDR3(서열번호 24 및 25, 및 77 및 78), MNC2 CDR1(서열번호 122 및 123, 및 172 및 173) CDR2(서열번호 126 및 127, 및 176 및 177) CDR3(서열번호 130 및 131, 및 180 및 181), 20A10 CDR1(서열번호 991 및 992, 및 1008 및 1009) CDR2(서열번호 996 및 997, 및 1012 및 1013) CDR3(서열번호 1000 및 1001, 및 1016 및 1017), 3C2B1 CDR1(서열번호 1388 및 1389, 및 1402 및 1403) CDR2(서열번호 1392 및 1393, 및 1406 및 1407) CDR3(서열번호 1396 및 1397, 및 1410 및 1411), 5C6F3 CDR1(서열번호 1358 및 1359, 및 1372 및 1373) CDR2(서열번호 1362 및 1363, 및 1376 및 1377) CDR3(서열번호 1366 및 1367, 및 1380 및 1381), 및 25E6 CDR1(서열번호 1024 및 1025, 및 1040 및 1041) CDR2(서열번호 1028 및 1029, 및 1044 및 1045) CDR3(서열번호 1032 및 1033, 및 1048 및 1049). 일부 경우, 모델링에 의해 CDR의 3차원 구조에 중요하다고 생각되는 프레임워크 영역의 일부도 마우스 서열로부터 가져온다.

단일클론 항체 MNE6, MNC2, 20A10, 3C2B1 및 25E6은 암 세포에서 보이는 MUC1*에 대한 더 큰 친화성을 가진다. 단일클론 항체 MNC3 및 MNC8은 줄기 세포에서 보이는 MUC1*에 대한 더 큰 친화성을 가진다.

7개의 항체 모두를 인간화하였는데, 이 과정은 각각의 항체의 여러 인간화된 형태를 생성시켰다. 마우스 항체의 가변 영역으로부터 유래한 CDR을 상동 인간 항체 가변 영역 서열에 생화학적으로 이식하였다. 마우스 CDR을 상동 인간 항체의 가변 영역에 이식함으로써 MNE6(서열번호 38 및 39, 및 93 및 94), MNC2(서열번호 144 및 145, 및 194 및 195), 20A10(서열번호 1576 내지 1581 및 5001 내지 5012), 3C2B1(서열번호 1812 및 1813), 5C6F3(서열번호 1814 및 1815), 25E6(서열번호 1600 및 1601), MNC3(서열번호 439 및 440, 및 486 및 487) 및 MNC8(서열번호 525 및 526, 및 543 및 544)의 인간화된 가변 영역을 생성하였다. 그 다음, 인간화된 중쇄 가변 구축물을 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(서열번호 58 및 59) 또는 인간 IgG2 중쇄 불변 영역(서열번호 54 및 55)의 불변 영역에 융합한 후, 인간 카파 쇄(서열번호 109 및 110) 또는 인간 람다 쇄(서열번호 113 및 114) 불변 영역에 융합된 인간화된 경쇄 가변 구축물과 쌍을 이룬다. IgG3 또는 IgG4를 포함하는 다른 IgG 이소타입을 불변 영역으로서 사용할 수 있다.

IgG2 중쇄(서열번호 52 및 53) 및 IgG1 중쇄(서열번호 56 및 57) 내로의 인간화된 MNE6 가변 영역, 람다 경쇄(서열번호 111 및 112, 및 216 내지 219) 또는 카파 쇄(서열번호 107 및 108, 및 210 내지 213)과 짝을 이룬 IgG1 중쇄(서열번호 157 및 158) 또는 IgG2 중쇄(서열번호 163 및 164) 내로의 인간화된 MNC2 가변, 및 인간화된 MNC3(서열번호 455 및 456, 453 및 454, 500 및 501, 및 502 및 503) 및 MNC8(서열번호 541 및 542, 539 및 540, 579 및 580, 및 581 및 582) 항체의 예를 생성하였다. 각각의 이소타입이 그 자신의 특징적인 활성을 갖기 때문에, 어느 IgG 불변 영역이 인간화된 가변 영역에 융합되는지는 원하는 효과에 의해 좌우된다. 인간 불변 영역의 이소타입은 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)을 원하는지 아니면 보체 의존적 세포독성(CDC)을 원하는지와 같은 것을 기반으로 선택되지만, 세포 기반 단백질 발현 시스템에서 생성되는 항체의 수율에 의해서도 좌우될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 인간화된 항-MUC1* 항체 또는 항체 단편은 MUC1 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 사람에게 투여된다.

암을 갖거나 발생시킬 위험이 있는 사람의 치료에 가장 유용한 인간화된 항-MUC1* 항체를 시험하고 선택하는 한 가지 방법은 활성화 리간드와 MUC1* 세포외 도메인의 결합을 억제하는 능력에 대해 이 항체를 시험하는 것이다. 이량체 NME1은 MUC1* 세포외 도메인에 결합하여 이를 이량체화할 수 있으며, 그렇게 함으로써 암 세포 생장을 자극한다. 따라서, MUC1* 세포외 도메인에 결합하기 위해 NME1과 경쟁하는 항체 및 항체 단편은 항암제이다. NME7_AB는 MUC1*의 또 다른 활성화 리간드이다. 일부 경우, NME7, 또는 NME7-X1의 NME7_AB 절두 또는 절단 생성물과 MUC1* 세포외 도메인의 결합을 차단하는 항체를 식별하는 것이 바람직하다. MUC1* 세포외 도메인에 결합하기 위해 NME7 및 NME7 변이체와 경쟁하는 항체 및 항체 단편은 항암 치료제로서 효과적이다. 이 항체는 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11뿐만 아니라, 이 항체들의 단일 쇄 버전, 예컨대, scFv 및 이들의 인간화된 버전도 포함하나 이들로 제한되지 않는다. NME1, NME6 및 NME8을 비롯한 다른 NME 단백질도 MUC1 또는 MUC1*에 결합한다. MUC1*에 결합하기 위해 이 단백질들과 경쟁하는 항체도 치료제로서 유용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 뮤린, 낙타, 인간 또는 인간화된 항-MUC1* 항체 또는 항체 단편은 MUC1 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 사람에게 투여된다. 보다 바람직한 실시양태에서, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 인간화된 서열로부터 유래한 단일 쇄 항체 단편 또는 단량체 scFv-Fc 융합체는 MUC1 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 사람에게 투여된다.

단일 쇄 가변 단편인 scFv, 또는 1가 항체 또는 항체 유사 단백질을 생성하는 다른 형태도 유용하다. 일부 경우, MUC1* 세포외 도메인의 이량체화를 방지하는 것이 요구된다. 단일 쇄 가변 단편, Fab 및 다른 1가 항체 유사 단백질은 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하고 MUC1* 이량체화를 차단하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이 단일 쇄 가변 단편, Fab 및 다른 1가 항체 유사 분자는 시험관내 및 인간 MUC1 양성 암 세포가 이종이식된 동물에서 암 성장을 효과적으로 차단하였다. 따라서, 인간화된 단일 쇄 가변 단편 또는 1가 항-MUC1* 항체 또는 항체 유사 분자는 항암 치료제로서 매우 효과적일 것이다. 따라서, MUC1* 세포외 도메인 또는 PSMGFR 펩티드에 결합하는 이러한 인간화된 단일 쇄 항체, Fab 및 다른 1가 항체 유사 분자는 항암 치료제로서 유용하다. 항-MUC1* 단일 쇄 가변 단편은 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하거나 PSMGFR 펩티드에 결합하는 항체의 비-인간 CDR을 상동 가변 영역 인간 항체의 프레임워크에 이식함으로써 생성된다. 그 후, 생성된 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 적합한 링커를 통해 서로 연결되며, 이때 링커는 유연해야 하고 중쇄와 경쇄의 결합을 허용하되, 한 분자의 중쇄가 또 다른 분자의 경쇄에 결합하지 못하게 하는 길이를 가져야 한다. 예를 들어, 약 10개 내지 15개 잔기의 링커. 바람직하게는, 링커는 [(글리신)₄(세린)₁]₃(서열번호 401 및 402)을 포함하나, 다른 서열도 가능하므로 이 서열로 제한되지 않는다.

한 측면에서, MNE6(서열번호 38 및 39, 및 93 및 94), MNC2(서열번호 144 및 145, 및 194 및 195) 또는 본 발명의 다른 항체의 인간화된 가변 영역은 링커를 통해 중쇄와 경쇄를 연결하는 구축물 내로 생화학적으로 이식된다. MNE6 및 MNC2의 가변 영역으로부터의 인간화된 서열을 포함하는 인간화된 단일 쇄 항-MUC1* 항체의 예를 생성하였다. 여러 인간화된 MNE6 단일 쇄 단백질들을 생성하였다(서열번호 232 내지 237, 397 및 398). 여러 인간화된 MNC2 단일 쇄 단백질들을 생성하였다(서열번호 238 내지 243, 395 및 396, 654 및 655, 5017 및 5018, 5019 및 5020). 여러 인간화된 20A10 단일 쇄 단백질들을 생성하였다(서열번호 1576 내지 1581 및 5001 내지 5012). 여러 인간화된 3C2B1 단일 쇄 단백질들을 생성하였다(서열번호 1812 및 1813). 여러 인간화된 5C6F3 단일 쇄 단백질들을 생성하였다(서열번호 1814 및 1815). 여러 인간화된 25E6 단일 쇄 단백질들을 생성하였다(서열번호 1600 및 1601). 바람직한 실시양태에서, CAR, 이중특이적 항체, BiTE, 항체 약물 접합체를 포함하는 다양한 치료제 포맷 내로 통합될 수 있는, MNE6 scFv, MNC2 scFv, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11 scFv로부터 유래한 가변 단편 및 scFv 항체 단편을 비롯한 인간화된 항-MUC1* 항체 단편은 MUC1 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 사람에게 투여된다.

본 발명의 한 측면은 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 상기 환자는 MNE6, MNC2, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 단량체 형태를 함유하는 유효량의 작용제를 투여받고, 항체 가변 단편 부분은 인간이거나 인간화되었고 항체 유사 단백질의 Fc 부분은 존재하는 경우 이량체 형성에 대한 내성을 갖도록 돌연변이되었다.

CAR T 및 암 면역요법 기법

본 발명의 또 다른 측면에서, 여러 상이한 키메라 항원 수용체를 사용하여('CAR' 전략) 항-MUC1* 항체 단편의 단일 쇄 부분의 일부 또는 전부를 면역 시스템 분자에 생화학적으로 융합한다. 이 생각은 전형적으로 단일 쇄 가변 단편으로서 항체의 인식 부분을, 예를 들어, 면역 세포를 활성화시키는 면역 시스템을 활성화시켜 상기 인식 유닛에 의해 인식되는 세포를 사멸시키는 신호를 전달할 수 있는 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리를 가진 면역 시스템 분자에 융합하는 것이다. 인식 유닛은 항체 단편, 단일 쇄 가변 단편, scFv 또는 펩티드일 수 있다. 한 측면에서, CAR의 세포외 도메인의 인식 부분은 MNE6(서열번호 12 및 13, 및 65 및 66, 56 및 57, 및 107 및 108, 38 및 39, 및 93 및 94, 341 및 342, 391 내지 394), MNC2(서열번호 118 및 119, 및 168 및 169, 또는 144 및 145, 및 194 및 195, 654 및 655, 239 내지 243, 또는 5017 내지 5020), 20A10(서열번호 988 및 989, 및 1004 및 1005, 또는 1574 내지 1581, 1677, 1687, 또는 5001 내지 5012), 3C2B1(서열번호 1386 내지 1413, 또는 1820 내지 1823, 1572 및 1573, 또는 1812 및 1813), 5C6F3(서열번호 1816 내지 1819, 또는 1384 및 1385, 또는 1814 및 1815), 25E6(서열번호 1020 및 1021, 또는 1036 및 1037, 또는 1598 내지 1601), 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 인간, 인간화된 또는 비-인간 가변 영역으로부터의 서열로 구성된다. 이들은 CAR, BiTE 또는 ADC 내로 통합될 수 있는 본 발명의 뮤린 또는 인간화된 항체, 또는 이들의 단일 쇄 단편인 scFv의 예이다. 또 다른 측면에서, 인식 유닛은 단일 쇄 가변 단편으로부터의 서열로 구성된다. 단일 쇄 구축물의 예가 제공된다. 여러 인간화된 MNE6 단일 쇄 단백질인 scFv를 생성하였다(서열번호 232 내지 237). 여러 인간화된 MNC2 단일 쇄 단백질인 scFv를 생성하였다(서열번호 238 내지 243, 654 및 655, 또는 5017 내지 5020). 여러 인간화된 20A10 단일 쇄 단백질인 scFv를 생성하였다(서열번호 1576 내지 1581, 1677, 1687 및 5001 내지 5012). 인간화된 단일 쇄 단백질은 또한 3C2B1(서열번호 1812 및 1813), 5C6F3(서열번호 1814 및 1815) 및 25E6(서열번호 1600 및 1601)으로부터 유래하였다. CAR의 세포외 힌지는 CD8(서열번호 345 및 346), CD4(서열번호 347 및 348) 또는 CD28(서열번호 349 및 350)을 포함하는 다양한 단백질들로부터 유래할 수 있다. CAR의 막횡단 영역은 또한 CD3-제타(서열번호 361 및 362), CD8(서열번호 363 및 364), CD4(서열번호 365 및 366), CD28(서열번호 367 및 368), 4-1BB(서열번호 369 및 370), OX40(서열번호 371 및 372), 항체 도메인, 또는 근위 세포질 보조자극 도메인, 예컨대, CD28, 4-1BB 등의 막횡단 영역을 포함하는 다른 막횡단 영역으로부터 유래할 수 있다. CAR의 세포질 꼬리는 면역 시스템 활성화 신호를 보내는 하나 이상의 모티프로 구성될 수 있다. 종종 보조자극 도메인으로서 지칭되는 세포질 신호전달 모티프의 군은 CD27, CD28(서열번호 377 및 378), 4-1BB(서열번호 379 및 380), OX40, CD30, CD40, ICAm-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD5, CD7 및 Fc 수용체 감마 도메인을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 신호전달 도메인은 CD3-제타(서열번호 373 및 374, 또는 375 및 376) 또는 1XX로서 지칭되는 변형된 CD3-제타(서열번호 1796 및 1797)일 수 있다. 최소 CAR은 CD3-제타 또는 Fc 수용체 감마 도메인에 이어, 세포질 꼬리에서 직렬로 상기 도메인들 중 1개 또는 2개의 도메인을 가질 수 있다. 한 측면에서, 세포질 꼬리는 CD3-제타, 또는 이의 돌연변이체, 예컨대, 1XX와, 보조자극 도메인, 예컨대, CD28, 4-1BB 및/또는 OX40을 포함한다. 또 다른 측면에서, 지속성을 증가시키고 면역 세포의 분화를 감소시키는 신호전달을 늦추기 위해 CD3-제타의 1개 또는 2개의 ITAM을 결실시키거나 돌연변이시킨다.

MUC1* 표적화 CAR의 세포외 도메인 인식 유닛은 PSMGFR 펩티드(서열번호 2)의 적어도 12개 연속 아미노산, 보다 바람직하게는 N-10 펩티드(서열번호 3), 훨씬 더 바람직하게는 N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합할 수 있으나 C-10 펩티드(서열번호 825)에는 결합할 수 없는 임의의 비-인간, 인간화된 또는 인간 항체의 가변 영역을 포함할 수 있다. 한 측면에서, CAR의 MUC1* 표적화 부분은 비-인간, 인간화된 또는 인간 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 가변 영역을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, CAR의 MUC1* 표적화 부분은 비-인간, 인간화된 또는 인간 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6의 가변 영역을 포함한다. 뮤린 또는 인간화된 항체로서 CAR 내로 통합된 본 발명의 몇몇 항체의 예는 MNE6(서열번호 297 및 298, 300 및 301, 303 및 304, 1626 내지 1633, 및 5045 내지 5048), MNC2(서열번호 306 및 307, 608 내지 611, 718 및 719, 1618 내지 1625, 5041 내지 5044, 및 1784 및 1785), 20A10(서열번호 1582 내지 1597, 5021 내지 5028, 1798 및 1799, 1692, 1699, 및 1706) 및 25E6(서열번호 1602 내지 1617, 5033 내지 5040)으로서 제공된다. 유사하게, 3C2B1(서열번호 1572 및 1573, 또는 1812 및 1813) 또는 5C6F3(서열번호 1384 및 1385, 또는 1814 및 1815)으로부터 유래한 단일 쇄 항체는 상기 나열된 CAR들 중 임의의 CAR에서 단일 쇄 항체 단편을 대체할 수 있다. 인간화 과정에서, 항체 CDR은 다수의 상이한 프레임워크 영역에 삽입될 수 있다; 입증으로서, 본 발명자들은 프레임워크 영역에서만 상이한 세 가지 버전의 인간화된 20A10을 생성하였다. 이들은 인간 T 세포 내로 형질도입될 때 MUC1* 발현 세포를 인식하고 이를 사멸시킬 수 있는 CAR(서열번호 1675, 1678, 1685) 내로 통합되었다. 한 측면에서, CAR의 세포외 도메인 인식 유닛은 본질적으로 인간화된 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11 단일 쇄 가변 단편 scFv로 구성된다. 전형적으로 항체 단편인 인식 도메인은 종종 힌지로서 지칭되는 세포외 영역에 융합될 수 있다. 힌지는 CD8(서열번호 345 및 346), CD4(서열번호 347 및 348) 또는 CD28(서열번호 349 및 350)의 힌지 영역을 포함하나 이들로 제한되지 않는 다양한 세포외 영역 또는 펩티드로부터 유래할 수 있다. CAR의 막횡단 영역은 CD8(서열번호 363 및 364)을 포함하나 이로 제한되지 않는 다수의 단백질 막횡단 도메인으로부터 유래할 수 있거나, CD3-제타(서열번호 361 및 362), CD4(서열번호 365 및 366), CD28(서열번호 367 및 368), 41BB(서열번호 369 및 370), OX40(서열번호 371 및 372) 또는 다른 막횡단 영역의 막횡단 도메인일 수 있다. MUC1* 세포외 도메인을 표적화하는 항체 단편을 가진 CAR의 세포질 도메인은 면역 시스템 보조자극 세포질 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상으로 구성될 수 있다. 면역 시스템 보조자극 도메인의 군은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICAm-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD5, CD7 및 Fc 수용체 감마 도메인(서열번호 373 내지 382)을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 면역 시스템 신호전달 도메인의 군은 CD3-제타(서열번호 373 내지 376) 및 CD3-제타-1XX(서열번호 1796 및 1797)를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. CD3-제타 신호전달 도메인은 야생형일 수 있거나 3개의 ITAM 중 1개 또는 2개의 ITAM의 결실 또는 돌연변이를 함유할 수 있다. 한 측면에서, CD3-제타 도메인은 1개의 기능적 ITAM만을 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 그 ITAM은 CD3-제타의 1XX 변이로서도 알려진 ITAM1이다.

기재된 CAR은 면역 시스템의 세포 내로 형질감염될 수 있거나 형질도입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, MUC1* 표적화 CAR은 T 세포 또는 NK 세포 내로 형질감염되거나 형질도입된다. 면역 세포는 자가 또는 동종이계 면역 세포일 수 있다. 한 측면에서, T 세포는 CD8 또는 CD4 양성일 수 있는 CD3+ T 세포이다. 또 다른 경우, 면역 세포는 수지상 세포이다. 또 다른 경우, 면역 세포는 B 세포이다. 또 다른 경우, 면역 세포는 비만 세포이다. 또 다른 경우, 면역 세포는 천연 킬러 세포인 NK 세포이다. 또 다른 측면에서, 면역 세포는 시험관내에서 그 면역 세포 유형으로 분화하도록 유도된 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 항체의 서열을 함유하는 CAR은 나중에 면역 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포에서 발현된다. 한 경우, 면역 세포는 T 세포이다. 또 다른 경우, 면역 세포는 NK 세포이다. 세포는 환자 또는 기증자로부터 유래할 수 있다. 기증자로부터 유래한 경우, 세포는 거부를 유발할 분자를 제거하도록 조작될 수 있다. 본 발명의 CAR로 형질감염되었거나 형질도입된 세포는 생체외에서 또는 시험관내에서 증폭된 후 환자에게 투여될 수 있다. 투여 경로는 골수 이식, 정맥내 주사, 제자리 주사 또는 이식을 포함하나 이들로 제한되지 않는 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, MUC1* 표적화 CAR은 MUC1 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 사람에게 투여된다.

MUC1* 양성 암의 치료 또는 예방을 위해 T 세포 또는 다른 면역 세포 내로 형질도입될 수 있는 많은 가능한 항-MUC1* CAR 구축물이 있다. CAR은 모듈로 구성되고 일부 모듈의 정체는 비교적 중요하지 않지만, 다른 모듈의 정체는 매우 중요하다. 본 발명자들 및 다른 연구진은 세포내 신호전달 모듈, 예컨대, CD3-제타(서열번호 373 내지 376), CD28(서열번호 377 및 378) 및 41BB(서열번호 379 및 380)가 단독으로 또는 조합으로 면역 세포 증폭, 사이토카인 분비 및 표적화된 종양 세포의 면역 세포 매개 사멸을 자극한다는 것을 밝혔다(Pule MA, Straathof KC, Dotti G, Heslop HE, Rooney CM and Brenner MK (2005) A chimeric T cell antigen receptor that augments cytokine release and supports clonal expansion of primary human T cells. Mol Ther. 12(5):933-941; Hombach AA, Heiders J, Foppe M, Chmielewski M and Abken H. (2012) OX40 costimulation by a chimeric antigen receptor abrogates CD28 and IL-2 induced IL-10 secretion by redirected CD4(+) T cells. Oncoimmunology. 1(4):458-466; Kowolik CM, Topp MS, Gonzalez S, Pfeiffer T, Olivares S, Gonzalez N, Smith DD, Forman SJ, Jensen MC and Cooper LJ. (2006) CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 66(22):10995-11004; Loskog A, Giandomenico V, Rossig C, Pule M, Dotti G and Brenner MK. (2006) Addition of the CD28 signaling domain to chimeric T cell receptors enhances chimeric T cell resistance to T regulatory cells. Leukemia. 20(10):1819-1828; Milone MC, Fish JD, Carpenito C, Carroll RG, Binder GK, Teachey D, Samanta M, Lakhal M, Gloss B, Danet-Desnoyers G, Campana D, Riley JL, Grupp SA and June CH. (2009) Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Mol Ther. 17(8):1453-1464; Song DG, Ye Q, Carpenito C, Poussin M, Wang LP, Ji C, Figini M, June CH, Coukos G, Powell DJ Jr. (2011) In vivo persistence, tumor localization, and antitumor activity of CAR-engineered T cells is enhanced by costimulatory signaling through CD137 (4-1BB). Cancer Res. 71(13):4617-4627). MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 단편을 포함하나 이들로 제한되지 않는 본 발명의 항체는 하나 이상의 ITAM의 돌연변이되었거나 결실된 티로신과 같은 돌연변이된 세포질 꼬리를 가진 CAR 내로 통합될 수도 있다. 전술된 CAR들 중 임의의 CAR에서, 세포질 꼬리는 신호전달을 약화시켜 지속성을 증가시키고 숙주 세포 분화를 감소시키는 돌연변이 또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 인산화 및 신호전달을 억제하도록 돌연변이된 티로신을 포함하나 이로 제한되지 않는다(Salter et al, 2018). 전술된 CAR들 중 임의의 CAR에서, CD3-제타의 ITAM은 신호전달을 억제하거나 약화시키도록 돌연변이될 수 있다(Feucht et al 2019). 전술된 CAR들 중 임의의 CAR에서, 세포질 꼬리의 CD3-제타는 1XX로서 지칭되는 ITAM을 포함하는 ITAM 내에 돌연변이 또는 결실을 포함할 수 있다(서열번호 1796 및 1797). 또 다른 측면에서 1개 또는 2개의 ITAM만을 남기면서 1개 또는 2개의 ITAM이 결실된다(Feucht et al 2019). 또 다른 측면에서, 포함된 ITAM 또는 ITAM들의 위치는 보조자극 도메인에 인접한 위치로 이동된다. CAR의 증가된 지속성에 적합한 ITAM 구성은 1XX, X2X, XX3, 12X 및 23X를 포함하나 이들로 제한되지 않고, 이때 숫자 1, 2 또는 3은 ITAM1, ITAM2 또는 ITAM3을 지칭하고 X는 그 ITAM의 결실을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, ITAM1은 1XX로서도 알려져 있는, CAR 구축물에 포함된 유일한 기능적 ITAM이다. CD3-제타의 ITAM에서 1XX 돌연변이를 가진 CAR 내로 통합된 본 발명의 항체의 예는 하기 서열로 제공된다: MNC2(서열번호 1618 내지 1625, 5041 내지 5044, 및 1784 및 1785), MNE6(서열번호 1626 내지 1633 및 5045 내지 5048), 20A10(서열번호 1590 내지 1597, 5021 내지 5028, 및 1798 및 1799), 25E6(서열번호 1610 내지 1617 및 5037 내지 5040). CAR의 막횡단 및 세포외 힌지 영역은 인접 보조자극 도메인의 서열로부터 유래할 수 있거나 유래하지 않을 수 있다. 예를 들어, 4-1BB 보조자극 도메인을 포함하는 CAR은 CD8 또는 CD28로부터 유래한 막횡단 및 힌지 영역을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, CD28 보조자극 도메인을 포함하는 CAR은 CD28로부터 유래한 막횡단 및 힌지 영역을 가질 수 있다. CD28 보조자극 도메인뿐만 아니라 CD28로부터 유래한 막횡단 및 힌지 영역도 가진, CD3-제타의 ITAM에서 1XX 돌연변이를 가진 CAR 내로 통합된 본 발명의 항체의 예는 하기 서열로 제공된다: MNC2(서열번호 5041 내지 5044, 및 1784 및 1785) MNE6(서열번호 5045 내지 5048), 20A10(서열번호 5025 내지 5028, 1798 및 1799, 1692, 1699, 및 1706); 25E6(서열번호 5037 내지 5040). 여기에 기재된 CAR들 중 임의의 CAR에서, 세포질 영역은 CD3-제타, CD3-제타-1XX, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICAm-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD5 또는 CD7을 포함하나 이들로 제한되지 않는 신호전달 서열 모티프 및 보조자극 도메인 중 하나 이상으로 구성될 수 있다. 추가로, 세포내 신호전달 도메인의 서열은 지속성 또는 표적 세포 사멸을 개선하기 위해 신호를 약화시키는 돌연변이, 예컨대, CD3-제타-1XX(서열번호 1796 및 1797)를 함유할 수 있다. 신호전달 도메인 CD3-제타는 야생형일 수 있거나 1개 또는 2개의 ITAM의 돌연변이 또는 결실을 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ITAM 2 및 3은 결실되거나 불활성화되어, 1XX 구축물로서도 알려진 ITAM1인 단일 ITAM을 남긴다.

본 발명의 한 측면에서, CAR의 힌지 및 막횡단 영역은 CD8(서열번호 301, 719, 1675 또는 1605)로부터 유래한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, CAR의 힌지 및 막횡단 영역은 CD28(서열번호 5048, 5044, 5024 또는 5036)로부터 유래한다. 본 발명의 한 측면에서, 보조자극 도메인은 CD28(서열번호 298, 609, 1589, 1609)이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 보조자극 도메인은 4-1BB(서열번호 301, 719, 1585 또는 1605)이다. 바람직한 실시양태에서, CAR의 표적화 헤드인 항체 단편은 탠덤 반복부 도메인을 결여하는 MUC1의 세포외 도메인에 결합한다. 보다 바람직한 실시양태에서, CAR의 표적화 헤드인 항체 단편은 본원에서 N-10(서열번호 3)으로서도 지칭되는, 35개의 가장 막 근위 아미노산을 함유하는 MUC1* 세포외 도메인의 영역에 결합한다. 훨씬 더 바람직한 실시양태에서, CAR의 표적화 헤드인 항체 단편은 N-10(서열번호 3)에 결합하지만 C-10(서열번호 825)에는 결합하지 않는다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, CAR의 표적화 헤드인 항체 단편은 N-10(서열번호 3)에 결합하고, C-10(서열번호 825)에 결합하지 않으며, 선형 에피토프에 결합하지 않거나, 즉 표준 웨스턴 블롯에서 작동하지 않거나, N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합하기 위해 NME7_AB와 경쟁한다. 본원에 기재된 CAR에서, 세포외 도메인은 MNE6 scFv(서열번호 5014 또는 5016), MNC2 scFv(서열번호 5018 또는 5020) 또는 20A10 scFv(서열번호 5002, 5004, 5006, 5008, 5010 또는 5012), 25E6 scFv(서열번호 5030 또는 5032)로서 기재된, 가변 길이를 가진 경쇄의 프레임워크 영역 IV를 가진 뮤린, 낙타, 인간, 비-인간 또는 인간화된 단일 쇄 항체 단편을 포함할 수 있다. 상기 기재된 CAR들 중 임의의 CAR에서, 단일 쇄 항체 단편의 경쇄의 프레임워크 영역 IV는 말단 아미노산 R 및 T가 결실될 수 있거나 T만이 결실될 수 있다. 본 발명자들은 항체의 CDR이 다수의 상이한 프레임워크 영역의 배경에 삽입될 수 있음을 주목한다. 예로서, 20A10 CDR은 3개의 상이한 프레임워크 영역 세트(서열번호 1692, 1699 및 1706)에 삽입되었고 모두 T 세포 내로 형질도입되었을 때 작용할 수 있었다. 전술된 CAR들 중 임의의 CAR에서, T 세포는 T 세포 고갈을 억제하는 방법으로서 c-Jun을 과다발현하도록 조작될 수 있다(Lynn et al 2019). CRISPR, 슬립핑 뷰티(Sleeping Beauty) 또는 유사한 부위 지정 유전자 삽입 기술을 이용하여 세포 내의 천연 생성 프로모터, 예컨대, TRAC 유전자좌 내로 삽입하는 것을 포함하는, 다양한 프로모터들을 본 발명의 CAR 및 다른 조성물을 위해 유전자의 업스트림에서 사용할 수 있다. 통상적으로 사용되는 프로모터들 중에는 CMV 프로모터, 또는 mini CMV(서열번호 1634), 최소 IL-2 프로모터(서열번호 1635) 또는 최소 프로모터 minip(서열번호 1636)가 있다.

MNE6 또는 MNC2로서 지칭되는 단일클론 항-MUC1* 항체의 가변 도메인을 포함하는 단일 쇄 항체 단편을 CAR의 패널 내로 조작하였다. 그 다음, MUC1* 표적화 CAR을 개별적으로 또는 조합하여 면역 세포 내로 형질도입하였다. MUC1* 펩티드를 제시하는 표면, MUC1*로 형질감염된 항원 제시 세포 또는 MUC1* 양성 암 세포로 챌린지하였을 때, MUC1* 표적화 CAR로 형질도입된 면역 세포는 사이토카인 방출, 표적화된 세포의 사멸 및 면역 세포의 증폭을 비롯한 면역 반응을 이끌어내었다.

예를 들어, CAR을 코딩하는 유전자 및 본원에 기재된 활성화된 T 세포 유도 유전자는 바이러스의 사용을 통해 면역 세포 내로 바이러스 형질도입될 수 있거나, 세포의 프로모터 또는 인핸서 중 하나, 예컨대, TRAC(T 세포 수용체 알파 쇄) 유전자좌의 업스트림에 있는 영역에 삽입될 수 있다. 감마-레트로바이러스를 포함하는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 바큘로바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 종양용해성 바이러스, HF10, T-Vec 등을 포함하나 이들로 제한되지 않는 바이러스 전달 시스템 및 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 형질도입 이외에, 본원에 기재된 CAR 및 활성화된 T 세포 유도 유전자는 CRISPR 기술, CRISPR-Cas9 및 CRISPR-CPF1, TALEN, 슬립핑 뷰티 트랜스포존 시스템 및 SB 100X와 같은 방법을 이용함으로써 수용자 세포의 게놈 내로 직접 스플라이싱될 수 있다.

유사하게, CD3-제타 정체를 제외하고 CAR의 비-표적화 부분을 구성하는 분자, 예컨대, 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인의 막 근위 부분의 정체는 MUC1* 표적화 CAR의 기능에 필수적이지 않다. 예를 들어, 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인의 막 근위 부분은 CD8, CD4, CD28, 또는 일반적인 항체 도메인, 예컨대, Fc, CH2CH3 또는 CH3의 부분으로 구성될 수 있다. 추가로, CAR의 비-표적화 부분은 이 분자들 또는 다른 패밀리 구성원들 중 하나 이상의 부분의 합성물일 수 있다. 그러나, 1XX 또는 CD3-제타-1XX로서 지칭되는 돌연변이와 같은 돌연변이가 CAR T 세포의 생체내 지속성에 크게 영향을 미치기 때문에 CD3-제타의 정체는 중요하다. CD3-제타-1XX를 포함하는 세포질 꼬리를 가진 CAR을 발현하는 CAR T 세포는 야생형 CD3-제타를 함유하는 세포만큼 빨리 고갈되지 않기 때문에 생체내에서 연장된 활성을 가진다. 또한, 본 발명자들은 1XX 신호전달 도메인을 가진 CAR이 낮은 항원 밀도를 특징으로 하는 세포에 대해 더 효과적이라는 것을 발견하였다. 항원 밀도가 낮은 암 세포는 불균질한 종양의 하위집단을 포함할 수 있다. 항원 밀도가 낮은 암 세포는 암 재발로 이어질 수 있는 초기 암 세포의 특성일 수 있다. 추가로, 치료 시점에서 종양은 낮은 수준의 특정 암 항원을 발현하는 암 세포로 구성될 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 암으로 진단받거나 암 또는 암 재발을 발생시킬 위험이 있는 환자는 1XX 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 면역 세포로 치료받는다. 한 측면에서, 환자는 MUC1* 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있다. 바람직한 실시양태에서, CAR의 인식 유닛은 N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합하나 C-10 펩티드(서열번호 825)에는 결합하지 않는 항체 단편을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항체 단편은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 또는 25E6으로부터 유래한다.

또 다른 실시양태에서, 낮은 수준의 표적화된 항원을 발현하는 종양 세포로 구성된 암으로 진단받거나 초기 암으로 진단받은 환자, 또는 치료를 받았지만 여전히 잔류 종양 세포를 갖고 암 재발의 위험이 있는 환자는 CAR T 세포가 항원 고밀도 암 세포 및 항원 저밀도 암 세포 둘 다를 사멸시킬 수 있게 하는, 1XX 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 면역 세포로 치료받는다. 한 측면에서, 환자는 MUC1* 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있다. 바람직한 실시양태에서, CAR의 인식 유닛은 N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합하나 C-10 펩티드(서열번호 825)에는 결합하지 않는 항체 단편을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항체 단편은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 또는 25E6으로부터 유래한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 암으로 진단받거나 암 또는 암 재발을 발생시킬 위험이 있는 환자는 야생형 CD3-제타를 가진 CAR을 발현하는 면역 세포로 치료받고 CD3-제타-1XX와 같은 돌연변이된 CD3-제타를 가진 CAR을 발현하는 면역 세포로도 치료받는다. 이 방식으로, 종양은 고항원 발현 세포를 효율적으로 사멸시키는 완전한 CD3-제타 신호전달을 가진 CAR을 발현하지만 조기에 고갈되는 면역 세포에 의해 공격을 받지만, CD3-제타-1XX와 같은 돌연변이된 CD3-제타를 가진 CAR을 발현하는 세포는 환자에서 더 오래 지속되고 종양 재발을 야기할 가능성이 있는 저항원 발현 세포를 사멸시킨다. 한 측면에서, 환자는 MUC1* 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있다. 바람직한 실시양태에서, CAR의 인식 유닛은 N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합하나 C-10 펩티드(서열번호 825)에는 결합하지 않는 항체 단편을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항체 단편은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 또는 25E6으로부터 유래한다. 한 측면에서, 환자는 CAR이 야생형 CD3-제타 신호전달 도메인을 가진 CAR T 세포로 치료받고, 이때 CAR은 MNC2 CAR(서열번호 306 및 307, 608 내지 611, 718 및 719), MNE6 CAR(서열번호 297 및 298, 300 및 301, 303 및 304), 20A10 CAR(서열번호 1582 내지 1589, 5021 내지 5024), 25E6 CAR(1602 내지 1609, 5033 내지 5036), 신호전달 도메인이 야생형 CD3-제타인 3C2B1로부터 유래한 항체 단편을 포함하는 CAR, 및 신호전달 도메인이 야생형 CD3-제타인 5C6F3으로부터 유래한 항체 단편을 포함하는 CAR을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 환자는 CAR이 CD3-제타-1XX 신호전달 도메인을 가진 CAR T 세포로 치료받고, 이때 CAR은 MNC2 CAR(서열번호 1618 내지 1625, 5041 내지 5044, 1784 및 1785), MNE6 CAR(서열번호 1626 내지 1633, 5045 내지 5048), 20A10 CAR(서열번호 1590 내지 1597, 5025 내지 5028, 1798 및 1799), 25E6 CAR(서열번호 1610 내지 1617, 5037 내지 5040), 신호전달 도메인이 CD3-제타-1XX인 3C2B1로부터 유래한 항체 단편을 포함하는 CAR, 및 신호전달 도메인이 CD3-제타-1XX인 5C6F3으로부터 유래한 항체 단편을 포함하는 CAR을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 환자는 야생형 CD3-제타 신호전달 도메인을 가진 CAR 및 1XX 신호전달 도메인을 가진 CAR 둘 다를 발현하는 면역 세포로 치료받는다.

본 발명자들은 CD3-제타 내에 1XX 돌연변이를 가진 CAR T 세포가 야생형 CD3-제타를 가진 CAR T 세포보다 종양 재발을 예방하는 데 더 효과적이라는 것을 보여주었다. 도 218은 IVIS 기기에 의해 측정된 종양 부피의 그래프를 보여주는 것으로, 이때 종양 세포는 루시퍼라제를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 기질 루시페린을 주사한 지 10분 후, 진정된 동물에서 광 방출을 측정하였다. 실험 1일째 날, 250,000개의 인간 유방 종양 세포를 동물에게 피하 주사하였다. 종양은 2개의 상이한 종양 세포 유형으로 구성된 불균질한 종양으로 만들어졌다. 제1 종양 세포 집단은 전체 길이 MUC1 및 성장 인자 수용체 형태 MUC1* 둘 다를 발현하는 유방암 세포주인 T47D-wt이었고, 본 발명자들은 mCherry 형광을 발현하도록 이 세포주를 조작하였다. 제2 종양 세포 집단은 훨씬 더 많은 MUC1* 및 GFP 형광을 발현하도록 안정적으로 형질도입되었다는 점을 제외하고 동일한 T47D 유방암 세포(본원에서 T47D-MUC1*로서도 지칭됨)이었다. 이 실험에서, T47D-wt와 T47D-MUC1*를 동물에 이식하였는데, 이때 T47D-MUC1*의 집단은 종양 집단의 30%, 15% 또는 7.5%를 구성하였다. 이어서, PBS, huMNC2-41BB-3z CAR T 세포(4-1BB), huMNC2-CD28-3z CAR T 세포(CD28) 또는 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포(CD28-1XX 또는 1XX)의 1회 주사를 동물에게 투여하였다. CAR T 세포를 10:1, 5:1 또는 1:1의 이펙터 대 표적 비(E:T)로 꼬리 정맥에 주사하였다. 이 그래프들에서 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CD28-1XX는 huMNC2-CD28-3z 및 huMNC2-41BB-3z를 능가하며, 그 차이는 낮은 항원 밀도를 가진 종양에서 더 현저할 뿐만 아니라 낮은 CAR T 세포 용량으로 치료할 때에도 더 현저하다. 본원에 기재된 후속 실험에서, 1XX CAR T 세포가 생체내에서 더 오래 지속되고 T 세포 고갈을 막을 뿐만 아니라, 산업계에서 인식된 문제이며 암 재발로 이어질 항원 저밀도 종양 세포를 사멸시키는 데에도 훨씬 더 효과적이라는 것은 분명하다. 도 219a 및 219b는 IVIS 사진 및 IVIS 종양 부피 측정의 그래프를 보여준다. 도 219a는 암 세포 집단의 30%가 본원에서 고항원 발현 세포로서 지칭되는 T47D-MUC1*인 종양을 이식받은 마우스의 사진을 보여준다. 다양한 CAR T 세포를 10:1의 CAR T 대 종양 세포 비로 투여하였으며, 이때 250,000개의 종양 세포를 이식하였고 5일 후에 2,500,000개의 CAR T 세포를 동물에 주사하였다. 도 219b는 일별 IVIS 측정에 의한 종양 부피의 그래프를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CD28-1XX가 주사된 동물은 CD3-제타 도메인 내에 1XX 돌연변이를 갖지 않는다는 점을 제외하고 동일한 CAR T인 huMNC2-4-1BB-3z 또는 huMNC2-CD28-3z로 치료받은 동물보다 훨씬 더 작은 종양을 가졌다. 도 220a 내지 220t는 10:1의 CAR T 대 종양 비로 치료받은 30% 종양에 대한 IVIS 그래프를 보여준다. 이때 그래프는 치료군의 평균보다는 각각의 개별 동물에 대해 표시된다. 도 221a 및 221b 및 도 222a 내지 222t는 단지 250,000개의 CAR T 세포가 단일 주사로 투여되므로, CAR T 세포 용량이 더 낮다는 점을 제외하고 본질적으로 동일한 실험을 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CD28-1XX가 주사된 동물은 CD3-제타 도메인 내에 1XX 돌연변이를 갖지 않는다는 점을 제외하고 동일한 CAR T인 huMNC2-4-1BB-3z 또는 huMNC2-CD28-3z로 치료받은 동물보다 훨씬 더 작은 종양을 가졌다. 그러나, 더 낮은 용량의 CAR T 세포를 사용한 경우, huMNC2-CD28-1XX 치료군의 종양조차도 더 느리기는 하지만 다시 성장하기 시작한다.

다음 실험(도 223 내지 도 226)에서, 본 발명자들은 종양의 7.5%만이 높은 항원 밀도를 발현하는 종양이 이식된 동물에서 표준 CAR T 세포가 종양을 사멸시키기 훨씬 더 어렵다는 것을 보여준다. 그러나, CD3-제타 내에 1XX 돌연변이를 가진 동일한 CAR T 세포는 종양을 사멸시키고 종양 재발을 억제하는 데 여전히 매우 효과적이다. 10:1의 이펙터 대 표적 비를 가진 적당한 CAR T 세포 용량에서, huMNC2-41BB-3z 및 huMNC2-CD28-3z는 huMNC2-CD28-1XX에 의해 초과되는 약간의 장기간 사멸을 보여준다. 그러나, 초기 암 세포 및 잔류 내성 암 세포와 유사한 낮은 항원 밀도, 및 1:1의 이펙터 대 표적 비를 가진 낮은 CAR T 세포 용량의 사용 시, huMNC2-41BB-3z 및 huMNC2-CD28-3z는 대조군 PBS보다 더 우수하지 않은 반면, huMNC2-CD28-1XX는 종양을 계속 사멸시켰다.

동물을 69일째 날 내지 90일째 날에 희생시켰다. 도 227 내지 233은 희생 후 시험 동물의 비장 및 혈액으로부터 채취된 CD3 양성 인간 T 세포의 표를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 더 작은 종양을 가진 huMNC2-CD28-1XX 치료 마우스는 야생형 CD3-제타를 가진 CAR T 세포로 치료받은 동물보다 더 많은 수의 살아있는 지속성 CAR T 세포 및 CD8 양성 킬러 T 세포를 가진다. T 세포 고갈의 분자 마커인 TIM3, LAG3 및 PD-1이 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 회수된 세포에서 크게 감소되거나 부재한다는 것도 확인된다. 이 결과는 CD3-제타의 1XX 돌연변이가 생체내에서 CAR T 세포 지속성을 증가시킨다는 생각과 일치한다.

희생 후, 종양을 절제하고 마찬가지로 분석하였다. 절제된 종양을 사진촬영하고 칭량하여(도 234, 도 236, 도 238, 도 240) 체중을 기록하였다. 그 다음, 종양을 효소로 해리하고 형광 사진을 촬영하여 종양 재발을 야기한 세포를 특징규명하고 정량하였다. 종양은 GFP 양성을 띠는 고항원 발현 세포와 mCherry 양성을 띠는 항원 저밀도 세포의 불균질한 집단임을 상기한다. 잔류 종양의 적색 및 녹색 형광 사진은 종양이 높은 퍼센트의 항원 고밀도 세포와 높은 CAR T 세포 용량을 가질 때 모든 CAR T 세포가 높은 수준의 표적 항원을 발현하는 종양 세포를 사멸시킬 수 있었음을 보여준다. 그러나, 종양 재발은 주로 표준 CAR T 세포가 쉽게 사멸시키지 못하는 항원 저밀도 세포의 생장에 기인하였다. 종양이 낮은 퍼센트의 고항원 세포로 구성되고 CAR T 세포 용량이 낮았을 때, 표준 CAR T 세포는 PBS의 대조군 주사보다 더 우수하지 않았다. 그러나, CD3-제타 도메인 내에 1XX 돌연변이를 가진 CAR T 세포는 항원 저밀도 세포를 상당히 더 잘 사멸시켰고, 이것은 종양 재발을 크게 억제하였다(도 235, 도 237, 도 239, 도 241).

도 242는 형광 이미지화된 살아있는 동물의 사진을 보여준다. 두 상이한 시점에서 촬영된 형광 사진은 적당한 퍼센트의 고항원 세포를 이식받고 야생형 CD3-제타를 가진 CAR 또는 1XX 돌연변이를 가진 CAR로 치료받은 동물의 경우, 항원 저밀도 세포의 생장 속도가 CD3-1XX를 가진 CAR로 치료받은 동물에 비해 야생형 CD3-제타를 가진 CAR로 치료받은 동물에서 더 빨랐음을 보여주었다. 낮은 CAR T 세포 용량에서, 표준 CAR은 항원 저밀도 종양 세포 및 항원 고밀도 종양 세포 둘 다의 더 빠른 생장 속도를 보여주었다. 이것은 야생형 CD3-제타를 가진 CAR이 항원 저밀도 세포를 사멸시키는 데 있어서 1XX를 가진 CAR만큼 효율적이지 않으며, 더 적은 수의 CAR T 세포의 사용 시, 표준 CAR이 CD3-제타 내에 1XX 돌연변이를 가진 CAR보다 더 빨리 고갈된다는 생각과 일치한다(도 242, 도 243, 도 244, 도 245).

또 다른 실험에서, 본 발명자들은 52일째 날에 250,000개의 항원 고밀도 종양 세포 또는 2,500,000개의 더 많은 CAR T 세포를 마우스에 주사하였다. 도 246 및 도 247에서 볼 수 있는 바와 같이, 추가 종양 세포의 주사는 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포로 치료받은 동물에서 종양 성장을 증가시키지 않는다. 그러나, 추가 종양 세포의 주사는 huMNC2-CD28-3z 또는 huMNC2-41BB-3z CAR T 세포로 치료받은 동물에서 종양 성장을 증가시킨다. 이 결과는 CD3z 내에 1XX 돌연변이를 가진 CAR T 세포가 생체내에서 CAR T 세포 지속성을 연장한다는 결과와 일치한다. 추가 CAR T 세포의 주사는 모든 군의 동물들 중 일부에서 종양 세포를 억제하였다는 것도 알 수 있다. 이것은 신선한 CAR T 세포가 여전히 종양 세포를 인식하고 사멸시켰기 때문에 종양 재발이 종양 탈출에 기인하지 않았다는 생각과 일치한다.

암 치료에 있어서 중요한 문제는 특히 현재까지 종양 세포의 사멸이 종양 세포의 항원 밀도에 의존하는 세포 요법의 경우 낮은 수준의 종양 관련 항원을 발현하는 종양 세포이다. 낮은 수준의 표적 항원을 발현하는 종양 세포는 조작된 CAR NK 세포뿐만 아니라 CAR T 세포도 탈출한다. 본질적으로 모든 고형 종양은 불균질하고 상이한 수준의 표적 항원을 발현하는 세포들로 구성된다. 이 문제를 더 연구하고 낮은 수준의 표적 항원을 발현하는 종양 세포를 검출하고 사멸시킬 수 있는 치료제를 개발하기 위해, 본 발명자들은 고항원 발현 세포 및 저항원 발현 세포로 구성된 불균질한 종양을 만드는 전략을 고안하였는데, 이때 두 상이한 세포 유형은 시험 동물의 희생 후 생체내 및 생체외에서 검출될 수 있는 형광 표지를 가진다(도 248 내지 도 256 참조). 도 249 및 도 250의 IVIS 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 표준 CD3z 신호전달 도메인 또는 1XX 돌연변이를 가진 CAR은 10:1 고용량의 CAR T 세포로 치료될 때 높은 수준의 항원을 발현하는 종양 세포를 사멸시킨다. 그러나, 표준 CD3-z 도메인을 가진 CAR의 경우, CAR T 세포의 용량이 높을 때조차도, 낮은 퍼센트의 고항원 발현 세포를 발현하는 종양 세포가 이식된 동물의 경우 치료군과 비치료군 사이의 차이는 작아진다. 이 결과는 1XX와 같은 돌연변이된 CD3-z 신호전달 도메인을 가진 CAR이 낮은 퍼센트의 고항원 발현 세포를 발현하는 종양 세포를 검출하는 향상된 능력을 가짐을 뒷받침한다. 도 251은 250,000개의 종양 세포를 이식받은 후 2.5M CAR T 세포 또는 250,000개 CAR T 세포로 1회 치료받은 동물에서 종양이 재발하고 재발의 시기와 정도가 1XX 돌연변이를 가진 CD3z를 보유하는 동물보다 표준 CD3z를 가진 CAR로 치료받은 동물에서 더 크다는 것을 보여준다. 절제된 종양의 형광 사진을 mCherry 파장 및 GFP 파장에서 촬영하였다. 도 252에서 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 동물의 종양의 경우 종양 재발이 가장 적다. 또한, 도면은 종양 재발이 표준 CAR T 세포가 놓친 저항원 발현 세포에 주로 기인함을 보여준다. 도 253 및 도 256에서 볼 수 있는 바와 같이, 낮은 퍼센트의 고항원 발현 세포를 발현하는 종양이 저용량 CAR T 세포를 사용한 치료와 커플링될 때, CAR T 세포 고갈과 저항원 세포 탈출의 조합은 종양 내성을 유도한다. 본 발명자들은 15% 높은 항원 밀도로 표지된 종양의 경우, 유세포분석이 생체내에서 더 큰 종양 성장 속도를 초래하는 것으로 보고된 종양 세포 클러스터의 집단이 존재한다는 것을 보여주었음을 주목한다.

항-MUC1* CAR T 세포는 예를 들어, 본 발명자들이 huMNC2-CD28-1XX를 사용하여 수행한 바와 같이 CD3-제타 신호전달 도메인이 일부 티로신의 돌연변이유발처럼 신호전달을 늦추도록 돌연변이될 때 더 오래 지속되고 T 세포 고갈을 피한다(도 257 내지 도 282의 표 참조). 시험 동물로부터 절제된 종양을 인간 CAR T 세포의 존재 및 이의 고갈 마커의 발현에 대해 유세포분석으로 분석하였다. 항원 고밀도 종양, 예컨대, 세포의 30%가 높은 수준의 항원, 이 경우 MUC1*를 발현하는 경우에도, 동물이 10:1 CAR T 세포 대 종양 세포의 높은 이펙터 대 표적 비로 치료받았을 때, CD3z 돌연변이, 이 경우 1XX를 가진 항-MUC1* CAR T로 치료받은 마우스의 종양에서 상당히 더 많은 수의 CAR T 세포가 존재한다는 것은 주목할 만하다. 도 257의 표에서 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 마우스는 절제된 종양에서 평균 1,516개의 CAR T 세포를 가졌지만, 이에 비해 huMNC2-41BB-3z로 치료받은 마우스의 경우 단지 196개의 CAR T 세포가 있었고 huMNC2-CD28-3z로 치료받은 마우스의 경우 단지 395개의 CAR T 세포가 있었다. huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 마우스에서, CAR T 세포는 가장 낮은 퍼센트의 고갈 마커를 발현하였다. 이것은 상당한 양의 고항원 발현 세포를 가진 종양의 경우 고용량의 CAR T 세포에서, 1XX 돌연변이와 같이 돌연변이된 CD3z가 종양 세포를 인식할 수 있고 고갈을 피할 수 있다는 관점에서 이점을 CAR T 세포에게 제공한다는 것을 의미한다. 돌연변이된 CD3z를 갖거나 갖지 않는 CAR들 사이에 CAR T 세포 지속성의 비교는 이 동일한 30% 고항원 발현 종양들을 살펴봄으로써 평가되지만, 이때 동물은 저용량의 CAR T 세포로 치료받았다: 250,000개의 CAR T 세포 및 250,000개의 종양 세포, 즉 1:1 비. 도 262의 표는 저용량으로 동물에게 투여된, 표준 CD3z 신호전달 도메인을 가진 CAR이 CAR T 세포 주사 후 약 70일 내지 90일 후 이 동물의 종양에서 측정 가능한 CAR T 세포를 거의 갖지 않음을 보여준다. 이 데이터는 낮은 CAR T 용량에서 CAR T 세포가 더 열심히 작동할 필요가 있고 더 빨리 고갈됨을 뒷받침한다. 대조적으로, 250,000개의 이식된 종양 세포에 대해 저용량인 250,000개의 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포로 치료받은 동물은 희생 당일에 그의 종양에서 평균 1,444개의 CAR T 세포를 가졌고, 이것은 동물이 고용량의 huMNC2-CD28-1XX CAR T 세포로 치료받았을 때와 거의 동일하다. 이 결과는 돌연변이된 CD3z 신호전달 도메인이 T 세포 고갈에 대한 내성을 가짐을 보여준다.

그러나, 단지 7.5% 높은 발현 수준의 항원을 가진 종양을 이식받았으나 고용량의 CAR T 세포(2.5M CAR T 세포 대 250,000개 이식된 종양 세포)로 치료받은 동물로부터 절제된 종양을 살펴본 결과는 CD3-z의 신호전달을 늦추는 돌연변이가 다른 기능도 수행함을 보여준다. 따라서, 항원 밀도는 낮지만 고용량의 CAR T 세포를 사용할 때, CAR T 세포는 더 적은 수의 항원 분자로 인해 신호를 덜 전달하므로 고갈되지 않을 것이라는 결론에 이르게 된다. 예상외로, 도 259의 표에서 볼 수 있는 바와 같이, 고용량 10:1의 CAR T 세포로 치료받은 동물로부터 절제된 7.5% 고항원 발현 종양은 야생형 CD3z를 가진 CAR로 치료받은 경우 그의 종양에서 여전히 상당한 수의 CAR T 세포를 갖지 않는다. huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 동물의 종양은 절제된 종양에서 평균 1,555개의 CAR T 세포를 가졌으나, 이에 비해 huMNC2-41BB-3z로 치료받은 마우스의 종양에는 단지 167개의 CAR T 세포가 있었고 huMNC2-CD28-3z로 치료받은 마우스의 종양에는 단지 275개의 CAR T 세포가 있었다. 이 결과는 예기치 않게 1XX 돌연변이된 CD3z 또는 유사한 돌연변이된 신호전달 도메인을 가진 CAR T 세포가 낮은 수준의 표적 항원을 발현하는 종양 세포를 인식하고 사멸시키는 향상된 능력을 가짐을 강력히 뒷받침한다.

유사하게, 표준 CAR T 세포는 동물을 저용량의 CAR T 세포로 치료하였을 때 낮은 퍼센트(7.5%)의 고항원 발현 세포를 발현하는 종양을 인식할 수 없었고 사멸시킬 수도 없었다. 도 264의 표는 저용량 CAR T 세포(250,000개의 CAR T 세포 및 250,000개의 종양 세포, 1:1 비)로 치료받은, 단지 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 이식받은 마우스들 중 huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 동물만이 그의 종양에서 측정 가능한 CAR T 세포(평균 841개)를 가졌고, 이러한 CAR T 세포가 고갈의 징후를 거의 보이지 않았음을 보여준다.

동물의 비장 세포를 분석하였을 때 유사한 결과를 수득하였다(도 265 내지 도 273). 하나의 두드러진 예가 도 273에 제시되어 있다. 이식되었을 때 7.5% 고항원 발현 세포인 종양을 가진 동물로부터 절제된 비장의 분석은 huMNC2-CD28-1XX로 치료받은 동물로부터의 비장만이 검출 가능한 CAR T 세포를 가졌음을 보여주었고, 이때 이 비장은 그의 종양에서 평균 1,413개의 CAR T 세포를 가졌다.

치료받은 동물의 혈액을 도 274 내지 도 282에 나타낸 바와 같이 유세포분석으로 분석하였을 때에도 이러한 경향이 관찰되었다.

이 실험은 CAR이 돌연변이된 CD3z 도메인, 예컨대, 1XX 돌연변이를 가진 CD3z 도메인을 포함할 때 항-MUC1* CAR T 세포가 MUC1* 양성 종양 세포를 사멸시키고 사멸이 향상됨을 입증한다. 실험은 1XX CD3z 도메인을 가진 CAR T 세포가 낮은 수준의 표적 항원을 발현하는 종양 세포를 인식하고 사멸시키는 향상된 능력을 가진다는 예상치 못한 결과도 보여준다. 따라서, MUC1*를 인식하는 CAR을 포함하나 이로 제한되지 않는, 1XX를 보유하는 CAR T 세포는 종양이 혈액암보다 더 불균질한 경우 고형 종양 암의 사멸을 개선하였다. 또한, MUC1*를 인식하는 CAR을 포함하나 이로 제한되지 않는, 1XX를 보유하는 CAR T 세포는 종양 재발을 예방하는 데 있어서 표준 CAR T 세포보다 훨씬 더 우수하다.

본 발명의 한 측면은 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나,이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 상기 환자는 MUC1* 표적화 CAR로 형질도입된 유효량의 면역 세포를 투여받는다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 면역 세포는 환자로부터 단리된 후 CAR로 형질도입된 T 세포이고, 이때 CAR의 표적화 헤드는 MUC1*에 결합하고, 형질도입된 T 세포의 증폭 후, CAR T 세포는 환자에게 유효량으로 투여된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 면역 세포는 환자로부터 단리된 후 CAR로 형질도입된 T 세포이고, 이때 CAR의 표적화 헤드는 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 일부를 포함하고, 형질도입된 T 세포의 임의적 증폭 후, CAR T 세포는 유효량으로 환자에게 투여된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3 또는 25E6의 항체 단편은 천연 킬러 세포 또는 NK 세포의 키메라 항원 수용체 내로 통합된다.

항-MUC1* 표적화 항체의 특이성

이 실험들이 입증하는 바와 같이, CAR의 중요한 부분은 면역 세포를 종양 세포로 향하게 하는 항체 단편이다. 본 발명자들이 다음 단락에서 보여주는 바와 같이, MNE6, MNC2, 20A10, 3C2B1 및 5C6F3은 종양 세포에서 발현되는 MUC1*의 형태에 매우 특이적이다. CAR의 다음으로 가장 중요한 부분은 면역 시스템 보조자극 도메인 및 신호전달 도메인 CD3-제타 또는 이의 변이체를 가진 세포질 꼬리이다. 이 도메인들의 정체는 면역 반응의 정도를 조절하지만 특이성에 영향을 미치지 않는다. 밝혀진 바와 같이, CAR의 막횡단 부분의 정체는 가장 중요하지 않다. 막횡단 부분이 어느 정도 유연성을 갖고 항체 단편으로 하여금 종양 세포 상의 그의 동족 수용체에 도달할 수 있게 할 정도로 충분히 길다면, 이것으로 충분할 것으로 보인다. MNE6 표적화 항체 단편, 및 세포내 보조자극 도메인 41BB 및 CD3-제타를 포함하되 다양한 상이한 세포외, 막횡단 및 짧은 세포질 꼬리를 가진 CAR들은 숙주 T의 증폭을 자극하면서 표적화된 세포를 특이적으로 사멸시킨다는 점에서 모두 작동하였다.

항체 특이성을 입증하는 가장 정확한 방법은 암 조직 표본에 비해 정상 인간 조직 표본에서 항체를 시험하는 것이다. MNC2 및 MNE6은 MUC1 또는 MUC1* 양성 암 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 이미 밝혀졌다. 여러 항-MUC1 또는 MUC1* 항체를 사용하여 여러 유방 종양 어레이를 어세이하였다. 본질적으로 1,200명 이상의 상이한 유방암 환자들로부터의 유방암 조직 표본의 일련의 박편을 이용하는 연구는 전체 길이 MUC1이 유방암 조직에 거의 남아있지 않음을 보여주었다. 발현된 MUC1의 대부분은 MUC1*이고 MNC2에 의해 염색된다. 분석은 클라리언트 디아그노스틱스(Clarient Diagnostics)에 의해 수행되었고 조직 염색은 Allred 방법을 이용함으로써 점수화되었다. 예를 들어, 도 10은 탠덤 반복부에 결합하는 시판되는 항-MUC1 항체인 VU4H5, 또는 MUC1*에 결합하는 MNC2로 염색된 유방암 조직 어레이의 일련의 박편을 보여준다. 도 10 및 11은 MUC1-FL(전체 길이)을 인식하는 VU4H5 또는 암성 MUC1*를 인식하는 MNC2로 염색된 유방암 조직 어레이의 사진이다. 조직 염색은 강도 점수와 분포 점수를 합하는 Allred 점수화 방법을 이용함으로써 점수화되었다. 조직 어레이의 사진 아래에는 결과를 표시하는 색상 코딩된 그래프가 있다. 볼 수 있는 바와 같이, VU4H5로 염색된 어레이는 매우 밝고 핵산 기반 진단에 의해 입증된 바와 같이 MUC1이 모든 유방암의 96% 이상에서 비정상적으로 발현된다는 공개된 보고에도 불구하고 많은 조직이 염색되지 않는다. 대조적으로, MNC2로 염색된 어레이는 매우 어둡다(그래프에서 적색 대 황색 또는 백색). 추가로, 많은 조직이 항-전체 길이 MUC1의 사용 시 전혀 염색되지 않았으나 MNC2의 사용 시 매우 어둡게 염색되었다(그래프의 녹색 상자 참조). 마찬가지로, 본 발명자들은 인간화된 MNE6 scFv-Fc로 정상 또는 암성 유방 조직을 염색하였다. 항체 단편은 이차 스트렙타비딘 기반 이차에 의해 시각화될 수 있도록 바이오티닐화되었다. 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, hMNE6 scFv-Fc는 정상 유방 조직을 염색하지 않으나 암성 유방 조직을 염색한다. 또한, 염색의 강도와 균질성은 환자의 종양 등급 및/또는 전이 등급에 따라 증가한다(도 12 및 13). 유사하게, hMNE6 scFv-Fc는 정상 폐 조직을 염색하지 않았으나 폐암 조직을 염색하였고(도 14 내지 18), 염색의 강도와 분포는 종양 등급 또는 전이 등급이 증가함에 따라 증가하였다. 도 19는 5 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 바이오티닐화된 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 스트렙타비딘 HRP 항체로 염색된 정상 소장 및 암성 소장 조직의 사진을 보여준다. A)는 정상 소장 조직이다. B)는 도면에 표시된 환자의 소장암이다. C 및 D는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 20은 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 정상 소장 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 정상 소장 조직이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 21은 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후, 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 암성 소장 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 도면에 표시된 환자의 암성 소장 조직이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 22는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 염소-항-인간 HRP 이차 항체로 염색된 암성 소장 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 도면에 표시된 환자의 암성 소장 조직이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 23은 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 정상 결장 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 정상 결장이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 24는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 결장암 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 도면에 표시된 전이성 환자의 결장암 조직이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 25는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 결장암 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 도면에 표시된 등급 2 환자의 결장암 조직이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 26은 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 결장암 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 도면에 표시된 전이성 환자의 결장암 조직이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 27은 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 전립선암 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 도면에 표시된 환자의 전립선암 조직이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 28은 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 전립선암 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 도면에 표시된 환자의 전립선암 조직이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다. 도 29는 50 ㎍/㎖의 인간화된 MNE6-scFv-Fc 항-MUC1* 항체로 염색된 후 이차 염소-항-인간 HRP 항체로 염색된 전립선암 조직의 사진을 보여준다. A 내지 D는 도면에 표시된 환자의 전립선암 조직이다. E 내지 H는 이차 항체만으로 염색된 상응하는 일련의 박편의 사진이다.

본 발명의 한 측면은 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 표본은 환자의 암으로부터 수득되고 PSMGFR(서열번호 2) 또는 보다 구체적으로 N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합하거나, 보다 구체적으로 N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합하지만, C-10 펩티드(서열번호 825)에는 결합하지 않는 항체와의 반응성에 대해 시험된다. 이어서, 환자는 그의 암 표본과 반응하거나 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11로부터 선택될 수 있는 항체로부터의 항체 가변 단편을 포함하는 scFv, scFv-Fc 또는 CAR T로 치료받는다. 본 발명의 또 다른 측면은 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 표본은 환자의 암으로부터 수득되고 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11과의 반응성에 대해 시험되고; 그 후, 환자는 그의 암 표본과 반응하는 항체의 일부를 포함하는 항체, 항체 단편, scFv, scFv-Fc-mut, BiTE 또는 CAR T로 치료받는다.

본 발명자들이 앞서 보고한 바와 같이, 종양 성장을 유도하는 성장 인자 수용체는 전체 길이 MUC1이 아니라 막횡단 절단 생성물인 MUC1*이다. MUC1*를 활성화시키는 성장 인자는 MUC1의 탠덤 반복부 부분의 절단 및 방출 후에만 노출되는 이소성 부위에 결합한다. 본 발명의 항체는 활성화 성장 인자와 마찬가지로 전체 길이 MUC1에 결합할 수 없다. FACS 분석은 항-MUC1* 항체 MNC2가 MUC1 음성 세포인 HCT-116에 결합할 수 없고(도 35a), MUC1*로 형질감염된 경우 이 세포에 강력히 결합하나(도 35b), 전체 길이 MUC1로 형질감염된 HCT 세포에는 결합하지 않을 것임(도 35c)을 명확히 보여준다. 시판되는 항-탠덤 반복부 항체 VU4H5는 전체 길이 MUC1을 명확히 인식한다(도 35d).

본 발명자들은 MUC1이 하나 초과의 절단 효소에 의해 MUC1*로 절단될 수 있고 절단 부위가 그의 접힘에 영향을 미치고 결과적으로 어느 단일클론 항체가 그 형태의 MUC1*를 인식할 수 있는지에 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 상이한 암 세포 또는 암 조직은 상이한 절단 효소를 발현한다. 본 발명자들은 상이한 암 세포주에 대해 다양한 절단 효소 억제제를 시험하였고 하나의 암 세포주에서 MUC1의 절단을 억제하는 억제제가 또 다른 암 세포주에서 그의 절단을 억제하지 않았음을 발견하였다. 유사하게, PCR 실험은 절단 효소가 상이한 세포 또는 세포주에서 상이한 수준으로 발현됨을 보여주었다. 예를 들어, 골수의 조혈 줄기 세포는 단일클론 항체 MNC3에 의해 인식되지만 MNE6 또는 MNC2에 의해 인식되지 않는 MUC1*를 발현한다(도 39). DU145 전립선암 세포 및 T47D 유방암 세포의 생장은 MNC2 및 MNE6의 Fab에 의해 억제되지만 MNC3 또는 MNC8의 Fab에 의해서는 억제되지 않는데, 이것은 암 세포주가 MNE6 및 MNC2에 의해 인식되나 MNC3 또는 MNC8에 의해 인식되지 않는 MUC1*를 발현함을 시사한다(도 42). PCR 실험은 골수의 CD34 양성 세포가 T47D 유방암 세포보다 약 2,500배 더 많은 MMP2 및 약 350배 더 많은 ADAM28을 발현하는 반면, DU145 전립선암 세포가 T47D 유방암 세포보다 약 2,000배 더 많은 ADAM TS16, 약 400배 더 많은 MMP14 및 약 100배 더 많은 MMP1을 발현함을 보여준다(도 43 및 도 44). 대조적으로, T47D 유방암 세포는 골수 세포보다 약 80배 더 많고 DU145 전립선암 세포보다 약 2배 만큼 더 많은 MMP9를 발현한다. 다양한 절단 효소 억제제들을, 상이한 종류의 암 세포에서 절단을 억제하는 그들의 능력에 대해 시험하였다.

MUC1*의 세포외 도메인을 표적화하는 항체, 항체 단편 및 CAR을 사용하기 위한 일반적인 전략

본 발명의 한 측면에서, 절단 효소, 항체, 사이토카인 또는 제2 CAR일 수 있는 제2 인자, 및 CAR을 동일한 T 세포 내로 형질도입한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 제2 인자는 CAR이 표적화된 암 세포와 맞물릴 때 그의 발현이 활성화되도록 유도성 프로모터에 있다. 일부 경우, 제2 인자의 발현은 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 본 발명의 한 측면에서, 제2 인자의 발현은 면역 세포가 활성화될 때, 예를 들어, 면역 세포가 그의 표적을 인식하거나 그의 표적과 맞물릴 때 유도된다. 한 예에서, T 세포는 T 세포가 표적 암 세포를 인식할 때 발현이 유도되는 제2 인자로 형질감염되거나 형질도입된다. 이를 수행하는 한 가지 방법은 NFAT 단백질이 발현되거나 핵으로 전위될 때 또는 직후에 제2 인자의 발현을 유도하는 것이다. 예를 들어, NFAT 프로모터 영역으로부터 유래한 서열은 제2 인자에 대한 유전자의 업스트림에 놓인다. 이 방식으로, NFAT 단백질의 프로모터에 결합하는 전사 인자가 결합하여 NFAT 단백질의 전사를 유도하기에 충분한 농도로 존재할 때, 이 전사 인자는 제2 인자의 전사를 위한 서열의 앞에서 조작된 그 동일한 프로모터에도 결합할 것이다. NFAT 단백질은 NFATc2로서도 알려진 NFAT1, NFATc 또는 NFATc1로서도 알려진 NFAT2, NFATc4로서도 알려진 NFAT3, NFATc3으로서도 알려진 NFAT4, 또는 NFAT5일 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, NFAT는 NFATc1, NFATc3 또는 NFATc2이다. 본 발명의 한 측면에서, NFAT는 NFATc1로서도 알려진 NFAT2이다. 서열번호 646은 NFAT2에 대한 업스트림 전사 조절 영역의 핵산 서열을 보여준다. NFAT 유전자에 대한 프로모터 서열은 예로서 서열번호 781 내지 783 또는 서열번호 815의 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 제2 인자의 발현을 위한 최적 서열 또는 최소 서열은 프로모터의 단편, 확장 또는 돌연변이를 만들고 제2 인자의 발현에 대하여 프로모터의 강도를 시험함으로써 수득될 수 있음을 확인할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, NFAT2에 대한 전사 조절 영역은 절단 효소 MMP9(서열번호 647) 또는 MMP9의 촉매 서브유닛(서열번호 648) 중 어느 경우이든 제2 인자를 코딩하는 유전자의 업스트림에서 조작된다. 본 발명의 한 측면에서, NFAT는 NFATc3이고 NFATc3의 프로모터 서열은 서열번호 816으로부터의 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, NFATc3에 대한 전사 조절 영역은 본원에서 예로서 MMP9인 제2 인자를 코딩하는 유전자의 업스트림에서 조작된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, NFAT는 NFATc2이다. 서열번호 817 및 818은 NFATc2에 대한 업스트림 전사 조절 영역의 핵산 서열을 보여준다. 본 발명의 한 측면에서, NFATc2에 대한 전사 조절 영역은 절단 효소 MMP9(서열번호 647) 또는 MMP9의 촉매 서브유닛(서열번호 648)일 수 있는 제2 인자를 코딩하는 유전자의 업스트림에서 조작된다.

T 세포 또는 CAR T 세포가 활성화될 때 제2 인자의 발현을 유도하는 또 다른 방법은 NFAT 단백질 그 자체가 제2 인자에 결합하여 이의 전사를 유도하는 유도성 프로모터 상에 제2 인자에 대한 유전자를 갖는 것이다. 이 경우, NFAT 반응 요소(NFAT RE)는 제2 인자 또는 제2 인자의 단편에 대한 유전자의 업스트림에 위치할 수 있다. NFAT는 단독으로 또는 복합체의 일부로서 제2 인자의 업스트림에서 그의 반응 요소에 결합할 수 있다. NFAT 단백질은 NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4 또는 NFAT5일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, NFAT 단백질은 NFATc1 또는 NFATc로서도 알려진 NFAT2이다. 제2 인자 또는 이의 단편의 유전자는 NFAT 단백질에 의한 제2 인자의 발현을 유도하기 위해 반응 요소의 반복부(서열번호 650) 및 CMV 최소 프로모터(mCMV)(서열번호 651)일 수 있는 NFAT 반응 요소(서열번호 649)의 다운스트림에서 클로닝된다. NFAT 반응 요소는 NFAT 컨센서스 서열(서열번호 804)의 핵산 서열을 포함할 수 있다. NFAT 반응 요소는 예로서 서열번호 805 내지 814의 핵산 서열을 포함할 수 있지만, 제2 인자의 발현을 위한 최적 서열 또는 최소 서열은 반응 요소 핵산의 단편, 연장 또는 돌연변이를 만들고 제2 인자의 발현에 대해 반응 요소의 강도를 시험함으로써 수득될 수 있음을 알 수 있다. Foxp3의 인핸서 영역도 2079부터 2098에 이르는 120 bp 내에 NFAT 반응 요소를 함유한다(서열번호 821). NFAT 반응 요소는 NFATc1이 특이적으로 결합하는 (5'-catttttccat-3')(서열번호 819) 또는 (5'-tttttcca-3')(서열번호 820)의 핵산 NFAT 컨센서스 서열(Xu et al., Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR. CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15, Blood 2014 123:3750-3759), 또는 이의 반복부를 포함할 수 있다. NFAT 반응 요소는 또한 핵산 스페이서 서열에 의해 분리될 수 있다. 다른 NFAT 반응 요소가 존재할 수 있고 추가로 발견될 수 있으며, 당분야에서 숙련된 기술자는 NFAT 반응 요소를 확인하라는 지시를 받았을 때, 단지 예일 뿐이지만 적어도 서열번호 804 내지 814로서 기재된 반응 요소의 안내가 제공된다면, 분자 생물학적 어세이를 수행하여 그렇게 함으로써 이를 수득할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, NFAT 반응 요소 및 CMV 최소 프로모터의 다운스트림에 있는 절단 효소는 MMP9(서열번호 652)이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 절단 효소는 MMP9의 촉매 서브유닛(서열번호 653)이다.

NFAT1 내지 NFAT4가 칼시뉴린 경로에 의해 조절되기 때문에, 환자에서 발생할 수 있는 잠재적인 독성은 칼시뉴린 활성을 차단하고 핵으로의 NFAT 전위를 억제하는 면역억제제, 예컨대, FK506, 사이클로스포린(Cyclosporin), 사이클로스포린 A 또는 타크롤리무스(Tacrolimus)를 사용한 치료에 의해 중단될 수 있다. 유도성 프로모터 상의 절단 효소로 형질도입되었거나 형질감염된 T 세포는 암 세포 상의 단백질 또는 분자를 인식하는 CAR로도 형질감염될 수 있거나 형질도입될 수 있다. 구체적인 예에서, 절단 효소는 전체 길이 MUC1을 절단할 수 있는 효소이고 CAR은 그를 암 세포의 표면 상의 MUC1*로 향하게 하는 항체 단편을 보유한다.

어느 절단 효소가 암 세포 상의 MUC1을 절단하는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 일련의 MMP 및 ADAM 효소 억제제를 시험하였다. 이 실험은 MMP9가 암 세포에서 중요한 절단 효소임을 표시하였다. MMP9가 암 세포 상의 MUC1을 절단함을 확인하기 위해, 본 발명자들은 41개의 탠덤 반복부 도메인을 가진 전체 길이 MUC1의 모방체인 HCT-MUC1-41TR로 HCT-116 MUC1 음성 결장암 세포를 형질감염시켰다. 본 발명자들은 단일 세포 클로닝을 통해 MUC1이 MUC1*로 최소한으로만 절단되는 이 세포주를 확립할 수 있었다. 도 36a 내지 36d는 HCT-MUC1-41TR이 전체 길이 MUC1에 대해 95% 양성이고 절단된 형태인 MUC1*에 대해 단지 5% 내지 10% 양성임을 보여주는 웨스턴 블롯 및 FACS 분석을 보여준다. HCT-MUC1-41TR 세포를 다양한 농도의 MMP9와 함께 인큐베이션한 다음, 면역형광으로 어세이하여 MNC2 단일클론 항체와 생성된 세포의 결합을 측정하였다. 도 37a 내지 37c에서 볼 수 있는 바와 같이, MNC2의 결합은 세포에 첨가된 MMP9의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 이 실험은 MMP9가 MUC1을 MNC2에 의해 인식되는 형태로 절단함을 보여준다. 본 발명자들이 수행한 인간 암 조직 어레이 연구(도 30a 내지 30f, 도 31a 내지 31f, 도 32a 내지 32f, 도 33a 내지 33f)는 MNC2가 암 조직에 존재하나 건강한 세포 또는 조직에는 존재하지 않는 절단된 MUC1의 형태를 인식함을 보여준다(도 34a 내지 34i). 중요한 것은 MNC2가 골수의 건강한 조혈 줄기 세포에서 발현되는 절단된 MUC1의 형태를 인식하지 않는다는 것이다(도 39 내지 41).

본 발명의 한 측면에서, 면역 세포는 면역 세포를 종양에 표적화하기 위한 CAR 및 절단 효소 둘 다로 형질도입된다. CAR 및 절단 효소는 동일한 플라스미드 또는 2개의 상이한 플라스미드 상에 코딩될 수 있다. 한 측면에서, 절단 효소는 유도성 프로모터 상에 있다. 또 다른 측면에서, 절단 효소의 발현은 면역 세포가 활성화될 때 발현되는 단백질에 의해 유도된다. 한 경우, 절단 효소의 발현은 NFAT 단백질에 의해 유도된다. 또 다른 측면에서, 절단 효소의 발현은 NFATc1에 의해 유도된다. 또 다른 측면에서, 절단 효소의 발현은 NFAT 단백질 중 하나가 절단 효소 또는 이의 촉매 활성 단편에 대한 유전자의 업스트림에 삽입된 NFAT 반응 요소에 결합할 때 유도된다. 한 측면에서, 절단 효소는 MMP9, 또는 MMP9의 촉매 활성 단편이다.

본 발명의 한 측면에서, 절단 효소는 MMP9(서열번호 643)이다. 일부 절단 효소는 활성화될 필요가 있는 전구효소로서 천연적으로 발현된다. 이것은 생화학적 수단에 의해 달성될 수 있거나, 절단 효소를 활성화시키는 보조효소를 발현함으로써 달성될 수 있거나, 효소를 활성화된 형태로 조작함으로써 달성될 수 있다. 본 발명은 절단 효소를 그의 활성화제와 함께 공-발현함으로써 이 문제를 극복할 것으로 예상된다. 본 발명의 한 측면에서, 절단 효소는 MMP9이고 보조활성화제는 MMP3이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 절단 효소는 예를 들어, 여전히 촉매 기능을 가진 절단 효소의 단편을 발현함으로써 이미 활성을 가진 형태로 발현된다. 한 경우, 절단 효소는 촉매 활성을 가진 MMP9 단편이다. MMP9 촉매 단편의 한 예는 서열번호 645로서 제공된다.

MMP3에 의해 활성화되어야 하는 MMP9는 큰 퍼센트의 고형 종양에서 과다발현된다. 또한, MNC2 항-MUC1* 단일클론 항체는 MMP9에 의해 절단된 후 MUC1을 인식하는 것으로 알려져 있다. 도 30 내지 33에 나타낸 다양한 유방암, 난소암, 췌장암 및 폐암 조직 어레이는 MNC2-scFv로 프로빙되었는데, 이것도 이 암들에서 MUC1이 MMP9에 의해 절단되고 있음을 시사한다. MMP9에 의한 종양의 절단이 종양으로의 T 세포의 접근을 증가시키는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 전체 길이 MUC1을 발현하는 세포주인 HCT-MUC1-41TR, 전체 길이 MUC1 및 MUC1* 둘 다의 고발현자인 유방암 세포주, 및 본 발명자들에 의해 MUC1*₄₅로 형질감염된 MUC1 음성 세포주를 사용하여 일련의 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 MM9, 및 MMP9를 활성화시키는 MMP3으로 세포를 형질감염시켰다. 본 발명자들은 활성화된 MM9를 함유하는, 이 세포들의 상청액을 수득하고 이를 다양한 세포에 첨가한 후, 항-MUC1* CAR인 huMNC2-CAR44로 형질도입된 T 세포와 공-배양하였다. 결과는 MUC1 절단 효소와 함께 인큐베이션되지 않은 대조군 세포에 비해, CAR T 세포에 의한 크게 증가된 표적화된 MUC1/MUC1* 양성 암 세포 사멸이었다.

APMA는 MMP를 활성화시키는 생화학 물질이다. 본 발명자들은 본 발명자들이 MMP9 또는 ADAM17로 형질감염시킨 세포의 컨디셔닝 배지와 함께 APMA를 사용하여, 이 절단 효소들 중 임의의 효소가 전체 길이 MUC1만을 발현하는 HCT-MUC1-41TR 세포주에서 MUC1을 절단하는지를 확인하였다. 대조군으로서, 본 발명자들은 HCT-MUC1* 세포에서도 상기 효소를 시험하였다. MUC1 및 MUC1* 발현 세포를 적색 염료인 CMTMR로 염색하였다. 항-MUC1* CAR, CAR44 또는 CAR50으로 형질도입된 인간 T 세포를 암 세포와 공-배양하였다. 형질도입되지 않은 T 세포를 대조군으로서 사용하였다(도 45a 내지 45p). 도 45b, 도 45c 및 도 45d에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-MUC1* CAR T 세포는 HCT-MUC1* 암 세포를 효과적으로 인식하고 클러스터링하였는데, 이것은 T 세포 활성화 및 사멸의 징후이다. 그러나, 전체 길이 MUC1 발현 세포인 HCT-MUC1-41TR을 함유하는 웰에서는 CAR T 세포 유도 클러스터링이 보이지 않는다(도 45f, 도 45g 및 도 45h). 그러나, 활성화된 MMP9와 함께 인큐베이션된 세포는 CAR T 세포 유도 클러스터링의 두드러진 증가를 보여주는데(도 45j, 도 45k 및 도 45l), 이것은 MMP9가 전체 길이 MUC1을, MNC2 단일클론 항체, 보다 구체적으로 huMNC2-scFv에 의해 인식되는 MUC1*의 형태로 절단하였음을 시사한다. ADAM17은 뚜렷한 효과를 갖지 않았다. ADAM17은 MUC1을 절단하지 않았거나 MNC2에 의해 인식되지 않는 위치에서 MUC1을 절단하였는데, 후자일 가능성이 더 높다(도 45n 내지 45p).

본 발명자들은 이번에는 아마도 MUC1*뿐만 아니라 높은 수준의 전체 길이 MUC1도 발현하기 때문에 항-MUC1* CAR T 세포를 사용하여 사멸시키기 어려운 T47D 유방암 세포를 사용하여 동일한 실험을 수행하였다(도 46a 내지 46t). 도 46b, 46c 및 46d에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-MUC1* CAR44 및 CAR50은 T47D 암 세포에 거의 영향을 미치지 않는다. 본 발명자들은 T 세포에서 최대 CAR 발현 수준에서 CAR44인 도 46d에서만 소량의 CAR T 세포 유도 클러스터링을 볼 수 있다. 그러나, 활성화된 MMP2(도 46j, 46k, 46l) 또는 활성화된 MMP9(도 46r, 46s, 46t)의 존재는 CAR T 세포 인식, 클러스터링 및 사멸의 현저한 증가를 보여줌으로써, 전체 길이 MUC1의 절단이 암 세포로의 T 세포 접근을 증가시킴을 보여준다. APMA의 첨가가 일부 다른 기작에 의한 절단 또는 항-MUC1* CAR T 인식을 유도하지 않았음을 확신하기 위해, 본 발명자들은 MMP9의 촉매 활성 형태를 만들었고 이를 T47D 세포에 첨가하고, 이 세포를 MNC2-CAR44 T 세포와 공-배양하였다(도 47a 내지 47i). 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, MNC2-CAR T 세포는 MUC1*로 형질감염된 세포를 인식하고 클러스터링하고(도 47b 및 47c), 전체 길이 MUC1 및 MUC1* 둘 다를 발현하는 T47D 유방암 세포를 잘 클러스터링하지 않으나(도 47e 및 47f), 촉매 활성 MMP9의 첨가 후 T47D 세포에 강하게 결합하고 이 세포를 클러스터링한다(도 47h 및 47i). 이 결과는 MNC2가 전체 길이 MUC1을 인식하지 않지만 성장 인자 수용체 MUC1*를 인식한다는 주장을 뒷받침한다. 이 세포주에서 발현된 전체 길이 MUC1은 세포막 근처에서 CAR T 세포의 결합을 입체적으로 방해할 수 있음을 주목한다.

또 다른 예에서, T47D MUC1 양성 종양 세포를 100 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖의 MMP9(Enzo Life Sciences, Inc., 뉴욕주 파밍데일 소재)의 재조합 촉매 도메인과 함께 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯 분석은 MUC1/MUC1* 양성 암 세포가 MUC1*로의 MUC1의 광범위한 절단을 겪음을 보여주었다. 또 다른 예에서, T47D 유방암 세포를 인간 재조합 MMP9 촉매 도메인 단백질과 사전인큐베이션한 후 항-MUC1* CAR44 T 세포와 공-배양하였다. 시간의 함수로서 임피던스를 측정하는 xCelligence 기기에서 CAR44 T 세포에 의한 T47D 세포의 특이적 사멸을 실시간으로 모니터링하였다. 이 분석은 암 세포가 플레이팅되어 있는 전극 어레이를 사용한다. 부착성 암 세포는 전극을 절연하고 생장함에 따라 임피던스의 증가를 야기한다. 대조적으로, T 세포는 부착되지 않고 현탁 상태로 남아있으므로 임피던스를 증가시키거나 감소시키지 않는다. 그러나, T 세포 또는 CAR T 세포가 전극 플레이트 상의 암 세포를 사멸시키는 경우, 암 세포는 뭉쳐지고 사멸함에 따라 부유하게 되는데, 이것은 임피던스의 감소를 야기한다. MMP9 촉매 도메인의 첨가는 T47D 암 세포의 사멸을 현저히 증가시켰다. 도 48은 대조군인 형질도입되지 않은 T 세포 또는 huMNC2-CAR44 T 세포와 45시간 동안 공-배양된 T47D 유방암 세포의 xCelligence 그래프를 보여준다. 18시간의 암 세포 생장 후, 촉매 서브유닛 MMP9를 일부 세포에 첨가하였다. 25시간에서, T 세포를 첨가하였다. 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CAR44 T 세포 사멸은 T47D 세포가 절단 효소 MMP9와 함께 사전인큐베이션될 때 크게 개선된다. xCelligence 시스템에서, 부착성을 가진 표적 암 세포를 전극 어레이 플레이트에 플레이팅한다. 부착성 세포는 전극을 절연하고 임피던스를 증가시킨다. 부착성 암 세포의 수는 임피던스에 정비례한다. T 세포는 부착되지 않으며 임피던스에 기여하지 않는다. 따라서, 임피던스의 증가는 암 세포의 생장을 반영하고 임피던스의 감소는 암 세포의 사멸을 반영한다. 전립선암 세포주 DU145는 MUC1 및 MUC1* 둘 다를 발현하지만 T47D 세포보다 훨씬 더 낮은 발현 수준으로 발현한다. DU145 세포는 절단 효소의 존재 또는 부재 하에 항-MUC1* CAR T 세포에 의해 효율적으로 사멸된다.

도 49는 대조군인 형질도입되지 않은 T 세포 또는 huMNC2-CAR44 T 세포와 45시간 동안 공-배양된 DU145 전립선암 세포의 xCelligence 그래프를 보여준다. 18시간의 암 세포 생장 후, 촉매 서브유닛 MMP9를 일부 세포에 첨가하였다. 25시간에서, T 세포를 첨가하였다. 볼 수 있는 바와 같이, 저밀도 MUC1/MUC1* 양성 암 세포의 huMNC2-CAR44 T 세포 사멸은 절단 효소 MMP9와의 사전인큐베이션에 의해 영향을 받지 않는다. DU145 암 세포는 MUC1*뿐만 아니라 전체 길이 형태도 포함하는 상당히 더 낮은 양의 MUC1을 발현한다. 전체 길이 MUC1의 저밀도는 막 근위 MUC1*로의 T 세포 접근을 입체적으로 방해하지 않는다. DU145 세포는 전체 길이 MUC1 및 절단된 MUC1 둘 다를 발현하지만 T 세포 접근이 입체적으로 방해받지 않도록 더 낮은 수준으로 발현하는 초기 암을 대표한다. T47D 세포는 높은 수준의 MUC1 및 MUC1* 둘 다를 발현하는 중기 암을 대표하고, 이때 전체 길이 MUC1의 밀도는 종양으로의 T 세포의 접근을 입체적으로 방해한다. HCT-MUC1* 세포는 MUC1*₄₅로 안정적으로 형질감염된 MUC1 음성 세포주이고 말기 암 세포를 대표한다. MMP9에 의해 MUC1*로 절단된 MUC1이 CAR의 표적화 헤드인 항-MUC1* 항체 MNC2에 의해 인식된다는 것은 중요하다. 암 세포 표면의 종양 항원으로의 면역 세포 접근은 부피가 큰 세포외 도메인 단백질, 또는 종양 미세환경으로서도 알려진 다른 방해 요소의 존재에 의해 입체적으로 방해받을 수 있다. 앞서 언급된 것은 다른 종양 항원을 표적화하는 CAR T 요법의 효능을 개선하기 위해 확장될 수 있는 예로서 역할을 한다. 본 발명의 한 측면에서, 면역 세포는 종양 항원을 표적화하는 항체 단편을 포함하는 CAR 및 절단 효소 둘 다로 형질감염되거나 형질도입된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 면역 세포는 종양 항원을 표적화하는 항체 단편을 포함하는 CAR, 및 종양 항원을 CAR의 항체 단편에 의해 인식되는 형태로 절단하는 절단 효소 둘 다로 형질감염되거나 형질도입된다. 한 측면에서, 면역 세포는 종양 항원을 표적화하는 항체 단편을 포함하는 CAR, 및 종양 항원을 CAR의 항체 단편에 의해 인식되는 형태로 절단하는 절단 효소 둘 다로 형질감염되거나 형질도입되고, 이때 CAR의 항체 단편은 MUC1* 세포외 도메인을 인식하고 절단 효소는 MUC1을 MUC1*로 절단한다. 한 측면에서, T 세포 또는 NK 세포일 수 있는 면역 세포는 MNC2, MNE6, MNC3 또는 MNC8로부터 유래한 항체 단편을 포함하는 CAR, 및 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP16, ADAM9, ADAM10, ADAM17, ADAM 19, ADAMTS16, ADAM28 또는 이의 촉매 활성 단편을 포함하는 군으로부터 선택된 절단 효소로 형질감염되거나 형질도입된다. 본 발명의 한 측면에서, 면역 세포는 시험관내에서 면역 세포 유형으로 분화하도록 유도된 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 항체의 서열을 함유하는 CAR은 나중에 면역 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포에서 발현된다. 한 경우, 면역 세포는 T 세포이다. 또 다른 경우, 면역 세포는 NK 세포이다.

본 발명의 한 측면에서, CAR 및 절단 효소 둘 다로 형질도입된 충분한 양의 면역 세포를, 암으로 진단받거나 암을 발생시킬 위험이 있는 사람에게 투여한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, CAR 및 절단 효소 둘 다로 형질도입된 충분한 양의 면역 세포를, 암으로 진단받거나 암을 발생시킬 위험이 있는 사람에게 투여하고, 이때 절단 효소는 면역 세포가 활성화될 때 발현되는 단백질에 의해 활성화되는 유도성 프로모터 상에 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, CAR 및 절단 효소 둘 다로 형질도입된 충분한 양의 면역 세포를, 암으로 진단받거나 암을 발생시킬 위험이 있는 사람에게 투여하고, 이때 절단 효소는 하나 이상의 NFAT에 의해 활성화되는 유도성 프로모터 상에 있다. 한 경우, NFAT는 NFATc1이다. 또 다른 측면에서, NFAT는 NFATc3이다. 또 다른 측면에서, NFAT는 NFATc2이다. 상기 경우들 중 임의의 경우, CAR의 세포외 도메인은 항-MUC1* 항체의 단편을 포함한다. 한 측면에서, 항-MUC1* 항체는 MNC2scFv, 또는 MNC2scFv의 인간화된 형태이다. 또 다른 측면에서, 항-MUC1* 항체는 MNE6scFv, 또는 MNE6scFv의 인간화된 형태이다. 상기 경우들 중 임의의 경우, 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 비만 세포 또는 수지상 세포일 수 있다. 한 측면에서, 면역 세포는 시험관내에서 그 면역 세포 유형으로 분화하도록 유도된 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 항체의 서열을 함유하는 CAR은 나중에 면역 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포에서 발현된다. 한 경우, 면역 세포는 T 세포이다. 또 다른 경우, 면역 세포는 NK 세포이다.

본 발명은 활성화된 T 세포에 의해 유도된 절단 효소의 발현을 가진 한 가지 또는 두 가지 특정 방법으로 제한되지 않는다. 본 발명자들은 NFAT 프로모터 서열의 다운스트림 또는 NFAT 반응 요소의 하나 이상의 반복부의 다운스트림에서 절단 효소 유전자를 가진 플라스미드를 구축함으로써 T 세포 활성화 시에만 절단 효소가 특이적으로 발현됨을 입증하였다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 절단 효소의 발현은 절단 효소 유전자가 IL-2 프로모터 서열의 다운스트림 또는 IL-2 반응 요소의 다운스트림에 삽입되어 있는 플라스미드를 구축한 다음, 이 플라스미드를 면역 세포에 삽입함으로써 유도된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 절단 효소의 발현은 절단 효소 유전자가 칼시뉴린 프로모터 서열의 다운스트림 또는 칼시뉴린 반응 요소의 다운스트림에 삽입되어 있는 플라스미드를 구축한 후, 이 플라스미드를 면역 세포에 삽입한 다음, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여함으로써 유도된다. 절단 효소의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있거나 활성화된 T 세포의 요소에 의해 유도된 발현을 중단하는 데 사용될 수 있는 약물 유도성 플라스미드도 있다. 이 약물 유도성 시스템은 테트라사이클린 유도성 시스템, Tet-on, Tet-off, 테트라사이클린 반응 요소, 독시사이클린, 타목시펜 유도성 시스템, 엑디손 유도성 시스템 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 CAR 또는 유도성 절단 효소를 코딩하는 플라스미드에 사용되는 1개 또는 2개의 특정 프로모터로 제한되지 않는다. 당분야에서 숙련된 자에 의해 알려진 바와 같이, SV40, PGK1, Ubc, CAG, TRE, UAS, Ac5, 다면체, CaMKIIa, GAL1, GAL10, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1 및 U6을 비롯한 많은 프로모터들이 교환될 수 있다. 부피가 큰 세포 표면 단백질, 예컨대, MUC1-FL에 의해 야기되는, CAR T 세포 접근의 입체 장애라는 문제에 대한 또 다른 해법은 T 세포에 의해 발현되는 CAR의 링커 영역의 길이를 증가시키는 것이다. 표준 설계 CAR에서, 막횡단 부분과 항체 단편 사이의 세포외 링커 영역의 길이는 약 45개 내지 50개 아미노산 길이이다. 본 발명자들은 세포외 링커의 길이가 약 50개 아미노산부터 217개 내지 290개 아미노산까지 연장되어 있는 긴 아암(arm) CAR을 만들었다. 공-배양 어세이는 더 긴 세포외 링커를 가진 CAR이 표적 암 세포 상의 종양 관련 항원으로의 접근을 개선하였음을 보여준다.

BiTE, 이중특이적 항체 및 다중특이성을 가진 항체 유사 분자

본 발명의 항체는 적어도 2개의 결합 아암을 포함하는 분자 내로 통합될 수 있으며, 이때 적어도 2개의 결합 아암은 상이한 항원에 결합한다. 다중특이적 항체 유사 분자의 여러 예는 전체, 특히 이중특이적 항체 및 이중특이적 항체의 단편의 제조의 개시내용에 대해 본원에 참고로 포함되는 참고문헌인 문헌[Brinkmann and Kontermann, MABS, Vol. 9, No. 2, 182-212 (2017); Spiess et al. Molecular Immunology 67, 95-106 (2015)]에 기재되어 있다. 또한 본원의 도 217 및 본원에 인용된 문헌[Spiess et al.]의 도 1에서 발견되는 다양한 용어, 예컨대, "CrossMab", "DutaMab"은 기술 용어이며 본원에 인용된 문헌[Spiess et al.] 또는 문헌[Brinkmann and Kondermann]에서 제공된 설명의 내용 내에서 해석되어야 한다는 것도 이해된다.

본 발명의 항체 또는 이의 단편의 가변 영역은 1개의 분자가 적어도 2개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있는 분자 포맷 내로 통합될 수 있다. 이 다양한 항체 유사 분자들의 안정성은 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인의 도입에 의해 증가될 수 있다. 본 발명의 항체 및 다중특이적일 수 있는 다양한 항체 유사 분자들의 안정성은 전체, 특히 이중특이적 항체 또는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 단편의 제조의 개시내용에 대해 본원에 참고로 포함되는 참고문헌인 미국 특허 제US9708388B2호(Beckman)에 더 완전히 기재되어 있는 돌연변이의 도입에 의해 증가될 수 있다. 본 발명은 다른 결합 특이성을 가진 다른 항체 또는 이의 단편과 함께 본 발명의 항체의 가변 영역 또는 이의 단편을, 하기 포맷들을 포함하나 이들로 제한되지 않는 다양한 항체 유사 포맷 내로 통합하는 것을 고려한다. 가능한 항체 유사 포맷 중에는 Fc 영역을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 이중특이적 항체가 있다. 적어도 하나의 Fc 영역을 함유하는 이중특이적 항체는 체내에서 더 높은 분자량 및 연장된 반감기를 가질 것이다. 이중특이적 Fc 함유 항체의 변이체에서, 다른 결합 특이성을 가진 항체로부터 유래한 가변 영역 또는 이의 단편을 IgG 스캐폴드의 N-말단 또는 C-말단에 부착하여, 4가 다중특이적 항체 유사 분자를 생성한다. scFv 내로 통합될 수 있는, 다양한 결합 특이성을 가진 항체의 가변 영역 또는 이의 단편의 조합을 IgG 스캐폴드 또는 다른 스캐폴드에 부착하여, 다가 다중특이적 항체 유사 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 scFv가 항체 Fc 영역의 CH3 부분 또는 힌지 영역의 C-말단에 융합되어 있는 미니-항체 내로 통합될 수 있다. 2가(또는 이가) 단일 쇄 가변 단편(di-scFv, bi-scFv)은 2개의 scFv를 연결함으로써 조작될 수 있다. 이것은 2개의 V_H 및 2개의 V_L 영역을 가진 단일 펩티드 쇄를 생성하여 탠덤 scFv를 생성함으로써 수행될 수 있다. 또 다른 가능성은 2개의 가변 영역을 함께 접기에는 너무 짧아(약 5개의 아미노산), scFv가 강제로 이량체화되게 하는 링커 펩티드로 scFv를 생성하는 것이다. 이 유형은 디아바디로서 알려져 있다. 디아바디는 상응하는 scFv보다 최대 40배 더 낮은 해리 상수를 가진 것으로 확인되었는데, 이것은 디아비디가 그의 표적에 대해 훨씬 더 높은 친화성을 가짐을 의미한다. 결과적으로, 디아바디 약물은 다른 치료 항체보다 훨씬 더 낮은 용량으로 투여될 수 있으며 생체내에서 종양을 매우 특이적으로 표적화할 수 있다. 더 짧은 링커(1개 또는 2개의 아미노산), 및 디설파이드 결합의 임의적 추가는 소위 트리아바디 또는 트리바디인 삼량체의 형성으로 이어진다. 테트라바디 및 더 높은 차수의 다량체도 생성되었다. 이들은 이들의 표적에 대해 디아바디보다 휠씬 더 높은 친화성을 나타낸다.

이중특이적 항체 유사 분자의 다른 포맷은 BiTE(BiTE 항체 구축물)로서 알려져 있는 이중특이적 탠덤 di-scFv 및 이중특이적 T 세포 인게이저이다. BiTE는 약 55 킬로달톤의 단일 펩티드 쇄 상에 상이한 항체의 2개의 scFv로 구성된 융합 단백질이다. 전형적으로, 결합 아암들 중 하나는 T 세포 상의 분자, 예컨대, CD3 수용체에 결합하고, 다른 결합 아암은 종양 특이적 분자, 예컨대, 비정상적으로 발현된 MUC1*를 통해 종양 세포에 결합한다. 이 포맷들 모두가 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 특이성을 가진, 본 발명의 항체의 하나 이상의 가변 단편으로 구성되어, 다가 및 다중특이적 항체 유사 분자를 생성할 수 있다. 한 측면에서, 제1 항체로부터 유래한 가변 도메인 단편은 제1 표면 상의 제1 항원에 결합하고 제2 항체로부터 유래한 가변 도메인 단편은 제2 표면 상의 제2 항원에 결합하며, 이때 표면 중 적어도 하나는 세포의 표면일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 다가 다중특이적 항체 유사 분자를 구성하는 가변 도메인 단편 중 적어도 하나는 표면과 회합되어 있지 않은 항원에 결합한다. 한 측면에서, 표면과 회합되어 있지 않은 항원은 사이토카인이다.

본 발명의 항체가 이중특이적 항체 내로 통합될 수 있는 방법의 예로서, 본 발명자들은 KIH로서도 알려져 있는 놉-인-홀(knob-in-hole) 포맷을 이용하여 이중특이적 항체를 구축하였다(Spiess et al. Molecular Immunology 67, 95-106 (2015)). 이 예에서, 항체의 제1 아암은 14616 프레임워크 영역을 가진, hu20A10으로서도 알려져 있는 인간화된 항-MUC1* 항체 20A10이고; 항체의 제2 아암은 인간 T 세포 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항-CD3 항체 OKT3 또는 12F6이다. 생성된 이중특이적 항체는 본원에서 20A10-OKT3-BiTE 및 20A10-12F6-BiTE로서 지칭된다. 기능을 입증하기 위해, 이중특이적 항체를 인간 T 세포 및 MUC1* 양성 암 세포 둘 다가 존재하는 배양물 중의 세포에 다양한 농도로 첨가한다. 한 경우, 암 세포는 T47D 유방암 세포이고, 다른 경우, MUC1* 음성 세포주인 HCT-116 결장암 세포는 MUC1*를 발현하도록 형질도입되었고 HCT-MUC1*로서 지칭된다. 도 283a 내지 283l, 도 284a 내지 284l, 도 285a 내지 285l 및 도 286a 내지 286l에 나타낸 사진에서 볼 수 있는 바와 같이, 이중특이적 항체의 첨가는 이중특이적 용량 의존적 세포 클러스터링에 의해 입증되는 바와 같이 T 세포와 MUC1* 양성 암 세포의 연결을 매개하였다. 두 가지 대조군 실험을 수행하였다. 한 대조군에서, 이중특이적 항체가 첨가되지 않으나, T 세포 및 MUC1* 암 세포 둘 다가 존재한다. 클러스터링은 관찰되지 않는다. 또 다른 대조군에서, 이중특이적 항체가 MUC1* 양성 암 세포에 첨가되나, T 세포가 존재하지 않는다. 이들 데이터는 본 발명의 항-MUC1* 항체가 이중특이적 포맷으로 용이하게 통합될 수 있음을 입증한다. 이들 예에서, 이중특이적 항체의 제2 아암은 T 세포 상의 CD3을 인식하는 항체이었다. 그러나, 본 발명은 하나의 아암이 MUC1*에 결합하고 다른 아암이 T 세포에 결합하는 이중특이적 항체로 제한되지 않는다. 당분야에서 숙련된 자는 친화성 증가를 위해 NK 세포, 또는 암 세포 상의 또 다른 수용체에 결합하는 항체로 이중특이적 항체의 제2 아암을 쉽게 대체할 수 있다. MNC2가 20A10과 동일한 에피토프에 결합하기 때문에, 당분야에서 숙련된 자가 20A10을 MNC2 또는 인간화된 MNC2로 용이하게 대체할 수 있다는 것은 분명하다. 본 발명의 한 측면에서, MUC1* 양성 암 세포 및 인간 T 세포에 동시에 결합하는 유효량의 이중특이적 항체를 사용하여 MUC1* 양성 암으로 진단받거나 MUC1* 양성 암을 발생시킬 위험이 있는 사람을 치료한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 이중특이적 항체는 hu20A10-OKT3-BiTE이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 이중특이적 항체는 hu20A10-12F6-BiTE이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 이중특이적 항체는 huMNC2-OKT3-BiTE이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 이중특이적 항체는 huMNC2-12F6-BiTE이다.

본 발명의 또 다른 측면은 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 상기 환자는 본원에 기재된 다가 다중특이적 항체 유사 분자들 중 하나를 유효량으로 투여받고, 이때 가변 도메인 중 적어도 하나 또는 이의 단편은 PSMGFR(서열번호 2), 또는 보다 구체적으로 N-10 펩티드(서열번호 3), 또는 보다 구체적으로 N-19 펩티드(서열번호 4), 또는 N-23 펩티드(서열번호 5), 또는 N-26 펩티드(서열번호 6), 또는 N-30 펩티드(서열번호 7)에 결합하는, 보다 구체적으로 PSMGFR 펩티드의 단편에 결합하는 항체로부터 유래하고, 이때 상기 결합은 아미노산 FPFSAQSGA(서열번호 10)의 존재에 의존한다. 한 경우, MUC1*에 결합하는 항체 가변 단편은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 부분을 포함한다. 한 경우, MUC1*에 결합하는 다가 다중특이적 항체 유사 분자를 구성하는 항체 가변 단편 중 적어도 하나는 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 부분을 포함하고, 적어도 하나의 다른 항체 가변 단편은 T 세포 또는 NK 세포일 수 있는 면역 세포 상의 항원에 결합한다.

본 발명의 또 다른 측면은 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 상기 환자는 유효량의 BiTE를 투여받고, 이때 BiTE의 한 항체 가변 단편은 T 세포 표면 항원에 결합하고 BiTE의 다른 항체 가변 단편은 PSMGFR(서열번호 2), 또는 보다 구체적으로 N-10 펩티드(서열번호 3), 또는 보다 구체적으로 N-19 펩티드(서열번호 4), 또는 N-23 펩티드(서열번호 5), 또는 N-26 펩티드(서열번호 6), 또는 N-30 펩티드(서열번호 7)에 결합하고, 보다 구체적으로 PSMGFR 펩티드의 단편에 결합하고, 이때 상기 결합은 아미노산 FPFSAQSGA(서열번호 10)의 존재에 의존한다. 한 경우, MUC1*에 결합하는 BiTE의 항체 가변 단편은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11의 부분을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, PSMGFR(서열번호 2)을 포함하는 MUC1* 펩티드, 또는 N-10 펩티드의 대부분 또는 전부가 입양 T 세포 접근법에 사용된다. 이 경우, 환자의 T 세포는 MUC1* 펩티드에 노출되고 T 세포는 다양한 성숙 라운드를 통해 MUC1* 특이적 수용체를 발달시킨다. 그 다음, 적응된 T 세포는 증폭되고 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 기증자 환자에게 투여된다.

CAR의 세포외 표적화 헤드로서 MNC2 및 인간화된 MNC2를 가진 일련의 CAR도 제조하였다. 이 CAR에 대한 구축물을 플라스미드에 삽입한 다음, 이 플라스미드를 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 이어서, 인간 T 세포를, MNC2 CAR 및 huMNC2 CAR을 보유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 마우스 서열이거나 인간화되어 있는 MNC2-scFv-CAR이 생성되었다. 본 발명의 한 측면에서, CAR은 CD8-짧은 세포내 조각-4-1BB-3제타로부터 유래한 huMNC2-scFv-짧은 힌지 영역-막횡단 도메인을 포함하였다. 또 다른 측면에서, 막횡단 도메인은 CD4 막횡단 서열로부터 유래하였다. 또 다른 측면에서, 세포내 보조자극 도메인은 CD28-3제타이었다. 또 다른 측면에서, 세포내 보조자극 도메인은 CD28-4-1BB-3제타이었다.

T 세포가 표적 세포를 인식하고 면역 반응을 일으키는 과정에 있는지를 평가하는 다양한 방법이 있다. T 세포는 표적 또는 외래 세포를 인식할 때 클러스터링된다. 이것은 육안 또는 저배율에서 쉽게 관찰될 수 있다. 표적 암 세포와 공-배양될 때 CAR T 세포 클러스터링의 출현은 a) 세포를 표적 세포로서 인식하는지 여부; 및 b) 이 경우 암 세포인 표적화된 세포를 공격하도록 활성화되는지 여부의 한 척도이다. 도 45 내지 47은 CAR을 갖지 않은 인간 T 세포 또는 huMNC2-scFv-CAR44 또는 huMNC2-scFv-CAR50으로 형질도입된 인간 T 세포와 공-배양된, mCherry로 안정적으로 형질감염되었거나 CMTMR로 염색되어 적색을 띠는 MUC1* 양성 T47D 유방암 세포의 사진을 보여준다. CAR T 세포는 투명하다. 볼 수 있는 바와 같이, T 세포가 CAR을 보유하지 않을 때 암 세포의 T 세포 유도 클러스터링이 없다. 그러나, T 세포가 MUC1* 표적화 CAR을 보유할 때, MUC1* 양성 암 세포의 현저한 클러스터링이 있다.

T 세포는 표적 세포를 인식하고 클러스터링한 후, 퍼포린 및 그랜자임 B를 과다발현한다. 이 두 분자가 함께 표적화된 세포에서 세포 사멸 경로를 활성화시킨다. 퍼포린은 표적 세포에서 구멍을 만들고, T 세포는 그랜자임 B를 이 구멍에 주입하고, 그 후 그랜자임 B는 아폽토시스성 프로테아제를 활성화시켜, 표적 세포가 용해되게 하는 것으로 생각된다. 도 55 및 도 56은 표적 MUC1* 양성 전립선암 및 췌장암 세포에 결합하고 그랜자임 B를 주입하는 huMNC2-scFV-CAR44 T 세포를 보여준다.

T 세포가 표적 세포를 인식하고 그 세포를 사멸시키도록 활성화되는지 여부의 또 다른 척도는 T 세포에 의한 사이토카인, 인터페론 감마(IFN-g) 및 인터류킨-2(IL-2)의 상향조절 및 분비이다. IFN-g 및 IL-2 분비에 의해 입증되는 바와 같이, CAR T 세포의 활성화는 시험관내에서 용이하게 측정될 수 있다. CAR T 세포를 표적 세포와 공-배양하고 인큐베이션 기간 후, 컨디셔닝 배지를 ELISA로 어세이하여 분비된 IFN-g 및 IL-2를 검출한다. CAR의 표적화 헤드가 huMNC2 또는 huMNE6인 CAR T 세포의 암 특이성을 측정하기 위해, MUC1* 양성 암 세포 및 정상 세포와 공-배양된 huMNC2-CAR44 T 세포 및 huMNE6-CAR44 T 세포를 사용하여 이 실험을 수행하였다. 표 1은 시험된 MUC1 양성 정상 또는 일차 세포를 상세히 설명한다.

도 50은 시험된 다양한 세포주의 PCR 측정의 그래프로서, 이때 MUC1의 mRNA 수준이 측정된다. 이 어세이에서 시험된 암 세포주는 HCT-MUC1* 및 T47D 유방암 세포이었다. 이 세포들을 huMNC2-CAR44 인간 T 세포와 공-배양하였다. huMNC2-CAR44 T 세포와 암 세포의 공-배양은 CAR T 세포가 다량의 IFN-g 및 IL-2를 주변 배지 내로 분비하도록 유도하였지만, MUC1 양성 정상 세포와의 공-배양은 사이카인의 분비를 유도하지 않았다(도 51 및 도 52). CAR T 세포에 의한 IFN-g 및 IL-2 분비에 대한 시험 이외에, 항체 표적화 헤드가 그다지 암 특이적이지 않은 경우 CAR T 세포에 의해 유도되었을 수 있는 세포 사멸의 징후에 대해 정상 세포를 어세이하였다. huMNC2-CAR44 T 세포와의 공-배양 후, 세포를 세포 사멸 마커와 함께 인큐베이션한 후 FACS로 어세이하였다. huMNC2-CAR44 T 세포는 정상 세포에서 세포 사멸을 유도하지 않았다(도 53a 내지 53j).

FACS 분석 이외에, 많은 연구원들은 이제 xCELLigence 기기를 이용하여 암 세포의 CAR T 사멸을 측정한다. FACS는 T 세포가 표적 세포를 용해시키기 때문에 T 세포 유도 세포 사멸을 추적하는 가장 좋은 방법이 아니다. 사멸된 세포는 세포 잔해로서 제외되기 때문에 사멸된 세포를 FACS로 측정하기 어려우므로, 세포 사멸의 양을 유추해야 하고 누락된 세포가 T 세포인지 아니면 암 세포인지를 다양한 방법으로 확인해야 한다.

xCELLigence 기기는 암 세포가 플레이팅되어 있는 전극 어레이를 사용한다. 부착성 암 세포는 전극을 절연하므로, 이 암 세포가 생장함에 따라 임피던스의 증가를 야기한다. 대조적으로, T 세포는 부착되지 않고 현탁 상태로 남아있으므로, 임피던스를 증가시키는 전극의 절연에 기여하지 않는다. 그러나, T 세포 또는 CAR T 세포가 전극 플레이트 상의 암 세포를 사멸시키는 경우, 암 세포는 사멸함에 따라 뭉쳐지고 부유하여, 임피던스의 감소를 야기한다. xCELLigence 기기는 시간의 함수로서 임피던스를 측정하며, 이것은 암 세포 사멸과 상관관계를 가진다. 또한, 전극 플레이트는 관찰 윈도우도 가진다. CAR T 세포가 흡착된 표적 암 세포를 효과적으로 사멸시킬 때, 임피던스의 감소가 있을 뿐만 아니라, 암 세포가 플레이트 표면에 남아있지 않음을 알 수 있다.

도 55a 내지 55h는 다양한 어세이에 의해 측정된, MUC1* 양성 DU145 전립선암 세포에 대한 huMNC2-CAR44 T 세포의 세포독성 효과를 보여준다. 도 55a는 전립선암 세포와 공-배양된 형질도입되지 않은 T 세포의 형광 사진이고, 이때 그랜자임 B는 적색 형광단으로 염색된다. 도 55c는 전립선암 세포와 공-배양된 huMNC2-CAR44 T 세포의 형광 사진이며, 이때 그랜자임 B는 적색 형광단으로 염색된다. 도 55d는 DAPI 및 그랜자임 B 병합이다. 도 55e는 암 세포와 함께 인큐베이션된 형질도입되지 않은 T 세포에 대한 형광 표지된 그랜자임 B에 대한 FACS 스캔이다. 도 55f는 암 세포와 함께 인큐베이션된 huMNC2-CAR44 T 세포에 대한 형광 표지된 그랜자임 B의 양성 증가를 보여주는 FACS 스캔이다. 도 55g는 평균 형광 강도의 그래프이다. 도 55h는 huMNC2-CAR44 T 세포(청색 추적선)에 의한 DU145 암 세포의 실시간 사멸을 추적하는 xCELLigence 스캔이고, 형질도입되지 않은 T 세포(녹색)에 의한 실시간 사멸은 추적되지 않는다. 도 56a 내지 56h는 다양한 어세이에 의해 측정된, MUC1* 양성 CAPAN-2 췌장암 세포에 대한 huMNC2-CAR44 T 세포의 세포독성 효과를 보여준다. 도 56a는 췌장암 세포와 공-배양된 형질도입되지 않은 T 세포의 형광 사진이고, 이때 그랜자임 B는 적색 형광단으로 염색된다. 도 56b는 DAPI 및 그랜자임 B 병합이다. 도 56c는 췌장암 세포와 공-배양된 huMNC2-CAR44 T 세포의 형광 사진이고, 이때 그랜자임 B는 적색 형광단으로 염색된다. 도 56d는 DAPI 및 그랜자임 B 병합이다. 도 56e는 암 세포와 함께 인큐베이션된 형질도입되지 않은 T 세포에 대한 형광 표지된 그랜자임 B에 대한 FACS 스캔이다. 도 56f는 암 세포와 함께 인큐베이션된 huMNC2-CAR44 T 세포에 대한 형광 표지된 그랜자임 B의 양성 증가를 보여주는 FACS 스캔이다. 도 56g는 평균 형광 강도의 그래프이다. 도 56h는 huMNC2-CAR44 T 세포(청색 추적선)에 의한 CAPAN-2 암 세포의 실시간 사멸을 추적하는 xCELLigence 스캔이고, 형질도입되지 않은 T 세포(녹색)에 의한 실시간 사멸은 추적되지 않는다. 도 57a 내지 57c는 huMNC2-CAR44 T 세포에 의한 MUC1* 양성 암 세포의 실시간 사멸을 추적하는 xCELLigence 스캔을 보여주고, MUC1* 음성 세포는 실시간 사멸되지 않는다. 도 57a는 huMNC2-CAR44 T 세포가 MUC1*로 안정적으로 형질감염된 HCT 결장암 세포를 효과적으로 사멸시킴을 보여준다. 도 57b는 huMNC2-CAR44 T 세포가 전체 길이 MUC1로 안정적으로 형질감염된 MUC1 음성 암 세포인 HCT-MUC1-41TR에 거의 영향을 미치지 않음을 보여준다. 이 세포주에서 세포의 약 10%만이 MUC1*로 절단된 MUC1을 가진다. 도 57c는 huMNC2-CAR44 T 세포가 MUC1 음성 결장암 세포주인 HCT-116 세포에 영향을 미치지 않음을 보여준다.

이들 데이터는 항체 단편 표적화 헤드가 MNC2인 CAR로 형질도입된 T 세포가 MUC1* 양성 암 세포를 효과적으로 사멸시킴을 입증한다. 이들 데이터는 특히 인간 T 세포 내로 형질도입된 huMNC2-scFV-CAR44가 MUC1* 양성 암 세포를 효과적으로 사멸시킴을 보여준다. 본 발명자들 및 다른 연구진이 이제 CAR T 기능의 가장 중요한 측면이 표적화 항체 단편이라는 것을 입증하였기 때문에, 항체 단편 MNC2-scFV 또는 huMNC2-scFV를 가진 임의의 CAR로 형질도입된 면역 세포 또는 T 세포는 MUC1 또는 MUC1* 양성 종양에 대한 유사한 효능을 가질 것이라는 결론에 이른다. 예를 들어, scFv를 막횡단 부분에 연결하는 힌지 영역은 임의의 유연한 링커일 수 있다. 세포내 보조자극 도메인은 CD28-3제타, CD28-4-1BB-3제타 또는 면역 세포 보조자극 도메인의 임의의 조합일 수 있다.

도 61은 비드에 의해 자극되었거나(프로토콜 1) 암 세포에 의해 자극된(프로토콜 2) huMNC2-scFv-CAR44 형질도입된 인간 T 세포가 동물에서 종양 성장을 억제하는 능력을 시험한 실험을 보여준다. 루시퍼라제로 안정적으로 형질감염된 인간 암 세포를 11주령 내지 15주령의 암컷 NOD/SCID/GAMMA(NSG) 마우스에 주사하였다. 500,000개의 BT-20 유방암 세포를 후방 옆구리에 피하 주사하였다. 루시페린을 동물에 주사한 다음 IVIS 기기를 이용하여 형광 암 세포를 이미지화함으로써 종양 생착을 확인하였다. 이식 후 5일째 날 촬영된 IVIS 이미지는 종양 세포의 존재를 보여주었다. IVIS 측정 후 6일째 날, huMNC2-scFv-CAR44로 형질도입된 1,000만 개의 인간 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포를 동물에게 1회 주사하였다. 500만 개의 T 세포를 종양 내로 주사하였고 500만 개의 T 세포를 꼬리 정맥에 주사하였다. IVIS 사진촬영 10분 전, 루시퍼라제에 의한 절단 후 형광을 생성함으로써, 종양 세포가 형광을 띠게 만드는 루시페린을 마우스에 IP 주사하였다. 도 61a, 61d 및 61g는 투여 24시간 전에 합성 MUC1*인 PSMGFR 펩티드가 부착된 4 ㎛ 비드와 함께 24시간 동안 공-배양함으로써 사전자극된 huMNC2-scFv-CAR44 T 세포로 치료받은 마우스의 사진을 보여준다("프로토콜 1"). 도 61b, 61e 및 61h는 투여 24시간 전에 MUC1* 양성 암 세포와 함께 24시간 동안 2회 공-배양함으로써 사전자극된 huMNC2-scFv-CAR44 T 세포로 치료받은 마우스의 사진을 보여준다("프로토콜 2"). 도 61에서 볼 수 있는 바와 같이, 펩티드-비드에 의해 자극된 huMNC2-CAR44 T 세포는 아마도 표적 세포를 오염시키고 종양 부피를 증가시킨 살아있는 암 세포와의 인큐베이션에 의해 사전자극된 세포보다 종양 성장을 더 잘 억제하였다.

비드에 의해 자극되었거나(프로토콜 1) 암 세포에 의해 자극된(프로토콜 2) huMNC2-scFv-CAR44 형질도입된 인간 T 세포가 동물에서 종양 성장을 억제하는 능력도 시험하였다. 루시퍼라제로 안정적으로 형질감염된 인간 암 세포를 11주령 내지 15주령의 암컷 NOD/SCID/GAMMA(NSG) 마우스에 주사하였다. 또 다른 실험에서, 500,000개의 BT-20 MUC1* 양성 삼중 음성 유방암 세포를 후방 옆구리에 피하 주사하였다. 루시페린을 동물에 주사한 다음 IVIS 기기를 이용하여 형광 암 세포를 이미지화함으로써 종양 생착을 확인하였다. 이식 후 6일째 날 촬영된 IVIS 이미지는 종양 세포의 존재를 보여주었다. 6일째 날, IVIS 이미지화 후, 10M huMNC2-scFv-CAR44 T 세포를 동물에게 투여하였다. 5M CAR T 세포를 종양내 주사로 투여하였고 남은 5M CAR T 세포를 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. 동일한 수의 형질도입되지 않은 T 세포를 동일한 투여 경로로 대조군에 주사하였다. 종양 존재량의 IVIS 측정을 6일째 날, 8일째 날 및 12일째 날에 수행하였다. 도 61a 내지 61j에서 볼 수 있는 바와 같이, huMNC2-CAR44 T 세포로 치료받은 2개의 마우스 군은 대조군에 비해 종양 존재량의 감소를 보여주었다.

비드에 의해 자극된(프로토콜 1) huMNC2-scFv-CAR44 형질도입된 인간 T 세포가 동물에서 난소암 성장을 억제하는 능력도 시험하였다. 루시퍼라제로 안정적으로 형질감염된 인간 SKOV-3 MUC1* 양성 난소암 세포를 11주령 내지 15주령의 암컷 NOD/SCID/GAMMA(NSG) 마우스에 주사하였다. 한 실험에서, 500,000개의 SKOV-3 암 세포를 복강에 주사하여 인간의 전이성 난소암을 모방하였다. 루시페린을 동물에 주사한 다음 IVIS 기기를 이용하여 형광 암 세포를 이미지화함으로써 종양 생착을 확인하였다. 이식 후 3일째 날 촬영된 IVIS 이미지는 종양 세포의 존재를 보여주었다. 종양 이식 후 4일째 날 및 11일째 날, 10M huMNC2-scFv-CAR44 T 세포를 동물에게 IP 투여하였다. 4일째 날, CAR T 세포를 IP 주사하였다. 11일째 날, CAR T 세포의 절반을 복강내 공간에 주사하였고 나머지 절반을 꼬리 정맥에 주사하였다. 동일한 수의 형질도입되지 않은 T 세포 또는 동일한 부피의 PBS를 동일한 투여 경로로 대조군에 주사하였다. 종양 존재량의 후속 IVIS 측정을 7일째 날, 10일째 날 및 15일째 날에 수행하였다. 도 62a 내지 62l에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조군 마우스는 huMNC2-CAR44 T 세포로 치료받은 마우스보다 훨씬 더 빠른 속도로 성장하는 종양을 가진다. 도 62m은 광자/초를 색상과 상호관련시키는 IVIS 색상 막대를 보여준다.

본 발명의 한 측면은 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 상기 환자는 면역 세포에서 발현되는 BiTE, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, ADC 또는 CAR 내로 통합될 수 있는 유효량의 항체 또는 이의 단편을 투여받고, 이때 상기 항체 또는 이의 단편은 본 발명의 항체로부터 유래한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3 또는 25E6으로부터 유래한다.

본 발명의 한 측면은 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 상기 환자는 MUC1* 표적화 CAR로 형질도입된 유효량의 면역 세포를 투여받고, 이때 상기 CAR은 MNE6-CD8-CD28-3z(서열번호 297 및 298); MNE6-CD4-CD28-3z(서열번호 748 및 749); MNE6-CD8-41BB-3z(서열번호 300 및 301); MNE6-CD4-41BB-3z(서열번호 750 및 751); MNE6-CD8-CD28-41BB-3z(서열번호 303 및 304); MNE6-CD4-CD28-41BB-3z(서열번호 754 및 755); MNE6scFv-Fc-8-41BB-CD3z(서열번호 310 및 311); MNE6scFv-IgD-Fc-8-41BB-CD3z(서열번호 770 및 771); MNE6scFv-FcH-8-41BB-CD3z(서열번호 315 및 316); MNE6scFv-IgD-FcH-8-41BB-CD3z(서열번호 772 및 773); MNE6scFv-Fc-4-41BB-CD3z(서열번호 318 및 319); MNE6scFv-FcH-4-41BB-CD3z(서열번호 321 및 322); MNE6scFv-IgD-8-41BB-CD3z(서열번호 323 및 324); MNE6scFv-IgD-4-41BB-CD3z(서열번호 327 및 328); MNE6scFv-X4-8-41BB-CD3z(서열번호 330 및 331); MNE6scFv-X4-4-41BB-CD3z(서열번호 333 및 334); MNE6scFv-8-4-41BB-CD3z(서열번호 336 및 337), 또는 상기 언급된 CAR들 중 임의의 CAR로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 MNE6은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11로부터 유래한 단편으로 대체된다. 본 발명의 또 다른 측면은 암으로 진단받거나, 암을 가진 것으로 의심되거나, 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 상기 환자는 상기 언급된 CAR들 중 하나로 형질도입된 유효량의 면역 세포를 투여받고, 이때 MNE6은 암 항원에 특이적인 항체 가변 도메인 단편을 포함하는 펩티드로 대체된다. 상기 방법들 중 임의의 방법에서, 면역 세포는 T 세포일 수 있고, 치료될 환자로부터 더 단리될 수 있다. 대안적으로, T 세포일 수 있는 면역 세포는 기증자로부터 단리된다. 또 다른 측면에서, 면역 세포는 시험관내에서 그 면역 세포 유형으로 분화하도록 유도된 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 항체의 서열을 함유하는 CAR은 나중에 면역 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포에서 발현된다. 한 경우, 면역 세포는 T 세포이다. 또 다른 경우, 면역 세포는 NK 세포이다.

본 발명의 또 다른 측면은 MUC1 양성 또는 MUC1* 양성 암으로 진단받거나, 이러한 암을 가진 것으로 의심되거나, 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 이때 상기 환자는 MUC1* 표적화 CAR로 형질도입된 유효량의 면역 세포를 투여받는다. 바람직한 실시양태에서, CAR은 항체 MNC2, 예컨대, MNC2-scFv(서열번호 239, 241, 243, 654 또는 655); 항체 20A10, 예컨대, 서열번호 1574 내지 1581 또는 5001 내지 5012; 예를 들어, 서열번호 1812 및 1813과 같이 인간화될 수 있는 항체 3C2B1, 예컨대, 서열번호 1572 및 1573; 예를 들어, 서열번호 1814 및 1815와 같이 인간화될 수 있는 항체 5C6F3, 예컨대, 서열번호 1384 및 1385; 또는 항체 25E6, 예컨대, 서열번호 1598 및 1599 또는 1600 및 1601로부터 유래한 서열을 포함하는 단일 쇄 항체 단편인 scFv를 포함할 수 있고, 이때 힌지 및 막횡단 서열은 41BB(서열번호 659) 또는 CD28(서열번호 378)일 수 있는 보조자극 도메인을 추가로 포함하는, CD8(서열번호 346 및 서열번호 364) 또는 CD28(서열번호 350 및 서열번호 368)로부터 유래할 수 있고, CD3-제타 신호전달 도메인은 서열번호 661로부터 유래할 수 있거나 1XX(서열번호 1796 및 1797)로서 지칭되는 돌연변이를 비롯한 돌연변이를 함유할 수 있다.

다른 MUC1 절단 부위

MUC1은 암 세포 이외에 일부 건강한 세포에서도 성장 인자 수용체 형태인 MUC1*로 절단되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, MUC1은 건강한 줄기 세포 및 전구체 세포에서 MUC1*로 절단된다. 큰 퍼센트의 골수 세포가 MUC1* 양성이다. 장의 일부는 MUC1* 양성이다.

본 발명자들은 MUC1이 서로 비교적 가까운 상이한 위치에서 절단될 수 있으나, 절단 위치는 세포외 도메인의 남은 부분의 접힘을 변화시킨다는 것을 발견하였다. 그 결과, 제1 위치에서 절단된 MUC1*에 결합하고 제2 위치에서 절단된 MUC1*에 결합하지 않는 단일클론 항체를 식별할 수 있다. 이 발견은 내용 전체가 본원에 참고로 포함되는, 2013년 8월 14일에 출원된 국제 출원 공개 제WO2014/028668호에 개시되어 있다. 본 발명자들은 암 세포에 나타나는 MUC1*에 결합하지만 줄기 세포 및 전구체 세포에 나타나는 MUC1*에는 결합하지 않는 항-MUC1* 단일클론 항체 세트를 식별하였다. 대조적으로, 본 발명자들은 줄기 세포 및 전구체 세포에 결합하나 암 세포에 결합하지 않는 제2 단일클론 항체 세트를 식별하였다. 줄기 특이적 항체를 식별하는 데 이용되는 한 가지 방법은 다음과 같다: 단일클론 하이브리도마로부터의 상청액을 2개의 멀티웰 플레이트 상에 개별적으로 흡착시켰다. 비-부착성 세포인 줄기 세포를 한 플레이트에 넣었고, 부착성을 가진 암 세포를 동일한 플레이트에 넣었다. 인큐베이션 기간 후, 플레이트를 헹구고 뒤집었다. 비-부착성 줄기 세포가 플레이트에 부착된 경우, 그 특정 웰 내의 단일클론 항체는 줄기 세포를 인식하고 암 세포를 인식하지 않을 것이다. 줄기 세포를 포획하지 않은 항체 또는 암 세포를 포획한 항체는 암 특이적 항체로서 식별되었다. FACS 분석은 이 방법이 작동함을 확인시켜주었다.

항체 MNE6 및 MNC2는 암 특이적 항체의 예이다. 항체 MNC3 및 MNC8은 줄기 특이적 항체의 예이다. 두 세트의 항체가 PSMGFR 서열을 가진 펩티드에 결합할 수 있지만, FACS 분석은 항-MUC1* 다중클론 항체 및 MNC3이 MUC1* 양성 골수 세포에 결합하나, MNE6이 결합하지 않음을 보여준다. MUC1* 다중클론 항체는 토끼를 PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성되었다. 유사하게, MNC3은 장 선와의 줄기 세포에 결합하지만, MNE6은 결합하지 않는다. 대조적으로, MNE6 항체는 암 조직에 결합하는 반면, 줄기 특이적 MNC3은 결합하지 않는다. 경쟁 ELISA 실험은 PSMGFR 펩티드의 C-말단 10개 아미노산이 MNE6 및 MNC2 결합에 필요하지만 MNC3 및 MNC8에는 필요하지 않음을 표시한다. 따라서, 암 특이적 항체를 식별하는 또 다른 방법은 10개의 N-말단 아미노산이 제거된 PSMGFR 펩티드의 서열을 가진 펩티드로 면역화하거나 그 펩티드를 사용하여 암 특이적 항체 또는 항체 단편에 대해 스크리닝하는 것이다. 본원에서 N-10 펩티드로서 지칭되는, N-말단 10개 아미노산이 제거된 PSMGFR 펩티드의 서열을 가진 펩티드에 결합하나, C-말단 10개 아미노산이 제거된 PSMGFR 펩티드의 서열을 가진 펩티드인 C-10 펩티드에는 결합하지 않는 항체는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 암 특이적 항체이다.

MUC1의 세포외 도메인은 또한 줄기 세포 및 일부 전구체 세포에서 절단되며, 이때 이량체 형태의 리간드 NME1 또는 NME7에 의한 절단된 MUC1의 활성화는 생장 및 분화다능성을 촉진하고 분화를 억제한다. 절단 후 남아있는 MUC1의 막횡단 부분은 MUC1*로서 지칭되고 세포외 도메인은 본질적으로 MUC1 성장 인자 수용체(PSMGFR) 서열의 일차 서열로 구성된다. 그러나, 절단의 정확한 부위는 세포 유형, 조직 유형, 또는 특정 사람이 어느 절단 효소를 발현하거나 과다발현하는지에 따라 달라질 수 있다. PSMGFR(서열번호 2)의 대부분 또는 전부를 포함하는 MUC1*의 막횡단 부분을 남기는, 본 발명자들에 의해 이전에 확인된 절단 부위 이외에, 다른 절단 부위는 가능하게는 SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(서열번호 620); 또는 SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(서열번호 621)의 대부분 또는 전부로 구성된 연장된 MUC1*를 초래할 수 있다.

이 가설을 검정하고 N-말단 연장된 PSMGFR에 대한 항체가 PSMGFR에 결합하는 항체보다 더 암 특이적인 항체로 생성되는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 하기 펩티드를 사용한 면역화로 단일클론 항체를 생성하였다:

(PSMGFR) GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 2),

(N+20/C-27) SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTE(서열번호 822), 또는

(N+9/C-9) VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVP(서열번호 824)

동일한 펩티드를 사용한 면역화로부터 생성된 단일클론 항체는 동일한 암 조직 표본에 대한 반응성의 차이도 보일 수 있다. 이 결과는 단일클론 항체가 숙주 동물에서 상이한 길이의 펩티드를 사용한 면역화, 상이한 절단 부위의 모방, 또는 상이한 부위에서의 절단으로부터 생성된 절두된 MUC1 세포외 도메인의 상이한 입체구조를 인식함을 시사한다. 상이한 절단 부위 입체구조를 인식하는 항체는 그의 종양이 어느 절단 효소를 발현하는지에 따라 암 아형(subtype) 특이적일 수 있거나 환자 특이적일 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 특정 유형의 암으로 진단받은 환자는 절단된 MUC1을 인식하는 본 발명의 항체로 치료받고, 이때 상기 항체는 그 아형의 암에 의해 전형적으로 발현되는 것으로 알려진 특정 효소에 의한 절단에 특이적이다. 또 다른 측면에서, 환자 종양을 분석하여 그의 또는 그녀의 종양이 어느 효소를 발현하는지를 확인한 후, 그 효소에 의해 절단된 MUC1을 인식하는 항체를 암 치료를 위해 환자에게 투여한다. 항체는 CAR, BiTE, ADC, FC 영역 또는 Fc 영역의 일부를 갖거나 갖지 않은 이중특이적 항체, bi-scFv, di-scFv, 탠덤 di-scFv, 디아바디, 트리아바디, 트리바디, 테트라바디, 및 다가 및 다중특이적인 다른 항체 유사 분자의 형태로 존재할 수 있다.

본 발명자들은 종양 성장을 매개하는 것이 전체 길이 MUC1이 아니라 MUC1*(muk1 스타)로서 지칭되는 MUC1 막횡단 절단 생성물이라고 이미 보고하였다(Mahanta et al 2008). MUC1*는 그의 짧은 세포외 도메인의 리간드 유도 이량체화에 의해 활성화되는 성장 인자 수용체이다(도 1a). MUC1* 세포외 도메인의 이량체화는 MAP 키나제 신호전달 캐스케이드를 활성화시키고 암 세포의 생장과 생존을 자극한다(Fessler et al 2009). MUC1* 세포외 도메인을 이량체화하는 2가 항체는 암 세포 생장을 자극하는 반면, 이량체화할 수 없는 동일한 항체의 1가 Fab는 암 세포 생장을 억제한다. 본 발명자들은 시험관내(도 1b) 및 생체내(도 7a 및 7b)에서 이것을 입증하였다.

그 다음, 본 발명자들은 MUC1* 성장 인자 수용체 기능을 이량체화하고 활성화시키는 천연 리간드를 식별하였다. NME1의 이량체는 MUC1* 세포외 도메인에 결합하고 이를 이량체화하며 생장을 촉진한다(도 1c 및 문헌[Smagghe et al 2013]). NME1은 그의 성장 인자 성질을 끌 수 있다. NME1은 MUC1* 양성 세포에 의해 분비된다. 이량체 NME1은 MUC1*에 결합하여 생장을 촉진한다. 그러나, 세포 집단이 생장함에 따라, 점점 더 많은 NME1이 세포로부터 분비된다. 고농도에서, NME1 이량체는 다량체화되어 육량체를 형성하는데, 이 육량체는 MUC1*에 결합하지 않으나, NME1 육량체의 첨가가 생장을 끌 때, 일부 알려지지 않은 수용체에 결합할 가능성이 높다. NME1은 성숙 형태이다. 배아 형태는 NME7_AB이다(Carter et al 2016). 각각의 NME7_AB 단량체는 MUC1*에 대한 2개의 결합 부위를 가지므로, 단량체로서 MUC1*를 이량체화하고(도 1d), 생장을 자극하고 스스로 꺼질 수 없다. 발달 중인 배아에서, BRD4는 NME7을 끄고 그의 보조인자 JMJD6은 자가 조절 형태인 NME1을 켠다. 그러나, 암에서는 성년기에 침묵되어야 하는 NME7이 다시 비정상적으로 발현되며, 이때 MUC1* 성장 인자 수용체가 항시적으로 활성을 띠게 된다.

시험관내에서, NME1(서열번호 4) 및 NME7_AB(서열번호 827)는 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분에 결합한다. 두 성장 인자는 10개의 N-말단 아미노산이 결실되어 있는 경우조차도(본원에서 N-10(서열번호 3)으로서 지칭됨) PSMGFR 펩티드(서열번호 2)에 결합할 수 있다. 그러나, NME1 및 NME7_AB 중 어느 것도 10개의 막 근위 아미노산이 결실되어 있는 경우(본원에서 C-10(서열번호 825)으로서 지칭됨) PSMGFR 펩티드에 결합할 수 없다(도 2a 내지 2d). 요약하면, NME1 및 NME7_AB가 결합하는 에피토프는 10개의 막 근위 아미노산인 PFPFSAQSGA(서열번호 1743)의 전부 또는 일부를 포함한다. 본 발명자들은 암 세포를 인식하되 건강한 세포를 인식하지 않는 능력에 대해 PSMGFR 펩티드를 사용한 면역화에 의해 동물에서 생성된 다양한 항체를 시험하였다. 가장 암 선택적인 것은 MNC2 및 MNE6 단일클론 항-MUC1* 항체이었다. PSMGFR 펩티드로 동물을 면역화함으로써 생성된 2개의 다른 단일클론 항체는 MNC3 및 MNC8이다. MNC2, MNE6, MNC3 및 MNC8은 모두 NME1 및 NME7_AB처럼 PSMGFR 펩티드에 결합하지만, MNC2 및 MNE6은 N-10 펩티드에 강하게 결합하나 C-10 펩티드에는 결합하지 않는다(도 2b 및 2c). 실제로, MNC2 및 MNE6은 NME1 및 NME7_AB와 PSMGFR의 결합을 경쟁적으로 억제한다(도 3a 내지 3c). 대조적으로, MNC3 및 MNC8은 C-10 펩티드에 결합하고, N-10 펩티드에 덜 잘 결합하며, PSMGFR을 비롯한 MUC1* 펩티드에 결합하기 위해 NME1 및 NME7_AB 둘 다와 경쟁하지 않는다(도 2e 및 2f). MNC3 및 MNC8은 MNC2 및 MNE6보다 훨씬 덜 암 특이적이다. MNC3 및 MNC8은 조혈 줄기 세포와 같은 줄기 세포 및 전구체 세포를 인식하는 반면, MNC2 및 MNE6은 인식하지 않는다(도 39 내지 41). 조혈 줄기 세포는 혈액 세포의 전구체 세포이기 때문에, 이러한 중요한 정상 세포 유형도 표적화할 암 치료제를 가진다는 것은 문제가 될 것이다.

MUC1*는 MUC1의 효소 절단에 의해 생성되기 때문에, 본 발명자들은 어느 절단 효소가 MUC1을 MUC1*로 절단하는지와, 본 발명자들이 제1 절단 효소에 의해 생성된 MUC1*를 인식하지만 제2 절단 효소에 의해 생성된 MUC1*를 인식하지 않는 항체를 식별할 수 있는지 여부를 연구하였다. 본 발명자들은 MNC2 및 MNE6이 MMP9에 의한 MUC1의 절단에 의해 생성된 MUC1*를 인식하였으나, MMP2와 같은 다른 효소에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1*를 인식하지 않음을 발견하였다(도 37 및 도 75). 본 발명자들은 MMP9가 암에서 과다발현되고 좋지 않은 예후의 예측자이며(vant Veer et al 2002; Dufour et al 2011) 전이에 관여하는 반면(Owyong et al, 2019), MMP2가 골수에서 발현된다는 점을 주목한다. 제1 효소에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1*에 결합하나 제2 효소에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1*에 결합하지 않는 항체는 이 항체가 선형 에피토프보다는 입체구조적 에피토프를 인식한다는 것을 암시한다.

본 발명자들은 가장 암 특이적인 항체가 하기 성질들의 대부분 또는 전부의 일부 조합을 특징으로 하는 항체일 것이라고 추론하였다:

(i) 항체는 PSMGFR 펩티드에 결합함;

항체는 전체 길이 MUC1에 결합하지 않음;

(ii) 항체는 N-10에 결합함;

(iii) 항체는 C-10에 결합하지 않음;

(iv) 항체는 NME1 또는 NME7_AB와 MUC1* 세포외 도메인 또는 PSMGFR 펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제함;

(v) 항체는 MMP9에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1*를 인식함;

(vi) 항체는 선형 에피토프가 아니라 입체구조적 에피토프를 인식함.

MNC2 및 MNE6은 암 특이적이다.

본 발명자들의 실험은 MNC2 및 MNE6 둘 다가 a) 종양 세포에 결합하고; b) 1가 형태가 시험관내 및 생체내에서 종양 성장을 차단하고; c) 종양 조직의 광범위한 패널에 강하게 결합하면서 정상 조직에 최소한으로 결합하거나 결합하지 않고; d) CAR T 세포 내로 통합될 때, MNC2 및 MNE6 지향(directed) CAR T 세포가 전체 길이 MUC1을 인식하지 않고 전체 길이 MUC1만 발현하는 세포를 사멸시키지 않고; e) MNC2 및 MNE6 지향 CAR T 세포 클러스터가 MUC1*를 발현하는 종양 세포를 사멸시키고; f) MNC2 및 MNE6이 MMP9에 의해 절단된 MUC1 절단 생성물을 인식함을 보여준다.

MNC2 지향 CAR T 세포는 MUC1* 양성을 띠는 정상 건강한 세포를 인식하지 않는다. 일차 세포뿐만 아니라 정상 세포주의 패널도 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양하였다. 정상 세포 집단을 분석하여, MNC2 지향 CAR T 세포가 이 정상 세포 집단을 사멸시키는지 여부를 확인하였다. 상기 CAR T 세포를 분석하여, MUC1 양성 정상 세포와의 공-배양이 IL-2 또는 인터페론 감마의 분비에 의해 측정될 때 CAR T 세포의 사멸 기능을 활성화시키는지를 확인하였다. 도 50 내지 52가 보여주는 바와 같이, MNC2 지향 CAR T 세포는 정상 세포를 사멸시키지 않았고, T 세포 활성화를 표시하는 사이토카인 분비도 없었다. 또한, 2,000개 이상의 인체 조직 표본을 분석하였다. 결과는 MNC2 및 MNE6 둘 다가 정상 조직과의 어떠한 유의미한 결합도 보여주지 않으나, 암 조직의 광범위한 패널의 강력한 염색을 보여줌을 보여주었다. 예를 들어, MNC2는 93% 유방암 표본, 83% 난소암 표본, 78% 췌장암 표본 및 71% 폐암 표본을 염색하였다. 또한, 환자 일치된 원발성 종양(도 54) 및 후속 전이는 MNC2 반응성 MUC1*의 양이 종양 진행 및 전이와 함께 증가함을 보여주었다. 요약하면, MNC2는 고도로 암 특이적인 항체이다.

MNC2 및 MNE6의 특징규명

본 발명자들의 최적 표준인 암 특이적 항체 MNC2 및 MNE6은 1) N-10 펩티드에 결합하지만 C-10 펩티드에는 결합하지 않고; 2) 세포에서 MUC1*의 막 근위 부분인 PSMGFR 펩티드의 C-말단 근처의 동일한 결합 부위에 대해 NME7_AB 및 이량체 NME1과 경쟁하고; 3) 웨스턴 블롯 어세이에서 작동하지 않고, 이것은 이 항체들이 선형 에피토프보다는 입체구조적 에피토프를 인식한다는 것을 시사하고; 4) MUC1이 MMP9에 의해 절단될 때 생성된 MUC1*를 인식하고; 5) 모델 세포주 및 암 세포주에서 전체 길이 MUC1에 결합하지 않고 절단된 형태인 MUC1*에만 결합하고; 6) 정상 조직과의 결합을 거의 내지 전혀 보이지 않으나 매우 다양한 종양 조직을 강하게 염색하고; 7) 그들의 상보성 결정 영역인 CDR에서 일부 컨센서스 서열을 공유한다.

MNC2 및 MNE6처럼 고도로 암 특이적인 다른 항체를 식별하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 한 세트의 일곱(7)가지 특징규명 실험을 신규 항체에 대해 수행하였다: 1) 에피토프 결합 어세이; 2) MUC1* 펩티드 PSMGFR 또는 N-10과의 결합으로부터 활성화 성장 인자 NME7_AB 또는 이량체 NME1을 이탈시키는 능력과 같은 기능 어세이; 3) 항체가 입체구조적 에피토프에 비해 선형 에피토프를 인식하는지 여부를 확인하기 위한 웨스턴 블롯, 이 경우 항체는 웨스턴에서 작동하지 않을 것임; 4) 항체가 MMP9에 의한 절단에 의존하는 절단된 MUC1을 인식하는지를 알아보기 위한 결합 어세이; 5) MUC1* 양성 세포를 인식하지만 전체 길이 MUC1을 인식하지 않는 항체의 능력을 측정하기 위한 FACS 분석; 및 MUC1/MUC1* 양성 암 세포를 인식하는 항체의 능력을 측정하기 위한 FACS 분석; 6) 진정한 암 특이성을 확인하기 위한, 정상 조직 대 암 조직의 면역조직화학, 즉 IHC 어세이; 및 7) 항체의 서브세트가 그들의 암 특이성 또는 이의 결여를 예측할 수 있는 컨센서스 서열을 공유하는지를 확인하기 위한 항체 서열의 정렬.

탠덤 반복부를 결여하는 MUC1로부터 유래한 펩티드로 동물을 면역화함으로써 단일클론 항체를 생성하였다. 이 항체는 PSMGFR, 및 PSMGFR의 N-말단에서 연장된 펩티드를 포함하였다. 면역화 펩티드는 다음과 같았다:

PSMGFR(서열번호 2))

N+9/C-9(N-말단에 추가된 9개의 아미노산 및 C-말단으로부터 결실된 9개의 아미노산)(서열번호 824)

N+20/C-27(N-말단에 추가된 20개의 아미노산 및 C-말단으로부터 결실된 27개의 아미노산)(서열번호 823)

그 다음, 이 단일클론 항체를 시험하여, 어느 단일클론 항체가 상기 인용된 일곱(7)가지 특징규명 기준을 충족시키는지를 확인하였고, 본 발명자들은 이 기준이 가장 암 특이적인 항체를 식별할 것이라고 추론하였다.

에피토프 결합 어세이

항체가 그의 면역화 펩티드를 인식하는 것 이외에 PSMGFR, N-10 또는 C-10을 인식하는지를 확인하기 위해 ELISA 어세이를 수행하였다. 추가로, N+20/C-27, N+9/C-9에 결합하는 항체의 능력을 시험하였다. 본 발명자들은 본 발명자들의 기준 항체 세트, 즉 본 발명자들이 아는 한, 암 특이적인 MNC2 및 MNE6, 및 본 발명자들이 아는 한, 줄기 세포 및 전구체 세포를 인식하는 MNC3에 대해 ELISA 어세이를 먼저 수행하였다(도 63a 및 63b). 기준 항체들 중 어느 것도 N+20/C-27 펩티드에 결합하지 않았다. MNC2 및 MNE6은 27개, 10개 또는 9개의 C-말단 결실을 가진 PSMGFR 펩티드에 결합할 수 없으나, MNC3은 C-10 및 N+9/C-9 펩티드에 결합한다.

이 동일한 ELISA 어세이를 본 발명의 항체에 대해 수행하였다(도 64 내지 66 및 도 201). PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체들의 결합 패턴은 도 64a 및 64b에 표시되어 있다. 20A10만이 MNC2 및 MNE6의 결합 프로파일과 정확히 일치함을 주목한다. 25E6, 28F9 및 18G12는 모두 N-10 펩티드에 결합할 수 있다. 18B4는 펩티드의 10개 가장 N-말단 아미노산을 요구하는 PSMGFR 펩티드에 대해 생성된 유일한 항체이다. ELISA 그래프에서 각각의 항체에 대한 막대의 색상은 그 항체의 연역적 동족 서열 또는 이의 일부와 일치하도록 색상 코딩된다. 또한, 또 다른 항체 세트를 ELISA로 어세이하였다(도 201). 이 세트 중 B12, B2, B7, B9, 8C7F3 및 H11은 PSMGFR 펩티드에 결합하였고 N-10 펩티드에 결합하였으나, C-10 펩티드에는 결합하지 않았다(도 201). N+20/C-27 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체들의 결합 패턴은 도 65a 및 65b에 표시되어 있다. 이 항체들이 N+20/C-27 펩티드에 대해 생성되었지만, 45C11 하나를 제외한 모두가 PSMGFR의 N-말단 부분에도 불구하고 여전히 PSMGFR 펩티드에 결합한다. 45C11의 결합은 약하지만, 연역적 추론은 동족 에피토프의 전부 또는 일부가 SNIKFRPGSVV(서열번호 1744) 내에 있어야 함을 보여준다.

N+9/C-9 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체들 중 8A9 및 17H6은 PSMGFR 펩티드에 결합하지 않으므로, 9개의 추가 N-말단 아미노산에 결합해야 한다. 항체 3C5 및 39H5는 PSMGFR 펩티드의 10개 가장 N-말단 아미노산에 결합하는 것으로 보인다.

각각의 항체가 결합하는 에피토프를 더 세밀히 구별하기 위해, PSMGFR 서열로부터 유래한 일련의 더 작은 펩티드를 합성하였다: N-30(서열번호 7), N-26(서열번호 6), N-19(서열번호 4), N-10/C-5(서열번호 8), N-19/C-5(서열번호 9). PSMGFR, N-10 및 C-10 펩티드뿐만 아니라 이 세밀히 구별된 펩티드 세트에도 결합하는 각각의 항체의 능력을 ELISA 어세이에서 시험하였다(도 67 내지 69).

도 67a 내지 67d에서, PSMGFR 펩티드로 면역화함으로써 생성된 항체를 어세이하였다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 본질적으로 PSMGFR 펩티드의 중간에 있는 아미노산 ASRYNLT(서열번호 1745)는 28F9, 18G12, 25E6 및 MNC3 항체의 결합에 중요하거나 필수적이다. PSMGFR 펩티드의 가장 N-말단 부분을 포함하는 아미노산 GTINVHDVET(서열번호 1746)는 18B4 항체의 결합에 중요하거나 필수적이다. 아미노산 FPFS(서열번호 1747)는 20A10, MNC2 및 MNE6의 결합에 중요하거나 필수적이다. 본 발명자들은 이 3개의 항체들이 선형 에피토프가 아니라 입체구조적 에피토프를 인식한다는 점을 주목한다. FPFS 서열의 프롤린은 PSMGFR 펩티드의 인접 부분의 입체구조를 유의미하게 변경하기 때문에, 상기 항체들이 이 4개의 아미노산들에 직접 결합하지 않으나, 프롤린의 부재가 나머지 펩티드의 접힘을 변경하여, 20A10, MNC2 및 MNE6이 결합하는 입체구조가 더 이상 존재하지 않을 가능성도 있다.

도 68a 내지 68d에서, N+20/C-27 펩티드를 사용한 면역화에 의해 생성된 항체를 어세이하였다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, PSMGFR 펩티드의 가장 N-말단 부분을 포함하는 아미노산 GTINVHDVET는 29H1, 32C1 및 31A1 항체의 결합에 중요하거나 필수적이다. PSMGFR 펩티드의 N-말단 쪽에 있고 PSMGFR 펩티드의 외부에 있는 20개의 추가 아미노산인 아미노산 SNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(서열번호 1748)는 항체 45C11의 결합에 중요하거나 필수적이다. 그러나, 도 65를 다시 참조하건대, 항체 45C11은 N+9/C-9 펩티드에 결합할 수 없었으므로, 본 발명자들은 SNIKFRPGSVV 서열 내의 아미노산이 45C11의 결합에 필수적이라는 결론을 내린다. 여전히 PSMGFR의 서열 내에 있는 아미노산 QFNQYKTEA(서열번호 1749)는 항체 1E4의 결합에 중요하거나 필수적이다.

도 69a 내지 69d에서, N+9/C-9 펩티드를 사용한 면역화에 의해 생성된 항체를 어세이하였다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, PSMGFR 펩티드의 가장 N-말단 부분을 포함하는 아미노산 GTINVHDVET는 39H5 및 3C5 항체의 결합에 중요하거나 필수적이다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, PSMGFR 펩티드의 N-말단 쪽에 있고 PSMGFR 펩티드의 외부에 있는 9개의 추가 아미노산인 아미노산 VQLTLAFRE(서열번호 1750)는 항체 17H6 및 8A9의 결합에 중요하거나 필수적이다. 17H6 및 8A9 항체가 이 도면에 표시된 더 작은 펩티드들 중 임의의 펩티드에 결합하지 않기 때문에, 이 두 항체들이 PSMGFR 펩티드의 N-말단 쪽에 있는 9개의 추가 아미노산을 가진 펩티드에만 결합함을 보여주는 도 66a 내지 66c를 참조한다.

하기 표 2는 본 발명의 항체 및 이의 동족 에피토프를 나열한다.

MUC1* 세포외 도메인 펩티드 PSMGFR에 결합하는 NME7 _AB 를 이탈시키는 능력

본 발명자들은 이량체 NME1이 MUC1* 세포외 도메인을 이량체화하고 생장을 자극한다고 앞서 보고하였다. 단량체 NME7_AB는 단량체로서 MUC1*를 이량체화하고 암 세포 생장을 매개하도록 MUC1*에 대한 2개의 결합 부위를 가진다. 본 발명자들은 NME1 및 NME7_AB가 MUC1* 세포외 도메인에 결합할 수 있음을 보여주었다. 시험관내에서, NME1 및 NME7_AB는 10개의 N-말단 아미노산이 결실되어 있는 경우조차도(본원에서 N-10(서열번호 3)으로서 지칭됨) PSMGFR 펩티드에 결합한다. 그러나, NME1 및 NME7_AB 중 어느 것도 10개의 막 근위 아미노산이 결실되어 있는 경우(본원에서 C-10(서열번호 825)으로서 지칭됨) PSMGFR 펩티드에 결합할 수 없다. 요약하면, NME1 및 NME7_AB가 결합하는 에피토프는 10개의 막 근위 아미노산인 PFPFSAQSGA(서열번호 1743)의 전부 또는 일부를 포함한다. 본 발명자들은 암 세포를 인식하되 건강한 세포를 인식하지 않는 능력에 대해 PSMGFR 펩티드를 사용한 면역화에 의해 동물에서 생성된 다양한 항체들을 시험하였다. 가장 암 선택적인 것은 MNC2 및 MNE6 단일클론 항-MUC1* 항체이었다. PSMGFR 펩티드로 동물을 면역화함으로써 생성된 2개의 다른 단일클론 항체는 MNC3 및 MNC8이다. MNC2, MNE6, MNC3 및 MNC8은 모두 NME1 및 NME7_AB처럼 PSMGFR 펩티드에 결합하지만, MNC2 및 MNE6은 N-10 펩티드에 강하게 결합하나 C-10 펩티드에는 결합하지 않는다. 실제로, MNC2 및 MNE6은 NME1 및 NME7_AB와 PSMGFR의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 대조적으로, MNC3 및 MNC8은 C-10 펩티드에 결합할 수 있고, N-10 펩티드에 덜 잘 결합하며, PSMGFR을 비롯한 MUC1* 펩티드에 결합하기 위해 NME1 및 NME7_AB 둘 다와 경쟁하지 않는다(도 70). MNC3 및 MNC8은 MNC2 및 MNE6보다 훨씬 덜 암 특이적이다. MNC3 및 MNC8은 조혈 줄기 세포와 같은 줄기 세포 및 전구체 세포를 인식하는 반면, MNC2 및 MNE6은 인식하지 않는다. 조혈 줄기 세포는 혈액 세포의 전구체 세포이기 때문에, 이러한 중요한 정상 세포 유형도 표적화할 암 치료제를 가진다는 것은 문제가 될 것이다.

이 실험에서, PSMGFR 펩티드와의 결합으로부터 NME7_AB를 이탈시키는 본 발명의 항체의 능력을 시험하였다. 이 실험에서, 멀티웰 플레이트를 PSMGFR 펩티드로 코팅하였다. 재조합 NME7_AB가 표면에 고정된 PSMGFR 펩티드에 결합되게 하였다. 세척 단계가 뒤따랐다. 다양한 항체들을 첨가한 후, 세척 단계를 수행하였다. 항체 경쟁 후, PSMGFR 코팅된 플레이트에 부착된 상태로 남아있는 NME7_AB의 양을, NME7_AB의 태그를 검출함으로써 측정하였다. 대조군으로서, PSMGFR로부터 NME7_AB를 이탈시키는 항-NME7_AB 항체의 능력도 시험하였다. 도 70은 ELISA 이탈 어세이의 그래프를 보여준다. 막대 그래프는 각각의 항체가 결합하는 동족 에피토프를 표시하기 위해 색상 코딩된다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, PSMGFR의 더 많은 C-말단 부분에 결합하는 항체는 암배아 성장 인자 NME7_AB와 MUC1* 세포외 도메인 또는 PSMGFR 펩티드의 결합을 파괴하는 데 있어서 가장 강력하다. NME7_AB와 PSMGFR의 결합을 파괴하는 데 있어서 효능의 순위는 이들의 동족 에피토프에 따라 다음과 같다: FPFS> ASRYNLT> QFNQYKTEA> GTINVHDVET. PSMGFR 펩티드의 외부에 있는 에피토프에 결합하는 항체, 예컨대, 45C11, 8A9 및 17H6은 결합하기 위해 NME7_AB와 경쟁하지 않았다.

선형 대 입체구조적 동족 에피토프를 확인하기 위한 웨스턴 블롯 어세이

항체가 선형 에피토프를 인식하는지 아니면 입체구조적 에피토프를 인식하는지를 확인하기 위해 항체를 시험하였다. 선형 에피토프를 인식하는 항체만이 변성 겔을 사용할 때 웨스턴 블롯에서 작동한다. 비교를 위해, MUC1 음성 암 세포주인 HCT-116, 전체 길이 MUC1로 형질감염된 HCT의 절단 내성 클론인 HCT-MUC1-18, 및 MUC1*로 형질감염된 HCT에 결합하는 능력에 대해 공지된 항체를 시험하였는데, 이때 세포외 도메인은 PSMGFR 서열만을 포함한다. 비교를 위해 시험된 항체는 입체구조적 에피토프만을 인식하는 것으로 알려진 MNC2 및 MNE6, PSMGFR에 대해 생성된 다중클론 항체인 SDIX, 및 전체 길이 MUC1의 탠덤 반복부를 인식하는 시판되는 단일클론 항체인 VU4H5이다(도 71a 내지 71d). 볼 수 있는 바와 같이, MNC2 및 MNE6 둘 다가 MUC1 또는 MUC1* 특이적 선형 에피토프를 인식하지 않는다. 도 71a 및 71e는 항체 20A10도 MUC1 또는 MUC1* 특이적 선형 에피토프를 인식하지 않음을 보여준다. SDIX 다중클론 항체는 HCT-MUC1*를 인식하지만 전체 길이 MUC1을 인식하지 않으며, VU4H5만이 전체 길이 MUC1을 인식한다. 이 동일한 항체들을 2개의 유방암 세포주 1500(Zr-75-1로서도 알려짐) 및 T47D 세포의 웨스턴 블롯에서 작동하는 능력에 대해서도 시험하였고 이들은 동일한 결합 패턴을 보여준다(도 71e 내지 71h).

PSMGFR 펩티드에 대해 생성된 항체를 웨스턴 블롯에서 동일한 방식으로 시험하였다(도 72a 내지 72p). 볼 수 있는 바와 같이, 항체 25E6 및 18B4는 선형 에피토프를 인식하지만, 20A10(도 72a; 72i), 3C2B1(도 72f; 72n), 5C6F3(도 72g; 72o), 18G12 및 28F9는 인식하지 않는데, 이것은 이들이 입체구조적 에피토프에 결합함을 시사한다. N+20/C-27 펩티드에 대해 생성된 항체를 웨스턴 블롯에서 동일한 방식으로 시험하였다(도 73a 내지 73j). 볼 수 있는 바와 같이, 항체 31A1 및 32C1은 선형 에피토프를 인식한다. 항체 1E4 및 45C11은 입체구조적 에피토프를 인식할 수 있다. N+9/C-9 펩티드에 대해 생성된 항체를 웨스턴 블롯에서 동일한 방식으로 시험하였다(도 74a 내지 74h). 볼 수 있는 바와 같이, 이 항체들 중 어느 것도 선형 MUC1 또는 MUC1* 특이적 에피토프를 인식하지 않는다. 이 항체들은 입체구조적 에피토프를 인식할 수 있다. 그러나, 대안적 해석은 웨스턴 블롯에서의 결합의 결여가 상기 항체들이 MUC1 또는 MUC1 절단 생성물을 특이적으로 인식하지 않거나 이 어세이에 사용된 농도가 불충분함을 의미한다는 것이다.

MMP9에 의한 절단 후 MUC1 절단 생성물의 인식

본 발명자들은 MNC2가 매트릭스 메탈로프로테아제 9인 MMP9에 의해 전체 길이 MUC1이 절단될 때 생성되는 MUC1*를 인식한다는 것을 이미 입증하였다(도 37). MMP9는 종양 조직에 의해 발현되며 유방암에 대한 좋지 않은 예후의 예측자이다(vant Veer et al 2002; Dufour et al 2011). MMP9는 전이에도 관여한다(Owyong et al 2019). MNC2가 암배아 성장 인자 NME7_AB와 MUC1* 세포외 도메인의 결합을 경쟁적으로 억제한다는 것도 상기한다(도 3). 따라서, MUC1*의 성장 및 생존 기능을 활성화시키는 암배아 성장 인자도 MMP9에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1*를 인식한다는 결론에 이르게 된다. 이어서, 대부분의 암 특이적 항체들은 MUC1이 MMP9에 의해 MUC1*로 절단될 때 형성된 입체구조적 에피토프를 인식하는 항체라는 결론에 이르게 된다.

PSMGFR, N+20/C-27 또는 N+9/C-9를 사용한 면역화에 의해 생성된 항체를, MUC1이 MMP9에 의해 절단된 후 MUC1을 인식하는 능력에 대해 시험하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 MUC1 음성 결장암 세포주인 HCT-116을 전체 길이 MUC1로 형질감염시키고 절단 내성을 가진 단일 세포 클론을 단리하였는데; 이 절단 내성 세포주는 HCT-MUC1-18로서 지칭된다. 촉매 활성 MMP9 또는 MMP2를 HCT-MUC1-18 세포에 첨가하였다. 농도 범위에 걸쳐 첨가된 효소를 24시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 생성된 세포를 다양한 항체들과 함께 인큐베이션하고 FACS로 분석하여, 어느 항체가 MMP9에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1 절단 생성물에 결합하는지를 확인하였다(도 75a 내지 75n). 각각의 그래프의 첫 번째 막대는 항체들 중 어느 항체도 절단의 부재 하에 전체 길이 MUC1에 결합하지 않음을 보여준다는 것을 주목한다. 각각의 막대 그래프는 그 어세이에 사용된 항체의 명칭 및 그의 동족 에피토프 둘 다로 표지되어 있다. 오른쪽에서 왼쪽으로 그래프의 순서는 항체의 동족 에피토프의 세포 표면으로부터의 거리에 상응한다. PSMGFR 펩티드 내의 더 많은 C-말단 에피토프에 결합하는 항체, 예컨대, 20A10(도 75e), 3C2B1(도 75o) 및 5C6F3(도 75p)은 MMP9에 의한 절단 후 MUC1 절단 생성물과의 결합의 농도 의존적 증가를 보였으나, MMP2에 의한 절단 후에는 그렇지 않았다. MUC1의 PSMGFR 부분의 외부에 있는 SNIKFRPGSVV 에피토프에 결합하는 항체 45C11은 MMP9 또는 MMP2에 의한 절단 후 MUC1 절단 생성물을 인식하지 않는다(도 75k). 유사하게, 항체 8A9 및 17H6은 마찬가지로 PSMGFR 서열의 외부에 있는 VQLTLAFRE 에피토프에 결합하고, MMP9 또는 MMP2에 의해 절단된 MUC1에는 결합하지 않는다. 이 결과는 남은 막횡단 절단 생성물의 세포외 도메인이 본질적으로 PSMGFR 펩티드의 아미노산을 포함도록 MMP9가 MUC1을 절단한다는 생각과 일치한다. 가장 큰 정도의 암 특이성을 위해, 항체는 MUC1이 MMP9에 의해 절단될 때 생성된 MUC1 절단 생성물의 입체구조적 에피토프를 인식해야 한다. 도 75a 내지 75n에 나타낸 항체들 중 20A10만이 MMP9에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1 절단 생성물을 인식하고 또한 웨스턴 블롯에서 작동하지 않는데, 이것은 이 항체가 MNC2 및 MNE6처럼 입체구조적 에피토프를 인식함을 시사한다. MUC1의 거대한 탠덤 반복부 도메인의 절단 및 방출은 MUC1*의 이소성 결합 부위를 노출시키고; 입체구조적 에피토프 이외에 선형 에피토프도 노출될 것이다.

암 세포주 패널에의 결합의 FACS 분석

형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 기준 항체 및 본 발명의 신규 항체에 대해 수행하였다. 기준 항체 MNC2인 "C2" 및 VU4H5와 MUC1 음성 세포주 HCT-116, MUC1*로 형질감염된 HCT인 "HCT-MUC1*", 또는 전체 길이 MUC1로 형질감염된 HCT의 절단 내성 단일 세포 클론인 "HCT-MUC1-18"의 결합, 및 MNC2와 유방암 세포주 T47D 또는 ZR-75-1로서도 알려진 유방암 세포주 1500의 결합의 FACS 분석을 수행하였다(도 76a 내지 76j). 이 분석은 MNC2가 탠덤 반복부 도메인을 포함하는 세포외 도메인의 대부분의 절단 및 방출 후에만 이용 가능한 MUC1*의 세포외 도메인에 있는 이소성 결합 부위에 결합한다는 것을 보여준다. VU4H5는 전체 길이 MUC1의 탠덤 반복부 도메인에서 수백 개의 반복 에피토프에 결합하고 MUC1*에는 결합하지 않는다. 본 발명자들은 암 세포주가 전체 길이 MUC1 및 MUC1* 둘 다를 발현한다는 것을 알고 있지만, 전체 길이 MUC1에 대한 항체는 아직까지는 치료적 가치를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 스티뮤박스(Stimuvax), 임뮤신(ImMucin), IMGN242, SAR566658, 판코맙(PankoMab) 및 AS1402는 모두 전체 길이 MUC1에 결합하는 항체이었고 모두 임상 시험에서 효능을 보이지 못했다. 전체 길이 MUC1이 아니라 MUC1*가 암 세포의 생장(Mahanta et al 2008) 및 화학요법제에 대한 그의 내성(Fessler et al 2009)을 매개하는 강력한 성장 인자 수용체이다. 이 연구는 전체 길이 MUC1이 종양 촉진 활성을 갖지 않는다는 것을 보여주었다. 또한, IHC 연구는 종양 단계가 증가할 때, 전체 길이 MUC1의 양이 감소함에 따라 MUC1*의 양이 증가함을 보여준다(도 54). 실제로, 유방암의 조직 마이크로어레이를 이용한 연구는 MUC1*에 대해 음성을 나타내는 단지 5%에 비해 유방암 표본의 거의 30%가 검출 가능한 전체 길이 MUC1을 갖지 않음을 보여준다(도 10 및 11). 전체 길이 MUC1을 표적화하는 치료제에 대해 고려해야 할 점은 전체 길이 MUC1을 발현하는 세포가 제거되면, 종양 집단이 더 높은 병독성을 가진 MUC1* 성장 인자 수용체를 발현하는 세포에 대해 단순히 농후화될 것이고, 이것이 암을 더 악화시킬 것이라는 점이다.

종종 음성 대조군으로서 사용될 정도로 낮은 수준으로 MUC1 및 MUC1*를 발현하는 MDA-MB-231을 제외하고 모두 MUC1* 양성을 나타내는 암 세포주의 패널에 결합하는 기준 항체 MNC2, 즉 "C2"의 능력을 FACS로 분석하였다(도 77a 내지 77n). MNC2로 프로빙된 암 세포의 패널은 T47D 및 1500 유방암 세포, NCI-H292 및 NCI-H1975 폐암 세포, SKOV-3 난소암 세포, HPAF-II 및 Capan-1 췌장암 세포, DU145 전립선암 세포, 및 거의 MUC1 및 MUC1* 음성을 나타내는 유방암 세포인 MDA-MB-231을 포함하였다. MNC2는 광범위한 암 세포주를 강하게 인식하였다. 본 발명자들은 MNC2가 HPAF-II 췌장 세포를 인식하였지만, 또 다른 췌장 세포주인 Capan-1을 인식하지 않았음을 주목한다. 유사하게, MNC2는 전립선암 세포주 DU145를 그다지 잘 인식하지 않았다. IHC 조직 연구에서, 본 발명자들은 MNC2가 상당한 종양 불균질성에도 불구하고 전립선암 조직의 약 57% 및 췌장 조직의 78%를 인식함을 발견하였다.

도 78a 내지 78c는 N-말단 및 C-말단 둘 다에서 연장되어 있거나 결실되어 있는 PSMGFR 서열의 색상 코딩된 개략도를 보여준다. 각각의 항체가 결합하는 에피토프 또는 각각의 항체가 결합하는 에피토프 내의 중요한 아미노산을 더 세밀히 구별하기 위해 이 펩티드 서브세트에 대해 본 발명의 항체를 시험하였다. 도 78a는 다양한 펩티드 서브세트의 정렬된 개략도이다. 도 78b는 각각의 색상 코딩된 서열에 결합하는 항체를 나열한다. 도 78c는 각각의 항체가 인식하는 암 세포주를 나열한다.

도 80 내지 87은 상이한 유형의 암 세포를 특이적으로 인식하는 능력에 대해 본 발명의 항체를 비교하는 FACS 분석의 그래프를 보여준다. 평균 형광 강도인 MFI뿐만 아니라 인식된 세포의 퍼센트도 측정하였다. 이 FACS 실험들만을 고려하면, 이 실험들은 PSMGFR 펩티드를 인식하는 항체만이 암 세포주를 인식할 수 있음을 보여준다. PSMGFR 서열의 외부에 있는 에피토프에 결합하는 항체는 이 암 세포주들을 특이적으로 인식하지 않는다.

진정한 암 특이성을 확인하기 위한 정상 조직 대 암 조직의 IHC 조직 연구

조직 마이크로어레이, 즉 “TMA"의 면역조직화학, 즉 IHC 조직 연구는 단일 암 세포주의 FACS 분석보다 항체의 암 특이성에 대한 더 엄격한 시험이다. 암 세포주는 수십 년 동안 실험실에서 증폭된, 단일 환자로부터의 단일 세포이다. 세포주는 인간 집단의 단면을 대표하지 않는다는 점에서 제한된다. 추가로, 수십 년 동안 시험관내에서 세포주를 배양한 후, 이 세포주는 더 이상 원래 세포처럼 보이지 않을 수 있다. 또한, 정상 세포주는 불멸 상태로 만들어져야 하기 때문에, 비교를 위한 실제 정상 세포주는 없다. 조직 연구는 각각의 조직 마이크로어레이가 다수의 기증자들로부터의 조직을 포함하고 세포가 비생리학적 조건 하에서의 수년간의 배양 없이 그의 천연 환경에 있기 때문에 더 많은 정보를 제공한다. 추가로, 조직은 종양 불균질성에 관한 정보뿐만 아니라 정상 발현 패턴에 관한 정보도 제공한다. 본 발명의 각각의 항체를 사용하여 정상 조직 마이크로어레이인 FDA 정상 어레이 MNO1021을 프로빙하였다. 또한, 상기 항체를 사용하여 암 조직 어레이의 패널도 프로빙하였다. 일부 경우, 정상 조직, 특히 심장 또는 폐와 같은 중요 장기의 강한 염색을 보인 항체는 정상 조직에 대한 그의 교차반응성으로 인해 항암 치료제로서 고려되지 않았기 때문에 제한된 수의 암 조직 어레이에 대해 시험되었다.

도 113 내지 200은 본 발명의 각각의 항체에 대한 정상 TMA 대 암 TMA의 IHC 염색의 사진을 보여준다.

도 113 내지 120은 항체 20A10으로 프로빙된 조직 연구의 사진을 보여준다. 20A10은 PSMGFR 펩티드에 결합하고 N-10 펩티드에 결합하지만, C-10 펩티드에는 결합하지 않는다는 점을 상기한다. 세밀히 구별된 에피토프 맵핑은 MNC2 및 MNE6처럼 20A10의 결합이 PSMGFR 펩티드에 존재하는 아미노산 FPFS에 의존함을 보여준다. 20A10은 MUC1* 세포외 도메인의 가장 막 근위 부분에 결합한다. FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 개요는 도 113에 제시되어 있다. 도 114a 내지 114x는 정상 조직에 대한 20A10의 교차반응성이 거의 내지 전혀 없음을 보여준다. 본 발명자들은 MNC2, MNE6 및 20A10 모두가 말단 유방관의 내강 가장자리, 나팔관의 내강 가장자리, 정상 신장의 원위 집합관의 약 10%의 내강 가장자리 및 요관의 내강 가장자리에서 발현되는 MUC1*와 반응함을 주목한다. 염색은 관 및 샘의 서브세트의 내강 가장자리로 엄격히 제한되기 때문에, 관 및 샘의 내부가 혈액에 의해 운반되는 큰 물질, 예컨대, 항체 또는 CAR T 세포로부터 보호되므로, 이 항체들은 치료제로서 안전한 것으로 간주된다. 중요한 것은 MNC2, MNE6 및 20A10이 심장, 폐 및 뇌와 같은 중요 장기의 염색을 보이지 않는다는 것이다. 극명하게 대조적으로, 20A10은 MNC2 및 MNE6처럼 암 조직에 강하게 결합한다. 20A10은 BR1141 유방암 어레이의 거의 모든 표본을 염색한다(도 115 및 116). 유방암 조직의 강력한 염색 이외에, 염색은 20A10이 효과적인 항체 기반 항암 치료제에 중요한 MUC1*의 세포외 부분을 인식함을 시사하는 막 염색이다. 20A10은 췌장암 조직(도 117 및 118) 및 식도암 조직(도 119 및 120)의 강력한 막 염색도 보여주었다. 요약하면, 20A10은 큰 암 특이성을 보여주고, 염색 위치와 강도의 관점에서 정상 조직과 암 조직의 염색 사이에 엄청난 차이 때문에 항암 치료제로서 큰 치료 윈도우를 제공한다.

항-MUC1* 항체 3C2B1은 MNC2, MNE6 및 20A10처럼 N-10에 결합하지만 C-10에는 결합하지 않는 항체이다. 더 세밀히 구별된 에피토프 맵핑은 이들 3개의 다른 고도 암 특이적 항체들처럼 3C2B1이 MUC1* 세포외 도메인 펩티드에 결합하기 위해 FPFS 서열을 필요로 함을 보여준다. 도 121은 FDA 정상 어레이 MNO1021의 사진을 보여준다. 도 122a 내지 122x는 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 3C2B1과 임의의 중요 정상 장기의 결합은 없다. 도 123은 1 내지 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진을 보여준다. 도 124는 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 125는 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진을 보여준다. 도 126a 내지 126f는 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 3C2B1로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 확대된 사진을 보여준다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 3C2B1은 유방암 조직을 강하게 염색한다.

항-MUC1* 항체 5C6F3은 N-10 펩티드에 결합하고 C-10 펩티드에 결합하지만, 결합은 다소 감소된다. 그의 동족 에피토프는 서열 SVSDV(서열번호 1751)의 전부 또는 일부를 포함한다. 도 127은 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021의 사진을 보여준다. 도 128은 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 FDA 정상 조직 어레이 MNO1021로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 129는 1 내지 20 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003의 사진을 보여준다. 도 130은 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 췌장암 조직 어레이 PA1003으로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도 131은 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141의 사진을 보여준다. 도 132는 1 ㎍/㎖의 항-PSMGFR 항체 5C6F3으로 염색된 유방암 조직 어레이 BR1141로부터의 특정 조직의 사진을 보여준다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 5C6F3은 큰 암 특이성을 갖고 부신을 제외한 정상 조직과의 결합을 보이지 않은 고친화성 항체이고, 이때 부신과의 결합은 그 조직의 인공물일 수 있다.

MUC1* 세포외 도메인의 가장 막 근위 부분에 결합하는 20A10과 대조적으로, 18B4는 PSMGFR 서열의 가장 원위 부분인 GTINVHDVET 서열 내에서 결합한다. 항체 MNC2, MNE6 또는 20A10과 달리, 18B4는 N-10 펩티드에 결합할 수 없지만 C-10 펩티드에는 결합한다. 도 133 및 134는 항체 18B4와 정상 조직의 결합을 보여준다. 20A10과 대조적으로, 항체 18B4는 폐(도 134k)를 포함하는 광범위한 정상 조직(도 134)과의 강한 결합을 보여준다. 도 135 내지 138은 유방암 조직 및 식도암 조직의 18B4 염색을 보여준다. 18B4와 정상 조직의 강한 결합 때문에, 이 항체의 암 특이성은 더 작다.

도 139 내지 144는 PSMGFR 항체 18G12와 정상 조직, 유방암 조직 및 식도암 조직의 결합을 보여준다. 18G12는 N-10 펩티드에 결합할 수 있으나, C-10 펩티드에도 결합할 수 있다. 18G12는 PSMGFR 펩티드 내의 ASRYNLT 에피토프에 결합한다. 항체 18G12는 정상 신장의 많은 집합관의 내강 가장자리에 결합하고(도 140d), 정상 심장근(도 140i)뿐만 아니라 정상 골격근(도 140x)에도 결합한다. 그러나, 18G12가 몇몇 정상 조직보다 암 조직에 훨씬 더 강하게 결합한다는 점에서 분명한 암 특이성이 있다. 또한, 18G12는 내강 가장자리 여기 또는 저기보다는 전체 암 조직을 염색한다. 도 141 내지 146은 유방암 조직, 췌장암 조직 및 식도암 조직의 18G12 염색을 보여준다. 정상 조직과 암 조직의 염색 사이의 대조는 암 특이성을 명확하게 입증한다.

도 147 및 148은 PSMGFR 항체 25E6과 정상 조직의 결합을 보여준다. 25E6은 N-10 펩티드에 결합할 수 있으나, C-10 펩티드에도 결합할 수 있다. 25E6은 PSMGFR 펩티드 내의 ASRYNLT 에피토프에 결합한다. MNC2, MNE6 및 20A10처럼 항체 25E6은 말단 유방관의 내강 가장자리, 나팔관의 내강 가장자리, 정상 신장의 원위 집합관의 서브세트의 내강 가장자리 및 요관의 내강 가장자리에 결합한다. MNC2, MNE6 및 20A10과 달리 25E6은 비록 매우 약하지만 정상 심장근(도 148i)뿐만 아니라 정상 골격근(도 148x)에도 결합한다. 그러나, 25E6이 몇몇 정상 조직보다 암 조직에 훨씬 더 강하게 결합한다는 점에서 분명한 암 특이성이 있다. 또한, 25E6은 내강 가장자리 여기 저기보다는 전체 암 조직을 염색한다. 도 149 내지 152는 유방암 조직 및 췌장암 조직의 25E6 염색을 보여준다. 정상 조직과 암 조직의 염색 사이의 대조는 암 특이성을 명확하게 입증한다.

도 153 내지 156은 PSMGFR 항체 28F9와 정상 조직 및 유방암 조직의 결합을 보여준다. 28F9는 N-10 펩티드에 결합할 수 있으나, C-10 펩티드에도 결합할 수 있다. 28F9는 PSMGFR 펩티드 내의 ASRYNLT 에피토프에 결합한다. MNC2, MNE6 및 20A10처럼 항체 25E6은 말단 유방관의 내강 가장자리, 나팔관의 내강 가장자리, 정상 신장의 원위 집합관의 서브세트의 내강 가장자리 및 요관의 내강 가장자리에 결합한다. 도 155 및 156은 유방암 조직의 28F9 염색을 보여준다.

도 157 및 158은 N+20/C-27 항체 1E4와 정상 조직의 결합을 보여준다. 1E4는 N-10 펩티드에 결합할 수 있으나, C-10 펩티드에도 결합할 수 있다. 1E4는 PSMGFR 서열 내에 있는 QFNQYKTEA 서열에 결합한다. 전체 정상 조직 마이크로어레이의 검사(도 157a)는 항체 1E4가 뇌, 소뇌, 모든 3개의 간 표본, 췌장, 부갑상선, 척수 및 골격근을 포함하는 많은 정상 조직에 결합함을 보여준다. 확대된 이미지는 1E4가 심장도 염색함을 보여준다(도 158i). 유방암 어레이의 1E4 염색(도 159 및 160)은 약간의 암 특이성이 있음을 보여준다.

도 161 및 162는 N+20/C-27 항체 29H1과 정상 조직의 결합을 보여준다. 29H1은 PSMGFR 서열의 가장 원위 부분인 GTINVHDVET 서열 내에서 결합한다. 항체 MNC2, MNE6 또는 20A10과 달리 29H1은 N-10 펩티드에 결합할 수 없지만 C-10 펩티드에는 결합한다. 전체 정상 조직 마이크로어레이의 검사(도 157a)는 항체 29H1이 0.5 ㎍/㎖만큼 낮은 농도에서도 뇌, 심장, 간 및 폐를 포함하는 광범위한 정상 조직을 강하게 염색함을 보여준다. 유방암 어레이의 29H1 염색(도 163 및 164) 및 췌장암 조직 어레이의 염색(도 165 및 166)은 암 특이성이 없음을 보여준다.

항체 31A1은 PSMGFR 서열의 가장 원위 부분인 GTINVHDVET(서열번호 1746) 서열 내에서 결합하는 N+20/C-27 항체라는 점에서 29H1과 유사하다. 항체 MNC2, MNE6 또는 20A10과 달리, 31A1 및 29H1 둘 다가 N-10 펩티드에 결합할 수 없으나 C-10 펩티드에는 결합한다. 전체 정상 조직 마이크로어레이의 검사 및 확대된 이미지(도 167 및 168)는 항체 31A1이 0.5 ㎍/㎖만큼 낮은 농도에서도 뇌, 심장, 폐, 비장, 골수 및 골격근을 비롯한 광범위한 정상 조직을 강하게 염색함을 보여준다. 31A1을 사용하여 유방암 어레이를 염색하였다(도 169 및 170). 31A1을 농도 범위에 걸쳐 사용하여 췌장암 조직 어레이를 염색하였다(도 171 및 172). 이 도면들은 31A1이 불충분한 암 특이성을 가짐을 보여준다.

항체 32C1은 PSMGFR 서열의 가장 원위 부분인 GTINVHDVET 서열 내에서 결합하는 N+20/C-27 항체라는 점에서 29H1 및 31A1과 유사하다. 항체 MNC2, MNE6 또는 20A10과 달리, 32C1, 31A1 또는 29H1 중 어느 항체도 N-10 펩티드에 결합할 수 없지만 모두 C-10 펩티드에는 결합한다. 전체 정상 조직 마이크로어레이의 검사 및 확대된 이미지(도 173 및 174)는 항체 32C1이 0.25 ㎍/㎖만큼 낮은 농도에서도 뇌, 심장, 폐, 간, 비장 및 골수를 비롯한 광범위한 정상 조직을 강하게 염색함을 보여준다. 또한, 32C1을 사용하여 유방암 어레이를 프로빙하였다(도 175 및 176). 32C1을 농도 범위에 걸쳐 사용하여 식도암 조직 어레이를 염색하였다(도 177 및 178). 종합하건대, 이 도면들은 32C1이 불충분한 암 특이성을 가짐을 보여준다.

항체 45C11은 N-말단에서 PSMGFR 서열 외부의 20개 아미노산인 에피토프 SNIKFRPGSVV(서열번호 1744)에 결합하는 N+20/C-27 항체이다. 45C11은 N-10 펩티드에 결합하지 않는다. 정상 조직 어레이 FDA MNO1021은 12.5 ㎍/㎖의 45C11로 염색되었다(도 179 및 180). 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 45C11은 뇌, 심장, 폐, 간, 비장, 골격근 및 골수를 포함하는 많은 정상 조직과의 강한 결합을 보여준다. 45C11을 농도 범위에 걸쳐 사용하여 유방암 조직 어레이를 염색하였다(도 181 및 182). 45C11을 사용하여 췌장암 조직 어레이도 염색하였다(도 183 및 184). 종합하건대, 이 도면들은 45C11이 암 특이성을 갖지 않음을 보여준다.

항체 3C5는 에피토프 GTINVHDVET에 결합하는 N+9/C-9 항체이다. 이 에피토프에 결합하는 다른 항체, 예컨대, 32C1, 29H1 및 31A1과 마찬가지로, 이 항체는 PSMGFR 서열의 가장 원위, 즉 가장 N-말단 부분에 결합한다. 항체 MNC2, MNE6 또는 20A10과 달리, 3C5, 32C1, 31A1 또는 29H1 중 어느 항체도 N-10 펩티드에 결합할 수 없으나, 모두 C-10 펩티드에는 결합한다. 3C5를 10 ㎍/㎖로 사용한 경우 전체 정상 조직 마이크로어레이의 검사 및 확대된 이미지(도 185 및 186)는 항체 3C5가 뇌, 심장, 부신 및 골수를 비롯한 일부 정상 조직을 강하게 염색함을 보여준다. 또한 3C5를 10 ㎍/㎖로 사용하여 췌장암 어레이를 프로빙하였다(도 187 및 188). 종합하건대, 이 도면들은 3C5가 암 특이성을 갖지 않음을 보여준다.

항체 8A9는 PSMGFR 서열의 외부에 있는 에피토프 VQLTLAFRE에 결합하는 N+9/C-9 항체이다. 항체 8A9는 N-10 펩티드에 결합할 수 없다. 정상 조직 어레이 FDA MNO1021은 8A9로 염색되었다(도 189 및 190). 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, PSMGFR 서열을 넘어 N-말단에 있는 에피토프에도 결합하는 항체 45C11처럼 항체 8A9는 부신, 뇌, 심장, 폐, 간, 비장, 골격근 및 골수를 포함하는 많은 정상 조직과의 강한 결합을 보여준다. 항체 8A9로 염색된 췌장암 어레이는 췌장암 조직의 서브세트와의 약한 결합을 보여주었다(도 191 및 192). 종합하건대, 이 도면들은 8A9가 암 특이성을 갖지 않음을 보여준다.

항체 17H6은 PSMGFR 서열의 외부에 있는 에피토프 VQLTLAFRE에 결합하는 N+9/C-9 항체이다. 17H6을 사용하여 정상 조직 어레이 MNO1021을 염색하였다. 전체 정상 조직 마이크로어레이의 검사 및 확대된 이미지(도 193 및 194)는 항체 17H6이 뇌, 심장, 부신, 골수 및 골격근을 비롯한 일부 정상 조직을 염색함을 보여준다. 17H6은 췌장암 어레이를 프로빙하는 데 사용되었고 대부분의 췌장암 조직과의 약한 결합을 보여주었다(도 195 및 196). 그러나, 17H6과 중요 장기의 여러 정상 조직의 결합은 17H6이 암 특이성을 거의 갖지 않음을 보여준다.

항체 39H5는 온전한 PSMGFR 펩티드에 약하게 결합하지만 서브세트 펩티드들 중 임의의 서브세트 펩티드에 유의미하게 결합하지 않는 N+9/C-9 항체이다. 39H5는 PSMGFR 서열의 가장 원위 부분인 GTINVHDVET에 결합할 수 있다. 전체 정상 조직 마이크로어레이의 검사 및 확대된 이미지(도 197 및 198)는 항체 39H5가 뇌, 심장, 간 및 골수를 포함하는 일부 정상 조직을 염색함을 보여준다. 39H5를 사용하여 췌장암 어레이를 프로빙하였다(도 199 및 200). 39H5가 우수한 퍼센트의 췌장암 표본을 염색하였지만, 39H5가 염색한 정상 조직을 고려할 때, 39H5는 암 특이성을 거의 갖지 않는다.

FACS 분석의 요약

세포주는 수십 년 전에 단일 환자의 종양으로부터 수득된 후 수십 년 동안 배양물에서 증식되었기 때문에, 세포주를 사용하여 항체의 암 특이성을 확인하는 것은 어렵다. 환자의 종양이 한 시점에서 불균질하였더라도, 수십 년의 시험관내 배양은 본질적으로 세포주를 단일 세포 클론으로 만든다. 본 발명의 항체가 MUC1 또는 MUC1* 양성 암 세포에 결합하나 MUC1 음성 세포에는 결합하지 않는지를 확인하기 위해 본 발명의 항체를 FACS로 어세이하였다. 이 실험의 결과는 도 76 내지 87에 제시되어 있다. 매우 분명한 것은 PSMGFR 서열의 외부에 N-말단 쪽으로 있는 MUC1 서열의 에피토프에 결합하는 항체가 암 특이성을 보이지 않는다는 것이다. 지금 평균 형광 강도(MFI)의 판독값을 참조하면, PSMGFR 서열의 바로 N-말단에서 동족 에피토프를 가진 항체, 예컨대, GTINVHDVET 내의 에피토프에 결합하는 항체는 더 많은 C-말단 에피토프를 인식하는 항체보다 훨씬 더 작은 암 특이성을 보여주는 것으로 보인다. 예를 들어, C-10 펩티드에 결합하지 않을 항체 MNC2는 거의 모든 MUC1* 양성 세포주에 강하게 결합한다(도 76 및 77). 그러나, 더 면밀한 검사는 MNC2가 NCI-H292보다 훨씬 더 강하게 폐암 세포주 NCI-H1975에 결합함을 보여준다. 유사하게, MNC2는 Capan-1 또는 전립선암 세포주 DU145보다 훨씬 더 잘 췌장 세포주 HPAF-II에 결합한다. PCR 측정은 절단 효소의 발현 수준이 암 세포주의 패널에 걸쳐 크게 다르다는 것을 보여준다(도 43 및 도 44). MUC1* 세포외 도메인의 접힘은 어느 절단 효소가 이 도메인을 절단하느냐에 따라 크게 달라질 수 있으며, 이것은 단일 항체가 인식하는 암 세포주들 사이의 차이를 설명할 가능성이 있다. 암 아형 내에서도 다양한 세포주의 항체 인식의 이 변경은 도면에서 명백하다.

IHC 데이터의 요약

정상 조직 및 암 조직을 둘 다를 포함하는 실제 조직의 IHC 분석은 FACS 분석에 필요한, 배양된 세포주의 연구보다 더 많은 정보를 제공한다. 각각의 항체를 먼저 농도 범위에 걸쳐 시험하여 최적 농도를 결정하였다. 간질도 염색될 때까지 항체 농도를 증가시켰는데, 이 간질 염색은 비특이적 배경 결합을 표시한다. 그 특정 항체에 대한 최적 농도는 항체가 간질을 염색하는 농도 바로 아래인 것으로 간주되었다.

IHC 조직 연구의 개요는 도 88 내지 112에 제시되어 있다. 여기서, 본 발명자들은 항체와 중요 장기 조직의 결합에 초점을 맞추었는데, 이는 특정 정상 조직과의 결합이 그 항체의 치료적 용도를 없앨 가능성이 높기 때문이다. 이 도면들에서, 항체들은 그들의 동족 에피토프에 따라 분류되었다. 조직 연구로부터 분명한 것은 에피토프가 세포막으로부터 멀수록 정상 조직의 정상 MUC1에 더 많이 결합한다는 것이다. 예를 들어, 특정 에피토프를 인식하는 대표적인 항체와 정상 심장 조직의 결합은 도 88a 내지 88l에 표시되어 있다. 도면이 보여주는 바와 같이, PSMGFR 펩티드의 N-말단 쪽에 있는 에피토프, 예컨대, SNIKFRPGSVV 또는 VQLTLAFRE 내의 에피토프에 결합하는 항체는 치료제로 사용될 수 없을 정도로 정상 심장과의 강한 결합을 보여준다. 또한, PSMGFR의 더 N-말단 부분에 결합하는 항체, 예컨대, 29H1도 정상 심장과의 결합을 보여준다. 정상 조직과 가장 약하게 결합하고 암 조직과 가장 강하게 결합하는 항체는 FPFS 또는 PFPFSAQSGA 내의 에피토프에 결합한다. ASRYNLT 부분 내의 에피토프에 결합하는 일부 항체도 치료제로서 적합할 수 있다. 이 항체들 및 동일한 에피토프를 인식하는 다른 항체는 정상 조직과의 낮은 결합 및 낮은 부작용 때문에 종양 세포를 효과적으로 사멸시키기에 충분히 높은 수준의 항체를 환자에게 투여할 수 있음을 의미하는 큰 치료 윈도우를 갖기 때문에 항암 치료제로서 바람직하다. 다른 중요 조직에 결합하거나 결합하지 않는 본 발명의 항체의 보다 상세한 사진도 제시되어 있다. 도 89 내지 94는 정상 심장 조직에 결합하는 각각의 항체의 확대된 사진을 보여주는 것으로, 이때 항체들은 그들이 결합하는 에피토프에 따라 범주화된다. 도 95 내지 100은 정상 간 조직에 결합하는 각각의 항체의 확대된 사진을 보여주는 것으로, 이때 항체들은 그들이 결합하는 에피토프에 따라 범주화된다. 도 101 내지 106은 정상 폐 조직에 결합하는 각각의 항체의 확대된 사진을 보여주는 것으로, 이때 항체들은 그들이 결합하는 에피토프에 따라 범주화된다. 도 107 내지 112는 정상 골수에 결합하는 각각의 항체의 확대된 사진을 보여주는 것으로, 이때 항체들은 그들이 결합하는 에피토프에 따라 범주화된다.

IHC 연구의 결과(도 88 내지 도 200)는 표 3에 요약되어 있다.

표에서 명확하게 알 수 있는 바와 같이, 항체가 결합하는 세포막으로부터 멀수록 비특이적 결합이 많다. 이 항체들은 PSMGFR 펩티드, N+20/C-27 펩티드 또는 C+9/C-9 펩티드를 사용한 면역화에 의해 생성되었지만, 연장된 펩티드를 사용한 면역화에 의해 생성된 일부 항체는 여전히 PSMGFR 서열 내에서 결합한다(각각의 항체에 대한 에피토프 결합의 세부사항에 대해서는 도 63 내지 69를 참조함). 정상 조직과의 일부 결합은 항체가 적절한 치료 포맷 내로 통합되는 경우 용인될 수 있다. 예를 들어, CAR T와 같은 세포 요법은 혈액에 의해 전달되며 관 및 샘의 내강 가장자리로의 세포의 접근을 제한하는 고유판 및 혈액-뇌 장벽을 포함하는 생리학적 장벽을 만난다. 암 조직에 훨씬 더 강하게 결합하나 정상 조직과의 일부 결합을 보이는 다른 항체도 국소적으로 투여되거나 암 특이성이 이중특이적 항체 내로의 통합에 의해 향상되는 경우 안전하고 유용한 치료제일 수 있다. 그러나, 많은 정상 장기 또는 물리적 장벽이 없는 필수 장기와의 광범위한 항체 결합은 환자에게 치명적일 수 있다.

정상 조직에 거의 내지 전혀 결합하지 않는 가장 암 특이적 항체는 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 및 25E6이다. 이상적인 항체 치료제는 정상 조직을 염색하지 않지만 암 세포를 강하게 염색하는 항체이다. 불행하게도, 암 항원은 정상 조직에서도 발현되므로, 정상 조직의 제로 염색은 불가능하다. 목표는 정상 조직보다 종양 조직에 훨씬 더 강하게 결합하고 중요하지 않은 정상 조직에 결합하거나 온전한 장기에서 생리학적으로 가능하지 않을 방식으로 정상 조직에 결합하는 항체를 식별하는 것이다. 예를 들어, CAR T 세포는 혈액에 의해 운반되고 고유층은 이 세포가 관 또는 샘의 내강 가장자리에 도달하는 데 있어서 장벽이다. 유사하게, 혈액 뇌 장벽은 항체와 같은 큰 분자가 혈액으로부터 뇌로 들어가는 것을 방지한다. 치료제로서 항체의 유용성은 치료제의 포맷에 의해서도 좌우된다. 언급된 바와 같이, 세포 기반 요법은 CAR T 세포가 일부 정상 조직에 도달하지 못하게 하는 천연 장벽을 가진다. 항체 약물 접합체(ADC) 기반 요법은 때때로 항체에 부착된 독소를 활성화시켜, 노출된 항체가 일부 정상 조직에 결합하는지 여부의 중요성을 최소화하기 위해 국소 암 특이적 분자에 의존한다. 또 다른 예에서, 항체 및 항체 기반 치료제는 정상 조직에 대한 그의 영향을 최소화하면서 종양 세포에 대한 영향을 최대화하기 위해 복강내를 비롯한 국소적으로 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 순전히 암 특이적이지 않은 항체는 분자의 제1 측면이 제1 암 항원에 결합하고 분자의 제2 측면이 조직 특이적 항원, 또 다른 암 특이적 항원 또는 심지어 T 세포와 같은 세포의 항원일 수 있는 제2 항원에 결합하는 이중특이적 항체 내로 통합되는 경우 더 큰 암 특이성을 갖게 될 수 있고, 이러한 이중특이적 항체는 이중특이적 T 세포 인게이저인 BiTES로서 지칭된다. 또 다른 예에서, 암 특이성이 더 작은 항체는 세포 기반 요법 내로 통합될 수 있고, 이때 그의 발현은 세포가 종양을 인식한 후에만 유도된다. 한 측면에서, CAR T 세포는 인식이 제2 항체의 발현을 유도하는 제1 항원을 인식하는 제1 CAR, 또는 제2 항체를 포함하는 CAR을 발현할 수 있다. 한 측면에서, 세포는 암 특이적 항체 단편에 의해 지향되는 CAR을 발현하고, 제2 항체 또는 제2 항체를 발현하는 CAR은 NFAT 유도성 시스템에서 발현되도록 유도된다. 한 측면에서, 제2 항체 또는 제2 CAR을 코딩하는 핵산은 NFAT 반응 요소의 다운스트림에 있다. NFAT 유도성 유전자는 Foxp3 인핸서 또는 프로모터에 삽입될 수 있다.

도 202는 각각 상이한 환자로부터의 췌장암 조직의 사진을 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 1E4의 염색 패턴은 18B4 및 다중클론 항체 SDIX의 염색 패턴과 매우 상이하다. 동일한 펩티드(PSMGFR)로 동물을 면역화하여 18B4 및 SDIX 항체를 생성한 한편, 상이한 펩티드(N+20)를 사용한 면역화로부터 1E4 항체를 생성하였다. 도 203 내지 207은 이 항체들 사이의 차이를 강조하기 위해 이 어레이로부터 선택된 조직의 확대된 이미지를 보여준다. 도 208은 둘 다 PSMGFR 펩티드를 사용한 면역화로부터 생성된 다중클론 항체 SDIX와 단일클론 항체 20A10의 염색을 비교한다. N+20 펩티드를 사용한 면역화에 의해 생성된 항체 29H1에 대한 염색 패턴의 차이도 표시되어 있다. 항체 염색은 더 연한지만, 항체 29H1은 SDIX 다중클론 또는 20A10보다 더 많은 췌장암 조직 표본을 인식한다. 도 209는 식도암이 연장된 N-말단을 가진 MUC1* 펩티드에 결합하는 항체, 예컨대, 항체 29H1 및 항체 31A1에 의해 더 잘 인식된다는 것을 보여준다. 유사하게, 도 210은 전립선암이 연장된 N-말단을 가진 MUC1* 펩티드에 결합하는 항체, 예컨대, 항체 29H1에 의해 더 잘 인식된다는 것을 보여준다.

아래 표 4는 다양한 단일클론 항체들의 암 특이성을 측정하기 시험 기준의 요약을 보여준다.

요약하면, 본 발명자들은 PSMGFR 서열의 N-말단 쪽에 있는 서열에 결합하는 항체가 암 특이성을 갖지 않음을 발견하였다. 추가로, 항체가 결합하는 세포막에 가까울수록, 항체의 암 특이성은 커진다. 더 중요한 것은 시험 기준 1 내지 4 또는 심지어 1 내지 5가 MUC1*의 암 특이적 형태에 대해 매우 선택적인 항체를 식별하기 위해 수백 또는 수천 개의 불순한 하이브리도마 클론 상청액에 대해 수행될 수 있는 한 세트의 빠른 다중체화된 저렴한 시험을 제공한다는 것이다.

시험 기준 충족

바람직한 실시양태에서, 표 4에 기재된 일곱(7)개 기준 중 네(4)개를 충족시키는 것을 기반으로 MUC1* 양성 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 표 4에 기재된 일곱(7)개 기준 중 다섯(5)개를 충족시키는 것을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 표 4에 기재된 일곱(7)개 기준 중 여섯(6)개를 충족시키는 것을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 표 4에 기재된 일곱(7)개 기준 모두를 충족시키는 것을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다. 표 4에 기재된 기준 중 4개 이상을 충족시킴으로써 MUC1* 양성 암에 대한 치료로서의 적합성으로 인해 선택된 항체는 부분적으로 또는 전체적으로 여러 치료 포맷 내로 통합될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 T 세포일 수 있는 면역 세포에서 발현되는 CAR 내로 통합된 다음, MUC1* 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자에게 투여된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, scFv일 수 있는 항체의 단편은 BiTE 내로 통합된 다음, MUC1* 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자에게 투여된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, scFv일 수 있는 항체의 단편은 이중특이적 항체 내로 통합된 다음, MUC1* 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자에게 투여된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 독소 또는 ADC, 즉 항체 약물 접합체에 접합된 후, MUC1* 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자에게 투여된다.

N-10에 결합한다.

본 발명자들은 탠덤 반복부를 결여하고 PSMGFR 서열의 45개 아미노산의 세포외 도메인을 가진 MUC1 막횡단 단백질이 성장 인자 수용체로서 작용하기에 충분하고 발암 특성을 세포에 부여함을 입증하였다(Mahanta et al 2008). PSMGFR 펩티드 또는 막횡단 MUC1 절단 생성물의 일부에 결합하는 항체는 암 특이적일 수 있지만 줄기 또는 전구체 세포에도 결합할 수 있다. N-10 펩티드에 결합하는 항체는 더 암 특이적이다. 바람직한 실시양태에서, N-10 펩티드에 결합하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

C-10에 결합하지 않는다.

본 발명자들은 MUC1 세포외 도메인이 대안적 스플라이스 변이체 또는 세포외 도메인의 절단과 방출의 결과로서 일어날 수 있는 탠덤 반복부 도메인의 누락이 있는 경우에만 노출되는 이소성 결합 부위를 함유함을 입증하였다. 암 특이적 항체 MNC2 및 MNE6은 전체 길이 MUC1에 결합하지 않을 것이나, MUC1이 절단되고 탠덤 반복부 도메인이 떨어져 나갈 때 남은 부분에 결합한다. MNC2 및 MNE6은 탠덤 반복부가 없는 경우, 예를 들어, MUC1 음성 세포가 탠덤 반복부를 결여하는 조작된 MUC1로 형질감염되거나 형질도입되는 경우, 특히 세포외 도메인이 PSMGFR을 포함하는 경우 MUC1* 유사 단백질에 결합할 것이다. 따라서, MNC2 및 MNE6이 결합하는 이소성 부위는 탠덤 반복부 도메인이 누락되거나 제거될 때 노출된다. MNC2 및 MNE6 둘 다가 결합을 위해 MUC1* 세포외 도메인의 10개 막 근위 아미노산을 요구하고; 이들은 C-10 펩티드에 결합하지 않는다. 이것은 MNC2 및 MNE6에 대한 이소성 결합 부위가 PSMGFR의 10개 C-말단 아미노산인 PFPFSAQSGA의 전부 또는 일부 내에 있거나 이를 함유한다는 것을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 항체가 C-10 펩티드에 결합할 수 없음을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다. 바람직한 실시양태에서, 항체가 N-10 펩티드에 결합할 수 있고 항체가 C-10 펩티드에 결합할 수 없음을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

MUC1* 양성 세포, PSMGFR 펩티드 또는 N-10 펩티드에 결합하기 위해 NME7 _AB 또는 NME7-X1과 경쟁한다.

본 발명자들은 암 특이적 항체 MNC2 및 MNE6이 PSMGFR 펩티드 10개 C-말단 아미노산인 PFPFSAQSGA의 전부 또는 일부를 포함하는 이소성 에피토프에 결합함을 입증하였다. 본 발명자들은 성장 인자인 이량체 NME1 및 NME7_AB도 PSMGFR 펩티드의 10개 C-말단 아미노산의 전부 또는 일부를 포함하는 이소성 에피토프에 결합함을 보여주었다. MNC2 및 MNE6은 PSMGFR 펩티드 및 N-10 펩티드에 결합하기 위해 이량체 NME1 또는 NME7_AB와 경쟁한다. 바람직한 실시양태에서, NME1, NME7_AB 또는 NME7-X1과 PSMGFR 펩티드, N-10 펩티드 또는 MUC1* 양성 암 세포의 표면의 결합을 파괴하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

선형 에피토프보다는 입체구조적 에피토프를 인식한다.

탠덤 반복부를 결여하는 MUC1에 결합하는 능력 및 전체 길이 MUC1에 결합할 수 없음을 기반으로 암 특이적 항체를 선택할 것이다. 가장 흔하게는, MUC1*는 MUC1이 절단 효소에 의해 절단되고 탠덤 반복부 도메인이 세포 표면으로부터 방출될 때 생성된다. 탠덤 반복부 도메인의 절단 및 방출은 정상 조직에 존재하는 MUC1* 유사 절단 생성물의 일부를 노출시킬 수도 있다. 그러나, 선형 에피토프보다는 입체구조를 인식하는 항체가 더 선택적이다. 선형 에피토프보다는 입체구조적 에피토프를 인식하는 항체는 다양한 수단에 의해 식별될 수 있다. 특히, 입체구조적 에피토프를 인식하는 항체는 변성 웨스턴 블롯 어세이에서 작동하지 않을 것이다. 바람직한 실시양태에서, 입체구조적 에피토프를 인식하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

MMP9 또는 다른 종양 관련 절단 효소에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1*를 인식한다.

MUC1* 절두된 세포외 도메인의 접힘 또는 입체구조는 어느 효소가 MUC1을 절단하는지에 따라 상이하다. 절단된 MUC1* 또는 MUC1* 유사 절단 생성물은 정상 건강한 조직에서 성장 인자 수용체로서 작용할 수 있다. 하나 초과의 절단 효소가 MUC1을 MUC1* 유사 형태로 절단할 수 있다. 제1 효소에 의한 절단은 제2 효소에 의한 절단에 의해 생성된 입체구조 또는 접힘과 동일하지 않은 입체구조 또는 접힘을 생성할 수 있다. 이에 대한 뒷받침은 본원에서 발견될 수 있으며 도 39 내지 41에 예시되어 있다. 이 도면들은 PSMGFR에 결합하는 다중클론 항체가 조혈 줄기 세포에서 절단된 MUC1을 인식하지만, PSMGFR 펩티드에 결합하는 일부 단일클론 항체가 조혈 줄기 세포에서 이 MUC1* 유사 형태에 결합할 수 있는 반면, 다른 항체는 결합할 수 없음을 보여준다. 예를 들어, MNC3은 조혈 줄기 세포에서 MUC1의 절단된 형태를 쉽게 인식하나, MNC2 및 MNE6은 인식하지 않는다. 본 발명자들은 MNC2 및 MNE6이 MMP9에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1*를 인식하지만, MUC1*가 MMP2에 의해 절단된 때에는 인식하지 않는다는 것을 알고 있다. MNC2 및 MNE6은 암 특이적인 반면, MNC3은 줄기 세포 및 전구체 세포를 인식하기 때문에 암 특이적이지 않다. 본 발명자들은 MMP9가 암에서 과다발현된다는 것도 알고 있다. 조혈 줄기 세포가 만들어지는 골수는 MMP9보다 거의 2,500배 더 많은 MMP2를 발현한다(도 65). MMP14는 MUC1을 MUC1* 성장 인자 수용체 형태로 절단하는 또 다른 효소이다(도 38). 본 발명의 한 측면에서, MUC1이 MMP14에 의해 절단될 때 생성된 MUC1 절단 생성물을 인식하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다. 바람직한 실시양태에서, MUC1이 MMP9에 의해 절단될 때 생성된 MUC1 절단 생성물을 인식하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다. 바람직한 실시양태에서, MUC1이 MMP9에 의해 절단될 때 생성된 MUC1 절단 생성물을 인식하고 또한 입체구조적 에피토프를 인식하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

정상 세포보다 암 세포에 더 많이 결합한다.

암 특이적 항체를 식별하는 전통적인 접근법은 상이한 암 세포주들의 패널에 대해 항체의 패널을 시험하는 단계, 및 FACS, IF, 면역침전 또는 다른 방법으로 항체가 암 세포에 결합하는지를 확인하는 단계를 포함한다. 이 접근법은 전통적이지만, 순차적이고 시간이 소모적이므로, 암 치료 또는 진단에 적합한 이상적인 항체를 찾는 데 필요한, 많은 수의 단일클론 항체 클론들의 분석을 제한한다. 또한, 실제 정상 세포주가 없으며 정상 일차 세포의 선택이 제한된다. 앞서 제시된 선택 기준은 MUC1* 양성 암에 특이적인 단일클론 항체 클론을 식별하는 빠른 다중체화된 방법을 제공한다. 많은 선택 기준에 대해, 하이브리도마 상청액을 사용할 수 있다. 이것은 MUC1* 양성 암에 특이적인 항체를 식별하는 최신기술 방법에 비해 엄청난 이점을 제공한다. 불순한 하이브리도마 상청액을 사용함으로써 수행된 어세이로부터 항체를 선택하는 능력은 수백 또는 수천 개의 클론에 대해 많은 선택을 신속히 매우 적은 비용으로 수행할 수 있음을 의미한다. FACS 분석 및 IHC 조직 연구와 같은 방법은 시험될 수 있는 클론의 수를 수백도 아닌 수십으로 제한하는, 정제된 항체의 사용을 요구한다.

그러나, 암 세포, 또는 암 세포 유형 또는 특정 항원을 발현하도록 조작된 세포에 결합하는 능력을 기반으로 항체를 선택하는 것은 항체 선택에 중요하다. 바람직한 실시양태에서, MUC1* 양성 암 세포에 결합하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

정상 조직보다 종양 조직에 더 많이 결합한다.

암 조직 대 정상 조직의 면역조직화학, 즉 IHC 조직 연구는 FACS 분석보다 항체의 암 특이성의 더 엄격한 시험이다. 암 세포주는 수십 년 동안 실험실에서 증폭된, 단일 환자로부터의 단일 세포이고 인간 집단의 단면을 대표하지 않는다. 또한, 세포주의 분석은 실제 종양의 불균질성을 보지 못한다. 조직 연구는 정제된 항체를 요구하고 매우 비싸고 시간 소모적이며 각각의 염색된 조직 표본을 분석하기 위해 숙련된 병리학자를 요구한다. 그러나, 정상 조직 대 암 조직으로부터의 조직의 항체 염색은 어느 항체가 정상 조직과의 교차반응성 때문에 치료제 또는 진단제로서 사용될 수 없는지를 보여줄 수 있다. 여러 암 아형 전체에 걸쳐 수천 개의 인간 정상 조직 또는 암 조직을 사용한 수많은 항체의 본 발명자들의 체계적인 연구는 N-10에 결합하고 C-10에 결합하지 않고 NME1 또는 NME7_AB, 또는 NME7-X1과 PSMGFR 펩티드, N-10 펩티드 또는 MUC1* 양성 암 세포의 표면의 결합을 파괴하고, 입체구조적 에피토프를 인식하고, MMP9에 의한 절단에 의해 생성된 입체구조적 에피토프를 인식하는 항체가 가장 암 특이적임을 보여주었다.

바람직한 실시양태에서, 정상 조직에 결합하는 것보다 적어도 2배 더 많이 MUC1* 양성 종양 조직에 결합하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다. 바람직한 실시양태에서, 정상 조직에 결합하는 것보다 적어도 5배 더 많이 MUC1* 양성 종양 조직에 결합하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다. 바람직한 실시양태에서, 정상 조직에 결합하는 것보다 적어도 10배 더 많이 MUC1* 양성 종양 조직에 결합하는 항체의 능력을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

세밀히 구별된 에피토프에 결합하는 항체

바람직한 실시양태에서, 서열 QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA를 포함하는 펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 MUC1* 양성 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항암 치료제 또는 진단제 내로 통합된다.

보다 바람직한 실시양태에서, 서열 ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA를 포함하는 펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 MUC1* 양성 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항암 치료제 또는 진단제 내로 통합된다.

보다 더 바람직한 실시양태에서, 서열 SDVSVSDVPFPFSAQSGA를 포함하는 펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 MUC1* 양성 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항암 치료제 또는 진단제 내로 통합된다.

보다 더 바람직한 실시양태에서, 서열 SVSDV를 포함하는 펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 MUC1* 양성 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항암 치료제 또는 진단제 내로 통합된다.

훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 서열 PFPFSAQSGA의 일부 또는 전부를 포함하는 펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 MUC1* 양성 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항암 치료제 또는 진단제 내로 통합된다. 항암 치료로서, 선택된 항체 또는 이의 단편은 CAR, BiTE, ADC 또는 이중특이적 항체 내로 통합된 다음, MUC1* 양성 암으로 진단받거나 이러한 암을 발생시킬 위험이 있는 환자에게 투여된다.

컨센서스 서열

본 발명의 항체는 동족 에피토프에 따라 범주화되었다. 이들 각각의 중쇄 CDR의 서열은 표 5에 제시되어 있다. 이들 각각의 경쇄 CDR의 서열은 표 6에 제시되어 있다. 각각의 에피토프 특이적 항체 세트에 대한 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 컨센서스 서열을 컴퓨터로 생성하였다. 도 215 및 도 216은 항체의 동족 에피토프의 위치가 PSMGFR의 막 근위 부분으로부터 더 원위 부분으로 이동할 때 CDR 컨센서스 서열이 어떻게 변화하는지를 보여준다.

표 5 및 표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, PSMGFR 펩티드의 10 막 근위(C-말단) 부분 내의 에피토프에 결합하는 항체에 대한 CDR1 및 CDR2의 서열은 컨센서스 서열에 밀접하게 부합한다.

MNC2에 대한 중쇄 CDR1은 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 9까지 넘버링된 FTFSGYAMS인 반면, PSMGFR의 그 부분에 결합하는 다른 항체의 컨센서스는 다음과 같다: 위치 1에서 F 또는 I, 위치 2에서 T, 위치 3에서 F, 위치 4에서 S, 위치 5에서 T, G 또는 R, 위치 6에서 Y, 위치 7에서 A, G 또는 T, 위치 8에서 M, 및 위치 9에서 S.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR1과 적어도 90% 동일한 중쇄 CDR1을 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 1에서 F 또는 I, 위치 2에서 T, 위치 3에서 F, 위치 4에서 S, 위치 5에서 T, G 또는 R, 위치 6에서 Y, 위치 7에서 A, G 또는 T, 위치 8에서 M, 및 위치 9에서 S.

MNC2에 대한 중쇄 CDR2는 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 17까지 넘버링된 TISSGGTYIYYPDSVKG인 반면, PSMGFR의 그 부분에 결합하는 다른 항체의 컨센서스는 다음과 같다: 위치 1에서 T, 위치 2에서 I 또는 S, 위치 3에서 I 또는 S, 위치 5에서 G 또는 R, 위치 6에서 G 또는 A, 위치 9에서 T 또는 I, 위치 10에서 Y, 위치 11에서 Y, 위치 12에서 P 또는 S, 및 위치 13 내지 17에서 DSVKG.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR2와 적어도 90% 동일한 중쇄 CDR2를 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 1에서 T, 위치 2에서 I 또는 S, 위치 3에서 I 또는 S, 위치 5에서 G 또는 R, 위치 6에서 G 또는 A, 위치 9에서 T 또는 I, 위치 10에서 Y, 위치 11에서 Y, 위치 12에서 P 또는 S, 및 위치 13 내지 17에서 DSVKG.

MNC2에 대한 중쇄 CDR3은 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 15까지 넘버링된 -LGGDNYYEYFDV--인 반면, PSMGFR의 그 부분에 결합하는 다른 항체의 컨센서스는 위치 2에서 G, L 또는 N, 위치 4에서 G 또는 T, 위치 7에서 Y, 위치 12에서 D 또는 E, 위치 14에서 A, 및 위치 15에서 Y.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR3과 적어도 90% 동일한 중쇄 CDR3을 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 2에서 G, L 또는 N, 위치 4에서 G 또는 T, 위치 7에서 Y, 위치 12에서 D 또는 E, 위치 14에서 A, 및 위치 15에서 Y.

MNC2에 대한 경쇄 CDR1은 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 17까지 넘버링된 RASKS--VSTSGYSYMH인 반면, PSMGFR의 그 부분에 결합하는 다른 항체의 컨센서스는 다음과 같다: 위치 1에서 K 또는 R, 위치 2에서 A 또는 S, 위치 3에서 S, 위치 4에서 K 또는 Q, 위치 5에서 S, 위치 6에서 V, 위치 7에서 L, 위치 10에서 T 또는 S, 위치 15에서 Y, 및 위치 16에서 I, L 또는 M.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR1과 적어도 90% 동일한 경쇄 CDR1을 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 1에서 K 또는 R, 위치 2에서 A 또는 S, 위치 3에서 S, 위치 4에서 K 또는 Q, 위치 5에서 S, 위치 6에서 L 또는 V, 위치 7에서 L, 위치 10에서 T 또는 S, 위치 15에서 Y, 및 위치 16에서 I, L 또는 M.

MNC2에 대한 경쇄 CDR2는 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 7까지 넘버링된 LASNLES인 반면, PSMGFR의 그 부분에 결합하는 다른 항체의 컨센서스는 다음과 같다: 위치 1에서 L 또는 W, 또는 S, 위치 2에서 A 또는 T, 위치 3에서 S, 위치 4에서 N 또는 T, 위치 5에서 L 또는 R, 위치 6에서 E 또는 A, 및 위치 7에서 S.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR2와 적어도 90% 동일한 경쇄 CDR2를 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 1에서 L 또는 W, 또는 S, 위치 2에서 A 또는 T, 위치 3에서 S, 위치 4에서 N 또는 T, 위치 5에서 L 또는 R, 위치 6에서 E 또는 A, 및 위치 7에서 S.

MNC2에 대한 경쇄 CDR3은 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 9까지 넘버링된 QHSRELPF인 반면, PSMGFR의 그 부분에 결합하는 다른 항체의 컨센서스는 다음과 같다: 위치 1에서 Q, 위치 2에서 H 또는 Q, S, 위치 3에서 S, Q 또는 R, 위치 4에서 R, S 또는 Y, 위치 5에서 E, L 또는 S, 위치 6에서 L 또는 S, 위치 7에서 P 또는 S, 위치 8에서 F 또는 L, 및 위치 9에서 T.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR3과 적어도 90% 동일한 경쇄 CDR3을 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 1에서 Q, 위치 2에서 H 또는 Q, 위치 3에서 S, Q 또는 R, 위치 4에서 R, S 또는 Y, 위치 5에서 E, L 또는 S, 위치 6에서 L 또는 S, 위치 7에서 P 또는 S, 위치 8에서 F 또는 L, 및 위치 9에서 T.

또 다른 항체 세트를 생성하였고 생성된 클론을 PSMGFR, N-10 및 C-10 펩티드에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. PSMGFR 및 N-10 펩티드에 결합하지만 C-10 펩티드에는 결합하지 않는 항체 클론을 선택하였다. 이 항체를 시퀀싱하였다. 표 7은 암 특이적 항체 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1와 신규 항체 B2, B7, 8C7F3, H11 및 B9에 대한 중쇄 CDR의 서열을 보여준다. 표 8은 암 특이적 항체 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1과 신규 항체 B2, B7, 8C7F3, H11 및 B9에 대한 경쇄 CDR의 서열을 보여준다. 중쇄 및 경쇄 CRD에 대한 컨센서스 서열을 생성하였고 표 7 및 표 8에 표시한다. 항체 5C6F3 및 25E6이 IHC 조직 연구에서 큰 암 특이성을 보였고 이들 둘 다가 PSMGFR 및 N-10 펩티드에 결합하되, C-10 펩티드에는 결합하지 않았지만, 에피토프 맵핑은 이들이 MNC2, MNE6, 20A10 및 3C2B1에 의해 결합되는 에피토프로부터 약간 N-말단 쪽에 있는 에피토프에 결합함을 보여주었다. 이러한 이유로, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 및 신규 항체에 대한 컨센서스 서열을 생성하였고, N-10에 결합하지만 C-10에는 결합하지 않는 모든 항체들에 대한 컨센서스 서열도 생성하였다.

표 7 및 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이, PSMGFR 펩티드의 10개 막 근위(C-말단) 아미노산에 결합하기 위해 필요로 하는, 항체에 대한 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열은 공통 컨센서스 서열에 밀접하게 부합한다.

MNC2에 대한 중쇄 CDR1은 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 9까지 넘버링된 FTFSGYAMS인 반면, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 및 신규 항체 B2, B7, 8C7F3, H11 및 B9의 컨센서스 서열은 다음과 같다: 위치 1에서 F 또는 I, 위치 2에서 T 또는 A, 위치 3에서 F, 위치 4에서 S, 위치 5에서 T, G 또는 R, 위치 6에서 Y 또는 F, 위치 7에서 A, G 또는 T, 위치 8에서 M 및 위치 9에서 S. 밑줄친 아미노산은 암 특이적 항체 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 단독에 대해 생성된 컨센서스 서열에 대한 유일한 추가 변이체이다.

표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 컨센서스 서열의 생성 내로의 항체 5C6F3 및 25E6의 포함은 암 특이적 항-MUC1* 항체를 기술하는 중쇄 CDR1에 대한 컨센서스 서열을 어떠한 방식으로든 변경하지 않았다.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR1과 적어도 90% 동일한 중쇄 CDR1을 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 1에서 F 또는 I, 위치 2에서 T 또는 A, 위치 3에서 F, 위치 4에서 S, 위치 5에서 T, G 또는 R, 위치 6에서 Y 또는 F, 위치 7에서 A, G 또는 T, 위치 8에서 M 및 위치 9에서 S.

MNC2에 대한 중쇄 CDR2는 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 17까지 넘버링된 TISSGGTYIYYPDSVKG인 반면, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 및 신규 항체 B2, B7, 8C7F3, H11 및 B9의 컨센서스 서열은 다음과 같다: 위치 1에서 T 또는 A, 위치 2에서 I 또는 S, 위치 3에서 I 또는 S, 위치 4에서 N, S, T 또는 G, 위치 5에서 G 또는 R, 위치 6에서 G 또는 A, 위치 7에서 G, T 또는 D, 위치 8에서 Y, K 또는 S, 위치 9에서 T 또는 I, 위치 10에서 Y, 위치 11에서 Y, 위치 12에서 P 또는 S, 위치 13에서 D, 위치 14에서 S 또는 T, 위치 15에서 V 또는 L, 및 위치 16 및 17에서 KG. 밑줄친 아미노산은 이 보다 포괄적인 컨센서스 서열이 MNC2, MNE6, 20A10 및 3C2B1 단독에 대해 생성된 컨센서스 서열과 어떻게 상이한지를 표시한다. 9개의 항체 모두에 대한 컨센서스 서열은 중쇄 CDR2의 17개 아미노산 중 단지 4개의 아미노산에 의해 4개의 원래 암 특이적 항체에 대한 컨센서스 서열과 상이하다. 4개의 변이체 중 2개는 일반적으로 단백질의 구조 또는 특이성에 유의미한 영향을 미치지 않는 상동 변경, 즉 S 대신 T 및 V 대신 L임을 주목한다.

표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 중쇄 CDR2에 대한 컨센서스 서열의 생성 내로의 항체 5C6F3 및 25E6의 포함은 2개의 다른 가능한 아미노산을 추가함으로써 컨센서스 서열만을 변경시켰다: 암 특이적 항-MUC1* 항체를 기술하는 중쇄 CDR2의 경우 위치 8에서 가능한 H, 및 위치 10에서 가능한 F. 본 발명자들은 위치 10에서 Y를 F로 변경시키는 것이 일반적으로 단백질의 구조 또는 특이성에 유의미한 영향을 미치지 않는 상동 변경임을 주목한다.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR2와 적어도 90% 동일한 중쇄 CDR2를 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 1에서 T 또는 A, 위치 2에서 I 또는 S, 위치 3에서 I 또는 S, 위치 4에서 N, S, T 또는 G, 위치 5에서 G 또는 R, 위치 6에서 G 또는 A, 위치 7에서 G, T 또는 D, 위치 8에서 Y, K, H 또는 S, 위치 9에서 T 또는 I, 위치 10에서 Y 또는 F, 위치 11에서 Y, 위치 12에서 P 또는 S, 위치 13에서 D, 위치 14에서 S 또는 T, 위치 15에서 V 또는 L, 및 위치 16 및 17에서 KG.

MNC2에 대한 중쇄 CDR3은 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 2부터 13까지 넘버링된 LGGDNYYEYFDV인 반면, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 및 신규 항체 B2, B7, 8C7F3, H11 및 B9의 컨센서스 서열은 다음과 같다: 위치 2에서 G, L 또는 N, 위치 3에서 G, T 또는 Y, 위치 4에서 G 또는 T, 위치 5에서 A, D, P, R 또는 S, 위치 6에서 Y, M, I 또는 S, 위치 7에서 Y, 위치 8에서 D, Y 또는 N, 위치 9에서 E, D, Y, L 또는 H, 위치 10에서 Y, A 또는 G, 위치 11에서 M, D 또는 F, 위치 12에서 D 또는 E, 위치 13에서 V, F, Y 또는 L, 및 위치 14 및 15에서 AY. 밑줄친 아미노산은 이 보다 포괄적인 컨센서스 서열이 MNC2, MNE6, 20A10 및 3C2B1 단독에 대해 생성된 컨센서스 서열과 어떻게 상이한지를 표시한다. 9개의 항체 모두에 대한 컨센서스 서열은 중쇄 CDR3의 15개 아미노산 중 7개의 아미노산에 의해 4개의 원래 암 특이적 항체에 대한 컨센서스 서열과 상이하고, 이때 7개의 치환 중 3개가 위치 6에 있다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 위치 6의 아미노산이 항체의 특이성을 변경하지 않으면서 변경될 수 있다는 결론을 내렸다.

항체 5C6F3 및 25E6을 포함시켜 생성된 컨센서스 서열을 분석한 결과는 어느 아미노산이 모든 11개의 항체 사이에 보존되어 있는지를 강조하였다. 이러한 이유로, 중쇄 CDR3에 대한 본 발명자들의 바람직한 컨센서스 서열은 위치 2, 3, 4, 7, 10, 11, 12, 14 및 15에서 아미노산을 정의하며, 이때 11개의 항체의 경우 이 위치들에서 3개 이하의 변이체가 있었다.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR3과 적어도 90% 동일한 중쇄 CDR3을 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 2에서 G, L 또는 N, 위치 3에서 G, T 또는 Y, 위치 4에서 G 또는 T, 위치 7에서 Y, 위치 10에서 Y, A 또는 G, 위치 11에서 M, D 또는 F, 위치 12에서 D 또는 E, 및 위치 14 및 15에서 AY.

MNC2에 대한 경쇄 CDR1은 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 17까지 넘버링된 RASKS--VSTSGYSYMH인 반면, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 및 신규 항체 B2, B7, 8C7F3, H11 및 B9의 컨센서스 서열은 다음과 같다: 위치 1에서 K 또는 R, 위치 2에서 A 또는 S, 위치 3에서 S 또는 R, 위치 4에서 K, Q 또는 A, 위치 5에서 S, N 또는 T, 위치 6에서 V, I, E 또는 K, 위치 7에서 L, V 또는 S, 위치 8에서 S, Y, I 또는 V, 위치 9에서 A, S 또는 H, 위치 10에서 T 또는 S, 위치 11에서 N, S 또는 Y, 위치 12에서 G, S, D 또는 Q, 위치 13에서 V, Y, K 또는 N, 위치 14에서 N, S 또는 T, 위치 15에서 Y 또는 F, 및 위치 16에서 I, L 또는 M, 및 위치 17에서 H, A, E 또는 Q. 밑줄친 아미노산은 이 보다 포괄적인 컨센서스 서열이 MNC2, MNE6, 20A10 및 3C2B1 단독에 대해 생성된 컨센서스 서열과 어떻게 상이한지를 표시한다. 9개의 항체 모두에 대한 컨센서스 서열은 경쇄 CDR1의 17개 아미노산 중 13개의 아미노산에 의해 4개의 원래 암 특이적 항체에 대한 컨센서스 서열과 상이하다. 13개 중 4개는 일반적으로 단백질의 구조 또는 특이성을 유의미하게 변경하지 않는 상동 치환이다. 남은 9개의 치환 중에서, 1개는 위치 4에 있고, 1개는 위치 5에 있고, 3개는 위치 6에 있고, 1개는 위치 7에 있고, 1개는 위치 11에 있고, 2개는 위치 17에 있다. 5개의 신규 항체의 포함은 위치 1, 2, 3, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 또는 16에서 상동 치환을 제외하고 아미노산을 변경하지 않았다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 MUC1* 암 특이적 항체를 정의하는 경쇄 CDR1에 대한 보존된 컨센서스 서열이 위치 1, 2, 3, 8, 10, 12, 13, 14, 15 및 16에 대해 상기 제공된 아미노산을 포함한다는 결론을 내렸다.

5C6F3 및 25E6을 포함하는 모든 항체들을 사용하여 생성된 컨센서스 서열을 분석한 결과는 경쇄 CDR1에 대한 컨센서스 서열이 다음과 같은 아미노산 치환에 의해 더 변경되었음을 보여준다: 위치 6에서 L; 위치 9에서 D; 위치 11에서 D 및 위치 17에서 N. 본 발명자들은 이 치환들 중 어느 치환도 4개의 원래 암 특이적 항체와 5개의 신규 항체에서 변경되지 않은 위치에 있지 않았음을 주목한다. 따라서, 본 발명자들은 암 특이적 항체의 적어도 90% 동일성을 정의하는 경쇄 CDR1에 대한 보존된 컨센서스 서열이 위치 1, 2, 3, 8, 10, 12, 13, 14, 15 및 16에서 상기 정의된 아미노산을 포함한다는 결론을 내렸다.

바람직한 실시양태에서, 위치 1에서 K 또는 R, 위치 2에서 A 또는 S, 위치 3에서 S 또는 R, 위치 8에서 S, Y, I 또는 V, 위치 10에서 T 또는 S, 위치 12에서 G, S, D 또는 Q, 위치 13에서 V, Y, K 또는 N, 위치 14에서 N, S 또는 T, 위치 15에서 Y 또는 F, 및 위치 16에서 I, L 또는 M을 포함하는 CDR1과 적어도 90% 동일한 경쇄 CDR1을 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

MNC2에 대한 경쇄 CDR2는 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 7까지 넘버링된 LASNLES인 반면, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 및 신규 항체 B2, B7, 8C7F3, H11 및 B9의 컨센서스 서열은 다음과 같다: 위치 1에서 L, W, S, T 또는 K, 위치 2에서 A, T 또는 V, 위치 3에서 S, 위치 4에서 N 또는 T, 위치 5에서 L 또는 R, 위치 6에서 E, A, F 또는 D, 및 위치 7에서 S. 밑줄친 아미노산은 이 보다 포괄적인 컨센서스 서열이 MNC2, MNE6, 20A10 및 3C2B1 단독에 대해 생성된 컨센서스 서열과 어떻게 상이한지를 표시한다.

바람직한 실시양태에서, 특정된 위치에서 하기 아미노산을 포함하는 CDR2와 적어도 90% 동일한 경쇄 CDR2를 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다: 위치 1에서 L, W, S, T 또는 K, 위치 2에서 A, T 또는 V, 위치 3에서 S, 위치 4에서 N 또는 T, 위치 5에서 L 또는 R, 위치 6에서 E, A, F 또는 D, 및 위치 7에서 S. 5개의 신규 항체의 포함은 7개의 위치 중 5개의 위치에서 치환을 도입하였고 이 치환 중 2개만이 상동 치환이 아니었다.

5C6F3 및 25E6을 포함하는 모든 항체들을 사용하여 생성된 컨센서스 서열을 분석한 결과는 경쇄 CDR2에 대한 컨센서스 서열이 다음과 같은 아미노산 치환에 의해 더 변경되었음을 보여준다: 위치 4에서 K, 이 치환은 N과 상동한 치환이다.

바람직한 실시양태에서, 위치 2에서 A, T 또는 V, 위치 3에서 S, 위치 4에서 N, T 또는 K, 위치 5에서 L 또는 R, 위치 6에서 E, A, F 또는 D, 및 위치 7에서 S를 포함하는 CDR2와 적어도 90% 동일한 경쇄 CDR2를 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

MNC2에 대한 경쇄 CDR3은 아미노산이 왼쪽에서 오른쪽으로 1부터 9까지 넘버링된 QHSRELPFT인 반면, MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1 및 신규 항체 B2, B7, 8C7F3, H11 및 B9의 컨센서스 서열은 다음과 같다: 위치 1에서 Q 또는 F, 위치 2에서 H 또는 Q, 위치 3에서 S, Q, R, D 또는 N, 위치 4에서 R, S, Y 또는 N, 위치 5에서 E, L, S 또는 H, 위치 6에서 L, S, V, D 또는 Y, 위치 7에서 P 또는 S, 위치 8에서 F, L 또는 P, 및 위치 9에서 T. 밑줄친 아미노산은 이 더 포괄적인 컨센서스 서열이 MNC2, MNE6, 20A10 및 3C2B1 단독에 대해 생성된 컨센서스 서열과 어떻게 상이한지를 표시한다.

5C6F3 및 25E6을 포함하는 모든 항체들을 사용하여 생성된 컨센서스 서열을 분석한 결과는 경쇄 CDR2에 대한 컨센서스 서열이 다음과 같은 아미노산 치환에 의해 더 변경되었음을 보여준다: 위치 1에서 W; 위치 3에서 G; 위치 4에서 T; 위치 5에서 F; 위치 8에서 Q.

바람직한 실시양태에서, 위치 1에서 Q, F 또는 W, 위치 2에서 H 또는 Q, 위치 4에서 R, S, T, Y 또는 N, 위치 5에서 E, L, S 또는 H, 위치 6에서 L, S, V, D 또는 Y, 위치 7에서 P 또는 S, 및 위치 9에서 T를 포함하는 CDR2와 적어도 90% 동일한 경쇄 CDR3을 가진다는 점을 기반으로 암의 치료, 예방 또는 진단을 위해 항체를 선택한다.

MUC1*의 세포외 도메인을 표적화하는 항체, 항체 단편 및 CAR을 사용하기 위한 다른 일반적인 전략

또 다른 측면에서, 본 발명은 동일한 면역 세포 내로 형질감염된 적어도 2개의 상이한 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 이때 첫 번째 플라스미드는 종양 항원에 결합하는 항체 단편, scFv 또는 펩티드를 포함하는 CAR을 코딩하고 다른 플라스미드는 CAR이 아닌 유전자를 코딩하고, 이때 CAR이 아닌 유전자는 활성화된 면역 세포의 요소에 의해 활성화되는 유도성 프로모터로부터 발현된다. 한 측면에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 한 측면에서, 면역 세포는 시험관내에서 그 면역 세포 유형으로 분화하도록 유도된 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 항체의 서열을 함유하는 CAR은 나중에 면역 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포에서 발현된다. 한 측면에서, CAR은 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하는 항체 단편, scFv 또는 펩티드를 포함한다. 한 측면에서, CAR은 MNC2, MNE6, 20A10, 3C2B1, 5C6F3, 25E6, 18G12, 28F9, 1E4, B12, B2, B7, B9, 8C7F3 또는 H11로부터 유래한 scFv를 포함한다. 한 측면에서, 비-CAR 종은 절단 효소이다. 한 측면에서, 절단 효소는 MMP2, MMP3, MMP9, MMP13, MMP14, MMP16, ADAM10, ADAM17, ADAM28 또는 이의 촉매 활성 단편이다. 또 다른 측면에서, 비-CAR 종은 사이토카인이다. 한 측면에서, 사이토카인은 IL-7이다. 한 측면에서, 사이토카인은 IL-15이다. 한 측면에서, 사이토카인은 IL-12이다. 한 측면에서, 사이토카인은 IL-18이다. 활성화된 IL-18의 서열이 제공된다(서열번호 1637 및 1638). Foxp3 인핸서 영역에 내재된 NFAT 유도성 IL-18의 두 예가 제공된다(서열번호 1639 및 1640). IL-2 인핸서 영역에 내재된 NFAT 유도성 IL-18의 두 예가 제공된다(서열번호 1641 및 1642). 한 경우, 세(3)개의 NFAT 반응 요소가 있고, 다른 경우 여섯(6)개의 NFAT 반응 요소가 있다. NFAT 반응 요소의 수는 표적의 CAR T 세포 인식 시 발현되는 IL-18의 원하는 양을 얻기 위해 변경될 수 있다. 유도성 IL-18을 가진 CARS 내로 통합된 본 발명의 항체의 예는 다음과 같이 제시된다: 4-1BB 또는 CD28 보조자극 도메인과 유도성 IL-18을 갖거나(서열번호 1643 내지 1646), 1XX 돌연변이된 CD3-제타 또한 가진(서열번호 1647 내지 1650) CAR 내의 뮤린 또는 인간 MNC2; 4-1BB 또는 CD28 보조자극 도메인과 유도성 IL-18을 갖거나(서열번호 1651 내지 1654), 1XX 돌연변이된 CD3-제타 또한 가진(서열번호 1655 내지 1658) CAR 내의 뮤린 또는 인간 MNE6; 4-1BB 또는 CD28 보조자극 도메인과 유도성 IL-18을 갖거나(서열번호 1659 내지 1662), 1XX 돌연변이된 CD3-제타 또한 가진(서열번호 1663 내지 1666) CAR 내의 뮤린 또는 인간 20A10; 4-1BB 또는 CD28 보조자극 도메인과 유도성 IL-18을 갖거나(서열번호 1667 내지 1670), 1XX 돌연변이된 CD3-제타 또한 가진(서열번호 1671 내지 1674) CAR 내의 뮤린 또는 인간 25E6. 또 다른 측면에서, 사이토카인은 IL-7 및 IL-15이다. 한 경우, 비-CAR 종의 발현은 활성화된 면역 세포의 요소에 의해 유도된다. 한 측면에서, 활성화된 면역 세포의 요소는 NFAT이다. 한 측면에서, NFAT는 NFATc1, NFATc3 또는 NFATc2이다. 사이토카인 IL-7, IL-15, IL-12 및 IL-18은 T 세포 지속성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 한 측면에서, 상기 면역 세포는 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다. 본 발명의 한 측면에서, 암은 MUC1 양성 암 또는 MUC1* 양성 암이다.

절단 효소의 발현도 유도하는 CAR T 세포를 만드는 것 이외에, 본 발명자들은 IL-18의 국소 및 일시적 발현도 유도하는 CAR T 세포를 만들었다. 보고된 T 세포 기반 유도성 시스템들 대다수는 유도 발현될 유전자를 IL-2 프로모터 또는 인핸서에 삽입한다. 본 발명자들은 IL-2 프로모터/인핸서의 유도성 발현을 Foxp3 인핸서의 일부의 유도성 발현과 비교하였다. 이 특정 예에서, 인간 T 세포를 huMNC2-CAR44 및 NFAT 유도성 IL-18 둘 다로 형질도입하였는데, 이때 IL-18 유전자는 IL-2 프로모터 또는 Foxp3 인핸서 영역에 삽입되었다. 유도성 제2 인자를 가진 CAR T의 주요 문제는 제2 인자가 누출된다는 점이고, 이것은 제2 인자의 상당한 발현이 CAR T 세포의 활성화 없이 일어난다는 것을 의미하는 것으로 당분야에 알려져 있다. 기존 유도성 시스템이 가진 또 다른 문제는 CAR T 세포가 활성화될 때와 제2 인자가 유도될 때 사이에 경과하는 시간의 길이가 전형적으로 매우 길어서, 제2 인자를 분비하는 세포가 제2 인자가 발현될 때까지 종양으로부터 멀리 떨어질 수 있다는 점이다.

도 211a 내지 211c는 MUC1* 양성 암 세포와 공-배양된, NFAT 유도성 IL-18을 보유하는 huMNC2-CAR44 T 세포의 조건 배지 내로 분비된 IL-18의 양을 측정하는 ELISA 실험의 그래프를 보여준다. 다양한 수준의 IL-18 발현을 유도하는 방법으로서, 본 발명자들은 훨씬 더 많은 MUC1*를 발현하도록 조작된 증가하는 양의 세포로 도핑된 암 세포와 함께 CAR T 세포를 공-배양하였다. 이 도면들에서, 본 발명자들은 야생형인 T47D 암 세포, 또는 더 많은 MUC1*를 발현하는 5%, 10% 또는 30%의 T47D 세포로 도핑된 T47D 암 세포를 보여준다. 도 211a는 형질도입되지 않은 인간 T 세포와 공-배양된 T47D 유방암 세포의 상청액 내로 분비된 IL-18의 그래프를 보여준다. 도 211b는 Foxp3 인핸서의 일부에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자를 보유하는 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 T47D 유방암 세포의 상청액 내로 분비된 IL-18의 그래프를 보여준다. 도 211c는 IL-2 인핸서의 일부에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자를 보유하는 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 T47D 유방암 세포의 상청액 내로 분비된 IL-18의 그래프를 보여준다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, Foxp3 시스템은 IL-2 프로모터에서 동일한 구축물의 IL-18 발현보다 유의미하게 더 빠르고 더 높은, 빠르고 강력한 IL-18 발현을 유도한다. 이 예에서, IL-18 유전자는 여섯(6)개의 NFAT 반응 요소의 다운스트림에 삽입되나, 더 적은 수의 반응 요소를 사용함으로써 제2 인자의 양을 약화시킬 수 있거나 NFAT 반응 요소의 수를 증가시킴으로써 상기 양을 향상시킬 수 있다.

IL-18은 생체내에서 CAR T 세포의 지속성을 증가시키는 것으로 보고되었다. 그러나, 본 발명자들은 예상치 못한 결과를 관찰하였다. IL-18의 분비는 CAR T 세포에 의한 항원 저밀도 세포의 사멸을 용량 의존적 방식으로 증가시켰다. 본 발명자들은 T47D-wt 세포(적색: mCherry), 및 더 많은 MUC1*를 발현하도록 형질도입된 T47D(녹색: GFP)를 차별적으로 표지하였다. 도 212a 내지 212x는 더 많은 MUC1*를 발현하도록 조작된 다양한 퍼센트의 T47D 세포(녹색)로 도핑된 T47D 유방암 세포(적색)의 사진을 보여준다. 표적 암 세포를, NFAT 유도성 IL-18을 가진 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양하였는데, 이때 IL-18 유전자는 Foxp3 인핸서/프로모터 또는 IL-2 인핸서/프로모터에 삽입되었다. 도 212a 내지 212c, 212i 내지 212k 및 212q 내지 212s는 형질도입되지 않은 T 세포와 공-배양된 암 세포를 보여준다. 도 212d 내지 212f, 212l 내지 212n 및 212t 내지 212v는 Foxp3 인핸서/프로모터에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자를 가진 hiMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 암 세포를 보여준다. 도 212g, 212h, 212o, 212p, 212w 및 212x는 IL-2 인핸서/프로모터에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자를 가진 hiMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양된 암 세포를 보여준다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 항원 저밀도 T47D-wt 유형 세포(적색)는 더 많은 MUC1*를 발현하여 더 많은 IL-18을 분비하는 더 높은 퍼센트의 세포로 도핑될 때 사멸된다. 실험은 훨씬 더 낮은 수준의 IL-18을 발현하는 IL-2 프로모터로부터 IL-18을 발현하는 세포가 더 많은 MUC1*를 발현하는 30% 세포로 도핑되어 있을 때조차도 항원 저밀도 세포를 사멸시키지 않기 때문에, 이것이 단순히 방관자 효과가 아님을 보여준다.

그 다음, 본 발명자들은 CAR T 매개 사멸이 CAR T 특이적 항원에 특이적이라는 것을 보여주었다. 본 발명자들은 대조군인 MUC1/MUC1* 음성 세포가 더 많은 MUC1*를 발현하는 5%, 10% 또는 30%의 T47D 세포로 도핑되고 MUC1* 특이적 CAR T 세포와 공-배양되는 유사한 실험을 수행하였다. 도 213a 및 213b는 컨디셔닝 배지 내로 분비된 IL-18의 수준이 MUC1* 양성 암 세포 또는 MUC1 음성 비-암성 세포와 공-배양된, Foxp3 인핸서 또는 프로모터에 삽입된 NFAT 유도성 IL-18 유전자를 가진 huMNC1-CAR44 T 세포에 대해 측정되는 ELISA 실험의 그래프를 보여준다. 도 213a는 T47D 유방암 세포와 공-배양된, NFAT 유도성 IL-18을 가진 huMNC2-CAR44 T 세포로부터의 IL-18 분비를 보여주는 것으로, 이때 집단은 훨씬 더 많은 MUC1*로 형질감염된 5%, 10% 또는 30% T47D 세포로 도핑되어 있다. 도 213b는 비-암성 MUC1 음성 HEK293 세포와 공-배양된, NFAT 유도성 IL-18을 가진 huMNC2-CAR44 T 세포로부터의 IL-18 분비를 보여주는 것으로, 이때 세포 집단은 더 많은 MUC1*로 형질감염된 5%, 10% 또는 30% T47D 세포로 도핑되어 있다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 배지 내로 분비된 IL-18의 양은 집단을 도핑시킨 MUC1* 양성 세포에 기인할 수 있다. 실험의 시간 경과 형광 사진은 상당한 퍼센트의 항원 고밀도 MUC1* 양성 세포로 도핑되었을 때조차도 MUC1 음성 세포가 MUC1* 표적화 CAR T 세포에 의해 사멸되지 않음을 보여준다. 도 214a 내지 214x는 T47D 유방암 세포(적색) 또는 비-암성 HEK293 세포(마찬가지로 적색)의 사진을 보여주는 것으로, 이때 두 세포 유형은 더 많은 MUC1*를 발현하도록 조작된 다양한 퍼센트의 T47D 세포(녹색)로 도핑되어 있다. 이 표적 암 세포를, NFAT 유도성 IL-18을 가진 huMNC2-CAR44 T 세포와 공-배양하였는데, 이때 IL-18 유전자는 Foxp3 인핸서/프로모터에 삽입되어 있다. 도 214a 내지 214f는 높은 MUC1* 밀도를 발현하도록 조작된 T47D 세포로 도핑되지 않은 T47D 세포 또는 HEK293 세포를 보여준다. 도 214g 내지 214l은 높은 MUC1* 밀도를 발현하도록 조작된 5% T47D 세포로 도핑된 T47D 세포 또는 HEK293 세포를 보여준다. 도 214m 내지 214r은 높은 MUC1* 밀도를 발현하도록 조작된 10% T47D 세포로 도핑된 T47D 세포 또는 HEK293 세포를 보여준다. 도 214s 내지 214x는 높은 MUC1* 밀도를 발현하도록 조작된 30% T47D 세포로 도핑된 T47D 세포 또는 HEK293 세포를 보여준다. 도 214a, 도 214b, 도 214g, 도 214h, 도 214m, 도 214n, 도 214s 및 도 214t는 T47D 유방암 세포를 보여준다. 도 214c 내지 도 214f, 도 214i 내지 도 214l, 도 214o 내지 도 214r 및 도 214u 내지 도 214x는 HEK293 세포를 보여준다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 유도된 IL-18 분비는 낮은 MUC1* 밀도 T47D 세포의 사멸을 야기하였으나, MUC1* 음성 HEK293 세포의 비특이적 사멸을 유도하지 않았다. 종합하건대, 이 결과는 Foxp3 시스템이 제2 인자의 유도성 발현을 위한 우수한 시스템이며 CAR T 시스템에 특히 유용하다는 것을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 IL-18이 근처 MUC1/MUC1* 음성 세포를 사멸시키는 원치 않는 효과 없이 항원 저밀도 세포의 사멸을 증가시킨다는 예상치 못한 결과를 입증하였다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 동일한 면역 세포 내로 형질감염된 적어도 2개의 상이한 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 이때 첫 번째 플라스미드는 B 세포 표면의 항원의 세포외 도메인에 결합하는 항체 단편, scFv 또는 펩티드를 포함하는 CAR을 코딩하고, 다른 플라스미드는 CAR이 아닌 유전자를 코딩하는데, 이때 CAR이 아닌 유전자는 활성화된 면역 세포의 요소에 의해 활성화되는 유도성 프로모터로부터 발현된다. 한 측면에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 한 측면에서, 면역 세포는 시험관내에서 그 면역 세포 유형으로 분화하도록 유도된 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 측면에서, 항체의 서열을 함유하는 CAR은 나중에 면역 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포에서 발현된다. 한 측면에서, CAR은 CD19에 결합하는 항체 단편, scFv 또는 펩티드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체 단편, scFv 또는 펩티드는 B 세포 또는 B 세포 전구체의 표면 항원에 결합하거나, CD19, CD20, CD22, BCMA, CD30, CD138, CD123, CD33 또는 LeY 항원에 결합한다. 한 측면에서, 비-CAR 종은 절단 효소이다. 또 다른 측면에서, 비-CAR 종은 사이토카인이다. 한 측면에서, 사이토카인은 IL-7이다. 한 측면에서, 사이토카인은 IL-15이다. 또 다른 측면에서, 사이토카인은 IL-7 및 IL-15이다. 한 경우, 비-CAR 종의 발현은 활성화된 면역 세포의 요소에 의해 유도된다. 한 측면에서, 활성화된 면역 세포의 요소는 NFAT이다. 한 측면에서, NFAT는 NFATc1, NFATc3 또는 NFATc2이다. CAR이 아닌 유전자는 유도성 프로모터로부터 발현되고, 이때 발현은 활성화된 면역 세포의 요소에 의해 유도된다. 한 측면에서, 상기 조성물로 형질감염되었거나 형질도입된 면역 세포는 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다. 한 경우, 암은 백혈병, 림프종 또는 혈액암이다.

본 발명은 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 유전자 또는 플라스미드, 또는 이에 코딩된 활성화된 T 세포 유도성 단백질 또는 펩티드를 삽입하는 특정 방법 또는 기술에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 유전자 및 활성화된 T 세포 유도 유전자는 CAR 유전자를 수용자 세포의 게놈 내로 통합할 수 있거나 통합할 수 없는 바이러스를 사용함으로써, 바이러스에 의해 면역 세포 내로 형질도입될 수 있다. 바이러스 전달 시스템 및 바이러스 벡터는 감마-레트로바이러스를 포함하는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 바큘로바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 종양용해 바이러스, HF10, T-Vec 등을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 바이러스 형질도입 이외에, 본원에 기재된 CAR 및 활성화된 T 세포 유도 유전자는 CRISPR 기술, CRISPR-Cas9, CRISPR-CPF1, TALEN, 슬립핑 뷰티 트랜스포존 시스템 및 SB 100X와 같은 방법을 이용함으로써 수용자 세포의 게놈 내로 직접 스플라이싱될 수 있다.

부피가 큰 세포 표면 단백질, 예컨대, MUC1-FL은 BiTE에서 입체 장애 문제를 일으킬 수도 있다. BiTE는 하나의 헤드가 T 세포에 결합하고 다른 헤드가 종양 관련 항원에 결합하는 투-헤드 이중특이적 항체이다. BiTE는 이러한 방식으로 T 세포와 종양 세포를 함께 연결한다. T 세포에 결합하는 항체는 T 세포를 활성화시키는 항체, 예컨대, CD3 또는 CD28에 대한 항체이어야 한다. 입체 장애 문제를 해결하기 위해, T 세포 특이적 항체와 종양 특이적 항체 사이의 링커를 늘린다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 항-MUC1* 단일 쇄 분자는 절단 효소 또는 절단 효소의 촉매 활성 단편에 융합된다. 본 발명의 한 측면에서, 절단 효소는 MMP9(서열번호 643)이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 효소는 MMP9의 촉매 활성 단편(서열번호 645)이다. 일부 경우, CAR의 항체 단편은 그 특이적 절단 효소에 의해 절단될 때 MUC1*를 인식하는 그의 능력으로 인해 선택된다. 한 실시양태에서, 절단 효소는 MMP9, MMP3, MMP14, MMP2, ADAM17, ADAM TS16 및/또는 ADAM28이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 (PSMGFR) GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA, PSMGFR N-10 QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA, 또는 PSMGFR N+20 SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA의 서열을 가진 펩티드에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 절단 효소 MMP9 및 MMP3은 MNC2의 단편인 항체 단편을 가진 CAR로도 형질도입된 T 세포 내로 형질도입된다.

많은 경우, 면역 세포가 고형 종양의 종양 관련 표적을 인식한 후에만 절단 효소가 발현되도록 하는 것이 바람직하다. 이 방식으로, 절단 효소는 MUC1, MUC16 또는 다른 단백질을 절단하면서 신체 전체를 자유롭게 이동하지 않을 것이고, 이때 이들의 절단은 실제로 암을 촉진할 수 있다. 그러나, 화학요법제, CAR T 세포 및 다른 항암제의 직접적인 적용에 물리적으로 접근 가능한 암이 있다. 예를 들어, 뇌암, 전립선암 및 난소암의 유형은 모두 항암제를 암의 국소 부근에 직접 적용하였을 때의 이점을 보여주었다. CAR T 세포는 교모세포종 환자의 뇌 및/또는 뇌척수액에 직접 주사되었다. 전이된 암을 비롯한 전립선암의 치료를 위해 방사선이 전립선 부위로 향하게 하였다. 난소암의 치료를 위해 뜨거운 화학요법제가 복강 내로 직접 주사되었다. 이 경우 및 다른 경우, 즉 화학요법제의 직접 적용에 물리적으로 접근 가능한 암의 경우, 절단 효소는 CAR T 세포, 종양 관련 항원을 인식하도록 조작된 면역 세포, BiTE, ADC, 생물학적 또는 표준 화학요법제일 수 있는 또 다른 항암제의 존재 또는 부재 하에 투여된다. 난소암은 체내 어느 곳으로나 전이될 수 있지만, 인접 장기, 예컨대, 장, 간 및 위로 퍼질 때 통상적으로 복부에 머문다. 이러한 이유로, 난소암은 백금 기반 약물, 예컨대, 카르보플라틴(carboplatin)(파라플라틴(Paraplatin)) 또는 시스플라틴(cisplatin), 및/또는 탁산(taxane), 예컨대, 파클리탁셀(paclitaxel)(탁솔(Taxol)) 또는 도세탁셀(docetaxel)(탁소테레(Taxotere))을 비롯한 다른 항암제와 함께 절단 효소를 투여함으로써 항암제의 효과를 개선하기 위한 이상적인 시험 사례가 된다. 알케란(Alkeran)(멜팔란(Melphalan)), 아바스틴(Avastin)(베바시주맙(Bevacizumab)), 카르보플라틴, 클라펜(Clafen)(사이클로포스파미드(Cyclophosphamide)) 및 사이톡산(Cytoxan)은 모두 난소암의 치료용으로 승인되었다. 난소암의 치료를 위해 시험되고 있는 다른 치료제는 MUC1, MUC16 및 본원에 기재된 MUC1*를 표적화하는 작용제를 포함한다.

MMP9 이외에 또는 대신에 다른 절단 효소를 사용할 수 있다. 예를 들어, MMP14는 MUC1을 MUC1*로 효율적으로 절단하는 것으로 밝혀졌다(도 38). 본 발명의 한 측면에서, MMP14는 CAR도 발현하도록 조작된 면역 세포에서 발현된다. 한 경우, CAR은 항-MUC1* CAR이다. 예를 들어, 이것은 MNC2-CAR44 형질도입된 T 세포일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, MMP14는 종양의 위치에서 또는 정맥내로 환자에게 직접 투여된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 암은 난소암이고 MMP9 또는 MMP14는 화학요법제, 생물제제, 항-MUC1* CAR T 또는 항-MUC16 CAR T일 수 있는 항암제와 함께 복부 부위에 직접 주사된다.

절단 효소의 국소 투여 이외에, + 정맥내 투여 단독, 또는 유도성 프로모터로부터도 발현될 수 있는, CAR T 세포일 수 있는 면역 세포로부터의 분비도 고려된다.

본 발명과 관련된 실험의 수행에 이용된 방법

1. 렌티바이러스 생성 및 면역 세포의 바이러스 형질도입

HEK293 또는 HEK293T 세포(ATCC)를 사용하여 렌티바이러스를 생성하였다. 형질감염 전날, 플레이트(6웰 플레이트)를 폴리-D-라이신으로 코팅하였고, 5% CO₂ 대기 하에 형질감염시키고 배양하였을 때 세포 밀도가 90% 내지 95%에 도달하도록 세포를 시딩하였다. 다음날, 세포를 제조업체 설명서에 따라 리포펙타민(Lipofectamine) 3000(life technologies) 및 Opti-MEM^® I 감소 혈청 배지(Reduced Serum Medium)로 형질감염시켰다(0.75 ㎍의 렌티바이러스 발현 벡터 및 2.25 ㎍의 pPACKH1 팩키징 혼합물을 사용하였다). 6시간 인큐베이션 후, 배지를 교체하고 24시간 및 48시간 후에 렌티바이러스를 함유하는 배지를 회수하였다. 렌티바이러스를 Lenti-X 농축기(Clontech)로 농축하였고, Lenti-X p@4 신속 역가 키트(Rapid Titer Kit)(Clontech)를 사용하여 역가를 계산하였다. 렌티바이러스를 일회용 분취량으로 -80℃에서 보관하였다.

CAR을 포함하는 구축물을 사용한 면역 세포의 형질도입

냉동된 경우 인간 T 세포를 해동하고 100 내지 200 유닛 IL-2 및 TexMACS 배지 20 ㎖에서 미리 가온하고 원심분리로 펠릿화하였다. 세포를 10 ㎖ 배지에 재현탁하고 항-CD3/항-CD28 비드(TransAct 키트)를 가진 완전 배지에서 1x10⁶개 세포/㎖로 37℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다.

4일간의 배양 후, 세포를 계수하고 450 ㎕의 세포 현탁액을 약 1x10⁶개 세포/㎖의 밀도로 24웰 플레이트의 단일 웰에 넣었다. 세포를 침전시켰다. 각각의 웰의 상단으로부터 150 ㎕를 조심스럽게 제거하였다. 일반 TexMACS 배지에 희석된 렌티바이러스 벡터의 적절한 희석물을, 프로타민 설페이트와 함께 최종 농도 10 ㎍/㎖ 및 150 ㎕ 부피로 웰당 최종 총 부피 450 ㎕가 되도록 각각의 웰에 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 형질도입된 세포를 제거하고, 원심분리로 펠릿화하고, 1.0x10⁶개 세포/㎖를 초과하지 않도록 세포 밀도를 조절하면서 신선한 배지에 재현탁하였다. 형질도입된 T 세포는 증폭될 수 있고 냉동될 수 있거나 직접 사용될 수 있다. 전형적으로 형질도입된 T 세포는 IL-2 및 TransAct 배지를 사용한 활성화 후 7일째 날 내지 20일째 날에 사용되거나 냉동된다.

2. 외생성 절단 효소의 존재 또는 부재 하에 항-MUC1* CAR T 세포 활성의 비교

인간 T 세포(ALLCELLS)를 huMNC2-CAR44 또는 huMNC2-CAR50으로 형질도입하였다. CAR44는 huMNC2-scFv-CD8-CD8(막횡단-41BB-3z)이다. CAR50은 CAR50이 뮤린 MNC2-scFv 및 CD4 막횡단 도메인을 가진다는 점을 제외하고 CAR44와 동일하다. CAR T 세포를, CMTMR의 사용 시 적색으로 염색된 표적 및 비-표적 세포와 함께 18시간 동안 인큐베이션하였다. T 세포는 표적 세포를 인식할 때 표적 세포를 클러스터링하고 사멸시키기 시작한다. 도 45 내지 47에서 볼 수 있는 바와 같이, CAR T 세포는 표적 MUC1* 양성 암 세포를 효과적으로 클러스터링하고 사멸시킨다. 도 45는 MUC1*를 발현하도록 형질도입된 HCT-116 세포인 "HCT-MUC1*", 또는 전체 길이 MUC1로 형질도입된 HCT-116 세포인 "HCT-MUC1-41TR"과 공-배양되는 huMNC2-CAR44 또는 huMNC2-CAR50 T 세포를 보여준다. MNC2는 MUC1 탠덤 반복부 도메인의 절단 및 방출 후에만 드러나는 이소성 에피토프를 인식한다는 점을 상기한다. huMNC2-CAR44 T 세포 및 huMNC2-CAR50 T 세포 중 어느 T 세포도 전체 길이 MUC1을 발현하는 세포를 인식하지 않는다(도 45f 내지 45h). 그러나, MMP9와 활성제 APMA가 첨가될 때, CAR T 세포가 세포를 인식하고 클러스터링하고 사멸시킨다(도 45j 내지 45l). 절단 효소 ADAM-17의 첨가는 전체 길이 MUC1에 대한 CAR T 세포의 인식에 영향을 미치지 않았다(도 45n 내지 45p). 그 이유는 ADAM-17이 MUC1을 절단하지 않거나 절단 생성물이 MNC2에 의해 인식되지 않기 때문일 수 있다. MMP2가 MUC1 절단에서 단지 약하게 효과적이거나 MMP2 절단 생성물이 MNC2에 의해 단지 약하게 인식됨을 보여주는 유사한 실험을 수행하였다(도 46). 도 47은 HCT-MUC1* 세포, T47D-wt 유방암 세포, 및 추정컨대 전체 길이 MUC1을 MNC2에 의해 인식될 수 있는 MUC1*로 절단하는 MMP9가 첨가된 T47D 세포 사이의 대조를 보여준다.

3. MUC1* 양성 암 세포에 "죽음의 키스"를 주는 CAR T 세포의 공초점 이미지화

MUC1* 양성 DU145 전립선 암 세포와 24시간 동안 공-배양된, huMNC2-CAR44로 형질도입된 인간 T 세포의 공초점 이미지는 그랜자임 B를 표적 암 세포에 삽입하는 CAR T 세포를 보여주었다. 도 55는 전립선암 세포와 공-배양되었을 때 그랜자임 B를 분비하는 huMNC2-CAR44 T 세포의 형광 이미지, CAR T 세포에 의한 그랜자임 B의 증가된 발현을 보여주는 FACS 분석, 및 표적 전립선암 세포가 실제로 사멸되었음을 보여주는 xCELLigence 실험을 보여준다.

5. FACS 분석에 의한 MUC1* 양성 암 세포의 CAR T 세포 유도 사멸의 분석

본 발명자들은 T47D MUC1* 양성 유방암 세포에 대한 huMNC2-CAR44 T 세포의 사멸 효과를 입증하였는데, 이때 유방암 세포는 증가하는 양의 추가 MUC1*로 형질감염되었다. huMNC2-CAR44 T 세포의 사멸 효과는 세포에서 발현된 표적 MUC1*의 양이 증가함에 따라 증가한다.

인간 IFN-γ ELISA 키트(Biolegend)를 사용하여 배지에서의 IFN-γ 분비를 측정하였다. 플레이트를 항-IFN-γ 항체(포획 항체, 코팅 완충제 중의 1X)로 코팅하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하였고, 차단 용액을 첨가하여 웰에 남아있는 결합 부위를 차단하였다. (500 rpm에서 진탕하면서) 실온에서 1시간 후, 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고 컨디셔닝 배지(CM) 및 IFN-γ 표준물을 첨가하였다. 진탕하면서 실온에서 2시간 후, 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고 검출 항체(1x)를 첨가하였다. 진탕하면서 실온에서 1시간 후, 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고 아비딘(Avidin)-HRP(1x)를 첨가하였다. 진탕하면서 실온에서 30분 후, 플레이트를 PBS-T로 5회 세척하고(세척할 때마다 1분 동안 담금) TMB 기질 용액을 첨가하였다. 중단 용액을 첨가함으로써 20분 후에 반응을 중단시키고 중단 후 15분 이내에 450 nm에서 흡광도를 판독하였다(570 nm에서의 흡광도를 뺌).

6. xCELLigence에 의한 MUC1* 양성 암 세포의 CAR T 세포 유도 사멸의 분석

FACS 분석 이외에, 많은 연구원들은 현재 xCELLigence 기기를 이용하여 암 세포의 CAR T 사멸을 측정한다. xCELLigence 기기는 암 세포가 플레이팅되어 있는 전극 어레이를 사용한다. 부착성 암 세포는 전극을 절연하므로, 이 세포가 생장함에 따라 임피던스의 증가를 야기한다. 대조적으로, T 세포는 부착되지 않고 현탁 상태로 남아있으므로 임피던스를 증가시킬 전극의 절연에 기여하지 않는다. 그러나, T 세포 또는 CAR T 세포가 전극 플레이트 상의 암 세포를 사멸시키는 경우, 암 세포는 사멸함에 따라 뭉쳐지고 부유하게 되어, 임피던스의 감소를 야기한다. xCELLigence 기기는 암 세포 사멸과 상관관계를 가진 임피던스를 시간의 함수로서 측정한다. 또한, 전극 플레이트는 관찰 윈도우도 가진다. CAR T 세포가 흡착된 표적 암 세포를 효과적으로 사멸시킬 때, 임피던스의 감소가 있을 뿐만 아니라, 플레이트 표면에 남아있는 암 세포가 없다는 것도 알 수 있다.

대부분의 XCELLigence 실험에서, 96웰 전극 어레이 플레이트의 웰당 5,000개의 암 세포를 플레이팅하였다. 세포를 24시간 동안 부착시키고 생장시켰다. 이어서, CAR T 세포를 0.5:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1 및 종종 20:1의 이펙터 대 표적 비(E:T)로 첨가하였다. E:T 비는 실제 형질도입 효율이 40%일 때 T 세포 내로의 CAR의 100% 형질도입을 가정한다.

xCELLigence 기기는 임피던스를 시간의 함수로서 기록하고 실험은 최대 7일 동안 계속될 수 있다.

도 48, 도 49, 도 55h, 도 56h, 도 57a 내지 도 57c는 모두 xCELLigence 기기에서 수행된 CAR T 및 암 세포 실험의 결과를 보여준다.

7. 인간 종양을 가진 마우스에서의 항-MUC1* CAR T 세포 요법

500,000개의 인간 암 세포를 8주령 내지 12주령의 암컷 NOD/SCID/GAMMA(NSG) 마우스에 이식하였는데, 이때 암 세포는 루시퍼라제로 미리 안정적으로 형질감염되었다. 암 세포가 형광을 띠게 만드는 효소 기질 루시페린을, 이미지화 직전에 루시퍼라제 양성 세포를 가진 마우스에 주사할 수 있다. 루시페린을 주사한 후 10분 내지 15분 이내에 IVIS 기기로 살아있는 마우스에서 암 세포를 이미지화한다. 판독값은 플럭스(flux) 또는 초당 광자이다. 종양이 IVIS에 의해 명확하게 보일 때까지 종양이 생착되게 하였다.

도 58a 내지 58f는 IVIS 기기에서 촬영된 마우스의 형광 사진을 보여준다. IVIS 사진촬영 10분 전, 루시퍼라제에 의한 절단 후 형광을 생성함으로써, 종양 세포가 형광을 띠게 만드는 루시페린을 마우스에게 복강내(IP) 주사하였다. 0일째 날, 루시퍼라제로 안정적으로 형질감염된 500,000개의 인간 MUC1* 양성 암 세포를 NSG(NOD/SCID/GAMMA) 면역손상된 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 종양이 생착되게 하였다. IVIS 측정 후 7일째 날, PBS, 1,000만 개의 형질도입되지 않은 인간 T 세포 또는 8.5M huMNC2-scFv-CAR44 T 세포를 동물의 꼬리 정맥에 주사하였다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조군 마우스는 과도한 종양 존재량으로 인해 20일째 날에 희생되어야 했다(도 58a 및 58b). huMNC2-CAR44 T 세포로 치료받은 마우스들은 이들이 희생된 때인 100일째 날까지 단일 CAR T 세포 주사 후 종양이 없었다(도 58c). 도 58e는 항-MUC1* 항체에 의해 안내된 T 세포 요법의 효능을 입증하는 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. 도 58f는 희생 시 시험 마우스로부터 채취된 인간 T 세포의 특성을 요약한 표를 보여준다. 출발 CAR T 세포 집단은 50% CD4 양성 헬퍼 T 세포 및 50% CD8 양성 킬러 T 세포이었다. 표에서 볼 수 있는 바와 같이, CD8 양성 세포의 퍼센트는 CAR T 치료군에서 증가하였는데, 이것은 효능의 지표인, 그 세포군의 생체내 증폭을 시사한다. 본 발명자들은 또한 치료군에서 CAR T 세포가 T 세포 고갈의 마커인 PD1을 더 높은 수준으로 발현한다는 것을 주목한다.

또 다른 동물 실험에서, 500,000개의 종양 세포를 NSG 마우스의 옆구리에 피하 이식한 다음, 7일째 날 및 다시 14일째 날에 식염수, PBS 또는 10M huMNC2-CAR44 T 세포를 주사하였다(도 59a 내지 59c). 이 실험에서, 종양 세포에서 발현된 MUC1*의 양은 달라졌다. 한 경우, 이식된 종양 세포는 T47D 야생형이었다(도 59b). 또 다른 경우, T47D 세포는 훨씬 더 많은 MUC1*를 발현하도록 형질감염된 95% T47D 세포로 도핑되었다(도 59c). 볼 수 있는 바와 같이, 더 많은 MUC1*를 발현하는 세포로 구성된 종양이 더 빨리 제거되었고 재발하지 않았다. 유사한 실험에서, 더 많은 MUC1*를 발현하는 비교적 적은 양의 세포로 종양 세포를 도핑하였다. 도 60a 내지 60c는 더 많은 MUC1*를 발현하도록 형질감염된 30%의 T47D 세포로 도핑된 T47D-wt 유방암 세포를 이식받은 NSG 마우스를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 높은 수준의 MUC1*를 발현하는 작은 퍼센트의 세포라도 전체 종양의 CAR T 세포 매개 사멸을 유발하기에 충분하다. 천연 생성 종양은 불균질하고 고항원 발현 세포 및 저항원 발현 세포 둘 다로 구성된다. 이 실험은 huMNC2-CAR44 T 세포가 천연 생성 종양을 박멸하는 데 효과적일 것임을 시사한다.

도 61a 내지 61j는 IVIS 기기에서 촬영된 마우스의 형광 사진을 보여준다. 0일째 날, MUC1* 양성 삼중 음성 유방암 세포주인 500K 인간 BT-20 세포를 NSG(NOD/SCID/GAMMA) 면역손상된 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 암 세포는 루시퍼라제로 안정적으로 형질감염되었다. 종양이 생착되게 하였다. IVIS 측정 후 6일째 날, huMNC2-scFv-CAR44로 형질도입된 1,000만 개의 인간 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포를 동물에게 1회 주사하였다. 500만 개의 T 세포를 종양 내로 주사하였고 500만 개의 T 세포를 꼬리 정맥에 주사하였다. IVIS 사진촬영 10분 전, 루시페린을 마우스에게 IP 주사하였다. 한 경우, huMNC2-CAR44 T 세포를 PSMGFR 펩티드가 부착된 비드와 함께 먼저 인큐베이션하여 T 세포를 사전자극하였고 이것은 도면에서 프로토콜 1로 표시된다. 프로토콜 2에서, huMNC2-CAR44 T 세포를 살아있는 종양 세포로 사전자극하였는데, 이것은 아마도 더 많은 종양 세포를 동물의 순환계 내로 주입하였을 것이다.

도 62a 내지 62m은 IVIS 기기에서 촬영된 마우스의 형광 사진을 보여준다. 0일째 날, MUC1* 양성 난소암 세포주인 500K 인간 SKOV-3 세포를 NSG(NOD/SCID/GAMMA) 면역손상된 마우스의 복강내(IP) 내로 주사하였다. 암 세포는 루시퍼라제로 안정적으로 형질감염되었다. 종양이 생착되게 하였다. IVIS 측정 후 3일째 날, huMNC2-CAR44 T 세포로 형질도입된 10M 인간 T 세포, 형질도입되지 않은 T 세포 또는 PBS를 동물에게 IP 주사하였다. 동물을 7일째 날에 다시 IVIS 이미지화하였다. IVIS 사진촬영 10분 전, 루시페린을 마우스에게 IP 주사하였다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-MUC1* CAR T 세포는 15일째 날까지 난소 종양 부피를 효과적으로 감소시켰다.

9. NFAT 유도 IL-18 서열 및 클로닝

pGL4-14 3xNFAT에서 IL18의 클로닝:

활성화된 IL18(서열번호 1644)을 CD8 리더 서열과 함께 합성하였다. pGL4-14 3xIL2 NFAT 및 pGL4-14 3xFoxP3 NFAT를 XhoI 및 HindIII 제한 효소(New England Biolabs)로 분해하였다. 깁슨(Gibson) 어셈블리 클로닝 키트(New England Biolab)를 사용하여 정제된 플라스미드 및 합성된 IL18 서열을 어셈블링하였다. 생성된 구축물(pGL4-14 3xIL2NFAT-IL18 및 pGL4-14 3xFoxP3NFAT-IL18)은 NFAT 반응 요소(IL2 또는 FoxP3)의 3개 반복부 다음에 최소 프로모터(mCMV: 서열번호 1634) 및 CD8 리더 서열을 가진 IL18(서열번호 1752 및 1753)을 함유한다.

pCDNA 벡터에서 IL18을 가진 MNC2 CAR의 클로닝:

하기 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 이전에 만들어진 벡터로부터 MNC2 CAR 서열을 증폭하였다: 5'-agggagacccaagctggctagttaagcttggatggccttaccagtgaccgccttgc-3'(서열번호 1754) 및 5'-taggccagagaaatgttctggcattatcagcgagggggcagggcctgc-3'(서열번호 1755).

하기 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 pGL4-14 3xNFAT-IL18로부터 NFAT 반응 요소를 포함하는 IL18 서열을 증폭하였다: 5'-tgccagaacatttctctgg-3'(서열번호 1756) 및 5'-acagtcgaggctgatcagcgggtttaaacttatcagtcctcgttctgcacgg-3'(서열번호 1757). 깁슨 어셈블리 클로닝 키트(New England Biolab)를 사용하여 정제된 PCR 단편 및 분해된 pCDNA 3.1 V5(ThermoFisher Scientific)를 어셈블링하여, 구축물 pCDNA MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18 및 pCDNA MNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18을 생성하였다.

렌티벡터에서 MNC2 CAR-NFAT-IL18의 클로닝:

하기 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 pCDNA MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18 및 pCDNA MNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18로부터 MNC2 CAR-NFAT-IL18 서열을 증폭하였다: 5'-atgcaggccctgccccctcgctgataagtttaaactgccagaacatttctctggcctaac-3'(서열번호 1758) 및 5'-accggagcgatcgcagatccttcgcggccgcttatcagtcctcgttctgcacggtgaac-3'(서열번호 1759). 깁슨 어셈블리 클로닝 키트(New England Biolab)를 사용하여 정제된 PCR 단편 및 분해된 pCDH Dual Hygro(System Biosciences, 캘리포니아주 소재)를 어셈블링하여, 구축물 pCDH MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18 및 pCDH MNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18을 생성하였다.

MSCV 프로모터를 가진 렌티벡터의 생성

하기 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 pCDH-MSCV-MCS-EF1a-GFP(System Biosciences)로부터 MSCV 프로모터 서열을 증폭하였다: 5'-attgcactagttgaaagaccccacctgtagg-3'(서열번호 1760) 및 5'-aatgctctagaatacgggtatccag-3'(서열번호 1761). SpeI 및 XbaI 제한 효소(New England Biolabs)로 분해한 후, 정제된 단편을 동일한 제한 효소에 의해 분해된 pCDH CMV MCS(System Bioscience)에 클로닝하여 구축물 pCDH MSCV MCS를 생성하였다.

pCDH MSCV MCS에서 MNC2 CAR-NFAT-IL18의 클로닝:

하기 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 pCDNA MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18로부터 MNC2 CAR-IL2NFAT-IL18 서열을 증폭하였다: 5'-atagcgaattcgtaccgagggccaccatgg-3'(서열번호 1762) 및 5'-taggcctcccaccgtacacgcctaggtaccacgccttctgtatg-3'(서열번호 1763). 하기 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 pCDNA MNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18로부터 MNC2 CAR-IL2NFAT-IL18 서열을 증폭하였다: 5'-atagcgaattcgtaccgagggccaccatgg-3'(서열번호 1762) 및 5'-taggcctcccaccgtacacgcctaggtacctctgcagtaaatgg-3'(서열번호 1764). EcoRI 및 KpnI 제한 효소(New England Biolabs)로 분해한 후, 정제된 단편을 동일한 제한 효소에 의해 분해된 pCDH MSCV MCS에 클로닝하여 구축물 pCDH MSCV MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18 및 pCDH MSCV MNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18을 생성하였다.

6xNFAT 반응 요소의 클로닝:

6xNFAT(IL2 및 FoxP3) 반응 요소를 합성한 후, 상이한 최소 프로모터를 합성하였다: mCMV(서열번호 1634), mIL2P(서열번호 1635) 및 miniP(서열번호 1636). 총 여섯(6)개의 서열이 합성되었다: 서열번호 1768 내지 1779.

하기 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 6xNFAT 서열을 증폭하였다: 5'-tgccagaacatttctctgg-3'(서열번호 1756) 및 5'-taaggccatggtggctagc-3'(서열번호 1765). 깁슨 어셈블리 클로닝 키트(New England Biolab)를 사용하여 정제된 PCR 단편 및 분해된(KpnI 및 XhoI) pCDNA MNC2CAR 3XNFAT IL18을 어셈블링하여, 3x NFAT 반응 요소 대신에 6x NFAT 반응 요소를 가진 구축물을 생성하였다.

하기 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 상기 생성된 pCDNA 벡터로부터 6xNFAT 서열을 증폭하였다: 5'-aataagtttaaactgccagaacatttctctgg-3'(서열번호 1766) 및 5'-atatagcggccgcttatcagtcctcgttctgcacgg-3'(서열번호 1767). PmeI 및 NotI 제한 효소(New England Biolabs)로 분해한 후, 정제된 단편을 동일한 제한 효소에 의해 분해된 pCDH MSCV MNC2CAR에 클로닝하여 구축물 pCDH MSCV MNC2CAR-6xIL2NFAT-IL18 및 pCDH MSCV MNC2CAR-6xFoxP3NFAT-IL18을 생성하였다. 각각의 구축물에 대해 3개의 최소 프로모터를 시험하였다.

당분야에서 숙련된 자는 본원에 구체적으로 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 통상의 실험만을 이용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> MINERVA BIOTECHNOLOGIES CORPORATION <120> ANTI-VARIABLE MUC1* ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 16831-169WO0 <140> PCT/US2021/071017 <141> 2021-07-27 <160> 1879 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln 85 90 95 Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr 100 105 110 Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 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ggctgtgtat 360 tactgtacca gagataacta tggccgcaac tatgattatg gcatggatta ttggggccag 420 ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggcg 480 ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac 540 ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc 600 ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 660 tccagcaact tcggcaccca gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc 720 aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca 780 cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc 900 cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag 960 gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg 1020 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag 1080 aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140 tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1200 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260 acacctccca tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1320 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatagtaagt ttaaactcta 1440 ga 1442 <210> 53 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized E6 IgG2 heavy chain synthesized by Genescript <220> <221> misc_feature <222> (477)..(477) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 53 Glu Phe Ala Trp Ala Thr Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu 1 5 10 15 Val Ala Ile Leu Glu Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 35 40 45 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln 50 55 60 Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 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gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaata g 981 <210> 55 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG2 heavy chain constant region sequence <400> 55 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 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120 ccagggaaga ggctggagtg ggtctcaacc attagtggcg gaggcaccta catatactac 180 ccagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cccactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtcc cagagataac 300 tatggccgca actatgatta tggcatggat tattggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360 agcagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgacagtgc cctccagcag cttgggcacc 600 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960 ggcaaggagt 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sequence <400> 99 tggtaccaac agaggcctgg ccagagcccc aggctcctca tctat 45 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized E6 heavy light variable framework region 2 (FWR2) acid sequence <400> 100 Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized E6 light chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 101 agcacctcca acctggccag c 21 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized E6 light chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 102 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 103 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized E6 light chain variable framework region 3 (FWR3) acid sequence <400> 103 ggcatcccag ccaggttcag tggcagtggg tctgggagcg actacactct caccatcagc 60 agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgt 96 <210> 104 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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agaggcctgg ccagagcccc aggctcctca tctatagcac ctccaacctg 240 gccagcggca tcccagccag gttcagtggc agtgggtctg ggagcgacta cactctcacc 300 atcagcagcc tagagcctga agattttgca gtttattact gtcagcagcg tagcagctcc 360 cctttcacct ttggcagcgg caccaaagtg gaaattaaaa ggacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtaagttt aaactctaga 740 <210> 108 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized E6 Kappa light chain synthesized by Genescript <220> <221> misc_feature <222> (243)..(243) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 108 Glu Phe Ala Trp Ala Thr Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile 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ccctacagaa tgttcatagt aa 642 <210> 112 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized E6 lambda light chain sequence <400> 112 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Ser Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro Lys Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn 115 120 125 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val 130 135 140 Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu 145 150 155 160 Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 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chain variable framework region 1 (FWR1) sequence <400> 121 Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 122 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse C2 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 122 ggctatgcca tgtct 15 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse C2 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 123 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 124 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse C2 heavy chain variable framework region 2 (FWR2) sequence <400> 124 tgggttcgcc agactccgga gaagaggctg gagtgggtcg ca 42 <210> 125 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse C2 heavy chain variable framework region 2 (FWR2) sequence <400> 125 Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 126 <211> 51 <212> DNA <213> 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cggctaccgc 960 tggtgcgcca ccaccgccaa ctacgaccgg gacaagctct tcggcttctg cccgacccga 1020 gctgactcga cggtgatggg gggcaactcg gcgggggagc tgtgcgtctt ccccttcact 1080 ttcctgggta aggagtactc gacctgtacc agcgagggcc gcggagatgg gcgcctctgg 1140 tgcgctacca cctcgaactt tgacagcgac aagaagtggg gcttctgccc ggaccaagga 1200 tacagtttgt tcctcgtggc ggcgcatgag ttcggccacg cgctgggctt agatcattcc 1260 tcagtgccgg aggcgctcat gtaccctatg taccgcttca ctgaggggcc ccccttgcat 1320 aaggacgacg tgaatggcat ccggcacctc tatggtcctc gccctgaacc tgattacaag 1380 gatgacgacg ataagtgata a 1401 <210> 781 <211> 2238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 Promoter fragment (P1) <400> 781 aggcaggagg aagaggaaag gggcgcaggg cgctcgggga gcagagccgg gggcccgcgg 60 tggccgcaga ggccgggccg gggcgcagag gccgggcgag ctggccgcgc tctgggccgc 120 cgcctccgga actccctgcg cctggcgcgc ggccaccgtg gtcccggcaa cggcattaaa 180 cagagggaaa cagacccggg attccgtcac ccgggcgggg ggataaggac ggctttgaga 240 gcagacagga aaagggagct tttctgcatg gggtgaaaaa attatttatt gaaggaggag 300 gaggcggcag cggaggaagg ggaggggcgg gaggaggagg aagagccggc cgcccccgcc 360 ccggccccgg ctcctcagga gccaagggca gcctcgccag gtcggtcccg ggctcgagga 420 ccgcggctgg ggtcgagggg ctcagtctcc cacgtgaccg gctgggcgcg ccccgccaga 480 cccggcctcg ggattccctc ctcccggcga gtctccgccc gccccgtcct ggaggtgggg 540 agaaggaggg cggggcgggg gggacggaaa ctctccccgc caaatcctgg ccccaggcct 600 ggggacactc gcggcgggaa gatttggagg ggaggggagg gggaggggcg tgggggcgcg 660 gcctcgctgg agtccccctg accccccgac ccccgcccac cggcctgggc gtcctcccgc 720 ggcccctcct cccctcccgg cgcccggtgc tctggggcgc gtgccacgcc tggctcggcg 780 ccgtaggggc ccccgcaggt agagacccct ggaaatggcc tcgacgccgc aggagcgagg 840 cggccaccac cccgctaatc cgggcacgtc tctccaggcc gaggcctgcg gtggaaaagc 900 cggggttcca tttgtgctga gtcggggcgg ccgaatggag ccaggcctcg ggacgcggga 960 cggacgggct ctggccgcgc accttcgcgg gctctgcagc gcccgaccgc ctcccccggc 1020 agggaggagg cgcttgtggg gggcacccac ggggcacagt gatccctggg ggtctgcgga 1080 cctcctgggc cccgcagcag acacgagttt agcctttggg tttagtttaa atcacataag 1140 ggtgtcgtgc aatcgattta tggtttctac acaccagaca ctttaacctc caaccccccc 1200 catccaagcc aacaagaaaa tgcggtgccg tgttggcagc tgagctgcgc ccgaagagac 1260 gcagggagac gtaagagagg aaagtgtgag tggccggggg gcctcccccc gtcagaagtc 1320 gcgcagtcgc gcccataaaa cgccccctcc gggcggctag ggcaggtgag cgcgtccccg 1380 ggcctcccca cgccggcccc tgccacagag ccgtctaggt cgagcagata tttacagaat 1440 aaaaatgaca ataactcgac gtcccgggac ggccacgcaa tctgttagta atttagcggg 1500 atgggaattt cctttctagg gcctgccagt gaagcgcttt tccaaatttc cacagcgggg 1560 gaagcctgcg attttacata atgacttcag catgccgggc tttctcgaca cccctccccg 1620 gcccccggcc cccgcccccc gccccttttc cagcagggcc gggctccctc cggacacccg 1680 cgtggactca ggcgtcccgt ctggcccgtt cgcccccgtt tcccccgcca gccccagcgc 1740 ccccctgccc ggcccccgga ttccccgttc ccgcccctac gcccccatcc cctccccgtg 1800 cgcccctccc cgtgcgcccc cctccccgtg cgccccccct ccccgtgcgc ccccctcccc 1860 gtgcgccccc cctccccggg cgcccccctc cccgggcgcc ccccctcccc gtgcgccccc 1920 ccctccccgt gcgccccccc tccccgtgcg cgccccgcct cttgcgcccc tgcccccagg 1980 cgagcggctg ccgcggcgcg gggaggggcg ggcgctcggc gactcgtccc cggggccccg 2040 cgcgggcccg ggcagcaggg gcgtgatgtc acggcaggga gggggcgcgg gagccgccgg 2100 gccggcgggg aggcggggga ggtgttttcc agctttaaaa aggcaggagg cagagcgcgg 2160 ccctgcgtca gagcgagact cagaggctcc gaactcgccg gcggagtcgc cgcgccagat 2220 cccagcagca gggcgcgg 2238 <210> 782 <211> 2186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 Promoter fragment (P2) <400> 782 aggcaggagg aagaggaaag gggcgcaggg cgctcgggga gcagagccgg gggcccgcgg 60 tggccgcaga ggccgggccg gggcgcagag gccgggcgag ctggccgcgc tctgggccgc 120 cgcctccgga actccctgcg cctggcgcgc ggccaccgtg gtcccggcaa cggcattaaa 180 cagagggaaa cagacccggg attccgtcac ccgggcgggg ggataaggac ggctttgaga 240 gcagacagga aaagggagct tttctgcatg gggtgaaaaa attatttatt gaaggaggag 300 gaggcggcag cggaggaagg ggaggggcgg gaggaggagg aagagccggc cgcccccgcc 360 ccggccccgg ctcctcagga gccaagggca gcctcgccag gtcggtcccg ggctcgagga 420 ccgcggctgg ggtcgagggg ctcagtctcc cacgtgaccg gctgggcgcg ccccgccaga 480 cccggcctcg ggattccctc ctcccggcga gtctccgccc gccccgtcct ggaggtgggg 540 agaaggaggg cggggcgggg gggacggaaa ctctccccgc caaatcctgg ccccaggcct 600 ggggacactc gcggcgggaa gatttggagg ggaggggagg gggaggggcg tgggggcgcg 660 gcctcgctgg agtccccctg accccccgac ccccgcccac cggcctgggc gtcctcccgc 720 ggcccctcct cccctcccgg cgcccggtgc tctggggcgc gtgccacgcc tggctcggcg 780 ccgtaggggc ccccgcaggt agagacccct ggaaatggcc tcgacgccgc aggagcgagg 840 cggccaccac cccgctaatc cgggcacgtc tctccaggcc gaggcctgcg gtggaaaagc 900 cggggttcca tttgtgctga gtcggggcgg ccgaatggag ccaggcctcg ggacgcggga 960 cggacgggct ctggccgcgc accttcgcgg gctctgcagc gcccgaccgc ctcccccggc 1020 agggaggagg cgcttgtggg gggcacccac ggggcacagt gatccctggg ggtctgcgga 1080 cctcctgggc cccgcagcag acacgagttt agcctttggg tttagtttaa atcacataag 1140 ggtgtcgtgc aatcgattta tggtttctac acaccagaca ctttaacctc caaccccccc 1200 catccaagcc aacaagaaaa tgcggtgccg tgttggcagc tgagctgcgc ccgaagagac 1260 gcagggagac gtaagagagg aaagtgtgag tggccggggg gcctcccccc gtcagaagtc 1320 gcgcagtcgc gcccataaaa cgccccctcc gggcggctag ggcaggtgag cgcgtccccg 1380 ggcctcccca cgccggcccc tgccacagag ccgtctaggt cgagcagata tttacagaat 1440 aaaaatgaca ataactcgac gtcccgggac ggccacgcaa tctgttagta atttagcggg 1500 atgggaattt cctttctagg gcctgccagt gaagcgcttt tccaaatttc cacagcgggg 1560 gaagcctgcg attttacata atgacttcag catgccgggc tttctcgaca cccctccccg 1620 gcccccggcc cccgcccccc gccccttttc cagcagggcc gggctccctc cggacacccg 1680 cgtggactca ggcgtcccgt ctggcccgtt cgcccccgtt tcccccgcca gccccagcgc 1740 ccccctgccc ggcccccgga ttccccgttc ccgcccctac gcccccatcc cctccccgtg 1800 cgcccctccc cgtgcgcccc cctccccgtg cgccccccct ccccgtgcgc ccccctcccc 1860 gtgcgccccc cctccccggg cgcccccctc cccgggcgcc ccccctcccc gtgcgccccc 1920 ccctccccgt gcgccccccc tccccgtgcg cgccccgcct cttgcgcccc tgcccccagg 1980 cgagcggctg ccgcggcgcg gggaggggcg ggcgctcggc gactcgtccc cggggccccg 2040 cgcgggcccg ggcagcaggg gcgtgatgtc acggcaggga gggggcgcgg gagccgccgg 2100 gccggcgggg aggcggggga ggtgttttcc agctttaaaa aggcaggagg cagagcgcgg 2160 ccctgcgtca gagcgagact cagagg 2186 <210> 783 <211> 1645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 Promoter fragment (P3) <400> 783 caggcctggg gacactcgcg gcgggaagat ttggagggga ggggaggggg aggggcgtgg 60 gggcgcggcc tcgctggagt ccccctgacc ccccgacccc cgcccaccgg cctgggcgtc 120 ctcccgcggc ccctcctccc ctcccggcgc ccggtgctct ggggcgcgtg ccacgcctgg 180 ctcggcgccg taggggcccc cgcaggtaga gacccctgga aatggcctcg acgccgcagg 240 agcgaggcgg ccaccacccc gctaatccgg gcacgtctct ccaggccgag gcctgcggtg 300 gaaaagccgg ggttccattt gtgctgagtc ggggcggccg aatggagcca ggcctcggga 360 cgcgggacgg acgggctctg gccgcgcacc ttcgcgggct ctgcagcgcc cgaccgcctc 420 ccccggcagg gaggaggcgc ttgtgggggg cacccacggg gcacagtgat ccctgggggt 480 ctgcggacct cctgggcccc gcagcagaca cgagtttagc ctttgggttt agtttaaatc 540 acataagggt gtcgtgcaat cgatttatgg tttctacaca ccagacactt taacctccaa 600 ccccccccat ccaaagccaa caagaaaatg cggtgccgtg ttggcagctg agctgcgccc 660 gaagagacgc agggagacgt aagagaggaa agtgtgagtg gccggggggc ctccccccgt 720 cagaagtcgc gcagtcgcgc ccataaaacg ccccctccgg gcggctaggg caggtgagcg 780 cgtccccggg cctccccacg ccggcccctg ccacaggccg tctaggtcga gcagatattt 840 acagaataaa aatgacaata actcgacgtc ccgggacggc cacgcaatct gttagtaatt 900 tagcgggatg ggaatttcct ttctagggcc tgccagtgaa gcgcttttcc aaatttccac 960 agcgggggaa gcctgcgatt ttacataatg acttcagcat gccgggcttt ctcgacaccc 1020 ctccccggcc cccggccccc gccccccgcc ccttttccag cagggccggg ctccctccgg 1080 acacccgcgt ggactcaggc gtcccgtctg gcccgttcgc ccccgtttcc cccgccagcc 1140 ccagcgcccc cctgcccggc ccccggattc cccgttcccg cccctacgcc cccatcccct 1200 ccccgtgcgc ccctccccgt gcgcccccct ccccgtgcgc cccccctccc cgtgcgcccc 1260 cctccccgtg cgccccccct ccccgggcgc ccccctcccc gggcgccccc cctccccgtg 1320 cgcccccccc tccccgtgcg ccccccctcc ccgtgcgcgc cccgcctctt gcgcccctgc 1380 ccccaggcga gcggctgccg cggcgcgggg aggggcgggc gctcggcgac tcgtccccgg 1440 ggccccgcgc gggcccgggc agcaggggcg tgatgtcacg gcagggaggg ggcgcgggag 1500 ccgccgggcc ggcggggagg cgggggaggt gttttccagc tttaaaaagg caggaggcag 1560 agcgcggccc tgcgtcagag cgagactcag aggctccgaa ctcgccggcg gagtcgccgc 1620 gccagatccc agcagcaggg cgcgg 1645 <210> 784 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNFATMMP9cat1 gBLOCK sequence <400> 784 aagaggaaaa tttgtttcat acagaaggcg ttactagtta ggcgtgtacg gtgggaggcc 60 tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt 120 tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctct cgacattcgt ttctagagcc 180 accatgagcc tctggcagcc cctggtcctg gtgctcctgg tgctgggctg ctgctttgct 240 ttccaaacct ttgagggcga cctcaagtgg caccaccaca acatcaccta ttggatccaa 300 aactactcgg aagacttgcc gcgggcggtg attgacgacg cctttgcccg cgccttcgca 360 ctgtggagcg cggtgacgcc gctcaccttc actcgcgtgt acagccggga cgcagacatc 420 gtcatccagt ttggtgtcgc ggagcacgga gacgggtatc ccttcgacgg gaaggacggg 480 ctcctggcac acgcctttcc tcctggcccc ggcattcagg gagacgccca tttcgacgat 540 gacgagttgt ggtccctggg caagggcgtc gtggttccaa ctcggtttgg aaacgcagat 600 ggcgcggcct gccacttccc cttcatcttc gagggccgct cctactctgc ctgcaccacc 660 gacggtcgct ccgacggctt gccctggtgc agtaccacgg ccaactacga caccgacgac 720 cggtttggct tctgccccag cgagagactc tacacccagg acggcaatgc tgatgggaaa 780 ccctgccagt ttccattcat cttccaaggc caatcctact ccgcctgcac cacggacggt 840 cgctccgacg gctaccgctg gtgcgccacc accgccaact acgaccggga caagctcttc 900 ggcttctgcc cgacccgagc tgactcg 927 <210> 785 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 heavy chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 785 Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 786 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 heavy chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 786 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 787 <400> 787 000 <210> 788 <400> 788 000 <210> 789 <400> 789 000 <210> 790 <400> 790 000 <210> 791 <400> 791 000 <210> 792 <400> 792 000 <210> 793 <400> 793 000 <210> 794 <400> 794 000 <210> 795 <400> 795 000 <210> 796 <400> 796 000 <210> 797 <400> 797 000 <210> 798 <400> 798 000 <210> 799 <400> 799 000 <210> 800 <400> 800 000 <210> 801 <400> 801 000 <210> 802 <400> 802 000 <210> 803 <400> 803 000 <210> 804 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NFAT consensus sequence <400> 804 Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Asn Ala Thr Cys Asn 1 5 10 <210> 805 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Current NFAT RE (Form System Biosciences. The sequence is from the mouse IL2 promoter.) <400> 805 aagaggaaaa tttgtttcat acagaaggcg tt 32 <210> 806 <211> 812 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse IL2 Promoter (highlighted in green the NFAT RE used, highlighted in yellow is the start codon) <400> 806 aactagagac atataaaata acaccaacat ccttagatac aacccttcct gagaatttat 60 tggacatcat actcttttta aaaagcataa taaacatcaa gacacttaca caaaatatgt 120 taaattaaat ttaaaacaac aacgacaaaa tagtacctca agctcaacaa gcattttagg 180 tgtccttagc ttactatttc tctggctaac tgtatgaagc catctatcac cctgtgtgca 240 attagctcat tgtgtagata agaaggtaaa accatcttga aacaggaaac caatatcctt 300 cctgtctaat caacaaatct aaaagattta ttcttttcat ctatctcctc ttgcgtttgt 360 ccaccacaac aggctgctta caggttcagg atggttttga caaagagaac attttcatga 420 gttacttttg tgtctccacc ccaaagagga aaatttgttt catacagaag gcgttcattg 480 tatgaattaa aactgccacc taagtgtggg ctaacccgac caagagggat ttcacctaaa 540 tccattcagt cagtgtatgg gggtttaaag aaattccaga gagtcatcag aagaggaaaa 600 acaaaaggta atgctttctg ccacacaggt agactctttg aaaatatgtg taatatgtaa 660 aacatcgtga cacccccata ttatttttcc agcattaaca gtataaattg cctcccatgc 720 tgaagagctg cctatcaccc ttgctaatca ctcctcacag tgacctcaag tcctgcaggc 780 atgtacagca tgcagctcgc atcctgtgtc ac 812 <210> 807 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFAT RE (Form PRomega. The sequence is from the humane IL2 promoter.) <400> 807 ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 30 <210> 808 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Possible NFAT RE from ET1 promoter <400> 808 tccagggaaa atcggagtag aacaagaggg atg 33 <210> 809 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Possible NFAT RE from ET1 promoter <400> 809 actgttggaa aacgtaaaca cgttattaaa cggt 34 <210> 810 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Possible NFAT RE from human CD3? <400> 810 tccttaacgg aaaaacaaaa 20 <210> 811 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Possible NFAT RE from human CD3? <400> 811 aaaggaaaaa gtatatgttc 20 <210> 812 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Possible NFAT RE from human IL3 promoter <400> 812 atgccatgga aagggtg 17 <210> 813 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Possible NFAT RE from human GPC6 <400> 813 aaggggaaat gttgagtcta ga 22 <210> 814 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Possible NFAT RE from human growth hormonereleasing hormone <400> 814 aacttggaaa agcatag 17 <210> 815 <211> 5320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 promoter large <400> 815 ttatgccgtc tagaggagac atactttcta ctcaaagcta cacacataga ctacaacgat 60 gggaaaagac gacacaccaa cagcgacttc aggaaagctg gagtggctgc taatgttaga 120 caaaataggc tttttaaaaa aggttttatt aaagaggaat gtttcgtaat gataaaagca 180 ctaatctgtg agaaagatac aacaatgata aacatacgtg cagctaataa gagagctcca 240 aaatctatga agcaaaaact cacagaatga ggggagaagc agttctacaa cagagaatgg 300 ggacttcgat actccacttt caataatgga tacaacaacc aggcagataa caaggcaaca 360 gaaggcctga acaacagtat aaaccaatta gacctaccag atatctatag ctagcacact 420 ccacccaacg acagcagaat acacattctt ctcaagcgca caagtaacat cctccaggat 480 gggccatgtt ctaggccatc aaacaaactc aggtggtttg aggccagagg cctctctttt 540 aaccaccaca ctagggcctt cggaggaggc aagcagagag ttgtcaaaga ggccctcagg 600 actgggtgca gtggctcatg actgtaatcc cagcacttta gaaggctgag gcacaaggat 660 cttttgagct caggagttca agaaatgagc acttatccac tgggcgcggt ggctcacgcc 720 agtaatccag cactttggga ggcttaggcg ggcggatcaa gaggtcagaa gctcaagacc 780 agcctgacca acatggtgaa accccgtctc tactaaaagt acaaaaatta gccgggcgtg 840 gtggcgcaca cctgtaatcc cagctacttg ggaggctgag gcaggagaat cacttgaacc 900 cgggaggtgg aggttgcagt gagtggagat cacaccattg caccccagcc tgggcaacag 960 agcgagactc cgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagaa agaaagaaaa agaaaaaaaa 1020 agtgagcatg tattttgcca gagtctggag attagaatta aattagcaaa ccagaattat 1080 agaaaaagct atttactttt aagtaaacag ctgagatttt tttttttaag tcagtgtgaa 1140 tgaagctcac agccatggtt ggagctgaga aagaaggatt tccctttagt tatgcacctg 1200 tgtcagcacc ttctgacttt ccttctaaag tctggggtgt tcctgaggat ccgtaagttt 1260 ggggttcagg gtttctacag catgctgtta cttgtgaaac atctctttaa ccatgtccca 1320 gagttgccca ggagtttaag accagcctga gcaacatagc aagacctcat ctcaacaaca 1380 acaaaaatta gaaataaatt agccaggtgt ggtgacatgt gcctgtagtc ccagctactc 1440 agaaggctga ggcatgagga tcacttgggc ccaggaagtt ggggctgcag ggagccctgt 1500 tcatgccgct gcactccagc ctgcaagaca gagcagaaaa aaagaatcag gatcctgggc 1560 agagggagga gaggggaccg gggtccagca agcacttggg gattgactga atggcgttgg 1620 ggagagatga ctccaaagtc ctggagtggg tgagaatgac tgcgagtggc ttttaggtgg 1680 ggaggttcct gcctggccac tccgggaggg gacgtggggc tgaagggtat caggtgccgt 1740 gctgagcagt ttggccttga tcctaatgcc ctggacacac gtctagggta ggaaagttga 1800 ctgatccatt ggtgatctga gtttttagac atggtggtag tccatgaggt gggtgttcat 1860 gctaagagtt tagacaggga aacctatgaa gcccttagca accctccagg gaaggggcgt 1920 ggttaaagag atgtttcata agtaacagca tggtatagaa actctgaacc ccaaatgtat 1980 gggtcctcag gaacacccca gactttagaa ggaaagtcag aaggtgctga cacgggtgta 2040 taactaaagg gaaatccttc tttctcagct ccaaccatgg ctgtgaggtt cattcacact 2100 gacttaaaaa aaaaaatctc agtttactta aaagtaaata gctttttcta taattctggt 2160 ttgctaattt aatcctagtc tccagaccct ggctaaataa atgcccattt ctccagatgg 2220 tctcaagagt ctctggacat cgtgggggcc cttccctgtt ggttggaagg tgcctcagga 2280 agaagggggt ggattctgag ttgagtcaaa acctcaaaga cccctgatgg gaaaagctct 2340 caagtgacca ccgctgtggg ccagaatgca aaactgcagg aacagaacat tcgcaggaac 2400 agaacacagt cgtattaagt gattttcccg agcaggaagt ggcatctggc ctgcggttca 2460 gtagggggag gaaagggtgg gcgcacctgc ccctggctgg cgcacctgcc aggtagcccc 2520 acgcggcacc gcgtgtgccg agcgcccctg aggatggaaa gccccacgcg gggcaggtgg 2580 cacccaccct ccgaagacgg gacgggatgg agcgttgagc ttcggggcag ctccggcccg 2640 gcccgcgctg gagacgcccg catctgccag gatggcgtct catagccctg gtgctcacac 2700 atgacgccag gaagccccag caacagtgac cgcccaggct ctagaaaata ttggacgggg 2760 tggatgaaca cccaagtgcg ctccaggaga agggatttgg caccccaagg ggcttttaaa 2820 acggtaagct tctaggggtg tctttgcccc caataatcca tagaaacaac agtcatctaa 2880 aaatagtctt gttttctgtc ctaagctcct tttaactttg ttagtcatca ccaatcctaa 2940 aataaaaccc gtgtaacgtc tcccctagta gcggctataa acaaacctac gaggaggcag 3000 gaggaagagg aaaggggcgc agggcgctcg gggagcagag ccgggggccc gcggtggccg 3060 cagaggccgg gccggggcgc agaggccggg cgagctggcc gcgctctggg ccgccgcctc 3120 cggaactccc tgcgcctggc gcgcggccac cgtggtcccg gcaacggcat taaacagagg 3180 gaaacagacc cgggattccg tcacccgggc ggggggataa ggacggcttt gagagcagac 3240 aggaaaaggg agcttttctg catggggtga aaaaattatt tattgaagga ggaggaggcg 3300 gcagcggagg aaggggaggg gcgggaggag gaggaagagc cggccgcccc cgccccggcc 3360 ccggctcctc aggagccaag ggcagcctcg ccaggtcggt cccgggctcg aggaccgcgg 3420 ctggggtcga ggggctcagt ctcccacgtg accggctggg cgcgccccgc cagacccggc 3480 ctcgggattc cctcctcccg gcgagtctcc gcccgccccg tcctggaggt ggggagaagg 3540 agggcggggc gggggggacg gaaactctcc ccgccaaatc ctggccccag gcctggggac 3600 actcgcggcg ggaagatttg gaggggaggg gagggggagg ggcgtggggg cgcggcctcg 3660 ctggagtccc cctgaccccc cgacccccgc ccaccggcct gggcgtcctc ccgcggcccc 3720 tcctcccctc ccggcgcccg gtgctctggg gcgcgtgcca cgcctggctc ggcgccgtag 3780 gggcccccgc aggtagagac ccctggaaat ggcctcgacg ccgcaggagc gaggcggcca 3840 ccaccccgct aatccgggca cgtctctcca ggccgaggcc tgcggtggaa aagccggggt 3900 tccatttgtg ctgagtcggg gcggccgaat ggagccaggc ctcgggacgc gggacggacg 3960 ggctctggcc gcgcaccttc gcgggctctg cagcgcccga ccgcctcccc cggcagggag 4020 gaggcgcttg tggggggcac ccacggggca cagtgatccc tgggggtctg cggacctcct 4080 gggccccgca gcagacacga gtttagcctt tgggtttagt ttaaatcaca taagggtgtc 4140 gtgcaatcga tttatggttt ctacacacca gacactttaa cctccaaccc cccccatcca 4200 aagccaacaa gaaaatgcgg tgccgtgttg gcagctgagc tgcgcccgaa gagacgcagg 4260 gagacgtaag agaggaaagt gtgagtggcc ggggggcctc cccccgtcag aagtcgcgca 4320 gtcgcgccca taaaacgccc cctccgggcg gctagggcag gtgagcgcgt ccccgggcct 4380 ccccacgccg gcccctgcca caggccgtct aggtcgagca gatatttaca gaataaaaat 4440 gacaataact cgacgtcccg ggacggccac gcaatctgtt agtaatttag cgggatggga 4500 atttcctttc tagggcctgc cagtgaagcg cttttccaaa tttccacagc gggggaagcc 4560 tgcgatttta cataatgact tcagcatgcc gggctttctc gacacccctc cccggccccc 4620 ggcccccgcc ccccgcccct tttccagcag ggccgggctc cctccggaca cccgcgtgga 4680 ctcaggcgtc ccgtctggcc cgttcgcccc cgtttccccc gccagcccca gcgcccccct 4740 gcccggcccc cggattcccc gttcccgccc ctacgccccc atcccctccc cgtgcgcccc 4800 tccccgtgcg cccccctccc cgtgcgcccc ccctccccgt gcgcccccct ccccgtgcgc 4860 cccccctccc cgggcgcccc cctccccggg cgccccccct ccccgtgcgc ccccccctcc 4920 ccgtgcgccc cccctccccg tgcgcgcccc gcctcttgcg cccctgcccc caggcgagcg 4980 gctgccgcgg cgcggggagg ggcgggcgct cggcgactcg tccccggggc cccgcgcggg 5040 cccgggcagc aggggcgtga tgtcacggca gggagggggc gcgggagccg ccgggccggc 5100 ggggaggcgg gggaggtgtt ttccagcttt aaaaaggcag gaggcagagc gcggccctgc 5160 gtcagagcga gactcagagg ctccgaactc gccggcggag tcgccgcgcc agatcccagc 5220 agcagggcgc gggcaccggg gcgcgggcag ggctcggagc caccgcgcag gtcctagggc 5280 cgcggccggg ccccgccacg cgcgcacacg cccctcgatg 5320 <210> 816 <211> 361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc3 promoter sequence <400> 816 gcagccaggc agggtgggcg cgcgtagggg gcggggccgg gcgcgcggca gggcgcgaga 60 gcgcacccgc ggcggcggtg gcggcgactg tgggggggcg gcggggaaca ttggctaagc 120 cgacagtgga ggcttaggca ccggtggcgg gcggctgcgg ttcctggtgc tgctcggcgc 180 gcggccagct ttcggaacgg aacgctcggc gtcgcgggcc ccgcccggaa agtttgccgt 240 ggagtcgcga cctcttggcc cgcgcggccc ggcatgaagc ggcgttgagg agctgctgcc 300 gccgcttgcc gctgccgccg ccgccgcctg aggaggagct gcagcaccct gggccacgcc 360 g 361 <210> 817 <211> 430 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc2 promoter sequence 1 <400> 817 cagagagagg ctgcgttcag actggggcac tgccatcccc tccgcatcat ggggtctgtg 60 gaccaaggta actgactctc gatcccttcc agccttttcc gctcgctcct cccggccctt 120 tcctgctgct cccgtcccgg gcagcacttt cagctcccgg cagaggtcgg tgcgggaggc 180 ctggggaccc cgctcgccct cggcgcacag gtagcggggc ccgcggaggg gcgcccgcgc 240 cccggccagg gaagggacac ttgggaaggc gactttggac aactttacgc gggggcaggg 300 aagtgtccca ggccgggatt ccctaggcca gtctgtcggg aggattttcc tctccacggg 360 acaccgggag ggattctcgc tactaaccgc tggctgttta accgtttcag cactcggctt 420 ttgacagcaa 430 <210> 818 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc2 promoter sequence 2 <400> 818 catcatgggg tctgtggacc aaggtaactg actctcgatc ccttccagcc ttttccgctc 60 gctc 64 <210> 819 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 response element consensus <400> 819 cattttttcc at 12 <210> 820 <211> 8 <212> DNA <213> 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cagagcaatc 660 tttggtaaaa ctaagatcca gaatgctgtt cactgtactg atctgccaga ggatggccta 720 ttagaggttc aatacttctt caagatcttg gataatctcg agcaccacca ccaccaccac 780 tga 783 <210> 829 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7 x1 <400> 829 Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His 1 5 10 15 Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly 20 25 30 Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp 35 40 45 Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Asn Ala 65 70 75 80 Ala His Gly Pro Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg Glu Met Glu Leu 85 90 95 Phe Phe Pro Ser Ser Gly Gly Cys Gly Pro Ala Asn Thr Ala Lys Phe 100 105 110 Thr Asn Cys Thr Cys Cys Ile Val Lys Pro His Ala Val Ser Glu Gly 115 120 125 Leu Leu Gly Lys Ile Leu Met Ala Ile Arg Asp Ala Gly Phe Glu Ile 130 135 140 Ser Ala Met Gln Met Phe Asn Met Asp Arg Val Asn Val Glu Glu Phe 145 150 155 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agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtagtggaa acaccttttt agaatggtac 180 ctgcagaaac ctggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggatag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttcctttc 360 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 393 <210> 845 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Antibody 17H6 Light chain: Amino acid sequence - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 845 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Asn Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val His Ser Ser Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 846 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 light chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 846 gatattttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgc 69 <210> 847 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 light chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 847 Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 848 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 light chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 848 agatctagtc agagcattgt acatagtagt ggaaacacct ttttagaa 48 <210> 849 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 light chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 849 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser 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atttcacact caagatcagc 60 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgc 96 <210> 855 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 light chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 855 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 856 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 light chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 856 tttcaaggtt cacatgttcc tttcacg 27 <210> 857 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 light chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 857 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 858 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 light chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 858 ttcggctcgg ggacaaagtt ggaaataaaa 30 <210> 859 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 17H6 light chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 859 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 860 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 39H5 Heavy chain: DNA sequence - Signal sequenceFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 860 atggcttggg tgtggacctt gctattcctg atggcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 60 atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 180 ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacacctaca ctggagagcc aacatatgtt 240 ggtgacttca agggacggtt tgccttctct ttggagacct ctgccagcac tgcctatttg 300 cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tttgtgttag aggtatccac 360 ggctacgtgg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 408 <210> 861 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 39H5 Heavy chain: Amino acid sequence - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 861 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ala Gln 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120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agaaatggaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tcttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 393 <210> 877 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 39H5 Light chain: Amino acid sequence - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 877 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr 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Mouse antibody 3C5 heavy chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 895 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 896 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 3C5 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 896 aactatggaa tgaac 15 <210> 897 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 3C5 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 897 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 898 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 3C5 heavy chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 898 tgggtgaagc aggctccagg aaagggttta aagtggatgg gc 42 <210> 899 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 3C5 heavy chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 899 Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly 1 5 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1077 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 1078 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 28F9 light chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1078 ggagtccctg acaggttcac cggcagtgga tcagggacag atttcacact gaaaatcagc 60 agagtggagg ctgaggattt gggagtttat ttttgc 96 <210> 1079 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 28F9 light chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1079 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 1080 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 28F9 light chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1080 tgtcaaggta cacattttcc gtggacg 27 <210> 1081 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 28F9 light chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1081 Cys Gln Gly Thr His Phe Pro 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ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 411 <210> 1085 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 Heavy chain: Amino acid sequence (137 aa) - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1085 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Asn Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Thr Ala Asn Ile His Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Pro Leu Leu Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 1086 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 1086 gaagtgaaac ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctgggggatc catgaaactc 60 tcttgtgctg cctctggatt cacttttaat 90 <210> 1087 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 1087 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn 20 25 30 <210> 1088 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1088 gacgcctgga tggac 15 <210> 1089 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1089 Asp Ala Trp Met Asp 1 5 <210> 1090 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1090 tgggtccgcc agtctccaga gaaggggctt gagtgggttg ct 42 <210> 1091 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1091 Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 1092 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1092 gaaattagaa gcacagctaa tattcataca acatactatg ctgagtctgt ccaaggg 57 <210> 1093 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1093 Glu Ile Arg Ser Thr Ala Asn Ile His Thr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Gln Gly <210> 1094 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1094 aggttcacca tctcaagaga tgattccaaa agtagtgtct acctgcaaat gaacagcttg 60 agagctgaag acactggcat ttattattgt acccca 96 <210> 1095 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1095 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Pro 20 25 30 <210> 1096 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1096 ttactctacg gatttgctta c 21 <210> 1097 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1097 Leu Leu Tyr Gly Phe Ala Tyr 1 5 <210> 1098 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1098 tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 33 <210> 1099 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 heavy chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1099 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 1100 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 Light chain: DNA sequence (393 bp) - Signal sequenceFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1100 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttgtgatga cccaaagtcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagaa ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggcac 180 ctgcagaagc caggccagtc tccaaaggtc ctgatctaca aagtttccag ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcggggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaaatacaca tgttccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393 <210> 1101 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 Light chain: Amino acid sequence (131 aa) - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1101 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp His Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Asn Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 1102 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 light chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 1102 gatgttgtga tgacccaaag tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgc 69 <210> 1103 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 light chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 1103 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 1104 <211> 48 <212> DNA 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determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1108 aaagtttcca gccgattttc t 21 <210> 1109 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 light chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1109 Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser 1 5 <210> 1110 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 light chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1110 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcggggacag atttcacact caagatcagc 60 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgc 96 <210> 1111 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 light chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1111 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 1112 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 light chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1112 tctcaaaata cacatgttcc gtacacg 27 <210> 1113 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 light chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1113 Ser Gln Asn Thr His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 1114 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 light chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1114 ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa 30 <210> 1115 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 18B4 light chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1115 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 1116 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Antibody IE4 Heavy chain: DNA sequence (408 bp) - Signal sequenceFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1116 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 60 gttcagctgc agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 120 tgtaaggctt ctggctatgc attcagtacc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atagtgatac taactacaat 240 ggaaagttca agggtaaagc cacactgact gcagacaagt cctccaacac agcctacatg 300 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctttt tctgtgcaag aggtaaccac 360 gcctctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 408 <210> 1117 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Antibody IE4 Heavy chain: Amino acid sequence (136 aa) - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1117 Met Glu Trp Pro Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Glu Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Phe Phe Cys Ala Arg Gly Asn His Ala Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 1118 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Antibody IE4 heavy chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 1118 caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60 tcctgtaagg cttctggcta tgcattcagt 90 <210> 1119 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Antibody IE4 heavy chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 1119 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 <210> 1120 <400> 1120 000 <210> 1121 <400> 1121 000 <210> 1122 <400> 1122 000 <210> 1123 <400> 1123 000 <210> 1124 <400> 1124 000 <210> 1125 <400> 1125 000 <210> 1126 <400> 1126 000 <210> 1127 <400> 1127 000 <210> 1128 <400> 1128 000 <210> 1129 <400> 1129 000 <210> 1130 <400> 1130 000 <210> 1131 <400> 1131 000 <210> 1132 <400> 1132 000 <210> 1133 <400> 1133 000 <210> 1134 <400> 1134 000 <210> 1135 <400> 1135 000 <210> 1136 <400> 1136 000 <210> 1137 <400> 1137 000 <210> 1138 <400> 1138 000 <210> 1139 <400> 1139 000 <210> 1140 <400> 1140 000 <210> 1141 <400> 1141 000 <210> 1142 <400> 1142 000 <210> 1143 <400> 1143 000 <210> 1144 <400> 1144 000 <210> 1145 <400> 1145 000 <210> 1146 <400> 1146 000 <210> 1147 <400> 1147 000 <210> 1148 <400> 1148 000 <210> 1149 <400> 1149 000 <210> 1150 <400> 1150 000 <210> 1151 <400> 1151 000 <210> 1152 <400> 1152 000 <210> 1153 <400> 1153 000 <210> 1154 <400> 1154 000 <210> 1155 <400> 1155 000 <210> 1156 <400> 1156 000 <210> 1157 <400> 1157 000 <210> 1158 <400> 1158 000 <210> 1159 <400> 1159 000 <210> 1160 <400> 1160 000 <210> 1161 <400> 1161 000 <210> 1162 <400> 1162 000 <210> 1163 <400> 1163 000 <210> 1164 <400> 1164 000 <210> 1165 <400> 1165 000 <210> 1166 <400> 1166 000 <210> 1167 <400> 1167 000 <210> 1168 <400> 1168 000 <210> 1169 <400> 1169 000 <210> 1170 <400> 1170 000 <210> 1171 <400> 1171 000 <210> 1172 <400> 1172 000 <210> 1173 <400> 1173 000 <210> 1174 <400> 1174 000 <210> 1175 <400> 1175 000 <210> 1176 <400> 1176 000 <210> 1177 <400> 1177 000 <210> 1178 <400> 1178 000 <210> 1179 <400> 1179 000 <210> 1180 <400> 1180 000 <210> 1181 <400> 1181 000 <210> 1182 <400> 1182 000 <210> 1183 <400> 1183 000 <210> 1184 <400> 1184 000 <210> 1185 <400> 1185 000 <210> 1186 <400> 1186 000 <210> 1187 <400> 1187 000 <210> 1188 <400> 1188 000 <210> 1189 <400> 1189 000 <210> 1190 <400> 1190 000 <210> 1191 <400> 1191 000 <210> 1192 <400> 1192 000 <210> 1193 <400> 1193 000 <210> 1194 <400> 1194 000 <210> 1195 <400> 1195 000 <210> 1196 <400> 1196 000 <210> 1197 <400> 1197 000 <210> 1198 <400> 1198 000 <210> 1199 <400> 1199 000 <210> 1200 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1200 acctactgga tgaac 15 <210> 1201 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1201 Thr Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 1202 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1202 tgggtgaagc agaggcctgg acagggtctt gagtggattg ga 42 <210> 1203 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1203 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 1204 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1204 cagatttatc ctggagatag tgatactaac tacaatggaa agttcaaggg t 51 <210> 1205 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1205 Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 1206 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1206 aaagccacac tgactgcaga caagtcctcc aacacagcct acatgcagct cagcagccta 60 acatctgagg actctgcggt ctttttctgt gcaaga 96 <210> 1207 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1207 Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Phe Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 1208 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1208 ggtaaccacg cctctatgga ctac 24 <210> 1209 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1209 Gly Asn His Ala Ser Met Asp Tyr 1 5 <210> 1210 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1210 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tca 33 <210> 1211 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 heavy chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1211 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 1212 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Antibody IE4 Light chain: DNA sequence (393 bp) - Signal sequenceFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1212 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 180 ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaaaaacaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 393 <210> 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atctcttgc 69 <210> 1215 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 light chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 1215 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 1216 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 light chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1216 agatctagtc agagccttgt acacagtaat ggaaacacct atttacat 48 <210> 1217 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 light chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1217 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 1218 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 light chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1218 tggtacctgc agaagccagg ccagtctcca aagctcctga tctac 45 <210> 1219 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 1224 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 light chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1224 tctcaaaaaa cacatgttcc gtggacg 27 <210> 1225 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 light chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1225 Ser Gln Lys Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 1226 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 light chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1226 ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 30 <210> 1227 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody IE4 light chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1227 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 1228 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 Heavy chain: DNA sequence (411 bp) - Signal sequenceFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1228 atgtacttgg gactgaacta tgtattcata gtttttctct taaatggtgt ccagagtgaa 60 gtgaagcttg aggagtctgg aggaggcttg gtacaacctg gaggatccat gaaactctct 120 tgtgctgcct ctggattcac ttttagtgac gcctggatgg actgggtccg ccagtctcca 180 gagaaggggc ttgaatgggt tgctgaaatt agaagcaaag ctactaatca tgcaacatac 240 tatgctgagt ctgtgaaagg gaggttcacc atctcaagag atgattccaa aagtagtgtc 300 tacctgcaaa tgaacagctt aagagctgaa gacactggca tttattactg taccccccta 360 ctttacgggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 411 <210> 1229 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 Heavy chain: Amino acid sequence (137 aa) - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1229 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg 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antibody 29H1 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1232 gacgcctgga tggac 15 <210> 1233 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1233 Asp Ala Trp Met Asp 1 5 <210> 1234 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1234 tgggtccgcc agtctccaga gaaggggctt gaatgggttg ct 42 <210> 1235 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1235 Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 1236 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1236 gaaattagaa gcaaagctac taatcatgca acatactatg ctgagtctgt gaaaggg 57 <210> 1237 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1237 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Thr Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 1238 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1238 aggttcacca tctcaagaga tgattccaaa agtagtgtct acctgcaaat gaacagctta 60 agagctgaag acactggcat ttattactgt accccc 96 <210> 1239 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1239 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Pro 20 25 30 <210> 1240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1240 ctactttacg ggtttgctta c 21 <210> 1241 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1241 Leu Leu Tyr Gly Phe Ala Tyr 1 5 <210> 1242 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1242 tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 33 <210> 1243 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 heavy chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1243 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 1244 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 Light chain: DNA sequence (393 bp) - Signal sequenceFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1244 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctggtcagag ccttgtacac agtaatggac acacctattt acattggtac 180 ctgcagaagc caggccagtc tccaaggctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcaagggcag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaactacaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 393 <210> 1245 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 Light chain: Amino acid sequence (131 aa) - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1245 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly His Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Ala Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 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Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 light chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1250 tggtacctgc agaagccagg ccagtctcca aggctcctga tctac 45 <210> 1251 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 light chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1251 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 1252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 light chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1252 aaagtttcca accgattttc t 21 <210> 1253 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 light chain variable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence <400> 1253 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 1254 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 29H1 light chain variable framework 3 (FW3) sequence <400> 1254 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcaagggcag atttcacact caagatcagc 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catgaaactc 60 tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt 90 <210> 1295 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 32C1 heavy chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 1295 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 1296 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 32C1 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1296 aattactgga tgaac 15 <210> 1297 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 32C1 heavy chain variable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence <400> 1297 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 1298 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 32C1 heavy chain variable framework 2 (FW2) sequence <400> 1298 tgggtccgcc agtctccaga gaaggggctt gagtgggttg ct 42 <210> 1299 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse 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Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 32C1 light chain variable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence <400> 1321 Ser Gln Ile Thr His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 1322 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 32C1 light chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1322 ttcggagggg ggaccaatct ggaaataaaa 30 <210> 1323 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 32C1 light chain variable framework 4 (FW4) sequence <400> 1323 Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 1324 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 45C11 Heavy chain: DNA sequence (423 bp) - Signal sequenceFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1324 atgaaatgca gctgggttat cttcttcctg atggcagtgg ttacaggggt caattcagag 60 gttcagctgc agcagtctgg ggcagacctt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc 120 tgcacagctt ctggcttcaa cattaaagac acctttatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 gaacagggcc tggagtggat tggaaggatt gatcctgcga atggtaatac taaatatgac 240 ccgaaattcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctacctg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtgctaa accgtatggt 360 aactacggct attactatgc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tca 423 <210> 1325 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 45C11 Heavy chain: Amino acid sequence (141 aa) - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1325 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Lys Asp Thr Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp 65 70 75 80 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Tyr Gly Asn Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Ala Leu 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Mouse antibody 45C11 Light chain: Amino acid sequence (127 aa) - Signal peptideFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4 <400> 1341 Met Arg Phe Gln Val Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Gln Cys Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser 35 40 45 Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn 100 105 110 Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 1342 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 45C11 light chain variable framework 1 (FW1) sequence <400> 1342 gatgtccaga taacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60 attaattgc 69 <210> 1343 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080 gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140 gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1200 aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260 gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctgataa 1479 <210> 1583 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mu20A10CAR T841BB3z <400> 1583 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys 50 55 60 Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Gly Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Ser Asp Ser Val Lys 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gaccgacagc gactgcagag 420 acaacgcccc tcggaccatc ttcatcatca gcatgtacaa ggacagccag cctagaggca 480 tggccgtgac catctctgtg aagtgcgaga agatcagcac cctgagctgc gagaacaaga 540 tcatcagctt caaagagatg aacccgccgg acaacatcaa ggacaccaag agcgacatca 600 tattcttcca gcggagcgtg cccggccacg acaacaagat gcagtttgag agcagcagct 660 acgagggcta cttcctggcc tgcgagaaag agcgggacct gttcaagctg atcctgaaga 720 aagaggacga actgggcgac cgcagcatca tgttcaccgt gcagaacgag gactgataa 779 <210> 1642 <211> 868 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2NFATc1X6IL18 <400> 1642 ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60 ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120 ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 180 actagttagg cgtgtacggt gggaggccta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca 240 gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc 300 cagctcgaga gacccaatgc tagccaccat ggccttacca gtgaccgcct tgctcctgcc 360 gctggccttg ctgctccacg ccgccaggcc gtacttcggc aagctggaaa gcaagctgag 420 cgtgatccgg aacctgaacg accaggtgct gttcatcgat cagggcaaca gacccctgtt 480 cgaggacatg accgacagcg actgcagaga caacgcccct cggaccatct tcatcatcag 540 catgtacaag gacagccagc ctagaggcat ggccgtgacc atctctgtga agtgcgagaa 600 gatcagcacc ctgagctgcg agaacaagat catcagcttc aaagagatga acccgccgga 660 caacatcaag gacaccaaga gcgacatcat attcttccag cggagcgtgc ccggccacga 720 caacaagatg cagtttgaga gcagcagcta cgagggctac ttcctggcct gcgagaaaga 780 gcgggacctg ttcaagctga tcctgaagaa agaggacgaa ctgggcgacc gcagcatcat 840 gttcaccgtg cagaacgagg actgataa 868 <210> 1643 <211> 2347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Best antibodies with inducible IL18 +/ 1XX mutations in ITAMs of CD3zeta - MNC2 - muMNC2841BB3zFoxp3NFATIL18 <400> 1643 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggaggtcc agctggagga gtcaggggga ggcttagtga agcctggagg gtccctgaaa 120 ctctcctgtg cagcctctgg attcactttc agtggctatg ccatgtcttg ggttcgccag 180 actccggaga agaggctgga gtgggtcgca 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aacatccatc 240 ctgtggagga agaagatgct gcaacctatt actgtcagca cagtagggag cttcctctca 300 cgttcggtgc tgggaccaag ctggagctga aa 332 <210> 1823 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse antibody 3C2B1 Light chain sequence Signal peptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 <400> 1823 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Thr Ser 20 25 30 Asp Tyr Asn Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 1824 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hu20A10MR scFV <400> 1824 gaggtgcagc tggttgaatc tggcggcgga cttgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt 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tcatcgatca 1800 gggcaacaga cccctgttcg aggacatgac cgacagcgac tgcagagaca acgcccctcg 1860 gaccatcttc atcatcagca tgtacaagga cagccagcct agaggcatgg ccgtgaccat 1920 ctctgtgaag tgcgagaaga tcagcaccct gagctgcgag aacaagatca tcagcttcaa 1980 agagatgaac ccgccggaca acatcaagga caccaagagc gacatcatat tcttccagcg 2040 gagcgtgccc ggccacgaca acaagatgca gtttgagagc agcagctacg agggctactt 2100 cctggcctgc gagaaagagc gggacctgtt caagctgatc ctgaagaaag aggacgaact 2160 gggcgaccgc agcatcatgt tcaccgtgca gaacgaggac tgataa 2206 <210> 1879 <211> 2206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hu25E6-8-28-3z1XX-Foxp3-NFAT-IL-18 <400> 1879 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggaggtgc agctggtgga atctggcgga ggactggtca agcctggagg cagcctgaga 120 ctgagctgcg ccgccagcgg cttcacattc agcagctacg gcatgagctg ggtgcggcag 180 gcccctggca agggcctgga atgggtcagc accatcagca acggcggaag acacaccttc 240 taccccgaca gcgtgaaggg cagattcacc atctcaagag ataacgccaa gaacagcctg 300 tacctgcaga tgaacagcct gcgggccgag gacaccgccg tgtactactg cgccagacag 360 accggcacag agggctggtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccagc 420 ggcggtggcg gaagcggagg cggtggctcc ggtggcggag gcagcgacat cgtgatgacc 480 cagacccctc tgtctctgag cgtgacccct ggccagcctg ccagcatctc ttgtaaaagc 540 agccagagcc tgctggacag cgacggcaag acctacctga actggtacct gcagaagccc 600 ggccaaagcc ctcagctgct gatctacctg gtgtccaagc tggatagcgg tgttcctgat 660 agattcagcg gatctggcag cggcaccgac ttcaccctga agatcagcag agtggaagcc 720 gaggacgtgg gcgtgtacta ctgctggcag ggcacacact tcccccagac attcggccag 780 ggcaccaagg tggaaatcaa gaagcacctg tgtccttctc cactgttccc cggccctagc 840 aagcctttct gggtcctggt ggtggtgggc ggagtgctgg cctgctacag cctgctggtg 900 accgtggcct ttatcatctt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac 960 tacatgaaca tgactcctag aagacctggg cctaccagaa agcattacca gccctatgcc 1020 ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1080 cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1140 gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1200 aggaagaacc ctcaggaagg cctgttcaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1260 ttcagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggccttttc 1320 cagggtctca gtacagccac caaggacacc ttcgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1380 cctcgctgat aagtttaaac tgccagaaca tttctctggc ctaactggcc ggtaccggct 1440 tcattttttc catttactgc agaggcttca ttttttccat ttactgcaga ggcttcattt 1500 tttccattta ctgcagaact agttaggcgt gtacggtggg aggcctatat aagcagagct 1560 cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 1620 agacaccggg accgatccag cctcgagaga cccaatgcta gccaccatgg ccttaccagt 1680 gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc gccaggccgt acttcggcaa 1740 gctggaaagc aagctgagcg tgatccggaa cctgaacgac caggtgctgt tcatcgatca 1800 gggcaacaga cccctgttcg aggacatgac cgacagcgac tgcagagaca acgcccctcg 1860 gaccatcttc atcatcagca tgtacaagga cagccagcct agaggcatgg ccgtgaccat 1920 ctctgtgaag tgcgagaaga tcagcaccct gagctgcgag aacaagatca tcagcttcaa 1980 agagatgaac ccgccggaca acatcaagga caccaagagc gacatcatat tcttccagcg 2040 gagcgtgccc ggccacgaca acaagatgca gtttgagagc agcagctacg agggctactt 2100 cctggcctgc gagaaagagc gggacctgtt caagctgatc ctgaagaaag aggacgaact 2160 gggcgaccgc agcatcatgt tcaccgtgca gaacgaggac tgataa 2206

Claims (71)

1. 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 이의 단편으로서, 항체는 PSMGFR 펩티드(서열번호 2) 또는 이 펩티드의 단편에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
2. 제1항에 있어서, N-10 펩티드(서열번호 3), N-19 펩티드(서열번호 4), N-23 펩티드(서열번호 5), N-26 펩티드(서열번호 6), N-30 펩티드(서열번호 7), N-10/C-5 펩티드(서열번호 8), N-19/C-5 펩티드(서열번호 9) 또는 C-5 펩티드(서열번호 825)에 결합하는 항체 또는 이의 단편.
3. 제1항에 있어서, N-26 서열 ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6) 내에 입체구조적 에피토프 SVSDV(서열번호 1751) 및 FPSA(서열번호 1747)를 포함하는 펩티드와 상호작용하는 항체 또는 이의 단편으로서, FPFS(서열번호 1747)의 돌연변이 또는 결실이 상기 항체 또는 이의 단편의 N-26 펩티드에 대한 결합을 파괴하는 것인 항체 또는 이의 단편.
4. 제1항에 있어서, N-19 서열 ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 4) 내에 입체구조적 에피토프 ASRYNLT(서열번호 1745), SVSDV(서열번호 1751) 및 FPSA(서열번호 1747)를 포함하는 펩티드와 상호작용하는 항체 또는 이의 단편으로서, ASRYNLT(서열번호 1745)의 돌연변이 또는 결실이 상기 항체 또는 이의 단편의 N-26 펩티드에 대한 결합을 파괴하는 것인 항체 또는 이의 단편.
5. 제1항에 있어서, C-10 펩티드(서열번호 825)에 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편.
6. 제5항에 있어서, N-10 펩티드(서열번호 3)에 결합하지만 C-10 펩티드(서열번호 825)에는 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편.
7. 제1항에 있어서, NME7_AB와 MUC1* 사이의 상호작용을 억제하는 항체 또는 이의 단편.
8. 제1항에 있어서, NME7_AB와 PSMGFR 펩티드(서열번호 2) 사이의 상호작용을 억제하는 항체 또는 이의 단편.
9. 제2항에 있어서, NME7_AB와, N-10 펩티드(서열번호 3), N-19 펩티드(서열번호 4), N-23 펩티드(서열번호 5), N-26 펩티드(서열번호 6), N-30 펩티드(서열번호 7), N-10/C-5 펩티드(서열번호 8), N-19/C-5 펩티드(서열번호 9) 또는 C-5 펩티드(서열번호 825) 사이의 상호작용을 억제하는 항체 또는 이의 단편.
10. 제1항에 있어서, 항체는 MUC1 막횡단 효소 절단 생성물을 인식하는 것인 항체 또는 이의 단편.
11. 제10항에 있어서, 절단 효소가 MMP14 또는 MMP9, 또는 이 효소의 촉매 활성 단편인 항체 또는 이의 단편.
12. 제1항에 있어서, PSMGFR(서열번호 2) 또는 이의 단편에 결합하는 항체 또는 이의 단편으로서, PSMGFR(서열번호 2) 내의 아미노산 서열의 존재가 이 항체의 PSMGFR에 대한 결합을 유도하는 것인 항체 또는 이의 단편.
13. 제12항에 있어서, 결합 입체구조적 유도 펩티드의 아미노산 서열이 N-10 펩티드(서열번호 3)에 존재하는 것인 항체.
14. 제12항에 있어서, 결합 입체구조적 유도 펩티드 서열의 선형 형태에 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편으로서, 상기 펩티드의 선형 형태가 변성된 형태인 항체 또는 이의 단편.
15. 제14항에 있어서, 결합 입체구조적 유도 펩티드 서열이 N-26 펩티드 서열 ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6)에 있고, FPFS(서열번호 1747)의 돌연변이 또는 결실이 항체 또는 이의 단편의 N-26 펩티드에 대한 결합을 파괴하는 것인 항체 또는 이의 단편.
16. 제14항에 있어서, 결합 입체구조적 유도 펩티드 서열이 N-19 서열 ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 4) 내에 위치하고, ASRYNLT(서열번호 1745)의 돌연변이 또는 결실이 상기 항체 또는 이의 단편의 N-19 펩티드에 대한 결합을 파괴하는 것인 항체 또는 이의 단편.
17. 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 이의 단편으로서, 결합 유도 펩티드 서열이 N-26 서열 ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6) 내에 위치하고, FPFS(서열번호 1747) 내의 돌연변이 또는 결실이 상기 항체 또는 이의 단편의 PSMGFR에 대한 결합을 파괴하는 것인 항체 또는 이의 단편.
18. 제17항에 있어서,
    중쇄 CDR1이 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 F 또는 I, 위치 2에서 T, 위치 3에서 F, 위치 4에서 S, 위치 5에서 T, G 또는 R, 위치 6에서 Y, 위치 7에서 A, G 또는 T, 위치 8에서 M 및 위치 9에서 S;
    중쇄 CDR2가 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 T, 위치 2에서 I 또는 S, 위치 3에서 I 또는 S, 위치 5에서 G 또는 R, 위치 6에서 G 또는 A, 위치 9에서 T 또는 I, 위치 10에서 Y, 위치 11에서 Y, 위치 12에서 P 또는 S 및 위치 13 내지 17에서 DSVKG;
    중쇄 CDR3이 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 2에서 G, L 또는 N, 위치 4에서 G 또는 T, 위치 7에서 Y, 위치 12에서 D 또는 E, 위치 14에서 A, 및 위치 15에서 Y;
    경쇄 CDR1이 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 K 또는 R, 위치 2에서 A 또는 S, 위치 3에서 S, 위치 4에서 K 또는 Q, 위치 5에서 S, 위치 6에서 L 또는 V, 위치 7에서 L, 위치 10에서 T 또는 S, 위치 15에서 Y, 및 위치 16에서 I, L 또는 M;
    경쇄 CDR2가 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 L 또는 W, 또는 S, 위치 2에서 A 또는 T, 위치 3에서 S, 위치 4에서 N 또는 T, 위치 5에서 L 또는 R, 위치 6에서 E 또는 A, 및 위치 7에서 S;
    경쇄 CDR3이 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편: 위치 1에서 Q, 위치 2에서 H 또는 Q, 위치 3에서 S, Q 또는 R, 위치 4에서 R, S 또는 Y, 위치 5에서 E, L 또는 S, 위치 6에서 L 또는 S, 위치 7에서 P 또는 S, 위치 8에서 F 또는 L, 및 위치 9에서 T.
19. 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 이의 단편으로서, 결합 입체구조적 유도 펩티드가 N-26 서열 ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6) 내에 있고, FPFS(서열번호 1747), SVSDV(서열번호 1751) 또는 ASRYNLT(서열번호 1745) 내의 돌연변이 또는 결실이 항체 또는 이의 단편의 PSMGFR에 대한 결합을 파괴하는 것인 항체 또는 이의 단편.
20. 제17항에 있어서,
    중쇄 CDR1이 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 F 또는 I, 위치 2에서 T 또는 A, 위치 3에서 F, 위치 4에서 S, 위치 5에서 T, G 또는 R, 위치 6에서 Y 또는 F, 위치 7에서 A, G 또는 T, 위치 8에서 M, 및 위치 9에서 S;
    중쇄 CDR2가 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 T 또는 A, 위치 2에서 I 또는 S, 위치 3에서 I 또는 S, 위치 4에서 N, S, T 또는 G, 위치 5에서 G 또는 R, 위치 6에서 G 또는 A, 위치 7에서 G, T 또는 D, 위치 8에서 Y, K, H 또는 S, 위치 9에서 T 또는 I, 위치 10에서 Y 또는 F, 위치 11에서 Y, 위치 12에서 P 또는 S, 및 위치 13에서 D, 위치 14에서 S 또는 T, 위치 15에서 V 또는 L, 및 위치 16-17에서 KG;
    중쇄 CDR3이 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 2에서 G, L 또는 N, 위치 3에서 G, T 또는 Y, 위치 4에서 G 또는 T, 위치 7에서 Y, 위치 10에서 Y, A 또는 G, 위치 11에서 M, D 또는 F, 위치 12에서 D 또는 E, 및 위치 14 및 15에서 AY;
    경쇄 CDR1이 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 1에서 K 또는 R, 위치 2에서 A 또는 S, 위치 3에서 S 또는 R, 위치 8에서 S, Y, I 또는 V, 위치 10에서 T 또는 S, 위치 12에서 G, S, D 또는 Q, 위치 13에서 V, Y, K 또는 N, 위치 14에서 N, S 또는 T, 위치 15에서 Y 또는 F, 및 위치 16에서 I, L 또는 M;
    경쇄 CDR2가 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하고: 위치 2에서 A, T 또는 V, 위치 3에서 S, 위치 4에서 N, T 또는 K, 위치 5에서 L 또는 R, 위치 6에서 E, A, F 또는 D, 및 위치 7에서 S;
    경쇄 CDR3이 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편: 위치 1에서 Q, F 또는 W, 위치 2에서 H 또는 Q, 위치 4에서 R, S, T, Y 또는 N, 위치 5에서 E, L, S 또는 H, 위치 6에서 L, S, V, D 또는 Y, 위치 7에서 P 또는 S, 및 위치 9에서 T.
21. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 FTFSGYAMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 TISSGGTYIYYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 -LGGDNYYEYFDV--를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 RASKS--VSTSGYSYMH를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 LASNLES를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 QHSRELPFT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 MNC2인 항체 또는 이의 단편.
22. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 FTFSRYGMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 TISGGGTYIYYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 DNYGRNYDYGMDY--를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 -------SATSSVSYIH를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 STSNLAS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 QQRSSSPFT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 MNE6인 항체 또는 이의 단편.
23. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 FAFSTFAMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 AISNGGGYTYYPDTLKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 ----RYYDLYFDL--을 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 RSSQNIV-HSNGNTYLE를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 KVSNRFS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 FQDSHVPLT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 B2인 항체 또는 이의 단편.
24. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 FTFSRYGMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 TISSGGTYIYYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 DNYGSSYDYAMDY--를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 RSSQTIV-HSNGNTYLE를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 KVSNRFS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 FQDSHVPLT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 B7인 항체 또는 이의 단편.
25. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 FTFSRYGMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 TISSGGTYIYYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 DNYGSSYDYAMDY--를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 -------SASSSVSYMH를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 TTSNLAS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 QQRSSYPF-를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 B9인 항체 또는 이의 단편.
26. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 FTFSTYAMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 AISNGGGYTYYPDSLKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 ----RYYDHYFDY--를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 --RASESVATYGNNFMQ를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 LASTLDS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 QQNNEDPPT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 8C7F3인 항체 또는 이의 단편.
27. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 FAFSTFAMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 AISNGGGYTYYPDTLKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 ----RYYDLYFDL--을 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 RSSQNIV-HSNGNTYLE를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 KVSNRFS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 FQDSHVPLT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 H11인 항체 또는 이의 단편.
28. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 SYGVH를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 VIWPGGSTNYNSTLMSRM을 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 DRTPRVGAWFAY를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 RASESVATYGNNFMQ를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 LASTLDS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 QQNNEDPPT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 B12인 항체 또는 이의 단편.
29. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 FTFSTYAMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 -SIGRAGSTYYSDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 ---GPIYNDYDEFAY를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 KSSQSVLYSSNQKNYLA를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 WASTRES를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 HQYLSSLT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 20A10인 항체 또는 이의 단편.
30. 제17항에 있어서,
    컨센서스 서열 ITFSTYTMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 TISTGGDKTYYSDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 -GTTAMYYYAMDY를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 RASKS---ISTSDYNYIH를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 LASNLES를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 QHSRELPLT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 3C2B1인 항체 또는 이의 단편.
31. PSMGFR(서열번호 2)의 항체 결합 입체구조적 유도 펩티드 ASRYNLT(서열번호 1745)의 존재를 필요로 하는, 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 이의 단편.
32. 제31항에 있어서,
    컨센서스 서열 FTFSSYGMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 TISNGGRHTFYPDSVKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 QTGTEGWFAY를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 KSSQSLLDSDGKTYLN을 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 LVSKLDS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 WQGTHFPQT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 25E6인 항체 또는 이의 단편.
33. PSMGFR(서열번호 2)의 항체 결합 입체구조적 유도 펩티드 SVSDV(서열번호 1761)의 존재를 필요로 하는, 암의 진단, 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 이의 단편.
34. 제33항에 있어서,
    컨센서스 서열 FTFSTYAMS를 포함하는 중쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 AISNGGGYTYYPDSLKG를 포함하는 중쇄 CDR2;
    컨센서스 서열 RYYDHYFDY를 포함하는 중쇄 CDR3;
    컨센서스 서열 RSSQTIVHSNGNTYLE를 포함하는 경쇄 CDR1;
    컨센서스 서열 KVSNRFS를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    컨센서스 서열 FQDSHVPLT를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 가진 5C6F3인 항체.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤린, 낙타, 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편.
36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이 scFv 또는 scFv-Fc이고, 이의 가변 영역이 뮤린, 낙타, 인간 또는 인간화될 수 있는 것인 항체 또는 이의 단편.
37. 제36항의 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
38. 제36항의 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 보조자극 도메인 또는 CD3-제타 신호전달 도메인 내에 돌연변이를 추가로 포함하는 CAR.
39. 제38항에 있어서, 티로신이 CD28 또는 4-1BB에서 돌연변이된 것인 CAR.
40. 제38항에 있어서, CD3-제타가 1XX 돌연변이를 함유하는 것인 CAR.
41. 제37항의 CAR을 포함하는 면역 세포.
42. 제41항에 있어서, 면역 세포, T 세포, NK 세포, 수지상 세포 또는 비만 세포로 분화될 수 있는 줄기 세포인 면역 세포.
43. 제37항의 CAR, 및 이 CAR의 특이성과 상이한 특이성을 가진 생물학적 인식 유닛을 가진 제2 물질을 포함하는, 세포에서 발현된 세포 조성물.
44. 제43항에 있어서, 제2 물질이 PD-1, PDL-1, 또는 다른 체크포인트 억제제에 결합하는 것인 조성물.
45. 제43항에 있어서, 제2 물질이 NME7에 결합하는 것인 조성물.
46. 제43항에 있어서, 제2 물질이 사이토카인인 조성물.
47. 제46항에 있어서, 사이토카인이 IL-12인 조성물.
48. 제46항에 있어서, 사이토카인이 IL-18인 조성물.
49. 제43항에 있어서, 제2 물질이 c-Jun인 조성물.
50. 제37항의 CAR을 코딩하는 핵산 및 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 기재된 제2 물질을 코딩하는 핵산을 발현하도록 조작된 면역 세포로서, 상기 제2 물질이 유도성 프로모터로부터 발현되는 것인 면역 세포.
51. 제50항에 있어서, 제2 물질이 활성화된 면역 세포의 요소에 의해 활성화되는 유도성 프로모터로부터 발현되는 것인 면역 세포.
52. 제51항에 있어서, 제2 물질이 NFAT 유도성 프로모터로부터 발현되는 것인 면역 세포.
53. 제52항에 있어서, NFAT가 NFATc1, NFATc3 또는 NFATc2인 면역 세포.
54. 제50항에 있어서, 제2 물질이 사이토카인인 면역 세포.
55. 제51항에 있어서, 사이토카인이 IL-7, IL-15 또는 IL-18인 면역 세포.
56. 제50항에 있어서, 제2 물질을 코딩하는 핵산이 Foxp3 프로모터 또는 인핸서 영역에 삽입되는 것인 면역 세포.
57. 제56항에 있어서, 사이토카인이 IL-18인 면역 세포.
58. 제56항에 있어서, 사이토카인이 NFAT 유도성 프로모터로부터 발현되는 것인 면역 세포.
59. 제36항의 항체 단편을 포함하는 BiTE 구축물.
60. 제35항의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC).
61. PSMGFR(서열번호 2) 및 N-10(서열번호 3)에 특이적으로 결합하고;
    (i) 전체 길이 MUC1에 결합하지 않거나;
    (ii) C-10(서열번호 825)에 결합하지 않거나;
    (iii) NME1 또는 NME7_AB의 MUC1* 세포외 도메인 또는 PSMGFR 펩티드에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하거나;
    (iv) 절단 효소에 의한 절단에 의해 생성된 MUC1*를 인식하거나;
    (v) 입체구조적 에피토프를 인식하고 선형 에피토프를 인식하지 않거나;
    (vi) 조직에 대한 면역조직화학에 의해 암 선택적인
    항체 또는 이의 단편.
62. 제61항에 있어서, 기준 (i) 내지 (vi) 중 4개가 충족되는 것인 항체 또는 이의 단편.
63. 제61항에 있어서, 기준 (i) 내지 (vi) 중 5개가 충족되는 것인 항체 또는 이의 단편.
64. 제61항에 있어서, 기준 (i) 내지 (vi) 중 6개가 충족되는 것인 항체 또는 이의 단편.
65. 제61항에 있어서, 적어도 기준 (vi)이 충족되는 것인 항체 또는 이의 단편.
66. 제61항에 있어서, 절단 효소가 MMP-9인 항체 또는 이의 단편.
67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암, 췌장암, 난소암, 폐암, 결장암, 위암 또는 식도암인 항체 또는 이의 단편.
68. 제61항의 항체를, 항원 저밀도 세포 종양의 치료를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함하는, 항원 저밀도 세포 종양을 치료하는 방법.
69. 제68항에 있어서, 항체가 CAR에 있고, CAR의 세포내 부분이 1xx 돌연변이를 포함하는 CD3 제타인 방법.
70. 제59항에 있어서, 항체 20A10의 단편 및 CD3에 대한 항체를 포함하는 BiTE.
71. 제70항에 있어서, 20A10-OKT3-BiTE 또는 20A10-12F6-BiTE인 BiTE.

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