KR102604433B1 - 항-icos 항체 - Google Patents

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Abstract

ICOS (유도성 T 세포 보조자극제)와 결합하는 항체. 조절 T 세포와 효과기 T 세포 간의 비율을 조절하여 환자의 면역계를 자극하기 위한, 암을 치료하는 용도를 포함하는 항-ICOS 항체의 치료적 용도. 유전자전환 녹아웃 마우스를 사용하여, 종 교차-반응성 항체를 포함하는, 항-ICOS 항체를 생산하는 방법.

Description

항-ICOS 항체
본 발명은 포유동물의 면역 반응, 특히 T 세포 반응을 자극하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 환자에서 항-종양 T 세포 반응의 촉진에 의한 항-종양 요법을 포함하는 면역-종양학에서 상기 조성물의 의학적 용도뿐만 아니라, 다른 질환 및 병태에서 상기 조성물의 용도에 관한 것이고, 예를 들어 효과기 T 세포의 자극 및/또는 조절 T 세포의 고갈을 통해 효과기 T 세포 활성을 선호하게 효과기 T 세포와 조절 T 세포 간의 균형을 조절하는 치료적 유익이 있다.
ICOS (유도성 T 세포 보조자극제)는 면역 반응, 상세하게는 1999년에 처음 확인된 체액성 면역 반응을 조절하는 데 관여하는 CD28 유전자 패밀리의 구성원이다[1]. 이것은 55 kDa 막통과 단백질이고, 두 개의 차별적으로 글리코실화된 서브유닛을 갖는 디설파이드 연결된 동종이량체로서 존재한다. ICOS는 T 림프구에서만 배타적으로 발현되며, 다양한 T 세포 하위집합에서 발견된다. 이것은 미감작 T 림프구에서 낮은 수준으로 존재하지만, 이의 발현은 TCR의 관여 및 CD28로의 보조-자극 시와 같은 전-염증성 자극에 반응하여 상향 조절되면서, 면역 활성화 시 신속하게 유도된다[2,3]. ICOS는 T 세포 활성화의 후기 단계, 기억 T 세포 형성, 중요하게는 T 세포 의존적 B 세포 반응을 통한 체액성 반응의 조절에서 역할을 한다[4,5]. 세포 내에서, COS는 PI3K와 결합하여 포스포이노시타이드-의존성 키나제 1 (PDK1) 및 단백질 키나제 B (PKB)를 활성화시킨다. ICOS의 활성화는 세포 사망을 예방하고 세포 대사를 상향 조절한다. ICOS의 부재 시 (ICOS 녹아웃) 또는 항-ICOS 중화 항체의 존재 시에는 전-염증 반응을 억압할 것이다.
ICOS는 B-세포 및 항원 제시 세포 (APC)에서 발현되는 ICOS 리간드 (ICOSL)에 결합한다[6,7]. 보조자극성 분자로서 이것은 TCR 매개성 면역 반응 및 항원에 대한 항체 반응을 조절하는 작용을 한다. T 조절 세포에서 ICOS의 발현은 이 세포 유형이 암 세포의 면역 감시에 부정적인 역할을 하는 것으로 제시되었기 때문에 중요할 수 있고 - 난소암에서 이 현상의 증거가 출현하고 있다[8]. 중요하게, ICOS 발현은 종양 미세환경에 존재하는 CD4+ 및 CD8+ 효과기 세포와 비교하여 종양내 조절 T 세포 (Treg)에서 더 높은 것으로 보고되어 왔다. Fc-매개성 세포 효과기 기능을 가진 항체를 사용하는 Treg의 고갈은 전-임상 모델에서 강력한 항-종양 효능을 입증하여 왔다[9]. 나온 증거는 면역 체크포인트 억제제로 치료받는 환자뿐만 아니라 동물 모델의 항-종양 효과에는 ICOS를 내포하고 있다. ICOS 또는 ICOSL이 결핍된 마우스에서 항-MTLA4 요법의 항-종양 효과는 감소하지만[10], 정상 마우스에서는 ICOS 리간드가 흑색종 및 전립선 암에서 항-MTLA4 치료의 효과를 증가시킨다[11]. 또한, 인간에서 진행성 흑색종 환자에 대한 회고적 연구는 이필리무마브 (항-CTLA4) 치료 후 ICOS의 증가된 수준을 보여주었다[12]. 또한, ICOS 발현은 항-CTLA4로 치료된 방광암 환자에서 상향 조절된다[13]. 항-CTLA4 요법으로 치료된 암 환자에서 다량의 종양 특이적 IFNη 생산 CD4 T-세포는 ICOS 양성인 한편, ICOS 양성 CD4 T-세포의 지속적인 상승은 생존과 상관 관계가 있는 것으로 관찰되었다[12,13,14].
국제특허출원 WO2016/120789는 항-ICOS 항체를 기술하고, T 세포를 활성화하고 암, 감염성 질환 및/또는 패혈증을 치료하기 위한 이의 용도를 제안하였다. 다수의 마우스 항-ICOS 항체가 생성되었고, 이 하위집합의 항체는 인간 ICOS 수용체의 작동제인 것으로 보고되었다. 항체 "422.2"를 선도 항-ICOS 항체로서 선택하고, "H2L5"로 명명된 인간 "IgG4PE" 항체를 생산하도록 인간화하였다. H2L5는 인간 ICOS에 대해 1.34 nM 및 시노몰거스 ICOS에 대해 0.95 nM의 친화성을 가지고, T 세포에서 사이토카인 생산을 유도하고, CD3 자극과 조합하여 T 세포 활성화 마커를 상향 조절하는 것으로 보고되었다. 그러나, 이식된 인간 흑색종 세포를 보유한 마우스는 대조군와 비교하여 H2L5 hIgG4PE로 처리될 때 최소의 종양 성장 지연 또는 생존의 증가만을 나타내는 것으로 보고되었다. 항체는 또한 이필리무마브 또는 펨브로리주마브 단독요법과 비교하여 이필리무마브 (항-CTLA-4) 또는 펨브로리주마브 (항-PD-1)와의 조합으로 종양 성장을 유의하게 추가로 억제하지 못하였다. 마지막으로, 이식된 결장암 세포 (CT26)를 보유한 마우스에서, 이필리무마브 또는 펨브로리주마브의 마우스 대용물과 조합으로 저용량의 H2L5의 마우스 교차-반응성 대용물만이 항-MTL4 및 항-PD1 단일요법과 비교하여 전반적인 생존을 약간 개선시켰다. 이식된 EMT6 세포를 보유한 마우스에서는 강한 치료적 유익이 없는 유사한 결과가 관찰되었다.
국제특허출원 WO2016/154177에는 항-ICOS 항체의 추가의 예가 기술되어 있다. 이들 항체는 효과기 CD8+ T 세포 (TEff)를 포함하여 CD4+ T 세포의 작동제이고, T 조절 세포 (TReg)를 고갈시키는 것으로 보고되었다. 항체가 Teff 대비 TReg 세포에 미치는 선택적 효과가 기술되었고, 이로써 항체는 낮은 수준의 ICOS를 발현하는 TEff에 미치는 최소한의 효과를 가지면서 TReg를 우선적으로 고갈시킬 수 있다. 암 치료에 사용하기 위한 항-ICOS 항체가 제안되었으며, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체와의 조합 요법도 기술되었다.
효과기 T 세포 활성을 증가시키도록 작용하는 ICOS 항체는 다양한 질환 및 병태 및 백신 접종법을 포함하여 CD8+ T 세포 반응이 유익한 면역학 및 기타 의학적 상황에서의 치료적 접근법을 나타낸다. 면역 성분을 수반하는 많은 질환 및 병태에서, CD8+ T 세포 면역 반응을 발휘하는 효과기 T 세포 (TEff)와 해당 면역 반응을 TEff를 하향 조절함으로써 억압하는 조절 T 세포 (TReg) 간의 균형이 존재한다. 본 발명은 효과기 T 세포 활성을 선호하는 이 TEff/TReg 균형을 조절하는 항체에 관한 것이다. ICOS가 높은 양성인 조절 T 세포의 고갈을 유발하는 항체는 TEff의 억압을 완화시키고, 이로써 효과기 T 세포 반응을 촉진시키는 순 효과를 가진다. 항-ICOS 항체를 위한 추가적 또는 보완적인 기작은 ICOS 수용체 수준에서의 작동제 활성을 통해 효과기 T 세포 반응을 자극하는 것이다.
조절 T 세포 (TReg)와 비교하여 효과기 T 세포 (TEff)에서 ICOS의 상대적 발현 및 이들 세포 집단의 상대적 활성은 생체내 항-ICOS 항체의 전반적 효과에 영향을 줄 것이다. 예상되는 작용 방식은 효과기 T 세포의 작동기작을 ICOS 양성 조절 T 세포의 고갈과 조합한다. ICOS 발현의 상이한 수준으로 인해 이들 두 가지 T 세포 집단에 미치는 차별적이고 심지어 반대되는 효과도 달성가능할 수 있다． 항-ICOS 항체의 가변 및 불변 영역 각각의 이중-공학은 CD8/TReg 비율에 영향을 줌으로써 효과기 T 세포 반응에 미치는 순 양성 효과를 발휘하는 분자를 제공할 수 있다. ICOS 수용체를 활성화하는 작동제 항체의 항원-결합 도메인은 항체가 결합된 높게 발현하는 세포의 하향 조절 및/또는 청소를 촉진하는 항체 불변 영역 (Fc)과 결합될 수 있다. 효과기 양성 불변 영역은 예로 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 또는 항체-의존성 세포 포식작용 (ADCP)을 촉진하기 위해 표적 세포 (TReg)에 대한 세포 효과기 기능을 채용하는데 사용될 수 있다. 따라서 항체는 효과기 T 세포 활성화를 촉진하고 면역억압성 T 조절 세포를 하향 조절하도록 작용할 수 있다． ICOS는 TEff보다 TReg에서 더 많이 발현되기 때문에, 치료적 균형이 달성되고 이로써 Teff 기능이 촉진되고 TReg가 고갈되어, T 세포 면역 반응 (예로, 항-종양 반응 또는 기타 치료적으로 유익한 T 세포 반응)의 순 증가를 유도한다.
여러 전-임상 및 임상 연구는 종양 미세환경 (TME)에서 효과기 T-세포 대비 T-reg 세포의 높은 비율 및 전반적인 생존 간의 강한 양성의 상관 관계를 보여준다. 난소암 환자에서 CD8 : T-reg 세포의 비율은 양호한 임상 성과의 지표인 것으로 보고되어 왔다[15]. 유사한 결과가 이필리무마브를 수여받은 후 전이성 흑색종 환자에서 관찰되었다[16]. 전-임상 연구에서, TME에서의 효과기 세포 : T-reg의 높은 비율도 항-종양 반응과 연관된 것으로 역시 밝혀져 왔다[43].
본 발명은 인간 ICOS와 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 ICOS 세포외 도메인을 표적하여 이로써 ICOS를 발현하는 T 세포에 결합한다. IFNγ 발현 및 분비를 증가시키는 능력에 의해 나타난 바와 같이, 항체는 ICOS에 미치는 작동제 효과를 가지도록 설계되어 효과기 T 세포의 기능을 향상시키는 예가 제공된다. 언급한 바와 같이, 항-ICOS 항체는 또한 이들이 결합하는 세포를 고갈시키도록 설계될 수 있으며, 이는 조절 T 세포를 우선적으로 하향 조절하는 효과를 가져야 하며, 이들 세포가 효과기 T 세포 반응에 미치는 억압 효과를 제거하여 효과기 T 세포의 전반적인 세포 반응을 촉진시킨다. 이들의 작용 기작에 관계없이, 본 발명에 따른 항-ICOS 항체는 실시예에 나타낸 바와 같이 T 세포 반응을 자극하고 생체내 항-종양 효과를 가지는 것이 경험적으로 입증되었다. 원하는 수준의 Fc 효과기 기능을 갖는 불변 영역을 포함하는 것과 같은 적절한 항체 형식의 선택 또는 적절한 경우 이러한 효과기 기능의 부재를 통해, 항-ICOS 항체는 효과기 T 세포 반응이 유익하고/거나 조절 T 세포의 억압이 요구되는 질환 및 병태의 치료를 포함하는 다양한 의학적 상황에서의 사용에 맞출 수 있다.
대표적인 항체는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009의 본원에 명시된 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 부위 (CDR)을 포함하는 항체 (예로, 인간 IgG1 또는 scFv), 선택적으로 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체와 인간 ICOS에 대한 결합을 경쟁하는 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009의 하나 이상의 CDR (예로, 임의의 이러한 항체의 6개 CDR 모두, 또는 HCDR 및/또는 LCDR의 집합) 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 항체는 CDR HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009로부터 선택된 항체의 HCDR3이거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 해당 HCDR3를 포함한다. 상기 HCDR2는 선택된 항체의 HCDR2일 수 있거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 해당HCDR2를 포함할 수 있다. 상기 HCDR1은 선택된 항체의 HCDR1일 수 있거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 해당HCDR1을 포함할 수 있다.
상기 항체는 CDR HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009로부터 선택된 항체의 LCDR3이거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 해당 LCDR3를 포함한다. 상기 LCDR2는 선택된 항체의 LCDR2일 수 있거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 해당LCDR2를 포함할 수 있다. 상기 LCDR1은 선택된 항체의 LCDR1일 수 있거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 해당LCDR1을 포함할 수 있다.
항체는
상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및
상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있고,
상기 중쇄 상보성 결정 영역은 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 중쇄 상보성 결정 영역이거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하고/거나;
상기 경쇄 상보성 결정 영역은 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 경쇄 상보성 결정 영역이거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함한다.
항체는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 집합을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있으며,
HCDR1은 STIM003의 HCDR1이고,
HCDR2는 STIM003의 HCDR2이고,
HCDR3은 STIM003의 HCDR3이고,
또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 변경을 갖는 HCDR의 해당 집합을 포함한다.
항체는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 집합을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있으며,
LCDR1은 STIM003의 LCDR1이고,
LCDR2는 STIM003의 LCDR2고,
LCDR3은 STIM003의 LCDR3이고,
또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 변경을 갖는 LCDR의 해당 집합을 포함한다.
아미노산 변경 (예로, 치환)은 CDR 내의 임의의 잔기 위치에 있을 수 있다. 아미노산 변경의 예는 항-ICOS 항체의 변이체 서열의 정렬을 나타내는 도 35, 도 36 및 도 37에 도시된 것이다. 따라서, STIM003 CDR에서 아미노산 변경은 도 36에 나타낸 바와 같이 항체 CL-74570 또는 항체 CL-71642의 상응하는 위치에 존재하는 잔기의 치환일 수 있다.
STIM003 CDR의 아미노산 변경 예는 IMGT에 따라 정의된 다음의 잔기 위치에서의 치환이다:
HCDR1에서, IMGT 위치 28번에서의 치환, 선택적으로 보존적 치환, 예로 V28F.
HCDR2에서 IMGT 위치 59, 63 및/또는 64번에서의 치환. 선택적으로, 위치 59번에서의 치환은 N59I이고, 위치 63번에서의 치환은 G63D이고 및/또는 위치 64번에서의 치환은 D64N 및/또는 D64S이다.
HCDR3에서 IMGT 위치 106, 108, 109 및/또는 112번에서의 치환. 선택적으로, 위치 106번에서의 치환은 R106A이고, 위치 108번에서의 치환은 F108Y이고, 위치 109번에서의 치환은 Y109F이고 및/또는 위치 112번에서의 치환은 H112N이다.
LCDR1에서 위치 36번에서의 치환, 예로 R36S.
LCDR3에서 위치 105, 108 및/또는 109번에서의 치환. 선택적으로, 위치 105번에서의 치환은 H105Q이고, 위치 108번에서의 치환은 D108G이고 및/또는 위치 109번에서의 치환은 M109N 또는 M109S이다.
본 발명의 항체는 인간 생식계열 유전자 분절 서열에 상응하는 VH 및/또는 VL 도메인 구조틀 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이것은 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 하나 이상의 구조틀 영역을 포함할 수 있다. 구조틀 영역 또는 구조틀 영역들은 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4일 수 있다.
실시예 12에 기술된 바와 같이, 표 E12-1는 재조합을 통해 이들 항체의 VH 도메인을 생성한 인간 생식계열 V, D 및 J 유전자 분절을 보여주고, 표 E12-2는 재조합을 통해 이들 항체의 VL 도메인을 생성한 인간 생식계열 V 및 J 유전자 분절을 보여준다. 본 발명의 항체의 VH 및 VL 도메인은 이들 V (D) J 분절을 기초로 할 수 있다.
본 발명의 항체는 항체 VH 도메인로서,
(i) 인간 중쇄 V 유전자 분절, 인간 중쇄 D 유전자 분절 및 인간 중쇄 J 유전자 분절의 재조합으로부터 유래하고,
V 유전자 분절은 IGHV1-18 (예로, V1-18*01), IGVH3-20 (예로, V3-20*d01), IGVH3-11 (예로, V3-11*01) 또는 IGVH2-5 (예로, V2-5*10)이고/거나;
D 유전자 분절은 IGHD6-19 (예로, IGHD6-19*01), IGHD3-10 (예로, IGHD3-10*01) 또는 IGHD3-9 (예로, IGHD3-9*01)이고/거나;
J 유전자 분절은 IGHJ6 (예로, IGHJ6*02), IGHJ4 (예로, IGHJ4*02) 또는 IGHJ3 (예로, IGHJ3*02)이거나;
(ii) 구조틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하고,
FR1은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGHV1-18 (예로, V1-18*01), IGVH3-20 (예로, V3-20*d01), IGVH3-11 (예로, V3-11*01) 또는 IGVH2-5 (예로, V2-5*10)과 함께 정렬하고/거나,
FR2은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGHV1-18 (예로, V1-18*01), IGVH3-20 (예로, V3-20*d01), IGVH3-11 (예로, V3-11*01) 또는 IGVH2-5 (예로, V2-5*10)과 함께 정렬하고/거나,
FR3은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 IGHV1-18 (예로, V1-18*01), IGVH3-20 (예로, V3-20*d01), IGVH3-11 (예로, V3-11*01) 또는 IGVH2-5 (예로, V2-5*10)과 함께 정렬하고/거나,
FR4은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 J 유전자 분절 IGJH6 (예로, JH6*02), IGJH4 (예로, JH4*02) 또는 IGJH3 (예로, JH3*02)과 함께 정렬하는, 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다.
VH 도메인의 FR1, FR2 및 FR3는 전형적으로 동일한 생식계열 V 유전자 분절과 함께 정렬한다. 따라서, 예를 들어 항체는 인간 중쇄 V 유전자 분절 IGHV3-20 (예로, VH3-20*d01), 인간 중쇄 D 유전자 분절 및 인간 중쇄 J 유전자 분절 및 인간 중쇄 J 유전자 분절 IGJH4 (예로, JH4*02)의 재조합으로부터 유래한 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항체는 VH 도메인 구조틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있으며, 각각의 FR1, FR2 및 FR3은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGHV3-20 (예로, IGVH3-20*d01)와 함께 정렬하고, FR4는 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 J 유전자 분절 IGHJ4 (예로, IGHJ4*02)와 함께 정렬한다. 정렬은 정확할 수 있지만, 일부 경우에 하나 이상의 잔기가 생식계열에서 돌연변이될 수 있어 아미노산 치환이 존재하거나 드문 경우에 결실 또는 삽입이 존재할 수 있다．
본 발명의 항체는 항체 VL 도메인로서,
(i) 인간 경쇄 V 유전자 분절 및 인간 경쇄 J 유전자 분절의 재조합으로부터 유래하고,
V 분절는 IGKV2-28 (예로, 01*IGKV2-28), IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01) IGKV1D-39 (예로, IGKV1D-39*01) 또는 IGKV3-11 (예로, IGKV3-11*01)이고/거나,
J 유전자 분절 IGKJ4 (예로, IGKJ4*01), IGKJ2 (예로, IGKJ2*04), IGLJ3 (예로, IGKJ3*01) 또는 IGKJ1 (예로, IGKJ1*01)이거나;
(ii) 구조틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하고,
FR1은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGKV2-28 (예로, IGKV2-28*01), IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01), IGKV1D-39 (예로, IGKV1D-39*01) 또는 IGKV3-11 (예로, IGKV3-11*01)과 함께 정렬하고/거나,
FR2는 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGKV2-28 (예로, IGKV2-28*01), IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01), IGKV1D-39 (예로, IGKV1D-39*01) 또는 IGKV3-11 (예로, IGKV3-11*01)과 함께 정렬하고/거나,
FR3은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGKV2-28 (예로, IGKV2-28*01), IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01), IGKV1D-39 (예로, IGKV1D-39*01) 또는 IGKV3-11 (예로, IGKV3-11*01)과 함께 정렬하고/거나,
FR4는 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 J 유전자 분절 IGKJ4 (예로, IGKJ4*01), IGKJ2 (예로, IGKJ2*04), IGKJ3 (예로, IGKJ3*01) 또는 IGKJ1 (예로, IGKJ1*01)와 함께 정렬하는, 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다.
VL 도메인의 FR1, FR2 및 FR3은 전형적으로 동일한 생식계열 V 유전자 분절과 함께 정렬한다. 따라서, 예를 들어 항체는 인간 경쇄 V 유전자 분절 IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01) 및 인간 경쇄 J 유전자 분절 IGKJ3 (예로, IGKJ3*01)의 재조합으로부터 유래한 VL 도메인을 포함할 수 있다. 항체는 VL 도메인 구조틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있으며, 각각의 FR1, FR2 및 FR3은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01)와 함께 정렬하고, FR4는 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 J 유전자 분절 IGKJ3 (예로, IGKJ3*01)와 함께 정렬한다. 정렬은 정확할 수 있지만, 일부 경우에 하나 이상의 잔기가 생식계열에서 돌연변이될 수 있어 아미노산 치환이 존재하거나 드문 경우에 결실 또는 삽입이 존재할 수 있다．
본 발명에 따른 항체는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009이거나, STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 항체 VH 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다. 아미노산 서열 동일성은 적어도 95%일 수 있다.
항체는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009이거나, STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 항체 VL 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다. 아미노산 서열 동일성은 적어도 95%일 수 있다.
STIM001 , STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 HCDR을 가지거나 이들 CDR의 변이체를 가지는 항체 VH 도메인은 동일한 항체의LCDR을 가지거나 이들 CDR의 변이체를 가지는 항체 VL 도메인과 쌍을 이룰 수 있다. 유사하게, 임의의 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 VH 도메인 또는 해당 VH 도메인의 변이체는 동일한 항체의 VL 도메인 또는 동일한 항체의 VL 도메인 변이체와 쌍을 이룰 수 있다.
예를 들어, 항체는 항체 STIM001 VH 도메인과 STIM001 VL 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 항체 STIM002 VH 도메인 및 STIM002 VL 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 항체 STIM003 VH 도메인 및 STIM003 VL 도메인을 포함할 수 있다.
항체는 불변 영역, 선택적으로 인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다． 대표적인 이소형은 IgG, 예로 인간 IgG1이다.
본 발명의 추가의 관점은 본원에 기술된 항체의 서열을 인코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포, 상기 숙주 세포의 배양하고 발현시키고, 선택적으로 항체를 단리하거나 정제하여 항체를 생산하는 방법을 포함한다. 발현된 항체가 이로써 획득된다. 본원에 기술된 항체의 VH 및 VL 도메인은 유사하게 생산될 수 있고 본 발명의 관점이다. 항체를 포함하는 약제학적 조성물도 또한 제공된다.
본 발명의 다른 관점은 ICOS 녹아웃 비-인간 동물 및 인간 ICOS에 대한 항체를 생성하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. ICOS 녹아웃 동물에서는, ICOS를 인코딩하는 유전자가 동물의 게놈에서 비활성화되거나 결실되었기 때문에 ICOS가 발현되지 않는다. 이러한 동물은 인간 ICOS 및 비-인간 종으로부터의 ICOS 둘 다를 인식하는 종 교차-반응성 항체를 생성하는데 유용하다. 면역 내성의 정상적인 과정은 "자가" 항원을 인식하는 림프구가 신체의 자가 면역 반응을 예방하도록 제거되거나 불활성화되는 것을 의미하는 반면, 비-인간 녹아웃 동물의 내인성 ICOS 항원의 부재는 동물의 면역계가 해당 항원에 내성화되지 않아 재조합 단백질로서 주입되거나 ICOS를 발현하는 세포주 또는 소포를 사용할 때 ICOS에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 것을 의미한다. 녹아웃 동물의 면역 레퍼토리는 해당 동물 종으로부터의 ICOS 단백질을 인식할 수 있는 림프구를 포함하여야 한다. 인간 ICOS로 면역화된 비-인간 동물 (예로, 마우스)은 따라서 인간 ICOS 및 테스트 동물 ICOS (예로, 마우스 ICOS) 모두와 결합하는 항체를 생성할 수 있다.
이것은 적어도 두 가지 이점을 가진다． 첫째, 종 교차-반응성 항체는 인간 임상 시험으로 진행되기 전에 비-인간 테스트 동물의 전-임상 시험에 사용될 수 있다. 둘째, 녹아웃 동물의 면역계는 ICOS-발현 동물에 의해 인식된 것과 비교하여 인간 ICOS 분자 상에서 더 많은 가능한 에피토프를 인식할 수 있어서, 녹아웃된 동물의 면역 레파토리는 더 큰 기능적 항체의 다양성을 포함할 수 있다. 상이한 종으로부터의 상동성 ICOS 분자의 서열 간에는 유사성이 있기 때문에, 비-인간 동물의 면역계는 비-인간 동물 ICOS의 것과 매칭되는 이들 인간 ICOS 단백질의 영역에 통상적으로 내성화될 수 있지만, 이러한 내성화 녹아웃 동물에서는 발생하지 않다.
ICOS 녹아웃 동물을 사용하는 능력 및 교차-반응성 항체를 생성하는 데 이의 장점이 실시예에 나타나 있다. 특히 ICOS가 녹아웃된 동물이 성공적으로 면역화되어 항체 반응을 생성할 수 있는 점이 놀랍고, ICOS 자체가 배아 중심의 형성과 유지와 같은 면역계 생물학에 관여하고 ICOS 양성 세포인 T 난포 헬퍼 세포 상의 이의 역할을 통해 면역 반응의 생성에 기여하기 때문이다[37]. 이를 염두에 두고, ICOS 녹아웃 동물은 기껏해야 빈약한 항체 반응을 생성할 것으로 예측될 수 있다． 놀랍게도, 강력한 역가가 ICOS 녹아웃 마우스에서 획득되었으며, 바람직한 교차-반응성 항체를 포함하여 항체 레퍼토리로부터 고기능성 항체가 분리되었다.
본 발명의 대표적인 구현예는 첨부된 청구범위에 기술되어 있다.
도 1: 유세포 계측법에 의한 CHO 세포에서 발현된 인간 및 마우스 ICOS에 대한 ICOS KO 및 야생형 Kymouse의 혈청 역가의 결정. 데이타는 인간 ICOS 발현 MEF 세포 및 인간 ICOS 단백질로 각각 면역화된 (a) ICOS KO 마우스 (KO) 또는 (b) 야생형 비-ICOSKO 마우스 (HK 또는 HL)의 혈청에서의 면역글로불린이 CHO 세포에서 발현된 인간 ICOS (인간 ICOS 결합) 또는 마우스 ICOS (마우스 ICOS 결합)를 결합하는 능력을 도시한다. 기하 평균은 유세포 계측법에 의해 결정된 바와 같이 세포에 결합하는 면역글로불린의 형광 강도의 척도이다.
도 2: 인간 ICOS 수용체를 갖는 인간 ICOS-리간드 중화 HTRF. 인간 IgG1 형식에서 STIM001 대비 STIM009 항-ICOSmAb의 중화 프로파일은 C398.4A 및 각각의 이소형 대조군과 비교하였다. 네 가지 실험을 대표하는 데이타.
도 3: 마우스 ICOS 수용체와의 마우스 ICOS-리간드 중화 HTRF. 인간 IgG1 형식에서 STIM001 대비 STIM009 항-ICOSmAb의 중화 프로파일은 C398.4A 및 각각의 이소형 대조군과 비교하였다. 세 가지 실험을 대표하는 데이타.
도 4: 인간 ICOS 수용체와의 인간 ICOS-리간드 직접 중화 HTRF. 인간 IgG4.PE 형식에서 STIM001 대비 STIM009 항-ICOSmAb의 중화 프로파일은 C398.4A 및 각각의 이소형 대조군과 비교하였다. 네 가지 실험을 대표하는 데이타.
도 5: 마우스 ICOS 수용체와의 마우스 ICOS-리간드 중화 HTRF. 인간 IgG4.PE 형식에서 STIM001 대비 STIM009 항-ICOSmAb의 중화 프로파일은 C398.4A 및 각각의 이소형 대조군과 비교하였다. 네 가지 실험을 대표하는 데이타.
도 6a: 신선하게 단리된 NK 세포를 효과기 세포로서 사용하여 MJ 세포에 대한 STIM001-매개성 ADCC의 농도-의존성 연구. 효과기 세포 및 표적 세포 (효과기 : 표적 비율 5 : 1)를 항체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 용해된 표적 세포로부터 방출된 BATDA는 제조사 키트 지침에 기술된 바와 같이 측정하였다. HC는 하이브리드 이소형 대조군이다.
도 6b, c, d: 신선하게 단리된 NK 세포를 효과기 세포로서 사용하여 MJ 세포에 대한 STIM001 및 STIM003-매개성 ADCC의 농도-의존성 연구. 효과기 세포 및 표적 세포 (효과기 : 표적 비율 5 : 1)를 항체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 용해된 표적 세포로부터 방출된 BATDA는 제조사 키트 지침에 기술된 바와 같이 측정하였다. HC는 하이브리드 이소형 대조군이다.
도 6e, f, g: 신선하게 단리된 NK 세포를 효과기 세포로서 사용하여 ICOS-형질감염된 CCRF-CEM세포에 대한 STIM001 (hIgG1) 및 STIM003 (hIgG1)-매개성 ADCC의 농도-의존성 연구. 효과기 세포 및 표적 세포 (효과기 : 표적 비율 5 : 1)를 항체와 함께 4시간 동안 배양하였다. 용해된 표적 세포로부터 방출된 BATDA는 제조사 키트 지침에 기술된 바와 같이 측정하였다. HC는 하이브리드 이소형 대조군이다.
도 7, 도 8, 도 9: 항-ICOS 항체는 단독요법으로 또는 항-PDL1과 조합으로 투여하였을 때 CT26 종양 성장을 억제하고 생존율을 향상시킨다. STIM001 mIgG2a는 mIgG1 형식보다 더 강력한다. 완치되거나 안정된 질환이 있는 동물의 수는 각 그래프에 표시된다.
도 10: 2x2 조합 CT26 생체내 효능 연구. 각 치료군은 개별 동물 (군 당 n = 10)의 종양 크기를 보여주는 "스파이더 좌표"에 의해 표시된다. 항-PDL1 항체와 조합될 때 STIM001은 종양 성장을 지연시키고 치료 동물의 생존율을 향상시킨다. STIM001 mIgG2a의 존재 시 관찰된 효능은 STIM001 mIgG1의 효능보다 우수하다. 마지막으로, STIM001 mIgG2a와 항-PDL1 mIgG2a의 조합은 항-종양 반응을 유발하는 가장 강력한 조합이고, 질환이 완치된 60% 동물의 결과를 가져온다. 각 그룹에 대해 질환이 완치된 동물의 수는 각 그래프의 오른쪽 최상단에 표시된다. 투여는 6, 8, 10, 13, 15 및 17일째에 시행되었다.
도 11: 항-ICOS또는 항-PDL1 단일 요법 또는 조합 요법으로 치료된 동물의 시간 경과 시 CT26 종양 부피를 나타내는 그래프. 각 치료군은 개별 동물 (군 당 n = 10)의 종양 크기를 보여주는 "스파이더 좌표"에 의해 표시된다. 각 그룹에 대해 100 mm3 미만의 종양 크기를 갖는 (질환이 안정한/완치된) 동물의 수는 각 그래프의 오른쪽 최상단에 표시된다. 투여는 6, 8, 10, 13, 15 및 17일째에 수행되었다. 투약 시간은 음영 영역으로 표시된다. (a) 이소형 대조군; (b)항-PDL1 mIgG2a AbW; (c)항-ICOSSTIM003 mIgG1; (d)항-ICOSSTIM003 mIgG2a; (e)항-PDL1 mIgG2a AbW+ STIM003 mIgG1; (f)항-PDL1 mIgG2a AbW+ STIM003 mIgG2a. STIM003 mIgG2는 항-PDL1 (AbW) mIgG2a와 조합될 때 CT26 종양의 성장을 유의하게 억제한다.
도 12: MJ 세포 시험관내 활성화 검정 - 비드 결합. 비드에 결합된 STIM001, STIM002 및 STIM003 항-ICOSmAb의 자극 프로파일은 항-ICOSC398.4A 및 각각의 이소형 대조군과 비교되었다. 데이타는 두 실험의 평균을 나타낸다 (C398.4A 이소형 대조군 비드의 경우 n = 1).
도 13: MJ 세포 시험관내 활성화 검정 - 플레이트 결합. 플레이트에 결합된 STIM001, STIM002, STIM003 및 STIM004 항-ICOSmAb의 자극 프로파일은 항-ICOSC398.4A 및 각각의 이소형 대조군과 비교되었다. 데이타는 두 실험의 평균을 나타낸다.
도 14: 활성화된 T 세포에 결합한 STIM001 및 STIM003 hIgG1의 FACS 분석. (a)는 활성화된 T 세포에 결합하는 사전-표지된 항체의 용량 반응의 대표적인 실험을 보여 주는 반면, (b)는 미가공 항체의 용량 반응에 이어 이차 표지 항체로 검출한 결합을 보여준다. 표는 그래프패드 프리즘을 사용하여 결정된 관련 EC50 (M)을 표시한다.
도 15: STIM001 및 STIM003은 종양 부위의 T 세포 구획에 미치는 이소형-의존성 효과를 나타냈다. 총 1x10E5개 CT-26 종양 세포를 Balb/c 암컷 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 13일 및 15일째에 동물에게 항체 또는 식염수를 복강내로 투여하였다 (n = 10/각 군). 이식 후 16일째에 종양 보유 동물 (n = 8/각 군)에서 비장 및 종양을 수확하고, FACS 분석을 위해 해리하여 염색하였다. A, CD4 세포에 양성인 CD3 세포의 백분율. B, CD8 세포에 양성인 CD3 세포의 백분율. C, Foxp3+ 및 CD25+인 CD4 세포의 백분율. D, Foxp3+ 및 CD25+에 양성인 비장에서 CD4 세포의 백분율. E, 총 CD4 세포에서 CD4 효과기 세포의 백분율. F, T-Reg 대비 CD8 효과기 세포의 비율. G, T-Reg 대비 CD4 효과기 세포의 비율. 통계적 분석은 그래프패드 프리즘을 사용하여 수행하였으며, 항체 처리군 모두는 식염수 처리군과 비교되었고, P값은 유의미한 경우 언급되었다 (p <0.05). 값은 평균+ SD를 표시한다 (n = 8 마우스/군). F의 경우: 값은 평균+ SEM을 표시한다.
도 16: T-세포 활성화 분석에서 3일 동안 항-CD3 /항-CD28 다이나비드로 공동-자극된 분리된 인간 T-세포에 미치는 STIM001 (hIgG1) 및 STIM003 (hIgG1) 작동제 효과의 농도-의존성 연구로부터의 데이타 예 1 (실시예 9b 참조). IFN-γ 생산은 작동제 효과의 지시인자로서 사용되었다. STIM001 (hIgG1) 및 STIM003 (hIgG1)은 플레이트-결합된, 용해성 또는 교차 용해성 (Fc-연결된 Ab) 형식으로 테스트하고 하이브리드 이소형 대조군 (HC hIgG1)과 비교하였다. 플레이트-결합 검정에서 비교를 위해 햄스터 항체 C398.4A 및 이의 이소형 대조군 (햄스터 IgG)이 포함되었다. 상단 패널은 플레이트-결합 항체의 데이타를 보여준다. 하단 패널은 IgG1 항체의 용해성 및 교차-결합 형태의 데이타를 보여준다. 왼쪽과 오른쪽 패널은 각각 독립적인 인간 공여자로부터의 T 세포를 사용한다.
도 17: T 세포 활성화 검정 1에서 STIM001에 대한 데이타 집합 예 (실시예 9 참조). 데이타는 8명의 독립적인 인간 공여자로부터의 T 세포에 대해 주어진 용량에서 STIM001 (hIgG1) 또는 이의 하이브리드 이소형 대조군 (HC IgG1)에 의해 유도된 IFN-γ의 수준을 나타낸다. 플레이트-결합된 항체 (도 17a)를 5 μg/ml로 사용하였다. 용해성 항체 (도 17b)는 15 μg/ml로 사용되었다. 각 점은 번호 (D214)로 식별되는 한 명의 공여자를 나타낸다. 윌콕슨 통계적 검정을 이용하여 유의성을 평가하였다: *, p <0.05, **, p <0.01.
도 18: T-세포 활성화 검정 1에서 STIM003에 대한 데이타 집합 예 (실시예 9 참조). 데이타는 8명의 독립적인 건강한 인간 공여자로부터의 T 세포에 대해 주어진 용량에서 STIM003 (hIgG1) 또는 이의 하이브리드 이소형 대조군 (HC hIgG1)에 의해 유도된 IFN-γ의 수준을 나타낸다. 용해성 항체 (도 18a)는 15 μg/ml로 사용되었다. 플레이트-결합된 항체 (도 18b)는 5 μg/ml로 사용하였다. 각 점은 번호 (D214)로 식별되는 한 명의 공여자를 나타낸다. 윌콕슨 통계적 검정을 이용하여 유의성을 평가하였다: *, p <0.05, **, p <0.01.
도 19: T 세포 활성화 검정 2에서 데이타 예 (실시예 9c 참조). 3일 동안 항-CD3/항-CD28의 다이나비드로 자극된 다음 3일 동안 배지에 나두고, 마지막으로 플레이트-결합된 항체 STIM001, STIM003 또는 C398.4A Ab +/- CD3 Ab로 재자극된 단리된 인간 T-세포에 미치는 STIM001 (hIgG1) 및 STIM003 (hIgG1) 작동제의 연구. 데이타는 STIM001, STIM003 대비 이들의 하이브리드 대조군 IgG1 (A, C, E) 또는 C398.4A 대비 이의 햄스터 IgG 대조군 (B, D, F)에 의해 주어진 용량으로 및 CD3 Ab (TCR 관여)와 조합하여 유도된 IFN-γ (A, B), TNF-α (C, D) 및 IL-2 (E, F)의 수준을 비교하였다. 각 점은 번호 (예를 들어, D190)로 식별가능한 한 명의 독립적인 공여자를 나타낸다. Ab 및 이들의 이소형 대조군 사이의 통계적 유의성은 윌콕슨 통계적 테스트와 지시된 p 값을 사용하여 평가되었다. STIM003 농도가 HC IgG1의 농도와 약간 다른 점 (5.4 대비 5 μg/ml)을 언급한다.
도 20: CT26 종양에서 및 이들의 표면에 ICOS를 발현하는 종양 보유 동물의 비장에서 면역 세포 (CD8 T-효과기, CD4 T-효과기 및 CD4/FoxP3 TReg 세포)의 백분율을 나타내는 그래프. 값은 평균 ± 표준 편차 (n = 8)를 의미한다. P 값은 비-매개변수적 던의 다중 비교 테스트를 사용하여 계산되었다. NS = 유의하지 않음; *** = p <0.001; **** = p <0.0001.
도 21: 면역 세포 - CD8 T 효과기, CD4 T 효과기 및 CD4/FoxP3 Treg의 표면에서 평균 형광 강도 (MFI)에 의해 결정된 바와 같은 ICOS의 상대적 발현. 값은 평균 ± 표준 편차 (n = 8)를 의미한다. P 값은 비-매개변수적 던의 다중 비교 테스트를 사용하여 계산되었다. **** = p <0.0001, ** = p <0.01. 비장 (저)과 종양 (고) 사이의 형광 강도의 차이를 언급한다.
도 22: CT26 종양의 미세환경에서 다른 면역 세포의 백분율에 미치는 STIM001 및 STIM003의 효과. * = p <0.05.
도 23: CT26 종양의 미세환경에서 조절 T 세포 (CD4+/FoxP3+ 세포)의 백분율에 미치는 항체 STIM001 및 STIM003의 효과. ** = p <0.05, **** = p <0.0001. 값은 평균 ± 표준 편차 (n = 8)를 표시한다. P 값은 비-매개변수적 던의 다중 비교 테스트를 사용하여 계산되었다.
도 24: STIM001 및 STIM003 mIgG2는 CT26 종양에서 TReg 대비 CD8 효과기 T-세포 비율 및 TReg 대비 CD4 효과기 T 세포 비율을 유의하게 증가시킨다. 비율은 종양 내의 효과기 세포의 백분율을 종양 내의 조절 T 세포의 백분율로 나누어 결정하였다.
도 25: CT26 종양 보유 동물의 비장에서 면역 세포의 백분율에 미치는 항체의 효과.
도 26: CT26 종양 보유 동물의 비장에서 조절 T 세포 (CD4+/FoxP3+ 세포)의 백분율에 미치는 항체의 효과.
도 27: CT26 종양 보유 동물의 비장에서 (A) CD8 효과기 : Treg 비율 및 (B) CD4 : TReg 비율.
도 28: 활성화된 모리셔스 시노몰거스 범용 T 세포에서 AF647-컨쥬게이션된 STIM001, STIM003 및 hIgG1 하이브리드 대조군 (HC IgG1)의 표면 염색. T 세포의 상이한 공여자 출처를 사용하는 검정법으로부터의 데이타는 각각 A 및 B에 도시된다. EC50 값은 표에 표시된다．
도 29: CT26 Balb/C 모델의 카프란 마이어 곡선. 음영은 투약 윈도우를 나타낸다. 로그 순위 p <0.0001.
도 30, 도 31, 도 32, 도 33: 실시예 20에서 기술된 연구를 위해 마우스에서 시간 경과 시 A20 종양의 부피를 나타내는 그래프. 각 치료군은 개별 동물, 군 당 n = 8의 종양 크기를 보여주는 스파이더 좌표에 의해 표시된다. 각 그룹에 대해 종양의 징후가 없는 동물의 수 (질환 완치를 나타냄)는 그래프의 왼쪽 최하단에 표시된다. 투약은 종양 세포 이식 후 8, 11, 15, 18, 22, 25 및 29일째에 수행하였고 투약 시간은 회색 음영 영역으로 표시하였다. 대조군 (도 30) 및 항-PD-L1 처리군 (도 31)과 비교하여, STIM001 mIgG2a (도 32) 및 STIM003 mIgG2a (도 33) 처리군은 A20 종양 성장의 유의적인 억제를 보여주었다.
도 34: 항-PD-L1 mIgG2a 항체와 단일 대비 다중 용량의 STIM003 mIgG2a의 조합을 사용하여 실시예 11c에 기술된 CT26 생체내 효능 연구로부터의 데이타. 각 치료군은 개별 동물 (군 당 n = 8)의 종양 크기를 보여주는 "스파이더 좌표"에 의해 표시된다. 각 실험군에 대해 질환이 완치된 동물의 수는 각 그래프의 오른쪽 최하단에 표시된다. 각 항체의 투약 일수는 각각의 그래프 아래 화살표로 표시된다.
도 35: STIM001, STIM002B 및 관련 항체 CL-61091, CL-64536, CL-64837, CL-64841 및 CL-64912의 상응하는 서열 및/또는 인간 생식계열에서 상이한 잔기를 보여주는 STIM002 VH (최상단) 및 VL (최하단) 도메인 아미노산 서열. 서열 번호매김는 IMGT에 따른다.
도 36: 관련 항체 CL-71642 및 CL-74570의 상응하는 서열 및/또는 인간 생식계열에서 상이한 잔기를 보여주는 STIM003 VH (최상단) 및 VL (최하단) 도메인 아미노산 서열. 서열 번호매김는 IMGT에 따른다. 서열결정으로부터 획득된 항체 CL-71642의 VL 도메인은 본원에서 N 말단 잔기 없이 나타낸다. 정렬로부터, 완전 VH 도메인 서열은 N 말단 글루탐산을 포함할 것을 알 수 있다.
도 37: STIM008의 상응하는 서열 및/또는 인간 생식계열에서 상이한 잔기를 보여주는 STIM007 VH (최상단) 및 VL (최하단) 도메인 아미노산 서열. 서열 번호매김는 IMGT에 따른다.
도 38: J558 동종유전자 모델에서 STIM003 (항-ICOS) 및 AbW (항-PD-L1) mIgG2a 항체의 효과. 각 치료군은 개별 동물 (군 당 n = 10 또는 n = 8)의 종양 크기를 보여주는 "스파이더 좌표"에 의해 표시된다. STIM003 단일요법은 일정 효능을 동물 8마리 중 3마리가 질환이 완치되어 입증하였다. 유사하게, 항-PDL1은 이 모델에서 37일째까지 동물 8마리 중 6 마리가 질환으로부터 완치되어 효과적이었다. 항-PDL1 항체와 조합할 때, STIM003 mIgG2는 종양 성장을 완전히 억제하고 치료 동물의 생존율을 향상시켰다. 각 실험군에 대해 질환이 완치된 동물의 수는 각 그래프의 오른쪽 최하단에 표시된다. 투약 일수는 점선으로 표시된다 (11, 15, 18, 22, 25 및 29일).
도 39: 종양 조직의 상이한 TIL 세포 아형 상의 ICOS 발현 (양성 세포의 백분율 및 상대적 발현/dMFI)의 정량화. (A) 식염수 또는 항-PD-L1 또는항-PD-1 대용 항체로 처리된 동물의 면역 세포 아형의 ICOS 발현이 양성인 면역 세포 아형% 및 (B) ICOS dMFI (ICOS 양성 세포에서의 상대적 ICOS 발현). 마우스는 0일째 (n = 7 또는 n = 8)에 100 μL의 1 x 106개 생존 세포/ml가 이식되었다. 동물에게 13일 및 15일째에 130 μg의 항체를 복강내로 투여하였다. 조직 시료를 분리하고 16일째에 분석하였다. CD4+/FOXP3+ 세포는 TReg 집단에만 포함되었고 (오른쪽 미단측 그래프), 모든 Foxp3가 음성인 "효과기" CD4 세포로부터 배제되었다 (왼쪽 미단측 그래프). 실시예 22 참조.
도 40: A20 생체내 효능 연구로부터의 데이타. 각 치료군은 개별 동물 (군 당 n = 10)의 종양 크기를 보여주는 "스파이더 좌표"에 의해 표시된다. 각 그룹에 대해 질환이 치유된 동물의 수는 각 그래프에 표시된다. 다중 용량의 경우, 점선으로 표시된 8, 11, 15, 18, 22 및 25일에 투약되었다. 단일 용량의 경우, 동물은 8 일째에만 IP 주사를 수여받았다. (A) 식염수; (B) STIM003 mIgG2a 다중 용량; (C) STIM003 mIgG2a 단일 용량. 실시예 23 참조.
도 41: STIM003 mIgG2a 60 μg 고정된 용량으로 실시예 23에 보고된 연구의 카프란-마이어 곡선. SD = 단일 용량, 8일. MD = 8일째부터 다중 용량 BIW.
도 42: 식염수를 투여한 CT26 종양 보유 동물 (시점 당 n =4)로부터의 주요 T 세포 하위집합 (T-reg [CD4+/FoxP3+], CD4 Eff [CD4+/FoxP3-] 세포 및 CD8+)에서 ICOS 발현. 면역 세포 표현형 측정은 치료 후 1, 2, 3, 4 및 8일에 시행하고 모든 시점에서 모든 조직의 ICOS 발현을 위해 염색하였다. A 내지 D는 네 개의 상이한 조직에서 모든 시점에 ICOS 양성 세포의 백분율을 보여준다. E 내지 H는 네 개의 상이한 조직 모두에서 ICOS dMFI (상대 발현) 모든 시점를 나타낸다. 실시예 24 참조.
도 43: STIM003 mIgG2a 항체에 반응하여 TME의 T-reg 고갈을 입증하는 FACS 분석. CT-26 종양 보유 동물을 종양 세포 이식 후 12일째에 STIM003의 단일 용량 (6, 60 또는 200 μg)으로 처리하였다. 치료 후 1, 2, 3, 4 및 8일에 FACS 분석을 위해 수확한 조직 (시점 당 n = 4). 전체 종양 (A)에서 T-reg 세포 (CD4+ CD25+ Foxp3+)의 백분율 및 혈액 (B)에서 T-reg 세포의 백분율을 다른 시점에 나타낸다. 실시예 24 참조.
도 44: STIM003 mIgG2a에 반응한 CD8 : T-reg 및 CD4 eff : T-reg 비율의 증가. CT-26 종양 보유 동물은 종양 세포 이식 후 12일째에 STIM003 mIgG2a의 단일 용량 (6, 60 또는 200 μg)을 수여받았다. 치료 후 1, 2, 3, 4 및 8일에 FACS 분석을 위해 조직 (시점 당 n = 4)이 수확되었고, T eff 대비 T-reg 비율이 계산되었다. (A) 및 (B), 종양 및 혈액에서의 CD8 : T-reg 비율, (C) 및 (D) 종양 및 혈액에서의 CD4-eff : T-reg 비율. 실시예 24 참조.
도 45: STIM003 처리는 증가된 탈과립화 및 TIL에 의한 Th1 사이토카인 생성과 상관 관계가 있다． 치료 후 8일째에 TIL을 분리하고 CD4 및 CD8 T 세포 (A 내지 B)에서 CD107a 발현을 검출하기 위해 FACS 분석을 수행하였다. 이와 동시에, 해리된 종양의 세포를 브레펠딘-A의 존재 시 4시간 동안 나두었으며, T 세포 마커에 염색하고 IFN-γ와 TNF-α (CH)를 검출하기 위해 세포내 염색을 위해 투과화하였다. 실시예 24 참조.
ICOS
본 발명에 따른 항체는 인간 ICOS의 세포외 도메인과 결합한다. 따라서, 상기 항체는 ICOS-발현 T 림프구와 결합한다. 본원에서 언급된 "ICOS" 또는 "ICOS 수용체"는 문맥 상 달리 지시하지 않는 한, 인간 ICOS일 수 있다. 인간, 시노몰거스 및 마우스 ICOS의 서열은 첨부된 서열 목록에 도시하고, 인간 NCBI 번호 NP_036224.1, 마우스 NCBI 번호 NP_059508.2 및 시노몰거스 진뱅크 번호 EHH55098.1로서 NCBI로부터 입수가능하다.
교차-반응성
본 발명에 따른 항체는 바람직하게 교차-반응성이며, 예를 들어 인간 ICOS뿐만 아니라 마우스 ICOS의 세포외 도메인에도 결합할 수 있다. 항체는 시노몰거스와 같은 영장류의 ICOS를 포함하여 다른 비-인간 ICOS와 결합할 수 있다． 인간에서 치료적 용도로 사용하기 위한 항-ICOS 항체는 인간 ICOS에 결합해야 하지만, 다른 종의 ICOS에 대한 결합은 인간 임상 상황에서 직접적인 치료적 관련성을 갖지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고, 본원의 데이타는 인간 및 마우스 ICOS 둘 다와 결합하는 항체가 이들이 작동제 및 고갈 분자로서 특히 적합하게 하는 성질을 가지는 것을 가리킨다. 이것은 교차-반응성 항체에 의해 표적화되는 하나 이상의 특정 에피토프에 기인할 수 있다. 그러나 근간의 이론에 관계없이 교차-반응성 항체는 높은 가치를 지니며 전임상 및 임상 연구를 위한 치료제 분자로서 우수한 후보 물질이다.
실험 실시예에서 설명한 바와 같이, 본원에 설명된 STIM 항체를 마우스가 마우스 ICOS의 발현이 부족하도록 (ICOS 녹아웃) 설계되었던 KymouseTM 기술을 사용하여 생성하였다. ICOS 녹아웃 유전자전환 동물 및 교차-반응성 항체를 생성하기 위한 이의 용도는 본 발명의 추가의 관점이다.
항체의 종 교차-반응성 항원의 정도를 정량화하는 하나의 방식은 또 다른 종의 항원과 비교하여 하나의 종의 항원에 대한 친화성의 배수 차이, 예로 인간 ICOS 대비 마우스 ICOS에 대한 친화성의 배수 차이이다. 친화성은 본원의 다른 곳에서 기술된 Fab 형식의 항체 SPR에 의해 결정된 바와 같이, 항체-항원 반응의 평형 해리 상수를 말하는 KD로서 정량화될 수 있다. 종 교차-반응성 항-ICOS 항체는 30배 이하, 25배 이하, 20배 이하, 15배 이하, 10배 이하 또는 5배 이하인 인간 및 마우스 ICOS에 대한 친화성의 배수 차이를 가질 수 있다. 다른 말로 하면, 인간 ICOS의 세포외 도메인과 결합의 KD는 마우스 ICOS의 세포외 도메인과 결합의 KD의 30배 이내, 25배 이내, 20배 이내, 15배 이내, 10배 이내 또는 5배 이내일 수 있다. 항체는 둘 다의 종과 결합의 KD가 역치 값을 충족하는 경우, 예로 인간 ICOS와 결합의 KD 및 마우스 ICOS와 결합의 KD가 둘 다 10 mm 이하, 바람직하게는 5 mM 이하, 더욱 바람직하게는 1 mM 이하인 경우 교차-반응성으로 역시 고려될 수 있다. KD는 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하 또는 1 nM 이하 일 수 있다. KD는 0.9 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하 또는 0.1 nM 이하일 수 있다.
인간 ICOS 및 마우스 ICOS에 대한 교차-반응성의 대안적인 측정은 HTRF 검정법 (실시예 8 참조)에서와 같이 ICOS 수용체에 결합하는 ICOS 리간드를 중화시키는 항체의 능력이다. STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM005 및 STIM006을 포함하는 종 교차-반응성 항체의 예가 본원에 제공되며, 이들 각각은 HTRF 검정법에서 인간 B7-H2 (ICOS 리간드)의 인간 ICOS에 대한 결합을 중화시키고, 마우스 B7-H2의 마우스 ICOS에 대한 결합을 중화시키는 것이 검증되었다. 인간 및 마우스 ICOS에 대해 교차-반응하는 항체를 원할 때, 임의의 이들 항체 또는 이의 변이체를 선택할 수 있다. 종 교차-반응성 항-ICOS 항체는 HTRF 검정법에서 결정된 바와 같이 인간 ICOS 수용체에 대한 인간 ICOS의 결합을 억제하기 위한 IC50을 마우스 ICOS 수용체에 대한 마우스 ICOS의 결합을 억제하기 위한 IC50의 25배, 20배, 15배, 10배 또는 5배 이내로 가질 수 있다. 항체는 또한 인간 ICOS 수용체에 대한 인간 ICOS의 결합을 억제하는 IC50 및 마우스 ICOS 수용체에 대한 마우스 ICOS의 결합을 억제하는 IC50이 둘 다 1 mM 이하, 바람직하게는 0.5 mM 이하, 예로 30 mM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하인 경우 교차-반응성으로서 간주될 수 있다. IC50은 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하 또는 2 nM 이하일 수 있다. 일부 경우에, IC50은 적어도 0.1 nM, 적어도 0.5 nM 또는 적어도 1 nM이 될 것이다.
특이성
본 발명에 따른 항체는 바람직하게 ICOS에 대해 특이적이다. 즉, 상기 항체는 표적 단백질인 ICOS (상기 언급된 바와 같은 인간 ICOS, 바람직하게는 마우스 및/또는 시노몰거스 ICOS) 상에 이의 에피토프와 결합하지만, CD28 유전자 패밀리의 다른 분자를 포함하여 해당 에피토프를 제시하지 않는 분자에는 유의한 결합을 나타내지 않는다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게 인간 CD28과 결합하지 않는다. 항체는 또한 바람직하게는 마우스 또는 시노몰거스 CD28과 결합하지 않는다.
CD28은 TCR을 통한 항원 인식의 맥락에서 전문적 항원 제시 세포에서 이의 리간드 CD80 및 CD86에 의해 결합될 때 T-세포 반응을 보조자극한다. 본원에 기술된 항체의 다양한 생체내 용도에 있어서, CD28에 결합의 회피가 유익한 것으로 고려된다. CD28에 대한 항-ICOS 항체의 비-결합은 CD28이 이의 미가공 리간드와 상호작용하고 T-세포 활성화를 위한 적절한 보조-자극 신호를 생성하도록 허용한다. 추가적으로, CD28에 대한 항-ICOS 항체의 비-결합은 수퍼작동기작의 위험을 회피한다. CD28의 과다-자극은 TCR을 통한 동종 항원의 인식의 정상적인 요구없이 휴식 T-세포에서 증식을 유도할 수 있으며, 잠재적으로 특히 인간 대상에서 T-세포의 급속 활성화 및 결과적인 사이토카인 방출 증후군으로 이어진다. 따라서, 본 발명에 따른 항체의 CD28의 미인식은 인간에서의 이들의 임상적 안전성 견지에서 이점을 나타낸다.
본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 다중특이적 항체 (예로, 이중특이체)로 확장된다. 다중특이적 (예로, 이중특이적) 항체는 (i) ICOS를 위한 항체의 항원 결합 부위 및 (ii) 또 다른 항원 (예로, PD-L1)을 인식하는 추가의 항원 결합 부위 (본원에 기술된 바와 같이, 선택적으로 항체의 항원 결합 부위)를 포함할 수 있다. 개별 항원 결합 부위의 특이적 결합이 결정될 수 있다. 따라서, ICOS와 특이적으로 결합하는 항체는 ICOS와 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 포함하며, 선택적으로 ICOS의 항원 결합 부위는 하나 이상의 다른 항원에 대한 하나 이상의 추가적인 결합 부위를 더 포함하는 항원 결합 분자, 예로 ICOS 및 PD-L1와 결합하는 이중특이적 항체를 포함한다.
친화성
ICOS에 대한 항체의 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항체의 이의 항원에 대한 친화성은 평형 해리 상수 KD, 항체-항원 상호작용의 결합 또는 온 속도 (Ka) 및 해리 또는 오프 속도 (kd)의 비율 Ka/Kd의 견지에서 정량화될 수 있다. 항체-항원 결합에 대한 Kd, Ka 및 Kd는 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance; SPR)을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 10 mM 이하, 바람직하게는 5 mM 이하, 더욱 바람직하게는 1 mM 이하의 KD로 인간 ICOS의 EC 도메인과 결합할 수 있다. KD는 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하 또는 1 nM 이하일 수 있다. KD는 0.9 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하 또는 0.1 nM 이하일 수 있다. KD는 적어도 0.001 nM 이상, 예를 들면 적어도 0.01 nM 또는 적어도 0.1 nM일 수 있다.
친화성의 정량화는 Fab 형식의 항체와 함께 SPR을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 프로토콜은 다음과 같다:
1. 일차 아민 커플링에 의해서와 같은 바이오센서 칩 (예로, GLM 칩)에 항-인간 (또는 종 매칭된 다른 항체 불변 영역) IgG와 결합시키고;
2. 항-인간 IgG (또는 매칭된 종의 다른 항체)를 예로 Fab 형식으로 테스트 항체에 노출시키고 칩 상에서 테스트 항체를 포획하고;
3. 테스트 항원을 칩의 포획 표면에 농도 범위 예로 5,000 nM, 1,000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM 및 2nM 및 0 nM (예로, 완충액만)로 통과시키고;
4. 25°C에서 SPR을 사용하여 테스트 항원에 대한 테스트 항체의 결합 친화성을 결정한다. 완충액은 pH 7.6에서 150 mM NaCl, 0.05% 계면활성제 (예로, P20) 및 3 mM EDTA일 수 있다. 완충액은 선택적으로 10 mM HEPES를 포함할 수 있다. HBS-EP는 전개 완충액으로서 사용될 수 있다． HBS-EP는 테크노바사 (Teknova Inc, 캘리포니아, 카탈로그 번호 H8022)로부터 입수가능하다．
포획 표면의 재생은 pH 1.7의 10 mM 글리신으로 수행할 수 있다． 이렇게 하면 포획된 항체가 제거되고 표면을 또 다른 상호작용에 사용할 수 있다． 결합 데이타는 예로 ProteOn XPR36TM 분석 소프트웨어에 고유한 모델을 사용하는 표준 기법을 사용하여 고유한 1 : 1 모델에 맞출 수 있다．
비아코아TM, ProteOn XPR36TM (Bio-Rad®) 및 KinExA® (Sapidyne Instruments, Inc)와 같은 다양한 SPR 장비가 알려져 있다． SPR의 작업된 예는 실시예 7에 나와 있다．
기술된 바와 같이, 친화성은 단량체 항체-항원 상호작용의 친화성을 결정하기 위해, 항체가 칩 표면에 결합되고, 테스트 항체가 용액에서 Fab 형식으로 칩 상에 통과하면서, Fab 형식의 항체로 SPR에 의해 결정될 수 있다. 친화성은 임의의 원하는 pH, 예로 pH 5.5 또는 pH 7.6 및 임의의 원하는 온도, 예로 25°C 또는 37°C에서 결정할 수 있다． 실시예 7에서 보고된 바와 같이, 본 발명에 따른 항체는 단가 (Fab) 형식의 항체를 사용하여 SPR에 의해 결정된 바와 같이 2 nM 미만의 외관상 친화성으로 인간 ICOS와 결합하였다.
ICOS에 대한 항체의 결합을 측정하는 다른 방식은, 예로 ICOS의 외인성 표면 발현을 갖는 세포 (예로, CHO 세포) 또는 내인성 수준의 ICOS를 발현하는 활성화된 일차 T-세포를 사용하는 형광 활성화 세포 선별 (FACS)을 포함한다. FACS에 의해 측정된 바와 같이 ICOS-발현 세포에 결합하는 항체는 항체가 ICOS의 세포외 (EC) 도메인에 결합할 수 있음을 가리킨다.
ICOS 수용체 작동기작
ICOS 리간드 (ICOSL, B7-H2로도 역시 알려짐)는 ICOS 수용체에 결합하는 세포 표면 발현된 분자이다[17]. 이러한 세포간 리간드-수용체 상호작용은 T-세포 표면에서 ICOS의 다량체화를 촉진시키고, 수용체를 활성화하고 T-세포에서의 하류 신호전달을 자극시킨다. 효과기 T-세포에서, 이 수용체 활성화는 효과기 T-세포 반응을 자극한다.
항-ICOS 항체는 ICOS의 작동제 (agonist)로서 작용할 수 있으며, 수용체에 미치는 미가공 ICOS 리간드의 이러한 자극성 효과를 모방하거나 능가할 수 있다. 이러한 작동기작은 항체가 T-세포 상의 ICOS의 다량체화를 촉진시키는 능력에 기인 할 수 있다. 이를 위한 하나의 기작은 항체가 T-세포 표면의 ICOS 및 Fc 수용체와 같은 인접한 세포 (예로, B 세포, 항원-제시 세포 또는 다른 면역 세포)의 수용체 사이에 세포간 가교를 형성하는 것이다. 또 다른 기작은 다중 (예로, 두 개) 항원-결합 부위 (예로, 두 개 VH-VL 도메인의 쌍)를 갖는 항체가 다수의 ICOS 수용체 분자를 연결하여 다량체화를 촉진시키는 것이다. 이러한 기작의 조합이 발생할 수 있다．
작동기작은 가교-결합제를 포함하거나 배제하고 용해성 형태의 항체 (예로, 면역글로불린 형식 또는 두 개의 공간적으로 분리된 항원-결합 부위, 예로 두 개 VH-VL의 쌍을 포함하는 다른 항체 형식)를 사용하여 또는 고체 표면에 결합되어 항원-결합 부위의 고정 어레이를 제공하는 항체를 사용하여 시험관내 T-세포 활성화 검정법으로 테스트될 수 있다. 작동기작의 검정은 이러한 검정의 활성화를 위한 표적 T-세포로서 MJ 세포 (ATCC CRL-8294)와 같은 인간 ICOS 양성 T 림프구 세포주를 사용할 수 있다. 하나 이상의 T-세포 활성화 측정은 테스트 항체에 대해 결정될 수 있으며 기준 항체 또는 음성 대조군과 비교되어 테스트 항체에 의해 영향을 받는 T-세포 활성화에 기준 분자 또는 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 (p <0.05) 차이가 있는지 여부를 결정한다. T-세포 활성화의 하나의 적절한 측정은 IFNγ, TNFα 또는 IL-2와 같은 사이토카인의 생산이다. 당업자는 테스트 항체와 대조군 사이의 검정 조건을 표준화하여 적절한 경우 적합한 대조군을 포함할 것이다. 적합한 음성 대조군은 ICOS과 결합하지 않는 동일한 형식 (예로, 이소형 대조군)의 항체, 예로 검정 시스템에 존재하지 않는 항원에 특이적인 항체이다. 검정법의 동적 범위 내에서 동족 이소형 대조군과 비교하여 테스트 항체의 경우에 유의한 차이가 관찰되며, 이는 항체가 해당 검정법에서 ICOS 수용체의 작동제로서 작용하는 것을 나타낸다.
작동제 항체는 T-세포 활성화 검정법으로 테스트될 때 다음과 같이 정의될 수 있다:
대조군 항체와 비교하여 IFNγ 생산의 유도에 대해 유의하게 낮은 EC50을 가지고;
대조군 항체와 비교하여 유의하게 더 높은 최대 IFNγ 생산을 유도하고;
ICOSL-Fc와 비교하여 IFNγ 생산의 유도에 대해 유의하게 낮은 EC50을 가지고;
ICOSL-Fc와 비교하여 유의하게 더 높은 최대 IFNγ 생산을 유도하고;
기준 항체 C398.4A와 비교하여 IFNγ 생산의 유도에 대해 유의하게 낮은 EC50을 가지고; 및/또는
기준 항체 C398.4A와 비교하여 유의하게 더 높은 최대 IFNγ 생산을 유도한다.
시험관내 T-세포 검정은 실시예 13의 비드-결합 검정, 실시예 14의 플레이트-결합 검정 및 실시예 15의 용해성 형태 검정을 포함한다.
유의하게 더 낮은 또는 유의하게 더 높은 값은 예를 들어, 기준 또는 대조군 값과 비교하여 0.5배까지 상이할 수 있고, 0.75배 이하, 2배 이하, 3배 이하, 4배 이하 또는 5배 이하로 상이할 수 있다.
따라서, 일 예에서, 본 발명에 따른 항체는 대조군과 비교하여 비드-결합 형식으로 항체를 사용하는 MJ 세포 활성화 검정법에서 IFNγ의 유도에 대해 유의하게 낮은, 예로 적어도 2배 낮은 EC50을 가진다.
비드 결합 검정법은 비드 표면에 결합된 항체 (대조군 또는 기준 실험의 경우, 대조군 항체, 기준 항체 또는 ICOSL-Fc)를 사용한다. 자성 비드가 사용될 수 있고, 다양한 종류가 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 토실-활성화된 DYNABEADS M-450 (DYNAL Inc, 5 Delaware Drive, Lake Success, NY 11042 Prod No. 140.03, 140.04). 비드는 실시예 13에 기술된 바와 같이 코팅되거나, 일반적으로 코팅 물질을 탄산염 완충액 (pH 9.6, 0.2 M) 또는 당해 기술분야에 공지된 다른 방법으로 용해시킴으로써 코팅될 수 있다. 비드의 사용은 비드 표면에 결합된 단백질의 양을 양호한 정도의 정확도로 편리하게 결정할 수 있게 한다. 표준 Fc 단백질 정량화 방법은 비드 상에 결합된 단백질 정량화에 사용될 수 있다． 임의의 적합한 방법이 분석의 동적 범위 내에서 관련 표준을 참조하여 사용될 수 있다. DELFIA가 실시예 13에서 예시되지만, ELISA 또는 다른 방법이 사용될 수 있다.
항체의 작동기작 활성은 또한 일차 인간 T 림프구에서생체외 측정될 수 있다. 이러한 T-세포에서 IFNγ의 발현을 유도하는 항체의 능력은 ICOS 작동기작을 나타낸다. 본원에는 일차 세포를 사용한 두 가지 T-세포 활성화 검정법이 기술되어 있다 - 실시예 2, T-세포 활성화 검정 1 및 T-세포 활성화 검정 2 참조. 바람직하게, 항체는 T-세포 활성화 검정 1 및/또는 T-세포 활성화 검정 2에서 대조군 항체와 비교하여 5 μg/ml에서 IFNγ의 유의한 (p <0.05) 유도를 나타낼 것이다. 상기 언급된 바와 같이, 항-ICOS 항체는 이러한 분석에서 ICOS-L 또는 C398.4보다 T-세포 활성화를 더 많이 자극할 수 있다. 따라서, 항체는 T-세포 활성화 검정 1 또는 2에서 대조군 또는 기군 항체와 비교하여 5 μg/ml에서 IFNγ의 더 큰 유도를 유의하게 (p <0.05) 나타낼 수 있다. TNFα 또는 IL-2 유도는 대안의 검정 결과로서 측정될 수 있다.
항-ICOS 항체의 작동기작은, 예로 종양 미세환경과 같은 병리학 부위에서 생체내 TReg 및 TEff 세포 집단 사이의 균형을 변화시키는 이의 능력에 기여할 수 있으며, 이는 TEff 세포를 선호한다. 활성화된 ICOS-양성 효과기 T-세포에 의한 종양 세포 살상을 증진하는 항체의 능력은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 결정될 수 있다.
T 세포 의존적 살상
효과기 T-세포 기능은 생체외 공동-배양 검정을 사용하여 생물학적으로 적절한 맥락에서 결정될 수 있고, 상기 검정에서는 종양 세포를 관련 면역 세포와 함께 배양하여 면역 세포-의존적 살상을 유발시키며, TEFF에 의한 종양 세포 살상에 미치는 항-ICOS 항체의 효과가 관찰된다.
활성화된 ICOS-양성 효과기 T-세포에 의한 종양 세포 살상을 증진하는 항체의 능력이 결정될 수 있다. 항-ICOS 항체는 대조군 항체와 비교하여 유의하게 (p <0.05) 종양 세포 사멸을 더 많이 자극할 수 있다. 항-ICOS 항체는 ICOS 리간드 또는 C398.4 항체와 같은 기준 분자와 비교하여 이러한 분석에서 유사하거나 더 많이 종양 세포 살상을 자극할 수 있다. 유사한 정도의 종양 세포 살상은 테스트 항체가 기준 분자와 비교하여 두 배 미만인 검정 판독값으로 나타낼 수 있다.
ICOS 리간드-수용체 중화 효능
본 발명에 따른 항체는 ICOS의 이의 리간드 ICOSL에 대한 결합을 억제하는 것일 수 있다.
항체가 ICOS 수용체의 이의 리간드에 결합을 저해하는 정도는 이의 리간드-수용체 중화 효능이라고 지칭된다. 효능은 달리 명시되지 않는 한 정상적으로 IC50 값 (pM)으로서 표현된다. 리간드 결합 연구에서, IC50은 최대 특이적 결합 수준의 50%까지 수용체 결합을 감소시키는 농도이다. IC50은 항체 농도의 로그 함수로서 특이적 수용체 결합%을 좌표화하고, 프리즘 (GraphPad)과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 IC50 값을 생성하기 위해 시그모이드 함수를 데이타에 맞춤으로써 계산될 수 있다. 중화 효능은 HTRF 검정법에 의해 결정될 수 있다. 리간드-수용체 중화 능력에 대한 HTRF 검정법의 자세한 작동 예를 실시예 8에 설명한다.
IC50 값은 다수의 측정의 평균을 나타낼 수 있다. 따라서, 예를 들어, 세 번의 실험 결과로부터 IC50 값을 얻을 수 있고, 다음으로 평균 IC50 값을 계산할 수 있다.
항체는 리간드-수용체 중화 검정법에서 1 mM 이하의 IC50, 예로 0.5 mM 이하를 가질 수 있다. IC50은 30 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하 또는 2 nM 이하일 수 있다. IC50은 적어도 0.1 nM, 적어도 0.5 nM 또는 적어도 1 nM일 수 있다.
항체
실시예에서 보다 자세히 기술된 바와 같이, 본 발명자는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009로 명명된 특히 관심있는 항체를 분리하고 특성화하였다. 본 발명의 다양한 관점에서, 문맥 상 달리 지시하지 않는 한, 항체는 이들 항체 중 어느 하나 또는 STIM001, STIM002, STIM003, STIM004 및 STIM005의 하위집합로부터 선택될 수 있다. 이들 항체 각각의 서열은 첨부된 서열 목록에 제공되며, 각 항체에 대해 다음의 서열이 표시된다: VH 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; VH 도메인의 아미노산 서열; VH CDR1 아미노산 서열, VH CDR2 아미노산 서열; VH CDR3 아미노산 서열; VL 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; VL 도메인의 아미노산 서열; VL CDR1 아미노산 서열; VL CDR2 아미노산 서열; 및 VL CDR3 아미노산 서열. 본 발명은 첨부된 서열 목록 및/또는 도면에 나타낸 모든 항체의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 갖는 항-ICOS 항체뿐만 아니라 이들 항체의 HCDR 및/또는 LCDR을 포함하고, 선택적으로 완전 중쇄 및/또는 완전 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체를 포괄한다.
STIM001는 서열번호 363의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 364의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 365의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 366의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 367이다. STIM001은 서열번호 370의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 371의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 372의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 373의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 374이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 368 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 369)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 375 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 376)이다.
STIM002는 서열번호 377의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 378의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 379의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 380의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 381이다. STIM002는 서열번호 384의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 385의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 386의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 387의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 388 또는 서열번호 519이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 382 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 383)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 389 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 390 또는 서열번호 520)이다.
STIM002 -B는 서열번호 391의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 392의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 393의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 394의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 395이다. STIM002-B는 서열번호 398의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 399의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 400의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 401의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 402이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 396 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 397)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 403 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 404)이다.
STIM003은 서열번호 405의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 406의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 407의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 408의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 409 또는 서열번호 521이다. STIM003은 서열번호 412의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 413의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 414의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 415의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 416이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 410 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 411 또는 서열번호 522)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 417 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 418)이다.
STIM004는 서열번호 419의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 420의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 421의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 422의 중쇄 가변 영역 (Vh) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 423이다. STIM004는 서열번호 426의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 427의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 428의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 429의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 430 또는 서열번호 431이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 424 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 425)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 432 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 433 또는 서열번호 434)이다.
STIM005는 서열번호 435의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 436의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 437의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 438의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 439이다. STIM005는 서열번호 442의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 443의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 444의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 445의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 446이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 440 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 441)이다. 전장 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 447 (경쇄 핵산 서열 서열번호 448)이다.
STIM006은 서열번호 449의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 450의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 451의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 452의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 453이다. STIM006은 서열번호 456의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 457의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 458의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 459의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 460이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 454 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 455)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 461 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 462)이다.
STIM007은 서열번호 463의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 464의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 465의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 466의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 467이다. STIM007은 서열번호 470의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 471의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 472의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 473의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 474이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 468 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 469)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 475 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 476)이다.
STIM008은 서열번호 477의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 478의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 479의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 480의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 481이다. STIM008은 서열번호 484의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 485의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 486의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 487의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 488이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 482 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 483)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 489 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 490)이다.
STIM009는 서열번호 491의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 492의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 493의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 494의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 가진다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 495이다. STIM009는 서열번호 498의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 499의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 500의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 501의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 가진다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 502이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 496 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 497)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 503 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 504)이다.
본 발명에 따른 항체는 면역글로불린 또는 면역글로불린 도메인을 포함하는 분자로서 자연적으로 또는 일부 또는 전부 합성적으로 생산된다. 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자 또는 이의 항원-특이적 항체 단편 (Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체구조 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scfv, 다이아체를 포함하나 이에 한정되지는 않음)일 수 있고, 항체를 자연적으로 생산하는 임의의 종으로부터 유래되거나 재조합 DNA 기술로 생성되는지 여부와 상관없고, 혈청, B 세포, 하이브리도마, 트랜스팩토마, 효모 또는 박테리아로부터 분리되는지 여부와 상관없다. 항체는 일상적인 기술을 사용하여 인간화될 수 있다． 용어 항체는 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 항원-결합 부위 (파라토프)는 표적 항원 (ICOS)의 에피토프에 결합하고 이의 항원과 상보적인 항체의 일부이다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원의 영역을 말한다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 하위집합이며, 상호작용의 친화성에 직접 기여하는 이들 잔기를 갖는다. 에피토프는 또한 비-선형 아미노산으로 구성된 입체구조일 수 있다. 소정의 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기 또는 설포닐기와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화인 결정기를 포함할 수 있으며, 소정의 구현예에서는 특이적 삼차원 구조적 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다.
항원 결합 부위는 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 항원과 결합할 수 있는 폴리펩타이드 또는 도메인이다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 CDR3 (예로, HCDR3)를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 항체 (예로, HCDR1 내지 3)의 가변 도메인의 CDR1 및 2 (예로, HCDR1 및 2) 또는 CDR1 내지 3을 포함한다.
항체 항원-결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 결합 부위는 단일 가변 도메인, 예로 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인) 또는 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인)에 의해 제공된다. 또 다른 예에서, 결합 부위는 VH/VL 쌍 또는 둘 이상의 이러한 쌍을 포함한다. 따라서, 항체 항원-결합 부위는 VH 및 VL을 포함할 수 있다.
항체는 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 전체일 수 있거나, 항체 단편 일 수 있다. 항체 단편은 미가공 항체의 일부, 예를 들어 미가공 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다.
항체 단편의 예로는
(i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 단가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편;
(iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편;
(iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편,
(v) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편 (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합된 Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); 및
(vi) 특이적 항원-결합 기능성을 보유하는 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
추가의 항체의 예는 중쇄 (5'-VH-(조건부 힌지)-CH2-CH3-3')의 이량체를 포함하고, 경쇄가 결여되어 H2 항체이다.
단일 사슬 항체 (예로, scFv)는 공통적으로 사용되는 단편이다. 다중특이적 항체는 항체 단편으로부터 형성될 수 있다. 본 발명의 항체는 적절한 경우 임의의 이러한 형식을 채용할 수 있다.
선택적으로, 항체 면역글로불린 도메인은 추가적인 폴리펩타이드 서열 및/또는 표지, 태그, 독소 또는 기타 분자에 융합되거나 컨쥬게이션될 수 있다. 항체 면역글로불린 도메인은 ICOS에 추가하여 제 2 항원과 결합할 수 있는 분자를 제공하면서, 하나 이상의 상이한 항원 결합 영역에 융합되거나 컨쥬게이션될 수 있다. 본 발명의 항체는 (i) ICOS에 대한 항체 항원 결합 부위 및 (ii) 또 다른 항원 (예로, PD-L1)을 인식하는 추가의 항원 결합 부위 (본원에 기술된 바, 선택적으로 항체 항원 결합 부위)를 포함하는, 다중특이적 항체, 예로 이중특이적 항체일 수 있다.
항체는 정상적으로 항체의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 항체의 단리된 VH 및 VL 도메인도 역시 본 발명의 일부이다. 항체 가변 도메인은 상보성 결정 영역 (CDR, 예로, CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 구조틀 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 및 중쇄의 부분이다. 따라서, 각각의 VH 및 VL 도메인 내에 CDR 및 FR이 있다. VH 도메인은 HCDR 집합을 포함하고, VL 도메인은 LCDR 집합을 포함한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 말한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 말한다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지 배열된 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성된다. 본 발명에서 사용되는 방법에 따르면, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 카밧에 따라 (면역학적 관심있는 단백질의 서열 (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991)) 또는 IMGT 명명법에 따라 정의될 수 있다. 항체는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 및 구조틀을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다. VL CDR1, CDR2 및 CDR3 및 구조틀을 포함하는 항체 VL 도메인을 대안적으로 또는 역시 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 예는 본 발명의 일부를 형성하는 첨부된 서열 목록에 열거된 바와 같다. 서열 목록에 표시된 CDR은 IMGT 시스템에 따라 정의된다 [18]. 본원에 개시된 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 집합 및 HCDR 집합 및 LCDR 집합은 본 발명의 관점 및 구현예를 나타낸다. 본원에 기술된 바와 같이, "CDR 집합"은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR 집합은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 말하고, LCDR 집합은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 말한다. 달리 명시되지 않는 한, "CDR 집합"은 HCDR 및 LCDR을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이 본 발명의 항체는 하나 이상의 CDR, 예로 CDR3 및 선택적으로 CDR1 및 CDR2도 역시 포함하여 CDR 집합을 형성한다. CDR 또는 CDR 집합은 임의의 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009의 CDR 또는 CDR 집합일 수 있거나, 또는 본원에 기술된 바와 같은 이의 변이체일 수 있다.
본 발명은 항체 임의의 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 및/또는 임의의 이들 항체의 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 예로 CDR 집합을 포함하는 항체를 제공한다. 항체는 이들 항체 중 하나의 VH CDR 집합을 포함할 수 있다. 선택적으로, 이것은 또한 이들 항체 중 하나의 VL CDR 집합을 포함할 수 있으며, VL CDR은 VH CDR과 동일하거나 상이한 항체로부터 유래될 수 있다.
개시된 HCDR 집합을 포함하는 VH 도메인 및/또는 개시된 LCDR 집합을 포함하는 VL 도메인이 또한 본 발명에 의해 제공된다.
전형적으로, VH 또는 VL 도메인 단독을 하기에 더 논의된 바와 같이 항원과 결합시키는 데 사용할 수 있더라도, VH 도메인은 항체의 항원 결합 부위를 제공하도록 VL 도메인과 쌍을 이룬다. STIM003 VH 도메인은 STIM003 VH 도메인과 쌍을 이룰 수 있어, STIM003 VH 및 VL 도메인 둘 다를 포함하는 항체의 항원-결합 부위가 형성된다. 유사한 구현예가 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인에 제공된다. 다른 구현예에서, STIM003 VH는 STIM003 VL 이외의 VL 도메인과 쌍을 이룬다. 경쇄 다양성은 당해 기술분야에 잘 확립되어 있다. 다시 말하면, 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인에 대한 유사한 구현예가 본 발명에 의해 제공된다.
따라서 임의의 항체 STIM001, STIM002, STIM003, STIM004 STIM005의 VH는 임의의 항체 STIM001, STIM002, STIM003, STIM004 및 STIM005의 VL과 쌍을 이룰 수 있다. 또한, 임의의 항체 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009의 VH는 임의의 항체 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 VL과 쌍을 이룰 수 있다.
항체는 항체 구조틀 내에서 하나 이상의 CDR, 예로 CDR 집합을 포함할 수 있다. 구조틀 영역은 인간 생식계열 유전자 분절 서열이 될 수 있다. 따라서, 항체는 인간 생식계열 구조틀에서 HCDR 집합을 포함하는 VH 도메인을 갖는 인간 항체일 수 있다. 정상적으로, 항체는 예로 인간 생식계열 구조틀에서 LCDR 집합을 포함하는 VL 도메인도 역시 갖는다. 항체 "유전자 분절", 예로 VH 유전자 분절, D 유전자 분절 또는 JH 유전자 분절은 항체의 해당 부분이 유래한 핵산 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드를 말하며, 예로 VH 유전자 분절은 FR1에서 CDR3 부분까지의 폴리펩타이드 VH 도메인에 상응하는 핵산 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드이다. 인간 V, D 및 J 유전자 분절은 재조합하여 VH 도메인을 생성하고, 인간 V 및 J 단편은 재조합하여 VL 도메인을 생성한다. D 도메인 또는 영역은 항체 사슬의 다양성 도메인 또는 영역을말한다. J 도메인 또는 영역은 항체 사슬의 연결 도메인 또는 영역을 말한다. 체세포 과다-돌연변이는 상응하는 유전자 분절과 정확하게 매칭 또는 정렬하지 않는 구조틀 영역을 갖는 항체 VH 또는 VL 도메인을 유도할 수 있지만, 서열 정렬은 가장 가까운 유전자 분절을 확인하고 이로써 특정 유전자 분절의 조합으로부터 특정 VH 또는 VL 도메인이 유도되는 것을 확인하는 데 사용될 수 있다. 항체 서열을 유전자 분절과 정렬시킬 때, 항체 아미노산 서열은 유전자 분절에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 함께 정렬 될 수 있거나, 항체 뉴클레오타이드 서열이 유전자 분절의 뉴클레오타이드 서열과 함께 직접 정렬될 수 있다.
관련된 항체 및 인간 생식계열 서열에 대한 STIM 항체 VH 및 VL 도메인 서열의 정렬을 도 35, 도 36 및 도 37에 나타낸다.
본 발명의 항체는 인간 가변 영역 및 비-인간 (예로, 마우스) 불변 영역을 포함하는 인간 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들어 인간 가변 영역을 가지며, 선택적으로 인간 불변 영역도 역시 갖는다.
따라서, 항체는 선택적으로 불변 영역 또는 이의 일부, 예를 들어, 인간 항체 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 예를 들어, VL 도메인은 이의 C- 말단에서 항체 경쇄 카파 또는 람다 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, 항체 VH 도메인은 C- 말단에서 임의의 항체 이소형, 예로 IgG, IgA, IgE 및 IgM 또는 IgG1 또는 IgG4와 같은 임의의 이소형 하위클래스로부터 유래한 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부 (예로, CH1 도메인 또는 Fc 영역)에 부착될 수 있다.
인간 중쇄 불변 영역의 예는 표 S1에 나타낸다.
본 발명의 항체의 불변 영역은 대안적으로 비-인간 불변 영역일 수 있다. 예를 들어, 항체가 유전자전환 동물 (본원의 다른 곳에서 설명된 예)에서 생성될 때, 인간 가변 영역 및 비-인간 (숙주 동물) 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 생성될 수 있다. 일부 유전자전환 동물은 완전 인간 항체를 생성한다. 다른 것들은 키메라 중쇄 및 완전 인간 경쇄를 포함하는 항체를 생성하도록 조작되었다. 항체가 하나 이상의 비-인간 불변 영역을 포함하는 경우, 이들은 면역원성이 감소됨으로써 치료적 조성물로서 인간에게 투여하기에 보다 적합한 항체를 제공하기 위해 인간 불변 영역으로 대체될 수 있다.
효소 파파인으로 항체를 분해하면 "Fab" 단편으로도 알려진 두 개의 동일한 항원-결합 단편과 항원-결합 활성을 갖지 않지만 결정화 능력을 갖는 "Fc" 단편이 생성된다. 본원에서 사용되는 "Fab"는 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인을 포함하는 항체의 단편을 나타낸다. 본원에서 용어 "Fc 영역"은 미가공-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C- 말단 영역을 정의하는데 사용된다. "Fc 단편"은 디설파이드에 의해 함께 보유된 중쇄의 카복시-말단 부분을 말한다. 항체의 효과기 기능은 소정의 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 역시 인식되는 영역인 Fc 영역의 서열에 의해 결정된다. 효소 펩신으로 항체를 분해하면 항체 분자의 두 팔이 연결되어 두 개의 항원 결합 부위를 포함하는 F(ab')2 단편이 생성된다. F(ab')2 단편은 항원을 교차결합시키는 능력을 가진다.
"Fv"는 본원에서 사용될 때 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 모두 보유하는 항체의 최소 단편을 말한다. 이 영역은 치밀한 비공유 또는 공유 결합으로 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. VH-VL 이량체의 표면에서 항원-결합 부위를 정의하도록 각 가변 도메인의 세 개 CDR이 상호작용하는 것이 이 입체구조에 있다. 종합적으로, 여섯 개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 종합적으로, 여섯 개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 세 개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화성일지라도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다．
본원에 개시된 항체는 혈청 반감기를 증가 또는 감소시키도록 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 다음의 돌연변이 T252L, T254S 또는 T256F는 항체의 생물학적 반감기를 증가시키도록 도입될 수 있다. 생물학적 반감기는 또한 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개 루프로부터 가져온 에피토프와 결합하는 구제 수용체를 포함하도록 중쇄 불변 영역 CH1 도메인 또는 CL 영역을 변경함으로써 증가될 수 있고, 미국 특허 5,869,046 및 6,121,022에 개시된 바와 같으며, 이에 기술된 변형은 본원에 참고문헌으로 통합된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 Fc 힌지 영역은 항체 또는 단편의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 경계면 영역 내로 도입되어 항체 또는 단편은 미가공 Fc-힌지 도메인 SpA와 비교하여 스태필로코커스 단백질 A (SpA) 결합을 손상시켰다. 다른 혈청 반감기를 증가시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 일 구현예에서, 항체 또는 단편은 PEG화된다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 단편은 알부민-결합 도메인, 예로 알부민 결합 단일 도메인 항체 (dAb)에 융합된다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 단편은 PAS화된다 (예로, 큰 유체역학적 부피를 갖는 하전되지 않은 무작위 코일 구조를 형성하는 PAS (XL-Protein GmbH)로 구성된 폴리펩타이드 서열의 유전적 융합). 또 다른 구현예에서, 항체 또는 단편은 XTEN화®/rPEG화된다 (예로, 치료제 펩타이드에 부정확 반복 펩타이드 서열 (Amunix, Versartis)의 유전적 융합). 또 다른 구현예에서, 항체 또는 단편은 ELP화된다 (예로, ELP 반복 서열 (PhaseBio)의 유전적 융합). 이들 다양한 반감기를 연장하는 융합은 Strohl, BioDrugs (2015) 29: 215-239에서 보다 자세하게 기술되고, 예로 표 2 및 6에서의 융합은 본원에서 참고문헌으로 통합된다.
항체는 안정성을 증가시키도록 변형된 불변 영역을 가질 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 Ser228Pro 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 항체 및 단편은 시스테인 잔기의 수를 변경시키도록 변형되었던 중쇄 힌지 영역을 포함한다. 이 변형은 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키는 데 사용될 수 있다.
Fc 효과기 기능, ADCC , ADCP 및 CDC
상기 논의한 바와 같이, 항-ICOS 항체는 다양한 이소형으로 및 상이한 불변 영역과 함께 제공될 수 있다. 인간 IgG 항체 중쇄 불변 영역 서열의 예는 표 S1에 나타낸다. 항체의 Fc 부위는 주로 Fc 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 포식작용 (ADCP) 활성의 견지에서 이의 효과기 기능을 결정한다. 이들 "세포 효과기 기능"은 효과기 T-세포 기능과는 달리 Fc 수용체를 보유하는 세포를 표적 세포 부위에 모집하여 항체-결합 세포를 죽이는 결과를 가져온다. ADCC 및 CDC에 추가하여, ADCP 기작 [19]은 항체-결합 T-세포를 고갈시키고 따라서 ICOS를 발현하는 TReg를 표적화하여 결실시키는 수단을 나타낸다.
세포 효과기 기능 ADCC, ADCP 및/또는 CDC는 또한 Fc 영역이 결여된 항체에 의해 나타날 수 있다. 항체는 다수의 상이한 항원-결합 부위를 포함할 수 있으며, 하나는 ICOS로 지향하고, 다른 하나는 표적 분자로 지향하여 해당 표적 분자의 관여로 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 유도하고, 예로 하나의 scFv가 효과기 세포와 결합 할 수 있는 링커에 의해 연결된 두 개의 scFv 영역을 포함하는 항체이다.
본 발명에 따른 항체는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 나타내는 항체일 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC 활성이 결여될 수 있다. 어느 경우에나, 본 발명에 따른 항체는 하나 이상의 유형의 Fc 수용체에 결합하는 Fc 영역을 포함할 수 있거나, 선택적으로 결여할 수 있다. 상이한 항체 형식의 사용 및 FcR 결합 및 세포 효과기 기능의 존재 또는 부재는, 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 상세하게 치료 목적으로 사용하기 위해 항체가 재단되도록 한다.
일부 치료 분야에 적합한 항체 형식은 야생형 인간 IgG1 불변 영역을 채용한다. 불변 영역은 선택적으로 ADCC 및/또는 CDC 및/또는 ADCP 활성을 갖는 효과기-작동 IgG1 불변 영역일 수 있다. 적합한 야생형 인간 IgG1 불변 영역 서열은 서열번호 340 (IGHG1*01)이다. 인간 IgG1 불변 영역 서열의 추가의 예는 표 S1에 나타낸다.
인간 질환의 마우스 모델에서 후보 치료 항체를 테스트하기 위해, 효과기 양성 인간 불변 영역 대신에 마우스 IgG2a (mIgG2a)와 같은 효과기 양성 마우스 불변 영역이 포함될 수 있다.
불변 영역은 증진된 ADCC 및/또는 CDC 및/또는 ADCP를 위해 조작될 수 있다.
Fc-매개성 효과의 효능은 다양한 확립된 기법에 의해 Fc 영역을 조작함으로써 증진될 수 있다. 이러한 방법은 특정 Fc-수용체에 대한 친화성을 증가시켜 잠재적인 활성화 증진의 다양한 프로파일을 생성한다. 이것은 하나 또는 여러 아미노산 잔기의 변형에 의해 달성될 수 있다 [20]. Asn297 잔기 (예로, N297Q, EU 인덱스 번호매김) 상의 특이적 돌연변이 또는 변형된 글리코실화를 포함 한 인간 IgG1 불변 영역은 Fc 수용체와의 결합을 증진시키는 것으로 나타났다. 돌연변이의 예는 인간 IgG1 불변 영역 (또는 다른 IgG 이소형의 등가 위치)에 대해 239, 332 및 330번으로부터 선택된 하나 이상의 잔기이다. 따라서, 항체는 N297Q, S239D, I332E 및 A330L (EU 인덱스 번호매김)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 삼중 돌연변이 (M252Y/S254T/T256E)가 FcRn에 대한 결합 증진시키는 데 사용될 수 있고, FcRn 결합에 영향을 주는 기타 돌연변이가 본 발명에 채용될 수 있는 표 2에서 논의된다 [21].
Fc 수용체에 대한 증가된 친화성은 Fc 영역의 천연 글리코실화 프로파일을 변경하여, 예를 들어 퓨코실화 또는 탈퓨코실화 변이체 하에 생성함으로써 또한 달성될 수 있다 [22]. 비-퓨코실화 항체는 퓨코스 잔기가 없는 Fc의 복합체-유형의 N-글리칸의 삼중-만노실 코아 구조를 보유한다. Fc N-글리칸으로부터 코어 퓨코스 잔기가 결여된 이들 당조작된 항체는 FcRIIIa 결합능의 증진으로 인하여 퓨코실화 등가물보다 강한 ADCC를 나타낼 수 있다. 예를 들어, ADCC를 증가시키기 위해, 힌지 영역의 잔기가 Fc-감마 RIII에 대한 결합을 증가시키도록 변경될 수 있다 [23]. 따라서, 항체는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 변이체인 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있고, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역보다 높은 친화성으로 인간 Fcγ 수용체에 결합하는 FcyRIIB 및 FcyRIIA로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Fc 수용체에 결합한다. 따라서, 항체는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 변이체인 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있고, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역보다 높은 친화성으로 인간 FcRIIB에 결합하는 인간 FcRIIB에 결합한다. 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 변이체 인간 IgG1, 변이체 인간 IgG2 또는 변이체 인간 IgG4 중쇄 불변 영역일 수 있다. 일 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 G236D, P238D, S239D, S267E, L328F 및 L328E (EU 인덱스 번호매김 시스템)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 S267E 및 L328F; P238D 및 L328E; P238D로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 돌연변이; 및 E233D, G237D, H268D, P271G 및 A330R; P238D, E233D, G237D, H268D, P271G 및 A330R; G236D 및 S267E; S239D 및 S267E; V262E, S267E 및 L328F; 및 V264E, S267E 및 L328F (EU 인덱스 번호매김 시스템)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환의 집합을 포함한다.CDC의 증진은 고전적인 보체 연쇄 활성화의 첫 번째 성분인 C1q에 대한 친화성을 증가시키는 아미노산 변화에 의해 달성될 수 있다 [24]. 또 다른 접근법은 C1q [25]에 대한 IgG3의 고친화성을 이용하는 인간 IgG1 및 인간 IgG3 분절로부터 생성된 키메라 Fc 도메인을 생성하는 것이다. 본 발명의 항체는 잔기 329, 331 및/또는 322번의 아미노산 변이를 포함하여 C1q 결합 및/또는 감소 또는 제거된 CDC 활성을 변경할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 항체 또는 항체 단편은 잔기 231 및 239번에서의 변형을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있으며, 이에 의해 아미노산은 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시키도록 대체된다. 일 구현예에서, 항체 또는 단편은 E345K, E430G, R344D 및 D356R로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, 상세하게 R344D 및 D356R을 포함하는 이중 돌연변이 (EU 인덱스 번호매김 시스템)를 포함하는 불변 영역을 갖는다.
국제특허출원 WO2008/137915는 증진된 효과기 기능을 갖는 변형된 Fc 영역을 갖는 항-ICOS 항체가 기술한다. 항체는 VH 및 VK 도메인 및 야생형 Fc 영역을 포함하는 모체 항체에 의해 매개되는 ADCC 활성의 수준과 비교하여 증진된 ADCC 활성을 매개하는 것으로 보고되었다. 본 발명에 따른 항체는 본원에 기술된 바와 같은 효과기 기능을 갖는 이러한 변이체 Fc 영역을 채용할 수 있다.
항체의 ADCC 활성은 본원에 기술된 검정법으로 결정될 수 있다. 항-ICOS 항체의 ADCC 활성은 실시예 10에 기술된 바와 같은 ICOS 양성 T-세포주를 사용하여 시험관내에서 측정될 수 있다. 항-PD-L1 항체의 ADCC 활성은 PD-L1 발현 세포를 사용하는 ADCC 검정법에서 시험관내에서 측정될 수 있다.
소정의 적용의 경우 (예로, 백신 접종의 맥락에서) Fc 효과기 기능이 없는 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 항체는 불변 영역 없이 또는 Fc 영역 없이 제공될 수 있다 - 이러한 항체 형식의 예는 본 명세서의 다른 곳에서 설명된다. 대안적으로, 항체는 효과기가 없는 불변 영역을 가질 수 있다. 항체는 Fcγ 수용체와 결합하지 않는 중쇄 불변 영역을 가질 수 있으며, 예를 들어 불변 영역은 Leu235Glu 돌연변이 (예로, 야생형 류신 잔기가 글루탐산 잔기로 돌연변이된 경우)를 포함할 수 있다. 또 다른 중쇄 불변 영역에 대한 조건부 돌연변이는 안정성을 증가시키는 Ser228Pro이다. 중쇄 불변 영역은 Leu235Glu 돌연변이 및 Ser228Pro 돌연변이 둘 다를 포함하는 IgG4일 수 있다. 이 "IgG4-PE" 중쇄 불변 영역은 효과기가 없다.
대안의 효과기가 없는 인간 불변 영역은 무력화 IgG1이다. 무력화 IgG1 중쇄 불변 영역은 235 및/또는 237번 위치에 알라닌 (EU 인덱스 번호매김)을 포함할 수 있으며, 예를 들어 L235A 및/또는 G237A 돌연변이 ("LAGA")를 포함하는 IgG1*01 서열일 수 있다.
변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 인간 FcRIIIA, 인간 FcRIIA 또는 인간 FcRI에 대한 IgG 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, FcRIIB는 대식구, 단핵구, B-세포, 수지상 세포, 내피 세포 및 활성화된 T-세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포에서 발현된다. 일 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 하나 이상의 다음의 아미노산 돌연변이 G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305I, A330L, I332E, E333A, K334A, A339T 및 P396L (EU 인덱스 번호매김 시스템)를 포함한다. 일 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 S239D; T256A; K290A; S298A; I332E; E333A; K334A; A339T; S239D 및 I332E; S239D, A330L 및 I332E; S298A, E333A 및 K334A; G236A, S239D 및 I332E; 및 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L (EU 인덱스 번호매김 시스템)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 돌연변이의 집합을 포함한다. 일 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 S239D, A330L 또는 I332E 아미노산 돌연변이 (EU 인덱스 번호매김 시스템)를 포함한다. 일 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 S239D 및 I332E 아미노산 돌연변이 (EU 인덱스 번호매김 시스템)를 포함한다. 일 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 S239D 및 I332E 아미노산 돌연변이 (EU 인덱스 번호매김 시스템)를 포함하는 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이다. 일 구현예에서, 항체 또는 단편은 퓨코실화되지 않은 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 탈퓨코실화된다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 단편은 퓨코실화된다.
항체는 하나 이상 유형의 Fc 수용체에 결합하지만 세포 효과기 기능을 유도하지 않는, 예로 ADCC, CDC 또는 ADCP 활성을 매개하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 이러한 불변 영역은 ADCC, CDC 또는 ADCP 활성을 촉발시키는 특정 Fc 수용체(들)에 결합할 수 없다.
항체 생성 및 변형
항체를 확인하고 제조하는 방법은 잘 알려져 있다． 항체는 유전자전환 마우스 (KymouseTM, Velocimouse®, Omnimouse®, Xenomouse®, HuMab Mouse® 또는 MeMo Mouse®), 래트 (예로, Omnirat®), 낙타, 상어, 토끼, 닭 또는 ICOS 또는 이의 단편 또는 관심있는 ICOS 서열 모티프를 포함하는 합성 펩타이드로 면역화된 비-인간 동물을 사용하여 생성할 수 있고, 이후에 선택적으로 인간 또는 인간화 항체를 생산하도록 불변 영역 및/또는 가변 영역의 인간화가 이어진다. 예로서, 당업자에게 자명할 바와 같이, 효모, 파지 또는 리보솜 디스플레이와 같은 디스플레이 기술이 사용될 수 있다. 예로 디스플레이 기술을 사용하는 표준 친화성 성숙은 유전자전환 동물, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 기타 라이브러리로부터 선도 항체를 분리한 후 추가 단계에서 수행될 수 있다. 적합한 기술의 대표적인 예는 본 명세서에서 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 US20120093818 (Amgen, Inc)에, 예로 단락 [0309] 내지 [0346]에 기술된 방법으로 기술되어 있다.
인간 ICOS 항원을 갖는 ICOS 녹아웃 비-인간 동물의 면역화는 인간 및 비-인간 ICOS 모두를 인식하는 항체의 생성을 용이하게 한다. 본원에 기술되고 실시예에 설명된 바와 같이, ICOS 녹아웃 마우스는 인간 ICOS를 발현하는 세포로 면역화되어 마우스에서 인간 및 마우스 ICOS에 대한 항체 생산을 자극할 수 있으며, 이를 회수하여 인간 ICOS 및 마우스 ICOS에 대한 결합을 테스트할 수 있다. 따라서, 교차-반응성 항체가 선택될 수 있으며, 이는 본원에 기술된 바와 같은 다른 바람직한 성질에 대해 스크리닝될 수 있다. 내인성 항원 (예로, 내인성 마우스 항원)의 발현이 동물에서 녹아웃된 항원으로 동물을 면역화함으로써 항원 (예로, 인간 항원)에 대한 항체를 생성하는 방법은 인간 가변 도메인을 포함하는 항체를 생성할 수 있는 동물에서 수행될 수 있다. 이러한 동물의 게놈은 인간 가변 영역 유전자 분절을 인코딩하는 인간 또는 인간화 면역글로불린 유전자좌 및 선택적으로 내인성 불변 영역 또는 인간 불변 영역을 포함하도록 조작될 수 있다. 인간 가변 영역 유전자 분절의 재조합은 비-인간 또는 인간 불변 영역을 가질 수 있는 인간 항체를 생성한다. 비-인간 불변 영역은 후속적으로 항체가 인간에서 생체내 사용을 의도하는 곳에서 인간 불변 영역으로 대체될 수 있다. 이러한 방법 및 녹아웃 유전자전환 동물은 국제특허출원 O2013/061078에 기술되어 있다.
일반적으로, KymouseTM, VELOCIMMUNE® 또는 다른 마우스 또는 래트 (언급된 바와 같이, 선택적으로 ICOS 녹아웃 마우스 또는 래트)는 관심있는 항원으로 접종될 수 있고, 림프 세포 (예로, B 세포)를 항체를 발현하는 마우스로부터 회수할 수 있다. 림프 세포를 불멸성 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 골수종 세포주와 융합시키고, 이러한 하이브리도마 세포주를 스크리닝하여 관심있는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인할 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 분리되고 중쇄 및 경쇄의 바람직한 이소형 불변 영역에 연결될 수 있다. 이러한 항체 단백질은 CHO 세포와 같은 세포에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 항원-특이적 키메라 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 인코딩하는 DNA는 항원-특이적 림프구로부터 직접 분리될 수 있다.
우선, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 고친화성 키메라 항체가 분리된다. 항체는 친화성, 선택성, 작동기작, T- 세포 의존적 살상, 중화 효능, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특징을 특성화하고 이에 대해 선택된다. 마우스 불변 영역을 선택적으로 원하는 인간 불변 영역으로 대체하여 본 발명의 완전 인간 항체, 예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4 (예를 들어, 미국 특허 US2011/0065902 (이는 본원에 전문이 참고문헌으로 포함됨)의 서열번호 751, 752, 753)를 생성한다. 선택된 불변 영역은 특정 용도에 따라 다를 수 있지만, 고친화성 항원-결합 및 표적 특이성 특징은 가변 영역에 존재한다.
따라서, 추가의 관점에서, 본 발명은 포유동물 ICOS을 발현하지 않는 인간 또는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 갖는 유전자전환 비-인간 포유동물을 제공한다. 포유동물는 예를 들어, 녹아웃 마우스 또는 래트 또는 다른 실험용 동물 종일 수 있다. Kymouse TM과 같은 유전자전환 마우스는 상응하는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 삽입된 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 본 발명에 따른 유전자전환 포유동물은 이러한 표적화된 삽입을 포함하는 것일 수 있거나, 인간 게놈에 무작위로 삽입되거나, 내인성 Ig 유전자좌 이외의 좌위에 삽입되거나, 추가적인 염색체 또는 염색체 단편 상에 제공되는 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자좌 또는 면역글로불린 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 관점은 ICOS에 대한 항체를 생산하기 위한 이러한 비-인간 포유동물의 용도 및 이러한 포유동물에서 항체 또는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 생산하는 방법이다.
인간 및 비-인간 ICOS의 세포외 도메인과 결합하는 항체를 생산하는 방법은 ICOS를 발현하지 않는, 인간 또는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 갖는 유전자전환 비-인간 포유동물을 제공하는 단계 및
(a) 포유동물을 ICOS 인간 항원 (예로, 인간 ICOS 발현 세포 또는 정제된 재조합 ICOS 단백질) 으로 면역화하는 단계;
(b) 포유동물에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계;
(c) 인간 및 비-인간 ICOS와 결합하는 능력에 대해 항체를 테스트하는 단계; 및
(d) 인간 및 비-인간 ICOS 둘 다와 결합하는 하나 이상의 항체를 선별하는 단계를 포함하는, 방법.
인간 ICOS 및 비-인간 ICOS에 결합하는 능력에 대한 테스트은 표면 플라스몬 공명, HTRF, FACS 또는 본원에 기술된 임의의 다른 방법을 사용하여 시행할 수 있다. 선택적으로, 인간 및 마우스 ICOS에 대한 결합 친화성이 결정된다. 인간 ICOS 및 마우스 ICOS에 대한 결합의 친화성 또는 친화성의 배수 차이가 결정될 수 있고, 따라서 종 교차-반응성을 나타내는 항체가 선택될 수 있다 (선택 판정기준으로서 사용될 수 있는 친화성 역치 및 배수 차이는 본원의 다른 곳에서 예시됨). 인간 및 마우스 ICOS 수용체에 대한 인간 및 마우스 ICOS 리간드 결합을 각각 억제하기 위한 항체의 중화 효능 또는 중화 효능의 배수 차이는 교차-반응성 항체를 스크리닝하는 방식, 예로 HTRF 검정법으로서 역시 또는 대안적으로 결정될 수 있다. 다시 말하면, 선택 판정기준으로서 사용될 수 있는 가능한 임계값 및 배수 차이는 본 명세서의 다른 곳에서 예시된다.
상기 방법은 면역화된 포유동물과 동일한 종으로부터 또는 상이한 종으로부터의 비-인간 ICOS와 결합하는 능력에 대해 항체를 테스트하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 유전자전환 포유동물이 마우스 (예로, KymouseTM)인 경우, 항체는 마우스 ICOS와 결합하는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 유전자전환 포유동물이 래트인 경우, 래트 ICOS와 결합하는 능력에 대해 항체를 테스트할 수 있다. 그러나, 또 다른 종의 비-인간 ICOS에 대한 단리된 항체의 교차-반응성을 결정하는 것이 동등하게 유용할 수 있다. 따라서, 염소에서 생성된 항체는 래트 또는 마우스 ICOS에 대한 결합을 테스트할 수 있다. 선택적으로, 염소 ICOS에 결합이 대신에 또는 추가적으로 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 유전자전환된 비-인간 포유동물은 비-인간 ICOS, 선택적으로 동일한 포유동물 종의 ICOS (예로, ICOS 녹아웃 마우스는 마우스 ICOS로 면역화될 수 있음)로 인간 ICOS 대신에 면역화될 수 있다. 이어서, 인간 ICOS 및 비-인간 ICOS에 대한 결합에 대한 단리된 항체의 친화성을 동일한 방식으로 결정하고, 인간 및 비-인간 ICOS 둘 다에 결합하는 항체를 선별한다.
선택된 항체의 항체 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산이 분리될 수 있다. 이러한 핵산은 완전 항체 중쇄 및/또는 경쇄 또는 관련 불변 영역이 없는 가변 도메인(들)을 인코딩할 수 있다. 언급된 바와 같이,인코딩 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 항체 생산 세포로부터 직접 획득될 수 있거나, B 세포가 항체를 발현하는 하이브리도마 또는 이러한 세포로부터 수득된 인코딩 핵산을 생성하도록 불멸화되거나 융합될 수 있다. 선택적으로, 가변 도메인(들)을 인코딩하는 핵산은 인간 중쇄 불변 영역 및/또는 인간 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 컨쥬게이션되어 인간 항체 중쇄 및/또는 인간 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 예로 중쇄 및 경쇄 둘 다를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이 단계는 면역화된 포유동물이 비-인간 불변 영역을 갖는 키메라 항체를 생성하는 경우에 특히 유용하고, 바람직하게는 인간 불변 영역으로 대체되어 약제로서 인간에게 투여될 때 면역원성이 덜한 항체를 생성한다. 특정 인간 이소형 불변 영역의 제공은 항체의 효과기 기능을 결정하는데 역시 중요하고, 다수의 적합한 중쇄 불변 영역이 본원에서 논의된다.
본원에 기술된 바와 같이, 잔기의 돌연변이 및 변이체의 생성과 같은 항체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산에 대한 다른 변형을 수행할 수 있다.
단리된 (선택적으로 돌연변이된) 핵산은 논의된 바와 같이 숙주 세포, 예로 CHO 세포 내로 도입될 수 있다. 다음으로 숙주 세포를 임의의 원하는 항체 형식으로 항체 또는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 발현 조건 하에 배양한다. 일부 가능한 항체 형식, 예로 전체 면역글로불린, 항원-결합 단편 및 다른 설계가 본원에 기술되어 있다.
임의의 VH 및 VL 도메인의 가변 영역의 아미노산 서열 변이체 또는 본원에 구체적으로 서열이 개시되는CDR이 논의된 바와 같이 본 발명에 따라 채용될 수 있다.
대규모 제조를 위한 항체 서열의 최적화, 정제의 용이화, 안정성의 증진 또는 원하는 약제학적 제형에 포함시키기 위한 적합성의 개선을 포함하는, 변이체를 만드는 것이 바람직할 수 있는 많은 이유가 있다. 단백질 공학 작업은 항체 서열의 하나 이상의 표적 잔기에서 수행될 수 있는데, 예로 하나의 아미노산을 대안의 아미노산으로 치환시키는 것 (선택적으로, 이 위치에서 가능한 Cys 및 Met를 제외하고는 모두 자연 발생 아미노산을 포함하는 변이체를 생성하는 것) 및 최상의 치환을 결정하기 위해 기능 및 표현에 미치는 영향을 모니터링하는 것 등이다. 예를 들어 새로운 분자내 또는 분자간 시스테인-시스테인 결합의 형성을 통해 제조 시 어려움을 유발할 수 있기 때문에 잔기를 Cys 또는 Met로 치환하거나, 이들 잔기를 서열에 도입하는 것이 바람직하지 않은 경우가 있다. 선도 후보 물질이 선택되어 제조 및 임상 개발에 최적화되어 있는 경우, 가능한 한 적은 항원-결합 성질을 변경하거나 적어도 모체 분자의 친화성 및 효능을 유지하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 그러나, 변이체는 친화성, 교차-반응성 또는 중화 효능과 같은 핵심 항체 특징을 조절하기 위해 역시 생성될 수 있다.
항체는 개시된 H 및/또는 L CDR 집합 내에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 임의의 개시된 항체의 H 및/또는 L CDR 집합을 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 따라서, 예를 들어 개시된 H 및/또는 L CDR 집합 내에 하나 이상의 아미노산 치환이 있을 수 있다. 예를 들어, H 및/또는 L CDR 집합 내에 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 돌연변이, 예로 치환이 있을 수 있다. 예를 들어, HCDR3에는 6, 5, 4, 3, 또는 2개의 돌연변이, 예로 치환이 있을 수 있고/거나 LCDR3에는 6, 5, 4, 3 또는 2개의 돌연변이, 예로 치환이 있을 수 있다. 항체는 본원에서 임의의 STIM 항체에 대해 제시된 HCDR, LCDR 또는 6개 (H 및 L) CDR 집합의 집합을 포함할 수 있거나 하나 또는 두 개의 보존적 치환을 갖는 CDR 집합을 포함할 수 있다.
하나 이상의 아미노산 돌연변이는 선택적으로 본원에 개시된 항체 VH 또는 VL 도메인의 구조틀 영역에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 상응하는 인간 생식계열 분절 서열과 다른 하나 이상의 잔기가 생식계열로 복귀될 수 있다. 예시적인 항-ICOS 항체의 VH 및 VL 도메인에 상응하는 인간 생식계열 유전자 분절 서열을 표 E12-1, 표 E12-2 및 표 E12-3에 표시하고, 항체 VH 및 VL 도메인의 상응하는 생식계열 서열과의 정렬을 도면에 나타낸다.
항체는 첨부된 서열 목록에 나타낸 임의의 항체의 VH 도메인과 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하고/거나 임의의 이들 항체의 VL 도메인과 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 두 개 아미노산 서열의 동일성%을 계산하는 데 사용할 수 있는 알고리즘은 예로 기본 매개변수를 채용하는 BLAST, FASTA 또는 스미스-워터맨 알고리즘을 포함한다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경 (아미노산 잔기의 첨가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있다.
하나 이상의 구조틀 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 변경이 만들어질 수 있다． 변이체는 CDR 돌연변이 유발에 의해 선택적으로 제공된다. 변경은 정상적으로 기능의 손실을 초래하지 않고, 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 항체는 ICOS와 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 이것은 예로 본원에 기술된 검정법에서 측정된 바와 같이 변경이 만들어지지 않은 항체와 동일한 정량적인 결합 능력을 보유할 수 있다. 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 항체는 ICOS와 결합하는 개선된 능력을 가질 수 있다.
변경은 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산으로 대체하거나, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-천연 발생 또는 비-표준 형태로 변형시키는 것, 또는 하나 이상의 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산을 서열 내에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 서열에서 변경의 수 및 위치의 예는 본 명세서의 다른 곳에서 기술된다. 자연 발생 아미노산은 표준 단일-문자 코드에 의해 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로서 식별되는 20개의 "표준" L-아미노산을 포함한다. 비-표준 아미노산은 폴리펩타이드 골격에 도입되거나 기존의 아미노산 잔기의 변형으로부터 나올 수 있는 임의의 다른 잔기를 포함한다. 비-표준 아미노산은 자연 발생적이거나 비-자연 발생적일 수 있다．
본원에서 사용되는 용어 "변형"은 하나 이상의 아미노산 또는 핵산의 결실, 치환 또는 첨가에 의해 모체 폴리펩타이드 또는 핵산과 달라지지만, 모체 분자의 하나 이상의 특이적 기능 또는 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 핵산을 말한다. 아미노산 치환은 아미노산이 상이한 천연 발생 아미노산 잔기로 대체되는 변형을 포함한다. 이러한 치환은 "보존적"으로서 분류될 수 있으며, 이 경우 폴리펩타이드 내에 포함된 아미노산 잔기는 극성, 측쇄의 기능성 또는 크기와 관련하여 유사한 특성의 또 다른 천연 발생 아미노산으로 대체된다. 이러한 보존적 치환은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 발명에 포괄되는 치환은 또한 펩타이드에 존재하는 아미노산 잔기가 상이한 군으로부터의 자연 발생 아미노산과 같은 상이한 성질을 갖는 아미노산으로 치환되거나 (예로, 하전된 또는 소수성 아미노산을 알라닌으로 치환함), 선택적으로 자연 발생 아미노산이 통상적이지 않은 아미노산으로 치환되어, "비-보존적"일 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 다양한 용어 내에 포함되는 용어는 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 각각 비교하여 (예로, 야생형 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드와 비교하여) 일차, 이차 또는 삼차 구조에서 변화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 말한다.
일부 관점에서, 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 단리되거나 생성된 "합성 변이체", "재조합 변이체" 또는 "화학적으로 변형된" 폴리뉴클레오티드 변이체 또는 폴리펩타이드 변이체를 사용할 수 있다. "변형된 변이체"는 하기에 설명된 바와 같이 보존적 또는 비-보존적 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변화는 기준 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드에서 아미노산 치환, 첨가, 결실, 융합 및 절단을 초래할 수 있다. 일부 관점은 변이체의 기초가 되는 펩타이드 서열에서 정상적으로 발생하지 않는 (아미노산 및 다른 분자의 삽입 및 치환을 포함하는) 삽입 변이체, 결실 변이체 또는 아미노산의 치환을 갖는 치환된 변이체, 예를 들어 정상적으로 발생하지 않는 오르니틴의 삽입을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다는. 폴리펩타이드를 기술할 때 용어 "보존적 치환"은 폴리펩타이드의 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 폴리펩타이드의 아미노산 조성의 변화를 말한다. 예를 들어, 보존적 치환은 유사한 화학적 성질 (예로, 산성, 염기성, 양성 또는 음성 전하, 극성 또는 비극성 등)을 갖는 상이한 아미노산 잔기로 아미노산 잔기를 치환하는 것을 말한다. 보존적인 아미노산 치환은 류신의 이소류신 또는 발린으로 치환, 아스파테이트의 글루타메이트로 치환 또는 트레오닌의 세린으로 치환을 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 기술 분야에 잘 알려져있다. 예를 들어, 다음의 여섯 개 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환이 되는 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및 6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W). (본원에서 전문이 참고문헌으로 통합되는 Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)도 역시 참조) 일부 구현예에서, 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 개별 치환, 결실 또는 첨가는 또한 변화가 펩타이드의 활성을 감소시키지 않으면 "보존적 치환"으로 간주될 수 있다. 삽입 또는 결실은 전형적으로 약 1 내지 5개 아미노산의 범위이다. 보존적 아미노산의 선택은, 예를 들어 아미노산이 펩타이드의 외부에 존재하고 용매에 노출되거나 내부에 존재하고 용매에 노출되지 않은 경우, 펩타이드에서 치환될 아미노산의 위치에 기초하여 선택될 수 있다.
용매에 노출 (예로, 용매에 노출되지 않은 내부적으로 정착된 아미노산과 비교하여 아미노산이 용매에 노출되거나 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 외부 표면 상에 존재하는 경우)를 포함하여, 기존의 아미노산 위치에 따라 기존의 아미노산을 치환할 아미노산을 선택할 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환의 선택은 예를 들어 Dordo et al, J. MoI Biol, 1999, 217, 721-739 and Taylor et al, J. Theor. Biol. 119(1986); 205-218 and S. French and B. Robson, J. Mol. Evol. 19(1983)171에 개시된 바와 같이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 단백질 또는 펩타이드의 외부에서 아미노산에 적합한 보존적 아미노산 치환 (예로, 용매에 노출된 아미노산)를 선택할 수 있는데, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 다음의 치환을 사용할 수 있다: Y는 F, T는 S 또는 K, A는 P는 A, E는 D 또는 Q, N은 D 또는 G, R은 K, G는 N 또는 A, T는 S 또는 K, D는 N 또는 E, I는 L 또는 V, F는 Y, S는 T 또는 A, R은 K, G는 N 또는 A, K는 R, A는 S, K 또는 P로의 치환.
대안의 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드의 내부에서 아미노산에 적합한 포괄된 보존적 아미노산 치환도 역시 선택할 수 있는데, 예를 들어 단백질 또는 펩타이드의 내부에 존재하는 아미노산에 적합한 (예로, 아미노산이 용매에 노출되지 않음) 보존적 치환을 사용할 수 있고, 예를 들어 이에 한정되지 않지만 다음의 Y는 F, T는 S 또는 K, A는 P는 A, E는 D 또는 Q, N은 D 또는 G, R은 K, G는 N 또는 A, T는 S 또는 K, D는 N 또는 E, I는 L 또는 V, F는 Y, S는 T 또는 A, R은 K, G는 N 또는 A, K는 R, A는 S, K 또는 P로 치환되는 보존적 치환을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-보존적 아미노산 치환도 역시 변이체의 용어 내에 포괄된다.
본 발명은 첨부된 서열 목록에 나타낸 항체 VH 및/또는 VL 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인 변이체를 포함하는 항체를 생산하는 방법을 포함한다. 이러한 항체는 다음을 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다:
(i) 모체 항체 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 모체 항체 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 항체 VH 도메인을 제공하고,
모체 항체 VH 도메인은 항체 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009 중 임의의 적의 VH 도메인 또는 임의의 이들 항체의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 VH 도메인인, 단계,
(ii) 선택적으로 VL 도메인과 함께 제공된 VH 도메인과 조합하여 VH/VL 조합을 제공하는 단계, 및
(iii) 제공된 VH 도메인 또는 VH/VL 도메인 조합을 테스트하여 하나 이상의 원하는 특징을 갖는 항체를 확인하는 단계.
원하는 특징은 인간 ICOS와의 결합, 마우스 ICOS와의 결합, 및 시노몰거스 ICOS와 같은 다른 비-인간 ICOS와의 결합을 포함한다． 인간 및/또는 마우스 ICOS에 대해 비슷하거나 더 높은 친화성을 갖는 항체가 확인될 수 있다. 다른 바람직한 특징은 면역억압성 TReg의 고갈을 통해 간접적으로 또는 T 효과기 세포에서 ICOS 신호전달 활성화를 통해 직접적으로 효과기 T-세포 기능을 증가시키는 것을 포함한다． 원하는 특징을 갖는 항체의 확인은 이의 친화성, 교차-반응성, 특이성, ICOS 수용체 작동기작, 중화 효능 및/또는 T 세포 의존적 살상의 촉진과 같은 본원에 기술된 기능적 속성을 갖는 항체를 확인하는 것을 포함할 수 있으며, 본원에 기술된 바와 같은 검정법으로 결정될 수 있다.
본 방법에 VL 도메인이 포함되는 경우, VL 도메인은 임의의 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 VL 도메인일 수 있거나, 모체 VL 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 제공된 변이체일 수 있고, 모체 VL 도메인은 임의의 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 VL 도메인이거나 임의의 이들 항체의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 VL 도메인이다.
변이체 항체를 생성하는 방법은 선택적으로 항체 또는 VH/VL 도메인 조합의 사본을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 결과로 얻은 항체를 발현시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로 하나 이상의 발현 벡터에서, 원하는 항체 VH 및/또는 VL 도메인에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 것이 가능하다. 숙주 세포에서의 재조합 발현을 포함하는 적합한 발현 방법이 본 명세서에 자세하게 기재되어 있다.
인코딩 핵산 및 발현 방법
본 발명에 따른 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공될 수 있다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA일 수 있다. 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA, 또는 이들의 임의의 조합은 항체를 인코딩할 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구조물을 제공한다. 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 서열 목록에 포함된다. 본 명세서에 기술된 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 특정된 서열을 갖는 DNA 분자를 포괄하고, 문맥 상 달리 요구하지 않는 한, U가 T로 치환되는 특정된 서열을 갖는 RNA 분자를 포괄한다.
본 발명은 또한 항체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 인코딩된 항체를 생산하는 방법은 핵산으로부터의 발현, 예로 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 발현을 포함할 수 있다. 따라서, 항체를 획득할 수 있고, 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리하고/거나 정제한 다음 적절한 경우 사용할 수 있다. 생산 방법은 약제학적으로 허용가능한 부형제와 같은 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함하는 조성물 내로 생성물을 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 상이한 숙주 세포에서 클로닝 및 폴리펩타이드의 발현을 위한 시스템은 잘 알려져있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 사상 진균, 효모 및 바큘로바이러스 시스템 및 유전자전환 식물 및 동물을 포함한다.
원핵 세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당해 기술분야에 잘 확립되어 있다. 공통적인 박테리아 숙주는 대장균이다. 배양물에서의 진핵 세포의 발현은 또한 생산을 위한 옵션으로서 당업자에게 이용가능하다. 이종유래 폴리펩타이드의 발현을 위해 당해 기술분야에서 입수가능한 포유동물 세포주에는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 많은 다른 것을 포함한다.
벡터는 프로모터 서열, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 경우 기타 서열을 포함하여 적절한 조절 서열을 포함할 수 있다. 항체를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 핵산은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포좀-매개성 형질감염 및 레트로 바이러스 또는 다른 바이러스 예로 백시니아 또는 곤충 세포용 바큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함하는 다양한 방법에 의해 진핵 세포로 도입될 수 있다. 숙주 세포, 상세하게 진핵 세포에서 핵산을 도입하는 것은 바이러스성 또는 플라스미드 기반의 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀으로 유지되거나 숙주 세포 또는 인공 염색체 내에 도입될 수 있다. 도입은 단일 또는 복수의 유전자좌에서 하나 이상의 사본의 무작위 또는 표적화 통합에 의할 수 있다． 박테리아 세포의 경우 적합한 기술로는 염화칼슘 형질전환, 전기천공법 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함한다． 상기 도입은 이후에 예로 숙주 세포를 유전자 발현 조건 하에 배양한 다음 항체를 선택적으로 단리하거나 정제함으로써 핵산을 발현시킬 수 있다.
본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예로, 염색체) 내에 도입될 수 있다. 도입은 표준 기법에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다.
또한, 본 발명은 항체를 발현하기 위하여 발현 시스템에서 본원에 기술된 핵산을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
치료적 용도
본원에 기술된 항체는 치료법에 의해 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용될 수 있다. 항체는 암 또는 고형 종양의 치료 및 백신 접종의 맥락을 포함하여 다양한 질환 또는 병태에 유익한 효과기 T-세포 반응을 증가시키는 데 용도를 찾는다. 증가된 Teff 반응은 Teff 활성을 선호하는 Teff 및 Treg 사이의 균형 또는 비율을 조절하는 항체를 사용하여 달성될 수 있다．
항-ICOS 항체는 환자에서 조절 T-세포를 고갈시키고/거나 효과기 T-세포 반응을 증가 시키는데 사용될 수 있고, 조절 T-세포를 고갈시키고/거나 효과기 T-세포 반응을 증가시킴으로써 치료법에 순응하는 질환 또는 병태를 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이러한 항체 분자 또는 이의 인코딩 핵산을 포함하는 조성물은 임의의 이러한 방법에서 사용하기 위해 사용되거나 제공될 수 있다. 임의의 이러한 방법에 사용하는 약제의 제조를 위한, 항체 또는 항체 또는 이의 인코딩 핵산을 포함하는 조성물의 용도도 역시 고려된다. 이 방법은 전형적으로 항체 또는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 적합한 제형 및 투여 방법은 본 명세서의 다른 곳에 기술되어있다.
항체의 한 가지 고려되는 치료적 용도는 암의 치료이다. 암은 고형 종양, 예로 신장 세포 암 (선택적으로 신장 세포 암종, 예로 투명 신장 세포 암종), 두경부암, 흑색종 (선택적으로 악성 흑색종), 비-소세포 폐암 (예로, 샘암종), 방광암, 난소암, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 유방암, 고환 배아세포 암종 또는 열거된 것과 같은 고형 종양의 전이일 수 있거나, 이것은 액체 혈액학적 종양, 예로 림프종 (예로, 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종, 예로 확산성 대형 B 세포 림프종, DLBCL) 또는 백혈병 (예로, 급성 골수성 백혈병)일 수 있다． 항-ICOS 항체는 흑색종, 두경부암 및 비-소세포 폐암 및 약한 내지 높은 돌연변이성 부하를 갖는 다른 암에서 종양 제거를 증진시킬 수 있다 [26]. 이들의 신생물 병변에 대한 환자의 면역 반응을 증진시킴으로써, 항-ICOS 항체를 이용한 면역요법은 잠재적으로 말기 질환의 맥락에서도 지속가능한 치유 또는 장기적인 완화의 전망을 제공한다.
암은 다양한 질환군이지만, 항-ICOS 항체는 암 세포를 정상 조직과 구별하는 돌연변이체 또는 과다발현된 에피토프의 인식을 통해 임의의 암 세포를 살상할 잠재력을 가진 환자 자신의 면역계를 이용하여 다양한 암을 치료할 수 있는 가능성을 제공한다. Teff/Treg 균형을 조절함으로써, 항-ICOS 항체는 면역 인식 및 암 세포의 살상을 가능하게 하거나 촉진시킬 수 있다. 따라서, 항-ICOS 항체는 다양한 암에 대한 유용한 치료제인 한편, 항-ICOS요법이 특히 적합하고/거나 다른 치료제가 효과적이지 않을 때 항-ICOS요법이 효과적일 수 있는 암의 특정 카테고리가 있다.
이러한 군 중 하나는 ICOS 리간드의 발현이 양성인 암이다. 암 세포는 흑색종의 경우에 기술되었던 바와 같이 ICOS 리간드의 발현을 획득할 수 있다 [27]. ICOS 리간드의 발현은 표면 발현된 리간드가 Treg 상의 ICOS와 결합하여 Treg의 증식 및 활성화를 촉진함으로써 암에 대한 면역 반응을 억압함으로써 세포에게 선택적 이점을 제공할 수 있다. ICOS 리간드를 발현하는 암 세포는 생존을 위해 Treg에 의한 면역계의 억압에 의존할 수 있으며 Treg를 표적하는 항-ICOS 항체로의 치료에 취약할 것이다． 이것은 또한 ICOS 리간드를 자연적으로 발현하는 세포로부터 유래된 암에도 적용된다. 이들 세포에 의한 ICOS 리간드의 계속적인 발현은 면역 억업을 통한 생존 이점을 다시 제공한다. ICOS 리간드를 발현하는 암은 B 세포, 수지상 세포 및 단핵구와 같은 항원-제시 세포로부터 유래될 수 있으며, 본원에 언급된 것과 같은 액체의 혈액학적 종양일 수 있다. 흥미롭게도 이들 유형의 암은 ICOS 및 FOXP3 발현 (TCGA 데이타)에서도 높다 (실시예 25 참조). 본원의 실시예 20은 ICOS 리간드를 발현하는 암성 B 세포 (A20 동종 세포)로부터 유래된 종양을 치료하는 데 예시적인항-ICOS 항체의 효능을 입증한다.
따라서, 항-ICOS 항체는 ICOS 리간드의 발현에 양성인 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항-ICOS 항체로 치료되는 암은 ICOS 및/또는 FOXP3의 발현에 양성이며, 선택적으로 ICOS 리간드도 역시 발현할 수 있는 암일 수 있다.
환자는 예를 들어 환자로부터 테스트 시료 (예로, 종양 생검)을 채취하여 관심있는 단백질의 발현을 결정함으로써 자신의 암이 관심있는 단백질 (예로, ICOS 리간드, ICOS 및/또는 FOXP3)의 발현에 양성인지 여부를 결정하는 테스트을 받을 수 있다. 암이 이러한 관심있는 있는 단백질 하나, 둘 또는 모두의 발현에 양성으로서 특성화되었던 환자는 항-ICOS 항체로의 치료를 위해 선택된다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 항-ICOS 항체는 단일요법으로 또는 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
항-ICOS 항체는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD137, GITR 또는 CD73과 같은 면역 체크포인트 분자에 대한 항체 또는 다른 약물 치료에 불응성인 암 환자에게도 희망을 제공한다. 이들 면역요법은 일부 암에 효과적이지만 일부의 경우에 암이 반응하지 않거나 항체로의 치료를 계속하면 반응이 없어질 수 있다． 면역 체크포인트 억제제에 대한 항체와 마찬가지로, 항-ICOS 항체는 환자의 면역계를 조절하지만 그럼에도 불구하고 항-ICOS 항체는 다른 항체가 실패한 곳에서 성공할 수 있다． 본원에서 A20 B 세포 림프종을 보유하는 동물을 항-ICOS 항체로 처리하여 종양의 성장을 감소시키고, 종양을 수축시키고, 실제로 종양을 신체로부터 제거할 수 있는 반면, 항-PD-L1 항체로의 처리는 대조군보다 양호하지 않다. A20 세포주는 항 CTLA-4에 저항성인 것으로 보고되었다[28].
따라서, 항-ICOS 항체는 항-CTLA-4 항체, 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD137 항체, 항-GITR 항체 또는 항-CD73 항체 (임의의 또는 모두)와 같은 하나 이상의 면역요법으로의 치료에 불응성인 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 암은 해당 항체 또는 약물로의 치료가 암의 성장을 유의하게 감소시키지 않으면, 예로 종양이 계속 성장하거나 크기가 감소하지 않으면 또는 반응 기간 이후에 종양이 다시 성장을 개시하면, 항체 또는 다른 약물로의 치료에 불응하는 것으로서 특성화될 수 있다. 치료제에 대한 미반응은 시료 (예로, 종양 생검 시료)를 암 세포 살상 또는 성장 억제에 대해 테스트함으로써 및/또는 요법으로 치료받은 환자가 치료에 반응하지 않는 것을 (예로, MRI를 포함하는 영상화 기술학을 사용하여) 관찰하는 임상 설정에서 생체외 결정될 수 있다. 암이 이러한 면역요법으로의 치료에 불응성으로서 특성화되었던 환자는 항-ICOS 항체로의 치료를 위해 선택된다.
또한, 항-ICOS 항체는 항-CD20 항체로의 치료에 저항성을 가진 B-세포 유래 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 항-ICOS 항체는 리투시마브와 같은 항-CD20 항체로의 치료에 반응하지 않거나 이에 저항성을 갖는 암을 위한 치료제이다. 항-ICOS 항체는 이러한 암에 대한 이차 (또는 추가의 또는 추가적인) 치료로서 사용될 수 있다. 항-CD20 항체 저항성 암은 B 세포 암, 예로 확산성 대형 B 세포 림프종과 같은 B 세포 림프종일 수 있다. 항-CD20에 대한 암의 내성은 시료 (예로, 종양 생검 시료)를 항-CD20 항체에 의한 암 세포 살상 또는 성장 억제에 대해 테스트함으로써 및/또는 항-CD20 항체로 치료받은 환자가 치료에 반응하지 않는 것을 관찰하는 임상 설정에서 생체외 결정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, CD20 발현의 부재 또는 저수준이 항-CD20 항체에 대한 민감성의 상실을 가리키는 경우, 암 (예로, 종양 생검 시료)을 테스트하여 CD20의 발현을 평가할 수 있다.
따라서, 환자로부터 획득된 시료를 테스트하여 관심있는 단백질, 예를 들어 ICOS 리간드, ICOS, FOXP3 및/또는 또 다른 치료제 (예로, 항-수용체 항체)가 지시되는 표적 수용체의 표면 발현을 결정할 수 있다. 표적 수용체는 CD20 (리투시마브와 같은 항-CD20 항체 요법이 지시됨) 또는 PD1, EGFR, HER2 또는 HER3와 같은 또 다른 수용체일 수 있다. ICOS 리간드, ICOS, FOXP3의 표면 발현 및/또는 표적 수용체의 표면 발현의 결핍 또는 손실은 암이 항-ICOS 항체 요법에 민감성인 것을 가리킨다. 항-ICOS 항체는 예를 들어 계속된 또는 재개된 암 세포 성장 예로 종양 크기의 증가에 의해 측정된 바와 같이, 암이 ICOS 리간드, ICOS, FOXP3의 표면 발현 및/또는 표적 수용체의 표면 발현의 결핍 또는 손실에 의해 특성화되거나, 선택적으로 이전에 항-CTLA4, 항-PD1, 항-PD-L1 또는 표적 수용체에 대한 항체로 치료되었거나, 해당 항체를 이용한 치료에 반응하지 않는 환자에게 투여하기 위해 제공될 수 있다.
암 세포가 ICOS 리간드, CD20 또는 본원에서 언급된 다른 표적 수용체와 같은 단백질의 표면 발현에 양성인지 여부를 결정하기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 전형적인 방법은 면역조직화학법이고, 세포 시료 (예로, 종양 생검 시료)을 관심있는 단백질의 항체와 접촉시키고 항체의 결합을 표지된 시약 - 전형적으로 제 1 항체의 Fc 영역을 인식하고 형광 마커와 같은 검출가능한 표지를 보유하는 제 2 항체를 사용하여 검출한다. 시료는 세포 염색 또는 다른 표지 검출에 의해 시각화되는 바와 같이 적어도 5%의 세포가 표지되는 경우 양성으로 판정하도록 정할 수 있다. 선택적으로 10% 또는 25%와 같이 더 높은 컷오프가 사용될 수 있다． 항체는 일반적으로 과량으로 사용될 것이다. 관심있는 분자에 대한 시약 항체는 입수가능하거나 간단한 방법으로 생성될 수 있다． ICOS 리간드를 테스트하기 위해, 항체 MAB1651은 현재 인간 ICOS 리간드를 인식하는 마우스 IgG로서 R & D 시스템사로부터 입수가능하다. CD20 발현을 테스트하기 위해 리투시마브를 사용할 수 있다． ICOS 리간드 또는 관심있는 표적 수용체의 mRNA 수준을 검출하는 것은 대안의 기법이다[27].
종양이 항-ICOS 항체 치료에 반응할 것이라는 추가의 징후는 종양 미세환경에서 Treg의 존재이다. 활성화된 Treg는 고-ICOS및 고-Foxp3 표면 발현을 특징으로 한다. 종양에서 Treg의 존재, 특히 높은 수치의 경우, 항-ICOS 항체 치료를 위해 환자를 선택할 수 있는 근거를 제공한다. Treg는 예를 들어 면역조직화학법 (상기 기술한바와 같이 표적 단백질에 대한 항체를 사용하여 Foxp3 및 ICOS의 공동-발현을 검정한 후 표지를 검출함) 또는 ICOS 및 Foxp3에 대한 표지된 항체로의 FACS에 사용하는 시료의 단일 세포 분산에 의해 종양 생검 시료에서 생체외 검출될 수 있다. FACS 방법은 실시예 17 및 실시예 18에 예시되어 있다.
항-ICOS 항체는 바이러스-유도성 암과 같은 전염병와 관련된 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 이 카테고리에는 두경부 편평세포 암종, 자궁경부암, 메르켈 세포 암종 등이 있다． 암과 관련된 바이러스에는 HBV, HCV, HPV (자궁경부암, 구강인두암) 및 EBV (버키트 림프종, 위암, 호 지킨 림프종, 기타 EBV 양성 B 세포 림프종, 비인두 암종 및 이식 후 림프증식성 질환)을 포함한다. 국제 암 연구기관 (Monograph 100B)은 다음의 전염병과 관련된 주요 암 부위를 확인하였다:
· 위장/위: 헬리코박터 파일로리
· 간: B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 (HCV), 오피스토르키스 비베리니, 크로노르키스 시넨시스
· 자궁경부: HIV 유무에 관계없이 인간 유두종 바이러스 (HPV)
· 항문생식기 (페니스, 외음부, 질, 항문): HIV 유무에 관계없이 HPV
· 비인두: 엡스타인-바 바이러스 (EBV)
· 구강인두: 담배 또는 알코올 소비가 있거나 없는 HPV
· 카포시 육종: HIV 유무에 관계없이 인간 헤르페스 바이러스 8형
· 비호지킨 림프종: H. 파일로리, HIV 유무에 관계없이 EBV, HCV, 인간 T-세포 림프영양성 바이러스 1형
· 호지킨 림프종: HIV 유무에 관계없이 EBV
· 방광: 스키스토조마 헤마토븀
본 발명에 따른 항체는 상기에 특정된 암과 같은 임의의 이들 전염병과 관련된 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
효과기 T-세포 반응의 자극은 또한 감염성 질환에 대한 면역성 및/또는 환자의 감염성 질환으로부터의 회복에 기여할 수 있다. 따라서, 항-ICOS 항체는 항체를 환자에게 투여함으로써 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
감염성 질환은 박테리아성, 곰팡이성, 바이러스성 또는 원충성 병원균와 같은 병원균에 의해 유발되는 질환을 포함하며 치료는 병원균 감염에 대한 환자의 면역 반응을 촉진시키는 것일 수 있다. 박테리아성 병원균의 예는 결핵이다． 바이러스성 병원균의 예는 B형 간염과 HIV이다. 원충성 병원균의 예는 P. 팔시파룸과 같은 말라리아를 일으키는 플라스모듐 종이다.
항체는 감염, 예로 본원에서 언급된 임의의 병원균에 의한 감염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 감염은 지속적 또는 만성 감염일 수 있다． 감염은 국소화되거나 전신적일 수 있다． 병원균과 면역계 사이의 장기간의 접촉은 면역계의 고갈 또는 내성의 발달 (예를 들어, Treg 수치의 증가 및 Treg를 선호하는 Treg : Teff 균형의 변화를 통해 나타남) 및/또는 전시된 병원균 항원의 진화 및 변형을 통한 병원균에 의한 면역 회피를 유도할 수 있다. 이들 특징은 암에서 발생하는 것으로 여겨지는 유사한 과정을 반영한다. 항-ICOS 항체는 Teff를 선호하는 Treg : Teff 비율의 조절 및/또는 본원에 기술된 다른 효과를 통해 병원균에 의한 감염, 예를 들어, 만성 감염을 치료하는 치료적 접근법을 제시한다.
치료는 감염성 질환 또는 감염으로 진단받았던 환자에게 일 수 있다． 대안적으로, 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 치료는 예방적이고, 질환의 발병으로부터 보호하기 위해 예로 백신으로서 환자에게 투여될 수 있다.
또한 면역 반응, 특히 IFNγ-의존성 전신 면역 반응이, 알츠하이머병 및 신경염증성 성분을 공유하는 다른 CNS 병리학의 치료에 유익할 수 있는 것이 제안되어 왔다[29]. 국제특허출원 WO2015/136541은 항-PD-1 항체를 사용한 알츠하이머병의 치료를 제안하였다. 항-ICOS 항체는 선택적으로 하나 이상의 다른 면역조절제 (예로, PD-1에 대한 항체)와 조합하여, 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴화성 질환의 치료에 사용될 수 있다.
조합 요법
항-CTLA4 항체, 항-PD1 또는 항-PDL1과 같은 면역조절성 항체, 특히 Fc 효과기 기능을 갖는 면역조절 항체로 처리하면 ICOS 고발현하는 면역-억압성 세포가 더 고갈되는 환경이 형성될 수 있다. 항-ICOS 항체를 이러한 면역조절제와 조합하여 이의 치료 효과를 증진시키는 것이 바람직할 수 있다.
면역조절성 항체 (예로, 항-PDL-1, 항-PD-1, 항-CTLA-4)로 치료받은 환자는 특히 항-ICOS 항체로의 치료로부터 이익이 될 수 있다． 이에 대한 한 가지 이유는 면역조절성 항체가 환자의 ICOS-양성 Treg (예로, 종양내 Treg)의 수를 증가시킬 수 있는 것이다. 이러한 효과는 재조합 IL-2와 같은 소정의 다른 치료제로도 관찰된다. 항-ICOS 항체는 환자의 다른 치료제로 치료로부터 유발되는 ICOS+ Treg (예로, 종양내 Treg)의 급상승 또는 상승을 감소시키고/거나 역전시킬 수 있다. 따라서 항-ICOS 항체로의 치료를 위해 선택된 환자는 항체 (예로, 면역조절성 항체) 또는 환자의 ICOS+ Treg 수를 증가시키는 다른 제제 (예로, IL-2)인 제 1 치료제로 이미 치료를 받은 환자일 수 있다.
항-ICOS 항체가 결합될 수 있는 면역조절제는 임의의 PDL1 (예로, 아벨루마브), PD-1 (예로, 펨브로리주마브 또는 니볼루마브) 또는 CTLA-4 (예로, 이필리무마브 또는 트레멜리무마브)에 대한 항체를 포함한다. 항-ICOS 항체는 피딜리주마브와 조합될 수 있다． 다른 구현예에서, 항-ICOS 항체는 항-CTLA-4 항체와 조합하여 투여되지 않고/거나 선택적으로 항-CTLA-4 항체가 아닌 치료 항체와 조합하여 투여한다.
예를 들어, 항-ICOS 항체는 항-PDL1 항체와의 조합 요법에 사용될 수 있다. 바람직하게, 항-ICOS 항체는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 매개하는 항체이다. 바람직하게, 항-PDL 1 항체는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 매개하는 항체이다. 이러한 조합 요법의 예는 항-PDL1 항체와 함께 항-ICOS 항체를 투여하는 것이며, 두 항체는 효과기 양성 불변 영역을 갖는다. 따라서, 항-ICOS 항체 및 항-PDL1 항체는 모두 ADCC, CDC 및/또는 ADCP를 매개할 수 있다. Fc 효과기 기능 및 불변 영역의 선별은 본 명세서의 다른 곳에서 상세히 기술되지만, 일례로서 항-ICOS인간 IgG1은 항-PD-L1 인간 IgG1과 조합될 수 있다. 항-ICOS 항체 및/또는 항-PD-L1 항체는 야생형 인간 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 효과기 양성 불변 영역은 증진된 효과기 기능, 예로 증진된 CDC, ADCC 및/또는 ADCP를 위해 조작된 것일 수 있다. 야생형 인간 IgG1 서열 및 효과기 기능을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 항체 불변 영역 예는 본 명세서의 다른 곳에서 자세히 논의된다.
항-ICOS 항체가 조합될 수 있는 항-PDL1 항체는 다음을 포함한다:
· PDL1에 대한 PD-1의 결합을 억제하고/거나 PDL1을 억제하고, 선택적으로 효과기 양성 인간 IgG1로서의 항-PDL1 항체;
· PDL1 및/또는 PDL2에 대한 PD-1의 결합을 억제하는 항-PD-1 항체;
· 아벨루마브, PDL-1에 대한 PD-1의 결합을 억제하는 인간 IgG1 항체. 국제특허출원 WO2013/079174 참조;
· 듀르바루마브 (또는 "MEDI4736"), 돌연변이 L234A, L235A 및 331을 갖는 인간 IgG1 항체 변이체. 국제특허출원 WO2011/066389 참조;
· 아테졸리주마브, 돌연변이 N297A, D356E 및 L358M을 갖는 인간 IgG1 항체 변이체. 미국 특허 US2010/0203056 참조;
· BMS-936559, 돌연변이 S228P를 포함하는 인간 IgG4 항체. 국제특허출원 WO2007/005874 참조.
항-PD-L1 항체의 수많은 추가의 예가 본원에 개시되어 있고 다른 것들은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 언급된 많은 항-PD-L1 항체에 대한 특성화 데이타는 본원에서 둘 다 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 US 9,567,399 및 US 9,617,338에 발표되었다. 항-PD-L1 항체 예는 미국 특허 US 9,567,399 또는 US 9,617,338에 개시된 바와 같이 1D05, 84G09, 1D05 HC 돌연변이체 1, 1D05 HC 돌연변이체 2, 1D05 HC 돌연변이체 3, 1D05 HC 돌연변이체 4, 1D05 LC 돌연변이체 1, 1D05 LC 돌연변이체 2, 1D05 LC 돌연변이체 3, 411B08, 411C04, 411D07, 385F01, 386H03, 389A03, 413D08, 413G05, 413F09, 414B06 또는 416E01 중 임의의 것의 HCDR 및/또는 LCDR을 포함하는 VH 및/또는 VL 도메인을 가진다. 항체는 임의의 이들 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있으며, 선택적으로 임의의 이들 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함할 수 있다. 이들 항-PD-L1 항체의 VH 및 VL 도메인은 본원의 다른 곳에서 추가로 기술된다.
항-PD-L1 항체의 추가 예는 KN-035, CA-170, FAZ-053, M7824, ABBV-368, LY-3300054, GNS-1480, YW243.55.S70, REGN3504 또는 국제특허출원 WO2017/034916, WO2017/020291, WO2017/020858, WO2017/020801, WO2016/111645, WO2016/197367, WO2016/061142, WO2016/149201, WO2016/000619, WO2016/160792, WO2016/022630, WO2016/007235, WO2015/179654, WO2015/173267, WO2015/181342, WO2015/109124, WO2015/112805, WO2015/061668, WO2014/159562, WO2014/165082, WO2014/100079, WO2014/055897, WO2013/181634, WO2013/173223, WO2013/079174, WO2012/145493, WO2011/066389, WO2010/077634, WO2010/036959, WO2010/089411 및 WO2007/005874 중 임의의 것에 개시된 항-PD-L1 항체의 HCDR 및/또는 LCDR을 포함하는 VH 및/또는 VL 도메인을 가진다. 항체는 임의의 이들 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있으며, 선택적으로 임의의 이들 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함할 수 있다.항-PD-L1과의 조합 요법에 사용되는 항-ICOS 항체는 본원에 개시된 본 발명의 항체일 수 있다. 대안적으로, 항-ICOS 항체는 다음의 공보의 어느 하나에 개시된 항-ICOS 항체의 CDR 또는 VH 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다:
국제특허울원 WO2016154177, 미국 특허 US2016304610 - 예를 들어 임의의 항체 7F12, 37A10, 35A9, 36E10, 16G10, 37A10S713, 37A10S714, 37A10S715, 37A10S716, 37A10S717, 37A10S718, 16G10S71, 16G10S72, 16G10S73, 16G10S83, 35A9S79, 35A9S710 또는 35A9S89;
국제특허출원 WO16120789, 미국 특허 US2016215059 - 예를 들어 422.2 및/또는 H2L5로 알려진 항체;
국제특허출원 WO14033327, 유럽 특허 EP2892928, 미국 특허 US2015239978 - 예를 들어 314-8로 알려지고/거나 하이브리도마 CNCM I-4180으로부터 생산된 항체;
국제특허출원 WO12131004, 유럽 특허 EP2691419, 미국 특허 US9376493, US20160264666 - 예를 들어 항체 Icos145-1 및/또는 하이브리도마 CNCM I-4179에 의해 생산된 항체;
국제특허출원 WO10056804 - 예를 들어 항체 JMAb 136 또는 "136";
국제특허출원 WO9915553, 유럽 특허 EP1017723B1, 미국 특허 US7259247, US7132099, US7125551, US7306800, US7722872, 국제특허출원 WO05103086, 유럽 특허 EP1740617, 미국 특허 US8318905, US8916155 - 예를 들어 항체 MIC-944 또는 9F3;
국제특허출원 WO983821, 미국 특허 US7932358B2, US2002156242, 유럽 특허 EP0984023, EP1502920, 미국 특허 US7030225, US7045615, US7279560, US7226909, US7196175, US7932358, US8389690, 국제특허출원 WO02070010, 유럽 특허 EP1286668, EP1374901, 미국 특허 US7438905, US7438905, 국제특허출원 WO0187981, 유럽 특허 EP1158004, 미국 특허 US6803039, US7166283, US7988965, 국제특허출원 WO0115732, 유럽 특허 EP1125585, 미국 특허 US7465445, US7998478 - 예를 들어 임의의JMAb 항체, 예로 임의의 JMAb-124, JMAb-126, JMAb-127, JMAb-128, JMAb-135, JMAb-136, JMAb-137, JMAb-138, JMAb-139, JMAb- 140, JMAb-141, 예로 JMAb136;
국제특허출원 WO2014/089113 - 예를 들어 항체 17G9;
국제특허출원 WO12174338;
미국 특허 US2016145344;
국제특허출원 WO11020024, 유럽 특허 EP2464661, 미국 특허 US2016002336, US2016024211, US8840889;
미국 특허 US8497244.
항-ICOS 항체는 선택적으로 국제특허출원 WO2016154177에 개시된 바와 같은 37A10S713의 CDR을 포함한다. 이는 37A10S713의 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있으며, 선택적으로 37A10S713의 항체 중쇄 및 경쇄를 가질 수 있다.
항-ICOS 항체의 면역조절제와의 조합은 단일요법과 비교하여 증가된 치료 효과를 제공할 수 있고, 면역조절제(들)의 저용량으로 치료 유익을 달성할 수 있다. 따라서, 예를 들어 항-ICOS 항체와 조합하여 사용되는 항체 (예로, 항-PD-L1 항체, 선택적으로 이필리무마브)는 더욱 통상적인 10 mg/kg보다는 3 mg/kg에서 투여될 수 있다. 항-PD-L1 또는 다른 항체의 투여 요법은 3주마다 90분 동안 총 4회의 정맥내 투여를 수반할 수 있다.
항-ICOS 항체는 항-PD-L1 항체가 치료 효과를 나타내는 용량의 감소로서 인식될 수 있는, 항-PD-L1 항체로의 치료에 대한 종양의 민감성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 항-ICOS 항체는 환자에게 암 또는 종양을 치료하는데 효과적인 항-PD-L1 항체의 용량을 감소시키기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 항-ICOS 항체의 투여는 항-PD-L1 항체가 항-ICOS없이 투여될 때 용량과 비교하여 예를 들어 75%, 50%, 25%, 20% 또는 10% 이하로 해당 환자에게 항-PD-L1 항체 투여의 권장되거나 요구된 용량을 감소시킬 수 있다 환자는 본원에 기술된 바와 같은 조합 요법으로 항-ICOS 항체 및 항-PD-L1 항체의 투여에 의해 치료될 수 있다.
항-PD-L1와 항-ICOS를 조합한 이점은 단독요법으로의 사용과 비교할 때 각 제제의 용량을 줄일 수 있다. 항-PD-L1 항체는 항-ICOS 항체가 치료적 유익을 발휘하는 용량을 감소시키는 데 사용될 수 있고, 따라서 환자에게 암 또는 종양을 치료하는데 효과적인 항-ICOS 항체의 용량을 감소시키기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 항-PD-L1 항체는 항-ICOS 항체가 항-PD-L1 없이 투여될 때 용량과 비교하여, 예를 들어 75%, 50%, 25%, 20% 또는 10% 이하로 해당 환자에게 항-ICOS 항체 투여의 권장되거나 요구된 용량을 감소시킬 수 있다 환자는 본원에 기술된 바와 같은 조합 요법으로 항-ICOS 항체 및 항-PD-L1 항체의 투여에 의해 치료될 수 있다.
본원의 실시예 22에서 논의된 바와 같이, 항-PD-L1 항체, 특히 효과기 양성 Fc를 갖는 항체로의 처리는 Teff 세포에서 ICOS의 발현을 증가시키지 않는 것으로 보인다. 이것은 효과기 양성 항-ICOS 항체와 조합하여 이러한 항체를 투여할 때 유리하며, Teff 상의 ICOS 발현은 이들 세포를 바람직하지 않게 항-ICOS 항체에 의한 고갈에 보다 민감하게 만든다. 항-PD-L1과 조합하여, 항-ICOS요법은 Treg와 비교하여 Teff에서 ICOS의 차별적인 발현을 이용할 수 있으며, 우선적으로 고갈을 위해 고-ICOSTreg을 표적한다. 이것은 순서대로 TEff의 억압을 완화하고 환자에서 효과기 T 세포 반응 촉진시키는 순 효과를 가진다. T 세포 상의 ICOS의 발현에 미치는 면역 체크포인트 분자의 표적화 효과도 이전에 연구되었다 - 참고문헌의 도 S6C 참조 [30] (보충 자료), CTLA-4 항체 및/또는항-PD -1 항체로의 치료가 ICOS를 발현하는 CD4+ Treg의 백분율을 증가시키는 것으로 보고됨. Treg 및 Teff에서의 ICOS 발현에 미치는 치료제의 효과는 항-ICOS 항체와 조합하여 사용하는 적절한 제제의 선택에서 중요한 요소일 수 있으며, 항-ICOS 항체의 효과가 Treg 대비 Teff에서 ICOS의 높은 차별적인 발현이 있는 조건 하에 증진될 수 있는 점을 언급한다.
본원에 기술된 바와 같이, 항-ICOS 항체의 단일 용량은 특히 항-PD-L1 항체와 같은 다른 치료제와 조합하여 치료 효과를 제공하기에 충분할 수 있다. 종양 치료법에서 이 단일 용량 유익에 대한 근본적인 근거는 항-ICOS 항체가 적어도 부분적으로 종양의 미세환경을 재설정하거나 변경함으로써 이의 효과를 매개하여 종양을 면역 공격 및/또는 언급된 것과 같은 다른 면역조절제의 효과에 더욱 민감하게 만드는 데 충분한 점일 수 있다. 종양의 미세환경 재설정은 예를 들어 ICOS 양성 종양 침윤성 T-reg의 고갈을 통해 촉발된다. 예를 들어, 환자는 항-ICOS 항체의 단일 용량으로 치료된 후 항-PD-L1 항체의 일회 또는 여러 회 투여가 이어질 수 있다． 치료 기간, 예를 들어 6개월 또는 1년 동안 항-ICOS 항체는 단일 용량으로 투여될 수 있는 반면, 다른 제제, 예로 항-PD-L1 항체는 선택적으로 해당 치료 기간 동안 여러 회 투여되고, 바람직하게는 적어도 일회의 이러한 용량을 항-ICOS 항체로의 처리에 후속하여 투여한다.
조합 요법의 추가의 예는 다음과 항-ICOS 항체의 조합을 포함한다:
- 아데노신 A2A 수용체의 길항제 ("A2AR 저해제");
- CD137 작동제 (예로, 작동제 항체);
- 트립토판의 분해를 촉매하는 인돌아민-2,3 디옥시게나제 효소의 길항제 (IDO 저해제). IDO는 면역 억압/내성에 기여하는 수지상 세포 및 대식구에서 활성화되는 면역 체크포인트이다.
항-ICOS 항체는 IL-2 (예로, 알데스류킨과 같은 재조합 IL-2)와의 조합 요법에 사용될 수 있다. IL-2는 고용량 (HD)으로 투여될 수 있다． 전형적인 HD IL-2 요법은 치료 주기 당 500,000 IU/kg 초과의 볼루스 주입, 예로 600,000 또는 720,000 IU/kg의 볼루스 주입을 수반하고, 10 내지 15회의 볼루스 주입이 5 내지 10시간의 간격으로 주어지고, 예로 8시간마다 최대 15회의 볼루스 주입 및 최대 6 내지 8회 주기 동안 대략 14 내지 21일마다의 치료 주기를 반복한다. HD IL-2 요법은 종양, 특히 흑색종 (예로, 전이성 흑색종) 및 신장 세포 암종의 치료에 성공적이었지만 심각한 부작용을 유발할 수 있는 IL-2의 높은 독성으로 사용이 제한된다.
고용량 IL-2로 치료하면 암 환자에서 ICOS 양성 Treg의 집단이 증가하는 것으로 나타났다[31]. HD IL-2 요법의 첫 번째 주기 이후에 이러한 ICOS+ TReg의 증가는 ICOS+ Treg의 수가 많을수록 예후가 악화되는 더 나쁜 임상 결과와 상관 관계가 있는 것으로 보고되었다. IL-2 변이체 F42K는 ICOS+ Treg 세포의 바람직하지 않은 증가를 회피하는 대안의 요법으로서 제안되었다[32]. 그러나, 또 다른 접근법은 이차 치료제로서 본 발명에 따른 항체를 사용함으로써 ICOS+ Treg의 증가를 이용하는 것이다.
IL-2 요법을 항-ICOS 항체와 조합하는 것이 유익할 수 있는 데, ICOS를 높게 발현하는 Treg를 표적하는 항-ICOS 항체의 능력을 이용하고, 이들 세포를 억제하며, IL-2 요법을 받는 환자의 예후를 개선시킨다. IL-2 및 항-ICOS 항체의 병용 투여는 치료된 환자 집단에서 부작용을 회피하거나 감소시키면서 반응 속도를 증가시킬 수 있다. 상기 조합은 IL-2 단일요법와 비교하여 IL-2를 저용량으로 사용하여 IL-2 요법으로 인한 부작용 위험이나 수준을 줄이면서 임상적 유익을 유지하거나 향상킬 수 있다 (예로, 종양 성장의 감소, 고형 종양의 제거 및/또는 전이의 감소). 이 방식으로, 항-ICOS의 첨가는 고용량 (HD) 또는 저용량 (LD) IL-2에 관계없이 IL-2를 투여받는 환자의 치료를 향상시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 관점은 항-ICOS 항체를 환자에게 투여함으로써 환자를 치료하는 방법으로서, 환자는 IL-2, 예로 HD IL-2로도 역시 치료되는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 관점은 환자를 치료하는데 사용하기 위한 항-ICOS 항체이며, 환자는 또한 IL-2, 예로 HD IL-2로 치료된다. 항-ICOS 항체는 이차 요법으로서 사용될 수 있다． 따라서, 환자는 IL-2로 치료받은 인간, 예로 적어도 일회 주기의 HD IL-2 요법을 받았고 ICOS+ Treg의 수준이 증가한 환자일 수 있다． 검정법은 ICOS, Foxp3, ICOSL에 대해 양성인 세포 및 선택적으로 추가의 관심있는 마커를 검출하기 위해 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 면역조직화학법 또는 FACS를 사용하여 종양 생검 시료과 같은 암 세포 시료에서 수행될 수 있다. 방법은 IL-2 요법 후에 환자가 증가된 수준의 ICOS+ Treg (예로, 말초 혈액 또는 종양 생검)를 가지는 것을 결정하는 단계를 포함할 수 있으며, 증가된 수준은 환자가 항-ICOS 항체로의 치료로부터 유익을 받을 것을 나타낸다. Treg의 증가는 IL-2 요법 전에 대조군 (미치료) 개인 또는 환자에게 상대적일 수 있다． 이러한 Treg가 증가한 환자는 지속적인 IL-2 치료 단독으로는 유익이 없지만, 항-ICOS 항체 및 IL-2 요법의 조합 또는 항-ICOS 항체 단독으로의 치료가 치료 효과를 제공하는 집단을 나타낸다. 따라서, 환자가 증가된 수준의 ICOS+ Treg를 가지는 긍정적인 결정 이후, 항-ICOS 항체 및/또는 추가의 IL-2 요법이 투여될 수 있다. 항-ICOS 항체로 치료하면 이러한 환자에서 다른 T-세포 집단과 비교하여 ICOS+ Treg를 선택적으로 표적하여 고갈시킬 수 있다. 이것은 이들 세포에 의해 매개되는 면역억압을 완화하여 표적 세포 예로 종양 세포 또는 감염된 세포에 대한 Teff의 활성을 증진시킴으로써 치료 효과를 제공한다.
항-ICOS 항체 및 IL-2의 조합 요법은 본원에 기술된 임의의 치료 적응증, 특히 종양 예로 전이성 흑색종 또는 신장 세포 암종과 같은 흑색종을 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일 예에서, 항-ICOS 항체로 치료된 환자는 전이성 흑색종을 제시하며 IL-2, 예로 HD IL-2 요법 또는 LD IL-2 요법으로 치료되었던 환자이다.
일반적으로, 항-ICOS 항체가 제 1 치료제 (예로, 면역조절 항체) 또는 다른 제제 (예로, IL-2)로 치료받은 환자에게 투여되는 경우, 항-ICOS 항체는 제 1 치료제의 투여 후 최소 기간, 예를 들어 24시간, 48시간, 72시간, 1주 또는 2주 이후에 투여될 수 있다. 항-ICOS 항체는 제 1 치료제의 투여 후 2, 3, 4 또는 5주 이내에 투여될 수 있다. 환자의 순응도를 높이고 비용을 절감하기 위해 투여된 치료 횟수를 최소화하는 것이 바람직할 수 있지만, 이는 언제든지 두 제제의 추가적인 투여를 배제하지는 않는다. 오히려, 투여의 상대적인 타이밍은 이들의 결합된 효과를 최적화하도록 선택될 것이며, 제 1 치료제는 항-ICOS 항체의 효과가 특히 유리한 면역학적 환경 (예로, 하기에 논의된 바와 같이 상승된 ICOS+ Treg 또는 항원 방출)을 만든다. 따라서, 제 1 치료제 및 항-ICOS 항체의 순차적 투여는 제 1 제제가 작용하는 시간을 허용하여, 항-ICOS 항체가 이의 증진된 효과를 나타낼 수 있는 생체내 조건을 만들 수 있다. 동시적 또는 순차적 조합 치료를 포함하는 다양한 투여 요법이 본원에 기술되어 있으며 적절한 경우 이용 될 수 있다. 제 1 치료제가 환자의 ICOS+ Treg의 수를 증가시키는 경우, 환자를 위한 치료 요법은 환자가 ICOS+ Treg의 증가된 수를 가지는 것을 결정한 다음 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
언급된 바와 같이, 조합 요법에서 항-ICOS 항체의 사용은 치료제의 유효 용량을 감소시키고/거나 환자에서 ICOS+ Treg를 증가시키는 치료제의 부작용에 대항하는 이점을 제공할 수 있다. 그러나 "면역학적 세포 사망"을 통해 표적 세포로부터 항원을 방출시키는 제 1 치료제를 선택하고 항-ICOS 항체와 조합하여 제 1 치료제를 투여함으로써 치료 효과를 달성할 수 있다. 언급된 바와 같이, 항-ICOS 항체의 투여는 제 1 치료제의 투여와 순차적으로 수행할 수 있고, 두 개 제제 제제의 투여는 상기 논의된 바와 같이 소정의 시간 윈도우에 의해 분리된다.
면역학적 세포 사망은 세포 사멸과 대조되는 세포 사망의 인식된 형태이다. 이것은 ATP와 HMGB1이 세포에서 방출되고 칼레티큘린이 세포질 막에 노출되는 것을 특징으로 한다[33,34].
표적 조직 또는 표적 세포에서 면역학적 세포 사망은 항원-제시 세포에 의한 세포의 삼투 현상을 촉진하여 표적 세포로부터의 항원을 나타내어 항원-특이적 Teff 세포를 유도한다. 항-ICOS 항체는 Teff 세포 상에 ICOS의 작동제로서 작용함으로써 Teff 반응의 크기 및/또는 기간을 증가시킬 수 있다. 또한 항-ICOS 항체가 Fc 효과기 작동 (예로, 인간 IgG1 항체)인 경우 항-ICOS 항체는 항원-특이적 Treg의 고갈을 유발할 수 있다． 따라서, 이들 효과 중 하나 또는 둘 모두의 조합을 통해, Teff 및 Treg 세포 사이의 균형은 Teff 활성을 증진하도록 조절된다. 항-ICOS 항체와 종양 또는 암 세포와 같은 표적 조직 또는 세포 유형에서 면역학적 세포 사망을 유도하는 치료와 조합하면, 이로써 표적 조직 또는 세포에 대한 환자의 면역 반응을 촉진시키고, 생체내에서 백신 항원이 생성되는 백신 접종의 형태를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 일 관점은 암 세포에 대한 환자의 생체내 백신 접종에 의해 환자에서 암을 치료하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 관점은 이러한 방법에 사용하기 위한 항-ICOS 항체이다. 항-ICOS 항체는 다음을 포함하는 방법에 사용될 수 있다:
암 세포의 면역학적 세포 사망을 유발시키는 요법으로 환자를 치료하여 항원-특이적 효과기 T-세포에 대한 항원의 제시를 유도하는 단계; 및
항-ICOS 항체가 암 세포에 대한 항원 특이적 효과기 T-세포 반응을 증진시키는 환자에게 항-IGCOS 항체를 투여하는 단계.
면역학적 세포 사망을 유도하는 치료는 방사선 (예로, UVC 광 또는 γ선을 사용하는 세포의 이온화 방사선 조사), 화학치료제 (예로, 옥살리플라틴, 독소루비신, 이다루비신 또는 미토잔트론과 같은 안트라 사이클린, 플로레틴 또는 피마르산과 같은 BK 통로 작동제, 보르테조미브, 심장 글리코시드, 사이클로포스파미드, 미토마이신과 함께 GADD34/PP1 저해제, 하이퍼리신과 함께 PDT, 폴리이노신-폴리시티딜산, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 제피티닙, 에를로티닙 또는 시스플라틴과 함께 타프시가르진) 및 종양-관련 항원에 대한 항체를 포함한다. 종양-관련 항원은 동일한 조직의 비-종양 세포 (예로, HER2, CD20, EGFR)와 비교하여 종양 세포에 의해 과다발현되는 임의의 항원일 수 있다． 적합한 항체는 허셉틴 (항-HER2), 리투시마브 (항-CD20) 또는 세투시마브 (항-EGFR)를 포함한다.
따라서, 항-ICOS 항체를 하나 이상의 이러한 치료와 조합하는 것이 유리하다. 선택적으로, 항-ICOS 항체는 이미 이러한 치료를 받은 환자에게 투여된다. 항-ICOS 항체는 면역학적 세포 사망을 유도하는 치료 후 예를 들어 24시간, 48시간, 72시간, 1주 또는 2주 후, 예로 치료 후 24시간 내지 72시간 범위에서 투여될 수 있다. 항-ICOS 항체는 치료 후 2, 3, 4 또는 5주 이내에 투여될 수 있다. 조합 요법을 위한 다른 요법은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다.
"생체내 백신 접종"은 상기에 기술되었던 한편, 종양 세포를 처리하여 생체외 면역학적 세포 사망을 유도하고, 이후에 세포가 환자에게 재도입될 수 있는 것도 역시 가능하다. 환자에게 직접적으로 면역학적 세포 사망을 유도하는 제제 또는 치료를 투여하기보다는 치료된 종양 세포를 환자에게 투여한다. 환자의 치료는 상기 기술된 투여 요법에 따른 것일 수 있다.
이미 언급한 바와 같이, 항-ICOS 항체의 단일 용량은 치료 효과를 제공하기에 충분할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 치료 방법에서, 항-ICOS 항체는 선택적으로 단일 용량으로서 투여된다. 항-ICOS 항체의 단일 용량는 환자의 Treg를 고갈시킬 수 있으며 결과적으로 암과 같은 질환에 유익한 효과가 있다． 이전에 Treg의 일시적인 제거가 종양의 진행을 감소시키고, 확립된 종양 및 전이를 치료하고, 생존을 연장시키는 것을 포함하는 항-종양 효과를 가지며 종양 방사선 조사의 치료 효과를 증진시킬 수 있는 것으로 보고되었다[35]. 항-ICOS의 단일 용량의 투여는 이러한 Treg 고갈을 제공할 수 있으며, 방사선요법과 같은 조합하여 사용되는 다른 치료적 접근법의 효과를 증진시키는데 사용될 수 있다.
PD-L1에 대한 항체
항-ICOS 항체와 조합하여 사용하기 위한 PD-L1에 대한 항체는 별도의 치료제 또는 본원에 기술된 다중특이적 항체로서 임의의 항-PD-L1 항체의 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 항-PD-L1 항체의 수많은 예가 본원에 개시되어 있고 다른 것들은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 언급된 많은 항-PD-L1 항체에 대한 특성화 데이타는 본원에서 둘 다 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 US 9,567,399 및 US 9,617,338에 발표되었다.
1D05는 서열번호 27 (IMGT) 또는 서열번호 30 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 28 (IMGT) 또는 서열번호 31 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 29 (IMGT) 또는 서열번호 32 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 34이다. 1D05는 서열번호 37 (IMGT) 또는 서열번호 40 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 38 (IMGT) 또는 서열번호 41 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 39 (IMGT) 또는 서열번호 42 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 43의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 44이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 35 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 36)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 45 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 46)이다.
84G09는 서열번호 7 (IMGT) 또는 서열번호 10 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 8 (IMGT) 또는 서열번호 11 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 9 (IMGT) 또는 서열번호 12 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 13의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 14이다. 84G09는 서열번호 17 (IMGT) 또는 서열번호 20 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 18 (IMGT) 또는 서열번호 21 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 19 (IMGT) 또는 서열번호 22 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 23의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 24이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 15 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 16)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 25 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 26)이다.
1D05 HC 변이체 1은 서열번호 27 (IMGT) 또는 서열번호 30 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 28 (IMGT) 또는 서열번호 31 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 29 (IMGT) 또는 서열번호 32 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 47의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. 1D05 HC 변이체 1은 서열번호 37 (IMGT) 또는 서열번호 40 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 38 (IMGT) 또는 서열번호 41 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 39 (IMGT) 또는 서열번호 42 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 43의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 44이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 45 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 46)이다.
1D05 HC 변이체 2는 서열번호 27 (IMGT) 또는 서열번호 30 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 28 (IMGT) 또는 서열번호 31 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 29 (IMGT) 또는 서열번호 32 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 48의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. 1D05 HC 변이체 2는 서열번호 37 (IMGT) 또는 서열번호 40 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 38 (IMGT) 또는 서열번호 41 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 39 (IMGT) 또는 서열번호 42 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 43의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 44이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 45 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 46)이다.
1D05 HC 변이체 3은 서열번호 27 (IMGT) 또는 서열번호 30 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 28 (IMGT) 또는 서열번호 31 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 29 (IMGT) 또는 서열번호 32 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 49의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. 1D05 HC 변이체 3은 서열번호 37 (IMGT) 또는 서열번호 40 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 38 (IMGT) 또는 서열번호 41 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 39 (IMGT) 또는 서열번호 42 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 43의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 44이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 45 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 46)이다.
1D05 HC 변이체 4는 서열번호 27 (IMGT) 또는 서열번호 30 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 28 (IMGT) 또는 서열번호 31 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 29 (IMGT) 또는 서열번호 32 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 342의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. 1D05 HC 변이체 4는 서열번호 37 (IMGT) 또는 서열번호 40 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 38 (IMGT) 또는 서열번호 41 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 39 (IMGT) 또는 서열번호 42 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 43의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 44이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 45 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 46)이다.
1D05 LC 변이체 1은 서열번호 27 (IMGT) 또는 서열번호 30 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 28 (IMGT) 또는 서열번호 31 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 29 (IMGT) 또는 서열번호 32 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 34이다. 1D05 LC 변이체 1은 서열번호 37 (IMGT) 또는 서열번호 40 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열 및 서열번호 39 (IMGT) 또는 서열번호 42 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 50의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. 1D05 LC 변이체 1의 CDRL2 서열은 카밧 및 IMGT 시스템에 의해 정의된 바와 같이 서열번호 50의 VL 서열로부터 나온다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534와 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 35 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 36)이다.
1D05의 LC 변이체 2는 서열번호 27 (IMGT) 또는 서열번호 30 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 28 (IMGT) 또는 서열번호 31 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 29 (IMGT) 또는 서열번호 32 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 34이다. 1D05 LC 변이체 2는 서열번호 37 (IMGT) 또는 서열번호 40 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 38 (IMGT) 또는 서열번호 41 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 39 (IMGT) 또는 서열번호 42 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 51의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 35 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 36)이다.
1D05의 LC 변이체 3은 서열번호 27 (IMGT) 또는 서열번호 30 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 28 (IMGT) 또는 서열번호 31 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 29 (IMGT) 또는 서열번호 32 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 34이다. 1D05 LC 변이체 3는 서열번호 37 (IMGT) 또는 서열번호 40 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열 및 서열번호 39 (IMGT) 또는 서열번호 42 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 298의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. 1D05 LC 변이체 3의 CDRL2 서열은 카밧 및 IMGT 시스템에 의해 정의된 바와 같이 서열번호 298의 VL 서열로부터 나온다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 44이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534와 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 35 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 36)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 45 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 46)이다.
411B08은 서열번호 52 (IMGT) 또는 서열번호 55 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 53 (IMGT) 또는 서열번호 56 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 54 (IMGT) 또는 서열번호 57 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 58의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 59이다. 411B08은 서열번호 62 (IMGT) 또는 서열번호 65 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 63 (IMGT) 또는 서열번호 66 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 64 (IMGT) 또는 서열번호 67 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 68의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 69이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 60 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 61)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 70 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 71)이다.
411C04는 서열번호 72 (IMGT) 또는 서열번호 75 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 73 (IMGT) 또는 서열번호 76 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 74 (IMGT) 또는 서열번호 77 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 78의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 79이다. 411C04는 서열번호 82 (IMGT) 또는 서열번호 85 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 83 (IMGT) 또는 서열번호 86 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 84 (IMGT) 또는 서열번호 87 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 88의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 89이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 80 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 81)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 90 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 91)이다.
411D07은 서열번호 92 (IMGT) 또는 서열번호 95 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 93 (IMGT) 또는 서열번호 96 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 94 (IMGT) 또는 서열번호 97 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 98의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 99이다. 411D07는 서열번호 102 (IMGT) 또는 서열번호 105 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 103 (IMGT) 또는 서열번호 106 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 104 (IMGT) 또는 서열번호 107 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 108의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 109이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 100 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 101)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 110이다 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 111).
385F01은 서열번호 112 (IMGT) 또는 서열번호 115 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 113 (IMGT) 또는 서열번호 116 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 114 (IMGT) 또는 서열번호 117 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 118의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 119이다. 385F01은 서열번호 122 (IMGT) 또는 서열번호 125 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 123 (IMGT) 또는 서열번호 126 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 124 (IMGT) 또는 서열번호 127 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 128의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 129이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 120 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 121)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 130 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 131)이다.
386H03은 서열번호 152 (IMGT) 또는 서열번호 155 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 153 (IMGT) 또는 서열번호 156 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 154 (IMGT) 또는 서열번호 157 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 158의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 159이다. 386H03은 서열번호 162 (IMGT) 또는 서열번호 165 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 163 (IMGT) 또는 서열번호 166 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 164 (IMGT) 또는 서열번호 167 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 168의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 169이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 160 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 161)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 170 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 171)이다.
389A03은 서열번호 172 (IMGT) 또는 서열번호 175 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 173 (IMGT) 또는 서열번호 176 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 174 (IMGT) 또는 서열번호 177 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 178의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 179이다. 389A03은 서열번호 182 (IMGT) 또는 서열번호 185 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 183 (IMGT) 또는 서열번호 186 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 184 (IMGT) 또는 서열번호 187 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 188의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 189이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 180 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 181)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 190 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 191)이다.
413D08은 서열번호 132 (IMGT) 또는 서열번호 135 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 133 (IMGT) 또는 서열번호 136 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 134 (IMGT) 또는 서열번호 137 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 138의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 139이다. 413D08은 서열번호 142 (IMGT) 또는 서열번호 145 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 143 (IMGT) 또는 서열번호 146 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 144 (IMGT) 또는 서열번호 147 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 148의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 149이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 140 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 141)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 150 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 151)이다.
413G05는 서열번호 238 (IMGT) 또는 서열번호 241 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 239 (IMGT) 또는 서열번호 242 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 240 (IMGT) 또는 서열번호 243 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 244의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 245이다. 413G05는 서열번호 248 (IMGT) 또는 서열번호 251 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 249 (IMGT) 또는 서열번호 252 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 250 (IMGT) 또는 서열번호 253 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 254의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 255이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 246 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 247)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 256이다 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 257).
413F09는 서열번호 258 (IMGT) 또는 서열번호 261 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 259 (IMGT) 또는 서열번호 262 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 260 (IMGT) 또는 서열번호 263 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 264의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 265이다. 413F09는 서열번호 268 (IMGT) 또는 서열번호 271 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 269 (IMGT) 또는 서열번호 272 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 270 (IMGT) 또는 서열번호 273 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 274의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 275이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 266 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 267)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 276 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 277)이다.
414B06은 서열번호 278 (IMGT) 또는 서열번호 281 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 279 (IMGT) 또는 서열번호 282 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 280 (IMGT) 또는 서열번호 283 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 284의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 285이다. 414B06은 서열번호 288 (IMGT) 또는 서열번호 291 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 289 (IMGT) 또는 서열번호 292 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 290 (IMGT) 또는 서열번호 293 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 294의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 295이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 286 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 287)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 296 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 297)이다.
416E01은 서열번호 343 (IMGT) 또는 서열번호 346 (카밧)의 CDRH1 아미노산 서열, 서열번호 344 (IMGT) 또는 서열번호 347 (카밧)의 CDRH2 아미노산 서열 및 서열번호 345 (IMGT) 또는 서열번호 348 (카밧)의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 349의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열을 갖는다. VH 도메인의 중쇄 핵산 서열은 서열번호 350이다. 416E01은 서열번호 353 (IMGT) 또는 서열번호 356 (카밧)의 CDRL1 아미노산 서열, 서열번호 354 (IMGT) 또는 서열번호 357 (카밧)의 CDRL2 아미노산 서열 및 서열번호 355 (IMGT) 또는 서열번호 358 (카밧)의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 359의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 갖는다. VL 도메인의 경쇄 핵산 서열은 서열번호 360이다. VH 도메인은 본원에 기술된 임의의 중쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 193, 서열번호 195, 서열번호 197, 서열번호 199, 서열번호 201, 서열번호 203, 서열번호 205, 서열번호 340, 서열번호 524, 서열번호 526, 서열번호 528, 서열번호 530, 서열번호 532 또는 서열번호 534과 조합될 수 있다. VL 도메인은 본원에 기술된 임의의 경쇄 불변 영역 서열, 예로 서열번호 207, 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 215, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227, 서열번호 229, 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235, 서열번호 237, 서열번호 536 또는 서열번호 538과 조합될 수 있다. 전장의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 351 (중쇄 핵산 서열은 서열번호 352)이다. 전장의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 361 (경쇄 핵산 서열은 서열번호 362)이다.
항체-약물 컨쥬게이트
항-ICOS 항체는 세포독성 제제의 운반체로서 Treg를 표적하는 데 사용될 수 있다． 실시예 18에 보고된 바와 같이, 종양 미세환경 (TME)에 위치한 Treg는 ICOS를 강하게 발현한다. ICOS는 종양내 Teff 또는 말초 Treg보다 종양내 Treg에서 더 강하게 발현된다. 따라서, 독성 약물 또는 전구-약물로 표지된 항-ICOS 항체는 TME에서 Treg를 우선적으로 표적하여 독성 페이로드를 전달할 수 있고, 선택적으로 이들 세포를 억제한다. 이러한 세포독성 제제의 표적화는 Treg의 면역억압성 효과를 제거하는 추가적인 경로를 제공함으로써 Teff 활성에 유리하게 Treg : Teff 균형을 변화시키며, 대안으로서 또는 본원에서 논의된 임의의 다른 치료적 접근법 (예로, Treg의 Fc 효과기-매개성 억제, 효과기 T-세포의 작동기작) 하나 이상과 조합하여 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 세포독성 약물 또는 전구-약물에 컨쥬게이션된 항-ICOS 항체를 제공한다. 전구-약물의 경우, 전구-약물은 TME 또는 치료 활성의 다른 표적 부위에서 활성화가능하여 세포독성 제제를 생성한다. 활성화는 광활성화, 예로 광흡수체 컨쥬게이트를 활성화하는 근적외광을 사용하는 것과 같은 촉발인자에 반응할 수 있다 [36]. 전구-약물의 공간-선택적 활성화는 항체-약물 컨쥬게이트의 세포독성 효과를 증진시키며, 종양 내 Treg에서의 높은 ICOS 발현과 조합하여 이들 세포에 대해 매우 선택적인 세포독성 효과를 제공한다.
항체-약물 컨쥬게이트에 사용하기 위해, 세포독성 약물 또는 전구-약물은 바람직하게 혈액 내 항체-약물 컨쥬게이트의 순환 동안 비-면역원성이고 무독성 (휴면 또는 비활성)이다. 바람직하게 세포독성 약물 (또는 활성화될 때 전구-약물)은 효능이 강력하고 - 예로, 약물의 두 개 내지 네 개 분자가 표적 세포를 살상하는 데 충분할 수 있다. 광활성화 가능한 전구-약물은 근적외선 광 노출 후 세포막에 치명적인 손상을 일으키는 실리카프탈로시아닌 염료 (IRDye 700 DX)이다. 세포독성 약물은 모노메틸 아우리스타틴 E와 같은 항-세포분열제 및 메이탄신 유도체 예로 메르탄신, DM1, 엠탄신과 같은 미세소관 저해제를 포함한다.
항체에 대한 약물 (또는 전구-약물)의 컨쥬게이션은 일반적으로 링커를 통한다. 링커는 절단가능한 링커, 예로 설파이드, 히드라존 또는 펩타이드 링크일 수 있다. 카텝신-분해가능 링커가 사용될 수 있어 종양 세포에서 카텝신에 의해 약물이 방출된다. 대안적으로, 티오에테르 연결과 같은 비-분해가능 링커를 사용할 수 있다. 추가적인 부착기 및/또는 스페이서가 또한 포함될 수 있다.
항체-약물 컨쥬게이트에서의 항체는 작은 크기의 이러한 단편이 조직 부위 (예로, 고형 종양)로의 침투를 도울 수 있기 때문에, Fab'2 또는 본원에 기술된 다른 항원-결합 단편과 같은 항체 단편일 수 있다.
본 발명에 따른 항-ICOS 항체는 면역사이토카인으로서 제공될 수 있다. 항-ICOS 항체는 또한 조합 요법에서 면역사이토카인과 함께 투여될 수 있다. 항체의 다수의 예가 항-ICOS와의 조합 요법에 사용하기 위해 본원에 기술되어 있으며, 임의의 이들 항체 (예로, 항-PD-L1 항체)가 본 발명에 사용하기 위한 면역사이토카인으로서 제공될 수 있다. 면역사이토카인은 IL-2와 같은 사이토카인에 컨쥬게이션된 항체 분자를 포함한다. 따라서, 항-ICOS: IL-2 컨쥬게이트 및 항-PD-L1 : IL-2 컨쥬게이트가 본 발명의 추가의 관점이다.
IL-2 사이토카인은 높은 (αβγ) 친화성 IL-2 수용체 및/또는 중간 친화성 (αβ) IL-2 수용체에서 활성을 가질 수 있다. 면역사이토카인으로서 사용되는 IL-2는 인간 야생형 IL-2 또는 하나 이상의 아미노산 결실, 치환 또는 첨가를 갖는 변이체 IL-2 사이토카인 , 예로 N-말단에서 1 내지 10개의 아미노산 결실을 갖는 IL-2 일 수 있다. 다른 IL-2 변이체는 돌연변이 R38A 또는 R38Q를 포함한다.
예시적인 항-PD-L1 면역사이토카인은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하며, 중쇄는 N- 내지 C- 말단 방향으로
a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 VH 도메인; 및
b) 중쇄 불변 영역을 포함하고,
경쇄는 N- 내지 C-말단 방향으로
c) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 VL 도메인;
d) 경쇄 불변 영역 (CL);
e) 선택적으로, 링커 (L); 및
f) IL-2 사이토카인을 포함하고,
VH도메인 및 VL 도메인은 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위로 구성되며;
면역사이토카인은 모티브 X1GSGX2YGX3X4FD (서열번호 609)를 포함하는 CDRH3을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 식 중 X1, X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산이고, X4는 존재하거나 부재하고, 존재하는 경우 임의의 아미노산일 수 있다.
VH 및 VL 도메인은 본원에 언급된 임의의 항-PD-L1 항체의 VH 및 VL 도메인, 예로 1D05 VH 및 VL 도메인일 수 있다.
IL-2는 인간 야생형 또는 변이체 IL-2일 수 있다.
백신 접종
항-ICOS 항체는 백신 조성물로 제공되거나 백신 제조물과 함께 공동-투여될 수 있다. ICOS는 T 난포 헬퍼 세포 형성과 배아 중심 반응에 관여한다 [37]. 따라서, 작동제 ICOS 항체는 백신 효능을 증진시키기 위한 분자 아쥬반트로서 잠재적 임상 유용성을 갖는다. 이 항체는 B형 간염, 말라리아, HIV와 같은 수많은 백신의 방어적 효능을 증가시키는 데 사용될 수 있다．
백신 접종의 맥락에서, 항-ICOS 항체는 일반적으로 Fc 효과기 기능이 결여되어 ADCC, CDC 또는 ADCP를 매개하지 않는 항체일 것이다. 항체는 Fc 영역을 결여하거나 효과기가 없는 불변 영역을 갖는 형식으로 제공 될 수 있다. 선택적으로, 항-ICOS 항체는 하나 이상의 유형의 Fc 수용체와 결합하지만 ADCC, CDC 또는 ADCP 활성을 유도하지 않거나, 야생형 인간 IgG1과 비교하여 더 낮은 ADCC, CDC 및 ADCP 활성을 나타내는 중쇄 불변 영역을 가질 수 있다. 이러한 불변 영역은 ADCC, CDC 또는 ADCP 활성을 촉발시키는 특정 Fc 수용체(들)과 결합할 수 없거나 더 낮은 친화성으로 결합할 수 있다. 대안적으로, 세포 효과기 기능이 백신 접종의 맥락에서 허용가능하거나 바람직한 경우, 항-ICOS 항체는 Fc 효과기 기능 양성인 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 임의의 IgG1, IgG4 및 IgG4.PE 형식이 백신 요법에서의 항-ICOS 항체로 사용될 수 있으며, 적합한 이소형 및 항체 불변 영역의 다른 예는 본 명세서의 다른 곳에서 보다 자세히 설명된다.
제형 및 투여
항체는 단일클론 또는 다중클론성일 수 있지만, 바람직하게는 치료용 단일클론 항체로서 제공된다. 이들은 선택적으로 상이한 결합 특이성의 항체를 포함하는 다른 항체의 혼합물의 일부로서 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 및 인코딩 핵산은 보통 단리된 형태로 제공될 것이다. 따라서, 항체, VH 및/또는 VL 도메인 및 핵산은 이들의 자연 환경 또는 이들의 생산 환경으로부터 정제되어 제공될 수 있다. 단리된 항체 및 단리된 핵산은 이러한 제조가 시험관내 재조합 DNA 기술에 의한 경우 생체내에서 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산 또는 이들이 제조되는 환경 (예로, 세포 배양)과 같은 자연적으로 연관된 물질이 없거나 실질적으로 존재하지 않을 것이다. 선택적으로 단리된 항체 또는 핵산은 (1) 정상적으로 발견될 적어도 일부 다른 단백질이 없고, (2) 동일한 출처 예로 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 필수적으로 없고, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되고, (4) 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 이것이 자연적으로 연관되는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리되었으며, (5) 이것이 자연적으로 연결되지 않는 폴리펩타이드와 작동 가능하게 (공유 결합 또는 비공유 결합에 의해) 연결되었고, 또는 (6) 자연적으로 발생하지 않는다.
항체 또는 핵산은 희석제 또는 아쥬반트와 함께 제형화되고, 여전히 실용적 목적으로 단리될 수 있으며 - 예를 들어 면역검정법에 사용하기 위해 마이크로타이터 플레이트를 코팅하여 사용되는 경우, 이들은 담체와 혼합될 수 있고, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 다른 활성 성분이 또한 치료적 제조물에 포함될 수 있다. 항체는 생체내에서 자연적으로 또는 CHO 세포와 같은 이종 진핵 세포의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, (예를 들어, 원핵 세포에서 발현에 의해 생산된 경우) 글리코실화되지 않을 수 있다. 본 발명은 변형된 글리코실화 양상을 갖는 항체를 포괄한다. 일부 응용에서, 바람직하지 않은 당화 부위를 제거하는 변형, 예로 ADCC 기능을 증가시키는 퓨코스 부분의 제거기 유용할 수 있다[38]. 다른 응용에서, 갈락토실화의 변형은 CDC를 변형시키기 위해 이루어질 수 있다.
전형적으로, 단리된 생성물은 주어진 시료의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25% 또는 적어도 약 50%를 구성한다. 항체는 치료, 진단, 예방, 연구 또는 다른 용도를 방해하는 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 천연 또는 생산 환경에서 발견되는 다른 오염 물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.
항체는 이의 생산 환경의 성분으로부터 (예로, 자연적으로 또는 재조합으로) 확인, 분리 및/또는 회수될 수 있다. 단리된 항체는 생산 환경의 다른 모든 성분과 관련이 없을 수 있고, 예로 항체가 FDA에서 승인하거나 승인한 표준에 따라 분리되었다. 재조합 형질감염된 세포로부터 나온 것과 같은 생산 환경의 오염 성분은 전형적으로 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다． 일부 구현예에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리 방법에 의해 결정된 바와 같이, 항체의 중량으로 95% 초과, 일부 구현예에서 중량으로 99% 초과; (2) 회전컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 획득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 실버 염색을 사용하여 비환원 조건 또는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에서 항체를 제자리에 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체 또는 이의 인코딩 핵산은 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 발명은 본원에 기술된 항체를 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 또한, 이러한 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 치료 조성물이 제공된다. 인코딩 핵산은 본원의 다른 곳에서 보다 자세하게 기술되며, DNA 및 RNA, 예로 mRNA를 포함한다. 본원에 기술된 치료 방법에서, 항체를 인코딩하는 핵산 및/또는 이러한 핵산을 포함하는 세포의 사용이 항체 자체를 포함하는 조성물의 대안으로서 (또는 추가적으로) 사용될 수 있다. 선택적으로 핵산이 게놈 내에 안정적으로 도입된, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포는 따라서 환자에서 치료용 약제이다. 항-ICOS 항체를 인코딩하는 핵산은 인간 B 림프구, 선택적으로 의도된 환자로부터 유래되고 생체외에서 변형된 B 림프구 내에 도입될 수 있다. 선택적으로, 기억 B 세포가 사용된다. 환자에게 인코딩 핵산을 포함하는 세포의 투여는 항-ICOS 항체를 발현할 수 있는 세포 저장조를 제공하며, 이는 단리된 핵산 또는 단리된 항체의 투여와 비교하여 장기간 동안 치료 효과를 제공할 수 있다.
조성물은 이동, 전달, 내성 등을 향상시키기 위해 제형 내에 도입되는 적합한 담체, 부형제 및 기타 제제를 포함할 수 있다. 적절한 제형의 다수는 모든 약제학 화학자들에게 공지된 처방에서 찾을 수 있다: Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 이들 제형은 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질 (양이온성 또는 음이온성) 포함 소포 (예로, LIPOFECTINT™), DNA 컨쥬게이트, 무수 흡수 페이스트, 수중-오일 및 오일중-수 에멀전, 에멀전 카보왁스 (다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔 및 카보왁스를 포함한 반고체 혼합물을 포함한다. 또한 Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311 참조. 조성물은 의료용 주사 완충액 및/또는 아쥬반트와 조합하여 항체 또는 핵산을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 인코딩 핵산은 환자에게 원하는 투여 경로를 위해, 예로 주사용 액체 (선택적으로 수용액)로 제형화될 수 있다. 다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 구강 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 피하 투여를 위한 항체를 제형화는 전형적으로 정맥내 제조물과 비교하여 작은 부피 내에 이들을 농축시켜야 한다. 본 발명에 따른 항체의 높은 효능은 피하 제형을 실용화하기에 충분히 낮은 용량으로 사용하게 하여 덜 강력한 항-IGS 항체와 비교하여 장점을 나타낸다.
상기 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주입, 상피 또는 점막 피부층 (예로, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다．
약제학적 조성물은 또한 소포 상세하게는 리포좀로 전달될 수 있다 (Langer (1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 ; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327 참조; 일반적으로 동시 참조).
소정의 상황에서, 약제학적 조성물은 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (상기 Langer; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 참조). 또 다른 구현예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다; Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974) 참조. 또 다른 구현예에서, 제어 방출 시스템은 조성물의 표적 근처에 위치할 수 있으므로, 전신적 용량의 일부만을 필요로 한다 (예로, Goodson, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp. 115-138, 1984 참조).
주사가능한 제조물은 정맥내, 피하, 피내 또는 근육 주사, 점적 주입 등의 용량 형태를 포함할 수 있다. 이러한 주사가능한 제조물은 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사가능한 제조물은 예로 상기 기술한 항체 또는 이의 염을 통상적으로 주사에 사용되는 무균 수용성 매질 또는 유성 매질에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수용성 매질로서, 예를 들어, 생리 식염수, 포도당을 포함하는 등장액 및 기타 보조제 등이 있고, 이는 알코올 (예로, 에탄올) , 폴리알코올 (예로, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 표면 활성제 [예로, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (경화 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50몰) 부가물]] 등과 같은 적당한 용해화제와 조합하여 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 예로 참기름, 콩기름 등이 사용되고, 이는 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등의 용해화제와 조합하여 사용될 수 있다. 이와 같이 제조된 주사제는 적절한 앰플에 충전될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기로 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 치료는 클리닉에서의 사용에만 국한되지는 않을 것으로 예상된다. 따라서, 무-바늘 장치를 이용한 피하 주사가 또한 유리하다. 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는 적용을 바로 갖는다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용가능 또는 일회용일 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 포함하는 교체가능한 카트리지를 사용한다. 일단 카트리지 내의 모든 약제학적 조성물이 투여되고 카트리지가 비워지면, 빈 카트리지는 바로 폐기되어 약제학적 조성물을 포함하는 새로운 카트리지로 대체될 수 있다. 다음으로 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다． 일회용 펜 전달 장치에는 교체가능한 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내의 저장조에 보유된 약제학적 조성물로 사전 충전된다. 일단 저장조가 제약 조성물을 비우면, 전체 장치는 폐기된다. 다수의 재사용가능한 펜 및 자동주사기 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용된다. 예는 일부만 명명하자면 AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ 펜 (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜 (Eli Lilly and Co., Indianapolis, Ind.), NOVOPEN™ I, II 및 III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.), OPTIPENT™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ 및 OPTICLIKT™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany)를 포함하나 확실하게 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용되는 일회용 펜 전달 장치의 예는 SOLOSTAR™ 펜 (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) 및 KWIKPEN™ (KWIKPEN ™) (Eli Lilly)를 포함하나 확실하게 이에 한정되지 않는다.
유리하게, 상기에 기술된 경구용 또는 비경구용 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량에 맞는 적합한 단위 용량의 용량 형태 내에 제조된다. 이러한 단위 용량 형태는 예를 들어 정제, 환제, 캡슐, 주사 (앰플), 좌제 등을 포함한다. 포함된 전술된 항체의 양은 일반적으로 단위 용량에서 용량 형태 당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사 구성에서, 전술된 항체는 다른 용량 형태의 경우 약 5 내지 약 100 mg 및 약 10 내지 약 250 mg으로 포함될 수 있다.
항체, 핵산 또는 이를 포함하는 조성물은 병, 주사기, IV 용기 또는 주사 장치와 같은 의료용 용기에 포함될 수 있다. 일 예에서, 항체, 핵산 또는 조성물은 시험관내에 존재하며, 무균 용기에 담을 수 있다. 일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 치료 방법에서 사용하기 위한 항체, 포장 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 일 관점은 상기에 열거된 본 발명의 항체 또는 핵산 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물이다. "약제학적으로 허용가능한"은 미국 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인가능하거나 미국 약전 또는 인간을 포함한 동물에서의 사용을 위해 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 것을 말한다. 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 아쥬반트는 제제, 예로 본원에 기술된 임의의 항체 또는 항체 사슬과 함께 환자에게 투여될 수 있고, 이의 약리학적 활성을 파괴시키지 않으며, 제제의 치료적 용량을 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 비독성이다.
일부 구현예에서, 항-ICOS 항체는 본 발명에 따른 조성물에서 유일한 활성 성분일 것이다. 따라서, 조성물은 항체로 구성될 수 있거나 또는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 갖는 항체로 구성될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 활성 성분을 포함한다. 항-ICOS 항체가 조합될 수 있는 제제의 상세한 설명은 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다. 선택적으로, 조성물은 조합된 제조물, 예로 항-ICOS 항체 및 하나 이상의 다른 항체를 포함하는 단일 제형에서 다수의 항체 (또는 인코딩 핵산)를 포함한다. 본 발명에 따른 항체 또는 핵산과 함께 투여하는 것이 바람직할 수 있는 다른 치료제는 진통제를 포함한다. 이러한 임의의 제제 또는 제제의 조합은 조합된 또는 별도의 제조물이든 관계없이, 본 발명에 따른 항체 또는 핵산과 조합하여 투여되거나, 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 핵산은 언급된 것과 같은 또 다른 치료제 또는 제제와 함께 개별적으로 및 순차적으로, 또는 동시에 및 선택적으로 조합된 제조물로서 투여될 수 있다.
특정 치료적 적응증에 사용하기 위한 항-ICOS 항체는 허용된 간호 표준과 조합될 수 있다. 따라서, 항암 치료를 위해, 항체 요법은 예를 들어 화학요법, 수술 및/또는 방사선요법을 또한 포함하는 치료 요법에 사용될 수 있다. 방사선요법은 침범된 조직에 직접 전달되거나 전신에 전달되는 단일 용량 또는 분획 용량에 의할 수 있다．
다수의 조성물을 별도로 또는 동시에 투여할 수 있다． 별도의 투여는 두 개의 조성물이 상이한 시점, 예로 적어도 10, 20, 30 또는 10 내지 60분 간격으로 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12시간 간격으로 투여되는 것을 말한다. 또한 24시간 간격으로 또는 심지어 더 긴 간격으로 조성물을 투여할 수 있다. 대안적으로, 둘 이상의 조성물을 동시에, 예로 10분 미만 또는 5분 미만의 간격으로 투여할 수 있다. 동시에 투여되는 조성물은, 일부 관점에서, 각각의 성분에 대해 유사한 또는 상이한 시간 방출 기작을 갖거나 갖지 않는 혼합물로서 투여될 수 있다.
항체와 이의 인코딩 핵산은 치료제로서 사용될 수 있다． 본원의 환자는 일반적으로 포유동물, 전형적으로 인간이다. 항체 또는 핵산은 예로 본 명세서에서 언급된 임의의 투여 경로에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다.
투여는 정상적으로 "치료적 유효량"으로 이며, 이는 환자에게 유익한 효과를 나타내기에 충분한. 이것이 투여되어 원하는 효과를 생산하는 양이다. 정확한 양은 치료의 목적에 따라 달라질 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확증가능할 것이다 (예를 들어, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding 참조). 치료 처방, 예로 용량에 관한 결정 등은 일반 의사와 다른 의사의 책임 하에 있으며 증상의 심각도 및/또는 치료되는 질환의 진행에 따라 달라질 수 있다. 항체 또는 핵산의 치료적 유효량 또는 적합한 용량은 동물 모델에서 이의 시험관내 활성 및 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 시험 동물에서 인간에게 유효한 용량을 외삽하는 방법은 공지되어 있다.
본원의 실시예에 기술된 생체내 연구에 의해 지시된 바와 같이, 항-ICOS 항체는 용량 범위에서 효과적 일 수 있다. 약력학적 연구는 실시예 24에 보고되어 있다.
항-ICOS 항체는 용량 당 다음의 범위 중 하나의 양으로 투여될 수 있다:
약 10 μg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중,
약 50 μg/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중,
약 100 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중,
약 100 μg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중,
약 0.5 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중, 또는
약 5 mg/kg 체중 이하, 예를 들어 4 mg/kg 미만, 3 미만, 2 미만 또는 1 미만의 항체를 포함한다.
최적의 치료 용량은 인간에서 약 0.1 내지 0.5 mg/kg 사이 범위, 예를 들어 약 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.45 mg/kg 또는 0.5 mg/kg일 수 있다. 성인 인간에서의 고정된 투여의 경우, 적합한 용량은 8 내지 50 mg, 또는 8 내지 25 mg 사이 범위, 예로 15 mg 또는 20 mg일 수 있다.
본원에 기술된 치료 방법에서, 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 경우에 따라, 장기간의 효과를 얻으려면 단일 용량이 효과적일 수 있다． 따라서, 상기 방법은 항체, 이의 인코딩 핵산 또는 조성물의 단일 용량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 다수의 용량을 보통 순차적으로 투여하고 일, 주 또는 개월의 기간으로 분리할 수 있다. 항-ICOS 항체는 4 내지 6주의 간격으로, 예로 4주마다, 5주마다, 6주마다 반복적으로 환자에게 투여될 수 있다． 선택적으로,항-ICOS 항체는 환자에게 한달에 한 번 또는 덜 빈번하게, 예로 2개월마다 또는 3개월마다 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 환자를 치료하는 방법은 항-ICOS 항체의 단일 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월 동안 투여를 반복하지 않고 선택적으로 적어도 12개월 동안 투여를 반복하지 않는다.
실시예 11c에서 논의된 바와 같이, 비슷한 치료 효과를 항-ICOS 항체의 하나 또는 다수의 용량을 사용하여 얻을 수 있고, 이는 종양 미세환경을 재설정하는데 효과적인 항체의 단일 투여의 결과일 수 있다. 의사는 항-ICOS 항체 (예로, 수술, 방사선 요법 등)와 질환 상태 및 임의의 다른 치료제 또는 치료적 방법 (예로, 수술, 방사선 요법 등)을 고려하여 치료 중인 질환 및 환자에 대한 항-ICOS 항체의 투여 요법을 재단할 수 있다 일부 구현예에서, 항-ICOS 항체의 유효량은 예를 들어 3주마다 1회, 2주마다 1회, 매주 1회와 같이 1개월에 1회 이상 빈번하게 투여된다. 항-ICOS 항체를 이용한 치료는 적어도 1개월, 적어도 6개월, 또는 적어도 1년의 기간 동안 투여된 다중 용량을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "완화"는 질환 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전시키거나, 경감시키거나, 완화시키거나, 억제하거나, 지연시키거나 중단시키는 치료학적 치료를 말한다. 용어 "치료하는"은 병태, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 증상의 감소 또는 경감을 포함한다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상 또는 임상 마커가 감소될 경우 "효과적"이다. 대안적으로, 질환의 진행이 감소되거나 중단되는 경우 치료가 "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라 치료의 부재 시 예상되는 것과 비교하여 증상의 진행 또는 악화의 중지 또는 적어도 감속을 포함한다. 유익하거나 바람직한 임상 결과는 하나 이상의 증상 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화 상태 (예로, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 완화 또는 호전, 진정 (일부 또는 전부에 관계없이) 및/또는 사망율 감소를 검출가능 여부와 상관없이 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 용어 질환의 "치료"는 질환의 증상 또는 부작용 (진정 처치 포함)으로부터의 안정을 제공하는 것도 역시 포함한다. 치료가 효과적이기 위해 완전한 치유가 고려되지 않다. 이 방법은 소정의 관점에서 완치를 마찬가지로 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 치료는 예방적 치료일 수 있다.
T 세포 요법
국제특허출원 WO2011/097477은 T 세포 집단을, 선택적으로 IL-1β, IL-6, 중화 항-IFNγ 및/또는 항-IL-4와 같은 Th17 분극화제의 존재 시 일차 활성화 신호 (예로, 항-CD3 항체)를 제공하는 제 1 제제 및 ICOS를 활성화하는 제 2 제제 (예로, 항-ICOS 항체)와 접촉시킴으로써 T 세포를 생성하고 증식시키는 항-ICOS 항체의 용도를 기술하고 있다. 본원에 기술된 항-ICOS 항체는 T 세포 집단을 제공하는 이러한 방법에 사용될 수 있다. 치료적 활성을 갖는 배양된 증식된 T 세포의 집단 (예로, 항-종양 활성)이 생성될 수 있다. 국제특허출원 WO2011/097477에 기술된 바와 같이, 이러한 T 세포는 면역요법으로 환자를 치료하는 방법에서 치료적으로 사용될 수 있다.
치료 후보 물질로서 항- ICOS 항체의 형태학적 검정
후보 치료제 항-ICOS 항체는 고체 표면에 결합되어 ICOS-발현 T 세포에 접촉할 때, 이들은 세포에서 형태학적 변화를 유도할 수 있었던 것으로 확인되었다. 항-ICOS 항체로 내부적으로 코팅된 웰에 ICOS+ T 세포를 첨가하면 세포는 초기 원형 모양으로부터 변화하여 방추형 모양을 취하고, 항체-코팅 표면에 퍼지면서 부착하는 것으로 관찰되었다. 이 형태학적 변화는 대조군 항체로는 관찰되지 않았다. 더욱이, 이의 효과는 용량 의존적인 것으로 밝혀졌으며, 표면 상의 항체 농도가 증가하면서 더 빠르고 더 현저한 형태 변화가 일어났다. 모양 변화는 ICOS에 결합하는 T 세포 및/또는 항-ICOS 항체에 의한 작동기작의 대용 지시인자를 제공한다. 이 검정법은 T 세포 표면에서 ICOS의 다량체화를 촉진하는 항체를 확인하는 데 사용될 수 있다． 이러한 항체는 치료 후보 작동제 항체이다. 편리하게도, 이 검정법에 의해 제공되는 시각적 지시인자는 상세하게 많은 수로 항체 또는 세포를 스크리닝하는 간단한 방법이다. 이 검정법은 고처리량 시스템에서 실행되도록 자동화될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 관점은 ICOS와 결합하는 항체를 선별하는, 선택적으로 ICOS 작동제 항체를 선별하는 검정법으로서,
테스트 웰의 기질에 고정화된 (부착되거나 밀착된) 항체 어레이를 제공하는 단계;
ICOS-발현 세포 (예로, 활성화된 일차 T 세포 또는 MJ 세포)를 테스트 웰에 첨가하는 단계;
세포의 형태를 관찰하는 단계;
웰 내의 기질에 대해 원형 내지 평면으로 된 세포의 모양 변화를 검출하고, 상기 모양 변화는 항체가 ICOS, 선택적으로 ICOS 작동제 항체와 결합하는 항체인 것을 나타내는 단계; 및
테스트 웰로부터 항체를 선별하는 단계를 포함하는, 검정법이다.
이 분석은 각각 96 웰 플레이트 형식과 같이 선택적으로 동시에 테스트하는 상이한 항체를 포함하는 다수의 테스트 웰을 사용하여 실행할 수 있다． 기질은 바람직하게는 웰의 내부 표면이다. 따라서, 세포의 평탄화가 관찰될 수 있는 이차원 표면이 제공된다. 예를 들어, 웰의 바닥 및/또는 벽은 항체로 코팅될 수 있다. 기질에 대한 항체의 고정은 항체의 불변 영역을 통할 수 있다.
ICOS와 결합하지 않는 것으로 공지된 항체, 바람직하게는 사용되는 ICOS-발현 세포의 표면 상에 항원을 결합시키지 않는 항체와 같은 음성 대조군이 포함될 수 있다. 검정법은 형태학적 변화의 정도를 정량화하는 단계 및 복수의 항체가 테스트되는 경우 하나 이상의 다른 테스트 항체보다 큰 형태학적 변화를 유도하는 항체를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
항체의 선별은 대상 테스트 웰에 존재하는 항체를 인코딩하는 핵산을 발현시키거나, CDR 또는 해당 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 항체는 예를 들어, 선택된 항체의 항원 결합 도메인, 예로 항체 단편 또는 상이한 불변 영역을 포함하는 항체를 제공하도록 선택적으로 재구성될 수 있다. 선택된 항체에는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 인간 IgG1 불변 영역 또는 다른 불변 영역이 제공된다. 선택된 항체는 하나 이상의 추가적인 성분을 포함하는 조성물로 추가로 제형화될 수 있다 - 적합한 약제학적 제형물은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다.
조항
본 발명의 구현예는 다음의 번호 매겨진 조항으로 제시되고, 이는 상세한 설명의 일부이다.
조항 1. 인간 및/또는 마우스 ICOS의 세포외 도메인과 결합하는 단리된 항체로서, STIM003 VH 도메인 서열번호 408과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 STIM003 VL 도메인 서열번호 415와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 항체.
조항 2. VH 도메인은 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) HCDR1, HCD1R2 및 HCDR3의 집합을 포함하고,
HCDR1 은 서열번호 405의 아미노산 서열을 갖는 STIM003 HCDR1이고,
HCDR2는 서열번호 406의 아미노산 서열을 갖는 STIM003 HCDR2이고,
HCDR3은 서열번호 407의 아미노산 서열을 갖는 STIM003 HCDR3인, 조항 1에 따른 항체.
조항 3. VH 도메인은 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 집합을 포함하고,
LCDR1 은 아미노산 서열 서열번호 412를 갖는 STIM003 LCDR1이고,
LCDR2 는 아미노산 서열 서열번호 413을 갖는 STIM003 LCDR2이고,
LCDR3 은 아미노산 서열 서열번호 414를 갖는 STIM003 LCDR3인, 조항 1 또는 2에 따른 항체.
조항 4. VH 도메인 아미노산 서열은 서열번호 408이고/거나 상기 VL 도메인 아미노산 서열은 서열번호 415인, 조항 1에 따른 항체.
조항 5. 인간 및/또는 마우스 ICOS의 세포외 도메인에 결합하는 단리된 항체로서,
상보성 결정 영역 (CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 항체 VH 도메인 및
상보성 결정 영역 (CDR) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하고,
HCDR1은 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 HCDR1이거나 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 해당 HCDR1을 포함하고,
HCDR2는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 HCDR2이거나 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 HCDR2를 포함하고,
HCDR3은 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 HCDR3이거나 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 HCDR3을 포함하는, 항체.
조항 6. 항체 중쇄 CDR은 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 CDR이거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009 중쇄 CDR을 포함하는, 조항 5에 따른 항체.
조항 7. 항체 VH 도메인은 STIM003의 중쇄 CDR을 가지는, 조항 6에 따른 항체.
조항 8. 인간 및/또는 마우스 ICOS의 세포외 도메인과 결합하는 단리된 항체로서,
상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및
상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하고,
LCDR1은 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 LCDR1이거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 해당 LCDR1을 포함하고,
LCDR2는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 LCDR2이거나 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 LCDR2를 포함하고,
LCDR3은 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 LCDR3이거나 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 LCDR3을 포함하는, 항체.
조항 9. 항체 경쇄 CDR은 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 CDR이거나, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009 경쇄 CDR을 포함하는, 임의의 조항 5 내지 8에 따른 항체.
조항 10. 항체 VL 도메인은 STIM003의 경쇄 CDR을 가지는, 조항 9에 따른 항체.
조항 11. 인간 생식계열 유전자 분절 서열의 VH 및/또는 VL 도메인 구조틀 영역을 포함하는, 임의의 조항 5 내지 10에 따른 항체.
조항 12. 항체 VH 도메인이
(i) 인간 중쇄 V 유전자 분절, 인간 중쇄 D 유전자 분절 및 인간 중쇄 J 유전자 분절의 재조합으로부터 유래하고,
V 유전자 분절은 IGHV1-18 (예로, V1-18*01), IGVH3-20 (예로, V3-20*d01), IGVH3-11 (예로, V3-11*01) 또는 IGVH2-5 (예로, V2-5*10)이고/거나;
D 유전자 분절은 IGHD6-19 (예로, IGHD6-19*01), IGHD3-10 (예로, IGHD3-10*01) 또는 IGHD3-9 (예로, IGHD3-9*01)이고/거나;
J 유전자 분절은 IGHJ6 (예로, IGHJ6*02), IGHJ4 (예로, IGHJ4*02) 또는 IGHJ3 (예로, IGHJ3*02)이거나;
(ii) 구조틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하고,
FR1은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGHV1-18 (예로, V1-18*01), IGVH3-20 (예로, V3-20*d01), IGVH3-11 (예로, V3-11*01) 또는 IGVH2-5 (예로, V2-5*10)과 함께 정렬하고/거나,
FR2은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGHV1-18 (예로, V1-18*01), IGVH3-20 (예로, V3-20*d01), IGVH3-11 (예로, V3-11*01) 또는 IGVH2-5 (예로, V2-5*10)과 함께 정렬하고/거나,
FR3은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 IGHV1-18 (예로, V1-18*01), IGVH3-20 (예로, V3-20*d01), IGVH3-11 (예로, V3-11*01) 또는 IGVH2-5 (예로, V2-5*10)과 함께 정렬하고/거나,
FR4은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 J 유전자 분절 IGJH6 (예로, JH6*02), IGJH4 (예로, JH4*02) 또는 IGJH3 (예로, JH3*02)과 함께 정렬하는, 항체 VH 도메인을 포함하는, 임의의 조항 5 내지 11에 따른 항체.
조항 13. 항체 VL 도메인이
(i) 인간 경쇄 V 유전자 분절 및 인간 경쇄 J 유전자 분절의 재조합으로부터 유래하고,
V 분절는 IGKV2-28 (예로, 01*IGKV2-28), IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01) IGKV1D-39 (예로, IGKV1D-39*01) 또는 IGKV3-11 (예로, IGKV3-11*01)이고/거나,
J 유전자 분절은 IGKJ4 (예로, IGKJ4*01), IGKJ2 (예로, IGKJ2*04), IGLJ3 (예로, IGKJ3*01) 또는 IGKJ1 (예로, IGKJ1*01)이거나;
(ii) 구조틀 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하고,
FR1은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGKV2-28 (예로, IGKV2-28*01), IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01), IGKV1D-39 (예로, IGKV1D-39*01) 또는 IGKV3-11 (예로, IGKV3-11*01)과 함께 정렬하고/거나,
FR2는 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGKV2-28 (예로, IGKV2-28*01), IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01), IGKV1D-39 (예로, IGKV1D-39*01) 또는 IGKV3-11 (예로, IGKV3-11*01)과 함께 정렬하고/거나,
FR3은 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 V 유전자 분절 IGKV2-28 (예로, IGKV2-28*01), IGKV3-20 (예로, IGKV3-20*01), IGKV1D-39 (예로, IGKV1D-39*01) 또는 IGKV3-11 (예로, IGKV3-11*01)과 함께 정렬하고/거나,
FR4는 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 갖는 인간 생식계열 J 유전자 분절 IGKJ4 (예로, IGKJ4*01), IGKJ2 (예로, IGKJ2*04), IGKJ3 (예로, IGKJ3*01) 또는 IGKJ1 (예로, IGKJ1*01)과 함께 정렬하는, 항체 VL 도메인을 포함하는, 임의의 조항 5 내지 12에 따른 항체.
조항 14. 항체 VH 도메인이 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 VH 도메인이거나, STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 항체 VH 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 항체 VH 도메인을 포함하는, 임의의 조항 5 내지 13에 따른 항체.
조항 15. 항체 VL 도메인이 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 VL 도메인이거나, STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 항체 VL 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 항체 VL 도메인을 포함하는, 임의의 조항 5 내지 14에 따른 항체.
조항 16.
STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 VH 도메인으로부터 선택되거나, STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 또는 STIM009의 항체 VH 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 항체 VH 도메인 및
상기 선택된 항체의 VL 도메인이거나, 상기 선택된 항체의 항체 VL 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체 VL 도메인을 포함하는, 조항 15에 따른 항체.
조항 17. STIM003 VH 도메인 및 STIM003 VL 도메인을 포함하는, 조항 16에 따른 항체.
조항 18. 항체 불변 영역을 포함하는, 임의의 선행 조항에 따른 항체.
조항 19. 불변 영역은 인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 조항 18에 따른 항체.
조항 20. 불변 영역은 Fc 효과기 양성인, 조항 18 또는 19에 따른 항체.
조항 21. 미가공 인간 Fc 영역과 비교하여 증진된 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC 기능을 갖는 Fc 영역을 포함하는, 조항 20에 따른 항체.
조항 22. 항체는 IgG1인, 임의의 조항 18 내지 21에 따른 항체.
조항 23. 항체는 퓨코실화되지 않은, 조항 21 또는 22에 따른 항체.
조항 24. 세포독성 약물 또는 전구-약물에 컨쥬게이션된, 임의의 선행 조항에 따른 항체.
조항 25. 다중특이적 항체인, 임의의 선행 조항에 따른 항체.
조항26. 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되는 바 50 nM 미만의 친화도 (Kd)로 인간 및 마우스 ICOS의 세포외 도메인과 결합하는, 단리된 항체.
조항 27. 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되는 바 5 nM 미만의 친화도 (Kd)로 인간 및 마우스 ICOS의 세포외 도메인과 결합하는, 조항 26에 따른 항체.
조항 28. 인간 ICOS의 세포외 도메인과 결합하는 Kd는 상기 마우스 ICOS의 세포외 도메인과 결합하는 Kd의 10배 이내인, 조항 26 또는 27에 따른 항체.
조항 29. 임의의 선행 조항에 따른 단리된 항체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
조항 30. 임의의 조항 1 내지 29에 따른 항체를 인코딩하는 단리된 핵산 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
조항 31. 환자에서 효과기 T 세포 반응을 증가시키도록 조절 T 세포 (Treg) 대비 효과기 T 세포 (Teff)의 균형을 조절하는 방법으로서, 임의의 조항 1 내지 28에 따른 항체 또는 조항 29에 따른 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 32. 환자에서 조절 T 세포 (Treg)를 고갈시키고/거나 효과기 T 세포 (Teff) 반응을 증가시킴으로써 치료법에 순응하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 임의의 조항 1 내지 28에 따른 항체 또는 조항 29에 따른 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 33. 치료법에 의해 인간 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 임의의 조항 1 내지 28에 따른 항체 또는 조항 29에 따른 조성물.
조항 34. 환자에서 효과기 T 세포 반응을 증가시키도록 조절 T 세포 (Treg) 대비 효과기 T 세포 (Teff)의 균형을 조절하는 데 사용하기 위한, 조항 33에 따른 항체 또는 조성물.
조항 35. 조절성 T 세포 (Treg)를 고갈시키고/거나 효과기 T 세포 (Teff) 반응을 증가시킴으로써 치료법에 순응하는 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용하기 위한, 조항 33에 따른 항체 또는 조성물.
조항 36. 질환은 암 또는 고형 종양인, 조항 32에 따른 방법 또는 조항 35에 따른 항체 또는 조성물.
조항 37. 인간 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 임의의 조항 1 내지 28에 따른 항체 또는 조항 29에 따른 조성물.
조항 38. 인간 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 임의의 조항 1 내지 28에 따른 항체 또는 조항 29에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 39. 암은 신장세포암, 두경부암, 흑색종, 비-소세포 폐암 또는 확산성 대형 B-세포 림프종인, 임의의 조항 36 내지 38에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 40. 방법은 환자에게 상기 항체 및 또 다른 치료제 및/또는 방사선요법을 투여하는 단계를 포함하는, 임의의 조항 31 내지 39에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 41. 치료제는 항-PD-L1 항체인, 조항 40에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 42. 항-PD-L1 항체는 서열번호 299의 아미노산 서열을 가진 VH 도메인 및 서열번호 300의 아미노산 서열을 가진 VL 도메인을 포함하는, 조항 41에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 43. 치료제는 항-PD-L1 IL-2 면역사이토카인인, 조항 41 또는 42에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 44. 항-PD-L1 항체는 인간 야생형 또는 변이체 IL-2를 포함하는 면역사이토카인인, 조항 43에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 45. 항-ICOS 항체 및 항-PDL1 항체는 각각 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 매개할 수 있는, 조항 44에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 46. 항-ICOS 항체는 인간 IgG1 항체이고, 항-PDL1 항체는 인간 IgG1 항체인, 임의의 조항 41 내지 45에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 47. 치료제는 항-PD-L1 항체인, 조항 40에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 48. 다른 치료제는 IL-2인, 조항 40에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 49. 상기 방법은 다른 치료제 및/또는 방사선요법을 투여한 이후에 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 임의의 조항 40 내지 48에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 50.
항-ICOS 항체는 전구-약물에 컨쥬게이션되고,
방법 또는 사용은
항-ICOS 항체를 환자에게 투여하는 단계 및
표적 조직 부위에서 전구-약물을 선택적으로 활성화시키는 단계를 포함하는, 임의의 조항 31 내지 49에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 51. 환자는 고형 종양을 가지고, 상기 방법은 종양에서 전구 약물을 선택적으로 활성화시키는 단계를 포함하는, 조항 50에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 52. 전구-약물을 광활성화를 통해 선택적으로 활성화시키는 단계를 포함하는, 조항 50 또는 51에 따른 방법 또는 항체 또는 조성물.
조항 53. 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-ICOS 인간 IgG1 항체 및 항-PDL1 인간 IgG1 항체의 조합.
조항 54. 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 항-ICOS 인간 IgG1 항체 및 항-PD-L1 인간 IgG1 항체를 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 55. 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-ICOS 항체로서, 상기 방법은 항-ICOS 항체 및 항-PD -L1 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-ICOS 항체의 단일 용량이 투여되는, 항체.
조항 56. 항-ICOS 항체는 인간 IgG1 항체이고, 항-PDL1 항체는 인간 IgG1 항체인, 조항 55에 따른 항체.
조항 57. 암은 신장암, 두경부암, 흑색종, 비-소세포 폐암 또는 확산성 대형 B-세포 림프종인, 조항 53에 따른 조합, 조항 54에 따른 방법 또는 조항 55 또는 56에 따른 항체.
조항 58. 상기 방법은 환자에게 항-ICOS 항체 및 항-PD -L1 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-ICOS 항체은 단일 용량이 투여되는, 임의의 조항 41 내지 46 또는 53 또는 54에 따른 방법 또는 항체, 조성물 또는 조합.
조항 59. 상기 방법은 항-ICOS 항체의 단일 용량을 투여한 이후에 항-PD-L1 항체의 다중 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 조항 58에 따른 방법 또는 항체, 조성물 또는 조합.
조항 60. 항-ICOS 항체 및 항-PD -L1 항체는 투여를 위한 별도의 조성물에 제공되는, 임의의 조항 41 내지 46 또는 53 또는 54에 따른 방법 또는 항체, 조성물 또는 조합.
조항 61. 항-ICOS 항체 및/또는 항-PD-L1 항체는 서열번호 340의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는, 임의의 조항 41 내지 46 또는 53 내지 60에 따른 방법 또는 항체, 조성물 또는 조합.
조항 62. 환자를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-ICOS 항체로서, 상기 방법은 또 다른 치료제로의 치료 이후에 ICOS-양성 조절 T 세포의 수준이 증가한 환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항-ICOS 항체.
조항 63. 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 또 다른 치료제로의 치료 이후에 ICOS-양성 조절 T 세포의 수준이 증가한 환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 64. 상기 방법은 환자에게 치료제를 투여하는 단계, 상기 치료제로의 치료 이후에 환자가ICOS-양성 조절 T 세포의 수준이 증가하는지 여부를 결정하는 단계 및 환자에게 항-ICOS 항체를 투여하여 조절 T 세포의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 조항 62에 따른 항-ICOS 항체 또는 조항 63에 따른 방법.
조항 65. 치료제는 IL-2 또는 면역조절성 항체 (예로, 항-PDL-1, 항-PD-1 또는 항-CTLA-4)인, 임의의 조항 62 내지 64에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 66. 상기 방법은 암, 예로 전이성 흑색종과 같은 흑색종을 치료하는 단계를 포함하는, 임의의 조항 62 내지 65에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 67. 환자의 암 세포에 대한 생체내 백신 접종에 의해 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-ICOS 항체로서, 상기 방법은
암 세포의 면역학적 세포 사망을 유발하는 요법으로 환자를 치료하여 항원-특이적 효과기 T-세포에게로 항원의 제시를 유도하는 단계; 및
환자에게 항-ICOS 항체를 투여하고, 항-ICOS 항체는 항원-특이적 효과기 T 세포 반응을 증진시키는 단계를 포함하는, 항-ICOS 항체.
조항 68. 환자의 암 세포에 대한 생체내 백신 접종에 의해 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
암 세포의 면역학적 세포 사망을 유발하는 요법으로 환자를 치료하여 항원-특이적 효과기 T-세포에게로 항원의 제시를 유도하는 단계; 및
환자에게 항-ICOS 항체를 투여하고, 항-ICOS 항체가 항원-특이적 효과기 T 세포 반응을 증진시키는 단계를 포함하는, 항-ICOS 항체.
조항 69. 환자의 암 세포에 대한 생체내 백신 접종에 의해 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하고,
환자는 암 세포의 면역학적 세포 사망을 유발하여 항원-특이적 효과기 T 세포에게로 항원의 제시를 유도하는 요법으로 이전에 치료받았던 대상이고,
항-ICOS 항체는 항원-특이적 효과기 T 세포 반응을 증진시키는, 방법.
조항 70. 면역학적 세포 사망을 유발시키는 요법은 암 세포의 방사선 조사, 화학치료제의 투여 및/또는 종양-관련 항원에게로 유도된 항체의 투여인, 임의의 조항 67 내지 69에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 71. 화학치료제는 옥살리플라틴인, 조항 70에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 72. 종양-관련 항원은 HER2 또는 CD20인, 조항 70에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 73. 환자의 암을 치료하는 방법에 사용하는 항-ICOS 항체로서, 암은 ICOS 리간드 및/또는 Foxp3의 발현에 대한 양성인 것을 특징으로 하거나 하였던, 항-ICOS 항체.
조항 74. 환자의 암을 치료하는 방법으로서, 암은 ICOS 리간드 및/또는 FOXP3의 발현에 대해 양성인 것을 특징으로 하거나 하였고, 상기 방법은 환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 75. 조항 73에 따른 항-ICOS 항체 또는 조항 74에 따른 방법 으로서, 상기 방법은
환자로부터의 시료를 테스트하여 암이 ICOS 리간드 및/또는 FOXP3을 발현하는 것을 결정하는 단계;
항-ICOS 항체로의 치료를 위해 환자를 선별하는 단계; 및
환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 76. 조항 73에 따른 항-ICOS 항체 또는 조항 74에 따른 방법으로서, 상기 방법은 테스트 시료가 암이 ICOS 리간드 및/또는 FOXP3의 발현에 대해 양성인 것을 나타낸 환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 77. 시료는 고형 종양의 생검 시료인, 조항 75 또는 조항 76에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 78. 환자의 암을 치료하는 방법에 사용하는 항-ICOS 항체로서, 암은 면역종양학 약물 예로 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD137 항체 또는항-GITR 항체로의 치료에 불응성인 것을 특징으로 하거나 하였던, 항-ICOS 항체.
조항 79. 환자의 암을 치료하는 방법으로서, 암은 면역종양학 약물 예로 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD137 항체 또는항-GITR 항체로의 치료에 불응성인 것을 특징으로 하거나 하였고, 상기 방법은 항-ICOS 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 80. 조항 73에 따른 항-ICOS 항체 또는 조항 74에 따른 방법 으로서, 상기 방법은
면역종양학 약물로 환자를 치료하는 단계;
암이 약물에 반응하지 않는 것을 결정하는 단계;
항-ICOS 항체로의 치료를 위해 환자를 선별하는 단계; 및
환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 81. 상기 방법은 면역종양학 약물로의 이전의 치료에 암이 반응하지 않은 환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 조항 78에 따른 항-ICOS 항체 또는 조항 79에 따른 방법.
조항 82. 암은 ICOS 리간드를 발현하는 능력을 획득하였던 세포로부터 유래한 종양인, 임의의 조항 73 내지 81에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 83. 암은 흑색종인, 조항 82에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 84. 암은 B 림프구 (예로, 확산성 대형 B 세포 림프종과 같은 B 세포 림프종) 또는 T 림프구와 같은 항원-제시 세포로부터 유래하는, 임의의 조항 73 내지 81에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 85. 암은 항-CD20 항체로의 치료에 저항성인, 임의의 조항 73 내지 81에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 86. 암은 B 세포 림프종인, 조항 85에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 87. 항-CD20 항체는 리투시마브인, 조항 86에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 88. 상기 방법은 환자를 항-CD20 항체로 치료하는 단계;
상기 암이 상기 항-CD20 항체에 반응하지 않는 것을 결정하는 단계;
환자로부터의 시료를 테스트하여 암이 ICOS 리간드를 발현하는 것을 결정하는 단계
항-ICOS 항체로의 치료를 위해 환자를 선별하는 단계; 및
환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 임의의 조항 85 내지 87에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 89. 상기 방법은 항-CD20 항체로의 이전의 치료에 암이 반응하지 않은 환자에게 항-ICOS 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 임의의 조항 85 내지 87에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 90. 암은 고형 종양인, 임의의 조항 67 내지 89에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 91. 암은 혈액학적 액체 종양인, 임의의 조항 67 내지 89에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 92. 종양은 조절 T 세포가 높은, 조항 90 또는 91에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 93. 항-ICOS 항체는 임의의 조항 1 내지 28에서 정의된 바와 같거나 조항 29에 따른 조성물에 제공되는, 임의의 조항 53 내지 92에 따른 항-ICOS 항체 또는 방법.
조항 94. 인간 가변 영역 유전자 분절을 인코딩하는 인간 또는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 지닌 유전자전환 비-인간 포유동물로서, 포유동물는 ICOS를 발현하지 않는, 유전자전환 포유동물.
조항 95. 인간 및 비-인간 ICOS의 세포외 도메인과 결합하는 항체를 생산하는 방법으로서,
(a) 조항 94에 따른 포유동물을 인간 ICOS 항원으로 면역화하는 단계;
(b) 포유동물에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계;
(c) 항체를 인간 및 비-인간 ICOS와 결합하는 능력에 대해 테스트하는 단계; 및
(d) 인간 및 비-인간 ICOS 둘 다와 결합하는 하나 이상의 항체를 선별하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 96. 인간 ICOS을 발현하는 세포로 포유동물을 면역화하는 단계를 포함하는, 조항 95에 따른 방법.
조항 97. 상기 방법은
(c) 항체를 표면 플라스몬 공명을 사용하여 인간 및 비-인간 ICOS와 결합하는 능력에 대해 테스트하여 결합 친화성을 결정하는 단계; 및
(d) 인간 ICOS에 대한 결합의 KD가 50 nM 미만이고, 비-인간 ICOS에 대한 결합의 KD가 500 nM 미만인 하나 이상의 항체를 선별하는 단계를 포함하는, 조항 95 또는 96에 따른 방법.
조항 98. 상기 방법은
(d) 인간 ICOS에 대한 결합의 KD가 10 nM 미만이고, 비-인간 ICOS에 대한 결합의 KD가 100 nM 미만인 하나 이상의 항체를 선별하는 단계를 포함하는, 조항 97에 따른 방법.
조항 99. 상기 방법은
(c) 상기 항체를 표면 플라스몬 공명을 사용하여 인간 및 비-인간 ICOS와 결합하는 능력에 대해 테스트하여 결합 친화성을 결정하는 단계; 및
(d) 인간 ICOS에 대한 결합의 KD가 비-인간 ICOS에 대한 결합의 KD의 10배 이내인, 임의의 조항 95 내지 98에 따른 방법.
조항 100. 상기 방법은
(d) 인간 ICOS에 대한 결합의 KD가 비-인간 ICOS에 대한 결합의 KD의 5배 이내인, 조항 99에 따른 방법
조항 101. 포유동물과 동일한 종으로부터의 비-인간 ICOS와 결합하는 능력에 대해 항체를 테스트하는 단계를 포함하는, 조항 99에 따른 방법.
조항 102. 포유동물과 상이한 종으로부터의 비-인간 ICOS와 결합하는 능력에 대해 항체를 테스트하는 단계를 포함하는, 임의의 조항 95 내지 101에 따른 방법.
조항 103. 포유동물은 마우스 또는 래트인, 임의의 조항 95 내지 102에 따른 방법.
조항 104. 비-인간 ICOS는 마우스 ICOS 또는 래트 ICOS인, 임의의 조항 95 내지 103에 따른 방법.
조항 105. 인간 또는 인간화 면역글로불린 유전자좌가 내인성 불변 영역의 상류에 인간 가변 영역 유전자 분절을 포함하는, 임의의 조항 95 내지 104에 따른 방법.
조항 106. 상기 방법은
(a) 조항 94에 따른 포유동물을 인간 ICOS 항원으로 면역화하고, 포유동물은 마우스인 단계;
(b) 마우스에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계;
(c) 항체를 인간 및 비-인간 ICOS와 결합하는 능력에 대해 테스트하는 단계; 및
(d) 인간 및 비-인간 ICOS 둘 다와 결합하는 하나 이상의 항체를 선별하는 단계를 포함하는, 조항 105에 따른 방법.
조항 107. 항체 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계를 포함하는, 임의의 조항 95 내지 106에 따른 방법.
조항 108. 포유동물이 인간 가변 영역 유전자 분절 및 내인성 불변 영역의 재조합을 통해 항체를 생성하는, 임의의 조항 95 내지 107에 따른 방법.
조항 109. 중쇄 및/또는 경쇄 가변도메인을 인코딩하는 핵산을 인간 중쇄 불변 영역 및/또는 인간 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 각각 컨쥬게이션하는 단계를 포함하는, 조항 107 또는 108에 따른 방법.
조항 110. 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 임의의 조항 107 내지 109에 따른 방법.
조항 111. 숙주 세포를 항체 또는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 발현 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 조항 110에 따른 방법.
조항 112. 임의의 조항 95 내지 111에 따른 방법에 의해 생산되는, 항체 또는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인.
조항 113. ICOS와 결합하는 항체를 선별하기 위한, 선택적으로 ICOS 작동제 항체를 선별하기 위한 방법으로서, 상기 검정법은
테스트 웰의 기질에 고정화된 (부착되거나 밀착된) 항체 어레이를 제공하는 단계;
ICOS-발현 세포 (예로, 활성화된 일차 T 세포 또는 MJ 세포)를 테스트 웰에 첨가하는 단계;
세포의 형태를 관찰하는 단계;
웰 내의 기질에 대한 원형 내지 평면이 된 세포의 모양 변화를 검출하는 단계로서, 모양 변화가 항체가 ICOS, 선택적으로 ICOS 작동제 항체와 결합하는 항체인 것을 나타내는, 단계;
테스트 웰로부터 항체를 선별하는 단계;
선택된 항체의 CDR을 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계; 및
항체를 하나 이상의 추가적인 성분을 포함하는 조성물 내에 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
본 발명의 다양한 추가의 관점 및 구현예는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 자명할 것이다. 언급된 임의의 특허 또는 특허 출원의 미국 공개된 문헌들을 포함하여 본 명세서에서 언급된 모든 문헌은 이의 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다.
실험 실시예
다음 실시예는 항-ICOS 항체의 생성, 특성화 및 성능을 설명한다. 항체는 인간 가변 도메인을 갖는 항체를 생성할 수 있는 유전자전환 마우스 플랫폼인 KymouseTM를 사용하여 생성되었다. KymouseTM로부터의 항체는 인간 V (D) 및 J 분절로부터 생성된 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 갖는다. 내인성 마우스 가변 유전자는 침묵화되어 레퍼토리의 아주 작은 부분을 구성한다 (모든 중쇄 가변 영역의 0.5% 미만이 마우스 기원임). KymouseTM 시스템은 Lee et al 2014 [39], 국제특허출원 WO2011/004192, WO2011/158009 및 WO2013/061098에 기술되어 있다. 이 프로젝트 중쇄 유전자좌 및 경쇄 카파 유전자좌가 인간화되는 Kymouse HKTM 균주를 채용하였다.
ICOS 녹아웃 KymouseTM은 ICOS 단백질 또는 인간 및 마우스 ICOS를 발현하는 세포와 단백질의 교대하는 추가 접종의 조합으로 면역화되었다.
인간 ICOS에 결합한 히트가 확인되었다. 스크리닝을 위한 일차 선별 판정기준은 ICOS를 발현한 인간 세포 (CHO 세포)에 대한 결합 및 ICOS 단백질 (HTRF)에 대한 결합이었다. 마우스 ICOS 단백질 및 ICOS를 발현한 마우스 세포 (CHO 세포)에 결합도 역시 일차 스크리닝 히트를 선별할 때 평가되고 고려되었다. 이들 판정기준을 사용하여 히트가 이차 스크리닝으로 진행되었다. 이차 스크리닝에서, 히트는 유세포 계측법에 의해 CHO 세포 상에 발현된 인간 및 마우스 ICOS에 대한 결합을 결정함으로써 검증되었다.
다수의 항체를 스크리닝하여 표면 플라즈몬 공명 및 유세포 계측법에 의해 결정된 바와 같이 인간/시노몰거스 및 마우스 ICOS에 결합하는 작은 패널을 확인하였다. 이들 항체는 STIM001, STIM002 및 이의 변이체 STIM002-B, STIM003, STIM004 및 STIM005를 포함하였다. 추가적인 네 개의 항체 STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009를 역시 선택하여 마우스 ICOS와의 교차-반응성은 적지만 인간 ICOS 수용체의 작동기작을 입증하였다. 본원에 제시된 데이타는 항-ICOS 항체가 ICOS 양성 CD4+ 세포주에서 ICOS 수용체의 작동제로 작용할 수 있는 능력을 나타내고, 또한 일차 T 세포-기반의 검정으로 ADCC 검정에서의 세포 살상 능력 및 생체내 항-종양 면역 반응을 촉진시키는 능력을 보여준다.
실시예 1: ICOS 녹아웃 마우스의 생성
ICOM 녹아웃 KymouseTM 세포주는 KymouseTM HK ES 세포에서 동종 재조합에 의해 생성되었다. 간략하게, 퓨로마이신 선별을 인코딩하는 3.5kb 표적화 벡터를 ES 세포 내로 표적화하였다. 성공적인 표적화는 마우스 ICOS 유전자좌의 작은 영역 (72 bp)을 퓨로마이신 카세트로 대체하여 유전자의 신호 펩타이드/개시 코돈을 파괴하였다. 인간화된 중쇄 및 카파 면역글로불린 유전자좌 둘 다 및 변형된 기능적-효과가 없는 ICOS 유전자좌의 동형접합 동물을 궁극적으로 생성하기 위하여, 양성 ES 클론을 증식시키고, 마우스 포배에 미세주입하고, 결과로 얻은 키메라를 배양하였다.
실시예 2: 항원 및 세포주 제조
인간 또는 마우스 ICOS를 발현하는 안정적으로 형질감염된 MEF 및 CHO -S 세포의 생성
인간 및 마우스 ICOS를 인코딩하는 전장의 DNA 서열을 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화하고, 합성 가닥 DNA로서 주문하여 CMV 프로모터의 조절 하에 세포 게놈 내의 안정한 통합을 용이하게 하는 3' 및 5' piggyBac 특이적 말단 반복 서열이 인접된 발현 벡터 내로 클로닝하였다 ([40] 참조). 발현 벡터는 안정한 세포주 생성을 용이하게 하는 퓨로마이신 선별 카세트을 포함하였다. 인간 ICOS 발현 및 마우스 ICOS 발현 세포주를 각각 생성하기 위해, 인간 또는 마우스 ICOS 발현 플라스미드를 piggyBac 트랜스포스아제를 인코딩하는 플라스미드로 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 세포주 및 CHO-S 세포 내에 FreeStyle Max 형질감염 시약 (Invitrogen)을 제조사의 지침에 따라 사용 하여 공동-형질감염하였다. C57BL6 암컷 마우스에 교차된 129S5로부터 얻은 배아로부터 MEF 세포를 생성하였다. 형질감염 후 24시간째에, 배지에 퓨로마이신을 보충하고 안정된 세포주를 선별하기 위해 적어도 2주 동안 배양하였다. 세포 배양 배지는 3 내지 4일마다 교체되었다. 인간 또는 마우스 ICOS 단백질의 발현은 항-인간 또는 항-마우스 ICOS-PE 컨쥬게이션된 항체 (eBioscience)를 각각 사용하는 유세포 계측법에 의해 평가되었다. 완전한 MEF 배지는 10% v/v 우태아 혈청 (Gibco)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Gibco)로 만들어졌다. 완전 CHO-S 배지는 8 mM 글루타맥스 (Gibco)가 보충된 CD-CHO 배지로 구성되었다. CHO-S 세포는 캐나다 국립 연구위원회로부터 입수가능한 pTT5 시스템에 포함된 CHO-3E7 세포주이지만 다른 CHO 세포주도 사용할 수 있다.
마우스 면역화를 위한 MEF 세포의 제조
세포 배양 배지를 제거하고 세포를 1X PBS로 한 번 세척하였다. 세포를 조직 배양 표면으로부터 세포를 이완시키기 위해 트립신으로 5분 동안 처리 하였다. 세포를 수집하고 10% v/v 우태아 혈청 (FCS)을 포함하는 완전 배지를 첨가하여 트립신을 중화시켰다. 이어서 세포를 300 g에서 10분 동안 원심분리하고 1X PBS 25 ml로 세척하였다. 세포를 계수하고, 1X PBS에서 적절한 농도로 재현탁하였다.
재조합 단백질의 클로닝 및 발현
인간 ICOS (NCBI 기탁번호 NP_036224.1), 마우스 ICOS (NCBI 기탁번호 NP_059508.2) 및 시노몰거스 ICOS (GenBank 기탁번호 EHH55098.1)의 세포외 도메인을 인코딩하는 합성 DNA를 표준 분자생물학 기법을 사용하여 pREP4 (Invitrogen) 또는 pTT5 (National Research Council Of Canada) 둘 중 하나 내에 클로닝하였다. 구조물은 또한 정제 및 검출을 돕도록 인간 Fc, 마우스 Fc 또는 FLAG His 펩타이드 모티프를 포함하였다. 이들은 중첩 연장에 의해 DNA 구조물에 첨가되었다. 모든 구조물은 정확한 서열 조성을 보장하기 위해 발현 전에 서열 결정되었다.
실시예 3: 백신 접종
ICOS 녹아웃 HK KymiceTM (실시예 1 참조), KymouseTM 야생형 HK 세포주 및 KymouseTM 야생형 HL 세포주를 표 E3에 기술된 요법에 따라 면역화시켰다. Kymouse™ 야생형 HK 및 HL 세포주는 야생형 마우스 ICOS를 발현한다. HK 세포주에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 경쇄 카파 유전자좌는 인간화되고, HL 세포주에서 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및 경쇄 람다 유전자좌가 인간화된다.
표 E3. Kymouse™ 세포주에 대한 면역화 요법
표의 핵심
mICOS Fc = 인간 Fc를 갖는 마우스 ICOS 단백질
hICOS Fc = 인간 Fc를 갖는 인간 ICOS 단백질
mICOS MEF = MEF 세포에서 발현된 마우스 ICOS
hICOS MEF = MEF 세포에서 발현된 인간 ICOS
mICOS Fc+ hICOS Fc = 인간 Fc를 갖는 마우스 ICOS 단백질 + 동시에 투여된 인간 Fc를 갖는 인간 ICOS 단백질
mICOS MEF+ hICOS MEF = MEF 세포에 발현된 마우스 ICOS + 동시에 투여된 MEF 세포에서 발현된 인간 ICOS
ICOS KO = ICOS 녹아웃 HK Kymouse
HK 및 HL = 야생형 Kymouse HK 및 HL 유전형
RIMMS는 변형된 피하 면역화 절차 (다수 부위에서의 신속한 면역화)이다; Kilpatrick et al. 이후로 변형됨 ([41]). 면역요법 KM103 및 KM111은 복강내 (ip) 투여에 의해 일차-휴식-추가 접종되었다. 시그마 아쥬반트 시스템은 모든 면역화에 사용되었으며 휴식 간격은 보통 2 및 3주 사이였다. 최종 추가 접종는 아쥬반트의 부재 시 정맥내로 투여하였다.
일련의 또는 최종 혈액 시료로부터의 혈청을 유세포 계측법으로 특이적 항체의 존재에 대해 분석하고, 역가 데이타를 B 세포 선별에 사용할 마우스를 선택하기 위해 (가능한 경우) 사용하였다.
실시예 4: ICOS KO 및 야생형 마우스 간의 혈청 역가의 비교
면역화된 ICOS KO와 면역화된 야생형 Kymouse의 혈청 역가는 유세포 계측법을 사용하여 결정되었다. ICOS KO 마우스에서, 인간 ICOS 항원으로 면역화하여 CHO 세포에서 발현된 인간 및 마우스 ICOS 모두에 대한 Ig 결합을 갖는 혈청 면역글로불린 반응을 유도하였다 (도 1a). 반대로, 야생형 Kymouse (마우스 ICOS 발현)에서, 동일한 인간 ICOS 항원으로 면역화하여 인간 ICOS에 대한 동일한 혈청의 결합와 비교하여 마우스 ICOS에 대한 결합이 현저하게 감소된 혈청을 생산하였다 (도 1b).
방법
FACS 완충액 (PBS + 1% w/v BSA + 0.1% w/v 소듐 아자이드)에 현탁시킨 인간 ICOS 또는 마우스 ICOS를 발현하는 CHO-S 세포 (실시예 2 참조) 또는 형질감염되지 않은 CHO-S 세포 (야생형 (WT)라고도 지칭됨)를 96-웰, V-바닥 플레이트 (Greiner)에 웰 당 105개 세포의 밀도로 분배하였다. 마우스 혈청의 적정을 준비하고, 시료를 FACS 완충액으로 희석시켰다. 50 μL/웰의 이 적정을 세포 플레이트에 첨가하였다. 면역화로 인한 활성 수준의 변화를 결정하기 위해, 면역화 전의 각 동물의 혈청을 FACS 완충액에서 1/100로 희석하고 세포에 50 μL/웰을 첨가하였다. 세포를 4°C에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 150 μL PBS로 두 번 세척하고, 각 세척 단계 후 원심분리하여 상청액을 흡인하였다 (300xg에서 3분 동안 원심분리). 항체 결합을 검출하기 위해, APC 염소-항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch)를 FACS 완충액에서 1/500으로 희석하고 세포에 50 μL을 첨가하였다. 일부 경우에 AF647 염소-항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch)가 사용되었다. 세포를 암소에서 4°C로 1시간 동안 배양한 후 상기와 같이 150 μL PBS로 두 번 세척하였다. 세포를 고정하기 위해 100 μL 2% v/v 파라포름알데히드를 첨가하고 세포를 4°C에서 30분 동안 배양하였다. 다음으로 세포를 300 x g 에서 원심분리하여 펠렛으로 만들고 플레이트를 50 μL의 FACS 완충액에 재현 탁하였다. 형광 신호 강도 (기하 평균)는 BD FACS 어레이 장비를 사용하여 유세포 계측법으로 측정하였다.
실시예 5: FACS에 의해 항원-특이적 B 세포의 선별
항-ICOS 항체를 발현하는 B-세포는국제특허출원 WO2015/040401의 실시예 1에 기술된 바와 같은 기법을 실질적으로 사용하여 면역화된 마우스로부터 회수하였다. 간략하게, 면역화 요법으로부터 격리된 비장 세포 및/또는 림프절 세포를 관심있는 세포 (CD19)를 선택하기 위한 마커를 포함하는 항체 칵테일로 염색하는 반면, 불필요한 세포는 최종 선별된 집단으로부터 제외시켰다 (IgM, IgD, 7AAD). CD19+ B 세포를 형광-태그화 인간 ICOS ECD-Fc 이량체 및 형광-태그화 마우스 ICOS ECD-Fc로 추가로 표지하여 항-ICOS 항체를 생산하는 B 세포를 검출하였다. 인간 및 마우스 ICOS의 형광 표지화는 각각 AlexaFluor647 및 AlexaFluor488을 사용하였다 - 실시예 6 참조. 인간 ICOS 또는 인간 및 마우스 ICOS 둘 다에 결합하는 세포가 선별되었다. 이들 세포는 FACS에 의해 용해 완충액으로 분류된 단일 세포였다. V-영역 서열은 RT-PCR 및 두 번 이상의 추가 PCR을 사용하여 회수한 다음, 마우스 IgG1 불변 영역에 가교 결합시키고 HEK293 세포에서 발현시켰다. HEK293 세포로부터의 상청액을 ICOS 결합 및 기능성 항체의 존재에 대해 스크리닝하였다. 이 방법을 본원에서 이하 BCT라고 지칭한다.
실시예 6: BCT로부터 항체의 스크리닝
재조합 인간 및 마우스 ICOS - Fc에 대한 결합을 위한 BCT 상청액의 HTRF 스크리닝
실시예 5에서 BCT로부터 수집된 상청액을 재조합 단백질로서 발현된 인간 ICOS Fc 및 마우스 ICOS Fc에 결합하는 분비된 항체의 능력에 대해 스크리닝하였다. 재조합 인간 및 마우스 ICOS에 대한 분비된 항체의 결합은 FluoProbes®647H (Innova Biosciences) 표지된 ICOS (본원에서 FluoProbes®647로 표지된 인간 ICOS 및 마우스 ICOS 각각의 경우 647 hICOS 또는 647 mICOS라고 지칭됨)을 사용하여 HTRF® (균질한 시간 분해 형광, Cisbio) 검정법 형식에 의해 확인되었다. 5 μL의 BCT 상청액을 흰색 384-웰, 저-부피, 비-결합 표면 폴리스티렌 플레이트 (Greiner)로 옮겼다. HTRF 검정 완충액으로 희석된 20 nM 647 hICOS 또는 647 mICOS 5 μL을 모든 웰에 첨가하였다. 인간 ICOS 결합 검정을 위해 기준 항체를 BCN 배지 (Gibco # A14351-01)에서 120 nM으로 희석하고 5 μL를 플레이트에 첨가하였다. 인간 ICOS 결합 분석을 위한 음성 대조군 웰의 경우, 마우스 IgG1 (시그마 9269, 일부 경우에는 CM7이라고 지칭됨) 5 μL을 BCT 배지에서 120 nM로 희석하였다. 마우스 ICOS 결합 검정의 경우 기준 항체를 BCN 배지 (Gibco # A14351-01)에서 120 nM으로 희석하고 5 μL를 플레이트에 첨가하였다. 마우스 IgG2b 이소형 대조군 (R & D 시스템)을 BCT 배지로 120 nM로 희석하여 5 μL을 음성 대조군 웰 (R & D Systems)에 첨가하였다. 인간 ICOS에 대한 분비된 항체의 결합은 HTRF 검정 완충액에서 1/2000으로 희석된 유로피움 크립테이트 (Cisbio)로 직접 표지된 염소 항-마우스 IgG (Southern Biotech) 10 μL를 첨가하여 검출하였다. 마우스 ICOS 결합 검정의 경우, 5 μL의 마우스 항-래트 IgG2B-UBLB (Southern Biotech)를 양성 및 음성 대조군 웰에 첨가하고, 5 μL의 HTRF 검정 완충액을 플레이트의 다른 모든 웰에 첨가하였다. 다음으로 HTRF 검정 완충액에서 1/1000 희석된 유로피움 크립테이트 (Cisbio)로 직접 표지된 염소-항 마우스 IgG (Southern Biotech) 5 μL를 첨가하여 결합을 검출하였다. 플레이트를 엔비젼 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)를 사용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장, 100회 플래쉬에서 시간 분해된 형광을 판독하기 전에 2시간 동안 암소에서 배양하였다.
데이타는 각각 공식 2 및 공식 1에 따라 각각의 시료에 대한 665/620 비율 및 효과 백분율을 계산함으로써 분석되었다.
KM103 및 KM11-B1의 경우, 일차 히트가 인간 및 마우스 ICOS에 대한 결합에 대해 5% 이상의 효과에 기초하여 선택되었다. KM135의 경우, 일차 히트가 인간 및 마우스 ICOS에 대한 결합에 대해 10% 이상의 효과에 기초하여 선택되었다. KM111-B2의 경우, 일차 히트가 인간에 대한 결합에 대해 4% 이상의 효과 및 마우스 ICOS에 대한 결합에 대해 3% 이상의 효과로서 정의되었다.
공식 1: 일차 스크리닝 엔비전 세포 결합 및 HTRF로부터 효과 백분율의 계산
웰 비율 값 (공식 3) 또는 665/620 nm 비율 (공식 2 참조) (HTRF)
비-특이적 결합 = 이소형 대조군 마우스 IgG1을 포함하는 웰로부터의 값총 결합 = 기준 항체를 포함하는 웰로부터의 값
공식 2: 665 /620 비율의 계산
665/620 비율 = (시료 665/620 nm 값) Х 10,000
공식 3: 647 / FITC 비율의 계산
데이타는 먼저 "웰 비율"를 얻기 위해 mAb 채널 (647)을 FITC (세포 염색) 채널로 나누어 세포 수를 정상화하였다:
세포-발현된 인간 및 마우스 ICOS에 대한 결합을 위한 BCT 상청액의 스크리닝
실시예 5에서 BCT로부터 수집된 상청액을 CHO-S 세포의 표면 상에 발현된 인간 또는 마우스 ICOS에 결합하는 분비된 항체의 능력에 대해 스크리닝하였다. CHO-S 인간 및 마우스 ICOS 결합을 결정하기 위해, 세포를 검정색-벽, 투명-바닥 조직 배양 처리된 384-웰 플레이트 (퍼킨 엘머)에서 10% FBS (Gibco)로 보충된 F12 배지 (Gibco)에서 4 x 104/웰로 도말하였고, 밤샘 동안 배양하였다. 384 웰 분석 플레이트로부터 배양 배지를 제거하였다. 적어도 50 μL의 BCT 상청액 또는 BCT 배지에서 2 μg/mL의 50 μL 기준 항체 또는 BCT 배지에 희석된 2 μg/mL 최종 농도의 이소형 IgG1 대조군 항체 (일부 경우에 Cm7, 시그마 M9269라고 지칭함)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4°C에서 1시간 동안 배양하였다. 상청액을 흡인하고 이차 항체 완충액 (1X PBS + 1% BSA + 0.1% 소듐아자이드)으로 1 : 500 희석된 유성 녹색 DNA 염색 (Life Technologies)으로 5 μg/ml의 염소 항-마우스 647 (Jackson immunoresearch) 50 μL이 첨가되어 항체 결합을 검출하고 세포를 가시화하였다. 플레이트를 4°C에서 1시간 동안 배양하였다. 상청액을 흡인하고 4% v/v 파라포름알데히드 25 μL을 첨가하여 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양하였다. 플레이트를 100 μL PBS로 두 번 세척한 후 세척 완충액을 완전히 제거하였다. FITC (여기 494nm, 방출 520nm) 및 알렉사플루오르 647 (여기 650nm, 방출 668nm)을 측정하는 엔비젼 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)를 사용하여 형광 강도를 측정하였다. 검정 신호는 공식 3에서 기술된 바와 같이 결정되고 효과 백분율은 공식 1에서와 같다. 총 결합은 2 μg/mL의 최종 검정 농도에서 기준 항체를 사용하여 정의하였다. 2 μg/mL의 최종 검정 농도에서 마우스 IgG1 이소형 대조군 (Sigma)을 사용하여 비-특이적 결합을 정의 하였다. 히트 선별 판정기준은 검정 신호 및 백분율 효과를 기초로 한다.
KM103, KM111-B1 및 KM135의 경우 일차 히트는 10% 이상의 효과를 기초로 하여 선별되었다. KM111-B2의 경우 일차 히트는 4% 이상의 효과를 기초로 하여 선별되었다.
일차 스크리닝 결과의 요약
표 E6. 예방 접종으로부터 선별된 BCT 상청액의 수 및 인간 및 마우스 ICOS에 대한 결합의 일차 스크리닝 선별 판정기준을 충족하는 상청액의 수의 요약.세포 발현된 인간 및 마우스 ICOS에 대한 결합을 위한 FACS 스크리닝
실시예 5의 BCT 상청액 및 HEK293 발현된 항체를 인간 또는 마우스 ICOS를 발현하는 CHO-S 세포에 결합하는 능력에 대해 테스트하였다.
인간 또는 마우스 ICOS를 발현하는 CHO-S 세포 (실시예 2 참조)를 FACS 완충액 (PBS 1% BSA 0.1% 소듐 아자이드)에서 희석하고, 96-웰, V-바닥 플레이트 (Greiner)에 웰 당 1 Х 105개 세포의 밀도로 배분하였다. 세포를 150 μL PBS로 세척하고 300 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 상청액 스크리닝을 위해 상청액을 흡인하고 150 μL PBS를 첨가하였다. 이 세척 단계가 반복되었다. 30 μL BCT 미희석된 상청액 또는 기준 항체 또는 대조군 항체 50 μL를 BCT 배지에서 5 μg/ml로 희석하여 세척된 세포에 첨가하였다. 세포를 4°C에서 60분 동안 배양하였다. 150 μL FACS 완충액을 첨가하고 상기 기술한 바와 같이 세포를 세척하였다. 항체 결합을 검출하기 위해, FACS 완충액에서 2 μg/ml로 희석된 염소 항-마우스 APC (Jackson ImmunoResearch) 50 μL을 세포에 첨가하였다. 세포를 4°C에서 60분 동안 배양하였다. 세포를 150 μL FACS 완충액으로 두 번 세척하고, 각 세척 단계 후 3분 동안 300 g에서 원심분리하고 상청액을 흡인하였다. 실온에서 20분 동안 25 μL 4% 파라포름알데히드를 첨가하여 세포를 고정시켰다. 세포를 상기와 같이 한 번 세척하고 분석을 위해 FACS 완충액에 재현탁시켰다. APC 신호 강도 (기하 평균)는 BD FACS 어레이 장비를 사용하여 유세포 계측법으로 측정하였다. 데이타는 추가의 계산 없이 기하 평균값으로서 좌표화하였다.
항체의 작은 하위집합는 일차 스크리닝과 비교하여이 추가의 스크리닝에서 더 엄격한 종 교차-반응성 판정기준을 충족시키는 것으로 선택되었다. 간략하게:
KM103에서, hICOS, mICOS 및 WT CHO 세포에 결합하는 하이브리드 대조군의 평균 기하 평균을 취하여 4배를 초과하는 마우스 및 인간 결합체를 확인함으로써 4개의 항체를 선택하였다. 이들 4개 항체를 STIM001, STIM002-B, STIM007 및 STIM009로 명명하였다.
KM111-B1에서, hICOS, mICOS 및 WT CHO 세포에 결합하는 음성 대조군 (아르메니안 햄스터: 클론 HTK888)의 평균 기하 평균을 취하여 10배를 초과하는 마우스 및 인간 결합체를 확인함으로써 4개의 항체를 선택하였다.
KM111-B2에서, hICOS, mICOS 및 WT CHO 세포에 결합하는 음성 대조군 (아르메니안 햄스터: 클론 HTK888)의 평균 기하 평균을 취하여 4배를 초과하는 마우스 및 인간 결합체를 확인함으로써 4개의 항체를 선택하였다. 이들 4개 항체는 STIM003, STIM004 및 STIM005를 포함하였다.
KM135에서 교차-반응성 항체는 확인되지 않았다. FACS 이차 스크리닝 방법의 기술적 실패로 인해, SPR 및 HTRF를 사용한 스크리닝도 수행되었지만, 원하는 교차-반응성 수준을 충족시키는 항체가 발견되지 않았다.
결론적으로, 실시예 3에 기술된 다양한 다중 면역화 요법으로부터, (ICOS KO 마우스에서만 유래한) 4000 BCT 상청액을 인간 ICOS 및 마우스 ICOS에 대한 결합에 대해 스크리닝하였고, STIM001, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM007 및 STIM009를 포함하는 작은 후보 패널이 향후 개발을 위해 가장 유망한 특징을 가지는 것으로서 확인되었다. 이들은 더 자세한 특성화를 위해 나아갔다.
별도로, 종 교차-반응성 판정기준을 충족시키지 못하는 두 개 항체 STIM006 및 STIM008도 역시 인간 ICOS와 결합하는 이들의 능력에 기초하여 추가의 특성화를 위해 선택되었다.
실시예 7: 표면 플라스몬 공명에 의한 친화성 결정 ( SPR )
선도 ICOS의 Fab 친화성은 ProteOn XPR3 6 (BioRad)을 사용한 SPR에 의해 생성되었다. 항-인간 IgG 포획 표면은 세 개의 항-인간 IgG 항체 (Jackson Labs 109-005-008, 109-006-008 및 309-006-008)를 고정화시킨 일차 아민 커플링에 의해 GLC 바이오센서 칩 상에 생성되었다. 인간 Fc 태그화 인간 ICOS (hICOS) 및 마우스 ICOS (mICOS)를 항-인간 IgG 표면에서 개별적으로 포획하였고, 정제된 Fab를 5000 nM, 1000 nM, 200 nM, 40 nM 및 8 nM에서 분석물로서 사용하였고, 예외로 STIM003은 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM 및 2 nM에서 사용하였다. 결합 센서그램은 완충액 주입을 사용하여 이중 기준화되었고 (예로, 0 nM), 데이타는 ProteOn XPR36 분석 소프트웨어에 내재된 1 : 1 모델에 맞추었다. 분석은 25oC에서 BS-EP를 전개 완충액으로서 사용하였다.
표 E7-1. SPR에 의해 측정된 바와 같이 선택된 항체의 친화성 및 동역학 데이타
또한, 상이한 pH 값에서 항체 : 항원 결합 친화성의 비교가 수행되었다. 이전과 같이, 인간 Fc 영역에 융합된 ICOS의 세포외 도메인으로서 제시된 이량체 인간 ICOS 단백질은 일차 아민 커플링에 의해 GLC 바이오센서 칩 상에 고정화된 3개 항체 칵테일을 사용하여 생성된 항-인간 Fc 포획 표면 상에 포획되었다. 재조합으로 발현된항-ICOS Fab의 SPR 분석을 ProteOn XPR36 어레이 시스템 (Biorad)에서 수행하였다. Fab 단편은 결합 센서그램을 생성하는 데 분석물로서 사용되었으며, 이는 완충액 주입 (예로, 0 nM)으로 이중 기준화되었다. 후속의 기준화 센서그램은 ProteOn 분석 소프트웨어에 내재된 1 : 1 모델에 맞추었다. 표 E7-2는 항체에 대한 친화성 및 동역학 데이타를 나타내며, 명시되지 않는 한 37oC에서 HBS-EP를 pH 7.4/7.6 또는 pH 5.5에서 사용하여 실행된다. 데이타는 1 : 1 모델에 맞추었다. STIM002의 데이타는 pH 7.4와 5.5에서 1 : 1 모델에 잘 맞지 않았던 점을 언급하고, 따라서 이 항체에 대한 친화성은 표에 표시된 것보다 낮을 수 있다．
표 E7-2. 명시된 경우 제외하고 37oC에서, STIM001, STIM002, STIM002-B 및 STIM003 Fab의 재조합 인간 ICOS에 대한 상대적 친화성,.
상이한 pH 값에서의 친화성 데이타의 비교는 항체가 생리학적 pH 범위에 걸쳐 이들의 표적에 대한 결합을 유지하는 것을 나타냈다. 종양 미세환경은 혈액과 비교하여 상대적으로 산성일 수 있어, 낮은 pH에서 친화성의 유지가 생체내에서 종양내 T-reg 고갈을 개선하는 잠재적인 이점이다．
실시예 8: HTRF에 의해 검정된 ICOS 수용체에 대한 ICOS 리간드의 중화
선택된 항-ICOS 항체를 균질한 시간 분해 형광 (HTRF)을 사용하여 ICOS에 결합하는 ICOS 리간드 (B7-H2)를 중화시키는 능력에 대해 추가로 평가하였다. 단일클론 항체의 인간 IgG1 및 인간 IgG4.PE (무효-효과기) 이소형은 다음에서 평 하였다:
- 인간 ICOS에 대한 인간 B7-H2 결합의 중화에 대한 HTRF 분석; 및
- 마우스 ICOS에 대한 마우스 B7-H2 결합의 중화에 대한 HTRF 분석.
비교를 위해 항-ICOS 항체 C398.4A (각 경우에 햄스터 IgG)를 포함하였다.
다수의 항체가 인간 및/또는 마우스 ICOS 수용체-리간드 결합에 대해 높은 중화 효능을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이들 항체 중 일부는 양호한 교차-반응성을 나타냈다. 항체 이소형은 유의한 효과가 없었으며, IgG1 및 IgG4.PE 검정 간의 결과의 차이는 실험 오차 이내에 있었다.
IgG1
인간 IgG1 검정에서, 항체 C398.4A는 인간 ICOS 리간드의 중화에 대해 1.2 ± 0.30 nM의 IC50 및 마우스 ICOS 리간드의 중화에 대해 0.14 ± 0.01 nM의 IC50을 생성하였다.
IgG1 mAb STIM001, STIM002, STIM003 및 STIM005는 인간 ICOS 리간드 중화 시스템을 사용하여 C398.4A와 유사한 IC50를 생성하였으며 마우스 ICOS 수용체에 대한 마우스 ICOS 리간드의 결합도 중화시켰다.
STIM002-B 및 STIM004의 두 개의 교차-반응성 단일클론 항체는 인간 및 마우스 ICOS 리간드 중화가 약하였다.
STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009는 인간 ICOS 리간드의 중화를 나타내지만 마우스 ICOS 리간드 중화 시스템에서는 유의한 교차-반응성을 나타내지 않았다. 마우스 B7-H2 리간드의 중화 IC50 값은 이들 항체에 대해 계산될 수 없었다.
표 E8-1. 인간 B7-H2에 결합하는 인간 ICOS 수용체의 중화에 대한 인간 IgG1 이소형 단일클론 항체의 IC50 값. 또한 도 2 참조.
표 E8-2. 마우스 B7-H2에 결합하는 마우스 ICOS 수용체의 중화에 대한 인간 IgG1 이소형 단일클론 항체의 IC50 값. 또한 도 3 참조.IgG4.PE
예상된 바와 같이, IgG4.PE mAb는 IgG1 이소형과 유사한 결과를 생산하였다.
STIM001, STIM003 및 STIM005는 인간 ICOS 리간드 중화 시스템을 사용하여 C398.4A와 유사한 IC50 값을 나타내었다. 이들 mAb는 또한 중화 마우스 ICOS 리간드에서 교차-반응성이었다. STIM002-B 및 STIM004는 인간 ICOS B7-H2 중화 및 마우스 B7-H2 리간드에 대해 보다 약한 IC50 값을 나타냈다. STIM007, STIM008 및 STIM009는 인간 ICOS 수용체에 대한 인간 ICOS 리간드 결합의 중화를 나타내지 만, 마우스 B7-H2 리간드에 대한 중화 IC50 값은 이들 검정에서 계산될 수 없었다.
STIM006 및 STIM002의 IgG4.PE 이소형은 검정되지 않았다.
표 E8-3. 인간 B7-H2에 결합하는 인간 ICOS 수용체의 중화에 대한 인간 IgG4.PE 이소형 단일클론 항체의 IC50 값. 또한 도 4 참조.
표 E8-4. 마우스 B7-H2에 대한 마우스 ICOS 수용체의 중화에 대한 인간 IgG4.PE 이소형 단일클론 항체의 IC50 값. 또한 도 5 참조.재료 및 방법
테스트 항체 및 이소형 대조군을 1 : 3 희석으로 11개 지점 적정에 걸쳐 시작 작동 농도부터 4 μM까지, 1 μM 내지 최종 0.002 nM, 5.64e-4 nM 검정 완충액 (1x PBA에서 0.53 M 칼륨 불화물 (KF), 0.1% 소혈청 알부민 (BSA))으로 희석하였다. 항체 5 μL의 적정을 384w 흰색벽 검정 플레이트 (Greiner Bio-One)에 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 5 μL의 검정 완충액만을 받았다.
5 μL의 ICOS 수용체 (인간 ICOS-mFc, 20 nM, 5 nM 최종 또는 마우스 ICOS-mFc 4 nM, 1 nM 최종 (Chimerigen))를 필요한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온 (RT)에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, Alexa 647 (Innova Bioscience)에 컨쥬게이션된 마우스 또는 인간 ICOS 리간드 (B7-H2, R & D Systems) 5 μL을 인간 B7-H2의 경우 32 nM (최종 8 nM) 또는 마우스 B7-H2의 경우 30 nM, 최종 7.5 nM로 희석하였고, 5 μL의 검정 완충액을 대신 받은 음성 대조군 웰을 제외하고 검정 플레이트의 모든 웰에 첨가하였다.
마지막으로, 유로피움 크립테이트 (Cis Bio) 40 nM, 최종 10 nM으로 표지된 5 μL의 항-마우스 IgG 공여자 단일클론 항체 (Southern Biotech)를 각 웰에 첨가하고 검정을 실온으로 암실에서 방치하여 추가로 2시간 동안 배양하였다. 항온 배양 후, 표준 HTRF 프로토콜을 사용하여 엔비전 플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 상에서 검정을 판독하였다. 620 nm 및 665 nm 채널 값을 마이크로소프트 엑셀 (Microsoft) 및 델타-F%로 내보내고 % 중화 계산%을 수행하였다. 적정 곡선 및 IC50 값 [M]은 그래프패드 (프리즘)를 사용하여 좌표화하였다. IC50 값은 먼저 공식 X = 로그 (X)를 사용하여 데이타를 변환함으로써 계산되었다. 다음으로 피팅 알고리즘, 로그 (저해제) 대비 반응-가변 경사 (네 개의 매개변수)를 사용한 비선형 회귀를 사용하여 변형된 데이타를 맞추었다.
덜타-F% 계산:
비율 측정 데이타 감소를 위한 665/620nm 비율.
신호 음성 대조군 = 최소 신호 비율의 평균.
중화%:
실시예 9a: T- 세포 활성화
사이토카인 생산에 미치는 STIM001 및 STIM003 작동제 잠재력을 항-CD3 및 항-CD28 Ab가 항-ICOS Ab에 동시에 첨가되어 효과기 T-세포에서 ICOS 발현을 유도하는 인간 일차 T- 세포 활성화 검정에서 플레이트-결합 및 용해성 형식으로 테스트하였다. 이들 활성화된 T-세포에 의해 생성된 IFNγ의 수준에 미치는 ICOS 공동-자극의 효과를 활성화 후 72시간째에 ELISA를 사용하여 평가하였다.
재료 및 방법
T-세포 활성화 검정 1:
인간 말초 혈액 (PBMC)으로부터 단핵 세포의 분리:
백혈구 콘을 건강한 공여자로부터 수집하고 인산염 완충 식염수 (PBS, Gibco)로 이의 함량을 50 ml까지 희석하고 15 ml 피콜-파크 (GE Healthcare) 최상단의 두 개의 원심분리 튜브 내에 층상화하였다. PBMC를 밀도 구배 원심분리 (브레이크 없이 40분 동안 400 g)에 의해 분리시키고, 깨끗한 원심분리 튜브에 옮긴 다음, 50 mL PBS로 세척하고, 5분 동안 300 g에서 두 번 원심분리하고, 5분 동안 200 g에서 두 번 원심분리하였다. 다음으로 PBMC를 R10 배지 (RPMI+ 10% 열-비활성화된 우태아 혈청, 둘 다 Gibco)에서 재현탁하고, 이들의 세포 수 및 생존율을 EVETM 자동화 세포 계수기 (NanoEnTek)로 평가하였다.
ICOS 항체 (Ab) 제조 및 희석:
STIM001 및 STIM003는 3개 형식으로 테스트되었다: 플레이트-결합, 용해성 또는 항-ICOS Ab를 교차결합하는 용해성 + F(ab')2 단편 (109-006-170, Jackson Immuno Research).
플레이트-결합 형식의 경우: 항-ICOS Ab 및 이들의 이소형 대조군은 PBS에서 1 : 3으로 희석되어 45 내지 0.19 μg/mL 범위의 최종 항체 농도를 얻었다. 희석된 항체 100 μL를 96-웰l, 고-결합 평면바닥 플레이트 (Corning EIA/RIA 플레이트)에 4°C에서 밤샘 동안 두 벌로 코팅하였다. 이어서 플레이트를 PBS로 세척하고 125 μL의 R10을 각 웰에 첨가하였다.
용해성 형식의 경우: 항-ICOS Ab 및 이들의 이소형 대조군을 R10 배지에서 1 : 3으로 희석하여 90 내지 0.38 μg/mL 범위의 2X Ab 스톡 농도를 얻었다. 125 μL의 희석된 Ab를 96-웰 평평-바닥 플레이트에 두 벌로 피펫팅하였다.
교차 결합된 용해성 형식의 경우: 항-ICOS Ab 및 이들의 이소형 대조군은 1 M 대비 1 M 비율에서 F(ab')2 단편과 혼합하였다. 다음으로 Abs/F(ab')2 단편 혼합물을 R10 배지에서 1 : 3으로 희석하여 ICOS의 경우 90 내지 0.38 μg/mL 범위, F(ab')2의 경우 60 내지 0.24 μg/mL 범위의 2X Ab 농도를 얻었다. 125 μL의 희석된 Ab를 96-웰 평평-바닥 플레이트에 두 벌로 피펫팅하였다.
T 세포 분리, 배양 및 IFN-γ 정량화:
T-세포는 EasySep 인간 T 세포 분리 키트 (Stemcell Technologies)를 사용하여 PBMC로부터 음성적으로 분리되었고, 40 μl/ml의 다이나비드 인간 T-활성인자 CD3/CD28 (Life Technologies)가 보충된 R10 배지에서 2x106개/mL로 재현탁되었다.
T-세포 현탁액 125 μL를 Ab-포함 플레이트에 첨가하여 1 Х 106개 세포/mL의 최종 농도를 얻었고, 37°C 및 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 다음으로 세포가 없는 상청액을 수집하여 ELISA (R & D의 듀오세트 키트)에 의해 분비된 IFNγ를 분석할 때까지 -20°C에서 보관하였다.
이 실험을 6명의 독립적인 공여자로부터 단리된 T 세포로 반복하였고, 2벌의 기술적 사본이 각각의 검정 조건에 포함되었다.
T-세포 활성화 검정 2 ( STIM -REST- STIM 검정):
사이토카인 방출에 미치는 STIM001 및 STIM003 작동제 잠재력은 또한 T-세포가 3일 동안 항-CD3 및 항--CD28 Ab에 의해 미리 자극되어 3일 동안 휴식되어 이들의 활성화 수준을 감소시키기 전에 ICOS 발현을 유도하는 인간 T 세포 검정에서 플레이트-결합으로 테스트되었다. ICOS 발현은 자극 (3일) 및 휴식 (6일) 후 FACS 염색에 의해 검증되었다. 다음으로 이들 자극된 휴식 T 세포를 CD3 Ab의 존재 또는 부재 시 STIM001 또는 STIM003과 배양하여 TCR 관여의 요건을 평가하였다. 배양물에 존재하는 IFNγ, TNFα 및 IL-2의 수준에 미치는 ICOS 보조자극의 효과를 72시간 후에 평가하였다.
ICOS Ab 희석 및 코팅:
항-인간 CD3 (eBioscience, 클론 UCHT1)을 PBS에서 10 μg/mL의 2X Ab 농도로 희석하였다. PBS 50 μL 또는 희석된 CD3 Ab 50 μL을 96-웰, 고-결합 평면바닥 플레이트에 피펫팅하였다. STIM001, STIM003 및 이들의 이소형 대조군을 PBS로 1 : 2로 희석하여 최종 2X 항체 농도를 20 내지 0.62 μg/mL 범위로 얻었다. 희석된 항-ICOS Ab 50 μL를 PBS (TCR 관여 없음) 또는 희석 CD3 Ab (TCR 관여)를 포함하는 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밤샘 동안 4°C에서 코팅하였다.
T 세포 분리, 배양 및 IFN-γ 정량화:
백혈구 콘으로부터의 PBMC는 T-세포 활성화 검정 1에서 기술한 바와 같이 획득되었다. T-세포는 EasySep 인간 T 세포 분리 키트 (Stemcell Technologies)를 사용하여 이 PBMC로부터 음성적으로 분리되었다. T-세포는 20 μl/ml의 다이나비드 인간 T-활성인자 CD3/CD28 (Life Technologies)가 보충된 R10 배지에서 1 x 106개/mL로 재현탁되었고, 37°C 및 5% CO2에서 3일 동안 배양되었다 (자극). 3일째에 다이나비드가 배양물에서 제거되었다. 다음으로 T-세포를 세척하고 (300 g 5분), R10 배지에서 1.5 x 106개/mL로 계수하여 재현탁하고 추가 3일 동안 37°C 및 5% CO2에서 배양하였다 (휴식 단계).
자극되고 6일째에 휴식 T 세포는 다음으로 세척되고 (300 g 5분), 계수되어 R10 배지에서 1 x 106개/mL로 재현탁되고, T 세포 현탁액 250 μL을 ICOS AB-코팅 플레이트에 첨가하여 37°C 및 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 세포가 없는 상층액 을 수집하여 MSD 플랫폼에서 분비된 사이토카인을 분석할 때까지 -20°C에서 유지하였다.
이 실험을 5명의 독립적인 공여자로부터 단리된 T 세포로 반복하였고, 3벌의 기술적 사본이 각 검정 조건에 포함되었다.
결과
STIM001 및 STIM003 모두가 IFNγ 발현 유도에 양성으로 테스트되어 두 검정 모두에서 작동기작을 입증하였다.
실시예 9B: T 세포 활성화 검정 1 데이타
인간의 IgG1 형식의 STIM001 및 STIM003 각각을 테스트하는 T 세포 활성화 분석 1을 8개의 독립적인 공여자로부터 단리된 T 세포를 사용하여 실시예 9a에서 설명한 바와 같이 수행하였다. 비교를 위해 햄스터 항-ICOS 항체 C398.4A 및 햄스터 항체 이소형 대조군을 포함시켰다. 각 분석 조건을 위한 2벌의 사본이 포함되었다.
결과는 도 16, 도 17 및 도 18에 나타낸다. 이전에 언급한 바와 같이, STIM001 및 STIM003 모두는 IFNγ 발현 유도에 양성으로 테스트되어, 인간 일차 T 세포에 미치는 작동제 효과를 입증하였다.
Fc-연결 F(ab')2 단편의 존재 시에 IFNγ 유도의 강한 증진에 의해 나타난 바와 같이 교차-연결된 항체는 용해성 항체 또는 대조군 둘 중 하나와 비교하여 T 세포 활성화의 작동제로서 작용하였다. T 세포의 IFNγ 발현은 교차-연결된 STIM001 또는 STIM003의 농도가 증가함에 따라 증가하였다 (도 16, 하단 패널). 작동기작은 항체 농도가 증가함에 따라 T 세포에서 관찰된 IFNγ 발현의 증가에 의해 나타난 바와 같이 플레이트-결합 형태에서 STIM001 및 STIM003 둘 다의 경우 및 더 약하게는 햄스터 항체 C398.4A의 경우에 또한 관찰되었다 (도 16, 최상단 패널).
IFNγ 반응의 크기는 다른 공여자로부터 얻은 T 세포 사이에 다양했지만, STIM001은 대조군 항체 (HC IgG1)로 관찰된 IFNγ 발현과 비교하여 T 세포에서 지속적으로 IFNγ 발현을 증가시켰다. 모두 8명의 공여자로부터의 T 세포를 이용한 검정법으로부터의 데이타를 고려할 때, STIM001으로 T 세포를 처리하면 플레이트-결합 형태, 용해성 형태 및 교차-연결된 형태에서 이소형 대조군 항체와 비교하여 IFNγ 발현이 유의하게 증가하는 것이 관찰된다 (도 17). 따라서 STIM001은 세 가지 형식 모두에서 T 세포 활성화의 작동제로 행동하였다.
유사한 효과가 STIM003으로 관찰되었다 (도 18). STIM003 hIgG1에 의해 유도된 IFNγ의 수준을, 8명의 독립적인 공여자의 경우 검정법의 항체의 주어진 용량에서 이의 이소형 대조군 (HC IgG1)에 의해 유도된 IFNγ의 수준과 비교하였다. 공여자 간의 다양성에도 불구하고, STIM003에 의해 유도된 IFNγ 수준의 평균 증가는 HC IgG1와 비교할 때 유의하였다. STIM001 및 본원에 설명된 다른 STIM 항체가 생체내에서 T 세포 활성화를 유사하게 촉진할 수 있는 잠재력을 가진 것으로 제안된다. 이전에 논의된 바와 같이, 활성화된 ICOS-발현 T 세포의 작동기작은 T 세포 표면 상의 ICOS 수용체에 결합하여 다량체화를 유도하는 항-ICOS 항체에 의해 매개될 수 있다. 실시예 9c: T 세포 활성화 검정 2 데이타
T 세포 활성화 검정 2는 실시예 9a에 기술된 바와 같이 수행하였다.
TCR 관여의 부재 시 (항-CD3 항체 없음), 일차 T 세포로부터 생산된 사이토카인의 수준은 낮았으며, 10 μg/ml의 가장 높은 농도에서도 STIM001 (hIgG1), STIM003 (hIgG1) 또는 항체 C398.4A에 의해 유도된 증가는 없었다. 대조적으로, 항-ICOS 항체를 항-CD3 항체와 조합하여 T 세포에 첨가하였을 때, STIM001 (hIgG1), STIM003 (hIgG1) 및 C398.4A 각각은 IFNγ, TNFα 및 낮은 정도로 IL-2의 발현을 증가시키도록 용량-의존적 경향을 보여주었다.
TCR 관여 조건 하에서 항-ICOS 항체로 처리한 일차 T 세포의 데이타로부터의 데이타는 도 19에 나타내었다. STIM001, STIM003 및 C389.4A 각각의 경우 각각의 이소형 대조군와 비교하여 사이토카인 발현의 현저한 증가가 관찰되었지만, 이 검정에서 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 더 많은 공여자로부터의 반응성 일차 T 세포로의 검정의 추가 사본은 통계적으로 유의한 결과를 가져올 것으로 예상될 수 있다.
실시예 10a: ADCC 검정
ADCC를 통해 살상할 수 있는 STIM001 및 STIM003 잠재력을 효과기로서 인간 일차 NK 세포 및 표적 세포로서 고ICOS MJ 세포주 (ATCC, CRL-8294)를 사용하여 델피아 BATDA 세포독성 검정법 (Perkin Elmer)에서 테스트하였다. MJ 세포는 높은 수준의 ICOS 단백질을 발현하는 인간 CD4 T-림프구 세포이다.
이 방법은 신속하게 세포막을 투과하는 형광 증진 리간드 (BATDA)의 아세톡시메틸 에스테르로 표적 세포를 로딩하는 것에 기초한다. 세포 내에서 에스테르 결합은 가수분해되어 더 이상 막을 통과하지 않는 친수성 리간드 (TDA)를 형성한다. 세포 분해 후, 리간드가 방출되고, BATDA와 함께 높은 형광 및 안정한 킬레이트 (EuTDA)를 형성하는 유로피움을 첨가함으로써 검출될 수 있다. 측정된 신호는 용해된 세포의 양과 직접적으로 상관 관계가 있다．
재료 및 방법
표적 세포 표지화:
제조사의 사용 설명서에 따르면, MJ 세포는 검정 배지 (RPMI + 10% 초저 IgG FBS, Gibco)에서 1 x 106개/mL로 재현탁하고 Delfia BATDA 시약 (Perkin Elmer) 5 μl/mL과 함께 37°C에서 30분 동안 로딩되었다. 다음으로 MJ 세포는 50 mL PBS (5분 300 g)로 3번 세척하고, 세포로부터 BATDA 자발적 방출을 줄이도록 2 mM 프로베네시드 (Life technologies)가 보충된 검정 배지에 8 x 105/mL로 재현탁하였다.
ICOS Ab 희석:
STIM001, STIM003 및 이들의 이소형 대조군은 검정 배지+ 2 mM 프로베네시드에서 1 : 4 일련 희석되어 80 pg/mL까지의 범위에 걸쳐 최종 4X 항체 농도를 얻었다.
NK 세포 분리 및 배양:
백혈구 콘으로부터의 PBMC는 T-세포 활성화 검정 1에서 기술한 바와 같이 획득되었다. EasySep 인간 NK 세포 분리 키트 (Stemcell Technologies)를 사용하여 NK 세포를 이 PBMC로부터 음성적으로 분리하고 R10 배지+ 2 mM 프로베네시드에서 4 x 106개/ml로 재현탁하였다. NK 세포 순도는 CD3-/CD56+에 대한 염색에 의해 90% 초과인 것으로 확인되었다.
50 μl의 희석된 Ab, 50 μl의 BATDA 로딩된 MJ 세포, 50 μl의 NK 세포 및 50 μl의 검정 배지 + 2 mM 프로베네시드 (최종 부피 200 μl/웰)를 각 웰에 첨가하여 20 pg/mL까지의 범위에 걸친 최종 Ab 농도 및 효과기 : 표적 비율 5 : 1를 얻었다. MJ 세포 단독 또는 MJ 세포+ 델피아 용해 완충액 (Perkin Elmer)을 포함하는 웰을 사용하여 자발적 및 100% BATDA 방출을 결정한다.
이 검정은 DELFIA 마이크로적정 플레이트 (Perkin Elmer)에 세포가 없는 상청액 50 μl를 옮기기 전에 2시간 동안 37°C, 5% CO2에서 실행되었다. 200 μL의 델피아 유로피움 용액 (Perkin Elmer)을 상청액에 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양하였다. 다음으로 엔비전 다중표지 판독기 (PerkinElmer)로 형광 신호를 정량화하였다.
STIM001 및 STIM003에 의해 유도된 특이적 방출은 키트 사용 설명서에 따라 계산되었다. 이 실험을 독립적인 공여자로부터 단리된 NK 세포로 반복하였고, 3벌의 기술적 사본이 각 검정 조건에 포함되었다.
결과
항-ICOS 항체 STIM001 (hIgG1) 및 STIM003 (hIgG1)은 일차 NK 의존성 ADCC 검정법 (2시간 시점)에서 ICOS 양성 인간 MJ 세포를 살상한다. 또한 도 6a 참조. 이 검정법에서 나노몰 이하의 EC50가 테스트된 둘 다의 분자의 경우에 달성되었다.
표 E10-1: 2명의 공여자 (2시간 시점)로부터의 NK 일차 세포 ADCC 검정에서 STIM001의 EC50 (몰 단위).
실시예 10b: MJ 표적 세포로의 ADCC 검정
실험은 실시예 10a에 설명된 재료 및 방법에 따라 수행하였다. STIM001, STIM003 및 이소형 대조군은 검정 배지+ 2 mM 프로베네시드에서 1 : 4 일련 희석되어 40 μg/mL 내지 80 pg/mL 범위를 갖는 최종 4X 항체 농도를 얻었다. 50 μl의 희석된 Ab, 50 μl의 BATDA 로딩된 MJ 세포, 50 μl의 NK 세포 및 50 μl의 검정 배지 + 2 mM 프로베네시드 (최종 부피 200 μl/웰)를 각 웰에 첨가하여 10 μg/mL 내지 20 pg/mL 범위를 갖는 최종 Ab 농도 및 효과기 : 표적 비율 5 : 1를 얻었다.
결과는 도 6 (b 내지 d) 및 하기 표에 나타낸다. STIM001 (hIgG1) 및 STIM003 (hIgG1)은 두 시간 시점에서 측정된 일차 NK 의존성 ADCC 검정법에서 ICOS 양성 인간 MJ 세포를 살상하였다.
표 E10-2: 3명의 공여자 (2시간 시점)로부터의 NK 일차 세포 ADCC 검정에서 STIM001 및 STIM 003의 EC50 (몰 단위).실시예 10c: ICOS-형질감염된 CCRF-CEM 표적 세포로의 ADCC 검정
ADCC를 통해 살상할 수 있는 STIM001 및 STIM003 hIgG1 잠재력을 효과기로서 인간 일차 NK 세포 및 표적 세포로서 ICOS-형질감염된 CCRF-CEM 세포 (ATCC, CRL-119)를 사용하여 델피아 BATDA 세포독성 검정법 (Perkin Elmer)에서 추가로 테스트하였다. CCRF-CEM은 급성 림프모구성 백혈병 환자의 말초 혈액으로부터 기원한 인간 T 림프모구 세포주이다. 이 검정에서 CCRF-CEM 세포의 항체-매개성 살상이 STIM001 및 STIM003 둘 다에 대해 검증되었다.
재료 및 방법
재료 및 방법은 실시예 10a에 설명된 바와 같았지만, 표적 세포로서 MJ 세포보다는 ATCC로부터 획득한 CCRF-CEM 세포 (ATCC CCL-119)를 사용하고 4시간의 배양 시간을 사용하였다.
CCRF-CEM 세포를 ICOS로 형질감염시켰다. 포유동물 발현을 위해 코돈-최적화된 전장 인간 ICOS (첨부된 서열 목록에 나타낸 바와 같은 신호 펩타이드를 갖음)를 인코딩하는 합성 가닥 DNA를 CMV 프로모터의 조절 하에 발현 벡터 내로 클로닝시켰고 3' 및 5' piggyBac 특이적 말단 반복 서열이 인접되어 세포 게놈 내로의 안정한 도입을 용이하게 하였다 ([40] 참조). 발현 벡터는 안정한 세포주 생성을 용이하게 하는 퓨로마이신 선별 카세트을 포함하였다. 인간 ICOS 발현 플라스미드는 전기천공법에 의해 piggyBac 트랜스포사제를 인코딩하는 플라스미드와 함께 CEM CCRF 세포 내로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 배지를 퓨로마이신으로 보충하고 3 내지 4일마다 배지를 교환하면서 안정된 세포주를 선별하기 위해 적어도 2주 동안 배양하였다. 인간 ICOS의 발현은 항-인간 ICOS-PE 컨쥬게이트 항체 (eBioscience)를 사용하는 유세포 계측법에 의해 평가되었다. 완전한 CEM 배지는 10% (v/v) FBS 및 2mM 글루타맥스를 포함하는 어드밴스된 RPMI 배지로 구성되었다.
STIM001 (hIgG1), STIM003 (hIgG1) 및 이소형 대조군 항체 (HC IgG1)를 20 μg/mL 내지 80 pg/mL 범위의 최종 4X 항체 농도를 얻기 위해 검정 배지에서 일련 희석시켰다.
50 μl의 희석된 Ab, 50 μl의 BATDA 로딩된 ICOS-형질감염된 CEM 세포, 50 μl의 NK 세포 및 50 μl의 검정 배지 (최종 부피 200 μl/웰)를 각 웰에 첨가하여 5 μg/mL 내지 20 pg/mL 범위를 갖는 최종 Ab 농도 및 효과기 : 표적 비율 5 : 1를 얻었다.
결과
STIM001 (hIgG1) 및 STIM003 (hIgG1)은 두 시간 시점에서 측정된 일차 NK 의존성 ADCC 검정법에서 ICOS-형질감염된 CCRF-CEM 세포를 살상하였다. 결과는 도 6 (b 내지 g) 및 하기 표에 나타낸다.
* 불완전한 곡선으로부터 추정된 값.
표 E10-3: 3명의 공여자 (4시간 시점)로부터의 NK 일차 세포 ADCC 검정에서 STIM001 및 STIM 003의 EC50 (몰 단위).
실시예 11a: CT26 동종유전자 모델
개선된 항-종양 생체내 효능이 항-ICOS (STIM001 mIgG2a, 효과기 가능) 및 항-PDL1 (10F9G2)을 조합함으로써 CT26 동종유전자 모델에서 나타났다.
재료 및 방법
효능 연구는 피하 CT26 결장 암종 모델 (ATCC, CRL-2638)을 사용하여 Balb/c 마우스에서 수행되었다. 이 모델은 PD1/PDL1 차단에 거의 민감하지 않으며 10F9.G2 (항-PDL1) 및 RMT1-14 (항-PD1) 단일요법에 반응하여 종양 성장 지연만이 (안정한 질환 또는 완치 없음) 관찰된다. 따라서 이 모델은 조합 연구를 위해 항-PDL1, 항-PDL1의 내재적 저항성을 관찰하기 위한 적절한 모델이 된다. 모든 생체내 실험은 UK 가정 직장 프로젝트 라이센스 하에 1986년 UK 동물 (과학적 절차) 조항 및 EU 지침 86/609에 따라 수행되었으며 바브라햄 연구소 동물 복지 및 윤리적 검토기관의 승인을 받았다.
Balb/c 마우스는 6 내지 8주령에서 18 g 미만으로 찰스리버 UK에 의해 공급되었으며 특이적 병원균이 없는 조건 하에 사육되었다. 총 1 Х 105개의 CT26 세포 (P20 미만의 계대수)를 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 달리 명시하지 않는 한, 치료는 종양 세포 주사 후 6일째에 개시되었다. CT26 세포를 아큐타제 (Sigma)를 사용하여 시험관내에서 계대시키고, PBS로 두 번 세척하고 10% 우태아 혈청이 보충된 RPMI에 재현탁시켰다. 종양 세포 주사 시점에 세포 생존률이 90% 초과인 것으로 검증되었다.
생체내 연구를 위해 STIM001 항-ICOS 작동제 (마우스 ICOS 단백질에 교차-반응성)를 마우스 IgG1 및 마우스 IgG2a로 재구성하여 효과기 기능 없음 및 효과기 기능 가능으로서 각각 테스트하였다. 항-PDL1은 Biolegend (카탈로그 번호 124325)로부터 구입하였다. 하이브리드 대조군은 Kymab (mIgG2a 이소형)에서 또는 시판 출처 (햄스터 이소형 HTK888, Biolegend (번호 92257, 로트 B215504))로부터 생성되었다. 모든 항체를 단일요법으로서 또는 항-ICOS 항체와 항-PDL1과 항체를 조합하여 6일째부터 매주 3회 (6 내지 18일인 2주 동안 투약) 10 mg/kg (0.9% 식염수에서 1 mg/ml)으로 복강내 (IP) 투여하였다. 종양 세포 주사 당일부터 매주 3회 동물 무게 및 종양 부피를 측정하였다. 종양 부피는 변형된 타원 식 1/2 (길이 Х 너비2)를 사용하여 계산하였다. 마우스는 종양이 평균 직경 12 mm에 도달하거나 드문 경우에 종양 궤양의 발생이 관찰될 때까지 (복지) 연구를 계속하였다. 실험은 50일째에 중단되었다. 인간 종결점 생존 통계는 카프란-마이어 방법을 프리즘와 함께 사용하여 계산되었다. 이 접근법은 특이적 치료가 생존율 향상과 관련되는지 여부를 결정하는 데 사용되었다.
표 E11-1: 치료군
결과
도 7, 도 8 및 도 9에 도시된 바와 같이, ICOS 작동제는 질환 진행을 지연시키고 단일요법 또는 항-PDL1과 조합하여 CT-26 피하 종양으로부터 동물의 일부를 치유할 수 있다. 항-PDL1 단일요법은 종양 성장 지연을 유도했지만 안정한 질환 또는 치유 잠재력은 관찰되지 않았다. 이 조합 요법은 항-ICOS 단일요법보다 종양 치료에 더 효과적이었다. 이 연구는 또한 마우스 IgG2a 형식 (효과기 기능 가능)의 STIM001이 이 모델에서 항-종양 반응을 촉발하는 데 마우스 IgG1 (효과기 널) 형식보다 더 강력함을 강조하였다.
실시예 11B: 항- PDL1 mIgG2a와 항- ICOS mIgG2a의 조합의 CT26 동종유전자 모델에서 강력한 생체내 항-종양 효능
생체내 조합 연구는 AbW로 명명된 마우스 교차-반응성 항-인간 PDL1 항체를 갖는 STIM001으로 수행 하였다. 이러한 생체내 연구를 위해, STIM001을 마우스 IgG1 및 마우스 IgG2a로서 재구성하여 이의 효능을 낮은 효과기 기능과 또는 효과기 기능 작동 분자로서 비교하였다. 항-PDL1 AbW는 동일한 형식 (마우스 IgG1 및 마우스 IgG2A)에서 생성되었다.
효능 연구는 피하 CT26 결장 암종 모델 (ATCC, CRL-2638)을 사용하여 Balb/c 마우스에서 수행되었다. Balb/c 마우스는 6 내지 8주령에서 18 g 미만으로 찰스리버 UK에 의해 공급되었으며 특이적 병원균이 없는 조건 하에 사육되었다. 총 1 Х 105개의 CT26 세포 (P20 미만의 계대수)를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 달리 명시하지 않는 한, 치료는 종양 세포 주사 후 6일째에 개시되었다. CT26 세포를 TrypLE ™ 익스프레스 효소 (Thermofisher)를 사용하여 시험관내에서 계대시키고 PBS로 두 번 세척한 다음 10% 우태아 혈청이 보충된 RPMI에 재현탁시켰다. 종양 세포 주사 시점에 세포 생존률이 90% 초과인 것으로 검증되었다.
STIM001 및 항-PDL1 항체를 동시에 조합하여 6일째부터 매주 3회 (6 내지 17일 사이의 2주 동안 투약) 복강내 (IP)로 각각 200 μg (0.9% 식염수에서 1 mg/ml)으로 투약하였다. 종양 성장을 모니터링하고 이소형 대조군 항체 (mIgG1 및 mIgG2A)의 혼합물로 처리한 동물의 종양과 비교하였다. 종양 세포 주사의 당일로부터 동물의 체중 및 종양 부피를 매주 3회 측정하였다. 종양 부피는 변형된 타원 식 1/2 (길이 Х 너비2)를 사용하여 계산하였다. 마우스는 종양이 평균 직경 12 mm에 도달하거나 드문 경우에 종양 궤양의 발생이 관찰될 때까지 (복지) 연구를 계속하였다. 실험은 60일째에 중단되었다. 인간 종결점 생존 통계는 카프란-마이어 방법을 프리즘와 함께 사용하여 계산되었다. 이 접근법은 특이적 치료가 생존율 향상과 관련되는지 여부를 결정하는 데 사용되었다.
표 E11-2: STIM001 2 Х 2 조합의 치료군
결과는 도 10에 나타낸다. 모든 항체 조합은 종양 성장을 지연시켰고, 이소형 대조군-처리된 동물과 비교할 때, 처리된 동물의 생존 (인간 종결점에 도달하는 시간)을 연장시켰다. 흥미롭게도, 항-PDL1 (이의 형식 mIgG1 또는 mIgG2a와는 독립적으로)과 결합할 때, STIM001 mIgG2a 항체는 mIgG1 형식의 STIM001보다 종양 성장 억제하는 데 더 효과적이었다. 이들 데이타는 항-종양 효능을 최대화하는 효과기 기능을 갖는 항-ICOS 항체의 이점을 제시한다. 주목할만하게, aPD-L1 mIgG2a와 조합된 STIM001 mIgG2a는 가장 강력한 항-종양 효능 및 개선된 생존율을 나타내었다 (반응을 보이는 동물의 90% 및 60일째의 60%는 질환으로부터 완치됨).
유사하게, STIM003 mIgG1 및 mIgG2a를 동일한 CT26 종양 모델에서 단일요법으로 또는 항-PDL1 (AbW) mIgG2a와 조합하여 테스트하였다. STIM003 및 항-PDL1 항체를 단일요법으로서 또는 조합으로 동물에서 종양 세포 이식 후 6일째부터 매주 3회 (6 내지 17일 사이의 2주 동안 투약) 200 μg의 각 항체 (0.9% 식염수에서 1 mg/ml)를 복강내 (IP) 주사에 의해 투약하였다. 이 실험에서 종양 크기를 41일 동안 모니터링하였다. 인간 종결점 생존 통계는 카프란-마이어 방법을 프리즘와 함께 사용하여 계산되었다. 이 접근법은 특이적 치료가 생존율 향상과 관련되는지 여부를 결정하는 데 사용되었다.
표 E11-3: 항-PDL1 AbW IgG2a와 STIM003 조합의 치료군
결과는 도 11에 나타낸다. aPDL1 (AbW) 및 STIM003 mIgG2a를 사용한 단일요법은 경미한 항-종양 활성을 나타냈다 (하나의 동물이 각 치료군에서 질환 완치됨). STIM003 mIgG1 또는 mIgG2a와 aPDL1 (AbW) mIgG2a의 조합은 강력한 항-종양 효능을 나타냈다. 흥미롭게도, 41일째까지, aPDL1 mIgG2a와 조합될 때, STIM003 mIgG2a는 STIM003 mIgG1보다 종양 성장을 억제하는데 더 강력하였다 (질환 완치된 동물의 60% 대비 30%). 이 데이타는 항-종양 효능을 최대화하는 항-ICOS 항체의 효과기 형식의 이점을 추가로 강조하였다.
종합적으로, 이들 데이타는 항-ICOS 항체 STIM001 또는 STIM003의 항-PDL1와 조합이 두 항체가 효과기 작동 기능을 가질 때 가장 강력한 항-종양 반응을 유도하는 것을 입증한다. 적합한 상응하는 인간 항체 이소형은, 선택적으로 더 증진된 효과기 기능을 갖는 인간 IgG1, 예로 퓨코실화가 없는 IgG1을 포함할 것이다.
항-PDL1 mIgG2a 및 STIM003 mIgG2a의 조합으로 처리된 마우스 및 각 제제가 개별적으로 처리된 경우 카플란 마이어 곡선을 도 29에 나타낸다.
실시예 11c: STIM003 항체의 단일 용량은 종양 미세환경 ( TME )을 재설정하고 연속적인 항-PD-L1 투약과 조합하여 강력한 항-종양 효능을 유도한다
이 연구는 항-PDL1 항체 (AbW)의 다중 투약과 함께 STIM003 mIgG2A의 단일 대비 다중 투약을 비교하였다. 데이타는 항-ICOS 항체의 단일 용량이 항-PD-L1 항체가 더 큰 효과를 발휘할 수 있도록 종양 미세환경을 변화시킬 수 있음을 나타낸다. 이것은 항-ICOS 항체에 의한 TME의 "재설정"으로서 고려될 수 있다.
이전과 마찬가지로, 이들 효능 연구는 피하 CT26 결장 암종 모델 (ATCC, CRL -2638)을 사용하여 Balb/c 마우스에서 수행되었다. Balb/c 마우스는 6 내지 8주령에서 18 g 미만으로 찰스리버 UK에 의해 공급되었으며 특이적 병원균이 없는 조건 하에 사육되었다. 총 1 Х 105개의 CT26 세포 (P20 미만의 계대수)를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 달리 명시하지 않는 한, 치료는 종양 세포 주사 후 6일째에 개시되었다. CT26 세포를 TrypLE ™ 익스프레스 효소 (Thermofisher)를 사용하여 시험관내에서 계대시키고 PBS로 두 번 세척한 다음 10% 우태아 혈청이 보충된 RPMI에 재현탁시켰다. 종양 세포 주사 시점에 세포 생존률이 90% 초과인 것으로 검증되었다.
처리군은 표 E11-4에 나타낸다. STIM003 및 항-PDL1 항체를 10 mg/kg (0.9% 식염수에서 1 mg/ml)으로 복강내 (IP) 투약하였다. 치료는 종양 세포 이식 후 6일째부터 개시되었다. 종양 성장을 모니터링하고 생리 식염수로 처리한 동물의 종양과 비교하였다. 종양 세포 주사의 당일로부터 동물의 체중 및 종양 부피를 매주 3회 측정하였다. 종양 부피는 변형된 타원 식 1/2 (길이 Х 너비2)를 사용하여 계산하였다. 마우스는 종양이 평균 직경 12 mm에 도달하거나 드문 경우에 종양 궤양의 발생이 관찰될 때까지 (복지) 연구를 계속하였다. 실험은 55일째에 중단되었다.
결과는 도 34에 나타낸다. 6일째부터 6회 용량에 대한 STIM003 및 항-PDL1의 동시적 투여는 연구 종결 시점 (55일)에 종양이 없는 5/8마리 동물로의 CT26 모델에서 강한 항-종양 효능을 나타냈다. 흥미롭게도, 유사한 항-종양 효능이 단일요법으로서 항-PDL1의 다중 용량이 이어진 STIM003의 단일 용량으로 달성되었다. 항-PD-L1 mIgG2a와 조합될 때, STIM003을 1회 투약하는 것과 6회 투약하는 것 사이에서 유사한 효능이 관찰되었다 (B). 한 마리 동물만이 자발적 종양 거부 반응 (이 모델에서 드문)을 보인 식염수 처리군 (A)과 비교할 때, 조합된 약물로의 처리군을 실험 종결 시점 (55일째)까지 동물의 62.5%에서 완전 종양 거부 반응을 보였다. 이 데이타는 STIM003 항체가 종양의 미세환경을 재설정하는 데 사용될 수 있으며 항체가 면역 체크포인트 저항성 종양을 항-PDL1에 민감하게 만들 수 있음을 시사한다. 이전에 나타낸 바와 같이 (실시예 11b), CT26 종양 세포주는 항-PDL1 단일요법에 강하게 반응하지 않는다. STIM003은 항-PDL1 치료의 항-종양 활성을 용이하게 하는 변화를 일으킨다.
실시예 12: 항체 서열 분석
항체 STIM001, STIM002, STIM002-B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 및 STIM009의 구조틀 영역을 인간 생식계열 유전자 분절과 비교하여 가장 가까운 매칭을 확인하였다. 표 E12-1 및 표 E12-2 참조.
표 E12-1. 항-ICOS Ab의 중쇄 생식계열 유전자 분절
표 E12-2. 항-ICOS Ab의 카파 경쇄 생식계열 유전자 분절
추가적인 항체 서열은 실시예 3에 기술된 바와 같이 면역화된 마우스로부터 선별된 추가의 ICOS-특이적 세포로부터의 PCR 증폭된 항체 DNA의 차세대 서열결정에 의해 획득되었다. 이것은 STIM001, STIM002 또는 STIM003을 갖는 군집으로 그룹화될 수 있는 다수의 항체를 이의 중쇄 및 경쇄 v 및 j 유전자 분절 및 CDR3 길이에 기초하여 확인하였다. STIM001로 군집된 CL-61091; STIM002로 군집된 CL-64536, CL-64837, CL-64841 및 CL-64912; STIM003으로 군집된 CL-71642 및 CL-74570. 항체 VH 및 VL 도메인의 서열 정렬이 도 35 내지 도 37에 나타나 있다.
표 E12-3. 서열에 의해 군집된 항체.
실시예 13: 비드 - 결합된 항체에 의한 ICOS -발현 MJ 세포의 작동기작
항체 STIM001, STIM002 및 STIM003, 항-ICOS 항체 C398.4A및 ICOS 리간드 (ICOSL-Fc)는 각각 비드에 공유 결합되었고, 배양된 MJ 세포로부터 사이토카인 IFN-γ의 발현을 유도하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 비드에 결합된 인간 IgG1 및 클론 C398.4A 이소형 대조군을 동시에 평가하였다.
데이타는 하기 도 12 및 표 E13에 나타낸다．
각 항-ICOS 항체는 이 검정에서, IFN-γ 정량화에 의해 결정된 바와 같이 검정의 동적 범위 이내에서 이들의 동족체 이소형 대조군에 의해 관찰된 것을 유의하게 초과하여 MJ 세포를 자극하는 작동기작을 입증하였다.
STIM003 및 클론 C398.4A는 STIM001 (최상위 95% CI: 7.21 내지 8.88 및 로그EC50 95% CI: -8.82 내지 -8.63) 및 STIM002 (최상위 95% CI: 5.38 내지 6.95 및 로그EC50 95% CI: -9.00 내지 -8.74)와 비교하여 더 낮은 최상위 점근선 값 (각각 95% CI: 3.79 내지 5.13 및 3.07 내지 4.22)을 생성하지만, 더 강력한 로그EC50 값 (각각 95% CI: -9.40 내지 -9.11 및 -9.56 내지 -9.23)이었다. COSL-Fc 및 클론 C398.4A 이소형 대조군의 불완전한 곡선 (검정의 동적 범위 외의 최상위)이 생성되었기 때문에, 맞춘 최상위 및 로그EC50 값은 신뢰가능한 것으로 처리되지 않았다. 인간 IgG1 하이브리드 대조군은 완전한 곡선을 생성하였지만, 곡선 아래의 면적은 0과 유의하게 다르지 않았고 따라서 작동제인 것으로 간주되지 않았다.
표 E13. 비드 결합된 MJ 세포 시험관내 활성화 검정의 요약 표. NA - 미적용.
MJ 세포 활성화 검정법 재료 및 방법- 비드 -결합
관심있는 단백질과 자성 입자의 커플링
항-ICOS 항체, 대조군 항체 및 ICOSL-Fc를 다음과 같이 비드에 커플링하였다.
토실 활성화된 다이나비드 M-450 (Invitrogen, 약 2 Х 108개 비드/시료)을 교반하면서 실온에서 밤샘 동안 각 단백질 시료 100 μg과 함께 배양하였다. 비드를 DPBS (Gibco)로 세 번 세척하고 1M 트리스-HCl, pH 8.0 (UltraPure™, Gibco)과 함께 실온에서 1시간 동안 교반하면서 비-결합된 반응 부위를 차단하였다. 비드를 DPBS로 세 번 다시 세척하고 마지막으로 DPBS 0.5 ml/시료에 재현탁시켰다.
이어서, 비드 상의 각 관심있는 단백질의 양을 다음과 같이 결정하였다. 검정색 평면바닥, 고결합 ELISA 플레이트 (Greiner)는 DPBS에서 4 μg/mL, 50 μl/웰로 항-인간 IgG (Southern Biotech) 또는 항-아르메니안 햄스터 IgG (Jackson ImmunoResearch) 포획 항체로 밤샘 동안 4°C에서 코팅되었다. 이어서, 웰을 DPBS+ 0.1% 트윈, 200 μl/웰로 세 번 세척하고, 200 μl/웰의 DPBS + 1% BSA로 1시간 동안 실온에서 차단시켰다. 웰을 DPBS + 0.1% 트윈으로 세 번 다시 세척하였다. 스톡 단백질 시료를 분광광도계로 정량하고 비드를 세포 계수기 상에서 계수하였다. 일련 희석의 단백질 시료 및 비드를 50 μl/웰의 플레이트에서 실온으로 1시간 동안 배양한 후, 다시 DPBS+ 0.1% 트윈으로 세 번 세척하였다. 50 μL/웰의 바이오틴화된 항-아르메니안 햄스터 항체 또는 항-인간 IgG - DPBS + 0.1% BSA에서 유로피움을 첨가하고, RT에서 1시간 동안 배양하였다. 바이오틴화된 항-아르메니안 햄스터 항체 C398.4A의 첨가의 경우 검정 완충액 (Perkin Elmer)에서 1 : 500으로 희석된 50 μl/웰의 스트렙타비딘-유로피움 (Perkin Elmer)을 사용한 또 다른 배양 단계가 추가되고, RT에서 1시간 동안 배양되었다. 웰을 200 μL의 TBS + 0.1% 트윈으로 세 번 세척하고, 이후에 50 μL/웰의 DELFIA 증진 용액 (Perkin Elmer)을 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하고 615 nm에서 방출되는 형광을 엔비전 다중표지 판독기 상에서 측정함으로써 검정을 현상하였다. 비드 상의 단백질 정량을 공지된 농도의 커플링되지 않은 단백질 시료로부터 획득된 신호로부터 외삽한 값에 의해 결정하였다.
MJ 세포 시험관내 활성화 검정 - 비드 결합.
MJ [G11] 세포주 (ATCC CRL-8294)를 20% 열 불활성화된 FBS가 보충된 IMDM (Gibco 또는 ATCC)에서 성장시켰다. 세포를 계수하고 15,000개 세포/웰 (50 μl/웰)의 세포 현탁액을 96-웰 투명 평면바닥 폴리스티렌 멸균 TC- 처리된 마이크로플레이트에 첨가 하였다. 비드를 계수하고, 1.5 x 106개 비드/웰 내지 대략 5860개 비드/웰 (50 μl/웰) 범위의 일련 1 : 2 희석액을 세포에 두 벌 또는 세 벌로 첨가하였다. 배경을 고려하여, 플레이트의 여러 웰은 MJ 세포만을 (100 μL/웰) 포함하였다. 세포 및 비드를 37°C, 5% CO2에서 3일 동안 플레이트에서 공동-배양한 후에, 상청액이 원심분리에 의해 수확되었으며, IFN-γ 함량 측정을 위해 회수되었다.
IFN -γ 수준 측정
각 웰의 IFN-γ 함량은 인간 IFN-감마 듀오세트 ELISA 키트 (R & D systems)의 변형을 사용하여 결정하였다. 포획 항체 (50 μl/웰)를 검정색 평면바닥, 고결합 플레이트 (Greiner) 상의 DPBS에서 4 μg/ml로 밤샘 동안 코팅하였다. 웰을 200 μl의 DPBS + 0.1% 트윈으로 세 번 세척하였다. 웰을 200 μL/웰의 DPBS + 1% BSA로 차단하고, 200 μL/웰의 DPBS + 0.1% 트윈으로 세 번 세척한 다음 50 μL/웰의 IFN-γ (V/w) + RPMI 또는 정상 세포 상청액을 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 200 μl/웰의 DPBS + 0.1% 트윈으로 세 번 세척하고, 이후에 50 μL/웰의 바이오틴화된 검출 항체를 200 ng/mL의 DPBS+ 0.1% 트윈으로 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 200 μl/웰의 DPBS + 0.1% 트윈으로 세 번 세척하고, 이후에 50 μL/웰의 검정 완충액 (Perkin Elmer)에 1 : 500 희석된 스트렙타비딘-유로피움 (Perkin Elmer)을 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 200 μL의 TBS + 0.1% 트윈으로 세 번 세척하고, 이후에 50 μL/웰의 DELFIA 증진 용액 (Perkin Elmer)을 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하고 615 nm에서 방출되는 형광을 엔비전 다중표지 판독기 상에서 측정함으로써 검정을 현상하였다.
데이타 분석
각 웰에 대한 IFN-γ 값을 표준 곡선으로부터 보간하고 세포만의 웰로부터의 평균 배경 수준을 차감하였다. 다음으로 그래프패드 프리즘에서 배경 보정 값을 사용하여 4-매개변수 로그-로지스틱 농도 반응선에 맞 추었다.
실시예 14: 플레이트-결합된 항체에 의한 ICOS-발현 MJ 세포의 작동기작
ICOS-발현 T 세포의 작동기작에 대한 또 다른 검정법은 플레이트-결합 형식으로 항체를 사용한다.
MJ 세포 활성화 검정법 재료 및 방법 - 플레이트-결합
항체 코팅: 96-웰 무균 평면바닥 고친화 플레이트 (Costar)가 의 100 μl/웰의 관심있는 단백질 (항-ICOS 항체, 대조군 항체 및 ICOS-Fc)의 일련 1 : 2 희석액과 함께 10 μg/ml 내지 0.02 μg/ml 범위의 DPBS (Gibco)에서 4°C로 밤샘 동안 코팅되었다. 배경을 고려하여, 플레이트의 여러 웰은 DPBS만으로 코팅되었다. 이어서 플레이트를 200 μL /웰의 DPBS로 세 번 세척한 후 세포를 첨가하였다.
세포 자극: MJ [G11] 세포주 (ATCC CRL-8294)를 20% 열 불활성화된 FBS가 보충된 IMDM (Gibco 또는 ATCC)에서 성장시켰다. 세포를 계수하고 15000개 세포/웰 (100㎕/웰)의 세포 현탁액을 단백질 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 세포를 배양 플레이트로 37°C 및 5% CO2에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 배지로부터 분리하고, 상청액을 IFN-γ 함량 결정을 위해 수집하였다.
IFNγ 수준 및 데이타 분석의 측정은 실시예 13에 기술된 바와 같았다.
결과
결과는 하기 도 13 및 표 E14-1에 나타낸다. 요약하면, STIM001, STIM002 및 STIM003은 모두 유사한 로그EC50 값 (로그EC50 95% CI: 각각 -7.76 내지 -7.64, -7.79 내지 -7.70 및 -7.82 내지 -7.73) 및 최상위 값 (최상위 95% CI: 각각 2.06 내지 2.54, 2.44 내지 2.93 및 2.01 내지 2.41)으로의 IFN-γ 분비에 의해 측정된 바와 같이 강력한 작동기작을 보였다. 클론 C398.4A는 유사한 로그EC50 값 (로그EC50 95% CI: -7.78 내지 -7.60)을 나타내지만, STIM001 내지 STIM003보다 낮은 최상위 값 (상위 95% CI: 1.22 내지 1.63)을 나타냈다. STIM004는 또한 이 분석에서 작동기작을 보였지만, 유사한 로그EC50 값 (로그EC50 95% CI: -7.91 내지 -7.21)으로 중간 상위 값 (상위 95% CI: 0.16 내지 0.82)에 도달하여 덜 강력하였다. STIM001, STIM002 및 STIM003은 ICOSL-Fc보다 더 강한 작동제였다 (로그EC50 95% CI: -7.85 내지 -7.31 및 최상위 95% CI: 0.87 내지 2.45).
표 E14-1. 플레이트-결합된 MJ 세포 시험관내 활성 검정의 요약. IgG1 = 인간 IgG1 하이브리드 대조군 항체.
실시예 15: 용해성 형태의 항체에 의한 ICOS -발현 MJ 세포의 작동기작
고체 표면 상에 배열된 항체를 사용하는 실시예 13 및 실시예 14에 기술된 검정과는 대조적으로, 이 검정은 용해성 형태의 항체가 ICOS-발현 T 세포의 작동제로 작용하는지 여부를 결정한다.
MJ 세포 활성화 분석 재료 및 방법 - 용해성
MJ [G11] 세포주 (ATCC CRL-8294)를 20% 열 불활성화된 FBS가 보충된 IMDM (Gibco 또는 ATCC)에서 성장시켰다. 세포를 계수하고 15,000개 세포/웰 (50 μl/웰)의 세포 현탁액을 96-웰 투명 평면바닥 폴리스티렌 멸균 TC- 처리된 마이크로플레이트에 첨가 하였다. 10 μg/ml 내지 0.01953125 μg/ml 범위의 관심있는 단백질의 1 : 2 일련 희석을 단독으로 또는 교차-결합 시약 (AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적; Jackson ImmunoResearch)과 함께 세포에 두 벌 또는 세 벌로 첨가하였다 (50 μl/웰). 배경을 고려하여, 플레이트의 여러 웰은 MJ 세포만을 (100 μL/웰) 포함하였다. 세포 및 비드를 37°C, 5% CO2에서 3일 동안 플레이트에서 공동-배양한 후에, 상청액이 원심분리에 의해 수확되었으며, IFN-γ 함량 측정을 위해 회수되었다.
IFNγ 수준 및 데이타 분석의 측정은 실시예 13에 기술된 바와 같았다.
결과
STIM001 및 STIM002 둘 다는 인간 IgG4.PE 하이브리드 대조군와 비교하여 IFN-γ 분비에 의해 측정된 바와 같이 유의한 용해성 작동기작을 나타내었다. 염소 항-인간 IgG F된 Fc(ab')2 단편을 통한 Mab 교차-결합은 IFN-γ 수준을 훨씬 더 증가시켰다.
실시예 16: 활성화된 T 세포의 항체 결합
A. 인간 ICOS
활성화된 일차 인간 T 세포의 표면에서 이의 미가공 형태의 ICOS 세포외 도메인을 인식하는 항-ICOS 항체의 능력이 이 검정에서 검증된다.
범용 T 세포 (CD3 세포)를 분리하였고, 이들의 표면에 ICOS의 발현을 유도하도록 CD3/CD28 다이나비드 (Thermofisher)와 함께 3일 동안 배양하였다. STIM001, STIM003 및 hIgG1 하이브리드 대조군 (HC IgG1)의 표면 염색은 두 가지 방법, 즉 미리 표지된 항체 (AF647에 직접 컨쥬게이션된 항체)의 직접적인 결합 또는 이차 AF647-염소 항-인간 항체의 사용을 통한 간접적인 검출에 의해 결정되었다. 염색된 세포를 어튠 상에서 측정하고 형광 강도 (MFI)의 평균으로서 표현하였다. 그래프패드 프리즘을 사용하여 EC50을 측정하였다.
결과는 도 14에 나타낸다. 일단 활성화되면, 범용 CD3 T 세포는 STIM001 및 STIM003 hIgG1 둘 다에 의해 분명하게 염색되었다. 주목할만하게, 활성화된 T 세포에 결합하는 STIM003의 포화는 STIM001의 농도보다 낮은 농도에서 일어나서 STIM003의 인간 ICOS에 대한 높은 친화성을 시사한다. STIM003의 EC50은 STIM001의 값보다 대략 100배 낮았다 (간접 결합 검정의 경우 0.148 nM 대비 17 nM).
B. 비-인간 영장류로부터의 ICOS
비-인간 영장류 (NHP)로부터의 활성화된 일차 T 세포의 표면에서 이의 미가공 형태의 ICOS 세포외 도메인을 인식하는 항-ICOS 항체의 능력이 이 검정에서 검증된다.
2개의 모리셔스 시노몰거스 머카크 (Wickham Laboratories)의 전혈로부터 얻은 PBMC를 구배 원심분리에 의해 분리하고 CD2/CD3/CD28 MACSi 비드 (Miltenyi)와 함께 3일 동안 배양하여 이들의 표면에 ICOS 발현을 유도하였다. STIM001, STIM003 및 hIgG1 하이브리드 대조군 (HC IgG1)의 표면 염색은 AF647 사전 표지된 항체 (80 μg 내지 8 pg/ml)의 직접적인 결합 후 측정하였다. T 세포 하위집합 상의 염색을 평가하기 위해 세포를 V450-CD3로 표지하였다. 염색된 세포를 어튠 (Thermofisher) 상에서 측정하고 평균 형광 강도 (MFI)로서 표현하였다. 그래프패드 프리즘을 사용하여 EC50을 측정하였다.
결과는 도 28에 나타낸다. 일단 활성화되면, T 세포는 STIM001 및 STIM003 hIgG1 둘 다에 의해 분명하게 염색되었다. 인간 T 세포에 대한 결합으로 관찰된 바와 같이, 활성화된 NHP T 세포에 대한 STIM003 결합의 포화는 STIM001보다 낮은 농도에서 일어났으며, 이는 STIM0003이 이들 두 개 항체 ICOS의 높은 친화성을 가지는 것을 나타낸다. NHP ICOS에 대한 결합의 EC50 값은 인간 ICOS에 대한 결합의 경우 획득된 것과 유사하였다.
표 E16. 활성화된 NHP T 세포에서 ICOS에 결합하는 항체에 대해 계산된 EC50 (몰)
실시예 17: 종양 침윤성 림프구 및 말초 T 세포 중의 T 세포 하위집단의 분석
약력학적 연구는 mIgG2a 이소형에서 항-ICOS 항체 STIM001 및 STIM003가 Treg를 유의하게 고갈시키고, 종양 미세환경 (TME) 내에서 CD4+ 효과기 세포의 백분율을 증가시키고 CD4+ 효과기/TReg 비율 및 CD8 +/TReg 비율을 증가시키는 것을 밝혀냈다.
TME 내의 증가된 CD8 +/TReg 비율 및 증가된 수의 CD4+ 효과기 세포는 STIM001 및 STIM003 효능 연구에서 이들 항-ICOS 항체가 항-PDL1 항체와 공동-주입될 때 관찰된 CT26 종양 제거에 종합적으로 기여할 수 있다 (실시예 11).
방법
약력학 연구는 CT-26 마우스 결장 암종 세포 (ATCC, CRL-2638)를 보유한 암컷 Balb/c 마우스에서 수행되었다. Balb/c 마우스는 6 내지 8주령에서 18 g 미만으로 찰스리버 UK에 의해 공급되었으며 특이적 병원균이 없는 조건 하에 사육되었다. 총 1 Х 105개의 CT-26 종양 세포 (계대수 P8)를 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 모든 CT-26 종양 보유 동물을 6개 실험군 (표 E17-1)에 할당하고 개별 마우스에게 항체 또는 염수 200 μg을 2회 (종양 세포 이식 후 13일 및 15일에) 투약하였다. 종양 세포 이식 후 16일째에, CT-26 종양 보유 동물로부터의 CD3+ T-세포를 FACS로 분석하였다.
표 E17-1: 치료군결과
mIgG2a 이소형에서 STIM001 및 STIM003으로 처리된 동물은 식염수 처리군과 비교할 때 종양 부위에서 CD4+ CD3+ CD45+ 세포의 더 낮은 백분율을 보여주었던 한편 (도 15a), STIM001 또는 STIM003 처리는 CD8+ CD3+ CD45+ 백분율에 미치는 매우 작은 효과를 가졌다 (도 15b). CD4+ T 세포의 감소는 STIM001 및 STIM003 항체로 처리된 모든 실험군에서 T-조절 세포의 백분율이 크게 감소했기 때문일 수 있다. 주목할만하게, mIgG2a 이소형에서 STIM001 및 STIM003으로 처리된 동물은 TME 내에서 T-Reg (CD4+ Foxp3+ CD25 +)의 극적인 감소를 보였던 반면, mIgG1 이소형에서 STIM001 및 STIM003은 TME에서 T-Reg 함량에 미치는 미미한 효과를 가졌다. 또한, mIgG2a 이소형에서 STIM001 및 STIM003으로 처리된 동물은 T를 고갈시키는 것으로 알려진 시판되는 항-MTLA-4 (9H10, Biolegend Cat # 106208) 항체로 처리한 동물과 비교할 때 TME에서 T-Reg를 감소시켰지만 [42], 이 결과는 통계적으로 유의하지 않았다 (도 15c). T-Reg 구획에 미치는 mIgG1 또는 mIgG2a 이소형의 STIM001 및 STIM003 효과는 종양 침윤성 림프구 (TIL)에 더 특이적이었다. T-reg 고갈은 말초에서 관찰되지 않았다 (이전에 항-CTLA4의 경우 기술된 바와 같음 [43]) (도 15d). T-Reg 함량의 변화는 또한 종양내 CD4-효과기 세포 (CD4+ Foxp3- CD25-)의 백분율을 유의하게 증가 시켰고 (도 15e), 유사하게 mIgG2a에서 STIM001 및 STIM003으로 처리된 동물에서 CD4 효과기/T-Reg 및 CD8/T-reg의 비율도 역시 TME 내에서 유의하게 증가하였다 (도 15f 및 도 15g).
실시예 18: CT26 종양 및 비장에서 ICOS -발현 T 세포의 수준에 미치는 항- ICOS 항체의 효과
분석은 항-ICOS 항체 STIM001 또는 STIM003으로의 치료 이후 종양 비장 조직에서의 총 면역 세포의 분석에 의해, 비장과 비교하여 종양 내의 면역 세포의 백분율을 정량하도록 수행되었다. STIM001 및 STIM003 mIgG2a는 각각 종양 내에서 Treg를 유의하게 감소시켰지만, 비장에서는 아니었고 종양-선택적 효과를 나타냈다. 이 고갈은 다른 T 세포 아형과 비교하여 Treg에 대해 선택적이었다. 본원 제시된 결과는 면역 구조에 미치는 STIM 항체의 효과를 이해하는 데 도움을 주고, 효과기 기능이 작동하는 Fc 영역을 가진 항-ICOS 항체가 TReg를 강하게 고갈시킬 수 있음을 검증한다.
재료 및 방법
CT26 종양을 보유하는 마우스에게 STIM001, STIM003 또는 항-CTLA4 항체 (9H10)를 2회 투약하였다. 항-CTLA4 항체가 이전에 종양에서 Treg를 선택적으로 감소시키는 것으로 나타났기 때문에, 항-CTLA4 항체는 Treg 고갈에 대한 양성 대조군으로 포함되었다[43].
종양 및 처리된 동물의 비장 내의 면역 구조를 조직 분해 후 FACS에 의해 분석하였다.
이 연구에서 사용된 FACS 항체의 세부사항을 표 E18에 나타낸다. 모든 FACS 항체는 공급자가 권장하는 농도로 사용하였다. FACS 데이타는 어튠 NxT 유세포 계측기를 사용하여 얻었고 데이타는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
표 E18. FACS 항체.결과
CT26 종양 및 종양-보유 동물의 비장에서 ICOS 발현이 결정되었다. 본 발명자는 ICOS 단백질을 발현하는 종양 침윤성 면역 세포의 증가된 백분율을 관찰하였으며 (도 20), 이는 종양 내의 면역 세포가 말초의 면역 세포보다 ICOS 발현 양성인 경우가 많은 것을 나타낸다. 치료되지 않은 동물의 종양에서의 Treg는 ICOS 발현에 거의 양성이었던 한편 (> 90%), 종양에서 CD8+ 효과기 T 세포는 그렇지 않았다 (대략 60%). 종양에서 T 세포 하위집단을 비장 세포의 집단과 비교하여, 비장에서 Treg와 비교하여 유의하게 더 높은 (P <0.0001) 백분율의 종양내 Treg가 ICOS에 대해 양성이었고, 비장에서 CD4+ Teff 세포와 비교하여 유의하게 더 높은 (P <0.001) 백분율의 종양내 CD4+ Teff 세포가 ICOS에 대해 양성이었다.
또한 치료 전 마우스에서 CT26 종양의 미세환경에서 면역 세포의 ICOS 발현 수준은 비장의 면역 세포와 비교할 때 훨씬 더 높았다 (도 21). 종양 미세환경에서 분석된 모든 면역 세포 하위집합 (CD8 T-효과기, CD4 T-효과기 및 CD4/FoxP3 TReg 세포)의 표면에서 ICOS 발현이 증가하였다. 종양 및 비장의 면역 세포는 모두 ICOS를 발현하지만 종양의 면역 세포는 비장 세포 (더 낮은 MFI로 표시됨, 도 21)보다 유의하게 더 많은 ICOS (더 높은 MFI로 표시됨, 도 21)를 발현함을 언급한다. 중요한 것은, 이전에 보고된 바와 같이 종양의 Treg가 최고 수준의 ICOS를 발현하는 점이다[11].
CT26 종양을 보유하는 동물을 2회 용량의 항체 STIM001 또는 STIM003 및 항-CTLA-4 항체로 처리하였다. STIM 항체는 mIgG1 또는 mIgG2 형식으로 사용되었을 때 종양에서 CD45 양성 세포 (면역 세포의 마커)의 전반적인 백분율에 영향을 미치지 않았다. 또한 이들 항체로 치료한 결과가 CT26 종양에서 CD8 효과기 T 세포의 백분율에 유의한 영향을 미치지 않았다 (도 22). mIgG2a 이소형의 STIM001 처리는 CD4+ 효과기 T 세포의 유의한 (p<0.05) 고갈을 가져 왔지만 STIM001 mIgG1, STIM003 mIgG1 및 STIM003 mIgG2a는 CD4+ 효과기 T 세포의 백분율에 영향을 미치지 않았다.
항-CTLA-4 처리는 TME에서 CD45+ 세포 및 CD8+ 효과기 T 세포의 현저한 증가를 (통계적으로 유의하지는 않지만) 생성했지만 CD4+ 효과기 T 세포에는 영향을 미치지 않았다 (도 22).
STIM 항체는 종양에서 조절 T 세포에 유의하게 영향을 미쳤다. 도 23에 도시된 바와 같이, STIM001 mIgG2a 및 STIM003 mIgG2a는 종양 미세환경에서 (ICOS 발현이 높은) Treg를 유의하게 및 선택적으로 고갈시켰다. 흥미롭게도, 이 실험에서 Treg 고갈에 대한 양성 대조군으로서 포함됨에도 불구하고, 항-CTLA-4항체는 Treg를 고갈시키는 데 STIM mIgG2a 항체보다 덜 효과적이었다.
Treg의 선택적 고갈은 종양에서 Treg에 대한 CD8 효과기 T 세포의 비율의 증가 및 종양에서 Treg에 대한 CD4 효과기 T 세포의 비율의 증가를 유도하였으며, 둘 다는 항-종양 면역 반응을 선호한다. 비율 데이타는 도 24에 나타낸다．
STIM001 mIgG2a 및 STIM003 mIgG2a에 의한 종양내 Treg의 고갈과는 대조적으로, 비장의 Treg에서는 이러한 효과가 관찰되지 않았다 (도 25, 도 26, 도 27). 이것은 Treg 고갈에 미치는 항-ICOS 항체의 효과가 모든 조직에서 전신적인 것이 아닌 점을 나타낸다. 이러한 선택성은 환자의 종양 치료 시 치료용 항-ICOS 항체에 유리할 수 있는데, 이는 종양 미세환경에서 Treg를 우선적으로 고갈시키면 신체의 다른 부위에서 부작용을 최소화하면서 항-종양 효과기 T 세포의 억압을 선택적으로 완화할 수 있기 때문이다. 따라서 항-ICOS 항체는 치료-제한적 자가면역 부작용을 일으킬 수 있는 더 넓은 T 세포 반응의 바람직하지 않은 활성화의 위험이 낮은 면역계에서 항-종양 반응을 촉진시킬 수 있다.
실시예 19: 항체 안정성
STIM003 인간 IgG1은 보관, 동결/해동 및 정제 과정에서 안정성을 테스트한 결과 모든 테스트한 조건 하에서 안정성을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 응집%는 HPLC에 의해 결정되었다.
완충액 (10 mM 인산나트륨, 40 mM 염화나트륨, pH 7.0)에서 4°C에서 3개월 보관 후의 단량체의 백분율 (> 99%)의 유의한 변화가 없었다.
열 변성 테스트에서 모든 시료 (n = 15)는 동일한 Tm을 가졌으며 (분량 간의 유의한 차이가 없음) 비슷한 열 변성 곡선을 가졌다.
3회 동결 및 해동 후 Tm (약 70.3°C), 단량체의 비율 또는 SDS-PAGE 상의 프로파일에는 유의한 변화가 없었다.
실온에서 7일 동안 보관한 후 Tm (약 70.3°C), 단량체의 비율 또는 SDS-PAGE 상의 프로파일에는 유의한 변화가 없었다.
단백질 A 정제 후 90%의 회수가 있었다.
실시예 20: 마우스에서 A20 종양 성장에 대한 항-ICOS Ab의 단일요법 효능
항-ICOS 항체 STIM001 mIgG2a 및 STIM003 mIgG2a는 마우스 A20 동종유전자 모델에서 생체내 단일 요법으로서 사용될 때 각각 강력한 항-종양 효능을 나타내었다.
재료 및 방법
BALB/c 마우스에서 피하 A20 세망 세포 육종 모델 (ATCC, TIB-208)을 사용하여 효능 연구를 수행하였다. A20 세포주는 늙은 BALB/cAnN 마우스에서 발견되는 자발적 세망 세포 신생물로부터 유래된 BALB/c B 세포 림프종 세포주이다. 이 세포주는 ICOSL에 대해 양성인 것으로 보고되었다.
Balb/c 마우스는 18 g 초과로 찰스 리버 UK에 의해 공급되었으며 특이적 병원균이 없는 조건 하에 사육되었다. 총 5 Х 105개의 A20 세포 (P20 미만의 계대수)를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. A20 세포를 시험관내에서 계대시켜 PBS로 두 번 세척하고 10% 우태아 혈청이 보충된 RPMI에 재현 탁시켰다. 종양 세포 주사 시점에 세포 생존률이 85% 초과인 것으로 검증되었다. 달리 명시하지 않는 한, 항체 또는 이소형 투여는 종양 세포 주사 후 8일째부터 개시되었다.
STIM001 및 STIM003 항-ICOS 항체가 마우스 IgG2a 이소형 형식으로 생성되었다. 마우스 교차-반응성 항-PD-L1 항체 (AbW)도 역시 동일한 이소형 형식 (마우스 IgG2a)으로 생성되었다. STIM001, STIM003 및 항-PD-L1 항체를 종양 세포 이식 후 8일째부터 매주 2회 (8 내지 29일 사이의 3주 동안 투약) 각 항체 200 ㎍을 복강 내 (IP) 투여하였다. 종양 세포 주사의 당일로부터 동물의 체중 및 종양 부피를 매주 3회 측정하였다. 종양 부피는 변형된 타원 식 1/2 (길이 Х 너비2)를 사용하여 계산하였다. 마우스의 종양이 평균 직경 12 mm에 도달할 때까지 연구를 계속하였다. 종양 세포 이식 후 43일째에 실험을 중단하였다. 종양 성장을 모니터링하고 이소형 대조군 (mIgG2a) 항체로 처리한 동물의 종양과 비교하였다. 처리군은 하기 표 E20에 나타낸다.
표 E20. A20 연구를 위한 치료군.결과
A20 종양 모델에서 STIM001 또는 STIM003 (mIgG2a) 단일요법 투여는 완전한 항-종양 반응을 생성하였다 (도 32, 도 33). STIM001 또는 STIM003과 함께 투여된 모든 동물은 질환에서 완치되었다. 이것은 이소형 대조군 및 PD-L1 mIgG2a 처리군의 결과와 대조된다 (도 30, 도 31). 드문 경우에서, 이소형 대조군 (자발적 퇴행) 및 항-PDL-1 처리군에서 일부 동물의 경우 종양 퇴화가 관찰되었지만, 항-ICOS 항체를 사용한 치료는 유의하게 더 큰 효능을 생산하였다. 연구 종료 시, 8마리의 대조군 동물 중 3마리 및 8마리의 PDL-1 처리된 동물 중 2마리는 종양이 없었다. 그러나, STIM001 또는 STIM003으로 치료한 모든 동물은 연구 종료 시 (둘 다의 처리군 8마리 중 8마리) 종양이 없었으며, 항-ICOS 항체를 사용하여 100% 완치하였다.
실시예 21: J558 골수종 동종유전자 모델에서 항- ICOS 항체 및 항-PD-L1 항체의 조합의 생체내 강한 항-종양 효능
항-ICOS 항체 STIM003 mIgG2a 및 항-PD-L1 항체 AbW mIgG2a를 J558 종양 모델에서 개별적으로 및 조합으로 투여하였다. 이것은 골수종의 동종유전자 마우스 모델이다. 항-ICOS 항체는 단일요법으로 또는 항-PD-L1과 조합하여 투여될 때 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
재료 및 방법
항-종양 효능 연구는 피하 J558 형질세포종 : 골수종 세포주 (ATCC, TIB-6)를 사용하여 Balb/c 마우스에서 수행되었다. Balb/c 마우스는 6 내지 8주령에서 18 g 미만으로 찰스리버 UK에 의해 공급되었으며 특이적 병원균이 없는 조건 하에 사육되었다. 총 5 Х 106개의 세포 (P15 미만의 계대수)를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다 (100 μl). 달리 명시하지 않는 한, 종양 세포 주사 후 11일째에, 동물을 종양 크기에 기초하여 무작위화하고 치료를 개시하였다. J558 세포를 TrypLE™ 익스프레스 효소 (Thermofisher)를 사용하여 시험관내에서 계대시키고 PBS로 두 번 세척한 다음 10% 우태아 혈청이 보충된 DMEM에 재현탁시켰다. 종양 세포 주사 시점에 세포 생존률이 90% 초과인 것으로 검증되었다.
종양이 약 140 mm3의 평균 부피에 도달할 때 치료가 개시되었다. 동물들은 유사한 평균 종양 크기를 가진 4개의 군으로 할당되었다 (투약군에 대해서는 표 E-21 참조). 복지 (드문) 또는 종양 크기로 인해 동물을 연구에서 제외해야 하는 경우가 아니라면 마우스 교차-반응성인 두 항체 모두 11주로부터 (종양 세포 이식 후) 3주 동안 매주 2회 IP로 투약되었다 (도 38). 대조군으로서 식염수 용액을 사용하여 동물 군 (n = 10)을 동시에 투약하였다. 조합 군의 경우, STIM003 및 항-PDL1 항체를 각각 60 μg 및 200 μg (0.9% 식염수)으로 IP 투여와 동시에 투약하였다. 종양 성장을 37일 동안 모니터링하고 식염수로 처리한 동물의 종양과 비교하였다. 종양 세포 주사의 당일로부터 동물의 체중 및 종양 부피를 매주 3회 측정하였다. 종양 부피는 변형된 타원 식 1/2 (길이 Х 너비2)를 사용하여 계산하였다. 마우스는 종양이 평균 직경 12 mm에 도달하거나 드문 경우에 종양 궤양의 발생이 관찰될 때까지 (복지) 연구를 계속하였다.
표 E21. J558 효능 연구를 위한 치료군.결과
J558 동종유전자 종양은 매우 공격적이었고, 식염수 대조군 (N = 10)의 모든 동물은 종양 크기로 인해 21일까지는 연구로부터 배제되었다. 항-STIM003 mIgG2a 및 항-PDL1 mIgG2a는 각각 37.5% 및 75%의 질환이 완치된 동물로 이 모델에서 단일요법으로서 양호한 효능을 입증하였다. 중요하게는, 두 항체의 조합은 37일째에 형질세포종 종양을 거부하였던 100%의 동물의 결과를 가져왔다. 데이타는 도 38에 나타낸다.
실시예 22: 항-PD1의 투여는 항-PD-L1 항체보다 유의하게 TIL 상의 ICOS 발현을 증가시킨다
종양 침윤성 림프구 (TIL)의 하위집합에서 ICOS 발현에 미치는 항-PD-L1 또는항-PD-1 항체로의 치료 효과를 평가하기 위해 확립된 CT26 종양을 보유하는 동물에서 약력학적 연구를 수행하였다. 다음의 항체를 비교하였다:
· 항-PD-L1 AbW mIgG1 [제한된 효과기 기능]
· 항-PD-L1 AbW mIgG2a [효과기 기능 있음]
· 항-PD-L1 10F9.G2 래트 IgG2b [효과기 기능 있음]
· 항-PD1 항체 RMT1-14 래트 IgG2a [효과기 없음].
처리된 마우스의 종양을 단리하고, CD45, CD3, CD4, CD8, FOXP3 및 ICOS에 대해 염색하였다.
재료 및 방법
래트 항-PD-1 RMP1-14 IgG2a (BioXCell, 카탈로그 번호: BE0146), 래트 항-PD-L1 10F9.G2 IgG2b (Bio-Legend, 카탈로그 번호: 124325) 및 항-PD-L1 AbW mIgG1 및 mIgG2a는 CT26 종양 모델에서 종양 세포 이식 후 13일 및 15일째에 130 μg을 복강내로 투여하였다. 16일째에, 동물을 도살하고 마우스 종양을 FACS 분석을 위해 수확하였다. 마우스 종양 해리 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 종양을 해리시키고 균질화시켰다. 결과로 생성된 세포 현탁액을 70 μM 필터를 통해 정화시키고, 96 웰 플레이트에서 2백만 개 세포/웰로 FACS 완충액에 펠렛화하여 재현탁하였다. 세포 현탁액을 항-16/32 mAb (eBioscience)와 함께 배양하고, 모두가 eBioscience Ltd.로부터 획득된 CD3 (17A2), CD45 (30-F11), CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7) 및 ICOS (7E.17G9)에 특이적인 FACS 항체로 염색하였다. 또한 세포를 생사 노란색 고정가능한 생존능 염료 (Life technologies)로 염색하였다. Foxp3 세포내 염색을 위해 시료를 고정시키고 투과화하고 Foxp3에 특이적인 항체 (eBioscience, FJK-16s)로 염색하였다. 시료를 PBS에 재현탁하고 데이타를 어튠 유세포 계측기 (Invitrogen)에 입력하고 FlowJo V10 소프트웨어 (Treestar)를 사용하여 분석하였다.
결과
항-PD1 및 항-PD-L1 항체로 치료한 경우에만 측정된 시점에서 ICOS를 발현하는 CD8 세포 및 T Reg의 백분율이 약간 증가하였다.　그러나, 항-PD1 래트 IgG2a에 반응하여, ICOS 양성 CD8 세포의 표면에서 ICOS 발현의 분명하고 유의한 (식염수 처리군 대비) 증가 (dMFI 증가)가 관찰되었다. ICOS 발현은 CD4 효과기 및 CD4 T Reg 세포에서 상향 조절되는 것으로 나타났으나 통계적 유의성에는 도달하지 못하였다. 이 항-PD1 항체는 항-PD-L1 mIgG2a에서 거의 관찰되지 않는 CD8 효과기 세포에서 ICOS 발현의 현저한 증가를 유도하였다. 유사하게, 상이한 형식의 항-PD-L1 항체와 비교할 때, 치료된 일부 동물에서 가장 낮은 효과기 기능을 갖는 항체 (mIgG1)는 거의 관찰되지 않는 효과기 기능을 갖는 항체 (mIgG2a 및 ratIgG2b)와 비교할 때 효과기 CD8 및 CD4 세포에서 더 높은 ICOS 발현과 관련되는 것으로 관찰되었다. 도 39 참조.
효과기 CD8/CD4 T 세포 상의 ICOS 발현이 증가하면 항-ICOS 항체에 의해 이들 세포가 고갈에 더 민감해지는 효과를 가질 수 있다 (예로, STIM003 mIgG2a로의 마우스 처리 시)． 효과기 CD8 및 CD4 T 세포에서 더 낮은 ICOS 유도를 나타내는 항체는 항-ICOS 항체와 함께 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 연구로부터의 데이타는 본원의 다른 실시예에서 보고된 항-PDL1 mIgG2a 및 STIM003 mIgG2a를 조합할 때 관찰된 항-종양 효능을 반영하여, 항-PD-L1 효과기 양성 항체가 항-ICOS 효과기 양성 항체와의 조합에 특히 적합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 23: B 세포 림프종 동종유전자 모델에서 생체내 단일 용량의 항- ICOS 항체 단일요법의 강력한 항-종양 효능
이 실험은 단일요법으로서 STIM003 mIgG2a의 항-종양 효능을 검증한다. 강력한 항-종양 효능은 STIM003 mIgG2a의 짧은 노출 후 입증되었다.
재료 및 방법
효능 연구는 피하 A20 세망 세포 육종 모델 (ATCC 기탁번호 CRL-TIB-208)을 사용하여 BALB/c 마우스에서 수행되었다. Balb/c 마우스는 6 내지 8주령에서 18 g 미만으로 찰스리버 UK에 의해 공급되었으며 특이적 병원균이 없는 조건 하에 사육되었다. 총 5 Х 105개의 A20 세포 (P20 미만의 계대수)를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 치료는 종양 세포 주사 후 8일째에 하기 표에 나타낸 바와 같이 개시되었다. A20 세포를 TrypLE™ 익스프레스 효소 (Thermofisher)를 사용하여 시험관내에서 계대시키고 PBS로 두 번 세척한 다음 10% 우태아 혈청이 보충된 RPMI에 재현탁하였다. 종양 세포 주사 시점에 세포 생존률이 85% 초과인 것으로 검증되었다. STIM003 mIgG2a는 60 μg (20 g 동물의 경우 3 mg/kg과 등가물)의 단일 용량 (SD) 또는 60 μg의 다중 용량 (MD, 3주 동안 매주 2회)으로서 사용되었다. 두 가지 계획에 반응하여 관찰된 항-종양 효능을 식염수로 "처리"한 동물의 효능과 비교하였다 (MD, 3주 동안 매주 2회). 항체를 0.9% 식염수에서 1 mg/ml로 복강내 (IP) 투여하였다. 종양 세포 주사의 당일로부터 동물의 체중 및 종양 부피를 매주 3회 측정하였다. 종양 부피는 변형된 타원 식 1/2 (길이 Х 너비2)를 사용하여 계산하였다. 마우스는 종양이 평균 직경 12 mm에 도달하거나 드문 경우에 종양 궤양의 발생이 관찰될 때까지 (복지) 연구를 계속하였다.
표 E23-1. 치료군.
결과
STIM003 mIgG2a의 다중 및 단일 용량 모두 종결점 (41일째)에서 종양 성장의 징후가 없는 동물의 수에 의해 나타난 바와 같이 강력하고 유의한 단일요법 항-종양 효능을 유도하였다. SD는 10마리 중 7마리 동물을 질환 완치하였던 반면, A20 B 세포 림프모종을 주사한 10마리 중 9마리는 다중 요법으로 완치되었다. 식염수 처리군의 모든 동물은 종양 크기로 인해 40일째까지는 연구로부터 배제되어야 하였다. 도 40 참조.
인간 종결점 생존 통계는 그래프패드 프리즘 V7.0을 사용하여 카프란-마이어 곡선 (도 41)으로부터 계산되었다. 이 접근법은 치료가 생존율 향상과 관련되는지 여부를 결정하는 데 사용되었다. 위험 비율 (Mantel-Haenszel) 값 및 이들의 연관된 P 값 (Log-Rank Mantel-Cox)은 하기 표에 나타낸다．
표 E23-1. 도 41 카프란-마이어 곡선에 해당하는 위험 비율 (Mantel-Haenszel) 값 및 이들의 연관된 P 값 (로그-순위 Mantel-Cox).
실시예 24: CT-26 종양 보유 동물에서의 항-ICOS 항체의 시간 및 용량 의존성 효과
본 실시예는 CT-26 종양을 보유한 마우스의 면역 세포에 미치는 항-ICOS 항체의 효과를 평가하는 약력학적 연구의 결과를 제시한다. 상이한 조직으로부터의 T 및 B 세포 아형을 STIM003 mIgG2a의 단일 용량 이후에 FACS로 분석하였다.
방법
종양 세포 이식 후 12일째에 CT-26 종양 보유 동물에 식염수 또는 STIM003을 200 μg, 60 μg 또는 6 μg으로 투여하였다. 종양 조직, 혈액, 종양 유출 림프절 (TDLN) 및 비장을 처리 후 1일, 2일, 3일, 4일 및 8일째에 수확하였다. 마우스 종양 해리 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 종양을 해리시켰다. 비장 조직을 부드러운 MACS 해리를 이용하여 해리시키고, 적혈구를 RBC 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 종양 유출 림프절을 기계적으로 분해하여 단일 세포 현탁액을 만들었다. 결과적인 세포 현탁액을 조직에 따라 70 μM 또는 40 μM 필터를 통해 정화시킨 후, 세포를 RMPI 완전 배지에서 두 번 세척한 다음 최종적으로 얼음으로 차가운 FACS 완충액에 재현탁하였다. 총 혈액을 혈장 튜브에 수집하고 적혈구를 RBC 용해 완충액을 사용하여 용해시키고 세포를 RPMI 완전 배지에서 두 번 세척한 다음 최종적으로 얼음으로 차가운 FACS 완충액에 재현탁하였다. 모든 조직으로부터의 단일 세포 현탁액을 FACS 분석을 위해 96개의 깊은 웰 플레이트에 분배시켰다. 세포는 생사 고정가능 노란색 생존능 염료 (Life technologies)로 염색되었다. 세포 현탁액을 항-CD16/CD32 mAb (eBioscience)와 함께 항온 배양하고, CD3 (17A2), CD45 (30-F11), CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), CD25 (PC61.5), ICOSL (HK5.3), B220 (RA3-6B2), Ki-67 (SolA15), CD107a (eBio1D4B), IFN-γ (XMG1.2), TNF-α (MP6-XT22), Foxp3 (FJK-16s) 및 ICOS (7E.17G9)에 특이적인 FACS 항체로 염색하였고, 이는 모두 eBioscience Ltd.로부터 획득된 것이었다. FACS에 의한 사이토카인 판독을 위해, 종양으로부터의 단일 세포 현탁액을 브레펠딘-A의 존재 시 4시간 동안 24 웰 플레이트에 도말하였다. 세포 내 염색을 위해, 시료를 고정시키고, 투과화시키고, 특이적 항체로 염색하였다. 시료를 마지막으로 PBS에 재현탁하고 어튠 유세포 계측기 (Invitrogen) 상의 입력된 데이타를 FlowJo V10 소프트웨어 (Treestar)를 사용하여 분석하였다.
결과는 하기에 제시되고 논의된다.
ICOS 발현은 CT26 모델에서 종양내 T- reg에서 높다
ICOS를 발현하는 종양 침윤성 림프구 (TIL)의 백분율을 비장, 혈액 및 TDLN에서 면역 세포의 백분율과 비교할 때, 본 발명자는 CT-26 종양의 미세환경에서 더 많은 면역 세포가 다른 조직 대비 ICOS를 발현하는 것을 입증하였다. 더 중요한 것은, 모든 조직 및 모든 시점에서 ICOS 양성 T-reg 세포의 백분율은 ICOS에 양성인 CD4 또는 CD8 효과기 T 세포의 백분율보다 높았다. 중요한 것은, ICOS의 dMFI (상대 발현)는 또한 다른 TIL 아형 대비 ICOS에 대해 매우 양성인 종양내 T-reg을 갖는 발현에서 유사한 순위를 따랐다. 흥미롭게도, 이 실험의 시간 프레임 내에서 ICOS+ TIL의 백분율에는 현저한 변화가 없었다. 비장 및 TDLN에서도 역시 유사한 결과가 보였다. 한편, 혈액에서 ICOS 발현은 T 효과기 세포에서 비교적 안정하지만 실험 과정 동안 T-reg에서는 증가하였다. 전체 데이타는 종양 미세환경에서 더 많은 세포가 ICOS를 발현하고 이들 양성 세포도 역시 이들의 표면에 더 많은 ICOS 분자를 발현하는 것을 입증하였다. 더 중요한 것은, TIL의 Treg는 ICOS에 대해 높게 양성이다. 도 42 참조.
STIM003 투여에 반응하여 종양내 T-reg 세포의 강력한 고갈
STIM003 mIgG2a 항체에 대한 반응으로, TME에서 T-reg 세포 (CD4+ CD25+ Foxp3)의 강력하고 신속한 고갈이 있었다. T-reg는 다른 T 세포 하위집합과 비교하여 ICOS 발현이 높기 때문에 효과기 기능을 가진 항-ICOS 항체가 이들 세포를 우선적으로 고갈시킬 것으로 예상된다. 저용량의 STIM003 (20 g 동물에 대해 0.3 mg/kg에 상응하는 6 μg)에서 T-reg의 계속적인 고갈이 있었고, 3일째에는 대부분의 T-reg가 TME로부터 고갈되었다. 흥미롭게도, 8일째까지, T-reg 세포는 TME를 다시 축적하고, 식염수 처리된 동물에서 관찰되는 수준을 약간 초과하는 수준에 도달한다. 저용량에서 T-reg 세포의 재축적은 Ki-67+ CD4 T-세포의 관찰된 증가에 의해 입증된 바와 같이 TME에서 증식하는 CD4 T 세포의 증가에 기인할 수 있다. 6 μg 이상의 용량에서 본 연구 (8 일째)에서 분석된 마지막 시점까지 완전 T-reg 고갈에 의해 보여지는 바와 같이 TME에서 T-reg 세포의 장기간 고갈이 있었다. 한편 혈액에서 모든 용량으로 T-reg 세포가 일시적으로 고갈되었다. 중요한 것은, 8일째까지, 처리된 모든 동물은 식염수로 처리된 동물과 비교할 때 혈액에서 T-reg 세포와 유사한 (또는 6 μg 용량의 경우 더 높은) 수준을 가졌다. 데이타는 도 43에 나타낸다． 주목할만하게 및 CTLA-4 항체를 고갈시키기 위해 이전에 발표된 데이타와 유사하게, 비장 또는 TDLN 조직에서 T-reg 세포의 백분율에 유의한 변화는 없었으며, 이는 T-reg 세포가 이들 기관에서 고갈되지 않도록 보호될 수 있음을 시사한다.
요약하면, TME에서의 T-reg 세포의 강력한 고갈은 CT-26 모델에서 동물 당 6 μg 정도의 낮은 용량으로 달성되었다. 그러나, 60 μg의 용량은 STIM003 mIgG2a 주사 후 8일째까지 장기간 고갈을 초래하였다. 이것은 더 높은 용량 (200 μg)을 사용하여 개선되지 않았다.
STIM003 mIgG2a는 CD8 : T Reg 및 CD4 : T Reg 비율을 증가시켰다
T-eff : T-reg 비율에 미치는 STIM003의 효과는 도 44에 나타낸다．
STIM003 mIgG2a는 CD8 : T-reg 비율뿐만 아니라 CD4 eff : T-reg 비율도 증가시켰다. 모든 처리 용량이 T-eff 대 T-reg 비율의 증가와 관련되었지만, 중간 용량 60 μg (20 g 동물의 경우 3 mg/kg과 등가물)은 처리 후 8일째까지 가장 높은 비율과 관련된다.
흥미롭게도, 6 μg 용량에서, 비율은 4일째까지 높았지만 치료 후 8일째에는 식염수 처리된 동물의 비율과 일치하였다. 이것은 치료 후 8일째까지 이 용량으로 관찰된 TReg의 축적으로 설명할 수 있다． 한편, 60 또는 200 μg의 용량에서, Teff 대비 T-reg 비율은 모든 시점에서 높게 유지되었다. 이것은 이들 용량에서 Treg의 장기간 고갈에 의해 설명된다. 주목할만하게, 고농도 (200 μg)에서 장기간의 Treg 고갈에도 불구하고 8일째에는 중등도의 개선만이 있었다. 이것은 STIM003의 고농도에서 ICOSINT 효과기 세포의 일부 고갈로 설명할 수 있다．
종합적으로, 데이타는 테스트된 모든 용량에서 Treg 고갈 및 효과기 : T reg 비율의 증가를 입증하였다. 그러나, 60 μg (약 3 mg/kg)의 최적 용량은 가장 바람직한 면역 구조와 관련되는 가장 높은 T-eff 대비 T-reg 비율뿐만 아니라 T-reg의 장기 고갈 둘 다를 항-종양 면역 반응을 개시하도록 달성하였다. 흥미롭게도 유사한 양상이 혈액에서 관찰되었으며, 60 μg의 중간 용량이 가장 높은 T-eff 대 T-reg 비율과 관련되었다. 중요한 것은, 혈액에서 비율의 개선이 초기 시점 (3일과 4일 사이)에서 관찰되었다.
STIM003에 반응하여 효과기 세포의 활성화
종양 침윤성 T 효과기 세포에서 CD107a의 표면 발현은 이전에 활성화되어 세포독성 활성을 발휘하는 세포에 대한 신뢰할 수 있는 마커로서 확인되었다 [44]. 본 연구에서는 T-reg를 고갈시키는 것에 추가하여, STIM003이 TME에서 효과기 T 세포의 세포독성 활성을 자극할 수 있음을 마커를 사용하여 검증하였다. 흥미롭게도, 치료 후 8일째에, 모든 용량의 STIM003에서 CD4 및 CD8 효과기 T 세포 구획 모두에서 CD107a의 표면 발현이 증가하였다. 또한, CD4 및 CD8 T 세포 모두에서의 CD107a 발현의 상향 조절은 200 μg 투여 시 개선되지 않았기 때문에 동물에 60 μg을 투여했을 때 일정 상태에 이른 것으로 보였다.
TME에서 효과기 세포의 활성화를 추가로 입증하기 위해, CD4 및 CD8 TIL에 의한 사이토카인 방출을 FACS로 분석하였다. 본원의 초기 실시예에 제시된 시험관내 작동기작 데이타로 예상되고 이와 일관되게, 모든 용량에서 STIM003 mIgG2a는 효과기 CD4 및 CD8 T 세포에 의한 전-염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α 생산을 촉진시켰다. 전-염증성 사이토카인 생산의 유도는 최적 용량 60 μg에서 높은 것으로 나타났다. 실제로, 60 μg의 STIM003은 CD4 T 세포에 의한 사이토카인 생산을 유의하게 증가시켰다. 유사한 경향이 TME에서 효과기 CD8 T 세포에 의한 전염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α 생산의 경우 관찰되었다. 데이타는 도 45에 나타낸다．
요약하면, 모든 용량의 STIM003은 (1) 표면에 탈과립화 마커 CD107a의 존재 및 (2) T 세포에 의한 Th1 사이토카인 (IFNγ 및 TNFα)의 생산에 의해 나타난 바와 같이 TME에서 T 세포 활성화를 유도하였다. 이것은 STIM003이 TME의 면역 구조에 강력하게 영향을 미치고 Treg 세포를 고갈시키고 T 효과기 세포의 살상 활성을 자극하는 이중 역할을 하는 점을 나타낸다 .
인간 용량 추정
마우스에서 관찰한 전임상 효능 데이타에 기초하여, 초기 예측이 상응하는 표면적 (BSA)에 기초하여 인간 환자를 위한 적절한 임상적 용량으로 제조될 수 있다 [45].
예를 들어, 마우스에서 최적의 항-ICOS IgG 용량을 3 mg/kg (60 μg)으로 취하고, 참고문헌을 따르면 [45], 인간을 위한 상응하는 용량은 0.25 mg/kg이다.
모스렐러 공식을 사용하여 60 kg 및 1.70 m의 개인의 경우 BSA 1.68 m2이다. mg/kg 단위의 용량에 35.7 (60/1.68) 팩터를 곱하면 15 mg의 고정된 용량이 제공된다. 80 kg 개인의 경우 상응하는 고정된 용량은 20 mg일 것이다.
안전하고 효과적인 치료 요법을 결정하기 위해 임상 시험에서 인간의 치료법에 맞게 용량을 최적화할 수 있다．
실시예 25: 종양 시료로부터의 데이타의 생물정보학적 분석
본 발명에 따른 암의 하나의 표적 그룹은 ICOS+ 면역억압성 Treg의 상대적으로 높은 수준과 연관된 이들 암이다.
높은 Treg 함량과 연관된 암 유형을 확인하기 위해 암 게놈 아틀라스 (TCGA) 공개 데이타집합으로부터 전사체 데이타를 획득하고 ICOS 및 FOXP3 발현 수준을 분석하였다. TCGA는 많은 상이한 유형의 암에 대해 축적된 게놈 및 전사체 데이타를 카탈로그화한 대규모 연구이고, 돌연변이, 사본수 다양성, mRNA 및 miRNA 유전자 발현, DNA 메틸화를 실질적인 시료 메타데이타와 함께 포함한다.
유전자 집합 농축 분석 (GSEA)은 다음과 같이 시행되었다. TCGA 컨소시엄의 일부로서 수집된 유전자 발현 RNA 서열 데이타는 UCSC Xena 기능적 게놈학 브라우저로부터 log2 (normalized_count+1)로서 다운로드되었다. 비-종양 조직 시료를 데이타 집합으로부터 제거하여 9732개의 시료로부터 20530개의 유전자에 대한 데이타를 남겼다. 특이적 유전자 집합 내의 유전자에 대한 농축 점수를 계산하는 [46]로부터의 알고리즘 및 [47]에서 이의 실행을 사용하여 유전자 수준 계수를 각 시료의 유전자 집합 점수로 전환시켰다. 관심있는 유전자 집합은 ICOS와 FOXP3 둘 다를 포함하는 것으로서 정의되었다. 시료를 주요 질환에 의해 분류하고 각 군의 ssGSEA 점수를 33개 주요 질환 군에 걸쳐 비교하였다. 가장 큰 중간값 점수를 보인 질환 군은 림프성 신생물 확산성 대형 B 세포 림프종, 흉선종, 두경부 편평세포 암종인 것으로 확인되었지만, 확산성 대형 B 세포 림프종은 하위집합이 높게 나머지는 집단 중앙값 미만으로 점수를 매긴 다중 점수 분포를 보였다.
ICOS 및 FOXP3 발현에 대한 ssGSEA 점수의 최고 순위에서 가장 낮은 순위 순서로, 상위 15개 암 유형은 다음과 같다:
DLBC (n = 48) 림프성 신생물 확산성 대형 B 세포 림프종
THYM (n = 120) 흉선종
HNSC (n = 522) 두경부 편평세포 암종
TGCT (n = 156) 고환 생식 세포 종양
STAD (n = 415) 위 샘암종
SKCM (N = 473) 피부 흑색종
CESC (n = 305) 자궁경부 편평세포 암종 및 자궁경부 샘암종
LUAD (n = 517) 폐 샘암종
LAML (n = 173) 급성 골수성 백혈병
ESCA (n = 185) 식도 암종
LUSC (n = 502) 폐 편평세포 암종
READ (N = 95) 직장 샘암종
COAD (n = 288) 결장 샘암종
BRCA (n = 1104) 유방 침윤성 암종
LIHC는 (N = 373) 간 간세포 암종
상기 중 n은 TCGA 데이타 집합에서 해당 암 유형에 대한 환자 시료의 수이다. 본원에 기술된 항-ICOS 항체는 이들 및 다른 암의 치료에 사용될 수 있다.
비교적 높은 수준의 ICOS+ 면역억압성 Treg와 관련되고 PD-L1을 추가로 발현하는 암은 항-ICOS 항체 및 항-PD-L1 항체의 조합 치료에 특히 잘 반응할 수 있다． 이 목적을 위한 적절한 치료 요법 및 항체는 전술한 설명에서 이미 상술되었다.
이전과 같이 TCGA 데이타 집합을 사용하여, ICOS 및 FOXP3에 대한 농축 점수는 스페어만의 순위 상관 관계를 사용하는 PD-L1의 발현 수준과 상관 관계가 있었고, 일차 질환 적응증에 의해 분류된다. P 값은 각 군의 경우에 계산되었고, p 값 0.05은 (본페로니의 다중 비교 교정으로) 통계적으로 유의한 것으로 처리되었다. ICOS/FOXP3 및 PD-L1 발현 사이의 상관 관계가 가장 높은 질환 군은 다음과 같다:
TGCT (n = 156) 고환 생식 세포 종양
COAD (n = 288) 결장 샘암종
READ (N = 95) 직장 샘암종
BLCA (n = 407) 방광 요로 암종
OV (N = 308) 난소 장액성 낭샘암종,
BRCA (n = 1104) 유방 침윤성 암종
SKCM (N = 473) 피부 흑색종
CESC (n = 305) 자궁경부 편평세포 암종 및 자궁경부 샘암종
STAD (n = 415) 위 샘암종
LUAD (n = 517) 폐 샘암종
암이 ICOS+ 면역억압성 Treg 및 PD-L1 발현과 연관되는지 여부를 결정하는 검정법 이후 환자를 치료를 위해 선택할 수 있다. 상기와 같이 높은 상관 관계 점수가 있는 암 유형의 경우, ICOS+ 면역억압성 Treg 및 PD-L1 발현 중 하나가 존재하는 것을 (예로, 임계값 초과) 결정하기에 충분할 수 있다． PD-L1 면역조직화학 검정법이 이 맥락에서 사용될 수 있다．
실시예 26: 추가의 항- ICOS 항체의 평가
실시예 12에서 확인된 CL-74570 및 CL-61091 항체 서열을 합성하고 HEK 세포에서 IgG1 형식으로 발현시켰다.
이들 항체의 기능적 특성화는 실시예 6에 기술된 것과 유사한 HTRF 검정법을 사용하여 수행하였고, BCT 상청액보다는 정제된 IgG1의 사용에 적응하도록 검정법을 변형시켰다. HEK 세포로부터 발현된 인간 IgG1 항체를 포함하는 5 μL의 상청액을 BCT 상청액 대신에 사용하였고, 총 부피는 이전과 같이 HTRF 완충액을 사용하여 웰 당 20 μL로 만들었다. 인간 IgG1 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 두 항체 모두 공식 1을 사용하여 계산된 바와 같이 인간 및 마우스 ICOS와의 결합에 대해 5% 이상의 효과를 나타냈으므로 본 검정법에서 양성 반응이 검증되었다.
CHO-S 세포의 표면 상에 발현된 인간 및 마우스 ICOS와 결합하는 이들 항체의 능력은 미러볼 검정법을 사용하여 추가로 검증되었다. 이 분석에서, 항-ICOS IgG1을 포함하는 5 μL 상청액을 384 미러볼 검정색 플레이트 (코닝)의 각 웰에 옮겼다. 항-ICOS 항체의 결합은 모든 웰에 0.8 mg/ml의 농도로 검정 완충액 (PBS + 1% BSA + 0.1% 소듐아자 이드)으로 희석된 염소 항-인간 488 (Jackson Immunoresearch) 10 μL을 첨가함으로써 검출되었다.
양성 대조군 웰의 경우, 2.2 μg/mL까지 검정 배지로 희석된 5 μL 기준 항체를 플레이트에 첨가하였다. 음성 대조군 웰의 경우, 2.2 μg/mL로 검정 배지로 희석된 5 μL 하이브리드 대조군 IgG1을 플레이트에 첨가하였다. DRAQ5 10 μM (Thermoscientific)는 검정 완충액에 재현탁된 0.4 Х 106개/ml의 세포에 첨가되었고, 5 μL을 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4°C에서 2시간 동안 배양하였다.
형광 강도는 미러볼 플레이트 판독기 (TTP Labtech)를 사용하여 500 내지 700개 단일 세포의 집단으로부터 Alexafluor 488 (본원 493 nm, 방출 519 nm)을 측정하여 측정하였다. 검정 신호는 중간값 (FL2) 평균 강도로서 측정되었다.
총 결합은 2.2 μg/mL의 검정 농도에서 기준 항체를 사용하여 정의하였다. 비특이적 결합은 2.22 μg/mL의 검정 농도에서 하이브리드 대조군 hIgG1을 사용하여 정의하였다. 두 항체 모두는 1% 이상의 효과를 나타애고, 따라서 본 검정법에서 양성 반응이 검증되었다.
효과 백분율 = (시료 웰 - 비특이적 결합) Х 100
(총 결합 - 비특이적 결합)
CL-74570 및 CL-61091 각각은 또한 유세포 계측법에 의해 결정된 바와 같이 CHO-S 세포에서 발현된 인간 및 마우스 ICOS에 대한 결합을 입증하였다. FACS 스크리닝은 실시예 6에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였고, BCT 상청액보다는 정제된 IgG1의 사용에 적응하도록 검정법을 변형시켰다. 두 항체 모두 hICOS, mICOS 및 WT CHO 세포에 결합하는 음성 대조군의 기하평균보다 10배 초과의 결합을 보였다.
표 E26-1. CL-74570 및 CL-61091의 기능적 특성화.
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항체 STIM003
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항체 STIM006
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항체 STIM008
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VH 도메인 아미노산 서열: 서열번호 480
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VL CDR1 아미노산 서열: QSVtnY 서열번호 484
VL CDR2 아미노산 서열: DAS 서열번호 485
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항체 STIM009
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CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATTAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATTTTTACGATATTTTGACTGATAGTCCGTACTTCTACTACGGTGTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
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VL 도메인 뉴클레오타이드 서열: 서열번호 502
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VL 도메인 아미노산 서열: 서열번호 501
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VL CDR1 아미노산 서열: QSLLHSNGYNY 서열번호 498
VL CDR2 아미노산 서열: LGS 서열번호 499
VL CDR3 아미노산 서열: MQALQTPrT 서열번호 500
표 S1. 서열번호들 1 내지 342
표 S2. 서열번호들 343-538
표 S3. 서열번호들 539-562
표 S4: 추가적인 클론으로부터 획득된 항체 중쇄 가변 영역의 서열
CDR은 IMGT에 따라 정의됨.
표 S5: 추가적인 클론으로부터 획득된 항체 경쇄 가변 영역의 서열
CL-71642에서 N 말단 E 및 5' 뉴클레오타이드 첨가는 진하게 표시된다. 이들은 서열결정에서 회수되지 않았지만, 도 36에 나타낸 바와 같이 관련된 클론과 비교하여 서열에 존재하는 것으로 결정되었다. CDR은 IMGT에 따라 정의됨.
<110> Kymab Limited <120> Anti-ICOS Antibodies <130> K00037-1 WO <150> GB1613683.0 <151> 2016-08-09 <150> GB1615224.1 <151> 2016-09-07 <150> GB1615335.5 <151> 2016-09-09 <150> US15/354,971 <151> 2016-11-17 <150> GB1620414.1 <151> 2016-12-01 <150> GB1621782.0 <151> 2016-12-20 <150> GB1702338.3 <151> 2017-02-13 <150> GB1702339.1 <151> 2017-02-13 <150> GB1703071.9 <151> 2017-02-24 <150> US15/480,525 <151> 2017-04-06 <150> GB1709818.7 <151> 2017-06-20 <150> PCT/GB2017/051794 <151> 2017-06-27 <150> TW106120563 <151> 2017-06-27 <150> PCT/GB2017/051795 <151> 2017-06-27 <150> TW106120562 <151> 2017-06-27 <150> PCT/GB2017/051796 <151> 2017-06-27 <150> TW106120564 <151> 2017-06-27 <160> 610 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> Cynomologus <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Met Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val 20 25 30 Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys 35 40 45 Gln Leu Asp Leu Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys 50 55 60 Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His 65 70 75 80 Ser Asn Tyr Arg Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu 85 90 95 Gly Asn Ala Ala Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly 100 105 110 Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile 115 120 125 Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu 130 135 140 Val Val Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu 145 150 155 160 Gly Tyr Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val 165 170 175 Leu Ser Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile 195 200 205 Phe Tyr Cys Ile Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala 210 215 220 Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg 225 230 235 240 Thr <210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 His His His His His 245 <210> 4 <211> 475 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg 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Sapiens <400> 65 Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 66 Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 67 Gln Gln Ala Asn Ser Ile Pro Phe Thr 1 5 <210> 68 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 68 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ile Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Ile Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 69 <211> 322 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 69 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtgttagc agctggttag cctggtatca gcagaaatca 120 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atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcttgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagatctacg 300 tatttctatg gttcggggac cctctacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct cagccagcac caagggcccc tctgtgttcc ctctggcccc ttccagcaag 420 tccacctctg gcggaacagc cgctctgggc tgcctcgtga aggactactt ccccgagcct 480 gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg accagcggag tgcacacctt ccctgctgtg 540 ctgcagtcct ccggcctgta ctccctgtcc tccgtcgtga ccgtgccttc cagctctctg 600 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccct ccaacaccaa ggtggacaag 660 aaggtggaac ccaagtcctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccctgaa 720 ctgctgggcg gaccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 780 tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 840 aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag 900 gaacagtaca actccaccta ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg 960 ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg 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catagtgatg gatacaactg tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc tactcgggcc 180 tccgggttcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300 tgcagttttg gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtggccgc tccctccgtg 360 ttcatcttcc caccttccga cgagcagctg aagtccggca ccgcttctgt cgtgtgcctg 420 ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480 tccggcaact cccaggaatc cgtgaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 540 tcctccaccc tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600 gtgacccacc agggcctgtc tagccccgtg accaagtctt tcaaccgggg cgagtgt 657 <210> 405 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 405 Gly Val Thr Phe Asp Asp Tyr Gly 1 5 <210> 406 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 406 Ile Asn Trp Asn Gly Gly Asp Thr 1 5 <210> 407 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 407 Ala Arg Asp Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr His Val Pro Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 408 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caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acatcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 526 <211> 330 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 526 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 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tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc tactcgggcc 180 tccgggttcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300 tgcagttttg gccaggggac caagctggag atcaaac 337 <210> 602 <211> 112 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 602 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Cys Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Ala Ser Gly Phe Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 603 <211> 325 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 603 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttt cactttcggc 300 cctgggacca aagtggatat caaac 325 <210> 604 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 604 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 605 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 605 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 606 <211> 325 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 606 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggaa 240 cctgaagatt ttgcagtata ttactgtcac cagtatggta attcaccatt cactttcggc 300 cctgggacca aagtggatat caaac 325 <210> 607 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 607 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Asn Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 608 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 608 His Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 609 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X = any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X = any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X = any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X = is either present or absent, and if present, may be any amino acid. <400> 609 Xaa Gly Ser Gly Xaa Tyr Gly Xaa Xaa Phe Asp 1 5 10 <210> 610 <211> 478 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ICOSL-Fc fusion protein <400> 610 Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu 1 5 10 15 Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His 35 40 45 Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn 50 55 60 Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu 65 70 75 80 Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu 85 90 95 Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val 100 105 110 Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro 115 120 125 His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn 130 135 140 Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser 145 150 155 160 Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg 165 170 175 Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser 180 185 190 Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu 195 200 205 Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr Trp Ser 225 230 235 240 Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 245 250 255 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 420 425 430 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475

Claims (113)

  1. 인간 및 마우스 ICOS의 세포외 도메인과 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 아미노산 서열이 서열번호 408인 VH 도메인, 및 아미노산 서열이 서열번호 415인 VL 도메인을 포함하는, 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 항체 불변 영역을 포함하는, 항체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 불변 영역은 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항체.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 불변 영역은 인간 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항체.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 불변 영역은 Fc 효과기 양성인, 항체.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 항체는 IgG1인, 항체.
  7. 제 6항에 있어서, 서열번호 410의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 417의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  8. 제 1항에 있어서, 다중특이적 항체인, 항체.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 in vitro 숙주 세포.
  10. 인간 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 암은 신장세포암, 두경부암, 흑색종, 비-소세포 폐암, 식도 암종, 자궁경부암 또는 확산성 대형 B-세포 림프종인, 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물은 상기 환자에게 항-ICOS 항체 및 항-PD-L1 항체를 투여하는 것을 포함하는 것인, 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 아테졸리주마브(atezolizumab)인, 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 항-ICOS 항체 및 상기 항-PDL1 항체는 각각 ADCC, ADCP 및 CDC를 매개할 수 있는, 조성물.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 항-ICOS 항체는 인간 IgG1 항체이고, 상기 항-PDL1 항체는 인간 IgG1 항체인, 조성물.
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