TWI760352B - 抗ｉｃｏｓ抗體 - Google Patents

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宜彊 李
馬修 約翰 馬克考特
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克瑞恩克斯 卡珊德拉 凡
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Abstract

結合ICOS(可誘導型T細胞共刺激子)的抗體。抗ICOS抗體於調節調節性T細胞和效應T細胞間的比率以刺激患者之免疫系統的治療用途，包括於治療癌症的用途。使用基因轉殖剔除小鼠產生抗ICOS抗體(包括物種交叉反應性抗體)的方法。

Description

抗ICOS抗體
本發明係關於用於刺激哺乳動物免疫反應(特別是T細胞反應)的組成物。本發明亦關於這類組成物於免疫腫瘤學的醫療用途(包括通過在患者中促進抗腫瘤T細胞反應的抗腫瘤療法)以及關於該等組成物於其他疾病和病況(其中將效應T細胞和調節性T細胞間的平衡調節成傾向效應T細胞活性(例如通過刺激效應T細胞及/或通過耗盡調節性T細胞)是治療上有益的)用途。
ICOS(可誘導型T細胞共刺激子)為涉及調節免疫反應(特別是體液免疫反應)的CD28基因家族之一個成員，其於1999年首次被報導[1]。其為一個55kDa的跨膜蛋白質，其呈具有兩個有區別地糖化的子單元的雙硫連結的同元二聚體。ICOS僅表現在T淋巴球上，且在各種各樣的T細胞子群上找到。其在初始T淋巴球(naïve T lymphocyte)上以低水平存在但其表現在免疫活化後被快速地誘導，對促發炎刺激(諸如於TCR之接觸(engagement)和使用CD28的共刺激)反應而被向上調節[2、3]。ICOS參與了T細胞活化之晚期、記憶T細胞形成且重要地在透過T細胞依賴性B細胞 反應的體液反應之調節[4、5]。細胞內地，ICOS結合PI3K並活化激酶磷脂肌醇依賴性激酶1(PDK1)和蛋白質激酶B(PKB)。ICOS之活化預防細胞死亡並向上調節細胞代謝。於缺乏ICOS下(ICOS剔除)或於抗ICOS中和性抗體之存在下，會有促發炎反應之抑制。
ICOS與表現在B細胞和抗原呈現細胞(APC)上的ICOS配體(ICOSL)結合[6、7]。作為共刺激性分子，其起調節針對抗原的TCR介導的免疫反應和抗體反應的作用。ICOS在T調節細胞上的表現可能是重要的，因為已暗示此種細胞類型於癌症細胞之免疫監視扮演負向角色-在卵巢癌對於此有浮現中的證據[8]。重要地，已報導ICOS相較於在腫瘤微環境中出現的CD4+和CD8+效應細胞在腫瘤內調節性T細胞(TReg)上表現較高。使用具有Fc介導的細胞效應功能的抗體之TReg之耗盡已在臨床前模型中展現強大的抗腫瘤效力[9]。越來越多的證據暗示ICOS與在使用免疫查核點抑制劑治療的動物模型以及患者兩者中的抗腫瘤功效有牽連。在ICOS或ICOSL不足的小鼠中，抗CTLA4療法之抗腫瘤功效減低[10]而在正常小鼠ICOS配體在黑色素瘤和前列腺癌增加抗CTLA4治療之有效性[11]。此外，在人類中，一個晚期黑色素瘤患者之回顧性研究顯示ICOS之水平於伊匹單抗(ipilimumab)(抗CTLA4)治療後增高[12]。此外，ICOS表現在使用抗CTLA4治療的膀胱癌患者中被向上調節[13]。亦已觀察到在使用抗CTLA4療法治療的癌症患者中，大多數腫瘤專一性IFNγ生產性CD4 T細胞是ICOS陽性而ICOS陽性CD4 T細胞之持續性提高與存活有關連[12、13、14]。
WO2016/120789描述抗ICOS抗體並提議其等用於活化T細 胞和用於治療癌症、感染性疾病及/或敗血症之用途。已產生一些鼠類抗ICOS抗體，其中一個子群被報導為人類ICOS受體之促效劑。抗體「422.2」被選擇作為先導抗ICOS抗體且被人類化以產生被命名為「H2L5」的人類「IgG4PE」抗體。報導了H2L5對於人類ICOS具有1.34nM的親和力且對於食蟹獼猴ICOS具有0.95nM的親和力，以在T細胞中誘導細胞介素生產，並聯合CD3刺激向上調節T細胞活化標記。然而，已報導當使用H2L5hIgG4PE治療時，帶有移植的人類黑色素瘤細胞的小鼠相較於對照處理組僅顯示極微的腫瘤生長延遲或存活之增加。該抗體於加上伊匹單抗(抗CTLA-4)或派姆單抗(pembrolizumab)(抗PD-1)的組合實驗中相較於伊匹單抗或派姆單抗單一療法亦無法產生顯著的腫瘤生長之進一步抑制。最後，在帶有移植的結腸癌細胞(CT26)的小鼠中，低劑量的H2L5之小鼠交叉反應性替代物組合伊匹單抗或派姆單抗之小鼠替代物相較於單獨抗CTL4和抗PD1療法僅輕微地改善整體存活。在帶有移植的EMT6細胞的小鼠中也類似地顯示強大治療效益之缺乏。
WO2016/154177描述抗ICOS抗體之進一步實例。已報導此等抗體是CD4+ T細胞(包括效應CD8+ T細胞(TEff))之促效劑，且會耗盡T調節細胞(TReg)。已描述該等抗體對TEff vs TReg細胞之選擇功效，憑藉其該等抗體可優先耗盡TReg同時對表現較低水平的ICOS的TEff有極微的功效。已提議將該等抗ICOS抗體用於治療癌症，且已描述加上抗PD-1或抗PD-L1抗體的組合療法。
起增加效應T細胞活性之作用的針對ICOS的抗體在其中CD8+ T細胞反應是有益的免疫腫瘤學和其他醫藥背景(包括多種疾病和病況)中和在疫苗接種攝生法中代表一種治療方法。在許多涉及免疫組分的疾病和病況中，在效應T細胞(TEff)(其發揮CD8+ T細胞免疫反應)和調節性T細胞(TReg)(其藉由向下調節TEff來抑制該免疫反應)間存在有平衡。本發明係關於將此TEff/TReg平衡調節成傾向效應T細胞活性的抗體。觸發ICOS高度陽性調節性T細胞之耗盡的抗體會減輕TEff之抑制，且因此具有促進效應T細胞反應的淨功效。抗ICOS抗體之另外的或補充的機制是透過於ICOS受體水平的促效活性，以刺激效應T細胞反應。
ICOS在效應T細胞(TEff)相較於調節性T細胞(TReg)上的相對表現和此等細胞族群之相對活性會影響抗ICOS抗體活體內之整體功效。作用之想象模式組合效應T細胞之促效作用與ICOS陽性調節性T細胞之耗盡。對此等兩種不同的T細胞族群的有差異的且甚至相反的功效可由於其不同的ICOS表現水平而可達成。抗ICOS抗體之可變和恆定區分別之雙重工程改造可提供藉由影響CD8/TReg比率對效應T細胞反應發揮淨正向功效的分子。促效抗體(其活化ICOS受體)之抗原結合域可與抗體恆定(Fc)區(其促進該抗體與其結合的高度表現細胞之向下調節及/或清除)組合。可使用效應陽性恆定區以募集對抗目標細胞(TReg)的細胞效應功能，例如以促進抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。該抗體因此可作用以促進效應T細胞活化和以向下調節免疫抑制性T調節細胞兩者。因為ICOS在TReg上相較於在TEff上被更高度地表現，可達成治療性平衡，藉其Teff功能被促進而TReg被耗盡， 導致T細胞免疫反應(例如抗腫瘤反應或其他治療上有益的T細胞反應)之淨增加。
數種臨床前和臨床研究已顯示腫瘤微環境(TME)中的高效應T細胞對T-reg細胞比率和整體存活間有強正相關。已報導於卵巢癌患者中，CD8：T-reg細胞之比率為良好的臨床結果之指標[15]。在轉移性黑色素瘤患者中於接受伊匹單抗(ipilumumab)後觀察到類似的結果[16]。於臨床前研究中，亦已顯示TME中的高效應細胞：T-reg比率與抗腫瘤反應相關連[43]。
本發明提供結合人類ICOS的抗體。該等抗體靶向ICOS細胞外域並藉此與表現ICOS的T細胞結合。提供以下抗體之實例：已經設計以對ICOS具有促效性功效，因此增強效應T細胞之功能，如由增加IFNγ表現和分泌的能力所顯示的。如以上所述的，抗ICOS抗體亦可經工程改造以耗盡其等與之結合的細胞，其應具有以下功效：優先地向下調節調節性T細胞、提高此等細胞對效應T細胞反應之抑制性功效並因此促進整體效應T細胞反應。無論其作用機制為何，依照經驗展現了根據本發明的抗ICOS抗體確實會刺激T細胞反應且具有活體內抗腫瘤功效，如於實施例中所顯示的。通過適當的抗體形式(諸如該等包括具有所欲水平的Fc效應功能或在適當時缺乏這類效應功能的恆定區者)之選擇，該等抗ICOS抗體可被修改以用於各種各樣的醫藥背景中，包括其中效應T細胞反應是有益的及/或其中調節性T細胞之抑制是所欲的疾病和病況之治療。
例示性抗體包括STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009，其序列係 於本文中提供。
根據本發明的抗體可以是與以下者競爭與人類ICOS之結合者：包含STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)的抗體(例如人類IgG1、或scFv)，視情況為包含STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之VH和VL域的抗體。
根據本發明的抗體可包含STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009之任一者之一或多個CDR(例如任何這些抗體的所有6個CDR、或HCDR及/或LCDR之組)或其變體，如於本文中描述的。
該抗體可包含抗體VH域和抗體VL域，該VH域包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3且該抗體VL域包含CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR3係選自STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009的抗體之HCDR3或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該HCDR3。該HCDR2可以是所選抗體之HCDR2或其可包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該HCDR2。該HCDR1可以是所選抗體之HCDR1或其可包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該HCDR1。
該抗體可包含抗體VL域和抗體VL域，該VL域包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3且該抗體VL域包含CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該LCDR3係選自STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、 STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009的抗體之LCDR3或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該LCDR3。該LCDR2可以是所選抗體之LCDR2或其可包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該LCDR2。該LCDR1可以是所選抗體之LCDR1或其可包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該LCDR1。
抗體可包含：抗體VH域，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3、和抗體VL域，其包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該重鏈互補決定區是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之重鏈互補決定區或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004或STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009重鏈互補決定區；及/或其中該輕鏈互補決定區是抗體STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之輕鏈互補決定區，或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009輕鏈互補決定區。
抗體可包含VH域，該VH域包含重鏈互補決定區(HCDR)之組HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1是STIM003之HCDR1，HCDR2是STIM003之HCDR2， HCDR3是STIM003之HCDR3，或包含具有1、2、3、4、5或6個胺基酸改變的該組HCDR。
抗體可包含VL域，該VL域包含輕鏈互補決定區(LCDR)之組LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1是STIM003之LCDR1，LCDR2是STIM003之LCDR2，LCDR3是STIM003之LCDR3，或包含具有1、2、3或4個胺基酸改變的該組LCDR。
胺基酸改變(例如取代)可位於該等CDR中的任何殘基位置。胺基酸改變之實例為該等在圖35、圖36和圖37(其等顯示抗ICOS抗體之變體序列之比對)中闡明者。因此，於STIM003 CDR中的胺基酸改變可以是在如圖36中指出的於抗體CL-74570或抗體CL-71642中的對應位置出現的殘基之取代。
STIM003 CDR中的實例胺基酸改變是在以下殘基位置(根據IMGT定義)的取代：在HCDR1中，於IMGT位置28的取代，視情況為保守性取代，例如V28F。
在HCDR2中，於IMGT位置59、63及/或64的取代。視情況於位置59的取代是N59I，於位置63的取代是G63D及/或於位置64的取代是D64N及/或D64S。
在HCDR3中，於IMGT位置106、108、109及/或112的取代。視情況於位置106的取代是R106A，於位置108的取代是F108Y，於位置109的取代是Y109F及/或於位置112的取代是H112N。
在LCDR1中，於位置36的取代，例如R36S。
在LCDR3中，於位置105、108及/或109的取代。視情況於位置105的取代是H105Q，於位置108的取代是D108G及/或於位置109的取代是M109N或M109S。
本發明之抗體可包含對應於人類生殖系基因節段序列的VH及/或VL域架構區。例如，其可包含一或多個STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之架構區。該架構區或該等架構區可以是FR1、FR2、FR3及/或FR4。
如在實施例12中描述的，表E12-1顯示透過重組產生此等抗體之VH域的人類生殖系V、D和J基因節段和且表E12-2顯示透過重組產生此等抗體之VL域的人類生殖系V和J基因節段。本發明之抗體VH和VL域可以是基於此等V(D)J節段。
本發明之抗體可包含抗體VH域，該抗體VH域(i)衍生自人類重鏈V基因節段、人類重鏈D基因節段和人類重鏈J基因節段之重組，其中該V節段是IGHV1-18(例如V1-18*01)、IGVH3-20(例如V3-20*d01)、IGVH3-11(例如V3-11*01)或IGVH2-5(例如V2-5*10)；該D基因節段是IGHD6-19(例如IGHD6-19*01)、IGHD3-10(例如IGHD3-10*01)或IGHD3-9(例如IGHD3-9*01)；及/或該J基因節段是IGHJ6(例如IGHJ6*02)、IGHJ4(例如IGHJ4*02)或IGHJ3(例如IGHJ3*02)、或 (ii)包含架構區FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1與人類生殖系V基因節段IGHV1-18(例如V1-18*01)、IGVH3-20(例如V3-20*d01)、IGVH3-11(例如V3-11*01)或IGVH2-5(例如V2-5*10)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，FR2與人類生殖系V基因節段IGHV1-18(例如V1-18*01)、IGVH3-20(例如V3-20*d01)、IGVH3-11(例如V3-11*01)或IGVH2-5(例如V2-5*10)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，FR3與人類生殖系V基因節段IGHV1-18(例如V1-18*01)、IGVH3-20(例如V3-20*d01)、IGVH3-11(例如V3-11*01)或IGVH2-5(例如V2-5*10)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，及/或FR4與人類生殖系J基因節段IGJH6(例如JH6*02)、IGJH4(例如JH4*02)或IGJH3(例如JH3*02)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變。
VH域之FR1、FR2和FR3典型與相同生殖系V基因節段比對。因此，例如，該抗體可包含衍生自人類重鏈V基因節段IGHV3-20(例如VH3-20*d01)、人類重鏈D基因節段和人類重鏈J基因節段IGJH4(例如JH4*02)之重組的VH域。抗體可包含VH域架構區FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1、FR2和FR3各自與具有至多達1、2、3、4或5個胺基酸改變的人類生殖系V基因節段IGHV3-20(例如IGVH3-20*d01)比對，和與具有至多達1、2、3、4或5個胺基酸改變的人類生殖系J基因節段IGHJ4(例如IGHJ4*02)比對的FR4。比對可以是精確的，但於一些例子中一或多個殘基可從生殖系突變，因此可能存在胺基酸取代、或於更少的例子中存在缺失或插入。
本發明之抗體可包含抗體VL域，該抗體VL域(i)衍生自人類輕鏈V基因節段和人類輕鏈J基因節段之重組，其中該V節段是IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)、IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)、IGKV1D-39(例如IGKV1D-39*01)或IGKV3-11(例如IGKV3-11*01)，及/或該J基因節段是IGKJ4(例如IGKJ4*01)、IGKJ2(例如IGKJ2*04)、IGLJ3(例如IGKJ3*01)或IGKJ1(例如IGKJ1*01)；或(ii)包含架構區FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1與人類生殖系V基因節段IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)、IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)、IGKV1D-39(例如IGKV1D-39*01)或IGKV3-11(例如IGKV3-11*01)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，FR2與人類生殖系V基因節段IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)、IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)、IGKV1D-39(例如IGKV1D-39*01)或IGKV3-11(例如IGKV3-11*01)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，FR3與人類生殖系V基因節段IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)、IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)、IGKV1D-39(例如IGKV1D-39*01)或IGKV3-11(例如IGKV3-11*01)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，及/或FR4與人類生殖系J基因節段IGKJ4(例如IGKJ4*01)、IGKJ2(例如IGKJ2*04)、IGKJ3(例如IGKJ3*01)或IGKJ1(例如IGKJ1*01)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變。
VL域之FR1、FR2和FR3典型與相同生殖系V基因節段比 對。因此，例如，該抗體可包含衍生自人類輕鏈V基因節段IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)和人類輕鏈J基因節段IGKJ3(例如IGKJ3*01)之重組的VL域。抗體可包含VL域架構區FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1、FR2和FR3各自與具有至多達1、2、3、4或5個胺基酸改變的人類生殖系V基因節段IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)比對，和與具有至多達1、2、3、4或5個胺基酸改變的人類生殖系J基因節段IGKJ3(例如IGKJ3*01)比對的FR4。比對可以是精確的，但於一些例子中一或多個殘基可從生殖系突變，因此可能存在胺基酸取代、或於更少的例子中存在缺失或插入。
根據本發明的抗體可包含抗體VH域，該抗體VH域是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004或STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之VH域，或具有與STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之抗體VH域序列至少90%相同的胺基酸序列。該胺基酸序列一致性可以是至少95%。
該抗體可包含抗體VL域，該抗體VL域是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004或STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之VL域，或具有與STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之抗體VL域序列至少90%相同的胺基酸序列。該胺基酸序列一致性可以是至少95%。
具有STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之HCDR或具有該等 CDR之變體的抗體VH域可與具有相同抗體之LCDR或具有該等CDR之變體的抗體VL域配對。同樣地，STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之任一者之VH域或該VH域之變體可與相同抗體之VL域或相同抗體之VL域變體配對。
例如，該抗體可包含抗體STIM001 VH域和STIM001 VL域。於另一個實例中，該抗體可包含抗體STIM002 VH域和STIM002 VL域。於另一個實例中，該抗體可包含抗體STIM003 VH域和STIM003 VL域。
抗體可包括恆定區，視情況為人類重鏈及/或輕鏈恆定區。例示性同型為IgG，例如人類IgG1。
本發明之另外的方面包括編碼該等於本文中描述的抗體之序列的核酸分子、含有這類核酸的宿主細胞、和藉由培養該等宿主細胞和表現並視情況分離或純化該等抗體來產生該等抗體的方法。藉此獲得所表現的抗體。於本文中描述的抗體之VH和VL域可類似地產生且為本發明之方面。亦提供包含該等抗體的醫藥組成物。
本發明之其他方面係關於ICOS剔除非人類動物和其等於產生針對人類ICOS的抗體之用途。在ICOS剔除動物中，ICOS不被表現，例如因為編碼ICOS的基因已被失活或自該動物之基因體缺失。這類動物可用於產生物種交叉反應性抗體，其等辨識人類ICOS和來自該非人類物種的ICOS兩者。免疫耐受之正常方法意謂辨識「自我」抗原的淋巴球是缺失的或失活的以預防體內的自體免疫反應，而在非人類剔除動物中內源性ICOS抗原之缺乏意謂該動物之免疫系統應不容忍該抗原且因此在以重組蛋白質 的形式注射ICOS或使用表現ICOS的細胞株或囊泡時可引發針對ICOS的免疫反應。該剔除動物之全套免疫應含有能夠辨識來自該動物物種的ICOS蛋白質的淋巴球。以人類ICOS免疫的非人類測試動物(例如小鼠)可因此產生結合人類ICOS和該測試動物ICOS(例如小鼠ICOS)兩者的抗體。
此具有至少兩個優點。首先，物種交叉反應性抗體可在將其進一步用於人類臨床試驗之開發之前用於非人類測試動物中的臨床前測試。其次，剔除動物之免疫系統可能可以辨識較大數量的可能的人類ICOS分子上之抗原決定基(相較於該等由ICOS表現性動物所辨識者)，使得該剔除動物之全套免疫可含有較大的抗體之功能多樣性。由於在來自不同的物種之同源ICOS分子之序列間有相似性，非人類動物之免疫系統可普通地容忍與非人類動物ICOS者配對的人類ICOS蛋白質之區域，而此容忍不會在剔除動物中發生。
使用ICOS剔除動物之能力、和其於產生交叉反應性抗體的優點於實施例中顯示。以下者是特別令人意外的：ICOS剔除動物可被成功地免疫以產生抗體反應，因為ICOS本身涉及免疫系統生物學(諸如生發中心(germinal center)之形成和維持)且透過其在T濾泡性輔助細胞(其等為ICOS+ve細胞)的角色促成免疫反應之產生[37]。鑑於此，可能預期ICOS剔除動物最多只會產生極差的抗體反應。令人意外地，在ICOS剔除小鼠中獲得強力價，且於該全套抗體中分離出高度功能性抗體，包括所欲的交叉反應性抗體。
本發明之例示性具體實例於所附申請專利範圍中提出。
本發明之某些方面和具體實例現將參照所附圖式更詳細描述。
圖1：藉由流式細胞測量術的針對在CHO細胞上表現的人類ICOS和小鼠ICOS兩者的ICOS KO和野生型Kymouse之血清力價之測定。數據闡明在(a)ICOS KO小鼠(KO)或(b)野生型非ICOS KO小鼠(HK或HL)(各自以人類ICOS表現性MEF細胞和人類ICOS蛋白質免疫)之血清中的免疫球蛋白結合在CHO細胞上表現的人類ICOS(人類ICOS結合性)或小鼠ICOS(小鼠ICOS結合性)之能力。幾何平均值是與細胞結合的免疫球蛋白之螢光強度(如藉由流式細胞測量術測定的)之測量結果。
圖2：使用人類ICOS受體的人類ICOS-配體中和HTRF。呈人類IgG1形式的STIM001至STIM009抗ICOS mAb相較於C398.4A和各自的同型對照組的中和特性。代表四個實驗的數據。
圖3：使用小鼠ICOS受體的小鼠ICOS-配體中和HTRF。呈人類IgG1形式的STIM001至STIM009抗ICOS mAb相較於C398.4A和各自的同型對照組的中和特性。代表三個實驗的數據。
圖4：使用人類ICOS受體的人類ICOS-配體直接中和HTRF。呈人類IgG4.PE形式的STIM001至STIM009抗ICOS mAb相較於C398.4A和各自的同型對照組的中和特性。代表四個實驗的數據。
圖5：使用小鼠ICOS受體的小鼠ICOS-配體中和HTRF。呈人類IgG4.PE形式的STIM001至STIM009抗ICOS mAb相較於C398.4A和各自的同型對照組的中和特性。代表四個實驗的數據。
圖6a：藉由使用新鮮分離的NK細胞作為效應細胞的對MJ細胞的STIM001介導的ADCC之濃度依賴性研究。將效應細胞和目標細胞(5：1的效應細胞：目標細胞比例)與抗體一起培養2小時。如在製造商套組說明中描述地測量從經溶胞目標細胞釋放的BATDA。HC是混合同型對照組。
圖6b、c、d：使用新鮮分離的NK細胞作為效應細胞的對MJ細胞的STIM001和STIM003介導的ADCC之濃度依賴性研究。將效應細胞和目標細胞(5：1的效應細胞：目標細胞比例)與抗體一起培養2小時。如在製造商套組說明中描述地測量從經溶胞目標細胞釋放的BATDA。HC是混合同型對照組。
圖6e、f、g：使用新鮮分離的NK細胞作為效應細胞的對經ICOS轉染的CCRF-CEM細胞的STIM001(hIgG1)和STIM003(hIgG1)介導的ADCC之濃度依賴性研究。將效應細胞和目標細胞(5：1的效應細胞：目標細胞比例)與抗體一起培養4小時。如在製造商套組說明中描述地測量從經溶胞目標細胞釋放的BATDA。HC是混合同型對照組。
圖7、圖8、圖9：當以單一療法的形式或與抗PDL1組合給藥時，抗ICOS抗體抑制CT26腫瘤生長並改善存活。STIM001 mIgG2a相較於mIgG1形式更有效。治癒的或具有穩定的疾病的動物之數目在各圖上指出。
圖10：2x2組合CT26活體內效力研究。各個治療組由「蛛網圖」表現，其顯示個別動物之腫瘤大小(每組n=10)。當與抗PDL1抗體組合時，STIM001延遲腫瘤生長並改善經治療動物之存活。於STIM001 mIgG2a之存在下觀察到的效力優於STIM001 mIgG1者。最後，STIM001 mIgG2a組合抗PDL1 mIgG2a對於觸發該抗腫瘤反應而言是最有效的組合，其導致60%的動物自其疾病治癒。對於各個組，自其疾病治癒的動物之數目於各圖之右上角指出。於第6、8、10、13、15和17日給藥。
圖11：顯示使用抗ICOS或抗PDL1單一療法或組合療法治療的動物隨時間的CT26腫瘤體積的圖。各個治療組由「蛛網圖」表現，其顯示個別動物之腫瘤大小(每組n=10)。對於各個組，具有小於100mm^3的腫瘤大小的動物(穩定/自其疾病治癒)之數目於各圖之右上角指出)。於第6、8、10、13、15和17日執行給藥。給藥時間以陰影區域指出。(a)同型對照組；(b)抗PDL1 mIgG2a AbW；(c)抗ICOS STIM003 mIgG1；(d)抗ICOS STIM003 mIgG2a；(e)抗PDL1 mIgG2a AbW+STIM003 mIgG1；(f)抗PDL1 mIgG2a AbW+STIM003 mIgG2a。當與抗PDL1(AbW)mIgG2a組合時，STIM003 mIgG2顯著地抑制CT26腫瘤生長。
圖12：MJ細胞試管內活化分析-結合珠粒的。與珠粒結合的STIM001、STIM002和STIM003抗ICOS mAb相較於抗ICOS C398.4A和各自的同型對照組之刺激特性。數據代表兩個實驗之平均值(於C398.4A同型對照組珠粒的例子中n=1)。
圖13：MJ細胞試管內活化分析-結合盤的。結合盤的STIM001、STIM002、STIM003和STIM004抗ICOS mAb相較於抗ICOS C398.4A和各自的同型對照組之刺激特性。數據表示兩個實驗之平均值。
圖14：與經活化T細胞結合之STIM001和STIM003 hIgG1的FACS分析。(a)顯示與經活化T細胞結合之預標記抗體的劑量反應之代 表性實驗，而(b)顯示依照裸抗體接著使用經標記的二級抗體偵測之劑量反應的結合。表格指示相關EC50(M)，其使用GraphPad Prism測定。
圖15：STIM001和STIM003於腫瘤位置對T細胞區室顯示同型依賴性功效。在Balb/c雌性小鼠中皮下地移植總共1x10E5個CT-26腫瘤細胞。於移植後第13日和第15日，腹膜內地給藥動物抗體或食鹽水(n=10/各組)。於移植後第16日，從帶有腫瘤的動物(n=8/各組)收穫脾臟和腫瘤，解離並染色之以用於FACS分析。A，對CD4細胞為陽性的CD3細胞之百分比。B，對CD8細胞為陽性的CD3細胞之百分比。C，Foxp3+ & CD25+的CD4細胞之百分比。D，脾臟中對Foxp3+ & CD25+為陽性的CD4細胞之百分比。E，總CD4細胞中CD4效應細胞之百分比。F，CD8效應細胞對T-Reg細胞之比率。G，CD4效應細胞對T-Reg細胞之比率。使用GraphPad Prism執行統計分析，將所有的抗體治療組與食鹽水治療組作比較，於顯著時(p<0.05)註記P值。數值表示平均值+SD(n=8小鼠/組)。對於F：數值表示平均值+SEM。
圖16：來自對在T細胞活化分析1中使用抗CD3/抗CD28 dynabead共刺激3日的經分離的人類T細胞的STIM001(hIgG1)和STIM003(hIgG1)促效功效之濃度依賴性研究的實施例數據(參見實施例9b)。使用IFN-γ生產作為促效性功效之指標。以結合盤、可溶或交聯可溶(連結Fc的Ab)的形式測試STIM001(hIgG1)和STIM003(hIgG1)並將其等與混合同型對照組(HC hIgG1)比較。倉鼠抗體C398.4A和其同型對照組(倉鼠IgG)包括在結合盤的分析之比較。上部顯示來自結合盤的抗體的數據。下部顯示來自呈可溶和交聯形式的IgG1抗體的數據。左部和右部分別使用 來自兩名獨立的人類供體的T細胞。
圖17：T細胞活化分析1中的STIM001之實施例數據組(參見實施例9)。數據指示來自8名獨立的人類供體的T細胞的由一個給定劑量的STIM001(hIgG1)或其混合同型對照組(HC IgG1)誘導的IFN-γ之水平。以5μg/ml使用結合盤的抗體(圖17a)。以15μg/ml使用可溶的抗體(圖17b)。各點代表一名供體，由數字(例如D214)鑑認。使用Wilcoxon統計檢定評估顯著性：*，p<0.05和**，p<0.01。
圖18：T細胞活化分析1中STIM003之實施例數據組(參見實施例9)。數據指示來自8名獨立的健康人類供體的T細胞的由一個給定劑量的STIM003(hIgG1)或其混合同型對照組(HC hIgG1)誘導的IFN-γ之水平。以15μg/ml使用可溶的抗體(圖18a)。以5μg/ml使用結合盤的抗體(圖18b)。各點代表一名供體，由數字(例如D214)鑑認。使用Wilcoxon統計檢定評估顯著性：*，p<0.05和**，p<0.01。
圖19：來自T細胞活化分析2的實施例數據(參見實施例9c)。STIM001(hIgG1)和STIM003(hIgG1)對以下的經分離的人類T細胞的促效功效之研究：使用抗CD3/抗CD28 dynabead刺激3日，接著放置在培養基中3日並最終使用結合盤的STIM001、STIM003或C398.4A Ab +/- CD3 Ab再刺激。比較由以下者誘導的IFN-γ(A、B)、TNF-α(C、D)和IL-2(E、F)之水平的數據：STIM001、STIM003 vs其混合對照組IgG1(A、C、E)或C398.4A vs其倉鼠IgG對照組(B、D、F)，於一個給定的劑量和與CD3 Ab組合(TCR接觸)。各點代表可由其數字(例如D190)鑑認的獨立的供體。使用Wilcoxon統計檢定評估Ab和其同型對照組間的統計顯著性並 指出p值。注意STIM003濃度與該等HC IgG1者稍微不同(5.4 vs 5μg/ml)。
圖20：顯示在CT26腫瘤中和在帶有腫瘤的動物之脾臟(其表面上表現ICOS)中免疫細胞(CD8 T效應細胞、CD4 T效應細胞和CD4/FoxP3 TReg細胞)之百分比的圖。數值表示平均±SD(n=8)。使用非參數鄧恩多重比較法計算P值。NS=非顯著；***=p<0.001；****=p<0.0001。
圖21：在免疫細胞(CD8 T效應細胞、CD4 T效應細胞和CD4/FoxP3 TReg)之表面上的ICOS之相對表現-如由平均螢光強度(MFI)測定的。數值表示平均±SD(n=8)。使用非參數鄧恩多重比較法計算P值。****=p<0.0001，**=p<0.01。注意在脾臟(低)和腫瘤(高)間的螢光強度之差異。
圖22：STIM001和STIM003對在CT26腫瘤之微環境中不同免疫細胞之百分比的功效。*=p<0.05。
圖23：抗體STIM001和STIM003對在CT26腫瘤之微環境中調節性T細胞(CD4+/FoxP3+細胞)之百分比的功效。**=p<0.05、****=p<0.0001。數值表示平均±SD(n=8)。使用非參數鄧恩多重比較法計算P值。
圖24：STIM001和STIM003 mIgG2在CT26腫瘤中顯著地增加CD8效應T細胞對TReg的比率和CD4效應T細胞對TReg的比率。該比率是藉由在該腫瘤中的效應細胞之百分比除以在腫瘤中的調節性T細胞之百分比來決定。
圖25：抗體對在帶有CT26腫瘤的動物之脾臟中免疫細胞之百分比的功效。
圖26：抗體對在帶有CT26腫瘤的動物之脾臟中調節性T細胞(CD4+/FoxP3+細胞)之百分比的功效。
圖27：在帶有CT26腫瘤的動物之脾臟中(A)CD8效應細胞：Treg比率和(B)CD4：TReg比率。
圖28：在經活化的模里西斯食蟹獼猴泛T細胞上的與AF647共軛的STIM001、STIM003和hIgG1混合對照組(HC IgG1)之表面染色。來自使用不同的T細胞之供體來源的分析的數據分別在A和B中顯示。在表格中指出EC50值。
圖29：CT26 Balb/C模型之卡本麥爾曲線。陰影顯示給藥窗口(dosing window)。對數秩p<0.0001。
圖30、圖31、圖32、圖33：顯示在實施例20中描述的研究之小鼠隨時間的A20腫瘤之體積的圖。各個治療組由蛛網圖表現，其顯示個別動物之腫瘤大小，每組n=8。對於各個組，無腫瘤之徵兆(表示自疾病治癒)的動物之數目在該圖之左下角指出。於腫瘤細胞移植後第8、11、15、18、22、25和29日執行給藥且藉由灰色加陰影區域指出給藥時間。相較於對照組(圖30)和抗PD-L1治療組(圖31)，STIM001 mIgG2a(圖32)和STIM003 mIgG2a(圖33)治療組顯示顯著的A20腫瘤生長之抑制。
圖34：來自在實施例11c中描述使用抗PD-L1 mIgG2a抗體與單劑vs多劑的STIM003 mIgG2a組合的CT26活體內效力研究的數據。各個治療組由「蛛網圖」表現，其顯示個別動物之腫瘤大小(每組n=8)。對於各個組，自其疾病治癒的動物之數目於各圖之右下角指出。各個抗體之給藥日由各圖下方之箭頭指出。
圖35：STIM002 VH(頂部)和VL(底部)域胺基酸序列，其等顯示於STIM001、STIM002B和相關抗體CL-61091、CL-64536、CL-64837、CL-64841和CL-64912的對應序列中及/或於人類生殖系中不同的殘基。序列編號是根據IMGT。
圖36：STIM003 VH(頂部)和VL(底部)域胺基酸序列，其等顯示於相關抗體CL-71642和CL-74570之對應序列中及/或於人類生殖系中不同的殘基。序列編號是根據IMGT。從定序獲得的抗體CL-71642之VL域於此處顯示(無N端殘基)。基於比對，可看到完整VH域序列會包含N端麩胺酸。
圖37：STIM007 VH(頂部)和VL(底部)域胺基酸序列，其等顯示於STIM008之對應序列中及/或於人類生殖系中不同的殘基。序列編號是根據IMGT。
圖38：STIM003(抗ICOS)和AbW(抗PD-L1)mIgG2a抗體在J558同基因模型中的功效。各個治療組由「蛛網圖」表現，其顯示個別動物之腫瘤大小(每組n=10或n=8)。STIM003單一療法展現一些效力，其中8隻動物中的3隻自其疾病治癒。類似地，抗PDL1在此模型中是有效的，其中8隻動物中的6隻於第37日時自其疾病治癒。當與抗PDL1抗體組合時，STIM003 mIgG2完全抑制腫瘤生長並改善經治療動物之存活。對於各個組，自其疾病治癒的動物之數目於各圖之右下角指出。由虛線指出給藥日(第11、15、18、22、25和29日)。
圖39：在腫瘤組織中不同的TILS細胞子類型上的ICOS表現之定量(陽性細胞之百分比和相對表現/dMFI)。(A)對ICOS表現為陽性的 免疫細胞子類型之%和(B)使用食鹽水或抗PD-L1或抗PD-1替代抗體治療的動物之免疫細胞子類型之ICOS dMFI(在ICOS陽性細胞上的相對ICOS表現)。於第0日使用100μl的1 x 106個活細胞/ml移植小鼠(n=7或n=8)。於第13日和第15日使用130ug的抗體i.p給藥動物。於第16日分離組織樣本並分析。僅於TReg族群(最右側的圖)包括CD4+/FOXP3+細胞並自「效應」CD4細胞(最左側的圖)(其等皆為Foxp3陰性)中排除。參見實施例22。
圖40：來自A20活體內效力研究的數據。各個治療組由「蛛網圖」表現，其顯示個別動物之腫瘤大小(每組n=10)。對於各個組，自其疾病治癒的動物之數目在各圖上指出。對於多劑，於第8、11、15、18、22和25日給藥，由虛線指出。對於單劑，動物僅於第8日接受IP注射。(A)食鹽水；(B)STIM003 mIgG2a多劑；(C)STIM003 mIgG2a單劑。參見實施例23。
圖41：在實施例23中使用STIM003 mIgG2a 60μg固定劑量報導的研究之卡本-麥爾(Kaplan-Meier)曲線。SD=單劑，第8日。MD=從第8日開始多劑BIW。
圖42：在來自以食鹽水給藥的帶有CT26腫瘤的動物(每個時間點n=4)之主要T細胞子群(T-reg[CD4+/FoxP3+]、CD4 Eff[CD4+/FoxP3-]細胞和CD8+)上的ICOS表現。於治療後第1、2、3、4和8日進行免疫細胞表型鑑定並染色以用於在所有時間點在所有組織的ICOS表現。A-D顯示在所有時間點在四種不同的組織ICOS陽性細胞之百分比。E-H顯示所有時間點在所有四種不同的組織的ICOS dMFI(相對表現)。參見實施例24。
圖43：展示於TME中對STIM003 mIgG2a抗體反應的T-reg 耗盡的FACS分析。帶有CT-26腫瘤的動物是在腫瘤細胞移植後第12日使用單劑(6、60或200μg)的STIM003治療。於治療後第1、2、3、4和8日收穫組織(每個時間點n=4)以用於FACS分析。總腫瘤中的T-reg細胞(CD4+CD25+Foxp3+)之百分比(A)和血液中T-reg細胞之百分比(B)是在不同的時間點顯示。參見實施例24。
圖44：對STIM003 mIgG2a反應的CD8：T-reg和CD4 eff：T-reg比率之增加。帶有CT-26腫瘤的動物於腫瘤細胞移植後第12日接受單劑(6、60或200μg)的STIM003 mIgG2a。於治療後第1、2、3、4和8日收穫組織(每個時間點n=4)以用於FACS分析並計算T eff對T-reg比率。(A)&(B)，於腫瘤和血液中的CD8：T-reg比率，(C)&(D)於腫瘤和血液中的CD4-eff：T-reg比率。參見實施例24。
圖45：STIM003治療與經由TIL的去顆粒化和Th1細胞介素生產之增加相關。於治療後第8日，分離TIL並執行FACS分析以偵測CD4和CD8 T細胞上的CD107a表現(A-B)。平行地，在布雷非德菌素A(Brefeldin-A)之存在下將來自經解離腫瘤的細胞放置4hr，針對T細胞標記染色細胞並使其可滲透化以用於細胞內染色以偵測IFN-γ和TNF-α(C-H)。參見實施例24。
ICOS
根據本發明的抗體結合人類ICOS之胞外域。因此，該等抗體結合ICOS表現性T淋巴球。本文提及的「ICOS」或「ICOS受體」可為 人類ICOS，除非前後文另外指定。人類、食蟹獼猴和小鼠ICOS之序列於所附序列表中顯示，且可自NCBI以以下者獲得：人類NCBI ID：NP_036224.1、小鼠NCBI ID：NP_059508.2和食蟹獼猴GenBank ID：EHH55098.1。
交叉反應性
根據本發明的抗體較佳為交叉反應性，且可例如結合小鼠ICOS以及人類ICOS之胞外域。該等抗體可結合其他非人類ICOS，包括靈長類(諸如食蟹獼猴)之ICOS。意欲用於人類之治療用途的抗ICOS抗體必須結合人類ICOS，而與其他物種之ICOS的結合在人類臨床背景下不會具有直接治療相關性。儘管如此，本文之數據指出結合人類ICOS和小鼠ICOS兩者的抗體具有使其等特別適用於作為促效劑和耗盡性分子的特性。此可導因於一或多個該等交叉反應性抗體所靶向的特別抗原決定基。然而，無論基礎理論為何，交叉反應性抗體具有高價值且為臨床前和臨床研究之治療分子之極佳的候選物。
如於實驗性實施例中解釋的，本文所描述的STIM抗體是使用KymouseTM技術產生，於該技術中小鼠已經工程改造以缺乏小鼠ICOS之表現(ICOS剔除)。ICOS剔除基因轉殖動物和其等於產生交叉反應性抗體之用途是本發明之另外的方面。
定量抗體之物種交叉反應性之程度的方法之一是以其對於抗原或一個物種相較於其他物種之抗原的親和力之差異倍數(例如對於人類ICOS vs小鼠ICOS的親和力之差異倍數)。親和力可被定量成KD，其是 指抗體-抗原反應之平衡解離常數，如由使用如於本文之其他處描述的呈Fab形式的抗體的SPR測定的。物種交叉反應性抗ICOS抗體可在對於結合人類和小鼠ICOS的親和力方面具有以下差異倍數：30倍或更小、25倍或更小、20倍或更小、15倍或更小、10倍或更小或5倍或更小。換句話說，結合人類ICOS之胞外域之KD可以是在其結合小鼠ICOS之胞外域之KD之30倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍以內。若結合兩種物種之抗原的KD符合某閾值(例如若結合人類ICOS之KD和結合小鼠ICOS之KD皆為10mM或更小、較佳為5mM或更小、更較為1mM或更小)，則抗體亦可被視為交叉反應性。該KD可以是10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小。該KD可以是0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、或0.1nM或更小。
結合人類ICOS和小鼠ICOS的交叉反應性之替代判斷基準是抗體中和ICOS配體與ICOS受體結合的能力，諸如於HTRF分析中(參見實施例8)。於本文中提供物種交叉反應性抗體之實例，包括STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM005和STIM006，其各者皆已於HTRF分析中被確認會中和人類B7-H2(ICOS配體)與人類ICOS之結合和中和小鼠B7-H2和小鼠ICOS之結合。當對於人類和小鼠ICOS之抗體交叉反應性是所欲者時，可選擇此等抗體或其變體之任一者。物種交叉反應性抗ICOS抗體可具有在抑制小鼠ICOS與小鼠ICOS受體的IC50之25倍、20倍、15倍、10倍或5倍以內的抑制人類ICOS與人類ICOS受體之結合的IC50，如於HTRF分析中測定的。若抑制人類ICOS與人類ICOS受體之結合的IC50 和抑制小鼠ICOS與小鼠ICOS受體之結合的IC50皆為1mM或更低，較佳為0.5mM或更低(例如30nM或更低、20nM或更低、10nM或更低)，則抗體亦可被視為交叉反應性。該等IC50可以是5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低或2nM或更低。於一些實例中，該等IC50可以是至少0.1nM、至少0.5nM或至少1nM。
專一性
根據本發明的抗體較佳對ICOS有專一性。即，該抗體結合在目標蛋白質(ICOS(人類ICOS、和較佳小鼠及/或食蟹獼猴ICOS，如以上所述的))上的其抗原決定基但不顯示顯著的與不呈現該抗原決定基的分子(包括CD28基因家族中的其他分子)之結合。根據本發明的抗體較佳不結合人類CD28。該抗體較佳亦不結合小鼠或食蟹獼猴CD28。
於透過TCR的抗原辨識之背景中，CD28於與在專門抗原呈現細胞上的其配體CD80和CD86接觸時共刺激T細胞反應。關於多種該等於本文中描述的抗體之活體內用途，避免與CD28結合被認為是有益的。該抗ICOS抗體對於CD28之不結合應使得CD28能夠與其天然配體交互作用並產生適當的T細胞活化之共刺激訊號。此外，該抗ICOS抗體對於CD28之不結合避免超促效作用之風險。CD28之過度刺激可誘導靜止T細胞增殖而無對於透過TCR的同源抗原之辨識的正常需要，潛在地導致T細胞之失控活化和之後的細胞介素釋放症候群，特別是在人類個體中。根據本發明的抗體對於CD28之不辨識因此於其等在人類中的安全臨床使用的方面代表一個優點。
如於本文之其他部分討論的，本發明延伸至多重專一性抗體(例如雙專一性物)。多重專一性(例如雙專一性)抗體可包含(i)針對ICOS的抗體抗原結合位置和(ii)另外的抗原結合位置(視情況為抗體抗原結合位置，如於本文中描述的)，其辨識其他的抗原(例如PD-L1)。可測定個別抗原結合位置之專一性結合。因此，專一性地結合ICOS的抗體包括包含專一性地結合ICOS的抗原結合位置的抗體，其中視情況該針對ICOS的抗原結合位置係包含在另外包括針對一或多個其他抗原的一或多個另外的結合位置的抗原結合分子內，例如結合ICOS和PD-L1的雙專一性抗體。
親和力
可測定抗體與ICOS之結合的親和力。抗體對其抗原之親和力可以以平衡解離常數KD的方式定量，而KD為該抗體-抗原交互作用之締合或結合速率(Ka)和解離(dissociation)或解離(off)速率(kd)之比率Ka/Kd。抗體-抗原結合之Kd、Ka和Kd可使用表面電漿子共振(SPR)測量。
根據本發明的抗體可以以下KD結合人類ICOS之EC域：10mM或更低、較佳是5mM或更低、更佳是1mM或更低。該KD可以是50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、2nM或更低、或1nM或更低。該KD可以是0.9nM或更低、0.8nM或更低、0.7nM或更低、0.6nM或更低、0.5nM或更低、0.4nM或更低、0.3nM或更低、0.2nM或更低、或0.1nM或更低。該KD可以是至少0.001nM，例如至少0.01nM或至少0.1nM。
可使用SPR利用呈Fab形式的抗體執行親和力之定量。適合的方案係如以下者： 1.將抗人類(或其他經抗體恆定區物種匹配的)IgG偶合至生物感應晶片(例如GLM晶片)，諸如藉由一級胺偶合；2.使該抗人類IgG(或其他經匹配物種抗體)暴露至測試抗體(例如呈Fab形式者)以在該晶片上捕捉測試抗體；3.以一個範圍的濃度(例如以5000nM、1000nM、200nM、40nM、8nM和2nM、和以0nM(即單獨緩衝液))使測試抗原通過該晶片之捕捉表面；和4.於25℃下使用SPR測定測試抗體與測試抗原之結合的親和力。緩衝液可以是pH 7.6，150mM NaCl，0.05%清潔劑(例如P20)和3mM EDTA。緩衝液可視情況含有10mM HEPES。可使用HBS-EP作為運行緩衝液。HBS-EP可得自Teknova Inc(加利福尼亞；型錄編號H8022)。
可於pH 1.7下使用10mM甘胺酸進行捕捉表面之再生。此移除所捕捉的抗體並使得該表面能夠用於另一次交互作用。可使用標準技術固有模式將結合數據擬合至1：1(例如使用ProteOn XPR36TM分析軟體固有的模式)。
已知各種各樣的SPR儀器，諸如BiacoreTM、ProteOn XPR36TM(Bio-Rad®)、和KinExA®(Sapidyne Instruments,Inc)。SPR之操作實施例係於實施例7中找到。
如所描述的，可藉由SPR使用呈Fab形式的抗體測定親和力，其中使抗原偶合至晶片表面且使在溶液中呈Fab形式的測試抗體通過晶片上，以測定單體抗體-抗原交互作用之親和力。可於任何所欲的pH(例如pH 5.5或pH 7.6)和任何所欲的溫度(例如25℃或27℃)下測定親和力。如在實施例7中報導的，根據本發明的抗體以小於2nM的表觀親和力 (apparent affinity)結合人類ICOS，如藉由SPR使用呈單價(Fab)形式的抗體測定的。
其他測量抗體與ICOS之結合的方式包括螢光活化細胞分選(FACS)，例如使用具有ICOS之外源表面表現的細胞(例如CHO細胞)或表現ICOS之內源水平的經活化初級T細胞。如由FACS測量的抗體與ICOS表現性細胞之結合表示該抗體能夠結合ICOS之胞外(EC)域。
ICOS受體促效作用
ICOS配體(ICOSL，亦稱為B7-H2)為細胞表面表現的分子，其與ICOS受體結合[17]。此細胞間配體-受體交互作用促進ICOS在T細胞表面上的多聚化，活化該受體並刺激該T細胞中的下游訊息傳導。在效應T細胞中，此受體活化刺激效應T細胞反應。
抗ICOS抗體可扮演ICOS之促效劑、模擬且甚至超越天然ICOS配體對該受體之此刺激性功效。這種促效作用可導因於該抗體促進在T細胞上的ICOS之多聚化的能力。此之一種機制是其中該等抗體形成在T細胞表面上的ICOS與在鄰近細胞(例如B細胞、抗原呈現細胞、或其他免疫細胞)上的受體(諸如Fc受體)間的細胞間橋接。另一個機制是其中具有多個(例如兩個)抗原結合位置(例如兩個VH-VL域對)的抗體橋接多重ICOS受體分子並因此促進多聚化。可發生此等機制之組合。
可於試管內T細胞活化分析中測試促效作用，其使用呈可溶形式的抗體(例如呈包含二個空間上分離的抗原結合位置(例如二個VH-VL對)的免疫球蛋白形式或其他抗體形式)，包括或排除交聯劑，或使 用與固體表面結合的抗體以提供抗原結合位置之繫留(tethered)陣列。促效作用分析可使用人類ICOS陽性T淋巴球細胞株(諸如MJ細胞(ATCC CRL-8294))作為這種分析中的活化之目標T細胞。可針對測試抗體測定一或多個T細胞活化之測量結果並與參考分子或陰性對照組比較以確定相較於該參考分子或該對照組在透過測試抗體進行的T細胞活化方面是否有統計上顯著的(p<0.05)差異。一個T細胞活化之適合的判斷基準為細胞介素(例如IFNγ、TNFα或IL-2)之生產。所屬技術領域中具有通常知識者會酌情納入適合的對照組，以在測試抗體與對照組間標準化分析條件。適合的陰性對照組為不結合ICOS的呈相同形式的抗體(例如同型對照組)，例如對在該分析系統中不存在的抗原有專一性的抗體。在該分析之動態範圍內對於測試抗體相較於同源同型對照組觀察到顯著的差異表示該抗體於該分析中扮演該ICOS受體之促效劑。
促效抗體可被界定成以下者：當於T細胞活化分析中測試時相較於對照組抗體對於IFNγ生產之誘導具有顯著較低的EC50；相較於對照組抗體誘導顯著較高的最大IFNγ生產；相較於ICOSL-Fc對於IFNγ生產之誘導具有顯著較低的EC50；相較於ICOSL-Fc誘導顯著較高的最大IFNγ生產；相較於參考抗體C398.4A對於IFNγ生產之誘導具有顯著較低的EC50；及/或相較於參考抗體C398.4A誘導顯著較高的最大IFNγ生產。
試管內T細胞分析包括實施例13之珠粒結合性分析、實施 例14之盤結合性分析和實施例15之可溶形式分析。
顯著較低的或顯著較高的值可例如係相較於參考或對照組值，高達0.5倍不同、高達0.75倍不同、高達2倍不同、高達3倍不同、高達4倍不同或高達5倍不同。
因此，於一個實例中，根據本發明的抗體相較於對照組於使用呈與珠粒結合的形式的抗體的MJ細胞活化分析中對於IFNγ之誘導具有顯著較低的(例如低至少2倍的)EC50。
該珠粒結合分析使用與珠粒之表面結合的抗體(且，對於對照組或參考實驗，使用對照組抗體、參考抗體或ICOSL-FC)。可使用磁性珠粒，且多種種類是市面上可購得的，例如經甲苯磺醯基活化的DYNABEADS M-450(DYNAL Inc,5 Delaware Drive,Lake Success,N.Y.11042 Prod No.140.03,140.04)。珠粒可如在實施例13中描述地塗覆，或一般性地藉由將塗覆材料溶解於碳酸鹽緩衝液(pH 9.6，0.2M)或其他所屬技術領域中已知的方法來塗覆。珠粒之使用便利地使得與珠粒表面結合的蛋白質之量能夠以良好程度的準確度來測定。可將標準Fc-蛋白質定量方法用於珠粒上的偶合蛋白質定量。可使用任何適合的方法，參照該分析之動態範圍內的相關的標準。DELFIA例示於實施例13中，但可使用ELISA或其他方法。
抗體之促效活性亦可於初級人類T淋巴球活體外測量。抗體於這類T細胞中誘導IFNγ之表現的能力為對ICOS促效作用的指標。於本文中描述者為兩種T細胞活化分析，其等使用初級細胞-參見實施例2，T細胞活化分析1和T細胞活化分析2。較佳地，抗體於T細胞活化分析1及/或T細胞活化分析2中相較於對照組抗體於5μg/mL會顯示顯著的 (p<0.05)IFNγ之誘導。如以上所述的，在這種分析中抗ICOS抗體相較於ICOS-L或C398.4可刺激T細胞活化至較大的程度。因此，該抗體於T細胞活化分析1或2中相較於對照組或參考抗體於5μg/mL可顯示顯著(p<0.05)較大的IFNγ之誘導。可測量TNFα或IL-2誘導來作為供選擇的分析讀數。
抗ICOS抗體之促效作用可促成其改變活體內TReg與TEff細胞之族群間的平衡(例如於病理之位置，諸如腫瘤微環境)傾向TEff細胞的能力。可測定抗體增強透過經活化的ICOS陽性效應T細胞的腫瘤細胞殺死的能力，如於本文之其他部分討論的。
T細胞依賴性殺死
可在與生物學相關的背景中使用試管內共培養分析測定效應T細胞功能，於該分析中腫瘤細胞與相關免疫細胞一起培養以觸發免疫細胞依賴性殺死，其中觀察抗ICOS抗體對透過TEff的腫瘤細胞殺死之功效。
可測定抗體增強透過經活化的ICOS陽性效應T細胞的腫瘤細胞殺死之能力。抗ICOS抗體相較於對照組抗體可刺激顯著較大的(p<0.05)腫瘤細胞殺死。抗ICOS抗體在這種分析中相較於諸如ICOS配體或C398.4抗體的參考分子可刺激類似的或較大的腫瘤細胞殺死。類似程度的腫瘤細胞殺死可以與參考分子之分析讀數差異小於兩倍的測試抗體之分析讀數的形式表示。
ICOS配體-受體中和效力
根據本發明的抗體可以是抑制ICOS與其配體ICOSL之結合者。
抗體抑制ICOS受體與其配體之結合的程度稱為其配體-受體中和效力。除非另加陳述，效力一般以IC50值以pM表示。於配體結合研究中，IC50為減少受體結合達最大專一性結合水平之50%的濃度。IC50可藉由以下者來計算：以該抗體濃度之對數之函數形式對%專一性受體結合作圖，並使用諸如Prism(GraphPad)的軟體程式以將S形函數擬合至該等數據以產生IC50值。中和效力可於HTRF分析中測定。配體-受體中和效力之HTRF分析之詳細實施例於實施例8提出。
IC50值可表示複數個測量之平均值。因此，例如，可從三重複實驗之結果獲得IC50值，並接著計算平均IC50值。
抗體可於配體-受體中和分析中具有1mM或更低的IC50，例如0.5mM或更低。該IC50可以是，30nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低或2nM或更低。該IC50可以是至少0.1nM，至少0.5nM或至少1nM。
抗體
如於實施例中更詳細地描述的，吾人分離特別的目標抗體(命名為STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009)並進行定性。於本發明之各種方面，除非前後文另加指出，抗體可選自此等抗體之任一者、或選自 STIM001、STIM002、STIM003、STIM004和STIM005之子群。此等抗體之各者之序列於所附序列表提供，其中對於各個抗體顯示以下序列：分別為編碼VH域的核苷酸序列；VH域之胺基酸序列；VH CDR1胺基酸序列，VH CDR2胺基酸序列；VH CDR3胺基酸序列；編碼VL域的核苷酸序列；VL域之胺基酸序列；VL CDR1胺基酸序列；VL CDR2胺基酸序列；和VL CDR3胺基酸序列。本發明涵蓋具有在所附序列表中及/或在圖式中顯示的所有抗體之VH及/或VL域序列的抗ICOS抗體，以及包含該等抗體之HCDR及/或LCDR和視情況具有完整重鏈及/或完整輕鏈胺基酸序列的抗體。
STIM001具有SEQ ID No：366之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：363之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：364之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：365之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：367。STIM001具有SEQ ID No：373之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：370之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：371之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：372之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：374。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是 Seq ID No：368(重鏈核酸序列Seq ID No：369)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：375(輕鏈核酸序列Seq ID No：376)。
STIM002具有SEQ ID No：380之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：377之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：378之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：379之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：381。STIM002具有SEQ ID No：387之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：384之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：385之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：386之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：388或Seq ID No：519。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：382(重鏈核酸序列Seq ID No：383)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：389(輕鏈核酸序列Seq ID No：390或Seq ID NO：520)。
STIM002-B具有SEQ ID No：394之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：391之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：392之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：393之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：395。STIM002-B具有SEQ ID No：401之輕鏈可變區(VL) 胺基酸序列，其包含SEQ ID No：398之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：399之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：400之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：402。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：396(重鏈核酸序列Seq ID No：397)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：403(輕鏈核酸序列Seq ID No：404)。
STIM003具有SEQ ID No：408之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：405之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：406之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：407之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：409或Seq ID No：521。STIM003具有SEQ ID No：415之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：412之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：413之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：414之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：4416。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文 中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：410(重鏈核酸序列Seq ID No：411或Seq ID No：522)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：417(輕鏈核酸序列Seq ID No：418)。
STIM004具有SEQ ID No：422之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：419之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：420之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：421之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：423。STIM004具有SEQ ID No：429之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：426之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：427之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：428之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：430或Seq ID No：431。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：424(重鏈核酸序列Seq ID No：425)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：432(輕鏈核酸序列Seq ID No：433或SEQ ID No：434)。
STIM005具有SEQ ID NO：438之重鏈可變區(VH)胺基酸序 列，其包含SEQ ID NO：435之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID NO：436之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID NO：437之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：439。STIM005具有SEQ ID No：445之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：442之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：443之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：444之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：446。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：440(重鏈核酸序列Seq ID No：441)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：447(輕鏈核酸序列Seq ID No：448)。
STIM006具有SEQ ID No：452之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：449之CDRH1胺基酸序列、Seq ID No：450之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：451之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：453。STIM006具有SEQ ID No：459之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：456之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：457之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：458之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：460。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、 Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：454(重鏈核酸序列Seq ID No：455)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：461(輕鏈核酸序列Seq ID No：462)。
STIM007具有SEQ ID No：466之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：463之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：464之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：465之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：467。STIM007具有SEQ ID No：473之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：470之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：471之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：472之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：474。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：468(重鏈核酸序列Seq ID No：469)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：475(輕鏈核酸序列Seq ID No：476)。
STIM008具有SEQ ID No：480之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：477之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：478之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：479之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：481。STIM008具有SEQ ID No：487之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：484之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：485之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：486之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：488。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：482(重鏈核酸序列Seq ID No：483)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：489(輕鏈核酸序列Seq ID No：490)。
STIM009具有SEQ ID No：494之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：491之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：492之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：493之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：495。STIM009具有SEQ ID No：501之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：498之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：499之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：500之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：502。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重 鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：496(重鏈核酸序列Seq ID No：497)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：503(輕鏈核酸序列Seq ID No：504)。
根據本發明的抗體是免疫球蛋白或包含免疫球蛋白域的分子，無論是天然或部分或完全合成產生的。抗體可以是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子或其抗原專一性抗體片段(包括(但不限於)Fab、F(ab')2、Fv，雙硫連結的Fv、scFv、單域抗體，封閉構形多重專一性抗體、雙硫連結的scfv、雙鏈體(diabody))，無論是衍生自任何天然產生抗體的物種、或藉由重組DNA技術創造；無論是自血清、B細胞、融合瘤、轉染瘤(transfectoma)、酵母菌或細菌分離的。可使用例行技術使抗體人類化。術語抗體涵蓋任何包含抗體抗原結合位置的多肽或蛋白質。抗原結合位置(互補位(paratope))是抗體與目標抗原(ICOS)之抗原決定基結合且與該抗原決定基互補的部位。
術語「抗原決定基」是指抗原被抗體結合的區域。抗原決定基可被定義為結構性的或功能性的。功能性抗原決定基一般是結構性抗原決定基之子群且具有該等直接促成交互作用之親和力的殘基。抗原決定基亦可以是構形性，即構成非線性胺基酸。於某些具體實例中，抗原決定基 可包括諸如胺基酸、糖側鏈、磷氧基(phosphoryl)基團、或碸基基團的分子之化學活性表面基團的決定位，且(於某些具體實例中)可具有特定的三度空間結構特徵、及/或特定的帶電特徵。
抗原結合位置是包含一或多個抗體之CDR且能夠結合其抗原的多肽或域。例如，該多肽包含CDR3(例如HCDR3)，例如該多肽包含CDR1和2(例如HCDR1和2)或抗體之可變域之CDR1-3(例如HCDR1-3)。
抗體抗原結合位置可由一或多個抗體可變域提供。於一個實例中，該抗體結合位置係由單一可變域(例如重鏈可變域(VH域)或輕鏈可變域(VL域))提供。於另一個實例中，該結合位置包含VH/VL對或兩個或多個這類配對。因此，抗體抗原結合位置可包含VH和VL。
該抗體可以是完整免疫球蛋白，包括恆定區，或可以是抗體片段。抗體片段是完整抗體之部分，其例如包含完整抗體之抗原結合區及/或可變區。抗體片段之實例包括：(i)Fab片段，其係由VL、VH、CL和CH1域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，其為包括藉由位於鉸鏈區的雙硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其係由VH和CH1域組成；(iv)Fv片段，其係由抗體之單臂之VL和VH域組成，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546；其係以其完整內容以引用方式併入本文中)，其係由VH或VL域組成；和(vi)經分離的互補決定區(CDR)，其保有專一性抗原結合官能性。
抗體之其他實例為H2抗體，其包含重鏈(5’-VH-(視情況存在的鉸鏈)-CH2-CH3-3’)之二聚體且缺乏輕鏈。
單鏈抗體(例如scFv)為經常使用的片段。多重專一性抗體可由抗體片段形成。酌情，本發明之抗體可利用任何這種形式。
視情況地，該等抗體免疫球蛋白域可與另外的多肽序列及/或與標記、標籤、毒素或其他分子融合或共軛。抗體免疫球蛋白域可與一或多個不同的抗原結合區域融合或共軛，以提供除了ICOS外能夠結合第二種抗原的分子。本發明之抗體可以是多重專一性抗體(例如雙專一性抗體)，其包含(i)抗體針對ICOS的抗原結合位置和(ii)另外的抗原結合位置(視情況為抗體抗原結合位置，如於本文中描述的)，其辨識另一抗原(例如PD-L1)。
抗體正常包含抗體VH及/或VL域。經分離的抗體之VH和VL域亦為本發明之一部分。該抗體可變域為抗體之輕鏈和重鏈包括互補決定區(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)、和架構區(FR)之胺基酸序列的部分。因此，在各個VH和VL域中者為CDR和FR。VH域包含HCDR之組，且VL域包含LCDR之組。VH是指重鏈之可變域。VL是指輕鏈之可變域。各個VH和VL典型係由三個CDR和四個FR構成，從胺基端至羧基端以下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。根據於本發明中使用的方法，被指定給CDR和FR的胺基酸位置可根據Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(國家衛生研究院，Bethesda，Md.,1987和1991))或根據IMGT命名法定義。抗體可包含抗體VH域，該VH域包含VH CDR1、CDR2和CDR3和架構。其可供選擇地或亦包含抗體VL域，該VL域包含VL CDR1、CDR2和CDR3和架構。根據本發明的抗體VH和VL域和CDR之實例在所附序列表(其形成本文之揭露內容之部 分)中列出。該等在序列表中顯示的CDR是根據IMGT系統定義[18]。所有本文中揭露的VH和VL序列、CDR序列、CDR之組和HCDR之組和LCDR之組代表本發明之方面和具體實例。如於本文中描述的，「CDR之組」包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，HCDR之組是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，且LCDR之組是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另加陳述，「CDR之組」包括HCDR和LCDR。
本發明抗體可包含一或多個如於本文中描述的CDR，例如CDR3，和視情況亦包含CDR1和CDR2以形成CDR之組。該CDR或CDR之組可以是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009之任一者之CDR或CDR之組，或可以是如於本文中描述的其變體。
本發明提供包含抗體STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009之任一者之HCDR1、HCDR2及/或HCDR3及/或此等抗體之任一者之LCDR1、LCDR2及/或LCDR3(例如CDR之組)的抗體。該抗體可包含此等抗體之一之VH CDR之組。視情況其亦可包含此等抗體之一之VL CDR之組，且該等VL CDR與該等VH CDR可以是來自相同或不同的抗體。
本發明亦提供包含所揭露的HCDR之組的VH域、及/或包含所揭露的LCDR之組的VL域。
典型地，VH域是與VL域配對以提供抗體抗原結合位置，雖然如於以下進一步討論地可使用單獨VH域或單獨VL域以結合抗原。STIM003 VH域可與STIM003 VL域配對，使得形成包含STIM003 VH和VL 域兩者的抗體抗原結合位置。針對其他本文中揭露的VH和VL域提供相似的具體實例。於其他具體實例中，STIM003 VH與除了STIM003 VL以外的VL域配對。輕鏈混雜性(promiscuity)於所屬技術領域中為充分建立的。再次地，本發明針對其他本文中揭露的VH和VL域提供相似的具體實例。
因此，抗體STIM001、STIM002、STIM003、STIM004和STIM005之任一者之VH可與抗體STIM001、STIM002、STIM003、STIM004和STIM005之任一者之VL配對。此外，抗體STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009之任一者之VH可與抗體STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之任一者之VL配對。
抗體在抗體架構內可包含一或多個CDR，例如CDR之組。該架構區可以是人類生殖系基因節段序列之架構區。因此，該抗體可以是具有包含人類生殖系架構中的HCDR之組的VH域的人類抗體。該抗體正常亦具有包含LCDR(例如人類生殖系架構中者)之組的VL域。抗體「基因節段」(例如VH基因節段、D基因節段、或JH基因節段)是指具有該抗體之部分從其衍生的核酸序列的寡核苷酸，例如VH基因節段是包含對應於從FR1至CDR3之部分的多肽VH域的核酸序列的寡核苷酸。人類V、D和該J基因節段重組以產生VH域，且人類V和J節段重組以產生VL域。D域或區是指抗體鏈之多樣性域或區。J域或區是指抗體鏈之接合域或區。體細胞超突變可造成具有不與對應基因節段確切相配或比對的架構區的抗體VH或VL域，但可使用序列比對以鑑認最接近的基因節段和因此鑑認特別 的VH或VL域從其衍生的特別的基因節段之組合。當比對抗體序列與基因節段時，該抗體胺基酸序列可與該基因節段編碼的胺基酸序列比對、或該抗體核苷酸序列可直接與該基因節段之核苷酸序列比對。
STIM抗體VH和VL域序列與相關的抗體和與人類生殖系序列之比對在圖35、圖36和圖37中顯示。
本發明之抗體可以是人類抗體或包含人類可變區和非人類(例如小鼠)恆定區的嵌合抗體。本發明之抗體例如具有人類可變區，且視情況亦具有人類恆定區。
因此，抗體視情況包括恆定區或其部分，例如人類抗體恆定區或其部分。例如，VL域可於其C端接附至抗體輕鏈κ或λ恆定域。類似地，抗體VH域可於其C端接附至整個衍生自任何抗體同型(例如IgG、IgA、IgE和IgM和同型子類型之任一者，諸如IgG1或IgG4)的免疫球蛋白重鏈恆定區或其部分(例如CH1域或Fc區)。
人類重鏈恆定區之實例在表S1中顯示。
供選擇地，本發明之抗體之恆定區可以是非人類恆定區。例如，當抗體是在基因轉殖動物(其實例於本文之其他處描述)中產生時，可產生包含人類可變區和非人類(宿主動物)恆定區的嵌合抗體。一些基因轉殖動物產生完全人類抗體。其他者已經工程改造以產生包含嵌合重鏈和完全人類輕鏈的抗體。當抗體包含一或多個非人類恆定區時，此等可以人類恆定區置換以提供更適用於投予至人類作為治療組成物的抗體，因為其免疫原性被藉此減少。
以酵素木瓜酵素消化抗體產生二個相同的抗原結合片段，其 亦稱為「Fab」片段、和「Fc」片段，其不具有抗原結合活性但具有結晶的能力。當於本文中使用時，「Fab」是指抗體之片段，其包括重鏈和輕鏈之各者之一個恆定域和一個可變域。術語「Fc區」於本文中是用於界定免疫球蛋白重鏈之C端區域，其包括天然序列Fc區和變體Fc區。「Fc片段」是指藉由雙硫橋綁在一起的兩個H鏈之羧基端部分。抗體之效應功能是由Fc區中的序列決定，該區域亦被在某些種類的細胞上發現的Fc受體(FcR)辨識。以酵素胃蛋白酶消化抗體產生F(ab’)2片段，其中該抗體分子之二個臂仍被連在一起且包含二個抗原結合位置。F(ab’)2片段具有交聯抗原的能力。
當於本文中使用時，「Fv」是指保留抗原辨識位置和抗原結合位置兩者的抗體之最小片段。此區域是由緊密地非共價或共價連結的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域之二聚體所組成。正是於此形態中各個可變域之三個CDR交互作用以決定在該VH-VL二聚體之表面上的抗原結合位置。一起，該六個CDR賦予該抗體抗原結合專一性。然而，即使是單一可變域(或僅包含對抗原具有專一性的三個CDR的Fv之一半)亦具有辨識並結合抗原的能力，雖然相較於整個結合位置親和力較低。
可修飾本文中揭露的抗體以增加或減少血清半衰期。在一個具體實例中，以下突變之一或多者被導入以增長該抗體之生物半衰期：T252L、T254S或T256F。生物半衰期亦可藉由改變重鏈恆定區CH1域或CL區以含有取自IgG之Fc區之CH2域之二個環的補救受體(salvage receptor)結合性抗原決定基來增長，如在美國專利編號5,869,046和6,121,022中描述的(在該等文獻中描述的修飾以引用的方式併入本文中)。於另一個具體實 例中，本發明之抗體或抗原結合片段之Fc鉸鏈區係經突變以減短該抗體或片段之生物半衰期。一或多個胺基酸突變被導入至該Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區域中以使得該抗體或片段相對於天然Fc-鉸鏈域SpA結合具有削弱的葡萄球菌蛋白質A(SpA)結合。其他增長血清半衰期的方法對於所屬技術領域中具有通常知識者而言是已知的。因此，在一個具體實例中，該抗體或片段經PEG化。於另一個具體實例中，該抗體或片段與白蛋白結合域融合，例如白蛋白結合單域抗體(dAB)。於另一個具體實例中，該抗體或片段經PAS化(即含有PAS(其形成具有大流體動力學體積之不帶電的無規則捲曲結構)的多肽序列(XL-Protein GmbH)之基因融合)。於另一個具體實例中，該抗體或片段經XTENylated®/rPEG化(即非精確重複胜肽序列(Amunix,Versartis)與該治療性胜肽之基因融合)。於另一個具體實例中，該抗體或片段經ELP化(即與ELP重複序列(PhaseBio)的基因融合)。這些多種半衰期延伸性融合在Strohl,BioDrugs(2015)29：215-239中更詳細地描述，其中的融合(例如在表2和6中的)以引用的方式併入本文中。
該抗體可具有增加穩定性的經修飾的恆定區。因此，在一個具體實例中，該重鏈恆定區包含Ser228Pro突變。於另一個具體實例中，本文中揭露的抗體和片段包含已經修飾以改變半胱胺酸殘基之數目的重鏈鉸鏈區。此修飾可用於促進輕鏈和重鏈之集合或用於增加或減少該抗體之穩定性。
Fc效應功能、ADCC、ADCP和CDC
如於以上討論的，抗ICOS抗體可以各種同型和以不同的恆定區提供。人類IgG抗體重鏈恆定區序列之實例在表S1中顯示。在Fc結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性、補體依賴性細胞毒性(CDC)活性和抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)活性方面，抗體之Fc區主要地決定其效應功能。與效應T細胞功能不同，此等「細胞效應功能」涉及將帶有Fc受體的細胞募集至目標細胞之位置，導致與抗體結合的細胞之殺死。除了ADCC和CDC之外，ADCP機制[19]代表了耗盡與抗體結合的T細胞並因此瞄準高ICOS表現性TReg以缺失之的方法。
細胞效應功能ADCC、ADCP及/或CDC亦可由缺乏Fc區的抗體展現。抗體可包含多個不同的抗原結合位置，一個針對ICOS且另一個針對目標分子，其中該目標分子之接觸誘導ADCC、ADCP及/或CDC，例如包含藉由連接子連接的兩個scFv區域的抗體，其中一個scFv可接觸效應細胞。
根據本發明的抗體可以是展現ADCC、ADCP及/或CDC者。供選擇地，根據本發明的抗體可缺乏ADCC、ADCP及/或CDC活性。於任一情況下，根據本發明的抗體可包含(或可視情況缺乏)Fc區，該Fc區與一或多種Fc受體結合。不同抗體形式之使用、和FcR結合和細胞的效應功能之存在或缺少使得該抗體能夠被製作成用於特別是如於本文之其他部分討論的治療目的。
用於一些治療應用的適合的抗體形式利用野生型人類IgG1恆定區。恆定區可以是效應經啟動的IgG1恆定區，視情況具有ADCC及/或CDC及/或ADCP活性。適合的野生型人類IgG1恆定區序列為SEQ ID NO：340(IGHG1*01)。人類IgG1恆定區之其他實例在表S1中顯示。
為了在人類疾病之小鼠模型中測試候選治療抗體，可包括功效陽性小鼠恆定區(諸如小鼠IgG2a(mIgG2a))來取代功效陽性人類恆定區。
恆定區可經工程改造以增強ADCC及/或CDC及/或ADCP。
Fc介導的功效之效力可藉由多種已建立的技術通過工程改造Fc域來增強。這種方法增加針對某種Fc-受體的親和力，因此創造出潛在多變的活化增強之特性。此可藉由一或若干個胺基酸殘基之修飾達成[20]。已顯示在殘基Asn297上含有特定的突變或經改變的醣化(例如N297Q，EU索引編號)之人類IgG1恆定區會增強與Fc受體的結合。對於人類IgG1恆定區，實例突變係選自239、332和330的殘基(或在其他IgG同型中之相等的位置)之一或多者。抗體可因此包含具有一或多個獨立地選自N297Q、S239D、I332E和A330L(EU索引編號)的突變的人類IgG1恆定區。可使用三重突變(M252Y/S254T/T256E)以增強與FcRn之結合，且其他影響FcRn結合的突變在[21]之表2中討論，其任一者皆可於本發明中利用。
針對Fc-受體之親和力的增加亦可藉由改變該Fc域之天然醣化特性達成，其係藉由(例如)產生海藻糖化不足的(under fucosylated)或去海藻糖化的(defucosylated)變體[22]。非海藻糖化的(non-fucosylated)抗體帶有Fc之複合型N-聚糖之三-甘露糖基核心結構而無海藻糖殘基。由於FcγRIIIa結合能力之增強，此等缺乏來自Fc N-聚糖的核心海藻糖殘基的 經糖工程改造的抗體相較於經海藻糖化的(fucosylated)等效物可展現較強的ADCC。例如，為增加ADCC，可改變在鉸鏈區中的殘基以增加與Fc-γRIII的結合[23]。因此，抗體可包含人類IgG重鏈恆定區，其為野生型人類IgG重鏈恆定區之變體，其中該變體人類IgG重鏈恆定區相較於野生型人類IgG重鏈恆定區與選自由FcyRIIB和FcyRIIA所組成的群組的人類Fcγ受體之結合是以較高的親和力與該等人類Fcγ受體結合。該抗體可包含人類IgG重鏈恆定區，其為野生型人類IgG重鏈恆定區之變體，其中該變體人類IgG重鏈恆定區相較於野生型人類IgG重鏈恆定區與人類FcγRIIB之結合是以較高的親和力與人類FcγRIIB結合。該變體人類IgG重鏈恆定區可以是變體人類IgG1、變體人類IgG2、或變體人類IgG4重鏈恆定區。在一個具體實例中，該變體人類IgG重鏈恆定區包含一或多個選自G236D、P238D、S239D、S267E、L328F、和L328E(EU索引編號系統)的胺基酸突變。於另一個具體實例中，該變體人類IgG重鏈恆定區包含選自由以下者所組成的群組之胺基酸突變組：S267E和L328F；P238D和L328E；P238D和一或多個選自由E233D、G237D、H268D、P271G、和A330R所組成之群組的取代；P238D、E233D、G237D、H268D、P271G、和A330R；G236D和S267E；S239D和S267E；V262E、S267E、和L328F；和V264E、S267E、和L328F(EU索引編號系統)。CDC之增強可藉由增加針對C1q(典型補體活化級聯之第一組分)的親和力之胺基酸改變達成[24]。另一個方法為創造嵌合性Fc域，其係自人類IgG1和人類IgG3節段創造，其利用IgG3對於C1q之較高的親和力[25]。本發明之抗體可於殘基329、331及/或322可包含經突變的胺基酸以改變C1q結合及/或減少或消除CDC活性。於另一個具體實例中，本文中揭露的抗體 或抗體片段可含有於殘基231和239具有修飾的Fc區，藉此該等胺基酸被置換以改變該抗體固定補體的能力。在一個具體實例中，該抗體或片段具有包含一或多個選自E345K、E430G、R344D和D356R的突變(特別是包含R344D和D356R的雙重突變)(EU索引編號系統)的恆定區。
WO2008/137915描述具有增強的效應功能的具有經修飾的Fc區的抗ICOS抗體。該等抗體被報導會介導增強的ADCC活性(相較於由包含VH和VK域和野生型Fc區的親本抗體的介導的ADCC活性之水平)。根據本發明的抗體可利用如於其中描述的這類具有效應功能的變體Fc區。
抗體之ADCC活性可於如於本文中描述的分析中測定。抗ICOS抗體之ADCC活性可使用ICOS陽性T細胞株試管內測定，如在實施例10中描述的。抗PD-L1抗體之ADCC活性可於ADCC分析中使用PD-L1表現性細胞試管內測定。
對於某些應用(諸如於疫苗接種之背景下)，使用無Fc效應功能的抗體可為較佳的。可以無恆定區或無Fc區提供抗體-這類抗體形式之實例於本文之其他處描述。供選擇地，抗體可具有無效應的恆定區。抗體可具有不結合Fcγ受體的重鏈恆定區，例如該恆定區可包含Leu235Glu突變(即其中野生型白胺酸殘基被突變成麩胺酸殘基)。另一個重鏈恆定區之視情況的突變為Ser228Pro，其增加穩定性。重鏈恆定區可以是包含Leu235Glu突變和Ser228Pro突變兩者的IgG4。此「IgG4-PE」重鏈恆定區是無效應的。
供選擇的無效應的人類恆定區為失能IgG1。失能IgG1重鏈 恆定區可於位置235及/或237(EU索引編號)含有丙胺酸，例如其可以是包含L235A及/或G237A突變(「LAGA」)的IgG1*01序列。
變體人類IgG重鏈恆定區可包含一或多個減少IgG對於人類FcγRIIIA、人類FcγRIIA、或人類FcγRI的親和力之胺基酸突變。在一個具體實例中，該FcγRIIB表現在選自由巨噬細胞、單核球、B細胞、樹突細胞、內皮細胞、和經活化T細胞所組成的群組的細胞上。在一個具體實例中，該變體人類IgG重鏈恆定區包含以下胺基酸突變之一或多者：G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305I、A330L、I332E、E333A、K334A、A339T、和P396L(EU索引編號系統)。在一個具體實例中，該變體人類IgG重鏈恆定區包含選自由以下者所組成的群組的胺基酸突變組：S239D；T256A；K290A；S298A；I332E；E333A；K334A；A339T；S239D和I332E；S239D、A330L、和I332E；S298A、E333A、和K334A；G236A、S239D、和I332E；和F243L、R292P、Y300L、V305I、和P396L(EU索引編號系統)。在一個具體實例中，該變體人類IgG重鏈恆定區包含S239D、A330L、或I332E胺基酸突變(EU索引編號系統)。在一個具體實例中，該變體人類IgG重鏈恆定區包含S239D和I332E胺基酸突變(EU索引編號系統)。在一個具體實例中，該變體人類IgG重鏈恆定區是包含S239D和I332E胺基酸突變(EU索引編號系統)的變體人類IgG1重鏈恆定區。在一個具體實例中，該抗體或片段包含無海藻糖化的(afucosylated)Fc區。於另一個具體實例中，該抗體或其片段是經去海藻糖化的。於另一個具體實例中，該抗體或片段是海藻糖化不足的。
抗體可具有結合一或多種Fc受體但不誘導細胞效應功能 (即不介導ADCC、CDC或ADCP活性)的重鏈恆定區。這類恆定區可能無法結合負責觸發ADCC、CDC或ADCP活性的特別Fc受體。
產生和修飾抗體
用於鑑認和製備抗體的方法是廣為人知的。抗體可如下產生：使用以ICOS或其片段或包含目標ICOS序列模體的合成胜肽免疫的基因轉殖小鼠(例如KymouseTM、Velocimouse®、Omnimouse®、Xenomouse®、HuMab Mouse®或MeMo Mouse®)、大鼠(例如Omnirat®)、駱駝科、鯊魚、兔、雞或其他非人類動物，接著視情況地人類化其恆定區及/或可變區以產生人類或人類化抗體。於一個實例中，可使用展示技術，諸如酵母菌、噬菌體或核醣體展示，如對於所屬技術領域中具有通常知識者而言會是明顯的。可於在從基因轉殖動物、噬菌體展示庫(library)或其他庫分離抗體先導物後的進一步步驟中執行標準親和力成熟(例如使用展示技術)。適合的技術之代表性實例在US20120093818(Amgen,Inc)中描述，該文獻以其完整內容(例如在段落[0309]至[0346]中提出的方法)以引用方式併入本文中。
使用人類ICOS抗原對ICOS剔除非人類動物免疫會促進辨識人類ICOS和非人類ICOS兩者的抗體之產生。如於本文中描述且在實施例中闡明的，可以用表現人類ICOS的細胞使ICOS剔除小鼠免疫以在小鼠中刺激針對人類和小鼠ICOS的抗體之生產，該等抗體可被回收和針對與人類ICOS和與小鼠ICOS之結合測試。可因此選擇交叉反應性抗體，且可針對如於本文中描述的其他所欲特性作篩選。透過以抗原(例如人類抗原)免疫動物(其中內源性抗原(例如內源性小鼠抗原)之表現已於該動物中 被剔除)來產生針對該抗原的抗體的方法可在能夠產生包含人類可變域的抗體的動物中執行。這類動物之基因體可經工程改造以包含編碼人類可變區基因節段和視情況的內源性恆定區或人類恆定區的人類或人類化免疫球蛋白基因座。該等人類可變區基因節段之重組產生人類抗體，其可具有非人類或人類恆定區。非人類恆定區可隨後以人類恆定區置換，其中該抗體係意欲在人類中活體內使用。這種方法和剔除基因轉殖動物在WO2013/061078中描述。
大體而言，可使用目標抗原攻擊KymouseTM、VELOCIMMUNE®或其他小鼠或大鼠(視情況為ICOS剔除小鼠或大鼠，如以上所述的)，並從表現抗體的小鼠回收淋巴的細胞(諸如B細胞)。可使該等淋巴的細胞與骨髓瘤細胞株融合以製備不朽融合瘤細胞株，並篩選和選擇這類融合瘤細胞株以鑑認產生對目標抗原有專一性的抗體的融合瘤細胞株。可分離編碼其重鏈和輕鏈之可變區的DNA並將其連接至所欲的重鏈和輕鏈之同型恆定區。這類抗體蛋白質可在細胞(諸如CHO細胞)中產生。供選擇地，可直接從抗原專一性淋巴球分離編碼抗原專一性嵌合抗體或其輕鏈和重鏈之可變域的DNA。
最初地，分離具有人類可變區和小鼠恆定區的高親和力嵌合抗體。對該等抗體進行定性並針對所欲的特徵(包括親和力、選擇性、促效作用、T細胞依賴性殺死、中和效力、抗原決定基、等等)選擇該等抗體。視情況以所欲的人類恆定區置換小鼠恆定區以產生本發明之完全人類抗體，例如野生型或經修飾IgG1或IgG4(例如，US2011/0065902(其係以其完整內容以引用方式併入本文中)中的SEQ ID NO：751、752、753。雖然所 選擇的恆定區可根據特別用途變化，高親和力抗原結合和目標專一性特徵存在於可變區中。
因此，於另外的方面中，本發明提供基因轉殖非人類哺乳動物，其具有包含人類或人類化免疫球蛋白基因座的基因體，其中該哺乳動物不表現ICOS。該哺乳動物可例如為剔除小鼠或大鼠、或其他實驗室動物物種。基因轉殖小鼠(諸如KymouseTM)含有於對應內源性小鼠免疫球蛋白基因座插入的人類重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因座。根據本發明的基因轉殖哺乳動物可以是含有這種靶向性插入者，或其可含有於其基因體中隨機插入、於除了內源性Ig基因座以外的基因座插入、或在另外的染色體或染色體片段上提供的人類重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因座或免疫球蛋白基因。
本發明之另外的方面為這類非人類哺乳動物之用途，其係用於產生針對ICOS的抗體，和在這類哺乳動物中產生抗體或抗體重鏈及/或輕鏈可變域的方法。
產生結合人類和非人類ICOS之胞外域的抗體的方法可包含提供基因轉殖非人類哺乳動物，其具有包含人類或人類化免疫球蛋白基因座的基因體，其中該哺乳動物不表現ICOS，和(a)以人類ICOS抗原(例如以表現人類ICOS的細胞或以經純化的重組ICOS蛋白質)使該哺乳動物免疫；(b)分離由該哺乳動物產生的抗體；(c)針對結合人類ICOS和非人類ICOS之能力測試該等抗體；和(d)選擇一或多種結合人類和非人類ICOS兩者的抗體。
可使用表面電漿子共振、HTRF、FACS或任何其他於本文中 描述的方法完成針對結合人類ICOS和非人類ICOS之能力的測試。視情況地，測定針對人類和小鼠ICOS的結合親和力。可測定與人類ICOS和小鼠ICOS結合的親和力(或親和力之差異倍數)，且可因此選擇展現物種交叉反應性的抗體(可用作為選擇標準的親和力閾值和差異倍數在本文之其他處例示)。亦可或供選擇地測定抗體抑制人類和小鼠ICOS配體分別與人類和小鼠ICOS受體結合的中和效力(或中和效力之差異倍數)作為篩選交叉反應性抗體的方法(例如在HTRF分析中)。再次地，可用作為選擇標準的可能閾值和差異倍數在本文之其他處例示。
該方法可包含針對結合來自與所免疫的哺乳動物相同的物種或來自與所免疫的哺乳動物不同的物種的非人類ICOS之能力測試該等抗體。因此，當該基因轉殖哺乳動物是小鼠(例如KymouseTM)時，可針對結合小鼠ICOS的能力測試抗體。當該基因轉殖哺乳動物是大鼠時，可針對結合大鼠ICOS的能力測試抗體。然而，測定經分離的針對另一個物種之非人類ICOS的抗體之交叉反應性可以是同樣有用的。因此，可針對與大鼠或小鼠ICOS之結合測試在山羊中產生的抗體。視情況地，可替代性地或另外地測定與山羊ICOS之結合。
於其他具體實例中，可以用非人類ICOS(視情況為相同的哺乳動物物種之ICOS)替代人類ICOS使基因轉殖非人類哺乳動物免疫(例如可以小鼠ICOS使ICOS剔除小鼠免疫)。接著以相同的方式測定經分離的抗體與人類ICOS和非人類ICOS結合之親和力，並選擇結合人類ICOS和非人類ICOS兩者的抗體。
編碼所選抗體之抗體重鏈可變域及/或抗體輕鏈可變域的 核酸可以是經分離的。這類核酸可編碼完整該抗體重鏈及/或輕鏈、或該(等)可變域而無締合的恆定區。如以上所述的，可直接從小鼠之抗體產生性細胞獲得編碼性核苷酸序列，或可使B細胞變得不朽或融合以產生表現該抗體的融合瘤，和從這類細胞獲得編碼性核酸。視情況地，接著將編碼該(等)可變域的核酸共軛至編碼人類重鏈恆定區及/或人類輕鏈恆定區的核苷酸序列，以提供編碼人類抗體重鏈及/或人類抗體輕鏈(例如編碼包含重鏈和輕鏈兩者的抗體)的核酸。如於本文之其他處描述的，當所免疫的哺乳動物產生具有非人類恆定區(其較佳是以人類恆定區置換以產生當投予至人類作為醫藥品時免疫原性會較低的抗體)的嵌合抗體時，此步驟是特別有用的。提供特別的人類同型恆定區對於決定該抗體之效應功能亦為重要的，且一些適合的重鏈恆定區於本文中討論。
可執行其他編碼該抗體重鏈及/或輕鏈可變域的核酸之改變，諸如如於本文中描述的殘基之突變和變體之產生。
可將經分離的(視情況經突變的)核酸導入至宿主細胞中，例如如所討論的CHO細胞。接著將宿主細胞培養在用於表現呈任何所欲的抗體形式的該抗體、或該抗體重鏈及/或輕鏈可變域的條件下。一些可能的抗體形式於本文中描述，例如完整免疫球蛋白、抗原結合片段、和其他設計。
如所討論地，可根據本發明利用其序列係於本文中具體揭露的VH和VL域之任一者之可變域胺基酸序列變體或CDR。
有許多理由為何創造變體可能是所欲的，其等包括最佳化抗體序列以用於大規模製造、促進純化、增強穩定性或改善適合性以包含在 所欲的醫藥調配物中。可於一或多個抗體序列中的目標殘基執行蛋白質工程改造工作，例如以另一個胺基酸取代一個胺基酸(視情況地，產生於此位置含有所有天然存在的胺基酸的變體，除了Cys和Met之可能的例外外)，並監測對功能和表現的影響以確定最佳取代。在一些實例中，以Cys或Met取代殘基、或將此等殘基導入至序列中是非所欲的，因為作此可能會產生於製造上的困難-例如通過新的分子內或分子間半胱胺酸-半胱胺酸鍵之形成。當已選擇先導候選物並將其最佳化以用於製造和臨床開發時，通常希望盡可能不改變其抗原結合特性或至少保留親本分子之親和力和效力。然而，亦可為了調節關鍵抗體特徵(諸如親和力、交叉反應性或中和效力)而產生變體。
抗體可包含所揭露的抗體之任一者之H及/或L CDR之組以及一或多個在所揭露的H及/或L CDR之組內的胺基酸突變。該突變可以是胺基酸取代、缺失或插入。因此，例如在所揭露的H及/或L CDR之組內可有一或多個胺基酸取代。例如，在該H及/或L CDR之組內可有至多達12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個突變(例如取代)。例如，在HCDR3中可有至多達6、5、4、3或2個突變(例如取代)及/或在LCDR3中可有至多達6、5、4，3、或2個突變(例如取代)。抗體可包含對於本文中的任何STIM抗體顯示的HCDR、LCDR之組或6個(H和L)CDR之組或可包含具有一或兩個保守性取代的該等CDR之組。
可視情況在本文中揭露的抗體VH或VL域之架構區中製造一或多個胺基酸突變。例如，可將一或多個與對應人類生殖系節段序列不同的殘基恢復成生殖系。對應於實例抗ICOS抗體之VH和VL域的人類生 殖系基因節段序列在表E12-1、表E12-2和表E12-3中指出，且抗體VH和VL域與對應生殖系序列之比對於圖式中顯示。
抗體可包含與在所附序列表中顯示的抗體之任一者之VH域有至少60、70、80、85、90、95、98或99%胺基酸序列一致性的VH域，及/或包含與該等抗體之任一者之VL域有至少60、70、80、85、90、95、98或99%胺基酸序列一致性的VL域。可用以計算兩個胺基酸序列之%一致性的演算法包括例如BLAST、FASTA、或Smith-Waterman演算法，例如利用預設參數。特別的變體可包括一或多個胺基酸序列改變(胺基酸殘基之添加、缺失、取代及/或插入)。
可在一或多個架構區及/或一或多個CDR中作改變。變體視情況地由CDR致突變提供。該等改變正常不會造成功能喪失，所以包含從而改變的胺基酸序列之抗體可保留結合ICOS的能力。其可保留與其中未作改變的抗體定量上相同的結合能力，例如如在於本文中描述的分析中測量的。包含從而改變的胺基酸序列的抗體可具有改善的結合ICOS的能力。
改變可包含以非天然存在的或非標準胺基酸置換一或多個胺基酸殘基、將一或多個胺基酸殘基修飾成非天然存在的或非標準形式、或將一或多個非天然存在的或非標準胺基酸插入該序列中。本發明之序列中的改變之數目和位置之實例於本文之其他處描述。天然存在的胺基酸包括由其標準單字母碼識別為G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E的20種「標準」L-胺基酸。非標準胺基酸包括任何其他可被併入多肽主鏈中或來自現存胺基酸殘基之修飾的殘基。非標準胺基酸可以是天然存在的或非天然存在的。
術語「變體」用於本文中是指胜肽或核酸，其與親本多肽或核酸有一或多個胺基酸或核酸缺失、取代或添加之差異，但保留親本分子之一或多個特定功能或生物活性。胺基酸取代包括其中胺基酸是以不同的天然存在的胺基酸殘基置換的改變。這類取代可被歸類成「保守性」，於該例子中多肽中所含的胺基酸殘基是以另一個在極性、側鏈官能性或大小方面的特徵類似之天然存在的胺基酸置換。這類保守性取代在所屬技術領域中是廣為人知的。本發明所涵蓋的取代亦可以是「非保守性」，其中胜肽中存在的胺基酸殘基是以具有不同的特性之胺基酸(諸如來自不同群組的天然存在的胺基酸)取代(例如以丙胺酸取代帶電的或疏水性胺基酸)，或供選擇地，其中天然存在的胺基酸是以非常規胺基酸取代。在一些具體實例中，胺基酸取代是保守性的。當用於提及多核苷酸或多肽時，亦被涵蓋在術語變體內者是指可在一級、二級、或三級結構方面變化(分別相較於參考多核苷酸或多肽，例如相較於野生型多核苷酸或多肽)的多核苷酸或多肽。
在一些方面，可利用使用於所屬技術領域中廣為人知的方法分離的或產生的「合成變體」、「重組變體」、或「經化學修飾的」多核苷酸變體或多肽變體。「經修飾的變體」可包括保守性或非保守性胺基酸改變，如於以下描述的。多核苷酸改變可造成在由參考序列編碼的多肽中的胺基酸取代、添加、缺失、融合和截短。一些方面使用包括插入變體、缺失變體或經取代變體，其具有胺基酸之取代，包括在該變體所基於的胜肽序列中正常不會存在的胺基酸和其他分子之插入和取代，例如但不限於在人類蛋白質中正常不會存在的鳥胺酸之插入。當描述多肽時，術語「保守性取 代」是指多肽之胺基酸組成之改變，其不實質上地改變該多肽之活性。例如，保守性取代是指以一胺基酸殘基取代具有類似的化學特性(例如酸性、鹼性、帶正電或帶負電、極性或非極性、等等)的不同的胺基酸殘基。保守性胺基酸取代包括以異白胺酸或纈胺酸置換白胺酸、以麩胺酸置換天門冬胺酸、或以絲胺酸置換蘇胺酸。提供功能上類似的胺基酸的保守性取代表於所屬技術領域中是廣為人知的。例如，以下六組各含有對彼此為保守性取代的胺基酸：1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天門冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；和6)苯基胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。(亦參見Creighton,Proteins,W.H.Freeman and Company(1984)，以其完整內容以引用方式併入)。在一些具體實例中，若改變、添加、或缺失單一胺基酸或小百分比的胺基酸之個別取代、缺失或添加不減少胜肽之活性，其亦可被視為「保守性取代」。插入或缺失典型範圍是在約1至5個胺基酸。保守性胺基酸之選擇可基於欲取代的胺基酸在該胜肽中的位置來選擇，例如該胺基酸是否在該胜肽之外面上且暴露至溶劑或在內部且不暴露至溶劑。
可基於現存的胺基酸之位置(包括其對於溶劑之暴露(即是否該胺基酸暴露至溶劑或存在於胜肽或多肽之外表面上，相較於不暴露至溶劑的位於內部的胺基酸))選擇將取代該現存的胺基酸的胺基酸。這類保守性胺基酸取代之選擇於所屬技術領域中是廣為人知的，例如如在以者中揭露的：Dordo等人，J.MoI Biol,1999,217,721-739和Taylor等人，J.Theor.Biol.119(1986)；205-218和S.French和B.Robson,J.Mol.Evol.19(1983)171。因 此，可選擇適用於在蛋白質或胜肽之外面上的胺基酸(即暴露至溶劑的胺基酸)的保守性胺基酸取代，例如(但不限於)可使用以下取代：以F取代Y，以S或K取代T，以A取代P，以D或Q取代E，以D或G取代N，以K取代R，以N或A取代G，以S或K取代T，以N或E取代D，以L或V取代I，以Y取代F，以T或A取代S，以K取代R，以N或A取代G，以R取代K，以S、K或P取代A。
於供選擇的具體實例中，亦可選擇包含適用於在蛋白質或胜肽之內部的胺基酸的保守性胺基酸取代，例如可使用適用於在蛋白質或胜肽之內部的胺基酸(即該等胺基酸不暴露至溶劑)的保守性取代，例如但不限於，可使用以下保守性取代：其中以F取代Y，以A或S取代T，以L或V取代I，以Y取代W，以L取代M，以D取代N，以A取代G，以A或S取代T，以N取代D，以L或V取代I，以Y或L取代F，以A或T取代S且以S、G、T或V取代A。在一些具體實例中，非保守性胺基酸取代亦被涵蓋在變體之術語內。
本發明包括產生含有在所附序列表中顯示的抗體VH及/或VL域之VH及/或VL域變體的抗體的方法。這類抗體可藉由包含以下者的方法產生：(i)通過在親本抗體VH域之胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個胺基酸，提供是親本抗體VH域之胺基酸序列變體的抗體VH域，其中該親本抗體VH域是抗體STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009之任一者之VH域或包含該等抗體之任一者之重鏈互補決定區的VH域， (ii)視情況組合從而提供的VH域與VL域，以提供VH/VL組合，和(iii)測試從而提供的VH域或VH/VL域組合以鑑認具有一或多個所欲特徵的抗體。
所欲的特徵包括與人類ICOS結合、與小鼠ICOS結合、和與其他非人類ICOS(諸如食蟹獼猴ICOS)結合。可鑑認對於人類及/或小鼠ICOS具有可比較的或較高的親和力的抗體。其他所欲的特徵包括間接地(通過免疫抑制性TReg之耗盡)或直接地(通過T效應細胞之ICOS訊息傳導活化)增加效應T細胞功能。鑑認具有所欲特徵的抗體可包含鑑認具有於本文中描述的功能性屬性(諸如其親和力、交叉反應性、專一性、ICOS受體促效作用、中和效力及/或T細胞依賴性殺死之促進，其任一者皆可於如於本文中描述的分析中測定)的抗體。
當該方法中包括VL域時，該VL域可以是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之任一者之VL域，或可以是通過親本VL域之胺基酸序列中的一或多個胺基酸之添加、缺失、取代或插入提供的變體，其中該親本VL域是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009之任一者之VL域或包含該等抗體之任一者之輕鏈互補決定區的VL域。
產生變體抗體的方法可視情況包含產生該抗體或VH/VL域組合之複本。方法可進一步包含表現所得的抗體。產生對應於所欲的抗體VH及/或VL域的核苷酸序列(視情況在一或多個表現載體中)是可能的。適合的表現方法(包括在宿主細胞中重組表現)在本文中詳細提出。
編碼性核酸和表現之方法
可提供經分離的核酸，其編碼根據本發明的抗體。核酸可為DNA及/或RNA。基因體DNA、cDNA、mRNA或其他RNA(合成來源的)、或任何其組合可編碼抗體。
本發明提供呈質體、載體、轉錄或表現卡匣之形式的構築體，其包含至少一個如上的多核苷酸。例示性核苷酸序列包括於序列表中。如於本文中提出的，提及核苷酸序列時涵蓋具有具體指出的序列之DNA分子，且涵蓋具有具體指出的序列(其中U取代T)的RNA分子，除非前後文另有要求。
本發明亦提供包含一或多個編碼該抗體的核酸的重組宿主細胞。產生所編碼的抗體的方法可包含從該核酸表現，例如藉由培養含有該核酸的重組宿主細胞。可從而獲得該抗體，且然後可酌情使用任何適合的技術分離及/或純化之。生產之方法可包含將產物調配成包括至少一種另外的組分(諸如醫藥上可接受的賦形劑)的組成物。
用於在各種各樣不同的宿主細胞中選殖和表現多肽的系統是廣為人知的。適合的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、絲狀真菌、酵母菌和桿狀病毒系統和基因轉殖植物和動物。
抗體和抗體片段在原核細胞中的表現於所屬技術領域中是充分建立的。常見細菌宿主之一為大腸桿菌。於培養中的真核細胞之表現對於所屬技術領域中具有通常知識者而言亦可用作為生產之選擇。於所屬技術領域中可用於表現異源性多肽的哺乳動物細胞株包括中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細胞、人類胚胎腎細胞、人類胚胎視網膜細胞和許多其他者。
載體可含有適當的調節性序列，包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和酌情的其他序列。可將編碼抗體的核酸導入至宿主細胞中。可藉由各種方法將核酸導入至真核細胞，該等方法包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質體介導的轉染和使用逆轉錄病毒或其他病毒(例如牛痘或(對於昆蟲細胞)桿狀病毒)的轉導。將核酸導入宿主細胞(特別是真核細胞)可使用基於病毒或質體的系統。可將質體系統維持在游離基因體之形式或可將其併入至宿主細胞中或至人工染色體中。併入可藉由一或多個複本於單一或多個基因座之隨機或靶向性整合。對於細菌細胞，適合的技術包括氯化鈣轉形、電穿孔和使用噬菌體的轉染。導入後可接著為表現核酸，例如藉由在用於該基因之表現之條件下培養宿主細胞，接著視情況分離或純化該抗體。
可將本發明之核酸整合至宿主細胞之基因體(例如染色體)中。整合可藉由根據標準技術納入促進與基因體的重組的序列來促進。
本發明亦提供包含在表現系統中使用於本文中描述的核酸以表現抗體的方法。
治療用途
可將於本文中描述的抗體用於藉由療法治療人類或動物體的方法。該等抗體在增加效應T細胞反應方面發揮作用，其對於某範圍的疾病或病況是有益處的，包括治療癌症或固態腫瘤和在疫苗接種之背景 下。增加的Teff反應可使用調節Teff和Treg間的平衡或比率傾向Teff活性的抗體達成。
可將抗ICOS抗體用於在患者中耗盡調節性T細胞及/或增加效應T細胞反應，且可將其投予至患者以治療對藉由耗盡調節性T細胞及/或增加效應T細胞反應的療法有反應的疾病或病況。
可使用本發明之抗體、或包含這類抗體分子組成物或編碼其的核酸或提供其以用於任何這種方法。亦設想到該抗體、或包含其的組成物或編碼其的核酸於製造用於任何這種方法的醫藥品之用途。該方法典型包含將該抗體或組成物投予至哺乳動物。適合的調配物和投予方法於本文之其他處描述。
一種該等抗體之設想到的治療用途為癌症之治療。該癌症可以是固態腫瘤，例如腎細胞癌(視情況為腎細胞上皮細胞癌，例如透明細胞腎細胞上皮細胞癌)、頭頸癌、黑色素瘤(視情況為惡性黑色素瘤)、非小細胞肺癌(例如腺癌)、膀胱癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌、胰臟癌、乳癌、睾丸生殖細胞癌、或諸如所列出者的固態腫瘤之轉移，或其可以是液體血液腫瘤，例如淋巴瘤(諸如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤，例如瀰漫性大型B細胞淋巴瘤，DLBCL)或白血病(例如急性骨髓性白血病)。抗ICOS抗體於具有中度至高度突變負載的黑色素瘤、頭頸癌和非小細胞肺癌和其他癌症中可增強腫瘤清除[26]。藉由增強患者對其腫瘤病變的免疫反應，使用抗ICOS抗體的免疫療法提供持久的治癒或長期減輕之希望(可能甚至在晚期疾病之背景下)。
癌症為不同疾病之群組，但抗ICOS抗體提供治療某範圍的 不同癌症之可能性，而此係藉由利用患者自己之免疫系統，其具有透過辨識將癌症細胞從正常的組織區分出來的突變體或過度表現的抗原決定基而殺死任何癌症細胞的潛力。藉由調節Teff/Treg平衡，抗ICOS抗體可促成及/或促進癌症細胞之免疫辨識和殺死。雖然抗ICOS抗體因此對於很多種類的癌症是有用的治療劑，存在有對其而言抗ICOS療法為特別適合的及/或其中抗ICOS療法於另外的治療劑無效時可以是有效的特別類型的癌症。
這種群組之一為對ICOS配體之表現為陽性的癌症。癌症細胞可獲得ICOS配體之表現，如已針對黑色素瘤描述的[27]。ICOS配體之表現可提供該等細胞選擇性優點，因為表面表現的配體結合Treg上的ICOS，促進Treg之表現和活化和藉此抑制對抗癌症的免疫反應。表現ICOS配體的癌症細胞之存活可依賴此透過Treg的免疫系統之抑制，且因此會易受使用靶向Treg的抗ICOS抗體的治療之傷害。此亦適用於衍生自天然地表現ICOS配體的細胞的癌症。通過此等細胞的持續ICOS配體之表現再次透過免疫抑制提供存活優點。表現ICOS配體的癌症可衍生自抗原呈現細胞，諸如B細胞、樹突細胞和單核球且可以是液體血液腫瘤，諸如該等在本文中提及者。有趣的是，已顯示此等類型的癌症之ICOS和FOXP3表現亦高(TCGA數據)-參見實施例25。本文之實施例20展示例示性抗ICOS抗體於治療衍生自表現ICOS配體的癌性B細胞(A20同基因細胞)的腫瘤的效力。
因此，可將抗ICOS抗體用於治療對ICOS配體之表現為陽性的癌症的方法。此外，欲使用根據本發明的抗ICOS抗體治療的癌症可以是對ICOS及/或FOXP3之表現為陽性(且視情況亦表現ICOS配體)者。
患者可進行測試以測定其癌症是否對目標蛋白質(例如ICOS配體、ICOS及/或FOXP3)之表現為陽性，例如藉由自該患者獲取測試樣本(例如腫瘤生檢)並測定目標蛋白質之表現。選擇其癌症已被定性為對一種、兩種或所有這類目標蛋白質為陽性表現的患者來以使用抗ICOS抗體治療。如於本文之其他部分討論的，抗ICOS抗體可用作為單一療法或與一或多種另外的治療劑組合。
抗ICOS抗體亦提供其癌症對使用針對免疫查核點分子(諸如CTLA-4、PD-1、PD-L1、CD137、GITR或CD73)的抗體或其他藥物的治療為不應性的患者希望。此等免疫療法對一些癌症有效但於一些例子中癌症可能不反應，或其可變得對使用該抗體的持續治療不反應。與針對免疫查核點抑制子的抗體相同，抗ICOS抗體調節患者之免疫系統-儘管如此當這類其他抗體失敗時抗ICOS抗體可能成功。本文中顯示帶有A20 B細胞淋巴瘤的動物可使用抗ICOS抗體治療以減少其腫瘤生長、縮小其腫瘤且確實自身體清除其腫瘤，然而使用抗PD-L1抗體的治療不比對照組佳。亦已報導A20細胞株對抗CTLA-4有抗性[28]。
因此，可將抗ICOS抗體用於治療對使用一或多種免疫療法(諸如(以下者之任一者或所有者)抗CTLA-4抗體、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD137抗體、抗GITR抗體、或抗CD73抗體)的治療為不應性的癌症之方法。若使用抗體或藥物的治療未顯著地減少癌症之生長(例如若腫瘤繼續生長或其大小不減小或若於反應期後腫瘤再次開始其生長)，則癌症可定性為對使用該抗體或其他藥物的治療為不應性的。對治療劑之不反應可藉由針對癌症細胞殺死或生長抑制測試樣本(例如腫瘤生檢樣本)來 活體外測定、及/或藉由觀察(例如使用成像技術，包括MRI)使用該療法治療的患者不對治療反應來於臨床設置中測定。選擇其癌症已被定性為對使用這類免疫療法的治療為不應性的患者來以抗ICOS抗體治療。
此外，可將抗ICOS抗體用於治療對使用抗CD20抗體的治療有抗性的衍生自B細胞的癌症。抗ICOS抗體代表用於無法對使用如利妥昔單抗(rituximab)的抗CD20抗體的療法有反應或變得對其有抗性的癌症的治療。可將抗ICOS抗體用作為用於這類癌症的第二線(或進一步的、或另外的)治療。該抗CD20抗體抗性癌症可以是B細胞癌症，例如B細胞淋巴瘤，諸如瀰漫性大型B細胞淋巴瘤。癌症對抗CD20的抗性可藉由針對通過抗CD20抗體的癌症細胞殺死或生長抑制測試樣本(例如腫瘤生檢樣本)來活體外測定，及/或藉由觀察使用該抗CD20抗體治療的患者不對治療反應來於臨床設置中測定。供選擇地(或此外)，可測試該癌症(例如腫瘤生檢樣本)以評估CD20之表現，其中CD20表現之缺少或低水平指出對抗CD20抗體的敏感性之喪失。
可因此測試自患者獲得的樣本以測定目標蛋白質(例如ICOS配體、ICOS、FOXP3及/或另一種治療劑(例如抗受體抗體)所針對的目標受體)之表面表現。目標受體可以是CD20(諸如利妥昔單抗之抗CD20抗體療法的目標)、或另一種受體，諸如PD1、EGFR、HER2或HER3。ICOS配體、ICOS、FOXP3之表面表現及/或目標受體之表面表現之缺乏或喪失是該癌症易受抗ICOS抗體療法影響的指標。可提供抗ICOS抗體以用於投予至其癌症之特徵在於ICOS配體、ICOS、FOXP3之表面表現及/或目標受體之表面表現之缺乏或喪失的患者，視情況其中該患者先前已使用抗 CTLA4、抗PD1、抗PD-L1治療或使用針對該目標受體的抗體治療且已不對使用該抗體的治療反應或已停止對使用該抗體的治療反應，如例如由持續的或恢復的癌症細胞生長(例如腫瘤大小之增加)測量的。
可利用任何適合的方法以測定是否癌症細胞對諸如ICOS配體、CD20或其他在本文中提及的目標受體的蛋白質之表面表現測試為陽性。典型的方法是免疫組織化學，其中使細胞之樣本(例如腫瘤生檢樣本)與針對目標蛋白質的抗體接觸，並使用經標記的試劑(典型地辨識一級抗體之Fc區且帶有諸如螢光標記的可偵測標記的二級抗體)偵測抗體之結合。當至少5%的細胞被標記(如由細胞染色或其他該標記之偵測顯像的)時，可斷言樣本測試為陽性。視情況可使用較高的門檻，諸如10%或25%。該抗體一般會以過量使用。針對目標分子的試劑抗體是可得的或可藉由直接的方法產生。為針對ICOS配體作測試，抗體MAB1651目前可自R&D Systems以辨識人類ICOS配體的小鼠IgG的形式獲得。為針對CD20表現作測試，可使用利妥昔單抗。目標ICOS配體或目標受體之mRNA水平之偵測為供選擇的技術[27]。
腫瘤微環境中Treg之存在為腫瘤會對使用抗ICOS抗體的治療反應的進一步指標。經活化Treg之特徵在於高ICOS和高Foxp3表面表現。腫瘤中Treg之存在(特別是提高數目的)提供基於其可選擇患者來使用抗ICOS抗體治療的進一步基礎。可在腫瘤生檢樣本中活體外偵測Treg，其例如藉由免疫組織化學(針對Foxp3和ICOS兩者之共表現的分析，其使用針對目標蛋白質的抗體接著為標記之偵測，如以上描述的)或藉由將樣本分散成單一細胞以用於使用針對ICOS和FOXP3的經標記的抗體的 FACS。FACS方法在實施例17和實施例18中例示。
可將該抗ICOS抗體用於治療與感染性媒介有關的癌症，諸如病毒誘導的癌症。於此類型中者為頭頸鱗狀細胞癌、子宮頸癌、Merkel氏細胞癌和許多其他者。與癌症相關的病毒包括HBV、HCV、HPV(子宮頸癌、口咽癌)、和EBV(勃兒基特氏淋巴瘤、胃癌、霍奇金氏淋巴瘤、其他EBV陽性B細胞淋巴瘤、鼻咽癌和移植後淋巴增生性疾病)。國際癌症研究署(Monograph 100B)鑑認了以下與感染性媒介相關的主要癌症部位：
˙胃/胃的：幽門螺旋桿菌
˙肝臟：B型肝炎病毒，C型肝炎病毒(HCV)、泰國肝吸蟲(Opisthorchis viverrini)、中華肝吸蟲
˙子宮頸：人類乳頭狀瘤病毒(HPV)加上或不加上HIV
˙會陰(陰莖、陰門、陰道、肛門)：HPV加上或不加上HIV
˙鼻咽：艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)
˙口咽：HPV加上或不加上菸或酒精攝取
˙卡波西氏肉瘤：第8型人類疱疹病毒加上或不加上HIV
˙非霍奇金氏淋巴瘤：幽門螺旋桿菌、EBV加上或不加上HIV、HCV、第1型人類嗜T細胞淋巴球病毒
˙霍奇金氏淋巴瘤：EBV加上或不加上HIV
˙膀胱：埃及住血吸蟲。
可將根據本發明的抗體用於治療與此等感染性媒介之任一者相關或由此等感染性媒介之任一者誘導的癌症，諸如以上具體指明的癌症。
效應T細胞反應之刺激亦可促成對抗感染性疾病的免疫性及/或患者自感染性疾病恢復。因此，可將抗ICOS抗體用於治療感染性疾病，其係藉由將該抗體投予至患者。
感染性疾病包括該等由病原體(例如細菌、真菌、病毒或原蟲病原體)造成者，且治療可以是在患者中促進對抗該病原體感染的免疫反應。細菌病原體之實例為結核病。病毒病原體之實例為B型肝炎和HIV。原蟲病原體之實例為造成瘧疾的瘧原蟲屬物種，諸如惡性瘧原蟲(P.falciparum)。
可將該抗體用於治療感染，例如由在本文中提及的任何病原體造成的感染。感染可以是持久性或慢性感染。感染可以是局部性的或全身性的。病原體和免疫系統間的延長接觸可導致免疫系統之衰竭或發展出耐受性(例如透過增加的Treg之水平和使Treg：Teff平衡傾向Treg來顯示)及/或病原體之免疫逃避，其透過所展示的病原體抗原之演化和修飾。此等特徵反映被認為在癌症中發生的類似程序。抗ICOS抗體呈現透過調節Treg：Teff比率傾向Teff及/或其他於本文中描述的功效來治療由病原體造成的感染(例如慢性感染)的治療方法。
治療可以是已被診斷為具有感染性疾病或感染的患者之治療。供選擇地，治療可以是預防性的且被投予至患者以守護其免於感染疾病，例如作為疫苗，如於本文之其他處描述的。
亦已提出免疫反應(特別是IFNγ依賴性全身性免疫反應)可能對於阿滋海默氏病和其他共有神經發炎組分作為部分的CNS病理之治療是有益的[29]。WO2015/136541提出使用抗PD-1抗體的阿滋海默氏病之治 療。可將抗ICOS抗體用於阿滋海默氏病或其他神經退化性疾病之治療，視情況與一或多種其他免疫調節劑(例如針對PD-1的抗體)組合。
組合療法
使用免疫調節性抗體(諸如抗CTLA4、抗PD1或抗PDL1，特別是具有Fc效應功能者)的治療可能創造其中高度表現ICOS的免疫抑制性細胞之進一步耗盡是有益的環境。組合抗ICOS抗體與這類免疫調節劑以增強其治療功效可以是有益的。
已使用免疫調節性抗體(例如抗PDL-1、抗PD-1、抗CTLA-4)治療的患者可特別受益於使用抗ICOS抗體的治療。此之一個理由是免疫調節性抗體可在患者中增加ICOS陽性Treg(例如腫瘤內Treg)之數目。此功效亦於使用某些其他的治療劑(諸如重組IL-2)時觀察到。抗ICOS抗體可減少及/或逆轉導因於使用另一種治療劑治療該患者的ICOS+ Treg(例如腫瘤內Treg)之波動或升高。被選擇來使用抗ICOS抗體治療的患者因此可為已接受使用第一種治療劑治療者，該第一種治療劑為在該患者中增加ICOS+ Treg之數目的抗體(例如免疫調節抗體)或其他藥劑(例如IL-2)。
抗ICOS抗體可與其組合的免疫調節劑包括針對以下者之任一者抗體：PDL1(例如avelumab)、PD-1(例如派姆單抗(pembrolizumab)或納武單抗(nivolumab))或CTLA-4(例如ipilimumab或曲美木單抗(tremelimumab))。抗ICOS抗體可與pidilizumab組合。於其他具體實例中，抗ICOS抗體不與抗CTLA-4抗體組合投予，及/或視情況與非抗CTLA-4抗體的治療抗體組合投予。
例如，可將抗ICOS抗體用於與抗PDL1抗體的組合療法。較佳地，該抗ICOS抗體介導ADCC、ADCP及/或CDC者。較佳地，該抗PDL1抗體介導ADCC、ADCP及/或CDC者。這類組合療法之實例為抗ICOS抗體與抗PDL1抗體之投予，其中二抗體皆具有功效陽性恆定區。因此，該抗ICOS抗體和該抗PDL1抗體可兩者皆能夠介導ADCC、CDC及/或ADCP。Fc效應功能和恆定區之選擇於本文之其他處詳細描述，但作為一個實例抗ICOS人類IgG1可與抗PD-L1人類IgG1組合。該抗ICOS抗體及/或該抗PD-L1抗體可包含野生型人類IgG1恆定區。供選擇地，抗體之功效陽性恆定區可以是經工程改造以增強效應功能(例如增強CDC、ADCC及/或ADCP)者。包括野生型人類IgG1序列和改變效應功能的突變的實例抗體恆定區於本文之其他處討論。
抗ICOS抗體可與其組合的抗PDL1抗體包括：˙抑制PD-1與PDL1之結合及/或抑制PDL1且視情況為功效陽性人類IgG1的抗PDL1抗體；˙抑制PD-1與PDL1及/或PDL2之結合的抗PD-1抗體；˙Avelumab，其為抑制PD-1與PDL-1之結合的人類IgG1抗體。參見WO2013/079174；˙Durvalumab(或「MEDI4736」)，其為具有突變L234A、L235A和331的變體人類IgG1抗體。參見WO2011/066389；˙阿特珠單抗(Atezolizumab)，其為具有突變N297A、D356E和L358M的變體人類IgG1抗體。參見US2010/0203056；˙BMS-936559，其為包含突變S228P的人類IgG4抗體。參見WO2007/005874。
數目眾多的抗PD-L1抗體之其他實例為在本文中揭露且其他者於所屬技術領域中為已知的。本文提及的抗PD-L1抗體之許多者之特徵數據已在US9,567,399和US9,617,338(兩者皆以引用方式併入本文中)中公開。實例抗PD-L1抗體具有包含如於US9,567,399或US9,617,338中提出的1D05、84G09、1D05 HC突變體1、1D05 HC突變體2、1D05 HC突變體3、1D05 HC突變體4、1D05 LC突變體1、1D05 LC突變體2、1D05 LC突變體3、411B08、411C04、411D07、385F01、386H03、389A03、413D08、413G05、413F09、414B06或416E01之任一者之HCDR及/或LCDR的VH及/或VL域。該抗體可包含此等抗體之任一者之VH和VL域，且可視情況包含具有此等抗體之任一者之重鏈及/或輕鏈胺基酸序列的重鏈及/或輕鏈。此等抗PD-L1抗體之VH和VL域在本文之其他處進一步描述。
其他實例抗PD-L1抗體具有包含KN-035、CA-170、FAZ-053、M7824、ABBV-368、LY-3300054、GNS-1480、YW243.55.S70、REGN3504或在以下者之任一者中揭露的抗PD-L1抗體之HCDR及/或LCDR的VH及/或VL域：WO2017/034916、WO2017/020291、WO2017/020858、WO2017/020801、WO2016/111645、WO2016/197367、WO2016/061142、WO2016/149201、WO2016/000619、WO2016/160792、WO2016/022630、WO2016/007235、WO2015/179654、WO2015/173267、WO2015/181342、WO2015/109124、WO2015/112805、WO2015/061668、WO2014/159562、WO2014/165082、WO2014/100079、WO2014/055897、WO2013/181634、WO2013/173223、WO2013/079174、WO2012/145493、WO2011/066389、WO2010/077634、WO2010/036959、WO2010/089411和WO2007/005874。該抗 體可包含此等抗體之任一者之VH和VL域，且可視情況包含具有此等抗體之任一者之重鏈及/或輕鏈胺基酸序列的重鏈及/或輕鏈。在與抗PD-L1的組合療法中使用的抗ICOS抗體可以是如本文中揭露的本發明之抗體。供選擇地，該抗ICOS抗體可包含在以下出版品之任一者中揭露的抗ICOS抗體之CDR或VH及/或VL域：WO2016154177、US2016304610-例如抗體7F12、37A10、35A9、36E10、16G10、37A10S713、37A10S714、37A10S715、37A10S716、37A10S717、37A10S718、16G10S71、16G10S72、16G10S73、16G10S83、35A9S79、35A9S710、或35A9S89之任一者；WO16120789、US2016215059-例如稱為422.2及/或H2L5的抗體；WO14033327、EP2892928、US2015239978-例如稱為314-8及/或從融合瘤CNCM I-4180產生的抗體；WO12131004、EP2691419、US9376493、US20160264666-例如抗體Icos145-1及/或由融合瘤CNCM I-4179產生的抗體；WO10056804-例如抗體JMAb 136或「136」；WO9915553、EP1017723B1、US7259247、US7132099、US7125551、US7306800、US7722872、WO05103086、EP1740617、US8318905、US8916155-例如抗體MIC-944或9F3；WO983821、US7932358B2、US2002156242、EP0984023、EP1502920、US7030225、US7045615、US7279560、US7226909、US7196175、US7932358、US8389690、WO02070010、EP1286668、EP1374901、US7438905、US7438905、WO0187981、EP1158004、US6803039、US7166283、US7988965、WO0115732、 EP1125585、US7465445、US7998478-例如任何JMAb抗體、例如JMAb-124、JMAb-126、JMAb-127、JMAb-128、JMAb-135、JMAb-136、JMAb-137、JMAb-138、JMAb-139、JMAb-140、JMAb-141之任一者，例如JMAb136；WO2014/089113-例如抗體17G9；WO12174338；US2016145344；WO11020024、EP2464661、US2016002336、US2016024211、US8840889；US8497244。
該抗ICOS抗體視情況包含如在WO2016154177中揭露的37A10S713之CDR。其可包含37A10S713之VH和VL域，且可視情況具有37A10S713之抗體重鏈和輕鏈。
抗ICOS抗體與免疫調節劑之組合相較於單一療法可提供增加的治療功效，且使得能夠以較低劑量的該(等)免疫調節劑達成治療益處。因此，例如，與抗ICOS抗體組合使用的抗體(例如抗PD-L1抗體，視情況為ipilimumab)可以3mg/kg而非更常見的10mg/kg之劑量給藥。該抗PD-L1或其他抗體之投予攝生法可涉及每3週於90分鐘的期間的靜脈內投予，共4劑。
可將抗ICOS抗體用於增加腫瘤對於使用抗PD-L1抗體的治療的敏感性，其可藉由該抗PD-L1抗體於其發揮治療益處的劑量之減低來辨識。因此，可將抗ICOS抗體投予至患者以減低抗PD-L1抗體在該患者中有效治療癌症或腫瘤的劑量。抗ICOS抗體之投予可將至該患者的抗PD-L1抗體投予之推薦或所需劑量減低至(例如)75%、50%、25%、20%、10% 或更少(相較於當抗PD-L1抗體不加上抗ICOS投予時的劑量)。可藉由投予在如於本文中描述的組合療法中的抗ICOS抗體和抗PD-L1抗體治療該患者。
組合抗PD-L1和抗ICOS之益處可延伸至各個藥劑之劑量之減低(當相較於其作為單一療法使用時)。可將抗PD-L1抗體用於減低抗ICOS抗體發揮治療益處的劑量，且因此可將其投予至患者以減低抗ICOS抗體在該患者中有效治療癌症或腫瘤的劑量。因此，抗PD-L1抗體可將至該患者的抗ICOS抗體投予之推薦或所需劑量減低至(例如)75%、50%、25%、20%、10%或更少(相較於當抗ICOS抗體不加上抗PD-L1投予時的劑量)。可藉由投予在如於本文中描述的組合療法中的抗ICOS抗體和抗PD-L1抗體來治療該患者。
如在本文之實施例22中討論的，使用抗PD-L1抗體(特別是具有功效陽性Fc的抗體)的治療顯得不會增加Teff細胞上ICOS之表現。當組合功效陽性抗ICOS抗體投予這類抗體(其中在Teff上ICOS表現之增加會非所欲地致使此等細胞對透過該抗ICOS抗體的耗盡更加敏感)時，此為有益的。在與抗PD-L1的組合中，抗ICOS療法因此可利用相較於Treg在Teff上的ICOS之差異性表現，優先使高ICOS的Treg成為耗盡之標的。此隨即減輕TEff之抑制且具有在患者中促進效應T細胞反應的淨功效。先前亦已研究靶向免疫查核點分子對在T細胞上的ICOS之表現的功效-參見文獻[30](補充資料)中的圖S6C，該文獻報導了使用CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體的治療會增加表現ICOS的CD4+ Treg之百分比。治療劑對Treg和Teff中的ICOS表現的功效可為在與抗ICOS抗體組合使用的適當藥劑之 選擇中的因子，注意該抗ICOS抗體之功效可在其中存在有在Treg上相對於在Teff上的ICOS之高差異性表現之情況下增強。
如於本文中描述的，單劑的抗ICOS抗體可能足以提供治療功效，特別是在與另外的治療劑(諸如抗PD-L1抗體)組合時。於腫瘤療法中，此單劑之益處的基礎原理可以是該抗ICOS抗體藉由(至少部分)以下者介導其功效：充分地重置或改變腫瘤之微環境以致使該腫瘤對於免疫攻擊及/或對於其他免疫調節劑(諸如該等所提及者)之功效更敏感。腫瘤微環境重置係透過例如ICOS陽性腫瘤浸潤性T-reg之耗盡觸發。因此，例如，可使用單劑的抗ICOS抗體接著使用一或多劑的抗PD-L1抗體來治療患者。可在治療期(例如六個月或一年)期間以單劑投予該抗ICOS抗體並在該治療期期間視情況地投予其他藥劑(例如抗PD-L1抗體)多次，較佳地其中此等劑之至少一劑是在使用該抗ICOS抗體的治療後投予。
組合療法之其他實例包括抗ICOS抗體與以下者之組合：-腺嘌呤核苷A2A受體之拮抗劑(「A2AR抑制劑」)；- CD137促效劑(例如促效抗體)；-酵素吲哚胺-2,3氧酶(其催化色胺酸之分解)之拮抗劑(「IDO抑制劑」)。IDO是免疫查核點(在樹突細胞和巨噬細胞中活化)，其促成免疫抑制/耐受性。
可將抗ICOS抗體用於與IL-2(例如重組IL-2，諸如aldesleukin)的組合療法。可以高劑量(HD)投予IL-2。典型的HD IL-2療法涉及每療法之循環超過500,000IU/kg的推注，例如600,000或720,000IU/kg的推注，其中於5-10個小時的間隔給予10-15個這樣的推注(例如每8小時 至多達15個推注)，和大約每14至21日重複該療法循環至多達6至8個循環。已成功地以HD IL-2療法治療腫瘤，特別是黑色素瘤(例如轉移性黑色素瘤)和腎細胞癌，但其使用受限於可能造成嚴重副作用的IL-2之高毒性。
已顯示使用高劑量IL-2的治療在癌症患者中會增加ICOS陽性Treg之總數[31]。已報導此於第一個HD IL-2療法循環後的ICOS+ TReg之增加與不佳的臨床結果相關-ICOS+ Treg之數目越高，預後越差。已提議使用IL-2變體F42K作為供選擇的療法以避免此ICOS+ Treg細胞之非所欲的增加[32]。然而，另一個方法會是藉由使用根據本發明的抗體作為第二線治療劑來利用ICOS+ T reg之增加。
以下者可以是有益的：組合IL-2療法與抗ICOS抗體，利用抗ICOS抗體靶向高度表現ICOS的TReg的能力，抑制此等細胞並改善經歷IL-2療法的患者之預後。IL-2和抗ICOS抗體之相伴投予可增加反應率同時避免或減少所治療的患者族群中之不良事件。該組合使得能夠以較低的劑量使用IL-2(相較於IL-2單一療法)，減少導因於IL-2療法的不良事件之風險或水平，同時保留或增強臨床益處(例如腫瘤生長之減少、固態腫瘤之清除及/或轉移之減少)。以此方式，抗ICOS之添加可改善正接受IL-2(無論是高劑量(HD)或低劑量(LD)IL-2)的患者之治療。
因此，本發明之一個方面提供治療患者的方法，其係藉由將抗ICOS抗體投予至該患者，其中該患者亦以IL-2(例如HD IL-2)治療。本發明之另一個方面為供治療患者之用的抗ICOS抗體，其中該患者係以IL-2(例如HD IL-2)治療。該抗ICOS抗體可以是以第二線療法使用。因此，該患者可以是已用IL-2治療(例如已接受至少一個循環的HD IL-2療法) 者、和具有增加水平的ICOS+ Treg者。可對癌症細胞之樣本(例如腫瘤生檢樣本)執行分析，其使用如於本文之其他處描述的免疫組織化學或FACS以偵測對ICOS、Foxp3、ICOSL和視情況的一或多種其他目標標記為陽性的細胞。方法可包含測定該患者在IL-2治療後具有增加水平的ICOS+ Treg(例如在周邊血液中、或在腫瘤生檢中)，其中增加的水平表示該患者會受益於使用該抗ICOS抗體的治療。Treg之增加可以是相對於對照組(未經治療的)個體或相對於IL-2療法前的患者。這類具有提高的Treg的患者代表一個群體，其可能無法受益於單獨的持續IL-2治療，但對其而言抗ICOS抗體和IL-2療法之組合或單獨使用抗ICOS抗體的治療會提供治療益處。因此，於測定並確認該患者具有增加水平的ICOS+ Treg後，可投予抗ICOS抗體及/或另外的IL-2療法。使用該抗ICOS抗體的治療可在這類患者中選擇性地靶向並耗盡ICOS+ Treg(相對於其他T細胞族群)。此藉由減輕由此等細胞介導的免疫抑制並藉此增強Teff對目標細胞(例如腫瘤細胞或經感染細胞)的活性來提供治療功效。
可將使用抗ICOS抗體和IL-2的組合療法用於任何於本文中描述的治療適應症，且特別可將其用於治療腫瘤，例如黑色素瘤，諸如轉移性黑色素瘤、或腎細胞癌。因此，於一個實例中，使用抗ICOS抗體治療的患者為具有轉移性黑色素瘤且已使用IL-2(例如HD IL-2療法或LD IL-2療法)治療者。
一般而言，當將抗ICOS抗體投予至已接受使用第一治療劑(例如免疫調節抗體)或其他藥劑(例如IL-2)的治療的患者時，該抗ICOS抗體可於第一治療劑之投予後(例如)24小時、48小時、72小時、1週或 2週的最小期間後投予。該抗ICOS抗體可於第一治療劑之投予後2、3、4或5週內投予。雖然可能希望最小化所投予的治療之數目以使患者易於順從並以減低花費，但並不排除於任何時間任一藥劑之另外的投予。相反地，會選擇投予之相對時間以最佳化其組合功效，第一治療劑創造其中該抗ICOS抗體之功效特別有益的免疫環境(例如提高的ICOS+ Treg、或抗原釋放，如以下所討論的)。因此，第一治療劑和接著該抗ICOS抗體之相繼投予可給第一藥劑發揮作用的時間，以創造其中該抗ICOS抗體可展現其增強的功效的活體內條件。本文中描述多種投予攝生法(包括同時或相繼組合治療)且可酌情利用之。當第一治療劑是在患者中增加ICOS+ Treg之數目者時，用於該患者的治療攝生法可包含測定該患者具有增加數目的ICOS+ Treg，並接著投予該抗ICOS抗體。
如以上所述的，於組合療法中使用抗ICOS抗體可提供減低治療劑之有效劑量及/或在患者中反擊治療劑增加ICOS+ Treg的副作用的優點。又另一個治療益處可透過以下者達成：選擇透過「免疫性細胞死亡」而造成抗原自目標細胞被釋放的第一治療劑，並組合投予該第一治療劑與抗ICOS抗體。如以上所述的，該抗ICOS抗體之投予可繼於該第一治療劑之投予後，該兩種藥劑之投予是以某種時間窗口分開，如以上所討論的。
免疫性細胞死亡為細胞死亡之辨識性模式，其與凋亡成對比。其特徵在於ATP和HMGB1自細胞之釋放和細胞膜上的鈣網伴護蛋白之暴露[33、34]。
於目標組織或於目標細胞的免疫性細胞死亡促進該細胞被抗原呈現細胞吞入，導致來自該目標細胞的抗原之展示，其隨即誘導抗原 專一性Teff細胞。抗ICOS抗體可藉由扮演Teff細胞上的ICOS之促效劑來增加Teff反應之程度及/或持續期間。此外，當該抗ICOS抗體之Fc效應功能被啟動(例如人類IgG1抗體)時，該抗ICOS抗體可造成抗原專一性Treg之耗盡。因此，透過此等功效之一或兩者之組合，Teff和Treg細胞間的平衡被調節成傾向增強Teff活性。抗ICOS抗體與於目標組織或細胞類型(諸如於腫瘤或於癌症細胞)誘導免疫性細胞死亡並藉此在該患者中促進對抗目標組織或細胞的免疫反應的治療之組合代表一種其中疫苗抗原是在活體內產生的疫苗接種之形式。
因此，本發明之一個方面為在患者中藉由該患者之對抗其癌症細胞的活體內疫苗接種來治療癌症的方法。本發明之另一個方面為供於這種方法中使用的抗ICOS抗體。可將抗ICOS抗體用於包含以下者的方法：以造成該等癌症細胞之免疫性細胞死亡的療法治療該患者，造成抗原被呈現給抗原專一性效應T細胞、和將抗ICOS抗體投予至該患者，其中該抗ICOS抗體增強對抗該等癌症細胞的抗原專一性效應T細胞反應。
誘導免疫性細胞死亡的治療包括放射線照射(例如使用UVC光或γ射線的細胞之游離照射)、化學治療劑(例如奧沙利鉑(oxaliplatin)，蒽環類，諸如多柔比星(Doxorubicin)、艾達黴素(idarubicin)或米托蒽醌(mitoxantrone)、BK通道促效劑，諸如根皮素或海松脂酸、硼替佐米(bortezomib)、強心苷類、環磷醯胺、GADD34/PP1抑制劑加上絲裂黴素、PDT加上金絲桃素、聚肌苷酸-聚胞苷酸、5-氟脲嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、吉非替尼(gefitnib)、厄洛替尼(erlotinib)、或thapsigargin 加上順鉑)和針對腫瘤相關抗原的抗體。腫瘤相關抗原可以是任何相對於相同的組織之非腫瘤細胞被腫瘤細胞過度表現的抗原，例如HER2、CD20、EGFR。適合的抗體包括賀癌平(herceptin)(抗HER2)、利妥昔單抗(抗CD20)、或西妥昔單抗(cetuximab)(抗EGFR)。
因此，組合抗ICOS抗體與一或多種這類治療是有益的。視情況地，將該抗ICOS抗體投予至已接受這類治療的患者。該抗ICOS抗體可於(例如)誘導免疫性細胞死亡的治療後24小時、48小時、72小時、1週或2週的期間後(例如治療後24至72小時間)投予。該抗ICOS抗體可於該治療後2、3、4或5週內投予。其他用於組合療法的攝生法於本文之其他處討論。
雖然「活體內疫苗接種」已於以上描述，以下者亦為可能的：活體外處理腫瘤細胞以誘導免疫性細胞死亡，之後可將該等細胞再導入至該患者。不直接將誘導免疫性細胞死亡的藥劑或治療投予至該患者，而是將經處理的腫瘤細胞投予至該患者。該患者之治療可根據以上描述的投予攝生法。
如以上所述的，單劑的抗ICOS抗體可足以提供治療益處。因此，於本文中描述的治療之方法中，視情況地以單劑形式投予該抗ICOS抗體。單劑的抗ICOS抗體可在患者中耗盡Treg，而於疾病(諸如癌症)中伴隨所導致的有益功效。先前已報導Treg之暫時摘除具有抗腫瘤功效，包括減少腫瘤進展、治療已建立的腫瘤和轉移和延長存活，且其可增強腫瘤放射線照射之治療功效[35]。單劑的抗ICOS之投予可提供這樣的Treg耗盡，且可用於增強組合使用的其他治療方法(諸如放射線療法)之功效。
針對PD-L1的抗體
與抗ICOS抗體組合使用的針對PD-L1的抗體(無論是否是呈分開的治療劑或於如在本文中描述的多重專一性抗體中)可包含任何抗PD-L1抗體之抗原-結合位置。數目眾多的抗PD-L1抗體之實例為在本文中揭露且其他者於所屬技術領域中已知的。本文提及的抗PD-L1抗體之許多者之特徵數據已在US9,567,399和US9,617,338(兩者皆以引用方式併入本文中)中公開。
1D05具有SEQ ID No：33之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：27(IMGT)或Seq ID No：30(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：28(IMGT)或Seq ID No：31(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和Seq ID No：29(IMGT)或Seq ID No：32(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：34。1D05具有SEQ ID NO：43之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：37(IMGT)或Seq ID No：40(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：38(IMGT)或Seq ID No：41(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：39(IMGT)或Seq ID No：42(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：44。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：35(重鏈核酸序列Seq ID No：36)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：45(輕鏈核酸序列Seq ID No：46)。
84G09具有SEQ ID No：13之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：7(IMGT)或Seq ID No：10(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：8(IMGT)或Seq ID No：11(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：9(IMGT)或Seq ID No：12(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：14。84G09具有SEQ ID No：23之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：17(IMGT)或Seq ID No：20(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：18(IMGT)或Seq ID No：21(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：19(IMGT)或Seq ID No：22(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：24。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：15(重鏈核酸序列Seq ID No：16)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：25(輕鏈核酸序列Seq ID No：26)。
1D05 HC突變體1具有SEQ ID No：47之重鏈可變(VH)區胺 基酸序列，其包含SEQ ID No：27(IMGT)或Seq ID No：30(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：28(IMGT)或Seq ID No：31(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：29(IMGT)或Seq ID No：32(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。1D05 HC突變體1具有SEQ ID NO：43之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：37(IMGT)或Seq ID No：40(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：38(IMGT)或Seq ID No：41(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：39(IMGT)或Seq ID No：42(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：44。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：45(輕鏈核酸序列Seq ID No：46)。
1D05 HC突變體2具有SEQ ID No：48之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：27(IMGT)或Seq ID No：30(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：28(IMGT)或Seq ID No：31(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：29(IMGT)或Seq ID No：32(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。1D05 HC突變體2具有SEQ ID NO：43之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：37(IMGT)或Seq ID No：40(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：38(IMGT)或Seq ID No：41(Kabat)之CDRL2胺 基酸序列、和SEQ ID No：39(IMGT)或Seq ID No：42(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：44。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：45(輕鏈核酸序列Seq ID No：46)。
1D05 HC突變體3具有SEQ ID No：49之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：27(IMGT)或Seq ID No：30(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：28(IMGT)或Seq ID No：31(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：29(IMGT)或Seq ID No：32(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。1D05 HC突變體3具有SEQ ID NO：43之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：37(IMGT)或Seq ID No：40(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：38(IMGT)或Seq ID No：41(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：39(IMGT)或Seq ID No：42(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：44。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文 中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：45(輕鏈核酸序列Seq ID No：46)。
1D05 HC突變體4具有SEQ ID No：342之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：27(IMGT)或Seq ID No：30(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：28(IMGT)或Seq ID No：31(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：29(IMGT)或Seq ID No：32(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。1D05 HC突變體4具有SEQ ID NO：43之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：37(IMGT)或Seq ID No：40(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：38(IMGT)或Seq ID No：41(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：39(IMGT)或Seq ID No：42(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：44。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：45(輕鏈核酸序列Seq ID No：46)。
1D05 LC突變體1具有SEQ ID No：33之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：27(IMGT)或Seq ID No：30(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：28(IMGT)或Seq ID No：31(Kabat)之CDRH2胺 基酸序列、和SEQ ID No：29(IMGT)或Seq ID No：32(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：34。1D05 LC突變體1具有SEQ ID No：50之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：37(IMGT)或Seq ID No：40(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、和SEQ ID No：39(IMGT)或Seq ID No：42(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。1D05 LC突變體1之CDRL2序列是如由Kabat或IMGT系統所界定的來自Seq ID No：50之VL序列。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205或Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：35(重鏈核酸序列Seq ID No：36)。
1D05 LC突變體2具有SEQ ID No：33之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：27(IMGT)或Seq ID No：30(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：28(IMGT)或Seq ID No：31(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：29(IMGT)或Seq ID No：32(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：34。1D05 LC突變體2具有SEQ ID No：51之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：37(IMGT)或Seq ID No：40(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：38(IMGT)或Seq ID No：41(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：39(IMGT)或 Seq ID No：42(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：35(重鏈核酸序列Seq ID No：36)。
1D05 LC突變體3具有SEQ ID No：33之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：27(IMGT)或Seq ID No：30(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：28(IMGT)或Seq ID No：31(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：29(IMGT)或Seq ID No：32(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：34。1D05 LC突變體3具有SEQ ID No：298之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：37(IMGT)或Seq ID No：40(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、和SEQ ID No：39(IMGT)或Seq ID No：42(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。1D05 LC突變體3之CDRL2序列是如由Kabat或IMGT系統所界定的來自Seq ID No：298之VL序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：44。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205或Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的 輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：35(重鏈核酸序列Seq ID No：36)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：45(輕鏈核酸序列Seq ID No：46)。
411B08具有SEQ ID No：58之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：52(IMGT)或Seq ID No：55(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：53(IMGT)或Seq ID No：56(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：54(IMGT)或Seq ID No：57(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：59。411B08具有SEQ ID No：68之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：62(IMGT)或Seq ID No：65(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：63(IMGT)或Seq ID No：66(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：64(IMGT)或Seq ID No：67(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：69。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：60(重鏈核酸序列Seq ID No：61)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：70(輕鏈核酸序列Seq ID No：71)。
411C04具有SEQ ID No：78之重鏈可變(VH)區胺基酸序列， 其包含SEQ ID No：72(IMGT)或Seq ID No：75(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：73(IMGT)或Seq ID No：76(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：74(IMGT)或Seq ID No：77(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：79。411C04具有SEQ ID No：88之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：82(IMGT)或Seq ID No：85(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：83(IMGT)或Seq ID No：86(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：84(IMGT)或Seq ID No：87(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：89。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：80(重鏈核酸序列Seq ID No：81)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：90(輕鏈核酸序列Seq ID No：91)。
411D07具有SEQ ID No：98之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：92(IMGT)或Seq ID No：95(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：93(IMGT)或Seq ID No：96(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和Seq ID No：94(IMGT)或Seq ID No：97(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：99。411D07具有SEQ ID No：108之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：102(IMGT)或Seq ID No：105 (Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：103(IMGT)或Seq ID No：106(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：104(IMGT)或Seq ID No：107(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：109。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：100(重鏈核酸序列Seq ID No：101)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：110(輕鏈核酸序列Seq ID No：111)。
385F01具有SEQ ID No：118之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：112(IMGT)或Seq ID No：115(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：113(IMGT)或Seq ID No：116(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：114(IMGT)或Seq ID No：117(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：119。385F01具有Seq ID No：128之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：122(IMGT)或Seq ID No：125(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：123(IMGT)或Seq ID No：126(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：124(IMGT)或Seq ID No：127(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：129。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合： Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：120(重鏈核酸序列Seq ID No：121)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：130(輕鏈核酸序列Seq ID No：131)。
386H03具有SEQ ID No：158之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：152(IMGT)或Seq ID No：155(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：153(IMGT)或Seq ID No：156(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：154(IMGT)或Seq ID No：157(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：159。386H03具有SEQ ID No：168之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：162(IMGT)或Seq ID No：165(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：163(IMGT)或Seq ID No：166(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：164(IMGT)或Seq ID No：167(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：169。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任 一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：160(重鏈核酸序列Seq ID No：161)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：170(輕鏈核酸序列Seq ID No：171)。
389A03具有SEQ ID No：178之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：172(IMGT)或Seq ID No：175(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：173(IMGT)或Seq ID No：176(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：174(IMGT)或Seq ID No：177(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：179。389A03具有SEQ ID No：188之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：182(IMGT)或Seq ID No：185(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：183(IMGT)或Seq ID No：186(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：184(IMGT)或Seq ID No：187(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：189。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：180(重鏈核酸序列Seq ID No：181)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：190(輕鏈核酸序列Seq ID No：191)。
413D08具有SEQ ID No：138之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：132(IMGT)或Seq ID No：135(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：133(IMGT)或Seq ID No：136(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：134(IMGT)或Seq ID No：137(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：139。413D08具有SEQ ID No：148之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：142(IMGT)或Seq ID No：145(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：143(IMGT)或Seq ID No：146(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：144(IMGT)或Seq ID No：147(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：149。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：140(重鏈核酸序列Seq ID No：141)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：150(輕鏈核酸序列Seq ID No：151)。
413G05具有SEQ ID No：244之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：238(IMGT)或Seq ID No：241(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：239(IMGT)或Seq ID No：242(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：240(IMGT)或Seq ID No：243(Kabat)之CDRH3胺基 酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：245。413G05具有SEQ ID No：254之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：248(IMGT)或Seq ID No：251(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：249(IMGT)或Seq ID No：252(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：250(IMGT)或Seq ID No：253(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：255。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：246(重鏈核酸序列Seq ID No：247)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：256(輕鏈核酸序列Seq ID No：257)。
413F09具有SEQ ID No：264之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：258(IMGT)或Seq ID No：261(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：259(IMGT)或Seq ID No：262(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：260(IMGT)或Seq ID No：263(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：265。413F09具有SEQ ID No：274之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：268(IMGT)或Seq ID No：271(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：269(IMGT)或Seq ID No：272(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：270(IMGT)或Seq ID No：273 (Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：275。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：266(重鏈核酸序列Seq ID No：267)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：276(輕鏈核酸序列Seq ID No：277)。
414B06具有SEQ ID No：284之重鏈可變(VH)區胺基酸序列，其包含SEQ ID No：278(IMGT)或Seq ID No：281(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：279(IMGT)或Seq ID No：282(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：280(IMGT)或Seq ID No：283(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：285。414B06具有SEQ ID No：294之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：288(IMGT)或Seq ID No：291(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：289(IMGT)或Seq ID No：292(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：290(IMGT)或Seq ID No：293(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：295。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、 Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：286(重鏈核酸序列Seq ID No：287)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：296(輕鏈核酸序列Seq ID No：297)。
416E01具有SEQ ID No：349之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：343(IMGT)或Seq ID No：346(Kabat)之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID No：344(IMGT)或Seq ID No：347(Kabat)之CDRH2胺基酸序列、和SEQ ID No：345(IMGT)或Seq ID No：348(Kabat)之CDRH3胺基酸序列。該VH域之重鏈核酸序列是Seq ID No：350。416E01具有SEQ ID No：359之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其包含SEQ ID No：353(IMGT)或Seq ID No：356(Kabat)之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID No：354(IMGT)或Seq ID No：357(Kabat)之CDRL2胺基酸序列、和SEQ ID No：355(IMGT)或Seq ID No：358(Kabat)之CDRL3胺基酸序列。該VL域之輕鏈核酸序列是Seq ID No：360。該VH域可與例如以下者的於本文中描述的重鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：193、Seq ID No：195、Seq ID No：197、Seq ID No：199、Seq ID No：201、Seq ID No：203、Seq ID No：205、Seq ID No：340、Seq ID No：524、Seq ID No：526、Seq ID No：528、Seq ID No：530、Seq ID No：532或Seq ID No：534。該VL域可與例如以下者的於本文中描述的輕鏈恆定區序列之任一者組合：Seq ID No：207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、536和538。全長重鏈胺基酸序列是Seq ID No：351(重鏈核 酸序列Seq ID No：352)。全長輕鏈胺基酸序列是Seq ID No：361(輕鏈核酸序列Seq ID No：362)。
抗體-藥物共軛物
可將抗ICOS抗體用作為細胞毒性劑之載體，以靶向Treg。如於實施例18中報導的，位於腫瘤微環境(TME)中的Treg強烈表現ICOS。ICOS相較於在腫瘤內Teff或周邊Treg上在腫瘤內Treg上被更強烈地表現。因此，使用毒性藥物或前藥標記的抗ICOS抗體可優先地靶向TME中的Treg以遞送其毒性負載，選擇性地抑制該等細胞。這類細胞毒性劑之靶向提供用於移除Treg之免疫抑制功效並藉此改變Treg：Teff平衡傾向Teff活性的另外的途徑，且可將其用作為於本文中討論的其他治療方法(例如Treg之Fc效應介導的抑制、效應T細胞之促效作用)之任一或多者之替代方法或可與之組合使用。
因此，本發明提供與細胞毒性藥物或前藥共軛的抗ICOS抗體。於前藥的例子中，該前藥於TME或治療活性之其他目標位置為可活化的以產生該細胞毒性劑。活化可以是對諸如光活化的觸發反應，例如使用近紅外光以活化光吸收共軛物[36]。前藥之空間選擇性活化進一步增強該抗體-藥物共軛之細胞毒性功效，與腫瘤內Treg上的高ICOS表現組合以提供對此等細胞為高度選擇性的細胞毒性功效。
對於在抗體-藥物共軛物中使用，該細胞毒性藥物或前藥於血液中的該抗體-藥物共軛之循環期間較佳是非免疫原性的和非毒性的(休眠的或非活性的)。較佳地，該細胞毒性藥物(或前藥，當活化時)是有效 的-例如二至四個分子的該藥物可足以殺死目標細胞。一種光可活化前藥是二氧化矽酞青素染料(IRDye 700 DX)，其於近紅外光暴露後對細胞膜誘導致死性傷害。細胞毒性藥物包括抗有絲分裂劑，諸如單甲基auristatin E和微管抑制劑，諸如美登素(maytansine)衍生物，例如mertansine、DM1、emtansine。
該藥物(或前藥)與該抗體之共軛通常會透過連接子。該連接子可以是可切斷的連接子，例如二硫化物、腙或胜肽連接。可使用可被細胞自溶酶切斷的連接子，以使得該藥物於腫瘤細胞中被細胞自溶酶釋放。供選擇地，可使用非可切斷的連接子，例如硫醚連接。亦可包括另外的接附基團及/或間隔物。
該抗體-藥物共軛中的抗體可為抗體片段，諸如Fab’2或其他如於本文中描述的抗原結合片段，因為這樣的片段之小尺寸可助於穿透至組織位置(例如固態腫瘤)。
可以免疫細胞介素的形式提供根據本發明的抗ICOS抗體。抗ICOS抗體亦可於組合療法中與免疫細胞介素一起投予。一些抗體之實例於本文中針對用於與抗ICOS的組合療法描述，且可以免疫細胞介素的形式提供此等(例如抗PD-L1抗體)之任一者以於本發明中使用。免疫細胞介素包含與細胞介素(諸如IL-2)共軛的抗體分子。抗ICOS：IL-2共軛物和抗PD-L1：IL-2共軛物因此為本發明之另外的方面。
IL-2細胞介素可於高(αβγ)親和力IL-2受體及/或中親和力(αβ)IL-2受體具有活性。如於免疫細胞介素中使用的IL-2可為人類野生型IL-2或具有一或多個胺基酸缺失、取代或添加的變體IL-2細胞介素，例如於其N端具有1至10胺基酸缺失的IL-2。其他IL-2變體包括突變R38A 或R38Q。
實例抗PD-L1免疫細胞介素包含免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈，其中該重鏈依N端至C端方向包含：a)包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的VH域；和b)重鏈恆定區；且其中該輕鏈依N端至C端方向包含：c)包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的VL域；d)輕鏈恆定區，(CL)；e)視情況存在的，連接子，(L)；和f)IL-2細胞介素；其中該VH域和VL域包含在抗原結合位置中，該抗原結合位置專一性地與人類PD-L1結合；且其中該免疫細胞介素包含VH域，該VH域包含CDRH3，該CDRH3包含模體X1GSGX2YGX3X4FD(SEQ ID NO：609)，其中X1、X2和X3獨立地是任何胺基酸，且X4存在或不存在，且若存在，則可以是任何胺基酸。
該VH和VL域可以是在本文中提及的任何抗PD-L1抗體之VH和VL域，例如1D05 VH和VL域。
該IL-2可以是人類野生型或變體IL-2。
疫苗接種
可以疫苗組成物之形式提供抗ICOS抗體或可將其與疫苗製劑共投予。ICOS涉及T濾泡性輔助細胞形成和生發中心反應[37]。促效性 ICOS抗體因此具有作為分子佐劑以增強疫苗效力的潛在臨床用途。可使用該等抗體以增加數目眾多的疫苗(諸如該等對抗B型肝炎、瘧疾、HIV者)之保護性效力。
在疫苗接種之背景下，該抗ICOS抗體一般會是缺乏Fc效應功能者，且因此不會介導ADCC、CDC或ADCP。該抗體可以缺乏Fc區或具有無功效的恆定區的形式提供。視情況地，抗ICOS抗體可具有結合一或多種Fc受體但不誘導ADCC、CDC或ADCP活性的重鏈恆定區、或相較於野生型人類IgG1展現較低的ADCC、CDC和ADCP活性的重鏈恆定區。這類恆定區可能無法結合負責觸發ADCC、CDC或ADCP活性的特別Fc受體、或可能以較低的親和力結合該受體。供選擇地，當在疫苗接種之背景下細胞的效應功能是可接受的或所欲的時，該抗ICOS抗體可包含為Fc效應功能陽性的重鏈恆定區。可例如在疫苗接種攝生法中將IgG1、IgG4和IgG4.PE形式之任一者用於抗ICOS抗體，且其他適合的同型和抗體恆定區之實例於本文之其他處更詳細提出。
調配和投予
抗體可以是單株或多株，但較佳是以單株抗體的形式提供以用於治療用途。其等可以其他抗體(視情況包括不同結合專一性的抗體)之混合物之部分的形式提供。
根據本發明的抗體和編碼性核酸通常會以經分離的形式提供。因此，該等抗體、VH及/或VL域、和核酸可從其天然環境或其生產環境純化提供。經分離的抗體和經分離的核酸會不含或實質上不含其等天 然與之締合的物質，諸如其他其等於活體內或其等於其中被製備的環境(例如細胞培養)(當這類製備是藉由試管內重組DNA技術時)中與之一起被找到的多肽或核酸。視情況地，經分離的抗體或核酸(1)不含至少一些其他其正常會與之一起被找到的蛋白質，(2)實質上不含其他來自相同來源(例如來自相同物種)的蛋白質，(3)由來自不同物種的細胞表現，(4)已從至少約百分之50的其天然與之締合的多核苷酸、脂質、碳水化合物、或其他物質分離，(5)可操作地與其天然不與之締合的多肽締合(藉由共價或非共價交互作用)、或(6)於天然不存在。
抗體或核酸可用稀釋劑或佐劑調配且進一步(為了實用目的)經分離-例如若用於塗覆微滴定盤以用於免疫分析中時，其等可與載劑混合，且當於療法中使用時，其等可與醫藥上地可接受的載劑或稀釋劑混合。如於本文之其他處描述的，治療製劑中亦可包括其他活性成分。抗體可經糖化，無論是活體內天然地或藉由異源性真核細胞(諸如CHO細胞)之系統，或其等可(例如若藉由在原核生物細胞中的表現產生時)未經糖化。本發明涵蓋具有經修飾的糖化模式的抗體。於一些應用中，移除非所欲的糖化位置的修飾可以是有用的，或例如移除海藻糖部分以增加ADCC功能[38]。於其他應用中，可作半乳糖化之修飾以修改CDC。
典型地，經分離的產物構成給定樣本之至少約5%、至少約10%、至少約25%、或至少約50%。抗體可實質上不含於其天然或生產環境中找到且會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途的蛋白質或多肽或其他污染物。
抗體可已自其生產環境(例如天然地或重組地)之組分鑑 認、分離及/或回收。經分離的抗體可不與來自其生產環境的所有其他組分締合(例如)以使得該抗體已經分離成可被FDA核准的或FDA所核准的標準。其生產環境之污染物組分(諸如導因於經重組轉染細胞者)為典型會干擾該抗體之研究、診斷或治療用途的物質，且可包括酵素、激素、和其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在一些具體實例中，該抗體會被純化：(1)至大於抗體之95%以重量計(如藉由(例如)洛瑞法測定的)，且在一些具體實例中至大於99%以重量計；(2)至足以藉由使用旋轉杯式定序儀獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度，或(3)至均質，其係藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍或銀染色。經分離的抗體包括在重組細胞內原位的抗體，因為該抗體之天然環境之至少一個組分不會出現。然而，一般地，經分離的抗體或其編碼性核酸會藉由至少一個純化步驟製備。
本發明提供包含於本文中描述的抗體的治療組成物。亦提供包含編碼這類抗體的核酸的治療組成物。編碼性核酸於本文之其他處更詳細地描述且包括DNA和RNA，例如mRNA。在於本文中描述的治療方法中，可將編碼該抗體的核酸及/或含有這類核酸的細胞之使用用作為包含該抗體本身的組成物之外的選項(或外加者)。含有編碼該抗體的核酸的細胞(視情況其中該核酸被穩定地整合入其基因體中)因此代表用於患者中的治療用途的醫藥品。可將編碼該抗ICOS抗體的核酸導入至人類B淋巴球(視情況為衍生自意欲的患者和經活體外修改的B淋巴球)中。視情況地，使用記憶B細胞。含有該編碼性核酸的細胞至該患者之投予提供能夠表現該抗ICOS抗體的細胞之貯庫，其相較於投予經分離的核酸或經分離的抗體可於 較長的期間提供治療益處。
組成物可含有被併入至調配物中以提供改善的轉移、遞送、耐受性、和類似者的適合的載劑、賦形劑、和其他藥劑。許多適當的調配物可於所有醫藥化學家皆知的處方集：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa中找到。此等調配物包括(例如)粉末、糊劑、軟膏、凍膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子性或陰離子性)(諸如LIPOFECTINTTM)、DNA共軛物、無水吸收糊劑、水包油和油包水乳液、乳液卡波蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠，和含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。組成物可包含與醫療注射緩衝液組合及/或與佐劑組合的該抗體或核酸。
可調配抗體或其編碼性核酸以用於所欲的患者投予途徑，例如在液體(視情況為水溶液)中以用於注射。已知多種遞送系統且可將其等用於投予本發明之醫藥組成物。導入之方法包括(但不限於)皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上、和口部途徑。調配抗體以用於皮下投予典型需要將其等濃縮至相較於靜脈內製劑為更小的體積。根據本發明的抗體之高效力可使其等能以足夠低而使皮下調配物可行的劑量使用，而此代表相較於功效較差的抗ICOS抗體的一個優點。
組成物可藉由任何方便的途徑投予，例如藉由輸注或推注、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口部黏膜、直腸和小腸、等等)的吸收且可與其他生物活性劑一起投予。投予可以是全身性或局部性。
醫藥組成物亦可在囊泡(特別是脂質體)中遞送(參見Langer (1990)Science 249：1527-1533；Treat等人(1989)於Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez Berestein和Fidler(編輯)，Liss，紐約，pp.353-365；Lopez-Berestein，同上，pp.317-327；大體而言參見同上)。
於某些情況中，可在控制釋放系統中遞送該醫藥組成物。在一個具體實例中，可使用泵(參見Langer，同上；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。於另一個具體實例中，可使用聚合性材料；參見，Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(編輯)，CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)。於又另一個具體實例中，可將控制釋放系統放置在組成物之目標附近，因此僅需要全身性劑量之一小部分(參見，例如Goodson，於Medical Applications of Controlled Release，同上，vol.2,pp.115-138,1984)。
可注射製劑可包括用於靜脈內、皮下、皮內和肌肉內注射、點滴輸注、等等的劑型。此等可注射製劑可藉由公眾已知的方法製備。例如，該等可注射製劑可例如藉由以下者製備：將以上描述的抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化在常規用於注射的無菌水性介質或油性介質中。關於用於注射的水性介質，存在有(例如)生理食鹽水、含有葡萄糖和其他助劑的等張溶液、等等，其可與諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性界面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化菎麻油之聚氧乙烯(50mol)加合物)]、等等的適當的助溶劑組合使用。關於油性介質，利用例如芝麻油、大豆油、等等，其可與諸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇、等等的助溶劑組合使用。從而製備的注射劑可被充入適當的安瓿中。本發明之醫藥組成物可使用標準針和注射器皮下或靜脈內遞送。設想到治 療不會受限於在臨床使用。因此，使用無針裝置的皮下注射亦是有益的。關於皮下遞送，筆式遞送裝置可於遞送本發明之醫藥組成物中輕易地應用。這樣的筆式遞送裝置可以是可再使用式或可拋棄式。可再使用式筆式遞送裝置一般利用含有醫藥組成物的可置換的匣筒。一旦已投予該匣筒內的所有醫藥組成物且該匣筒空了，可輕易地丟棄該空的匣筒並以含有該醫藥組成物的新匣筒置換。可接著再使用該筆式遞送裝置。於可拋棄式筆式遞送裝置中，並無可置換的匣筒。替代地，該可拋棄式筆式遞送裝置預先充有容納在該裝置內的貯庫中的醫藥組成物。一旦該貯庫內沒有醫藥組成物了，整個裝置被丟棄。數目眾多的可再使用式筆式和自動注射器遞送裝置可於本發明之醫藥組成物之皮下遞送中應用。實例包括但當然不限於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.，伍茲托克，UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.，印第安納波利斯，Ind.)、NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麥)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麥)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、OPTIPENTTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM、和OPTICLIKTTM(Sanofi-Aventis，法蘭克福，德國)，僅列舉一些。可於本發明之醫藥組成物之皮下遞送中應用的可拋棄式筆式遞送裝置之實例包括但當然不限於SOLOSTARTM筆(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、和KWIKPENTM(Eli Lilly)。
有益地，將以上描述的供口部或非經腸使用的醫藥組成物製備成呈適用於符合一劑活性成分的單位劑量的劑型。這類呈單位劑量的劑 量形式包括(例如)錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑、等等。於單位劑量中所含的前述抗體之量一般為每劑型約5至約500mg；特別是呈注射劑之形式時，前述抗體可以是含在約5至約100mg中，且對於其他劑型可以是含在約10至約250mg中。
該抗體、核酸、或包含其的組成物可以是含在醫療容器(諸如藥瓶、注射器、IV容器或注射裝置)中。於一個實例中，該抗體、核酸或組成物是在試管內，且可以是在無菌容器中。於一個實例中，提供包含該抗體、包裝和說明的套組以用於如於本文中描述的治療方法中。
本發明之一個方面為包含本發明之抗體或核酸和一或多種醫藥上可接受的賦形劑(其實例於以上列出)的組成物。「醫藥上可接受的」是指經美國聯邦或州政府之管制機關核准或可被其核准或在美國藥典、歐洲藥典或其他一般認可藥典中列出於動物(包括人類)中使用。醫藥上可接受的載劑、賦形劑、或佐劑可與藥劑(例如任何於本文中描述的抗體或抗體鏈)一起投予至患者而不破壞其藥理活性且當以足以遞送治療量的該藥劑的劑量投予時是無毒性的。
在一些具體實例中，抗ICOS抗體會是根據本發明的組成物中的唯一活性成分。因此，組成物可由該抗體組成或其可由該抗體加上一或多種醫藥上可接受的賦形劑組成。然而，根據本發明的組成物視情況包括一或多種另外的活性成分。該抗ICOS抗體可與其組合的藥劑之詳細描述於本文之其他處提供。視情況地，組成物在組合製劑中含有多種抗體(或編碼性核酸)，例如包含該抗ICOS抗體和一或多種其他抗體的單一調配物。可能欲與根據本發明的抗體或核酸一起投予的其他治療劑包括止痛劑。可 將任何這類藥劑或藥劑之組合與根據本發明的抗體或核酸組合投予、或在具有根據本發明的抗體或核酸的組成物中提供之，無論是呈組合的或分開的製劑。根據本發明的抗體或核酸可分開地和相繼投予、或同時地且視情況呈與另一或多種治療劑(諸如該等所提及者)的組合製劑之形式投予。
用於特定治療適應症的抗ICOS抗體可與被接受的標準照護組合。因此，對於抗癌症治療，該抗體療法可於亦包括例如化學療法、外科手術及/或放射療法的治療攝生法中利用。放射療法可以是單劑或呈分開的數劑，其被直接地遞送至受影響的組織或遞送至全身。
可分開地或同時地投予多個組成物。分開投予是指於不同的時間(例如分開至少10、20、30、或10-60分鐘、或分開1、2、3、4、5、6，7，8、9，10、12小時)投予的兩個組成物。亦可於分開24小時或甚至分開更久地投予組成物。供選擇地，可同時(例如於分開小於10分鐘或小於5分鐘)投予二或多個組成物。同時投予的組成物可(於一些方面)呈混合物的形式投予，而對於組分之各者具有或不具類似的或不同的時間釋放機制。
可將抗體和其編碼性核酸用作為治療劑。本文中的患者一般是哺乳動物，典型為人類。可將抗體或核酸投予至哺乳動物，例如藉由任何在本文中提及的投予之途徑。
投予通常是以「治療有效量」進行，而治療有效量為產生所欲功效的量，其係為了該功效而被投予(足以顯現對患者的益處)。確切的量會取決於治療之目的，且會可由所屬技術領域中具有通常知識者使用已知的技術確定(參見(例如)Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。治療之處方(例如對劑量等等的決定)落入一般開業醫生和其他醫生之責任內且可取決於症狀之嚴重性及/或所治療的疾病之進展。抗體或核酸之治療有效量或適合的劑量可藉由比較其試管內活性和動物模型中的活體內活性來測定。用於將在小鼠和其他測試動物中的有效劑量外推至人類的方法是已知的。
如由在本文之實施例中描述的活體內研究指出的，抗ICOS抗體可在一個範圍的劑量有效。於實施例24中報導藥效學研究。
抗ICOS抗體可以每劑以下範圍之一的量投予：約10μg/kg體重至約100mg/kg體重、約50μg/kg體重至約5mg/kg體重、約100μg/kg體重至約10mg/kg體重、約100μg/kg體重至約20mg/kg體重，約0.5mg/kg體重至約20mg/kg體重、或約5mg/kg體重或更低的，例如小於4、小於3、小於2、或小於1mg/kg的該抗體。
最理想的治療劑量在人類中可以是介於0.1與0.5mg/kg，例如約0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg或0.5mg/kg。對於成年人類中的固定給藥，適合劑量可介於8與50mg、或介於8與25mg，例如15mg或20mg。
於本文中描述的治療之方法中，可投予一或多劑。於一些例子中，對於達成長期益處，單劑可以是有效的。因此，該方法可包含投予單劑的該抗體、其編碼性核酸、或其組成物。供選擇地，可投予多劑，通 常是相繼地和分開數日、數週或數月的期間。可將抗ICOS抗體以4至6週(例如每4週、每5週、或每6週)的間隔重複投予至患者。視情況地，可以一月一次或更低的頻率(例如每二個月或每三個月)將該抗ICOS抗體投予至患者。因此，治療患者的方法可包含將單劑的該抗ICOS抗體投予至該患者，且不重複該投予至少一個月、至少二個月、至少三個月，且視情況不重複該投予至少12個月。
如在實施例11c中所討論的，可使用一或多劑的抗ICOS抗體獲得可比較的治療功效，其可以是有效重置腫瘤微環境的單劑的抗體之結果。考慮到疾病之狀態和任何該抗ICOS抗體欲與之組合的其他治療劑或治療手段(例如外科手術、放射療法等等)，醫師可針對疾病和經歷療法的患者定制該抗ICOS抗體之投予攝生法。在一些具體實例中，有效劑量的抗ICOS抗體是以超過一月一次的頻率(諸如(例如)每三週一次、每兩週一次、或每週一次)投予。使用抗ICOS抗體的治療可包括於至少一個月、至少六個月、或至少一年之期間投予的多劑。
用於本文中，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」、「治療(treating)」、或「改善」是指治療性治療，其中欲逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或停止個體之與疾病或失調相關的病況之進展或嚴重性。術語「治療」包括減低或減輕至少一個病況、疾病或失調之不良效應或症狀。若一或多個症狀或臨床標記被減低，則治療一般是「有效的」。供選擇地，若疾病之進展被減低或停止，則治療是「有效的」。即，「治療」不只包括症狀或標記之改善，但亦包括症狀之進展或惡化之停止或至少減緩(相較於缺乏治療時會預期者)。有益的或所欲的臨床結果包括(但不限於)一或多個 症狀之減輕、疾病之程度之減低、疾病之穩定(即不惡化)狀態、疾病進展之延遲或延緩、疾病狀態之改善或緩和、減輕(無論是部分或完全)、及/或減低的死亡率，無論是可偵測的或不可偵測的。術語疾病之「治療」亦包括提供自疾病之症狀或副作用緩解(包括舒緩性治療)。對於治療之有效，不設想完全的治癒。該方法可於某些方面亦包括治癒。在本發明之前後文中，治療可以是預防性治療。
T細胞療法
WO2011/097477描述使用抗ICOS抗體以產生和擴增T細胞，其藉由使T細胞之族群與提供初步活化訊號的第一藥劑(例如抗CD3抗體)和活化ICOS的第二藥劑(例如抗ICOS抗體)接觸，視情況在諸如IL-1β、IL-6、中和性抗IFNγ及/或抗IL-4的Th17極化劑之存在下。可將於本文中描述的抗ICOS抗體用於這種方法中以提供T細胞族群。可產生具有治療活性(例如抗腫瘤活性)的經培養之經擴增T細胞族群。如在WO2011/097477中描述的，這類T細胞可治療上地用於透過免疫療法治療患者的方法中。
對於作為治療候選物的抗ICOS抗體之形態分析
觀察到當候選治療抗ICOS抗體與固體表面偶合並使其與ICOS表現性T細胞接觸時，其等能夠在該等細胞誘導形態改變。當將ICOS+ T細胞添加至內部以抗ICOS抗體塗覆的孔時，看到細胞會從其等最初的球形形狀改變，採取紡錘狀、展開並附著至經抗體塗覆的表面。在使用對照 組抗體時未觀察到此形態改變。此外，發現該效果是劑量依賴性的，隨著該表面上的抗體之濃度增加而形狀改變發生更快及/或更明顯。該形狀改變提供T細胞與ICOS之結合及/或透過抗ICOS抗體的促效作用之替代性指標。可使用該分析以鑑認促進ICOS在T細胞表面之多聚化的抗體。這類抗體代表治療候選促效抗體。方便地，由此分析提供的可視指標是一種篩選抗體或細胞的簡單方法(特別是以大數目)。可使該分析自動化以於高輸出系統中運行。
因此，本發明之一個方面為一種用於選擇結合ICOS的抗體(視情況係用於選擇ICOS促效抗體)的分析，該分析包含：提供被固定(接附或黏附)至測試孔中的基底的抗體之陣列；將ICOS表現性細胞(例如經活化的初級T細胞、或MJ細胞)加至該測試孔；觀察該等細胞之形態；偵測該等細胞從球形到平鋪在該孔內的基底上的形狀之改變；其中該形狀之改變指出該抗體是結合ICOS的抗體，其視情況是ICOS促效抗體，和自該測試孔選擇該抗體。
該分析可以多個測試孔運行，該等孔各含有不同的抗體以用於測試，視情況為平行測試，例如於96孔盤形式。其基底較佳為該孔之內表面。因此，提供二維表面，而可觀察該等細胞對該表面的平鋪。例如，可以抗體塗覆孔之底部及/或孔之壁。抗體與基底之繫留可透過該抗體之恆定區。
可包括陰性對照組，諸如已知不會結合ICOS的抗體，較佳 是不會結合欲使用的ICOS表現性細胞之表面上的抗原的抗體。該分析可包含定量形態改變之程度並(當測試多種抗體時)選擇相較於一或多種其他測試抗體誘導較大的形態改變的抗體。
抗體之選擇可包含表現在目標測試孔中存在的編碼該抗體的核酸、或表現包含該抗體之CDR或抗原結合域的抗體。可視情況地變更該抗體之形式，例如以提供包含所選抗體之抗原結合域的抗體，例如抗體片段、或包含不同的恆定區的抗體。所選抗體較佳是由人類IgG1恆定區或如於本文中描述的其他恆定區提供。可進一步在包含一或多種另外的成分的組成物中調配所選抗體-適合的醫藥系統於本文之其他處討論。
條項
本發明之具體實例於說明書之一部份的以下經編號條項中提出。
條項第1項.一種經分離的抗體，其結合人類及/或小鼠ICOS之胞外域，其中該抗體包含VH域和VL域，該VH域包含與STIM003 VH域SEQ ID NO：408具有至少95%序列一致性的胺基酸序列且該VL域包含與STIM003 VL域SEQ ID NO：415具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
條項第2項.根據條項第1項的抗體，其中該VH域包含重鏈互補決定區(HCDR)之組HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1是具有胺基酸序列SEQ ID NO：405的STIM003 HCDR1，HCDR2是具有胺基酸序列SEQ ID NO：406的STIM003 HCDR2， HCDR3是具有胺基酸序列SEQ ID NO：407的STIM003 HCDR3。
條項第3項.根據條項第1項或條項第2項的抗體，其中該VL域包含輕鏈互補決定區(LCDR)之組LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1是具有胺基酸序列SEQ ID NO：412的STIM003 LCDR1，LCDR2是具有胺基酸序列SEQ ID NO：413的STIM003 LCDR2，LCDR3是具有胺基酸序列SEQ ID NO：414的STIM003 LCDR3。
條項第4項.根據條項第1項的抗體，其中該VH域胺基酸序列是SEQ ID NO：408及/或其中該VL域胺基酸序列是SEQ ID NO：415。
條項第5項.一種經分離的抗體，其結合人類及/或小鼠ICOS之胞外域，其包含抗體VH域，其包含互補決定區(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3、和抗體VL域，其包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之HCDR1、或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該HCDR1，HCDR2是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之HCDR2、或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該HCDR2，及/或HCDR3是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之HCDR3或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該HCDR3。
條項第6項.根據條項第5項的抗體，其中該等抗體重鏈CDR 是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009的重鏈CDR或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009重鏈CDR。
條項第7項.根據條項第6項的抗體，其中該抗體VH域具有STIM003之重鏈CDR。
條項第8項.一種經分離的抗體，其結合人類及/或小鼠ICOS之胞外域，其包含抗體VH域，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3、和抗體VL域，其包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之LCDR1、或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該LCDR1，LCDR2是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之LCDR2、或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該LCDR2，及/或LCDR3是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之LCDR3或包含具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的該LCDR3。
條項第9項.根據條項第5至8項中任一項的抗體，其中該等抗體輕鏈CDR是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之輕鏈CDR、或包含 具有1、2、3、4或5個胺基酸改變的STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009輕鏈CDR。
條項第10項.根據條項第9項的抗體，其中該抗體VL域具有STIM003之輕鏈CDR。
條項第11項.根據條項第5至10項中任一項的抗體，其包含人類生殖系基因節段序列之VH及/或VL域架構區。
條項第12項.根據條項第5至11項中任一項的抗體，其包含VH域，該VH域(i)衍生自人類重鏈V基因節段、人類重鏈D基因節段和人類重鏈J基因節段之重組，其中該V節段是IGHV1-18(例如V1-18*01)、IGVH3-20(例如V3-20*d01)、IGVH3-11(例如V3-11*01)或IGVH2-5(例如V2-5*10)；該D基因節段是IGHD6-19(例如IGHD6-19*01)、IGHD3-10(例如IGHD3-10*01)或IGHD3-9(例如IGHD3-9*01)；及/或該J基因節段是IGHJ6(例如IGHJ6*02)、IGHJ4(例如IGHJ4*02)或IGHJ3(例如IGHJ3*02)，或(ii)包含架構區FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1與人類生殖系V基因節段IGHV1-18(例如V1-18*01)、IGVH3-20(例如V3-20*d01)、IGVH3-11(例如V3-11*01)或IGVH2-5(例如V2-5*10)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，FR2與人類生殖系V基因節段IGHV1-18(例如V1-18*01)、IGVH3-20(例 如V3-20*d01)、IGVH3-11(例如V3-11*01)或IGVH2-5(例如V2-5*10)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，FR3與人類生殖系V基因節段IGHV1-18(例如V1-18*01)、IGVH3-20(例如V3-20*d01)、IGVH3-11(例如V3-11*01)或IGVH2-5(例如V2-5*10)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，及/或FR4與人類生殖系J基因節段IGJH6(例如JH6*02)、IGJH4(例如JH4*02)或IGJH3(例如JH3*02)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變。
條項第13項.根據條項第5至12項中任一項的抗體，其包含抗體VL域，該抗體VL域(i)衍生自人類輕鏈V基因節段和人類輕鏈J基因節段之重組，其中該V節段是IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)、IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)、IGKV1D-39(例如IGKV1D-39*01)或IGKV3-11(例如IGKV3-11*01)，及/或該J基因節段是IGKJ4(例如IGKJ4*01)、IGKJ2(例如IGKJ2*04)、IGLJ3(例如IGKJ3*01)或IGKJ1(例如IGKJ1*01)；或(ii)包含架構區FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1與人類生殖系V基因節段IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)、IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)、IGKV1D-39(例如IGKV1D-39*01)或IGKV3-11(例如IGKV3-11*01)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，FR2與人類生殖系V基因節段IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)、IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)、IGKV1D-39(例如IGKV1D-39*01)或IGKV3-11(例如IGKV3-11*01)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變， FR3與人類生殖系V基因節段IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)、IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)、IGKV1D-39(例如IGKV1D-39*01)或IGKV3-11(例如IGKV3-11*01)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變，及/或FR4與人類生殖系J基因節段IGKJ4(例如IGKJ4*01)、IGKJ2(例如IGKJ2*04)、IGKJ3(例如IGKJ3*01)或IGKJ1(例如IGKJ1*01)比對，視情況具有1、2、3、4或5個胺基酸改變。
條項第14項.根據條項第5至13項中任一項的抗體，其包含抗體VH域，該VH域是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之VH域、或具有與STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之抗體VH域序列至少90%相同的胺基酸序列。
條項第15項.根據條項第5至14項中任一項的抗體，其包含抗體VL域，該VL域是STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之VL域、或具有與STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之抗體VL域序列至少90%相同的胺基酸序列。
條項第16項.根據條項第15項的抗體，其包含抗體VH域，其係選自STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之VH域、或具有與 STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008或STIM009之抗體VH域序列至少90%相同的胺基酸序列、和抗體VL域，其為該所選抗體之VL域、或具有與該所選抗體之抗體VL域序列至少90%相同的胺基酸序列。
條項第17項.根據條項第16項的抗體，其包含STIM003 VH域和STIM003 VL域。
條項第18項.根據前述條項中任一項的抗體，其包含抗體恆定區。
條項第19項.根據條項第18項的抗體，其中該恆定區包含人類重鏈及/或輕鏈恆定區。
條項第20項.根據條項第18項或條項第19項的抗體，其中該恆定區為Fc效應陽性。
條項第21項.根據條項第20項的抗體，其包含Fc區，該Fc區相較於天然人類Fc區具有增強的ADCC、ADCP及/或CDC功能。
條項第22項.根據條項第18至21項中任一項的抗體，其中該抗體是IgG1。
條項第23項.根據條項第21項或條項第22項的抗體，其中該抗體是無海藻糖化的。
條項第24項.根據前述條項中任一項的抗體，其係與細胞毒性藥物或前藥共軛。
條項第25項.根據前述條項中任一項的抗體，其為多重專一 性抗體。
條項第26項.一種經分離的抗體，其以小於50nM的親和力(KD)結合人類和小鼠ICOS之胞外域，如藉由表面電漿子共振測定的。
條項第27項.根據條項第26項的抗體，其中該抗體以小於5nM的親和力(KD)結合人類和小鼠ICOS之胞外域，如藉由表面電漿子共振測定的。
條項第28項.根據條項第26項或條項第27項的抗體，其中其結合人類ICOS之胞外域之KD是在其結合小鼠ICOS之胞外域之KD之10倍以內。
條項第29項.一種組成物，其包含根據前述條項中任一項的經分離的抗體和醫藥上可接受的賦形劑。
條項第30項.一種組成物，其包含編碼根據條項第1至28項中任一項的抗體的經分離的核酸和醫藥上可接受的賦形劑。
條項第31項.一種在患者中調節調節性T細胞(Treg)與效應T細胞(Teff)之平衡以增加Teff反應的方法，其包含將根據條項第1至28項中任一項的抗體或根據條項第29項的組成物投予至該患者。
條項第32項.一種在患者中治療對藉由耗盡調節性T細胞(Treg)及/或增加效應T細胞(Teff)反應的療法有反應的疾病或病況的方法，該方法包含將根據條項第1至28項中任一項的抗體或根據條項第29項的組成物投予至該患者。
條項第33項.根據條項第1至28項中任一項的抗體或根據條項第29項的組成物，其係用於藉由療法治療人體的方法。
條項第34項.根據條項第33項的供使用的抗體或組成物，其係用於在患者中調節調節性T細胞(Treg)與效應T細胞(Teff)之平衡以增加效應T細胞反應。
條項第35項.根據條項第33項的供使用的抗體或組成物，其係用於在患者中治療對藉由耗盡調節性T細胞(Treg)及/或增加效應T細胞(Teff)反應的療法有反應的疾病或病況。
條項第36項.根據條項第32項的方法或根據條項第35項的供使用的抗體或組成物，其中該疾病是癌症或固態腫瘤。
條項第37項.根據條項第1至28項中任一項的抗體或根據條項第29項的組成物，其係用於在人類患者中治療癌症的方法。
條項第38項.一種在人類患者中治療癌症的方法，其包含將根據條項第1至28項中任一項的抗體或根據條項第29項的組成物投予至該患者。
條項第39項.根據條項第36至38項中任一項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該癌症是腎細胞癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌或瀰漫性大型B細胞淋巴瘤。
條項第40項.根據條項第31至39項中任一項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該方法包含將該抗體和另一種治療劑及/或放射療法投予至該患者。
條項第41項.根據條項第40項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該治療劑是抗PD-L1抗體。
條項第42項.根據條項第41項的方法或供使用的抗體或組 成物，其中該抗PD-L1抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：299的VH域和具有胺基酸序列SEQ ID NO：300的VL域。
條項第43項.根據條項第41項或條項第42項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該治療劑是抗PD-L1 IL-2免疫細胞介素。
條項第44項.根據條項第43項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該抗PD-L1抗體為包含人類野生型或變體IL-2的免疫細胞介素。
條項第45項.根據條項第44項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該抗ICOS抗體和該抗PDL1抗體各自能夠介導ADCC、ADCP及/或CDC。
條項第46項.根據條項第41至45項中任一項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該抗ICOS抗體是人類IgG1抗體且該抗PDL1抗體是人類IgG1抗體。
條項第47項.根據條項第40項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該治療劑是抗PD-1抗體。
條項第48項.根據條項第40項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該其他的治療劑是IL-2。
條項第49項.根據條項第40至48項中任一項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該方法包含於投予該其他的治療劑及/或放射療法後投予該抗ICOS抗體。
條項第50項.根據條項第31至49項中任一項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該抗ICOS抗體與前藥共軛，且其中 該方法或使用包含將該抗ICOS抗體投予至患者和於目標組織位置選擇性地活化該前藥。
條項第51項.根據條項第50項的方法或供使用的抗體或組成物，其中該患者具有固態腫瘤且該方法包含於該腫瘤選擇性地活化該前藥。
條項第52項.根據條項第50項或條項第51項的方法或供使用的抗體或組成物，其包含透過光活化選擇性地活化該前藥。
條項第53項.一種抗ICOS人類IgG1抗體和抗PDL1人類IgG1抗體之組合，其係用於在患者中治療癌症的方法。
條項第54項.一種在患者中治療癌症的方法，其包含將抗ICOS人類IgG1抗體和抗PD-L1人類IgG1抗體投予至該患者。
條項第55項.一種抗ICOS抗體，其係用於在患者中治療癌症的方法，該方法包含將該抗ICOS抗體和該抗PD-L1抗體投予至該患者，其中單劑的該抗ICOS抗體被投予。
條項第56項.根據條項第55項的供使用的抗ICOS抗體，其中該抗ICOS抗體是人類IgG1抗體且該抗PD-L1抗體是人類IgG1抗體。
條項第57項.根據條項第53項的組合、根據條項第54項的方法或根據條項第55項或條項第56項的供使用的抗ICOS抗體，其中該癌症是腎細胞癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌或瀰漫性大型B細胞淋巴瘤。
條項第58項.根據條項第41至46或53至54項中任一項的 方法或供使用的抗體、組成物或組合，該方法包含將該抗ICOS抗體和該抗PD-L1抗體投予至該患者，其中單劑的該抗ICOS抗體被投予。
條項第59項.根據條項第58項的方法或供使用的抗體、組成物或組合，其中該方法包含投予單劑的該抗ICOS抗體接著投予多劑的該抗PD-L1抗體。
條項第60項.根據條項第41至46或53至54項中任一項的方法或供使用的抗體、組成物或組合，其中該抗ICOS抗體和該抗PDL1抗體係於分開的組成物中提供以用於投予。
條項第61項.根據條項第41至46或53至60項中任一項的方法或供使用的抗體、組成物或組合，其中該抗ICOS抗體及/或該抗PD-L1抗體包含人類IgG1恆定區，該人類IgG1恆定區包含胺基酸序列SEQ ID NO：340。
條項第62項.一種抗ICOS抗體，其係用於治療患者的方法，該方法包含包含將該抗ICOS抗體投予至患者，該患者在以另一種治療劑治療後具有增高水平的ICOS陽性調節性T細胞。
條項第63項.一種治療患者的方法，該方法包含將抗ICOS抗體投予至患者，該患者在以另一種治療劑治療後具有增高水平的ICOS陽性調節性T細胞。
條項第64項.根據條項第62項的供使用的抗ICOS抗體或根據條項第63項的方法，其中該方法包含將治療劑投予至該患者、確定該患者於使用該藥劑治療後具有增高水平的ICOS陽性調節性T細胞、和將抗ICOS抗體投予至該患者以減低調節性T細胞之水平。
條項第65項.根據條項第62至64項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該治療劑是IL-2或免疫調節性抗體(例如抗PDL-1、抗PD-1或抗CTLA-4)。
條項第66項.根據條項第62至65項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該方法包含治療腫瘤，例如黑色素瘤，諸如轉移性黑色素瘤。
條項第67項.一種抗ICOS抗體，其係用於在患者中藉由該患者之對抗其癌症細胞的活體內疫苗接種來治療癌症的方法，該方法包含以造成該等癌症細胞之免疫性細胞死亡的療法治療該患者，造成抗原被呈現給抗原專一性效應T細胞、和將抗ICOS抗體投予至該患者，其中該抗ICOS抗體增強抗原專一性效應T細胞反應。
條項第68項.一種在患者中藉由該患者之對抗其癌症細胞的活體內疫苗接種來治療癌症的方法，該方法包含以造成該等癌症細胞之免疫性細胞死亡的療法治療該患者，造成抗原被呈現給抗原專一性效應T細胞、和將抗ICOS抗體投予至該患者，其中該抗ICOS抗體增強抗原專一性效應T細胞反應。
條項第69項.一種在患者中藉由該患者之對抗其癌症細胞的活體內疫苗接種來治療癌症的方法，該方法包含將抗ICOS抗體投予至該患者，其中該患者為以下者：先前已以造成該等癌症細胞之免疫性細胞死亡的療法治 療，造成抗原被呈現給抗原專一性效應T細胞，且其中該抗ICOS抗體增強抗原專一性效應T細胞反應。
條項第70項.根據條項第67至69項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該造成免疫性細胞死亡的療法是癌症細胞之放射療法、化學治療劑之投予及/或針對腫瘤相關抗原的抗體之投予。
條項第71項.根據條項第70項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該化學治療劑是奧沙利鉑。
條項第72項.根據條項第70項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該腫瘤相關抗原是HER2或CD20。
條項第73項.一種抗ICOS抗體，其係用於在患者中治療癌症的方法，其中該癌症為或已被定性為對於ICOS配體及/或FOXP3之表現為陽性。
條項第74項.一種在患者中治療癌症的方法，其中該癌症為或已被定性為對於ICOS配體及/或FOXP3之表現為陽性，該方法包含將抗ICOS抗體投予至該患者。
條項第75項.根據條項第73項的供使用的抗ICOS抗體或根據條項第74項的方法，其中該方法包含：測試來自患者的樣本以確定該癌症表現ICOS配體及/或FOXP3；選擇該患者來以該抗ICOS抗體治療；和將該抗ICOS抗體投予至該患者。
條項第76項.根據條項第73項的供使用的抗ICOS抗體或根據條項第74項的方法，其中該方法包含將抗ICOS抗體投予至患者，而來 自該患者的測試樣本已指出該癌症對於ICOS配體及/或FOXP3之表現為陽性。
條項第77項.根據條項第75項或條項第76項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該樣本是固態腫瘤之生檢樣本。
條項第78項.一種抗ICOS抗體，其係用於在患者中治療癌症的方法，其中該癌症為或已被定性為對使用免疫腫瘤學藥物的治療(例如抗CTLA-4抗體、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD137抗體或抗GITR抗體)為不應性的。
條項第79項.一種在患者中治療癌症的方法，其中該癌症為或已被定性為對使用免疫腫瘤學藥物的治療(例如抗CTLA-4抗體、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD137抗體或抗GITR抗體)為不應性的，該方法包含將抗ICOS抗體投予至該患者。
條項第80項.根據條項第78項的供使用的抗ICOS抗體或根據條項第79項的方法，其中該方法包含：以該免疫腫瘤學藥物治療該患者；確定該癌症對該藥物是非反應性；選擇該患者來以該抗ICOS抗體治療；和將該抗ICOS抗體投予至該患者。
條項第81項.根據條項第78項的供使用的抗ICOS抗體或根據條項第79項的方法，其中該方法包含將抗ICOS抗體投予至患者，該患者之癌症對先前使用該免疫腫瘤學藥物的治療無反應。
條項第82項.根據條項第73至81項中任一項的供使用的抗 ICOS抗體或方法，其中該癌症是衍生自已獲得表現ICOS配體之能力的細胞的腫瘤。
條項第83項.根據條項第82項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該癌症是黑色素瘤。
條項第84項.根據條項第73至81項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該癌症衍生自抗原呈現細胞，諸如B淋巴球(例如B細胞淋巴瘤，諸如瀰漫性大型B細胞淋巴瘤)或T淋巴球。
條項第85項.根據條項第73至81項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該癌症對使用抗CD20抗體的治療有抗性。
條項第86項.根據條項第85項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該癌症是B細胞淋巴瘤。
條項第87項.根據條項第86項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該抗CD20抗體是利妥昔單抗。
條項第88項.根據條項第85至87項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該方法包含以該抗CD20抗體治療該患者；確定該癌症對該抗CD20抗體無反應；測試來自患者的樣本以確定該癌症表現ICOS配體；選擇該患者來以該抗ICOS抗體治療；和將該抗ICOS抗體投予至該患者。
條項第89項.根據條項第85至87項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該方法包含將抗ICOS抗體投予至患者，該患者之癌症對先前使用抗CD20抗體的治療無反應。
條項第90項.根據條項第67至89項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該癌症是固態腫瘤。
條項第91項.根據條項第67至89項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該癌症是血液學液體腫瘤(haemotological liquid tumour)。
條項第92項.根據條項第90或91項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該腫瘤有高的調節性T細胞。
條項第93項.根據條項第53至92項中任一項的供使用的抗ICOS抗體或方法，其中該抗ICOS抗體如於條項第1至28項中任一項中定義的或於根據條項第29項的組成物中提供的。
條項第94項.一種基因轉殖非人類哺乳動物，其具有包含編碼人類可變區基因節段的人類或人類化免疫球蛋白基因座的基因體，其中該哺乳動物不表現ICOS。
條項第95項.一種產生結合人類和非人類ICOS之胞外域的抗體的方法，其包含(a)以人類ICOS抗原使根據條項第94項的哺乳動物免疫；(b)分離由該哺乳動物產生的抗體；(c)針對結合人類ICOS和非人類ICOS之能力測試該等抗體；和(d)選擇一或多種結合人類和非人類ICOS兩者的抗體。
條項第96項.根據條項第95項的方法，其包含以表現人類ICOS的細胞使該哺乳動物免疫。
條項第97項.根據條項第95項或條項第96項的方法，其包 含(c)使用表面電漿子共振針對結合人類ICOS和非人類ICOS之能力測試該等抗體並測定結合親和力；和(d)選擇一或多種與人類ICOS結合之KD小於50nM且與非人類ICOS結合之KD小於500nM的抗體。
條項第98項.根據條項第97項的方法，其包含(d)選擇一或多種與人類ICOS結合之KD小於10nM且與非人類ICOS結合之KD小於100nM的抗體。
條項第99項.根據條項第95至98項中任一項的方法，其包含(c)使用表面電漿子共振針對結合人類ICOS和非人類ICOS之能力測試該等抗體並測定結合親和力；和(d)選擇一或多種與人類ICOS結合之KD在與非人類ICOS結合之KD之10倍以內的抗體。
條項第100項.根據條項第99項的方法，其包含(d)選擇一或多種與人類ICOS結合之KD在與非人類ICOS結合之KD之5倍以內的抗體。
條項第101項.根據條項第95至100項中任一項的方法，其包含針對結合來自與該哺乳動物相同的物種的非人類ICOS之能力測試該等抗體。
條項第102項.根據條項第95至101項中任一項的方法，其包含針對結合來自與該哺乳動物不同的物種的非人類ICOS之能力測試該等 抗體。
條項第103項.根據條項第95至102項中任一項的方法，其中該哺乳動物是小鼠或大鼠。
條項第104項.根據條項第95至103項中任一項的方法，其中該非人類ICOS是小鼠ICOS或大鼠ICOS。
條項第105項.根據條項第95至104項中任一項的方法，其中該人類或人類化免疫球蛋白基因座包含位於內源性恆定區之上游的人類可變區基因節段。
條項第106項.根據條項第105項的方法，其包含(a)以人類ICOS抗原使根據條項第94項的哺乳動物免疫，其中該哺乳動物是小鼠；(b)分離由該小鼠產生的抗體；(c)針對結合人類ICOS和小鼠ICOS之能力測試該等抗體；和(d)選擇一或多種結合人類和小鼠ICOS兩者的抗體。
條項第107項.根據條項第95至106項中任一項的方法，其包含分離編碼抗體重鏈可變域及/或抗體輕鏈可變域的核酸。
條項第108項.根據條項第95至107項中任一項的方法，其中該哺乳動物透過人類可變區基因節段和內源性恆定區之重組產生抗體。
條項第109項.根據條項第107項或條項第108項的方法，其包含將該編碼重鏈及/或輕鏈可變域的核酸分別共軛至編碼人類重鏈恆定區及/或人類輕鏈恆定區的核苷酸序列。
條項第110項.根據條項第107至109項中任一項的方法，其 包含將該核酸導入至宿主細胞中。
條項第111項.根據條項第110項的方法，其包含在用於表現該抗體、或該抗體重鏈及/或輕鏈可變域的條件下培養該宿主細胞。
條項第112項.一種抗體或抗體重鏈及/或輕鏈可變域，其係藉由根據條項第95至111項中任一項的方法產生。
條項第113項.一種選擇結合ICOS的抗體的方法，其視情況係用於選擇ICOS促效抗體，該分析包含：提供被固定(接附或黏附)至測試孔中的基底的抗體之陣列；將ICOS表現性細胞(例如經活化的初級T細胞、或MJ細胞)加至該測試孔；觀察該等細胞之形態；偵測該等細胞從球形到平鋪在該孔內的基底上的形狀之改變；其中該形狀之改變指出該抗體是結合ICOS的抗體，其視情況是ICOS促效抗體；自該測試孔選擇該抗體；表現編碼所選抗體之CDR的核酸；和將該抗體調配成組成物，其包含一或多種其他的組分。
本發明之多種其他方面和具體實例對於所屬技術領域中具有通常知識者而言鑑於本文之揭露內容會是明顯的。所有在此說明書中提及的文獻(包括所提及的任何專利案或專利申請案之已公開的US對應案)皆以其完整內容以引用方式併入本文中。
實驗實施例
以下實施例描述抗ICOS抗體之產生、定性和性能。抗體係使用KymouseTM(一種能夠產生具有人類可變域的抗體的基因轉殖小鼠平台)產生。來自KymouseTM的抗體具有人類可變域(其係自人類V(D)和J節段產生)和小鼠恆定域。內源性小鼠可變基因已被靜默且構成其全套(repertoire)之非常小的部分(小於所有重鏈可變區之0.5%是來自小鼠)。KymouseTM系統於以下者中描述：Lee等人2014[39]、WO2011/004192、WO2011/158009和WO2013/061098。此計劃利用KymouseTM HK品系，其中其重鏈基因座和輕鏈κ基因座被人類化。
ICOS剔除KymouseTM使用ICOS蛋白質或蛋白質與表現人類和小鼠ICOS的細胞之交替性再次免疫(boost)之組合免疫。
鑑認出與人類ICOS結合的命中物。用於篩選之初步選擇標準是與人類細胞表現的ICOS之結合(CHO細胞)和與ICOS蛋白質之結合(HTRF)。亦評估與小鼠ICOS蛋白質和小鼠細胞表現的ICOS之結合(CHO細胞)並於選擇初步篩選命中物時將其納入考量。使用此等標準，將命中物推進至第二篩選。於第二篩選中，藉由通過流式細胞測量術測定與在CHO細胞上表現的人類和小鼠ICOS之結合來確認命中物。
從大數量的所篩選抗體，鑑認出一小組與人類/食蟹獼猴和小鼠ICOS結合者(如藉由表面電漿子共振和流式細胞測量術測定的)。此等抗體包括STIM001、STIM002和其變體STIM002-B、STIM003、STIM004和STIM005。亦選擇另外四種抗體STIM006、STIM007、STIM008和STIM009，其等顯示較低的與小鼠ICOS之交叉反應性但展現人類ICOS受體之促效作 用。本文中呈現的數據指出抗ICOS抗體於ICOS陽性CD4+細胞株中且亦於基於初級T細胞的分析中充當ICOS受體之促效劑之能力，於ADCC分析中顯示殺細胞能力且於活體內顯示促進抗腫瘤免疫反應的能力。
實施例1：ICOS剔除小鼠之產生
ICOS剔除KymouseTM株係藉由KymouseTM HK ES細胞中的同源重組來產生。簡言之，將編碼嘌呤黴素選擇物的3.5kb靶向性載體靶向至ES細胞中。成功的靶向導致小區域(72bp)的小鼠ICOS基因座被嘌呤黴素卡匣置換，瓦解該基因之訊號胜肽/起始密碼子。擴增陽性ES殖株並將其微注射入小鼠囊胚中並培育所產生的嵌合體以最終產生對於人類化重鏈和κ免疫球蛋白基因座和經修改的無功能ICOS基因座皆為同型合子的動物。
實施例2：抗原和細胞株製備 表現人類或小鼠ICOS的經穩定轉染的MEF和CHO-S細胞之產生
編碼人類和小鼠ICOS的全長DNA序列係針對哺乳動物表現作密碼子最佳化，以合成串DNA的形式訂購並被選殖至表現載體中，其等在CMV啟動子之控制下且兩側為3’和5’ piggyBac專一性末端重複序列，以促進至細胞基因體中的穩定整合(參見[40])。該表現載體含有嘌呤黴素選擇卡匣以促進穩定細胞株產生。為了分別產生人類ICOS表現性和小鼠ICOS表現性細胞株，人類或小鼠ICOS表現質體與編碼piggyBac轉位酶的質體共轉染至小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)細胞株和CHO-S細胞中，其使用FreeStyle Max轉染試劑(Invitrogen)並根據製造商的說明。從與C57BL6 雜交的129S5雌性小鼠獲得胚胎並自其產生MEF細胞。轉染後二十四小時後，以嘌呤黴素補充培養基並生長至少二週以選擇穩定的細胞株。每3-4日更換細胞培養基。人類或小鼠ICOS蛋白質之表現係藉由流式細胞測量術分別使用抗人類或抗小鼠ICOS-PE共軛抗體(eBioscience)評估。完全MEF培養基係由補充有10% v/v胎牛血清(Gibco)的Dulbecco氏經修改Eagle氏培養基(Gibco)構成。完全CHO-S培養基係由補充有8mM Glutamax(Gibco)的CD-CHO培養基構成。CHO-S細胞係包含在可自加拿大國際研究委員會獲得的pTT5系統中的CHO-3E7細胞株，但可利用其他CHO細胞株。
供小鼠免疫之用的MEF細胞之製備
移除細胞培養基並以1XPBS洗滌細胞一次。以胰蛋白酶處理細胞5分鐘以從組織培養表面解放細胞。收集細胞並藉由添加含有10% v/v胎牛血清(FCS)的完全培養基來中和胰蛋白酶。接著於300g下離心細胞10分鐘並以25ml的1XPBS洗滌之。計數細胞並以適當的濃度將其再懸浮在1XPBS中。
重組蛋白質之選殖和表現
使用標準分子生物學技術將編碼人類ICOS(NCBI ID：NNP_036224.1)、小鼠ICOS(NCBI ID：NP_059508.2)和食蟹獼猴ICOS(GenBank ID：EHH55098.1)之胞外域的合成性DNA選殖入pREP4(Invitrogen)或pTT5(加拿大國際研究委員會)表現質體中。該等構築體亦含有人類Fc、小鼠Fc或FLAG His胜肽模體以協助純化和偵測。此等係藉由重疊延伸來加至該 等DNA構築體。於表現前定序所有的構築體以保証其正確序列組成。
實施例3：免疫
根據表E3中顯示的攝生法使ICOS剔除HK KymouseTM(參見實施例1)、KymouseTM野生型HK品系和KymouseTM野生型HL品系免疫。KymouseTM野生型HK和HL品系表現野生型小鼠ICOS。在HK品系中，其免疫球蛋白重鏈基因座和輕鏈κ基因座經人類化，且在HL品系中，其免疫球蛋白重鏈基因座和輕鏈λ基因座經人類化。
表格之說明：mICOS Fc=具有人類Fc的小鼠ICOS蛋白質
hICOS Fc=具有人類Fc的人類ICOS蛋白質
mICOS MEF=在MEF細胞上表現的小鼠ICOS
hICOS MEF=在MEF細胞上表現的人類ICOS
mICOS Fc+ hICOS Fc=同時投予的具有人類Fc的小鼠ICOS蛋白質+具有人類Fc的人類ICOS蛋白質
mICOS MEF+hICOS MEF=同時投予的在MEF細胞上表現的小鼠ICOS+在MEF細胞上表現的人類ICOS
ICOS KO=ICOS剔除HK Kymouse
HK和HL=野生型KymouseHK和HL基因型
RIMMS是一種經修改的皮下免疫程序(於多重位置的快速免疫)；其按照Kilpatrick等人[41]修改)。免疫攝生法KM103和KM111是透過腹膜內(i.p.)投予的初次免疫-休息-再次免疫。對於所有免疫皆使用Sigma佐劑系統且間隔休息時間通常介於2和3週間。最終再次免疫在缺少佐劑下藉由靜脈內投予。
藉由流式細胞測量術針對專一性抗體之存在分析來自系列或末端血液樣本的血清並使用力價數據(當可能時)以選擇欲用於B細胞分選的小鼠。
實施例4：ICOS KO和野生型小鼠間的血清力價之比較
經免疫ICOS KO和經免疫野生型Kymouse之血清力價是使用流式細胞測量術測定。於ICOS KO小鼠中，使用人類ICOS抗原的免疫誘導伴隨有結合至CHO細胞上表現的人類和小鼠ICOS兩者的Ig的血清免疫球蛋白反應(圖1a)。相反的，於野生型Kymouse(其表現小鼠ICOS)中，使用相同的人類ICOS抗原免疫產生顯示明顯減少的與小鼠ICOS結合之血清(相較於相同的血清與人類ICOS之結合)(圖1b)。
方法
將表現人類ICOS或小鼠ICOS的CHO-S細胞(參見實施例2)或未經轉染的CHO-S細胞(稱為野生型(WT))(懸浮在FACS緩衝液(PBS+1% w/v BSA+0.1% w/v疊氮化鈉)中)以每孔105個細胞的密度分配至96孔V底盤(Greiner)。製備小鼠血清之力價滴定，在FACS緩衝液中稀釋樣本。接著將50μL/孔的此力價滴定加至該細胞盤。為測定導因於免疫的活性水平之改變，在FACS緩衝液中將來自免疫前的各個動物的血清稀釋至1/100並將50μL/孔加至該等細胞。於4℃下培養細胞1小時。以150μLPBS洗滌細胞兩次，於各洗滌步驟後離心並吸出上清液(於300xg下離心3分鐘)。為偵測抗體結合，在FACS緩衝液中將APC山羊-抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)稀釋1/500並將50μL加至該等細胞。於一些實例中，使用AF647山羊-抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)。於黑暗中於4℃下培養細胞1小時，接著以150μL PBS如上洗滌兩次。為固定細胞，添加100μL 2% v/v三聚甲醛並於4℃下培養細胞30分鐘。接著藉由於300xg下離心來 將細胞沈澱並將盤再懸浮在50μl的FACS緩衝液中。藉由流式細胞測量術使用BD FACS陣列儀器測量螢光訊號強度(幾何平均值)。
實施例5：通過FACS的抗原專一性B細胞之分選
從經免疫的小鼠回收表現抗ICOS抗體的B細胞，其使用實質上如在WO2015/040401之實施例1中描述的技術。簡言之，自該等免疫攝生法分離的脾細胞及/或淋巴結細胞係使用含有標記(CD19)的抗體混合物染色以用於目標細胞之選擇，而不想要的細胞從最終經分選的族群(IgM、IgD、7AAD)排除。進一步以加螢光標籤的人類ICOS ECD-Fc二聚體和加螢光標籤的小鼠ICOS ECD-Fc標記CD19+ B細胞以偵測產生抗ICOS抗體的B細胞。人類和小鼠ICOS之螢光標記分別使用AlexaFluor647和AlexaFluor488-參見實施例6。選擇結合人類ICOS或人類和小鼠ICOS兩者的細胞。藉由FACS將此等細胞單細胞分選至溶胞緩衝液中。使用RT-PCR和另外兩回合的PCR來回收V區序列，接著將其等橋接至小鼠IgG1恆定區並在HEK293細胞中表現。針對ICOS結合性和功能性抗體之存在篩選來自HEK293細胞的上清液。以下將此方法稱為BCT。
實施例6：來自BCT的抗體之篩選 針對與重組人類和小鼠ICOS-Fc之結合的BCT上清液之H7RF篩選
針對所分泌抗體與以重組蛋白質的形式表現的人類ICOS Fc和小鼠ICOS Fc結合之能力篩選從實施例5中的BCT收集的上清液。藉由HTRF®(均相時間解析螢光，Cisbio)分析形式使用經FluoProbes®647H (Innova Biosciences)標記的ICOS(對於以FluoProbes®647H標記的人類ICOS和小鼠ICOS，於本文中將其等分別稱為647 hICOS或647 mICOS)鑑認所分泌的抗體與重組人類和小鼠ICOS之結合。將5μL BCT上清液轉移至白色384孔低體積非結合性表面聚苯乙烯盤(Greiner)。將5μl在HTRF分析緩衝液中稀釋的20nM 647 hICOS或647 mICOS加至所有孔。對於人類ICOS結合性分析，在BCT培養基(Gibco #A14351-01)中將參考抗體稀釋至120nM並將5μL加至盤。對於用於人類ICOS結合性分析的陰性對照組孔，5μL在BCT培養基中稀釋至120nM的小鼠IgG1(Sigma M9269，於一些情況下稱為CM7)。在小鼠ICOS結合性分析的例子中，將參考抗體在BCT培養基(Gibco #A14351-01)中稀釋至120nM並將5μL加至盤。將大鼠IgG2b同型對照組(R&D Systems)加至陰性對照組孔(R&D Systems)，其在BCT培養基中稀釋至120nM並將5μL加至盤。藉由添加10μl在HTRF分析緩衝液中稀釋1/2000的直接以銪穴狀化合物(Cisbio)標記的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotech)來偵測所分泌的抗體與人類ICOS之結合。在小鼠ICOS結合性分析的例子中，將5μL的小鼠抗大鼠IgG2B-UBLB(Southern Biotech)加至陽性和陰性對照組孔，並將5μl的HTRF分析緩衝液加至盤之所有其他孔。接著添加5μl在HTRF分析緩衝液中稀釋1/1000的直接以銪穴狀化合物(Cisbio)標記的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotech)以偵測結合。放置盤以在黑暗中培養2小時，之後使用EnVision讀盤機(Perkin Elmer)於620nm和665nm發射波長，100閃爍下讀取時間解析螢光。
藉由對各個樣本分別根據方程式2和方程式1計算665/620比率和百分比功效來分析數據。
對於KM103和KM11-B1，初步命中物係基於對於人類和小鼠ICOS之結合大於或等於百分之5的功效選擇。對於KM135，初步命中物係基於對於與人類和小鼠ICOS之結合大於或等於百分之10的功效選擇。對於KM111-B2，初步命中物被定義成對於與人類之結合大於或等於百分之4的功效和對於與小鼠ICOS之結合大於或等於百分之3的功效。
方程式1：來自初步篩選Envision細胞結合和HTRF的百分比功效之計算
使用孔比率值(方程式3)或665/620nm比率(參見方程式2)(HTRF)
Figure 106126908-A0202-12-0146-1849
非專一性結合=來自含有同型對照組小鼠IgG1的孔的值
總結合=來自含有參考抗體的孔的值
方程式2：665/620比率之計算
665/620比率=(樣本665/620nm值)×10,000
方程式3：647/FITC比率之計算
首先藉由將mAb波段(647)除以FITC(細胞染色)波段以給出「孔比率值」來針對細胞數目標準化數據：
Figure 106126908-A0202-12-0147-1850
針對與細胞表現的人類和小鼠ICOS之結合的BCT上清液之篩選
針對所分泌抗體與在CHO-S細胞之表面上表現的人類ICOS Fc和小鼠ICOS Fc結合之能力篩選從實施例5中的BCT收集的上清液。為了測定CHO-S人類和小鼠ICOS結合，將細胞在以10% FBS(Gibco)補充的F12培養基(Gibco)中以4×104/孔塗盤在黑壁透明底組織培養處理384孔盤(Perkin Elmer)中並培養過夜。自384孔分析盤移出培養基。將至少50μl的BCT上清液或50μL參考抗體(在BCT培養基中，2μg/mL)或在BCT培養基中稀釋的同型IgG1對照組抗體(於一些情況下稱為Cm7，Sigma M9269)，以2μg/mL的最終濃度)加至各個孔。於4℃下培養盤1小時。吸出上清液並添加50μl在二級抗體緩衝液(1xPBS+1% BSA+0.1%疊氮化鈉)中稀釋500分之1的5μg/ml具有振動綠色DNA染料(Life Technologies)的山羊抗小鼠647(Jackson ImmunoResearch)以偵測抗體結合並顯像細胞。於4度下培養盤1hr。吸出上清液並添加25μl的4% v/v三聚甲醛並於室溫下培養盤15分鐘。以100μL PBS洗滌盤兩次並接著完全移除洗滌緩衝液。使用測量FITC(激發494nm，發射520nm)和alexafluor 647(激發650nm，發射668nm)的Envision讀盤機(Perkin Elmer)測量螢光強度。如在方程式3中描述地測定分析訊號並如在方程式1中描述地測定百分比功效。使用2μg/mL的最終分析濃度的參考抗體定義總結合。使用2μg/mL的最終分析濃度的小鼠IgG1同型對照組(Sigma)定義非專一性結合。用於命中物選擇的 標準係基於分析訊號和百分比功效。
對於KM103、KM111-B1和KM135，初步命中物係基於大於或等於百分之10的功效選擇。對於KM111-B2，初步命中物係基於大於或等於百分之4的功效選擇。
初步篩選結果之總結
針對與細胞表現的人類和小鼠ICOS之結合的FACS篩選
針對與表現人類或小鼠ICOS的CHO-S細胞結合的能力測試來自實施例5的BCT上清液和HEK293表現的抗體。
在FACS緩衝液中(PBS 1% BSA 0.1%疊氮化鈉)中稀釋表現人類或小鼠ICOS的CHO-S細胞(參見實施例2)並將其等以每孔1×105個細胞的密度分配至96孔V底盤(Greiner)。以150μL PBS洗滌細胞並於300g下離心3分鐘。對於上清液篩選，吸出上清液並添加150μL PBS。重複此洗滌步驟。將30μL BCT未經稀釋的上清液或50μl在BCT培養基中稀 釋至5μg/ml的參考抗體或對照組抗體加至經洗滌的細胞。於4℃下培養細胞60分鐘。添加150μL FACS緩衝液並如以上描述地洗滌細胞。為了偵測抗體結合，將50μl在FACS緩衝液中稀釋至2μg/ml的山羊抗小鼠APC(Jackson ImmunoResearch)加至細胞。4℃培養細胞60分鐘。以150μL FACS緩衝液洗滌細胞兩次，於各洗滌步驟後於300g下離心3分鐘並吸出上清液。藉由於室溫下添加25μL 4%三聚甲醛20分鐘來固定細胞。如上洗滌細胞一次並將其等再懸浮在FACS緩衝液中以用於分析。藉由流式細胞測量術使用BD FACS陣列儀器測量APC訊號強度(幾何平均值)。不經過進一步計算就以幾何平均值的形式將數據作圖。
一小子群的抗體被選擇為符合在此進一步篩選中相較於初步篩選更嚴苛的物種交叉反應性標準。簡言之：自KM103，選擇4種抗體，其係藉由取混合對照組與hICOS、mICOS和WT CHO細胞之結合之平均幾何平均值(geomean)並鑑認>超過4倍的小鼠和人類結合物。此等4種抗體被命名STIM001、STIM002-B、STIM007和STIM009。
自KM111-B1，選擇4種抗體，其係藉由取陰性對照組(亞美尼亞倉鼠：殖株HTK888)與hICOS、mICOS和WT CHO細胞之結合的幾何平均值之平均並鑑認>超過10倍的小鼠和人類結合物。
自KM111-B2，選擇4種抗體，其係藉由取陰性對照組(亞美尼亞倉鼠：殖株HTK888)與hICOS、mICOS和WT CHO細胞之結合之幾何平均值之平均並鑑認>超過4倍的小鼠和人類結合物。此等4種抗體包括STIM003、STIM004和STIM005。
自KM135，未鑑認出交叉反應性抗體。由於FACS第二篩選方法之技術失敗，亦使用SPR和HTRF進行篩選，但發現無抗體符合所欲的交叉反應性水平。
總而言之，自於實施例3中描述的多種多重免疫攝生法，針對與人類ICOS和小鼠ICOS之結合篩選至少4000BCT上清液(僅來自ICOS KO小鼠)，且鑑認出一小組的候選物(包括STIM001、STIM002-B、STIM003、STIM004、STIM005、STIM007和STIM009)為具有最有前途的供進一步開發之特徵。取此等作進一步更詳細的定性。
分開地，亦基於其等與人類ICOS結合的能力選擇兩種抗體STIM006和STIM008(其等不符合物種交叉反應性標準)作進一步定性。
實施例7：藉由表面電漿子共振(SPR)的親和力測定
藉由SPR使用ProteOn XPR3 6(BioRad)產生ICOS先導物之Fab親和力。藉由一級胺偶合固定三種抗人類IgG抗體(Jackson Labs 109-005-008、109-006-008和309-006-008)在GLC生物感應晶片上創造抗人類IgG捕捉表面。在該抗人類IgG表面各別捕捉加上人類Fc標籤的人類ICOS(hICOS)和小鼠ICOS(mICOS)並以5000nM、1000nM、200nM、40nM和8nM將經純化的Fab用作為分析物，除了STIM003，其係以1000nM、200nM、40nM、8nM和2nM使用。使用緩衝液注射(即0nM)雙重參照結合感測圖(sensorgram)，並將數據擬合至ProteOn XPR36分析軟體固有的1：1模式。於25℃下且使用HBS-EP作為運行緩衝液來運行分析。
此外，執行於不同pH值的抗體：抗原結合親和力之比較。如上所述，在使用藉由一級胺偶合固定在GLC生物感應晶片上的該3抗體混合物創造的抗人類Fc捕捉表面上捕捉二聚體人類ICOS蛋白質(其呈與人類Fc區融合的ICOS之胞外域之形式)。在ProteOn XPR36陣列系統(BioRad)上進行重組表現的抗ICOS Fab之SPR分析。使用該等Fab片段作為分析物以產生結合感測圖，其等係使用緩衝液注射(即0nM)雙重參照。將隨後的經參照的感測圖擬合至ProteOn分析軟體固有的1：1模式。表E7-2呈現該等抗體之親和力和動力學數據，除非另加指出，所有皆於37℃下運行，如所指出的使用HBS-EP於pH 7.4/7.6或pH 5.5下。將數據擬合至該1：1模式。注意STIM002之數據於pH 7.4和5.5兩者下皆很差地擬合至該1：1模式-此 抗體之親和力可因此低於該表格中指出者。
於不同pH值下的親和力數據之比較指出該等抗體於生理pH範圍內保留與其目標的結合。腫瘤微環境相較於血液可以是相對酸性， 因此於低pH下的親和力之維持是用於改善腫瘤內T-reg耗盡的潛在活體內優點。
實施例8：藉由HTRF分析的ICOS配體與ICOS受體之結合之中和
使用均相時間解析螢光(HTRF)，針對其等中和ICOS配體(B7-H2)與ICOS之結合的能力進一步評估所選抗ICOS抗體。於以下者中評估該等mAb之人類IgG1和人類IgG4.PE(無效應的)同型：-針對人類B7-H2與人類ICOS之結合之中和的HTRF分析；和-針對小鼠B7-H2與小鼠ICOS之結合之中和的HTRF分析。包括抗ICOS抗體C398.4A(於各個例子中為倉鼠IgG)以用於比較。
發現一些抗體對於人類及/或小鼠ICOS受體-配體結合具有高中和效力，且結果指出此等抗體中的一些顯示良好的交叉反應性。抗體同型不具有顯著的功效，IgG1和IgG4.PE分析之結果間的差異在實驗誤差內。
IgG1
於人類IgG1分析中，抗體C398.4A產生對於人類ICOS配體之中和的1.2±0.30nM的IC50和對於小鼠ICOS配體之中和的0.14±0.01nM的IC50。
使用人類ICOS配體中和系統，IgG1 mAb STIM001、STIM002、STIM003和STIM005產生類似於C398.4A的IC50且亦為交叉反應性，中和小鼠ICOS配體與小鼠ICOS受體之結合。
兩種另外的交叉反應性mAb(STIM002-B和STIM004)顯示較弱的人類和小鼠ICOS配體中和。
STIM006、STIM007、STIM008和STIM009顯示人類ICOS配體之中和但於小鼠ICOS配體中和系統中不展現顯著的交叉反應性。對於此等抗體，無法計算對於小鼠B7-H2配體的中和IC50值。
IgG4.PE
如所預期的，IgG4.PE mAb產生類似於IgG1同型的結果。
使用人類ICOS配體中和系統，STIM001、STIM003和STIM005顯示類似於C398.4A的IC50值。此等mAb於中和小鼠ICOS配體方面亦為交叉反應性。對於人類ICOS B7-H2中和和小鼠B7-H2配體，STIM002-B和STIM004產生較弱的IC50值。STIM007、STIM008和STIM009顯示人類ICOS配體與人類ICOS受體之結合之中和，但於此等分析中，無法計算對於小鼠B7-H2配體的中和IC50值。
未分析STIM006和STIM002之IgG4.PE同型。
材料和方法
在分析緩衝液(0.53M氟化鉀(KF)、0.1%牛血清白蛋白(BSA)，在1xPBS中)中從至多達4μM，1μM最終的起始操作濃度開始將測試抗體和同型對照組稀釋至0.002nM，5.64e-4nM最終，其跨越11點滴定，3分之1稀釋。將5μL的抗體之力價滴定加至384w白壁分析盤(Greiner Bio-One)。陽性對照組孔僅接收5μL的分析緩衝液。
將5μl的ICOS受體(人類ICOS-mFc，20nM，5nM最終或小鼠ICOS-mFc 4nM，1nM最終(Chimerigen))加至所需孔。於室溫下(RT)培養盤1hr。於培養後，將5μl的小鼠或人類ICOS配體(B7-H2，R&D Systems)(其與Alexa 647(Innova Bioscience)共軛)稀釋至32nM(8nM最終)以用於人類B7-H2或30nM，7.5nM最終以用於小鼠B7-H2並將其等加至分析盤之所有孔中，除了陰性對照組孔外(其替代地接收5μL的分析緩衝液)。
最後，將5μL以銪穴狀化合物(Cis Bio)標記的抗小鼠IgG供體mAb(Southern Biotech)(40nM，10nM最終)加至各個孔並於RT下在黑暗中放置分析以培養另外2個小時。於培養後，在Envision讀盤機(Perkin Elmer)上使用標準HTRF方案讀取分析。將620nm和665nm波段值輸出至微軟Excel(微軟)並執行% δ-F和%中和計算。使用Graphpad(Prism)將滴定曲線和IC50值[M]作圖。藉由首先使用方程式X=Log(X)轉換數據來計算IC50值。接著使用非線性回歸使用擬合演算法log(抑制子)vs.反應-可變斜率(四參數)擬合所轉換的數據。
% δ-F計算：
比率測量數據減少之665/620nm比率。
Figure 106126908-A0202-12-0158-1858
訊號陰性對照組=最小訊號比率之平均。
%中和：
Figure 106126908-A0202-12-0158-1859
實施例9a：T細胞活化
STIM001和STIM003對細胞介素生產之促效潛力係以結合盤的形式和可溶性形式在人類初級T細胞活化分析(其中同時將抗CD3和抗CD28 Ab加至該抗ICOS Ab以誘導效應T細胞上的ICOS表現)中測試。於活化後72hr使用ELISA評估ICOS共刺激對由此等經活化的T細胞生產的IFNγ之水平之功效。
材料和方法 T細胞活化分析1： 單核細胞從人類周邊血液之分離(PBMC)：
從健康的供體收集白血球錐(leukocyte cone)並將其內含物使用磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS，來自Gibco)稀釋至50ml並層堆至2個離心管中的15mL Ficoll-Paque(來自GE Healthcare)上。藉由密度梯度離心(400 g 40min而不中斷)分離PBMC，將其轉移在乾淨的離心管中並接著使用50mL PBS洗滌，藉由於300g下離心5min兩次和藉由於200g下離心5min兩次。接著將PBMC再懸浮在R10培養基(RPMI+10%經熱失活胎牛血清，兩者皆來自Gibco)中並使用EVETM自動細胞計數器(來自NanoEnTek)評估其細胞計數和生存力。
ICOS抗體(Ab)製備和稀釋：
以3種形式測試STIM001和STIM003：結合盤的、可溶性或可溶性加上F(ab')2片段(109-006-170，來自Jackson Immuno Research)，其交聯該抗等ICOS Ab。
對於結合盤的形式：在PBS中將該等抗ICOS Ab和其同型對照組連續稀釋1：3以給出範圍在45至0.19μg/mL的最終抗體濃度。將100μL的經稀釋的抗體以二重複塗覆至96孔高結合性平底盤(Corning EIA/RIA盤)中於4℃下過夜。接著使用PBS洗滌盤並將125μL的R10加至各個孔。
對於可溶性形式：在R10培養基中將該等抗ICOS Ab和其同型對照組連續稀釋1：3以給出範圍在90至0.38μg/mL的2X Ab儲備濃度。將125μL的經稀釋Ab以二重複以移液管移至96孔平底盤中。
對於交聯的可溶性形式：以1M比1M比例混合該等抗ICOS Ab和具有F(ab')2片段的其同型對照組。接著在R10培養基中將Ab/F(ab')2片段混合物1：3連續稀釋以給出範圍在90至0.38μg/mL的2X Ab濃度以用於ICOS和範圍在60至0.24μg/ml的2X Ab濃度以用於F(ab')2片段。將125μL 的經稀釋Ab以二重複以移液管移入96孔平底盤中。
T細胞分離、培養和IFN- γ定量：
使用EasySep人類T細胞分離套組(來自Stemcell Technologies)從PBMC負向分離T細胞並將其以2x106個/ml再懸浮在以40μl/mL的Dynabeads人類T-活化子CD3/CD28(來自Life Technologies)補充的R10培養基中。
將125μL的T細胞懸浮液加至含Ab的盤以給出1x106個細胞/ml的最終細胞濃度並於37℃和5% CO2下培養72hr。接著收集無細胞上清液並保存在-20℃下直到藉由ELISA分析所分泌IFNγ(來自R&D的duoset套組)。
對從6名獨立的供體分離的T細胞重複此實驗並對各個分析條件包括2個技術重複。
T細胞活化分析2(刺激-休息-刺激分析)：
亦在人類T細胞分析中以結合盤的形式測試STIM001和STIM003對細胞介素釋放的促效潛力，於該分析中T細胞係藉由抗CD3和抗CD28 Ab預刺激3日以誘導ICOS表現然後休息3日以減少其活化水平。於刺激(第3日)和休息(第6日)後藉由FACS染色確認ICOS表現。接著在CD3 Ab之存在或不存在下使用STIM001或STIM003培養此等經刺激經休息的T細胞以評估TCR接觸之需求。於72hr後評估ICOS共刺激對在培養物中出現的IFNγ、TNFα和IL-2之水平的功效。
ICOS Ab稀釋和塗覆：
在PBS中將抗人類CD3(來自eBioscience的殖株UCHT1)稀釋至10μg/mL的2X Ab濃度。以移液管將50μL的PBS或50μL的經稀釋CD3 Ab移至96孔高結合性平底盤中。在PBS中將STIM001、STIM003和其同型對照組1：2連續稀釋以給出範圍在20至0.62μg/mL的最終2X抗體濃度。將50μL的經稀釋的抗ICOS Ab加至含有PBS(無TCR接觸)或經稀釋的CD3 Ab(TCR接觸)的孔。於4℃下塗覆盤過夜。
T細胞分離、培養和IFN- γ定量：
如在T細胞活化分析1中描述地獲得來自白血球錐的PBMC。使用EasySep人類T細胞分離套組(來自Stemcell Technologies)從此PBMC負向分離T細胞。以1x106個/ml將T細胞再懸浮在補充有20μl/mL的Dynabeads人類T-活化子CD3/CD28(來自Life Technologies)的R10培養基中並於37℃和5% CO2下(刺激)培養3日。於第3日，自培養物移出dynabead。接著洗滌T細胞(300g 5min)，計數之並將其以1.5x106個/ml再懸浮在R10培養基中並於37℃和5% CO2下培養再3日(休息期)。
於第6日，接著洗滌經刺激經休息的T細胞(300g 5min)，計數之並將其以1x106個/ml再懸浮在R10培養基中並將250μL的T細胞懸浮液加至經ICOS Ab塗覆的盤並於37℃和5% CO2下培養72hr。接著收集無細胞上清液並將其保存在-20℃直到在MSD平台上分析所分泌細胞介素。
使用自5名獨立的供體分離的T細胞重複此實驗且對於各 個分析條件包括3個技術重複。
結果
所測試的STIM001和STIM003兩者皆對誘導IFNγ表現為陽性且因此於兩個分析中皆展現促效作用。
實施例9b：T細胞活化分析1數據
如在實施例9a中描述地執行T細胞活化分析1，而使用自8名獨立的供體分離的T細胞，測試呈人類IgG1形式的STIM001和STIM003之各者。包括倉鼠抗ICOS抗體C398.4A和倉鼠抗體同型對照組以用於比較。對於各個分析條件包括2個技術重複。
結果於圖16、圖17和圖18中顯示。如以上所述的，所測試的STIM001和STIM003兩者皆對誘導IFNγ表現為陽性且因此展現對人類初級T細胞的促效性功效。
交聯的抗體扮演T細胞活化之促效劑，如由在與Fc連接的F(ab')2片段之存在下的IFNγ誘導之強烈增強(相較於可溶的抗體或對照組)所顯示的。T細胞中的IFNγ表現隨著交聯的STIM001或STIM003之濃度增加而增加(圖16，下面的圖)。對於呈結合盤的形式的STIM001和STIM003兩者亦觀察到促效作用，且對於倉鼠抗體C398.4A亦觀察到較弱的促效作用，如由在T細胞中觀察到的隨著抗體之濃度增加而增加的IFNγ表現所顯示的(圖16，上面的圖)。
IFNγ反應之程度於獲自不同供體的T細胞間有所不同，但 STIM001一致地在T細胞中產生增加的IFNγ表現(相較於以對照組抗體(HC IgG1)觀察到的IFNγ表現)。當考慮到來自使用來自所有8名供體的T細胞的分析的數據時，可看到使用STIM001處理T細胞顯著地增加IFNγ表現(相較於使用同型對照組抗體處理)(於結合盤的形式、可溶形式和交聯形式)(圖17)。STIM001因此於所有三種形式皆扮演T細胞活化之促效劑。
於使用STIM003時觀察到類似的功效(圖18)。對於8名獨立的供體，於分析中針對對給定劑量的抗體，比較由STIM003 hIgG1誘導的IFNγ之水平與由其同型對照組(HC IgG1)誘導的IFNγ之水平。儘管供體間有變異性，當與HC IgG1作比較時，由STIM003誘導的IFNγ水平之平均增加是顯著的。此表示STIM001和其他本文所描述的STIM抗體具有類似地促進活體內T細胞活化的潛力。如所討論的先前，經活化的ICOS表現性T細胞之促效作用可由以下者介導：抗ICOS抗體與在T細胞表面上的ICOS受體結合並誘導其多聚化。實施例9c：T細胞活化分析2數據
如在實施例9a中描述地執行T細胞活化分析2。
於缺乏TCR接觸下(無抗CD3抗體)，自初級T細胞產生的細胞介素之水平是低的且STIM001(hIgG1)、STIM003(hIgG1)或抗體C398.4A(即使於10μg/ml的最高濃度下)無誘導增加。相反地，當將該抗ICOS抗體與該抗CD3抗體組合加至T細胞時，STIM001(hIgG1)、STIM003(hIgG1)和C398.4A之各者顯示增加IFNγ、TNFα和(較小程度的)IL-2之表現的劑量依賴性趨勢。
來自在TCR接觸之條件下使用抗ICOS抗體處理的初級T 細胞的數據在圖19中顯示。雖然對於STIM001、STIM003和C389.4A之各者觀察到明顯的細胞介素表現增加(相對於其各自的同型對照組)，其差異於此分析中並未達到統計顯著性。預期使用來自更多供體的反應性初級T細胞的此分析之進一步重複會產生統計上顯著的結果。
實施例10a：ADCC分析
於Delfia BATDA細胞毒性分析(Perkin Elmer)中使用人類初級NK細胞作為效應細胞和高ICOS MJ細胞株(ATCC，CRL-8294)作為目標細胞來測試STIM001和STIM003透過ADCC來殺死的潛力。MJ細胞是人類CD4 T-淋巴球細胞，其表現高水平的ICOS蛋白質。
此方法係基於以螢光增強性配體之乙醯氧基甲基酯(BATDA)(其快速地穿過細胞膜)裝載目標細胞。在細胞內，酯鍵被水解以形成親水性配體(TDA)(其不再通過細胞膜)。於細胞溶解後，該配體被釋放且可藉由添加銪(其與BATDA形成高螢光性和穩定性螫合物(EuTDA))來偵測。所測量的訊號直接與被溶胞的細胞之量相關。
材料和方法 目標細胞標記：
根據製造商之說明，將MJ細胞以1x106個/mL再懸浮在分析培養基(RPMI+10%超低IgG FBS，來自Gibco)中並於37℃下以5μl/mL的Delfia BATDA試劑(Perkin Elmer)裝載30min。接著使用50mL PBS洗滌MJ細胞3次(300g 5分鐘)並將其以8x105個/ml再懸浮在補充有2mM 丙磺舒(來自Life technologies)的分析培養基中以減少BATDA自細胞的自發性釋放。
ICOS Ab稀釋：
在分析培養基+2mM丙磺舒中將STIM001、STIM003和其同型對照組1：4連續稀釋以給出橫越低至80pg/mL的範圍的最終4X抗體濃度。
NK細胞分離和培養：
如在T細胞活化分析1中描述地獲得來自白血球錐的PBMC。使用EasySep人類NK細胞分離套組(來自Stemcell Technologies)從此PBMC負向分離NK細胞並將其以4x106個/ml再懸浮在R10培養基+2mM丙磺舒中。藉由針對CD3-/CD56+染色，檢查出NK細胞純度為高於90%。
在各個孔中添加50μl的經稀釋Ab、50μl的經裝載BATDA的MJ細胞、50μl的NK細胞和50μl的分析培養基+2mM丙磺舒(200μl/孔的最終體積)以給出橫越低至20pg/mL的範圍的最終Ab濃度和5：1的效應細胞：目標細胞比例。使用含有單獨MJ細胞或MJ細胞+delfia溶胞緩衝液(Perkin Elmer)的孔以測定自發性釋放和100% BATDA釋放。
於37℃、5% CO2下運行分析2hr，之後將50μl的無細胞上清液轉移至DELFIA微滴定盤(Perkin Elmer)。將200μl的Delfia銪溶液(Perkin Elmer)加至該上清液並於室溫下培養15min。接著使用EnVision多標記讀盤機(PerkinElmer)定量螢光訊號。
根據套組之說明計算由STIM001和STIM003誘導的專-性 釋放。使用來自獨立的供體的NK細胞重複此實驗且對於各個分析條件包括3個技術重複。
結果
抗ICOS抗體STIM001(hIgG1)和STIM003(hIgG1)於初級NK依賴性ADCC分析中殺死ICOS陽性人類MJ細胞(2小時時間點)。亦參見圖6a。兩種所測試的分子於此分析中皆達成次毫微體積莫耳濃度的EC50。
實施例10b：使用MJ目標細胞的ADCC分析
本實驗根據實施例10a中提出的材料和方法執行。在分析培養基+2mM丙磺舒中將STIM001、STIM003和同型對照組1：4連續稀釋以給出範圍在40μg/mL至80pg/mL的最終4X抗體濃度。在各個孔中添加50μl的經稀釋Ab、50μl的經裝載BATDA的MJ細胞、50μl的NK細胞和50μl的分析培養基+2mM丙磺舒(200μl/孔的最終體積)以給出範圍在10μg/mL至20pg/mL的最終Ab濃度和5：1的效應細胞：目標細胞比例。
結果在圖6(b-d)中和以下表格中顯示。STIM001(hIgG1)和STIM003(hIgG1)於此初級NK依賴性ADCC分析中殺死ICOS陽性人類MJ細胞，其係於二小時時間點測量。
實施例10c：使用經ICOS轉染的CCRF-CEM目標細胞的ADCC分析
進一步於Delfia BATDA細胞毒性分析(Perkin Elmer)中使用人類初級NK細胞作為效應細胞和經ICOS轉染的CCRF-CEM細胞(ATCC，CRL-119)作為目標細胞測試來測試STIM001和STIM003 hIgG1通過ADCC殺死的潛力。CCRF-CEM是一種人類T淋巴胚細胞株，其係源自來自具有急性淋巴胚細胞白血病的患者之周邊血液。針對STIM001和STIM003兩者確認CCRF-CEM細胞之抗體介導的殺死。
材料和方法
材料和方法如於實施例10a中提出者，但使用獲自ATCC的CCRF-CEM細胞(ATCC CCL-119)而非MJ細胞作為目標細胞，且使用4 小時的培養時間。
使用ICOS轉染CCRF-CEM細胞。將編碼全長人類ICOS的合成串DNA(其具有訊號胜肽，如在所附序列表中所顯示的)(其係針對哺乳動物表現作密碼子最佳化)選殖至表現載體中，其在CMV啟動子之控制下且兩側為3’和5’piggyBac專一性末端重複序列，以促進至細胞基因體中的穩定整合(參見[40])。該表現載體含有嘌呤黴素選擇卡匣以促進穩定細胞株產生。將該人類ICOS表現質體與編碼piggyBac轉位酶的質體藉由電穿孔共轉染至CEM CCRF細胞中。轉染後24小時後，以嘌呤黴素補充培養基並生長至少二週以選擇穩定的細胞株，且每3-4日更換培養基。人類ICOS之表現係藉由流式細胞測量術使用抗人類ICOS-PE共軛抗體(eBioscience)評估。完全CEM培養基係由含有10%(v/v)FBS和2mM Glutamax的Advanced RPMI培養基構成。
在分析培養基中將STIM001(hIgG1)、STIM003(hIgG1)和同型對照組抗體(HC IgG1)連續稀釋以給出範圍在20μg/mL至80pg/mL的最終4X抗體濃度。
在各個孔中添加50μl的經稀釋Ab、50μl的經裝載BATDA經ICOS轉染的CEM細胞、50μl的NK細胞和50μl的分析培養基(200μl/孔的最終體積)以給出範圍在5μg/mL至20pg/mL的最終Ab濃度和5：1的效應細胞：目標細胞比例。
結果
STIM001(hIgG1)和STIM003(hIgG1)於此初級NK依賴 性ADCC分析中殺死經ICOS轉染的CCRF-CEM細胞，其係於四小時時間點測量。結果在圖6(e-g)中和以下表格中顯示。
實施例11a：CT26同基因模型
改善的活體內抗腫瘤效力係於CT26同基因模型藉由組合抗ICOS(STIM001 mIgG2a，效應經啟動的)與抗PDL1(10F9G2)顯示。
材料和方法
於Balb/c小鼠中使用皮下CT26結腸癌模型(ATCC，CRL-2638)執行效力研究。此模型對PD1/PDL1阻斷敏感性差且通常僅觀察到對10F9.G2(抗PDL1)和RMT1-14(抗PD1)單一療法反應的腫瘤生長延遲(無穩定的疾病或治癒)。因此此模型構成用於關注抗PD1、抗PDL1內源抗性的相關模型以用於組合研究。所有的活體內實驗皆係根據英國動物科學處置法(UK Animal(Scientific Procedures)Act)1986和EU指令86/609 在英國內政部計劃許可證下執行並由Babraham研究所動物福祉和倫理審查機構核准。
Balb/c小鼠為6-8週齡和>18g由Charles River UK提供並養在無特定病原體條件下。將總共1x105個CT26細胞(繼代數低於P20)皮下注射至小鼠之左側腹中。除非另加說明，於腫瘤細胞注射後第6日起始治療。藉由使用Accutase(Sigma)試管內繼代CT26細胞，在PBS中洗滌兩次並再懸浮在補充有10%胎牛血清的RPMI中。確認細胞生存力於腫瘤細胞注射時高於90%。
對於活體內研究，將STIM001抗ICOS促效劑(對小鼠ICOS蛋白質有交叉反應性)之形式變更成小鼠IgG1和小鼠IgG2a以分別作為無效應功能者和作為效應功能經啟動者來測試。該抗PDL1來自Biolegend(目錄編號：124325)。混合對照組係以Kymab(mIgG2a同型)產生或來自市面上的來源(倉鼠同型HTK888，Biolegend(產品編號92257，批號B215504))。所有的抗體皆作為單一療法或藉由組合抗PDL1與抗ICOS抗體從第6日開始一週三次(第6-18日給藥2週)以10mg/kg(1mg/ml，於0.9%食鹽水中)腹膜內(IP)給藥。從腫瘤細胞注射日開始每週測量動物重量和腫瘤體積3次。藉由使用經修改的橢圓公式1/2(長×寬2)計算腫瘤體積。將小鼠保持在研究中直到其腫瘤達到12mm3的平均直徑或(極少地)當觀察到腫瘤潰瘍形成之發生時(福祉)。於第50日停止實驗。使用卡本-麥爾方法利用Prism計算人類終點存活統計。使用此方法以確定特定治療是否與改善存活相關連。
結果
如於圖7、圖8和圖9中所顯示的，ICOS促效劑無論是作為單一療法或與抗PDL1組合皆可延遲疾病進展和自CT-26皮下腫瘤治癒一部份動物。抗PDL1單一療法誘導腫瘤生長延遲但未觀察到穩定的疾病或治癒性潛力。該組合於治療腫瘤方面相較於該抗ICOS單一療法是更有效的。此研究亦突出了呈小鼠IgG2a形式的STIM001(效應功能經啟動的)在此模型中於觸發抗腫瘤反應方面相較於小鼠IgG1(無效應的)形式是更有效的。
實施例11b：抗ICOS mIgG2a與抗PDL1 mIgG2a之組合於CT26同基因模型 中的強活體內抗腫瘤效力
使用STIM001與命名為AbW的小鼠交叉反應性抗人類PDL1抗體執行活體內組合研究。對於此活體內工作，將STIM001之形式變更成小鼠IgG1和小鼠IgG2a以分別與低效應功能或作為效應功能經啟動的分子來比較其效力。該抗PDL1 AbW是以相同的形式(小鼠IgG1和小鼠IgG2A)產生。
在Balb/c小鼠中使用皮下的CT26結腸癌模型(ATCC，CRL-2638)執行效力研究。Balb/c小鼠為6-8週齡和>18g由Charles River UK提供並養在無特定病原體條件下。將總共1x10E5個CT26細胞(繼代數低於P20)皮下注射至小鼠之右側腹中。除非另加說明，於腫瘤細胞注射後第6日起始治療。藉由使用TrypLETM Express酵素(Thermofisher)試管內繼代CT26細胞，在PBS中洗滌兩次並再懸浮在補充有10%胎牛血清的RPMI中。確認細胞生存力於腫瘤細胞注射時高於90%。
將STIM001和抗PDL1抗體於腫瘤細胞移植後從第6日開始一週三次(於第6-17日間給藥2週)以各200μg(1mg/ml，於0.9%食鹽水中)腹膜內(IP)同時組合給藥。監測腫瘤生長並與使用同型對照組抗體(mIgG1和mIgG2A)之混合物治療的動物之腫瘤作比較。從腫瘤細胞注射日開始每週測量動物重量和腫瘤體積3次。藉由使用經修改的橢圓公式1/2(長×寬2)計算腫瘤體積。將小鼠保持在研究中直到其腫瘤達到12mm3的平均直徑或(極少地)當觀察到腫瘤潰瘍形成之發生時(福祉)。於第60日停止實驗。使用卡本-麥爾方法利用Prism計算人類終點存活統計。使用此方法以確定特定治療是否與改善存活相關連。
結果於圖10中顯示。當與經同型對照組治療的動物比較時，所有的抗體組合皆延遲經治療動物之腫瘤生長並延長其存活(達到人類終點的時間)。有趣的是，當與抗PDL1(無論其形式為mIgG1或mIgG2a)組合時，STIM001 mIgG2a抗體於抑制腫瘤生長方面相較於呈mIgG1形式的STIM001是更有效的。此等數據暗示具有效應功能的抗ICOS抗體最大化抗腫瘤效力之優點。明顯地，與PD-L1 mIgG2a組合的STIM001 mIgG2a展現了最強的抗腫瘤效力和改善的存活(於第60日90%的動物顯示反應且60%自該疾病治癒)。
類似地，在相同的CT26腫瘤模型中測試呈單一療法形式或與抗PDL1(AbW)mIgG2a組合的STIM003 mIgG1和mIgG2a。於腫瘤細胞移植後從第6日開始一週三次(於第6-17日間給藥2週)藉由腹膜內注射(IP)200μg的各抗體(1mg/ml，於0.9%食鹽水中)來在動物中給藥呈單一療法形式或呈組合形式的STIM003和抗PDL1抗體。於此實驗中，監測腫瘤大小41日。使用卡本-麥爾方法利用Prism計算人類終點存活統計。使用此方法以確定特定治療是否與改善存活相關連。
結果於圖11中顯示。使用aPDL1(AbW)和STIM003 mIgG2a的單一療法展現輕微的抗腫瘤活性(於各組中一隻動物自疾病被治癒)。STIM003 mIgG1或mIgG2a與aPDL1(AbW)mIgG2a之組合顯示強力的抗腫瘤效力。有趣的是，於第41日時，當與aPDL1 mIgG2a組合時，STIM003 mIgG2a於抑制腫瘤生長方面相較於STIM003 mIgG1是更有效的(分別60% vs 30% 的動物自疾病治癒)。此等數據進一步突出了對於抗ICOS抗體而言效應形式最大化抗腫瘤效力的優點。
總而言之，此等數據展現當兩種抗體皆具有效應經啟動的功能時，抗ICOS抗體STIM001或STIM003與抗PDL1之組合導致最強的抗腫瘤反應。適合的對應人類抗體同型可包括人類IgG1，其視情況具有進一步增強的效應功能，例如無海藻糖化的IgG1。
以抗PDL1 mIgG2a和STIM003 mIgG2a之組合治療和以任一藥劑個別治療的小鼠之卡本麥爾曲線於圖29中顯示。
實施例11c：單劑的STIM003抗體重置腫瘤微環境(TME)且與連續的抗PD-L1給藥組合導致強力的抗腫瘤效力
此研究比較與多次給藥的抗PDL1抗體(AbW)一起的單次vs多次給藥的STIM003 mIgG2A。數據顯示單劑的抗ICOS抗體可改變腫瘤微環境使得抗PD-L1抗能夠發揮較大的功效。此可被設想成藉由該抗ICOS抗體的TME之「重置」。
如上，在Balb/c小鼠中使用皮下的CT26結腸癌模型(ATCC，CRL-2638)執行此等效力研究。Balb/c小鼠是6-8週齡和>18g由Charles River UK提供並養在無特定病原體條件下。將總共1x10E5個CT26細胞(繼代數低於P20)皮下注射至小鼠之右側腹中。除非另加說明，於腫瘤細胞注射後第6日起始治療。藉由使用TrypLETM Express酵素(Thermofisher)試管內繼代CT26細胞，在PBS中洗滌兩次並再懸浮在補充有10%胎牛血清的RPMI中。確認細胞生存力於腫瘤細胞注射時高於90%。
治療組在表E11-4中顯示。STIM003和抗PDL1抗體是以10mg/kg(1mg/ml，於0.9%食鹽水中)腹膜內(IP)給藥。於腫瘤細胞移植後第6日起始治療。監測腫瘤生長並與使用食鹽水治療的動物之腫瘤作比較。從腫瘤細胞注射日開始每週測量動物重量和腫瘤體積3次。藉由使用經修改的橢圓公式1/2(長×寬2)計算腫瘤體積。將小鼠保持在研究中直到其腫瘤達到12mm3的平均直徑或(極少地)當觀察到腫瘤潰瘍形成之發生時(福祉)。於第55日停止實驗。
數據於圖34中顯示。從第6日開始同時給藥6劑STIM003和抗PDL1於CT26模型中產生強力的抗腫瘤效力，其中5/8隻動物於研究結束時(第55日)無腫瘤。有趣的是，使用呈單一療法的單劑STIM003接著多劑抗PDL1達成了類似的抗腫瘤效力。當與抗PD-L1 mIgG2a組合時，在給藥STIM003一次(C)vs給藥6次(B)間觀察到類似的整體效力。當與使用食鹽水治療的組(A)(其中僅有一隻動物有自發性腫瘤排斥(在此模型中很罕見))作比較時，使用組合的藥物治療的組於實驗結束時(第55日)有62.5%的動物具有完全腫瘤排斥。此等數據暗示可將STIM003抗體用於重置腫瘤微環境和該抗體使免疫查核點抗性腫瘤能夠變得對抗PDL1有敏感性。如先前所顯示的(實施例11b)，CT26腫瘤細胞株對抗PDL1單一療法反應不強。所顯現者是STIM003造成促進抗PDL1療法之抗腫瘤活性的改變。
實施例12：抗體序列分析
比較抗體STIM001、STIM002、STIM002-B、STIM003、 STIM004、STIM005、STIM006、STIM007、STIM008和STIM009之架構區與人類生殖系基因節段以鑑認最接近的相配。參見表E12-1和表E12-2。
另外的抗體序列係藉由次世代定序經PCR擴增的來自從如於實施例3中描述的經免疫的小鼠分選的另外的ICOS專一性細胞的抗體DNA來獲得。此鑑認一些可基於其重鏈和輕鏈v和J基因節段和CDR3長度與STIM001、STIM002或STIM003歸成群集的抗體。CL-61091與STIM001同群；CL-64536、CL-64837、CL-64841和CL-64912與STIM002同群；且CL-71642和CL-74570與STIM003同群。該等抗體VH和VL域之序列比對於圖35至37中顯示。
實施例13：通過結合珠粒的抗體的ICOS表現性MJ細胞之促效作用
將抗體STIM001、STIM002和STIM003、抗ICOS抗體C398.4A、和ICOS配體(ICOSL-Fc)各自共價偶合至珠粒並評估其等誘導細胞介素IFN-γ從在培養物中生長的MJ細胞表現的能力。同時評估與珠粒偶合的人類IgG1和殖株C398.4A同型對照組。
數據於圖12和以下表E13中顯示。
該等抗ICOS抗體之各者於此分析中皆展現促效作用，刺激MJ細胞(如由IFN-γ定量測定)至顯著高於在其同源同型對照組中觀察到者(在分析之動態範圍內)。
相較於STIM001(頂端95% CI：7.21至8.88和LogEC50 95% CI：-8.82至-8.63)和STIM002(頂端95% CI：5.38至6.95和LogEC50 95% CI：-9.00至-8.74)，STIM003和殖株C398.4A產生較低的頂端漸近線值(95% CI分別為：3.79至5.13和3.07至4.22)但更有效的LogEC50值(95% CI分別為：-9.40至-9.11和-9.56至-9.23)。因為ICOSL-Fc和殖株C398.4A同型對照組產生不完整的曲線(頂端超過分析之動態範圍)，不將其擬合頂端和LogEC50值視為可靠的。人類IgG1混合對照組產生完整曲線，然而其曲線下面積與0並無顯著不同且因此其不被視為促效劑。
MJ細胞活化分析材料和方法-結合珠粒的 將目標蛋白質偶合至磁性粒子
如下將抗ICOS抗體、對照組抗體、和ICOSL-Fc偶合至珠粒。
於室溫下伴隨攪動將經甲苯磺醯基活化的Dynabeads M-450(Invitrogen；大約2×10^8個珠粒/樣本)與100μg的各個蛋白質樣本一起培養過夜。以DPBS(Gibco)洗滌珠粒三次並於室溫下伴隨攪動以1M Tris-HCI，pH 8.0(UltraPureTM，Gibco)培養1hr以封阻未偶合的反應性位置。再次以DPBS洗滌珠粒三次並最終將其再懸浮在0.5ml的DPBS/樣本中。
接著如下測定各個目標蛋白質在珠粒上的量。於4℃下使用4μg/ml在DPBS中的抗人類IgG(Southern Biotech)或抗亞美尼亞倉鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)捕捉抗體(50μl/孔)塗覆黑色平底高結合性ELISA盤(Greiner)過夜。接著以DPBS+0.1% Tween，200μl/孔洗滌孔三次並於RT下以200μl/孔的DPBS+1% BSA封阻1hr。再次以DPBS+0.1% Tween洗滌孔三次。以光譜測定定量儲備蛋白質樣本並在細胞計數器上計數珠粒。接著於RT下在盤中以50μl/孔培養蛋白質樣本和珠粒之稀釋系列1hr，之後再次以DPBS+0.1% Tween洗滌三次。添加50μl/孔在DPBS+0.1% BSA中的經生物素化抗亞美尼亞倉鼠抗體或抗人類IgG-銪並於RT下培養1hr。在添加經生物素化抗亞美尼亞倉鼠抗體C398.4A的例子中，加上利用50μl/孔在分析緩衝液(Perkin Elmer)中稀釋1：500的鏈黴抗生物素蛋白-銪(Perkin Elmer)的另一個培養步驟並於RT下培養1hr。以200μl/孔的TBS+0.1% Tween洗滌孔三次，之後如下顯影分析：添加50μl/孔的Delfia增強溶液(Perkin Elmer)，於RT下培養10min並在EnVision多標記讀盤機上測量於615nm發射的螢光。藉由外推來自獲自已知濃度的未偶合的蛋白質樣本的訊號的值來測定珠粒上蛋白質之量。
MJ細胞試管內活化分析-結合珠粒的
使MJ[G11]細胞株(ATCC CRL-8294)生長在補充有20%熱失活FBS的IMDM(Gibco或ATCC)中。計數細胞並將15000個細胞/孔(50 μl/孔)的細胞懸浮液加至96孔透明平底聚苯乙烯無菌TC處理微盤。計數珠粒並將範圍在1.5 x 10^6個珠粒/孔至大約5860個珠粒/孔(50μl/孔)的系列1：2稀釋物以二重複或以三重複加至該等細胞。為分析背景值，數個盤之孔僅含有MJ細胞(100μl/孔)。於37℃和5% CO2下在盤中共培養該等細胞和珠粒3日，之後藉由離心來收穫上清液並收集之以用於IFN-γ含量測定。
測量IFN-γ水平
使用人類IFNγ DuoSet ELISA套組(R&D Systems)之修改測定各個孔中的IFN-γ含量。將捕捉抗體(50μl/孔)以4μg/ml(在DPBS中)塗覆在黑色平底高結合性盤(Greiner)上過夜。以200μl/孔的DPBS+0.1% Tween洗滌孔三次。以200μl/孔的在DPBS中的1% BSA(w/v)封阻孔，以200μl/孔的DPBS+0.1% Tween洗滌三次並接著將50μl/孔的在RPMI中的IFN-γ標準溶液或淨細胞上清液加至各個孔並於RT下培養1hr。以200μl/孔的DPBS+0.1% Tween洗滌孔三次，之後添加50μl/孔的在DPBS+0.1% BSA中的200ng/ml的經生物素化偵測抗體並於RT下培養1hr。以200μl/孔的DPBS+0.1% Tween洗滌孔三次，之後添加50μl/孔的在分析緩衝液(Perkin Elmer)中稀釋1：500的鏈黴抗生物素蛋白-銪(Perkin Elmer)並於RT下培養1hr。以200μl/孔的TBS+0.1% Tween洗滌孔三次，之後如下顯影分析：添加50μl/孔的Delfia增強溶液(Perkin Elmer)並於RT下培養10min並在Envision多標記讀盤機上測量於615nm發射的螢光。
數據分析
從標準曲線內插各個孔之IFN-γ值並減去來自僅含細胞的孔的平均背景水平。接著於GraphPad prism中使用經針對背景校正的值以擬合4參數對數-邏輯濃度反應曲線。
實施例14：透過結合盤的抗體的ICOS表現性MJ細胞之促效作用
ICOS表現性T細胞促效作用之可供選擇的分析使用呈結合盤的形式的抗體。
MJ細胞活化分析材料和方法-結合盤的
抗體塗覆：於4℃下以二重複或以三重複使用100μl/孔的目標蛋白質(抗ICOS抗體、對照組抗體、和ICOSL-Fc)在DPBS(Gibco)中範圍在10μg/ml至0.02μg/ml的系列1：2稀釋塗覆96孔無菌平底高結合性盤(Costar)過夜。為計算背景值，盤之數個孔以單獨DPBS塗覆。接著以200μl/孔的DPBS洗滌盤三次，之後添加細胞。
細胞刺激：使MJ[G11]細胞株(ATCC CRL-8294)生長在補充有20%熱失活FBS的IMDM(Gibco或ATCC)中。計數細胞並將15000細胞/孔(100μl/孔)的細胞懸浮液加至經塗覆蛋白質的盤。於37℃和5% CO2下在盤中培養細胞3日。藉由離心自培養基分離細胞並收集上清液以用於IFN-γ含量測定。
IFNγ水平之測量和數據分析如在實施例13中描述的。
結果
結果於圖13中和在以下表E14-1中顯示。總結來說，STIM001、STIM002和STIM003皆顯示有效的促效作用，如由IFN-γ分泌測量的，其有類似的LogEC50值(LogEC50 95% CI分別為：-7.76至-7.64，-7.79至-7.70和-7.82至-7.73)和頂端值(頂端95% CI分別為：2.06至2.54，2.44至2.93和2.01至2.41)。殖株C398.4A相較於STIM001至STIM003展現類似的LogEC50值(LogEC50 95% CI：-7.78至-7.60)但較低的頂端值(頂端95% CI：1.22至1.63)。STIM004亦於此分析中顯示促效作用，但效力較差，達到中等的頂端值(頂端95% CI：0.16至0.82)與類似的LogEC50值(LogEC50 95% CI：-7.91至-7.21)。STIM001、STIM002和STIM003相較於ICOSL-Fc(LogEC50 95% CI：-7.85至-7.31且頂端TOp 95% CI：0.87至2.45)是較強的促效劑。
實施例15：通過呈可溶形式的抗體的ICOS表現性MJ細胞之促效作用
與實施例13和實施例14中描述的分析(其等使用配置在固體表面上的抗體)相反，此分析測定呈可溶形式的抗體是否扮演ICOS表現性T細胞之促效劑。
MJ細胞活化分析材料和方法-可溶的
使MJ[G11]細胞株(ATCC CRL-8294)生長在補充有20%熱失活FBS的IMDM(Gibco或ATCC)中。計數細胞並將15000細胞/孔(50μl/孔)的細胞懸浮液加至96孔透明平底聚苯乙烯無菌TC處理微盤。以二重複或以三重複將目標蛋白質範圍在10μg/ml至0.01953125μg/ml的系列1：2稀釋單獨地或添加有交聯試劑(AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG，Fc片段專一性；Jackson ImmunoResearch)地一起加至該等細胞(50μl/孔)。為計算背景值，盤之數個孔僅含有MJ細胞(100μl/孔)。於37℃和5% CO2下在盤中共培養細胞和珠粒3日，之後藉由離心收穫上清液並收集之以用於IFN-γ含量測定。
IFNγ水平之測量和數據分析如在實施例13中描述的。
結果
如由IFN-γ分泌測量的，STIM001和STIM002皆顯示顯著的可溶的促效作用，其係與人類IgG4.PE混合對照組比較。透過山羊抗人類IgG Fc F(ab')2片段的MAb交聯甚至增加更多所分泌的IFN-γ水平。
實施例16：抗體與經活化T細胞之結合 A.人類ICOS
於此分析中確認抗ICOS抗體辨識經活化初級人類T細胞之表面上的ICOS胞外域(在其天然背景下)的能力。
分離泛T細胞(CD3細胞)並以CD3/CD28 dynabead將其(Thermofisher)培養3日以誘導在其表面上的ICOS表現。STIM001、STIM003和the hIgG1混合對照組(HC IgG1)之表面染色是由以下兩種方法測定：預標記的抗體(直接與AF647共軛的抗體)之直接結合後的偵測或透過使用二級AF647山羊抗人類Fc抗體之結合後的間接偵測。在Attune上運行經染色的細胞並以螢光強度之平均值(MFI)呈現染色強度。使用GraphPad Prism測定EC50。
結果於圖14中顯示。一旦被活化，泛CD3 T細胞清楚地被STIM001和STIM003 hIgG1兩者染色。明顯地，STIM003與經活化T細胞結合之飽和相較於STIM001之飽和是在較低的濃度發生，暗示STIM003對於人類ICOS的較高的親和力。STIM003之EC50相較於STIM001之EC50低大約100x(對於間接結合分析為0.148nM vs 17nM)。
B.來自非人類靈長類的ICOS
於此分析中確認抗ICOS抗體辨識來自非人類靈長類(NHP)的經活化初級T細胞之表面上的ICOS胞外域(在其天然背景下)的能力。
藉由梯度離心分離來自2隻模里西斯食蟹獼猴(Wickham Laboratories)之全血的PBMC並將其以CD2/CD3/CD28 MACSiBeads(Miltenyi)培養3日以在其表面上的誘導ICOS表現。STIM001、STIM003和the hIgG1混合對照組(HC IgG1)之表面染色於經AF647預標記的抗體(80μg至8pg/ml)之直接結合後測定。亦以V450-CD3標記細胞以評估於T細胞子群的染色。在Attune(Thermofisher)上運行經染色細胞並以平均螢光強度(MFI)呈現染色強度。使用GraphPad Prism測定EC50。
結果於圖28中顯示。一旦經活化，T細胞清楚地被STIM001和STIM003 hIgG1兩者染色。如於與人類T細胞之結合中觀察到的，STIM003與經活化NHP T細胞之結合之飽和相較於STIM001之飽和是在較低的濃度發生，表示STIM0003具有此二種抗體ICOS之較高的親和力。與NHP ICOS之結合的EC50值與該等於與人類ICOS之結合中獲得的EC50值類似。
實施例17：腫瘤浸潤性淋巴球和周邊T細胞間的T細胞次族群之分析
藥效學研究顯示呈mIgG2a同型的抗ICOS抗體STIM001和STIM003在腫瘤微環境(TME)內顯著地耗盡TReg，增加CD4+效應細胞之百分比和增加CD4+效應細胞/TReg比率以及CD8+/TReg比率。
TME內增加的CD8+/TReg比率和增加的CD4+效應細胞之數目一起可促成於STIM001 & STIM003效力研究中當共注射此等抗ICOS抗體與抗PDL1抗體時觀察到的CT26腫瘤清除(實施例11)。
方法
在帶有CT-26小鼠結腸癌細胞(ATCC，CRL-2638)的雌性Balb/c小鼠中執行藥效學研究。Balb/c小鼠為6-8週齡和>18g由Charles River UK提供並養在無特定病原體條件下。將總共1x10E5個CT26細胞(繼代數：P8)皮下注射至小鼠之右側腹中。將所有帶有CT-26腫瘤的動物分為6組(表E17-1)並將個別的小鼠以200μg的抗體或食鹽水給藥兩次(於腫瘤細胞移植後第13日&第15日)。於腫瘤細胞移植後第16日藉由FACS分析來自帶有CT-26腫瘤的動物的CD3+ T細胞。
結果
以呈mIgG2a同型的STIM001 & STIM003治療的動物當與使 用食鹽水治療的組作比較時於腫瘤位置顯示較低百分比的CD4+ CD3+ CD45+細胞(圖15A)，而STIM001或STIM003治療對於腫瘤位置之CD8+ CD3+ CD45+細胞之百分比之具有極小的功效(圖15B)。CD4+ T細胞之減少可能導因於在所有使用STIM001和STIM003抗體治療的組中T調節性細胞之百分比之大量減少。明顯地，以呈mIgG2a同型的STIM001和STIM003治療的動物於TME內顯示T-Reg(CD4+ Foxp3+ CD25+)之劇烈減少，而呈mIgG1同型的STIM001 & STIM003對TME中的T-Reg含量僅具有不大的功效。此外，以呈mIgG2a同型的STIM001 & STIM003治療的動物相較於以市面上的抗CTLA-4(9H10，Biolegend Cat# 106208)抗體(其已知會耗盡T-Reg[42])治療的動物於TME中具有減少的T-Reg，但此結果並未達到統計顯著性(圖15C)。呈mIgG1或mIgG2a同型的STIM001和STIM003對T-Reg間隔之功效對於腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)更有專一性。於周邊未觀察到T-reg耗盡(如先前針對抗CTLA4描述的[43])(圖15D)。T-Reg含量之改變亦導致腫瘤內CD4-效應細胞(CD4+ Foxp3- CD25-)之百分比之顯著的增加(圖15E)，類似地以呈mIgG2a的STIM001 & STIM003治療的動物中的CD4效應細胞/T-Reg之比率和CD8/T-Reg比率於TME內亦顯著地增加(圖15F &圖15G)。
實施例18：於CT26腫瘤和脾臟中抗ICOS抗體對ICOS表現性T細胞之水平之功效
執行分析以定量腫瘤內的免疫細胞之百分比(相較於脾臟內)，其係藉由在以抗ICOS抗體STIM001或STIM003治療後分析腫瘤和脾 臟組織中的總免疫細胞。STIM001和STIM003 mIgG2a在腫瘤內各自造成Treg顯著的減少，但非在脾臟中，顯示腫瘤選擇性功效。此耗盡對於TReg相較於其他T細胞子類型有選擇性。此處呈現的結果有助於瞭解該等STIM抗體對免疫構成之功效，並確認具有效應功能經啟動的Fc區的抗ICOS抗體可強力地耗盡TReg。
材料和方法
以STIM001、STIM003、或抗CTLA4抗體(9H10)給藥帶有CT26腫瘤的小鼠兩次。包括該抗CTLA4抗體作為陽性對照組以用於耗盡TReg，因為先前已顯示抗CTLA4抗體會選擇性地減少腫瘤中的TReg[43]。
於組織分解後藉由FACS分析在經治療動物之腫瘤和脾臟內的免疫構成。
用於此研究中的FACS抗體之細節在表E18中顯示。所有的FACS抗體皆以供應商推薦的濃度使用。使用Attune NxT流式細胞儀獲得FACS數據並使用FlowJo軟體分析數據。
結果
在帶有腫瘤的動物之CT26腫瘤和脾臟中測定ICOS表現。吾人觀察到表現ICOS蛋白質的腫瘤浸潤性免疫細胞之百分比增加(圖20)，表示腫瘤中的免疫細胞相較於在周邊的免疫細胞更常為對ICOS表現為陽性。未經治療動物之腫瘤中的TReg幾乎全部(>90%)都對ICOS表現為陽性，而腫瘤中的CD8+效應T細胞則否(大約60%)。比較腫瘤之T細胞次族群與該等在脾臟中者(再次在未經治療的小鼠中)，相較於脾臟中的TReg，顯著較高(p<0.0001)百分比的腫瘤內TReg對ICOS為陽性，且相 較於脾臟中的CD4+ Teff細胞，顯著較高(p<0.001)百分比的腫瘤內CD4+ Teff細胞對ICOS為陽性。
亦在治療前的小鼠中，當與脾臟中的免疫細胞作比較時，ICOS表現之水平在CT26腫瘤之微環境中在免疫細胞上遠較高(圖21)。在腫瘤微環境中ICOS表現在所有所分析的免疫細胞子群(CD8 T效應細胞，CD4 T效應細胞和CD4/FoxP3 TReg細胞)之表面上皆增加。注意雖然免疫細胞於腫瘤和脾臟中皆表現ICOS，相較於脾臟中的細胞(由較低的MFI顯示，圖21)，腫瘤中的免疫細胞表現顯著更多的ICOS(由較高的MFI顯示，圖21)。重要地，腫瘤中的TReg表現最高水平的ICOS，如先前報導的[11]。
以2劑的抗體STIM001或STIM003和以抗CTLA-4抗體治療帶有CT26腫瘤的動物。當以mIgG1或mIgG2形式使用時，該等STIM抗體不影響腫瘤中的CD45陽性細胞(免疫細胞之標記)之整體百分比。使用此等抗體的治療亦未顯著影響CT26腫瘤中CD8效應T細胞之百分比(圖22)。使用呈mIgG2a同型的STIM001治療導致CD4+效應T細胞之顯著的(p<0.05)耗盡，但STIM001 mIgG1、STIM003 mIgG1和STIM003 mIgG2a無一影響CD4+效應T細胞之百分比。
抗CTLA-4治療產生TME中的CD45+細胞和CD8+效應T細胞之明顯的(儘管非統計上顯著的)增加，但不影響CD4+效應T細胞(圖22)。
該等STIM抗體顯著地影響腫瘤中的調節性T細胞。如於圖23中所顯示的，STIM001 mIgG2a和STIM003 mIgG2a顯著地和選擇性地耗盡腫瘤微環境中的TReg(其等高度表現ICOS)。有趣的是，該抗CTLA4抗 體(儘管被包括在此實驗中以作為用於TReg耗盡的陽性對照組)於耗盡TReg方面相較於STIM mIgG2a抗體較不有效。
此TReg之選擇性耗盡導致腫瘤中比率CD8效應T細胞對TReg之增加、以及腫瘤中CD4效應T細胞對TReg之比率之增加，兩者皆應有利於抗腫瘤免疫反應。比率數據於圖24中顯示。
與透過STIM001 mIgG2a和STIM003 mIgG2a的腫瘤內TReg之耗盡相反，未對脾臟中的TReg觀察到這樣的功效(圖25、圖26、圖27)。此顯示該等抗ICOS抗體對TReg耗盡之耗盡的功效並非全身性的在所有組織中。這樣的選擇性於治療患者之腫瘤方面對治療性抗ICOS抗體可以是有益的，因為腫瘤微環境中的TReg之優先耗盡可選擇性地減輕抗腫瘤效應T細胞之抑制，同時最小化在身體之其他位置的副作用。該等抗ICOS抗體因此可在免疫系統中促進抗腫瘤反應且對非所欲的較寬廣T細胞反應之活化(其可造成限制治療的自體免疫不良事件)之風險是低的。
實施例19：抗體穩定性
針對儲存、冷凍/解凍和純化期間的穩定性測試STIM003人類IgG1，且發現其於所有所測試狀況下皆維持其穩定性。%聚集是由HPLC測定的。
在於4℃下在緩衝液(10mM磷酸鈉，40mM氯化鈉，pH 7.0)中儲存3個月後單體之百分比無顯著的改變(>99%)。
於熱變性測試，所有的樣本(n=15)皆具有相同的Tm(等分試樣間無顯著的差異)且具有可比較的熱變性曲線。
於3個冷凍和解凍之循環後Tm(
Figure 106126908-A0202-12-0194-137
70.3℃)、單體之百分比或SDS-PAGE上的特性無顯著的改變。
在於室溫下儲存7日後Tm(
Figure 106126908-A0202-12-0194-138
70.3℃)、單體之百分比或SDS-PAGE上的特性無顯著的改變。
蛋白質A純化後有90%回收。
實施例20：抗ICOS Ab對小鼠中A20腫瘤生長的單一治療性效力
當在小鼠A20同基因模型中以單一療法的形式活體內使用時，抗ICOS抗體STIM001 mIgG2a和STIM003 mIgG2a各顯示強力的抗腫瘤效力。
材料和方法
在BALB/c小鼠中使用皮下的A20網狀細胞肉瘤模型(ATCC，TIB-208)執行效力研究。A20細胞株是一種衍生自在年老的BALB/cAnN小鼠中找到的自發性網狀細胞贅生物的BALB/c B細胞淋巴瘤細胞株。已報導此細胞株對ICOSL為陽性。
BALB/c小鼠為>18克由Charles River UK提供並養在無特定病原體條件下。將總共5x10e5個A20細胞(繼代數低於P20)皮下注射至小鼠之右側腹中。試管內繼代A20細胞在PBS中洗滌兩次並再懸浮在補充有10%胎牛血清的RPMI中。確認細胞生存力於腫瘤細胞注射時高於85%。除非另加說明，於腫瘤細胞注射後第8日起始抗體或同型投予。
以小鼠IgG2a同型形式生產STIM001和STIM003抗ICOS抗 體。亦以相同的同型形式(小鼠IgG2a)生產小鼠交叉反應性抗PD-L1抗體(AbW)。於腫瘤細胞移植後第8日開始(第8-29日間給藥3週)一週兩次以200μg的各個抗體腹膜內地(IP)給藥STIM001、STIM003和抗PD-L1抗體。從腫瘤細胞注射日開始一週測量動物重量和腫瘤體積3次。藉由使用經修改的橢圓公式1/2(長×寬2)計算腫瘤體積。將小鼠保持在研究中直到其腫瘤達到12mm的平均直徑。於腫瘤細胞移植後第43日停止實驗。監測腫瘤生長並與使用同型對照組(mIgG2a)抗體治療的動物之腫瘤作比較。治療組在以下表E20中顯示。
結果
STIM001或STIM003(mIgG2a)之單一療法投予在A20腫瘤模型中產生完全抗腫瘤反應(圖32、圖33)。所有以STIM001或STIM003投予的動物皆自疾病被治癒。此與在同型對照組和PD-L1 mIgG2a組中的結果成對比(圖30、圖31)。於極少的例子中，在同型對照組中的一些動物觀 察到腫瘤之消退(自發性消退)且在抗PDL-1組亦如此，但使用抗ICOS抗體治療產生顯著更大的效力。於研究結束時，8隻對照組動物中的3隻和8隻經抗PDL-1治療的動物中的2隻不具有腫瘤。然而，所有以STIM001或STIM003治療的動物於研究結束時皆無腫瘤(兩組中皆8小鼠中的8隻)，代表使用該等抗ICOS抗體的100%治癒。
實施例21：抗ICOS抗體和抗PD-L1抗體之組合在J558骨髓瘤同基因模型中的強活體內抗腫瘤效力
在J558腫瘤模型中個別地和組合地投予抗ICOS抗體STIM003 mIgG2a和抗PD-L1抗體AbW mIgG2a。該模型是骨髓瘤之同基因小鼠模型。當以單一療法給藥或與抗PD-L1組合給藥時，發現該抗ICOS抗體會抑制腫瘤生長。
材料&方法
在Balb/c小鼠中使用皮下J558漿細胞瘤：骨髓瘤細胞株(ATCC，TIB-6)執行抗腫瘤效力研究。Balb/c小鼠為6-8週齡和>18g由Charles River UK提供並養在無特定病原體條件下。將總共5 x 106個細胞(繼代數低於P15)皮下注射(以100μl)至小鼠之右側腹中。除非另加說明，於腫瘤細胞注射後第11日，將動物基於腫瘤大小隨機化並起始治療。藉由使用TrypLETM Express酵素(Thermofisher)試管內繼代J558細胞，在PBS中洗滌兩次並再懸浮在補充有10%胎牛血清的DMEM中。確認細胞生存力於腫瘤細胞注射時高於90%。
於腫瘤達到~140mm^3的平均體積時起始治療。接著將動物分成有類似的平均腫瘤大小之4組(關於給藥組，參見表E-21)。兩種抗體(其等為小鼠交叉反應性)皆從第11日(腫瘤細胞移植後)開始一週IP給藥兩次共3週(圖38)，除非動物由於福祉(極少地)或腫瘤大小而必須自研究移除。作為對照組，一組動物(n=10)在相同的時間使用食鹽水溶液給藥。對於組合組，分別以60μg和200μg同時IP給藥STIM003和抗PDL1抗體兩者(在0.9%食鹽水中)。於37日的期間監測腫瘤生長並比較其與使用食鹽水治療的動物之腫瘤。從腫瘤細胞注射日開始一週測量動物重量和腫瘤體積3次。藉由使用經修改的橢圓公式1/2(長×寬2)計算腫瘤體積。將小鼠保持在研究中直到其腫瘤達到12mm3的平均直徑或(於極少的例子中)當觀察到腫瘤潰瘍形成之發生時(福祉)。
結果
J558同基因腫瘤是高度攻擊性的且於第21日食鹽水對照組 中的所有動物(n=10)皆由於腫瘤大小而必須自研究移除。在此模型中抗STIM003 mIgG2a和該抗PDL1 mIgG2a兩者作為單一療法皆展現良好的效力，其中分別37.5%和75%的動物自疾病治癒。重要地，於第37日，該兩種抗體之組合導致100%的動物已排斥漿細胞瘤腫瘤。數據於圖38中顯示。
實施例22：相較於抗PD-L1抗體，抗PD1之投予顯著增加TIL上的ICOS表現更多
在帶有已建立的CT26腫瘤的動物中執行藥效學研究以評估使用抗PD-L1或抗PD-1抗體的治療對腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之子群上的ICOS表現的功效。比較以下抗體：
˙抗PD-L1 AbW mIgG1[有限的效應功能]
˙抗PD-L1 AbW mIgG2a[具有效應功能]
˙抗PD-L1 10F9.G2大鼠IgG2b[具有效應功能]
˙抗PD1抗體RMT1-14大鼠IgG2a[無效應的]。
分離所治療的小鼠之腫瘤，解離成單細胞並針對CD45、CD3，CD4，CD8、FOXP3和ICOS染色。
材料&方法
於CT26腫瘤模型中藉由於腫瘤細胞移植後第13和15日以130μg i.p.給藥來測試大鼠抗PD-1 RMP1-14 IgG2a(BioXCell；目錄編號：BE0146)、大鼠抗PD-L1 10F9.G2 IgG2b(Bio-Legend；目錄編號：124325)和抗PD-L1 AbW mIgG1和mIgG2a。於第16日，撿選動物並收穫小鼠腫瘤 以用於FACS分析。使用小鼠腫瘤解離套組(Miltenyi Biotec)解離腫瘤並將其等均質化。通過70μM過濾器澄清所得的細胞懸浮液，將其等沈澱並在96孔盤中以2百萬個細胞/孔再懸浮在FACS緩衝液中。以抗16/32mAb(eBioscience)培養細胞懸浮液並以對CD3(17A2)、CD45(30-F11)、CD4(RM4-5)、CD8(53-6.7)和ICOS(7E.17G9)有專一性的FACS抗體(所有皆獲自eBioscience Ltd)染色。亦以LiveDead Yellow可固定生存力染料(Life Technologies)染色細胞。對於Foxp3細胞內染色，固定樣本，使其可滲透化，並以對Foxp3(eBioscience，FJK-16s)有專一性的抗體染色。將樣本再懸浮在PBS中並在Attune流式細胞儀(Invitrogen)上獲取數據並使用FlowJo V10軟體(Treestar)分析。
結果
使用抗PD1和抗PD-L1抗體的治療於測量的時間點於表現ICOS的CD8細胞和T Reg之百分比方面僅造成極小的增加。然而，針對抗PD1大鼠IgG2a之反應，在ICOS+ve CD8細胞之面表上觀察到ICOS表現之清楚且顯著的(超過使用食鹽水治療的組)增加(增加的dMFI)。亦注意到ICOS表現在CD4效應細胞和CD4 T Reg細胞上被向上調節，雖然此未達到統計顯著性。此抗PD1抗體在CD8效應細胞上誘導ICOS表現之顯著增加，其在使用抗PD-L1 mIgG2a時幾乎未見。類似地，當比較抗PD-L1抗體之不同形式時，在一些所治療的動物中觀察到具有最低效應功能的抗體(mIgG1)與效應CD8和CD4細胞上較高的ICOS表現相關(當與具有效應功能的抗體(mIgG2a和大鼠IgG2b)(其等顯示極少顯示此)比較時)。參見圖39。
效應CD8/CD4 T細胞上的ICOS表現之增加可具有致使此等細胞對通過抗ICOS抗體(例如使用STIM003 mIgG2a的小鼠之治療)的耗盡更敏感的功效。在效應CD8和CD4 T細胞中展現較低的ICOS誘導的抗體對於與抗ICOS抗體組合使用而言可以是較佳的。來自此研究的數據指出抗PD-L1功效陽性抗體可特別適用於與抗ICOS功效陽性抗體組合，反映在本文之其他實施例中報導的組合抗PDL1 mIgG2a與STIM003 mIgG2a時所觀察到的抗腫瘤效力。
實施例23：在B細胞淋巴瘤同基因模型中的單劑抗ICOS抗體單一療法之 活體內強力抗腫瘤效力
此實驗確認STIM003 mIgG2a作為單一療法的抗腫瘤效力。於STIM003 mIgG2a之短期暴露後顯現強力的抗腫瘤效力。
材料&方法
在BALB/c小鼠中使用皮下的A20網狀細胞肉瘤模型(ATCC編號CRL-TIB-208)執行效力研究。Balb/c小鼠為6-8週齡和>18g由Charles River UK提供並養在無特定病原體條件下。將總共5x10E5個A20細胞(繼代數低於P20)皮下注射至小鼠之右側腹中。於腫瘤細胞注射後第8日起始治療，如在以下表格中所顯示的。藉由使用TrypLETM Express酵素(Thermofisher)試管內繼代A20細胞，在PBS中洗滌兩次並再懸浮在補充有10%胎牛血清的RPMI中。確認細胞生存力於腫瘤細胞注射時高於85%。以60μg之單劑(SD)(對於20g的動物等於3mg/kg)或以60μg之多劑(MD， 一週兩次共3週)使用STIM003 mIgG2a。比較對該兩種排程反應所觀察到的抗腫瘤效力以及以食鹽水「治療」(MD，一週兩次共3週)的動物之效力。以1mg/ml(於0.9%食鹽水中)腹膜內(IP)給藥該等抗體。從腫瘤細胞注射日開始每週測量動物重量和腫瘤體積3次。藉由使用經修改的橢圓公式1/2(長×寬2)計算腫瘤體積。將小鼠保持在研究中直到其腫瘤達到12mm的平均直徑或(於極少的例子中)當觀察到腫瘤潰瘍形成之發生時(福祉)。
結果
多劑和單劑的STIM003 mIgG2a兩者皆導致強力且顯著的單一療法抗腫瘤效力，如由於終點(第41日)無腫瘤生長之徵兆的動物之數目所顯示的。SD導致10隻動物中的7隻自其疾病被治癒而多劑治癒10隻以A20 B細胞淋巴胚細胞注射的動物中的9隻。於第40日，使用食鹽水治療的組中的所有動物皆由於腫瘤大小而必須自研究移除。參見圖40。
自卡本-麥爾曲線(圖41)使用GraphPad Prism V7.0計算人道終點存活統計。使用此方法以確定治療是否與改善存活相關連。風險比率(Mantel-Haenszel)值和其相關P值(對數秩Mantel-Cox)在以下表格中顯示。
實施例24：在帶有CT-26腫瘤的動物中的抗ICOS抗體之時間和劑量依賴性功效
此實施例呈現評估在帶有CT-26腫瘤的小鼠中抗ICOS抗體對免疫細胞的功效的藥效學研究之結果。於單劑的STIM003 mIgG2a後藉由FACS分析來自不同組織的T和B細胞子類型。
方法
於腫瘤細胞移植後第I2日以食鹽水或STIM003(以200μg、60μg或6μg)i.p給藥帶有CT-26腫瘤的動物。於治療後第1、2、3、4、和 8日收穫腫瘤組織、血液、腫瘤引流淋巴結(TDLN)和脾臟。使用小鼠腫瘤解離套組(Miltenyi Biotec)解離腫瘤以製造單細胞懸浮液。使用溫和的MACS解離來解離脾臟組織，使用RBC溶胞緩衝液溶胞紅血球。機械性分解腫瘤引流淋巴結以製造單細胞懸浮液。透過70μM或40μM過濾器(取決於組織)澄清所得的細胞懸浮液，接著在RMPI完全培養基中洗滌細胞兩次並最終再懸浮在冰冷的FACS緩衝液中。收集全血並放入血漿管中並使用RBC溶胞緩衝液溶胞紅血球，在RMPI完全培養基中洗滌細胞兩次並最終將其再懸浮在冰冷的FACS緩衝液中。將來自所有組織的單細胞懸浮液分配至96深孔盤中以用於FACS分析。使用Live Dead Fixable Yellow生存力染料(Life Technologies)染色細胞。以抗CD16/CD32 mAb(eBioscience)培養細胞懸浮液並以對以下者有專一性的FACS抗體(所有皆獲自eBioscience Ltd.)染色：CD3(17A2)、CD45(30-F11)、CD4(RM4-5)、CD8(53-6.7)、CD25(PC61.5)、ICOSL(HK5.3)、B220(RA3-6B2)、Ki-67(SolA15)、CD107a(eBio1D4B)、IFN-γ(XMG1.2)、TNF-α(MP6-XT22)、Foxp3(FJK-16s)和ICOS(7E.17G9)。對於透過FACS的細胞介素讀數，在布雷非德菌素A之存在下將來自腫瘤的單細胞懸浮液塗盤在24孔盤中4小時。對於細胞內染色，固定樣本，使其等可滲透化，並以專一性抗體染色。最終將樣本再懸浮在PBS中和在Attune流式細胞儀(Invitrogen)上獲得數據並使用FlowJo V10軟體(Treestar)分析。
結果於以下呈現和討論。
在CT26模型中ICOS表現在腫瘤內T-reg上是高的
當比較表現ICOS的腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之百分比與脾臟、血液、和TDLN中的免疫細胞之百分比時，吾人顯示CT-26腫瘤之微環境中較多的免疫細胞表現ICOS(vs其他組織)。更重要地，ICOS陽性T-reg細胞之百分比在所有組織中和於所有時間點皆高於對ICOS為陽性的CD4或CD8效應T細胞之百分比。重要地，在對於ICOS表現為高度陽性的腫瘤內T-reg vs其他TIL子類型之方面，對於ICOS之dMFI(相對表現)亦依循類似的順序。有趣的是，於此實驗之時段內ICOS+ TIL之百分比並無醒目的改變。亦在脾臟和TDLN中看到類似的結果。另一方面，在血液中，ICOS表現於實驗之過程期間在T效應細胞上是相對穩定的但在T-reg上增加。總而言之，此等數據顯示在腫瘤微環境中更多的細胞表現ICOS且此等陽性細胞亦在其表面上表現更多的ICOS分子。更重要地，TIL中的T reg對ICOS為高度陽性。參見圖42。
對STIM003投予反應的腫瘤內T-reg細胞之強力耗盡
針對STIM003 mIgG2a抗體作出反應，在TME中有強力且快速的T-reg細胞(CD4+CD25+Foxp3)之耗盡。因為T-reg相較於其他T細胞子群具有高ICOS表現，預期具有效應功能的抗ICOS抗體會優先耗盡此等細胞。於較低劑量的STIM003(6μg，對於20g動物對應於0.3mg/kg)，有連續的T-reg之耗盡且於第3日大多數T-reg皆自TME耗盡。有趣的是，於第8日，T-reg細胞族群重建(repopulate)TME接著達到稍微高於在經食鹽水治療的動物中觀察到者的水平。T-reg細胞於較低劑量的族群重建可導因於在TME中的增殖性CD4 T細胞之增加，如由觀察到的Ki-67+ CD4 T細胞之 增加證明的。於高於6μg的劑量，在TME中有T-reg細胞之長期耗盡，如由直到此研究中分析的最後時間點(第8日)的完全T Reg耗盡所顯示的。然而，在血液中，於所有劑量皆有T-reg細胞之暫時耗盡。重要地，於第8日，所有經治療的動物當與經食鹽水治療的動物比較時在血液中皆具有類似(或對於6μg劑量為較高)水平的T-reg細胞。數據於圖43中顯示。明顯地，且與先前針對耗盡CTLA-4抗體公開的數據類似地，脾臟或TDLN組織中T-reg細胞之百分比無顯著的改變，暗示T-reg細胞在此等器官中可被保護而免於耗盡。
總結來說，T-reg細胞在TME中的強力耗盡在CT-26模型中是在低至每動物6μg的劑量達成。然而，60μg的劑量導致STIM003 mIgG2a注射後至第8日的長期耗盡。此未由使用較高的劑量(200μg)改善。
STIM003 mIgG2a增加CD8：TRe·g和CD4：T Reg比率
STIM003對T-eff：T-reg比率之功效於圖44中顯示。
STIM003 mIgG2a增加CD8：T-reg比率以及CD4 eff：T-reg比率。雖然所有的治療劑量皆伴隨著T-eff對T-reg的比率之增加，60μg的中間劑量(對於20g動物等於3mg/kg)於治療後第8日伴隨著最高比率。
有趣的是，於6μg劑量，到第4日為止該等比率是高的但於治療後第8日其等與經食鹽水治療的動物者相符。此可由於治療後第8日於此劑量觀察到的TReg之族群重建來解釋。另一方面，於60或200μg的劑量，Teff對T-reg比率於所有時間點皆維持高的。此可由於此等劑量的TReg長時間耗盡解釋。明顯地，於較高的劑量(200μg)，儘管有長期Treg 耗盡，比率於第8日僅有中等的改善。此可由於高的STIM003之濃度的一些ICOSINT效應細胞之耗盡解釋。
總而言之，該等數據顯示於所有所測試的劑量的TReg耗盡和增加的效應細胞：T reg比率。然而，60μg(~3mg/kg)的最理想劑量達成T-reg之長期耗盡以及最高的T-eff對T-reg比率兩者，其等會伴隨著最有利於起始抗腫瘤免疫反應的免疫背景。有趣的是，在血液中觀察到類似的模式，其中60μg的中間劑量伴隨著最高的T-eff對T-reg比率。重要地，在血液中，於較早的時間點(第3日和第4日間)觀察到該比率之改善。
對STIM003反應的效應細胞之活化
先前已鑑認出在腫瘤浸潤性T效應細胞上CD107a的表面表現為已被活化且發揮細胞毒性活性的細胞之可靠的標記[44]。於本研究中利用此標記以確認STIM003(除了耗盡T-reg之外)可在TME中刺激效應T細胞之細胞毒性活性。有趣的是，於治療後第8日，於所有劑量的STIM003在CD4和CD8效應T細胞區室兩者上的CD107a之表面表現皆有增加。此外，此在CD4和CD8 T細胞兩者之表面上的CD107a表現之向上調節於以60μg給藥動物時顯現平線區，因為於200μg給藥未見到改善。
為進一步展示TME中的效應細胞之活化，藉由FACS分析透過CD4和CD8 TIL的細胞介素釋放。如所預期的且與本文先前的實施例中呈現的試管內促效作用數據一致的，STIM003 mIgG2a於所有劑量皆促進透過效應CD4和CD8 T細胞的促發炎性細胞介素IFN-γ和TNF-α生產。促發炎性細胞介素生產之誘導於60μg的最適宜劑量似乎是高的。確實，60 μg的STIM003顯著地增加透過CD4 T細胞的細胞介素生產。對於TME中透過效應CD8 T細胞的促發炎性細胞介素IFN-γ和TNF-α生產，見到類似的趨勢。數據於圖45中顯示。
總結來說，STIM003於所有劑量皆在TME中導致T細胞活化，如由以下者所顯示的：(1)其表面上的去顆粒化標記CD107a之存在和(2)透過T細胞的Th1細胞介素(IFNγ和TNFα)之生產。此顯示STIM003強力地影響TME中的免疫背景且扮演耗盡Treg細胞和刺激T效應細胞之殺死活性的雙重角色。
人類劑量估計
基於在小鼠中見到的臨床前效力數據，可基於對應生物表面積(BSA)對適用於人類患者的臨床劑量作初步預測[45]。
例如，取小鼠中的最理想抗ICOS IgG劑量為3mg/kg(60μg)且按照文獻[45]之方法，用於人類的對應劑量是0.25mg/kg。
使用Mosteller公式，對於60kg和1.70m的個體BSA 1.68m2。將以mg/kg計的劑量乘以35.7(60/1.68)的因數得到15mg的固定劑量。對於80kg的個體，對應固定劑量會是20mg。
可於臨床試驗中針對人類療法最佳化劑量以決定安全且有效的治療攝生法。
實施例25：來自腫瘤樣本的數據之生物資訊分析
一個根據本發明的癌症之目標群組是該等與相對高水平的 ICOS+免疫抑制性TReg相關連的癌症。
為鑑認與高含量的TReg相關連的癌症類型，自癌症基因體圖譜計畫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)公開數據組獲得總轉錄本數據並針對ICOS和FOXP3表現水平作分析。TCGA是一大規模研究，其已將自許多不同癌症類型累積的基因體和總轉錄本數據編成目錄，且包括突變、複本數變化、mRNA和miRNA基因表現、和DNA甲基化以及實質上的樣本詮釋資料。
如下進行基因組富集分析(Gene Set enrichment analysis，GSEA)。以log2(經標準化的_計數+1)自UCSC Xena功能性基因體瀏覽器下載作為TCGA聯盟之一部份收集的基因表現RNA seq數據。自數據組移除非腫瘤組織樣本，留下來自9732個樣本的20530種基因之數據。使用來自[46]的演算法和其在[47]中針對在指定的基因組內的基因計算富集分數的實行以針對各個樣本將基因水平計數轉換成基因組分數。將目標基因組定義成含有ICOS和FOXP3兩者。基於原發性疾病分組樣本並針對各組橫跨33個原發性疾病組比較ssGSEA分數。發現顯示最高中位數分數的疾病組是淋巴贅生物瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、胸腺瘤、頭頸鱗狀細胞癌，雖然瀰漫性大型B細胞淋巴瘤顯示分數之多峰分布，其中一個子群得分高而剩下者得分低於組中位數。
於ICOS和FOXP3表現之最高至最低ssGSEA分數之順位次序中，最高的15種癌症類型為：DLBC(n=48)淋巴贅生物瀰漫性大型B細胞淋巴瘤
THYM(n=120)胸腺瘤
HNSC(n=522)頭頸鱗狀細胞癌
TGCT(n=156)睾丸生殖細胞腫瘤
STAD(n=415)胃腺癌
SKCM(n=473)皮膚黑色素瘤
CESC(n=305)子宮頸鱗狀細胞癌和子宮頸內腺癌
LUAD(n=517)肺腺癌
LAML(n=173)急性骨髓性白血病
ESCA(n=185)食道癌
LUSC(n=502)肺鱗狀細胞癌
READ(n=95)直腸腺癌
COAD(n=288)結腸腺癌
BRCA(n=1104)侵入性乳癌
LIHC(n=373)肝臟肝細胞癌
其中n是TCGA數據組中該癌症類型的患者樣本之數目。可將於本文中描述的抗ICOS抗體用於治療此等和其他癌症。
與相對高水平的ICOS+免疫抑制性TReg相關連且進一步表現PD-L1的癌症可對使用抗ICOS抗體和抗PD-L1抗體之組合的治療反應特佳。適當的治療組和用於此目的的抗體已於先前的敘述中詳述。
使用如上的TCGA數據組，使用Spearman氏順位相關找出ICOS和FOXP3之富集分數與PD-L1之表現水平間的相關性並以原發性疾病指標分組。針對各組計算P值並取0.05的p值(以Bonferroni氏多重比較校正)為統計上顯著的。於ICOS/FOXP3和PD-L1表現間具有最高相關性的疾 病組為以下者：TGCT(n=156)睾丸生殖細胞腫瘤
COAD(n=288)結腸腺癌
READ(n=95)直腸腺癌
BLCA(n=407)膀胱泌尿上皮癌
OV(n=308)卵巢漿液性囊腺癌
BRCA(n=1104)侵入性乳癌
SKCM(n=473)皮膚之皮膚黑色素瘤
CESC(n=305)子宮頸鱗狀細胞癌和子宮頸內腺癌
STAD(n=415)胃腺癌
LUAD(n=517)肺腺癌
可根據確定其癌症伴隨有ICOS+免疫抑制性TReg和PD-L1之表現的分析選擇患者以進行治療。對於(如上)有高相關性分數的癌症類型，可能足以確定存在有ICOS+免疫抑制性TReg和PD-L1表現中之一者(例如超過閾值)。可於此背景下使用PD-L1免疫組織化學分析。
實施例26：進一步抗ICOS抗體之評估
合成於實施例12中鑑認的CL-74570和CL-61091抗體序列並以IgG1形式在HEK細胞中表現。
使用類似於在實施例6中描述者且經修改以使之適用於經純化IgG1而非BCT上清液的HTRF分析執行此等抗體之功能性定性。使用5μl含有自HEK細胞表現的人類IgG1抗體的上清液取代BCT上清液，並 如之前使用HTRF緩衝液使總體積補足每孔20μl。使用人類IgG1抗體作為陰性對照組。兩種抗體對於與人類和小鼠ICOS之結合皆展現大於5%功效(如使用方程式1計算的)且因此於此分析中被確認為測試陽性。
進一步使用Mirrorball分析確認此等抗體結合表現在CHO-S細胞之表面上的人類和小鼠ICOS的能力。於此分析中，將5μl含有該抗ICOS IgG1的上清液轉移至384mirrorball黑色盤(Corning)之各個孔中。藉由將10μl在分析緩衝液(PBS+1%BSA+0.1%疊氮化鈉)中以0.8mg/mL的濃度稀釋的山羊抗人類488(Jackson ImmunoResearch)加至孔來偵測抗ICOS抗體之結合。
對於陽性對照組孔，將5μL在分析培養基中稀釋至2.2μg/mL的參考抗體加至盤。對於陰性對照組孔，將5μL在分析培養基中稀釋至2.2μg/mL的混合對照組IgG1加至盤。將10μM的DRAQ5(Thermoscientific)加至0.4 X 106個/ml再懸浮在分析緩衝液中的細胞並將5μl加至所有孔。於4度下培養盤2hr。
使用Mirrorball讀盤機(TTP Labtech)測量螢光強度，測量來自500-700個單細胞的群體的Alexafluor 488(激發493nm，發射519nm)。以中位數(FL2)平均強度測量分析訊號。
使用2.2μg/mL的分析濃度的參考抗體定義總結合。使用2.22μg/mL的分析濃度的混合對照組hIgG1定義非專一性結合。兩種抗體皆展現大於百分之1的功效且因此於此分析中被確認為測試陽性。
Figure 106126908-A0202-12-0212-1879
CL-74570和CL-61091之各者亦展現與在CHO-S細胞上表現的人類和小鼠ICOS之結合，如藉由流式細胞測量術測定的。使用類似於在實施例6中描述者且經修改以使之適用於經純化IgG1而非BCT上清液的方法執行FACS篩選。兩種抗體皆展現超過陰性對照組與hICOS、mICOS和WT CHO細胞之結合之幾何平均值之平均>10倍的結合。
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序列
抗體STIM001
VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：367
Figure 106126908-A0202-12-0218-1882
VH域胺基酸序列：SEQ ID NO：366 QVQVVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTFGITWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTNYAQNLQGRVIMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSSGHYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
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VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：374
Figure 106126908-A0202-12-0218-1880
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抗體STIM002
VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：381
Figure 106126908-A0202-12-0218-1881
Figure 106126908-A0202-12-0219-1883
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VL域核苷酸序列：388
Figure 106126908-A0202-12-0219-1884
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Figure 106126908-A0202-12-0219-1885
VL域胺基酸序列：SEQ ID NO：387 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSTRASGFPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLSFGQGTKLEIK
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抗體STIM002-B
VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：395
Figure 106126908-A0202-12-0219-1886
Figure 106126908-A0202-12-0220-1887
VH域胺基酸序列：SEQ ID NO：394 QVQLVQSGGEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGFSWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSTYFYGSGTLYGMDVWGQGTTVTVSS
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VH CDR3胺基酸序列：ARSTYFYGSGTLYGMDV SEQ ID NO：393
VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：402
Figure 106126908-A0202-12-0220-1888
VL域胺基酸序列：SEQ ID NO：401 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGYNCLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSTRASGFPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPCSFGQGTKLEIK
VL CDR1胺基酸序列：QSLLHSDGYNC SEQ ID NO：398
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VL CDR3胺基酸序列：MQALQTPCS SEQ ID NO：400
抗體STIM003
VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：409
Figure 106126908-A0202-12-0220-1889
經校正的STIM003 VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：521
Figure 106126908-A0202-12-0220-1890
Figure 106126908-A0202-12-0221-1891
VH域胺基酸序列：SEQ ID NO：408 EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCVASGVTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGDTDYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDFYGSGSYYHVPFDYWGQGILVTVSS
VH CDR1胺基酸序列：GVTFDDYG SEQ ID NO：405
VH CDR2胺基酸序列：INWNGGDT SEQ ID NO：406
VH CDR3胺基酸序列：ARDFYGSGSYYHVPFDY SEQ ID NO：407
VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：416
Figure 106126908-A0202-12-0221-1892
VL域胺基酸序列：SEQ ID NO：415 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKRGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGDGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCHQYDMSPFTFGPGTKVDIK
VL CDR1胺基酸序列：QSVSRSY SEQ ID NO：412
VL CDR2胺基酸序列：GAS SEQ ID NO：413
VL CDR3胺基酸序列：HQYDMSPFT SEQ ID NO：414
抗體STIM004
VH域核苷酸序列：
Figure 106126908-A0202-12-0221-1893
Figure 106126908-A0202-12-0221-1968
SEQ ID NO：423
VH域胺基酸序列： EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGLTFDDYGMSWVRQVPGKGLEWVSGINWNGDNTDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDYYGSGSYYNVPFDYWGOGTLVTVSS SEQ ID NO：422
VH CDR1胺基酸序列：GLTFDDYG SEQ ID NO：419
VH CDR2胺基酸序列：INWNGDNT SEQ ID NO：420
VH CDR3胺基酸序列：ARDYYGSGSYYNVPFDY SEQ ID NO：421
VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：431
Figure 106126908-A0202-12-0222-1895
VL域胺基酸序列，如由以上VL域核苷酸序列編碼的。
經校正的VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：430
Figure 106126908-A0202-12-0222-1896
經校正的VL域胺基酸序列：SEQ ID NO：432 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIRRLEPEDFAVYYCQQYGSSPFFGPGTKVDIK
VL CDR1胺基酸序列：QSVSSSY SEQ ID NO：426
VL CDR2胺基酸序列：GAS SEQ ID NO：427
VL CDR3胺基酸序列：QQYGSSPF SEQ ID NO：428
抗體STIM005
VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：439
Figure 106126908-A0202-12-0222-1897
VH域胺基酸序列：SEQ ID NO：438 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYGIIWVRQAPGQGLEWMGWISVHNGNTNCAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRTDDTAVYYCARAGYDILTDFSDAFDIWGHGTMVTVSS
VH CDR1胺基酸序列：GYTFNSYG SEQ ID NO：435
VH CDR2胺基酸序列：ISVHNGNT SEQ ID NO：436
VH CDR3胺基酸序列：ARAGYDILTDFSDAFDI SEQ ID NO：437
VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：446
Figure 106126908-A0202-12-0223-1898
VL域胺基酸序列：SEQ ID NO：445 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNFLNWYQQKEGKGPKLLIYAASSLQRGIPSTFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYICQQSYGIPWVGQGTKVEIK
VL CDR1胺基酸序列：QNINNF SEQ ID NO：442
VL CDR2胺基酸序列：AAS SEQ ID NO：443
VL CDR3胺基酸序列：QQSYGIPW SEQ ID NO：444
抗體STIM006
VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：453
Figure 106126908-A0202-12-0223-1899
VH域胺基酸序列：SEQ ID NO：454 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVRGRFTISRDNAKYSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARDHYDGSGIYPLYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
VH CDR1胺基酸序列：GFTFSDYF SEQ ID NO：449
VH CDR2胺基酸序列：ISSSGSTI SEQ ID NO：450
VH CDR3胺基酸序列：ARDHYDGSGIYPLYYYYGLDV SEQ ID NO：451
VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：460
Figure 106126908-A0202-12-0224-1900
VL域胺基酸序列：SEQ ID NO：459 IVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDYYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRSFGQGTTLEIK
VL CDR1胺基酸序列：QSLLHSNGYNY SEQ ID NO：456
VL CDR2胺基酸序列：LGS SEQ ID NO：457
VL CDR3胺基酸序列：MQALQTPRS SEQ ID NO：458
抗體STIM007
VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：467
Figure 106126908-A0202-12-0224-1901
VH域胺基酸序列：SEQ ID NO：466 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTTGVGVGWIRQPPGKALEWLAVIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYFCTHGYGSASYYHYGMDVWGQGTTVTVSS
VH CDR1胺基酸序列：GFSLSTTGVG SEQ ID NO：463
VH CDR2胺基酸序列：IYWDDDK SEQ ID NO：464
VH CDR3胺基酸序列：THGYGSASYYHYGMDV SEQ ID NO：465
VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：474
Figure 106126908-A0202-12-0224-1902
VL域胺基酸序列：SEQ ID NO：473 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVTNYLAWHQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCQHRSNWPLTFGGGTKVEIK
VL CDR1胺基酸序列：QSVTNY SEQ ID NO：470
VL CDR2胺基酸序列：DAS SEQ ID NO：471
VL CDR3胺基酸序列：QHRSNWPLT SEQ ID NO：472
抗體STIM008
VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：481
Figure 106126908-A0202-12-0225-1903
VH域胺基酸序列：SEQ ID NO：480 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLAVIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYFCTHGYGSASYYHYGMDVWGQGTTVTVSS
VH CDR1胺基酸序列：GFSLSTSGVG SEQ ID NO：477
VH CDR2胺基酸序列：IYWDDDK SEQ ID NO：478
VH CDR3胺基酸序列：THGYGSASYYHYGMDV SEQ ID NO：479
VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：488
Figure 106126908-A0202-12-0225-1904
VL域胺基酸序列：SEQ ID NO：489 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVTNYLAWHQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
VL CDR1胺基酸序列：QSVTNY SEQ ID NO：484
VL CDR2胺基酸序列：DAS SEQ ID NO：485
VL CDR3胺基酸序列：OQRSNWPLT SEQ ID NO：486
抗體STIM009
VH域核苷酸序列：SEQ ID NO：495
Figure 106126908-A0202-12-0226-1905
VH域胺基酸序列：SEQ ID NO：494 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQINSLRAEDTAVYYCARDFYDILTDSPYFYYGVDVWGQGTTVTVSS
VH CDR1胺基酸序列：GFTFSDYY SEQ ID NO：491
VH CDR2胺基酸序列：ISSSGSTI SEQ ID NO：492
VH CDR3胺基酸序列：ARDFYDILTDSPYFYYGVDV SEQ ID NO：493
VL域核苷酸序列：SEQ ID NO：502
Figure 106126908-A0202-12-0226-1906
VL域胺基酸序列：SEQ ID NO：501 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
VL CDR1胺基酸序列：QSLLHSNGYNY SEQ ID NO：498
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<213> 食蟹獼猴
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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Figure 106126908-A0305-02-0435-25
Figure 106126908-A0305-02-0436-26
Figure 106126908-A0305-02-0437-27
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 26
Figure 106126908-A0305-02-0442-39
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<213> 智人
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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Figure 106126908-A0305-02-0447-51
Figure 106126908-A0305-02-0448-52
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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Figure 106126908-A0305-02-0455-70
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<213> 智人
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Figure 106126908-A0305-02-0458-74
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<213> 智人
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<400> 69
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Figure 106126908-A0305-02-0472-105
Figure 106126908-A0305-02-0473-106
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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Figure 106126908-A0305-02-0474-109
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<212> PRT
<213> 智人
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Figure 106126908-A0305-02-0474-110
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Figure 106126908-A0305-02-0474-111
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<213> 智人
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Figure 106126908-A0305-02-0474-112
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Figure 106126908-A0305-02-0475-113
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Figure 106126908-A0305-02-0476-115
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<213> 智人
<400> 80
Figure 106126908-A0305-02-0476-116
Figure 106126908-A0305-02-0477-117
Figure 106126908-A0305-02-0478-118
<210> 81
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 81
Figure 106126908-A0305-02-0479-119
<210> 82
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Figure 106126908-A0305-02-0480-120
<210> 83
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Figure 106126908-A0305-02-0480-121
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Figure 106126908-A0305-02-0480-122
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Figure 106126908-A0305-02-0480-123
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Figure 106126908-A0305-02-0480-125
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Figure 106126908-A0305-02-0481-126
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Figure 106126908-A0305-02-0481-127
<210> 89
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 89
Figure 106126908-A0305-02-0482-128
<210> 90
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Figure 106126908-A0305-02-0482-129
Figure 106126908-A0305-02-0483-130
<210> 91
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
Figure 106126908-A0305-02-0483-131
Figure 106126908-A0305-02-0484-132
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Figure 106126908-A0305-02-0484-133
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Figure 106126908-A0305-02-0484-134
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Figure 106126908-A0305-02-0484-135
<210> 95
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Figure 106126908-A0305-02-0484-136
Figure 106126908-A0305-02-0485-137
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Figure 106126908-A0305-02-0485-138
<210> 97
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Figure 106126908-A0305-02-0485-139
<210> 98
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Figure 106126908-A0305-02-0485-140
Figure 106126908-A0305-02-0486-141
<210> 99
<211> 346
<212> DNA
<213> 智人
<400> 99
Figure 106126908-A0305-02-0486-142
<210> 100
<211> 445
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Figure 106126908-A0305-02-0486-143
Figure 106126908-A0305-02-0487-144
Figure 106126908-A0305-02-0488-145
<210> 101
<211> 1335
<212> DNA
<213> 智人
<400> 101
Figure 106126908-A0305-02-0489-146
Figure 106126908-A0305-02-0490-147
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Figure 106126908-A0305-02-0490-148
<210> 103
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Figure 106126908-A0305-02-0490-149
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Figure 106126908-A0305-02-0490-150
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Figure 106126908-A0305-02-0490-151
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Figure 106126908-A0305-02-0491-152
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Figure 106126908-A0305-02-0491-153
<210> 108
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
Figure 106126908-A0305-02-0491-154
Figure 106126908-A0305-02-0492-155
<210> 109
<211> 337
<212> DNA
<213> 智人
<400> 109
Figure 106126908-A0305-02-0492-156
<210> 110
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Figure 106126908-A0305-02-0492-157
Figure 106126908-A0305-02-0493-158
<210> 111
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人
<400> 111
Figure 106126908-A0305-02-0493-159
Figure 106126908-A0305-02-0494-160
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Figure 106126908-A0305-02-0494-161
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Figure 106126908-A0305-02-0494-162
<210> 114
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Figure 106126908-A0305-02-0495-163
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Figure 106126908-A0305-02-0495-164
<210> 116
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Figure 106126908-A0305-02-0495-165
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Figure 106126908-A0305-02-0495-166
<210> 118
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Figure 106126908-A0305-02-0495-168
Figure 106126908-A0305-02-0496-169
<210> 119
<211> 358
<212> DNA
<213> 智人
<400> 119
Figure 106126908-A0305-02-0496-170
<210> 120
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Figure 106126908-A0305-02-0497-171
Figure 106126908-A0305-02-0498-172
Figure 106126908-A0305-02-0499-173
<210> 121
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 121
Figure 106126908-A0305-02-0499-174
Figure 106126908-A0305-02-0500-175
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Figure 106126908-A0305-02-0500-176
<210> 123
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Figure 106126908-A0305-02-0500-177
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
Figure 106126908-A0305-02-0501-178
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Figure 106126908-A0305-02-0501-179
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Figure 106126908-A0305-02-0501-180
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Figure 106126908-A0305-02-0501-181
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Figure 106126908-A0305-02-0501-182
Figure 106126908-A0305-02-0502-183
<210> 129
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 129
Figure 106126908-A0305-02-0502-184
<210> 130
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 130
Figure 106126908-A0305-02-0503-185
Figure 106126908-A0305-02-0504-186
<210> 131
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人
<400> 131
Figure 106126908-A0305-02-0504-187
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 132
Figure 106126908-A0305-02-0504-188
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
Figure 106126908-A0305-02-0505-189
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 134
Figure 106126908-A0305-02-0505-190
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
Figure 106126908-A0305-02-0505-191
<210> 136
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
Figure 106126908-A0305-02-0505-192
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
Figure 106126908-A0305-02-0506-193
<210> 138
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Figure 106126908-A0305-02-0506-194
<210> 139
<211> 355
<212> DNA
<213> 智人
<400> 139
Figure 106126908-A0305-02-0507-195
<210> 140
<211> 448
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Figure 106126908-A0305-02-0507-196
Figure 106126908-A0305-02-0508-197
Figure 106126908-A0305-02-0509-198
<210> 141
<211> 1344
<212> DNA
<213> 智人
<400> 141
Figure 106126908-A0305-02-0509-199
Figure 106126908-A0305-02-0510-200
<210> 142
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Figure 106126908-A0305-02-0510-201
<210> 143
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Figure 106126908-A0305-02-0511-202
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Figure 106126908-A0305-02-0511-203
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Figure 106126908-A0305-02-0511-204
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Figure 106126908-A0305-02-0511-205
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
Figure 106126908-A0305-02-0511-206
Figure 106126908-A0305-02-0512-207
<210> 148
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
Figure 106126908-A0305-02-0512-208
<210> 149
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 149
Figure 106126908-A0305-02-0512-209
Figure 106126908-A0305-02-0513-210
<210> 150
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Figure 106126908-A0305-02-0513-211
Figure 106126908-A0305-02-0514-212
<210> 151
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人
<400> 151
Figure 106126908-A0305-02-0514-213
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Figure 106126908-A0305-02-0515-214
<210> 153
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Figure 106126908-A0305-02-0515-215
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Figure 106126908-A0305-02-0515-216
<210> 155
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Figure 106126908-A0305-02-0515-217
<210> 156
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
Figure 106126908-A0305-02-0516-218
<210> 157
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
Figure 106126908-A0305-02-0516-219
<210> 158
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
Figure 106126908-A0305-02-0516-220
Figure 106126908-A0305-02-0517-221
<210> 159
<211> 346
<212> DNA
<213> 智人
<400> 159
Figure 106126908-A0305-02-0517-222
<210> 160
<211> 445
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Figure 106126908-A0305-02-0517-223
Figure 106126908-A0305-02-0518-224
Figure 106126908-A0305-02-0519-225
<210> 161
<211> 1335
<212> DNA
<213> 智人
<400> 161
Figure 106126908-A0305-02-0519-226
Figure 106126908-A0305-02-0520-227
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Figure 106126908-A0305-02-0521-228
<210> 163
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Figure 106126908-A0305-02-0521-229
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Figure 106126908-A0305-02-0521-230
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Figure 106126908-A0305-02-0521-231
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Figure 106126908-A0305-02-0522-232
<210> 167
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
Figure 106126908-A0305-02-0522-233
<210> 168
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
Figure 106126908-A0305-02-0522-234
<210> 169
<211> 337
<212> DNA
<213> 智人
<400> 169
Figure 106126908-A0305-02-0523-235
<210> 170
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 170
Figure 106126908-A0305-02-0523-236
Figure 106126908-A0305-02-0524-237
<210> 171
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人
<400> 171
Figure 106126908-A0305-02-0524-238
Figure 106126908-A0305-02-0525-239
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
Figure 106126908-A0305-02-0525-240
<210> 173
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
Figure 106126908-A0305-02-0525-241
<210> 174
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 174
Figure 106126908-A0305-02-0525-243
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 175
Figure 106126908-A0305-02-0526-244
<210> 176
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 176
Figure 106126908-A0305-02-0526-245
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 177
Figure 106126908-A0305-02-0526-246
<210> 178
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
Figure 106126908-A0305-02-0526-247
Figure 106126908-A0305-02-0527-249
<210> 179
<211> 361
<212> DNA
<213> 智人
<400> 179
Figure 106126908-A0305-02-0527-250
<210> 180
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 180
Figure 106126908-A0305-02-0527-251
Figure 106126908-A0305-02-0528-252
Figure 106126908-A0305-02-0529-253
Figure 106126908-A0305-02-0530-254
<210> 181
<211> 1350
<212> DNA
<213> 智人
<400> 181
Figure 106126908-A0305-02-0530-255
Figure 106126908-A0305-02-0531-256
<210> 182
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 182
Figure 106126908-A0305-02-0531-257
<210> 183
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 183
Figure 106126908-A0305-02-0531-258
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 184
Figure 106126908-A0305-02-0531-259
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 185
Figure 106126908-A0305-02-0532-260
<210> 186
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 186
Figure 106126908-A0305-02-0532-261
<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 187
Figure 106126908-A0305-02-0532-262
<210> 188
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 188
Figure 106126908-A0305-02-0532-263
Figure 106126908-A0305-02-0533-264
<210> 189
<211> 340
<212> DNA
<213> 智人
<400> 189
Figure 106126908-A0305-02-0533-265
<210> 190
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 190
Figure 106126908-A0305-02-0533-266
Figure 106126908-A0305-02-0534-267
Figure 106126908-A0305-02-0535-268
<210> 191
<211> 660
<212> DNA
<213> 智人
<400> 191
Figure 106126908-A0305-02-0535-269
<210> 192
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 192
Figure 106126908-A0305-02-0535-270
Figure 106126908-A0305-02-0536-271
<210> 193
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 193
Figure 106126908-A0305-02-0536-272
Figure 106126908-A0305-02-0537-273
Figure 106126908-A0305-02-0538-274
<210> 194
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 194
Figure 106126908-A0305-02-0538-275
Figure 106126908-A0305-02-0539-276
<210> 195
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 195
Figure 106126908-A0305-02-0539-277
Figure 106126908-A0305-02-0540-278
<210> 196
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 196
Figure 106126908-A0305-02-0541-279
<210> 197
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 197
Figure 106126908-A0305-02-0541-280
Figure 106126908-A0305-02-0542-281
Figure 106126908-A0305-02-0543-282
<210> 198
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 198
Figure 106126908-A0305-02-0543-283
Figure 106126908-A0305-02-0544-284
<210> 199
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 199
Figure 106126908-A0305-02-0544-285
Figure 106126908-A0305-02-0545-286
Figure 106126908-A0305-02-0546-287
<210> 200
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 200
Figure 106126908-A0305-02-0546-288
<210> 201
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 201
Figure 106126908-A0305-02-0547-289
<210> 202
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 202
Figure 106126908-A0305-02-0547-290
Figure 106126908-A0305-02-0548-291
<210> 203
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 203
Figure 106126908-A0305-02-0548-292
Figure 106126908-A0305-02-0549-293
Figure 106126908-A0305-02-0550-294
<210> 204
<211> 990
<212> DNA
<213> 智人
<400> 204
Figure 106126908-A0305-02-0550-295
Figure 106126908-A0305-02-0551-296
<210> 205
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 205
Figure 106126908-A0305-02-0551-297
Figure 106126908-A0305-02-0552-298
Figure 106126908-A0305-02-0553-299
<210> 206
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 206
Figure 106126908-A0305-02-0553-300
<210> 207
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 207
Figure 106126908-A0305-02-0553-301
Figure 106126908-A0305-02-0554-302
<210> 208
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 208
Figure 106126908-A0305-02-0554-303
<210> 209
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 209
Figure 106126908-A0305-02-0554-304
Figure 106126908-A0305-02-0555-305
<210> 210
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 210
Figure 106126908-A0305-02-0555-306
<210> 211
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 211
Figure 106126908-A0305-02-0555-307
Figure 106126908-A0305-02-0556-308
<210> 212
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 212
Figure 106126908-A0305-02-0556-309
<210> 213
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 213
Figure 106126908-A0305-02-0556-310
Figure 106126908-A0305-02-0557-311
<210> 214
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 214
Figure 106126908-A0305-02-0557-312
<210> 215
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 215
Figure 106126908-A0305-02-0557-313
Figure 106126908-A0305-02-0558-314
<210> 216
<211> 312
<212> DNA
<213> 智人
<400> 216
Figure 106126908-A0305-02-0558-315
<210> 217
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 217
Figure 106126908-A0305-02-0559-316
<210> 218
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 218
Figure 106126908-A0305-02-0559-318
<210> 219
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 219
Figure 106126908-A0305-02-0560-319
<210> 220
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 220
Figure 106126908-A0305-02-0560-320
Figure 106126908-A0305-02-0561-321
<210> 221
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 221
Figure 106126908-A0305-02-0561-322
<210> 222
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 222
Figure 106126908-A0305-02-0561-323
<210> 223
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 223
Figure 106126908-A0305-02-0561-324
Figure 106126908-A0305-02-0562-325
<210> 224
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 224
Figure 106126908-A0305-02-0562-326
<210> 225
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 225
Figure 106126908-A0305-02-0563-327
<210> 226
<211> 312
<212> DNA
<213> 智人
<400> 226
Figure 106126908-A0305-02-0563-328
<210> 227
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 227
Figure 106126908-A0305-02-0564-329
<210> 228
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 228
Figure 106126908-A0305-02-0564-330
Figure 106126908-A0305-02-0565-331
<210> 229
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 229
Figure 106126908-A0305-02-0565-332
<210> 230
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 230
Figure 106126908-A0305-02-0565-333
Figure 106126908-A0305-02-0566-334
<210> 231
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 231
Figure 106126908-A0305-02-0566-335
<210> 232
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 232
Figure 106126908-A0305-02-0566-336
Figure 106126908-A0305-02-0567-337
<210> 233
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 233
Figure 106126908-A0305-02-0567-338
<210> 234
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 234
Figure 106126908-A0305-02-0568-339
<210> 235
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 235
Figure 106126908-A0305-02-0568-340
<210> 236
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 236
Figure 106126908-A0305-02-0569-341
<210> 237
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 237
Figure 106126908-A0305-02-0569-342
Figure 106126908-A0305-02-0570-343
<210> 238
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 238
Figure 106126908-A0305-02-0570-344
<210> 239
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 239
Figure 106126908-A0305-02-0570-345
<210> 240
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 240
Figure 106126908-A0305-02-0570-346
<210> 241
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 241
Figure 106126908-A0305-02-0570-347
<210> 242
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 242
Figure 106126908-A0305-02-0571-348
<210> 243
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 243
Figure 106126908-A0305-02-0571-349
<210> 244
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 244
Figure 106126908-A0305-02-0571-350
Figure 106126908-A0305-02-0572-351
<210> 245
<211> 370
<212> DNA
<213> 智人
<400> 245
Figure 106126908-A0305-02-0572-352
<210> 246
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<400> 246
Figure 106126908-A0305-02-0572-353
Figure 106126908-A0305-02-0573-354
Figure 106126908-A0305-02-0574-355
Figure 106126908-A0305-02-0575-356
<210> 247
<211> 1359
<212> DNA
<213> 智人
<400> 247
Figure 106126908-A0305-02-0575-357
Figure 106126908-A0305-02-0576-358
<210> 248
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 248
Figure 106126908-A0305-02-0576-359
<210> 249
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 249
Figure 106126908-A0305-02-0576-360
<210> 250
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 250
Figure 106126908-A0305-02-0576-361
<210> 251
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 251
Figure 106126908-A0305-02-0577-362
<210> 252
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 252
Figure 106126908-A0305-02-0577-363
<210> 253
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 253
Figure 106126908-A0305-02-0577-364
<210> 254
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 254
Figure 106126908-A0305-02-0577-365
Figure 106126908-A0305-02-0578-366
<210> 255
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 255
Figure 106126908-A0305-02-0578-367
<210> 256
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 256
Figure 106126908-A0305-02-0578-368
Figure 106126908-A0305-02-0579-369
<210> 257
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人
<400> 257
Figure 106126908-A0305-02-0580-370
<210> 258
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 258
Figure 106126908-A0305-02-0580-371
<210> 259
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 259
Figure 106126908-A0305-02-0580-372
<210> 260
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 260
Figure 106126908-A0305-02-0581-373
<210> 261
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 261
Figure 106126908-A0305-02-0581-374
<210> 262
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 262
Figure 106126908-A0305-02-0581-375
<210> 263
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 263
Figure 106126908-A0305-02-0581-376
<210> 264
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 264
Figure 106126908-A0305-02-0582-377
<210> 265
<211> 370
<212> DNA
<213> 智人
<400> 265
Figure 106126908-A0305-02-0582-378
Figure 106126908-A0305-02-0583-379
<210> 266
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<400> 266
Figure 106126908-A0305-02-0583-380
Figure 106126908-A0305-02-0584-381
Figure 106126908-A0305-02-0585-382
<210> 267
<211> 1359
<212> DNA
<213> 智人
<400> 267
Figure 106126908-A0305-02-0585-383
Figure 106126908-A0305-02-0586-384
<210> 268
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 268
Figure 106126908-A0305-02-0586-385
<210> 269
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 269
Figure 106126908-A0305-02-0586-386
<210> 270
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 270
Figure 106126908-A0305-02-0587-387
<210> 271
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 271
Figure 106126908-A0305-02-0587-388
<210> 272
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 272
Figure 106126908-A0305-02-0587-389
<210> 273
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 273
Figure 106126908-A0305-02-0587-390
<210> 274
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 274
Figure 106126908-A0305-02-0588-391
<210> 275
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 275
Figure 106126908-A0305-02-0588-392
<210> 276
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 276
Figure 106126908-A0305-02-0589-393
Figure 106126908-A0305-02-0590-394
<210> 277
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人
<400> 277
Figure 106126908-A0305-02-0590-395
<210> 278
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 278
Figure 106126908-A0305-02-0590-396
<210> 279
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 279
Figure 106126908-A0305-02-0591-397
<210> 280
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 280
Figure 106126908-A0305-02-0591-398
<210> 281
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 281
Figure 106126908-A0305-02-0591-399
<210> 282
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 282
Figure 106126908-A0305-02-0591-400
<210> 283
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 283
Figure 106126908-A0305-02-0592-401
<210> 284
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 284
Figure 106126908-A0305-02-0592-402
<210> 285
<211> 358
<212> DNA
<213> 智人
<400> 285
Figure 106126908-A0305-02-0593-403
<210> 286
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 286
Figure 106126908-A0305-02-0593-404
Figure 106126908-A0305-02-0594-405
Figure 106126908-A0305-02-0595-406
<210> 287
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 287
Figure 106126908-A0305-02-0595-407
Figure 106126908-A0305-02-0596-408
<210> 288
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 288
Figure 106126908-A0305-02-0597-409
<210> 289
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 289
Figure 106126908-A0305-02-0597-410
<210> 290
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 290
Figure 106126908-A0305-02-0597-411
<210> 291
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 291
Figure 106126908-A0305-02-0597-412
<210> 292
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 292
Figure 106126908-A0305-02-0597-413
<210> 293
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 293
Figure 106126908-A0305-02-0598-414
<210> 294
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 294
Figure 106126908-A0305-02-0598-415
<210> 295
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 295
Figure 106126908-A0305-02-0599-416
<210> 296
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 296
Figure 106126908-A0305-02-0599-417
Figure 106126908-A0305-02-0600-418
<210> 297
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人
<400> 297
Figure 106126908-A0305-02-0600-419
Figure 106126908-A0305-02-0601-420
<210> 298
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 298
Figure 106126908-A0305-02-0601-421
Figure 106126908-A0305-02-0602-422
<210> 299
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<400> 299
Figure 106126908-A0305-02-0602-423
Figure 106126908-A0305-02-0603-424
Figure 106126908-A0305-02-0604-425
<210> 300
<211> 347
<212> PRT
<213> 智人
<400> 300
Figure 106126908-A0305-02-0605-426
Figure 106126908-A0305-02-0606-427
<210> 301
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 301
Figure 106126908-A0305-02-0606-428
Figure 106126908-A0305-02-0607-429
<210> 302
<211> 586
<212> PRT
<213> 智人
<400> 302
Figure 106126908-A0305-02-0607-430
Figure 106126908-A0305-02-0608-431
Figure 106126908-A0305-02-0609-432
Figure 106126908-A0305-02-0610-433
<210> 303
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 303
Figure 106126908-A0305-02-0610-434
<210> 304
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 304
Figure 106126908-A0305-02-0611-435
<210> 305
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 305
Figure 106126908-A0305-02-0611-436
<210> 306
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 306
Figure 106126908-A0305-02-0611-437
<210> 307
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 307
Figure 106126908-A0305-02-0611-438
<210> 308
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 308
Figure 106126908-A0305-02-0612-439
<210> 309
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 309
Figure 106126908-A0305-02-0612-440
<210> 310
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 310
Figure 106126908-A0305-02-0612-442
<210> 311
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 311
Figure 106126908-A0305-02-0612-443
<210> 312
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 312
Figure 106126908-A0305-02-0613-444
<210> 313
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 313
Figure 106126908-A0305-02-0613-445
<210> 314
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 314
Figure 106126908-A0305-02-0613-446
<210> 315
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 315
Figure 106126908-A0305-02-0613-447
<210> 316
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 316
Figure 106126908-A0305-02-0614-448
<210> 317
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 317
Figure 106126908-A0305-02-0614-449
<210> 318
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 318
Figure 106126908-A0305-02-0614-450
<210> 319
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 319
Figure 106126908-A0305-02-0614-451
<210> 320
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 320
Figure 106126908-A0305-02-0615-452
<210> 321
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 321
Figure 106126908-A0305-02-0615-453
<210> 322
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 322
Figure 106126908-A0305-02-0615-454
<210> 323
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 323
Figure 106126908-A0305-02-0615-455
<210> 324
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 324
Figure 106126908-A0305-02-0616-456
<210> 325
<211> 290
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 325
Figure 106126908-A0305-02-0616-457
Figure 106126908-A0305-02-0617-458
Figure 106126908-A0305-02-0618-459
<210> 326
<211> 226
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 326
Figure 106126908-A0305-02-0618-460
Figure 106126908-A0305-02-0619-461
<210> 327
<211> 251
<212> PRT
<213> 智人
<400> 327
Figure 106126908-A0305-02-0619-462
Figure 106126908-A0305-02-0620-463
Figure 106126908-A0305-02-0621-464
<210> 328
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人
<400> 328
Figure 106126908-A0305-02-0621-465
Figure 106126908-A0305-02-0622-466
Figure 106126908-A0305-02-0623-467
<210> 329
<211> 347
<212> PRT
<213> 智人
<400> 329
Figure 106126908-A0305-02-0624-468
Figure 106126908-A0305-02-0625-469
<210> 330
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人
<400> 330
Figure 106126908-A0305-02-0625-470
Figure 106126908-A0305-02-0626-471
<210> 331
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 331
Figure 106126908-A0305-02-0626-472
Figure 106126908-A0305-02-0627-473
<210> 332
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 332
Figure 106126908-A0305-02-0627-474
Figure 106126908-A0305-02-0628-475
<210> 333
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 333
Figure 106126908-A0305-02-0628-476
Figure 106126908-A0305-02-0629-477
<210> 334
<211> 171
<212> PRT
<213> 智人
<400> 334
Figure 106126908-A0305-02-0629-478
Figure 106126908-A0305-02-0630-479
<210> 335
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人
<400> 335
Figure 106126908-A0305-02-0630-480
Figure 106126908-A0305-02-0631-481
<210> 336
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人
<400> 336
Figure 106126908-A0305-02-0631-482
Figure 106126908-A0305-02-0632-483
<210> 337
<211> 306
<212> PRT
<213> 智人
<400> 337
Figure 106126908-A0305-02-0632-484
Figure 106126908-A0305-02-0633-485
Figure 106126908-A0305-02-0634-486
<210> 338
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<400> 338
Figure 106126908-A0305-02-0634-487
<210> 339
<211> 77
<212> PRT
<213> 智人
<400> 339
Figure 106126908-A0305-02-0635-488
<210> 340
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 340
Figure 106126908-A0305-02-0635-489
Figure 106126908-A0305-02-0636-490
Figure 106126908-A0305-02-0637-491
<210> 341
<211> 996
<212> DNA
<213> 智人
<400> 341
Figure 106126908-A0305-02-0637-492
Figure 106126908-A0305-02-0638-493
<210> 342
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 342
Figure 106126908-A0305-02-0638-494
Figure 106126908-A0305-02-0639-495
Figure 106126908-A0305-02-0640-496
<210> 343
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 343
Figure 106126908-A0305-02-0640-497
<210> 344
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 344
Figure 106126908-A0305-02-0640-498
<210> 345
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 345
Figure 106126908-A0305-02-0641-499
<210> 346
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 346
Figure 106126908-A0305-02-0641-500
<210> 347
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 347
Figure 106126908-A0305-02-0641-501
<210> 348
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 348
Figure 106126908-A0305-02-0641-502
<210> 349
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 349
Figure 106126908-A0305-02-0642-503
<210> 350
<211> 364
<212> DNA
<213> 智人
<400> 350
Figure 106126908-A0305-02-0642-504
Figure 106126908-A0305-02-0643-505
<210> 351
<211> 448
<212> PRT
<213> 智人
<400> 351
Figure 106126908-A0305-02-0643-506
Figure 106126908-A0305-02-0644-507
Figure 106126908-A0305-02-0645-508
<210> 352
<211> 1344
<212> DNA
<213> 智人
<400> 352
Figure 106126908-A0305-02-0645-509
Figure 106126908-A0305-02-0646-510
<210> 353
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 353
Figure 106126908-A0305-02-0646-511
<210> 354
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 354
Figure 106126908-A0305-02-0647-512
<210> 355
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 355
Figure 106126908-A0305-02-0647-513
<210> 356
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 356
Figure 106126908-A0305-02-0647-514
<210> 357
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 357
Figure 106126908-A0305-02-0647-515
<210> 358
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 358
Figure 106126908-A0305-02-0647-516
<210> 359
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 359
Figure 106126908-A0305-02-0648-517
<210> 360
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 360
Figure 106126908-A0305-02-0648-518
<210> 361
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 361
Figure 106126908-A0305-02-0649-519
Figure 106126908-A0305-02-0650-520
<210> 362
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人
<400> 362
Figure 106126908-A0305-02-0650-521
<210> 363
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 363
Figure 106126908-A0305-02-0651-522
<210> 364
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 364
Figure 106126908-A0305-02-0651-523
<210> 365
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 365
Figure 106126908-A0305-02-0651-525
<210> 366
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 366
Figure 106126908-A0305-02-0651-526
Figure 106126908-A0305-02-0652-527
<210> 367
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<400> 367
Figure 106126908-A0305-02-0652-528
<210> 368
<211> 451
<212> PRT
<213> 智人
<400> 368
Figure 106126908-A0305-02-0652-529
Figure 106126908-A0305-02-0653-530
Figure 106126908-A0305-02-0654-531
Figure 106126908-A0305-02-0655-532
<210> 369
<211> 1359
<212> DNA
<213> 智人
<400> 369
Figure 106126908-A0305-02-0655-533
Figure 106126908-A0305-02-0656-534
<210> 370
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 370
Figure 106126908-A0305-02-0656-535
<210> 371
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 371
Figure 106126908-A0305-02-0656-536
<210> 372
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 372
Figure 106126908-A0305-02-0656-537
<210> 373
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 373
Figure 106126908-A0305-02-0657-538
<210> 374
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 374
Figure 106126908-A0305-02-0657-539
<210> 375
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 375
Figure 106126908-A0305-02-0658-540
Figure 106126908-A0305-02-0659-541
<210> 376
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人
<400> 376
Figure 106126908-A0305-02-0659-542
<210> 377
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 377
Figure 106126908-A0305-02-0659-543
Figure 106126908-A0305-02-0660-544
<210> 378
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 378
Figure 106126908-A0305-02-0660-545
<210> 379
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 379
Figure 106126908-A0305-02-0660-546
<210> 380
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 380
Figure 106126908-A0305-02-0660-547
Figure 106126908-A0305-02-0661-548
<210> 381
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 381
Figure 106126908-A0305-02-0661-549
<210> 382
<211> 454
<212> PRT
<213> 智人
<400> 382
Figure 106126908-A0305-02-0661-550
Figure 106126908-A0305-02-0662-551
Figure 106126908-A0305-02-0663-552
Figure 106126908-A0305-02-0664-553
<210> 383
<211> 1368
<212> DNA
<213> 智人
<400> 383
Figure 106126908-A0305-02-0664-554
Figure 106126908-A0305-02-0665-555
<210> 384
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 384
Figure 106126908-A0305-02-0665-556
<210> 385
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 385
Figure 106126908-A0305-02-0665-557
<210> 386
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 386
Figure 106126908-A0305-02-0665-558
<210> 387
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 387
Figure 106126908-A0305-02-0666-559
<210> 388
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 388
Figure 106126908-A0305-02-0666-560
<210> 389
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 389
Figure 106126908-A0305-02-0667-561
Figure 106126908-A0305-02-0668-562
<210> 390
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人
<400> 390
Figure 106126908-A0305-02-0668-563
<210> 391
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 391
Figure 106126908-A0305-02-0669-564
<210> 392
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 392
Figure 106126908-A0305-02-0669-565
<210> 393
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 393
Figure 106126908-A0305-02-0669-566
<210> 394
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 394
Figure 106126908-A0305-02-0669-567
Figure 106126908-A0305-02-0670-568
<210> 395
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 395
Figure 106126908-A0305-02-0670-569
<210> 396
<211> 454
<212> PRT
<213> 智人
<400> 396
Figure 106126908-A0305-02-0670-570
Figure 106126908-A0305-02-0671-571
Figure 106126908-A0305-02-0672-572
Figure 106126908-A0305-02-0673-573
<210> 397
<211> 1368
<212> DNA
<213> 智人
<400> 397
Figure 106126908-A0305-02-0673-574
Figure 106126908-A0305-02-0674-575
<210> 398
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 398
Figure 106126908-A0305-02-0674-576
<210> 399
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 399
Figure 106126908-A0305-02-0674-577
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 400
Figure 106126908-A0305-02-0674-578
<210> 401
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 401
Figure 106126908-A0305-02-0675-579
<210> 402
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 402
Figure 106126908-A0305-02-0675-580
Figure 106126908-A0305-02-0676-583
<210> 403
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 403
Figure 106126908-A0305-02-0676-584
Figure 106126908-A0305-02-0677-585
<210> 404
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人
<400> 404
Figure 106126908-A0305-02-0677-586
<210> 405
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 405
Figure 106126908-A0305-02-0678-587
<210> 406
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 406
Figure 106126908-A0305-02-0678-588
<210> 407
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 407
Figure 106126908-A0305-02-0678-589
<210> 408
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 408
Figure 106126908-A0305-02-0678-590
Figure 106126908-A0305-02-0679-591
<210> 409
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 409
Figure 106126908-A0305-02-0679-592
<210> 410
<211> 454
<212> PRT
<213> 智人
<400> 410
Figure 106126908-A0305-02-0680-593
Figure 106126908-A0305-02-0681-594
Figure 106126908-A0305-02-0682-595
<210> 411
<211> 1368
<212> DNA
<213> 智人
<400> 411
Figure 106126908-A0305-02-0682-596
Figure 106126908-A0305-02-0683-597
<210> 412
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 412
Figure 106126908-A0305-02-0683-598
<210> 413
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 413
Figure 106126908-A0305-02-0683-599
<210> 414
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 414
Figure 106126908-A0305-02-0683-600
<210> 415
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 415
Figure 106126908-A0305-02-0684-601
<210> 416
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 416
Figure 106126908-A0305-02-0684-602
Figure 106126908-A0305-02-0685-603
<210> 417
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 417
Figure 106126908-A0305-02-0685-604
Figure 106126908-A0305-02-0686-605
<210> 418
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 418
Figure 106126908-A0305-02-0686-606
<210> 419
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 419
Figure 106126908-A0305-02-0687-607
<210> 420
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 420
Figure 106126908-A0305-02-0687-608
<210> 421
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 421
Figure 106126908-A0305-02-0687-609
<210> 422
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 422
Figure 106126908-A0305-02-0687-610
Figure 106126908-A0305-02-0688-611
<210> 423
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 423
Figure 106126908-A0305-02-0688-612
<210> 424
<211> 454
<212> PRT
<213> 智人
<400> 424
Figure 106126908-A0305-02-0689-614
Figure 106126908-A0305-02-0690-615
Figure 106126908-A0305-02-0691-616
<210> 425
<211> 1368
<212> DNA
<213> 智人
<400> 425
Figure 106126908-A0305-02-0691-617
Figure 106126908-A0305-02-0692-618
<210> 426
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 426
Figure 106126908-A0305-02-0692-619
<210> 427
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 427
Figure 106126908-A0305-02-0692-620
<210> 428
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 428
Figure 106126908-A0305-02-0693-621
<210> 429
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 429
Figure 106126908-A0305-02-0693-622
<210> 430
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 430
Figure 106126908-A0305-02-0693-623
Figure 106126908-A0305-02-0694-624
<210> 431
<211> 323
<212> DNA
<213> 智人
<400> 431
Figure 106126908-A0305-02-0694-625
<210> 432
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 432
Figure 106126908-A0305-02-0694-626
Figure 106126908-A0305-02-0695-627
<210> 433
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人
<400> 433
Figure 106126908-A0305-02-0695-628
Figure 106126908-A0305-02-0696-629
<210> 434
<211> 644
<212> DNA
<213> 智人
<400> 434
Figure 106126908-A0305-02-0696-630
<210> 435
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 435
Figure 106126908-A0305-02-0697-631
<210> 436
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 436
Figure 106126908-A0305-02-0697-632
<210> 437
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 437
Figure 106126908-A0305-02-0697-633
<210> 438
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 438
Figure 106126908-A0305-02-0697-634
Figure 106126908-A0305-02-0698-635
<210> 439
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 439
Figure 106126908-A0305-02-0698-636
<210> 440
<211> 454
<212> PRT
<213> 智人
<400> 440
Figure 106126908-A0305-02-0699-637
Figure 106126908-A0305-02-0700-638
Figure 106126908-A0305-02-0701-639
<210> 441
<211> 1368
<212> DNA
<213> 智人
<400> 441
Figure 106126908-A0305-02-0701-640
Figure 106126908-A0305-02-0702-641
<210> 442
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 442
Figure 106126908-A0305-02-0702-642
<210> 443
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 443
Figure 106126908-A0305-02-0702-643
<210> 444
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 444
Figure 106126908-A0305-02-0703-644
<210> 445
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 445
Figure 106126908-A0305-02-0703-645
<210> 446
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 446
Figure 106126908-A0305-02-0703-646
Figure 106126908-A0305-02-0704-647
<210> 447
<211> 213
<212> PRT
<213> 智人
<400> 447
Figure 106126908-A0305-02-0704-648
Figure 106126908-A0305-02-0705-649
<210> 448
<211> 639
<212> DNA
<213> 智人
<400> 448
Figure 106126908-A0305-02-0705-650
<210> 449
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 449
Figure 106126908-A0305-02-0706-651
<210> 450
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 450
Figure 106126908-A0305-02-0706-652
<210> 451
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 451
Figure 106126908-A0305-02-0706-653
<210> 452
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人
<400> 452
Figure 106126908-A0305-02-0706-655
Figure 106126908-A0305-02-0707-656
<210> 453
<211> 384
<212> DNA
<213> 智人
<400> 453
Figure 106126908-A0305-02-0707-657
<210> 454
<211> 458
<212> PRT
<213> 智人
<400> 454
Figure 106126908-A0305-02-0708-658
Figure 106126908-A0305-02-0709-659
Figure 106126908-A0305-02-0710-660
<210> 455
<211> 1380
<212> DNA
<213> 智人
<400> 455
Figure 106126908-A0305-02-0710-661
Figure 106126908-A0305-02-0711-662
<210> 456
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 456
Figure 106126908-A0305-02-0711-663
<210> 457
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 457
Figure 106126908-A0305-02-0711-664
<210> 458
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 458
Figure 106126908-A0305-02-0712-665
<210> 459
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 459
Figure 106126908-A0305-02-0712-666
<210> 460
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人
<400> 460
Figure 106126908-A0305-02-0712-667
Figure 106126908-A0305-02-0713-668
<210> 461
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 461
Figure 106126908-A0305-02-0713-669
Figure 106126908-A0305-02-0714-670
<210> 462
<211> 654
<212> DNA
<213> 智人
<400> 462
Figure 106126908-A0305-02-0714-671
<210> 463
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 463
Figure 106126908-A0305-02-0715-672
<210> 464
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 464
Figure 106126908-A0305-02-0715-673
<210> 465
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 465
Figure 106126908-A0305-02-0715-674
<210> 466
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 466
Figure 106126908-A0305-02-0715-675
Figure 106126908-A0305-02-0716-676
<210> 467
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 467
Figure 106126908-A0305-02-0716-677
<210> 468
<211> 454
<212> PRT
<213> 智人
<400> 468
Figure 106126908-A0305-02-0717-678
Figure 106126908-A0305-02-0718-679
Figure 106126908-A0305-02-0719-680
<210> 469
<211> 1368
<212> DNA
<213> 智人
<400> 469
Figure 106126908-A0305-02-0719-681
Figure 106126908-A0305-02-0720-682
<210> 470
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 470
Figure 106126908-A0305-02-0720-683
<210> 471
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 471
Figure 106126908-A0305-02-0720-684
<210> 472
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 472
Figure 106126908-A0305-02-0721-685
<210> 473
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 473
Figure 106126908-A0305-02-0721-686
<210> 474
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 474
Figure 106126908-A0305-02-0721-687
Figure 106126908-A0305-02-0722-688
<210> 475
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 475
Figure 106126908-A0305-02-0722-689
Figure 106126908-A0305-02-0723-690
<210> 476
<211> 643
<212> DNA
<213> 智人
<400> 476
Figure 106126908-A0305-02-0723-691
<210> 477
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 477
Figure 106126908-A0305-02-0724-692
<210> 478
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 478
Figure 106126908-A0305-02-0724-693
<210> 479
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 479
Figure 106126908-A0305-02-0724-694
<210> 480
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 480
Figure 106126908-A0305-02-0724-695
Figure 106126908-A0305-02-0725-696
<210> 481
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 481
Figure 106126908-A0305-02-0725-697
<210> 482
<211> 454
<212> PRT
<213> 智人
<400> 482
Figure 106126908-A0305-02-0726-698
Figure 106126908-A0305-02-0727-699
Figure 106126908-A0305-02-0728-700
<210> 483
<211> 1368
<212> DNA
<213> 智人
<400> 483
Figure 106126908-A0305-02-0728-701
Figure 106126908-A0305-02-0729-702
<210> 484
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 484
Figure 106126908-A0305-02-0729-703
<210> 485
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 485
Figure 106126908-A0305-02-0729-704
<210> 486
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 486
Figure 106126908-A0305-02-0729-705
<210> 487
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 487
Figure 106126908-A0305-02-0730-706
<210> 488
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 488
Figure 106126908-A0305-02-0730-707
Figure 106126908-A0305-02-0731-708
<210> 489
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 489
Figure 106126908-A0305-02-0731-709
Figure 106126908-A0305-02-0732-710
<210> 490
<211> 642
<212> DNA
<213> 智人
<400> 490
Figure 106126908-A0305-02-0732-711
<210> 491
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 491
Figure 106126908-A0305-02-0733-712
<210> 492
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 492
Figure 106126908-A0305-02-0733-713
<210> 493
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 493
Figure 106126908-A0305-02-0733-714
<210> 494
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 494
Figure 106126908-A0305-02-0733-715
Figure 106126908-A0305-02-0734-716
<210> 495
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<400> 495
Figure 106126908-A0305-02-0734-717
<210> 496
<211> 457
<212> PRT
<213> 智人
<400> 496
Figure 106126908-A0305-02-0735-718
Figure 106126908-A0305-02-0736-719
Figure 106126908-A0305-02-0737-720
<210> 497
<211> 1377
<212> DNA
<213> 智人
<400> 497
Figure 106126908-A0305-02-0737-721
Figure 106126908-A0305-02-0738-722
<210> 498
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 498
Figure 106126908-A0305-02-0738-723
<210> 499
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 499
Figure 106126908-A0305-02-0738-724
<210> 500
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 500
Figure 106126908-A0305-02-0739-725
<210> 501
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 501
Figure 106126908-A0305-02-0739-726
<210> 502
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 502
Figure 106126908-A0305-02-0739-727
Figure 106126908-A0305-02-0740-728
<210> 503
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 503
Figure 106126908-A0305-02-0740-729
Figure 106126908-A0305-02-0741-730
<210> 504
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人
<400> 504
Figure 106126908-A0305-02-0741-731
<210> 505
<211> 239
<212> PRT
<213> 智人
<400> 505
Figure 106126908-A0305-02-0742-732
Figure 106126908-A0305-02-0743-733
<210> 506
<211> 179
<212> PRT
<213> 智人
<400> 506
Figure 106126908-A0305-02-0743-734
Figure 106126908-A0305-02-0744-735
<210> 507
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 507
Figure 106126908-A0305-02-0744-736
Figure 106126908-A0305-02-0745-737
<210> 508
<211> 199
<212> PRT
<213> 智人
<400> 508
Figure 106126908-A0305-02-0745-738
Figure 106126908-A0305-02-0746-739
<210> 509
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<400> 509
Figure 106126908-A0305-02-0746-740
<210> 510
<211> 128
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 510
Figure 106126908-A0305-02-0746-741
Figure 106126908-A0305-02-0747-742
<210> 511
<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 511
Figure 106126908-A0305-02-0747-743
Figure 106126908-A0305-02-0748-744
<210> 512
<211> 147
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 512
Figure 106126908-A0305-02-0748-745
Figure 106126908-A0305-02-0749-746
<210> 513
<211> 199
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 513
Figure 106126908-A0305-02-0749-747
Figure 106126908-A0305-02-0750-748
<210> 514
<211> 120
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 514
Figure 106126908-A0305-02-0750-749
Figure 106126908-A0305-02-0751-750
<210> 515
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人
<400> 515
Figure 106126908-A0305-02-0751-751
Figure 106126908-A0305-02-0752-752
<210> 516
<211> 302
<212> PRT
<213> 智人
<400> 516
Figure 106126908-A0305-02-0752-753
Figure 106126908-A0305-02-0753-754
Figure 106126908-A0305-02-0754-755
<210> 517
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 517
Figure 106126908-A0305-02-0754-756
<210> 518
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 518
Figure 106126908-A0305-02-0755-757
<210> 519
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 519
Figure 106126908-A0305-02-0755-758
Figure 106126908-A0305-02-0756-759
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<211> 657
<212> DNA
<213> 智人
<400> 520
Figure 106126908-A0305-02-0756-760
<210> 521
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 521
Figure 106126908-A0305-02-0756-761
Figure 106126908-A0305-02-0757-762
<210> 522
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 522
Figure 106126908-A0305-02-0757-763
Figure 106126908-A0305-02-0758-764
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 523
Figure 106126908-A0305-02-0758-765
Figure 106126908-A0305-02-0759-766
<210> 524
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 524
Figure 106126908-A0305-02-0759-767
Figure 106126908-A0305-02-0760-768
<210> 525
<211> 990
<212> DNA
<213> 智人
<400> 525
Figure 106126908-A0305-02-0761-769
<210> 526
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 526
Figure 106126908-A0305-02-0761-770
Figure 106126908-A0305-02-0762-771
Figure 106126908-A0305-02-0763-772
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<211> 978
<212> DNA
<213> 智人
<400> 527
Figure 106126908-A0305-02-0763-773
Figure 106126908-A0305-02-0764-774
<210> 528
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 528
Figure 106126908-A0305-02-0764-775
Figure 106126908-A0305-02-0765-776
Figure 106126908-A0305-02-0766-777
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<211> 978
<212> DNA
<213> 智人
<400> 529
Figure 106126908-A0305-02-0766-778
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<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 530
Figure 106126908-A0305-02-0767-779
Figure 106126908-A0305-02-0768-780
<210> 531
<211> 978
<212> DNA
<213> 智人
<400> 531
Figure 106126908-A0305-02-0768-781
Figure 106126908-A0305-02-0769-782
<210> 532
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 532
Figure 106126908-A0305-02-0769-783
Figure 106126908-A0305-02-0770-784
Figure 106126908-A0305-02-0771-785
<210> 533
<211> 978
<212> DNA
<213> 智人
<400> 533
Figure 106126908-A0305-02-0771-786
Figure 106126908-A0305-02-0772-787
<210> 534
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 534
Figure 106126908-A0305-02-0772-788
Figure 106126908-A0305-02-0773-789
Figure 106126908-A0305-02-0774-790
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<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 535
Figure 106126908-A0305-02-0774-791
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<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 536
Figure 106126908-A0305-02-0774-792
Figure 106126908-A0305-02-0775-793
<210> 537
<211> 990
<212> DNA
<213> 智人
<400> 537
Figure 106126908-A0305-02-0775-794
<210> 538
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 538
Figure 106126908-A0305-02-0776-795
<210> 539
<211> 663
<212> PRT
<213> 智人
<400> 539
Figure 106126908-A0305-02-0776-796
Figure 106126908-A0305-02-0777-797
Figure 106126908-A0305-02-0778-798
Figure 106126908-A0305-02-0779-799
Figure 106126908-A0305-02-0780-800
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<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 540
Figure 106126908-A0305-02-0780-801
Figure 106126908-A0305-02-0781-802
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 541
Figure 106126908-A0305-02-0781-803
Figure 106126908-A0305-02-0782-804
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 542
Figure 106126908-A0305-02-0782-805
Figure 106126908-A0305-02-0783-806
Figure 106126908-A0305-02-0784-808
Figure 106126908-A0305-02-0785-809
Figure 106126908-A0305-02-0786-810
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 543
Figure 106126908-A0305-02-0786-811
Figure 106126908-A0305-02-0787-812
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 544
Figure 106126908-A0305-02-0787-813
Figure 106126908-A0305-02-0788-814
<210> 545
<211> 663
<212> PRT
<213> 智人
<400> 545
Figure 106126908-A0305-02-0788-815
Figure 106126908-A0305-02-0789-816
Figure 106126908-A0305-02-0790-817
Figure 106126908-A0305-02-0791-818
Figure 106126908-A0305-02-0792-819
<210> 546
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 546
Figure 106126908-A0305-02-0792-820
Figure 106126908-A0305-02-0793-821
<210> 547
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 547
Figure 106126908-A0305-02-0793-822
Figure 106126908-A0305-02-0794-823
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 548
Figure 106126908-A0305-02-0794-824
Figure 106126908-A0305-02-0795-825
Figure 106126908-A0305-02-0796-826
Figure 106126908-A0305-02-0797-827
Figure 106126908-A0305-02-0798-828
<210> 549
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<400> 549
Figure 106126908-A0305-02-0798-830
Figure 106126908-A0305-02-0799-831
<210> 550
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 550
Figure 106126908-A0305-02-0799-832
Figure 106126908-A0305-02-0800-833
<210> 551
<211> 659
<212> PRT
<213> 智人
<400> 551
Figure 106126908-A0305-02-0800-834
Figure 106126908-A0305-02-0801-835
Figure 106126908-A0305-02-0802-836
Figure 106126908-A0305-02-0803-837
Figure 106126908-A0305-02-0804-838
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 552
Figure 106126908-A0305-02-0804-839
Figure 106126908-A0305-02-0805-840
<210> 553
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 553
Figure 106126908-A0305-02-0805-841
Figure 106126908-A0305-02-0806-842
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 554
Figure 106126908-A0305-02-0806-843
Figure 106126908-A0305-02-0807-844
Figure 106126908-A0305-02-0808-845
Figure 106126908-A0305-02-0809-846
Figure 106126908-A0305-02-0810-847
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<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 555
Figure 106126908-A0305-02-0810-848
Figure 106126908-A0305-02-0811-849
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<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 556
Figure 106126908-A0305-02-0811-850
Figure 106126908-A0305-02-0812-851
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<211> 659
<212> PRT
<213> 智人
<400> 557
Figure 106126908-A0305-02-0812-852
Figure 106126908-A0305-02-0813-853
Figure 106126908-A0305-02-0814-854
Figure 106126908-A0305-02-0815-855
Figure 106126908-A0305-02-0816-856
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<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 558
Figure 106126908-A0305-02-0816-857
Figure 106126908-A0305-02-0817-858
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<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 559
Figure 106126908-A0305-02-0817-859
Figure 106126908-A0305-02-0818-860
<210> 560
<211> 663
<212> PRT
<213> 智人
<400> 560
Figure 106126908-A0305-02-0818-861
Figure 106126908-A0305-02-0819-862
Figure 106126908-A0305-02-0820-863
Figure 106126908-A0305-02-0821-864
Figure 106126908-A0305-02-0822-865
<210> 561
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 561
Figure 106126908-A0305-02-0822-866
Figure 106126908-A0305-02-0823-867
<210> 562
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 562
Figure 106126908-A0305-02-0823-868
Figure 106126908-A0305-02-0824-869
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<211> 364
<212> DNA
<213> 智人
<400> 563
Figure 106126908-A0305-02-0824-870
Figure 106126908-A0305-02-0825-871
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<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 564
Figure 106126908-A0305-02-0825-872
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 565
Figure 106126908-A0305-02-0826-873
<210> 566
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 566
Figure 106126908-A0305-02-0826-874
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<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 567
Figure 106126908-A0305-02-0826-875
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<211> 373
<212> DNA
<213> 智人
<400> 568
Figure 106126908-A0305-02-0826-876
Figure 106126908-A0305-02-0827-877
<210> 569
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 569
Figure 106126908-A0305-02-0827-878
<210> 570
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 570
Figure 106126908-A0305-02-0828-879
<210> 571
<211> 373
<212> DNA
<213> 智人
<400> 571
Figure 106126908-A0305-02-0828-880
<210> 572
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 572
Figure 106126908-A0305-02-0828-881
Figure 106126908-A0305-02-0829-882
<210> 573
<211> 373
<212> DNA
<213> 智人
<400> 573
Figure 106126908-A0305-02-0829-883
<210> 574
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 574
Figure 106126908-A0305-02-0829-884
Figure 106126908-A0305-02-0830-885
<210> 575
<211> 373
<212> DNA
<213> 智人
<400> 575
Figure 106126908-A0305-02-0830-886
<210> 576
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 576
Figure 106126908-A0305-02-0831-887
<210> 577
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 577
Figure 106126908-A0305-02-0831-888
<210> 578
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 578
Figure 106126908-A0305-02-0832-889
<210> 579
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 579
Figure 106126908-A0305-02-0832-890
<210> 580
<211> 373
<212> DNA
<213> 智人
<400> 580
Figure 106126908-A0305-02-0832-891
<210> 581
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 581
Figure 106126908-A0305-02-0833-892
<210> 582
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 582
Figure 106126908-A0305-02-0833-893
<210> 583
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 583
Figure 106126908-A0305-02-0834-894
<210> 584
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 584
Figure 106126908-A0305-02-0834-895
<210> 585
<211> 373
<212> DNA
<213> 智人
<400> 585
Figure 106126908-A0305-02-0834-896
<210> 586
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 586
Figure 106126908-A0305-02-0835-897
<210> 587
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 587
Figure 106126908-A0305-02-0835-898
<210> 588
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 588
Figure 106126908-A0305-02-0836-899
<210> 589
<211> 337
<212> DNA
<213> 智人
<400> 589
Figure 106126908-A0305-02-0836-900
<210> 590
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 590
Figure 106126908-A0305-02-0836-901
Figure 106126908-A0305-02-0837-902
<210> 591
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 591
Figure 106126908-A0305-02-0837-903
<210> 592
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 592
Figure 106126908-A0305-02-0837-904
<210> 593
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
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<210> 594
<211> 337
<212> DNA
<213> 智人
<400> 594
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<210> 595
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 595
Figure 106126908-A0305-02-0838-908
<210> 596
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 596
Figure 106126908-A0305-02-0839-909
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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Figure 106126908-A0305-02-0839-911
Figure 106126908-A0305-02-0840-912
<210> 599
<211> 337
<212> DNA
<213> 智人
<400> 599
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<210> 600
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 600
Figure 106126908-A0305-02-0840-914
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<210> 601
<211> 337
<212> DNA
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<400> 601
Figure 106126908-A0305-02-0841-916
<210> 602
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 602
Figure 106126908-A0305-02-0841-917
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<210> 603
<211> 325
<212> DNA
<213> 智人
<400> 603
Figure 106126908-A0305-02-0842-919
<210> 604
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 604
Figure 106126908-A0305-02-0843-920
<210> 605
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 605
Figure 106126908-A0305-02-0843-921
<210> 606
<211> 325
<212> DNA
<213> 智人
<400> 606
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<210> 607
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 607
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<210> 608
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 608
Figure 106126908-A0305-02-0845-925
<210> 609
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> X=任何胺基酸。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> X=任何胺基酸。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (8)..(8)
<223> X=任何胺基酸。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (9)..(9)
<223> X=係存在或不存在，且若存在，則可係任何胺基酸。
<400> 609
Figure 106126908-A0305-02-0845-926
<210> 610
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL-Fc融合蛋白質
<400> 610
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Figure 106126908-A0305-02-0848-930

Claims (18)

  1. 一種經分離的抗體，其結合人類及/或小鼠ICOS之胞外域，其中該抗體包含VH域和VL域，該VH域包含與STIM003 VH域SEQ ID NO：408具有至少95%序列一致性的胺基酸序列且該VL域包含與STIM003 VL域SEQ ID NO：415具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該VH域包含重鏈互補決定區(HCDR)之組HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1是具有胺基酸序列SEQ ID NO：405的STIM003 HCDR1，HCDR2是具有胺基酸序列SEQ ID NO：406的STIM003 HCDR2，HCDR3是具有胺基酸序列SEQ ID NO：407的STIM003 HCDR3；且其中該VL域包含輕鏈互補決定區(LCDR)之組LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1是具有胺基酸序列SEQ ID NO：412的STIM003 LCDR1，LCDR2是具有胺基酸序列SEQ ID NO：413的STIM003 LCDR2，LCDR3是具有胺基酸序列SEQ ID NO：414的STIM003 LCDR3。
  2. 根據申請專利範圍第1項的抗體，其包含抗體恆定區。
  3. 根據申請專利範圍第2項的抗體，其中該恆定區包含人類重鏈及/或輕鏈恆定區。
  4. 根據申請專利範圍第2項的抗體，其中該恆定區為Fc效應陽性。
  5. 根據申請專利範圍第3項的抗體，其中該抗體是IgG1。
  6. 根據申請專利範圍第5項的抗體，其包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：410以及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：417。
  7. 根據申請專利範圍第1項的抗體，其為多重專一性抗體。
  8. 一種經分離的抗體，其結合人類及/或小鼠ICOS之胞外域，其中該抗體包含VH域胺基酸序列SEQ ID NO：408以及VL域胺基酸序列SEQ ID NO：415。
  9. 一種組成物，其包含根據申請專利範圍第1至8項中任一項的經分離的抗體和醫藥上可接受的賦形劑。
  10. 一種組成物，其包含編碼根據申請專利範圍第1至8項中任一項的抗體的經分離的核酸和醫藥上可接受的賦形劑。
  11. 一種試管內的宿主細胞，其包含編碼根據申請專利範圍第1至8項中任一項的抗體的核酸。
  12. 一種根據申請專利範圍第1至8項中任一項的抗體的用途，其係用於製備在人類患者中治療癌症的醫藥品。
  13. 根據申請專利範圍第12項的抗體用途，其中該癌症是腎細胞癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、食道癌、子宮頸癌或瀰漫性大型B細胞淋巴瘤。
  14. 根據申請專利範圍第12項的抗體用途，其中治療癌症包含向患者投予該抗體及抗PD-L1抗體。
  15. 根據申請專利範圍第14項的抗體用途，其中該抗PD-L1抗體是阿特珠單抗(atezolizumab)。
  16. 根據申請專利範圍第14項的抗體用途，其中該抗ICOS抗體和該抗PD-L1抗體各自能夠介導ADCC、ADCP及/或CDC。
  17. 根據申請專利範圍第16項的抗體用途，其中該抗ICOS抗體是人類 IgG1抗體且該抗PD-L1抗體是人類IgG1抗體。
  18. 根據申請專利範圍第17項的抗體用途，其中該抗ICOS抗體及/或該抗PD-L1抗體包含人類IgG1恆定區，該人類IgG1恆定區包含胺基酸序列SEQ ID NO：340。
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