KR102023661B1 - Icos에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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다니엘 올리브
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엥스띠뛰 쟝 빠올리 에 이렌느 깔메뜨
위니베르시떼 덱스-마르세이유
위니베르시테 끌로드 베르나르 리옹 Ⅰ
상뜨로 레옹 베라르
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Abstract

본 발명은 ICOS와 ICOS-L 사이의 고정을 억제함으로써 Treg에서의 ICOS 결합을 중화시키고, 플라스마사이토이드 수지상세포에 의해 유도되는 Treg의 증식을 파기하는, ICOS에 대한 항체 또는 이의 유도체를 제공한다. 또한, 본 발명은 IL-10 및 IFNγ 생성을 유도하고, CD4+ T 세포 증식을 유도하고, Tconv 증식을 감소시키고, Treg의 면역억제 기능을 증가시키는, ICOS에 대한 항체 또는 이의 유도체를 제공한다.

Description

ICOS에 대한 항체 및 이의 용도{ANTIBODIES DIRECTED AGAINST ICOS AND USES THEREOF}
본 발명은 ICOS에 대한 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
여러 암들에 있어서, 면역억제 T 세포 반응의 구축은 열악한 예후 및 질환 진행과 연관된다.
면역 관용의 구축에 수반되는 다양한 세포 이펙터 중에서, CD4+ 조절 T 림프구 서브세트(Treg)는 수지상 기능 뿐만 아니라 다른 T 세포(Tconv)의 억제에 있어서 전문화되어 있다. 상기 억제는 암, 특히 유방암을 앓는 환자의 열악한 생존율과 연관될 수 있다.
CD4+ T 세포에 의해 생성되는 소량의 IFNγ 및 다량의 IL-10은 CD8+ T 세포의 세포독성 능력의 감소, T 세포 증식의 저하와 연관되고, TAM(Tumor Associated Macrophage: 종양 연관 마크로파지)과 관련되는 면역억제 M2c 유형 마크로파지로의 단핵구 분화에 참여한다는 점이 보고되었다.
본 발명자들은 다량의 Treg(Ta-Treg)를 포함하는 기억 CD3+CD4+ T 세포가 원발성 유방 종양에 침윤한다는 점을 이미 보고한 바 있다. Ta-Treg 및 플라스마사이토이드 DC(pDC)에 의한 원발성 유방 종양 침윤은 유방 종양을 갖는 환자의 열악한 예후 및 열악한 생존과 모두 연관된다.
또한, 본 발명자들은 Treg를 수반하는 면역억제 메카니즘이 대부분의 암 및 만성 감염에서 관찰된다는 점을 확인하였다. 이러한 억제 메카니즘은 암 및 만성 바이러스 감염에 대한 효과적인 면역 반응을 방지한다.
현재, Treg는 세포 요법, 항-CD25 mAb 또는 저투여량 화학요법을 이용하여 암 및 만성 감염에서 표적화된다. 그러나, 상기 전략들은 받아들일 수 있는 결과를 제공하지 않았다.
또한, Treg는 과면역 반응과 연관되거나 과면역 반응에 의해 야기되는 질환에 대해 중요한 역할을 가질 수 있다는 점이 보고되었다.
그러나, Treg 연관 질환을 치료하기 위해 이용가능하고 효과적인 전략은 아직까지 존재하지 않는다. 따라서, Treg가 수반되는 질환을 치료하는데 효과적인 치료 전략에 대한 필요성이 여전히 크게 존재한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 ICOS와 이의 리간드 사이의 상호작용이 플라스마사이토이드 수지상세포(pDC)와의 상호작용을 통해 일부 암에서 Treg의 활성화, 증식 및 억제 기능에 대해 중추적인 역할을 한다는 점을 밝혔다. 이어서, 본 발명자들은 안타고니스트 및 아고니스트 효과를 갖는 특이적 항체를 제조하기 위해 집중적으로 노력하였다.
안타고니스트 항체는 면역 반응의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 또는 상태를 치료하는데 효과적이다. 아고니스트 항체는 과면역 반응과 연관되거나 과면역 반응에 의해 야기되는 질환 또는 상태를 치료하는데 효과적이다.
따라서, 본 발명은 ICOS에 대한 항체 또는 이의 유도체에 관한 것으로서, 이는
- ICOS와 ICOS-L 사이의 고정을 억제함으로써 Treg에서의 ICOS 결합(engagement)을 중화시키고(neutralize);
- pDC에 의해 유도되는 Treg의 증식을 파기한다(abrogate).
본 발명에서, 상기 항체는 "안타고니스트 항체"라고 지칭될 수도 있다.
또한, 본 발명은 ICOS에 대한 항체 및 이의 유도체에 관한 것으로서, 상기 항체는 Icos 145-1 및 Icos 314-8로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각 수탁번호 CNCM I-4179 및 CNCM I-4180으로서 2009년 7월 2일에 부다페스트 조약에 따라 "CNCM"(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 안타고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암 또는 만성 감염을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 안타고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 ICOS에 대한 항체 또는 이의 유도체에 관한 것으로서, 이는
- IL-10 및 IFNγ 생성을 유도하고;
- CD4+ T 세포 증식을 유도하고;
- Tconv 증식을 감소시키고;
- Treg의 면역억제 기능을 증가시킨다.
본 발명에서, 상기 항체는 "아고니스트 항체"라고 지칭될 수도 있다.
또한, 본 발명은 ICOS에 대한 항체 및 이의 유도체에 관한 것으로서, 상기 항체는 Icos 53-3, Icos 88-2 및 Icos 92-17로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각 수탁번호 CNCM I-4176, CNCM I-4177, CNCM I-4178로서 2009년 7월 2일에 부다페스트 조약에 따라 "CNCM"(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.
본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 아고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 자가면역 질환, 이식 거부증(transplantation rejection) 또는 이식편 대 숙주 질환(graft versus host disease)을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 아고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
정의
본원에서 "ICOS" 또는 "유도성 T 세포 공자극기(Inductible T cell costimulator)"는 세포외 부분에서 IgV 유형 도메인을 표출하고 세포질 부분에서 YMFM 모티프 내에 티로신을 표출하는 55 내지 60kDa의 막관통 호모다이머 당단백질을 의미한다. ICOS가 이의 리간드와 결합하는 것은 ICOS의 세포질 부분에서 티로신의 인산화를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 상기 인산화는 p85 PI3K 조절 서브유닛의 모집(recruitment)을 담당하며, 이는 PI3K/AKT 신호 경로를 활성화시킨다.
또한, ICOS 결합은 세포 표면에서 CD40L의 발현을 유도하는 것으로 개시된다. CD40L은 T 림프구와 B 림프구 사이의 협력에 있어서 중요한 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.
ICOS는 Treg상에서 뿐만 아니라 통상의 T 세포(Tconv CD4+, CD8+ 서브세트)상에서 TCR 활성화 이후에 발현되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 상기 활성화가 흑색종 또는 유방암을 갖는 환자에게서 더 중요했다는 점을 보여주었다.
본원에서 "ICOSL", "ICOS-L" 및 "B7-H2"는 ICOS 리간드를 나타낸다. 상기 리간드는 내피 세포 또는 상피 세포와 같은 비-림프구양 세포 뿐만 아니라 B 림프구, 마크로파지, 수지상세포와 같은 림프구양 세포 상에 존재한다. ICOS 결합은 림프구 활성화에 있어서 중요한 역할을 하며, 이는 T 림프구, 특히 Treg의 증식 및 생존을 유도한다.
본원에서, "JICOS 1"은 ICOS를 발현하는 특이적 세포주를 나타낸다.
본원에서, 다양한 문법적 형태로 기재되는 "모노클로날 항체"는 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항체 결합 부위의 한 종류만 함유하는 항체 군을 나타낸다. 따라서, 통상적으로 모노클로날 항체는 면역반응하게 되는 임의의 에피토프에 대해 단일 결합 친화성을 나타낸다. 따라서, 모노클로날 항체는 각각 다른 에피토프에 대해 면역특이적인 다수의 항체 결합 부위를 갖는 항체 분자를 함유할 수 있으며, 예컨대 이특이적 모노클로날 항체이다. 역사적으로 모노클로날 항체는 클로날 순수(clonally pure) 면역글로불린을 분비하는 세포주의 불멸화에 의해 생성되었을지라도, 모노클로날 순수 항체 분자 군은 본 발명의 방법에 의해 제조될 수도 있다. 모노클로날 항체를 제조하기 위한 실험실 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Harlow et al., 1988] 참조). 모노클로날 항체(mAb)는 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 인간 등의 포유류 내로 정제된 돌연변이 TXAS를 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 면역화된 포유류에서 항체-생성 세포는 분리되고 미엘로마 또는 헤테로미엘로마 세포와 융합되어, 하이브리드 세포(하이브리도마)를 생성한다. 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포는 원하는 모노클로날 항체의 원(source)으로서 이용된다. 하이브리도마 배양의 이러한 표준 방법은 문헌 [Kohler and Milstein, (1975)]에 개시되어 있다. mAb는 하이브리도마 배양에 의해 생성될 수 있지만, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 하이브리도마로부터 클로닝된 발현 핵산에 의해 생성되는 mAb를 이용하는 것이 또한 고려된다. 즉, 본 발명의 하이브리도마에 의해 분비되는 분자를 발현하는 핵산은 다른 세포주 내로 이동되어 형질전환체를 생성할 수 있다. 형질전환체는 본래 하이브리도마와 유전자형 측면에서 구분되지만, 이는 또한 본 발명의 항체 분자를 생성할 수 있으며, 여기에는 하이브리도마에 의해 분비되는 것에 상응하는, 전체 항체 분자의 면역학적으로 활성인 단편이 포함된다. 예를 들어, 미국특허 제 4,642,334; PCT 공개공보; Winter 등의 유럽특허공보 제0239400호; 및 Cabilly 등의 유럽특허공보 제0125023호 참조. 면역화를 수반하지 않는 항체 생성 방법들도 또한 고려되며, 예를 들어 (비-면역화된 동물의) 나이브 라이브러리를 조사하기 위하여 파지 디스플레이 기법을 사용하는 방법이 포함된다; 문헌 [Barbas et al. (1992)] 및 [Waterhouse et al. (1993)] 참조.
본원에서, "항-ICOS 항체"는 ICOS에 대한 모노클로날 항체, 바람직하게는 면역원으로서 재조합 ICOS-Fc를 사용하여 획득된 항체를 나타낸다.
본원에서, "항체의 유도체"는 상기 항체의 6개의 CDR을 포함하는 항체를 나타낸다.
본원에서, "53.3 mAb" 또는 "Icos 53-3"은 수탁번호 CNCN I-4176으로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 ICOS에 대한 모노클로날 항체를 나타낸다. 상기 항체는 ICOS의 아고니스트이다. "53.3 mAb의 유도체"는 53.3 mAb의 6개의 CDR을 포함하는 항-ICOS 항체를 나타낸다.
본원에서, "88.2 mAb" 또는 "Icos 88-2"는 수탁번호 CNCN I-4177로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 ICOS에 대한 모노클로날 항체를 나타낸다. 상기 항체는 ICOS의 아고니스트이다. 본 발명자들은 IL-2의 존재하에서 상기 항체의 사용은 Treg 증식 및 IL-10 분비에 유리하다는 점을 보여주었다. "88.2 mAb의 유도체"는 88.2 mAb의 6개의 CDR을 포함하는 항-ICOS 항체를 나타낸다.
88.2 mAb의 6개의 CDR은 하기 표 1에 기재되어 있다:
DNA 서열 아미노산 서열
H-CDR1 GGCTACAGTTTCACCAGCTACTGGATAAAC
(서열번호 17)		 GYSFTSYWIN
(서열번호 23)
H-CDR2 AATATTTATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAATGTTCAAGGAC
(서열번호 18)		 NIYPSDSYTNYNQMFKD
(서열번호 24)
H-CDR3 TGGAATCTTTCTTATTACTTCGATAATAACTACTACTTGGACTAC
(서열번호 19)		 WNLSYYFDNNYYLDY
(서열번호 25)
L-CDR1 AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTAT
(서열번호 20)		 RSSKSLLHSNGNTYLY
(서열번호 26)
L-CDR2 CGGATGTCCAACCTTGCCTCA
(서열번호 21)		 RMSNLAS
(서열번호 27)
L-CDR3 ATGCAACATCTAGAATATCCGTGGACG
(서열번호 22)		 MQHLEYPWT
(서열번호 28)
본원에서, "92.17 mAb" 또는 "Icos 92-17"은 수탁번호 CNCN I-4178로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 ICOS에 대한 모노클로날 항체를 나타낸다. 상기 항체는 ICOS의 아고니스트이다. "92.17 mAb의 유도체"는 92.17 mAb의 6개의 CDR을 포함하는 항-ICOS 항체를 나타낸다.
본원에서, "145.1 mAb" 또는 "Icos 145-1"은 수탁번호 CNCN I-4179로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 ICOS에 대한 모노클로날 항체를 나타낸다. 상기 항체는 ICOS의 안타고니스트이다. "145.1 mAb의 유도체"는 145-1 mAb의 6개의 CDR을 포함하는 항-ICOS 항체를 나타낸다.
본원에서, "314.8 mAb" 또는 "Icos 314-8"은 수탁번호 CNCN I-4180으로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 ICOS에 대한 모노클로날 항체를 나타낸다. 본 발명자들은 상기 항체의 사용이 Tconv에 의한 IL-10의 분비를 차단한다는 점을 보여주었다. 상기 항체는 ICOS의 안타고니스트이고, 이는 유방암과 같은 암에 있어서 수지상세포 매개된 조절 T 세포 확장 및 억제 기능을 방지하기 위해 고도로 조정된다. "314.8 mAb의 유도체"는 314.8 mAb의 6개의 CDR을 포함하는 항-ICOS 항체를 나타낸다.
314.8 mAb의 6개의 CDR은 하기 표 2에 기재되어 있다:
DNA 서열 아미노산 서열
H-CDR1 GGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCAC
(서열번호 1)		 GYTFTTYWMH
(서열번호 7)
H-CDR2 GAGATTGATCCTTCTGATAGTTATGTTAACTACAATCAAAACTTTAAGGGC
(서열번호 2)		 EIDPSDSYVNYNQNFKG
(서열번호 8)
H-CDR3 TTTGATTAC
(서열번호 3)		 FDY
(서열번호 9)
L-CDR1 AGGTCTAGTAAGAGTCCCCTGCATAGTAACGGCAACATTTACTTATAT
(서열번호 4)		 RSSKSPLHSNGNIYLY
(서열번호 10)
L-CDR2 CGGATGTCCAACCTTGCCTCA
(서열번호 5)		 RMSNLAS
(서열번호 11)
L-CDR3 ATGCAACATCTAGAATATCCGTACACG
(서열번호 6)		 MQHLEYPYT
(서열번호 12)
본원에서, "본 발명의 항체"라는 표현은 하기를 나타낸다:
- ICOS와 ICOS-L 사이의 고정을 억제함으로써 Treg상에서의 ICOS 결합을 중화시키고, 플라스마사이토이드 수지상세포에 의해 유도되는 Treg의 증식을 파기할 수 있는, ICOS에 대한 항체, 즉 안타고니스트 항체; 뿐만 아니라,
- IL-10 및 IFNγ 생성을 유도하고, CD4+ T 세포 증식을 유도하고; Tconv 증식을 감소시키고, Treg의 면역억제 기능을 증가시킬 수 있는, ICOS에 대한 항체, 즉 아고니스트 항체.
상기 표현에는 상기 항체의 임의의 유도체들이 또한 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 53.3 mAb, 88.2 mAb, 92.17 mAb, 145.1 mAb, 145.1 mAb 및 314.8 mAb와 이의 유도체 중에서 선택된다.
본원에서, "ICOS에 대한 안타고니스트 항체"는 천연적으로 발생한 ICOS에 의해 유도되는 반응과 유사한 세포성 반응을 야기시키지 않고 ICOS에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. "본 발명의 안타고니스트 항체"는 145.1 mAb, 314.8 mAb 및 이의 유도체를 나타낸다.
본원에서, "ICOS에 대한 아고니스트 항체"는 ICOS에 결합할 수 있고 천연적으로 발생한 ICOS에 의해 유도되는 반응과 유사한 세포성 반응을 야기시킬 수 있는 항체를 나타낸다. 따라서, 상기 항체는 ICOS의 작용을 모방한다. "본 발명의 아고니스트 항체"는 53.3 mAb, 88.2 mAb, 92.17 mAb 및 이의 유도체를 나타낸다.
본원에서, "항원 표출 세포(antigen presenting cell)" 및 "APC"는 항원을 내재화하고 가공할 수 있는 면역 세포 군을 나타내는 것으로서, 항원성 결정인자가 면역 시스템에 의해 인식될 수 있는 방식으로 MHC-연관 복합체로서 세포의 표면상에 표출된다(예컨대, MHC 클래스 I 제한된 세포독성 T 림프구 및/또는 MHC 클래스 II 제한된 헬퍼 T 림프구). 세포가 APC로서 기능하도록 하는 2개의 필요 성질은 흡수된 항원을 가공하는 능력 및 MHC 유전자 산물의 발현이다. APC의 예에는 수지상세포(DC), 단핵 식세포(예컨대, 마크로파지), B 림프구, 피부의 랑게르한스 세포, 및 인간에서, 내피 세포가 포함된다.
본원에서, "Treg" 및 "조절 T 세포(Regulatory T cell)"는 주로 시험관내 반응(responder) T 세포의 증식을 억제하고 자가면역 질환을 저지하는 능력을 갖는 T 림프구의 특이적인 군을 나타낸다. Treg는 인간에게서 항-종양 면역 반응의 궁극적인 실패의 주된 원인으로서 연루되어왔다. 예를 들어 난소암에 있어서, Treg는 종양-특이적 T 세포를 억제하고, 많은 수의 종양-연관 Treg는 생존 기간의 감소와 연관된다. 본 발명자들은 Treg가 숙주의 면역 반응을 선택적으로 억제하고, 이에 따라 암, 특히 유방암의 진행의 원인이 된다는 점을 보여주었다. Treg는 본래 CD4+CD25+ 세포 군으로서 동정되었지만, 이는 또한 포크헤드 패밀리(forkhead family) 전사인자 FoxP3의 발현을 특징으로 갖는다.
본 발명자들은 Treg가 환자의 암 조직 내에서 제자리(in situ) 증식하고, 동일한 환자의 혈액에서 추출된 Treg와 비교할 때 세포 표면 마커 ICOS 및 CD39를 발현한다는 점을 보여주었다.
반대로, "Tconv"라는 용어는 Treg 이외의 다른 T 세포들을 나타낸다. 따라서, "Tconv"는 (예컨대, 다른 세포들의 활성화를 제어하는 사이토킨을 생성함으로써, 또는 세포독성 활성에 의해) 항원을 제거하는 기능을 하는 T 세포를 포함한다. 상기 용어에는 T헬퍼 세포(예컨대, Th1 및 Th2 세포) 및 세포독성 T 세포가 포함된다. 이와 관련하여, T헬퍼 세포는 바람직하게는 CD4를 발현하고, CD25를 낮거나 검출될 수 없는 수준으로 발현한다. CTL 세포는 바람직하게는 CD8을 발현하고, CD4를 낮거나 검출될 수 없는 수준으로 발현한다. 바람직하게는, 비-Treg 세포는 CD4 및 CD25를 모두 발현하지 않는다. 바람직하게는, 비-Treg 세포는 FoxP3을 발현하지 않는다.
본원에서, "종양 연관 조절 T 세포(tumor associated regulatory T cell)" 및 "Ta-Treg"는 종양, 예를 들어 유방 종양과 연관되는 조절 T 세포를 나타낸다. 실제로, 본 발명자들은 Ta-Treg가 유방 종양 조직의 림프구 침윤(lymphoid infiltrates)에 존재하고, 유방암을 앓는 환자의 생존에 대해 부정적인 영향을 미친다는 점을 보여주었다.
본원에서, "플라스마사이토이드 수지상세포(plasmacytoid dendritic cell)" 및 "pDC"는 혈중에서 순환하고 말초 림프 기관에서 발견되는 선천적 면역 세포를 나타낸다. 이는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 군에 속하는 세포 군을 구성한다.
본원에서, "종양 연관 플라스마사이토이드 수지상세포(Tumor associated plasmacytoid dendritic cell)" 및 "Ta-pDC"는 종양, 예를 들어 유방 종양과 연관되는 플라스마사이토이드 수지상세포를 나타낸다. 본 발명자들은 Ta-pDC가 ICOS/ICOSL 공-자극의 의존 하에서 Ta-Treg의 증식을 유도할 수 있다는 점을 보여주었다.
본원에서, "IL-10" 및 "인터류킨-10"은 인간 사이토킨 합성 억제 인자(CSIF)를 나타내는 것으로서, 이는 항-염증성 사이토킨이다. 이러한 사이토킨은 단핵구에 의해 주로 생성되고, 림프구에 의해서는 더 적은 정도로 생성된다. 상기 사이토킨은 면역조절 및 염증에 대해 다면발현성 효과를 갖는다. 이는 Th1 사이토킨, MHC 클래스 II 항원의 발현을 하향조절한다. 또한, 이는 B 세포 생존, 증식, 및 항체 생성을 강화시킨다. 상기 사이토킨은 NF-κB 활성을 차단시킬 수 있고, JAK-STAT 신호 경로의 조절에 참여한다.
본원에서, "IFNγ" 및 "인터페론-감마"는 146개 아미노산의 서브유닛을 갖는 다이머 단백질을 나타낸다. 면역 시스템에서 IFN-γ의 중요성은 바이러스 복제를 직접적으로 억제하는 능력에 부분적으로 기인하며, 가장 중요하게는 면역자극 및 면역제어 효과에 기인한다. IFNγ은 주로 선천적 면역 반응의 일부로서 자연 살해(NK) 및 자연 살해 T(NKT) 세포에 의해, 그리고 항원-특이적 면역이 발달되면 CD4 및 CD8 세포독성 T 림프구(CTL) 이펙터 T 세포에 의해, 생성된다.
본원에서, "치료" 또는 "처치"라는 용어는 상기 용어가 적용되는 장애 또는 상태, 또는 상기 장애 또는 상태의 하나 이상의 징후를 예방하거나, 진행되는 것을 역전, 완화, 억제하는 것을 의미한다.
"치료적 유효량"은 대상체에게 치료적 이점을 부여하는데 필요한 활성제제의 최소량을 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, "치료적 유효량"은 병적 징후, 질환 진행 또는 질환과 관련되는 생리학적 상태의 개선을 유도하거나, 완화시키거나, 유발시키거나, 또는 장애에 대한 저항성을 개선시키는 양이다.
본원에서, "예방"은 질환 또는 상태를 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에게서 질환 또는 상태가 발생되는 것을 경감시키는 것을 나타낸다. 본원에서, "대상체(subject)"는 포유류, 예컨대 설치류, 고양잇과, 개과 및 영장류를 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 대상체는 인간이다.
"암"은 다양한 기관계의 악성종양, 예를 들어 폐, 유방, 갑상선, 림프구양, 위장, 및 비뇨생식기 관에 영향을 미치는 악성종양, 뿐만 아니라 악성종양을 포함하는 선암종, 예컨대 대부분의 대장암, 신장-세포 암종, 전립선 암 및/또는 고환 종양, 폐의 비-소세포 암종, 소장암 및 식도암을 포함한다.
"Treg 연관 질환"이라는 용어는 Treg 개수 및/또는 활성을 제어하는 것이 이로운 효과를 제공할 수 있는 임의의 질환 또는 장애 또는 상태를 포함하는 것으로 고려될 것이다. 상기 용어에는 하기가 포함된다:
- 대상체의 면역 반응의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 및 상태,
- 과면역 반응과 연관되거나 과면역 반응에 의해 야기되는 질환 및 상태.
본원에서, "면역 반응의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 및 상태"는 종양-특이적 T 세포와 같은 면역제어 세포의 증식의 Treg 억제에 의해 야기되는 질환 및 상태이다. 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 Treg가 암을 앓는 환자에게서 열악한 진단율 및 생존율과 연관된다는 점을 보여주었다.
대상체의 면역 시스템의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 및 상태의 비제한적인 예에는 암 및 만성 감염이 포함된다.
본원에서, "과면역 반응과 연관되거나 과면역 반응에 의해 야기되는 질환 및 상태"라는 표현은 예를 들어 자가면역 질환, 이식 거부증 또는 이식편 대 숙주 질환이다.
상기 표현에는 염증성 상태, 예컨대 신경계의 염증성 장애(예컨대, 다발성 경화증), 점막 염증성 질환(예컨대, 염증성 장 질환, 천식 또는 편도선염), 염증성 피부 질환(예컨대, 피부염, 건선 또는 접촉과민증), 자가면역 관절염(예컨대, 류머티즘성 관절염)이 더 포함된다.
본원에서, "면역 반응"은 암 세포, 전이성 종양 세포, 악성 흑색종, 침습 병원균, 병원균이 감염된 세포 또는 조직, 또는 자가면역 또는 병리적 염증의 경우 대상체의 정상 세포 또는 조직을 대상체의 신체로부터 선택적 손상, 파괴 또는 제거를 가져오는, 림프구, 항원 표출 세포, 식균 세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생성되는 가용성 거대분자(항체, 사이토킨 및 보체를 포함함)의 협동 작용을 나타낸다.
본원에서, "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직으로부터 발생하고 개체 자신의 조직에 대한 질환 또는 장애를 나타낸다.
본 발명의 안타고니스트 항체
ICOS의 특이적 리간드인 ICOS-L은 플라스마사이토이드 수지상세포상에서 발현된다는 점이 밝혀졌다. 본 발명자들은 종양 연관 Treg가 종양-연관 플라스마사이토이드 수지상세포와 밀접하게 접촉하였다는 점을 보여주었으며, 이러한 상호작용은 종양에서 ICOS와 ICOS-L의 결합을 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 제자리 ICOS/ICOS-L 상호작용에 의해 Ta-pDC 막에서 ICOS-L 하향조절(down-regulation)이 야기된다는 점을 보여주었다. 본 발명자들은 ICOS에 대한 안타고니스트 항체를 개발하였으며, 상기 항체의 첨가에 의해 Ta-Treg 활성화 및 증식의 원인이 되는 pDC에서의 ICOS-L 하향조절이 완전히 파기된다는 점을 보여주었다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 안타고니스트 항체가 Treg상에서 ICOS 결합을 중화시키고, pDC에 의해 유도되는 확장을 파기시킨다는 점을 보여주었다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 ICOS/ICOSL 상호작용에 의해 유도되는 Treg 증식 및 IL-10 분비를 파기시킨다.
따라서, 본 발명의 안타고니스트 항체는 병리학적 메카니즘에 수반되는 면역억제 반응을 파기하는데 매우 적합하다. 따라서, 이는 면역 반응의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 및 상태를 치료하는데 유용하다.
본 발명은 따라서 ICOS에 대한 항체 및 이의 유도체에 관한 것으로서, 이는
- ICOS와 ICOS-L 사이의 고정을 억제함으로써 Treg상에서의 ICOS 결합을 중화시키고;
- 플라스마사이토이드 수지상세포에 의해 유도되는 Treg의 증식을 파기한다.
일구현예에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다.
일구현예에서, 상기 항체는 키메라 항체이다.
일구현예에서, 상기 항체는 인간화 항체이다.
"Treg상에서 ICOS 결합을 중화시키는 것"은 항체가 ICOS와 이의 리간드 ICOS-L 사이의 협력을 저해한다는 것을 의미한다.
"Treg의 증식을 파기하는 것"은 대조 조직, 바람직하게는 비-종양 조직, 더 바람직하게는 혈액과 비교할 때 표적 조직, 바람직하게는 종양 조직에서 Treg의 증식의 유의적인 감소, 바람직하게는 완전 정지가 관찰된다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 ICOS에 대한 항체 및 이의 유도체에 관한 것으로서, 상기 항체는 Icos 145-1 및 Icos 314-8로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각 수탁번호 CNCM I-4179 및 CNCM I-4180으로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 Icos 145-1 및 Icos 314-8로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 6개의 CDR을 포함하는 항체 및 이의 유도체에 관한 것으로서, 각각 수탁번호 CNCM I-4179 및 CNCM I-4180으로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 표 2의 6개의 CDR을 포함하는 항체에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 Icos 145-1 및 Icos 314-8로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 중 하나의 유도 항체에 관한 것으로서, 각각 수탁번호 CNCM I-4179 및 CNCM I-4180으로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 안타고니스트 항체의 치료적 용도
Treg상에서 ICOS 결합을 중화시키고, Treg의 증식을 파기시킴으로써, 본 발명의 안타고니스트 항체는 면역 반응의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 및 상태, 예를 들어 암 및 만성 감염을 치료하기 위한 사용에 매우 적합하다. 따라서, 상기 항체는 항-종양 면역을 복원시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 안타고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 면역 반응의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 안타고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 상기 면역 반응의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 또는 상태는 암 및 만성 감염으로 이루어진 군에서 선택되는 질환이다.
실제로, 본 발명자들은 본 발명의 안타고니스트 항체가 Treg 개수 및/또는 활성을 제어하여 상기 Treg와 관련되는 면역억제 효과를 파기시키기 위해 조정된다는 점을 보여주었다. 따라서, 상기 안타고니스트 항체는 면역 시스템의 억제와 연관되는 질환, 예컨대 암 및 만성 감염을 치료하기 위한 매우 유망한 전략이 된다.
암의 예에는 인간 악성 림프종, 유방암, 난소암, 대장암, 폐암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 방광암, 대장암, 골암, 자궁경부암, 간암, 구강암, 식도암, 갑상선암, 신장암, 위암, 고환암 및 피부암이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
만성 감염의 예에는 바이러스성, 박테리아성, 기생충 또는 균류 감염, 예컨대 만성 간염, 폐 감염, 하기도 감염, 기관지염, 인플루엔자, 폐렴 및 성 전염성 질환이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바이러스 감염의 예에는 간염(HAV, HBV, HCV), 단순포진(HSV), 대상포진, HPV, 인플루엔자(Flu), AIDS 및 AIDS 관련 합병증(complex), 수두(chickenpox, varicella), 감기, 시토메갈로바이러스(CMV) 감염, 천연두(smallpox, variola), 콜로라도 진드기열, 뎅구열, 에볼라 출혈열, 구제역, 라사열병, 홍역, 마르부르크 출혈열, 감염성 단핵증, 볼거리, 노로바이러스, 소아마비, PML(progressive multifocal leukoencephalopathy: 진행성 다병소성 백질뇌증), 광견병, 풍진, SARS, 바이러스성 뇌염, 바이러스성 위장염, 바이러스성 수막염, 바이러스성 폐렴, 웨스트 나일 병 및 황열병이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
박테리아성 감염의 예에는 폐렴, 박테리아 수막염, 콜레라, 디프테리아, 결핵, 탄저병, 보툴리누스중독, 브루셀라병, 캄필로박테리아증, 발진티푸스, 임질, 리스테리아증, 라임병, 류머티즘열, 백일해(pertussis, Whooping Cough), 플라그, 살모넬라증, 성홍열, 시겔라균증, 매독, 파상풍, 트라코마, 야토병, 장티푸스 및 요로 감염증이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
기생충 감염의 예에는 말라리아, 레슈마니아증, 트리파노소마증, 샤가스병, 크립토스포리디아증, 간질병, 필라리아증, 아메바성 감염, 지아르디아증, 요충 감염, 주혈흡충증, 조충증, 톡소플라스마증, 선모충증 및 트리파노소마증이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
균류 감염의 예에는 칸디다증, 아스페르길루스증, 콕시디오이데스 진균증, 크립토코쿠스증, 히스토플라스마증 및 족부백선증이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 안타고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 암은 인간 악성 림프종, 난소암, 자궁경부암 및 유방암 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 암은 유방암이다.
또한, 본 발명은 면역 반응의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 또는 상태, 바람직하게는 암 및 만성 감염, 바람직하게는 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 ICOS에 대한 안타고니스트 항체 또는 이의 유도체를 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
ICOS에 대한 아고니스트 항체
ICOS 결합은 면역억제 T 세포 반응과 연관되는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 상기 결합은 IL-10 및 IFNγ 생성을 감소시키고 CD4+ T 세포 증식을 감소시키는 것으로 개시되었다.
따라서, 본 발명자들이 입증한 바에 따르면, ICOS의 아고니스트 항체는 역효과를 제공하며, 과면역 반응과 연관되거나 과면역 반응에 의해 야기되는 질환을 치료하는데 유익하다. 이에 따라, 본 발명은 ICOS에 대한 항체 또는 이의 유도체에 관한 것으로서, 이는
- IL-10 및 IFNγ 생성을 유도하고;
- CD4+ T 세포 증식을 유도하고;
- Tconv 증식을 감소시키고;
- Treg의 면역억제 기능을 증가시킨다.
"IL-10 및 IFNγ 생성을 유도하는 것"은 IL-10 및 IFNγ의 생성이 유의적으로 증가되는 것이 관찰된다는 것을 의미한다.
"CD4+ T 세포 증식을 유도하는 것"은 대조 조직, 바람직하게는 비-종양 조직, 더 바람직하게는 혈액과 비교할 때 표적 조직, 바람직하게는 종양 조직에서 CD4+ T 세포의 증식의 유의적인 증가가 관찰된다는 것을 의미한다.
"Tconv 증식을 감소시키는 것"은 대조 조직, 바람직하게는 비-종양 조직, 더 바람직하게는 혈액과 비교할 때 표적 조직, 바람직하게는 종양 조직에서 Tconv의 증식의 유의적인 감소가 관찰된다는 것을 의미한다.
"Treg의 면역억제 기능을 증가시키는 것"은 Treg 억제 활성의 유의적인 증가가 관찰된다는 것을 의미한다.
일구현예에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다.
일구현예에서, 상기 항체는 키메라 항체이다.
일구현예에서, 상기 항체는 인간화 항체이다.
또한, 본 발명은 ICOS에 대한 항체 및 이의 유도체에 관한 것으로서, 상기 항체는 Icos 53-3, Icos 88-2 및 Icos 92-17로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각 수탁번호 CNCM I-4176, CNCM I-4177, CNCM I-4178로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 Icos 53-3, Icos 88-2 및 Icos 92-17로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 6개의 CDR을 포함하는 항체에 관한 것으로서, 각각 수탁번호 CNCM I-4176, CNCM I-4177, CNCM I-4178로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 표 1의 6개의 CDR을 포함하는 항체에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 Icos 53-3, Icos 88-2 및 Icos 92-17로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 중 하나의 유도 항체에 관한 것으로서, 각각 수탁번호 CNCM I-4176, CNCM I-4177, CNCM I-4178로서 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 아고니스트 항체의 치료적 용도
또한, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 아고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 과면역 반응과 연관되거나 과면역 반응에 의해 야기되는 질환 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 아고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 자가면역 질환, 이식 거부증 또는 이식편 대 숙주 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 아고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 상기 자가면역 질환은 류머티즘성 관절염(RA), 인슐린 의존성 당뇨병(제1형 당뇨병), 다발성 경화증(MS), 크론병, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 피부경화증, 쇼그렌증후군, 심상성 천포창, 유천포창, 애디슨병, 강직성 척추염, 재생불량성 빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 복강 질병, 피부근염, 구드패스츄어 증후군, 그레이브스병, 귈랑-바레 증후군, 하시모토병, 특발성 백혈구감소증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 남성불임, 혼합 결합 조직병, 중증 근무력증, 악성빈혈, 파코제닉 포도막염, 원발성 담즙 간경변, 원발성 점액수종, 라이터 증후군, 강직인간 증후군, 갑상성중독증, 궤양성 대장염 및 베게너 육아종증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 또한 신경계의 염증성 장애, 예컨대 다발성 경화증, 점막 염증성 질환, 예컨대 염증성 장 질환, 천식 또는 편도선염, 염증성 피부 질환, 예컨대 피부염, 건선 또는 접촉과민증, 및 자가면역 관절염, 예컨대 류머티즘성 관절염으로 이루어진 군에서 선택되는 염증성 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 ICOS에 대한 아고니스트 항체 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 과면역 반응과 연관되거나 과면역 반응에 의해 야기되는 질환 또는 상태, 바람직하게는 자가면역 질환, 이식 거부증, 이식편 대 숙주 질환, 또는 염증성 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 ICOS에 대한 아고니스트 항체 또는 이의 유도체를 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 서열
본 발명의 추가 구현예는 53.3 mAb, 88.2 mAb, 92.17 mAb, 145.1 mAb, 314.8 mAb 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 중 하나를 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 53.3mAb, 88.2 mAb, 92.17 mAb, 145.1 mAb, 314.8 mAb 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 중 하나의 VH 도메인 또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.
통상적으로, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 분자이며, 이는 임의의 적합한 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 에피좀, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터 내에 포함될 수 있다.
"벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예컨대, 전사 및 번역)을 촉진시킬 수 있도록 DNA 또는 RNA 서열(예컨대, 외래 유전자)을 숙주 세포 내에 도입시키는 담체를 의미한다. 따라서, 본 발명의 추가 목적은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 대상체에 투여시에 상기 항체의 발현을 유발하거나 유도하기 위하여 조절 성분, 예컨대 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등을 포함할 수 있다. 동물 세포를 위한 발현 벡터에 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예에는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서, 면역글로불린 H 사슬의 프로모터 및 인핸서 등이 포함된다.
동물 세포를 위한 임의의 발현 벡터는 인간 항체 C 영역을 인코딩하는 유전자가 삽입되고 발현될 수 있다면 사용하는 것이 가능하다. 적합한 벡터의 예에는 pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 베타 d2-4- 등이 포함된다. 플라스미드의 다른 예에는 복제원점을 포함하는 복제 플라스미드, 또는 통합 플라스미드, 예컨대 pUC, pcDNA, pBR 등이 포함된다. 바이러스 벡터의 다른 예에는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터가 포함된다. 이러한 재조합 바이러스들은 당업계에 알려져 있는 기법들에 의해, 예를 들어 패키징 세포를 형질감염시키는 것에 의해, 또는 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스에 의한 일과성 형질감염에 의해, 생성될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 통상적인 예에는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등이 포함된다. 상기 복제-결핍 재조합 바이러스를 생성하기 위한 상세한 프로토콜은 예를 들어 WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 94/19478에서 확인할 수 있다.
본 발명의 추가 목적은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염되거나, 감염되거나, 또는 형질전환된 세포에 관한 것이다. "형질전환"은, 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 물질, 통상적으로는 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 효소를 생성하게 되도록, "외래(foreign)"(즉, 외인성 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포에게 도입하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하고 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"되었다. 본 발명의 핵산은 적합한 발현 시스템 내에서 본 발명의 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. "발현 시스템"은 적합한 조건하에서, 예컨대 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 위한 조건하에서, 숙주 세포 및 양립가능한 벡터를 의미한다.
통상의 발현 시스템에는 대장균 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 바큘로바이러스 벡터, 및 포유류 숙주 세포 및 벡터가 포함된다. 숙주 세포의 다른 예에는 원핵 세포(예컨대, 박테리아) 및 진핵 세포(예컨대, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특이적인 예에는 대장균, 클루이베로마이세스 또는 사카로마이세스 효모, 포유류 세포주(예컨대, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등), 뿐만 아니라 일차의 또는 구축된 포유류 세포 배양물(예컨대, 림프아세포, 섬유아세포, 배아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포 등에서 생성된 것)이 포함된다. 또한, 그 예에는 마우스 SP2/0-Agl4 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(하기에서는 "DHFR 유전자"라고 지칭함)가 결핍된 CHO 세포, 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.2O 세포(ATCC CRL1662, 하기에서는 "YB2/0 세포"라고 지칭함) 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 발현하는 재조합 숙주 세포를 생성하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 전술한 재조합 핵산 또는 벡터를 시험관내 또는 생체외에서 컴피턴트(competent) 숙주 세포 내에 도입하는 단계,
(ii) 획득된 재조합 숙주 세포를 시험관내 또는 생체외에서 배양하는 단계, 및
(iii) 선택적으로, 상기 항체를 발현 및/또는 분비하는 세포를 선택하는 단계.
상기 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 항체는 약학적으로 허용가능한 부형제, 및 선택적으로는 생분해성 폴리머와 같은 서방성 매트릭스와 조합되어, 치료 조성물을 형성할 수 있다.
"약학적으로" 또는 "약학적으로 허용가능한"은 적절한 경우에 포유류, 특히 인간에게 투여될 때 역반응, 알레르기반응 또는 다른 부반응을 나타내지 않는 분자체 및 조성물을 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제는 임의 유형의 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형화 보조제를 나타낸다.
약학 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 식이요법은 당연히 치료하려는 상태, 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 의존한다.
본 발명의 약학 조성물은 국부, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
바람직하게는, 약학 조성물은 주사될 수 있는 제형에 대해 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 이는 특히 등장성, 멸균, 염류 용액(인산 일나트륨 또는 인산 이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등, 또는 상기 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수를 첨가할 때 주사가능 용액을 구성할 수 있는 건조된 조성물, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다.
투여를 위해 사용되는 투여량은 다양한 파라미터들의 작용으로서 조정될 수 있으며, 특히 이용되는 투영 방식, 관련 병적 측면, 또다르게는 원하는 치료 기간의 작용으로서 조정될 수 있다. 약학 조성물을 제조하기 위해, 유효량의 항체가 약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 수성 매질 내에 용해되거나 분산될 수 있다. 주사가능 용도에 적합한 약학적 형태에는, 멸균 수성 용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 모든 경우에, 상기 형태는 멸균되어야 하며, 주사가능성이 용이한 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건하에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
자유 염기 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 수 중에서 제조될 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 정상 조건하에서, 상기 제조물들은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
본 발명의 항체는 중립 형태 또는 염 형태로 조성물 내에 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염에는 산부가염(단백질의 자유 아미노기에 의해 형성된 것), 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산에 의해 형성된 것, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된 것이 포함된다. 자유 카복실기에 의해 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물, 및 유기 염기, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다.
또한, 상기 캐리어는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 포함하는 용매 또는 분산 매질, 이의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일일 수 있다.
적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해, 유지될 수 있다.
미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어 당류 또는 염화나트륨을 함유하는 것이 바람직할 것이다.
주사가능 조성물의 지연된 흡수는 흡수 지연 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사가능 용액은, 적절한 용매 중에 필요한 양의 활성 화합물을 전술한 다양한 다른 성분들과 함께 혼입시키고, 필요하다면 이어서 여과멸균을 수행함으로써, 제조된다.
일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 다른 필요한 성분들을 함유하는 멸균 담체 내로 멸균된 다양한 활성성분들을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 미리 멸균여과된 용액으로부터 활성성분 및 원하는 임의의 추가 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기법이다.
직접 주사를 위한, 더 농축되거나 고도로 농축된 용액의 제조가 또한 고려되며, 여기서 DMSO을 용매로 사용하는 것은 고농도의 활성제제를 작은 종양 부위로 전달하면서 극히 신속한 침투를 야기시키는 것으로 여겨진다.
제형에 따라, 용액은 투여 제형에 적합한 방식으로 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여 형태, 예컨대 전술한 주사가능 용액의 유형으로 손쉽게 투여되며, 약물 방출 캡슐 등도 또한 이용될 수 있다.
수용액 중 비경구 투여를 위해, 예를 들어 용액은 필요하다면 적절하게 완충되어야 하며, 액체 희석제는 먼저 충분한 염류 또는 글루코스에 의해 등장성이 되어야 한다.
이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이용할 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세서를 고려하여 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액 중에 용해되고, 1000 ml의 피하주입 유체에 첨가되거나 제시된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 제15판, 제1035-1038페이지 및 제1570-1580페이지 참조). 투여량의 일부 변형은 치료되는 대상체의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여에 대해 책임이 있는 사람은 어떠한 경우에도 대상체 각각에 대해 적절한 투여량을 결정할 것이다.
본 발명의 항체는 치료 혼합물 내에 제형화되어, 투여량 당 약 0.0001 내지 1.0 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 약 10 밀리그램 정도를 포함할 수 있다. 다중 투여량이 또한 투여될 수 있다. 정맥내 또는 근육내 투여와 같은 비경구 투여를 위해 제형화된 화합물 외에, 다른 약학적으로 허용가능한 형태들은 예컨대 경구 투여를 위한 정제 또는 다른 고체; 시간 방출 캡슐; 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태를 포함한다.
특정 구현예에서, 리포좀 및/또는 나노입자의 사용은 숙주 세포내 항체의 도입을 위해 고려된다. 리포좀 및/또는 나노입자의 제형 및 사용은 당업자에게 알려져 있다.
일반적으로, 나노캡슐은 화합물을 안정적이고 재생가능한 방식으로 포획할 수 있다. 세포내 폴리머성 과부하에 기인한 부작용들을 피하기 위하여, 일반적으로 초미립자(약 0.1μm의 크기)가 생체내에서 분해될 수 있는 폴리머를 사용하여 구축된다. 이러한 필요조건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명에서 사용하기 위해 고려되며, 이러한 입자들은 용이하게 제조될 수 있다.
리포좀은 수성 매질 내에 분산된 인지질로부터 형성되며, 자연발생적으로 멀티라멜라 동심 이중층 소포(이는 또한 MLV(multilamellar vesicle)라고 지칭됨)를 형성한다. MLV는 일반적으로 25nm 내지 4μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파처리는 코어 내에 수용액을 함유하는 직경이 200 내지 500 A인 SUV(small unilamellar vesicle)를 형성시킨다. 리포좀의 물리적 특징들은 pH, 이온강도 및 이가 양이온의 존재에 의존한다.
본 발명의 항체를 제조하는 방법
본 발명의 항체는 당업계에 알려져 있는 임의의 기법에 의해, 예를 들어 비제한적으로 임의의 화학적, 생물학적, 유전적, 효소적 기법들을 단독으로 또는 조합시킴으로써, 생성될 수 있다.
원하는 서열의 아미노산 서열을 아는 경우, 당업자는 폴리펩티드를 생성하는 표준 기법에 의해 상기 항체를 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체는 잘 알려져 있는 고체상 방법을 이용하여 합성될 수 있으며, 바람직하게는 시판되는 펩티드 합성 기기(예컨대, Applied Biosystems, Foster City, California에서 제조된 기기)를 이용하고 제조사의 지시에 따라 합성될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 항체는 당업계에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기법에 의해 합성될 수 있다. 항체는, 예를 들어 항체를 인코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 내에 혼입시키고, 원하는 항체를 발현하게 될 적합한 진핵 또는 원핵 숙주 내에 상기 벡터를 도입시킨 후에, DNA 발현 산물로서 획득될 수 있으며, 이로부터 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 나중에 분리될 수 있다.
특히, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 본 발명의 항체의 제조방법에 관한 것이다:
(i) 상기 항체를 발현시키는데 적합한 조건하에서 본 발명에 따른 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(ii) 발현된 항체를 회수하는 단계.
또다른 특정 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 상기 항체를 발현시키는데 적합한 조건하에서, CNCM I-4176, CNCM I-4177, CNCM I-4178, CNCM I-4179 또는 CNCM I-4180으로서 기탁된 하이브리도마를 배양하는 단계; 및
(ii) 발현된 항체를 회수하는 단계.
본 발명의 항체는 통상의 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양배지로부터 적절하게 분리된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 인간 키메라 항체는, 전술한 바와 같은 VL 및 VH 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 획득하고, 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 인코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포에 대한 발현 벡터 내에 상기 핵산 서열을 삽입하여 인간 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포 내에 상기 발현 벡터를 도입하여 코딩 서열을 발현시킴으로써, 제조될 수 있다. 인간 키메라 항체의 CH 도메인으로서, 인간 면역글로불린에 속하는 임의의 영역이 될 수 있으며, IgG 클래스에 속하는 임의의 영역도 적합할 수 있고, IgG 클래스에 속하는 하위클래스 중 어느 하나, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 또한 사용될 수도 있다. 또한, 인간 키메라 항체의 CL로서, Ig에 속하는 임의의 영역이 될 수 있으며, 카파 클래스 또는 람다 클래스에 속하는 임의의 영역이 사용될 수 있다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있는 통상의 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법을 포함한다(특허공보 US 5,202,238 및 US 5,204,244 참조).
본 발명의 인간화 항체는 전술한 바와 같이 CDR 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 획득하고, (i) 인간 항체와 동일한 중쇄 보존 영역 및 (ii) 인간 항체와 동일한 경쇄 보존 영역을 인코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포에 대한 발현 벡터 내에 상기 핵산 서열을 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포 내에 상기 발현 벡터를 도입하여 유전자를 발현시킴으로써, 제조될 수 있다.
인간화 항체 발현 벡터는, 항체 중쇄를 인코딩하는 유전자와 항체 경쇄를 인코딩하는 유전자가 별개의 벡터상에 존재하는 유형일 수도 있고, 또는 상기 2개의 유전자가 동일한 벡터상에 존재하는 유형(탠덤 유형)일 수도 있다. 인간화 항체 발현 벡터의 구축의 용이성, 동물 세포내 도입의 용이성, 및 동물 세포에서 항체 H 및 L 사슬의 발현 수준 사이의 균형 측면에서, 탠덤 유형의 인간화 항체 발현 벡터가 바람직하다. 탠덤 유형 인간화 항체 발현 벡터의 예에는 pKANTEX93(WO 97/10354), pEE18 등이 포함된다.
통상의 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법에 기초한 인간화 항체의 제조방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체는 예를 들어 CDR-그래프팅(EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호 및 제5,585,089호), 베니어링 또는 리서페이싱(EP 592,106; EP 519,596), 및 사슬 셔플링(미국특허 제5,565,332호)을 포함하는 당업계에 알려져 있는 다양한 기법들을 이용하여 인간화될 수 있다. 상기 항체를 제조하기 위한 일반적인 재조합 DNA 기법도 역시 알려져 있다(유럽특허출원 EP 125023 및 국제특허출원 WO 96/02576 참조).
본 발명의 Fab는 ICOS와 특이적으로 반응하는 항체를 프로테아제 파파인으로 처리함으로써 획득될 수 있다. 또한, Fab는, 원핵 발현 시스템 또는 진핵 발현 시스템을 위한 벡터 내에 항체의 Fab를 인코딩하는 DNA를 삽입하고, 원핵생물 또는 진핵생물(적절한 경우) 내에 상기 벡터를 도입하여 Fab를 발현시킴으로써, 제조될 수 있다.
본 발명의 F(ab')2는 ICOS와 특이적으로 반응하는 항체를 프로테아제 펩신으로 처리함으로써 획득될 수 있다.
또한, F(ab')2는 티오에테르 결합 또는 이황화 결합을 통해 후술하는 Fab'를 결합시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 Fab'는 인간 ICOS와 특이적으로 반응하는 F(ab')2를 환원제 디티오트레이톨로 처리함으로써 획득될 수 있다. 또한, Fab'는, 원핵생물에 대한 발현 벡터 또는 진핵생물에 대한 발현 벡터 내에 항체의 Fab' 단편을 인코딩하는 DNA를 삽입하고, 원핵생물 또는 진핵생물(적절한 경우) 내에 상기 벡터를 도입하여 Fab'를 발현시킴으로써, 제조될 수 있다.
본 발명의 scFv는, 전술한 바와 같이 VH 및 VL 도메인을 인코딩하는 cDNA를 획득하고, scFv를 인코딩하는 DNA를 구축하고, 원핵생물에 대한 발현 벡터 또는 진핵생물에 대한 발현 벡터 내에 상기 DNA를 삽입하고, 그 후 원핵생물 또는 진핵생물(적절한 경우) 내에 상기 발현 벡터를 도입하여 scFv를 발현시킴으로써, 제조될 수 있다. 인간화 scFv 단편을 제조하기 위하여, CDR 그래프팅이라고 불리우는 잘 알려진 기법이 사용될 수 있으며, 이는 공여체 scFv 단편으로부터 상보성 결정 영역(CDR)을 선택하고, 공지된 삼차원 구조의 인간 scFv 단편 프레임워크상에 상기 CDR을 그래프팅하는 것을 포함한다(예컨대, W0 98/45322; WO 87/02671; US 5,859,205; US 5,585,089; US 4,816,567; EP 0173494 참조).
본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 개질(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 요구될 수 있다. 인간화 항체가 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에서 비-인간 동물로부터 유래된 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 단순하게 그래프팅함으로써 제조되는 경우, 항원 결합 활성은 비-인간 동물로부터 유래된 본래 항체에 비해 감소된다는 점이 알려져 있다. CDR에서 뿐만 아니라 FR에서, 비-인간 항체의 VH 및 VL의 여러 개의 아미노산 잔기들은 항원 결합 활성과 직접적으로 또는 간접적으로 연관된다는 점이 고려된다. 따라서, 상기 아미노산 잔기를 인간 항체의 VH 및 VL의 FR로부터 유래된 다른 아미노산 잔기들로 치환하는 것은 결합 활성을 감소시킬 것이다.
상기 문제점을 해소하기 위하여, 인간 CDR이 그래프트된 항체에 있어서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열들 중에서, 항체에 대한 결합과 직접 연관되는 아미노산 잔기, 또는 CDR의 아미노산 잔기와 상호작용하는 아미노산 잔기, 또는 항체의 삼차원 구조를 유지하는 아미노산 잔기, 및 항원에 대한 결합과 직접 연관되는 아미노산 잔기를 동정하는 시도가 이루어져야 한다. 감소된 항원 결합 활성은 상기 동정된 아미노산을 비-인간 동물로부터 유래된 본래 항체의 아미노산 잔기로 대체함으로써 증가될 수 있다.
본 발명의 항체 구조에 대해, 그리고 상기 항체를 인코딩하는 DNA 서열에 대해 개질 및 변형이 적용될 수 있으며, 원하는 특징들을 갖는 항체를 인코딩하는 기능성 분자를 여전히 획득할 수 있다. 아미노산 서열을 변형시키는데 있어서, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 대해 상호작용적인 생물학적 기능을 부여함에 있어서 수치요법 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 일반적으로 인식되어 있다. 아미노산의 상대적 수치요법 특질은 생성 단백질의 이차 구조에 기여하고, 결과적으로 상기 단백질과 다른 분자들, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호작용을 규정한다는 점이 받아들여진다.
각 아미노산은 소수성 및 전하 특징에 기초하여 수치요법 지수를 부여받으며, 이는 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
또한, 본 발명의 추가 구현예는 본 발명의 항체의 기능-보존 변이체를 포함한다.
"기능-보존 변이체(function-conservative variant)"는 단백질 또는 효소의 특정 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 전체적인 형태 및 기능을 변경시키지 않으면서 변형된 것(이는 아미노산이 유사한 성질(예컨대, 극성, 수소 결합 능력, 산성, 염기성, 소수성, 방향성 등)을 갖는 것으로 대체되는 것을 포함하며, 이에 한정되지 않음)이다.
보존되는 것으로 나타난 것 외의 다른 아미노산들은 단백질에서 다를 수 있으며, 이에 따라 기능이 유사한 2개의 임의 단백질 사이에서 단백질 또는 아미노산 서열 유사도 백분율이 달라질 수 있으며, 예를 들어 Cluster Method에 의한 것과 같은 정렬 도식에 따라 결정될 때 70% 내지 99%일 수 있고, 유사도는 MEGALIGN 알고리즘에 기초한다.
또한, "기능-보존 변이체"는, BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 결정될 때 60% 이상의 아미노산 상동성, 바람직하게는 75% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 상동성을 가지며, 비교되어지는 천연 단백질 또는 모 단백질과 동일하거나 실질적으로 유사한 성질 또는 기능을 갖는, 폴리펩티드를 포함한다. 2개의 아미노산 서열은 아미노산의 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 경우에, 또는 약 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상이 더 짧은 서열의 전체 길이에 걸쳐 유사한 경우(기능적으로 동일함)에, "실질적으로 상동(homologous)" 또는 "실질적으로 유사"이다. 바람직하게는, 유사한 서열 또는 상동성 서열은 예를 들어 GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램, 또는 BLAST, FASTA와 같은 임의의 서열 비교 알고리즘 등을 이용하여 정렬에 의해 동정된다.
예를 들어, 특정 아미노산들은 활성이 인지할 수 있을 정도로 손실되지 않으면서 단백질 구조에서 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 단백질의 상호작용 능력 및 성질이 단백질의 생물학적 기능적 활성을 규정하기 때문에, 특정 아미노산 치환은 단백질 서열에서 그리고 이의 DNA 인코딩 서열에서 수행될 수 있으며, 그럼에도 불구하고 유사한 성질을 갖는 단백질이 획득된다. 따라서, 본 발명의 항체 서열에서, 또는 상기 항체를 인코딩하는 상응하는 DNA 서열에서, 생물학적 활성을 인지할 수 있을 정도로 손상시키지 않으면서 다양한 변형들이 적용될 수 있다는 점이 고려된다.
특정 아미노산들은 수치요법 지수 또는 스코어가 유사한 다른 아미노산들로 치환될 수 있으며, 여전히 생물학적 활성이 유사한 단백질을 생성한다는 점, 즉 여전히 생물학적 기능적으로 등가인 단백질을 획득한다는 점이 당업계에 알려져 있다. 따라서, 상기에 개시된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사도, 예를 들어 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다.
전술한 다양한 특징들을 고려하는 예시적인 치환들은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 여기에는 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신이 포함된다. 본 발명의 항체의 아미노산 개질의 또다른 유형은 항체의 본래 글리코실화 패턴을 변형시키기 위해 유용할 수 있다.
"변형(altering)"은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키는 것, 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.
항체의 글리코실화는 통상적으로 N-연결된다. "N-연결"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티가 부착되는 것을 나타낸다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티가 효소적으로 부착되기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 상기 트리펩티드 서열들 중 어느 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. 항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 통상적으로 (N-연결된 글리코실화 부위에 대해) 전술한 트리펩티드 서열들 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 달성된다. 공유 개질의 또다른 유형에는, 항체에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소적으로 커플링시키는 것이 포함된다. 이러한 과정은 N-연결 또는 O-연결 글리코실화를 위한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 항체의 생성을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용되는 커플링 방식에 따라, 당류(들)는 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 자유 카복실기, (c) 자유 설프히드릴기, 예컨대 시스테인의 자유 설프히드릴기, (d) 자유 히드록실기, 예컨대 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 자유 히드록실기, (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법들은 WO 87/05330에 개시되어 있다.
항체에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티를 제거하는 것은 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 화합물 트리플루오로메탄설폰산 또는 등가 화합물에 항체를 노출시키는 것이 요구된다. 이러한 처리는 연결 당류(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)를 제외한 대부분의 당류 또는 모든 당류를 분할시키면서, 항체를 온전하게 놔두는 결과를 가져온다.
항체에서 탄수화물 모이어티의 효소적 분할은 다양한 엔도-글리코시다제 및 엑소-글리코시다제를 이용하여 달성될 수 있다.
항체의 공유 개질의 또다른 유형에는 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 개시된 방식으로 다양한 비 단백질성 폴리머들, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 대해 항체를 연결하는 것이 포함된다. 본 발명의 항체를 이펙터 기능 측면에서, 예컨대 항체의 항원-의존 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존 세포독성(CDC)이 증대되도록, 개질시키는 것이 또한 요구될 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 시스테인 잔기(들)가 Fc 영역에 도입될 수 있으며, 이에 따라 상기 영역에서 사슬간 이황화 결합이 형성될 수 있다. 이에 따라 생성된 호모다이머 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 살해 및/또는 항체-의존 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다(Caron PC. et al. J Exp Med. 1992 Oct 1;176(4):1191-5 및 Shopes B. J Immunol. 1992 May 1;148(9):2918-22).
진단 방법
본 발명은 또한 유방암 환자에게서 초기 사망 또는 재발의 증가된 위험을 진단하는 방법에 관한 것이다. 실제로, 실시예 3에서 보여진 바와 같이, 높은 ICOS+ Treg 세포 수의 존재는 유방암 환자에 대해 더 낮은 무진행 생존(Progression Free Survival) 또는 전체 생존(Overall Survival)과 연관된다.
따라서, 본 발명은 유방암 환자에게서 초기 사망 또는 재발의 증가된 위험을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 환자의 샘플에서 ICOS 양성(ICOS+) Treg 세포를 정량하는 단계를 포함한다. 상기 개수가 높은 경우, 예를 들어 실시예 3 및 도 9의 방법을 사용할 때 1.7 ICOS+ 세포/스폿보다 더 높은 경우, 상기 유방암 환자에게 재발 또는 초기 사망의 증가된 위험이 존재한다.
또한, 본 발명은 항-ICOS 면역요법에 의해 치료되는 것에 민감한(susceptible) 환자를 선택하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 환자의 샘플에서 ICOS 양성 Treg 세포를 정량하는 단계를 포함한다. 상기 면역요법은 본 발명의 항-ICOS 항체일 수 있다.
상기 샘플은 생검으로부터 유래될 수 있다. 상기 ICOS+ Treg 세포의 정량화는 항 ICOS 항체 덕분에, 특히 전술한 항체 중 어느 하나 덕분에 수행될 수 있게 된다.
전임상 유방 종양 모델에서의 치료
실시예 6에서 보여진 바와 같이, 대리 중화 래트 항 뮤린 ICOS 항체(17G9, IgG2b)에 의한 유방 종양의 구축된 뮤린 모델의 처치는 종양 진행을 감소시키고, 원발성 유방 종양에 대해 높은 ICOS+ Treg 검출을 갖는 환자의 하위군에서 종양 퇴행을 시키는 본 발명의 항-ICOS 중화 항체에 의한 처치 능력을 강화시킨다.
본 발명은 하기의 도 및 실시예의 측면에서 더 설명될 것이다.
도 1: Ta-Treg는 Ta-pDC에 의해 공-편재화된, ICOS를 강하게 발현하고, 제자리 증식하지만 시험관내에서는 증식하지 않는다.
A - 종양 동결 절편은 항 ICOS Ab(녹색) 및 Ki67 Ab(갈색) 및 HRP에 컨쥬게이트된 이차 항 뮤린 Ab로 염색되었으며, 각각 Histogreen 및 DAB에 의해 나타나졌다(배율 10x, 및 삽입 박스에 대해 40x).
B - Ki67 발현은 원발성 종양(Ta-Treg, Ta-Tconv) 또는 짝지어진(paired) 혈액(Treg, Tconv) 내에서 Treg(CD4+CD127-CD25high) 및 Tconv(CD4+CD127+CD25low/-)에 대해 다색 유동세포분석법을 이용하여 분석되었다.
C - 원발성 종양 또는 건강한 혈액으로부터 정제된 Treg 및 Tconv은 500 UI/ml의 IL-2의 존재하에 96 웰 U-바닥 플레이트에서 배양되었다. 세포수는 미생물수측정법에 의해 4일마다 정량되었다.
D-F 종양 동결 절편은 항 CD3 Ab(갈색)으로 염색되고 헤마톡실린(청색)으로 대조염색되었음 (10x, 및 삽입 박스에 대해 40x) (D); CD3 Ab(녹색) 및 BDCA2(갈색) (20x, 및 삽입 박스에 대해 40x) (E); FoxP3 Ab(갈색) 및 BDCA2(녹색) (20x, 및 삽입 박스에 대해 40x) (F).
도 2: ICOS 및 ICOS-L 차단은 MoDC/T 공배양에 대해 강하게 간섭하지 않으면서 pDC 매개 T 세포 활성화 동안 IL-10 분비를 파기한다. 정제된 R848-활성화된 pDC 또는 MoDC는 Ctrl Ab, 항 ICOS(314.8) 또는 항 ICOS-L(MIH12)의 존재하에 동종이계 기억 CD4+ T 세포와 함께 5일 동안 공배양되었다. 5일에, IL-10 및 IFNγ는 pDC/T 공배양(A) 및 MoDC/T 공배양(B)으로부터의 상청액에서 ELISA에 의해 정량되었다.
도 3: ICOS 및 CD3 공-자극은 외인성 IL-2의 존재하에 Treg 및 Tconv 증식 뿐만 아니라 IL-10 분비에 호의적이지만, IFNγ 분비는 그렇지 않다.
A/B - 편도선으로부터 발생된 FACS-선별된 Treg 또는 Tconv는 IL-2의 존재하에 단독으로 또는 CD3/IgG, CD3/88.2, CD3/CD28 아고니스트 mAb로 코팅된 비드와 함께 5일 동안 배양되었다(n=3). 증식은 [3H]-티미딘 혼입에 의해 평가되었다(A). IL-10 및 IFNγ 수준은 배양 상청액에서 ELISA에 의해 측정되었다(B).
C - 종양으로부터 선별된 CD4+ TaT 세포는 외인성 IL-2(100 UI/ml)의 존재하에 항CD3/IgG; 항CD3/88.2 또는 항CD3/항CD28로 코팅된 비드에 의해 5일 동안 배양되었다. 상청액 중 IL-10 및 IFNγ의 농도가 ELISA에 의해 정량되었다.
도 4: ICOS 결합은 CD28-유도된 IL-2를 차단하고, 결과적으로 증식 및 IFNγ 분비를 감소시킨다.
A - CFSE 표지된 CD4+ 기억 T 세포는 다른 농도의 외인성 rhIL-2(20 UI/ml 및 100 UI/ml)의 존재하에 또는 단독으로 다른 비드와 함께 5일 동안 배양되었다. 증식은 유동세포분석법에 의한 CFSE 희석에 의해 평가되었다.
B - IL-2는 외인성 IL-2 없이 다른 비드와 함께 5일 배양 후에 ELISA에 의해 검출되었다.
C - 건강한 공여체로부터 혈액 CD4+ 기억 T 림프구는 외인성 IL-2(100 UI/ml)의 존재하에 또는 단독으로 다른 비드와 함께 5일 동안 배양되었다. IL-10 및 IFNγ 분비는 ELISA에 의해 정량되었다.
도 5 : 유방 종양 세포주 및 원발성 유방 종양 절개에 대한 ICOS-L의 발현의 부재.
A - ICOS-L 발현은 Ag 저해를 피하기 위해 트립신의 부재하에 PBS-EDTA 중에서 수확된 유방 종양 상피 세포주 현탁액에 대해 유동세포분석법에 의해 평가되었다.
B - ICOS-L 발현은 대조군 Ab(점선) 또는 항 ICOS Ab(314.8)(실선)의 존재하에서 48시간 배양 후에 종양 세포(CD45- 세포)에서 평가되었다.
도 6 : 대용 래트 항-마우스 항 ICOS Ab(17G9, IgG2b)에 의한 원발성 Neu15 유방 종양의 처치는 종양 성장을 둔화시킨다.
도 7:
A: Treg 세포 수는 원발성 자궁경부암 내에서 증가된다.
B: Treg 세포 ICOS+는 원발성 자궁경부암 내에서 증가된다.
도 8: NHL(non Hodgkin lymphoma)에서 ICOS 발현 Treg의 증가.
HD - 호지킨 질환(Hodgkin Disease)
FL - 여포성 림프종(Follicular Lymphoma)
DLBCL - 확산 대형 B 세포 림프종(Diffuse Large B Cell Lymphoma)
MCL - 맨틀 세포 림프종(Mantle Cell Lymphoma)
MZL - 변연대 림프종(Marginal Zone Lymphoma)
도 9: 원발성 유방 종양 내의 ICOS + Treg 세포의 존재는 생존에 대해 부정적인 영향을 미친다.
10년의 임상 추적을 갖는 120 파라핀 포매된 원발성 종양 샘플은 시판되는 항 ICOS 래빗 폴리클로날 Ab를 사용하여 ICOS의 발현에 대해 시험되었다. ICOS+ 세포의 평균이 6개의 다른 스폿(spot)상에서 평가되었다. 통계 분석을 위해, 평형화된 그룹을 갖는 중앙값이 컷-오프로서 사용되었다.
전체 생존(A) 또는 무진행 생존(B)에 대해 원발성 종양에서 ICOS의 존재에 따른 ICOS 발현의 영향이 보여진다.
실시예 1: 본 발명에 따른 항체의 특징화
재료 및 방법
I. 세포생물학
1 - 선택 / 세포 정제
* 말초혈 단핵 세포의 분리
PBMC(말초혈 단핵 세포)는 Lymphoprep 구배(Abcys)에 의해 건강한 지원자들의 말초혈 줄기세포 이식으로부터 분리되었다(Etablissement Francais du sang, Marseille, France). 튜브에서, 혈액의 2/3가 Lymphoprep의 1/3에 대해 적하증착되고, 구배(gradient)를 교란시키지 않도록 가속화시키지 않고 20℃에서 20분 동안 2000rpm으로 원심분리된다. 원심분리 후에, 단핵 세포가 회수되고, 20℃에서 20분 동안 1000rpm으로 PBS 1% FCS(송아지태아혈청) + 헤파린에서 2회 세척된다.
그 후, 세포는 즉시 사용되거나, 또는 RPMI 1640 50% FCS 10% DMSO(디메틸 설폭시드) 중 50x106 세포/ml로 -80℃에서 동결된다. 24시간 후에, 세포는 보존을 위해 질소로 이동된다.
* CD4의 음성 선택(negative selection)
CD4+ T 림프구는 PBMC로부터 정제되었다. 해동 후에, 세포는 세척되고, 10x106 세포에 대해 40μL의 선별 완충액(sorting buffer)(PBS 0.5% BSA 2mM EDTA) 중에 희석되었다. 키트 MACS 인간 CD4 + T Cell Isolation Kit II가 사용되었다(Miltenyi Biotec): 비오틴(일차 표지)에 컨쥬게이트된 모노클로날 항체의 용액 10μL가 첨가되고, 혼합물은 교반하에 4℃에서 10분 동안 인큐베이션되었다.
그 후, 세포는 교반하에 4℃에서 15분 동안 항-비오틴(이차 표지)과 커플링된 자성 비드(bead) 20μL과 접촉되어 놓여진다. 선별 완충액으로 세척한 후에, 세포는 Automacs(Miltenyi)로 선별되었다. 이어서, CD4 + T 표지된 세포에서 감손된(depleted) 음성(negative) 분획이 분리된다. 이것은 약 95%의 CD4+ 순수 군을 제공한다.
2 - 활성화 및 세포 배양
* 비드 CD3/CD28에 의한 전-활성화, 및 그 후 mAb에 의한 자극
CD4 + T 세포는 비드 CD3/CD28(Dynabeads, Invitrogen)의 존재하에 106 세포/mL RPMI 10% FCS의 농도로 놓여지고(1개 세포/1개 비드), 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션된다. 그 후, 세포는 자성을 가진 비드로부터 분리되고 Dynal Biotech는 106 세포/ml의 농도로 RPMI 10% FCS 중에 밤새 놓여진다.
다른 한편으로는, mAb 항-CD3(OKT3), 항-ICOS(ICOS 88-2), 및 대조 IgG1 mAb(Sigma)가 4℃에서 밤새 96 플랫 웰(flat well)상에서 코팅되었다. 상기 웰은 다른 mAb PBS 1 X 100mL/웰 중에서 20μg/ml이 보충된 50 ng/ml 항-CD3으로 코팅된다. 다음날, 플레이트는 PBS로 세척되고, PBS 5% FCS로 2시간 포화된다(웰 당 200μL). 미리 혼입된 CFSE를 갖는 CD4 + T 세포(하기 참조)는 2105 세포/200μL의 배지/웰의 속도로 코팅된 플레이트상에 배분되고, 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션된다. 48시간에, 상청액이 수집되었으며, 72시간에, 세포가 수집되어 유동세포분석법에 의해 증식이 분석되었다(도 4).
* 인공(artificial) APC에 의한 활성화
자성 비드(Dynabeads M-450 Epoxy, Invitrogen)가 인산나트륨 완충액 0.1 M에서 세척되었으며, 그 후 mAb 항-CD28 또는 ICOS(ICOS 88-2 또는 CD28.2)로, 비드와 커플링된 5%의 mAb를 나타내는 1 mg/1x107 비드의 준최적 농도에서 mAb 항-CD3(OKT3)과 인큐베이션되었다(2μg/1x107 비드, 10%). 이러한 인공 APC는 4℃에서 밤새 느린 회전으로 mAb와 함께 인큐베이션되었다. 다음날, 2회 세척이 PBS 0.1% BSA에서 수행된다. 인공 APC는 96 라운드 플레이트 웰에서 세포에 대해 하나의 비드에 배분되고 웰 당 2x105 림프구 T CD4 + / 200μL가 증착되었으며, 그 후 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션되었다. CD4 + T 세포는 미리 CFSE를 혼입하였다. 48시간에, 상청액이 수집되었으며, 72시간에, 세포가 수집되어 유동세포분석법에 의해 증식이 분석되었다.
3 - 세포 증식
림프구의 증식 이후에 CFSE(카복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르)(Molecular Probes, Invitrogen)가 이어진다. 상기 CFSE는 세포 투과성이고, 비형광성이다. 세포에 진입할 때, 에스테라제는 형광성이 되는 아세테이트기를 분할시키는 반면, 세포는 비투과성이 된다.
CFSE의 특징은 각각의 분열에서 새롭게 형성되는 각 세포에 공평하게 공유된다는 것이다. 이는 녹색 방사선을 방출하고 세포의 수, 위치 및 분화 단계를 동시에 분석할 수 있도록 하며, 여기서 세포 당 형광 강도는 CFSE의 농도에 비례한다. 세포를 CFSE로 표지시키기 위하여, 세포 현탁액은 콜드 1X PBS에서 희석된다. CFSE의 첨가: 10x106 세포에 대해 5mM. 그 후, 세포는 37℃에서 수조에 위치된다.
8 내지 10분 교반한 후에, 세포는 신속하게 아이스 위에 놓여져 반응이 중지되었다. 이어서, 세포는 2ml의 PBS 1X로 2회 원심분리된다. 마지막으로, 세포는 배양을 위한 RPMI 10% FCS의 원하는 부피에서 수집된다. 증식은 유동세포분석법에 의해 결정된다.
II - 유동세포분석법
CD4 + 세포는 4℃에서 10분 동안 96-웰 플레이트에서 30% BSA PBS(50mL/웰)로 희석되고, 비특이적 부위를 포화시킨다. 그 후, 플루오로크롬에 커플링된 원하는 항체와 함께, 암실에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션된다.
PBS 1 X 1% BSA 0.02% 아지드(원심분리 2100rpm, 3분, 4℃)에서 2회 세척 후에, 세포는 200mL의 PBS 2% 포름알데히드에서 고정되고 유동세포분석기(FACS Canto, BD Biosciences)에 놓여졌다. 상기 결과는 FlowJo 소프트웨어에 의해 분석된다.
III - ELISA(효소결합 면역흡착 분석)
CD4 + T 세포의 배양 상청액이 48시간에 수집되고, IL-10, IFNγ 및 TNFα에 대한 분석을 위해 -20℃에서 분석된다.
결과
1 - 항-ICOS mAb의 특징화
본 발명자들은 5개의 항-ICOS Ab를 제조하였다. 이들의 이소타입은 ELISA에 의해 분석되었다. 수용체에 대한 이들의 친화성을 간접적으로 분석하기 위하여, mAb는 ICOS를 발현하는 안정적 형질감염체를 이용하여 시험되었다. JICOS.1 세포는 플루오로크롬에 커플링된 프로브(PE-GAM: 염소 항 마우스-PE)로 표지된 항-ICOS mAb(범위를 증가시킴)의 존재하에 놓여졌으며, 유동세포분석법에 의해 분석되었다.
이에 따라, ED 50(즉, 부위의 50%가 포화되는 mAb의 농도)을 결정하는 것이 가능하였다. ED 50이 가장 낮은 mAb는 친화성이 가장 높은 것으로 여겨진다.
그 후, 본 발명자들은 JICOS.1 세포에 의해 운반되는 ICOS L(인간 IgG1 Fc 도메인의 재조합 형태)의 결합을 억제하는 항-ICOS mAb의 능력을 시험하였다.
항-ICOS mAb의 농도 구배가 사용되었으며, 플루오로크롬에 커플링된 프로브(GAH-PE: 염소 항-인간-PE)에 의해 ICOS L Fc에 대한 고정이 나타내어졌다. 분석은 유동세포분석법에 의해 수행되었다. 본 발명자들은 이에 따라 ID 50(즉, ICOS에 대한 ICOS L-Fc의 결합의 50%를 억제하는 양)을 결정하였다.
ID 50이 더 작을수록, 더 많은 mAb가 재조합 ICOS Fc와 용이하게 경쟁한다.
따라서, 본 발명자들은 ICOS R 314-8 및 ICOS R 53-3이 결합 부위에 대한 높은 친화성(ED 50 < 0.5ug/ml) 및 유의적인 차단 능력(ID 50 < 1mg/ml)을 갖는다는 점을 입증하였다.
따라서, 항체 ICOS R 314-8이 선택되어 플루오로크롬 Alexa Fluor 647에 커플링되었으며, 유동세포분석법 분석에서 사용되었다.
2 - 항-ICOS mAb는 활성화된 CD4 + T 세포에 의한 IL-10의 생성을 유도하는 능력 면에서 다르다.
본 발명자들은 기능적 테스트를 이용하여, 아고니스트 항체로서 작용하는, 즉 ICOS의 천연 리간드와 동일한 작용을 나타낼 수 있는, mAb의 능력을 시험하였다. ICOS는 LT에 의해 IL-10의 생성을 유도하기 때문에, 시험된 파라미터는 IL-10의 분비였다.
항-ICOS mAb의 아고니스트성 능력은 CD4 + T 세포에서 시험되었으며, 이는 48시간 동안 CD3/CD28 비드에 의해 전-활성화되고 플레이트상에 배분되었으며, 항-CD3 mAb는 다양한 항-ICOS mAb들과 함께 자극을 지속시키기 위해 코팅되었다.
그 후, 배양 상청액은 IL-10에 대해 48시간 동안 분석되었으며, 다른 항-ICOS mAb들에 의해 유도되는 IL-10의 분비는 시판되는 항-ICOS mAb(ICOS c)에 의해 유도되는 IL-110의 분비에 기초하여 비교되었다.
항-ICOS mAb 53-3, 88-2 및 92-17은 CD4 +의 IL-10 분비를 유의적으로 증가시켰으며, 이는 따라서 아고니스트 항체이다. 항-ICOS mAb 145-1 및 314-8과 관련하여, IL-10의 생성에 있어서 어떠한 유의적인 증가도 관찰되지 않았다.
마지막으로, 본 발명자들은 항-ICOS mAb 53-3, 88-2 및 92-17이 시판되는 항-ICOS보다 더 아고니스트적이라는 점을 보여주었다. 실제로, 시판되는 항-ICOS mAb를 기준으로서 고려한는 경우, 항-ICOS mAb 88-2는 +61%의 IL-10의 분비 증가를 유발하고, 항-ICOS mAb 92-17은 +20%의 분비 증가를 유발하고, 항-ICOS mAb 53-3은 +14%의 분비 증가를 유발한다.
그 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
mAb 이소타입 [ED] 50
(μg/ml)		 [ID] 50
(μg/ml)		 아고니스트 효과
ICOS 88-2 IgG1- L 1.60 17 +++
ICOS 314-8 IgG1- K 0.06 0.29 -
실시예 2: 본 발며의 안타고니스트 항체 및 본 발명의 아고니스트 항체의 사용
재료 및 방법
면역조직화학
동결된 원발성 유방 종양 절편이 마우스 항-FOXP3 또는 항-Ki67로 염색되었으며, 제조사의 지시에 따라 ImmPRESS 항-마우스 Ig 페록시다제 키트(Abcys, Paris, France) 및 DAB를 이용하여 나타내어졌다. 이어서, 두번째 일차 항체 마우스 항-ICOS(53.3), 항-CD3, 항-BDCA2가 첨가되었으며, ImmPRESS 키트 및 Histogreen(Abcys)으로 나타내어졌다. 염색의 특이성은 첫번째 또는 두번째 일차 항체를 대신해서 마우스 이소타입 대조군을 이용하여 분석되었다.
유방 종양, 편도선 및 건강한 혈액으로부터 단핵 세포의 정제
단핵 세포(MNC)는, EFS로부터 수득된 건강한 말초혈액으로부터, 또는 원발성 유방 종양 또는 편도선 샘플의 효소적 절개로부터, Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 정제되었다.
pDC 및 T 세포 서브세트의 표현형 분석
확장적 표현형 분석을 위해, pDC는 CD40, CD86 또는 ICOSL에 대해 FITC 또는 PE 항-CD123 및 PE-Cy5 항-CD4 및 PE-커플링된 항체를 이용하여 CD4+CD123+ 세포로서 전체 MNC 중에서 동정되었다. T 세포는 CD3+CD4+ 세포로서 동정되었다. Treg는 다색 표현형 CD4+ CD127- CD25high에 의해 동정되거나, 또는 CD3+CD4+ T 세포상에 게이팅한 후에 FoxP3 발현으로 동정되었다.
Ta-Treg 및 Ta-Tconv 또는 이의 혈액 대응물의 증식은 KI67 Ab 염색과 연관되는 Treg CD4+(CD127- CD25high) 및 Tconv(CD4+CD127+CD25Low /-) 특징화를 허용하는 다색 분석에 의해 평가되었다.
유동세포분석은 FACScan(BD Biosciences) 또는 ADP Cyan(Beckman Coulter)으로 수행되었으며, Cell Quest Pro 소프트웨어(BD Biosciences) 또는 FlowJo(Treestar)를 이용하여 데이터가 분석되었다.
pDC의 정제
pDC는 CD304/BDCA-4 마이크로비드 키트를 이용한 자기적으로 활성된 세포 선별에 의해, 또는 pDC 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 이용한 음성 감손(negative depletion)에 의해, 또는 Lin-CD4+CD11c- 세포로서 FACS®-선별(FACSVantage SETM DiVa 유동세포분석기, BD Biosciences)에 의해, 계대(Lin)-음성 풍부 MNC로부터 정제되었다. 순도는 일반적으로 >98%였다.
단핵구 유래 DC( MoDC )의 시험관내 제조
MoDC는 GM-CSF(100ng/ml) + IL-4(50UI/ml) 중에서 7일 분화 후에 혈액 정제된 단핵구로부터 획득되었다(Schering Plough, Kenilworth USA).
CD4 + 기억 T 세포 및 Treg 정제
기억 CD4+ T 세포(>95% 순도)는 문헌 [Gobert et al, 2009]에 개시된 바와 같이 항-CD45RA Ab를 포함하는 자성 감손(magnetic depletion) 이후에 MNC로부터 획득되었다. CD4+CD25highCD127- Treg 및 CD4+CD25-CD127low /+ 통상적 CD4+ T 세포가 정제된 기억 CD4+ T 세포로부터 FACS®-선별되었다(순도 >98%).
시험관내 증식을 하기 위해, 정제된 기억 CD4+ T 세포는 CFSE로 0일에 염색되었다. 생존 세포는 세포 투과화의 경우 Live 및 Dead 시약 또는 DAPI 배제에 의해 선택되었다(200,000개 및 5,000개 최소 사건이 각각 전체 세포 군과 정제된 세포에 대해 게이팅되었음).
DC-T 세포 공배양
동종이계(allogeneic) 기억 CD4+ T 세포, Treg 또는 CD4+ Tconv 세포는 R848의 존재하에 IL-3, GM-CSF(10ng/ml)로 24시간 동안 전-활성화된 고도정제된 TApDC, 건강한 pDC 또는 MoDC 및 IL-2(100 IU/ml)와 함께 완전 배지에서 3x104 내지 5x104 세포로 배양되었다. 전-활성화된 DC 서브세트에 대한 T 림프구의 첨가는 1:5의 비율(DC/T 세포)로 96-웰 원형-바닥 플레이트에서 3회 수행되었으며, 5일 동안 공배양되었다. 증식은 FoxP3 발현을 분석하는 실험에서 CFSE 희석에 의해 평가되거나, 또는 3H-TdR 흡수에 의해 분석되는 DNA 합성에 의해 평가되었다.
ICOS/ICOSL 결합의 영향은 배양 중에 ctrl Ab, 시판되는 (ISA-3) 또는 사유 (314.8) 항 ICOS Ab 또는 항 ICOSL (MIH12)를 첨가하여 평가되었다. ELISA에 의해 T 세포 사이토킨 분비를 평가하기 위하여, 세포는 pDC 또는 TApDC와 함께 공배양되었으며, 5일에 수확된 상청액은 원심분리되고 -20℃에서 저장되었다.
인공 비드에 의한 Tconv 및 Treg의 자극
인공 APC는 실시예 1에 기재된 바에 따라 제조되었다. 편도선으로부터 선별된 Treg(3x104) 또는 Tconv(1x105) 또는 종양으로부터 정제된 Ta-CD4+ T 세포(1x105)는 200μL로 96 U-바닥 웰에서 IL-2(100 UI/ml)의 존재하에 1:1의 비율(인공 APC : T 세포)로 인공 비드와 함께 5일 동안 배양되었다. 증식은 CFSE 희석에 의해 또는 3H-TdR 흡수를 통해 분석되는 DNA 합성에 의해 평가되었다.
ELISA에 의한 T 세포 배양 상청액 중 사이토킨 검출
5일 배양 상청액 중 IL-10, IFNγ 및 IL-2가 제조사의 지시에 따라 Bender Medsystems에서 시판되는 키트를 이용하여 ELISA에 의해 정량되었다.
결과
아래에 제시되는 데이터는, 하기 사항을 입증하기 위하여 본 발명자들에 의해 개발된 ICOS에 대한 2개의 항체(즉, 차단 MAb 314.8; 아고니스트 MAb 88.2)의 영향을 분석하게 된다:
i) 유방암에서 관찰되는 면역억제 반응을 파기하는 새롭고 유망한 약물 후보물로서 안타고니스트성 314.8 MAb에 의한 ICOS의 차단; 및
ii) 자가면역 분야에서 흥미로운 Treg의 증폭을 선호하는 CD4+ T 세포상에서 아고니스트 88.2 MAb에 의한 ICOS의 결합.
ICOS를 고도로 발현하는 Ta - Treg는 원발성 유방 종양에서 림프구양 응집체 내에 존재하고 제자리 증식한다.
본 발명자들은 전이의 위험 증가 및 열악한 예후와 연관되는 림프구양 응집체 내에서 원발성 유방 종양에서 CD25high 및 FoxP3을 발현하는 종양 연관 조절 T 세포(Ta-Treg)의 존재를 이미 입증하였다(Gobert et al., 2009). 상기 Ta-Treg는 전체 CD4+ TaT 세포의 15% 내지 25%를 나타내며, ICOS, CD39, GITR 및 HLA-DR을 발현할 때 고도로 활성화되며, TaTconv 증식 및 사이토킨 분비(IL-2, IFNγ)를 억제한다.
종양 동결된 절편상에서 Ki67을 공발현하는 ICOS+ Treg의 존재(도 1A) 또는 Ta-Tconv 및 Tconv(각각, 3% 및 0.3%)에 비해 혈액으로부터 정제된 Ta-Treg 및 Treg(각각, 8% 및 4%) 내에서 KI67+ 세포의 더 높은 비율(도 1B)에 의해 입증된 바와 같이, 상기 Ta-Treg는 원발성 유방 종양 환경 제자리에서 증식한다(Gobert et al., 2009).
상기 생체내 결과와 달리, 본 발명자들은 확장 비드(아고니스트 항 CD3 및 항 CD28로 코팅된 비드)에 의한 정제된 Ta-Treg의 시험관내 자극이 건강한 공여체의 혈액으로부터 정제된 TaTconv 또는 정제된 Treg 또는 Tconv에 의해 관찰되는 것과는 대조적으로 Ta-Treg 증폭에 호의적이지 않을 수 있다는 점을 입증하였다(도 1C).
본 발명자들은 ICOS 결합이 Ta-Treg 증식 및 기능에 필수적이라는 가설을 세웠다.
A) 본 발명의 안타고니스트 항체의 사용
안타고니스트 ICOS mAb(314.8)를 통한 ICOS / ICOS -L 상호작용의 차단
Ta - Treg는 원발성 유방 암종에서 림프구양 응집체 내에서 Ta -pDC와 제자리 상호작용한다.
여러 연구들은 pDC상에서 ICOS-L(ICOS의 특이적 리간드)의 발현을 보고하였다(Janke et al., 2006). 종양 동결 절편에 대해 면역조직화학법을 사용하여, 본 발명자들은 종양을 둘러싸는 림프구양 응집체 내에 존재하는 Ta-CD3+ T 세포가 Ta-pDC BDCA2+와 상호작용한다는 점을 관찰하였다(도 1D 및 1E). FoxP3 및 BDCA2 Ab에 의한 이중 염색은 Ta-Treg가 상기 림프구양 응집체에서 Ta-pDC와 밀접하게 접촉된다는 점을 보여주었으며, 이는 상기 상호작용이 종양에서 ICOS-L에 의한 ICOS 결합을 유리하게 할 것이라는 점을 시사한다(도 1F).
Ta -pDC는 활성화되지만, 제자리 ICOS / ICOS -L 상호작용의 잠재적인 결과로서 ICOS-L을 발현하지 않는다.
종양 분해로부터 정제한 후에, Ta-pDC는 건강한 혈액에 비해 상향조절된 수준의 CD86 및 CD40을 발현하기 때문에 활성화된 표현형을 나타내며, 환자의 혈액 pDC에 매치되었다. 여러 그룹들에 의해 보고된 바와 같이(Ito et al., 2007; Janke et al., 2006), 새롭게 분리된 건강한 혈액 pDC는 IL-3 노출 또는 TLR7/8 결찰 이후에 강하게 조절되지 않는 낮은 수준의 ICOS-L을 발현하며, 이는 다른 DC 서브세트(mDC, MoDC)에서는 관찰되지 않는다. 흥미롭게도, 이의 활성화된 상태(CD86+CD40+)와 대조적으로, Ta-pDC는 막 ICOS-L 발현을 하지 않는다. 반면, 새롭게 분리된 짝지어진 환자의 혈액 pDC 또는 건강한 혈액 pDC는 ICOS-L을 발현한다. TLR7/8 결찰에 따라 또는 IL-3에서 24시간 배양한 후에, 선별된 Ta-pDC는 상기 ICOS-L 발현을 조절하는 능력을 입증하는 강한 ICOS-L 발현을 다시 획득한다(데이터는 나타내지 않음). CD3+ TaT 세포들 중에서, ICOS는 TaTconv(23% MFI: 83) 또는 TaCD8+(2% MFI: 50)과 대조적으로 Ta-Treg(69.9% MFI: 361)상에서 강하게 발현된다. 이러한 결과들은 제자리 ICOS/ICOS-L 상호작용에 의해 Ta-pDC 막에서 ICOS-L 하향조절이 야기된다는 점을 나타낸다.
안타고니스트성 항 ICOS MAb(314.8)를 통한 ICOS / ICOS -L 상호작용의 차단은 pDC에서 ICOS -L 하향조절을 파기한다.
이 가설을 시험하기 위해, 건강한 혈액 T 세포가 편도선으로부터 정제된 TLR7-활성화된 pDC와 함께 배양되었다. 본 발명자들은 T:pDC 비율을 증가시키면서 24시간 배양한 후에 pDC에서 용량 의존적 ICOS-L 하향조절을 관찰하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들의 ICOS에 대한 안타고니스트 MAb(314.8)를 첨가하는 것은 pDC에 대해 상기 ICOS-L 하향조절을 완전히 파기시키고, 그 결과는 시판되는 항 ICOS 항체 (ISA-3)를 이용하여 재현되지 않는다(데이터는 나타내지 않음).
상기 결과는 ICOS/ICOS-L을 통해 Ta-pDC 및 Ta-Treg 상호작용을 입증하고, 이는 ICOS 결찰이 Ta-Treg 활성화 및 증식에 관여될 수 있다는 점을 나타낸다.
CD4 + T 세포와 함께 정제된 Treg와 활성화된 pDC의 공배양은 314.8에 의해 차단된 Treg 증식을 유도하였으나, MoDC는 그렇지 않았다.
Treg 증폭을 유도하는 ICOS/ICOS-L 상호작용의 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 건강한 혈액 정제된 동종이계 TLR7/8(R848)-활성화된 pDC 또는 mDC와 함께 전체 기억 CD4+ T 세포를 배양하였다. 정제된 CD4+ T 세포들 중에서, 3.5%가 FoxP3을 발현하였다(데이터는 나타내지 않음). pDC와 공배양 5일 후에, Treg에 상응하는 FoxP3high 발현 세포의 비율은 12.3%로 증가하고, 314.8 Ab의 첨가는 FoxP3high 세포에서 상기 풍부(enrichment)를 80% 정도 차단한다. 반면, 활성화된 mDC와 CD4+ T 세포의 공배양은 CD4+ T 세포들 중에서 구별되는 FoxP3high 하위 군에 호의적이지 않을 수 있었으며, 314.8의 첨가는 유의적인 효과를 나타내지 않는다(6.3%에서 8%로).
유사한 결과가 종양으로부터 정제된 CD4+ T 세포에 의해 얻어졌다. Ta-Treg Foxp3+는 9%의 새롭게 정제된 CD4+ TaT 세포를 나타낸다(데이터는 나타내지 않음). R848 활성화된 pDC와의 공배양은 Ta-Treg의 비율을 14.5%로 증가시킨 반면, 314.8의 첨가는 출발 수준 미만으로 Ta-Treg 비율을 4.5%로 감소시킨다.
CFSE로 염색된 FACS 선별된 정제 Treg 또는 Tconv 군은 R848-활성화된 pDC 또는 LPS-활성화된 MoDC와 배양되었으며, 유동세포분석법(CFSE 발현의 희석)에 의해 증식 능력이 분석되었다. 먼저, 본 발명자들은 외인성 IL-2의 부재하에, 활성화된 MoDC가 정제된 Treg 증식을 유도하지 않는 반면, Tconv는 강하게 증식한다는 점을 관찰하였다. 이와 달리, 활성화된 pDC와의 공배양은 정제된 Treg 및 Tconv 모두의 강한 증식을 유도할 수 있다.
항-ICOS 314.8 MAb의 첨가는 pDC가 APC로서 사용될 때 Treg 및 Tconv 증식을 강하게 감소시키는 반면, Tconv 증식은 MoDC와의 공배양에서 변화되지 않는다. 본 실험에서, 시판되는 항체(ISA-3 mAb 또는 MIH-12 MAb)에 의한 ICOS 또는 ICOS-L 차단은 pDC/T 공배양에서 Treg 또는 Tconv 증식 어디에도 영향을 미치지 않는다.
상기 데이터는 항-ICOS 314.8 MAb가 Treg에 대해 ICOS 결합을 중화시키고 pDC에 의해 유도되는 확장을 파기한다는 점을 입증한다.
ICOS 및 ICOS -L 차단은 MoDC /T 공배양에 대해 강하게 간섭하지 않으면서 pDC 매개 T 세포 활성화 동안 IL-10 분비를 파기한다.
또한, 314.8 MAb는 활성화된 pDC 자극에 응하여 Tconv 증식을 감소시킨다. 본 발명자들은 Tconv 및 동종이계 R848 활성화된 pDC(도 2A) 또는 LPS 활성화된 MoDC(도 2B) 공배양 동안 Elisa에 의해 IFNγ 및 IL-10 분비에 대한 314.8의 영향을 확인하였다. 상기 실험에서, IL-10 분비는 314.8 mAb에 의해 완전히 파기된다(대조군에서 217 +/- 31 pg/ml, 및 314.8에서 13 +/- 6 pg/ml). 반면, IFNγ 분비는 pDC와의 공배양시에 314.8 MAb의 첨가에 따라 약간 감소된다(대조군에서 32% 감소 507 +/- 53 pg/ml, 및 314.8에서 341 +/- 73 pg/ml)(도 2A). Tconv/MoDC 공배양에서, ICOS 억제는 IL-10 및 IFNγ의 분비를 약간 증가시킨다(도 2B).
B) 본 발명에 따른 아고니스트 항체의 사용
ICOS 결합을 모방하기 위한 아고니스트 항 ICOS MAb(88.2)의 사용
Treg 및 Tconv에서의 ICOS 기능에 대한 이해를 높이기 위하여, 본 발명자들은 정제된 T 세포에 대해 신호를 나타내는 CD3(OKT3); CD28(CD28.2) 및/또는 ICOS(88.2, 표 1)에 관한 아고니스트 MAb로 코팅된 비드를 이용한 인공 APC의 모델을 제조하였다.
Treg에서 아고니스트 MAb(88.2)와의 ICOS 결합은 증식 및 다량의 IL-10을 분비하는 능력을 유도하였다.
먼저, 본 발명자들은 건강한 공여체의 Treg가 외인성 IL-2의 존재하에 항 CD3/88.2 비드에 응하여 증식한다는 점을 관찰하였다(도 3A). IL-2의 존재하에서 TCR 및 ICOS 결합을 통해 활성화될 때 이미 보고된 바와 같이(Simpson et al., 2010; Ito et al., 2008), 정제된 Tconv 및 Treg 하위군은 모두 다량의 IL-10(각각, 311 +/- 22 pg/ml 및 426 +/- 48 pg/ml) 및 낮은 수준의 IFNγ(205 +/- 8 pg/ml 및 381 +/- 12 pg/ml)를 분비한다. 이러한 결과는 항 CD3/항 CD28 비드를 이용하여 얻은 데이터와 대조를 이룬다. 상기 모델에서, Tconv는 다량의 IFNγ(1213 +/- 72 pg/ml) 및 낮은 수준의 IL-10(69 +/- 58 pg/ml)을 분비하는 반면, Treg는 IL-10 및 낮은 수준의 IFNγ(각각, 422 +/- 36 pg/ml 및 305 +/- 31 pg/ml)을 분비한다(도 3B).
종양으로부터 정제된 T 세포에 의한 유사한 실험들은 CD4+ TaT 세포가 ICOS 및 CD28에 응하여 유사한 수준의 IL-10을 생성하는 반면, IFNγ의 수준은 CD28 결합에 비해 ICOS에 대해 더 약하다는 점을 입증하였다(도 3C).
ICOS 결합은 CD28-유도된 IL-2를 차단하고, 결과적으로 증식 및 IFNγ 분비를 감소시킨다.
CD4+ 기억 T 세포는 외인성 IL-2와 독립적으로 항 CD3/항 CD28 자극에 응하여 증식하는 반면, 항 CD3/88.2 자극에 대해서는 어떠한 증식도 관찰되지 않는다(도 4A). hIL-2의 첨가는 용량 의존적 방식으로 상기 증식을 감소시킨다. 흥미롭게도, IL-2의 부재하에 ICOS 및 CD28의 공-결합은 유일한 CD28 결합만에 비해 CD4+ 기억 T 세포의 증식을 유의적으로 감소시키며, 이는 100 UI/ml IL-2의 존재하에 완전히 회복된다. 흥미롭게도, 88.2 mAb를 통한 ICOS 결찰은 항 CD3/항 CD28 자극에 의해 검출되는 IL-2 분비를 파기한다(도 4B). 이를 함께 고려할 때, 오직 CD28 결합만에 비해 ICOS와 CD28이 함께 참여할 때 자발적 IL-2 분비의 감소를 뒷받침하며, 이는 CD28-유도된 IL-2 분비에 대한 ICOS 억제 기능을 시사한다.
더욱이, 외인성 IL-2의 존재하에서도, 본 발명자들은 항 CD3/항 CD28 비드와 비교하여 ICOS 및 CD28이 작동될 때 Tconv에 의해 생성되는 IFNγ가 50% 감소된다는 점을 관찰하였다 (도 4C).
반면, 이미 개시된 바와 같이 세포가 ICOS 작동하에서 활성화될 때 IL-10 분비는 엄격하게 IL-2 의존적이지만(Ito 2008, Paulos 2010), ICOS 신호의 첨가는 항 CD3/항 CD28에 의해 유도되는 IL-10 분비에 영향을 미치지 않는다(도 4C).
이들 결과들을 모두 함께 고려할 때, ICOS 결찰은 (IFNγ 생성의 감소를 통해) Th1 극성화를 촉진하는 항 CD3/항 CD28의 능력을 감소시켰으나, 면역억제 환경의 발달을 촉진하는 IL-10 생성을 유지한다는 점이 입증된다.
88.2 MAb를 통한 ICOS 결합은 Treg 억제 기능을 증가시켰다 .
ICOS 결합이 면역억제 T 세포 반응과 연관될 수 있는지를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 항 CD3/항 CD28/IgG 및 항 CD3/항 CD28/88.2 비드 효능을 비교하는 외인성 IL-2의 부재하의 억제 분석을 설정하였다. ICOS 신호(88.2)의 첨가는 항 CD3/항 CD28/IgG1에 비해 Treg의 억제 기능을 강하게 증가시킨다(항 CD3/항 CD28/IgG에 의한 21% 억제에 비해, 4 Tconv 항 CD3/항 CD28/88.2에 대해 하나의 Treg 조건에서 51% 억제). 이들 결과들을 모두 함께 고려할 때, ICOS 결합은 Tconv의 억제에 대한 민감성의 증가로부터 야기되거나, 또는 더 강한 Treg 억제 능력으로부터 야기될 수 있는, 면역억제 T 세포 반응을 촉진시킨다는 점이 입증된다.
실시예 3: 원발성 유방 종양 내에서 ICOS + Treg 세포의 검출의 예후 영향의 분석
10년의 임상 추적을 갖는 120 파라핀 포매된 원발성 종양 샘플은 시판되는 항 ICOS 래빗 폴리클로날 Ab(Spring Biosciences)를 사용하여 ICOS의 발현에 대해 시험되었다. ICOS+ 세포는 각각의 종양에 대해 6개의 다른 복제물에 대해 이중 블라인드로 정량되었으며, 결과의 평균이 만들어졌다(데이터는 나타내지 않음). 통계 분석을 수행하기 위해, 본 발명자들은 평형화된 그룹을 갖기 위해 컷-오프로서 중앙값을 사용하였다.
단일변량 분석에서, 본 발명자들은 ICOS+ 세포의 존재(>1.66 ICOS+ 세포/스폿)가 높은 종양 등급(p=0.007), 종양 세포에 의한 에스트로겐 수용체의 발현(p=0.018), 루미날 A/B 분자 서브타입(p<0.001) 및 Her2/neu 과발현의 부재(p=0.035)와 연관된다는 점을 입증한다.
전체 생존(OS: overall survival) 또는 무진행 생존(PFS: progression free survival)에 대해, 원발성 유방 종양 내에서 ICOS+ 세포 검출의 영향이 조사되었다.
ICOS-군에서 6/59 사망이 관찰된 반면, 14/61 환자들이 ICOS+에서 사망하였으며, OS에 대해 ICOS+ 검출의 유의적인 예후 값을 보여준다(로그순위검정(Log Rank test) p 값 = 0.0465)(도 9A). PFS에서 수행된 유사한 분석은 ICOS+ 세포가 ICOS- 군에서 11/59의 진행을 보이면서 더 열악한 전체 생존과 연관되었던 반면, ICOS+ 군에서는 20/61 환자들이 진행되었다는 점을 입증하였다(p=0.0285)(도 9B).
실시예 4: 종양 환경에서 ICOS + Treg와 pDC의 제자리 상호작용의 존재의 확인
IL-3(20ng/ml)의 존재하에 48시간 동안 항 ICOS 314.8 MAb 또는 Ctrl Ab의 존재하에 종양 세포 절개의 생체외 공배양. 배양 기간 말기에, pDC에서 ICOS-L의 발현은 항 ICOS 314.8 MAb의 존재하에서만 관찰되고, 대조군 Ab에서는 관찰되지 않으며, 이는 pDC에서 ICOS-L의 하향조절이 ICOS+ 세포와의 상호작용을 통해 매개된다는 점을 입증한다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 5: 구축된 세포주로부터의 또는 새로운 종양 샘플로부터의 상피 유방 종양 세포는 항 ICOS 항체 314.8에 의한 생체외 배양 후에도 흑색종 또는 신경교종 종양 세포와는 달리 ICOS -L을 발현하지 않는다.
유방 상피 종양 세포주는 Ag의 트립신-연관 분해를 피하기 위해 PBS EDTA 중에서 수확되었으며, 세포는 항 ICOS-L 항체로 염색되어 유동세포분석법에 의해 세포 표면에서의 발현이 평가되었다. 시험된 세포주의 어느 것도 ICOS-L에 대해 양성인 것으로 발견되지 않았다(도 5A). 항 ICOS Ab(314.8) 또는 대조군 Ab 및 IL-3(20ng/ml)의 존재하에서 48시간 배양된 일차 종양 분해에 대해 유사한 분석이 이루어졌다(도 5B).
실시예 6: 동계( syngeneic ) 유방 종양 모델에서 유방 종양 성장에 대한 대용의 래트 항-마우스 항 ICOS Ab(17G9, IgG2b)의 영향
마우스 유방 종양 모델이 Neu 15 세포주의 동소 주사 후 28-35일에 암컷 FVB 마우스에서 얻어졌다. 생성된 종양은 활성화된 Ta-pDC, ICOShigh TATreg 및 휴지(resting) TATconv에 의해 유의적으로 침윤되는 것으로 나타난다.
종양 이식 후 11일부터 매주 3회 복강내 17G9 항체(50μg/ml)의 주사는 대조군 Ab(LTF2, IgG2b)의 주사에 비해 늦은 시간지점에서 Neu15 종양 크기의 감소를 야기하였다(p=0.053)(도 6).
실시예 7:
A: Treg 세포 수는 원발성 자궁경부암 내에서 증가된다 .
자궁경부 샘플이 형성이상(dysplasia)(CIN2/3, n=18) 또는 암(n=14)을 갖는 환자로부터 획득되었다. 정상적인 자궁경부 조직이 대조군(n=11)으로 사용되었다. 샘플은 효소적 및 물리적 분리 모두에 의해 획득되었다. 세척 후에, 단핵 세포는 표지된 mAb 및 CD127lowCD25brightCD4+ T 세포로서 열거된 Treg와 함께 인큐베이션되었다. CD4+ 서브세트 내에서 Treg의 백분율이 표현된다. Treg는 정상 조직 및 형성이상에 비해 자궁경부암 샘플 내에서 증가되었다. 따라서, 이러한 증가는 암 발달과 연관된다(도 7A).
B: Treg 세포 ICOS + 는 원발성 자궁경부암 내에서 증가된다 .
자궁경부 샘플이 형성이상(CIN2/3, n=5) 또는 암(n=12)을 갖는 환자로부터 획득되었다. 정상적인 자궁경부 조직이 대조군(n=5)으로 사용되었다. 샘플은 효소적 및 물리적 분리 모두에 의해 획득되었다. 세척 후에, 단핵 세포는 표지된 ICOS mAb 및 열거된 Treg와 함께 인큐베이션되었다. CD4+ 서브세트 내에서 Treg ICOS의 백분율이 표현된다. ICOS+ Treg는 분석되는 샘플의 제한된 수로 인해 자궁경부암에서 증가하는 경향으로만 조직 내에 존재한다(도 7B).
실시예 8: NHL(non Hodgkin lymphoma)에서 ICOS 발현 Treg의 증가.
본 발명자들은 LNH 샘플에서 Treg상에서 ICOS의 발현 및 Treg 수를 분석하였다. 림프절로부터 채취된 새로운 림프종 세포가 사전동의한 45명의 환자로부터 수집되었다. 림프종 샘플들은 Hodgkin 질환(HD, n=11), 여포성 림프종(FL, n=13), 확산 대형 B 세포 림프종(DLBCL, n=10), 맨틀 세포 림프종(MCL, n=5) 및 변연대(marginal zone) 림프종(MZL, n= 6)에 대응한다. Treg 세포의 검출은 항-ICOS-PE(Becton DickinsonTM), 항-CD3-ECD, 항-CD4-Pacific Blue(Beckman Coulter®), 항-CD127 FITC, 항-CD25 APC-Cy7 및 LIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kit(InvitrogenTM)와 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이션에 의해 수행되었다. 염색 후에, 각 세포 제조물은 PBS 중에 2회 세척되고, 2% 파라포름알데히드로 고정되었으며, FACS LSR2 유동세포분석기(Becton DickinsonTM)에서 분석되었다. FlowJo Software(TreeStarTM)를 이용하여 데이터를 분석하였다. Treg는 HD를 제외한 모든 림프종 샘플들에서 증가되었다. 대부분의 Treg는 대조군 림프절에 비해 ICOS의 발현 증가를 나타내었다(도 8).
실시예 9: Icos 314.8( CNCM I- 4180)의 시퀀싱.
전체 RNA가 주어진 동결 하이브리도마 세포로부터 추출되었으며, cDNA가 합성되었다. 그 후, RT-PCR이 수행되어 MAb의 가변영역(중쇄 및 경쇄)이 증폭되었다. 중쇄 및 경쇄의 MAb 가변영역은 개별적으로 클로닝 벡터 내에 클론되었으며, 획득된 서열들은 MAb의 서열을 추정하기 위해 분석되었다.
재료
하이브리도마 세포 ICOS 314.8(CNCM I-4180); TRIzol® Plus RNA Purification System (Invitrogen, Cat. No: 15596-026); SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Cat. No: 18080-051).
방법
전체 RNA 추출
전체 RNA는 TRIzol® Plus RNA Purification System의 기술 매뉴얼에 따라 하이브리도마 세포로부터 분리되었다. 전체 RNA는 겔 전기영동에 의해 확인되었다.
RT-PCR
전체 RNA는 이소타입 특이적 안티센스 프라이머 또는 보편적 프라이머를 이용하여 cDNA로 역전사되었으며, 전체 과정은 SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System의 기술 매뉴얼에 의거하였다. 항체 단편은 GenScript의 RACE 방법의 표준 작동 프로토콜에 따라 증폭될 것이다.
항체 유전자의 클로닝
항체 유전자의 표적 PCR 산물은 표준 분자 클로닝 과정에 따라 개별적으로 클로닝 벡터 내로 클론되었다.
스크리닝 및 시퀀싱
콜로니 스크리닝이 이용되어 정확한 크기의 삽입물을 갖는 클론들이 스크리닝되었으며, 자그마치 10개의 독립적인 양성 콜로니가 항체 단편 각각에 대해 시퀀싱되었다.
결과 및 분석
전체 RNA 추출
샘플의 전체 RNA가 1.5% 아가로스/GelRed TM 겔 전기영동에서 DL3000 DNA 마커와 나란히 런닝되었다.
항체 유전자의 PCR 산물
각 샘플의 4μL PCR 산물이 1.5% 아가로스/GelRed TM 겔 전기영동에서 DL3000 DNA 마커와 나란히 런닝되었다.
시퀀싱 결과 및 분석
시퀀싱 결과는 다음과 같다. 컨센서스 DNA 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 하기에 기재된다:
Figure 112018096264022-pat00001
따라서, ICOS 314.8(CNCM I-4180)의 서열은 하기와 같이 기재될 수 있다:
DNA 서열 아미노산 서열
H-CDR1 GGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCAC
(서열번호 1)		 GYTFTTYWMH
(서열번호 7)
H-CDR2 GAGATTGATCCTTCTGATAGTTATGTTAACTACAATCAAAACTTTAAGGGC
(서열번호 2)		 EIDPSDSYVNYNQNFKG
(서열번호 8)
H-CDR3 TTTGATTAC
(서열번호 3)		 FDY
(서열번호 9)
L-CDR1 AGGTCTAGTAAGAGTCCCCTGCATAGTAACGGCAACATTTACTTATAT
(서열번호 4)		 RSSKSPLHSNGNIYLY
(서열번호 10)
L-CDR2 CGGATGTCCAACCTTGCCTCA
(서열번호 5)		 RMSNLAS
(서열번호 11)
L-CDR3 ATGCAACATCTAGAATATCCGTACACG
(서열번호 6)		 MQHLEYPYT
(서열번호 12)
실시예 10: Icos 88.2( CNCM I- 4177)의 시퀀싱.
전체 RNA가 주어진 동결 하이브리도마 세포로부터 추출되었으며, cDNA가 합성되었다. 그 후, RT-PCR이 수행되어 MAb의 가변영역(중쇄 및 경쇄)이 증폭되었다. 중쇄 및 경쇄의 MAb 가변영역은 개별적으로 클로닝 벡터 내에 클론되었으며, 획득된 서열들은 MAb의 서열을 추정하기 위해 분석되었다.
재료
하이브리도마 세포 ICOS 88.2(CNCM I-4177); TRIzol® Plus RNA Purification System (Invitrogen, Cat. No: 15596-026); SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Cat. No: 18080-051).
방법
전체 RNA 추출
전체 RNA는 TRIzol® Plus RNA Purification System의 기술 매뉴얼에 따라 하이브리도마 세포로부터 분리되었다. 전체 RNA는 겔 전기영동에 의해 확인되었다.
RT-PCR
전체 RNA는 이소타입 특이적 안티센스 프라이머 또는 보편적 프라이머를 이용하여 cDNA로 역전사되었으며, 전체 과정은 SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System의 기술 매뉴얼에 의거하였다. 항체 단편은 GenScript의 RACE 방법의 표준 작동 프로토콜에 따라 증폭될 것이다.
항체 유전자의 클로닝
항체 유전자의 표적 PCR 산물은 표준 분자 클로닝 과정에 따라 개별적으로 클로닝 벡터 내로 클론되었다.
스크리닝 및 시퀀싱
콜로니 스크리닝이 이용되어 정확한 크기의 삽입물을 갖는 클론들이 스크리닝되었으며, 자그마치 10개의 독립적인 양성 콜로니가 항체 단편 각각에 대해 시퀀싱되었다.
결과 및 분석
전체 RNA 추출
샘플의 전체 RNA가 1.5% 아가로스/GelRed TM 겔 전기영동에서 DL3000 DNA 마커와 나란히 런닝되었다.
항체 유전자의 PCR 산물
각 샘플의 4μL PCR 산물이 1.5% 아가로스/GelRed TM 겔 전기영동에서 DL3000 DNA 마커와 나란히 런닝되었다.
시퀀싱 결과 및 분석
시퀀싱 결과는 다음과 같다. 컨센서스 DNA 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 하기에 기재된다:
Figure 112018096264022-pat00002
따라서, ICOS 88.2(CNCM I-4177)의 서열은 하기와 같이 기재될 수 있다:
DNA 서열 아미노산 서열
H-CDR1 GGCTACAGTTTCACCAGCTACTGGATAAAC
(서열번호 17)		 GYSFTSYWIN
(서열번호 23)
H-CDR2 AATATTTATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAATGTTCAAGGAC
(서열번호 18)		 NIYPSDSYTNYNQMFKD
(서열번호 24)
H-CDR3 TGGAATCTTTCTTATTACTTCGATAATAACTACTACTTGGACTAC
(서열번호 19)		 WNLSYYFDNNYYLDY
(서열번호 25)
L-CDR1 AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTAT
(서열번호 20)		 RSSKSLLHSNGNTYLY
(서열번호 26)
L-CDR2 CGGATGTCCAACCTTGCCTCA
(서열번호 21)		 RMSNLAS
(서열번호 27)
L-CDR3 ATGCAACATCTAGAATATCCGTGGACG
(서열번호 22)		 MQHLEYPWT
(서열번호 28)
CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) I-4176 20090702 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) I-4177 20090702 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) I-4178 20090702 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) I-4179 20090702 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) I-4180 20090702
SEQUENCE LISTING <110> INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) INSTITUT JEAN PAOLI & IRENE CALMETTES UNIVERSITE D'AIX-MARSEILLE <120> Antibodies directed against ICOS and uses thereof <130> IP20132302/FR <150> EP11305380.5 <151> 2011-03-31 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 ggctacacct tcaccaccta ctggatgcac 30 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 gagattgatc cttctgatag ttatgttaac tacaatcaaa actttaaggg c 51 <210> 3 <211> 9 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 tttgattac 9 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 aggtctagta agagtcccct gcatagtaac ggcaacattt acttatat 48 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 cggatgtcca accttgcctc a 21 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 atgcaacatc tagaatatcc gtacacg 27 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Val Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Phe Asp Tyr 1 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Arg Ser Ser Lys Ser Pro Leu His Ser Asn Gly Asn Ile Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 13 <211> 426 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 atgggatggc gctgtatcat cctcttcttg gtatcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtccaactac agcagcctgg gactgaactt atgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat cggagagatt gatccttctg atagttatgt taactacaat 240 caaaacttta agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacata 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt tttgtgcgag atcccctgat 360 tactacggta ctagtcttgc ctggtttgat tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 420 tctaca 426 <210> 14 <211> 142 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Met Gly Trp Arg Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Met Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Val Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Pro Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Ala Trp 115 120 125 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr 130 135 140 <210> 15 <211> 396 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agtcattggg 60 gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtcccctg catagtaacg gcaacattta cttatattgg 180 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 240 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctactttcac actgaaaatc 300 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 360 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 396 <210> 16 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Val Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Pro Leu His Ser Asn Gly Asn Ile Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys 130 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 ggctacagtt tcaccagcta ctggataaac 30 <210> 18 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 aatatttatc cttctgatag ttatactaac tacaatcaaa tgttcaagga c 51 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 19 tggaatcttt cttattactt cgataataac tactacttgg actac 45 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 aggtctagta agagtctcct gcatagtaat ggcaacactt acttgtat 48 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 cggatgtcca accttgcctc a 21 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 atgcaacatc tagaatatcc gtggacg 27 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn 1 5 10 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Met Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Trp Asn Leu Ser Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn Tyr Tyr Leu Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 29 <211> 429 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacag tttcaccagc tactggataa actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat cggaaatatt tatccttctg atagttatac taactacaat 240 caaatgttca aggacaaggc cacattgact gtagacaaat cctccaacac agcctacatg 300 cagctcacca gcccgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaag atggaatctt 360 tcttattact tcgataataa ctactacttg gactactggg gccaaggcac cactctcaca 420 gtctcctca 429 <210> 30 <211> 143 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Met Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Thr Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Trp Asn Leu Ser Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn Tyr 115 120 125 Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 31 <211> 396 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg 60 gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 180 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcaa ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 240 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 300 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 360 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 396 <210> 32 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe 85 90 95 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys 130

Claims (16)

  1. ICOS에 대한 항체에 있어서,
    상기 항체는 수탁번호 CNCM I-4179로 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 Icos 145-1인 것을 특징으로 하는, ICOS에 대한 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 항체.
  3. 면역 반응의 Treg 매개 억제와 연관되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한, 제1항에 따른 항체를 활성 성분으로 포함하는 조성물로, 상기 질환 또는 상태는 암 및 만성 감염 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 암은 인간 악성 림프종, 난소암, 자궁경부암 및 유방암 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. ICOS에 대한 항체에 있어서,
    상기 항체는 수탁번호 CNCM I-4176, 및 CNCM I 4178로 2009년 7월 2일에 CNCM에 기탁된 하이브리도마로부터 각각 획득할 수 있는 Icos 53-3, 및 Icos 92-17로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, ICOS에 대한 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 항체.
  7. 과면역 반응과 연관되거나 과면역 반응에 의해 야기되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한, 제5항에 따른 항체를 활성 성분으로 포함하는 조성물로,
    상기 질환 또는 상태는 염증성 장애, 자가면역 질환, 이식 거부증 및 이식편 대 숙주 질환(graft versus host disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 질환 또는 상태는 신경계 염증성 장애, 점막 염증성 질환, 염증성 피부 질환 및 자가면역 관절염으로 이루어진 군에서 선택되는 염증성 장애인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 질환 또는 상태는 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 천식 또는 편도선염, 피부염, 건선, 접촉과민증 및 류머티즘성 관절염 중에서 선택되는 염증성 장애인 것을 특징으로 하는 조성물.
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