ES2714381T3 - Anticuerpos dirigidos contra ICOS y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo dirigido contra ICOS, en el que dicho anticuerpo está seleccionado del grupo que consiste en Icos 53-3, Icos 88-2 e Icos 92-17, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 con los números de acceso CNCM 1-4176, CNCM 1-4177, CNCM I 4178 y derivados de los mismos.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos dirigidos contra ICOS y usos de los mismos

Sector de la tecnica

La invencion se refiere a anticuerpos dirigidos contra ICOS y usos de los mismos.

Estado de la tecnica

En varios canceres, el establecimiento de una respuesta de linfocitos T inmunosupresores se correlaciona con un mal pronostico y progresion de la enfermedad.

Entre los diferentes efectores celulares implicados en el establecimiento de tolerancia inmunitaria, el subconjunto de linfocitos T reguladores CD4+ (Treg) esta especializado en la supresion del otro linfocito T (Tconv), ademas de la funcion dendntica. Dicha supresion puede correlacionarse con una mala tasa de supervivencia del paciente que padece cancer, especialmente cancer de mama.

Se ha mostrado que grandes cantidades de IL-10 y bajas cantidades de IFNy producido por linfocitos T CD4+ estan asociados a capacidad reducida de linfocitos T citotoxicos CD8+, proliferacion de linfocitos T mas baja y participan en la diferenciacion de monocitos en macrofagos inmunosupresores de tipo M2c, relacionados con el macrofago asociado a tumores (TAM).

Los inventores informaron previamente que los linfocitos T CD3+CD4+ de memoria que engloban grandes cantidades de Treg (Ta-Treg) infiltraron tumores de mama primarios. La infiltracion de tumores de mama primarios por Ta-Treg y DC plasmacitoide (pDC) estan ambos asociados a mal pronostico y mala supervivencia del paciente que padece tumores de mama.

Los inventores confirmaron ademas que los mecanismos inmunosupresores que implican a Treg se observan en la mayona de los canceres e infecciones cronicas. Estos mecanismos supresores previenen una respuesta inmunitaria eficiente contra el cancer e infeccion viral cronica.

Actualmente, los Treg son elegidos como diana en canceres e infecciones cronicas usando terapia de celulas, mAb anti-CD25 o quimioterapia de baja dosis. Sin embargo, dichas estrategias no proporcionaron resultados aceptables. Ademas, se ha informado que Treg podna tener una funcion importante en enfermedades asociadas a o producidas por una respuesta inmunitaria excesiva.

Sin embargo, actualmente no hay estrategia disponible y eficiente para tratar enfermedades asociadas a Treg. Asf, todavfa hay una gran necesidad para proporcionar estrategias terapeuticas eficientes que se dirijan a enfermedades que implican a Treg.

Deng Zhong-bin et al (Hybridoma and Hybridomics, vol. 23, n.° 3, 2004, paginas 176-182) desvelan la produccion de anticuerpos monoclonales contra ICOS humano y particularmente de un anticuerpo que induce la proliferacion de linfocitos T y un aumento en la expresion de IL10.

K. Botturi et al (Respiratory Research, vol. 12, 2011, pagina 25) evaluan el papel de los co-receptores CD28, ICOS y CTLA-4 en asma y rinitis alergicas tras la estimulacion con alergenos.

Guo Lei et al (Transplant Immunology, vol. 12, n.° 1, 2003, paginas 41-48) ensenan que el anticuerpo anti-ICOS combinado con un vector de adenovirus recombinante que comprende ADNc CTLA-41g permite inducir inmunotolerancia.

Baowei Peng et al (Blood, vol. 112, n.° 5, 2008, paginas 1662-1672) y las solicitudes de patente publicadas bajo las referencias WO2008/137915, WO2010/056804, EP1374902, EP1374901, EP1125585, US2004/180052 y US2004/146991 desvelan el uso de anticuerpos anti-ICOS para el tratamiento de diversas enfermedades inmunes. R. Wiley et al (American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology; vol. 28 n.° 6, 2003, paginas 722-730) desvelan que la expresion de ICOS es redundante para el reclutamiento y la funcion de los linfocitos T en ratones con enfermedad alergica de las vfas aereas establecida.

Kawamoto et al (Arthritis Research & Therapy, vol. 8, n.° 3, R62, 2006, paginas 1-14) estudia la expresion y la funcion de ICOS en linfocitos T de sangre periferica de pacientes con lupus eritematoso sistemico.

Objeto de la invencion

La invencion se define por las reivindicaciones.

Sorprendentemente, los inventores han mostrado que la interaccion entre ICOS y su ligando desempena una funcion fundamental en la activacion, proliferacion y funcion supresora de Treg en algunos canceres mediante la interaccion con celulas dendnticas plasmacitoides (pDC). Entonces concentraron su esfuerzo en generar anticuerpos espedficos con efectos antagonistas y agonistas.

Los anticuerpos antagonistas son eficientes para tratar una enfermedad o una afeccion asociada a la supresion mediada por Treg de la respuesta inmunitaria. Los anticuerpos agonistas son eficaces para tratar una enfermedad o una afeccion asociada a o producida por una respuesta inmunitaria excesiva.

Asf, la presente divulgacion describe un anticuerpo dirigido contra ICOS o un derivado del mismo que:

> neutraliza la interaccion de ICOS en Treg inhibiendo la fijacion entre ICOS y ICOS-L; y

> anula la proliferacion de Treg inducida por pDC.

En el contexto de la presente divulgacion, dicho anticuerpo tambien puede llamarse "anticuerpo antagonista".

Tambien se describe un anticuerpo dirigido contra ICOS, en la que dicho anticuerpo esta seleccionado del grupo que consiste en Icos 145-1 e Icos 314-8, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia), segun los terminos del Tratado de Budapest, el 2 de julio de 2009 con los numeros de acceso CNCM 1-4179 y CNCM I-4180 y derivados de los mismos.

La divulgacion describe un anticuerpo antagonista dirigido contra ICOS o un derivado del mismo para su uso como un medicamento. La divulgacion describe ademas un anticuerpo antagonista dirigido contra ICOS o un derivado del mismo para su uso para tratar canceres o infecciones cronicas.

La presente invencion se refiere ademas a un anticuerpo dirigido contra ICOS o un derivado del mismo que:

> induce la produccion de IL-10 e IFNy;

> induce la proliferacion de linfocitos T CD4+;

> reduce la proliferacion de Tconv, y

> aumenta la funcion inmunosupresora de Treg.

En el contexto de la presente invencion, dicho anticuerpo tambien puede llamarse "anticuerpo agonista".

La invencion particularmente se refiere a un anticuerpo dirigido contra ICOS, en la que dicho anticuerpo esta seleccionado del grupo que consiste en Icos 53-3, Icos 88-2 e Icos 92-17, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia), segun los terminos del Tratado de Budapest, el 2 de julio de 2009 con los numeros de acceso CNCM I-4176, CNCM I-4177, CNCM I-4178 y derivados de los mismos.

La invencion se refiere a un anticuerpo agonista segun la invencion o un derivado del mismo para su uso como un medicamento. La invencion tambien se refiere a un anticuerpo agonista de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo para su uso para tratar enfermedades autoinmunitarias, rechazo de trasplante o una enfermedad de injerto contra huesped.

Descripcion detallada de la invencion

Definition

Como se usa en el presente documento, los terminos "ICOS" o "coestimulante de linfocitos T inducibles" se refieren a una glucoproterna homodimerica transmembranaria de 55 a 60 kDa que presenta un dominio tipo IgV en su parte extracelular y una tirosina dentro de un motivo YMFM en su parte citoplasmica. Se ha mostrado que la interaccion de ICOS con su ligando induce la fosforilacion de la tirosina en la parte citoplasmica de ICOS. Dicha fosforilacion es responsable del reclutamiento de la subunidad reguladora de p85 PI3K, que activa la via de senalizacion PI3K/AKT. Tambien se describe que la interaccion de ICOS induce la expresion de CD40L en la superficie celular. CD40L se conoce por tener un importante efecto en la cooperacion entre linfocitos T y linfocitos B.

Se ha encontrado que ICOS se expresa, tras la activacion de TCR, en linfocitos T convencionales (subconjuntos CD4+, CD8+ de Tconv), ademas de en Treg. Los inventores mostraron que dicha activacion era mas importante en pacientes que padedan melanoma o cancer de mama.

Como se usa en el presente documento, los terminos "ICOSL", "ICOS-L" y "B7-H2" se refieren a un ligando de ICOS. Dicho ligando esta presente en celulas linfoides tales como linfocitos B, macrofagos, celulas dendnticas, ademas de en celulas no linfoides tales como celulas endoteliales o epiteliales. La interaccion de ICOS tiene una funcion importante en la activacion de linfocitos, e induce la proliferacion y supervivencia de linfocitos T, especialmente Treg.

Como se usa en el presente documento, el termino "JICOS 1" se refiere a una lmea celular espedfica que expresa ICOS.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo monoclonal" en sus diversas formas gramaticales se refiere a una poblacion de anticuerpos que contiene solo una especie de anticuerpo que combina sitios capaces de inmunorreaccionar con un epftope particular. Asf, un anticuerpo monoclonal normalmente muestra una unica afinidad de union por cualquier epitope con el que inmunorreacciona. Un anticuerpo monoclonal puede, por tanto, contener una molecula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinacion de anticuerpo, cada uno inmunoespedfico para un epitope diferente, por ejemplo un anticuerpo monoclonal biespedfico. Aunque historicamente un anticuerpo monoclonal se produjo por inmortalizacion de una lmea celular secretora de inmunoglobulinas clonalmente puras, tambien puede prepararse una poblacion monoclonalmente pura de moleculas de anticuerpo por los metodos de la presente invencion. Los metodos de laboratorio de preparacion de anticuerpos monoclonales son muy conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Harlow et al., 1988). Los anticuerpos monoclonales (mAb) pueden prepararse inmunizando TXAS mutado purificado en un mairnfero, por ejemplo un raton, rata, ser humano y m ai^eras similares. Las celulas productoras de anticuerpo en el m a i^e ro inmunizado se afslan y se fusionan con celulas de mieloma o de heteromieloma para producir celulas tnbridas (hibridoma). Las celulas de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales se utilizan como una fuente del anticuerpo monoclonal deseado. Este metodo convencional de cultivo de hibridomas se describe en Kohler y Milstein (1975). Aunque los mAb pueden producirse por cultivo de hibridomas, la invencion no debe limitarse asf. Tambien se contempla el uso de mAb producidos expresando un acido nucleico clonado de un hibridoma de la presente invencion. Es decir, el acido nucleico que expresa las moleculas secretadas por un hibridoma de la presente invencion puede transferirse a otra lmea celular para producir un transformante. El transformante es genotipicamente distinto del hibridoma original, pero tambien es capaz de producir moleculas de anticuerpo de la presente invencion, que incluyen fragmentos inmunologicamente activos de moleculas de anticuerpo completo, correspondientes a aquellas secretadas por el hibridoma. Veanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 4.642.334 a Reading; publicacion PCT N.°; publicaciones de patente europea N.° 0239400 a Winter et al. y N.° 0125023 a Cabilly et al. Tambien se contemplan tecnicas de generacion de anticuerpos que no implican inmunizacion tales como, por ejemplo, usando tecnologfa de presentacion en fagos para examinar bibliotecas intactas (de animales no inmunizados); vease Barbas et al. (1992), y Waterhouse et al. (1993).

Como se usa en el presente documento, la expresion "anticuerpo anti-ICOS" se refiere a un anticuerpo monoclonal dirigido contra ICOS, preferentemente obtenido usando ICOS-Fc recombinante como inmunogen.

Como se usa en el presente documento, la expresion "derivado de un anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que comprende las 6 CDR de dicho anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, la expresion "mAb 53.3" o "Icos 53-3" se refiere a un anticuerpo monoclonal dirigido contra ICOS depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 bajo el numero de acceso CNCN I- 4176. Dicho anticuerpo es un agonista de ICOS. La expresion "un derivado de mAb 53.3" se refiere a un anticuerpo anti-ICOS que comprende las 6 CDR de mAb 53.3.

Como se usa en el presente documento, la expresion "mAb 88.2" o "Icos 88-2" se refiere a un anticuerpo monoclonal dirigido contra ICOS depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 bajo el numero de acceso CNCN I- 4177. Dicho anticuerpo es un agonista de ICOS. Los inventores han mostrado que usar dicho anticuerpo en presencia de IL-2 favorece la proliferacion de Treg y la secrecion de IL-10. La expresion "un derivado de mAb 88.2" se refiere a un anticuerpo anti-ICOS que comprende las 6 CDR de mAb 88.2.

Las 6 CDR de mAb 88.2 son como en la Tabla 1 a continuacion:

T l 1

Como se usa en el presente documento, la expresion "mAb 92.17" o "Icos 92-17" se refiere a un anticuerpo monoclonal dirigido contra ICOS depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 bajo el numero de acceso CNCN I-4178. Dicho anticuerpo es un agonista de ICOS. La expresion "un derivado de mAb 92.17" se refiere a un anticuerpo anti-ICOS que comprende las 6 CDR de mAb 92.17.

Como se usa en el presente documento, la expresion "mAb 145.1" o "Icos 145-1" se refiere a un anticuerpo monoclonal dirigido contra ICOS depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 bajo el numero de acceso CNCN I-4179. Dicho anticuerpo es un antagonista de ICOS. La expresion "un derivado de mAb 145.1" se refiere a un anticuerpo anti-ICOS que comprende las 6 CDR de 145-1 mAb.

Como se usa en el presente documento, la expresion "mAb 314.8" o "Icos 314-8" se refieren a un anticuerpo monoclonal dirigido contra ICOS depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 bajo el numero de acceso CNCM I-4180. Los inventores han mostrado que usar dicho anticuerpo bloquea la secrecion de IL-10 por Tconv. Dicho anticuerpo es un antagonista de ICOS y esta altamente adaptado para prevenir la funcion de expansion y supresora de linfocitos T reguladores mediada por celulas dendnticas en cancer tal como cancer de mama. La expresion "un derivado de mAb 314.8" se refiere a un anticuerpo anti-ICOS que comprende las 6 CDR de mAb 314.8.

Las 6 CDR de mAb 314.8 son como en la Tabla 2 a continuacion:

T l 2

Como se usa en el presente documento, la expresion "un anticuerpo de la divulgacion" se refiere a:

> un anticuerpo dirigido contra ICOS capaz de neutralizar la interaccion de ICOS en Treg inhibiendo la fijacion entre ICOS y ICOS-L y de suprimir la proliferacion de Treg inducida por celulas dendnticas plasmacitoides, es decir, un anticuerpo antagonista; ademas de

> un anticuerpo dirigido contra ICOS capaz de inducir la produccion de IL-10 e IFNy, para inducir la proliferacion de linfocitos T CD4+; para reducir la proliferacion de T conv y para aumentar la funcion inmunosupresora de T reg, es decir, un anticuerpo agonista.

Dicha expresion tambien engloba cualquier derivado de dichos anticuerpos.

Preferentemente, los anticuerpos de la invencion se eligen de mAb 53,3, 88,2 mAb, 92,17 mAb y los derivados de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresion "anticuerpo antagonista dirigido contra ICOS" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a ICOS sin desencadenar una respuesta celular similar a la respuesta inducida por ICOS que existe de forma natural. La expresion "los anticuerpos antagonistas de la divulgacion" se refiere a mAb 145.1, mAb 314.8 y derivados de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresion "anticuerpo agonista dirigido contra ICOS" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a ICOS y desencadenar una respuesta celular similar a la respuesta inducida por ICOS que existe de forma natural. Dicho anticuerpo asf imita la accion de ICOS. La expresion "el anticuerpo agonista de la invencion" se refiere a mAb 53.3, mAb 88.2, mAb 92.17 y derivados de los mismos.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "celula presentadora de antigenos" y "APC" se refieren a una clase de celulas inmunitarias capaces de internalizar y procesar un antfgeno, de manera que determinantes antigenicos se presentan sobre la superficie de la celula como complejos asociados a MHC, de un modo capaz de ser reconocidos por el sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T citotoxicos limitados a MHC clase I y/o linfocitos T colaboradores limitados a MHC clase II). Las dos propiedades requeridas que permiten que una celula funcione como una APC son la capacidad para procesar antfgenos endocitosados y la expresion de productos genicos de MHC. Ejemplos de APC incluyen celulas dendrfticas (DC), fagocitos mononucleares (por ejemplo macrofagos), linfocitos B, celulas de Langerhans de la piel y, en seres humanos, celulas endoteliales.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "Treg" y "linfocitos T reguladores" se refieren a una poblacion espedfica de linfocitos T que tiene la capacidad de suprimir de forma dominante la proliferacion de linfocitos T respondedores in vitro e inhibir enfermedades autoinmunitarias. Los Treg participan como contribuyentes importantes en el fallo definitivo de las respuestas inmunitarias antitumorales en seres humanos. Por ejemplo, en cancer de ovario, los Treg suprimen los linfocitos T espedficos de tumor y altos numeros de Treg asociados a tumor estan asociados a tiempo de supervivencia reducida. Los inventores han mostrado que los T reg inhiben selectivamente la respuesta inmunitaria del huesped y asf contribuyen a la progresion del cancer, especialmente en cancer de mama. Los Treg se identificaron originalmente como una poblacion de celulas CD4+CD25+, pero tambien se caracterizan por la expresion del factor de transcripcion de la familia forkhead, FoxP3.

Los inventores han mostrado que los Treg proliferan in situ dentro de tejido de cancer de un paciente y expresan los marcadores de la superficie de la celula ICOS y CD39, en comparacion con Treg extrafdos de sangre del mismo paciente.

Por oposicion, el termino "Tconv" se refiere a linfocitos T distintos de Treg. El termino "Tconv" incluye asf linfocitos T que funcionan eliminando el antfgeno (por ejemplo, produciendo citocinas que modulan la activacion de otras celulas o por actividad citotoxica). Este termino incluye linfocitos T colaboradores (por ejemplo, linfocitos Th1 y Th2) y linfocitos T citotoxicos. A este respecto, los linfocitos T colaboradores expresan preferentemente CD4 y expresan niveles bajos e indetectables de CD25. Los linfocitos CTL expresan preferentemente CD8 y niveles bajos e indetectables de c D4. Preferentemente, un linfocito no Treg no expresa no CD4 ni CD25. Preferentemente, un linfocito no Treg no expresa FoxP3.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "linfocitos T reguladores asociados a tumor" y "Ta-Treg" se refieren a linfocitos T reguladores asociados a tumores, por ejemplo a tumores de mama. Los inventores han mostrado de hecho que Ta-Treg estan presentes en los infiltrados linfoides de tejido tumoral mamario y presentan un impacto negativo en la supervivencia del paciente que padece cancer de mama.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "celulas dendrfticas plasmacitoides" y "pDC" se refieren a celulas inmunitarias innatas que circulan en la sangre y se encuentran en organos linfoides perifericos. Constituyen un grupo de celulas que pertenecen al grupo de las celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP).

Como se usa en el presente documento, las expresiones "celulas dendrfticas plasmacitoides asociadas a tumor" y "Ta-pDC" se refieren a celulas dendrfticas plasmacitoides asociadas a tumores, por ejemplo tumores de mama. Los inventores han mostrado que Ta-pDC son capaces de inducir la proliferacion de Ta-Treg bajo la dependencia de la co-estimulacion de ICOS/lCoSL.

Como se usa en el presente documento, los terminos "IL-10" e "interleucina-10" se refieren a un factor de inhibicion de la smtesis de citocinas humanas (CSIF), que es una citocina antiinflamatoria. Esta citocina se produce principalmente por monocitos y a un menor grado por linfocitos. Esta citocina tiene efectos pleiotropicos en la inmunorregulacion e inflamacion. Regula por disminucion la expresion de citocinas Th1, antfgenos de clase II de MHC. Tambien potencia la supervivencia de linfocitos B, proliferacion y produccion de anticuerpos. Esta citocina puede bloquear la actividad de NF-kB, y participa en la regulacion de la via de senalizacion JAK-STAT.

Como se usa en el presente documento, los terminos "IFNy" e "interferon-gamma" se refieren a una protema dimerica con subunidades de 146 aminoacidos. La importancia de IFN-y en el sistema inmunitario es el resultado en parte de su capacidad para inhibir la replicacion viral directamente, y, lo que es mas importante, de sus efectos inmunoestimulantes e inmunomoduladores. IFNy se produce predominantemente por linfocitos citolfticos espontaneos (NK) y linfocitos T citolfticos espontaneos (NKT) como parte de la respuesta inmunitaria innata, y por linfocitos T efectores de linfocitos T citotoxicos (CTL) CD4 y CD8 una vez se desarrolla inmunidad espedfica de antfgeno.

Como se usa en el presente documento, los terminos "tratar" o "tratamiento" significan invertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o afeccion al que se aplica tal termino, o uno o mas smtomas de tal trastorno o afeccion.

Esta prevista una "cantidad terapeuticamente eficaz" para una cantidad minima de agente activo que es necesaria para conferir beneficio terapeutico a un sujeto. Por ejemplo, una "cantidad terapeuticamente eficaz" es una cantidad que induce, mejora o produce de otro modo una mejora en los smtomas patologicos, progresion de la enfermedad o afecciones fisiologicas asociadas a una enfermedad o que mejora la resistencia a un trastorno.

Como se usa en el presente documento, el termino "prevencion" se refiere a aliviar que la enfermedad o afeccion se produzca en un sujeto que todavfa no ha sido diagnosticado con que la tiene. Como se usa en el presente documento, el termino "sujeto" indica un mamfero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Preferentemente, un sujeto segun la invencion es un ser humano.

El termino "cancer" incluye tumores malignos de los diversos sistemas de organos, tales como que afectan el pulmon, mama, tiroides, linfoides, gastrointestinales y v^as genitourinarias, ademas de adenocarcinomas que incluyen tumores malignos tales como la mayona de los canceres de colon, carcinoma de celulas renales, cancer de prostata y/o tumores testiculares, carcinoma de pulmon de celulas no pequenas, cancer del intestino delgado y cancer del esofago.

El termino "enfermedad asociada a Treg" debe considerarse que engloba cualquier enfermedad o trastorno o estado en el que la modulacion de numeros de Treg y/o actividad puede proporcionar un efecto beneficioso. Este termino engloba:

- enfermedades y afecciones asociadas a la supresion mediada por Treg de una respuesta inmunitaria del sujeto, - enfermedades y afecciones asociadas a o producidas por una excesiva respuesta inmunitaria.

Como se usa en el presente documento, la expresion "enfermedades y afecciones asociadas a la supresion mediada por Treg de la respuesta inmunitaria" son enfermedades y afecciones producidas por la supresion por T reg de la proliferacion de celulas inmunomoduladoras tales como linfocito T espedfico de tumor. Como se menciono previamente, los inventores han mostrado que Treg estan asociados a un mal diagnostico y tasa de supervivencia en un paciente que padece cancer.

Ejemplos no limitantes de enfermedades y afecciones asociadas a la supresion mediada por Treg de un sistema inmunitario del sujeto son cancer e infecciones cronicas.

Como se usa en el presente documento, "enfermedades y afecciones asociadas a o producidas por una excesiva respuesta inmunitaria" son, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, rechazo de trasplante o una enfermedad de injerto contra huesped.

Esta expresion engloba ademas afecciones inflamatorias, tales como trastorno inflamatorio del sistema nervioso (por ejemplo, esclerosis multiple), enfermedad inflamatoria de la mucosa (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino, asma o amigdalitis), enfermedad inflamatoria de la piel (por ejemplo, dermatitis, psoriasis o hipersensibilidad por contacto), artritis autoinmune (por ejemplo, artritis reumatoide).

Como se usa en el presente documento, el termino "respuesta inmunitaria" se refiere a la accion concertada de linfocitos, celulas presentadoras de antfgenos, celulas fagocfticas, granulocitos y macromoleculas solubles producidas por las celulas anteriores o el hngado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complemento) que producen dano selectivo a, destruccion de o eliminacion del cuerpo de un sujeto de celulas cancerosas, celulas tumorales metastasicas, melanoma maligno, patogenos invasores, celulas o tejidos infectados con patogenos, o, en casos de autoinmunidad o inflamacion patologica, celulas normales o tejidos de un sujeto.

Como se usa en el presente documento, una "enfermedad autoinmunitaria" es una enfermedad o un trastorno que surge de y se dirige contra los propios tejidos de un individuo.

Anticuerpos antagonistas

Se ha mostrado que ICOS-L, que es un ligando espedfico de ICOS, se expresa en celulas dendnticas plasmacitoides. Los inventores han mostrado que Treg asociados a tumor estuvieron en estrecho contacto con celulas dendnticas plasmacitoides asociadas a tumor, que indica que una interaccion tal permite la interaccion de ICOS con ICOS-L en tumores.

Mostraron ademas que la interaccion ICOS/ICOS-L in situ conduce a la regulacion por disminucion de ICOS-L en la membrana de Ta-pDC. Los inventores han desarrollado un anticuerpo antagonista dirigido contra ICOS y mostraron que la adicion de dicho anticuerpo anula totalmente la regulacion por disminucion de ICOS-L en pDC, que es responsable de la activacion y proliferacion de Ta-Treg.

Los inventores han mostrado que el anticuerpo antagonista segun la divulgacion neutraliza la interaccion de ICOS en Treg y anula su expansion inducida por pDC. Mas exactamente, dicho anticuerpo anula la proliferacion de Treg y la secrecion de IL-10 inducida por la interaccion ICOS/ICOSL.

Los anticuerpos antagonistas de la divulgacion son asf altamente apropiados para anular la respuesta inmunosupresora implicada en el mecanismo patologico. Asf, son utiles para tratar enfermedades y afecciones asociadas a la supresion mediada por Treg de la respuesta inmunitaria.

La divulgacion desvela asf a un anticuerpo dirigido contra ICOS y derivados del mismo que:

> neutraliza la interaccion de ICOS en Treg inhibiendo la fijacion entre ICOS y ICOS-L; y

> anula la proliferacion de Treg inducida por celula dendntica plasmacitoide.

Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado.

Por "neutralizar la interaccion de ICOS en Treg" se indica que el anticuerpo interfiere con la cooperacion entre ICOS y su ligando ICOS-L.

Por "anular la proliferacion de Treg" se indica que una disminucion significativa, preferentemente una detencion total, de la proliferacion de T reg se observa en un tejido diana, preferentemente un tejido tumoral, en comparacion con un tejido de control, preferentemente un tejido no tumoral, mas preferentemente sangre.

La divulgacion se refiere ademas a un anticuerpo dirigido contra ICOS, en el que dicho anticuerpo esta seleccionado del grupo que consiste en Icos 145-1 e Icos 314-8, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 con los numeros de acceso CNCM 1-4179 y CNCM I-4180 y derivados de los mismos.

La divulgacion tambien se refiere a un anticuerpo que comprende las 6 CDR de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Icos 145-1 e Icos 314-8, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 con los numeros de acceso Cn Cm 1-4179 y CNCM I-4180 y derivados de los mismos.

La divulgacion tambien se refiere a un anticuerpo que comprende las 6 CDR de la Tabla 2 anterior.

En otra realizacion, la divulgacion se refiere a un anticuerpo derivado de uno de los anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en Icos 145-1 e Icos 314-8, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 con los numeros de acceso CNCM 1-4179 y CNCM I-4180.

Uso terapeutico de anticuerpos antagonistas

Neutralizando la interaccion de ICOS en Treg y anulando la proliferacion de Treg, los anticuerpos antagonistas de la divulgacion son altamente apropiados para su uso para tratar enfermedades y afecciones asociadas a la supresion mediada por Treg de la respuesta inmunitaria, por ejemplo canceres e infecciones cronicas. Dichos anticuerpos pueden asf usarse para restaurar una inmunidad antitumoral.

La divulgacion, por tanto, se refiere al anticuerpo antagonista dirigido contra ICOS segun la divulgacion o un derivado del mismo para su uso como un medicamento.

La divulgacion se refiere ademas al anticuerpo antagonista dirigido contra ICOS segun la divulgacion o un derivado del mismo para su uso para tratar una enfermedad o una afeccion asociada a la supresion mediada por Treg de la respuesta inmunitaria.

Dicha enfermedad o una afeccion asociada a la supresion mediada por Treg de la respuesta inmunitaria puede ser una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en canceres e infecciones cronicas.

De hecho, los inventores han mostrado que los anticuerpos antagonistas de la divulgacion estan adaptados para modular numeros de Treg y/o actividad de manera que supriman el efecto inmunosupresor relacionado con aquellos Treg. Por tanto, dichos anticuerpos antagonistas representan una estrategia altamente prometedora para tratar enfermedades asociadas a una supresion del sistema inmunitario tal como cancer e infecciones cronicas.

Ejemplos de canceres incluyen, pero no se limitan a, linfoma maligno humano, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de colon, cancer de pulmon, cancer cerebral, cancer de prostata, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, cancer de vejiga, cancer colorrectal, cancer de huesos, cancer de cuello uterino, cancer de Imgado, cancer oral, cancer de esofago, cancer de tiroides, cancer de rinon, cancer de estomago, cancer testicular y cancer de piel.

Ejemplos de infecciones cronicas incluyen, pero no se limitan a, infecciones virales, bacterianas, parastticas o fungicas tales como hepatitis cronica, infecciones de pulmon, infecciones de las vfas respiratorias inferiores, bronquitis, gripe, neumoma y enfermedades de transmision sexual. Ejemplos de infecciones virales incluyen, pero no se limitan a, hepatitis (VHA, VHB, VHC), herpes simple (VHS), herpes zoster, VPH, gripe, SIDA y complejo relacionado con el SIDA, varicela, resfriado comun, infeccion por citomegalovirus (CMV), viruela, fiebre del Colorado por garrapatas, fiebre del dengue, fiebre hemorragica del Ebola, enfermedad de pies y boca, fiebre de Lassa, sarampion, fiebre hemorragica de Marburgo, mononucleosis infecciosa, paperas, norovirus, poliomielitis, leucencefalopatfa multifocal progresiva (PML), rabia, rubeola, SARS, encefalitis viral, gastroenteritis viral, meningitis viral, neumoma viral, enfermedad del Nilo Occidental y fiebre amarilla.

Ejemplos de infecciones bacterianas incluyen, pero no se limitan a, neumoma, meningitis bacteriana, colera, difteria, tuberculosis, carbunco, botulismo, brucelosis, campilobacteriosis, tifus, gonorrea, listeriosis, enfermedad de Lyme, fiebre reumatica, pertussis (tosferina), plaga, salmonelosis, fiebre escarlata, shigelosis, sffilis, tetanos, tracoma, tularemia, fiebre tifoidea e infecciones de las vfas urinarias.

Ejemplos de infecciones parasfticas incluyen, pero no se limitan a, malaria, leishmaniosis, tripanosomiasis, enfermedad de Chagas, criptosporidiosis, fascioliasis, filariasis, infecciones amebicas, giardiasis, infeccion por lombriz intestinal, esquistosomiasis, teniasis, toxoplasmosis, triquinelosis y tripanosomiasis. Ejemplos de infecciones fungicas incluyen, pero no se limitan a, candidiasis, aspergilosis, coccidioidomicosis, criptococcosis, histoplasmosis y pie de atleta.

La divulgacion se refiere ademas a los anticuerpos antagonistas dirigidos contra ICOS segun la divulgacion o un derivado de los mismos para su uso para tratar cancer. Preferentemente, dicho cancer esta seleccionado de linfoma maligno humano, cancer de ovario, cancer de cuello uterino y cancer de mama. Lo mas preferentemente, dicho cancer es cancer de mama.

La divulgacion tambien se refiere a un metodo de tratamiento de una enfermedad o una afeccion asociada a la supresion mediada por Treg de la respuesta inmunitaria es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en canceres e infecciones cronicas, preferentemente canceres e infecciones cronicas, preferentemente canceres, en la que dicho metodo comprende la etapa de administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo antagonista dirigido contra ICOS segun la divulgacion o un derivado del mismo.

Anticuerpos agonistas dirigidos contra ICOS

Se ha encontrado que la interaccion de ICOS se asocia a una respuesta de linfocitos T inmunosupresores. De hecho, se ha descrito que dicha interaccion reduce la produccion de IL-10 e IFNy y reduce la proliferacion de linfocitos T CD4+. Por tanto, como se prueba por los inventores, un anticuerpo agonista de ICOS proporciona el efecto opuesto y es beneficioso para tratar enfermedades asociadas a o producidas por una excesiva respuesta inmunitaria. La divulgacion se refiere asf a un anticuerpo dirigido contra ICOS o un derivado del mismo que:

> induce la produccion de IL-10 e IFNy;

> induce la proliferacion de linfocitos T CD4+;

> reduce la proliferacion de Tconv, y

> aumenta la funcion inmunosupresora de Treg.

Por "inducir la produccion de IL-10 e IFNy" se indica que se observa un aumento significativo de la produccion de IL-10 e IFNy.

Por "inducir la proliferacion de linfocitos T CD4+" se indica que se observa un aumento significativo de la proliferacion de linfocitos T CD4+ en un tejido diana, preferentemente un tejido tumoral, en comparacion con un tejido de control, preferentemente un tejido no tumoral, mas preferentemente sangre.

Por "reducir la proliferacion de Tconv" se indica que se observa una disminucion significativa de la proliferacion de Tconv en un tejido diana, preferentemente un tejido tumoral, en comparacion con un tejido de control, preferentemente un tejido no tumoral, mas preferentemente sangre.

Por "aumentar la funcion inmunosupresora de Treg" se indica que se observa un aumento significativo de la actividad supresora de Treg.

En una realizacion, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En una realizacion, dicho anticuerpo es un anticuerpo quimerico.

En una realizacion, dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

La invencion se refiere ademas a un anticuerpo dirigido contra ICOS, en la que dicho anticuerpo esta seleccionado del grupo que consiste en Icos 53-3, Icos 88-2 e Icos 92-17, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 con los numeros de acceso CNc M I-4176, CNCM I-4177, CNCM I-4178 y derivados de los mismos.

La invencion tambien se refiere a un anticuerpo que comprende las 6 CDR de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Icos 53-3, Icos 88-2 e Icos 92-17, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 con los numeros de acceso CNCM I-4176, CNCM I-4177, CNCM I-4178.

La invencion tambien se refiere a un anticuerpo que comprende las 6 CDR de la Tabla 1 anterior.

En otra realizacion, la invencion se refiere a un derivado anticuerpo de uno de los anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en Icos 53-3, Icos 88-2 e Icos 92-17, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 con los numeros de acceso CNCM I-4176, CNCM I-4177, CNCM I-4178.

Uso terapeutico de anticuerpos agonistas de la invencion

La invencion tambien se refiere al anticuerpo agonista dirigido contra ICOS de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo para su uso como un medicamento.

La invencion tambien se refiere al anticuerpo agonista dirigido contra ICOS de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo para su uso para tratar una enfermedad o una afeccion asociada a o producida por una excesiva respuesta inmunitaria.

La invencion tambien se refiere al anticuerpo agonista dirigido contra ICOS de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo para su uso para tratar una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o una enfermedad de injerto contra huesped.

En una realizacion particular, dicha enfermedad autoinmunitaria esta seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide (AR), diabetes mellitus dependiente de insulina (diabetes de tipo 1), esclerosis multiple (EM), enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistemico (LES), esclerodermia, smdrome de Sjogren, penfigo vulgar, penfigoide, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, anemia aplasica, anemia hemolftica autoinmune, hepatitis autoinmune, celiaqma, dermatomiositis, smdrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, leucopenia idiopatica, purpura trombocitopenica idiopatica, infertilidad masculina, enfermedad mixta de tejido conjuntivo, miastenia grave, anemia perniciosa, uveftis facogenica, cirrosis biliar primaria, mixedema primario, smdrome de Reiter, smdrome del hombre ngido, tirotoxicosis, colitis ulcerativa y granulomatosis de Wegener.

En otra realizacion, la invencion tambien se refiere al anticuerpo agonista dirigido contra ICOS de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo para su uso para tratar un trastorno inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en trastorno inflamatorio del sistema nervioso tal como esclerosis multiple, enfermedad inflamatoria de la mucosa tal como enfermedad inflamatoria del intestino, asma o amigdalitis, enfermedad inflamatoria de la piel tal como dermatitis, psoriasis o hipersensibilidad por contacto, y artritis autoinmune tales como artritis reumatoide.

La invencion tambien se refiere a un metodo de tratamiento de una enfermedad o una afeccion asociada a o producida por una excesiva respuesta inmunitaria, preferentemente una enfermedad autoinmunitaria, un rechazo de trasplante, una enfermedad de injerto contra huesped, o un trastorno inflamatorio, en la que dicho metodo comprende la etapa de administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo agonista dirigido contra ICOS de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo.

Secuencia de acidos nucleicos que codifica un anticuerpo de la invencion

Otra realizacion de la invencion se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que codifica un anticuerpo de uno de los anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en 53,3 mAb, 88,2 mAb, 92,17 mAb y derivados de los mismos.

En una realizacion particular, la invencion se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que codifica el dominio VH o el dominio VL de uno de los anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en 53,3 mAb, 88,2 mAb, 92,17 mAb y derivados de los mismos.

Normalmente, dicho acido nucleico es una molecula de ADN o de ARN, que puede incluirse en cualquier vector adecuado, tal como un plasmido, cosmido, episoma, cromosoma artificial, fago o un vector viral.

Los terminos "vector", "vector de clonacion" y "vector de expresion" significan el vehmulo por el que una secuencia de ADN o de ARN (por ejemplo, un gen extrano) pueden introducirse en una celula huesped, de manera que transformen el huesped y promuevan la expresion (por ejemplo, transcripcion y traduccion) de la secuencia introducida. Asf, otro objetivo de la invencion se refiere a un vector que comprende un acido nucleico de la invencion. Tales vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador y similares, para producir o dirigir la expresion de dicho anticuerpo tras la administracion a un sujeto. Ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresion para la celula de animal incluyen promotor temprano y potenciador de SV40, promotor de LTR y potenciador del virus de la leucemia de raton de Moloney, promotor y potenciador de cadena H de la inmunoglobulina y similares.

Puede usarse cualquier vector de expresion para la celula de animal, mientras que un gen que codifica la region C del anticuerpo humano pueda insertarse y expresarse. Ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 beta d2-4- y similares. Otros ejemplos de plasmidos incluyen plasmidos replicantes que comprenden un origen de replicacion, o plasmidos integrativos, tales como por ejemplo pUC, pcDNA, pBR, y similares. Otros ejemplos de vector viral incluyen vectores de virus adenoviral, retroviral, del herpes y AAV. Tales virus recombinantes pueden producirse por tecnicas conocidas en la tecnica, tales como por transfeccion de celulas de encapsidacion o por transfeccion transitoria con plasmidos colaboradores o virus. Ejemplos tfpicos de celulas de encapsidacion de virus incluyen celulas PA317, celulas PsiCRIP, celulas GPenv+, celulas 293, etc. Protocolos detallados para producir tales virus recombinantes defectuosos en la replicacion pueden encontrarse, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96/22378, US 5.882.877, US 6.013.516, US 4.861.719, US 5.278.056 y WO 94/19478.

Otro objetivo de la presente invencion se refiere a una celula que ha sido transfectada, infectada o transformada por un acido nucleico y/o un vector segun la invencion. El termino "transformacion" significa la introduccion de un gen "extrano" (es dedr, extrmseco o extracelular), secuencia de ADN o ARN a una celula huesped, de manera que la celula huesped exprese el gen introducido o la secuencia para producir una sustancia deseada, normalmente una protema o enzima codificada por el gen o secuencia introducido. Una celula huesped que recibe y expresa el ADN o ARN introducido ha sido "transformado". Los acidos nucleicos de la invencion pueden usarse para producir un anticuerpo de la invencion en un sistema de expresion adecuado. El termino "sistema de expresion" significa una celula huesped y vector compatible bajo condiciones adecuadas, por ejemplo para la expresion de una protema codificada por a Dn extrano llevado por el vector e introducido a la celula huesped.

Sistemas de expresion comunes incluyen celulas huesped de E. coli y vectores plasmfdicos, celulas huesped de insecto y vectores de baculovirus, y celulas huesped de mairnfero y vectores. Otros ejemplos de celulas huesped incluyen, sin limitacion, celulas procariotas (tales como bacterias) y celulas eucariotas (tales como celulas de levadura, celulas de mamnfero, celulas de insecto, celulas vegetales, etc.). Ejemplos espedficos incluyen levaduras de E. coli, Kluyveromyces o Saccharomyces, lmeas celulares de mamnfero (por ejemplo, celulas Vero, celulas CHO, celulas 3T3, celulas COS, etc.), ademas de cultivos de celulas de mamnfero primarios o establecidas (por ejemplo, producidos a partir de linfoblastos, fibroblastos, celulas embrionarias, celulas epiteliales, celulas nerviosas, adipocitos, etc.). Ejemplos tambien incluyen celula SP2/0-Agl4 de raton (ATCC CRL1581), celula P3X63-Ag8.653 de raton (ATc C CRL1580), celula CHO en l que un gen de dihidrofolato reductasa (denominado en lo sucesivo "gen DHFR") es defectuoso, celula YB2/3HL.p2.G11.16Ag,2O de rata (ATCC CRL1662, denominado en lo sucesivo "celula YB2/0"), y similares.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo de produccion de una celula huesped recombinante que expresa un anticuerpo segun la invencion, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

(i) introducir in vitro o ex vivo un acido nucleico recombinante o un vector como se ha descrito anteriormente en una celula huesped competente,

(ii) cultivar in vitro o ex vivo la celula huesped recombinante obtenida, y

(iii) opcionalmente, seleccionar las celulas que expresan y/o secretan dicho anticuerpo. Tales celulas huesped recombinantes pueden usarse para la produccion de anticuerpos de la invencion.

Composicion farmaceutica segun la invencion

La invencion tambien se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo de la invencion.

Por tanto, un anticuerpo de la invencion puede combinarse con excipientes farmaceuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberacion sostenida, tales como polfmeros biodegradables, para formar composiciones terapeuticas.

"Farmaceuticamente" o "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion adversa, alergica u otra no deseada cuando se administran a un mam^fero, especialmente un ser humano, segun convenga. Un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable se refiere a una carga solida, semi-solida o lfquida no toxica, diluyente, material de encapsulamiento o auxiliar de formulacion de cualquier tipo.

La forma de las composiciones farmaceuticas, la via de administracion, la dosificacion y el regimen naturalmente dependen de la afeccion que va a tratarse, la gravedad de la enfermedad, la edad, peso y sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden formularse para una administracion topica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutanea o intraocular, y similares.

Preferentemente, las composiciones farmaceuticas contienen vehmulos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion capaz de ser inyectada. Estas pueden ser en particular soluciones salinas esteriles isotonicas (fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, y similares, o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adicion, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solucion salina fisiologica, permiten la constitucion de soluciones inyectables.

Las dosis usadas para la administracion pueden adaptarse en funcion de diversos parametros, y en particular en funcion del modo de administracion usado, de la patologfa relevante, o alternativamente de la duracion deseada del tratamiento. Para preparar composiciones farmaceuticas, una cantidad eficaz del anticuerpo puede disolverse o dispersarse en un vehmulo farmaceuticamente aceptable o medio acuoso. Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles; formulaciones que incluyen aceite de sesamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida hasta el punto de que exista facil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe preservarse contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacologicamente aceptables en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Tambien pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles Kquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Un anticuerpo de la invencion puede formularse en una composicion en una forma neutra o de sal. Sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clortndrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico, y similares. Sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien puede derivar de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o ferrico, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares.

El vetnculo tambien puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales.

La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y por el uso de tensioactivos.

La prevencion de la accion de microorganismos puede provocarse por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro sodico.

La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan soluciones inyectables esteriles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros componentes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion.

Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vetnculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros componentes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de secado a vacfo y liofilizacion que dan un polvo del principio activo mas cualquier componente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada por filtracion del mismo.

Tambien se contempla la preparacion de soluciones mas concentradas o altamente concentradas para inyeccion directa, donde se preve el uso de DMSO como disolvente para producir penetracion extremadamente rapida, administrando altas concentraciones de los agentes activos a una pequena area de tumor.

Tras la formulacion, las soluciones se administraran de un modo compatible con la formulacion de dosificacion y en tal cantidad que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas de dosificacion, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero tambien pueden emplearse capsulas de liberacion de farmaco y similares.

Para administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion debe ser adecuadamente tamponada, si fuera necesario, y el diluyente lfquido convertirse primero en isotonico con solucion salina suficiente o glucosa.

Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. A este respecto, medios acuosos esteriles que pueden emplearse seran conocidos para aquellos expertos en la materia en vista de la presente divulgacion. Por ejemplo, una dosificacion podna disolverse en 1 ml de solucion isotonica de NaCl y tanto anadirse a 1000 ml de lfquido de hipodermoclisis como inyectarse en el sitio de infusion propuesto (vease, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edicion, paginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producira alguna variacion en la dosificacion dependiendo de la afeccion del sujeto que esta tratandose. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.

Los anticuerpos de la invencion pueden formularse dentro de una mezcla terapeutica para comprender aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, o aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis o asi. Tambien puede administrarse dosis multiples. Ademas de los compuestos formulados para administracion parenteral, tal como inyeccion intravenosa o intramuscular, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros solidos para administracion por via oral; capsulas de liberacion con el tiempo; y cualquier otra forma actualmente usada.

En ciertas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartfculas para la introduccion de anticuerpos en celulas huesped. La formacion y uso de liposomas y/o nanopartfculas son conocidos para aquellos expertos en la materia.

Las nanocapsulas pueden generalmente atrapar compuestos de una forma estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debido a la sobrecarga polimerica intracelular, tales partfculas ultrafinas (de tamano aproximadamente 0,1 pm) se disenan generalmente usando poKmeros capaces de ser degradados in vivo. Nanopartfculas de poli(cianoacrilato de alquilo) biodegradables que cumplen estos requisitos se contemplan para su uso en la presente invencion, y tales partfculas pueden ser facilmente preparadas.

Se forman liposomas a partir de fosfoKpidos que se dispersan en un medio acuoso y espontaneamente forman vesfculas bicapa concentricas multilaminares (tambien llamadas vesfculas multilaminares (MLV)). Las MLV tienen generalmente diametros de 25 nm a 4 pm. La sonicacion de MLV produce la formacion de pequenas vesfculas unilaminares (SUV) con diametros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una solucion acuosa en el nucleo. Las caractensticas ffsicas de los liposomas dependen del pH, fuerza ionica y la presencia de cationes divalentes.

Metodo de produccion de anticuerpos de la invencion

Los anticuerpos de la invencion pueden producirse por cualquier tecnica conocida en la tecnica, tal como, sin limitacion, cualquier tecnica qrnmica, biologica, genetica o enzimatica, tanto sola como en combinacion.

Conociendo la secuencia de aminoacidos de la secuencia deseada, un experto en la materia puede producir facilmente dichos anticuerpos, por tecnicas convencionales para la produccion de polipeptidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse usando el muy conocido metodo en fase solida, preferentemente usando un aparato de smtesis de peptidos comercialmente disponible (tal como aquel fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, los anticuerpos de la invencion pueden sintetizarse por tecnicas de ADN recombinante muy conocidas en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden obtenerse como productos de expresion de ADN despues de la incorporacion de las secuencias de ADN que codifican los anticuerpos en vectores de expresion y la introduccion de tales vectores en huespedes eucariotas o procariotas adecuados que expresaran los anticuerpos deseados, a partir de los cuales pueden aislarse despues usando tecnicas muy conocidas.

En particular, la invencion se refiere ademas a un metodo de produccion de un anticuerpo de la invencion, metodo que comprende las etapas que consiste en:

(i) cultivar una celula huesped transformada segun la invencion en condiciones adecuadas para permitir la expresion de dicho anticuerpo; y

(ii) recuperar el anticuerpo expresado.

En otra realizacion particular, el metodo comprende las etapas de:

(i) cultivar el hibridoma depositado como CNCM I-4176, CNCM I-4177 o CNCM I-4178 en condiciones adecuadas para permitir la expresion del anticuerpo; y

(ii) recuperar el anticuerpo expresado.

Los anticuerpos de la invencion se separan adecuadamente del medio de cultivo por procedimientos de purificacion de inmunoglobulina convencionales tal como, por ejemplo, protema A-Sepharose, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.

En una realizacion particular, el anticuerpo quimerico humano de la presente invencion puede producirse obteniendo secuencias nucleicas que codifican el dominio VL y VH como se describen previamente, construyendo un vector de expresion de anticuerpo quimerico humano insertandolas en un vector de expresion para la celula de animal que tiene genes que codifican Ch de anticuerpo humano y CL de anticuerpo humano, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresion en una celula de animal. Como dominio CH de un anticuerpo quimerico humano, puede ser cualquier region que pertenezca a la inmunoglobulina humana, pero aquellas de clase IgG son adecuadas y tambien puede usarse una cualquiera de las subclases que pertenecen a la clase IgG, tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Por tanto, como CL de un anticuerpo quimerico humano, puede ser cualquier region que pertenezca a Ig, y pueden usarse aquellas de clase kappa o clase lambda. Metodos de produccion de anticuerpos quimericos implican ADN recombinante convencional y las tecnicas de transfeccion genica son muy conocidas en la tecnica (veanse los documentos de patente US5.202.238; y US5.204.244).

El anticuerpo humanizado de la presente invencion puede producirse obteniendo secuencias de acidos nucleicos que codifican dominios CDR, como se ha descrito previamente, construyendo un vector de expresion de anticuerpo humanizado insertandolas en un vector de expresion para celula de animal que tiene genes que codifican (i) una region constante de la cadena pesada identica a la de un anticuerpo humano y (ii) una region constante de la cadena ligera identica a la de un anticuerpo humano, y expresando los genes introduciendo el vector de expresion en una celula de animal.

El vector de expresion de anticuerpo humanizado puede ser tanto de un tipo en el que un gen que codifica una cadena pesada del anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera del anticuerpo existen en vectores separados como de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tandem). Con respecto a la facilidad de construccion de un vector de expresion de anticuerpo humanizado, la facilidad de introduccion en celulas de animales, y el equilibrio entre los niveles de expresion de las cadenas H y L de anticuerpo en celulas de animales, se prefiere el vector de expresion de anticuerpo humanizado de tipo tandem. Ejemplos de vector de expresion de anticuerpo humanizado de tipo tandem incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18 y similares.

Metodos de produccion de anticuerpos humanizados basados en tecnicas de ADN recombinante y de transfeccion genica convencionales son muy conocidos en la tecnica. Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de tecnicas conocidas en la tecnica que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (documento EP 239.400; publicacion PCT WO91/09967; patentes de EE.Uu . N.° 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), inactivacion o acondicionamiento superficial (documentos EP 592.106; EP 519.596) y barajado de cadenas (patente de EE.UU. N.° 5.565.332). La tecnologfa de ADN recombinante general para la preparacion de tales anticuerpos tambien es conocida (veanse la solicitud de patente europea EP 125023 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576).

Fab de la presente invencion puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona espedficamente con ICOS con una proteasa, papama. Por tanto, Fab puede producirse insertando ADN que codifica Fab del anticuerpo en un vector para el sistema de expresion procariota, o para el sistema de expresion eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (segun convenga) para expresar Fab.

F(ab')2 de la presente invencion puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona espedficamente con ICOS con una proteasa, pepsina.

Por tanto, F(ab')2 puede producirse uniendo Fab' descrito mas adelante mediante un enlace tioeter o un enlace disulfuro.

Fab' de la presente invencion puede obtenerse tratando F(ab')2 que reacciona espedficamente con ICOS humano con un agente reductor, ditiotreitol. Por tanto, Fab' puede producirse insertando a Dn que codifica el fragmento Fab' del anticuerpo en un vector de expresion para procariota, o un vector de expresion para eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (segun convenga) para realizar su expresion.

scFv de la presente invencion puede producirse obteniendo ADNc que codifica los dominios VH y VL como se describio previamente, construyendo a Dn que codifica scFv, insertando el ADN en un vector de expresion para procariota, o un vector de expresion para eucariota, y entonces introduciendo el vector de expresion en un procariota o eucariota (segun convenga) para expresar scFv. Para generar un fragmento scFv humanizado, puede usarse una tecnologfa muy conocida llamada injerto de CDR, que implica seleccionar las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un fragmento scFv de donante, e injertarlas en una region estructural del fragmento scFv humano de estructura tridimensional conocida (veanse, por ejemplo, los documentos WO98/45322; WO 87/02671; US5.859.205; US5.585.089; US4.816.567; EP0173494).

Se contemplan modificacion (modificaciones) de la secuencia de aminoacidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede desearse mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del anticuerpo. Se sabe que cuando un anticuerpo humanizado se produce por injerto simple de solo CDR en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en FR de VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de union al antfgeno se reduce en comparacion con la del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Se considera que varios restos de aminoacidos de VH y VL del anticuerpo no humano, no solo en CDR sino tambien en FR, estan directamente o indirectamente asociados a la actividad de union al antfgeno. Por lo tanto, la sustitucion de estos restos de aminoacidos con diferentes restos de aminoacidos derivados de FR de VH y VL del anticuerpo humano reducina la actividad de union.

Con el fin de resolver el problema, en anticuerpos injertados con CDR humanas, se han hecho intentos por identificar, entre las secuencias de aminoacidos de FR de VH y VL de anticuerpos humanos, un resto de aminoacido que este directamente asociado a la union al anticuerpo, o que interaccione con un resto de aminoacido de CDR, o que mantenga la estructura tridimensional del anticuerpo y que este directamente asociado a la union al antfgeno. La reducida actividad de union al antfgeno podna aumentarse reemplazando los aminoacidos identificados con restos de aminoacidos del anticuerpo original derivado de un animal no humano.

Pueden hacerse modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente invencion, y en las secuencias de ADN que las codifican, y todavfa obtener una molecula funcional que codifica un anticuerpo con caractensticas deseables. Al hacer cambios en las secuencias de aminoacidos, puede considerarse el mdice hidropatico del aminoacido. La importancia del mdice hidropatico del aminoacido en conferir funcion biologica interactiva en una protema es generalmente entendida en la materia. Se acepta entonces que el caracter hidropatico relativo del aminoacido contribuye a la estructura secundaria de la protema resultante, que a su vez define la interaccion de la protema con otras moleculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antfgenos, y similares.

A cada aminoacido se le ha asignado un mdice hidropatico basandose en su caractensticas de hidrofobia y de carga, estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cistema/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamate (-3,5); glutamina (-3,5); aspartate (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Otra realizacion de la presente invencion tambien engloba variantes conservativas de funcion de los anticuerpos de la presente invencion.

"Variantes conservativas de funcion" son aquellas en las que un resto de aminoacido dado en una protema o enzima ha sido cambiado sin alterar la conformacion y funcion globales del polipeptido, que incluyen, pero no se limitan a, sustitucion de un aminoacido con uno que tiene propiedades similares (tal como, por ejemplo, polaridad, potencial del enlace de hidrogeno, acido, basico, hidrofobo, aromatico, y similares).

Aminoacidos distintos de aquellos indicados como conservados pueden diferenciarse en una protema de manera que el porcentaje de similitud de secuencias de protemas o de aminoacidos entre cualesquiera dos protemas de funcion similar pueda variar y pueda ser, por ejemplo, del 70 % al 99 % como se determina segun un esquema de alineamiento tal como por el metodo de Cluster, en el que la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN.

Una "variante conservativa de funcion" tambien incluye un polipeptido que tiene al menos el 60 % de identidad de aminoacidos como se ha determinado por los algoritmos BLAST o FASTa , preferentemente al menos el 75 %, mas preferentemente al menos el 85 %, todavfa preferentemente al menos el 90 %, e incluso mas preferentemente al menos el 95 %, y que tiene las mismas propiedades o funciones o sustancialmente similares a la protema nativa o parental con la que se compara. Dos secuencias de aminoacidos son "sustancialmente homologas" o "sustancialmente similares" cuando mas del 80 %, preferentemente mas del 85 %, preferentemente mas del 90 % de los aminoacidos son identicos, o mas de aproximadamente el 90 %, preferentemente mas del 95 %, son similares (funcionalmente identicas) con respecto a la longitud completa de la secuencia mas corta. Preferentemente, se identifican secuencias similares u homologas por alineamiento usando, por ejemplo, el programa de compilacion GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin), o cualquiera de los algoritmos de comparacion de secuencias tales como BLAST, FASTA, etc.

Por ejemplo, ciertos aminoacidos pueden ser sustituidos por otros aminoacidos en una estructura de protema sin perdida de actividad apreciable. Como la capacidad interactiva y naturaleza de una protema define la actividad funcional biologica de la protema, pueden hacerse ciertas sustituciones de aminoacidos en una secuencia de protemas, y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN, mientras que, sin embargo se obtiene una protema con propiedades similares. Asf se contempla que pueden hacerse diversos cambios en las secuencias de anticuerpos de la invencion, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos anticuerpos, sin perdida apreciable de su actividad biologica.

Se sabe en la tecnica que ciertos aminoacidos pueden ser sustituidos por otros aminoacidos que tienen un mdice hidropatico o puntuacion similar y todavfa producen una protema con actividad biologica similar, es decir, todavfa obtienen una protema biologica funcionalmente equivalente. Como se explica resumidamente anteriormente, las sustituciones de aminoacidos se basan generalmente, por tanto, en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoacidos, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamano, y similares.

Sustituciones a modo de ejemplo que tienen en consideracion diversas de las anteriores caractensticas son muy conocidas para aquellos expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Otro tipo de modificacion de aminoacidos del anticuerpo de la invencion puede ser util para alterar el patron de glucosilacion original del anticuerpo.

Por "alterar" se indica delecionar uno o mas restos de hidrato de carbono encontrados en el anticuerpo, y/o anadir uno o mas sitios de glucosilacion que no estan presentes en el anticuerpo.

La glucosilacion de anticuerpos normalmente esta unida en N. "Unida en N" se refiere a la union del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias de tripeptidos asparagina-X-serina y asparaginas-X-treonina, donde X es cualquier aminoacido, excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la union enzimatica del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Asf, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripeptidos en un polipeptido crea un posible sitio de glucosilacion. La adicion de sitios de glucosilacion al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoacidos de forma que contenga una o mas de las secuencias de tripeptidos anteriormente descritas (para sitios de glucosilacion unidos en N). Otro tipo de modificacion covalente implica acoplar químicamente o enzimaticamente glucosidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la produccion del anticuerpo en una celula huesped que tenga capacidades de glucosilacion para la glucosilacion unida a N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el (los) azucar(es) puede unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cistema, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) restos aromaticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina o triptofano, o (f) el grupo amida de glutamina. Por ejemplo, tales metodos se describen en el documento WO87/05330.

La eliminacion de cualquier resto de hidrato de carbono presente en el anticuerpo puede llevarse a cabo químicamente o enzimaticamente. La desglucosilacion química requiere la exposicion del anticuerpo al compuesto acido trifluorometanosulfonico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento produce la escision de la mayona o todos de los azucares, excepto el azucar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el anticuerpo intacto.

La escision enzimatica de restos de hidrato de carbono en anticuerpos puede lograrse por el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas.

Otro tipo de modificacion covalente del anticuerpo comprende unir el anticuerpo a uno de una variedad de polfmeros no proteinaceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, en la manera expuesta en las patentes de EE.UU. N.° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Tambien puede desearse modificar el anticuerpo de la invencion con respecto a la funcion efectora, por ejemplo para potenciar la citotoxidad mediada por celula dependiente de antigeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o mas sustituciones de aminoacidos en una region Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el (los) resto(s) de cistema puede(n) introducirse en la region Fc, permitiendo asf la formacion de enlaces disulfuro intercatenarios en esta region. El anticuerpo homodimerico asf generado puede tener capacidad de internalizacion mejorada y/o elevada destruccion de celulas mediada por el complemento y/o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) (Caron PC. et al. J Exp Med. 1992 Oct 1;176(4):1191-5 y Shopes B. J Immunol. 1992 May 1;148(9):2918-22).

Metodo de diagnostico

La presente divulgacion tambien se refiere a un metodo de diagnostico de un elevado riesgo de recafda o muerte prematura en un paciente con cancer de mama. De hecho, como se muestra en el Ejemplo 3, la presencia de un alto numero de linfocitos Treg ICOS+ esta asociada a progresion libre supervivencia o supervivencia global mas baja para pacientes con cancer de mama.

Asf, la divulgacion se refiere a un metodo de diagnostico de un elevado riesgo de recafda o muerte prematura en un paciente con cancer de mama, que comprende la etapa de cuantificar celulas Treg ICOS positivas (ICOS+) en una muestra de dicho paciente. Si dicho numero es alto, por ejemplo superior a 1,7 celulas ICOS+/mancha si se usa el metodo del Ejemplo 3 y la Figura 9, entonces hay un elevado riesgo de recafda o muerte prematura en dicho paciente con cancer de mama.

La divulgacion tambien se refiere a un metodo de seleccion de pacientes susceptibles que estan tratandose por inmunoterapia anti-ICOS, que comprende la etapa de cuantificar celulas T reg ICOS positivas en una muestra de dicho paciente. Dicha inmunoterapia puede ser anticuerpos anti-ICOS de la invencion.

Dicha muestra puede proceder de una biopsia. Dicha cuantificacion de celulas Treg ICOS+ puede realizarse gracias a anticuerpos anti-ICOS, especialmente gracias a uno cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente.

Tratamiento en el modelo de tumor mamario pre-clinico

Como se muestra en el Ejemplo 6, el tratamiento de un modelo murino establecido de tumor mamario con un anticuerpo anti-ICOS murino de rata neutralizante sustituto (17G9, IgG2b), reduce la progresion tumoral, reforzando el potencial de tratamiento con anticuerpos anti-ICOS neutralizantes de la divulgacion para favorecer la regresion tumoral en la subpoblacion de pacientes con alta deteccion de Treg ICOS+ en su tumor de mama primario.

La invencion se ilustrara adicionalmente en vista de las siguientes figuras y ejemplo.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Ta-Treg expresan fuertemente ICOS, se co-localizan con Ta-pDC y proliferan in situ pero no proliferan in vitro.

A- Se tineron secciones congeladas de tumor con Ab anti-ICOS (verde) y Ab Ki67 (marron) y Ab anti-murino secundario conjugado con HRP y se revelaron respectivamente con HistoGreen y DAB (aumentos 10x y 40x para el recuadro insertado)).

B- (Expresion de Ki67) Se analizo por citometna de flujo multicolor en Treg (CD4+CD127' CD25alto) y Tconv (CD4+CD127+CD25bajo/-) dentro de tumor primario (Ta-Treg, Ta-Tconv) o sangre emparejada (Treg, Tconv). C- Treg y Tconv purificados de tanto tumor primario como sangre sana se cultivaron en una placa de fondo en U de 96 pocillos en presencia de 500 UI/ml de IL-2. El numero de celulas se cuantifico cada 4 dfas por conteo.

D-F Se tineron secciones congeladas de tumor con Ab anti-CD3 (marron) y se contratineron con hematoxilina (azul) (10x y 40x en el recuadro insertado) (D); Ab CD3 (verde) y BDCA2 (marron) (20x y 40x en el recuadro insertado) (E); Ab FoxP3 (marron) y BDCA2 (verde) (20x y 40x en el recuadro insertado) (F).

Figura 2: El bloqueo de ICOS e ICOS-L anula la secrecion de IL-10 durante la activacion mediada por pDC de linfocitos T sin interferir fuertemente en el co-cultivo de MoDC/T. Se co-cultivaron pDC purificadas y activadas con R848 o MoDC durante 5 dfas con linfocitos T CD4+ de memoria alogenos en presencia de Ab de Ctrl, anti-ICOS (314.8) o anti-ICOS-L (MIH12). En el dfa 5, se cuantificaron IL-10 e IFNy por ELISA en sobrenadantes de co-cultivo de pDC/T (A) y co-cultivo de MoDC/T (B).

Figura 3: La co-estimulacion de ICOS y CD3 favorece la proliferacion de Treg y de Tconv, ademas de IL-10, pero no la secrecion de IFNy en presencia de IL-2 exogena.

A/B- Treg o Tconv clasificados por FACS producidos a partir de airngdala se cultivaron durante 5 dfas solos o con perlas recubiertas con mAb agonista CD3/IgG, CD3/88.2, CD3/CD28 en presencia de IL-2 (n=3). La proliferacion se evaluo por incorporacion de [3H]-timidina (A). Se midieron los niveles de IL-10 e IFNy por ELISA en el sobrenadante de cultivo (B).

C- Linfocitos TaT CD4+ clasificados de tumor se cultivaron durante 5 dfas con perlas recubiertas con anti-CD3/IgG; anti-CD3/88.2 o anti-CD3/antiCD28 en presencia de IL-2 exogena (100 UI/ml). Las concentraciones de IL-10 e IFNy en el sobrenadante se cuantificaron por ELISA.

Figura 4: La interaccion de ICOS bloquea la IL-2 inducida por CD28 y, por consiguiente, reduce la proliferacion y secrecion de IFNy

A- Linfocitos T de memoria CD4+ marcados con CFSE se cultivaron durante 5 dfas con las diferentes perlas solas o en presencia de concentracion escalonada de rhIL-2 exogena (20 UI/ml y 100 UI/ml) y la proliferacion se evaluo por dilucion de CFSE por citometna de flujo.

B- IL-2 se detecto por ELISA despues de 5 dfas cultivo con las diferentes perlas sin IL-2 exogena.

C- Linfocitos T de memoria CD4+ de sangre de donantes sanos se cultivaron durante 5 dfas con las diferentes perlas solas o en presencia de IL-2 exogena (100 UI/ml). Las secreciones de IL-10 e IFNy se cuantificaron por ELISA.

Figura 5: Ausencia de expresion de ICOS-L en lmeas celulares de tumor de mama y dilaceraciones de tumor de mama primario

A- Se evaluo la expresion de ICOS-L por citometna de flujo en suspensiones de lmeas celulares epiteliales de tumor de mama recogidas en PBS-EDTA en ausencia de tripsina para evitar el deterioro de Ag.

B- Se evaluo la expresion de ICOS-L en celulas tumorales (celulas CD45-) despues de 48 h de cultivo en presencia de Ab de control (lmea discontinua) o Ab anti-ICOS (314.8) (lmea continua).

Figura 6: El tratamiento de tumores mamarios Neu15 primarios con un Ab anti-ICOS anti-raton de rata sustituto (17G9, IgG2b) ralentiza el crecimiento tumoral.

Figura 7:

A: Los numeros de linfocitos Treg son elevados dentro de cancer de cuello uterino primario.

B: Los linfocitos Treg ICOS+ son elevados dentro de cancer de cuello uterino primario.

Figura 8: Aumento de Treg que expresan ICOS en linfoma no Hodgkin (NHL)

HD Enfermedad de Hodgkin

FL Linfoma folicular

DLBCL Linfoma difuso de linfocitos B grandes

MCL Linfoma de celulas del manto

MZL Linfoma de la zona marginal

Figura 9: La presencia de linfocitos Treg ICOS+ dentro de tumores de mama primarios tiene un impacto negativo sobre la supervivencia

Se probaron 120 muestras de tumor primario incorporadas en parafina con seguimiento clmico de 10 anos para su expresion de ICOS usando un Ab policlonal de conejo anti-ICOS comercial. La media de celulas ICOS+ se evaluo en seis manchas diferentes. Para realizar el analisis estadfstico se uso la mediana como corte para tener grupos equilibrados.

Se muestra el impacto de la expresion de ICOS segun la presencia de ICOS en el tumor primario sobre la supervivencia global (A) o progresion libre supervivencia (B).

EJEMPLO

EJEMPLO 1: Caracterizacion de los anticuerpos segun la invencion

MATERIAL Y METODOS

I. Biologia celular

1 - Seleccion / Purificacion de celulas

* Aislamiento de celulas mononucleares de sangre periferica

Se aislaron CMSP (celulas mononucleares de sangre periferica) de trasplante de celulas madre perifericas de voluntarios sanos (Etablissement Francais du sang, Marsella, Francia) por gradiente de Lymphoprep (Abcys). En tubos: se depositan 2 / 3 de sangre gota a gota sobre 1 / 3 de Lymphoprep y se centrifugan durante 20 minutos a 2000 rpm a 20 °C sin aceleracion para no alterar el gradiente. Despues de la centrifugacion, las celulas mononucleares se recuperan y se lavan dos veces en PBS 1 % de FCS (suero de ternero fetal) heparina durante 20 min a 1000 rpm a 20 °C.

Entonces, las celulas se usaron inmediatamente o se congelaron a -80 °C a 50.106 celulas / ml en RPMI 1640, 50 % de FCS, 10 % de DMSO (sulfoxido de dimetilo). Despues de 24 h, las celulas se transfieren a nitrogeno para la preservacion.

*Seleccion negativa de CD4

Se purificaron linfocitos T CD4+ de CMSP. Despues de descongelarlas, las celulas se lavaron y se diluyeron en 40 pl de tampon de clasificacion (PBS 0,5 % de BSA EDTA 2 mM) para 10.106 celulas. Se uso el kit MACS human CD4 T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec): se anaden 10 pl de una solucion de anticuerpos monoclonales conjugados con biotina (marcado primario) y la mezcla se incubo durante 10 min a 4 °C con agitacion.

Las celulas se ponen entonces en contacto con 20 pl de perlas magneticas acopladas con anti-biotina (marcado secundario) durante 15 min a 4 °C con agitacion. Despues de lavar con clasificacion de tampon, las celulas se clasificaron en Automacs (Miltenyi). Entonces se afsla la fraccion negativa agotada en linfocitos T CD4 marcados. Esto da una poblacion de CD4+ puras de aproximadamente el 95 %.

2 - Activacion y cultivo celular

* Pre-activacion con perlas CD3 / CD28 y entonces estimulacion con mAb

Los linfocitos T CD4+ se ponen a la concentracion de 106 celulas / ml de RPMI, 10 % de FCS, en presencia de perlas CD3 / CD28 (Dynabeads, Invitrogen) (1 celula / 1 perla) y se incuban durante 48 h a 37 °C. Las celulas se separan entonces de las perlas con un iman y reposan en Dynal Biotech durante la noche en RPMI 10 % de FCS a una concentracion de 106 celulas/ml.

Por otra parte, los mAb anti-CD3 (OKT3), anti-ICOS (ICOS 88-2) y mAb de IgG1 de control (Sigma) se recubrieron sobre una placa plana de 96 pocillos durante la noche a 4 °C. Los pocillos se recubren con 50 ng/ml de anti-CD3 complementado con 20 pg/ml en otros mAb PBS 1 x 100 pl/pocillos. Al dfa siguiente, la placa se lava con PBS, se satura dos horas con PBS, 5 % de FCS (200 pl por pocillo). Los linfocitos T CD4+ con el CFSE previamente incorporado (vease abajo) se distribuyen sobre la placa recubierta a una tasa de 2105 celulas / 200 pl de medio / pocillo y se incuban durante 72 h a 37 °C. A las 48 h, los sobrenadantes se recogieron y a las 72 h las celulas se recogieron para analizar la proliferacion por citometna de flujo (Figura 4).

* Activacion por APC artificiales

Se lavaron perlas magneticas (Dynabeads M-450 Epoxy, Invitrogen) en tampon fosfato de sodio 0,1 M y luego se incubaron con mAb anti-CD3 (OKT3) a una concentracion inferior a la optima de 1 mg/1.107 perlas que representaba el 5 % de los mAb acoplados con las perlas, con los mAb anti-CD28 o ICOS (ICOS 88-2 o CD28.2), (2 pg / 1.107 perlas, 10 %). Estas APC artificiales se incubaron con mAb con rotacion lenta durante la noche a 4 °C. Al dfa siguiente, se realizan dos lavados en PBS 0,1% de BSA. Las APC artificiales se distribuyen sobre una perla para una celula en una placa redonda de 96 pocillos sobre la que se depositaron 2.105 linfocitos T CD4+ / 200 pl por pocillo y entonces se incubaron durante 72 h a 37 °C. Los linfocitos T CD4+ han incorporado previamente el CFSE. A las 48 h, se recogieron sobrenadantes y a las 72 h las celulas se recogieron para analizar la proliferacion por citometna de flujo.

3 - Proliferacion celular

La proliferacion de linfocitos va seguida de CFSE (diacetato de carboxifluorescema-succinimidil ester) (Molecular Probes, Invitrogen). CFSE es permeable a las celulas y no fluorescente. Cuando entra en la celula, las esterasas escinden los grupos acetato que llegan a ser fluorescentes mientras que la celula llega a ser impermeable.

La caractenstica de CFSE es la de ser compartido equitativamente en cada celula recien formada en cada division. Emite en la radiacion verde, que permite el analisis simultaneo del numero, posicion y la etapa de diferenciacion de las celulas, siendo la intensidad de fluorescencia por celula proporcional a la concentracion de CFSE. Para marcar las celulas con CFSE, la suspension de celulas se diluye en 1X PBS fno. Anadir CFSE: 5 pM a 10.106 celulas. Las celulas se ponen entonces en un bano de agua a 37 °C.

Despues de 8 a 10 minutos de agitacion, las celulas se dispusieron rapidamente sobre hielo para detener la reaccion. Las celulas se centrifugan entonces dos veces con 2 ml de PBS 1X. Finalmente, se recogen en el volumen deseado de RPMI 10 % de FCS para cultivo. La proliferacion se determina gracias a citometna de flujo.

II - Citometna de flujo

Se diluyen celulas CD4+ con 30 % de BSA PBS (50 pl/pocillo) en una placa de 96 pocillos durante 10 minutos a 4 °C para saturar sitios no espedficos. Entonces se incuban durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad, con los anticuerpos deseados acoplados a un fluorocromo.

Despues de dos lavados en PBS 1 X 1 % de BSA 0,02 % de azida (centrifugacion 2100 rpm, 3 min a 4 °C), las celulas se fijaron en 200 pl de PBS 2 % de formaldelddo y se dispusieron en un citometro de flujo (FACS Canto, BD Biosciences). Los resultados se analizan gracias al software FlowJo.

III - ELISA (enzimoinmunoanalisis de adsorcion)

Se recogen sobrenadantes de cultivo de linfocitos T CD4+ a las 48 h y se guardan a -20 °C para un ensayo en IL-10, IFNy y TNFa.

RESULTADOS

1- Caracterizacion de mAb anti-ICOS

Los inventores desarrollaron 5 Ab anti-ICOS. Su isotipo se ensayo por ELISA. Para obtener un analisis indirecto de su afinidad por su receptor, los mAb se probaron usando transfectantes estables que expresaban ICOS. Celulas JICOS.1 estuvieron en presencia de un intervalo cada vez mayor de mAb anti-ICOS marcados con una sonda acoplada a un fluorocromo (PE-GAM: anti-raton-PE de cabra) y el analisis se hizo gracias a flujo de citometna.

Asf, fue posible determinar la DE50, es decir, la concentracion de mAb que satura el 50 % de los sitios. Los mAb con la DE50 mas baja son aquellos con la afinidad aparente mas alta.

Entonces, los inventores probaron la capacidad de mAb anti-ICOS para inhibir la union de ICOS-L (una forma recombinante de dominio Fc de IgG1 humana) llevado por la celula JICOS.1.

Usaron un gradiente de concentracion de mAb anti-ICOS y revelaron la fijacion a Fc de ICOS L gracias a una sonda acoplada a un fluorocromo (GAH-PE: anti-PE humano de cabra). El analisis se hizo por citometna de flujo. Los inventores determinaron asf la DI50, es decir, la dosis que inhibe el 50 % de la union de ICOS L-Fc sobre ICOS. Cuanto mas pequena sea DI50, mas mAb compite facilmente con Fc de ICOS recombinante.

Los inventores demostraron asf que ICOS R 314-8 e ICOS R 53-3 tienen una alta afinidad por su sitio de union (DE 50 <0,5 ug/ml) y un potencial de bloqueo significativo (DI50 <1 mg/ml).

El anticuerpo ICOS R 314-8 se eligio, por tanto, para acoplarse al fluorocromo Alexa Fluor 647 y se uso en analisis de citometna de flujo.

2 - Los mAb anti-ICOS se diferencian en su capacidad para inducir la produccion de IL-10 por linfocito T CD4+ activado Los inventores probaron la capacidad de los mAb para actuar de agonistas de anticuerpo, es decir, de ser capaces de tener la misma accion que el ligando natural de ICOS, usando pruebas funcionales. El parametro estudiado fue la secrecion de IL-10, ya que ICOS induce la produccion de IL-10 por LT.

Se probo el potencial agonista de los mAb anti-ICOS sobre linfocitos T CD4+, que se pre-activaron con perlas CD3/CD28 durante 48 h y se distribuyeron sobre una placa donde el mAb anti-CD3 se recubrio para continuar la estimulacion junto con los diversos mAb anti-ICOS.

Los sobrenadantes de cultivo se ensayaron entonces durante 48 h para IL-10 y se comparo la secrecion de IL-10 inducida por los diferentes mAb anti-ICOS basandose en la secrecion de IL-110 inducida por un mAb anti-ICOS comercialmente disponible (ICOS c)

Los mAb anti-ICOS 53-3, 88-2 y 92-17 aumentaron significativamente la secrecion por IL-10 de CD4+ y asf son anticuerpos agonistas. En relacion con los mAb anti-ICOS 145-1 y 314-8, no se detecto aumento significativo en la produccion de IL-10.

Los inventores mostraron finalmente que los mAb anti-ICOS 53-3, 88-2 y 92-17 son mejores agonistas que los anti-ICOS comercialmente disponibles. De hecho, si uno considera el mAb anti-ICOS comercialmente disponible como referencia, el mAb anti-IcOs 88-2 produce elevada secrecion de IL-10 de 61 %, mAb anti-ICOS 92-17 de 20 % y mAb anti-ICOS 53-3 de 14 %.

Los resultados se resumen en la siguiente tabla:

EJEMPLO 2: Uso de un "anticuerpo antagonista de la divulgacion y un anticuerpo agonista de la invencion

MATERIAL Y METODOS

Inmunohistoquimica

Se tineron secciones de tumor de mama primario congelado con anti-FOXP3 de raton, o anti-Ki67 y se revelaron usando el kit de peroxidasa de anti-Ig de raton ImmPRESS (Abcys, Paris, Francia) segun las instrucciones del proveedor y DAB. Entonces, se anadio el segundo anticuerpo primario (anti-ICOS de raton (53.3), anti-CD3, anti-BDCA2 y se revelo con el kit ImmPRESS kit e HistoGreen (Abcys). La especificidad de la tincion se evaluo usando controles de isotipo de raton en lugar del primer o el segundo anticuerpo primario.

Purificacion de celulas mononucleares de tumores de mama, amfgdalas y sangre sana

Se purificaron celulas mononucleares (CMN), de sangre periferica sana obtenida de EFS o de dilaceracion enzimatica de tumores de mama primarios o muestras de airngdalas, por centrifugacion en gradiente de densidad Ficoll.

Analisis fenotipico de subconjuntos de pDC y linfocitos T

Para el amplio analisis fenotipico, se identificaron pDC entre las CMN totales como celulas CD4+CD123+ usando FITC o PE anti-CD 123 y PE-Cy5 anti-CD4 y anticuerpos acoplados a PE contra CD40, CD86 o ICOSL. Los linfocitos T se identificaron como celulas CD3+CD4+. Se identificaron Treg tanto por el fenotipo multi-color CD4+ CD127' CD25alto como para su expresion de FoxP3 despues de seleccionarse en linfocitos T CD3+CD4+.

La proliferacion de Ta-Treg y Ta-Tconv o su homologo de sangre se evaluo por analisis multicolor permitiendo la caracterizacion de Treg CD4+ (CD127'CD25alto) y Tconv (CD4+CD127+CD25Bajo/‘) asociada a tincion de Ab Ki67. El analisis de citometria de flujo se realizo en un FACScan (BD Biosciences) o un ADP Cyan (Beckman Coulter) y los datos se analizaron con el software Cell Quest Pro (BD Biosciences) o FlowJo (Treestar).

Purificacion de pDC

Se purificaron pDC de CMN enriquecidos linaje (Lin)-negativo por tanto clasificacion de celulas activadas magneticamente usando el kit de microperlas CD304/BDCA-4 o agotamiento negativo usando el kit de aislamiento de pDC (Miltenyi Biotec)) como por clasificacion con FACS® (citometro de flujo FACSVantage SE™ DiVa, BD Biosciences) como celulas Lin'CD4+CD11c. La pureza fue rutinariamente >98 %.

Generacion in vitro de DC derivadas de monocitos (MoDC)

Se obtuvieron MoDC de monocitos purificados de sangre despues de 7 dfas de diferenciacion en GM-CSF (100 ng/ml) IL-4 (50 UI/ml) (Schering Plough, Kenilworth EE.UU.).

Purificacion de linfocitos T de memoria CD4+ y Treg

Se obtuvieron linfocitos T CD4+ de memoria (>95 % de pureza) a partir de CMN despues del agotamiento magnetico que incluye Ab anti-CD45RA, como se describio (Gobert et al, 2009). Treg CD4+CD25altoCD127‘ y linfocitos T CD4+ convencionales CD4+CD25'CD127bajo/+ se clasificaron por FACS® a partir de linfocitos T CD4+ de memoria purificados (pureza >98%).

Para seguir su proliferacion in vitro, se tineron linfocitos T CD4+ de memoria purificados en el dfa 0 con CFSE. Se seleccionaron celulas viables por exclusion con DAPI o reactivo Live and Dead en caso de permeabilizacion celular (se seleccionaron 200.000 y 5.000 eventos mmimos en la poblacion de celulas totales y en celulas purificadas, respectivamente).

Co-cultivos de DC-linfocitos T

Se cultivaron linfocitos T CD4+ de memoria alogenos, linfocitos Treg o Tconv CD4+ a 3 x 104 a 5 x 104 celulas en medio completo con IL-2 (100 UI/ml) y TApDC altamente purificadas, pDC sanas o MoDC que se pre-activaron durante 24 h con IL-3, GM-CSF (10 ng/ml) en presencia de R848. La adicion de linfocitos T en subconjuntos de DC pre-activadas se hizo por triplicado en placas de fondo redondo de 96 pocillos a una relacion de 1:5 (DC/linfocitos T) y se co-cultivaron durante 5 dfas. La proliferacion se evaluo tanto por dilucion de CFSE en experimented que analizan la expresion de FoxP3 como por smtesis de ADN analizado por captacion de 3H-TdR.

El impacto de la interaccion de ICOS/ICOSL se evaluo mediante la adicion de Ab de ctrl, Ab anti-ICOS comercial (ISA-3) o patentado (314.8) o anti-ICOSL (MIH12) en los cultivos. Para evaluar la secrecion de citocinas por linfocitos T por ELISA, las celulas se co-cultivaron con pDC o TApDC, y los sobrenadantes se recogieron en el dfa 5, se centrifugaron y se guardaron a -20 °C.

Estimulacion de Tconv y Treg con perlas artificiales

Se produjeron APC artificiales como se describio en el Ejemplo 1. Se cultivaron Treg (3x104) o Tconv (1x105) clasificados de amfgdala o linfocitos Ta-T CD4+ (1x105) purificados de tumores durante 5 dfas con perlas artificiales a una relacion 1:1 (APC artificial: linfocito T) en presencia de IL-2 (100 UI/ml) en 96 pocillos de fondo en U bajo 200 pl. La proliferacion se evaluo tanto por dilucion de CFSE como por analisis de ADN analizado por captacion de 3H-TdR.

Deteccion de citocinas en sobrenadantes de cultivos de linfocitos T por ELISA

Se cuantificaron por ELISA IL-10, IFNy e IL-2 en sobrenadantes de cultivo de 5 dfas usando kits comerciales de Bender Medsystems segun las instrucciones del fabricante.

RESULTADO

Los datos presentados a continuacion pretenden analizar el impacto de dos anticuerpos contra ICOS (es decir, mAb de bloqueo 314.8; mAb agonista 88.2) desarrollados por los inventores con el fin de validar

i) el bloqueo de ICOS por el mAb antagonista 314.8 como un nuevo farmaco candidato prometedor para suprimir la respuesta inmunosupresora observada en cancer de mama; y

ii) la interaccion de ICOs por el mAb agonista 88.2 en linfocitos T CD4+ para favorecer la amplificacion de Treg que sena de interes en el campo de la autoinmunidad.

Ta-Treg que expresan altamente ICOS estan presentes dentro de agregados linfoides en tumores de mama primarios y proliferan in situ

Los inventores han demostrado previamente la presencia de linfocitos T reguladores asociados a tumor (Ta-Treg) que expresan CD25alto y FoxP3 en tumores de mama primarios dentro de agregados linfoides que se correlacionan con un mal pronostico y riesgo elevado de metastasis (Gobert et al., 2009). Estos Ta-Treg representan del 15 % al 25 % de linfocitos TaT CD4+ totales, son altamente activados ya que expresan ICOS, CD39, GITR y HLA-DR y suprimen la proliferacion de Ta Tconv y la secrecion de citocinas (IL-2, IFNy).

Estos Ta-Treg proliferan dentro del entorno del tumor de mama primario in situ (Gobert et al., 2009) como se demuestra por tanto la presencia de Ki67 que co-expresa Treg ICOS+ en secciones congeladas de tumor (Figura 1A) como la proporcion mas alta de celulas K167+ dentro de Ta-Treg purificado y Treg de sangre (respectivamente 8 % y 4 %) en comparacion con Ta-Tconv y Tconv (3 % y 0,3 % respectivamente) (Figura 1B).

A diferencia de estos resultados in vivo, los inventores demostraron que la estimulacion in vitro de Ta-T reg purificados con perlas expandidas (perlas recubiertas con anti-CD3 y anti-CD28 agonistas) no es capaz de favorecer la amplificacion de Ta-Treg a diferencia de la observada con Ta-Tconv purificados o Treg o Tconv purificados de sangre de donantes sanos (Figura 1C).

Los inventores supusieron entonces que la interaccion de ICOS era esencial para la proliferacion y funciones de Ta-Treg.

A) Uso de un "anticuerpo antagonista de la divulgacion

Bloqueo de la interaccion ICOS/ICOS-L mediante el mAb antagonista para ICOS (314.8) Ta-Treg interaccionan in situ con Ta-pDC dentro de agregados linfoides en carcinoma de mama primario

Varios estudios informaron de la expresion de ICOS-L, el ligando espedfico de ICOS, en pDC (Janke et al., 2006). Usando inmunohistoquímica en secciones congeladas de tumor, los inventores observaron que linfocitos T Ta-CD3+ presentes dentro de los agregados linfoides que rodean el tumor estan en interaccion con Ta-pDC BDCA2+ (Figura 1D y 1E). Una tincion doble con Ab para FoxP3 y BDCA2 revelo que Ta-Treg estan en estrecho contacto con Ta-pDC en estos agregados linfoides, sugiriendo que esta interaccion favorecera la interaccion de ICOS por ICOS-L en tumores (Figura 1F).

Ta-pDC se activan pero no expresaron ICOS-L como posible consecuencia de la interaccidn de ICOS/ICOS-L in situ

Despues de la purificacion de la desagregacion tumoral, Ta-pDC muestran un fenotipo activado ya que expresan de forma regulada por incremento niveles de CD86 y CD40 en comparacion con pDC de sangre sana y de sangre de pacientes correspondientes. Como se informo por varios grupos (Ito et al., 2007; Janke et al., 2006), pDC de sangre sana recien aislada expresan bajos niveles de ICOS-L, que es fuertemente no regulado despues de la exposicion de IL-3 o ligacion TLR7/8, que no se observa en otros subconjuntos de DC (mDC, MoDC). De forma interesante, contrastando con su estado activado (CD86+CD40+), Ta-pDC carecen de expresion de ICOS-L de membrana. A diferencia, las pDC de sangre de pacientes emparejados recien aislada o pDC de sangre sana expresan ICOS-L. Despues de un periodo de cultivo de 24 h en IL-3 o tras la ligacion TLR7/8, Ta-pDC clasificados readquieren una fuerte expresion de ICOS-L demostrando su capacidad para modular esta expresion de ICOS-L (datos no mostrados). Entre los linfocitos CD3+ TaT, ICOS se expresa fuertemente en Ta-Treg (69,9 % MFI: 361) a diferencia de TaTconv (23 % MFI: 83) o TaCD8+ (2 % MFI: 50). Estos resultados indican que in situ la interaccion ICOS/ICOS-L conduce a la regulacion de ICOS-L por disminucion en la membrana de Ta-pDC.

El bloqueo de la interaccion ICOS/ICOS-L mediante mAb antagonista anti-ICOS (314.8) suprime la regulacion por disminucion de ICOS-L en pDC

Para probar esta hipotesis, linfocitos T de sangre sana se cultivaron con pDC activadas por TLR7 purificadas de airngdala. Los inventores observaron despues del periodo de cultivo de 24 h con elevada relacion T:pDC una regulacion por disminucion de ICOS-L dependiente de la dosis en pDC. De forma interesante, la adicion del mAb agonista de los presentes inventores contra ICOS (314.8) anula totalmente esta regulacion por disminucion de ICOS-L en pDC, resultado que no se reproduce usando anticuerpo anti-ICOS comercial (ISA-3) (datos no mostrados).

Los resultados demuestran interacciones Ta-pDC y Ta-Treg mediante ICOS/ICOS-L e indican que la ligacion de ICOS podna estar implicada en la activacion y proliferacion de Ta-Treg.

Co-cultivo de linfocitos T CD4+, ademas de Treg purificados con pDC activadas, pero no proliferacion de Treg inducidos por MoDC que se bloquean con 314.8

Para probar la capacidad de interacciones ICOS/ICOS-L para inducir la amplificacion de T reg, los inventores cultivaron linfocitos T CD4+ de memoria total con pDC activadas por TLR7/8 (R848) alogenas purificadas de sangre sana o mDC. Entre los linfocitos T CD4+ purificados, el 3,5 % expresaron FoxP3 (datos no mostrados). Despues de 5 dfas de cocultivo con pDC, la proporcion de celulas que expresan FoxP3, correspondiente a Treg, asciende al 12,3 % y la adicion del Ab 314.8 bloquea el 80 % de este enriquecimiento en celulas FoxP3alto. A diferencia, el co-cultivo de linfocitos T CD4+ con mDC activadas no fue capaz de favorecer una subpoblacion de FoxP3alto distinta entre linfocitos T CD4+, y la adicion de 314.8 no tiene efecto significativo (6,3 % al 8 %).

Se obtuvieron resultados similares con linfocitos T CD4+ purificados de tumor. Ta-Treg Foxp3+ representan el 9 % de los linfocitos TaT CD4+ recien purificados (datos no mostrados). Su co-cultivo con pDC activadas con R848 aumenta la proporcion de Ta-Treg al 14,5 %, mientras que la adicion de 314.8 conduce a una disminucion de la proporcion de Ta-Treg al 4,5 %, por debajo del nivel inicial.

Poblaciones de Treg o Tconv purificadas clasificadas por FACS tenidas con CFSE se cultivaron con pDC activadas con R848 o MoDC activadas con LPS para analizar su capacidad de proliferacion por citometna de flujo (dilucion de expresion de CFSE). Primero, los inventores observaron que en ausencia de IL-2 exogeno, que MoDC activadas no inducen la proliferacion de Treg purificados, mientas que Tconv proliferan fuertemente. A diferencia, el co-cultivo con pDC activadas es capaz de inducir una fuerte proliferacion de tanto Treg como Tconv purificados.

La adicion de mAb anti-ICOS 314.8 reduce fuertemente la proliferacion Treg y de Tconv cuando se usan pDC como APC mientras que la proliferacion de Tconv no vana en co-cultivos con MoDC. En este experimento, el bloqueo de ICOS o ICOS-L con anticuerpos comerciales (mAb ISA-3 o mAb MIH-12) no afecta ni la proliferacion de Treg ni de Tconv en co-cultivos pDC/T.

Estos datos demuestran que el mAb anti-ICOS 314.8 neutraliza la interaccion de ICOS en Treg y anula su expansion inducida por pDC.

El bloqueo de ICOS y ICOS-L anula las secreciones de IL-10 durante la activacion de linfocitos T mediada por pDC sin interferir fuertemente en co-cultivo de MoDC/T.

El mAb 314.8 tambien reduce la proliferacion de Tconv en respuesta a la estimulacion de pDC activadas. Los inventores determinaron el impacto de 314.8 sobre la secrecion de IFNy e IL-10 por ELISA durante Tconv y pDC alogenas activadas por R848 (Figura 2A) o y co-cultivos de MoDC activadas por LPS (Figura 2B). En estos entornos, la secrecion de IL-10 se anula totalmente por el mAb 314.8 (217 /- 31 pg/ml en control y 13 /- 6 pg/ml con 314.8). Mientras que la secrecion de IFNy se reduce ligeramente tras la adicion de mAb 314.8 en co-cultivos con pDC (32 % de reduccion 507 /- 53 pg/ml en condicion de control y 341 /- 73 pg/ml con 314.8) (Figura 2A). En co-cultivos de Tconv/MoDC la inhibicion de ICOS conduce a secreciones ligeramente elevadas de IL-10 e IFNy (Figura 2B).

B) Uso de un anticuerpo agonista segun la invencion

Uso del mAb agonista anti-ICOS (88.2) para imitar la interaccidn de ICOS

Para perfeccionar su entendimiento sobre las funciones de ICOS en Treg y Tconv, los inventores generaron un modelo de APC artificiales usando perlas recubiertas con mAb agonistas que condudan a la senalizacion de CD3 (OKT3); CD28 (CD28.2) y/o ICOS (88.2, Tabla 1) en linfocitos T purificados.

La interaccidn de ICOS con un mAb agonista (88.2) en Treg indujo su proliferacion y su capacidad para secretar altas cantidades de IL-10

Primero, los inventores observaron que Treg de donantes sanos proliferan en respuesta a perlas anti-CD3/88.2 en presencia de IL-2 exogena (Figura 3A). Como se informo previamente (Simpson et al., 2010; Ito et al., 2008) tras la activacion mediante TCR y la interaccion de ICOS en presencia de IL-2, tanto subpoblaciones de Tconv como de Treg purificadas secretan altas cantidades de IL-10 (311 /- 22 pg/ml y 426 /- 48 pg/ml, respectivamente) y bajos niveles de IFNy (205 /- 8 pg/ml y 381 /- 12 pg/ml). Este resultado contrasta con datos obtenidos usando las perlas anti-CD3/anti-CD28. En este modelo, Tconv secretan grandes cantidades de IFNy (1213 /- 72 pg/ml) y bajos niveles de IL-10 (69 /- 58 pg/ml) mientras que Treg secretan IL-10 y bajos niveles de IFNy (422 /- 36 pg/ml y 305 /- 31 pg/ml, respectivamente) (Figura 3B).

Experimentos similares con linfocitos T purificados de tumor demostraron que linfocitos TaT CD4+ producen niveles similares de IL-10 en respuesta a ICOS y CD28 mientras que los niveles de IFNy son mas debiles en respuesta a ICOS en comparacion con la interaccion de CD28 (Figura 3C).

La interaccidn de ICOS bloquea la IL-2 inducida por CD28 y por consiguiente reduce la proliferacion y secrecion de IFNy

Mientras que los linfocitos T de memoria CD4+ proliferan en respuesta a la estimulacion anti-CD3/anti-CD28 independientemente de IL-2 exogena, no se observa proliferacion en respuesta a la estimulacion anti-CD3/88.2 (Figura 4A). La adicion de hIL-2 rescata esta proliferacion en un modo dependiente de la dosis. De forma interesante, la cointeraccion de ICOS y CD28 en ausencia de IL-2 reduce significativamente la proliferacion de linfocitos T de memoria CD4+ en comparacion con solo la interaccion de CD28, y esto es completamente rescatado en presencia de 100 UI/ml de IL-2. De forma interesante, la ligacion de ICOS mediante mAb 88.2 anula la secrecion de IL-2 detectada con estimulacion de anti-CD3/anti-CD28 (Figura 4B). Tomados conjuntamente, esto argumenta en favor de una secrecion de IL-2 espontanea reducida cuando ICOS y CD28 co-interaccionan en comparacion con la interaccion unica de CD28, sugiriendo una funcion inhibidora de ICOS en la secrecion de IL-2 inducida por CD28.

Ademas, incluso en presencia de IL-2 exogena, los inventores observaron una reduccion del 50 % de IFNy producida por Tconv, cuando ICOS y CD28 son provocados en comparacion con perlas anti-CD3/anti-CD28 (Figura 4C).

A diferencia, mientras que la secrecion de IL-10 es estrictamente dependiente de IL-2 cuando las celulas se activan bajo provocacion de ICOS, como se describe previamente (Ito 2008, Paulos 2010), la adicion de senal de ICOS no afecta la secrecion de IL-10 inducida por anti-CD3/anti-CD28 (Figura 4C).

Todos juntos, estos resultados demuestran que la ligacion de ICOS redujo la capacidad de anti-CD3/anti-CD28 para favorecer la polarizacion de Th1 (mediante la reducida produccion de iFNy), pero mantiene la produccion de IL-10 favoreciendo el desarrollo de un entorno inmunosupresor.

La interaccidn de ICOS mediante mAb 88.2 aumento la funcion supresora de Treg

Para evaluar que la interaccion de ICOS puede asociarse a una respuesta de linfocitos T inmunosupresores, los inventores establecieron ensayos de supresion en ausencia de IL-2 exogena para comparar la eficiencia de perlas anti-CD3/anti-CD28/IgG y anti-CD3/anti-CD28/88.2. La adicion de la senalizacion de ICOS (88.2) aumenta fuertemente la funcion supresora de Treg en comparacion con anti-CD3/anti-CD28/IgG1 (51 % de inhibicion en la condicion un Treg para 4 Tconv anti-CD3/anti-CD28/88.2 en comparacion con 21 % de inhibicion con anti-CD3/anti-CD28/IgG). En conjunto, estos resultados demuestran que la interaccion de ICOS favorece una respuesta de linfocitos T inmunosupresores que podna resultar tanto de una elevada sensibilidad de Tconv a la supresion como de una capacidad supresora de Treg mas fuerte.

EJEMPLO 3: Analisis del impacto pronostico de la deteccion de linfocitos ICOS+ Treg dentro de tumores de mama primarios

Se probaron 120 muestras de tumor primario incorporado en parafina con seguimiento clmico de 10 anos para su expresion de ICOS usando un Ab policlonal de conejo anti-ICOS comercial (Spring Biosciences). Se cuantificaron celulas ICOS+ en cegado doble en 6 duplicados diferentes para cada tumor y la media de los resultados se compilo (datos no mostrados). Para realizar el analisis estad^stico los inventores usaron la mediana como valor de corte para tener grupos equilibrados.

En el analisis unifactorial los inventores demuestran que la presencia de celulas ICOS+ (>1,66 celulas ICOS+ / mancha) se correlaciono con alto grado de tumor (p=0,007), la expresion del receptor de estrogenos por celulas tumorales (p=0,018), subtipos moleculares A/B luminales (p<0,001) y ausencia de la expresion en exceso de Her2/neu (p=0,035). Se investigo el impacto de la deteccion de celulas ICOS+ dentro de tumores de mama primarios sobre la supervivencia global (OS) o progresion libre supervivencia (PFS).

Aunque se observaron 6/59 muertes en el grupo ICOS-, 14/61 pacientes fallecieron en ICOS+ demostrando el valor pronostico significativo de la deteccion de ICOS+ en OS (valor de p de la prueba del orden logantmico = 0,0465) (Figura 9A). Analisis similares realizados en PFS demostraron que las celulas ICOS+ se asociaron a una peor supervivencia global, con progresion en 11/59 en el grupo de ICOS', mientras que 20/61 pacientes progresaron en el grupo de ICOS+ (p=0,0285) (Figura 9B).

EJEMPLO 4: Confirmacion de la existencia de interaccion in situ de pDC con Treg ICOS+ en el entorno del tumor

Co-cultivo ex vivo de dilaceraciones de celulas tumorales en presencia de mAb anti-ICOS 314.8 o Ab de Ctrl durante 48 h en presencia de IL-3 (20 ng/ml). Al final del periodo de cultivo, la expresion de ICOS-L en pDC se observa solo en presencia del mAb anti-ICOS 314.8 y no con Ab de control, demostrando entonces que la regulacion por disminucion de ICOS-L en pDC esta mediada por una interaccion con celulas ICOS+ (datos no mostrados).

EJEMPLO 5: Celulas de tumor de mama epiteliales de tanto lrneas celulares establecidas como muestras tumorales frescas no expresan ICOS-L, a diferencia de celulas tumorales de melanoma o glioma incluso despues del cultivo ex vivo con el anticuerpo anti-ICOS 314.8

Se recogieron lrneas de celulas tumorales epiteliales de mama en PBS-EDTA para prevenir la degradacion asociada a tripsina de Ag y las celulas se tineron con anticuerpo anti-ICOS-L para evaluar la expresion en la superficie celular por citometna de flujo. Ninguna de las lrneas celulares probadas fue positiva para ICOS-L (Figura 5A). Se realizaron analisis similares en desagregaciones de tumor primario cultivadas 48 h en presencia de Ab anti-ICOS (314.8) o Ab de control mas IL-3 (20 ng/ml) (Figura 5B).

EJEMPLO 6: Impacto de un Ab anti-ICOS anti-raton de rata sustituto (17G9, IgG2b) en el crecimiento de tumor mamario en un modelo de tumor mamario singenico

Se obtuvo modelo de tumor mamario de raton en ratones FVB hembra 28-35 dfas despues de la inyeccion ortotopica de la lmea celular Neu 15. Los tumores generados parecen estar significativamente infiltrados por Ta-pDC activados, TATreg ICOSalto y TATconv en reposo.

La inyeccion del anticuerpo 17G9 (50 pg/ml) por via intraperitoneal tres veces a la semana desde el dfa 11 despues de la implantacion del tumor produce un tamano de tumor Neu15 reducido en momentos de tiempo tardfos en comparacion con la inyeccion de Ab de control (LTF2, IgG2b) (p=0,053) (Figura 6).

EJEMPLO 7: A: Los numeros de celulas Treg son elevados dentro de cancer de cuello uterino primario

Se obtuvieron muestras cervicales de pacientes tanto con displasia (CIN2/3, n=18) como cancer (n=14). Se uso tejido cervical normal como control (n= 11). Se obtuvieron muestras por tanto disociaciones enzimaticas como ffsicas. Despues de lavar, las celulas mononucleares se incubaron con mAb marcados y los Treg enumerados como linfocitos T CD127bajoCD25brillanteCD4+. Se representa el porcentaje de Treg dentro del subconjunto de CD4+. Treg aumento dentro de las muestras de cancer de cuello uterino en comparacion con tejido normal y displasia. Por lo tanto, este aumento esta asociado al desarrollo de cancer (Figura 7A).

B: Las celulas Treg ICOS+ son elevadas dentro de cancer de cuello uterino primario.

Se obtuvieron muestras cervicales de pacientes tanto con displasia (CIN2/3, n=5) como cancer (n=12). Se uso tejido cervical normal como control (n= 5). Las muestras se obtuvieron por tanto disociacion enzimatica como ffsica. Despues de lavar celulas mononucleares, se incubaron con mAb marcados usando los mAb para ICOS y Treg enumerados. Se representa el porcentaje de Treg ICOS dentro del subconjunto de CD4+. Treg ICOS+ estan presentes dentro de tejidos con solo una tendencia a su aumento en cancer de cuello uterino debido a los numeros limitados de muestras analizadas (Figura 7B).

EJEMPLO 8: Aumento de ICOS que expresa Treg en linfoma no Hodgkin (NHL)

Los inventores han analizado los numeros de Teg y la expresion de ICOS en Treg en muestras LNH. Se recogieron celulas de linfoma fresco provocadas de ganglios linfaticos de 45 pacientes con consentimiento informado. Las muestras de linfoma se corresponden con enfermedad Hodgkin (HD, n= 11), linfoma folicular (FL, n=13), linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL, n=10), linfoma de celulas del manto (MCL, n=5) y linfoma de la zona marginal (MZL, n= 6). La deteccion de linfocitos Treg se realizo por incubacion durante 20 min a 4 °C con anti-ICOS-PE (Becton Dickinson™), anti-CD3-ECD, anti-CD4-Pacific Blue (Beckman Coulter®), anti-CD127 FITC, anti-CD25 APC-Cy7 y el kit LIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen™). Despues de la tincion, cada preparacion de celulas se lavo dos veces en PBS, se fijo con 2 % de paraformaldeMdo y se analizo en un citometro de flujo FACS LSR2 (Becton Dickinson™). Los datos se analizaron usando el software FlowJo (TreeStar™). Treg aumentaron en todas las muestras de linfoma, excepto HD. La mayona de los T reg presentaron una elevada expresion de ICOS en comparacion con ganglios linfaticos de control (Figura 8).

EJEMPLO 9: Secuenciacion de Icos 314.8 (CNCM I-4180)

Se extrajo ARN total de celulas de hibridoma congeladas proporcionadas y se sintetizo ADNc. Entonces, se realizo RT-PCR para amplificar las regiones variables (cadenas pesadas y ligeras) del mAb. Las regiones variables de mAb de las cadenas pesadas y ligeras se clonaron en un vector de clonacion por separado, luego las secuencias obtenidas se analizaron para deducir las secuencias del mAb.

Materiales

Celulas de hibridoma ICOS 314.8 (CNCM I-4180); TRIzol® Plus RNA Purification System (Invitrogen, Cat. N.°: 15596­ 026); SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Cat. N.°: 18080-051).

Metodos

Extraccion de ARN total

Se aislo ARN total de las celulas de hibridoma segun el manual tecnico de TRIzol® Plus RNA Purification System. El ARN total se comprobo por electroforesis en gel.

RT-PCR

El ARN total se transcribio de forma inversa en ADNc usando cebador de sentido contrario espedfico de isotipo o cebador universal y el procedimiento completo fue segun el manual tecnico de SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. El fragmento de anticuerpo se amplificara segun el protocolo de operacion estandar del metodo RACE de GenScript.

Clonacion de genes de anticuerpo

Se clonaron productos de PCR diana de genes de anticuerpo en el vector de clonacion por separado segun procedimientos de clonacion molecular estandar.

Cribado y secuenciacion

Se empleo cribado de colonias para cribar clones con inserciones de tamanos correctos, y se secuenciaron no menos de diez colonias positivas independientes para cada fragmento de anticuerpo.

Resultados y analisis

Extraccion de ARN total

Se ejecuto ARN total de la muestra junto con el marcador de ADN DL3000 en una electroforesis en gel de 1,5 % de agarosa/GelRed TM.

Producto de PCR de genes de anticuerpo

Se ejecutaron 4 pl de productos de PCR de cada muestra junto con el marcado de ADN DL3000 en una electroforesis en gel de 1,5 % de agarosa/GelRed TM.

Resultados y analisis de secuenciacion

Los resultados de secuenciacion son del siguiente modo. Las secuencias de ADN consenso y secuencias de aminoacidos correspondientes se enumeran a continuacion:

Cadena pesada: Secuencia de ADN (426 pb): Secuencia conductora-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

Cadena pesada: Secuencia de aminoacidos (142 AA): Secuencia conductora-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

Cadena ligera: Secuencia de ADN (396 pb): Secuencia conductora-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

Cadena ligera: Secuencia de aminoacidos (132 AA): Secuencia conductora-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

MRCLAEFLGLLVLWIPGVTGDI¥MTQAAPS¥P¥TPGESVSISCRSSKSPLHSNGNIYLYWFLQR

PGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTTFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTK

LEIK (SEQ ID NO:16)

As^ las secuencias de ICOS 314.8 (CNCM I-4180) pueden resumirse del siguiente modo:

EJEMPLO 10: Secuenciacion de Icos 88.2 (CNCM I-4177)

Se extrajo ARN total de celulas de hibridoma congeladas proporcionadas y se sintetizo ADNc. Entonces, se realizo RT-PCR para amplificar las regiones variables (cadenas pesadas y ligeras) del mAb. Las regiones variables de mAb de las cadenas pesadas y ligeras se clonaron en un vector de clonacion por separado, luego se analizaron las secuencias obtenidas para deducir las secuencias del mAb.

Materiales

Celulas de hibridoma ICOS 88.2 (CNCM I-4177); TRIzol® Plus ARN Purification System (Invitrogen, Cat. N.°: 15596­ 026); SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Cat. N.°: 18080-051).

Metodos

Extraccion de ARN total

Se aislo ARN total de las celulas de hibridoma segun el manual tecnico de TRIzol® Plus ARN Purification System. El ARN total se comprobo por electroforesis en gel.

RT-PCR

El ARN total se transcribio de forma inversa en ADNc usando cebador de sentido contrario espedfico de isotipo o cebador universal y el procedimiento completo fue segun el manual tecnico de SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. El fragmento de anticuerpo se amplificara segun el protocolo de operacion estandar del metodo RACE de GenScript.

Clonacion de genes de anticuerpo

Se clonaron productos de PCR diana de genes de anticuerpo en el vector de clonacion por separado segun procedimientos de clonacion molecular estandar.

Cribado y secuenciacion

Se empleo cribado de colonias para cribar clones con inserciones de tamanos correctos, y se secuenciaron no menos de diez colonias positivas independientes para cada fragmento de anticuerpo.

Resultados y analisis

Extraccion de ARN total

Se ejecuto ARN total de la muestra junto con el marcador de ADN DL3000 en una electroforesis en gel de 1,5 % de agarosa/GelRed TM.

Producto de PCR de genes de anticuerpo

Se ejecutaron 4 ^l de productos de PCR de cada muestra junto con el marcado de ADN DL3000 en una electroforesis en gel de 1,5 % de agarosa/GelRed TM.

Resultados y analisis de secuenciacion

Los resultados de secuenciacion son del siguiente modo. Las secuencias de ADN consenso y secuencias de aminoacidos correspondientes se enumeran a continuation:

Cadena pesada: Secuencia de ADN (429 pb): Secuencia conductora-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

gg

Cadena pesada: Secuencia de aminoacidos (143 AA): Secuencia conductora-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo dirigido contra ICOS, en el que dicho anticuerpo esta seleccionado del grupo que consiste en Icos 53-3, Icos 88-2 e Icos 92-17, respectivamente obtenibles del hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009 con los numeros de acceso CNCM 1-4176, CNCM 1-4177, CNCM I 4178 y derivados de los mismos.

2. Un anticuerpo dirigido contra ICOS, en el que dicho anticuerpo tiene las siguientes 6 CDR:

3. Un anticuerpo segun la reivindicacion 2, en el que las secuencias nucleotfdicas que codifican las 6 CDR son las siguientes:

4. El anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso como un medicamento.

5. El anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunitarias, rechazo de trasplante o una enfermedad de injerto contra huesped.

6. El anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

7. El anticuerpo para su uso segun la reivindicacion 6, en el que dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en trastorno inflamatorio del sistema nervioso, enfermedad inflamatoria de la mucosa, enfermedad inflamatoria de la piel y artritis autoinmune.

8. El anticuerpo para su uso segun la reivindicacion 6, en el que dicho trastorno inflamatorio se selecciona de esclerosis multiple, enfermedad inflamatoria del intestino, asma o amigdalitis, dermatitis, psoriasis, hipersensibilidad por contacto y artritis reumatoide).