JP2014511843A - Ｉｃｏｓに対する抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＩＣＯＳ及びＩＣＯＳ−Ｌの間での固定を阻害することによりＴｒｅｇ上のＩＣＯＳ会合を中和し、形質細胞様樹状細胞により誘導されるＴｒｅｇの増殖を抑止する、ＩＣＯＳに対する抗体又はその誘導体を提供する。本発明は、さらに、ＩＬ−１０及びＩＦＮγ産生を誘導し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を誘導し、Ｔｃｏｎｖ増殖を低下させ、Ｔｒｅｇの免疫抑制機能を増加させる、ＩＣＯＳに対する抗体又はその誘導体を提供する。

Description

発明の属する技術分野
本発明は、ＩＣＯＳに対する抗体及びその使用に関する。

発明の背景
いくつかの癌において、免疫抑制性Ｔ細胞応答の確立は、不良な予後及び疾患進行と相関する。

免疫寛容の確立に関与する異なる細胞エフェクターの中で、ＣＤ４^＋調節性Ｔリンパ球サブセット（Ｔｒｅｇ）は、他のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）ならびに樹状細胞機能の抑制に特異的である。前記抑制は、癌、特に乳癌に苦しむ患者での不良な生存率と相関しうる。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞により産生された多量のＩＬ−１０及び少量のＩＦＮγは、低下したＣＤ８^＋Ｔ細胞傷害性能力、より低いＴ細胞増殖に関連し、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に関連する免疫抑制Ｍ２ｃ型マクロファージへの単球分化に関与することが示されている。

本発明者らは、以前に、多量のＴｒｅｇ（Ｔａ−Ｔｒｅｇ）を包含する記憶ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、原発性乳房腫瘍に浸潤することを報告した。Ｔａ−Ｔｒｅｇ及び形質細胞ＤＣ（ｐＤＣ）による原発性乳房腫瘍浸潤は、両方が、乳房腫瘍に苦しむ患者での不良な予後及び不良な生存率と関連する。

本発明者らは、さらに、Ｔｒｅｇが関与する免疫抑制機構が、大半の癌及び慢性感染症において観察されることを確認した。これらの抑制機構は、癌及び慢性ウイルス感染症に対する効率的な免疫応答を防止する。

現在、Ｔｒｅｇは、細胞治療、抗ＣＤ２５ ｍＡｂ、又は低用量化学療法を使用し、癌及び慢性感染症において標的にされる。しかし、前記戦略は、許容可能な結果を提供しなかった。

また、Ｔｒｅｇが、過剰な免疫応答と関連する又はそれにより起こされる疾患において重要な役割を有しうることが報告されている。

しかし、Ｔｒｅｇ関連疾患を処置するために利用可能な、効率的な戦略は、現在ない。従って依然として、Ｔｒｅｇが関与する疾患を標的とする効率的な治療戦略を提供することについての大きな必要性がある。

発明の概要
驚くべきことに、本発明者らは、ＩＣＯＳ及びそのリガンドの間での相互作用が、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）との相互作用を通じて、一部の癌においてＴｒｅｇの活性化、増殖、及び抑制機能において中心的な役割を果たすことを示している。本発明者らは、次に、彼らの努力を集中し、アンタゴニスト及びアゴニスト効果を伴う特異的抗体を生成した。

アンタゴニスト抗体は、免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制と関連する疾患又は状態を処置するために効率的である。アゴニスト抗体は、過剰な免疫応答と関連する又はそれにより起こされる疾患又は状態を処置するために効率的である。

本発明は、このように、ＩＣＯＳに対する抗体又はその誘導体に関し、ここで該抗体又はその誘導体は：
・ ＩＣＯＳ及びＩＣＯＳ−Ｌの間での固定を阻害することによりＴｒｅｇ上のＩＣＯＳ会合を中和し、
・ ｐＤＣにより誘導されるＴｒｅｇの増殖を抑止する。

本発明の文脈において、前記抗体は、また、「アンタゴニスト抗体」と呼んでもよい。

本発明は、さらに、ＩＣＯＳに対する抗体ならびにそれらの誘導体に関し、それにおいて、前記抗体は、「Collection Nationale de Cultures de Microorganismes」（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）で、ブダペスト条約の条項に従って、２００９年７月２日に、それぞれ受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７９及びＣＮＣＭ Ｉ−４１８０の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ １４５−１及びＩｃｏｓ ３１４−８からなる群より選択される。

本発明は、また、医薬としての使用のための本発明に従ったＩＣＯＳに対するアンタゴニスト抗体又はその誘導体に関する。本発明は、さらに、癌もしくは慢性感染症を処置するための使用のための本発明に従ったＩＣＯＳに対するアンタゴニスト抗体又はその誘導体に関する。

本発明は、さらに、ＩＣＯＳに対する抗体又はその誘導体に関し、ここで該抗体又はその誘導体は：
・ ＩＬ−１０及びＩＦＮγ産生を誘導し；
・ ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を誘導し；
・ Ｔｃｏｎｖ増殖を低下させ、及び
・ Ｔｒｅｇの免疫抑制機能を増加させる。

本発明の文脈において、前記抗体は、また、「アゴニスト抗体」と呼んでもよい。

本発明は、また、ＩＣＯＳに対する抗体に関し、それにおいて、前記抗体は、「Collection Nationale de Cultures de Microorganismes」（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）で、ブダペスト条約の条項に従って、２００９年７月２日に、それぞれ受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７６、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７７、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７８の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ ５３−３、Ｉｃｏｓ ８８−２、及びＩｃｏｓ ９２−１７ならびにそれらの誘導体からなる群より選択される。

本発明は、医薬としての使用のための本発明に従ったアゴニスト抗体又はその誘導体に関する。本発明は、また、自己免疫疾患、移植拒絶、又は移植片対宿主疾患を処置するための使用のための本発明に従ったアゴニスト抗体あるいはその誘導体に関する。

発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用する通り、用語「ＩＣＯＳ」又は「誘導性Ｔ細胞共刺激分子」は、その細胞外部分におけるＩｇＶ型ドメイン及びその細胞質部分におけるＹＭＦＭモチーフ内のチロシンを提示する５５〜６０kDaの膜貫通ホモ二量体糖タンパク質を指す。そのリガンドとのＩＣＯＳ会合は、ＩＣＯＳの細胞質部分におけるチロシンのリン酸化を誘導することが示されている。前記リン酸化は、ｐ８５ ＰＩ３Ｋ調節サブユニットの動員に関与し、それはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路を活性化する。

ＩＣＯＳ会合は、また、細胞表面でＣＤ４０Ｌの発現を誘導することが記載されている。ＣＤ４０Ｌは、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の間での協同作用において重要な効果を有することが公知である。

ＩＣＯＳは、ＴＣＲ活性化に続き、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋サブセット）上ならびにＴｒｅｇ上で発現されることが見出されている。本発明者らは、前記活性化が、メラノーマ又は乳癌に苦しむ患者においてより重要であることを示した。

本明細書において使用する通り、用語「ＩＣＯＳＬ」、「ＩＣＯＳ−Ｌ」、及び「Ｂ７−Ｈ２」はＩＣＯＳリガンドを指す。前記リガンドは、リンパ系細胞（例えばＢリンパ球、マクロファージ、樹状細胞など）、ならびに非リンパ系細胞（例えば内皮細胞又は上皮細胞など）上に存在する。ＩＣＯＳ会合は、リンパ球活性化において重要な役割を有している。それは、Ｔリンパ球、特にＴｒｅｇの増殖及び生存を誘導する。

本明細書において使用する通り、用語「ＪＩＣＯＳ１」は、ＩＣＯＳを発現する特定の細胞株を指す。

本明細書において使用する通り、「モノクローナル抗体」は、その種々の文法的な形態において、特定のエピトープと免疫反応することが可能な１種だけの抗体結合部位を含む抗体の集団を指す。モノクローナル抗体は、このように、典型的には、それが免疫反応する任意のエピトープについて単一の結合親和性を呈する。モノクローナル抗体は、従って、複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含み、各々が、異なるエピトープについて免疫特異的でありうる（例、二重特異性モノクローナル抗体）。歴史的に、モノクローナル抗体は、クローン的に純粋な免疫グロブリン分泌細胞株の不死化により産生されたが、抗体分子のモノクローン的に純粋な集団は、また、本発明の方法により調製することができる。モノクローナル抗体を調製するための実験室方法は、当技術分野において周知である（例えば、Harlow et al., 1988を参照のこと）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、精製した変異ＴＸＡＳを哺乳動物（例、マウス、ラット、ヒトなどの哺乳動物）中に免疫化することにより調製されうる。免疫化した哺乳動物中の抗体産生細胞を単離し、ミエローマ又はヘテロミエローマ細胞と融合させ、ハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）を産生する。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、所望のモノクローナル抗体の供給源として利用される。ハイブリドーマ培養のこの標準的な方法は、Kohler and Milstein (1975)に記載されている。ｍＡｂはハイブリドーマ培養により産生することができるが、本発明はそれほど限定されない。また、本発明のハイブリドーマからクローン化された発現核酸により産生されたｍＡｂの使用を熟慮する。すなわち、本発明のハイブリドーマにより分泌される分子を発現する核酸を、別の細胞株中に移し、形質転換体を産生することができる。形質転換体は、遺伝子型で、本来のハイブリドーマとは別であるが、しかし、また、ハイブリドーマにより分泌されるものに対応する、本発明の抗体分子（全抗体分子の免疫学的に活性なフラグメントを含む）を産生することが可能である。例えば、米国特許第４，６４２，３３４号（解釈）；ＰＣＴ公開第号；欧州特許公開第０２３９４００号（Winter et al.）及び第０１２５０２３号（Cabilly et al.）を参照のこと。免疫化を含まない抗体生成技術が、また、熟慮される。例えば、天然ライブラリー（非免疫化動物からの）を検証するためのファージディスプレイ技術を使用することなど；Barbas et al.(1992)、及びWaterhouse et al.(1993)を参照のこと。

本明細書において使用する通り、表現「抗ＩＣＯＳ抗体」は、好ましくは、免疫原として組換えＩＣＯＳ−Ｆｃを使用して得られるＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を指す。

本明細書において使用する通り、表現「抗体の誘導体」は、前記抗体の６つのＣＤＲを含む抗体を指す。

本明細書において使用する通り、表現「５３．３ ｍＡｂ」又は「Ｉｃｏｓ ５３−３」は、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、受入番号ＣＮＣＮ Ｉ− ４１７６の下で寄託された、ＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を指す。前記抗体は、ＩＣＯＳのアゴニストである。表現「５３．３ ｍＡｂの誘導体」は、５３．３ ｍＡｂの６つのＣＤＲを含む抗ＩＣＯＳ抗体を指す。

本明細書において使用する通り、表現「８８．２ ｍＡｂ」又は「Ｉｃｏｓ ８８−２」は、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、受入番号ＣＮＣＮ Ｉ− ４１７７の下で寄託された、ＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を指す。前記抗体は、ＩＣＯＳのアゴニストである。本発明者らは、ＩＬ−２の存在下での前記抗体の使用が、Ｔｒｅｇ増殖及びＩＬ−１０分泌を支持することを示している。表現「８８．２ ｍＡｂの誘導体」は、８８．２ ｍＡｂの６つのＣＤＲを含む抗ＩＣＯＳ抗体を指す。

８８．２ ｍＡｂの６つのＣＤＲは、以下の表１の通りである：

本明細書において使用する通り、表現「９２．１７ ｍＡｂ」又は「Ｉｃｏｓ ９２−１７」は、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、受入番号ＣＮＣＮ Ｉ− ４１７８の下で寄託された、ＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を指す。前記抗体は、ＩＣＯＳのアゴニストである。表現「９２．１７ ｍＡｂの誘導体」は、９２．１７ ｍＡｂの６つのＣＤＲを含む抗ＩＣＯＳ抗体を指す。

本明細書において使用する通り、表現「１４５．１ ｍＡｂ」又は「Ｉｃｏｓ １４５−１」は、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、受入番号ＣＮＣＮ Ｉ− ４１７９の下で寄託された、ＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を指す。前記抗体は、ＩＣＯＳのアンタゴニストである。表現「１４５．１ ｍＡｂの誘導体」は、１４５−１ ｍＡｂの６つのＣＤＲを含む抗ＩＣＯＳ抗体を指す。

本明細書において使用する通り、表現「３１４．８ ｍＡｂ」又は「Ｉｃｏｓ ３１４−８」は、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１８０の下で寄託された、ＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を指す。本発明者らは、前記抗体の使用が、ＴｃｏｎｖによるＩＬ−１０の分泌を遮断することを示している。前記抗体は、ＩＣＯＳのアンタゴニストであり、癌（例えば乳癌など）における樹状細胞媒介性の調節性Ｔ細胞増大及び抑制機能を防止するために高度に適応される。表現「３１４．８ ｍＡｂの誘導体」は、３１４．８ ｍＡｂの６つのＣＤＲを含む抗ＩＣＯＳ抗体を指す。

３１４．８ ｍＡｂの６つのＣＤＲは、以下の表２の通りである：

本明細書において使用する通り、表現「本発明の抗体」は、以下：
・ ＩＣＯＳ及びＩＣＯＳ−Ｌの間での固定を阻害することによりＴｒｅｇ上のＩＣＯＳ会合を中和し、形質細胞様樹状細胞により誘導されるＴｒｅｇの増殖を抑止することができるＩＣＯＳに対する抗体、即ち、アンタゴニスト抗体；ならびに
・ ＩＬ−１０及びＩＦＮγ産生を誘導し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を誘導し、Ｔｃｏｎｖ増殖を低下させ、Ｔｒｅｇの免疫抑制機能を増加させる、ＩＣＯＳに対する抗体、即ち、アゴニスト抗体
を指す。

前記表現は、また、前記抗体の任意の誘導体を包含する。

好ましくは、本発明の抗体は、５３．３ ｍＡｂ、８８．２ ｍＡｂ、９２．１７ ｍＡｂ、１４５．１ ｍＡｂ、１４５．１ ｍＡｂ、及び３１４．８ ｍＡｂならびにそれらの誘導体より選ばれる。

本明細書において使用する通り、表現「ＩＣＯＳに対するアンタゴニスト抗体」は、天然のＩＣＯＳにより誘導される応答と類似の細胞応答を誘発することなく、ＩＣＯＳに結合することができる抗体を指す。表現「本発明のアンタゴニスト抗体」は、１４５．１ ｍＡｂ、３１４．８ ｍＡｂ、及びそれらの誘導体を指す。

本明細書において使用する通り、表現「ＩＣＯＳに対するアゴニスト抗体」は、ＩＣＯＳに結合し、天然のＩＣＯＳにより誘導される応答と類似の細胞応答を誘発することができる抗体を指す。前記抗体は、このように、ＩＣＯＳの作用を模倣する。表現「本発明のアゴニスト抗体」は、５３．３ ｍＡｂ、８８．２ ｍＡｂ、９２．１７ ｍＡｂ、及びそれらの誘導体を指す。

本明細書において使用する通り、表現「抗原提示細胞」及び「ＡＰＣ」は、抗原決定基が、免疫系（例、ＭＨＣクラスＩ制限細胞傷害性Ｔリンパ球及び／又はＭＨＣクラスＩＩ制限ヘルパーＴリンパ球）により認識されることが可能な様式で、ＭＨＣ関連複合体として細胞の表面上に提示されるように、抗原を内在化及びプロセシングすることが可能な免疫細胞のクラスを指す。細胞がＡＰＣとして機能することを可能にする２つの必要な特性は、エンドサイトーシスされた抗原をプロセシングする能力とＭＨＣ遺伝子産物の発現である。ＡＰＣの例は、樹状細胞（ＤＣ）、単核食細胞（例、マクロファージ）、Ｂリンパ球、皮膚のランゲルハンス細胞、及び、ヒトにおける、内皮細胞を含む。

本明細書において使用する通り、表現「Ｔｒｅｇ」及び「調節性Ｔ細胞」は、レスポンダーＴ細胞の増殖をインビトロで優位に抑制し、自己免疫疾患を阻害する能力を有するＴリンパ球の特定の集団を指す。Ｔｒｅｇは、ヒトにおける抗腫瘍免疫応答の最終的な不全への主要な寄与体として結びつけられてきた。例えば、卵巣癌において、Ｔｒｅｇは腫瘍特異的Ｔ細胞を抑制し、多数の腫瘍関連Ｔｒｅｇが低下した生存時間に関連付けられる。本発明者らは、Ｔｒｅｇが宿主免疫応答を選択的に阻害し、それにより、特に乳癌において、癌進行に寄与することを示している。Ｔｒｅｇは、本来は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞集団として同定されたが、しかし、また、フォークヘッドファミリー転写因子、ＦｏｘＰ３の発現により特徴付けられる。

本発明者らは、Ｔｒｅｇが、同じ患者の血液から抽出されたＴｒｅｇと比較し、患者の癌組織内で、インサイチュで増殖し、細胞表面マーカーＩＣＯＳ及びＣＤ３９を発現することを示している。

反対に、用語「Ｔｃｏｎｖ」は、Ｔｒｅｇ以外のＴ細胞を指す。用語「Ｔｃｏｎｖ」は、このように、抗原を除去するように機能するＴ細胞を含む（例えば、他の細胞の活性化を調節するサイトカインを産生することにより又は細胞傷害活性により）。この用語は、Ｔヘルパー細胞（例、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）及び細胞傷害性Ｔ細胞を含む。この点において、Ｔヘルパー細胞は、好ましくは、ＣＤ４を発現し、低い又は検出不可能なレベルのＣＤ２５を発現する。ＣＴＬ細胞は、好ましくは、ＣＤ８及び低い又は検出不可能なレベルのＣＤ４を発現する。好ましくは、非Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ２５の両方を発現しない。好ましくは、非Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３を発現しない。

本明細書において使用する通り、表現「腫瘍関連調節性Ｔ細胞」及び「Ｔａ−Ｔｒｅｇ」は、腫瘍と、例えば、乳房腫瘍と関連する調節性Ｔ細胞を指す。本発明者らは、実際に、ＴＡ−Ｔｒｅｇが乳腺腫瘍組織のリンパ球浸潤において存在しており、乳癌に苦しむ患者の生存率においてネガティブな影響を提示することを示している。

本明細書において使用する通り、表現「形質細胞様樹状細胞」及び「ｐＤＣ」は、血液中に循環し、末梢リンパ器官において見出される先天性免疫細胞を指す。それらは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）群に属する細胞群を構成する。

本明細書において使用する通り、表現「腫瘍と関連する形質細胞様樹状細胞」及び「Ｔａ−ｐＤＣ」は、腫瘍、例えば、乳腺腫瘍と関連する形質細胞様樹状細胞を指す。本発明者らは、Ｔａ−ｐＤＣが、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ共刺激の依存下でＴａ−Ｔｒｅｇの増殖を誘導することができることを示している。

本明細書において使用する通り、用語「ＩＬ−１０」及び「インターロイキン１０」は、ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）を指し、それは、抗炎症性サイトカインである。このサイトカインは、主に、単球及びより少ない程度でリンパ球により産生される。このサイトカインは、免疫調節及び炎症において多面的な効果を有する。それは、Ｔｈ１型サイトカイン、ＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現を下方調節する。それは、また、Ｂ細胞の生存、増殖、及び抗体産生を増強する。このサイトカインは、ＮＦ−κＢ活性を遮断することができ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の調節に関与する。

本明細書において使用する通り、用語「ＩＦＮγ」及び「インターフェロン−ガンマ」は、１４６のアミノ酸のサブユニットを伴う二量体タンパク質を指す。免疫系におけるＩＦＮ−γの重要性は、部分的に、ウイルス複製を直接的に阻害するその能力に、最も重要なことに、その免疫刺激効果及び免疫調節効果に起因する。ＩＦＮγは、主に、ナチュラルキラー（ＮＫ）及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞により、先天性免疫応答の一部として、ならびに、一度、抗原特異的免疫が発生すると、ＣＤ４及びＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エフェクターＴ細胞により産生される。

本明細書において使用する通り、用語「処置する」又は「処置」は、そのような用語が適用される障害又は状態、あるいはそのような障害又は状態の１つ又は複数の症状の進行を逆転、緩和、阻害する、又は防止することを意味する。

「治療的に効果的な量」は、被験者に治療的利益を与えるために必要である活性薬剤の最小量について意図される。例えば、「治療的に効果的な量」は、病理学的症状、疾患進行、又は疾患に関連する生理学的状態の改善を誘導する、寛解する、又は、そうでなければ、起こす、あるいは、障害への耐性を改善する量である。

本明細書において使用する通り、用語「防止」は、まだ疾患又は状態を有すると診断されていない被験者において疾患又は状態の発生を軽減することを指す。本明細書において使用する通り、用語「被験体」は、哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類などを表示する。好ましくは、本発明に従った被験体はヒトである。

用語「癌」は、種々の臓器系の悪性腫瘍（例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸、及び尿生殖路に罹患するものなど）、ならびに悪性腫瘍（例えば、大半の結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌、及び食道の癌など）を含む腺癌を含む。

用語「Ｔｒｅｇ関連疾患」は、Ｔｒｅｇ数及び／又は活性の調節が有益な効果を提供しうる、任意の疾患又は障害又は状態を包含すると取るものとする。この用語は、以下：
− 被験体の免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制と関連する疾患及び状態、
− 過剰な免疫応答と関連する又はそれにより起こされる疾患及び状態
を包含する。

本明細書において使用する通り、表現「免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制と関連する疾患及び状態」は、免疫調節細胞（例えば腫瘍特異的Ｔ細胞など）の増殖のＴｒｅｇ抑制により起こされる疾患及び状態である。以前に言及した通り、本発明者らは、Ｔｒｅｇが、癌に苦しむ患者における不良な診断及び生存率と関連付けられることを示している。

被験体の免疫系のＴｒｅｇ媒介性抑制と関連する疾患及び状態の非限定的な例は、癌及び慢性感染症である。

本明細書において使用する通り、「過剰な免疫応答と関連する又はそれにより起こされる疾患及び状態」は、例えば、自己免疫疾患、移植拒絶、又は移植片対宿主疾患である。

この表現は、さらに、炎症性状態、例えば神経系の炎症性障害（例、多発性硬化症）、粘膜炎症性疾患（例、炎症性腸疾患、喘息、又は扁桃炎）、炎症性皮膚疾患（例、皮膚炎、乾癬、又は接触過敏症）、自己免疫性関節炎（例、関節リウマチ）を包含する。

本明細書において使用する通り、用語「免疫応答」は、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び上の細胞又は肝臓により産生される可溶性の巨大分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の協調作用を指し、それは、癌細胞、転移性腫瘍細胞、悪性メラノーマ、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織の、又は、自己免疫もしくは病理学的炎症の場合において、被験体の正常細胞もしくは組織の選択的損傷、破壊、もしくは被験体の身体からの除去をもたらす。

本明細書において使用する通り、「自己免疫疾患」は、個体の自身の組織から生じた及びそれに対する疾患又は障害である。

本発明のアンタゴニスト抗体
ＩＣＯＳ−Ｌ（ＩＣＯＳの特異的リガンドである）が、形質細胞様樹状細胞上で発現されることが示されている。本発明者らは、腫瘍関連Ｔｒｅｇが、腫瘍に関連する形質細胞様樹状細胞と密接な接触にあったことを示しているが、そのような相互作用が、腫瘍におけるＩＣＯＳとＩＣＯＳ−Ｌとの会合を可能にすることを示す。

本発明者らは、さらに、インサイチュでのＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌ相互作用が、Ｔａ−ｐＤＣ膜上でのＩＣＯＳ−Ｌ下方調節を導くことを示した。本発明者らは、ＩＣＯＳに対するアンタゴニスト抗体を開発しており、前記抗体の添加によって、ｐＤＣ（Ｔａ−Ｔｒｅｇ活性化及び増殖に関与する）上でのＩＣＯＳ−Ｌ下方調節を完全に抑止することを示している。

本発明者らは、本発明に従ったアンタゴニスト抗体が、Ｔｒｅｇ上でのＩＣＯＳ会合を中和し、ｐＤＣにより誘導されるそれらの増大を抑止することを示している。より正確には、前記抗体は、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ相互作用により誘導されるＴｒｅｇ増殖及びＩＬ−１０分泌を抑止する。

本発明のアンタゴニスト抗体は、このように、病理学的機構に関与する免疫抑制応答を抑止するために高度に適切である。それらは、このように、免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制と関連する疾患及び症状を処置するために有用である。

本発明は、このように、ＩＣＯＳに対する抗体及びその誘導体に引かれ、ここで該抗体及びその誘導体は：
・ ＩＣＯＳ及びＩＣＯＳ−Ｌの間での固定を阻害することによりＴｒｅｇ上のＩＣＯＳ会合を中和し、
・ 形質細胞様樹状細胞により誘導されるＴｒｅｇの増殖を抑止する。

−実施態様において、前記抗体はモノクローナル抗体である。

−実施態様において、前記抗体はキメラ抗体である。

−実施態様において、前記抗体はヒト化抗体である。

「Ｔｒｅｇ上でのＩＣＯＳ会合を中和すること」とは、抗体が、ＩＣＯＳ及びそのリガンドＩＣＯＳ−Ｌの間での協同作用に干渉することを意味する。

「Ｔｒｅｇの増殖を抑止すること」とは、Ｔｒｅｇの増殖の有意な減少、好ましくは、完全な停止が、コントロール組織、好ましくは非腫瘍組織、より好ましくは血液と比較し、標的組織、好ましくは腫瘍組織において観察されることを意味する。

本発明は、さらに、ＩＣＯＳに対する抗体に関し、それにおいて、前記抗体は、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、それぞれ受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７９及びＣＮＣＭ Ｉ−４１８０の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ １４５−１及びＩｃｏｓ ３１４−８ならびにそれらの誘導体からなる群より選択される。

本発明は、また、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、それぞれ受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７９及びＣＮＣＭ Ｉ−４１８０の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ １４５−１及びＩｃｏｓ ３１４−８ならびにそれらの誘導体からなる群より選択される抗体の６つのＣＤＲを含む抗体に関する。

本発明は、また、上の表２の６つのＣＤＲを含む抗体に関する。

別の実施態様において、本発明は、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、それぞれ受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７９及びＣＮＣＭ Ｉ−４１８０の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ １４５−１及びＩｃｏｓ ３１４−８からなる群より選択される抗体の１つの誘導体抗体に関する。

本発明のアンタゴニスト抗体の治療的使用
Ｔｒｅｇ上でのＩＣＯＳ会合を中和し、Ｔｒｅｇの増殖を抑止することにより、本発明のアンタゴニスト抗体は、免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制に関連する疾患及び状態、例えば、癌及び慢性感染症を処置するための使用のために高度に適切である。前記抗体は、このように、抗腫瘍免疫を回復するために使用されうる。

本発明は、従って、医薬としての使用のための本発明に従ったＩＣＯＳに対するアンタゴニスト抗体又はその誘導体に関する。

本発明は、さらに、免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制に関連する疾患もしくは状態を処置するための使用のための本発明に従ったＩＣＯＳに対するアンタゴニスト抗体又はその誘導体に関する。

好ましい実施態様において、免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制に関連する前記の疾患又は状態は、癌及び慢性感染症からなる群において選択される疾患である。

実際に、本発明者らは、本発明のアンタゴニスト抗体を、それらのＴｒｅｇに関連する免疫抑制効果を抑止するように、Ｔｒｅｇ数及び／又は活性を調節するために適応することを示している。従って、前記アンタゴニスト抗体は、免疫系の抑制に関連する疾患（例えば癌及び慢性感染症など）を処置するための高度に有望な戦略を表す。

癌の例は、しかし、限定しないが、ヒト悪性リンパ腫、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸直腸癌、骨癌、子宮頚癌、肝臓癌、口腔癌、食道癌、甲状腺癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、及び皮膚癌を含む。

慢性感染症の例は、しかし、限定しないが、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、又は真菌感染症、例えば慢性肝炎、肺感染症、下気道感染症、気管支炎、インフルエンザ、肺炎、及び性行為感染症を含む。ウイルス感染症の例は、しかし、限定しないが、肝炎（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、ＡＩＤＳ及びＡＩＤＳ関連症候群、鶏痘（水痘）、感冒、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、天然痘（痘瘡）、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、口蹄病、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、流行性耳下腺炎、ノロウイルス、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、ウエストナイル病、及び黄熱病を含む。

細菌感染症の例は、しかし、限定しないが、肺炎、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、結核、炭疽菌、ボツリヌス中毒、ブルセラ症、カンピロバクター症、チフス、淋病、リステリア症、ライム病、リウマチ熱、百日咳（百日咳）、ペスト、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、野兎病、腸チフス、及び尿路感染症を含む。

寄生虫感染症の例は、しかし、限定しないが、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、シャーガス病、クリプトスポリジウム症、肝蛭症、フィラリア症、アメーバ感染症、ジアルジア症、蟯虫感染症、住血吸虫症、条虫症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、及びトリパノソーマ症を含む。真菌感染症の例は、しかし、限定しないが、カンジダ症、アスペルギルス症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症、及び足白癬を含む。

本発明の好ましい実施態様において、本発明は、癌を処置するための使用のための本発明に従ったＩＣＯＳに対するアンタゴニスト抗体又はその誘導体に関する。好ましくは、前記癌は、ヒト悪性リンパ腫、卵巣癌、子宮頸癌、及び乳癌より選択される。最も好ましくは、前記癌は乳癌である。

本発明は、また、免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制に関連する疾患又は状態を処置するための方法に関し、疾患は、癌及び慢性感染症、好ましくは、癌及び慢性感染症、好ましくは、癌からなる群において選択され、それにおいて、前記方法は、それを必要とする被験体に、本発明に従ったＩＣＯＳに対するアンタゴニスト抗体又はその誘導体の治療的に効果的な量を投与する工程を含む。

ＩＣＯＳに対するアゴニスト抗体
ＩＣＯＳ会合は、免疫抑制性Ｔ細胞応答と関連することが見出されている。実際に、前記会合は、ＩＬ−１０及びＩＦＮγ産生を低下させ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を低下させると記載されている。

従って、本発明者らにより証明された通り、ＩＣＯＳのアゴニスト抗体は、反対の効果を提供し、過剰な免疫応答と関連する又はそれにより起こされる疾患を処置するために有益である。本発明は、このように、ＩＣＯＳに対する抗体又はその誘導体に関し、ここで該抗体又はその誘導体は：
・ ＩＬ−１０及びＩＦＮγ産生を誘導し；
・ ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を誘導し；
・ Ｔｃｏｎｖ増殖を低下させ、及び
・ Ｔｒｅｇの免疫抑制機能を増加させる。

「ＩＬ−１０及びＩＦＮγ産生を誘導すること」とは、ＩＬ−１０及びＩＦＮγの産生の有意な増加が観察されることを意味する。

「ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を誘導すること」とは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖の有意な増加が、コントロール組織、好ましくは非腫瘍組織、より好ましくは血液と比較し、標的組織、好ましくは腫瘍組織において観察されることを意味する。

「Ｔｃｏｎｖ増殖を低下させること」とは、Ｔｃｏｎｖの増殖の有意な増加が、コントロール組織、好ましくは非腫瘍組織、より好ましくは血液と比較し、標的組織、好ましくは腫瘍組織において観察されることを意味する。

「Ｔｒｅｇの免疫抑制機能を増加させること」とは、Ｔｒｅｇ抑制活性の有意な増加が観察されることを意味する。

実施態様において、前記抗体はモノクローナル抗体である。

実施態様において、前記抗体はキメラ抗体である。

実施態様において、前記抗体はヒト化抗体である。

本発明は、さらに、ＩＣＯＳに対する抗体に関し、それにおいて、前記抗体は、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、それぞれ受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７６、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７７、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７８の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ ５３−３、Ｉｃｏｓ ８８−２、及びＩｃｏｓ ９２−１７ならびにそれらの誘導体からなる群より選択される。

本発明は、また、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、それぞれ受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７６、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７７、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７８の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ ５３−３、Ｉｃｏｓ ８８−２、及びＩｃｏｓ ９２−１７からなる群より選択される抗体の６つのＣＤＲを含む抗体に関する。

本発明は、また、上の表１の６つのＣＤＲを含む抗体に関する。

別の実施態様において、本発明は、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、それぞれ受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７６、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７７、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７８の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ ５３−３、Ｉｃｏｓ ８８−２、及びＩｃｏｓ ９２−１７からなる群より選択される抗体の１つの誘導体抗体に関する。

本発明のアゴニスト抗体の治療的使用
本発明は、また、医薬としての使用のための本発明に従ったＩＣＯＳに対するアゴニスト抗体又はその誘導体に関する。

本発明は、また、過剰な免疫応答と関連する又はそれにより起こされる疾患又は状態を処置するための使用のための本発明に従ったＩＣＯＳに対するアゴニスト抗体あるいはその誘導体に引かれる。

本発明は、また、自己免疫疾患、移植拒絶、又は移植片対宿主疾患を処置するための使用のための本発明に従ったＩＣＯＳに対するアゴニスト抗体あるいはその誘導体に引かれる。

１つの特定の実施態様において、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、アジソン病、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、特発性白血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、男性不妊、混合性結合組織病、重症筋無力症、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、ライター症候群、スティフマン症候群、甲状腺中毒症、潰瘍性大腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される。

別の実施態様において、本発明は、また、神経系の炎症性障害（例えば多発性硬化症など）、粘膜炎症性疾患（例えば炎症性腸疾患、喘息、又は扁桃炎など）、炎症性皮膚疾患（例えば皮膚炎、乾癬、又は接触過敏症など）、及び自己免疫性関節炎（例えば関節リウマチなど）からなる群において選択される炎症性障害を処置するための使用のための本発明に従ったＩＣＯＳに対するアゴニスト抗体又はその誘導体に引かれる。

本発明は、また、過剰な免疫応答、好ましくは、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主疾患、又は炎症性障害と関連する又はそれにより起こされる疾患又は状態を処置するための方法に関し、それにおいて、前記方法は、それを必要とする被験体に、本発明に従ったＩＣＯＳに対するアゴニスト抗体又はその誘導体の治療的に効果的な量を投与する工程を含む。

本発明の抗体をコードする核酸配列
本発明のさらなる実施態様は、５３．３ ｍＡｂ、８８．２ ｍＡｂ、９２．１７ ｍＡｂ、１４５．１ ｍＡｂ、３１４．８ ｍＡｂ及びそれらの誘導体からなる群より選択される抗体の１つの抗体をコードする核酸配列に関する。

特定の実施態様において、本発明は、５３．３ ｍＡｂ、８８．２ ｍＡｂ、９２．１７ ｍＡｂ、１４５．１ ｍＡｂ、３１４．８ ｍＡｂ及びそれらの誘導体からなる群より選択される抗体の１つのＶＨドメイン又はＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。

典型的には、前記核酸はＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、それは、任意の適したベクター（例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターなど）に含まれうる。

用語「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例、外来遺伝子）を宿主細胞中に導入することができ、宿主を形質転換し、導入配列の発現（例、転写及び翻訳）を促進する媒剤を意味する。そのため、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターは、調節エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）を含み、被験体への投与時に前記抗体の発現を起こしうる又は向けうる。動物細胞用の発現ベクターにおいて使用されるプロモーター及びエンハンサーの例は、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター及びエンハンサーなどを含む。

動物細胞用の任意の発現ベクターを、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入し、発現させることができる限り、使用することができる。適したベクターの例は、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ＰＫＣＲ、ＰＳＧＬベータＤ２−４などを含む。プラスミドの他の例は、複製起点を含む複製プラスミド、又は統合プラスミド（例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなど）を含む。ウイルスベクターの他の例は、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、及びＡＡＶベクターを含む。そのような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術により（例えばパッケージング細胞をトランスフェクトすることにより又はヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いた一過性トランスフェクションにより）産生してもよい。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などを含む。そのような複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールが、例えば、ＷＯ ９５／１４７８５、ＷＯ ９６／２２３７８、ＵＳ ５，８８２，８７７、ＵＳ ６，０１３，５１６、ＵＳ ４，８６１，７１９、ＵＳ ５，２７８，０５６、及びＷＯ ９４／１９４７８において見出されうる。

本発明のさらなる目的は、本発明の核酸及び／又はベクターによりトランスフェクト、感染、又は形質転換された細胞に関する。用語「形質転換」は、宿主細胞への「外来」（即ち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の導入を意味し、宿主細胞が、導入された遺伝子又は配列を発現し、所望の物質（典型的には、導入された遺伝子又は配列によりコードされるタンパク質又は酵素）を産生する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け、発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。本発明の核酸を使用し、適した発現系において本発明の抗体を産生してもよい。用語「発現系」は、適した条件下での（例、ベクターにより運ばれ、宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための）宿主細胞及び適合するベクターを意味する。

一般的な発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞及びベクターを含む。宿主細胞の他の例は、限定されないが、原核細胞（例えば細菌など）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）を含む。特定の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、クルイベロマイセス又はサッカロマイセス酵母、哺乳動物細胞株（例、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）ならびに初代又は確立された哺乳動物細胞培養物（例、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生される）を含む。例は、また、マウスＳＰ２／０−Ａｇｌ４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ＣＨＯ細胞（それにおいてジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」として言及する）を欠損している）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２Ｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」として言及する）などを含む。

本発明は、また、本発明に従った抗体を発現する組換え宿主細胞を産生する方法に関し、前記方法は以下の工程：
（ｉ）インビトロ又はエクスビボで、上に記載する通りの組換え核酸又はベクターを、コンピテント宿主細胞中に導入すること、
（ｉｉ）インビトロ又はエクスビボで、得られた組換え宿主細胞を培養すること、及び
（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択すること
を含む。そのような組換え宿主細胞を、本発明の抗体の産生のために使用することができる。

本発明に従った医薬的組成物
本発明は、また、本発明の抗体を含む医薬的組成物に関する。

従って、本発明の抗体は、医薬的に許容可能な賦形剤、及び、場合により、徐放性マトリックス（例えば生物分解性ポリマーなど）と組み合わせて、治療用組成物を形成しうる。

「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに投与した場合（適宜）、有害の、アレルギー性の、又は他の厄介な反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、任意のタイプの非毒性の固体、半固体、もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は補助製剤を指す。

医薬的組成物の形態、投与の経路、投与量、及び投与計画は、当然ながら処置される状態、疾病の重症度、患者の年齢、体重、及び性別などに依存する。

本発明の医薬的組成物を、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、又は眼内投与などのために製剤化することができる。

好ましくは、医薬的組成物は、注入することが可能な製剤用の医薬的に許容可能である媒剤を含む。これらは、特に等張性の無菌生理食塩溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、又はそのような塩の混合物）、又は乾燥した、特に凍結乾燥組成物でありうるが、それらは、場合により、滅菌水又は生理学的食塩水の添加時に、注射用溶液を構成することができる。

投与のために使用される用量を、種々のパラメーターに応じて、特に、使用される投与の様式、関連する病理、又は、あるいは、処置の所望の持続期間に応じて適応することができる。医薬的組成物を調製するために、抗体の効果的な量を、医薬的に許容可能な担体又は水性媒質中に溶解又は分散させてもよい。注射可能な使用のために適した医薬的剤形は、無菌水性液剤又は分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射液剤又は分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、容易に注射可能である程度に液体でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌及び真菌など）の混入作用に対して保護されなければならない。

遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロースなど）と適切に混合し、水中で調製することができる。分散剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物ならびに油中で調製することができる。保存及び使用の普通の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含む。

本発明の抗体は、中性又は塩の形態で組成物に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、それらは、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸など）、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、また、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄など）、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導されうる。

担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適した混合物、及び野菜油を含む溶媒又は分散媒質でありうる。

適した流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、要求される粒子サイズの維持により（分散剤の場合において）、及び界面活性剤の使用により維持することができる。

微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬剤及び抗真菌薬剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらすことができる。多くの場合において、等張薬剤（例えば、糖又は塩化ナトリウム）を含むことが好ましいであろう。

注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）の組成物中での使用によりもたらすことができる。

無菌の注射可能な溶液は、上に列挙する種々の他の成分と共に適当な溶媒中に、要求される量で活性化合物を取り込ませることにより調製し、要求に応じて、続いてろ過滅菌を行う。

一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、基礎分散媒剤及び上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌媒剤中に取り込ませることにより調製する。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合において、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それによって、以前に無菌ろ過したその溶液から活性成分と、任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。

直接注射用のより濃縮された、又は高度に濃縮された溶液の調製も熟慮され、そこでは、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が、極めて迅速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍面積に送達する。

製剤化時に、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療的に効果的である量で投与されうる。製剤は、種々の投与形態（例えば上に記載する注射可能な溶液のタイプなど）で簡単に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。

水性溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要な場合、適切に緩衝化し、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にすべきである。

これらの特定の水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、用いることができる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１投与量を、１mlの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００mlの皮下注入液に添加する又は提案された注入部位に注射しうる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。投与量の変更が、処置されている患者の状態に依存して必ず生じる。投与責任者は、任意の事象において、個々の被験体のために適当な用量を決定する。

本発明の抗体を、治療用混合物内で製剤化し、約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０、又はさらには約１０ミリグラム／用量などを含みうる。複数用量を投与することもできる。非経口投与（例えば静脈内又は筋肉内注射など）のために製剤化される化合物に加えて、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与のための錠剤又は他の固体；徐放カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態を含む。

特定の実施態様において、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が、宿主細胞中への抗体の導入のために熟慮される。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者に公知である。

ナノカプセルは、一般的に、安定な再現性のある方法で、化合物を封入することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような超微粒子（およそ０．１μmのサイズ）は、一般的に、インビボで分解されることができるポリマーを使用して設計される。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本発明における使用のために熟慮され、そのような粒子は簡単に作られうる。

リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、自然に多層同心二重層小胞（また、多層小胞（ＭＬＶ）と呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００Aの範囲の直径を有し、コア中に水性溶液を含む、小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。

本発明の抗体を産生するための方法
本発明の抗体は、当技術分野において公知の任意の技術（例えば、限定をされないが、任意の化学的、生物学的、遺伝的、又は酵素的技術などを単独又は組み合わせのいずれかで）により産生されうる。

所望の配列のアミノ酸配列を知っていれば、当業者は、ポリペプチドの産生のための標準的技術により、前記抗体を容易に産生することができる。例えば、それらは、周知の固相方法を使用し、好ましくは、市販のペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems（Foster City, California）により作られたものなど）を使用し、製造業者の指示に従って、合成することができる。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術により合成することができる。例えば、抗体は、発現ベクター中への抗体をコードするＤＮＡ配列の組み込み及び所望の抗体を発現する適した真核生物又は原核生物宿主中へのそのようなベクターの導入後、ＤＮＡ発現産物として得ることができる（そこから、それらを、後に、周知の技術を使用して単離することができる）。

特に、本発明は、さらに、本発明の抗体を産生する方法に関し、その方法は、以下からなる工程：
（ｉ）前記抗体の発現を可能にするために適した条件下で、本発明に従った形質転換された宿主細胞を培養すること；及び
（ｉｉ）発現された抗体を回収すること
を含む。

別の特定の実施態様において、本方法は、以下の工程：
（ｉ）抗体の発現を可能にするために適した条件下で、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７６、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７７、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７８、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７９、又はＣＮＣＭ Ｉ−４１８０として寄託されたハイブリドーマを培養すること；及び
（ｉｉ）発現された抗体を回収すること
を含む。

本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手段（例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなど）により培養培地から適切に分離される。

特定の実施態様において、本発明のヒトキメラ抗体は、以前に記載された通りのＶＬ及びＶＨドメインをコードする核酸配列を得ること、それらを、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中に挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築すること、ならびに発現ベクターを動物細胞中に導入することによりコード配列を発現させることにより産生することができる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとして、それは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域でありうるが、しかし、ＩｇＧクラスのものが適し、ＩｇＧクラスに属するサブクラスの任意の１つ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４など）も使用することができる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとして、それは、Ｉｇに属する任意の領域でありうる。カッパクラス又はラムダクラスのものを使用することができる。キメラ抗体を産生するための方法は当技術分野において周知である、従来の組換えＤＮＡ技術、及び遺伝子トランスフェクション技術を含む（特許文書ＵＳ５，２０２，２３８；ＵＳ５，２０４，２４４を参照のこと）。

本発明のヒト化抗体を、以前に記載された通りの、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得ること、それらを、（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域及び（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中に挿入することによりヒト化抗体発現ベクターを構築すること、ならびに発現ベクターを動物細胞中に導入することにより遺伝子を発現させることにより産生してもよい。

ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子及び抗体軽鎖をコードする遺伝子が、別々のベクター上に存在するタイプ又は両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデムタイプ）のいずれかでありうる。ヒト化抗体発現ベクターの構築の簡単さ、動物細胞中への導入の簡単さ、ならびに動物細胞における抗体Ｈ及びＬ鎖の発現レベル間のバランスに関して、タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターの例は、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などを含む。

従来の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術に基づくヒト化抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である。抗体は、当技術分野において公知の種々の技術、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又はリサーフェイシング（ＥＰ ５９２，１０６；ＥＰ ５１９，５９６）、及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を使用してヒト化することができる。そのような抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３及び国際特許出願ＷＯ ９６／０２５７６を参照のこと）。

本発明のＦａｂは、ＩＣＯＳと特異的に反応する抗体を、プロテアーゼのパパインを用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核生物発現系用の又は真核生物発現系用のベクター中に挿入すること、及び、そのベクターを、原核生物又は真核生物（適宜）中に導入し、Ｆａｂを発現させることにより産生することができる。

本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＩＣＯＳと特異的に反応する抗体を、プロテアーゼのペプシンを用いて処理して得ることができる。

また、Ｆ（ａｂ’）２は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して、以下に記載するＦａｂ’を結合することにより産生することができる。

本発明のＦａｂ’は、ヒトＩＣＯＳと特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤のジチオスレイトールを用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを、原核生物用の発現ベクター又は真核生物用の発現ベクター中に挿入すること、及び、そのベクターを、原核生物又は真核生物（適宜）中に導入し、その発現を行うことにより産生することができる。

本発明のｓｃＦｖは、以前に記載された通りの、ＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得ること、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、このＤＮＡを原核生物用の発現ベクター又は真核生物用の発現ベクター中に挿入すること、次に、この発現ベクターを原核生物又は真核生物中に導入し（適宜）、ｓｃＦｖを発現させることにより産生することができる。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを生成するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を使用してもよく、それは、相補性決定領域（ＣＤＲ）をドナーｓｃＦｖフラグメントより選択すること、及び、それらを、公知の三次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワーク上に移植することを含む（例、Ｗ０９８／４５３２２；ＷＯ ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照のこと）。

本明細書に記載する抗体のアミノ酸配列修飾が熟慮される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。ヒト化抗体が、非ヒト動物に由来する抗体のＶＨ及びＶＬ中のＣＤＲだけを、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲにおいて単に移植することにより産生される場合、抗原結合活性が、非ヒト動物に由来する本来の抗体のものとの比較において、低下することが公知である。非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのいくつかのアミノ酸残基が、ＣＤＲ中だけでなく、また、ＦＲ中でも、抗原結合活性と直接的又は間接的に関連していることが考慮される。故に、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基を用いた、これらのアミノ酸残基の置換は、結合活性を低下させうる。

この問題を解決するために、ヒトＣＤＲを用いて移植された抗体において、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の内、抗体への結合に直接的に関連付けられる、又は、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用する、又は、抗体の三次元構造を維持する、及び抗原への結合に直接的に関連付けられるアミノ酸残基を同定する試みがなされた。低下した抗原結合活性は、同定されたアミノ酸を、非ヒト動物に由来する本来の抗体のアミノ酸残基を用いて置換することにより増加しうる。

修飾及び変化は、本発明の抗体の構造において、及びそれらをコードするＤＮＡ配列において行ってもよく、依然として、望ましい特徴を伴う抗体をコードする機能的分子を得る。アミノ酸配列において変化を行う際、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮してもよい。タンパク質上に相互作用的な生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特徴が、結果としてのタンパク質の二次構造に寄与し、それは、次に、タンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を定義することが受け入れられている。

各々のアミノ酸に、それらの疎水性及び電荷特徴に基づき、ヒドロパシー指数が割り当てられている。これらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。

本発明のさらなる実施態様は、また、本発明の抗体の機能保存変異体を包含する。

「機能保存変異体」は、タンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的な立体構造及び機能の変化を伴わずに変化させたものであり、しかし、限定しないが、同様の性質（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸を用いたアミノ酸の置換を含む。

保存されているとして示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、同様の機能の任意の２つのタンパク質間でのタンパク質又はアミノ酸配列類似性のパーセントが変動しうるように、及び、例えば、アライメントスキーム（例えばクラスター方法による、など）に従って決定される通りに７０%〜９９%でありうる（それにおいて類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく）ようにタンパク質において異なりうる。

「機能保存変異体」は、また、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定される通り少なくとも６０%のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８５%、さらに好ましくは少なくとも９０%及びさらにより好ましくは少なくとも９５%を有するポリペプチドを含み、それらは、それと比較される天然又は親タンパク質と同じ又は実質的に同様の特性又は機能を有する。２つのアミノ酸配列は、より短い配列の全長にわたり、アミノ酸の８０%を上回り、好ましくは、８５%を上回り、好ましくは、９０%を上回り同一である、又は、約９０%を上回り、好ましくは、９５%を上回り類似している（機能的に同一である）場合、「実質的に相同」又は「実質的に類似」している。好ましくは、類似の又は相同な配列は、アラインメントにより、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラム、又は配列比較アルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）のいずれかを使用して同定する。

例えば、特定のアミノ酸は、活性のかなりの喪失を伴わず、タンパク質構造中の他のアミノ酸により置換されてもよい。タンパク質の相互作用能力及び性質は、タンパク質の生物学的機能活性を定義するため、特定のアミノ酸置換は、タンパク質配列中で、及び、もちろん、そのＤＮＡコード配列中で行うことができ、それにもかかわらず、同様の特性を伴うタンパク質が得られる。このように、種々の変化を、本発明の抗体配列、又は、前記抗体をコードする対応するＤＮＡ配列中で、それらの生物学的活性のかなりの喪失を伴わず、行ってもよいことが熟慮される。

特定のアミノ酸を、同様のヒドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸により置換し、依然として、同様の生物学的活性を伴うタンパク質をもたらしうる、即ち、依然として、生物学的に機能的に等価のタンパク質を得うることが、当技術分野において公知である。上に概略を示す通り、アミノ酸置換は、一般的に、従って、アミノ酸側鎖置換の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。

種々の前述の特徴を考慮に入れる例示的な置換が、当業者に周知であり、アルギニン及びリシン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、及びイソロイシンを含む。本発明の抗体のアミノ酸修飾の別のタイプは、抗体の本来のグリコシル化パターンを変化させるために有用でありうる。

「変化する」とは、抗体中で見出される１つ又は複数の炭水化物部分を欠失すること、及び／又は、抗体中に存在しない１つ又は複数のグリコシル化部位を加えることを意味する。

抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結である。「Ｎ連結」は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。このように、ポリペプチド中でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作製する。抗体へのグリコシル化部位の添加は、便利には、アミノ酸配列を変化させることにより達成され、それは、上に記載するトリペプチド配列の１つ又は複数を含むようにする（Ｎ連結グリコシル化部位のため）。共有結合的な修飾の別のタイプは、抗体への化学的又は酵素的に共役するグリコシドを含む。これらの手順は、それらが、Ｎ又はＯ連結グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞において抗体の産生を要求しない点で有利である。使用した共役様式に依存して、糖を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのものなど、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニン、又はヒドロキシプロリンのものなど、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンのものなど、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に付着してもよい。例えば、そのような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。

抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成されうる。化学的な脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価の化合物への抗体の曝露を要求する。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大半の又は全ての糖の切断をもたらすが、抗体をインタクトなままにする。

抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。

抗体の共有結合的な修飾の別のタイプは、抗体を、種々の非タンパク質性ポリマー（例、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン）の１つに、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号、又は第４，１７９，３３７号に示す様式で連結することを含む。また、エフェクター機能に関して、本発明の抗体を修飾し、例えば、抗体の抗原依存的な細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存的な細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強することが望ましいであろう。これは、抗体のＦｃ領域において１つ又は複数のアミノ酸置換を導入することにより達成されうる。あるいは又は加えて、システイン残基をＦｃ領域において導入してもよく、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力及び／又は増加した補体媒介性細胞殺傷及び／又は抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有しうる（Caron PC. et al. J Exp Med. 1992 Oct 1; 176(4): 1191-5及びShopes B. J Immunol. 1992 May l; 148(9): 2918-22）。

診断方法
本発明は、また、乳癌患者における再発又は早期死亡の増加したリスクの診断方法に関する。実際に、実施例３において示す通り、高いＩＣＯＳ^＋Ｔｒｅｇ細胞数の存在は、乳癌患者についてのより低い無増悪生存率又は全生存率に関連付けられる。

このように、本発明は、乳癌患者のサンプル中でＩＣＯＳ陽性（ＩＣＯＳ^＋）Ｔｒｅｇ細胞を定量化する工程を含む、前記患者の再発又は早期死亡の増加したリスクを診断するための方法に関する。前記の数が高い、例えば、実施例３の方法及び図９を使用する場合に１．７個ＩＣＯＳ^＋細胞／スポットより大きい場合、前記乳癌患者における再発又は早期死亡の増加したリスクがある。

本発明は、また、患者のサンプル中のＩＣＯＳ陽性Ｔｒｅｇ細胞を定量化する工程を含む、抗ＩＣＯＳ免疫療法により処置可能な患者を選択するための方法に関する。前記免疫療法は、本発明の抗ＩＣＯＳ抗体でありうる。
前記サンプルは、生検から得てもよい。ＩＣＯＳ^＋Ｔｒｅｇ細胞の前記定量化は、抗ＩＣＯＳ抗体のおかげで、特に、上に記載する抗体のいずれか１つにより実施されうる。

前臨床乳腺腫瘍モデルにおける処置
実施例６において示す通り、代替中和ラット抗マウスＩＣＯＳ抗体（１７Ｇ９、ＩｇＧ２ｂ）を用いた乳腺腫瘍の確立されたマウスモデルの処置によって、腫瘍進行が低下し、それらの原発性乳房腫瘍において高いＩＣＯＳ^＋Ｔｒｅｇ検出を伴う患者の亜集団における腫瘍退縮を支持する、本発明の抗ＩＣＯＳ中和抗体を用いた処置の潜在力が強化される。

本発明を、さらに、以下の図及び実施例を考慮して例証する。

Ｔａ−ＴｒｅｇはＩＣＯＳを強く発現し、Ｔａ−ｐＤＣと共局在化し、インサイチュで増殖するが、しかし、インビトロでは増殖しない。Ａ− 腫瘍凍結切片を、抗ＩＣＯＳ Ａｂ（緑色）及びＫｉ６７ Ａｂ（茶色）ならびにＨＲＰにコンジュゲートさせた二次抗マウスＡｂを用いて染色し、それぞれ、ヒストグリーン及びＤＡＢを用いて明らかにした（インサートボックスについて倍率１０×及び４０×）。 Ｔａ−ＴｒｅｇはＩＣＯＳを強く発現し、Ｔａ−ｐＤＣと共局在化し、インサイチュで増殖するが、しかし、インビトロでは増殖しない。Ｂ− Ｋｉ６７発現を、マルチカラーフローサイトメトリーにより、原発性腫瘍（Ｔａ−Ｔｒｅｇ、Ｔａ−Ｔｃｏｎｖ）又はペア血液（Ｔｒｅｇ、Ｔｃｏｎｖ）内のＴｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ１２７−ＣＤ２５^ｈｉｇｈ）及びＴｃｏｎｖ（ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ２５^low/-）に関して分析した。 Ｔａ−ＴｒｅｇはＩＣＯＳを強く発現し、Ｔａ−ｐＤＣと共局在化し、インサイチュで増殖するが、しかし、インビトロでは増殖しない。Ｃ− 原発性腫瘍又は健常血液のいずれかからの精製Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖを、９６ウェルＵ底プレート中で、５００UI/mlのＩＬ−２の存在において培養した。細胞数を、４日毎に、数え上げにより定量化した。 Ｔａ−ＴｒｅｇはＩＣＯＳを強く発現し、Ｔａ−ｐＤＣと共局在化し、インサイチュで増殖するが、しかし、インビトロでは増殖しない。Ｄ−Ｆ 腫瘍凍結切片を、抗ＣＤ３ Ａｂ（茶色）を用いて染色し、ヘマトキシリン（青色）を用いて対比染色した（インサートボックス中の１０×及び４０×）（Ｄ）；ＣＤ３ Ａｂ（緑色）及びＢＤＣＡ２（茶色）（インサートボックス中の２０×及び４０×）（Ｅ）；ＦｏｘＰ３ Ａｂ（茶色）及びＢＤＣＡ２（緑色）（インサートボックス中の２０×及び４０×）（Ｆ）。 Ｔａ−ＴｒｅｇはＩＣＯＳを強く発現し、Ｔａ−ｐＤＣと共局在化し、インサイチュで増殖するが、しかし、インビトロでは増殖しない。Ｄ−Ｆ 腫瘍凍結切片を、抗ＣＤ３ Ａｂ（茶色）を用いて染色し、ヘマトキシリン（青色）を用いて対比染色した（インサートボックス中の１０×及び４０×）（Ｄ）；ＣＤ３ Ａｂ（緑色）及びＢＤＣＡ２（茶色）（インサートボックス中の２０×及び４０×）（Ｅ）；ＦｏｘＰ３ Ａｂ（茶色）及びＢＤＣＡ２（緑色）（インサートボックス中の２０×及び４０×）（Ｆ）。 Ｔａ−ＴｒｅｇはＩＣＯＳを強く発現し、Ｔａ−ｐＤＣと共局在化し、インサイチュで増殖するが、しかし、インビトロでは増殖しない。Ｄ−Ｆ 腫瘍凍結切片を、抗ＣＤ３ Ａｂ（茶色）を用いて染色し、ヘマトキシリン（青色）を用いて対比染色した（インサートボックス中の１０×及び４０×）（Ｄ）；ＣＤ３ Ａｂ（緑色）及びＢＤＣＡ２（茶色）（インサートボックス中の２０×及び４０×）（Ｅ）；ＦｏｘＰ３ Ａｂ（茶色）及びＢＤＣＡ２（緑色）（インサートボックス中の２０×及び４０×）（Ｆ）。 ＩＣＯＳ及びＩＣＯＳ−Ｌの遮断は、ｐＤＣ媒介性Ｔ細胞活性化の間に、ＭｏＤＣ／Ｔ共培養に強く干渉することなく、ＩＬ−１０分泌を抑止する。精製されたＲ８４８活性化ｐＤＣ又はＭｏＤＣを、５日間にわたり、同種記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞と、Ｃｔｒｌ Ａｂ、抗ＩＣＯＳ（３１４．８）、又は抗ＩＣＯＳ−Ｌ（ＭＩＨ１２）の存在において共培養した。５日目、ＩＬ−１０及びＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡにより、ｐＤＣ／Ｔ共培養（Ａ）及びＭｏＤＣ／Ｔ共培養（Ｂ）からの上清中で定量化した。 ＩＣＯＳ及びＩＣＯＳ−Ｌの遮断は、ｐＤＣ媒介性Ｔ細胞活性化の間に、ＭｏＤＣ／Ｔ共培養に強く干渉することなく、ＩＬ−１０分泌を抑止する。精製されたＲ８４８活性化ｐＤＣ又はＭｏＤＣを、５日間にわたり、同種記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞と、Ｃｔｒｌ Ａｂ、抗ＩＣＯＳ（３１４．８）、又は抗ＩＣＯＳ−Ｌ（ＭＩＨ１２）の存在において共培養した。５日目、ＩＬ−１０及びＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡにより、ｐＤＣ／Ｔ共培養（Ａ）及びＭｏＤＣ／Ｔ共培養（Ｂ）からの上清中で定量化した。 ＩＣＯＳ及びＣＤ３共刺激は、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ増殖ならびに外因性ＩＬ−２の存在におけるＩＬ−１０（しかし、ＩＦＮγではない）分泌を支持する。Ａ／Ｂ− 扁桃腺から出されたＦＡＣＳ選別Ｔｒｅｇ又はＴｃｏｎｖを、５日間にわたり、単独で、又は、ＣＤ３／ＩｇＧ、ＣＤ３／８８．２、ＣＤ３／ＣＤ２８アゴニストｍＡｂを用いてコーティングされたビーズと、ＩＬ−２の存在において培養した（ｎ＝３）。増殖を、［^３Ｈ］−チミジン取り込みにより評価した（Ａ）。ＩＬ−１０及びＩＦＮγレベルを、ＥＬＩＳＡにより、培養上清中で測定した（Ｂ）。 ＩＣＯＳ及びＣＤ３共刺激は、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ増殖ならびに外因性ＩＬ−２の存在におけるＩＬ−１０（しかし、ＩＦＮγではない）分泌を支持する。Ａ／Ｂ− 扁桃腺から出されたＦＡＣＳ選別Ｔｒｅｇ又はＴｃｏｎｖを、５日間にわたり、単独で、又は、ＣＤ３／ＩｇＧ、ＣＤ３／８８．２、ＣＤ３／ＣＤ２８アゴニストｍＡｂを用いてコーティングされたビーズと、ＩＬ−２の存在において培養した（ｎ＝３）。増殖を、［^３Ｈ］−チミジン取り込みにより評価した（Ａ）。ＩＬ−１０及びＩＦＮγレベルを、ＥＬＩＳＡにより、培養上清中で測定した（Ｂ）。 ＩＣＯＳ及びＣＤ３共刺激は、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ増殖ならびに外因性ＩＬ−２の存在におけるＩＬ−１０（しかし、ＩＦＮγではない）分泌を支持する。Ｃ− 腫瘍から選別されたＣＤ４^＋ＴａＴ細胞を、５日間にわたり、抗ＣＤ３／ＩｇＧ；抗ＣＤ３／８８．２又は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を用いてコーティングされたビーズと、外因性ＩＬ−２（１００UI/ml）の存在において培養した。上清中のＩＬ−１０及びＩＦＮγの濃度を、ＥＬＩＳＡにより定量化した。 ＩＣＯＳ会合は、ＣＤ２８誘導性ＩＬ−２を遮断し、結果的に、増殖及びＩＦＮγ分泌を低下させる。Ａ− ＣＦＳＥ標識ＣＤ４^＋記憶Ｔ細胞を、５日間にわたり、異なるビーズを用いて、単独で、又は、段階的濃度の外因性ｒｈＩＬ−２（２０UI/ml及び１００UI/ml）の存在において培養し、増殖を、ＣＦＳＥ希釈により、フローサイトメトリーにより評価した。 ＩＣＯＳ会合は、ＣＤ２８誘導性ＩＬ−２を遮断し、結果的に、増殖及びＩＦＮγ分泌を低下させる。Ｂ− 異なるビーズを用いた、外因性ＩＬ−２を伴わない５日間の培養後、ＥＬＩＳＡにより検出されたＩＬ−２。 ＩＣＯＳ会合は、ＣＤ２８誘導性ＩＬ−２を遮断し、結果的に、増殖及びＩＦＮγ分泌を低下させる。Ｃ− 健常ドナーからの血液ＣＤ４^＋記憶Ｔリンパ球を、５日間にわたり、異なるビーズ単独を用いて、又は、外因性ＩＬ−２（１００UI/ml）の存在において培養した。ＩＬ−１０及びＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより定量化した。 乳房腫瘍細胞株及び原発性乳房腫瘍引裂き上でのＩＣＯＳ−Ｌの発現の非存在。Ａ− ＩＣＯＳ−Ｌ発現を、フローサイトメトリーにより、Ａｇ劣化を避けるために、トリプシンの非存在においてＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に収集した乳房腫瘍上皮細胞株の懸濁液上で評価した。 乳房腫瘍細胞株及び原発性乳房腫瘍引裂き上でのＩＣＯＳ−Ｌの発現の非存在。Ｂ− ＩＣＯＳ−Ｌ発現を、コントロールＡｂ（破線）又は抗ＩＣＯＳ Ａｂ（３１４．８）（実線）の存在における４８時間培養後、腫瘍細胞（ＣＤ４５細胞）上で評価した。 代替ラット抗マウス抗ＩＣＯＳ Ａｂ（１７Ｇ９、ＩｇＧ２ｂ）を用いた原発性Ｎｅｕ１５乳腺腫瘍の処置によって、腫瘍成長が遅くなる。 Ａ：Ｔｒｅｇ細胞数が、原発性子宮頸癌内で増加している。 Ｂ：Ｔｒｅｇ細胞ＩＣＯＳ^＋が、原発性子宮頸癌内で増加している。 非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）におけるＩＣＯＳ発現Ｔｒｅｇの増加。ＨＤ ホジキン病。ＦＬ 濾胞性リンパ腫。ＤＬＢＣＬ びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫。ＭＣＬ マントル細胞リンパ腫。ＭＺＬ 辺縁帯リンパ腫。 原発性乳房腫瘍内でのＩＣＯＳ^＋ Ｔｒｅｇ細胞の存在は、生存にネガティブな影響を有する。１０年間の臨床追跡調査を行った１２０のパラフィン包埋原発性腫瘍サンプルを、それらのＩＣＯＳ発現について、市販の抗ＩＣＯＳウサギポリクローナルＡｂを使用してテストした。ＩＣＯＳ^＋細胞の平均値を、６つの異なるスポット上で評価した。統計分析を実施するために、中央値をカットオフとして使用し、群を平衡化した。全生存率（Ａ）又は無増悪生存率（Ｂ）に対する原発性腫瘍におけるＩＣＯＳの存在によるＩＣＯＳ発現の影響を示す。 原発性乳房腫瘍内でのＩＣＯＳ^＋ Ｔｒｅｇ細胞の存在は、生存にネガティブな影響を有する。１０年間の臨床追跡調査を行った１２０のパラフィン包埋原発性腫瘍サンプルを、それらのＩＣＯＳ発現について、市販の抗ＩＣＯＳウサギポリクローナルＡｂを使用してテストした。ＩＣＯＳ^＋細胞の平均値を、６つの異なるスポット上で評価した。統計分析を実施するために、中央値をカットオフとして使用し、群を平衡化した。全生存率（Ａ）又は無増悪生存率（Ｂ）に対する原発性腫瘍におけるＩＣＯＳの存在によるＩＣＯＳ発現の影響を示す。

実施例
実施例１：本発明に従った抗体の特徴付け
材料及び方法
Ｉ．細胞生物学
１−選択／細胞精製
＊末梢血単核細胞の単離
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、健常ボランティア（Etablissement Francais du sang, Marseille, France）の末梢血幹細胞移植から、Lymphoprep勾配（Abcys）により単離した。チューブ中で、血液の２／３を、Lymphoprepの１／３にわたり滴下して沈着させ、２０分間にわたり、２０００rpmで、２０℃で遠心し、勾配を乱さないように加速を伴わない。遠心後、単核細胞を回収し、ＰＢＳ１%ＦＣＳ（ウシ胎児血清）＋ヘパリン中で、２０分間にわたり、１０００rpmで、２０℃で２回洗浄する。

細胞を、次に、直ちに使用するか、又は、−８０℃で、ＲＰＭＩ １６４０ ５０% ＦＣＳ １０% ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中で５０．１０^６個細胞/mlに凍結した。２４時間後、細胞を保存のために窒素に移す。

＊ＣＤ４のネガティブ選択
ＣＤ４^＋Ｔリンパ球をＰＢＭＣから精製した。解凍後、細胞を洗浄し、４０μLの選別緩衝液（ＰＢＳ ０．５% ＢＳＡ ２mM ＥＤＴＡ）中で１０．１０^６個細胞に希釈した。キットＭＡＣＳヒトCD4⁺T Cell Isolation Kit IIを使用した（Miltenyi Biotec）：ビオチン（一次標識）にコンジュゲートさせたモノクローナル抗体の１０μLの溶液を加える。混合物を、１０分間にわたり、４℃で、撹拌しながらインキュベートした。
細胞を、次に、抗ビオチン（二次標識）と共役させた２０μLの磁気ビーズと、１５分間にわたり、４℃で、撹拌を伴って接触させる。緩衝液選別で洗浄後、細胞をAutomacs（Miltenyi）に選別した。ＣＤ４^＋Ｔ標識細胞が枯渇したネガティブ画分を、次に、単離する。これは、約９５%のＣＤ４^＋純度の集団を与える。

２−活性化及び細胞培養
＊ビーズＣＤ３／ＣＤ２８を用いた前活性化及び、続く、ｍＡｂを用いた刺激
ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ビーズＣＤ３／ＣＤ２８（Dynabeads, Invitrogen）（１個細胞／１ビーズ）の存在において、濃度１０^６個細胞/ＲＰＭＩ １０% ＦＣＳmLにし、４８時間にわたり３７℃でインキュベートする。細胞を、次に、ビーズから、磁気を用いて分離し、Dynal Biotechを、ＲＰＭＩ １０% ＦＣＳ中に、濃度１０^６個細胞/mlで一晩静置する。

他方で、ｍＡｂ 抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＩＣＯＳ（ＩＣＯＳ ８８−２）、及びコントロールＩｇＧ１ ｍＡｂ（Sigma）を、９６平面ウェル上に、一晩、４℃でコーティングした。ウェルを、他のｍＡｂ ＰＢＳ １×１００μL/ウェル中で、２０μg/mlを用いて添加された５０ng/ml抗ＣＤ３を用いてコーティングする。次の日、プレートを、ＰＢＳを用いて洗浄し、ＰＢＳ ５% ＦＣＳ （２００μl/ウェル）を用いて２時間飽和させる。以前に取り込まれたＣＦＳＥを伴うＣＤ４^＋Ｔ細胞（以下を参照のこと）を、コーティングされたプレート上に、２１０５個細胞／２００μL培地／ウェルの割合で分布させ、７２時間にわたり３７℃でインキュベートする。４８時間目、上清を収集し、７２時間目、細胞を収集し、フローサイトメトリーにより増殖を分析した（図４）。

＊人工ＡＰＣによる活性化
磁気ビーズ（Dynabeads M-450 Epoxy、Invitrogen）を、リン酸ナトリウム緩衝液（０．１M）中で洗浄し、次に、ビーズを用いて共役させたｍＡｂの５%を表す最適以下の濃度１mg/１．１０^７ビーズでのｍＡｂ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を用いて、ｍＡｂ抗ＣＤ２８又はＩＣＯＳ（ＩＣＯＳ ８８−２又はＣＤ２８．２）、（２μg/１．１０^７ビーズ、１０%）を用いてインキュベートした。これらの人工ＡＰＣを、ｍＡｂを用いて、遅い回転中で、一晩、４℃でインキュベートした。次の日、２回の洗浄をＰＢＳ ０．１% ＢＳＡ中で実施する。人工ＡＰＣは、２．１０^５個のリンパ球Ｔ ＣＤ４^＋／２００μl/ウェルを沈着させ、次に、７２時間にわたり３７℃でインキュベートした９６丸プレートウェル中の細胞について１個のビーズ上に分布させる。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、以前に、ＣＦＳＥを取り込んでいる。４８時間目、上清を収集し、７２時間目、細胞を収集し、フローサイトメトリーにより増殖を分析した。

３−細胞増殖
リンパ球の増殖は、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル）（Molecular Probes, Invitrogen）で追跡する。ＣＦＳＥは細胞透過性及び非蛍光性である。細胞に入る時、エステラーゼが、アセテート基を切断して蛍光を発するのに対し、細胞は不透過性になる。

ＣＦＳＥの特徴は、各々の新たに形成された細胞において、各々の分裂で、等しく共有されるはずである。それは緑色の放射を放出し、細胞の数、位置、及び分化段階の同時分析を許し、細胞当たりの蛍光強度は、ＣＦＳＥの濃度に比例している。ＣＦＳＥを用いて細胞を標識するために、細胞懸濁液を冷１×ＰＢＳ中で希釈する。ＣＦＳＥ：５μMを１０．１０^６個細胞に加えること。細胞を、次に、３７℃の水浴中に置く。

８〜１０分間の撹拌後、細胞を氷上にすぐに置き、反応を停止させた。細胞を、次に、２mlのＰＢＳ １×を用いて２回遠心する。最後に、それらを、所望の容積の培養用ＲＰＭＩ １０% ＦＣＳ中に収集した。増殖は、フローサイトメトリーにより決定される。

ＩＩ−フローサイトメトリー
ＣＤ４^＋細胞を、３０% ＢＳＡ ＰＢＳ（５０μL/ウェル）を用いて、９６ウェルプレート中で、１０分間にわたり４℃で希釈し、非特異的部位を飽和させる。それらは、次に、３０分間にわたり、４℃で、暗闇でインキュベートし、所望の抗体はフルオロクロムに共役されている。ＰＢＳ １×１% ＢＳＡ ０．０２%アジド中での２回の洗浄後（遠心２１００rpm、３分間、４℃で）、細胞を、２００μLのＰＢＳ ２%ホルムアルデヒド中で固定し、フローサイトメーター（FACS Canto、BD Biosciences）中に置いた。結果は、FlowJoソフトウェアにより分析される。

ＩＩＩ−ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定）
ＣＤ４^＋Ｔ細胞の培養上清を４８時間目に収集し、−２０℃で、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、及びＴＮＦαに関するアッセイのために保存する。

結果
１−抗ＩＣＯＳ ｍＡｂの特徴付け
本発明者らは、５つのＩＣＯＳ Ａｂを開発した。それらのアイソタイプをＥＬＩＳＡにより分析した。それらの受容体についてのそれらの親和性の間接的な分析を得るために、ｍＡｂを、ＩＣＯＳを発現する安定トランスフェクタントを使用してテストした。ＪＩＣＯＳ．１細胞は、フルオロクロム（ＰＥ−ＧＡＭ：ヤギ抗マウスＰＥ）に共役したプローブを用いて標識された増加範囲の抗ＩＣＯＳ ｍＡｂの存在下にあった。分析は、サイトメトリーフローにより行った。

このように、ＥＤ ５０、即ち、部位の５０%が飽和されているｍＡｂの濃度を決定することが可能であった。最も低いＥＤ ５０を伴うｍＡｂは、最も高い見かけ上の親和性を伴うものである。

次に、本発明者らは、ＪＩＣＯＳ．１細胞により運ばれるＩＣＯＳ Ｌ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの組換え形態）の結合を阻害する抗ＩＣＯＳ ｍＡｂの能力をテストした。

本発明者らは、抗ＩＣＯＳ ｍＡｂの濃度の勾配を使用した。本発明者らは、フルオロクロム（ＧＡＨ−ＰＥ：ヤギ抗ヒトＰＥ）に共役したプローブにより、ＩＣＯＳ Ｌ Ｆｃへの固定を明らかにした。分析をフローサイトメトリーにより行った。本発明者らは、このように、ＩＤ ５０、即ち、ＩＣＯＳ上でのＩＣＯＳ Ｌ−Ｆｃの結合の５０%を阻害する用量を決定した。

ＩＤ ５０がより小さいほど、より多くのｍＡｂが、組換えＩＣＯＳ Ｆｃと簡単に競合する。

本発明者らは、このように、ＩＣＯＳ Ｒ ３１４−８及びＩＣＯＳ Ｒ ５３−３が、それらの結合部位について高い親和性（ＥＤ ５０＜０．５μg/ml）及び有意な遮断潜在能（ＩＤ ５０＜１mg/ml）を有することを証明した。

抗体ＩＣＯＳ Ｒ ３１４−８を、従って、フルオロクロムAlexa Fluor 647に共役しているものを選び、フローサイトメトリー分析において使用した。

２−抗ＩＣＯＳ ｍＡｂは、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−１０の産生を誘導するそれらの能力において異なる。

本発明者らは、アゴニスト抗体として作用する（即ち、ＩＣＯＳの天然リガンドと同じ作用を有することができる）ｍＡｂの能力を、機能テストを使用してテストした。試験したパラメーターは、ＩＬ−１０の分泌であった。なぜなら、ＩＣＯＳが、ＬＴによりＩＬ−１０の産生を誘導するからである。

抗ＩＣＯＳ ｍＡｂのアゴニスト潜在能を、ＣＤ４^＋Ｔ細胞上でテストし、それは、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて、４８時間にわたり前活性化し、プレート上で分布させ、そこでは、抗ＣＤ３ ｍＡｂを、刺激を継続するために、種々のＩＣＯＳ ｍＡｂと一緒にコーティングした。

培養上清を、次に、４８時間にわたり、ＩＬ−１０についてアッセイし、異なる抗ＩＣＯＳ ｍＡｂにより誘導されるＩＬ−１０の分泌を、市販の抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ（ＩＣＯＳ ｃ）により誘導されるＩＬ−１１０の分泌と比較した。

抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ ５３−３、８８−２、及び９２−１７は、ＣＤ４^＋のＩＬ−１０分泌を有意に増加させるため、アゴニスト抗体である。抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ １４５−１及び３１４−８に関して、ＩＬ−１０の産生における有意な増加は検出されなかった。

本発明者らは、最後に、抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ ５３−３、８８−２、及び９２−１７が、市販の抗ＩＣＯＳよりも良いアゴニストであることを示した。実際に、市販の抗ＩＣＯＳ ｍＡｂを基準として考える場合、抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ ８８−２が、ＩＬ−１０の＋６１%、抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ ９２−１７の＋２０%、及び抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ ５３−３ の＋１４%の増加した分泌を起こす。

結果を以下の表中に要約した：

実施例２：本発明のアンタゴニスト抗体及び本発明のアゴニスト抗体の使用
材料及び方法
免疫組織化学
凍結させた原発性乳房腫瘍切片を、マウス抗ＦＯＸＰ３又は抗Ｋｉ６７を用いて染色し、供給者の指示に従ってImmPRESS抗マウスＩｇペルオキシダーゼキット（Abcys, Paris, France）及びＤＡＢを使用して明らかにした。次に、第２の一次抗体（マウス抗ＩＣＯＳ（５３．３）、抗ＣＤ３、抗ＢＤＣＡ２）を加え、ImmPRESSキット及びHistogreen（Abcys）を用いて明らかにした。染色の特異性を、第１又は第２の一次抗体の代わりに、マウスアイソタイプコントロールを使用して評価した。

乳房腫瘍、扁桃腺、及び健常血液からの単核細胞の精製
単球細胞（ＭＮＣ）を、ＥＦＳから又は原発性乳房腫瘍もしくは扁桃腺サンプルの酵素的な切断から得られた健常な末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心により精製した。

ｐＤＣ及びＴ細胞サブセットの表現型分析
広範な表現型分析のために、ｐＤＣを、全ＭＮＣの中で、ＣＤ４^＋ＣＤ１２３^＋細胞として、ＦＩＴＣ又はＰＥ抗ＣＤ１２３及びＰＥ−Ｃｙ５抗ＣＤ４ならびにＣＤ４０、ＣＤ８６、又はＩＣＯＳＬに対するＰＥ共役抗体を使用して同定した。Ｔ細胞を、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞として同定した。Ｔｒｅｇを、マルチカラー表現型ＣＤ４^＋ＣＤ１２７⁻ＣＤ２５^ｈｉｇｈにより、又は、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞上でのゲーティング後、それらのＦｏｘＰ３発現について同定した。

Ｔａ−Ｔｒｅｇ及びＴａ−Ｔｃｏｎｖ又はそれらの血液対応物の増殖を、マルチカラー分析により評価し、ＫＩ６７ Ａｂ染色に関連するＴｒｅｇ ＣＤ４^＋（ＣＤ１２７⁻ ＣＤ２５^ｈｉｇｈ）及びＴｃｏｎｖ（ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ２５^{Ｌｏｗ／−}）の特徴付けを可能にした。

フローサイトメトリー分析を、FACScan（BD Biosciences）又はADP Cyan（Beckman Coulter）で実施し、データを、Cell Quest Pro software（BD Biosciences）又はFlowJo（Treestar）を用いて分析した。

ｐＤＣの精製
ｐＤＣを、系統（Ｌｉｎ）陰性の濃縮ＭＮＣから、ＣＤ３０４／ＢＤＣＡ−４マイクロビーズキットを使用した磁気活性化細胞選別又はpDC単離キット（Miltenyi Biotec）もしくはFACS選別（登録商標）（FACSVantage SE（商標） DiVaフローサイトメーター、BD Biosciences）を使用したネガティブ枯渇のいずれかにより、Ｌｉｎ⁻ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ細胞として精製した。純度は、ルーチン的に、＞９８%であった。

単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ）のインビトロ生成
ＭｏＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng/ml）＋ ＩＬ−４（５０UI/ml）（Schering Plough, Kenilworth USA）中での７日間の分化後、血液精製単球から得た。

ＣＤ４^＋記憶Ｔ細胞及びＴｒｅｇ精製
記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞（＞９５%純度）を、記載された通りに（Gobert et al, 2009）、抗ＣＤ４５ＲＡ Ａｂを含む磁気枯渇後、ＭＮＣから得た。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７⁻ Ｔｒｅｇ及びＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＤ１２７^{ｌｏｗ／＋}の従来のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、精製した記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞（純度＞９８%）からＦＡＣＳ（登録商標）選別した。

それらのインビトロ増殖を追跡するために、精製された記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、０日目に、ＣＦＳＥを用いて染色した。生細胞を、ＤＡＰＩ排除又はLive and Dead試薬により、細胞透過処理の場合において選択した（２００，０００及び５，０００の最少事象を、全細胞集団で及び精製細胞でそれぞれゲートした）。

ＤＣ−Ｔ細胞の共培養
同種記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、又はＣＤ４^＋Ｔｃｏｎｖ細胞を、３×１０^４〜５×１０^４個細胞で、ＩＬ−２（１００IU/ml）を伴う完全培地中で培養し、高度に精製されたＴＡｐＤＣ、健常ｐＤＣ、又はＭｏＤＣを、２４時間にわたり、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ng/ml）を用いて、Ｒ８４８の存在において前活性化した。前活性化されたＤＣサブセット上でのＴリンパ球の添加を、３通りに、９６ウェル丸底プレート中で、比率１：５（ＤＣ／Ｔ細胞）で行い、５日間にわたり共培養した。増殖を、ＦｏｘＰ３発現を分析する実験においてＣＦＳＥ希釈により又は^３Ｈ−ＴｄＲ取り込みにより分析されたＤＮＡ合成により評価した。

ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ会合の影響を、培養中のｃｔｒｌ Ａｂ、市販の（ＩＳＡ−３）又は特許取得済み（３１４．８）抗ＩＣＯＳ Ａｂ又は抗ＩＣＯＳＬ（ＭＩＨ１２）の添加により評価した。ＥＬＩＳＡによりＴ細胞サイトカイン分泌を評価するために、細胞を、ｐＤＣ又はＴＡｐＤＣを用いて共培養し、５日目に収集した上清を遠心し、−２０℃で保存した。

人工ビーズを用いたＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇの刺激
人工ＡＰＣを、実施例１に記載する通りに産生した。扁桃腺から選別したＴｒｅｇ（３×１０^４）又はＴｃｏｎｖ（１×１０^５）又は腫瘍から精製したＴａ−ＣＤ４^＋Ｔ細胞（１×１０^５）を、５日間にわたり、人工ビーズを用いて、比率１：１（人工ＡＰＣ：Ｔ細胞）で、ＩＬ−２（１００UI/ml）の存在において、９６Ｕ底ウェル中で、２００μl下で培養した。増殖は、ＣＦＳＥ希釈により又は^３Ｈ−ＴｄＲ取り込みにより分析したＤＮＡ合成により評価した。

ＥＬＩＳＡによるＴ細胞培養上清中のサイトカイン検出
５日間の培養上清中のＩＬ−１０、ＩＦＮγ、及びＩＬ−２を、ＥＬＩＳＡにより、Bender Medsystemsからの市販のキットを使用して、製造者の指示に従って定量化した。

結果
下に提示するデータは、以下：
ｉ）乳癌において観察される免疫抑制応答を抑止するための新たな有望な薬物候補としてのアンタゴニスト３１４．８ ＭＡｂによるＩＣＯＳの遮断；及び
ｉｉ）自己免疫の分野における興味でありうるＴｒｅｇの増幅を支持する、ＣＤ４^＋Ｔ細胞上でのアゴニスト８８．２ ＭＡｂによるＩＣＯＳの会合
を検証するために本発明者らにより開発されたＩＣＯＳに対する２つの抗体（即ち、遮断ＭＡｂ ３１４．８；アゴニストＭＡｂ ８８．２）の影響を分析することを意図する。

ＩＣＯＳを高度に発現するＴａ−Ｔｒｅｇが、原発性乳房腫瘍におけるリンパ球凝集体内に存在しており、インサイチュで増殖する
本発明者らは、以前に、不良な予後及び転移の増加したリスクと相関するリンパ球凝集体内の原発性乳房腫瘍において、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ及びＦｏｘＰ３を発現する腫瘍関連調節性Ｔ細胞（Ｔａ−Ｔｒｅｇ）の存在を実証している（Gobert et al., 2009）。これらのＴａ−Ｔｒｅｇは、全ＣＤ４^＋ＴａＴ細胞の１５%〜２５%を表し、それらが、ＩＣＯＳ、ＣＤ３９、ＧＩＴＲ、及びＨＬＡ−ＤＲを発現し、ＴａＴｃｏｎｖ増殖及びサイトカイン分泌（ＩＬ−２、ＩＦＮγ）を抑制する際、高度に活性化される。

これらのＴａ−Ｔｒｅｇは、原発性乳房腫瘍環境内で、インサイチュで増殖する（Gobert et al., 2009）。腫瘍凍結切片上でＫｉ６７を同時発現するＩＣＯＳ^＋Ｔｒｅｇの存在（図１Ａ）又はＴａ−Ｔｃｏｎｖ及びＴｃｏｎｖと比較し（それぞれ３%及び０．３%）、血液からの精製Ｔａ−Ｔｒｅｇ及びＴｒｅｇ（それぞれ８%及び４%）内でのＫＩ６７＋細胞のより高い割合のいずれかにより実証される通りである（図１Ｂ）。

これらのインビボでの結果とは対照的に、本発明者らは、膨張ビーズ（アゴニスト抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を用いてコーティングされたビーズ）を用いた精製Ｔａ−Ｔｒｅｇのインビトロ刺激が、健常ドナーの血液からの精製ＴａＴｃｏｎｖ又は精製ＴｒｅｇもしくはＴｃｏｎｖを用いて観察されたものとは対照的に、Ｔａ−Ｔｒｅｇ増殖を支持することができないことを実証した（図１Ｃ）。

本発明者らは、ＩＣＯＳ会合が、Ｔａ−Ｔｒｅｇの増殖及び機能に不可欠であるという仮説を立てた。

Ａ）本発明のアンタゴニスト抗体の使用
アンタゴニストＩＣＯＳ ｍＡｂ（３１４．８）を通じたＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌ相互作用の遮断
Ｔａ−Ｔｒｅｇは、原発性乳癌におけるリンパ球凝集体内で、Ｔａ−ｐＤＣとインサイチュで相互作用する
いくつかの試験で、ｐＤＣ上でのＩＣＯＳ−Ｌ（ＩＣＯＳの特異的リガンド）の発現が報告された（Janke et al., 2006）。腫瘍凍結切片上での免疫組織化学を使用し、本発明者らは、腫瘍周囲のリンパ球凝集体内に存在するＴａ−ＣＤ３^＋ Ｔ細胞が、Ｔａ−ｐＤＣ ＢＤＣＡ２^＋と相互作用することを観察した（図１Ｄ及び１Ｅ）。ＦｏｘＰ３及びＢＤＣＡ２ Ａｂを用いた二重染色によって、Ｔａ−Ｔｒｅｇが、これらのリンパ球凝集体においてＴａ−ｐＤＣと密接に接触することが明らかになり、この相互作用が、腫瘍中のＩＣＯＳ−ＬによるＩＣＯＳ会合を支持することを示唆する（図１Ｆ）。

Ｔａ−ｐＤＣは活性化されるが、しかし、インサイチュのＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌ相互作用の潜在的な結果として、ＩＣＯＳ−Ｌを発現しなかった
腫瘍脱凝集からの精製後、Ｔａ−ｐＤＣは活性化した表現型を示す。なぜなら、それらは、健常血液及びマッチさせた患者の血液のｐＤＣと比較し、上方調節されたレベルのＣＤ８６及びＣＤ４０を発現するからである。いくつかのグループにより報告された通り（Ito et al., 2007; Janke et al., 2006）、新鮮に単離された健常血液ｐＤＣは、ＩＬ−３曝露又はＴＬＲ７／８連結後に強く上方調節される低レベルのＩＣＯＳ−Ｌを発現し、それは、他のＤＣサブセット（ｍＤＣ、ＭｏＤＣ）では観察されない。興味深いことに、それらの活性化状態（ＣＤ８６^＋ＣＤ４０^＋）とは対照的に、Ｔａ−ｐＤＣは、膜のＩＣＯＳ−Ｌ発現を欠いている。対照的に、新鮮に単離されたペアの患者の血液ｐＤＣ又は健常血液ｐＤＣは、ＩＣＯＳ−Ｌを発現する。ＩＬ−３中での２４時間の培養期間後又はＴＬＲ７／８連結時、選別されたＴＡ−ＰＤＣは強いＩＣＯＳ−Ｌ発現を再獲得し、このＩＣＯＳ−Ｌ発現を調節するそれらの能力を実証する（データ示さず）。ＣＤ３^＋ＴａＴ細胞の間で、ＩＣＯＳが、ＴａＴｃｏｎｖ（２３% ＭＦＩ：８３）又はＴａＣＤ８^＋（２% ＭＦＩ： ５０）とは対照的に、Ｔａ−Ｔｒｅｇ（６９．９% ＭＦＩ：３６１）上で強く発現される。これらの結果は、インサイチュのＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌ相互作用が、Ｔａ−ｐＤＣ膜上でのＩＣＯＳ−Ｌ下方調節に導くことを示す。

アンタゴニスト抗ＩＣＯＳ ＭＡｂ（３１４．８）を通じたＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌ相互作用の遮断は、ｐＤＣ上でのＩＣＯＳ−Ｌ下方調節を抑止する
この仮説をテストするために、健常血液Ｔ細胞を、扁桃腺から精製したＴＬＲ７活性化ｐＤＣを用いて培養した。本発明者らは、増加したＴ：ｐＤＣ比率を伴う２４時間の培養期間後、ｐＤＣ上での用量依存的なＩＣＯＳ−Ｌ下方調節を観察した。興味深いことに、ＩＣＯＳに対する本発明者らのアンタゴニストＭＡｂ（３１４．８）の添加は、ｐＤＣ上でのこのＩＣＯＳ−Ｌ下方調節を完全に抑止し、市販の抗ＩＣＯＳ抗体（ＩＳＡ−３）を使用して再現されない結果である（データ示さず）。

この結果は、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌを通じたＴａ−ｐＤＣ及びＴａ−Ｔｒｅｇの相互作用を実証し、ＩＣＯＳ連結がＴａ−Ｔｒｅｇ活性化及び増殖に関与しうることを示す。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞ならびに活性化ｐＤＣ（しかし、ＭｏＤＣではない）を伴う精製Ｔｒｅｇの共培養が、３１４．８を用いて遮断されるＴｒｅｇ増殖を誘導した
Ｔｒｅｇ増幅を誘導するＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌ相互作用の能力をテストするために、本発明者らは、健常血液の精製同種ＴＬＲ７／８（Ｒ８４８）活性化ｐＤＣ又はｍＤＣを伴う全記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞を培養した。精製されたＣＤ４^＋Ｔ細胞の中で、３．５%がＦｏｘＰ３を発現した（データ示さず）。ｐＤＣを用いた５日間の共培養後、Ｔｒｅｇに対応するＦｏｘＰ３^ｈｉｇｈ発現細胞の割合が、１２．３%まで上昇し、３１４．８ Ａｂの添加は、８０%だけ、ＦｏｘＰ３^ｈｉｇｈ細胞におけるこの濃縮を遮断する。対照的に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞と活性化ｍＤＣとの共培養は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の中で、異なるＦｏｘＰ３^ｈｉｇｈ亜集団を支持することができず、３１４．８の添加は有意な効果を有さない（６．３%〜８%）。

同様の結果が、腫瘍から精製されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を用いて得られた。Ｔａ−Ｔｒｅｇ Ｆｏｘｐ３＋は、新鮮に精製されたＣＤ４^＋ＴａＴ細胞の９%を表す（データ示さず）。Ｒ８４８活性化ｐＤＣとのそれらの共培養は、Ｔａ−Ｔｒｅｇの割合を１４．５%まで増加させるのに対し、３１４．８の添加は、開始レベルを下回る、４．５%までのＴａ−Ｔｒｅｇ割合の減少に導く。

ＣＦＳＥを用いて染色された、ＦＡＣＳ選別された精製Ｔｒｅｇ又はＴｃｏｎｖ集団を、Ｒ８４８活性化ｐＤＣ又はＬＰＳ活性化ＭｏＤＣを用いて培養し、フローサイトメトリーによりそれらの増殖能力を分析した（ＣＦＳＥ発現の希釈）。最初に、本発明者らは、外因性ＩＬ−２の非存在において、その活性化ＭｏＤＣが精製Ｔｒｅｇ増殖を誘導しないのに対し、Ｔｃｏｎｖは強く増殖することを観察した。対照的に、活性化されたＰＤＣとの共培養は、精製されたＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖの両方の強い増殖を誘導することができる。

抗ＩＣＯＳ ３１４．８ ＭＡｂの添加は、ｐＤＣがＡＰＣとして使用された場合、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ増殖を強く低下させるのに対し、Ｔｃｏｎｖ増殖は、ＭｏＤＣとの共培養において不変である。この実験において、市販の抗体（ＩＳＡ−３ ｍＡｂ又はＭＩＨ−１２ ＭＡｂ）を用いたＩＣＯＳ又はＩＣＯＳ−Ｌ遮断が、ｐＤＣ／Ｔ共培養中でＴｒｅｇ又はＴｃｏｎｖ増殖のいずれにも影響しない。

これらのデータは、抗ＩＣＯＳ ３１４．８ ＭＡｂが、Ｔｒｅｇ上でのＩＣＯＳ会合を中和し、ｐＤＣにより誘導されるそれらの増大を抑止することを実証する。

ＩＣＯＳ及びＩＣＯＳ−Ｌの遮断は、ｐＤＣ媒介性Ｔ細胞活性化の間に、ＭｏＤＣ／Ｔ共培養に強く干渉することなく、ＩＬ−１０分泌を抑止する
３１４．８ ＭＡｂは、また、活性化されたＰＤＣ刺激に応答して、Ｔｃｏｎｖ増殖を低下する。本発明者らは、ＩＦＮγ及びＩＬ−１０分泌に対する３１４．８の影響を、ＥＬＩＳＡにより、Ｔｃｏｎｖ及び同種Ｒ８４８活性化ｐＤＣ（図２Ａ）又は／及びＬＰＳ活性化ＭｏＤＣ（図２Ｂ）共培養の間に決定した。これらの設定において、ＩＬ−１０分泌は、３１４．８ ｍＡｂにより完全に抑止される（コントロールにおける２１７＋／−３１pg/ml及び３１４．８を用いた１３＋／−６pg/ml）。それに対し、ＩＦＮγ分泌は、ｐＤＣを用いた共培養時での３１４．８ ＭＡｂの添加時にわずかに低下する（３２%低下、コントロール条件における５０７＋／−５３pg/ml及び３１４．８を用いた３４１＋／−７３pg/ml）（図２Ａ）。Ｔｃｏｎｖ／ＭｏＤＣ共培養において、ＩＣＯＳ阻害は、ＩＬ−１０及びＩＦＮγのわずかに増加した分泌に導く（図２Ｂ）。

Ｂ）本発明に従ったアゴニスト抗体の使用
ＩＣＯＳ会合を模倣するためのアゴニスト抗ＩＣＯＳ ＭＡｂ（８８．２）の使用
Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ上でのＩＣＯＳ機能に関する本発明者らの理解を完成させるために、本発明者らは、アゴニストＭＡｂを用いてコーティングしたビーズを使用し、人工ＡＰＣのモデルを生成し、精製されたＴ細胞上でのＣＤ３（ＯＫＴ３）；ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）及び／又はＩＣＯＳ（８８．２、表１）シグナル伝達に導いた。

Ｔｒｅｇ上でのアゴニストＭＡｂ（８８．２）とのＩＣＯＳ会合が、それらの増殖及び多量のＩＬ−１０を分泌するそれらの能力を誘導した
最初に、本発明者らは、健常ドナーからのＴｒｅｇが、抗ＣＤ３／８８．２ビーズに応答して、外因性ＩＬ−２の存在において増殖することを観察した（図３Ａ）。以前に報告された通り（Simpson et al., 2010; Ito et al., 2008）、ＴＣＲを通じた活性化及びＩＬ−２の存在におけるＩＣＯＳ会合時、精製されたＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇの両方の亜集団は、多量のＩＬ−１０（それぞれ３１１＋／−２２pg/ml及び４２６＋／−４８pg/ml）及び低レベルのＩＦＮγ（２０５＋／−８pg/ml及び３８１＋／−１２pg/ml）を分泌する。この結果は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用して得られたデータと対比される。このモデルにおいて、Ｔｃｏｎｖは、多量のＩＦＮγ（１２１３＋／−７２pg/ml）及び低レベルのＩＬ−１０（６９＋／−５８pg/ml）を分泌するのに対し、ＴｒｅｇはＩＬ−１０及び低レベルのＩＦＮγ（それぞれ４２２＋／−３６pg/ml及び３０５＋／−３１pg/ml）を分泌する（図３Ｂ）。

腫瘍から精製されたＴ細胞を用いた同様の実験では、ＣＤ４^＋ＴａＴ細胞が、ＩＣＯＳ及びＣＤ２８に応答して、同様のレベルのＩＬ−１０を産生し、ＩＦＮγのレベルが、ＩＣＯＳに応答して、ＣＤ２８会合と比較して、弱いことが実証された（図３Ｃ）。

ＩＣＯＳ会合はＣＤ２８誘導性ＩＬ−２を遮断し、結果的に、増殖及びＩＦＮγ分泌を低下させる
それに対し、ＣＤ４^＋記憶Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激に応答して、外因性ＩＬ−２に非依存的に増殖し、増殖は、抗ＣＤ３／８８．２に応答して、観察されない（図４Ａ）。ｈＩＬ−２の添加は、用量依存的な様式で、この増殖を救出する。興味深いことに、ＩＬ−２の非存在におけるＩＣＯＳ及びＣＤ２８の同時会合が、ＣＤ２８会合だけと比較し、ＣＤ４^＋記憶Ｔ細胞の増殖を有意に低下させ、これは、１００UI/mlのＩＬ−２の存在において完全に救出される。興味深いことに、８８．２ ｍＡｂを通じたＩＣＯＳ連結は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激を用いて検出されるＩＬ−２分泌を抑止する（図４Ｂ）。まとめると、これは、ＩＣＯＳ及びＣＤ２８が同時会合された場合、ＣＤ２８会合だけと比較し、低下した自然ＩＬ−２分泌を支持すると主張し、ＣＤ２８誘導性ＩＬ−２分泌に対するＩＣＯＳ阻害的機能を示唆する。

さらに、外因性ＩＬ−２の存在においてでさえ、本発明者らは、ＩＣＯＳ及びＣＤ２８が誘発された場合、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと比較し、Ｔｃｏｎｖにより産生されたＩＦＮγの５０%低下を観察した（図４Ｃ）。

対照的に、以前に報告された通り（Ito 2008, Paulos 2010）、細胞がＩＣＯＳ誘発下で活性化された場合、ＩＬ−１０分泌が厳密にＩＬ−２依存的であるのに対し、ＩＣＯＳシグナルの添加は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により誘導されたＩＬ−１０分泌に影響しない（図４Ｃ）。

全てをまとめると、これらの結果は、ＩＣＯＳ連結が抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の能力を低下させ、Ｔｈ１局在化を支持したが（低下したＩＦＮγ産生を通じて）、しかし、ＩＬ−１０産生を持続し、免疫抑制環境の発生を支持することを実証する。

８８．２ ＭＡｂを通じたＩＣＯＳ会合は、Ｔｒｅｇ抑制機能を増加した
ＩＣＯＳ会合が免疫抑制性Ｔ細胞応答と関連しうることを評価するために、本発明者らは、外因性ＩＬ−２の非存在において抑制アッセイを準備し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／ＩｇＧ及び抗ＣＤ３／抗体ＣＤ２８／８８．２ビーズ効率を比較する。ＩＣＯＳシグナル伝達（８８．２）の添加は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／ＩｇＧ１と比較し、Ｔｒｅｇの抑制機能を強く増加する（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／ＩｇＧを用いた２１%と比較し、４つのＴｃｏｎｖ抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／８８．２について１つのＴｒｅｇの条件における５１%阻害）。全てをまとめると、これらの結果は、ＩＣＯＳ会合が、抑制への増加したＴｃｏｎｖ感度又はより強いＴｒｅｇ抑制能力のいずれかに起因しうる免疫抑制性Ｔ細胞応答を支持することを実証する。

実施例３：原発性乳房腫瘍内でのＩＣＯＳ^＋Ｔｒｅｇ細胞の検出の予後への影響の分析
１０年間の臨床追跡調査を行った１２０のパラフィン包埋原発性腫瘍サンプルを、それらのＩＣＯＳ発現について、市販の抗ＩＣＯＳウサギポリクローナルＡｂ（Spring Biosciences）を使用してテストした。ＩＣＯＳ^＋細胞を、各々の腫瘍についての６つの異なる複製物での二重盲検において定量化し、各結果の平均値をまとめた（データ示さず）。統計分析を実施するために、本発明者らは、中央値をカットオフとして使用し、群を平衡化した。

単変量解析において、本発明者らは、ＩＣＯＳ^＋細胞の存在（＞１．６６ ＩＣＯＳ^＋細胞／スポット）が、高い腫瘍悪性度（ｐ＝０．００７）、腫瘍細胞によるエストロゲン受容体の発現（ｐ＝０．０１８）、管腔Ａ／Ｂ分子サブタイプ（ｐ＜０．００１）、及びＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現の非存在（ｐ＝０．０３５）と相関することを実証する。

全生存率（ＯＳ）又は無増悪生存率（ＰＦＳ）に対する原発性乳房腫瘍内でのＩＣＯＳ^＋細胞検出の影響を調べた。

６／５９の死亡がＩＣＯＳ⁻群で観察されたのに対し、１４／６１の患者がＩＣＯＳ^＋において死亡し、ＯＳに関するＩＣＯＳ^＋検出の有意な予後値を実証する（ログ順位検定ｐ値＝０．０４６５）（図９Ａ）。ＰＦＳに関して実施された同様の分析は、ＩＣＯＳ^＋細胞が、ＩＣＯＳ⁻群の１１／５９において、より不良な全生存率と、進行と関連したのに対し、２０／６１の患者がＩＣＯＳ^＋群において進行したことを実証した（ｐ＝０．０２８５）（図９Ｂ）。

実施例４：腫瘍環境におけるｐＤＣとＩＣＯＳ^＋ Ｔｒｅｇとのインサイチュでの相互作用の存在の確認
抗ＩＣＯＳ ３１４．８ ＭＡｂ又はＣｔｒｌ Ａｂの存在における、４８時間にわたる、ＩＬ−３（２０ng/ml）の存在における腫瘍細胞引裂きのエクスビボ共培養。培養期間の終了時、ｐＤＣ上でのＩＣＯＳ−Ｌの発現が、抗ＩＣＯＳ ３１４．８ ＭＡｂの存在においてのみ観察されたが、コントロールＡｂでは観察されず、ｐＤＣ上でのＩＣＯＳ−Ｌの下方調節が、ＩＣＯＳ^＋細胞との相互作用を通じて媒介されることを実証する（データ示さず）。

実施例５：確立された細胞株又は新鮮な腫瘍サンプルのいずれかからの上皮乳房腫瘍細胞が、メラノーマ又はグリオーマ腫瘍細胞とは対照的に、抗ＩＣＯＳ抗体３１４．８とのエクスビボ培養後でさえ、ＩＣＯＳ−Ｌを発現しない
乳房上皮腫瘍細胞株を、ＰＢＳ ＥＤＴＡ中に収集し、Ａｇのトリプシンによる分解を避けた。細胞を、抗ＩＣＯＳ−Ｌ抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーにより細胞表面での発現を評価した。テストされた細胞株のいずれも、ＩＣＯＳ−Ｌについて陽性ではないことが見出された（図５Ａ）。同様の分析を、４８時間培養した原発性腫瘍脱凝集体で、抗ＩＣＯＳ Ａｂ（３１４．８）又はコントロールＡｂ＋ＩＬ−３（２０ng/ml）の存在において実施した（図５Ｂ）。

実施例６：シンジェニック乳腺腫瘍モデルにおける乳腺腫瘍成長に対する代替ラット抗マウス抗ＩＣＯＳ Ａｂ（１７Ｇ９、ＩｇＧ２ｂ）の影響
マウス乳腺腫瘍モデルを、雌ＦＶＢマウスにおいて、Ｎｅｕ １５細胞株の同所注射後２８〜３５日に得た。生成された腫瘍は、活性化Ｔａ−ｐＤＣ、ＩＣＯＳ^ｈｉｇｈ ＴＡＴｒｅｇ、及び休止ＴＡＴｃｏｎｖにより有意に浸潤しているように見える。

腫瘍移植後１１日から週３回の１７Ｇ９抗体（５０μg/ml）の腹腔内注射は、コントロールＡｂ（ＬＴＦ２、ＩｇＧ２ｂ）の注射と比較し、後の時間点で、低下したＮｅｕ１５腫瘍サイズをもたらす（ｐ＝０．０５３）（図６）。

実施例７：Ａ：Ｔｒｅｇ細胞数が、原発性子宮頸癌内で増加している
子宮頸部サンプルを、異形成（ＣＩＮ２／３、ｎ＝１８）又は癌（ｎ＝１４）のいずれかを伴う患者から得た。正常子宮頸部組織をコントロールとして使用した （ｎ＝１１）。サンプルを、酵素的及び物理的の両方の解離により得た。洗浄後、単核細胞を、標識ｍＡｂを用いてインキュベートし、Ｔｒｅｇを、ＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＤ４^＋Ｔ細胞として数え上げた。ＣＤ４^＋サブセット内のＴｒｅｇのパーセンテージを描写する。Ｔｒｅｇは、正常組織及び異形成との比較において、子宮頸癌サンプル内で増加した。故に、この増加は、癌発生に関連付けられる（図７Ａ）。

Ｂ：Ｔｒｅｇ細胞ＩＣＯＳ^＋が、原発性子宮頸癌内で増加している。
子宮頸部サンプルを、異形成（ＣＩＮ２／３、ｎ＝５）又は癌（ｎ＝１２）のいずれかを伴う患者から得た。正常子宮頸部組織をコントロールとして使用した （ｎ＝５）。サンプルを、酵素的及び物理的の両方の解離により得た。洗浄後、単核細胞を、標識ＩＣＯＳ ｍＡｂを用いてインキュベートし、Ｔｒｅｇを数え上げた。ＣＤ４^＋サブセット内のＴｒｅｇ ＩＣＯＳのパーセンテージを描写する。ＩＣＯＳ^＋ Ｔｒｅｇは、限られた数の分析サンプルに起因する、子宮頸癌におけるそれらの増加への傾向だけを伴う組織内に存在する（図７Ｂ）。

実施例８：非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）におけるＩＣＯＳ発現Ｔｒｅｇの増加
本発明者らは、ＬＮＨサンプル中でのＴｅｇ数及びＴｒｅｇ上のＩＣＯＳの発現を分析している。リンパ節から採取した新鮮なリンパ球細胞を、インフォームドコンセントを伴う４５人の患者から収集した。リンパ腫サンプルは、ホジキン病（ＨＤ、ｎ＝１１）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ、ｎ＝１３）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ、ｎ＝１０）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ、ｎ＝５）、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ、ｎ＝６）に対応した。Ｔｒｅｇ細胞の検出を、抗ICOS-PE（Becton Dickinson（商標））、抗CD3-ECD、抗CD4-Pacific Blue（Beckman Coulter（登録商標））、抗CD127 FITC、抗CD25 APC-Cy7、及びLIVE/DEAD（登録商標）Fixable Dead Cell Stain Kit（Invitrogen（商標））を用いた２０分間にわたる４℃でのインキュベーションにより実施した。染色後、各々の細胞調製物をＰＢＳ中で２回洗浄し、２%パラホルムアルデヒドを用いて固定し、ＦＡＣＳ ＬＳＲ２フローサイトメーター（Becton Dickinson（商標））で分析した。データを、FlowJo Software（TreeStar（商標））を使用して分析した。Ｔｒｅｇは、ＨＤを除く全てのリンパ腫サンプルにおいて増加した。Ｔｒｅｇの大半は、コントロールリンパ節との比較において、ＩＣＯＳの増加した発現を呈した（図８）。

実施例９：Ｉｃｏｓ ３１４．８（ＣＮＣＭ Ｉ−４１８０）のシークエンシング
全ＲＮＡを、提供された凍結ハイブリドーマ細胞から抽出し、ｃＤＮＡを合成した。次に、ＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＭＡｂの可変領域（重鎖及び軽鎖）を増幅した。重鎖及び軽鎖のＭＡｂ可変領域を、クローニングベクター中に別々にクローン化し、次に、得られた配列を分析し、ＭＡｂの配列を推定した。

材料
ハイブリドーマ細胞ＩＣＯＳ ３１４．８（ＣＮＣＭ Ｉ−４１８０）；TRIzol（登録商標）Plus RNA Purification System（Invitrogen， Ｃａｔ． Ｎｏ： １５５９６−０２６）；SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis System（Invitrogen， Ｃａｔ． Ｎｏ： １８０８０−０５１）。

方法
全ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、TRIzol（登録商標）Plus RNA Purification Systemの技術マニュアルに従ってハイブリドーマ細胞から単離した。全ＲＮＡをゲル電気泳動によりチェックした。

ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、アイソタイプ特異的なアンチセンスプライマー又はユニバーサルプライマーを使用してｃＤＮＡ中に逆転写した。全体の手順は、SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis Systemの技術マニュアルに従った。抗体フラグメントは、GenScriptのＲＡＣＥ方法の標準的な操作プロトコールに従って増幅する。

抗体遺伝子のクローニング
抗体遺伝子の標的ＰＣＲ産物を、標準的な分子クローニング手順に従ってクローニングベクター中に別々にクローン化した。

スクリーニング及びシークエンシング
コロニースクリーニングを用いて、正しいサイズのインサートを伴うクローンをスクリーニングした。１０以上の独立した陽性コロニーを、各々の抗体フラグメントについて、シークエンシングした。

結果及び分析
全ＲＮＡ抽出
サンプルの全ＲＮＡを、ＤＬ３０００ ＤＮＡマーカーと並べて、１．５%アガロース／GelRed（商標）ゲル電気泳動上で流した。

抗体遺伝子のＰＣＲ産物
各々のサンプルの４μlのＰＣＲ産物を、ＤＬ３０００ ＤＮＡマーカーと並べて、１．５%アガロース／GelRed（商標）ゲル電気泳動上で流した。

シークエンシング結果及び分析
シークエンシング結果は以下の通りである。コンセンサスＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列は以下の通りである：

重鎖：ＤＮＡ配列（４２６bp）：リーダー配列−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４

重鎖：アミノ酸配列（１４２ ＡＡ）：リーダー配列−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４

軽鎖：ＤＮＡ配列（３９６bp）：リーダー配列−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４

軽鎖：アミノ酸配列（１３２ＡＡ）：リーダー配列−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４

このように、ＩＣＯＳ ３１４．８（ＣＮＣＭ Ｉ−４１８０）の配列を以下の通りに要約することができる：

実施例１０：Ｉｃｏｓ ８８．２（ＣＮＣＭ Ｉ−４１７７）のシークエンシング
全ＲＮＡを、提供された凍結ハイブリドーマ細胞から抽出し、ｃＤＮＡを合成した。次に、ＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＭＡｂの可変領域（重鎖及び軽鎖）を増幅した。重鎖及び軽鎖のＭＡｂ可変領域を、クローニングベクター中に別々にクローン化し、次に、得られた配列を分析し、ＭＡｂの配列を推定した。

材料
ハイブリドーマ細胞ＩＣＯＳ ８８．２（ＣＮＣＭ Ｉ−４１７７）；TRIzol（登録商標）Plus RNA Purification System（Invitrogen， Ｃａｔ． Ｎｏ： １５５９６−０２６）；SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis System（Invitrogen， Ｃａｔ． Ｎｏ：１８０８０−０５１）。

方法
全ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、TRIzol（登録商標）Plus RNA Purification Systemの技術マニュアルに従ってハイブリドーマ細胞から単離した。全ＲＮＡをゲル電気泳動によりチェックした。

ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、アイソタイプ特異的なアンチセンスプライマー又はユニバーサルプライマーを使用してｃＤＮＡ中に逆転写した。全体の手順は、SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis Systemの技術マニュアルに従った。抗体フラグメントを、GenScriptのＲＡＣＥ方法の標準的な操作プロトコールに従って増幅する。

抗体遺伝子のクローニング
抗体遺伝子の標的ＰＣＲ産物を、標準的な分子クローニング手順に従って別々にクローニングベクター中にクローン化した。

スクリーニング及びシークエンシング
コロニースクリーニングを用いて、正しいサイズのインサートを伴うクローンをスクリーニングした。１０以上の独立した陽性コロニーを、各々の抗体フラグメントについて、シークエンシングした。

結果及び分析
全ＲＮＡ抽出
サンプルの全ＲＮＡを、ＤＬ３０００ ＤＮＡマーカーと並べて、１．５%アガロース／GelRed（商標）ゲル電気泳動上で流した。

抗体遺伝子のＰＣＲ産物
各々のサンプルの４μlのＰＣＲ産物を、ＤＬ３０００ ＤＮＡマーカーと並べて、１．５%アガロース／GelRed（商標）ゲル電気泳動上で流した。

シークエンシング結果及び分析
シークエンシング結果は以下の通りである。コンセンサスＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を下に列挙する：

重鎖：ＤＮＡ配列（４２９bp）：リーダー配列−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４

重鎖：アミノ酸配列（１４３ ＡＡ）：リーダー配列−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４

軽鎖：ＤＮＡ配列（３９６bp）：リーダー配列−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４

軽鎖：アミノ酸配列（１３２ ＡＡ）：リーダー配列−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４

このように、ＩＣＯＳ ８８．２（ＣＮＣＭ Ｉ−４１７７）の配列を以下の通りに要約することができる：

Claims (20)

1. ・ ＩＣＯＳ及びＩＣＯＳ−Ｌの間での固定を阻害することによりＴｒｅｇ上のＩＣＯＳ会合を中和し、そして
   ・ 形質細胞様樹状細胞により誘導されるＴｒｅｇの増殖を抑止する、
   ＩＣＯＳに対する抗体又はその誘導体。
2. 抗体が、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、それぞれ受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７９及びＣＮＣＭ Ｉ−４１８０の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ １４５−１及びＩｃｏｓ ３１４−８からなる群より選択される、ＩＣＯＳに対する抗体ならびにそれらの誘導体。
3. 抗体が、以下：
   

   

   
   の６つのＣＤＲを有する、ＩＣＯＳに対する抗体。
4. ６つのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列が、以下：
   

   

   
   である、請求項３記載の抗体。
5. 医薬としての使用のための請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体。
6. 免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制と関連する疾患又は状態を処置するための使用のための請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体。
7. 疾患又は状態が、癌及び慢性感染症より選択される、請求項６記載の抗体。
8. 癌が、ヒト悪性リンパ腫、卵巣癌、子宮頸癌、及び乳癌より選択される、請求項７記載の抗体。
9. ・ ＩＬ−１０及びＩＦＮγ産生を誘導し；
   ・ ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を誘導し；
   ・ Ｔｃｏｎｖ増殖を低下させ、及び
   ・ Ｔｒｅｇの免疫抑制機能を増加させる、
   ＩＣＯＳに対する抗体又はその誘導体。
10. 抗体が、ＣＮＣＭで、２００９年７月２日に、それぞれ受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１７６、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７７、ＣＮＣＭ Ｉ−４１７８の下で寄託されたハイブリドーマから入手可能なＩｃｏｓ ５３−３、Ｉｃｏｓ ８８−２、及びＩｃｏｓ ９２−１７からなる群より選択される、ＩＣＯＳに対する抗体ならびにそれらの誘導体。
11. 抗体が、以下：
    

    

    
    の６つのＣＤＲを有する、ＩＣＯＳに対する抗体。
12. ６つのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列が、以下：
    

    

    
    である、請求項１１記載の抗体。
13. 医薬としての使用のための請求項９〜１２のいずれか一項記載の抗体。
14. 過剰な免疫応答と関連する又はそれにより起こされる疾患又は状態を処置するための使用のための請求項９〜１２のいずれか一項記載の抗体。
15. 疾患が、自己免疫疾患、移植拒絶、又は移植片対宿主疾患からなる群より選択される、請求項１４記載の抗体。
16. 疾患が、炎症性障害である、請求項１４記載の抗体。
17. 炎症性障害が、神経系の炎症性障害、粘膜炎症性疾患、炎症性皮膚疾患、及び自己免疫性関節炎からなる群において選択される、請求項１６記載の抗体。
18. 炎症性障害が、多発性硬化症、炎症性腸疾患、喘息又は扁桃炎、皮膚炎、乾癬、接触過敏症、及び関節リウマチより選択される、請求項１７記載の抗体。
19. 乳癌患者のサンプル中のＩＣＯＳ陽性Ｔｒｅｇ細胞を定量化する工程を含む、患者において再発又は早期死亡の増加したリスクを診断するための方法。
20. 患者のサンプル中のＩＣＯＳ陽性Ｔｒｅｇ細胞を定量化する工程を含む、抗ＩＣＯＳ免疫療法により処置可能な患者を選択するための方法。

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